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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Erythrina velutina Willd: AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA,
FARMACOLÓGICA E BIOLÓGICA
Clara Raissa de França Rocha e Lopes
São Cristóvão Abril, 2010
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Erythrina velutina Willd: AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA,
FARMACOLÓGICA E BIOLÓGICA
Clara Raissa de França Rocha e Lopes
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa
São Cristóvão Abril, 2010
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
L864e
Lopes, Clara Raissa de França Rocha e Erythrina velutina Willd : avaliação fitoquímica, farmacológica e biológica / Clara Raissa de França Rocha e Lopes. – São Cristóvão, 2010.
104 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.
Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa.
1. Farmacologia. 2. Fitoquímica. 3. Erythrina velutina Willd. I. Título.
CDU 615.322
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Folha de aprovação
CLARA RAISSA DE FRANÇA ROCHA E LOPES
Erythrina velutina Willd: AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA,
FARMACOLÓGICA E BIOLÓGICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Aprovada em: 30/04/2010
Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa, Dr
1º Examinador: Prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti, PhD
2º Examinador: Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam, Dr
PARECER
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu pai José
Nilson, a minha mãe Lucimar, ao meu
marido Rogério e aos meus filhos Júlio
Miguel e João Gabriel
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, pelas oportunidades, pela força, proteção e presença real na minha vida. Ao meu pai, que desde pequena sempre acreditou em mim, sem medir esforços para que eu tivesse o melhor na minha vida profissional, por saber que seria a base para uma vida pessoal sólida. A minha mãe, que com sua compreensão, amor e carinho sempre esteve ao meu lado me dando apoio e força quando muitas vezes na minha vida quis desistir de tudo. Ao meu marido, que em todos os momentos me apoiou, incentivou, compreendeu e ajudou a concluir este trabalho e a buscar sempre novos desafios. Aos meus filhos, pela paciência nas minhas ausências, compreensão e palavras de carinho, todo o meu amor. Aos meus irmãos, cunhadas e sobrinha pelo carinho e apoio para que eu pudesse ter a tranqüilidade necessária durante o turbilhão de atividades. Agradeço ao meu professor e orientador Dr. Damião, pelas cobranças, confiança, paciência e estímulo à pesquisa. Reconheço o mérito do cuidado que dispensou ao meu trabalho e a generosidade em disponibilizar os seus conhecimentos e experiências. A minha querida amiga Dr. Silmara Pantaleão, com quem pude aprender muito da academia e da vida em intermináveis e deliciosas conversas. Ao amigo Heleno pela presteza e disponibilidade em ir comigo fazer a coleta da planta, deixando de estar no convívio de sua família para auxiliar-me em uma tarefa primordial para a realização desse estudo. Ao biológo Dr. Antônio Celso de Feitas pela identificação botânica da espécie. Aos professores do Departamento de Fisiologia pelo apoio e contribuições cientificas compartilhada durante a realização desse trabalho. Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pelo conhecimento adquirido no decorrer desse curso. Ao professor Dr. Lucindo José Quintans Júnior por ter aberto as portas do seu laboratório para a realização da triagem farmacológica. A professora Dr. Flávia Teixeira Silva e seu aluno Tiago por compartilharem seus conhecimentos e experiências.
vi
7
Ao professor Dr. Charles Estevam pelas conversas informais que enriqueceram o meu conhecimento. A professora Dr. Brancilene que sempre me apoio e, com sua experiência, ajudou-me em momentos decisivos. Aos funcionários do Departamento de Fisiologia, colegas de trabalho, pelo incentivo e convivência solidária. A funcionária Edina, da biblioteca central, pela amizade e presteza na solicitação dos artigos pelo Comut. A Genival, Mariana, Renata, Daiane, Ivan, Luciana e em especial a Tamires, amigos de laboratório pela amizade, convivência, demonstração de força e determinação, pelas conversas em tantas atividades realizadas juntos ou visitando a bancada de trabalho. As amigas do curso de mestrado em Ciências Farmacêuticas: Juliana Damasceno, Mônica, Jaqueline, Gabriele, Julyanna, Eline, Patrícia, Iderjane e Edisleide pelo companheirismo e incentivo. As amigas Adriana Gibara e Marilia pela ajuda em diversos momentos da realização da triagem farmacológica comportamental. A Sr. Osvaldo responsável pela manutenção e limpeza do biotério, pelo cuidado com os animais. A banca examinadora da qualificação, Dr. Sócrates Cavalcante e Dr. Rogéria Nunes, pelas preciosas contribuições a esse trabalho. Ao Programa de Pós – Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de realizar esse curso. Ao Instituto de Química da UNESP de Araraquara-SP e ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB) pelas analises espectrais. Ao Departamento de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro nas pessoas da Dr. Celuta S. Alviano e a Dr. Daniela S. Alviano pelo ensaio antimicrobiano.
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8
“... Porque é melhor a sabedoria do que os rubis; e tudo o que mais se deseja não se pode comparar com ela.”
(Prov. 8:11)
viii
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RESUMO
O gênero Erythrina, família Fabaceae, é muito conhecido pela presença de alcalóides tetracíclicos tipo eritrina e outras classes químicas como flavonóides. A espécie Erythrina velutina Willd, conhecida popularmente como “Mulungu”, é utilizada pela população do nordeste brasileiro por suas propriedades sudoríficas, calmante, emoliente, peitoral e anestésica local. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar os constituintes químicos presentes no extrato metanólico das folhas de Erythrina velutina, bem como investigar a atividade farmacológica e antimicrobiana do extrato bruto e das fases orgânicas, além de contribuir com a quimiotaxonomia do gênero Erythrina. As folhas foram coletadas no município de Simão Dias, Sergipe, Brasil. O extrato metanólico bruto, obtido por maceração, foi submetido a prospecção fitoquímica que indicou a presença dos seguintes metabólitos secundários: alcalóides, taninos e flavonóides. O particionamento deste extrato foi realizado com hexano, acetato de etila e n-butanol. A partir do extrato metanólico bruto foi feita uma marcha para alcalóide obtendo as fases clorofórmica e n-butanólica básica. Da fase n-butanólica básica isolou-se o ácido nicotínico. A identificação estrutural do composto foi realizada a partir dos dados espectrais de RMN de 1H e 13C e em comparação com dados da literatura. Na realização da triagem farmacológica comportamental, foi observado que administrações das fases orgânicas e do extrato bruto promoveram discretas alterações comportamentais ao nível de sistema nervoso central, sugerindo que o extrato de Erythrina velutina contém substâncias psicoativas. O extrato metanólico bruto e a fração hexânica promoveram uma inibição de crescimento fraco ou parcial, sem halo de inibição definido, para o fungo Trichophyton rubrum T544. PALAVRAS-CHAVE: Erythrina velutina Willd; Constituintes químicos; Triagem farmacológica comportamental; Atividade antimicrobiana.
ix
10
ABSTRACT
Erythrina plant species, botanical family Fabaceae, are the main source for the tetracyclic erythrina-type alkaloids, and other chemical classes such as flavonoids. The Erythrina velutina Willd specie is popularly known as "Mulungu" and used by the population of the northeastern region of Brazil for its sudorific, soothing, emollient, pectoral, and local anesthetic properties. The objective of this study was to isolate and identify the constituents present in the leaves methanol extract of Erythrina velutina, and to investigate the antimicrobial activity of the crude extract and organic phases as well as contribute to the chemotaxonomy of the genus Erythrina. The leaves were collected in the city of Simão Dias, Sergipe, Brazil. The phytochemical screening performed with the crude methanol extract showed the presence of the following secondary metabolites: alkaloids, tannins, and flavonoids. The crude methanol extract was obtained by maceration and fractionated into hexane, ethyl acetate and n-butanol phase. From the crude methanol extract was extracted alkaloids that resulted on basic chloroform and n-butanol phase. Nicotinic acid was isolated from basic n-butanol phase. The structure identification involved analysis of spectral data of NMR of 1H and 13C and comparison with literature data. The behavior pharmacological screening showed that administration of the organic phases and crude extract promoted discrete behavioral changes at the level of central nervous system, suggesting that the extract of Erythrina velutina contains psychoactive compounds. In addition, antimicrobial screening showed that the crude methanol extract and hexane fraction present a weak inhibition or in part without inhibition zone defined for the fungus Trichophyton rubrum T544. KEYWORDS: Erythrina velutina Willd; Chemical constituents; Pharmacological screening; Antimicrobial activity.
x
11
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO............................................................................................
20
II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................
2.1. Plantas medicinais................................................................................ 2.2. Importância dos marcadores químicos................................................. 2.3. Erythrina velutina Willd.......................................................................... 2.4. Fitoquímica............................................................................................ 2.5. Atividades farmacológicas..................................................................... 2.6. Aspectos toxicológicos do gênero e espécie.........................................2.7. Aspectos da atividade antibacteriana do gênero e espécie..................
24 24 28 31 34 40 43 44
III – OBJETIVOS............................................................................................ 3.1. Geral...................................................................................................... 3.2 Específicos.............................................................................................
50 50 50
IV – EXPERIMENTAL ................................................................................... 4.1. Especificações dos materiais e equipamentos......................................4.2. Estudo fitoquímico.................................................................................
4.2.1. Coleta e identificação do material botânico ................................ 4.2.2. Preparação do extrato metanólico das folhas secas de Erythina
velutina (EMEv).............................................................................................. 4.2.3. Fracionamento do extrato metanólico.......................................... 4.2.4. Características organolépticas e pH............................................ 4.2.5. Prospecção fitoquímica do extrato metanólico bruto da
Erythrina velutina Willd................................................................................... 4.2.6. Marcha para alcalóides................................................................ 4.2.7. Isolamento dos constituintes químicos........................................
4.2.7.1. Fase n-butanólica básica (FNB)...................................... 4.2.7.2. Fase acetato de etila e isolamento de seus
constituintes químicos(FACET)...................................................................... 4.3. Farmacologia.........................................................................................
4.3.1. Animais........................................................................................ 4.3.2. Triagem psicofarmacológica preliminar.......................................
4.4. Procedimento experimental do ensaio antimicrobiano in vitro.............. 4.4.1 Microorganismos utilizados.......................................................... 4.4.2. Preparo do inóculo contendo os microorganismos..................... 4.4.3. Preparação do extrato bruto e fases orgânicas da Erythrina
velutina para os ensaios antimicrobianos in vitro........................................... 4.4.4. Ensaio antimicrobiano in vitro......................................................
51 51 53 53 53 54 55 56 59 60 60 61 63 63 64 64 65 65 66 66
V – RESULTADOS E DICUSSÃO................................................................. 5.1. Fitoquímica............................................................................................
68 68
xi
12
5.1.1. Prospecção fitoquímica............................................................... 5.1.2. Marcha para alcalóides...............................................................
5.1.2.1. Fase n-butanólica básica............................................... 5.1.3. Fase acetato de etila...................................................................
68 70 70 78
5.1.4. Observações gerais.................................................................... 5.2 Farmacologia..............................................................................................
5.2.1 Triagem farmacológica comportamental...................................... 5.3. Atividade antimicrobiana.......................................................................
VI. CONCLUSÃO...........................................................................................
79 80 80 85 90
CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................
91
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
93
VIII – ANEXO(S)............................................................................................ ANEXO 1 – Declaração do CEPA (Conselho de Ética em pesquisas com Animais)......................................................................................................... ANEXO 2 – Triagem Farmacológica Comportamental (ALMEIDA et al., 1999)..............................................................................................................
103 103 104
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................... ÍNDICE DE ESQUEMAS................................................................................ ÍNDICE DE TABELAS....................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS E DE SIGLAS.................................................. LISTA DE SÍMBOLOS...................................................................................
xii
13
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Erythrina velutina Willd, Fabaceae................................................... 32
Figura 2 – Estrutura química do esqueleto clássico de alcalóides eritrínicos............................................................................................................
Figura 3 - Estrutura química do esqueleto básico de alcalóides eritrínicos do tipo dienóide (I) e alquenóide (II)........................................................................
35
35
Figura 4 - Estrutura química de alcalóides eritrínicos........................................
36
Figura 5 – Estrutura química do ácido nicotínico (AN)....................................... 71
Figura 6 – Espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 /300 MHz)....................................................................................................................
73
Figura 7 – Expansão do espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 / 300 MHz)....................................................................................................................
74
Figura 8 – Espectro de RMN 13C de FNB 10-16 (DMSO-d6 /75 MHz)............... 75
Figura 9 – Estrutura química e sinais de RMN1H do alcalóide (+)-coculidina............................................................................................................
76
Figura 10 – Expansão do espectro de RMN1H de NB-E (DMSO-d6/75 MHz)....................................................................................................................
77
Figura 11 – Espectro de RMN1H de F17-18 da fase acetato de etila (CDCl3 /200 MHz)............................................................................................................
79
xiii
14
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1 – Obtenção e particionamento do extrato bruto das folhas Erythrina velutina Willd (EMEv)......................................................................
55
Esquema 2 - Marcha para alcalóides do extrato metanólico bruto de Erythrina velutina Willd...................................................................................
60
Esquema 3 – Isolamento do ácido nicotínico da fase n-butanólica básica das folhas de Erythrina velutina Willd............................................................
61
Esquema 4 – Isolamento dos constituintes químicos da fase acetato de etila das folhas de Erythrina velutina Willd.....................................................
63
xiv
15
ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 – Estruturas químicas dos compostos isolados de Erythrina velutina Willd....................................................................................................
38
Tabela 2 - Resultados da prospecção fitoquímica com o extrato metanólico bruto.................................................................................................................
68
Tabela 3 – Dados de RMN1H (δ, 300 MHz) e 13C (δ, 75 MHz) de FNB 10-16 obtidos em DMSO-d6, comparados com dados da literatura (BHAT SV, NAGASAMPAGI BA, SIVAKUMAR M, 2005) (AN-1A e AN-1B)......................
Tabela 4 – Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana...................
