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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Estabelecimento de um modelo celular para o estudo de
hipertrofias cardíacas mediadas pela inflamação: o papel
de peptídeos vasoativos na modulação de COX-2 e PTEN
Walmir da Silva
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Estabelecimento de um modelo celular para o estudo de
hipertrofias cardíacas mediadas pela inflamação: o papel
de peptídeos vasoativos na modulação de COX-2 e PTEN
Walmir da Silva
Orientadora
Karen Cristiane Martinez de Moraes
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia da Universidade Federal de
Ouro Preto como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em
Biotecnologia
Ouro Preto
2013
I
“Volta teu rosto sempre na direção do sol, e então, as sombras
ficarão para trás.”
Da vinci, L.
II
Dedico este trabalho a todas as pessoas que são importantes para mim.
III
SUMÁRIO
SUMÁRIO ............................................................................................................................... III
AGRADECIMENTOS: ........................................................................................................... V
RESUMO ................................................................................................................................. VI
ABSTRACT ...........................................................................................................................VII
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. IX
ABREVIATURAS .................................................................................................................. XI
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1
1.1 Importância epidemiológica ........................................................................................ 2
1.2 O modelo celular e a biotecnologia ............................................................................. 3
1.3 O Sistema Renina-Angiotensina nas hipertrofias cardíacas ........................................ 4
1.4 Hipertrofia Cardíaca e Processo Inflamatório.............................................................. 9
1.5 Correlação das proteínas PTEN e COX-2 na instalação do processo hipertrófico de
origem inflamatória ............................................................................................................... 13
1.6 Sinalização Celular nas Hipertrofias Cardíacas de origem inflamatória ................... 15
1.7 miRNAs e o processo hipertrófico ............................................................................. 20
1.8 Justificativa ................................................................................................................ 23
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 24
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................ 25
2.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 25
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 26
3.1 Técnicas básicas de Biologia Molecular .................................................................... 27
3.2 Cultura celular e simulação de condições hipertróficas/ inflamatórias. .................... 27
3.3 Viabilidade Celular .................................................................................................... 27
3.4 Análise da expressão do mRNA dos receptores de Ang II e Ang-(1-7) .................... 28
3.5 Microscopia de Fluorescência ................................................................................... 30
3.6 Mensuração da área celular ........................................................................................ 31
3.7 Dosagem de Prostaglandina E2 ................................................................................. 31
3.8 Análise da expressão gênica por qRT-PCR ............................................................... 31
3.8 Análise da expressão proteica .................................................................................... 35
3.10 Análise da expressão de miRNA ............................................................................... 37
3.11 Análises de bioinformática ....................................................................................... 38
IV
3.12 Análises estatísticas ................................................................................................... 39
4. RESULTADOS ................................................................................................................ 40
4.1 Ang II a 10 µM e Ang-(1-7) a 1 µM não causam morte celular da linhagem H9c2 . 41
4.2 Receptores AT1b e Mas são expressos em células H9c2 .......................................... 42
4.3 Ang II promoveu aumento da área celular em H9c2 ................................................. 43
4.4 Prostaglandina E2 aumenta em 12h de indução com Ang II e Ang-(1-7) em células
H9c2......................................................................................................................................44
4.5 Expressão de genes marcadores de hipertrofia cardíaca são modulados quando
induzido com Ang II e Ang-(1-7) ......................................................................................... 45
4.6 Ang II e Ang (1-7) promove modulação na expressão gênica de fatores
transcricionais ....................................................................................................................... 47
4.7 Níveis do mRA de Cox-2, Pten e Akt podem estar correlacionados entre si num
processo de regulação diante ação da Ang II e Ang-(1-7) .................................................... 49
4.8 COX-2 e PTEN podem estar envolvidos num mecanismo de corregulação quando
induzidos por Ang II ............................................................................................................. 51
4.9 Ang-(1-7) modula diferencialmente a expressão das proteínas COX-2 e PTEN ...... 52
4.10 Ang II promove aumento da expressão dos miRNAs miR-1, -21, -26a e -26b ......... 53
4.11 miRNAs – 1, -21, -26a, -26b podem modular a expressão de outros genes
relacionada a via hipertrófica/ inflamatória .......................................................................... 54
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 56
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 69
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 71
V
AGRADECIMENTOS:
A Ouro Preto, que me deu a alegria de fazer parte da sua história e aqui fazer amigos que levarei por
toda minha vida.
À Profa. Dra. Karen Cristine Martinez de Moraes, pela oportunidade.
À Profa. Dra Renata Guerra de Sá e ao Prof. Dr. William de Castro Borges pelas brilhantes aulas
ministradas e pelas colaborações. Obrigado pela inspiração.
Ao Professor Dr. Luis Carlos Crocco Afonso, pela concessão do uso de seu laboratório e
equipamentos.
Ao Professor Dr. Robson Augusto Souza dos Santos pelas discussões e reagentes cedidos.
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Cíntia, Márcia, Suianne, Nathália,
Roberta, Karina, Isabel, Soraya, Ester, Amanda, Pricila, Nayara, Andréa, Victor, Leandro, Fabiano,
Felipe e Kelvin, pela excelente e divertida convivência.
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica Metabólica pelas boas gargalhadas juntos, sempre nos
considerei um só grupo.
Aos professores, funcionários e colegas dos demais laboratórios do NUPEB.
Ao Rafael, por ter sido tão bom companheiro, por sempre me incentivar e me inspirar em momentos
importantes.
À Cíntia, minha irmã de Ouro Preto, obrigado por me receber de braços abertos na sua vida. Uma
amizade sincera vale mais que qualquer riqueza. Ainda temos muito pela frente. Obrigado por tudo
querida!
Aos meus irmãos de casa, Rodrigo, Diogo e Walyson pela fantástica convivência e em especial as
queridas Valquíria e Suianne. Sentirei muita falta do nosso convívio.
Aos amigos Patrícia, Rory, Helton e Mateus pelas boas risadas e por tornarem minha estadia em Ouro
Preto mais agradável.
À minha querida família, Sandra, Waldir e Mateus.
Aos meus queridos avós pelo imenso amor e incentivo.
Aos meus queridos amigos de longa data que sempre torceram por mim Bruna, Débora, Tainara,
Thaynara, Roberta, Ricardo, Sonaire, Carollina e Thaís. Vocês são muito importantes para mim.
E em especial aos meus queridos e eternos amigos Ramsés, Lupi, Tuíte, Lipi e o Milo.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela
oportunidade e pelo apoio acadêmico e institucional.
À FAPEMIG e ao CNPq pelo incentivo à capacitação e ao desenvolvimento da ciência através de
apoio financeiro.
VI
RESUMO
Trabalhos recentes têm demonstrado a importância do Sistema Renina-Angiotensina (SRA)
na modulação das hipertrofias cardíacas e atenção especial vem sendo dada aos peptídeos
vasoativos, Angiotensina II (Ang II) e a Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], devido aos seus
efeitos antagônicos nas hipertrofias, além do envolvimento destes na modulação dos níveis da
enzima ciclooxigenase-2 (COX-2), importante na produção de Prostaglandina E2 (PGE2), que
direta ou indiretamente está envolvida com a resposta hipertrófica cardíaca quando mediada
pela inflamação. Outro importante elemento no desenvolvimento do processo inflamatório
crônico é a proteína supressora tumoral PTEN. Em tumores, onde a inflamação crônica esta
presente, alguns estudos correlacionam a diminuição dos níveis de PTEN com a modulação
da proteína COX-2, entretanto esta correlação ainda é obscura. Assim, no presente estudo,
considerando-se um paralelismo molecular existente entre o processo inflamatório tumoral e
os mecanismos hipertróficos/ inflamatórios cardíacos nós focamos nos processos de co-
regulação de PTEN e COX-2 em cultura de células cardíacas tratadas com os peptídeos
vasoativos Ang II e Ang-(1-7), visando a caracterização de marcadores moleculares e um
futuro desenvolvimento de fármacos. Nossos resultados mostraram que as concentrações
utilizadas dos peptídeos vasoativos não foram citotóxicas para o nosso modelo de estudo.
Frente aos tratamentos, a análise da expressão gênica realizada através de reações de
polimerização em cadeia (PCR) focou-se nos genes Cox-2, Pten, fatores transcricionais,
marcadores de hipertrofia, assim como outros elementos correlacionados ao nosso modelo de
estudo. Paralelamente, as análises proteícas por Western blot, demonstraram uma possível
correlação entre COX-2 e PTEN quando da utilização do peptídeo Ang II. Baseado nessa
observação, procuramos ainda analisar um possível mecanismo de regulação pós-
transcricional, pela análise da expressão miRNAs nas culturas cardíacas estimuladas com a
Ang II. Em conjunto os resultados deste trabalho demonstram que há um possível mecanismo
de corregulação entre COX-2 e PTEN, além do possível envolvimento dos miR-26a e miR-
26b na regulação dos níveis de PTEN, mostrando que o modelo celular estabelecido é
funcional pra estudo das hipertrofias cardíacas mediado pela inflamação e colaborará com as
etapas subsequentes na caracterização de marcadores moleculares como potenciais alvos
terapêuticos.
VII
ABSTRACT
Recent studies have shown the importance of the Renin-Angiotensin System (RAS) in
modulating cardiac hypertrophy and special attention is being given to vasoactive peptides,
Angiotensin II (Ang II) and Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7 )], due to its antagonistic effects on
hypertrophy, in addition to their involvement in the modulation of the levels of the enzyme
Cyclooxygenase-2 (COX-2), important in the production of Prostaglandin E2 (PGE2), which
is directly or indirectly involved in the hypertrophic response when mediated cardiac
inflammation. Another important element in the development of chronic inflammation is the
tumor suppressor protein PTEN. In tumors where chronic inflammation is present, some
studies correlated the decreased levels of PTEN protein with the modulation of COX-2;
however, this correlation is still unclear. Thus, in this study, considering a parallel between
the molecular inflammation and tumor mechanisms hypertrophic / inflammatory heart we
focus on the processes of co-regulation of PTEN and COX-2 in cultured heart cells treated
with vasoactive peptides Ang II and Ang-(1-7), aiming at the characterization of molecular
markers and future drug development. Our results showed that the concentrations of
vasoactive peptides used were not cytotoxic for our study model. Front to the treatment, the
gene expression analysis performed by polymerase chain reaction (PCR) focussed on the
Cox-2, Pten, transcriptional factors, markers of hypertrophy genes, as well as other elements
related to our study design. Simultaneously, the protein analysis by Western blot
demonstrated a correlation between COX-2 and PTEN as the use of the peptide Ang II. Based
on this observation, we further analyze a possible mechanism of post-transcriptional
regulation, the expression analysis of miRNAs in cardiac cultures stimulated with Ang II.
Combining the results of this study demonstrate that there is a possible mechanism of co-
regulation between COX-2 and PTEN, and the possible involvement of miR-26a and miR-26b
in regulating levels of PTEN, showing that the cellular model is established to study
functional of cardiac hypertrophy mediated by inflammation and collaborate with subsequent
steps in the characterization of molecular markers as potential therapeutic targets.
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados para análise da expressão relativa dos receptores de
Ang II e Ang-(1-7).
Tabela 2 - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para análise da expressão relativa dos
genes.
Tabela 3 - Slope, Eficiência e R2 dos iniciadores utilizados através de uma curva de
eficiência.
Tabela 4 - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na expressão gênica relativa de miRNA
envolvidos no processo hipertrófico mediado por inflamação.
Tabela 5 - miRNAs e seus alvos envolvidos no processo hipertrófico mediado por
inflamação.
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação sumarizada das ações da Ang II via receptores AT1 e AT2 e Ang-
(1-7) via receptor Mas.
Figura 2 - Ilustração das vias de formação dos peptídeos do SRA.
Figura 3 - Cascata enzimática da síntese das Prostaglandinas (PGS).
Figura 4 - Representação da interação molecular entre as proteínas PTEN e COX-2 na
modulação do processo hipertrófico mediado por infamação.
Figura 5 - Esquema mostrando as principais vias de sinalização celular no processo
inflamatório/hipertrófico quando induzido pelo peptídeo vasoativo Angiotensina II em células
cardíacas.
Figura 6 - Esquema mostrando as principais vias de sinalização celular no processo
inflamatório/hipertrófico quando induzido pelo peptídeo vasoativo Angiotensina-(1-7) em
células cardíacas.
Figura 7 - Esquema de biossíntese de microRNA.
Figura 8 - Amplificação de β-actina obtida do cDNA sintetizado a partir da extração de RNA
total de células H9c2.
Figura 9 - Plot de amplificação referente à curva de eficiência do gene β-actina.
Figura 10 - Curva padrão referente ao gene β-actina.
Figura 11 - Avaliação da proliferação e viabilidade de células H9c2.
Figura 12 - Expressão relativa do mRNA dos receptores AT1a, AT1b, AT2 e Mas.
Figura 13 - Avaliação da hipertrofia das células H9c2 pela mensuração da área celular.
Figura 14 - Dosagem dos níveis de Prostaglandina E2.
X
Figura 15 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes marcadores de
hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β-Myhc mediante a indução celular com Ang II 10 µM.
Figura 16 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes marcadores de
hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β-Myhc mediante a indução celular com Ang-(1-7) 1 µM.
Figura 17 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes Nf-κB, Nfat-3 Fos e
Jun mediante a indução celular com Ang II a 10 µM.
Figura 18 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes Nf-κB, Nfat-3 Fos e
Jun mediante a indução celular com Ang-(1-7) a 1 µM.
