Espectrometria de Luminescência Molecular_aula unica

Espectrometria de Luminescência Molecular

Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental

Química Analítica 12A (Instrumental)


Fluorescência Molecular

Fosforescência

Quimioluminescência

Fotoluminescência


É a emissão de radiação eletromagnética (na região UV-Visível) proveniente de moléculas excitadas voltando ao estado fundamental

Quando a absorção de fótons é responsável pela excitação da molécula pela elevação de elétrons de valência de um orbitalmenos energético para um de maior energia

Fotoluminescência (flourescência e fosforescência)

Quimioluminescência

Está baseada no espectro de emissão de uma espécie excitada que é formada no decorrer de uma reação química

Ocorre em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos simples bem como em sistemas complexos

Teoria da Fluorescência e Fosforescência

Fluorescência

O estado excitado envolvido é singlete, onde o spin do elétrons no orbital excitado mantém sua orientação.O retorno ao estado fundamental é rápido (10-5 a 10-8 s)

Fosforescência

A orientação do elétrons que foram promovidos ao estado excitado é invertida (estado excitado triplete). O retorno ao estado fundamental é mais lento (10-4 a 10 s ou mais) que no caso do singlete.

Teoria da Fluorescência e Fosforescência

A fluorescência é um fenômeno luminescente mais comum que a fosforescência

É observada em temperatura ambiente e diretamente em

solução o que torna o procedimento

experimental fluorimétrico, bastante simples

Fluorescência

É observada apenas em baixas temperaturas em

meios altamente viscosos, ou em moléculas que estão absorvidas em superfícies

sólidas

Fosforescência

Estados Excitados que Produzem Fluorescência e Fosforescência

Spin Eletrônico

Princípio de Exclusão de Pauli

Quaisquer dois elétrons em um átomo não podem ter os mesmos valores dos quatro números quânticos.

Não mais de dois elétrons podem ocupar um orbital e devem ter spins opostos (spins emparelhados).

A maioria das moléculas não apresenta campo magnético intrínsecosendo denominada de diamagnética (não é atraída nem repelida por

campos magnéticos estáticos).

Os radicais livres, que contém elétrons desemparelhados, têmmomento magnético e são atraídos por um campo elétrico.

Eles são paramagnéticos.

Estados Excitados Singlete e Triplete SingleteEstado eletrônico molecular no qual todos os spins eletrônicos estão emparelhados e nenhuma separação de níveis de energia ocorre quando a molécula é exposta a um campo magnético.

TripleteEstado eletrônico molecular no qual os spins eletrônicos estão desemparelhados e são paralelos

DubleteEstado fundamental para um radical livre onde, o elétron isolado pode ter duas orientações em um campo magnético, o que dá energias diferentes.

Estados Excitados Singlete e TripleteAs propriedades de uma molécula no estado excitado triplete

diferem muito daquelas do estado singlete

Molécula é paramagnética no estado triplete e diamagnética no estado singlete

Transições singlete/triplete ou triplete/singlete (que também envolvem mudanças de estado eletrônico) são menos prováveis que uma transição singlete/singlete correspondente

Estado Excitado Tempo de vida médio, s

Triplete 10-4 a vários segundos

Singlete 10-5 a 10-8

Excitação produzida por radiação de uma molécula no estado fundamental ao estado triplete tem pouca probabilidade de ocorrer e os picos decorrentes desse processo são muito menores que as transições singlete/singlete

Diagrama de Níveis de Energiade Moléculas Fotoluminescentes

Níveis excitados de energia

S = singlete

T = triplete

Estadofundamental

singlete

Estadoexcitadosinglete

Estadofundamental

triplete

Excitação não significativaDevido a mudança de multiplicidade

Emissão Fluorescência

Fosforescência

10-5 a 10-9 s

10-4 a 10 s ou mais

<10-9 s

Tempo de vida médio de uma espécie excitada

Tempo de vida médio de uma espécie excitada

Velocidades de Absorção e Emissão

t (10-14 a 10-15 s)

t estado excitado 1/(pico de absorção)(vida)

t (10-7 a 10-9 s)

M + hv M*vel. altíssima

M* Mreemissão

vel. menor

absorção

fluorescência fosforescência

Não há mudança de spin (t. curto)

Há mudança de spin (t. longo)

10-4 a 10 s10-5 a 10-8 s

Processos de Desativação

M* Mreemissão

vel. menorMolécula excitada

Molécula no estado

fundamental

Etapas Mecanísticas da volta ao Estado Fundamental

• Fluorescência• Fosforescência

Emissão de um fóton de radiação

Processos radiativos

Processos não-radiativosNão há emissão de fóton de radiação

• Relaxação Vibracional


“A trajetória favorecida é aquela que minimiza o tempo de vida do estado excitado”