72 86
xv
16
LISTA DE ABREVIATURAS E DE SIGLAS
AN – Ácido nicotínico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC - American Type Culture Collection
BHI - Brain Heart Infusion
CC – Cromatografia em coluna
CCD - Cromatografia em Camada Delgada
CCDA - Cromatografia em Camada Delgada Analitica
CCDP - Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CEPA – Conselho de Ética em Pesquisas com Animais
CIM - Concentração Inibitória Mínima
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EMEv - Extrato metanólico de Erythrina velutina
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EtOAc - Acetato de etila
FACET - Fase acetato de etila
FCA - Fase clorofórmica ácida
FCB - Fase clorofórmica básica
FHEX - Fase hexânica
FHMET - Fase hidrometanólica
F-NBU - Fase n-butanólica
FNB - Fase n-butanólica básica
xvi
17
MIC - Minimal Inhibitory Concentration
MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina
OMS - Organização Mundial de Saúde
ppm - Partes por milhão
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
RMN 13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze
RMN 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RF - Fator de retenção
SNC - Sistema Nervoso Central
SUS - Sistema Único de Saúde
UV - Ultravioleta
UFPB – Universidade Federal da Paraíba
UNESP – Universidade Estadual de São Paulo
xvii
18
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC – Grau Celcius
14C - Carbono 14
CDCl3 - Clorofórmio deuterado
CHCl3 – Clorofórmio
cm - centímetro
d - dupleto
dd - Duplo dupleto
ddd – Triplo dupleto
DMSO - Dimetilsulfóxido
DMSO d6 - Dimetilsulfóxido deuterado
g - grama
H - Hidrogênio
H2O – Água
HCl – Ácido clorídrico
Hz – Hertz
i.p. - intraperitoneal
J – Constante de acoplamento
L – Litro
m - Multipleto
MeOH – Metanol
mm – milímetro
mg - miligrama
mg/kg - miligrama(s) por kilograma(s)
MHz - Mega Hertz
xviii
19
mL – mililitro
NH4OH – Hidróxido de amônio
nm – nanômetros
s – simpleto
α – Alfa
β – Beta
γ – Gama
δ – Deslocamento químico
µg/mL - micrograma(s) por mililitro(s)
µL - Microlitro(s)
pH - Potencial hidrogeniônico
v.o. – via oral
v/v – volume/volume
xix
20
I. INTRODUÇÃO
Documentos escritos pelas primeiras civilizações comprovam que as
plantas medicinais representaram a única fonte de tratamento para as
enfermidades, sendo seu uso tão antigo quanto à história do homem (CALIXTO,
2000). No início, quando os métodos de extração, purificação e identificação
ainda não haviam sido desenvolvidos, empregava-se diretamente extratos das
plantas. Com o desenvolvimento tecnológico, algumas plantas passaram a ser
utilizadas como fonte para a extração direta dos princípios ativos. Ainda, estes
princípios ativos também serviam como material de partida para a síntese de
derivados químicos ou mesmo como modelo para a síntese total de fármacos.
Além de fornecer princípios ativos para o emprego direto na terapia, as
plantas medicinais também podem ser utilizadas como fitoterápicos, os quais são
definidos como preparações padronizadas, constituídas de misturas complexas
de uma ou mais plantas, usadas para o tratamento de várias doenças (CALIXTO,
2000). Neste caso, tanto a atividade farmacológica como os compostos
responsáveis por esta atividade devem estar bem definidos (HOSTETTMANN;
QUEIROZ; VIEIRA, 2003). Entretanto, em alguns casos os princípios ativos
responsáveis por sua ação farmacológica são desconhecidos e o sinergismo
entre as substâncias parece ser o principal responsável pela ação (KINGHORN,
2001).
Frequentemente, a atividade dos extratos vegetais não é reproduzida
pelas substâncias ativas isoladas. Assim, é possível que a atividade
farmacológica seja resultante da ação de mais de um componente, que podem
eventualmente atuar sobre os mesmos processos bioquímicos e podem também
21
contribuir de outras maneiras, modificando a solubilidade, alterando fenômenos
de absorção ou influenciando a estabilidade (SCKENKEL; GOSMANN;
PETROVICK, 2007). De acordo com MAHADY (2001), nota-se nos últimos anos
um interesse crescente por fármacos e medicamentos de origem vegetal,
principalmente porque as plantas medicinais representam uma reserva
praticamente inexplorada de substâncias úteis à humanidade. Aproximadamente
420 mil espécies vegetais são conhecidas (BRAMWELL, 2000) e menos de 5%
destas foram avaliadas para uma ou mais atividades biológicas (VERPOORTE;
VAN DER HEIJDEN; MEMELINK, 2000). Apesar do extenso emprego pelas
populações, relativamente poucas plantas medicinais foram avaliadas
cientificamente e clinicamente para comprovar sua eficácia, benefícios potenciais
e efetividade (CALIXTO, 2000). Diversos fatores podem explicar a razão desta
divergência. Quando comparados com fármacos sintéticos, os medicamentos
vegetais exibem algumas diferenças marcantes, como: princípios ativos são
frequentemente desconhecidos; a padronização, estabilidade e controle de
qualidade, embora realizáveis, são de execução relativamente complicados; a
disponibilidade e a qualidade da matéria-prima vegetal são questões
problemáticas; são raros os estudos clínicos e toxicológicos duplo-cegos bem
definidos para comprovar a eficácia e segurança (CALIXTO, 2000). Estes fatos
evidenciam a complexidade da tarefa de desenvolver, a partir de plantas
medicinais, produtos com constância de composição e propriedades terapêuticas
reprodutíveis, como se exige dos demais medicamentos. O estudo de
determinada espécie vegetal com fins medicinais deve compreender a realização
de pesquisas botânicas, farmacognósticas, químicas, farmacológicas e
toxicológicas, e este trabalho multidisciplinar deve concluir se a espécie em
22
questão está bem caracterizada morfológica e quimicamente e se sua ação será
eficaz e segura quando administrada em doses corretas (CALIXTO, 2000).
No Brasil, a utilização de plantas medicinais com fins terapêuticos
provém de diferentes origens e culturas, principalmente de índios, seitas afro-
brasileiras e da tradição européia. Em um primeiro momento, além do fator
cultural e religioso, as plantas medicinais coletadas no campo eram (e muitas
ainda são) mais acessíveis à grande parcela da população desprovida de poder
aquisitivo para adquirir medicamentos industrializados. Além deste fato, nota-se
atualmente uma tendência mundial em buscar terapias ditas “naturais”, cuja
principal vantagem é a ausência ou a redução (muitas vezes equivocada) de
eventos adversos.
Uma série de plantas medicinais vem sendo utilizada como matéria-
prima para produção de fitoterápicos, entre elas as do gênero Erythrina
(Fabacea).
No Brasil, a designação inclui as espécies Erythrina velutina, endêmica
das regiões semi-áridas do nordeste, e Erythrina mulungu, nativa do sul.
Investigações preliminares mostram que um número de alcalóides e flavonóides
têm sido isolados de plantas pertencentes ao gênero Erythrina. Vários estudos
desta classe de compostos apresentam atividades analgésica, antiagressiva,
antiinflamatória, ansiolítica e antibacteriana (RAUPP et al., 2008; RIBEIRO et al.,
2006; MARCHIORO et al., 2005; VIRTUOSO, 2005).
Os estudos fitoquímicos realizados até o momento utilizaram as cascas
do caule de Erythrina velutina e as sementes (VIRTUOSO, 2005; OZAWA et al.,
2008, 2009) o que representa um risco à sobrevivência da espécie (ZSCHOCKE
et al., 2000). Portanto, é de grande interesse científico a avaliação do potencial
23
farmacológico e o estudo fitoquímico de outras partes da planta, como folhas, as
quais são mais disponíveis que flores ou sementes e cuja coleta não tende a
causar a destruição da planta, ao contrário do que ocorre com cascas ou raízes.
Estudos para avaliar a atividade antimicrobiana e toxicológica que comprovem a
segurança do uso da Erythrina velutina são muito importantes, mas ainda muito
escassos.
As pesquisas em produtos naturais tornam-se urgentes, uma vez que a
concretização de programas para promover o levantamento desta riqueza nativa,
busca contribuir efetivamente para o desenvolvimento auto-sustentável da Região
Nordeste, oferecendo ao Estado de Sergipe uma alternativa de elevado potencial
econômico.
Desse modo, avaliou-se a composição química do extrato metanólico
das folhas da espécie Erythrina velutina Willd (Fabaceae). O mérito deste estudo
está na ocorrência da referida espécie no Estado de Sergipe e no pouco
conhecimento sobre a sua quimiotaxonomia e comprovação científica do seu
potencial terapêutico. Os dados levantados em pesquisa bibliográfica e de campo
permitem observar a unanimidade quanto à escassez de informações sobre o
aspecto químico, efeitos farmacológicos e atividade antimicrobiana das folhas da
Erythrina velutina, consumidas oralmente pela população, por meio de diferentes
preparados.
Assim sendo, torna-se relevante investigar o perfil fitoquímico do
extrato das folhas de Erythrina velutina Willd, podendo dessa maneira comprovar
e beneficiar a saúde da população que faz uso das substâncias provindas dessa
planta.
24
II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas medicinais
O conhecimento sobre as plantas acompanha a evolução do homem
ao longo dos séculos. As primitivas civilizações cedo se aperceberam da
existência, ao lado das plantas comestíveis, de outras dotadas de maior ou menor
toxicidade que, ao serem experimentadas no combate à doença, revelaram,
embora empiricamente, o seu potencial curativo. Esta interação se traduz na
religiosidade, modo de vida, trabalho e no trato com a saúde, conforme as
compreensões dos grupos culturais, que há milênios, praticam alguns dos
conhecimentos que são repassados através das gerações. Observar a história
das civilizações mesopotâmica, egípcia, chinesa, entre outras, quanto ao uso de
plantas medicinais mostra a importância dos conhecimentos que levaram a
construção da base da medicina tradicional.
Essa tendência alcança o século XIX, onde os recursos terapêuticos
usados na medicina tradicional eram constituídos predominantemente por plantas
e extratos vegetais. Destaca-se nessa época a “Farmacopéia Geral para o Reino
e Domínios de Portugal”, onde se encontram descritas cerca de 400 espécies
vegetais e seus usos pela população (SCHENKEL et al., 2007).
Ainda neste século foi descoberto o primeiro princípio ativo isolado de
planta, a quinina, marcando o início dos estudos para o isolamento e utilização de
substâncias terapêuticas (SCHENKEL et al., 2007, PHILLIPSON, 2001).
Os recursos terapêuticos de origem vegetal começaram a ser
estudados no início do século XX, estabelecendo-se lentamente a tendência de
25
utilização das substâncias ativas isoladas e seus efeitos terapêuticos estudados
(SCHENKEL et al., 2007).
A utilização das substâncias ativas isoladas se impôs pela constância
da composição, maior eficácia, segurança e qualidade dos produtos, facilitando o
estabelecimento de especificações para uma substância única, em relação ao
extrato bruto da planta (SCHENKEL et al., 2007).
MIGUEL e MIGUEL (2004) relatam que "as pesquisas científicas
iniciaram na tentativa de comprovar a identidade botânica, composição química e
ação farmacológica das drogas vegetais, agrupando aquelas de efeitos
semelhantes. Essas pesquisas buscaram determinar as estruturas quimicamente
ativas e a promoção de modificações estruturais. Esses estudos possibilitaram a
proposição de maior atividade terapêutica, junto aos requisitos de qualidade e
ausência de toxicidade".
Com o desenvolvimento de várias tecnologias, aliado ao interesse em
se confirmar o conhecimento em medicina popular, as plantas medicinais têm tido
seu valor terapêutico pesquisado mais intensamente pela ciência.
Como estratégia para investigação de plantas medicinais, a abordagem
etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto a
comunidades locais, que fazem uso da flora medicinal, com estudos
químico/farmacológicos realizados em laboratórios especializados
(ELIZABETSKY & SOUZA, 2007). Desse modo foram descobertos produtos como
a morfina, a codeína, a digoxina, a beladona, a atropina e muitos outros
compostos que modificaram a história médica e tornou o tratamento das doenças
uma realidade, e não apenas uma promessa de cura.
26
Esse grande avanço científico pode garantir as áreas da Botânica, da
Química de Produtos Naturais e da Farmacologia grandes descobertas com
aplicações diretas na medicina tradicional denominada Fitoterapia. Nesta
perspectiva programas de financiamento à pesquisa têm se incorporado junto às
Universidades e Instituições de Pesquisa incentivando a busca de fármacos com
aplicação na prevenção à saúde e cura de diversas patologias (VIRTUOSO,
2005).
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), pelo
menos 65-80% da população mundial, em países em desenvolvimento, recorre às
plantas medicinais para obter benefícios à saúde. Aproximadamente 25% das
drogas prescritas mundialmente vêm de plantas, sendo 121 desses compostos
ativos de uso corrente. Dos 252 medicamentos consideradas básicos e essenciais
pela Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente de origem
vegetal e um número significativo são compostos sintéticos obtidos a partir de
precursores naturais (RATES, 2001). No entanto, poucas plantas têm sido
cientificamente estudadas para a avaliação da sua qualidade, segurança e
eficácia (CALIXTO, 2005).
Nas últimas décadas, o interesse da população pela medicina
alternativa levou a indústria farmacêutica a investir na pesquisa de novas drogas
a partir dos recursos naturais, levando o mercado de fitoterápicos a atingir a cifra
de 7 bilhões no ano de 1997, somente na Europa (CALIXTO, 2000). Estima-se
que o comércio mundial de produtos fitoterápicos movimente cifras da ordem de
US$ 22 bilhões de dólares (YUNES; PEDROSA; FILHO, 2001).
Os países latino-americanos juntos possuem grande parte da
biodiversidade mundial. Nesta perspectiva, o Brasil possui cerca de 20-22% de
27
todas as plantas e microrganismos. Entretanto, estima-se que não mais de 25.000
espécies de plantas têm sido objeto de qualquer tipo de investigação científica
(CALIXTO, 2005).
Avalia-se, no Brasil, que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento da
indústria farmacêutica nacional, em 1996, foram originados de medicamentos
derivados de plantas (URIAS, 2006). O Brasil é o país com maior diversidade
genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 mil espécies
catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA; NODARI,
2007).
A biodiversidade do ecossistema brasileiro, uma das mais ricas do
planeta, coloca o Brasil em posição privilegiada frente a outros países e para
investigá-la, torna-se necessária a dedicação de inúmeros pesquisadores nas
várias áreas de pesquisas científicas.
Em dezembro de 2005 foi aprovada a Política Nacional de Práticas
Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (PNPIC-SUS), que
tem como objetivo ampliar as opções terapêuticas aos usuários do SUS, com
garantia de acesso às plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à
fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade
da atenção à saúde (BRASIL, 2006).
O aumento na produção e no consumo de produtos fitoterápicos
demanda maior rigor relativo à qualidade destes produtos. No Brasil, a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária tem sido bastante rigorosa e a legislação vigente
(RDC nº 14/2010 – ANVISA) requer a detecção e a quantificação dos chamados
marcadores. Apesar de muitos deles serem comerciais, seus preços são
28
geralmente bastante elevados, por isso são importantes os estudos de otimização
dos mesmos.
Diante disso, é necessária a realização de estudos para investigar a
atividade de extratos totais de plantas e a relação entre a atividade dos diferentes
compostos para a obtenção do efeito terapêutico desejado, pois são conhecidos
alguns constituintes bioativos de plantas, através de atividade sinergística, que
podem ter sua ação potencializada ou seus efeitos colaterais atenuados por
outros constituintes secundários encontrados nos extratos brutos (ELVIN-LEWIS,
2001).