Figura 19 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes Cox-2 Pten e Akt
mediante a indução celular com Ang II a 10 µM.
Figura 20 - Expressão relativa do mRNA pelo método do 2-ΔCt
dos genes Cox-2 Pten e Akt
mediante a indução celular com Ang-(1-7) a 1 µM.
Figura 21 - Análise da expressão relativa das proteínas COX-2 e PTEN por Western Blotting,
quando da indução por Ang II 10 µM.
Figura 22 - Análise da expressão relativa das proteínas COX-2 e PTEN por Western Blotting,
quando da indução por Ang-(1-7) 1 µM.
Figura 23 - Análise da expressão relativa dos miR-1 e miR-21 em células H9c2 induzidas
com o peptídeo vasoativo Ang II.
Figura 24 - Análise da expressão relativa dos miR-26a e miR-26b em células H9c2 induzidas
com o peptídeo vasoativo Ang II.
Figura 25 - Diagrama ilustrando a interação entre miRNAs e seus alvos relacionados ao
processo hipertrófico mediado por inflamação.
Figura 26 - Esquema do mecanismo de corregulação das proteínas COX-2 e PTEN no
modelo celular para estudo das hipertrofias mediada por inflamação quando induzida por
peptídeos vasoativos.
XI
ABREVIATURAS
AP-1 – Ativador de Proteína 1
AT1ar – Receptor de angiotensina AT1a
AT1br – Receptor de angiotensina AT1b
AT2r – Receptor de angiotensina AT2
ANG II – Angiotensina II
ANG-(1-7) – Angiotensina-(1-7)
Anf – Fator natriurético Atrial
AKT/PKB – Proteína Quinase B
Bnp – Peptídeo Natriurético cerebral
Β-Myhc – Cadeia pesada de β-miosina
BSA – Albumina Sérica Bovina
cAMP – Adenosina Monofosfato cíclica
PTGS2/Cox-2 – Ciclooxigenase-2
PTGS1/Cox-1 - Ciclooxigenase-1
CO2 – Dióxido de Carbono
DAG – Dialcilglicerol
DAPI – 4',6-diamidino-2-fenilindol
DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO –Dimetilsulfóxido
dNTP – Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
ECA 1 – Enzima conversora de Angiotensina I
ECA 2 - Enzima conversora de Angiotensina II
ERK – Quinases reguladoras de sinal extracelular
GPCR – Receptor Acoplado a Porteína G
GSK-3β – Glicogênio Sintase Quinase- 3β
HCl – Ácido Clorídrico
IGg – Imunoglobulina G
JNK – Quinase c-jun N-terminal
KCl – Cloreto de Potássio
mA – mili Amperagem
XII
MAPK – Proteínas Quinases Ativadas por Mitógenos
Mas r – Receptor de angiotensina MAS
MgCl2 – Cloreto de Magnésio
miRNA – microRNA
mRNA – RNA mensageiro
MTT – (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5- brometo difeniltetrazolio
NaCl – Cloreto de Sódio
Na2HPO4 – Fosfato de Sódio
Nf-Κb – Fator nuclear - Κb
NFAT – Fator nuclear ativado por Células T
PCR – Reação em cadeia pela polimerase
Pten – Fosfatase e Tensina homóloga
PLA2 – Fosfolipase A2
PLC – Fosfolipase C
PLD – Fosfolipase D
PKA – Proteína Quinase A
PKC – Proteína Quinase C
PBS – Tampão salino Fosfatado
PBS-EDTA – Tampão salino Fosfatado com ácido etilenodiamino tetra-acético
PVDF - Difluoreto de polivinilideno
PGE2 – Prostaglandina E2
PGs – Prostaglandinas
PIP-3 – Fosfatidil Inositol 3 Fosfato
PIP-2 – Fosfatidil Inositol 2 Fosfato
PI3K – Fosfatidil Inositol 3 Quinase
PDK1 – Quinase 1 dependente de fosfoinositídeos-3
Pri-miRNA – miRNA primário
Pré-miRNA – Precursor de miRNA
qRT-PCR – Reação em cadeia pela polimerase quantitativa acoplada a transcrição reversa
RISC – Complexo TBS-T - Tampão de Tris Salina com Tween-20
RNAi – RNA de interferência
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamina com gradient deesnaturante
SDS – Sulfato dodecil de sódio
SRA – Sistema Renina Angiotensina
XIII
TBS – Tampão de Tris Salina
Tris-HCl – Trisaminometado com Ácido Clorídrico
Tm – Temperatura de anelamento
TGF-β – Fator transformador de crescimento β
V - Voltagem
%CG – Conteúdo Citosina-Guanina
1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1 Importância epidemiológica
Os avanços na produção científica e na geração de tecnologias nos últimos anos
proporcionaram o desenvolvimento de novas abordagens clínicas e farmacológicas que
refletiram diretamente numa maior longevidade da população. Entretanto, algumas doenças,
entre elas as cardiomiopatias, são caracterizadas como um problema de saúde pública, uma
vez que são consideradas como uma das maiores causas de morbidade e mortalidade mundial
(Braunwald e Bristow, 2000; Paule et al., 2007).
As doenças cardiovasculares têm ampla incidência mundial, entretanto, o número de
indivíduos afetados e as sequelas dessas complicações patológicas se correlacionam
inversamente à qualidade de vida da população. Este fenômeno se deve principalmente a
diferenças no investimento governamental em prevenção, controle e tratamento. Países em
desenvolvimento e subdesenvolvidos apresentam taxas semelhantes de incidência e juntos,
são responsáveis por mais de 80% dos casos registrados em todo mundo. Por outro lado,
países desenvolvidos apresentam uma menor taxa de morbimortalidade (OMS, 2012).
Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2012) mostram que as doenças
cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, tendo grande importância clínica,
epidemiológica e financeira. Em 2008, foram estimados cerca de 17,3 milhões de óbitos
decorrentes das alterações patológicas oriundas de doenças cardiovasculares, representando
30% das causas de morte mundial. Registros da OMS, (2012) apontam ainda que em 2011
somente as doenças cardíacas e suas complicações, foram responsáveis por cerca de 9 milhões
de óbitos e ainda estima-se que em 2030 aproximadamente 23,6 milhões de pessoas morrerão
em decorrência dessas patologias. No Brasil, no ano 2000, foram registrados
aproximadamente 261.000 óbitos decorrentes de doenças do sistema cardiovascular e,
comparando-se este ano com a década anterior, observou-se um aumento de
aproximadamente 22% no número de obtidos, atingindo o valor de 320.074 indivíduos
(Brasil, 2009). As cardiomiopatias foram, portanto, responsáveis por 31,8% do número total
de óbitos registrados no Brasil em 2009, sendo que a população mais atingida foi a idosa com
idade acima de 54 anos e a incidência aumenta para 40% em indivíduos na faixa etária entre
60 e 70 anos.
Considerando-se a importância das cardiomiopatias e que dentre as anomalias que
conduzem a falha do sistema circulatório, as hipertrofias cardíacas assumem posição ímpar
3
há, portanto, a necessidade de se estudar e compreender melhor os mecanismos moleculares
envolvidos na instalação da hipertrofia de cardiomiócitos mediada pela inflamação.
1.2 O modelo celular e a biotecnologia
O grande desafio da ciência sempre esteve em aplicar os conhecimentos obtidos nos
laboratórios de pesquisa básica na geração de novos produtos para melhoria na qualidade de
vida. Desde os primórdios da história humana a observação da natureza e a experimentação
geravam conhecimentos que ao serem aplicados pelo homem trouxeram melhorias às suas
vidas como na agricultura, meteorologia, técnicas de conservação de alimentos, produção de
bebidas, uso de plantas para melhoria da saúde entre outras (Bolls, 1991; Min-Hsien, Song-
Bin, Gwo-Bin, 2010). A partir de meados do século XX, os avanços na área das ciências
biológicas e o domínio de técnicas que viabilizaram o isolamento de células vegetais e
animais e a manipulação genética das mesmas, proporcionou o desenvolvimento de cultura de
células e de tecido in vitro e/ou como aceito por muitos pesquisadores ex-vivo. Desde então,
houve grandes avanços em termos técnicos na utilização de cultura destas células como
modelo de biologia experimental (Bolls, 1991). Assim, utilizando-se da metodologia da
cultura celular mecanismos moleculares, bioquímicos e fisiológicos envolvidos no
desenvolvimento tecidual, seja nos estados patológico ou fisiológico, assim como os
mecanismos de interação entre diferentes moléculas de um mesmo organismo puderam ser
investigados de maneira mais pontual e direta poupando modelos experimentais in vivo. Este
evento também abriu precedentes para que o conhecimento gerado pela pesquisa básica
desenvolvida pela utilização do modelo celular se tornasse uma ferramenta chave na geração
de tecnologia para a comercialização de produtos, por exemplo, medicamentos para o
tratamento de doenças. Marco relevante na aplicação da cultura de células na biotecnologia
ocorreu em 1954, quando pela primeira vez, foram utilizadas células renais de macaco para
produção de vacina contra pólio e em modelo similar, onde células também foram utilizadas
para a produção de vacina veterinária contra febre aftosa (Min-Hsien, Song-Bin, Gwo-Bin,
2010). Desde então, diversos estudos têm utilizado o modelo celular como ferramenta básica
na compreensão do funcionamento e do equilíbrio celular sob diversas condições (Hall,
1988).
Dentro desse contexto, a utilização do modelo celular viabiliza o detalhamento de
questões fisiológicas e bioquímicas envolvidas no equilíbrio celular. Esse conhecimento é
4
certamente revertido em ferramentas da biotecnologia moderna. Atualmente, a produção de
organismos geneticamente modificados, peptídeos sintéticos utilizados na produção de
vacinas, hormônios e drogas deve grande parte do seu sucesso à tecnologia do DNA
recombinante aliada ao modelo de cultura celular. Portanto, validar um modelo de estudo para
investigações das hipertrofias cardíacas mediadas por inflamação, é um importante passo para
a geração de produtos para a indústria biotecnológica. O detalhamento de mecanismos
moleculares envolvidos no desenvolvimento dessas patologias é essencial para que
marcadores moleculares correlacionados as patogenias possam ser identificados e modulados
no intuito de se reverter o quadro patológico. Dessa maneira, o presente projeto procurou
investigar mecanismos de atuação de peptídeos vasoativos na regulação cruzada das proteínas
COX-2 e PTEN, conectando os mecanismos da hipertrofia cardíaca induzida pela inflamação
com elementos supressores tumorais.
1.3 O Sistema Renina-Angiotensina nas hipertrofias cardíacas
Alterações cardiovasculares causadas como respostas adaptativas frente a alterações
hemodinâmicas ou mesmo hormonais no sistema circulatório, têm sido consideradas como
um importante fator de risco para o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca do ventrículo
esquerdo (Franchini, 2001). Um dos fatores que contribui com o aparecimento das
hipertrofias cardíacas e que tem sido bastante evidenciado na literatura é a participação do
Sistema Renina-Angiotensina (SRA) em situações patológicas tais como hipertensão arterial,
infarto do miocárdio ou hiperatividade simpática (Baker e Chernin, 2004; Franchini, 2001;
Gray, 1998; RE, 1987).
Em 1987, foi descrita uma molécula obtida do rim de coelho que possuía a capacidade
de elevar a pressão arterial, a renina (Tigerstedt e Bergmann, 1987). Mais tarde em 1939,
Munoz et al. isolaram uma substância com capacidade vasoconstritora do sangue venoso renal
de cães com constrição da artéria renal, tendo sido denominada por eles de hipertensina. Page
e Helmer (1940) após injetar essa substância em um animal normal observaram que havia
uma atividade vasoconstritora, e então, denominaram esta substância de angiotonina. Mais
tarde alguns estudos mostraram tratar-se das mesmas substâncias. Os termos foram agregados
como angiotensina. Trabalhos futuros que se seguiram esclareceram o mecanismo de
formação das angiotensinas e seu papel na fisiologia cardiovascular (Francini, 2001).
5
O SRA corresponde a um sistema hormonal endócrino, cujo principal papel está
relacionado com o controle da pressão arterial e da homeostasia hidroeletrolítica do
organismo (Fleming, 2005). Na visão clássica do SRA a síntese dos seus peptídeos efetores
ocorre através de uma cascata de eventos onde, a proteína Renina é sintetizada e armazenada
na circulação renal pelas células justaglomerulares das paredes das arteríolas aferentes do
glomérulo renal na forma de uma proenzima, sendo esta liberada após alterações do padrão
hemodinâmico e hidroeletrolítico do sistema circulatório como, alterações na reabsorção de
Na+, aumento ou diminuição da pressão nos vasos ou ativação de adrenoceptores. A
proenzima liberada de 406 aminoácidos é processada a uma pró-renina, que por sua vez é
ativada por uma proteína ainda desconhecida que remove 43 aminoácidos da região N-
terminal desta proteína (RE, 2004).
Uma vez ativada a Renina atua sobre seu substrato, o Angiotensinogênio, que é
sintetizado e liberado na circulação pelo fígado, onde sua síntese é estimulada por diversos
hormônios, incluindo glicocorticoides, hormônio tireoidiano e Angiotensina II. Assim, o
angiotensinogênio é clivado e convertido a Angiotensina I por ação da renina plasmática ativa
(Coates, 2003). Neste contexto, insere-se a Enzima Conversora de Angiotensina-I (ECAI) que
é uma proteína de membrana com sítios ativos expostos para o espaço extracelular. Existem
duas isoformas que são expressas em tecidos de mamíferos. A germinativa, que apresenta
somente um domínio catalítico (C- terminal), e a somática que apresenta dois domínios
catalíticos (N e C-terminal). Na última, os dois domínios tem afinidades por diferentes
substratos e sobre diferentes condições químicas, onde o domínio C-terminal é o responsável
principalmente pela conversão da Ang I a Ang II especialmente no leito vascular pulmonar
(Coates, 2003).
