Espectroanalitica - Emissao Molecular.pps

Prof. Valmir F. Juliano

INTRODUÇÃO AOS MÉTODOSINTRODUÇÃO AOS MÉTODOSESPECTROANALÍTICOS - IIESPECTROANALÍTICOS - II

QUI624

• Três tipos de métodos ópticos relacionados entre si são conhecidos coletivamente como métodos de luminescência molecular: Fluorescência molecularFluorescência molecular; fosforescência e fosforescência e quimiluminescênciaquimiluminescência.

• A fluorescência e a fosforescênciafluorescência e a fosforescência são similares, no tocante ao processo de excitação, que é feita por absorção de fótonsabsorção de fótons. Por esse motivo são frequentemente mencionados pelo termo mais genérico fotoluminescênciafotoluminescência.• A quimiluminescênciaquimiluminescência está baseada no espectro de emissão de uma espécie excitada que é formada no decorrer de uma reação reação químicaquímica.

Luminescência MolecularLuminescência Molecular

• A medida da intensidade de fotoluminescência ou quimiluminescência permite a determinação quantitativa de uma variedade de espécies orgânicas e inorgânicas importantes em concentrações muito baixas (traços). • Atualmente, o número de métodos fluorimétricos é significativamente maior que o número de aplicações de procedimento de fosforescência e quimiluminescência.• Um dos aspectos mais atraentes dos métodos de luminescência é a sua sensibilidade intrínseca, com limites de detecção frequentemente de uma a três ordens de grandeza menores de a absorção (ppb).


• Outra vantagem dos métodos fotoluminescentes é a sua extensa faixa de concentração linear, que, com frequencia, é significativamente maior que as encontradas em métodos de absorção. • Devido à sua alta sensibilidade , os métodos de luminescência quantitativos estão sujeitos a efeitos de interferência sérios das matrizes das amostras. Por essa razão, normalmente, as medições de luminescência estão associadas com técnicas de separação da cromatografia e da eletroforese.• Geralmente os métodos de luminescência apresentam uma aplicação menos ampla. Muito mais espécies absorvem radiação UV/Vis do que emitem.


Teoria da fluorescência e fosforescênciaTeoria da fluorescência e fosforescência• Ocorrem em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos simples, bem como em sistemas complexos.

• Fluorescência de ressonânciaFluorescência de ressonância: emis = abs. Observada mais para espécies atômicas que moleculares.

• Fluorescência com deslocamento StokesFluorescência com deslocamento Stokes: emis > abs. O físico Irlandês George Gabriel Stokes, verificou que o fóton absorvido perdia energia por inúmeras vibrações microscópicas.

• A absorção de fótons ocorre instantaneamente (1010-14-14 a a 1010-15-15 s s).• A emissão de fluorescência ocorre em um tempo significativamente maior (1010-9-9 a 10 a 10-7-7 s, quando s, quando tem valores tem valores 101033 a 10 a 1055, e 10, e 10-6-6 a 10 a 10-5-5 s para s para bem menores bem menores). • A emissão de fosforescência, por sua vez, ocorre em tempos muito maiores (1010-4-4 a 10 s ou mais a 10 s ou mais) em virtude da transição de spin singlete-triplete diferente da transição singlete-singlete da fluorescência.


Teoria da fluorescência e fosforescênciaTeoria da fluorescência e fosforescência

• O estado eletrônico molecular é chamado de singlete quando os elétrons estão emparelhados e nenhuma separação de níveis de energia é observada sob efeito de um campo magnético. A molécula é diamagnéticaA molécula é diamagnética.• No estado dublete, o que acontece com um radical livre, o elétron pode ter duas orientações sob campo magnético, conferindo energias diferentes ao sistema (paramagnetismoparamagnetismo).• O estado triplete pode ser alcançado se o elétron tornar-se desemparelhado ao ser excitado para um nível de maior energia. Neste caso também ocorre o paramagnetismoparamagnetismo.


a) Estado fundamental singleteb) Estado excitado singletec) Estado excitado triplete

Teoria da fluorescência e fosforescênciaTeoria da fluorescência e fosforescência• A molécula pode voltar ao seu estado fundamental por uma combinação de várias etapas mecanísticas, denominados de processos de desativaçãoprocessos de desativação:

• Processos radiativos• Fluorescência. • Fosforescência.