2.2 Importância dos marcadores químicos
O desenvolvimento de fitoterápicos inclui várias etapas e envolve um
processo interdisciplinar, multidisciplinar e, muitas vezes, interinstitucional. As
áreas de conhecimento envolvidas vão desde a botânica, agronomia, ecologia,
química, fitoquímica, farmacologia, toxicologia, biotecnologia, química orgânica
até a tecnologia farmacêutica.
Neste contexto, os estudos fitoquímicos compreendem as etapas de
isolamento, elucidação estrutural e identificação dos constituintes mais
importantes do vegetal, principalmente de substâncias originárias do metabolismo
primário e secundário, responsáveis, ou não, pela ação biológica. Esses
conhecimentos permitem identificar a espécie vegetal, conjuntamente com
ensaios de atividade biológica, analisar e caracterizar frações ou substâncias
bioativas. Ressalta-se ainda, a importância do estabelecimento de marcadores
químicos para o desenvolvimento de fitoterápicos, onde a legislação vigente (RDC
nº 14/2010 – ANVISA) define marcador como o componente ou classe de
29
compostos químicos (ex: alcalóides, flavonóides, ácidos graxos, etc.) presente na
matéria-prima vegetal, idealmente o próprio princípio ativo e, preferencialmente,
que tenha correlação com o efeito terapêutico que é utilizado como referência no
controle de qualidade da matéria-prima vegetal e dos medicamentos fitoterápicos.
Para isso, o conhecimento da estrutura química tem especial relevância
no caso de substâncias facilmente degradáveis por fatores tais como luz, calor e
solventes, atrelados ao processo tecnológico (TOLEDO et al., 2003)
A diversidade molecular, fator importante para a procura de novas
moléculas em plantas, significa também, diferentes propriedades físico-químicas.
Esse fato representa um desafio para o químico que pretende isolar e determinar
a estrutura de compostos ativos, uma vez que o extrato de determinada planta
pode conter centenas ou milhares de compostos (HAMBURGER;
HOSTETTMANN, 1999).
Metabólitos são substâncias produzidas e/ou necessárias em qualquer
processo químico ou metabolismo inerente a um organismo vivo. O estudo de
metabólitos secundários como marcadores químicos em taxóns de plantas e
microorganismos vêm sendo cada vez mais ampliado e aceito por taxonomistas
de destaque. Estes podem utilizar caracteres químicos (micromoléculas) e
caracteres macromoleculares na identificação de relações existentes entre seres
vivos em qualquer nível hierárquico: populações, espécies, gêneros, tribos,
famílias, etc. bem como em análises evolutivas para avaliar relações filogenéticas
e variação dentro de espécies (ZDERO & BOHLMANN, 1990). Esse processo de
estudo classificatório denomina-se quimiossistemática ou quimiotaxonomia.
As plantas possuem em sua composição substâncias denominadas
metabólitos, e estas podem ser divididas em dois grupos distintos: metabólitos
30
primários e secundários. Os primários (lipídeos, carboidratos, proteínas e ácidos
nucléicos) são essenciais à vida e ao desenvolvimento das plantas, sendo
fornecedores de matéria-prima e de energia para a formação dos metabólitos
secundários, como: taninos, alcalóides, flavonóides, glicosídeos cianogênicos
dentre outros (SANTOS, 2007). A origem de metabólitos primários e secundários
em plantas envolve rotas biossintéticas complexas, onde atuam sistemas de
enzimas poderosas, muitas das quais ainda não foram totalmente elucidadas.
Durante muito tempo os metabólitos secundários foram considerados
como produtos de excreção do vegetal, com estruturas químicas e, algumas
vezes, propriedades biológicas interessantes. Atualmente, sabe-se que muitas
destas substâncias estão diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem
a adequação da planta ao seu meio. O aparecimento destes compostos é
determinado por necessidades ecológicas como, limitações nutricionais, defesa
contra herbívoros e microorganismos, proteção contra raios ultravioleta (UV),
atração de polinizadores e possibilidades biossintéticas, tanto em relação ao
número de substâncias produzidas quanto à sua diversidade numa mesma
espécie (SANTOS, 2007).
Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários,
apenas os compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados
e estudados pela fitoquímica clássica. Porém, normalmente, os compostos
presentes em menor proporção na planta são os que apresentam melhores
efeitos terapêuticos (YUNES; PEDROSA; FILHO, 2001).
É importante ressaltar que substâncias em princípio consideradas
terapêuticas também podem causar efeitos indesejados ou tóxicos, sendo
imprescindível à realização de estudos toxicológicos desses compostos. Apesar
31
de várias plantas do gênero Erythrina terem sido muito estudadas, outras
apresentam poucos estudos, como se observa com as folhas da Erythrina velutina
Willd.
2.3 Erythrina velutina Willd
O gênero Erythrina (família Fabaceae) é muito conhecido, ocorrendo
nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Possui cerca de 110 espécies, das
quais 70 são nativas da América (VASCONCELOS et al., 2003). O nome
Erythrina vem do grego "erythros", que significa vermelho, em alusão à cor de
suas flores. O epíteto específico “velutina” vem do latim, devido ao fato da folha
apresentar indumento de delicados e macios pêlos (CARVALHO, 2008).
Encontra-se no Brasil cerca de doze espécies (EPAMIG, 1993), sendo as duas
principais Erythrina velutina, originária do Nordeste e Erythrina mulungu, nativa do
Sudeste (NEILL, 1988).
A espécie Erythrina velutina Willd (Figura 1) é uma árvore de grande
porte, decídua, que mede de 8 a 12 m de altura, com tronco de 40-70 cm de
diâmetro; possui fruto do tipo legume, flores de coloração vermelha e folhas
alternadas compostas e trifolioladas, sustentadas por pecíolo de 6-14 cm; folíolos
cartáceos, com fase ventral apenas pulverulenta e dorsal de cor verde mais clara
revestida por densa pilosidade feltrosa, de 6-12 cm de comprimento por 5-14 cm
de largura (LORENZI, 1998).
Segundo a classificação taxonômica, a espécie pertence ao Reino-
Plantae, Filo-Magnoliophyta, Classe-Magnoliopsida, Ordem-Fabales, Família-
Fabaceae (Leguminosae – Papilionoideae), Subfamília - Faboideae. Tem como
sinonímias científicas Corallodendrum velutinum Willd., Chirocalyx velutinus Walp;
32
floresce de agosto a dezembro e os frutos amadurecem em janeiro a fevereiro,
podendo ser encontrada na região metropolitana de Aracaju (JOLY, 2002).
A planta em estudo é característica de várzeas úmidas e beira de rios
da caatinga da região semi-árida do Nordeste brasileiro. É também encontrada na
orla marítima de Pernambuco e na floresta latifoliada de Minas Gerais e São
Paulo (LORENZI, 1998). O Estado de Sergipe é caracterizado por vegetação
típica de caatinga e por remanescentes de mata atlântica, ambientes propícios
para encontrar esta planta (Figura 1).
Figura 1 - Erythrina velutina Willd., Fabaceae
Fonte: LORENZI (1998)
33
O referido gênero engloba plantas que são popularmente chamadas de
“mulungu”, “canivete”, “suína”, “sananduva”, “pau-imortal” ou “muchocho”
(CORRÊA, 1952).
Segundo LORENZI (1998) a Erythrina velutina é conhecida
popularmente por: “mulungu”, “suína”, “canivete”, “corticeira”. De acordo com
EPAMIG (1993) e o país onde a planta é encontrada vamos ter: “mulungu-da-
catinga”, “mulungu”, “pau-de-coral”, “sanaduí”, “sananduva”, “suína”, “suinan”
(Brasil); “arbe à coral” (Guiana Francesa); “bucare”, “pinon da costa” e “pinon
espinosa” (Cuba); “bucare” e “peonita” (Venezuela); “cay-boung” (Conchinchina);
“chocho” e “coral” (Colômbia); “coral bean tree” (Inglaterra); “imortelle” (Martinica);
“poró blanco” (Costa Rica).
A madeira da Erythrina velutina é leve, macia e pouco resistente aos
agentes decompositores. É empregada na confecção de tamancos, jangadas,
brinquedos e caixotaria. A árvore é extremamente ornamental, principalmente
quando em flor, e isto tem estimulado seu uso no paisagismo, principalmente na
arborização de ruas, jardins e alamedas. A árvore também é utilizada como cerca
viva pela facilidade com que pega de estacas espetadas no próprio local
(LORENZI, 1998).
A casca e os frutos dessa espécie são empregados na medicina
popular em algumas regiões do Nordeste, embora a eficácia e a segurança do
seu uso ainda não tenham sido comprovadas cientificamente. Assim, seu uso
vem sendo feito com base na tradição popular. São atribuídas às preparações de
sua casca propriedades sudoríficas, calmante, emoliente e peitoral. Ao seu fruto
seco, ação anestésica local quando usado na forma de cigarro como odontálgico
(CARVALHO, 2008).
34
2.4 Fitoquímica
Em 1877, teve início o estudo do gênero Erythrina, devido à descoberta
da ação farmacológica do extrato das sementes da E. americana, por Dominguez
e Altamirano (HARGREAVES et al., 1974). Após essa descoberta, os extratos de
diferentes espécies de Erythrina passaram a ter seus perfis fitoquímicos e
farmacológicos pesquisados.
As plantas do gênero Erythrina são a principal fonte dos alcalóides
tetracíclicos do tipo eritrina, que foram originalmente identificados em 1937 por
FOLKERS e MAJOR, através da investigação química das sementes da E.
americana Mill e isolaram a eritroidina, o qual apresentava atividade paralisante
semelhante a d-tubocurarina (NKENGFACK et al., 1994). As plantas do gênero
Cocculus (família Menispermaceae) também produzem alcalóides tetracíclicos
eritrínicos, diferindo somente no padrão de oxigenação (AMER; SHAMMA;
FREYER, 1991).
A nomenclatura dos tipos de alcalóides eritrínicos é interessante. O
prefixo “eryso-” denota a presença de uma função fenólica. O prefixo “erythroi-”
indica que o anel D do esqueleto é lactônico; enquanto o prefixo “erythra-” mostra
que o anel D do esqueleto é o clássico (Figura 2), como por exemplo a (+)-
eritravina (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991).
35
Figura 2 – Estrutura química do esqueleto clássico de alcalóides eritrínicos.
Fonte: AMER; SHAMMA; FREYER, 1991
Os alcalóides dienóides apresentam um sistema diênico nos anéis A e
B (Figura 3). Os alcalóides que possuem uma dupla ligação ∆1,6 no anel A são
denominados alquenóides (Figura 3) (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991).
(I) (II)
Figura 3 – Estrutura química do esqueleto básico de alcalóides eritrínicos
do tipo dienóide (I) e alquenóide (II)
Fonte: SARRAGIOTTO, 1981.
Um terceiro grupo de alcalóides eritrínicos inclui: erisodienona, 3-
desmetoxi eritratidinona, α-eritroidina e β-eritroidina (Figura 4) (AMER; SHAMMA;
FREYER, 1991).
36
Erisodienona 3-desmetoxi eritratidinona
α-eritroidina β-eritroidina
Figura 4 – Estruturas químicas de alcalóides eritrínicos
Fonte: SARRAGIOTTO, 1981
Também foram isolados de espécies de Erythrina alguns alcalóides
que não apresentam o esqueleto eritrínico: orientalina, N-noorientalina,
protosinomenina, N-norprotosinomenina, isoboldina, eribidina, scourelina,
coreximina, hipaforina, colina (FLAUSINO-JUNIOR, 2006).
Da E. variegata foram isolados alcalóides deste gênero como
erisotrina, erisodina, erisovina, eritralina, erisopina, erisonina, erisopitina,
eritratina, hipaforina (GHOSAL; DUTTA; BHATTACHARYA, 1972), sendo que a
erisodina e erisovina são os mais amplamente distribuídos (GARCIA-MATEOS;
SOTO-HERNANDEZ; KELLY,1998).
A erisotrina, eritrartina, hipaforina, N-óxido de erisotrina, N-óxido de
eritrartina foram isolados do extrato etanólico preparado com as flores secas de E.
37
mulungu, sendo que os três primeiros compostos são de ocorrência comum nesta
espécie de Erythrina. Dos dois últimos compostos não foi excluída a possibilidade
de serem artefatos, mas considerando o processo de extração e o material
vegetal utilizado, foi definido que são produtos naturais do metabolismo da
espécie (SARRAGIOTTO; LEITÃO FILHO; MARSAIOLI, 1981; SARRAGIOTTO,
1981).
Foram isolados dois novos alcalóides glucodienóides: o (+)-16β-D-
lucoerisopina e (+)-15β-D-glucoerisopina das sementes de E. latíssima
(WANJALA; MAJINDA, 2000). Flavonas e isoflavonas preniladas foram isoladas
da E. vogelii, a saber, vogelin A, vogelin B, e vogelin C, vogelin H, vogelin I,
vogelin J (WAFFO et al., 2006; ATINDEHOU et al., 2002). Um novo alcalóide foi
isolado das flores da E.herbacea: o 10-hidroxi-11-oxyerysotrine (TANAKA et al.,
2008). FLAUSINO et al., (2007) a partir do extrato hidroalcoólico das flores de E.
mulungu isolou um novo alcalóide eritrínico, a (+)-11 α – hidroxi-eritravina, e dois
já conhecidos, a (+) – eritravina e (+) – α – hidroxi-erisotrina.
Da Erythrina velutina isolou-se a (+)-eritralina e a (+)-eritratina (Tabela
1) (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991). Um novo isoflavonóide, a erivelutinona ((-
)2’, 4’-dihidroxi-6-prenil-7-metoxiisoflavona), foi isolada, pela primeira vez, da
casca da Erythrina velutina como uma goma marrom-amarelada, e a 4’- O -
metilsigmoidina (Tabela 1) (DA-CUNHA, 1996). Um estudo de fracionamento
químico realizado com o extrato etanólico da casca da Erythrina velutina foram
identificados a homoesperitina e faseolidina (Tabela 1) (RABELO et al., 2001).