Após sua síntese, a Ang II liga-se aos seus receptores específicos em órgãos-alvos
regulando a homeostase cardiovascular, a pressão arterial e o equilíbrio hidroeletrolítico, tanto
em condições fisiológicas quanto patológicas (Dzau et al., 1988). A Ang II liga-se com alta
afinidade em seus receptores localizados na superfície celular. Há dois tipos principais de
receptores bem caracterizados AT1 e AT2, ambos distribuídos diferentemente em tecidos
centrais e periféricos. Segundo Unger et al. (2002), o receptor AT1 é um receptor com sete
domínios transmembrana, composto de 359 aminoácidos e um peso de 40 kDa, encontrando-
se acoplado a proteína G. Sua sinalização envolve fosfolipase A, C e D, inositol fosfato,
canais de cálcio e uma variedade de serina/treonina e tirosina quinase. Unger et al.(2002),
6
ainda relata que o receptor AT1 está presente em tecidos somáticos e cerebrais,
predominantemente em órgãos e tecidos relacionados com o balanço eletrolítico e regulação
da pressão sanguínea, como glândulas adrenais, células do músculo liso vascular, rim e
coração e que sua estimulação medeia também o crescimento e proliferação de células do
músculo liso vascular. Está envolvida ainda em várias doenças cardiovasculares, renais e
cerebrais, tais como hipertrofia do ventrículo esquerdo, hipertrofia da camada média vascular,
arritmias cardíacas, aterosclerose e glomerulosclerose (Figura 1) (Sadoshima, Izumo, 1993).
Muito se sabe sobre os efeitos da Ang II sobre seu receptor AT1. Em ratos duas
isoformas deste receptor são conhecidas e elas possuem 95% de identidade entre suas
sequencias de aminoácidos. Funcionalmente e farmacologicamente esses dois subtipos do
receptor AT1 são indistinguíveis (Phillips, Speakman e Kimura, 1993). Por sua vez, o
receptor AT2 também é uma proteína com sete domínios transmembrana e possui
aproximadamente 34% de homologia com o receptor AT1. Possui 363 aminoácidos e é
altamente expresso em tecidos fetais, porém, após o nascimento seus níveis caem
significativamente sugerindo sua correlação com os mecanismos moleculares no
desenvolvimento fetal. Além disso, estudos apontam que a expressão desse receptor também
aparece elevada na insuficiência cardíaca, nos processos de reparo após infarto, em lesões de
pele e no sistema nervoso (Unger et al., 2002). O conjunto de dados sugere que o receptor
AT2 esteja envolvido no controle da proliferação e diferenciação celular, angiogênese,
regeneração tecidual e apoptose (Unger et al., 2002; Phillips, Speakman e Kimura, 1993). Um
sumário das particularidades fisiológicas e funcionais dos receptores AT1 e AT2 estão
representados na Figura 1.
A Ang II é o principal produto ativo do SRA, porém, há ainda outros peptídeos
menores que são gerados no sistema cardiovascular a partir da Ang I e da Ang II. Ações
periféricas e centrais do SRA podem ser mediadas por essas sequências menores dos
peptídeos de angiotensina, incluindo Angiotensina-III (Ang-III), Angiotensina-IV (Ang IV) e
Angiotensina-(1-7)(Gembardt et al., 2005) (Figura 2).
7
Figura 1 - Representação sumarizada das ações da Ang II via receptores AT1 e AT2 e Ang-
(1-7) via receptor Mas. Silva, 2013.
A angiotensina–(1-7) é um dos peptídeos da família das angiotensinas que possui
atividade biológica, sendo formada por uma via independente da ECA somática.
Recentemente foi descoberta em humanos e roedores uma nova enzima análoga a ECA com
alta especificidade para clivar angiotensinas. A ECA2, que possui 805 aminoácidos, inclui
uma sequência N-terminal e um único sítio catalítico, apresentando 42% de homologia com a
ECA somática, possuindo diferenças no que diz respeito à especificidade de substrato e sua
atividade não ser alterada pelos inibidores clássicos da ECA. No sistema cardiovascular, a
expressão da ECA2 ocorre predominantemente nas células endoteliais das artérias, arteríolas e
vênulas no coração e no rim (Gembardt et al., 2005).
Hipertrofia cardíaca e do músculo liso; Liberação de aldosterona Supressão de renina; Vasoconstrição; Retenção renal de Na+ e água; ↑Matrix extracelular; Arritmias; ↑Contratilidade Cardíaca ↑Secreção de endotelina
Desenvolvimento Fetal e diferenciação celular; Inibição do crescimento e proliferação celular; Modulação da matriz Extracelular; Apoptose; Reparo tecidual; Vasodilatação; Desenvolvimento do trato urinário e renal; Proteção isquêmica.
Ação antiproliferativa; Redução de arritmias de reperfusão; Antihipertrófico; Vasodilatação; Facilitação do barorreflexo; Modulação da atividade simpática.
8
Figura 2 - Ilustração das vias de formação dos peptídeos do SRA. ECA, enzima conversora
de angiotensina; ECA2, enzima conversora de angiotensina 2; PEP, prolilendopeptidase;
NEP, endopeptidase neutra; PCP, prolilcarboxipeptidase; AP, aminopeptidases. Modificado
de Leung e Carlsson (2001).
No sistema cardiovascular a ECA2 cliva a Ang I gerando o peptídeo Ang-(1-9), que
pode em seguida ser convertido a Ang-(1-7) e essa por sua vez pode ser inativada pela ECA
somática ou outras peptidases ao resíduo inativo Ang-(1-5). A ECA2 pode também
metabolizar diretamente a Ang II para gerar Ang-(1-7). A Ang-(1-9) e a Ang-(1-7) não podem
ser hidrolisadas pela ECA2. Essas ações sugerem ser a ECA2 a principal via de formação da
Ang-(1-7) (Donoughe et al., 2000).
A Ang-(1-7) juntamente com a Ang II, são considerados os principais efetores do
SRA. O papel da Ang-(1-7) como importante peptídeo com ações biológicas distintas dentro
do SRA, foram mostrados em estudos usando o antagonista seletivo das ações da Ang-(1-7), o
D-[Ala7]-Ang-(1-7) (A-779), que forneceram evidências de um receptor para a Ang-(1-7)
distinto dos receptores AT1 e AT2 da Ang II. Santos et al., (2003) caracterizaram o receptor
específico para Ang-(1-7), o protoncogene Mas.
Alguns trabalhos demonstram que a Ang-(1-7) atua como um peptídeo
contrarregulador dentro do sistema renina-angiotensina. A Ang-(1-7) pode atuar como um
9
modulador da ECA tanto no domínio N-terminal da enzima, no qual atua como substrato,
como no domínio C-terminal no qual atua como um inibidor (Tom et al., 2001). Além de
inibir a ECA a Ang-(1-7) inibe as ações da Ang II competindo pela ligação em receptores
AT1 (Ueda et al., 2000; Rowe et al., 1995), alterando a sinalização dos efeitos da Ang II
possivelmente por interferir na disponibilidade de cálcio intracelular (Chansel et al., 2001).
Além disso, a Ang-(1-7) antagoniza os efeitos deletérios da Ang II sobre o aparelho
cardiovascular pela potenciação dos efeitos da bradicinina (Li et al., 1997).
Estudos recentes têm demonstrado que a Ang-(1-7) apresenta ainda efeitos
antiproliferativos e cardioprotetores, contrários aos observados para Ang II (Strawn et al.,
1999). Estes mesmos autores demonstraram ainda que a Ang-(1-7) reduz o crescimento das
células do músculo liso vascular após lesão. Paralelamente, Tallant et al., (2005)
demonstraram que a Ang-(1-7) inibiu o crescimento dos cardiomiócitos através da ativação do
receptor Mas, modulando a síntese de proteínas e a atividade de MAPKs envolvidas com a
hipertrofia de cardiomiócitos. Além disto, Iwata et al., (2005) demonstraram que a Ang-(1-7)
se liga a receptores específicos nos fibroblastos cardíacos, reduzindo os efeitos pró-fibróticos
e hipertróficos da Ang II.
1.4 Hipertrofia Cardíaca e Processo Inflamatório
A hipertrofia cardíaca é uma resposta adaptativa à sobrecarga funcional imposta as
células cardíacas (Dorns et al., 2003). Caracteriza se como um crescimento celular na
ausência de divisão em células já terminantemente diferenciadas como, por exemplo, em
cardiomiócitos. Apesar de evidências epidemiológicas considerarem a hipertrofia miocárdica
como um fator de risco para a ocorrência de diversas doenças cardíacas (Levy et al., 1990), a
resposta hipertrófica nem sempre leva a essa condição. Um exemplo dessa adaptação é o
aumento da massa ventricular esquerda após o nascimento, durante a gestação ou mesmo em
atletas, caracterizando um quadro de hipertrofia fisiológica.
O aumento no volume das células musculares cardíacas pode ser desencadeado por
vários estímulos de origem externa ou interna, hormonais ou mecânicos que podem conduzir
a múltiplas vias de sinalização celular, mudança no padrão de expressão gênica, aumento da
síntese proteica e reorganização de proteínas contráteis nas unidades sarcoméricas dos
cardiomiócitos (Altamirano et al., 2009; Knoll et al., 2003; Petersen e Burleigh, 2003).
10
A sinalização molecular resulta em alterações celulares e no padrão transcricional dos
cardiomiócitos, que culminam na redução na capacidade de contração miocárdica,
sobrecarregando o coração em sua função de bombeamento sanguíneo objetivando manter a
homeostasia cardiovascular. Essa disfunção fisiológica é responsável pela hipertrofia, que se
prolongada conduz à falha cardíaca (Frey e Olson, 2003). Além de estudos moleculares
apontarem uma remodelação no citoesqueleto (Monreal et al., 2008; Chien, 1999), alterações
na sinalização adrenérgica (Lefkowitz et al., 2000) e nos níveis de cálcio intracelular
(Chakraborti et al., 2007; Marks, 2002), assim como aumento na demanda energética das
células do coração hipertrofiado (Taegtmeyer, 2002), algumas particularidades das vias
moleculares nas hipertrofias cardíacas ainda permanecem obscuras.
Cardiomiócitos são células que respondem prontamente a estímulos celulares. Além
de marcadores fenotípicos da hipertrofia, também são detectados aumentos nos níveis de
mRNAs do Fator natriurético atrial (ANF), do Peptídeo natriurético cerebral (BNP) do Fator
transformador de crescimento-b (TGF-b) e de mRNAs de outros genes de expressão
acentuada no início do desenvolvimento como c-fos, c-jun, erg-1 e c-myc (Mendez e La
Pointe, 2005). Também é detectado aumento do depósito de tecidos conectivos no coração na
matriz extracelular, que contribuem acentuadamente com a fibrose do órgão, característica
marcante da hipertrofia patológica, causando redução na viscoelasticidade e contribuindo com
a disfunção sistólica e diastólica (Brower et al., 2006).
Diversos estímulos entre eles os de origem mecânica, fatores de natureza neural,
fatores envolvidos nas sinalizações autócrina/parácrina podem contribuir com o
desenvolvimento das hipertrofias cardíacas. Dentre estes, atenção especial vem sendo dada à
proteína Ciclooxigenase-2 (COX-2), que é um fator proteico diretamente relacionado a
processos inflamatórios, uma vez que esta é responsável pela síntese da Prostaglandina E2
(PGE2) descrita por atuar a favor da instalação de um quadro pró-inflamatório. (Mendez e La
Pointe, 2002; Bamba et al., 1998).
A COX-2 pertence ao grupo das ciclooxigenses ou Prostaglandina G/H sintases que
são oxigenases que atuam na formação de peróxidos bicíclicos a partir da oxigenação de
ácidos graxos poliinsaturados (Marnett et al.,1999). Duas isoformas principais desta proteína
são conhecidas. A COX-1 que é a enzima de expressão constitutiva presente na maioria dos
tecidos, e a COX-2, que em muitos tipos celulares é a forma induzível em resposta a vários
estímulos, inclusive a citocinas (LaPointet al., 2004; Vane et al., 1998). LaPoint e Isenovic
11
(1999) estudando a função de COX-2 demonstraram que em cardiomiócitos, assim como em
outros tecidos, a proteína se encontra em baixíssimos níveis em condições normais porque o
mRNA de COX-2 é rapidamente degradado, mas é prontamente expressa, via atuação do fator
de transcrição NF-B, além do aumento da estabilidade deste mRNA (Sully et al., 2004;
Warner e Mitchell, 2004; Shao et al., 2000; Sadoshima e Izumo, 1993), mediante uma
resposta inflamatória ou outras condições patofisiológicas. Esta relação pode ser explicada
pelo fato da COX-2 ser a enzima limitante da produção de prostaglandina (PG), importante
mediador inflamatório pela via do Ácido Araquidônico (AA) (Smith e Marnett, 1991; Vane e
Botting, 1990).
Estudos apontam que em cardiomiócitos humanos originados de corações com falhas
cardíacas, são identificadas alterações nos níveis da proteína COX-2 (Wang et al., 2009;
Wong et al., 1998;). LaPointe et al., (2004) demonstraram que a inibição da COX-2 em
miocárdios infartados diminuiu a hipertrofia e a fibrose das células cardíacas de ratos.