Se a fluorescência é mais rápida que os processos

sem radiação

Se a trajetória não-radiativa tem constante de velocidade

mais favorável

Emissão por fluorescência

Não há fluorescênciaou é pouco intensa

Etapas Mecanísticas da volta ao Estado Fundamental


Relaxação Vibracional

A banda de fluorescência para uma dada transição eletrônica está deslocada para freqüências mais baixas ou comprimentos de onda

maiores em relação a banda de absorção

Como a relaxação vibracional é muito rápida, não há emissão

consequência

A transição ocorre a partir de um nível vibracional mais baixo de um estado eletrônico excitado


S = singlete

T = triplete

Cruzamento interno(10-13 a 10-11 s)


Não há emissão

t. de vida do estado excitado

(10-7 a 10-9 s)t. de vida do

estado excitado(10-4 a 10 s)

Relaxação Vibracional

r’ produz r


Conversão Interna

Descreve processos intermoleculares pelos quais uma molécula passa para um estado eletrônico de energia

menor sem emissão de radiação

A conversão interna parece ser eficiente quando dois níveis eletrônicos de energia estão próximos o suficiente para que

haja uma superposição de níveis de energia vibracionais

Quando as energias potenciais dos dois estados excitados são idênticas, a transição é muito eficiente


Conversão Interna

A conversão interna explica o fato de não haver banda de fluorescência proveniente de uma transição de S2 S0

A transição acontece de S1 S0

A fluorescência ocorre somente em 3, não importando qual radiação de comprimento de onda 1 ou 2 foi responsável pela excitação


S = singlete

T = triplete


Conversão Interna S1 S0


Exemplo de Conversão Interna

Quinino


Conversão Interna S1 S0

Os níveis vibracionais do estado fundamental podem se sobrepor aos do primeiro estado eletrônico excitado

A desativação ocorrerá rapidamente pelo mecanismo S1 S0

Compostos alifáticos têm esse comportamento e por isso, não fluorescem. A desativação vibracional é muito mais

rápida que a desativação por fluorescência

S = singlete

T = triplete

Processos de DesativaçãoConversão Interna S1 S0



Conversão Externa ou supressão (extinção) por colisão

É a desativação de um estado eletrônico excitado que envolve interação ou transferência de energia entre a

molécula excitada e o solvente ou soluto

M* solvente ou solutoh

A redução do número de colisões (baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a fluorescência.

S = singlete

T = triplete

Processos de DesativaçãoConversão Externa S1 S0



É um processo no qual o spin de um elétron excitado é invertido resultando em uma mudança de multiplicidade da molécula

A probabilidade dessa transição é aumentada se os níveis vibracionais dos dois estados se interpenetram.

Cruzamento Intersistema S1 T1

O cruzamento intersistema é mais comum em moléculas que contém átomos pesados, como iodo ou bromo

A presença de espécies paramagnéticas como o oxigênio, facilita o cruzamento intersistema decrécimo da fluorescência

S = singlete

T = triplete



Cruzamento Intersistema S1 T1


Depois do cruzameto intersistema para um estado triplete, uma desativação interna pode ocorrer, seja por conversão interna ou

seja por fosforescência

Uma transição triplete singlete é muito menos provável que pela conversão singlete/singlete . O tempo de vida médio do estado

triplete em relação à emissão varia de 10-4 a 10 s ou mais

Fosforescência

As conversões interna e externa competem de tal modo bem-sucedido com a fosforescência que esse tipo de emissão é

normalmente observado apenas em baixas temperaturas em meios altamente viscosos, ou em moléculas que estão absorvidas em

superfícies sólidas

S = singlete

T = triplete



Fosforescência

Variáveis que afetam a Fluorescência e a Fosforescência

Rendimento Quântico

Tipos de transições na Fluorescência

Eficiência Quântica e Tipos de transições na Fluorescência

Fluorescência e a Estrutura

Efeito da Rigidez Estrutural

Efeito do Solvente e da Temperatura

Efeito do pH na Fluorescência

Efeito do Oxigênio Dissolvido

Efeito da Concentração na Intensidade da Fluorescência

Rendimento Quântico ou Eficiência Quântica ()

É a razão no número de moléculas que fluorescem pelo número total de moléculas excitadas

Para a fluoresceína, a eficiênciaquântica se aproxima da unidade

f = fluorescênciai = cruzamento intersistemace = conversão externaci = conversão internapd = pré-dissociaçãod = dissociação

Tipos de Transições de Fluorescência

Radiação muito energética pode causar desativação dos estados excitados.