VIRTUOSO et al. (2005) realizaram um estudo com o extrato etanólico da casca
da Erythrina velutina onde a análise do cromatograma da amostra fração
hexânica obtido no cromatógrafo a gás evidenciou a presença de ácido fênico,
38
ácido cinâmico, α – amirina, estigmasterol, β – amirina, β – sitosterol e lupeol. No
extrato metanólico das sementes da Erythrina velutina, foi isolado hipaforina, um
alcalóide indólico (OZAWA et al., 2008). Em 2009, OZAWA et al. isolaram das
sementes um novo alcalóide: o N- óxido de erisodina (Tabela 1). Também das
cascas do caule de Erythrina velutina foi isolado por CABRAL (2009), um
triterpeno do tipo oleanano (3β-Olean-12-ene-3,28-diol), um alcalóide do tipo
eritrínico (erisovina) e três flavonóides: um pterocarpano (faseolidina), uma
flavona prenilada (4’-O-metil sigmoidina B) e um isoflavonóide glicosilado (7-O-[α-
ramnopiranosil-β-glicopiranoside]-genisteina), sendo esse último composto
relatado pela primeira vez no gênero Erythrina (Tabela 1).
Tabela 1 – Estruturas químicas dos compostos isolados da Erythrina velutina
(+) – eritralina
(+) - eritratina
Erivelutinona
4’-O-metilsigmoidina
39
Continuação da Tabela 1
Homoesperitina
Faseolidina
Hipaforina
N- óxido de erisodina
7-O-[α-ramnopiranosil-β-glicopiranoside]-genisteina
As plantas da Família-Fabaceae (Leguminosae – Papilionoideae)
possuem sementes ricas em lectinas, proteínas de natureza não-imunoglobulina
capazes de reconhecimento específico e ligação reversível a carboidratos. Seu
papel nas plantas não está bem estabelecido. MORAES et al. (1996), extraiu
lectina das sementes de Erythrina velutina e demonstrou indução da migração de
neutrófilos na cavidade peritoneal e bolsa de ar dorsal de ratos.
Em trabalho realizado com o extrato aquoso das folhas de Erythrina
velutina, CARVALHO et al. (2009), constataram a presença de diferentes classes
químicas tais como alcalóides, catequinas, esteróides, flavonóis, flavonas,
flavonóides, fenóis, saponinas, taninos, triterpenóides e xantonas.
O
OOH
OH
O
O
H
H O
H
HO
H
OHH
O
O
H
HO
H
H O
H
OHH
H 3C
78
6
29
105 4
3
4'
3'
6'
5'
1'2'
1'''
6''
3''1''2''
5''
2'''
5'''
3'''
4' ''6 '''
4 ''
40
Muitos estudos fitoquímicos mostram que as espécies do gênero
Erythrina possuem compostos que pertencem a outras classes químicas, tais
como isoflavanonas, isoflavonas e pterocarpanos, dentre os derivados não-
alcaloídicos (NKENGFACK et al., 1994). Isso vem demonstrar que este gênero é
uma fonte de substâncias biologicamente ativas.
2.5 Atividades farmacológicas
De acordo com GARIN-AGUILAR (2000), os efeitos anticonvulsivantes,
hipotensivos, hipnóticos e anestésicos (CRAIG, 1981; HARGREAVES et al., 1974;
GHOSAL et al., 1972) do curare são semelhantes aos efeitos dos alcalóides
extraídos da Erythrina americana, que foram descritos por Altamirano e
Domingues em 1888 (FOLKERS & MAYOR, 1937; LEHMAN, 1936) e confirmados
por RAMÍREZ & RIVERO em 1935.
ROGER et al. (2001) em um estudo com o extrato bruto de Erythrina
vespertilio, mostraram sua atividade sobre o sistema serotonérgico inibindo a
liberação cálcio-dependente de serotonina plaquetária, uma das principais
atividades dos antagonistas de receptores 5-HT3.
Segundo BARROS (1970) o extrato aquoso e etanólico das cascas de
Erythrina velutina utilizados em testes farmacológicos na concentração de 1:1,
apresentaram resultados significativos. No extrato etanólico aplicado em gatos,
sintomas, tais como depressão da respiração e da pressão sanguínea foi
reportada. Para o extrato aquoso observou-se estímulo respiratório. Quando
ambos os extratos foram utilizados em sapos, observou-se depressão da
atividade do músculo cardíaco, inibição das contrações musculares induzidas em
uma preparação de músculo abdominal de sapo. Já em coelhos observou-se,
41
inibição da motilidade e tônus de uma preparação de duodeno para ambos os
extratos e, forte atividade inibidora de contrações uterinas induzidas por ocitocina.
Estudos farmacológicos com Erythrina velutina em animais de
laboratório constataram uma atividade espasmolítica significativa do extrato bruto
hidroalcoólico, como também atividade curarizante, antimuscarínica e depressora
do sistema nervoso central, compatíveis com as propriedades preconizadas pela
medicina popular para esta planta (LORENZI & MATOS, 2002).
Estudos realizados por VASCONCELOS et al. (2003) com o extrato
hidroalcoólico da casca de Erythrina velutina e E. mulungu apresentaram efeitos
antinoceptivos significantes em diferentes modelos experimentais e, que os
efeitos analgésicos destas plantas são independentes do sistema opióide. Em
contra partida, em 2004, esses pesquisadores avaliaram os efeitos no
comportamento de ratos em estudo com os mesmos extratos demonstrando
redução da atividade locomotora após tratamento intraperitoneal (i.p.), no teste de
cruz elevado, campo aberto e de coordenação motora (rota rod).
Em 2004, DANTAS et al. testaram o extrato aquoso das folhas de
Erythrina velutina em roedores e apresentou aumento do sono induzido por
pentobarbital de maneira dose-dependente indicando efeito sedativo, hipnótico e
diminuição da atividade motora. Um dos dados mais significativos refere-se à
interferência com os processos mnemônicos em baixas doses. De acordo com o
trabalho de MARCHIORO et al. (2005) o extrato aquoso das folhas de Erythrina
velutina no teste do edema de pata não inibiu o processo inflamatório. Na placa
quente não houve diferença estatística na latência quando comparado ao
controle. Porém, tanto no modelo da formalina, quanto do ácido acético, os
42
resultados aproximaram-se dos obtidos por VASCONCELOS et al. (2003). Além
disso, o antagonista opióide naloxona reverteu o efeito do extrato na maior dose.
RIBEIRO et al. (2006) pesquisando os efeitos do extrato hidroalcoólico
da casca da Erythrina velutina e E. mulungu em ratos submetidos a modelos de
animais de ansiedade e depressão demonstraram efeito do tipo ansiolítico no
labirinto em T similar ao diazepam, controle positivo. O estudo mostrou também
que tanto a atividade locomotora no campo aberto, como o tempo de imobilidade
na natação forçada, não foi alterada em nenhuma das doses, após administração
aguda ou crônica.
SANTOS et al. (2007) em trabalho realizado com o extrato aquoso das
folhas da Erythrina velutina sobre ducto deferente de rato, observaram que o
extrato aquoso inibiu as contrações induzidas por estímulo elétrico de campo de
maneira dependente da concentração. VASCONCELOS et al. (2007) pesquisando
os efeitos anticonvulsivantes no extrato hidroalcoólico da casca de Erythrina
velutina (v.o. e i.p.) e E. mulungu (i.p.), utilizaram o teste das convulsões
induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ), estricnina sugerindo ação depressiva do
sistema nervoso central. RAUPP et al. (2008) utilizando modelos experimentais
de ansiedade em camundongos, quando administrado de forma crônica o extrato
hidroalcoólico da casca da Erythrina velutina sugeriu exercer efeito ansiolítico.
OZAWA et al. (2008) avaliaram o tempo de sono em camundongos administrando
hipaforina, um alcalóide indólico, presente em Erythrina velutina. O presente
estudo confirmou a indução do sono.
TEIXEIRA-SILVA et al. (2008) testaram os efeitos semelhantes dos
benzodiazepínicos utilizando o extrato alcoólico das folhas da Erythrina velutina,
em modelos animais que avaliam a ansiedade, memória e epilepsia. Os efeitos
43
observados para o extrato alcoólico no sistema nervoso dos roedores
assemelharam-se ao perfil dos efeitos dos benzodiazepínicos e podem ser
interpretados pela interação do extrato com os sistemas gabaérgicos.
CARVALHO et al. (2009) investigaram as evidências farmacológicas do
mecanismo de ação da Erythrina velutina a partir do extrato aquoso das folhas,
cujos constituintes são importantes para as atividades farmacológicas.
Observa-se que grande parte dos trabalhos realizados utilizam extratos
brutos de diferentes espécies de Erythrina, sem, no entanto, realizar a verificação
dos compostos envolvidos nas atividades observadas.
2.6 Aspectos toxicológicos do gênero e espécie
Os estudos de genotoxicidade com plantas têm crescido juntamente
com o aumento do uso terapêutico e com o interesse de comprovação da eficácia
das mesmas nas mais diversas finalidades farmacológicas. Isso se deve ao fato
de muitas das plantas utilizadas por um grande número de pessoas, apesar de
possuírem propriedades farmacológicas, também podem causar alterações no
DNA (VARANDA, 2006). Apesar da importância, poucos são os estudos
toxicológicos que comprovam a segurança do uso da Erythrina velutina Willd.
Em um trabalho feito com o extrato aquoso das folhas de Erythrina
velutina, BONFIM (2001) demonstrou o caráter possivelmente atóxico, em um
estudo de toxicidade aguda pré-clinica em todos os animais que sobreviveram à
administração de 5 g/Kg do extrato. O referido trabalho não atendeu a todas as
recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para a
realização de estudos de toxicidade pré-clinica de fitoterápicos (ANVISA-
44
Resolução RE No 90,16 de Março de 2004). CRAVEIRO et al. (2008)
demonstraram que não houve toxicidade aguda a partir do extrato aquoso de
folhas de Erythrina velutina em ratos Wister tratados por via oral. Nenhum animal
veio a óbito e nenhum sinal de toxicidade foi detectado nas observações
comportamentais ou nas autópsias, indicando uma razoável atoxicidade do
extrato.
OLIVEIRA et al. (2008) avaliaram em ratos, por meio do teste do
micronúcleo em células hematopoiéticas, o possível efeito genotóxico do extrato
alcoólico das folhas de Erythrina velutina. Os resultados obtidos demonstraram
que a incidência de eritrócitos policromáticos micronucleados observada nos
tratamentos não diferiu da incidência gerada pela formação espontânea do
micronúcleo. Portanto, a ingestão do extrato das folhas da Erythina velutina nas
concentrações testadas não apresentam potencial genotóxico.
Os dados obtidos nesses trabalhos de toxicidade e genotoxicidade com
a Erythrina velutina, mostram a necessidade de estudos, não apenas, com o
extrato bruto, como também com compostos isolados da planta.
2.7 Aspectos da atividade antimicrobiana do gênero e espécie
As primeiras observações acerca da utilização de produtos naturais
com atividade antimicrobiana remontam aos tempos da Babilônia, 3000 anos a.C.,
quando portadores de feridas infeccionadas usavam o alho Allium sativum L.
(Liliaceae), na forma de cataplasma para a cura de suas chagas (CAVALLITO &
BAILEY, 1944). Ao longo da história muitas foram às personalidades que
buscaram identificar propriedades antimicrobianas na natureza.
45
Na atualidade, os fármacos usados no tratamento de doenças
causadas por bactérias e fungos são denominados agentes antimicrobianos. Este
termo, introduzido com a descoberta da penicilina por Fleming em 1928, foi
considerado o primeiro antibiótico a ser produzido em escala industrial (PEREIRA
& PITA, 2005). Os antimicrobianos contribuíram de forma decisiva para a
diminuição das taxas de morbidade e mortalidade, particularmente das doenças
infecciosas de origem bacteriana. A partir da introdução da penicilina e da
sulfonamida, ocorreu um crescente progresso no isolamento e no
desenvolvimento de agentes antimicrobianos utilizados na terapia e na profilaxia
das patologias decorrentes da ação dos microorganismos (SILVA, 2006).
Ao longo das últimas décadas, o avanço da indústria farmacêutica
levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com espectro de ação cada vez
mais amplo. Entretanto, a exposição aos antimicrobianos desencadeou
resistência bacteriana, limitando as opções terapêuticas dos processos
infecciosos.
O uso indiscriminado dos antimicrobianos e a administração de forma
não controlada, juntamente com o aumento da prevalência das doenças
imunossupressoras têm sido as mais importantes causas da resistência aos
antimicrobianos. Os principais mecanismos de resistência são desencadeados
pela inativação enzimática; modificações nos receptores, devido a mudanças
ribossômicas e de DNA girase, alterações de enzimas bacterianas e fúngicas,
mudanças no transporte do antimicrobiano, nas proteínas da membrana externa,
na força protônica reduzida e transporte ativo a partir da célula microbiana
(SILVA, 2006). A busca de novas alternativas que possam substituir ou melhorar
os antimicrobianos disponíveis é urgente, e uma das fontes de pesquisa é
46
representada pelos produtos de origem natural. Grande parte dos antimicrobianos
em uso (penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos, entre outros) são derivados
de metabólitos secundários de fungos e bactérias. É possível que da mesma
forma, existam metabólitos provenientes de espécies vegetais com propriedades
semelhantes e que futuramente possam substituir os medicamentos outrora
eficientes. O antimicrobiano ideal, objeto permanente de pesquisa, é aquele que
apresenta atividade letal ou inibitória contra diferentes espécies de
microorganismos, não provoque efeitos colaterais, seja quimicamente estável e
não induza resistência microbiana (SCHENKEL et al., 2007).
Logo, a busca de propriedades antibacterianas a partir de extratos de
plantas e substâncias mais seletivas tem sido incentivada e intensificada
(MIGUEL & MIGUEL, 2004). Sendo assim, entre inúmeros gêneros vegetais a
serem investigados destaca-se o gênero Erythrina, que apresenta em sua
composição química uma grande diversidade de metabólitos secundários
bioativos.
O extrato da planta africana E. abyssinica demonstrou atividade contra
leveduras e fungos, sendo que a eritroabissin-I e faseolina, isolados desta
espécie, tiveram atividade antilevedura contra Sacharomyces cerevisae e
Candida utilis com concentração inibitória mínima (CIM) entre 25-50 µg/mL e
atividade antifúngica contra Sclerotinia lebertiana, Mucor mucedo, Rhizopus
chinensis com CIM entre 6-25 µg/mL (NAKANISHI, 1982).
O gênero Erythrina tem provado ser uma fonte farta de espécies
contendo agentes antimicrobianos que pertencem a várias classes estruturais de
flavonóides. Raízes de E. variegata demonstraram atividade contra Staphyloccus
aureus e Mycobacterium smegmatis (TELIKEPALLI et al., 1990). Também das
47
raízes da E. variegata L. foi isolado um isoflavonóide, a ericristagallin, que é um
potente agente antibacteriano contra Streptococcus mutans, sendo usado para
prevenção da cárie dental (SATO et al., 2002). TANAKA et al., (2002) mostrou
que os isoflavonóides ericristagallin e orientanol B, isolados da E. variegata
apresentam alta atividade antibacteriana quando testados contra cepas de
Staphyloccus aureus resistentes a meticilina com valores de concentração
inibitória mínima (CIM) entre 3,13-6,25 µg ml-1. Posteriormente, também dessa
mesma espécie foi isolada isoflavanona bidwillon B e foi demonstrada atividade
contra Staphyloccus aureus resistentes a meticilina (SATO et al., 2004).
