não

Determinar estrutura a partir das distâncias

1H-1H e outras restrições adicionais

Integrar picos e converter volumes em

distâncias

Assinalamento seqüencial

Assinalamento dos sistemas de spin

Identificar a maior quantidade de NOEs

Espectro COSY

Estrutura aceitável?

FIM

Identificar NOEs adicionais a partir da

estrutura já obtida

Recalcular NOESY a partir das estruturas obtidas e comparar

com espectro original

Picos inexplicáveis?

Reexaminar NOEs, integração, calibração,

larguras de linha

Espectro TOCSY Espectro NOESY

Assinalamento dos sistemas de spin

sim

sim

não

Simmulated annealing (SA): baseado em dinâmica molecular (MD) e minimizaçãode energia (EM)

baixo limite de distância (d 5Å) + dubiedade de muitos picos NOEs

família de estruturas

A acurácia das estruturas obtidas depende do número de restrições experimentais:a acurácia atinge um valor assintótico em 10-14 restrições por aminoácido.

A coerência entre modelo obtido e espectros medidos é essencial: o cálculoretroativo do espectro NOESY permite identificar erros em assinalamentos e aintrodução de NONOEs (d>5Å).

Cálculo de Estruturas

6

NOENOE dV

A energia do sistema de átomos pode ser descrita por:

• Eemp : energia da molécula segundo uma equação empírica (função de suas coordenadas);

• Eexp : termos de energia provenientes de informações experimentais.

expemppot EEE

Função para a Energia

Energia empírica - contém termos de energia de interação conformacionais e não-ligantes envolvendo 2, 3 ou 4 átomos:

• Ebond é a energia das ligações covalentes r;• Eangl a energia dos ângulos de valências;• Edihe a energia dos ângulos torcionais;• Eimpr a energia dos ângulos torcionais rígidos (quiralidade, planaridade);• Evdw a energia da interação de van der Waals;• Eelec a energia da interação eletrostática.

Os diversos wp são fatores de peso.

N

p

elec

p

elecvdw

p

vdwimpr

p

imprdihe

p

diheangle

p

anglebond

p

bondemp EwEwEwEwEwEwE1

Primeiros 4 termos da energia: termos conformacionais, descrevem a geometria daligação covalente da molécula.

Definidos por potenciais harmônicos, exceto dihe (periodicidade pode gerar váriosmínimos de potencial) que é representado for uma função coseno:

• r0, 0 e 0 : grandezas de equilíbrio (determinadas por difração de raios-X);• : ângulo de fase;• k : constantes de força (otimizadas de modo que a manter a estabilidade local do

sistema).

impropers

impr

torsion

dihe

angles

angle

bonds

bbond

kE

nnkE

kE

rrkE

2

0

2

0

2

0

)(2

1

1,)]cos(1[2

1

)(2

1

)(2

1

Dois últimos termos da energia: não-ligantes. A energia de van der Waals entredois átomos i e j separados por uma distância rij é descrita pelo potencial de Lennard-Jones:

• : definido pela energia mínima (Emin=- );• : definido pelo raio de van der Waals mínimo (rmin=21/6 ).

O termo de interação eletrostática é dado pelo potencial Coulombiano:

• q : carga dos átomos;• 0 : constante dielétrica do vácuo.

Os dois termos são, em geral, substituídos por um único termo simples epuramente repulsivo:

• Rmin : raio de van der Waals mínimo;• irexp e rexp : coeficientes ajustados.

])()[(42

1)( 6

)(

12

ijijpairs ij

vdwijvdwrr

krE

)( 04)(

ijpairs ij

ji

elecijelecr

qqkrE

0;]),0[max()( elec

rexpirexpirexp

min

rep

repijvdw ERRkCrE

Energia experimental - As restrições experimentais obtidas dos dados de NMRpodem ser descritas pela função:

• Enoe : restrições de distâncias;• Ecdih : restrições de constantes de acoplamento 3JNH (e portanto para ângulos

diedrais );• Ecoup : restrições de constantes de acoplamento J ;• Eshifts : restrições de deslocamentos químicos (comparados a um banco de dados

estrutural).