Algumas ligações da maior parte das moléculas orgânicas podem ser rompidas.

Fluorescência devido a transições * dificilmente é observada

A fluorescência dificilmente resulta da absorção ultravioleta

de comprimento de onda menores que 250 nm.

Ligante

Ligante

Não-ligante

Antiligante

Antiligante

Tipos de Transições de Fluorescência

Ligante

Ligante

Não-ligante

Antiligante

Antiligante

Emissão fica restrita aos processos menos energéticos transições * e * n

Eficiência Quântica e Tipo de Transição

Empiricamente:

* > * n

Fluorescência

transição de menor energia é *

transição de menor energia én *

* = (100 a 1000) x * n

t vida(* ) = 10-7 a 10-9 s t vida(* n) = 10-5 a 10-7 s

Eficiência Quântica e Tipo de Transição

Conclusão

A fluorescência está mais comumente associada atransições * porque apresentam tempo de vida

médio menores (kf é maior) e porque os processos dedesativação que competem com a fluorescência são

de ocorrência menos provável

Fluorescência e Estrutura

A fluorescência é mais intensa em compostos contendo grupos funcionais aromáticos com níveis de transição * de baixa energia

Estruturas comanéis condensadosapresentam fluorescência

Heterocíclicossimples nãoapresentam fluorescência

transição n *

O tempo de vida do anel benzeno é menor

Fluorescência e Estrutura

Efeito do átomopesado


A fluorescência é favorecida em moléculas quepossuem estrutura rígida

= 1,0 = 0,2

grupometileno


Certos agentes quelantes orgânicos tem sua fluorescência aumentada quando complexam com um íon metálico

N

OZn

2

N

OH

8-hidroxiquinolina

Intensidade da fluorescência

complexo de Zncom 8-hidroxiquinolina

Efeito do Solvente e da Temperatura

O aumento da temperatura aumenta a freqüência de colisões aumentando a probabilidade de desativação por conversão externa

A fluorescência de uma molécula é diminuída por solventes contendo átomos pesados ou outros solutos com tais átomos em sua estrutura

Ex.de solventes:Tetraboreto de carbono e iodeto de etila

Efeito do pH na Fluorescência

A anilina tem várias formas ressonantes. As formas ressonantes adicionais tornam o primeiro estado excitado mais estável.

O íon anilínio apresenta somente uma forma ressonante

Exemplo do efeito do pH na Fluorescência

Titulação ácido/base da forma fenólicado ácido 1-naftol-4-sulfônico

A fluorescência da forma fenólica do ácido 1-naftol-4-sulfônico

não é detectada visualmente porque ocorre no ultravioleta.

Uma vez convertido a forma de fenolato por adição de base, o pico de emissão se desloca para comprimentos de onda no visível onde pode ser visto.

A constante de dissociação ácida da forma excitada é diferente daquela da mesma espécie no estado fundamental

Efeito do Oxigênio Dissolvido

A presença de oxigênio dissolvido frequentemente reduz a intensidade de fluorescência de uma solução

Razões plausíveis:

Resultado da oxidação da espécie fluorescente, induzida fotoquimicamente

A supressão acontece como consequência das propriedades paramagnéticas do oxigênio molecular

Promove cruzamento intersistema convertendo as moléculas excitadas em estado triplete

OBS. Outras espécies paramagnéticas também tendem a suprimir a fluorescência

Efeito da Concentração na Intensidadeda Fluorescência

PPKF 0' bc

P

P 100

...

!3

303,2

!2

303,2303,2

22

0' bcbc

bcPKF

bcPKF 1010'

05,0303,2 Abc 0'3,2 bcPKF

KcF cteP 0

Expansão do termo exponencial em série de Maclaurin:


...

!3

303,2

!2

303,2303,2

22

0' bcbc

bcPKF

grandec

importantes

05,0303,2 Abc

A linearidade é perdida:

F situa-se abaixo de uma extrapolação da parte linear


grandec

Auto-supressão

Auto-absorção

Resultado de colisões de moléculas excitadas. Ocorre umatransferência não-radiativa talvez de modo semelhantea transferência para moléculas do solvente na conversão externa

Ocorre quando o comprimento de onda de emissão se sobrepõea um pico de absorção. A fluorescência diminui na proporção quea emissão atravessa a solução e é reabsorvida por moléculasfluorescentes.