Demonstraram ainda que diante um processo inflamatório, cardiomiócitos ventriculares de
ratos neonatais apresentam um aumento local da proteína COX-2, que possui ação
fundamental na via de síntese das prostaglandinas. A PGE2 é sintetizada a partir de estímulos
que ativam a fosfolipase A2 cálcio dependente (PLA2) que atua hidrolisando fosfolipídeos da
membrana plasmática produzindo o ácido araquidônico (AA). Um anel ciclopentano é então
formado e, a enzima COX, através do seu sítio ciclooxigenase, introduz quatro átomos de
oxigênio. O sítio hidroxiperoxidase da COX catalisa a transferência de 2e- de um grupamento
15-hidroxiperoxi para um grupamento 15-hidroxila dando origem à prostaglandina G2
(PGG2) que é convertida em prostaglandina H2 (PGH2), substrato de diversas enzimas
conhecidas como prostaglandinas sintases. Estas enzimas são responsáveis pela produção de
diversas PGs, dentre elas a prostaglandina E2 (PGE2), que é a mais abundante no corpo
humano e está relacionada com a resposta imunológica. Além das PGs, tromboxano e
prostaciclinas também são produzidos nesta via como mostrado na Figura 3 (Wang, 2007;
Greenhough et al., 2009).
12
Figura 3 - Cascata enzimática da síntese das Prostaglandinas (PGS). Adaptado de Mollace et
al.(2005).
As PGs atuam na célula através da sua ligação aos receptores transmembrana acoplados
à proteína G denominados EPs possuindo 4 isoformas. Quando ativados estes receptores
estimulam diferentes vias de sinalização, algumas delas envolvidas com o aumento ou
diminuição de cAMP, ativação de trifosfato inositol e aumento dos níveis de cálcio
intracelular (Dorsan e Gutkind, 2007; Sugimoto e Narumiya, 2007). Diversos trabalhos
utilizando diferentes tipos de células têm correlacionado o aumento dos níveis de PGE2 com a
instalação de um quadro pró-inflamatório que quando prolongado, pode conduzir ao
desenvolvimento de doenças relacionadas a um processo inflamatório crônico, como por
exemplo, tumores e hipertrofia (Greenhough et al., 2009; Langenbach et al., 1999).
13
1.5 Correlação das proteínas PTEN e COX-2 na instalação do processo hipertrófico
de origem inflamatória
Considerando-se os mecanismos de ação da proteína COX-2 num organismo, nas
células tumorais e cardíacas evidências crescentes indicam uma correlação do processo
inflamatório mediado pela proteína COX-2 com os mecanismos de ação da proteína
supressora tumoral PTEN (St-Germain et al., 2004).
A proteína PTEN, fosfatase e tensina homóloga, foi identificada em 1997 (Li et al.,
1997) como um gene supressor tumoral frequentemente mutado ou deletado em câncer. PTEN
é uma proteína envolvida diretamente com o ciclo celular e conhecida por atuar em
mecanismos tumorais, na migração e sobrevivência celular, e na apoptose (Lee et al., 2008;
Yamada e Araki, 2001). Foi demonstrado ainda o papel dessa proteína na própria
morfogênese cardíaca e na angiogênese pós-natal (Hamada et al., 2005). Diversos autores
(Oudite et al., 2008; Schwartzbauer e Robbins, 2001) mostraram também que a perda e/ou
inativação de PTEN na fase adulta pode atenuar o desenvolvimento de hipertrofias
patológicas e falhas cardíacas, demonstrando assim, a relevância dessa proteína nas
hipertrofias cardíacas.
A proteína PTEN se caracteriza como uma tirosina fosfatase. É a principal molécula
reguladora negativa de fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3) e da via de sinalização
celular mediada pela proteína Akt/PKB (proteína quinase B) (Oudit et al., 2004)(Figura 4)
que pode também ter sua atividade modulada pela Ang II e Ang-(1-7). A sinalização por
PTEN é um processo evolutivamente conservado em diferentes espécies, reforçando a sua
relevância para a manutenção da integridade do organismo (Oudit et al., 2004). A enzima
PI3K (Fosfatidilinositol-3 quinase) fosforila fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato (PIP2) no
segundo mensageiro fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), cujos níveis controlam a
atividade da Quinase 1 dependente de fosfoinositídeos-3 (PDK-1) e subsequentemente a
atividade de Akt. PTEN atua nesta via de sinalização molecular por atuar na reversão de PIP3
a PIP2, controlando os níveis de PIP3 e com isso as reações dependentes de Akt (Mocanu e
Yellon, 2007).
Tem sido demonstrado que a relação entre o aumento na expressão de COX-2 e
diminuição na expressão de PTEN pode estar correlacionado entre si e juntos com a
malignidade de tumores (Serra et al., 2012; Roos et al., 2007). Estudos demonstram ainda que
em células tumorais, PTEN correlaciona-se de maneira indireta com a expressão de COX-2,
14
modulando a atividade de Akt que estimula a síntese da ciclooxigenase (Covey et al., 2007;
St-Germain et al., 2004). Um estudo realizado por Lee et al., (2008) com macrófagos
Raw.264.7, a indução do processo inflamatório com lipopolissacarídeo (LPS) pode ser
modulado pelos níveis de PTEN. Ainda, Li et al., (2011) demonstram o efeito negativo da
proteína COX-2 na atividade de PTEN, considerando-se, que COX-2 estimula a fosforilação
de PTEN em vários dos seus resíduos de serina e treonina pela mediação da proteína caseína
quinase 2 (CK2), inativando a atividade fosfatásica de PTEN, e amplificando o processo
proliferativo nos osteoblastos. Provavelmente os mecanismos pró-inflamatórios
desencadeados por COX-2 também favoreçam a retro inibição de PTEN, amplificando o
processo inflamatório como exemplificado na Figura 4.
De maneira geral, COX-2 está envolvida nos processos inflamatórios, mas a
regulação das vias de sinalização celular envolvidas na síntese dessa proteína em hipertrofia
cardíaca ainda precisa ser compreendida.
Figura 4 - Representação da interação
molecular entre as proteínas PTEN e
COX-2 na modulação do processo
hipertrófico mediado por infamação. Silva,
2013.
CK2
15
1.6 Sinalização Celular nas Hipertrofias Cardíacas de origem inflamatória
A Ang II, um dos principais peptídeos efetores do SRA, possui um papel crítico que
afeta o funcionamento de órgãos incluindo o coração. Estimulação aguda por este peptídeo
regula o equilíbrio hidroeletrolítico, a vasoconstrição e modula a pressão sanguínea, enquanto
a estimulação crônica pode conduzir a um quadro hipertrofia em cardiomiócitos e a
hiperplasia em fibroblastos (Mehta e Griendling, 2006). Outro efetor importante do SRA é o
peptídeo Ang-(1-7) que atua como um peptídeo contrarregulador dentro do sistema renina-
angiotensina (Tom et al., 2001). Este peptídeo inibe as ações da Ang II competindo pela
ligação em receptores AT1 (Ueda et al., 2000; Rowe et al., 1995), alterando a sinalização dos
efeitos da Ang II possivelmente por interferir na disponibilidade de cálcio intracelular
(Chansel et al., 2001). Estudos recentes têm demonstrado que a Ang-(1-7) apresenta ainda
efeitos antiproliferativos e cardioprotetores, contrários aos observados para Ang II. Strawn et
al. (1999) demonstraram ainda que a Ang-(1-7) reduz o crescimento das células do músculo
liso vascular após lesão. Sabendo da importância desses peptídeos no desenvolvimento das
hipertrofias, diversos estudos têm focado nas vias pelas quais ocorre a sinalização celular que
conduz a este quadro. Diversos autores têm demonstrado que os peptídeos Ang II e Ang-(1-7)
ao se ligarem nos seus receptores específicos, AT1 e AT2 para a Ang II e, Mas e AT1 para
Ang-(1-7), desencadeiam a sua ativação e consequentemente ativação em cascata de diversas
proteínas envolvidas na ativação de um padrão transcricional característico das hipertrofias
induzidas pelo SRA.
Uma vez ligada ao receptor AT1, a Ang II ativa uma cascata de sinalização que regula
vários efeitos patofisiológicos. Tradicionalmente a via de sinalização induzida por este
peptídeo vasoativo tem sido dividida em duas classificações, sinalização acoplada à proteína
G e sinalização não acoplada a proteína G (Mehta e Griendling, 2007). Proteína G é uma
proteína heterotrimérica acoplada ao receptor (GPCR) e consiste em sete domínios
transmembranas que se dividem em três subunidades (α, β e γ)(Rockman et al., 2002). A
ligação de uma agonista leva a dissociação das subunidades Gα e Gβγ, seguida da ativação
das vias de sinalização à jusante (Gutkind, 1998 a, b; Rockman et al., 2002).
D’Angelo et al., 1997, demonstraram que camundongos transgênicos
superexpressando Gαq desenvolveram hipertrofia cardíaca. Porém, camundongos que não
expressam a proteína G (αq/11) nos cardiomiócitos e camundongos transgênicos expressando
um peptídeo que inibe Gq acoplado ao receptor, não mostrou desenvolvimento de hipertrofia
16
ou resposta a sobrecarga de pressão (Akhter et al., 1998; Wettschureck et al., 2001).
Juntos esses estudos sugerem que a sinalização pela proteína G (αq/11) é importante para a
indução da hipertrofia patológica.
A ativação dos receptores AT1 acoplados a proteína G pela Ang II, promove a
ativação de Fosfatidil-inositol -3 -quinase [PI3K (p110γ)] que esta envolvida na ativação de
vias que conduzem a um estresse e diminuição na contratilidade cardíaca. Camundongos com
o gene da PI3K(P110γ) deletado mostraram menor hipertrofia e fibrose sugerindo, portanto,
que a ativação do subtipo PI3K(P110γ)/AKT estaria envolvido na instalação do processo
inflamatório/hipertrófico (Oudit et al., 2003).
AKT ou proteína quinase B é uma proteína quinase Serina-Treonina altamente
expressa no tecido cardíaco de ratos e está relacionado ao crescimento celular e tecidual.
Estudos têm demostrado uma redução do volume tecidual em camundongos quando o gene
que codifica para esta proteína encontra-se deletado ou mutado (Matsui e Rosenzweig, 2005).
Além disto, têm-se sugerido que a isoforma AKT1 esteja relacionada ao crescimento
hipertrófico, uma vez que a sua deleção diminuiu o quadro de hipertrofia em camundongos
(DeBosch et al., 2006b). St-Germain et al., (2004) demonstraram em seus estudos uma
correlação entre a ativação de AKT e a ativação do fator transcricional Nf- κB onde, AKT
fosoforilada promove a fosforilação do IκB nos resíduos de serina marcando-o para
ubiquitinação e degradação pelo proteassoma com respectivo aumento da expressão da
proteína COX-2. Portanto, alteração na expressão de PTEN que inversamente regula os níveis
de AKT, poderia influenciar a expressão da enzima COX-2, envolvida no processo
hipertrófico mediado por inflamação.
AKT fosforilada promove ativação de elementos sinalizadores a jusante como a
Calcineurina, uma fosfatase que atua sobre Nfat-3 (Figura 5) (Macián et al., 2001). A
remoção de um grupo fosfato do fator trancricional Nfat-3 torna-o ativo, promovendo assim,
sua translocação do citoplasma para o núcleo onde exercerá suas funções como fator
transcricional, fundamental na transcrição de genes relacionados à hipertrofia (Macián et al.,
2001). A Ang II promove ainda a inativação da Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) que
é considerada um potente inibidor da via à jusante de calcineurina atuando como reguladora
desta via onde GSK-3β fosforilaria Nfat-3 e assim promoveria sua exportação do
núcleo(Abrahan et al., 2012).
17
Por outro lado, a Ang II pode se ligar aos receptores AT1 acoplados à proteína G
levando a ativação de Gαq/11 à jusante e de proteínas sinalizadoras incluindo Fosfolipase A2
(PLA2), Fosfolipase C (PLC), Fosfolipase D (PLD). Proteína quinases ativadoras de
mitogênese (MAPKs), Proteína Quinase A (PKA) e Proteína quinase C (PKC) como pode ser
observado na figura 5 (Ushio-Fukai et al., 1999).
Particularmente, a Ang II tem sido descrita como um elemento capaz de fosforilar e
ativar PLA2, que, conforme descrito anteriormente, leva a ativação da via do ácido
araquidônico e de metabólitos essenciais na manutenção do tônus vascular e além disto
modula o processo inflamatório pela produção de prostaciclinas, prostaglandinas e
tromboxanos. Há também a ativação de PLC que conduz a produção Inositol-1, 4, 5-trifosfato
(IP3) e Diacilglicerol (DAG), como mensageiros secundários. O IP3 produzido se liga a seus
receptores na membrana do retículo sarcoplasmático, abrindo os canais de Ca+2
e aumentado o
influxo para o citoplasma (Yan et al., 2003) e DAG ativa PKC que atua como efetor da
ativação das vias Ras/Raf/MEK/ERK. Estas moléculas contribuem com as propriedades
vasoconstritoras da ativação do receptor AT1 e levam a Ang II a promover a transcrição de
genes relacionados ao crescimento celular (Figura 5). PLD ativada promove a hidrólise de
fosfatidilcolina (PC) e ácido fosfatídico (PA). E este rapidamente converte DAG levando a
ativação de PKC (Touyz et al., 2000). As MAPKs entre elas Quinases Reguladoras de Sinal
Extracelular (ERK1/2), JNK e p38 MAPKs também são ativadas por Ang II e estão
envolvidas na síntese proteica, transporte, regulação do volume celular, expressão gênica e
crescimento celular (Sugden et al., 1997). As quinases serina/treonina também desempenham
fundamental papel na hipertrofia inflamatória cardíaca. PKC é considerada uma proteína
sinalizadora essencial, podendo ser ativada diretamente pela proteína G ou por outros
elementos envolvidos na sinalização celular, e também ativa proteínas quinases relacionados
com a transcrição de genes promotores da hipertrofia celular (Dorne e Force, 2005).