São pseudo-potenciais podendo ser definidos pelo usuário de acordo com a formada molécula e da confiabilidade dos parâmetros estruturais.

shiftscoupcdihnoeexp EEEEE

Os melhores resultados são, em geral, obtidos com os potenciais bi-harmônicos:

• rmax e rmin : limite superior e inferior para as distâncias obtidas a partir dos NOEs;• knoe : pode ser colocado como dependente da temperatura e dos limites dos erros.

Os outros termos podem ser definidos analogamente.

minij

maxijmin

maxij

minijnoe

maxijnoe

ijnoe

rr

rrr

rr

rrk

rrk

rE2

2

)(

0

)(

)(

Algoritmo utilizado para calcular a trajetória de uma molécula de N partículassegundo as equações clássicas de movimento. Pela equação de Newton, a partícula ide massa mi e posição ri estará sujeita, no tempo t, a uma força Fi:

A solução numérica das equações de movimento é obtida computacionalmente apartir de uma escolha de incremento de tempo, t. O cálculo das coordenadas dapartícula i no tempo (t+ t) é obtido das coordenadas nos dois tempos anteriores (t) e(t- t), pela soma das duas séries de Taylor para (t+ t) e (t- t) até terceira ordem:

O objetivo dos cálculos de dinâmica molecular é encontrar uma conformação da molécula que se aproxime do mínimo global de energia total.

potii

i Et

tmt

2

2 )()(

rF

2

2

2

)()(

)()(2)( tt

tttttt i

iii

rrrr

Dinâmica Molecular (Verlet)

Utiliza o método de gradiente conjugado, minimizando a energia total Etot utilizandoas coordenadas cartesianas como variáveis. Esse método costuma ser utilizado ao finalde uma dinâmica molecular, a fim de regularizar a estrutura.

Minimização de Energia (Powell)

A fim de evitar que a conformação da molécula caia em um mínimo local sãocriados protocolos, como o SA, nos quais a dinâmica molecular seja direcionada comdiferentes fatores de escala para os diversos termos de energia. Segundo esseprotocolo, o sistema pode alcançar valores de energia superiores de acordo com adistribuição de Boltzmann:

A “temperatura efetiva” T do sistema é obtida do valor médio para a energia cinética

A energia cinética é lentamente diminuída durante os cálculos através da redução davelocidade vi com a temperatura. Para tal, as equações de movimento são acrescidasde um fator de amortecimento, a fim de evitar oscilações de alta freqüência dosátomos que poderiam levar a uma dissociação da molécula:

Protocolos de Simmulated Annealing (SA)

Tk

E

BeEP )(

TNkvmE B

N

i

iic2

3

2

1

1

2

)1()(

)(2

2

curr

iiipotii

iT

TmE

t

tmt v

rF

A velocidade será, portanto, alterada de acordo com a temperatura desejada T, atemperatura atual Tcurr e do coeficiente de fricção i. Paralelamente ao resfriamento dosistema são aumentados gradativamente os pesos dos termos de energiaexperimentais, de modo a restringir as estruturas calculadas ao espaço conformacionalque mais se adapte às restrições por NMR.

Esse procedimento é aplicado sobre uma estrutura inicial desenovelada, sendocriadas diversas estruturas a partir de velocidades iniciais distintas. Ao final dadinâmica essas estruturas deverão ser semelhantes (convergir), o que só acontecerá seexistirem restrições experimentais suficientes e, em sua maioria, corretas. Parâmetrospara avaliar a qualidade da estrutura são as energias e seus desvios e o número deviolações de restrições experimentais. As subunidades flexíveis da molécula serãovistas, por NMR, em uma conformação média-temporal que, em geral, nãocorresponde a um mínimo de energia, não convergindo a uma única conformaçãofinal.