• Processo não-radiativos• Relaxação vibracional (10-12 s)

• Colisões entre as moléculas excitadas e as moléculas do solvente eliminam excesso de energia, atingindo o menor nível vibracional.

• Conversão interna• Processos intermoleculares pelos quais a molécula passa

para um estado eletrônico de menor energia sem emissão de radiação.

• Conversão externa (extinção por colisão)• A desativação de um estado eletrônico excitado envolve a

transferência de energia entre a molécula excitada e o solvente ou outros solutos. Condições que reduzem o Condições que reduzem o número de colisões (baixa temperatura e alta viscosidade) número de colisões (baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a emissãoaumentam a emissão.


Sempre ocorrem do menor nível energético vibracional

Teoria da fluorescência e fosforescênciaTeoria da fluorescência e fosforescênciaLuminescência MolecularLuminescência Molecular

Processo não-

radiativo que será

favorecido se houver

superposição dos níveis de energiaEstado tripleteEstado triplete

Estados Estados singletesinglete

Processo não-radiativo que ocorre

quando há superposição de níveis de energia


Efeito da conversão Efeito da conversão internainterna:Quinina

Tanto a absorção em 250 nm quanto em 350 nm

resultam na emissão em 450 nm.Emissão da

luz “negra”

Teoria da fluorescência e fosforescênciaTeoria da fluorescência e fosforescência• A estrutura molecular, assim como o ambiente químico, influenciam a ocorrência ou não da luminescência de uma molécula. Estes fatores também determinam a intensidade de emissão, quando esta ocorre.

• Rendimento quântico ou eficiência quântica :• É simplesmente a razão do número de moléculas que

luminescem pelo número de moléculas excitadas. A fluoresceína possui uma eficiência quântica próxima da unidade.

• Tipos de transição• Dificilmente a fluorescência resulta de absorção de radiação com

menor que 250 nm, porque tal radiação é suficientemente energética para promover a desativação dos estados excitados por pré-dissociação ou dissociação. A emissão fica restrita a transições * (maior eficiência quânticamaior eficiência quântica) e * n.

• Estrutura• Ainda que alguns compostos carbonílicos e alguns com

estruturas de duplas ligações altamente conjugadas fluoresçam, a fluorescência mais intensa e mais útil é encontrada em compostos com grupos aromáticos com transições * de baixa energia.



Não apresentam Não apresentam fluorescênciafluorescência

Apresentam Apresentam fluorescênciafluorescência

Fluoresceína



Apresenta fraca Apresenta fraca fluorescênciafluorescência

= 0,2= 0,2

Apresenta forte Apresenta forte fluorescênciafluorescência

= 1= 1

Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura favorece a fluorescência


A rigidez do complexo A rigidez do complexo formado explica formado explica

porque o complexo de porque o complexo de zinco com a 8-zinco com a 8-

hidroxiquinolina hidroxiquinolina apresenta uma apresenta uma

fluorescência muito fluorescência muito maior que a 8-maior que a 8-

hidroxiquinolina.hidroxiquinolina.

Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura favorece a fluorescência

Luminescência MolecularLuminescência MolecularEfeito do solvente e temperaturaEfeito do solvente e temperatura

• A eficiência quântica diminui com o aumento da temperaturatemperatura por causa do aumento da frequência das colisões ocasionando conversões externas.• Um decréscimo na viscosidadeviscosidade causa igual efeito.• A fluorescência é diminuída por solventes contendo átomos pesadosátomos pesados ou por solutos contendo tais átomos em suas estruturas. Exemplo: CBr4 e CH3CH2I• Efeitos de pH podem desfavorecer a fluorescência

Apresenta Apresenta fluorescêncifluorescênci

aa

Não Não apresenta apresenta

fluorescênciafluorescência

Luminescência MolecularLuminescência MolecularEfeito da concentração na intensidade de fluorescênciaEfeito da concentração na intensidade de fluorescência• A potência de emissão de fluorescência F é proporcional à potência radiante do feixe de excitaçãoproporcional à potência radiante do feixe de excitação que é absorvido.