18
Figura 5 - Esquema mostrando as principais vias de sinalização celular no processo
inflamatório/hipertrófico quando induzido pelo peptídeo vasoativo Angiotensina II em células
cardíacas (Silva, 2013).
Tanto nas vias sinalização celular mediada pelos receptores de Ang II acoplado a
proteína G, quando nas vias independentes desta proteína, há uma ativação de fatores
transcricionais envolvidos na transcrição de genes relacionados ao processo hipertrófico e
inflamatório, entre eles o NF-κB, o AP-1, Nfat-3. Estudos apontam que esses fatores de
transcrição também se encontram em seu estado ativado em muitos processos inflamatórios
em cardiomiócitos (Smeets et al., 2008), e que a utilização de inibidores COX-2 atenua os
efeitos da Ang II nessas células (Wu et al., 2005; Wang et al., 2010), corroborando mais uma
vez com a existência de uma ligação na sinalização celular nessas células, sugerindo a
ativação de processos inflamatórios/ hipertróficos.
Sabendo que a Ang-(1-7) pode exercer efeitos opostos àqueles propostos para a Ang II
atuando na melhoria das funções cardíacas (Ferreira et al., 2005; Grobe et al., 2007; Wang et
al., 2010; Ferrario, 2011; Kar et al., 2011) e na própria homeostase cardíaca pela redução da
produção de colágeno pelos fibroblastos cardíacos, pela modulação da ativação de quinases e
a própria redução da enzima COX-2 (Collum et al., 2012), atuando assim modulando a
19
resposta celular na contramão àquela sugerida para a Ang II .As ações antagônicas da Ang(1-
7) (Figura 6) se devem pela inibição da atividade de ECA na síntese de Ang II, na modulação
da ativação de MAPK envolvidas na transcrição de genes relacionados à hipertrofia (Gomes
et al., 2012), além da fosforilação de AKT/ PKB, que apresenta mecanismos específicos de
atuação nos diferentes tecidos (Munoz et al., 2010). Mc Collum et al., (2012) demonstraram
que Ang-(1-7) inibe a fosforilação e ativação de MAPK, como as ERK1/2, p38 e JNK e
consequentemente dos fatores transcricionais por elas ativadas como o NF-κB e o AP1
relacionados à transcrição de COX-2. A inibição destas MAP K também está relacionada com
a diminuição da síntese de prostaglandina E2 por células hepáticas, e também do processo
inflamatório e fibrose, sugerindo, portanto, que esta via de sinalização celular poderia no
tecido cardíaco conduzir a um quadro inflamatório/hipertrófico.
Estudos têm demonstrado ainda que Ang-(1-7) ativa receptores Mas acoplados a
proteína G promovendo uma indução e ativação da via PI3K(p110α) /AKT e esta estaria
envolvida no bloqueio dos efeitos da Ang II na promoção da hipertrofia patológica
(McMullen et al., 2004b). Assim como, Ang-(1-7) pode modular a ativação do fator
transcricional Nfat-3, impedindo sua translocação para o núcleo e a ativação de genes
relacionados à hipertrofia (Gomes et. al., 2012). A Ang-(1-7) ainda modula a atividade de
GSK-3β impedindo sua inativação, e consequente inibição da ativação do fator transcricional
Nfat-3. A modulação destas duas proteínas Nfat-3 e GSK-3β pela Ang-(1-7) têm reforçado o
papel anti-hipertrófico deste peptídeo (Gomes et. al., 2012).
Nas vias de sinalização AKT/Nfat-3, Pten, é uma importante proteína envolvida na
regulação dos níveis de PIP3, uma vez que esta proteína, ao contrário de PI3K que fosforila
PIP2 a PIP3, Pten possui atividade fosfatásica convertendo PIP3 a PIP2, regulado assim, as
vias de sinalização subsequentes como exemplificado na Figura 6 (Oudit et al., 2004). Assim
faz-se necessário conhecer o padrão de expressão desta proteína em células induzidas tanto
com Ang II, quanto com Ang-(1-7) e estabelecer vias de conexão entre estas proteínas e sua
influencia na expressão de COX-2 essencial na instalação do processo
inflamatório/hipertrófico.
20
Figura 6 - Esquema mostrando as principais vias de sinalização celular no processo
inflamatório/hipertrófico quando induzido pelo peptídeo vasoativo Angiotensina-(1-7) em
células cardíacas (Silva, 2013).
1.7 miRNAs e o processo hipertrófico
A regulação precisa da expressão gênica é vital para o desenvolvimento dos
organismos vivos. E esta regulação depende de múltiplos mecanismos que ocorrem a nível
transcricional, pós-transcricional e pós-traducional (Busk e Cirera, 2010). Entre eles
demonstrou-se um mecanismo de controle da expressão gênica que é dado por ação de
pequenos RNAs de interferência, os MicroRNAs (miRNAs) (Ambros, 2003; Winter et al.,
2009). miRNAs são pequenas moléculas de RNA fita simples que possuem entre 20 a 23
nucleotídeos, endógenas, envolvidos na regulação da expressão pós-transcricional de genes,
ligando-se a sequencias específicas de mRNA promovendo a sua degradação ou a repressão
21
da tradução (Bartel, 2004; Winter et al., 2009). Atuam principalmente pelo seu pareamento à
região 3’ não traduzida de mRNAs alvos, que podem ser vários para um mesmo miRNA (Liu
e Olson, 2010; Lewis et al, 2005). miRNAs têm sido descritos envolvidas em processos
biológicos entre eles o desenvolvimento de patologias cardiovasculares (Barry et al., 2008;
Scalbert e Bril, 2008).
A biogênese destes miRNAs ocorre por meio da sua transcrição por uma RNA
polimerase II que origina uma molécula primária denominada miRNA primário (pri-miRNA),
que contém desde um a múltiplos miRNAs. Essas moléculas são encontradas em regiões
intergênicas, intrônicas ou em exôns do genoma. Os pri-miRNAs possuem uma estrutura em
hairpin e são clivados por ribonuclease III. Quando localizado ainda no núcleo, esses pri-
miRNAs são clivados pela enzima Drosha (Winter et al., 2009; Bartel, 2004; Lee et al.,
2004), formando assim, pré-miRNAs com cerca 60 nucleotídeos. Essas moléculas originadas
são translocadas para o citoplasma pelo complexo Exportina5/Ran-GTP e então clivados pela
enzima Dicer, uma outra ribonuclease III, clivando essas moléculas precursoras em duplexes
com 20 - 23 nucleotídeos (Chendrimada et al, 2005). Na maioria das vezes umas das fitas do
duplex se transforma no miRNA maduro e a outra fita é degradada (Liu e Olson, 2010). A
molécula de miRNA maduro é então incorporada ao Complexo Indutor de Silenciamento de
RNA (RISC) que esta envolvido no processo de RNA interferência (RNAi), pelo
reconhecimento de alvos específicos (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003), quando
parcialmente pareado com a molécula alvo promove a inibição da sua tradução ou
completamente pareado à molécula direciona-a para degradação (Fillipowicz et al., 2008).
Assim, miRNAs maduros possuem a capacidade de interferir na tradução de proteínas,
interferindo na expressão gênica. Um esquema mostrando a biossíntese de miRNAs pode ser
visualizado na Figura 7.
Estudos vêm sendo realizados no intuito de se identificarem miRNAs relacionados a
processos hipertróficos cardíacos (Zhu et al, 2011; Thum, 2007; Yang et al., 2007). Em
tumores o miR-26b parece se correlacionar com a modulação dos níveis de PTEN (Tay et al.
2001), além do miR-1 e miR-21 que tem sido demonstrado regular diretamente o processo
hipertrófico (Wang e Yang, 2012; Yang, et al., 2007), o que sugere que PTEN poderia atuar
de maneira direta ou indireta no controle de vias inflamatórias cardíacas. Contudo, até o
momento nenhum estudo foi realizado buscando se detectar a expressão de miRNAs no
processo hipertrófico cardíaco mediado pela inflamação em modelo celular de hipertrofia
22
induzida por peptídeos vasoativos e a sua correlação com a expressão de supressores
tumorais, considerando-se que em células tumorais a inflamação crônica é característica
marcante.
Figura 7 - Esquema da Biossíntese de miRNAs. Adaptado de Winter et al. (2009).
A atividade pró-inflamatória da proteína ciclooxigenase-2 (COX-2) é apontada como
importante na regulação desse mecanismo hipertrófico mediado por inflamação (Mollace et
al., 2005; Mendez e La Pointe, 2002; Bamba et al., 1998). Diversos estudos apontam alguns
miRNAs envolvidos na regulação dos níveis da enzima COX-2. Jing et al.(2005),
demonstraram que miR-16, ao se ligar a porção 3’-UTR do mRNA Cox-2 promove a sua
degradação. Outros estudos detectaram também o miR-26a/b (Ji et al., 2010), o mir-101
(Strillacci et al., 2009) como elementos moduladores dos níveis de COX-2. Em paralelo,
estudos com proteína PTEN demonstram seu envolvimento nas hipertrofias cardíacas
patológicas (Cheng e Zhang, 2010; Oudit et al., 2008; Jacobshagen et al., 2008; Mocanu e
Yellon, 2007 Crackower et al., 2002). Estudos ainda demonstram que a regulação negativa da
proteína PTEN favorece processos inflamatórios, além de alguns miRNAs possuírem
afinidade por ambas as proteínas (Li et al., 2011; St-Germain et al., 2004) sugerindo que
23
PTEN poderia atuar de maneira direta ou indireta no controle de vias inflamatórias cardíacas,
considerando-se a competição endógena de microRNAs comuns a Cox-2. Assim a validação
de um modelo no qual pudesse estabelecer os possíveis mecanismos de regulação dos níveis
das proteínas COX-2 e PTEN no processo hipertrófico inflamatório, e levantando o possível
envolvimento de miRNAs no controle da expressão destas proteínas, seria de grande
importância para agregar conhecimento ao estudo destas patologias.
1.8 Justificativa
O aumento nos níveis da proteína COX-2 apontam a sua importância no papel
inflamatório relacionando a com as hipertrofias cardíacas. Além disto, estudos da proteína
PTEN demonstram seu envolvimento direto nas hipertrofias cardíacas patológicas e que sua
regulação negativa favorece processos inflamatórios. Assim, estabelecer um modelo funcional
de estudo baseado em cultura celular, visando o futuro desenvolvimento pela indústria
farmacêutica de métodos de diagnósticos e tratamentos, viabiliza a proposta do presente
estudo em validar um modelo celular para estudo das hipertrofias cardíacas mediadas por
inflamação, além de investigar uma possível correlação entre proteínas COX-2 e PTEN,
importantes em processos inflamatórios tumorais e cardíacos.
24
2. OBJETIVOS
25
2.1 Objetivo Geral
Estabelecer um modelo celular para estudo da modulação dos níveis das proteínas
COX-2 e PTEN, quando do estímulo com agentes indutores da hipertrofia cardíaca mediada
por inflamação.
2.2 Objetivos Específicos
Padronização das condições da cultura de células H9c2;
Validação da concentração dos peptídeos vasoativos utilizados na cultura celular em
ensaios de citotoxidade;
Avaliar a expressão de receptores específicos para os agentes indutores Ang II e Ang-
(1-7);
Determinação de mecanismos hipertróficos/ inflamatórios na cultura celular pela
mensuração da área celular e pela mensuração dos níveis de PGE2;
Analisar o padrão de transcrição de genes envolvidos na indução do processo
hipertrófico mediado por inflamação;
Acompanhar os níveis de expressão proteica de PTEN, COX-2 e da proteína
constitutiva β-Actina, nos diferentes ensaios celulares;
Analisar o padrão de transcrição de miRNAs potencialmente moduladores dos níveis
das proteínas estudadas;
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
27
3.1 Técnicas básicas de Biologia Molecular
Técnicas usuais em biologia molecular utilizadas encontram-se descritas em Sambrook
et al. (2001).
3.2 Cultura celular e simulação de condições hipertróficas/ inflamatórias.
Culturas da linhagem celular H9c2 (American Type Culture Collection, ATCC: CRL-
1446), oriundas de tecido cardíaco de embrião de rato, foram crescidas em garrafas de 175cm2
com meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro
bovino fetal (FBS) (Gibco®), 100 unidades (U)/ ml de antibiótico-antimitótico (Penicilina e
Estreptomicina/Gibco®
) a 37°C e em atmosfera contendo 5% CO2.
Culturas da linhagem celular H9c2 ao atingirem confluência de aproximadamente 80%
foram ou não estimuladas a desenvolver condições simuladoras de hipertrofias com Ang II
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 10 µM, e também induzidas por Ang-(1-7)(Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 1 µM descrita por muitos autores como possuindo um efeito
oposto aos observados quando induzidos por Ang II. As células foram incubadas a 37°C em
5% CO2. As amostras foram coletadas previamente a indução com os peptídeos (tempo de 0
h) e após 2, 6, 12, 24 e 48 horas de indução com os mesmos.