Os extratos metanólico e diclorometano de E. vogelii mostraram
propriedades antifúngicas contra Cladosporium cucumerinum no ensaio direto de
autobiografia (ATINDEHOU et al., 2002.). Os isoflavonóides cinnamilfenol e
eripostirene, isolados das raízes de E. poeppigiana, possuem atividade
antilevedura contra cepa de Candida albicans e atividade antibacteriana contra
cepa de Staphyloccus aureus resistentes a meticilina (SATO et al. 2003; TANAKA
et al., 2004).
A partir do tronco de madeira da E. latissima, duas isoflavonas e uma
flavanona foram isoladas e caracterizadas como 7,3’-dihidroxi-4’-metóxi-5’-(γ,γ-
dimetillalil) isoflavona (erilatissin A), 7,3’-dihidróxi-6’’,6’’-dimetil-4’’,5’’-
dehidropirano [2’’,3’’:4’,5’] isoflavona (erilatissin B), (-) -7,3’-dihidróxi-4’-metóxi 5’
(γ,γdimetillalil) flavanona (erilatissinC), respectivamente, além dos 10 conhecidos
flavonóides. Estes compostos mostraram atividade antimicrobiana contra
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida mycoderma
(CHACHA; BOJASE-MOLETA; MAJINDA, 2005).
48
Os flavonóides isolados da casca do caule de E. burttii apresentaram
atividade contra fungos e bactérias gram positivas, contudo, a bactéria
Escherichia coli (gram negativa) mostrou-se resistente (YENESEW et al., 2005).
Sete pterocarpanos, eribraedin B, eribraedin A, faseollin, eritrabissin II,
eristagallin A, eritrabissin-1 e ericristagallin, duas flavanonas, 5-hidroxisoforanona
e glabrol, e uma isoflavona, erisubin F, foram isolados do caule de E.
subumbrans. Os compostos eribraedin A e eritrabissin II apresentaram o mais alto
grau de atividade contra cepas de Streptococcus, com a concentração inibitória
mínima (CIM) de 0,78-1,56 µg/ml, enquanto o composto ericristagallin apresentou
o maior grau de atividade contra cepas de Staphylococcus aureus, incluindo
cepas resistentes à meticilina com um CIM de 0,39-1,56 µg/ml. Curiosamente, os
compostos eribraedin A, eritrabissin II, eristagallin A e ericristagallin foram mais
ativos contra as cepas testadas quando comparados aos antibióticos controle
(vancomicina e oxacilina) (RUKACHAISIRIKUL et al., 2007).
A atividade antibacteriana da Erythrina velutina é pouco estudada.
VIRTUOSO et al. (2005) realizaram um estudo preliminar da atividade
antibacteriana das cascas de Erythrina velutina onde foram utilizados os métodos
de difusão em disco e concentração inibitória mínima para o extrato etanólico
bruto e para a fração hexânica, contra oito bactérias patogênicas. Nesse trabalho
demonstrou-se que a presença de atividade antibacteriana dos produtos vegetais
sobre Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. Nenhuma atividade foi
observada sobre as outras bactérias testadas por difusão em ágar. Foi registrada
atividade moderada contra todos os microorganismos no teste de concentração
inibitória mínima para o extrato bruto e fração hexânica das cascas de Erythrina
velutina.
49
De acordo com o levantamento bibliográfico realizado, não foi relatada,
até o presente momento, a investigação da atividade antimicrobiana das folhas da
Erythrina velutina.
50
III. OBJETIVOS
3.1 Geral
Analisar a composição química do extrato metanólico das folhas de
Erythrina velutina Willd e verificar seu efeito farmacológico e antimicrobiano.
3.2 Específicos
- Isolar e identificar os constituintes químicos presentes no extrato
metanólico das folhas de Erythrina velutina Willd;
- Investigar o potencial efeito psicofarmacológico do extrato
metanólico bruto e das fases orgânicas de Erythrina velutina Willd;
- Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico bruto
e das fases orgânicas de Erythrina velutina Willd;
- Contribuir com a quimiotaxonomia do gênero Erythrina.
51
IV. EXPERIMENTAL
4.1 Especificações dos materiais e equipamentos
Aparelhos utilizados
- Estufa de ar circulante (MARCONI MA-037)
- Moinho (TECNAL TE-650)
- Evaporador rotativo (FISATOM 801)
- Lâmpada de ultravioleta VILBER LOURMAT, modelo CN-6
- Espectrômetro de RMN da marca MERCURY-VARIAN
- Espectrômetro de RMN da marca INOVA – Varian
Reagentes e outros materiais utilizados
- Todos os reagentes utilizados são de grau de pureza analítico e da
marca Synth ou Sigma-Aldrich.
- Sílica gel 60, ART 7734 da MERCK (0,063-0,200 mm).
- Óxido de Alumínio 90 (MERCK – pH 9,0-10,0).
- Tiras com indicadores coloridos para medir pH (Macherey-Nagel).
Métodos cromatográficos
Na cromatografia em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60, ART 7734
da MERCK, de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm e Óxido de
Alumínio 90 (MERCK – pH 9,0-10,0), tendo como suporte colunas de vidro
cilíndricas cujas dimensões variaram de acordo com a quantidade de amostra a
ser cromatografada. Para cromatografia em camada delgada (CCD), foi usada
sílica gel 60 PF254 ART 7749 da MERCK, distribuída sobre placas de vidro com
ajuda de um espalhador mecânico tipo quick fit, seguindo técnica descrita por
52
MATOS (1997). As cromatoplacas obtidas foram secas ao ar livre e ativadas em
estufa a 110 ºC durante 1 hora.
As revelações das substâncias na cromatografia em camada delgada
analítica (CCDA) foram executadas pela exposição das placas à lâmpada de
irradiação ultravioleta (UV) com comprimento de onda (254 nm) por meio de
lâmpada de ultravioleta VILBER LOURMAT, modelo CN-6 e/ou pela pulverização
com uma solução de ácido sulfúrico a 5% em etanol seguida de aquecimento. O
grau de pureza das substâncias foi evidenciado por cromatografia em camada
delgada analítica (CCDA), determinando-se a pureza quando observada uma
única mancha após revelação.
Na preparação das placas cromatográficas para a realização da
cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foi usada sílica gel 60
PF254 ART 7749 da MERCK, distribuída sobre placas de vidro com ajuda de um
espalhador mecânico tipo quick fit. A camada de sílica gel na placa foi de 1,0 mm
de espessura (MATOS, 1997). As cromatoplacas obtidas foram secas ao ar livre e
ativadas em estufa a 110 ºC durante 1 hora.
Como fases móveis foram usados os solventes hexano, clorofórmio,
acetato de etila e metanol, isoladamente ou em misturas binárias em gradiente
crescente de polaridade.
Métodos espectrométricos
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN
1H) e
Ressonância Magnética Nuclear de 13C (RMN13C) foram obtidos em
espectrômetro da marca MERCURY-VARIAN (LTF/UFPB) operando a 200 MHz
(1H) e 50 MHz (13C) e INOVA – Varian (Instituto de Química da UNESP de
Araraquara-SP) operando a 300 MHz (1H) e 75 MHz (13C).
53
As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se uma
pequena quantidade em solvente deuterado da Cambridge Isotope Laboratories
(CDCl3 e DMSO-d6). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes
por milhão (ppm) e foram referenciados para RMN1H pelos picos característicos
dos hidrogênios pertencentes às frações não deuteradas destes solventes:
clorofórmio (δH 7,24) e DMSO-d6 (δH 2,50 ppm). Para os espectros de RMN13C,
estes mesmos parâmetros foram utilizados: clorofórmio (δC 77,0) e DMSO-d6 (δC
39,50 ppm). Os dados foram obtidos em DMSO-d6 quando o aparelho utilizado foi
INOVA – Varian.
As multiplicidades das bandas de RMN1H foram indicadas segundo as
convenções: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (triplo dupleto), m
(multipleto).
4.2 Estudo fitoquímico
4.2.1 Coleta e identificação do material botânico
Foram coletadas as folhas de Erythrina velutina Willd no município de
Simão Dias (10º 47’ 8,12832” S, 37º 46’ 6,2346” O), Estado de Sergipe, Brasil,
durante o mês de Janeiro de 2009. A identidade botânica da planta foi confirmada
pelo biólogo, Dr. Antônio Celso de Freitas, através da comparação com uma
exsicata que se encontrava depositada no Herbário da Universidade Federal de
Sergipe sob o registro ASE 4126.
4.2.2 Preparação do extrato metanólico de folhas secas de Erythrina
velutina (EMEv)
54
As folhas de Erythrina velutina foram completamente desidratadas em
estufa de ar circulante a uma temperatura de 40ºC e depois trituradas em moinho
até sua transformação em pó fino (5 Kg). O pó fino (4054 g) foi submetido à
extração, até exaustão do material vegetal, por processo de maceração (72
horas) sucessivas com metanol contendo 2% de hidróxido de amônio PA. Em
seguida, o extrato foi filtrado e concentrado com auxilio de um evaporador
rotativo, resultando em 567,19 g de extrato metanólico bruto (Esquema 1).
4.2.3 Fracionamento do extrato metanólico
O processo foi realizado em funil de separação usando solventes de
ordem de polaridade crescente. Suspendeu-se o extrato metanólico bruto (EMEv
65 g) em uma solução metanol/água (7:3). O extrato suspendido (solução
hidrometanólica) foi submetido a uma partição líquido/líquido, sob agitação
manual de forma exaustiva e sucessiva, utilizando hexano (4 L), acetato de etila
(3 L) e n–butanol (1,5 L), respectivamente. Após a evaporação dos solventes em
evaporador rotativo obteve-se a fase hexânica (FHEX) (20 g), fase acetato de etila
(FACET) (13,0 g) e fase n-butanólica (F-NBU) (7,35 g). O resíduo final foi
denominado fase hidrometanólica remanescente (FHMET) (Esquema 1).
55
Esquema 1: Obtenção e particionamento do extrato bruto das folhas de Erythrina
velutina (EMEv)
Fase hexânica (20 g)
Folhas secas e pulverizadas(4054 g)
MeOH + 2% de NH4OHConcentração a vácuo
Extrato metanólico bruto(567,19 g)
Acetato de etila
Solução hidrometanólica
Fase hidrometanólica I
EMEv (65 g)MeOH / H2O (7:3)
Hexano
Fase hidrometanólica II Fase acetato de etila (13 g)
n -Butanol
Fase hidrometanólica III Fase n -butanólica (7,35 g)
4.2.4 Características organolépticas e pH
Foram observadas as seguintes características organolépticas do
extrato metanólico bruto: cor e odor. O pH foi verificado através do uso de tiras
com indicadores coloridos (Macherey-Nagel).
56
4.2.5 Prospecção fitoquímica do extrato metanólico bruto da Erythrina
velutina Willd
A pesquisa dos metabólitos secundários foi realizada através de testes
de prospecção fitoquímica de acordo com metodologias adaptadas de MOREIRA
(1979), MATOS (1997), COSTA (2000) e MIGUEL & MIGUEL (2004),
empregando reações de grupos funcionais da molécula. Esta triagem tem como
objetivo sistematizar ou rastrear os principais grupos de constituintes químicos
que compõem o extrato vegetal, através de um exame qualitativo rápido, no qual
se utiliza reagentes de coloração ou precipitação.
Os constituintes do metabolismo secundário pesquisados foram:
alcalóides, quinonas, taninos, flavonóides, glicosídeos saponínicos,
leucoantocianidinas, esteróides e triterpenos.
O extrato metanólico bruto (1,0 g) foi suspenso em uma solução de
metanol/água (7:3) sob agitação mecânica, obtendo-se uma solução
hidrometanólica (150 mL). A partir dessa solução foram realizados os seguintes
testes fitoquímicos:
a) Identificação de alcalóides
Em quatro tubos de ensaio adicionou-se 1 mL da solução
hidrometanólica de Erythrina velutina, acrescentou-se 3 gotas de ácido clorídrico
a 1% em cada tubo. Agitou-se. Adicionou-se 2 gotas dos reativos de precipitação:
Dragendorff (iodo bismutato de potássio), Bertrand (ácido sílico túngstico),
Bouchardat (solução aquosa de iodo em iodeto de potássio) e Mayer (iodo -
mercurato de potássio), respectivamente. Os tubos foram agitados. Observa-se o
aparecimento de precipitado e/ou a mudança da coloração da solução.
57
b) Identificação de quinonas (Reação de Bornträger Direta)
Em tubo de ensaio foi colocado a solução hidrometanólica de Erythrina
velutina (1,0 mL), adicionando-se 5 mL de amônia diluída 10%. Após agitação,
verificou-se a coloração da solução.
c) Identificação de glicosídeos saponínicos
Definiu-se o índice de espuma em 10 tubos de ensaio contendo
diluições sucessivas do extrato metanólico em análise. O ensaio baseou-se, após
agitação vigorosa no sentido longitudinal durante 15 segundos, no aparecimento
de espuma persistente de pelo menos 1 cm de altura, após 15 minutos de
descanso.
d) Identificação de taninos
Da solução hidrometanólica, foram retiradas alíquotas de 5 mL para a
realização de cada uma das reações abaixo relacionadas, onde observou-se a
intensidade e tonalidade da coloração adquirida pela solução ou precipitado
quando foi adicionado o reativo.
Reação com sais de ferro: À solução hidrometanólica juntou-se cerca
de 5 mL de água e algumas gotas de solução de cloreto férrico a 1% em água,
observando-se a formação e coloração do precipitado.
Reação com acetato de chumbo: Foram adicionadas a solução
hidrometanólica 5 gotas de solução aquosa a 10% de acetato neutro de chumbo,
anotando-se a cor do precipitado formado.
Reação com alcalóides: À solução com taninos foi adicionada uma gota
de solução de ácido clorídrico a 10% e algumas gotas de solução de sulfato de
atropina a 0,1%. Verificou-se a formação ou não de precipitado.
58
Reação com dicromato de potássio: Em um tubo de ensaio, contendo a
solução hidrometanólica do extrato, gotejou-se 5 gotas de solução de dicromato
de potássio.
e) Identificação de flavonóides
Para a identificação de flavonóides procederam-se as seguintes
reações de identificação:
Reação de Shinoda: Adicionou-se a 2 mL da solução hidrometanólica
uma pequena alíquota de magnésio metálico e 1 mL de ácido clorídrico
concentrado. Observou-se a mudança de cor.