F = K´(Po – P)• Escrevendo a lei de Beer, P / Po = 10-bc, onde é absortividade molar das moléculas fluorescentesF = K´(Po - Po 10-bc) = K´Po(1 - 10-bc)• O termo exponencial pode ser expandido e posteriormente simplificado. Considerando A < 0,05, o resultado passa a ser F = 2,303K´bcPo.

• Como b é constante e é possível manter Po também constante, o resultado final passa a ser: F = KcF = Kc

Luminescência MolecularLuminescência MolecularDesvios da linearidadeDesvios da linearidade

• Quando a concentração da espécie emissora é grande o suficiente para que a absorbância seja maior que 0,05, a simplificação do termo exponencial se torna inválida e a linearidade é perdida. (absorção primáriaabsorção primária)• Dois outros fatores também causam desvios negativos da linearidade:

• Auto-supressãoAuto-supressão• Colisões entre moléculas excitadas provocam a transferência de energia não-radiativa de um modo semelhante à transferência para moléculas do solvente na conversão externa.

• Absorção secundáriaAbsorção secundária (inclui a auto-absorção)• Ocorre quando emissão coincide com algum absorção. O resultado é a reabsorção da radiação por quaisquer moléculas na solução.

Luminescência MolecularLuminescência MolecularFatores que reduzem a intensidade de fluorescênciaFatores que reduzem a intensidade de fluorescência

• Supressão dinâmica• Também chamada de supressão colisional, necessita do contato entre as espécies excitadas e o agente supressor. O mecanismo não é muito bem compreendido.

• A concentração do agente supressor deve ser suficientemente alta para que haja uma alta probabilidade de colisão entre as espécies excitada e supressor durante o tempo de vida do estado excitado.

• A presença de O2 dissolvido, que é paramagnético, geralmente reduz a intensidade da fluorescência por promover o cruzamento intersistema. Entretanto, também pode promover a supressão do estado triplete, reduzindo também a fosforescência.• A fluorescência do sulfato de quinino é suprimida por altas concentrações de íons cloreto.


• Supressão estática• Neste caso, o supressor forma com o analito fluoróforo um complexo chamado de complexo escuro.

M + L M + L ⇌ ⇌ ML ML

• Supressão de longo alcance• Neste tipo de supressão a transferência de energia ocorre com colisões entre as moléculas. O acoplamento dipolo-dipolo entre o fluoróforo excitado e o supressor é responsável pela transferência.

Molécula fluorescente

Complexo não- fluorescente

supressor


• Uma vez que a emissão de fluorescência FF é diretamente proporcional à eficiência quântica ff, se a supressão depender de um único supressor, após alguma manipulação nas equações do sistema, obtém-se: [Sup]K1FF

q0 onde F e Fo são os sinais de fluorescência na

presença e ausência do supressor e Kq a constante de supressão

Supressão da fluorescência do sulfato de quinino por Supressão da fluorescência do sulfato de quinino por ClCl--..

Instrumentos para medir fluorescência e fosforescênciaInstrumentos para medir fluorescência e fosforescência• Os componentes dos instrumentos para medir a fotoluminescência são similares àqueles encontrados nos fotômetros e espectrofotômetros UV/Vis.

• A fonte de radiação necessita ser mais intensaser mais intensa que aquelas utilizadas na absorção molecular.• A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo feixe para compensar flutuações na compensar flutuações na potência da fontepotência da fonte.• A fluorescência emitida pela amostra se propaga em todas as direções, mas o ângulo reto em ângulo reto em relação ao feixerelação ao feixe incidente é mais conveniente para evitar perdas por espalhamento na solução e, principalmente, nas paredes da cubeta.