3.3 Viabilidade Celular
O teste do MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
baseia-se na redução dos sais amarelos de tetrazólio por redutases mitocondriais de células
metabolicamente ativas. Nesse ensaio formam-se, intracelularmente, cristais azuis que são
solubilizados e posteriormente analisados por espectrofotometria. Deste modo, quanto menor
for a viabilidade celular, menor será a redução do MTT e menor o sinal espectrofotométrico.
A determinação da viabilidade celular foi realizada adaptando-se a metodologia
descrita por Mosman et al. (1983). Para análise da viabilidade, as células foram incubadas por
0 h, 2h, 6h, 12h, 24h e 48h a 37ºC em atmosfera de 5% CO2 e quando atingiram confluência
de 80% foram induzidas com os peptídeos Ang II a 10 µM (Smmets et al., 2008 ) e Ang-(1-7)
a 1 µM (Santos et al., 2003). O sobrenadante das células foi recolhido e posteriormente
28
adicionado 100 µL de meio de cultura novo na concentração final de 0,5 mg/mL. A seguir, a
placa foi incubada em estufa de cultura por 3 horas até a formação de cristais de formazam. O
sobrenadante contendo meio e MTT foram removidos e os cristais formados foram
dissolvidos em 100µL de DMSO sob agitação por 30 minutos. A leitura da absorbância em
570 nm foi realizada em leitor de microplacas utilizando-se o solvente DMSO como branco.
3.4 Análise da expressão do mRNA dos receptores de Ang II e Ang-(1-7)
3.4.1 Extração de RNA total e obtenção do cDNA
Células da linhagem H9c2 foram crescidas e induzidas conforme anteriormente
descrito. Em seguida, as células aderidas a uma garrafa de 175 cm2
com aproximadamente um
número total de 1,5 x 106
foram coletadas e o RNA total destas células foram extraído
utilizando-se 1mL de TRIzol™ Reagent (Invitrogen), a amostra foi homogeneizada. A seguir
a fração insolúvel do homogenato foi precipitada por centrifugação a 12.000g por 10 minutos
a 4ºC e o sobrenadante foi coletado e transferido para um novo microtubo de 1,5 mL e
incubado por 5 minutos a temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos
complexos de nucleoproteínas. Foram então adicionados 0,2 mL de clorofórmio (Sigma – St.
Louis, Mo, USA) para cada um 1 mL de TRIzol™. A mistura foi homogeneizada com o
auxílio de um vórtex e incubados a temperatura ambiente por 3 minutos.
Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 10 minutos a 4ºC. A
fase aquosa foi transferida para um novo tubo. Para precipitar o RNA presente nesta fase,
utilizou-se 0.5 mL de Álcool Isopropílico para cada 1 mL de TRIzol™ utilizado
anteriormente. Esta mistura foi incubada a temperatura ambiente por 10 minutos e seguiu-se
com uma centrifugação a 12.000 g por 10 minutos a 4ºC. A seguir foi feita a lavagem do pelet
contendo o RNA precipitado com 1 mL de Etanol 70% e centrifugado a 7.500 g por 5 minutos
a 4 ºC. O sobrenadante foi então removido e o pelet secado a temperatura ambiente por 5
minutos. A pureza e a quantificação dos RNAs foram determinados utilizando
espectrofotômetro para avaliar as relações entre os comprimentos de onda 260/280 nm e
260/230 nm indicativos de pureza da amostra.
Além dos parâmetros avaliados no espectrofotômetro, a qualidade dos RNAs extraídos
foram ainda realizados utilizando uma alíquota desta amostra para a transcrição reversa e
polimerização em cadeia do gene normalizador β-actina.
29
Figura 8 - Amplificação de β-actina obtida do cDNA sintetizado a partir da
extração de RNA total de células H9c2. O RNA total foi extraído utilizando o reagente
TRIzol™ e seguindo-se as recomendações do fabricante. Foram utilizadas células H9c2
induzidas com Ang II e Ang-(1-7) respectivamente nas concentrações de 10 µM e 1 µM nos
tempos 0h, 2h, 6h, 12h, 24h e 48h. Foi realizada a síntese do cDNA por transcrição reversa e
este utilizado para realização da PCR do normalizador β-actina.
A primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando 1µg de RNA total extraído e o Kit
High Capacity RT-PCR System® (Applied Biosystems), seguindo as recomendações do
fabricante. Para as reações, 1µg de RNA total; 10 mM de oligonucleotídeos randômicos (10x
RT Random primer); 10 mM de dNTPs [ 25x dNTP Mix (100 mM)]; 1,25 U da enzima Muiti
ScriptTM
Reverse Transcriptase, e água livre de RNAse para um volume final de 10µL. A
mistura foi incubada a 25ºC por 10 minutos, seguidos de 120 minutos a 37ºC e 85º por 5
minutos, com o auxilio de um termociclador. A amostra ficou estocada a -20º até o momento
do uso.
3.4.2 Reação de PCR Semi-Quantitativo
A técnica de PCR semi-quantitativo foi utilizada para verificar o perfil da expressão
relativa dos receptores de Ang II e Ang-(1-7). Para isto, primeiramente foram desenhados
oligonucleotídeos específicos conforme demonstrado na Tabela 1. As reações de
polimerização em cadeia (PCR) foram realizadas em volume final de 25 μl, utilizando 3 μl de
cDNA na sua concentração real; 0,4 μM de cada oligonucleotídeo; 1,5 mM de MgCl2; solução
tampão para PCR (1X), 250 μM de dNTP e 1,25 U da enzima Taq DNA polimerase. A
amplificação foi conduzida em termociclador com o programa: 95ºC por 3 minutos uma vez,
95ºC por 1 minuto seguido da da temperatura de anelamento específica para o primer em
questão por 1 minuto, seguido de 72°C por 45 segundos durante 36 ciclos e a 72ºC por 10
30
minutos. A visualização dos produtos amplificados (amplicons) foi feita em gel de agarose a
0,8% seguindo metodologia básica descrita em Sambrook et al. (2001).
Tabela-1. Oligonucleotídeos utilizados para análise da expressão relativa dos receptores de
Ang II e Ang-(1-7)
Gene receptor Sequencia Tm
Agtr1a F:5' CGCCCTTCGGATAACATG 60°C
R:5' CCCACCAATCCATCCAGC 61°C
Agtr1b F:5' GGGTTCAAAGCCTGCAAG 59°C
R:5' AGTACCCTCCTCCCTAACC 58°C
Agtr2 F:5' GGCTCTTTGGACCTGTGATG 60°C
R:5' AAGGCAATCCCAGGACAG 59°C
MAS F:5' ATATGACATCCTTTGCTGAG 53°C
R:5' CTCTCGGCTTTGTGGAGAAC 54°C
3.5 Microscopia de Fluorescência
1,5 x 104
células H9c2 foram cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços,
próprias para cultivo celular. As células foram crescidas até atingirem 80% de confluência
para realização das induções com os peptídeos vasoativos. Em seguida o material foi fixado
em formaldeído a 3.8% por 7 minutos a 37ºC e lavado 3 vezes por 6 minutos com solução
salina de fosfato (PBS) 0,5 x (1 x PBS 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de
Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4 e água deionizada para completar 1 litro) sob agitação constante.
Em seguida, as lamínulas contendo as células foram incubadas com solução de albumina
bovina (BSA) a 1% por 2 h para bloquear marcações inespecíficas. As células foram então
utilizadas nas marcações fluorescente do núcleo e do citoesqueleto.
Para a marcação do citoesqueleto material foi incubado com Faloidina–TRICT
(Sigma) a 100μg/ mL em solução de BSA a 1% por 1 h e 30 min, e lavado 3 vezes
consecutivas em PBS 0,5 X por 6 minutos. Em seguida as lâminas foram incubadas com o
marcador nuclear DAPI (4,6 diamino-2-fenilindol) a 3,33 ng/ mL diluídas em PBS 1 x, por 3
minutos, e extensivamente lavadas novamente com PBS. Em seguida as lamínulas foram
analisadas com o auxílio de um microscópio de epifluorescência modelo Leica DMLB com
sistema fotográfico Leica MPS-30.
31
3.6 Mensuração da área celular
Imagens foram capturadas no aumento de 40x e as imagens obtidas foram analisadas
com o auxilio do programa ImageJ ®
versão 1.45S, Wayne Hasband. Para as análises
realizadas em cada condição estudada foram utilizados um N=100 células.
3.7 Dosagem de Prostaglandina E2
O sobrenadante das células induzidas com os peptídeos Ang II a 10 µM e Ang-(1-7) a
1 µM em diferentes intervalos de tempos foram coletados para análise da produção de
Prostaglandina E2 (PGE2) utilizando-se o produto comercial Prostaglandin E2 EIA-
Monoclonal®
(Cayman Chemical Company). Essa análise se baseia no método de ELISA
competitivo entre PGE2 e PGE2-Acetilcolinesterase conjugado. A análise da absorbância foi
realizada em um comprimento de onda de 412 nm. Os procedimentos foram realizados de
acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
3.8 Análise da expressão gênica por qRT-PCR
3.8.1 Extração do RNA total e obtenção do cDNA
A extração do RNA total e a obtenção do cDNA foram realizados conforme descrito no
item 3.4.1.
3.8.2 Oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos para os genes em estudo, foram baseados nas sequencias de
mRNA disponível no banco de dados de nucleotídeos de Rattus Norvegicus do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide) e desenhados pelo programa GeneRunner 3.05. A
Tabela 2 apresenta as especificações dos oligonucleotídeos.
32
Tabela-2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para análise da expressão relativa dos
genes.
Gene Primer Nº de Acesso
F:5' CAGCCCACCAACTTACAATG
R:5' CATCAGCCACAGGAGGAAG
F:5' CCAGGACCAGAGGAAACC
R:5' GTCATTATCCGCACGCTC
F:5' GCTTACTGAGAACCGTGTCC
R:5' GGTCGTGGGTCTGGAATG
F:5' GATTTGTCCAGTGCAGCCAG
R:5' CACCCTCATCCCTACATTGC
F:5' TGCGACAGATGGGCTACAC
R:5' TGTGGAGGAGGACGAGAGAG
F:5' TGGGCTCCTTCTCCATCACC
R:5' GCCAAAAGGCCAGGAAGAGG
F:5' CAGAACAATCCACGATGCAG
R:5' GCTGTCTCTGAGCCATTTCC
F:5' GCCTACCTCATGGGACTGAA
R:5' ACTTCTGCCCTTTGGTGAC
F:5' TCCGTCTCTAGTGCCAAC
R:5' ACGGAGGAGACCAGAGTG
F:5' CATCGCTGCCTCCAAGTG
R:5' TGCCACCTGTTCCCTGAG
F:5' TGGTGGGTATGGGTCAGAAG
R:5' CAATGCCGTGTTCAATGG
M25297.1
NM_001256509.1
NM_021836.2
NM_031144.3
bnp
fos
jun
β-actina
Βmyhc NM_017240.1
M27498.1
cox-2
pten
akt1
nfat-3
nf-κb
anf
NM_017232.3
NM_031606.1
NM_033230.1
NM_001108447.1
NM_001276711.1
3.8.3 Reação de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
Para análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica de PCR em
tempo real. As reações foram realizadas com Kit SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems) em placas de 96 poços (MicroAmp® Optical 96 Well Reacion Plate – Applied
Biosystems) e seladas com o adesivo óptico (MicroAmpTM
Optical Adhesive Film – Applied
Biosystems) ao final do procedimento. Foram pipetados 0,75µM de Oligonucleotídeos; 2µL
de cDNA diluído 10 vezes e 5µL de SYBR® Green PCR Master Mix, totalizando um volume
de reação em cada poço de 10 µL. Os ensaios foram realizados em triplicata biológica para
todos os genes avaliados, com o controle endógeno presente em todas as placas. Os valores de
baseline (ciclos iniciais em que há pequenas alterações na fluorescência) foram ajustados pra
3-15 ciclos. O threshold, desvio padrão médio do repórter normalizado (Rn) para os ciclos
iniciais da PCR multiplicado por um valor ajustável, foi ajustado à região associada ao
crescimento exponencial do produto da PCR e, portanto, fixado em 0,2 para todas as
33
amostras, uma vez que se comparou o mesmo gene em diferentes grupos. O Rn refere-se à
relação entre intensidade de fluorescência emitida pelo corante repórter pela intensidade de
fluorescência emitida pelo corante da referência passiva (ROX).
As análises foram feitas pelo método de quantificação relativa da expressão gênica
(ΔCT), que permite quantificar diferenças no nível de expressão de um alvo específico entre
diferentes amostras. Os níveis dos genes alvos foram normalizados pelos níveis do controle
endógeno. Os resultados foram lançados por uma fórmula aritmética que considera a
quantidade do alvo normalizado (2-ΔCt
). A reação de qRT-PCT foi conduzida conforme
programação contida no aparelho ABI 7500 Applied Biosystems.
Para determinar as eficiências relativas da amplificação dos alvos e do controle
endógeno, foram construídas curvas padrões para cada amplicon a partir de uma mesma
amostra. O ensaio foi realizado em triplicata e a concentração dos iniciadores foi de 2,5 µM.
A curva padrão foi representada por um gráfico de regressão linear semi log do valor de CT
(eixo y) em comparação ao log da quantidade inicial do ácido nucleico (eixo x). Foi utilizado
o cDNA de 0 h em cinco diluições seriadas de 10 vezes, como mostrado na Figura 09.