Reação com hidróxidos alcalinos: Adicionou-se 0,5 mL de solução de
hidróxido de sódio 1 M em alguns mililitros da solução hidrometanólica em tubo de
ensaio de Erythrina velutina.
Reação com sais de ferro: A solução hidrometanólica (5 mL) foram
acrescentadas algumas gotas de solução de cloreto férrico a 1% em água. Em
seguida, observou-se mudança na coloração (azul, verde, marrom ou vermelho).
f) Pesquisa de leucoantocianidinas
Levou-se 10 mL da solução hidrometanólica de Erythrina velutina a
secura em banho-maria e adicionou-se 5 mL de álcool etílico e cinco gotas de HCl
concentrado. Em seguida, o material foi aquecido à ebulição. A reação é positiva
se houver a reação de redução da leucoantocianidina (de coloração amarela) em
antocianidina em presença de ácido clorídrico, confirmada pela formação de
coloração vermelha.
g) Pesquisa de esteróides e triterpenos - reação de Liberman Bouchard
59
Levou-se a secura 30 mL da solução hidrometanólica de Erythrina
velutina em banho-maria e com auxílio de bastão de vidro dissolve-se 5 mL de
clorofórmio, filtrando em seguida. O extrato clorofórmico foi pipetado para três
tubos de ensaio nos volumes de 0,1 mL; 0,5 mL e 1,0 mL, e completou-se para 2
mL com clorofórmio. Em capela efetuou-se a reação de Liberman Bouchard
adicionando lentamente 1,0 mL de anidrido acético e 2,0 mL de ácido sulfúrico.
Observa-se a formação de coloração que passa por azul, verde, vermelho e
alaranjado que se modificam com o tempo em várias tonalidades (esteróides),
enquanto que a coloração é estável para os triterpenos.
4.2.6 Marcha para alcalóides
Uma parte do extrato metanólico bruto (452,18 g) foi dissolvido em
solução aquosa de ácido clorídrico (10%) e filtrado em funil de placa porosa. A
fase aquosa ácida foi submetida à extração líquido/líquido com clorofórmio
(CHCl3). A fase orgânica, fase clorofórmica ácida (FCA), foi separada da fase
aquosa. Em seguida, a fase aquosa ácida foi basificada com hidróxido de amônio
(NH4OH) a 10% em volume suficiente para atingir pH entre 8-9 e submetida
novamente à extração com CHCl3. A fase orgânica foi separada e evaporada,
resultando na fase clorofórmica básica (FCB) (1,0522g). A fase aquosa foi ainda
submetida a uma extração com n-butanol. A fase orgânica foi separada,
evaporada, resultando na fase n-butanólica básica (FNB) (33,58g). (Esquema 2)
60
Esquema 2: Marcha para alcalóides do extrato metanólico bruto de Erythrina
velutina Willd.
Extrato metanólico seco452,18 g
Resíduo Extrato aquoso ácido I
Fase clorofórmica ácida Extrato aquoso ácido II
Extrato aquoso básico
Fase n -butanólica básica33,580 g
Fase clorofórmica básica1,052 g
HCl a 10%Filtração a vácuo
Extração com CHCl3
NH4OH a 10%pH = 8 - 9
n -butanolCHCl3
I II
4.2.7 Isolamento dos constituintes químicos
4.2.7.1 Fase n-butanólica básica (FNB)
A fase n-butanólica básica (2 g) foi submetida à cromatografia em
coluna (CC), utilizando alumina básica como fase estacionária, clorofórmio e
metanol em misturas binárias, como fase móvel. A eluição da coluna foi realizada
empregando clorofórmio/metanol (95:5 – 1:1), a qual forneceu 30 frações de
aproximadamente 20 mL. Na proporção (9:1) coletou-se as frações 1 a 11. Na
proporção (8:2) coletou-se as frações 12 a 16. Na proporção 1:1 coletou-se as
frações 17 a 30.
61
Para o monitoramento das frações coletadas na coluna, foi utilizada a
CCDA, sendo utilizadas e reunidas de acordo com os seus fatores de retenção
(RF), após a visulização na luz ultravioleta e borrifamento de uma solução de
ácido sulfúrico a 5% em etanol.
Após revelação das placas, as amostras que possuíram mesmo RF,
foram reunidas. A amostra FNB 10-16 (23,5 mg) apresentou pureza satisfatória e
foi submetida à análise de RMN1H e 13C, (Esquema 3).
Esquema 3: Isolamento do ácido nicotínico da fase n-butanólica básica das
folhas de Erythrina velutina Willd
FNB 2-4 FNB 5-8 FNB10-1623,5 mg
FNB 17-19 FNB 21-30
Fase n -butanólica básica (2 g)
4.2.7.2 Fase acetato de etila e isolamento de seus constituintes químicos
(FACET)
A fase acetato de etila (1,400 g) foi submetida a cromatografia em
coluna (CC), utilizando-se sílica gel como fase estacionária e hexano, acetato de
etila e metanol, puros ou em misturas binárias, como fase móvel. Foram coletadas
120 frações. A eluição inicial da coluna foi realizada empregando hexano/acetato
de etila na proporção 8:2, a qual forneceu as frações F1 e F2. Em seguida,
empregou-se o sistema hexano/acetato de etila na proporção 1:1, o qual forneceu
as frações F3, F4, F5, F6, F7. Para a eluição hexano/acetato de etila 2:8,
obtiveram-se as frações F8 a F41. Aumentando a polaridade utilizando acetato de
62
etila puro obteve-se as frações F42 a 48. Empregando-se acetato de etila/metanol
95:5, 9:1 e 1:1 obteve-se as seguintes frações, respectivamente: F49 e F50; F51
a F75; F76 a F120. Para o monitoramento das frações coletadas na coluna, foi
utilizada a CCDA.
A visualização dos compostos foi feita por irradiação ultravioleta,
seguida por borrifamento de uma solução de ácido sulfúrico 5% em etanol. Após a
revelação das placas, as amostras que possuíram mesmo RF, foram reunidas.
Obteve-se sete frações reunidas: F1-3 (20 mg); F4-9 (11,6 mg); F10-16 (12 mg);
F17-18 (19,4 mg); F19-26 (23,4 mg); F42-60 (35,5 mg); F72-80 (8,5 mg)
(Esquema 4).
Após resultados de RMN1H a fração F17-18 (19,4 mg) foi submetida à
CCDP a fim de purificá-la. Utilizou-se hexano e acetato de etila (6:4) como
eluentes, obtendo-se duas subfrações: F17-18.1 e F17-18.2. A subfração F17-
18.1 (10 mg), apresentou-se como sólido marrom, que após análise por CCDA,
mostrou-se como única mancha e foi encaminhada para análise de RMN. A
subfração F17-18.2 (6,6 mg) apresentou-se como sólido marrom claro, que após
análise por CCDA mostrou-se como mancha esverdeada, que foi encaminhada
para análise de RMN (Esquema 4).
63
Esquema 4: Isolamento dos constituintes químicos da fase acetato de etila das
folhas de Erythrina velutina Willd.
F1-3 F4-9 F10-16 F42-60 F72-80
Fase Acetato de Etila(1,4 g)
F19-26F17-1819,4 mg
F17-18.1 F17-18.2
CCDP
4.3 Farmacologia
4.3.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss (machos e adultos), com 2-3
meses, pesando em média 25 g, provenientes do Biotério-UFS. Os animais foram
mantidos em caixas coletivas com alimentação e água ad libitum. No dia do
experimento os animais ficaram em jejum de seis horas. O presente protocolo (Nº
72/2009) de uso de animais está de acordo com os princípios éticos na
experimentação animal do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da
Universidade Federal de Sergipe, vide em anexo 1. Todos os experimentos foram
realizados conforme as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA).
64
4.3.2 Triagem psicofarmacológica preliminar
A triagem farmacológica comportamental representa uma avaliação
estimativa e preliminar das propriedades em nível do sistema nervoso central
(SNC) de uma substância em estudo, possibilitando o direcionamento da
pesquisa (ALMEIDA et al., 1999).
Grupos de 6 camundongos foram tratados (por via oral – v.o.) com a
fase n-butanólica básica (200 mg/kg), fase clorofórmica básica (200 mg/kg), fase
hexânica (200 mg/Kg), fase acetato de etila (200 mg/Kg), fase n-butanólica (200
mg/Kg), extrato metanólico bruto (400 mg/Kg) e comparados ao grupo controle
que recebeu tratamento do veículo utilizado para solubilizar o extrato e as fases
(uma mistura de solução salina/propilenoglicol a 0,1% - v/v) (v.o.). Após as
administrações todos os grupos de animais foram observados por um período de
4 horas quanto ao aparecimento ou mesmo alteração de uma série de
comportamentos que sugerem uma provável atividade no sistema nervoso
central, conforme protocolo experimental descrito por ALMEIDA et al. (1999)
(Anexo 2), onde foram comparados parâmetros como: ambulação, atividade geral,
irritabilidade, tremores, convulsão, agressividade, ptose palpebral, analgesia,
anestesia, piloereção, bocejo, contorções abdominais, sedação, ataxia, dentre
outros.
4.4 Procedimento experimental do ensaio antimicrobiano in vitro
A metodologia escolhida para o ensaio antimicrobiano in vitro foi o teste
de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, um método físico,
no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente
65
ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de
crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância
ensaiada (PINTO, KANEKO, OHARA, 2003).
O ensaio antimicrobiano foi realizado em colaboração com a Dr. Celuta
S. Alviano e a Dr. Daniela S. Alviano, do Departamento de Microbiologia
Professor Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Brasil.
4.4.1 Microorganismos utilizados
Foram utilizadas culturas puras de fungos Candida albicans Serotype B
ATCC 36802 (ATCC-American Type Culture Collection), Cryptococcus
neoformans T1-444 Sorotipo A (Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP-
SP), Trichophyton rubrum T544 e Aspergillus niger (Hospital Clementino Fraga
Filho, UFRJ); e as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus MRSA
(BMB 9393) (Hospital Clementino Fraga Filho, UFRJ).
4.4.2 Preparo do inóculo contendo os microorganismos
Em um tubo de ensaio contendo cultivo recente (máximo 24 h)
preparou-se o inóculo a partir de uma suspensão de cada microorganismo em
caldo BHI (Brain Heart Infusion) estéril. A concentração do inóculo foi ajustada de
modo a se obter 2x105 células/mL. O inóculo foi distribuído em placas de Petri
previamente preparados com meio BHI (Brain Heart Infusion) sólido com auxílio
de um swab estéril. Para retirar o excesso de material, o swab foi pressionado
acima do nível do líquido contra a parede interna do tubo contendo o inóculo. As
66
superfícies de cada placa de Petri contendo o meio BHI foram inoculadas
esfregando-se o swab em toda superfície do ágar.
4.4.3 Preparação do extrato bruto e fases orgânicas da Erythrina velutina
para os ensaios antimicrobianos in vitro
O extrato metanólico bruto, as fases hexânica, acetato de etila, n-
butanólica, clorofórmica básica e n-butanólica básica foram diluídas em DMSO
(Dimetilsulfóxido) atingindo a concentração de 50 mg/mL. Para o ensaio, cada
fase sofreu uma diluição de 1:3 em água destilada estéril gerando uma
concentração final de 16,6 mg/mL. O controle positivo foi feito com anfotericina B
(1 mg/mL) para os fungos e vancomicina (1 mg/mL) para as bactérias. O controle
negativo foi DMSO diluído 1:3 em água destilada estéril.
4.4.4 Ensaio antimicrobiano in vitro
Foi utilizada a metodologia de difusão em ágar “Drop test” onde aplica-
se o extrato a ser testado diretamente no meio previamente inoculado com o
microorganismo, sem a utilização de discos estéreis (HILI; EVANS; VENESS,
1997). Os microrganismos (2 x 105 células/mL) foram espalhados em placas de
Petri contendo meio BHI (Brain Heart Infusion) sólido e, depois de 10 minutos, 10
µL da substância (extrato e as fases orgânicas ) foi colocado no centro de cada
placa. Todas as placas foram incubadas a 37°C, com tempo de incubação
variando de 01 a 07 dias, dependendo do microrganismo testado e, com leitura
dos resultados através da medição dos halos de inibição em centímetros. O
controle positivo foi feito com anfotericina B para os fungos e vancomicina para as
bactérias. A formação do halo de inibição no local onde foi aplicada a amostra
67
indica a sensibilidade do microrganismo ao mesmo, sendo passível de ocorrer
resultados atípicos principalmente em testes com microrganismos mutantes ou
resistentes. Neste caso, é observado um halo de inibição, mas com a presença de
algumas colônias na região; a isto se dá o nome de pseudo-halo (FALCÃO,
2003). Os testes foram feitos em triplicata.
68
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Fitoquímica
5.1.1 Prospecção fitoquímica
De acordo com as características organolépticas, o extrato metanólico
bruto de Erythrina velutina possui coloração verde escuro, odor semelhante e
característico levemente adocicado e pH 6,0. Os resultados da prospecção
fitoquímica realizada estão dispostos na tabela 2.
Tabela 2 – Resultados da prospecção fitoquímica com o extrato metanólico bruto
ENSAIOS COM EXTRATO METANÓLICO BRUTO
Alcalóides
Dragendorff +
Bertrand +
Bouchardat +
Mayer +
Quinonas
Reação Borntrager direta -
Taninos
Reação com sais de ferro +
Reação com acetato de chumbo +
Reação com alcalóides +
Reação com dicromato de potássio +
Flavonóides
Reação de Shinoda +
Reação com hidróxidos alcalinos +
Reação com sais de ferro +
Glicosídeos saponínicos -
Leucoantocianidinas -
Esteróides e triterpenos -
Legenda: Resultados = positivo (+), negativo (-).
69
Segundo FALKENBERG et al. (2007), a caracterização dos principais
grupos de substâncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realização
de reações químicas que resultem no desenvolvimento de coloração e/ou
precipitado característico.
As plantas produzem diferentes substâncias químicas e o fazem em
diferentes proporções, dependendo do habitat, do regime de chuvas, da
insolação, do solo, enfim, das características climato-edáficas. Entretanto,
algumas substâncias químicas são bastantes características para um
determinado vegetal, e desta forma podem servir como parâmetro para sua
caracterização e identificação.
Os testes fitoquímicos realizados visaram evidenciar as principais
classes de substâncias químicas presentes na espécie, por reações qualitativas, a
partir do extrato metanólico bruto de Erythrina velutina Willd com reagentes
específicos para cada classe química de produtos naturais.
Os dados das análises químicas realizadas com o extrato das folhas de
Erythrina velutina demonstraram a presença de alcalóides, taninos e flavonóides.
Para a detecção de alcalóides, verificou-se a presença de precipitados
bastante característicos, variando do marrom ao marrom-alaranjado.