Espectros de Excitação e Emissão

Intensidade de luminescência medido em fixo

de excitação variável

A intensidade de emissãoé registrada em função de

Na fluorescência e fosforescência de excitação é fixo

excitação<fluorescência<fosforescência


Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental

Química Analítica 12A (Instrumental)

Instrumentos para medida de Fluorescência e a Fosforescência

Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro

1°

2°

1° (excitação)

2° (emissão)


Fontes

Lâmpadas • Vapor de mercúrio de baixa pressão: Linhas úteis para excitar fluorescência (254, 302, 313, 546, 578, 691, e 773 nm)

Lasers• Laser de corante sintonizado bombeado com laser de nitrogênio pulsado ou laser Nd:YAG

O isolamento da linha adequada é feito com filtros de absorção ou interferência


Fontes

Desvantagem: As fontes com Lasers são mais caras que as com lâmpadas

Vantagem:

Melhor para amostras muito pequenas Excelente para sensoreamento remoto(detecção de radicais hidroxila na atmosfera) Ideal quando é necessário uma excitação essencialmente monocromática (minimiza os efeitos de fluorescências interferentes)


Filtros e Monocromadores

Filtros de absorção e

Filtros de Interferência

Seleção do feixe de excitação

Seleção da radiação Fluorescente resultante

Transdutores Fotomultiplicadoras

Detectores com arranjo de diodos

(Diode array)


Células e Compartimentos de Células

Células cilíndricas e retangulares fabricadas com vidro ou sílica

• Deve-se proteger o compartimento contra a radiação espalhada• Evitar impressões digitais na célula porque as gorduras da pele fluorescem

Instrumentos para medida de Fluorescência e a Fosforescência

Projetos de Instrumentos

Fluorímetros de Filtro

SimplesBaixo custo (US$ 5.000)


Espectrofluorímetros

Características dos Espectros de Espectrofluorímetros

Os espectros de emissão variam de aparelho para aparelho e não

podem ser comparados entre si

A informação de saída depende:

Intensidade da fluorescência do analito

Características da lâmpada

Transdutor

Monocromadores


Espectrofluorímetros baseados em Arranjos de Transdutores (diodos)


Sensores de Fluorescência de Fibra Óptica (Optrodos ou optodos)

Consistem de uma fase reagente imobilizada na extremidade de uma fibra óptica.

A interação do analito com o reagente provoca uma mudança na absorbância, reflectância, fluorescência ou luminescência.


Fosforímetros

Dispositivo para Excitar e Observar a Fosforescência

A medida da fosforencênciaé realizada com um atrazo detempo para poder distinguira fluorescêcia (tvida curto) dafosforescência (tvida longo)

Frasco Dewarcom N2 liq.

Padronização de Instrumentos

É necessário realizar uma calibração dos fluorímetrose espectrofluorímetros

A calibração é feita com solução de sulfato de quinino ~10-5 M

A excitação é feita por radiação em 350 nm e a emissão da radiação se dá em 450 nm

Existe um conjunto de 6 padrões sólidos dissolvidosem matriz de plástico que podem ser usados indefinidadmente (fabricante - Perkin Elmer)

AεbcP

P0 logKcF

P0 = cte

Aplicações e Métodos de Fotoluminescência

Espectrofotometria Fluorimetria

Sensibilidade Faixa mais alta

de concentração

Faixa mais baixa

de concentração

(1 a 3 vezes mais sensível)

Dependência

da potência da fonte (P0)

existe Não existe

Precisão e

Exatidão

Melhor Pior

(2 a 5 vezes pior)

Cátions que formam Quelatos Fluorescentes

Íons de metais de transição não formam quelatos fluorescentes

A maioria dos íons são paramagnéticos cruzamento intersistema (triplete)

Complexos de metais de transição caracterízam-se por muitos níveis de energia pouco espaçados conversão interna (triplete)

Íons de outros metais que não são de transição formam quelatos fluorescentes

São menos susceptíveis aos efeitos acima

Reagentes Fluorimétricos

Reagentes Fluorimétricose Aplicações

Medidas de Tempo de Vidade Fluorescência

Saída da fonte em função do tempo

Decaimento do sinal de fluorescência (decaimento da fonte

e decaimento do sinal de emissão do analito)

Sinal de fluorescênciaverdadeiro obtidopor deconvolução

da contribuição da fonte para o sinal

experimental

Determinação Fluorimétrica de Espécies Orgânicas

Compostos orgânicos, Enzimas, Coenzimas, Agentes medicinais,Produtos de plantas,EsteróidesVitaminas

Mais de 200 substâncias podem ser analisadas por fluorimetria

Produtos para alimentos, FármacosAmostras Clínicas Produtos Naturais

Aplicações mais importantes

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