O slope da curva padrão foi usado para estimar a eficiência de amplificação (Tabela
3). Uma reação 100% eficiente produzirá um aumento de dez vezes no amplicon da PCR a
cada 3,32 ciclos durante a fase exponencial de amplificação (log2 10 = 3,3219), ou seja, o
amplicon dobra em quantidade durante a fase geométrica. O cálculo da estimativa da
eficiência (E) foi calculado pela fórmula: E= (10-1/slope
-1) x 100. Os iniciadores foram
considerados apropriados para avaliar a expressão gênica pelo sistema SYBR®
Green quando
apresentaram eficiência de reação acima de 80% e abaixo de 120%. Os valores de baseline
foram ajustados para 3,15 ciclos e o threshold fixado em 0,2 para todas as amostras (Figura
10).
34
Figuara 9 - Plot de amplificação referente à curva de eficiência do gene β-actina. Em x
está demonstrado o valor dos ciclos de PCR e em Y os valores de ΔRn. Foi utilizado cDNA
0h e uma diluição seriada de 6 vezes.
Figura 10 - Curva padrão referente ao gene β-actina. Em x estão demonstrados os valores
de log da concentração de cDNA e em y os valores de CT correspondente a cada diluição. Os
valores de slope e de coeficiente de linearidade estão representados a direita do gráfico. Foi
utilizado cDNA de 0h e uma diluição serial de 6 vezes.
35
3.8.4 Curva de dissociação dos amplicons
Foram realizadas análises da curva de dissociação dos amplicon para identificar a
formação de produtos inespecíficos no final de cada corrida, possivelmente geradas a partir de
excesso de temperatura. Na medida em que os amplicons desnaturam, o sinal fluorescente
emitido pelo SYBR® Green foi reduzido e a temperatura em que metade do produto da PCR
estava dissociada foi medida. O gráfico resultante permitiu verificar se houve um ou mais
produtos de PCR presentes em cada reação devido a diferenças de temperatura de melting
(Tm), específicas e dependentes do tamanho do fragmento e do conteúdo de GC (%GC). A
Tm desejada foi acima de 80ºC.
Tabela-3. Slope, Eficiência e R2 dos iniciadores utilizados através de uma curva de eficiência.
Oligonucleotídeo Slope Eficiência R2
Anf -3,275801000 101,96 0,101080000
Bnp -3,625801000 88,71 0,903876000
β-Myhc -3,486619800 98,06 0,101983000
Cox-2 -3,325647000 99,84 0,996758000
Pten -3,309091000 100,53 0,991358000
Akt -3,223309000 104,28 0,960000000
Nfat-3 -3,430156000 95,67 0,964073000
Nf-κB -3,563979000 90,80 0,979865000
Fos -3,369452000 98,05
0,919624000
Jun -3,616497000 89,02
0,996179000
β-actina -3,309091000 100,53 0,901338000
3.8 Análise da expressão proteica
3.8.1 Preparação do extrato bruto
Para a avaliação dos níveis de expressão proteica, células da linhagem H9c2 foram
crescidas, induzidas e coletadas conforme especificações anteriores. Após a tripsinização
celular e neutralização da enzima pela adição de meio de cultura contendo soro, seguida por
36
lavagens com PBS, as células foram ressuspensas em 200 l de tampão de lise (50 mM Tris-
HCl, pH 7.9, 150 mM NaCl, 0.01% Triton X-100) contendo 1mM de Coquetel de inibidores
de proteases para extrato de células de mamíferos obtidos da Sigma®
e incubadas a 4C por 30
minutos. O lisado foi então homogeneizado por sonicação e posteriormente centrifugado a
10.000 g por 15 minutos sob refrigeração de 4ºC. O sobrenadante foi recolhido e as proteínas
quantificadas em espectrofotômetro seguindo se o protocolo descrito por Bradford, 1976. Para
construção da curva padrão, utilizamos uma concentração padrão de albumina sérica bovina
(BSA) a 20 µg/mL em diversas em diluições.
3.8.5 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida
O extrato proteico total foi analisado por SDS-PAGE. Cerca de 50 µg juntamente com
tampão da amostra [100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% (w/v) glicerol, 4% (w/v) SDS, 0.001%
(w/v) azul de bromofenol] contendo 5% de -mercaptoetanol na proporção 1:1, foram
misturados para análise das proteínas. Cada uma das amostras foram desnaturadas a 95C por
5 minutos e em seguida separadas em géis de poliacrilamida a 10%. A corrida ocorreu a 200
V e 20 mA durante aproximadamente 1 h e 30 minutos. Os resultados obtidos após
eletroforese das amostras em SDS-PAGE foram observados pela coloração do gel em solução
de Azul de Coomassie G250 por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente, seguido
de descoloração com solução descorante para SDS-PAGE para visualização das bandas por
igual período de tempo.
3.8.6 Western blotting
Após a corrida eletroforética os géis foram preparados para a transferência das
proteínas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Os géis foram submersos
em solução de transferência (25 mM Tris-HCl, 0,192 M de glicina, 10% metanol) por 5
minutos e as transferências foram realizadas por 2 h 30 minutos a uma corrente elétrica fixa
de 250 mA pelo em aparelho transferidos do tipo Semi-Dry. Após o término da transferência
as membranas foram bloqueadas em Blotto [5% de Leite em pó desnatado contendo TBS (150
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6) e durante 3 h. Após o bloqueio, as membranas foram
lavadas 3 vezes com TBS-T durante 5 minutos. Após o bloqueio, as membranas foram
incubadas com os anticorpos primários policlonais de coelho de PTEN (Sigma), COX-2
37
(Cayman) e -actina (Santa Cruz Biotechnology). Os anticorpos foram diluídos em TBS
respectivamente nas concentrações de 1:200, 1:250 e 1:250. As incubações foram realizadas
em um período onde as membranas foram mantidas agitando por 4 horas a 4ºC e um período
overnight a 4ºC. Após a incubação com os anticorpos primários, as membranas foram lavadas
3 vezes durante 5 minutos com TBS-T para retirar os anticorpos que não se ligaram à
membrana e, então, incubadas a com o anticorpo secundário policlonal anti IgG de Coelho
conjugado a peroxidase (Cayman) diluído com TBS na razão 1:6.000. As membranas foram
incubadas com esse anticorpo por um intervalo de 5 h sob agitação e a temperatura ambiente.
Realizadas as incubações, as membranas foram lavadas para retirada dos anticorpos
secundários não ligados e em seguida reveladas. A detecção de sinais foi realizada com o
Western Blotting Luminol Reagent Kit (GE) de acordo com as especificações do fornecedor.
Após a revelação e secagem dos filmes, as bandas foram quantificadas por análise
computadorizada de imagem (com auxílio do software Quantity One®
, Biorad onde a
densidade ótica de cada banda foi aferida. Inicialmente o sistema de análise calcula a média
dos valores de densidade ótica para a região delimitada pelo operador. Esta região deve ter
uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada vez) visíveis no filme, não
devendo ser alterada, quando se passa a analisar outra banda. O valor final de intensidade
relativa pode ser expresso de forma absoluta ou como razão, quando comparada com a
intensidade relativa de outras bandas.
3.10 Análise da expressão de miRNA
A expressão de miRNAs envolvidas nos processos de inflamação e hipertrofia
cardíacas, foi realizado antes e após o estímulo das células com peptídeos vasoativos de
efeitos potencialmente antagônicos. Ang II e Ang 1-7 respectivamente a 10 µM e 1 µM
(Smmets et al., 2008 e Santos et al., 2003). A indução foi realizada nos intervalos de 0, 2, 6,
12, 24 e 48 horas, buscando-se com isso validar a relevância destas moléculas no controle da
regulação gênica da via inflamatória/ hipertrófica cardíaca e compreender o potencial destas
na modulação dos níveis dos mRNAs e das proteínas COX-2 e PTEN, uma vez que alguns
miRNAs comuns aos mRNAs de tais proteínas são identificados.
Para essas análises, células da linhagem H9c2 foram crescidas como descrito
anteriormente. As culturas (aproximadamente 106 células) foram utilizadas na preparação de
38
extratos de mRNA total enriquecidos com miRNAs com a utilização do miRNAse mini kit
(Qiagen®).
A transcrição reversa foi realizada com os reagentes Miscript II RT Kit (Qiagen®
),
seguindo as recomendações do fornecedor. Para as análises de PCR em tempo real o miScript
SYBR®
Green PCR Kit (Qiagen®
)foi utilizado primers para os miRNAs de interesse (Tabela
3) foram desenhados baseado na sua sequencia madura disponíveis em banco de dados Blast
(www.ncbi.lm.nih.gov/Blast), mirDB (http://mirdb.org/miRDB/), MiRBase
(http://www.mirbase.org/), TargetScan (http://www.targetscan.org/). As análises dos resultados
foram feitas utilizando-se o método do ΔCt, para calcular a expressão gênica relativa dos
miRNAs em estudo, conforme o boletim técnico do fabricante do aparelho de qPCR7500
(Applied Biosystems - Life Technologies).
Tabela- 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na expressão gênica relativa de miRNA
envolvidos no processo hipertrófico mediado por inflamação.
Gene Primer
miR-1 F:5' TGGAATGTAAAGAAGTGTGTAT
miR-21 F:5' TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-U6 F: 5' TGGCCCCTGCGCAGGATG
miR-26a F:5' TTCAAGTATCCAGGATAGGCT
mir-26b F: 5' TTCAAGTAATTCAGGATAGGT
3.11 Análises de bioinformática
Utilizando ferramentas básicas de bioinformáticas disponíveis na internet tais como
Blast (www.ncbi.lm.nih.gov/Blast), mirDB (http://mirdb.org/miRDB/), MiRBase
(http://www.mirbase.org/), TargetScan (http://www.targetscan.org/) buscou-se sequencias de
miRNAs maduros que estariam supostamente correlacionadas a modulação dos níveis das
proteínas COX-2 e PTEN envolvidas no processo de instalação da hipertrofia mediada por
inflamação. Mais tarde estes dados também foram utilizando no programa Cytoscape®
Versão
39
2.8.1 com o qual foi montado um diagrama mostrando padrão de interação entre os miRNAs
escolhidos com os alvos relacionados às vias de hipertrofia e inflamação.
3.12 Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas através do programa Graph Pad Prism®,
onde as médias ± SD foram obtidas e para tomada da significância empregou-se o teste
estatístico One Way ANOVA seguindo de teste de Dunnett, sendo que valores de p ≤ 0,05
foram considerados estatisticamente significantes.
40
4. RESULTADOS
41
4.1 Ang II a 10 µM e Ang-(1-7) a 1 µM não causam morte celular da linhagem H9c2
Nos ensaios de viabilidade celular pelo método de MTT, células da linhagem H9c2
foram induzidas com os peptídeos vasoativos angiotensina II e Ang-(1-7) nas concentrações
de 10 µM e 10 µM respectivamente em diferentes intervalos de tempo. A Figura 11 apresenta
os resultados obtidos, que não demonstraram alteração significativa na viabilidade das células
analisadas.
A B
Ang II
0 h 2 h 6 h 12 h 24 h 48 h0
5.0×103
1.0×104
1.5×104
Tempo de Indução com AngII
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r
Ang-(1-7)
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
5.0×103
1.0×104
1.5×104
2.0×104
Tempo de Indução com Ang-(1-7)
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r
Figura 11 - Avaliação da proliferação e viabilidade de células H9c2. Células cultivadas em
tempos de 0h, 2h, 6h, 12h, 24h e 48h de indução com os fármacos Ang II (A) e Ang-(1-7) (B)
a 10 µM e 1 µM respectivamente. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e
técnica, onde *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001.
42
4.2 Receptores AT1b e Mas são expressos em células H9c2
Para avaliar a expressão dos genes dos receptores específicos para Ang II e Ang-(1-
7), após o tratamento das células H9c2 com os peptídeos vasoativos, foram realizados PCR
semi-quantitativa, para os receptores AT1a, AT1b, AT2. Nas células H9c2 não houve a
expressão dos receptores AT1a e AT2 nos diferentes intervalos de indução celular (dados não
mostrados). Por outro lado, para os receptores AT1b e Mas houve expressão dos seus
respectivos mRNA para células induzidas com Ang II e Ang-(1-7). A Figura 12 apresenta os
resultados.
A B
Receptor AT1b
0H 2H 6H 12H 24H 48H0.0
0.5
1.0
1.5
*** ***
Tempo de indução com Ang II
Nív
eis
re
lativo
s d
e e
xp
ressã
o
Receptor MAS
0H 2H 6H 12H 24H 48H0.0
0.5
1.0
1.5
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lativo
s d
e e
xp
ressã
o
C D
Receptor AT1b
0H 2H 6H 12H 24H 48H0.0
0.5
1.0
1.5
** ****
*
Tempo de Indução com Ang1-7
Nív
eis
re
lativo
s d
e e
xp
ressã
o
Receptor MAS
0H 2H 6H 12H 24H 48H0.0
0.5
1.0
1.5
*** ******
***
Tempo de Indução com Ang-(1-7)
Nív
eis
re
lativo
s d
e e
xp
ressã
o
Figura 12 - Expressão relativa do mRNA dos receptores AT1a, AT1b (Dados não
mostrados), AT2 (Dados não mostrados) e Mas por Reação em cadeia pela Polimerase Semi-
Quantitativa quando as células H9c2 foram submetidas à indução com Ang II e Ang-(1-7) em
diferentes intervalos de tempos. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e
técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
43
4.3 Ang II promoveu aumento da área celular em H9c2
Considerando-se os efeitos vasodilatadores e hipertróficos dos peptídeos analisados, nas
condições estudadas, as células H9c2 induzidas com Ang II a 10 µM (Figura 13A)
apresentaram aumento significativo na média da área celular a partir de 6 horas de indução,
atingindo um aumento máximo em 12 horas de indução e com Ang-(1-7) a 1 µM (Figura
13B), não houve aumento significativo da média da área celular.