F = KcF = Kc



Para refletir e responder:Para refletir e responder:Seria possível realizar uma medida de fluorescência em um espectrofotômetro convencional após alguma pequena modificação?


Luminescência MolecularLuminescência MolecularAplicaçõesAplicações

• Os métodos de fluorescência e fosforescência são intrinsecamente aplicáveis a faixas de concentrações mais baixas que as medidas espectrofotométricas baseadas em absorbâncias e estão entre as técnicas analíticas mais sensíveis facilmente disponíveis.• Essa sensibilidade elevada vem do fato que F aumenta se a potência da fonte Po aumentar, ou então, pelo fato do sinal poder ser amplificado posteriormente. A absorbância, por estar relacionada com Po/P, não se altera com o aumento de Po, pois o aumento deste causa um aumento proporcional em P.

• Em contraste a alta sensibilidade, os métodos Em contraste a alta sensibilidade, os métodos fotoluminescentes são menos precisos e exatos que os fotoluminescentes são menos precisos e exatos que os métodos espectrofotométricos por um fator de 2 a 5.métodos espectrofotométricos por um fator de 2 a 5.


• Muitos íonsíons de metais de transição são paramagnéticos, o que favorece o cruzamento intersistema ao estado triplete, desfavorecendo a fluorescência, embora a fosforescência possa ser observada.• Os complexoscomplexos dos metais de transição possuem muitos níveis de energia pouco espaçados, favorecendo a desativação por conversão interna e não por fluorescência.• ComplexosComplexos de metais que não não são de transição de transição, geralmente incolores e que formam complexos também incolores, são menos suscetíveis a esses processos de desativação. Estes não poderiam ser determinados por absorção molecular no visível. Assim a fluorimetria é complementar à absorção molecular.


• Reagentes fluorimétricos


Luminescência MolecularLuminescência MolecularQuimiluminescênciaQuimiluminescência

A aplicação da quimiluminescência à química analítica A aplicação da quimiluminescência à química analítica é relativamente recente. O número de reações é relativamente recente. O número de reações químicas que produz quimiluminescência é pequeno, químicas que produz quimiluminescência é pequeno, limitando assim o métodolimitando assim o método.

• A quimiluminescência é produzida quando uma reação química fornece uma espécie excitada eletronicamente que emite luz quando retorna ao estado fundamental.

• A bioluminescência é a quimiluminescência que ocorre em sistemas biológicos. Os exemplos mais conhecido são os vaga-lumes e as águas-vivas.

• A instrumentação para medidas de quimiluminescência é notavelmente simples. É necessário um sistema fechado com apenas um tubo fotomultiplicador.


• A utilização do luminol para detecção de sangue em uma cena de crime baseia-se a reação do luminol com H2O2 em meio alcalino catalisada pelo ferro presente hemoglobina.• Dentro de certos limites, a intensidade de quimilumines-cência do luminol é diretamente proporcional à concentração do oxidante, do catalisador ou do luminol.• Os métodos de quimiluminescência em geral são altamente sensíveis porque níveis baixos de luz podem ser detectados na ausência de ruído. Não há atenuação da radiação em monocromadores ou filtros. Com isso limites de detecção na faixa de partes por bilhão (ppb) ou partes por trilhão (ppt) podem ser alcançados.


luminol íon 3-aminoftalato

VantagensVantagens ((em comparação à absorção molecular))

• Muito mais sensível. Alcança facilmente limites de detecção de ppb. A quimiluminescência pode fornecer limites de detecção da ordem de ppt.• Mais seletiva. O fato de absorver um determinado e emitir em outro, diminui em muito a probabilidade de existir na mesma solução outra espécie que faça o mesmo.• Serve para a determinação de metais que não são de transição que, em geral, são incolores e tendem a formar quelatos também incolores e que não poderiam ser determinados por absorção molecular na região do visível.