HENRIQUES et al. (2007) afirma que a formação de precipitados pode ser
considerada apenas como provável presença de alcalóides, enquanto resultados
negativos com estes reagentes são indicativos da ausência de alcalóides.
Na identificação de taninos os ensaios com sais de ferro, acetato de
chumbo e dicromato de potássio mostraram-se positivos, pois houve formação de
precipitado e mudança de coloração. Ocorreu mudança na tonalidade esverdeada
da solução do extrato para verde escuro, verde amarelado, verde amarronzado,
70
respectivamente. Já a reação com alcalóides apresentou resultado positivo para
esta classe química, notando-se a presença de precipitado branco (COSTA,
2000).
No teste para identificação de flavonóides os ensaios com sais de ferro
mostraram-se positivos, com a formação de precipitado, o que sugere a presença
da referida classe química. O ensaio com hidróxidos alcalinos apresentou
coloração verde claro amarelado, sugerindo resultado positivo para a presença de
isoflavonas (COSTA, 2000). Já a reação de Shinoda apresentou a formação de
um precipitado indicando a presença da classe química, entretanto não houve
mudança de cor. Segundo ZUANAZZI (2007), essa reação baseia-se no fato de
que os derivados flavônicos de cor amarela reduzem-se adquirindo coloração
avermelhada ou, no caso dos antociânicos, azulada. Este ensaio produz reação
negativa para chalconas e isoflavonas. O autor afirma que isoflavonóides são,
salvo raríssimas exceções, de ocorrência exclusiva em Fabaceae.
5.1.2 Marcha para alcalóides
Sabe-se que o gênero Erythrina é muito rico em vários tipos de
alcalóides. Sendo assim, devido aos resultados da prospecção fitoquímica serem
positivos para a presença de alcalóides no extrato metanólico bruto da planta em
estudo, optou-se por realizar uma extração ácido-base, método normalmente
usado para a extração de alcalóides. A partir da marcha para alcalóides obteve-se
a fase clorofórmica básica e a fase n-butanólica básica.
5.1.2.1 Fase n-butanólica básica
Por meio da cromatografia em coluna e CCDA foi selecionada a
amostra FNB 10 - 16 que apresentou satisfatório grau de pureza. Foi realizada
71
análise espectroscópica desta amostra através de RMN de 1H e 13C em DMSO-d6.
O espectro de RMN1H (Figura 6 e 7) apresentou sinais característicos de
hidrogênio aromático (δH = 6-9 ppm), conforme mostra os dados da tabela 3 para
os hidrogênios ligados aos carbonos 2, 4, 5 e 6. O composto heterocíclico é
monosubstituído na posição, C-3 (δc = 129) (Figura 8).
Conforme dados publicados por BHAT SV, NAGASAMPAGI BA,
SIVAKUMAR M, (2005) há semelhança entre os sinais da amostra FNB 10 – 16 e
(AN 1a e AN 1b) (Tabela 3) com o ácido nicotínico (Figura 5), sugerindo por meio
dessa análise que a amostra citada seja o ácido nicotínico.
O ácido nicotínico, nos vegetais, é proveniente do ácido aspártico e do
gliceraldeído, sendo um precursor de muitos alcalóides. Dentre as rotas
bissintéticas para formação dos alcalóides piridínicos e piperidínicos encontra-se
a possibilidade do núcleo piperidínico ser biossíntetizado, partindo do glicerol e do
ácido aspártico, tendo o ácido nicotínico como intermediário (SANTOS, 2007).
N
OH
O
H
H
H
H1
35
4
Figura 5 - Estrutura química do ácido nicotínico (AN)
72
Tabela 3 - Dados de RMN1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) de FNB 10-16 obtidos em
DMSO-d6, comparados com dados da literatura (BHAT SV, NAGASAMPAGI BA,
SIVAKUMAR M, 2005) (AN-1A e AN-1B)(δ em ppm e J em Hz).
FNB 10-16 (δC) FNB 10-16 (δH) AN-1A (δC) AN-1B (δH)
C
2
3
4
5
6
CO2H
148
129
135
123
151
166
9,02 dd (0,9; 2,1 Hz)
8,29 ddd (1,8; 2,1; 7,7 Hz)
7,49 ddd (0,9; 4,8; 7,7 Hz)
8,70 dd (1,8; 4,8 Hz)
150,3
133,5
138,6
124,8
151,5
170,8
9,14 s
8,25 m
7,60 m
8,72 m
Legenda: AN-1A e 1B (dados da literatura); FNB 10-16 (dados da amostra).
Muitos estudos têm concentrado seus experimentos nas sementes, que
tipicamente contém 0,1% de alcalóides, embora os alcalóides tenham sido
previamente isolados de folhas, caule, haste, casca, raiz, vagem e flores das
espécies de Erythrina. O perfil alcaloidal das espécies Erythrina é característico,
contudo, tem sido observado uma variação quantitativa em diferentes partes da
espécie. Ao passo que algumas variações podem ser resultados da localização
da planta, da idade e até da época da coleta, pois existe evidência na variação
química dentro das espécies (GARCIA-MATEOS et al., 1998).
Apesar dos resultados obtidos com as folhas no presente estudo,
OZAWA et al. (2008) pesquisou as sementes da Erythrina velutina Willd e isolou
da fase clorofórmica básica o alcalóide indólico hipaforina. Em 2009, OZAWA e
seus colaboradores, também das sementes isolaram da fase n-butanólica o N-
73
óxido de erisodina; da fase clorofórmica básica eritralina, 8-oxo-eritralina,
erisotrina, erisodina, erisovina, glicoerisodina e hipaforina.
Figura 6 - Espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6/300 MHz)
74
Figura 7 - Expansão do espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 / 300 MHz)
75
Figura 8 – Espectro de RMN13C de FNB 10-16 (DMSO-d6/75 MHz)
Apesar de não ter sido isolado alcalóides típicos do gênero Erythrina na
espécie velutina, o espectro expandido de RMN1H da fase n-butanólica básica
(NB-E) desta planta apresentou sinais com valores característicos, em ppm, desta
76
classe química. A indicação da presença destes alcalóides na fase baseia-se na
comparação dos sinais de RMN1H na região de hidrogênios ligados a carbono sp2
do alcalóide (+)-coculidina (Figura 9), isolado de Cocculus laurifolia (AMER,
SHAMMA, FREYER, 1991), com os sinais presentes no espectro expandido de
RMN1H da fase n-butanólica básica de Erythrina velutina Willd (Figura 10). A
intensidade destes sinais demonstra que os alcalóides estão presentes em
pequena proporção no extrato, o que justifica as diversas tentativas de seu
isolamento sem êxito. A baixa produção destes alcalóides pela espécie pode
envolver diferentes fatores, tais como época de coleta, tipo de solo e parte da
planta utilizada para armazenamento dos alcalóides. Esta última possibilidade é a
mais provável, considerando que já foram isolados alcalóides das sementes e
cascas desta espécie (OZAWA et al., 2008, 2009; CABRAL, 2009; VIRTUOSO,
2005).
N
MeO
H H
H
MeO
6,90 d
6,65 dd
6,93 d
5,41 m3,22 s
Figura 9: Estrutura química e sinais de RMN1H do alcalóide (+)-coculidina
77
Figura 10 – Expansão do espectro de RMN1H de NB-E (DMSO-d6/75 MHz)
78
5.1.3 Fase acetato de etila
Na literatura há diversos estudos fitoquímicos com o gênero Erythrina
realizados com a fase acetato de etila, da qual foram isolados flavonóides e
terpenos (DA-CUNHA et al.,1996; WANJALA & MAJINDA, 2000; OZAWA et al.,
2009). De forma semelhante, a fase acetato de etila foi submetida à cromatografia
em coluna utilizando sílica gel como adsorvente e as frações obtidas foram
monitoradas através de CCDA e CCDP. Selecionou-se uma fração para análise
de RMN1H. As demais tratavam-se de graxa ou mistura complexas.
O espectro de RMN1H da fração F17-18 apresentou dupletos na região
de hidrogênios aromáticos (6-9 ppm) e alguns simpletos na região de grupos
metoxílicos ligados a anel aromático (Figura 11). No espectro de RMN1H da
fração F17-18, observou-se a presença de picos referente à graxa, na faixa de
campo alto, dificultando a visualização dos demais picos do metabólito a ser
identificado (Figura 11). Entretanto, os sinais na região 3,5-4,0 ppm e 6,2-8,0 ppm
são sugestivos de substância aromática metoxilada (Figura 11), possivelmente da
classe química dos flavonóides, comumente encontrada no gênero Erythrina e
demonstrada sua presença no extrato metanólico das folhas de Erythrina velutina
através da prospecção fitoquímica realizada no presente estudo. Para uma maior
purificação desta substância realizou-se a CCDP objetivando uma melhor
purificação do composto investigado. Após o processo cromatográfico obteve-se
duas subfrações a F17-18.1 e a F17-18.2, as quais foram analisadas empregando
RMN1H e 13C. Contudo, não foi possível a identificação do metabólito secundário
investigado devido à pequena quantidade de amostra isolada e ao seu baixo grau
de pureza.
79
Figura 11 – Espectro de RMN1H de F17-18 da fase acetato de etila (CDCl3 /200
MHz)
5.1.4 Observações gerais
A fase hexânica, n-butanólica e a fase clorofórmica básica foram
exaustivamente cromatografadas em coluna de sílica gel e as frações obtidas não
foram purificadas por se apresentarem como misturas complexas.
80
Como descrito, o estudo das folhas de Erythrina velutina não levou ao
isolamento de metabólitos secundários e este fato pode ser atribuído à época da
coleta, ineficiência do método utilizado, pequena quantidade destes compostos
presentes nas folhas, bem como local de armazenamento destes alcalóides nesta
espécie, corroborando com o trabalho de SARRAGIOTO (1981) realizado com as
folhas e flores de Erythrina mulungu. O estudo supra citado objetivava o
isolamento de alcalóides, entretanto, essa classe de compostos não foi
encontrada nas folhas, o que motivou a autora a optar por outra parte da planta,
as flores. Com o extrato hexânico das folhas isolou-se um composto do tipo
poliisoprenóide, Fitol. Dos extratos clorofórmico e metanólico das flores isolaram-
se os alcalóides erisotrina, eritrartina, hipaforina, N-óxido de erisotrina e N-óxido
de eritrartina. Portanto, estes resultados mostram que em algumas espécies de
Erythrina, as folhas são pouco promissoras do ponto de vista fitoquímico, apesar
da presença das propriedades terapêuticas.
5.2 Farmacologia
5.2.1 Triagem farmacológica comportamental
A Erythrina velutina é uma planta largamente utilizada pela população
nordestina, principalmente como calmante. A partir de dados da literatura
verificou-se que o extrato alcoólico das folhas de Erythrina velutina, coletadas no
período de junho, apresentou resultados semelhantes ao perfil dos efeitos dos
benzodiazepínicos quando submetidos aos modelos animais que avaliam a
ansiedade, memória e epilepsia (TEXEIRA-SILVA et al., 2008). Considerando a
época de coleta (janeiro/2009) e a localização geográfica diferente da planta
81
avaliada em relação ao artigo citado, optamos por realizar uma triagem
farmacológica comportamental. Primeiramente, foi feita a triagem das fases
orgânicas e depois do extrato metanólico bruto, pois estudos mostram que
variáveis como época de coleta e condições ambientais interferem nos processos
bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos dos vegetais. A dose de 200
mg/Kg para as fases orgânicas e de 400 mg/Kg para o extrato metanólico bruto foi
baseada no estudo acima citado. A via de administração escolhida foi a via oral
devido ao uso popular.
Na triagem farmacológica foi realizado o monitoramento de
comportamentos, que na maioria das vezes são exibidos normalmente pelos
animais, de forma que qualquer alteração no padrão normal de comportamento
pode ser sugestiva de atividade no sistema nervoso central (ALMEIDA et al.,
1999).
Os animais que foram tratados com a fase n-butanólica básica, pela via
oral, apresentaram após uma hora de administração as seguintes alterações
comportamentais: leve diminuição da ambulação, leve aumento da auto-limpeza e
o levantar levemente aumentado. Também foi observada diminuição da
defecação dos animais.
Os animais tratados com a fase clorofórmica básica apresentaram após
trinta minutos de administração as seguintes alterações comportamentais:
discreta analgesia e resposta ao toque diminuído. Após uma hora: ptose palpebral
discreta, leve sedação. Após duas horas: leve sedação. Após três horas: leve
sedação, resposta ao toque diminuído. Após quatro horas: leve sedação. Durante
a 1ª, 2ª e 3ª hora a defecação foi diminuída.
82
Os animais tratados com a fase hexânica apresentaram após trinta
minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: discreta
ambulação e o levantar e escalar levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 3ª hora
nada foi observado. Após quatro horas: o levantar levemente aumentado.
Os animais tratados com a fase acetato de etila apresentaram após
trinta minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: leve
analgesia, discreta alteração da resposta ao toque diminuído e o levantar
levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 3ª hora: leve sedação, analgesia leve,
discreta alteração da resposta ao toque diminuído e a defecação foi diminuída.
Após quatro horas: analgesia leve, discreta alteração da resposta ao toque
diminuído e defecação diminuída.
Os animais tratados com a fase n-butanólica apresentaram após trinta
minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: discreta
ambulação, o levantar e o escalar levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 4ª
hora nada foi observado. Após três horas: discreta ptose palpebral.
Como os resultados com as fases orgânicas não foram contundentes
optamos por avaliar também o extrato metanólico bruto. Os animais tratados com
400 mg/Kg do extrato metanólico bruto apresentaram após trinta minutos de
administração a seguinte alteração comportamental: discreta catatonia. Durante a
1ª e 2ª hora: ptose palpebral discreta, leve sedação, defecação e micção
diminuída. Após 3ª e 4ª horas: defecação e micção diminuída.
Após os experimentos, todos os camundongos ficaram em observação
por 48 h e durante esse período, não houve óbitos para nenhuma das fases
orgânicas e extrato bruto testado.
83
Comparando-se as cinco fases orgânicas avaliadas, observou-se que
as mesmas apresentam uma discreta atividade depressora do sistema nervoso
central, a qual pode estar relacionada com o efeito calmante relatado pela
população. Entretanto, foi constatado efeito depressor mais acentuado ao utilizar
a fase acetato de etila. Esta fase promoveu maior número de alterações
comportamentais nos animais, quando comparado com as demais fases
orgânicas e extrato metanólico bruto. Esta diferença ocorre, possivelmente,
devido à presença de metabólitos secundários bioativos em maior quantidade na
fase acetato de etila. Enquanto isso, no extrato bruto, além dos metabólitos
secundários, estão presentes substâncias interferentes que podem agir de forma
antagônica ou sinérgica em relação aos efeitos observados, por tratar-se de uma
mistura complexa (MAUDERLY, 1993).
Sendo assim, as alterações comportamentais apresentadas em função
do efeito discreto exercido pelas referidas fases orgânicas e o extrato metanólico
bruto no sistema nervoso central podem estar relacionadas com o efeito calmante
relatado pela população, porém, não ocorreram em conformidade com os
resultados prévios relatados na literatura (DANTAS et al., 2004; MARCHIORO et
al., 2005), em particular com o estudo de TEXEIRA-SILVA et al., (2008). Diante
do exposto ressalta-se que vários fatores podem ter influenciado a quantidade de
metabólitos secundários bioativos presentes no extrato avaliado, tais como: a
época em que a planta foi coletada, visto que a quantidade e, às vezes, até
mesmo a natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano; a
variação da composição de metabólitos pode variar durante o ciclo dia/noite; a
idade e o desenvolvimento da planta, bem como dos diferentes órgãos vegetais
também são de considerável importância e podem influenciar não só a quantidade
84
total de metabólitos produzidos, mas também as proporções relativas dos
componentes da mistura; a faixa em que ocorrem as variações anuais, mensais e
diárias na temperatura é um dos fatores que exerce maior influência em seu
desenvolvimento, afetando, portanto, a produção de metabólitos secundários;
fatores fisiológicos críticos, tais como fotossíntese, comportamento estomatal,
mobilização de reservas, expansão foliar e crescimento, podem ser alterados por
estresse hídrico e, conseqüentemente, levar a alterações no metabolismo
secundário; o efeito da seca na concentração de metabólitos e, às vezes,
dependente do grau de estresse e do período em que ocorre, sendo que efeitos a
curto prazo parecem levar a uma produção aumentada, enquanto a longo prazo é
observado um efeito oposto. Os nutrientes afetam não somente o metabolismo
primário, mas também influenciam a produção de diferentes metabólitos
secundários; fatores mecânicos aos quais as plantas estão susceptíveis, tais
como ferimentos, ou mesmo meros estímulos, causados por chuva, vento, areia,
invasão por patógenos e pastagem de herbívoros, também podem influenciar a
expressão do metabolismo secundário. Sabendo-se dos inúmeros fatores que
podem levar as variações no conteúdo de metabólitos secundários, fica clara a
necessidade de estudos visando detectar as condições e épocas para a coleta
que conduza a uma amostra vegetal com concentrações desejáveis de princípios
ativos (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
Neste sentido, os resultados da triagem farmacológica preliminar com o
extrato metanólico bruto e as fases orgânicas não demonstraram atividade
satisfatória a nível de sistema nervoso central, o que nos levou a não dar
continuidade aos estudos psicofarmacológicos empregando modelos animais
para avaliação de atividades farmacológicas comportamentais específicas.
85
5.3 Atividade antimicrobiana
Espécies do gênero Erythrina vêm sendo estudadas e algumas
atividades são atribuídas às mesmas como: antimicrobiana (CHACHA; BOJASE-
MOLETA; MAJINDA, 2005; YENESEW ET AL., 2005), anti-HIV (MCKEE et al.,
1997), antibacterial (TANAKA et al., 2002, 2004; SATO et al., 2002) e
antiplasmodial (ANDAYI et al., 2006).
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade
antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Em um “screening” extensivo
de plantas utilizadas na medicina tradicional, destaca-se os extratos vegetais com
ação antimicrobiana, devido a sua importância no desenvolvimento e produção de
produtos farmacêuticos e cosméticos. Dentre os métodos mais conhecidos
incluem método de difusão em ágar, que foi escolhido para esse trabalho, pela
simplicidade de execução e baixo custo (OSTROSKY et al, 2008).
Os microrganismos a serem utilizados foram selecionados para esse
ensaio devido à capacidade de causarem diversas patologias que podem atingir
gravidade considerável, alguns representam riscos de infecção nosocomial de
difícil controle e, as culturas purificadas são acessíveis.
Os resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana pelo método de
difusão em ágar mostraram que o extrato metanólico bruto e a fase hexânica
apresentaram uma inibição fraca ou parcial, sem halo de inibição definido, para o
Trichophyton rubrum T544. Entretanto, para as demais fases orgânicas de
Erythrina velutina não houve inibição do crescimento de nenhuma das cepas de
bactérias e fungos testadas (Tabela 4).
86
Neste trabalho, os controles positivos utilizados foram anfotericina B e
vancomicina. Os resultados obtidos com o extrato bruto e as fases orgânicas não
foram comparados com os mesmos controles, pois não podemos comparar
substâncias puras com extrato bruto e fases orgânicas que são misturas
complexas (MAUDERLY, 1993).
Tabela 4 – Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana
Extrato e fases orgânicas (Drop teste com spots de 10 µl)
Trichophyton rubrum
Aspergillus niger
Cryptococcus neoformans
Candida albicans
Escherichia coli
Staphylococcus aureus MRSA
Controle negativo (DMSO)
- - - - - -
Extrato metanólico bruto +/- - - - - - Fase hexânica +/- - - - - - Fase acetato de etila - - - - - - Fase n-butanólica - - - - - - Fase clorofórmica básica - - - - - - Fase n-butanólica básica - - - - - - Anfotericina B 2,0±0,1 1,8±0,2 2,0±0,1 2,0±0,1 - - Vancomicina - - - - 1,0±0,1 1,8±0,1
Legenda: (-) Não houve inibição; (+/-) inibição fraca ou parcial sem halo de inibição definido; média ± desvio padrão.
Estudos similares foram realizados com outras espécies de Erythrina a
partir de substâncias puras isoladas ou extratos, onde comprovou-se o potencial
antifúngico deste gênero. Pterocarpanos isolados da Erythrina abyssinica e os
extratos metanólicos e diclorometano da Erythrina vogelli demostraram atividade
contra fungos e leveduras (NAKANISHI, 1982; ATINDEHOU et al., 2002). Da
Erythrina burttii foram isolados flavonóides que mostraram atividade antifúngica
(YENESEW et al., 2005). Os isoflavonóides isolados das raízes de Erythrina
poeppigiana possuem atividade antilevedura contra cepa de Candida albicans
(SATO et al., 2003; TANAKA et al., 2004). Estudos biológicos preliminares
revelaram que o N-óxido de erisotrina e N-óxido de eritrartina isolados das flores
da E. mulungu atuam como fungicida (SARRAGIOTTO, 1981).
87
Estudos realizados com a Erythrina latíssima mostraram resultados
diferentes quando avaliados para a atividade antimicrobiana. Segundo MAJINDA
et al. (2001) os alcalóides isolados da semente, madeira da raiz, casca do caule e
vagem da E. latissima não demonstraram atividade antibacteriana contra os
microrganismos testados (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida mycoderma e Sacharomyces
cerevisiae). Entretanto, a partir do tronco de madeira E. latissima, duas
isoflavonas e uma flavanona foram isoladas, além de 10 conhecidos flavonóides.
Estes compostos mostraram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida mycoderma (CHACHA;
BOJASE-MOLETA; MAJINDA, 2005). A diferença entre esses dois trabalhos pode
ser justificada porque quando se enumera as atividades de alguns flavonóides,
comprova-se que os mesmos podem ser responsáveis por ações antivirais,
antimicrobianas, antitumoral, anti-hemorrágicos, hormonais, antinflamatórios, e
antioxidantes (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007), enquanto que para os alcalóides
eritrinícos estudos mostram um maior número de atividades farmacológicas ao
nível de sistema nervoso central (MAJINDA et al., 2001).
VIRTUOSO et al., (2005), em avaliação preliminar a partir da casca de
Erythrina velutina, demonstrou que ocorreu atividade antibacteriana dos produtos
vegetais sobre Streptococcus pyogenes e Staplylococcus aureus. Nenhuma
atividade foi observada sobre outras bactérias testadas por difusão em ágar e foi
registrada atividade moderada contra todos os microrganismos no teste de
concentração inibitória mínima para o extrato etanólico bruto e fração hexano.
Segundo LENETTE et al. (1987) considera-se que o tamanho da zona
de inibição de crescimento no teste de difusão é bastante influenciada pela
88
velocidade de difusão das substâncias no ágar, sendo assim, é possível que a
baixa polaridade dos compostos da fase hexânica diminua a velocidade de
difusão destes no ágar, gerando um halo de inibição proporcionalmente menor em
relação aos antibióticos controle que são polares e ao extrato bruto. Os resultados
obtidos, apesar de modestos, comprovam o possível potencial antifúngico desse
gênero frente à cepa de Trichophyton rubrum T544 demonstrando dessa forma,
que extratos de plantas apresentam perspectivas para a obtenção de antifúngicos
naturais.
As dermatofitoses são infecções superficiais capazes de produzir
lesões em tecidos queratinizados, como pele, pelo e unhas, causadas por fungos
queratinofílicos denominados dermatófitos, que compreendem os gêneros
Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton, semelhantes em sua
morfofisiologia, imunologia e taxonomia. As dermatofitoses apresentam-se como
as infecções fúngicas mais comuns em países tropicais, constituindo um
problema de saúde pública e refletindo baixo nível de educação sanitária. A
distribuição e freqüência das dermatofitoses e seus agentes etiológicos variam
segundo a região geográfica e o nível sócio econômico da população
(BONCOMPTE; ALGUERÓ; VIDELA, 1997). Trichophyton rubrum é o fungo mais
comum observado em todo o mundo e especialmente é o dermatófito dominante
na onicomicose com uma prevalência de cerca de 80% (CHAN, 2002).
Logo, o possível potencial antifúngico exibido pelo extrato metanólico
bruto e fase hexânica de Erythrina velutina frente ao Trichophyton rubrum deve
ser investigado com mais detalhes, a fim de contribuir para a descoberta e
desenvolvimento de novos agentes antifúngicos naturais, os quais, se viáveis,
89
representarão alternativas terapêuticas aplicáveis no tratamento de várias
micoses.
90
VI. CONCLUSÃO
Conforme os resultados obtidos nesse trabalho, conclui-se que:
- O estudo fitoquímico da espécie Erythrina velutina, revelou-a como
bioprodutora de diferentes metabólitos, tais como alcalóides, flavonóides e
taninos;
- Através de métodos cromatográficos usuais e técnicas
espectroscópicas RMN de 1H e 13C foi possível isolar e identificar um marcador
químico para a espécie avaliada, o qual trata-se do ácido nicotínico.
- Da fase acetato de etila foi isolada uma substância, entretanto, não
foi determinada a sua estrutura química devido a pequena quantidade isolada do
metabólito, bem como a presença de impurezas, o que dificultou as análises
espectrais. Contudo, os sinais presentes no espectro de RNM1H são sugestivos
de substância aromática metoxilada, possivelmente da classe química dos
flavonóides, comumente presente no gênero Erythrina.
- Na realização da triagem comportamental, foi observado que
administrações da fase clorofórmica e n-butanólica básica, fase hexânica, fase
acetato de etila, fase n-butanólica e extrato metanólico bruto da planta Erythrina
velutina Willd promoveram alterações comportamentais discretas ao nível de
sistema nervoso central, do tipo depressor, que podem estar relacionadas com o
efeito calmante relatado pela população.
- O extrato metanólico bruto e a fase hexânica mostraram uma
inibição fraca ou parcial sem halo de inibição definido para o Trichophyton rubrum
T544.
91
- Para as demais fases orgânicas de Erythrina velutina não houve
inibição do crescimento de nenhuma das cepas de bactérias e fungos testadas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nas folhas há uma menor concentração de compostos químicos
quando comparado com outras partes da planta já estudadas por vários grupos
de pesquisa. Sendo assim, a importância deste trabalho advém da sua
contribuição no estudo de uma espécie etnofarmacologicamente bastante
utilizada, visando descrever sua constituição química e, a partir desses dados
comprovarem sua utilização pela população.
O isolamento dos demais constituintes químicos e possíveis
marcadores químicos presentes nas folhas de Erythrina velutina é um desafio
para os trabalhos futuros, uma vez que diversos métodos cromatográficos foram
empregados e demonstraram a dificuldade da separação em função da
proximidade dos seus coeficientes de retenção em cromatografia em camada
delgada e em cromatografia de coluna.
Durante a execução desse trabalho alguns conhecimentos foram
adquiridos, mas, cada um atrelado a novas perguntas que remetem à pesquisa
mais aprofundada de alguns pontos, tais como a sazonalidade da época de
coleta, a parte da planta a ser estuda, a idade da planta, o horário da coleta, o
método de extração, localização geográfica da planta, entre outros. O rigor
dessas informações e observações é necessário considerando-se a importância
da rigorosa legislação aplicada ao registro de fitoterápicos e a possibilidade de
ocorrência de fraudes. Por isso, esse estudo deve servir como estímulo e não
entrave à busca de informações, visando encontrar marcadores químicos da
92
espécie e proporcionar à indústria farmacêutica a garantia e segurança na
aquisição da matéria-prima.
Como sabemos, torna-se urgente a necessidade do conhecimento e
padronização rigorosa das condições experimentais para avaliação
antimicrobiana (in vitro) de plantas. Vários fatores afetam a suscetibilidade e a
execução dos métodos de difusão e de diluição, portanto, há alguns aspectos
importantes a serem considerados, tais como os meios de cultura, pH do meio,
disponibilidade de oxigênio, a suscetibilidade dos agentes antimicrobianos e
condições de incubação.
O uso de extratos e substâncias provenientes da planta Erythrina
velutina é de reconhecida aplicabilidade em muitas áreas da farmacologia
voltadas a saúde. Apesar do uso freqüente da casca e das folhas na forma de
chás, principalmente pela população nordestina, para várias finalidades, ainda
não existem informações de caráter científico suficiente para que este ou seus
constituintes sejam aplicados como fitoterápico, fato lastimável quando se
considera as potencialidades já descritas na literatura, o que traria diversos
benefícios a população.
93
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VIII. ANEXOS
ANEXO 1 – Declaração do CEPA (Conselho de Ética em Pesquisa com Animais)
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ANEXO 2 - Triagem Farmacológica Comportamental (ALMEIDA et al., 1999) PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_________ DATA:____/_____/_____ VIA DE ADMINISTRAÇÃO:____________ ANIMAIS:______________________________ RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________________ GRUPOS:________________________
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA
Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso
até 30` 1h 2h 3h 4h 1 – SNC a - Estimulante Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outras_____________________ b - Depressora Hipnose Ptose Sedação Anestesia Ataxia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular c - Outros comportamentos Ambulação Bocejo excessivo Groming Rearing Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Pedalar Estereotipia 2 - SN AUTÔNOMO Diarréia Constirpação Defecação aumentada Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE
obs.:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________