DesvantagensDesvantagens ((em comparação à absorção molecular))

• Limitada a um número muito menor de sistemas que incorporam características estruturais e ambientais que provocam uma desaceleração dos processos de relaxação ou desativação não-radiativos. Apesar disso, existem mais de 200 substâncias que podem ser analisadas por esta técnica.

• Espécies orgânicas e bioquímicas – produtos alimentícios, fármacos, produtos naturais e amostras clínicas:• Enzimas e coenzimas, esteróides, vitaminas, etc.

• Pior exatidão e precisão por um fator de 2 a 5.• Custo maior do equipamento.• Ao contrário da absorção molecular, não se aplica a determinação de complexos de metais de transição.


Para refletir e responder:Para refletir e responder:Seria possível analisar um analito orgânico aromático com anéis condensados em uma mistura de compostos orgânicos através da espectrometria de luminescência molecular? Em caso positivo, quais seriam as limitações da análise?


Exercício:Exercício:Os volumes de uma solução padrão contendo 1,10 ppm de Zn2+, mostrados na tabela, foram pipetados para frascos separados, cada um contendo 5,00 mL de uma solução de concentração desconhecida de zinco. Cada uma foi extraída com 3 alíquotas de 5mL de CCl4 contendo excesso de 8-hidroxiquinolina. Os extratos foram então diluídos a 25,00 mL e a fluo-rescência foi medida com um fluorímetro.a) Construa a curva de trabalho.b) Determine a equação linear.c) Calcule o desvio padrão da inclinação, do intercepto e da regressão.d) Determine a concentração de zinco na amostra com o respectivo desvio padrão


Volume da solução

padrão de Zn2+, mL

Leitura do fluorímetro

0,00 6,124,00 11,168,00 15,6812,00 20,64

2)()()(

xxyyxx

mi

i

xmyb

22

2

)()(1xxm

yyNm

ssi

rx2

)()( 222

N

xxmyysr

22

2

)()( xx

sxx

ss rrm

22

2

ii

irb

xxN

xss

Exercício - resposta:Exercício - resposta:a) Curva de trabalho em volume de padrão adicionado.b) Equação linear.

c) Desvios-padrãoRegressão: sr = 0,154402 Inclinação: sm = 0,01726 Intercepto: sb = 0,12918

d) Desvio padrão da leitura: sx = 0,17251sc = 0,17251 x 1,10 / 5 = 0,038 ppm[Zn2+] = (6,188/1,202) x 1,10 / 5 = 1,13 ppm


Volume da solução

padrão de Zn2+, mL

Leitura do fluorímetro

0,00 6,124,00 11,168,00 15,6812,00 20,64

Exercício - resposta:Exercício - resposta:a) Curva de trabalho em concentração de padrão adicionado.b) Equação linear.

c) Desvios-padrãoRegressão: sr = 0,154402 Inclinação: sm = 0,39233 Intercepto: sb = 0,12918

d) Desvio padrão da leitura: sx = 0,00759sc = 0,00759 x 25 / 5 = 0,038 ppm[Zn2+] = (6,188/27,31) x 25 / 5 = 1,13 ppm


[Zn2+], ppm Leitura do fluorímetro

0,00 6,120,176 11,160,352 15,680,528 20,64

Exercício:Exercício:Compare a luminescência molecular com a absorção molecular no UV/Vis. Porque o aumento da potência da fonte luminosa não aumenta a sensibilidade de detecção na absorção molecular, mas aumenta a emissão?

A = log (A = log (PP00/P/P))

F = K´ (PF = K´ (P00 – P) – P)F = F = K´(PK´(Poo - P - Poo 10 10--bcbc))F F = K´P= K´Poo(1 - 10(1 - 10--bcbc)) ≈ 2,303K´ ≈ 2,303K´bcbcPP00


Fim da Luminescência Fim da Luminescência Molecular. O que será que Molecular. O que será que

vem a seguir?vem a seguir?

Documents

Espectroanalitica - Emissao Molecular.pps