A B
AngII
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
2
4
6
8
***
***
******
Tempo de Indução com AngII
Are
a c
elu
lar
rela
tiva e
m µ
M
Ang-(1-7)
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
1
2
3
4
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Are
a c
elu
lar
rela
tiva e
m µ
M
C
Figura 13 - Avaliação da hipertrofia das células H9c2 pela mensuração da área quando as
células foram induzidas por Ang II (A) e Ang-(1-7) (B) nos tempos de 0h, 2h, 6h, 12h, 24h e
48h. Imagens da marcação com Dapi e Faloidina-TRICT em células induzidas com Ang II a
10 µM e Ang-(1-7) a 1 µM por 12 horas (C) para delimitação da área celular. Os
experimentos foram realizados em triplicata biológica e técnica e foram mesuradas 100
células para cada condição estudada, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
44
4.4 Prostaglandina E2 aumenta em 12h de indução com Ang II e Ang-(1-7) em
células H9c2
A análise de Prostaglandina E2 (PGE2) demonstra de maneira indireta a atividade da
enzima COX-2 e a ativação da via do ácido araquidônico, servindo para validação do efeito
dos peptídeos vasoativos estudados e seus mecanismos de ação pró-inflamatórios/
hipertróficos. Para essa análise, células da linhagem celular H9c2 foram induzidas com Ang II
e Ang-(1-7) e o sobrenadante das culturas foi coletado para análises.
Quando as células foram induzidas com Ang II (Figura 14A) houve uma diminuição
significativa da síntese de PGE2 nos intervalos de 2 h e 6 h em relação ao grupo controle
(células não induzidas). Por outro lado quando induzidas por 12h, as células aumentaram a
síntese de PGE2 duas vezes em relação ao controle. Porém este nível voltou a cair após 24 h e
48 h de indução. Quando analisado a síntese de PGE2 pelas células induzidas com Ang-(1-7)
(Figura 14B), houve uma resposta semelhante àquela ocorrida quando da indução com Ang II.
Inicialmente a Ang-(1-7) promoveu uma diminuição da síntese deste eicosanóide, porém, com
12 h de indução, houve um aumento significativo de cinco vezes em relação ao grupo
controle. Da mesma forma, nos intervalos de 24 h e 48 h houve uma diminuição dos níveis de
PGE2.
A B
Ang II
0 h 2 h 6 h 12 h 24 h 48 h0
100
200
300
***
*
**
** **
Tempo de Indução com AngII
Co
nc
en
tra
çã
o e
m p
g/m
L
Ang(1-7)
0 h 2 h 6 h 12 h 24 h 48h0
200
400
600
***
***
* ***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Co
nc
en
tra
çã
o e
m p
g/m
L
Figura 14 - Dosagem dos níveis de Prostaglandina E2 (não sei se isso cabe aqui...) onde as
células foram induzidas por Ang II (A) e Ang-(1-7) (B) nos tempos de 0 h, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h
e 48 h. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e técnica, onde *p<0,05,
**p<0,01 e ***p<0,001.
45
4.5 Expressão de genes marcadores de hipertrofia cardíaca são modulados quando
induzido com Ang II e Ang-(1-7)
A análise da expressão relativa dos mRNAs de genes relacionados ao processo
hipertrófico foram realizadas pelo método de qRT-PCR quando as células foram induzidas
com Ang II. O mRNA de Anf (Figura 15A), mostrou uma variação nos níveis de expressão
nos intervalos de 2 e 6 horas de indução, com respectivo aumento e diminuição significativos
em relação ao grupo controle. Por outro lado, a análise do mRNA de Bnp (Figura 15B)
revelou um aumento significativo de quatro vezes em relação ao grupo controle no intervalo
de 2 horas de indução. Ainda, analisando o mRNA de β-Myhc (Figura 15C), houve uma
aumento significativo do níveis de expressão nos intervalos de 12 e 24 horas de indução com
diminuição em 48 horas quando comparado com o grupo controle.
A B
Anf
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
*
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Bnp
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
1
2
3
4
5
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
-MYHC
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
***
****
*
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 15. Expressão relativa do mRNA
pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes
marcadores de hipertrofia cardíaca Anf
(A), Bnp (B) e β-Myhc (C) mediante a
indução celular com Ang II e Ang-(1-7)
respectivamente a 10 µM e 1 µM. A
normalização foi feita em relação à
expressão de β-actina. Os experimentos
foram realizados em triplicata biológica
e técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e
***p<0,001.
46
Ainda foram analisados os níveis do mRNA de genes relacionados ao processo
hipertrófico em células da linhagem H9c2 induzidas com Ang-(1-7). Não houve alteração
significativa nos níveis de expressão do mRNA de Anf em todos intervalos de tempo de
indução quando comparados com o controle (Figura 16A). Por outro lado, ao se analisar os
níveis do mRNA de Bnp (Figura 16B), houve uma diminuição significativa em todos os
intervalos de tempo de indução. Analisou-se também os níveis de expressão relativa do
mRNA de β-Myhc (Figura 16C), onde observou-se uma variação nos níveis de expressão nos
diferentes intervalos de tempo. Em 2, 6 e 12 horas de indução houve uma diminuição
significativa em comparação com o grupo controle, voltando a expressão aos níveis basais em
24h com posterior aumento da expressão em 48h de indução.
A B
Anf
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Bnp
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
******
***
******
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
-MYHC
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
***
***
***
*
***
***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 16. Expressão relativa do mRNA
pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes
marcadores de hipertrofia cardíaca Anf
(A), Bnp (B) e β-Myhc (C) mediante a
indução celular com Ang-(1-7) 1 µM. A
normalização foi feita em relação à
expressão de β-actina. Os experimentos
foram realizados em triplicata biológica
e técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e
***p<0,001.
47
4.6 Ang II e Ang (1-7) promove modulação na expressão gênica de fatores
transcricionais
Em células induzidas com o peptídeo vasoativo Ang II foi analisado o mRNA de Nf-
κB (Figura 17A), onde observou-se uma diminuição significativa nos níveis de expressão
relativa deste mRNA a partir de 12 horas de indução. Além disto, os níveis de expressão do
mRNA de Nfat-3 (Figura 17B) diminuiu significativamente em todos os tempos analisados.
Por outro lado, os níveis de expressão relativa do mRNA de Fos (Figura 17C) e Jun (Figura
17D), mostrou-se aumentado significativamente nos tempos de 6 e 12 horas de indução
quando comparados com o controle.
A B
Nf-kb
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
******
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Nfat-3
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
***
*** ******
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C D
Fos
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
***
*
******
***
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Jun
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
**
***
*
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 17. Expressão relativa do mRNA pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes Nf-κB (A), Nfat-3
(B) Fos(C) e Jun (D) envolvidos na sinalização celular da hipertrofia cardíaca mediada por
inflamação mediante a indução celular com Ang II a 10 µM. A normalização foi feita em
relação à expressão de β-actina. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e
técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
48
A análise de expressão destes mRNAs também foi realizada após o tratamento com
Ang (1-7). Os mRNAs de Nf-κB ( Figura18A), Nfat-3 (Figura 18B), Fos (Figura 18C) e Jun
(Figura 18D) mostrou uma diminuição significativa nos níveis de expressão relativa deste
mRNAs.
A B
Nf-kb
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
******
******
***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Nfat-3
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
*
***
*** *** ***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C D
Fos
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
*** ***
***
***
***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Jun
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
***
***
*** ***
***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 18. Expressão relativa do mRNA pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes Nf-κB (A), Nfat-3
(B) Fos (C) e Jun (D) envolvidos na sinalização celular da hipertrofia cardíaca mediada por
inflamação mediante a indução celular com Ang-(1-7) a 1 µM. A normalização foi feita em
relação à expressão de β-actina. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e
técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
49
4.7 Níveis do mRA de Cox-2, Pten e Akt podem estar correlacionados entre si num
processo de regulação diante ação da Ang II e Ang-(1-7)
Células H9c2 foram cultivadas e induzidas com Ang II para análise do padrão de
expressão relativo de mRNA de genes pertencentes às vias que levam ao desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca induzida por inflamação. Houve aumento significativo de sete vezes na
expressão relativa do mRNA de Cox-2 no tempo de 2h de indução (Figura 19A). Analisando
ainda a expressão do mRNA de Pten (Figura 19B), também houve um aumento significativo
nos níveis de expressão relativa deste mRNA nos intervalos de tempo de 2, 6 e 12 horas de
indução. Ainda, os valores da expressão relativa do mRNA de Akt1 mostrou-se
significativamente reduzidos em todos os intervalos de tempo quando as células foram
induzidas com Ang II (Figura 19C).
A B
Cox-2
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
2
4
6
8
10
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Pten
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
1
2
3
4
5
*
******
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
Akt
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
***
******
*** ***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 19. Expressão relativa do mRNA
pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes Cox-2
(A), Pten (B) e Akt (C) envolvidos na
sinalização celular da hipertrofia
cardíaca mediada por inflamação
mediante a indução celular com AngII a
10 µM. A normalização foi feita em
relação à expressão de β-actina. Os
experimentos foram realizados em
triplicata biológica e técnica, onde
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
50
Em relação as análise com o peptídeo Ang-(1-7) o mRNA de Cox-2 se mostrou
significativamente aumentando nos intervalos de tempos de 2 e 6 horas de indução, com pico
de cerca de 11 vezes aumentado em relação ao controle no tempo de 2 horas (Figura 20A). Os
níveis basais foram reestabelecidos nos tempos de 12 e 24 horas de indução, com conseguinte
aumento em 48 horas de indução. Por outro lado a expressão relativa do mRNA de Pten
mostrou-se majoritariamente reduzido quando da indução por Ang-(1-7) (Figura 20B), exceto
no intervalo de tempo de 6 horas, onde os níveis de expressão relativos deste mRNA
permaneceram em níveis basais. Ainda, analisando os níveis de expressão relativa do mRNA
de Akt, houve um aumento significativo em 2 horas de indução com Ang-(1-7) e uma
diminuição deste mRNA após 48 horas de indução (Figura 20C).
A B
Cox-2
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
5
10
15
***
***
***
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o Pten
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
*** *** ******
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
Akt
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0***
*
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 20. Expressão relativa do mRNA
pelo métodos do 2-ΔCt
dos genes Cox-2
(A), Pten (B) e Akt (C) envolvidos na
sinalização celular da hipertrofia
cardíaca mediada por inflamação
mediante a indução celular com Ang-(1-
7) a 1 µM. A normalização foi feita em
relação à expressão de β-actina. Os
experimentos foram realizados em
triplicata biológica e técnica, onde
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
51
4.8 COX-2 e PTEN podem estar envolvidos num mecanismo de corregulação quando
induzidos por Ang II
A identificação e quantificação dos níveis de expressão proteica respectivamente por
Western Blotting e densitometria revelaram um aumento significativo nos níveis de expressão
da proteína COX-2 quando induzidas com Ang II (Figura 21A) nos tempos de 2, 6 e 12 horas
de indução quando comparado com o controle. Em 24 horas de indução houve aumento em
relação aos níveis basais de expressão desta proteína, continuando a aumentar em 48 horas de
indução. Por outro lado, a quantificação dos níveis de expressão da proteína PTEN mostrou
uma redução significativa em relação ao seu padrão de expressão basal nos intervalos de
tempos de 2, 6 e 12 horas de indução com Ang II (Figura 21B). Após 24 horas de indução, o
nível de expressão desta proteína retornou aos níveis basais, com conseguinte redução no
intervalo de 48 horas de indução.
A B
Cox-2
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
1
2
3
4
***
***
*
******
***
**
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Pten
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
******
*** ***
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
Figura 21 - Análise da expressão relativa das proteínas COX-2 e PTEN por Western Blotting,
tomando a proteína β-actina como normalizadora quando as células foram induzidas com Ang
II 10 µM. As quantificações das proteínas por densitometria representadas pelos gráficos A e
B, respectivamente para COX-2 e PTEN, além do padrão de bandas identificadas,
representadas em C. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e técnica, onde
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
52
4.9 Ang-(1-7) modula diferencialmente a expressão das proteínas COX-2 e PTEN
Níveis de expressão das proteínas COX-2 e PTEN foram investigados após o
tratamento celular com Ang-(1-7). Na Figura 22A observamos um aumento significativo nos
níveis de expressão desta proteína em relação ao controle nos tempos de 2, 6, 12 e 24 horas de
indução, retornando aos níveis basais 48 horas. Em relação à proteína PTEN (Figura 22B),
após o tratamento com o peptídeo Ang-(1-7), os níveis da proteína supressora tumoral decaem
em todos os intervalos de indução.
A B
Cox-2
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*** ** *** ******
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Pten
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
***
***
***
***
**
Tempo de Indução com Ang(1-7)
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
C
Figura 22. Análise da expressão relativa das proteínas COX-2 e PTEN por Western Blotting,
tomando a proteína β-actina como normalizadora quando induzidas com Ang-(1-7) 1 µM. As
quantificações das proteínas por densitometria representadas pelos gráficos A e B,
respectivamente para COX-2 e PTEN, além do padrão de bandas identificadas, representadas
em C. Os experimentos foram realizados em triplicata biológica e técnica, onde *p<0,05,
**p<0,01 e ***p<0,001.
53
4.10 Ang II promove aumento da expressão dos miRNAs miR-1, -21, -26a e -26b
Considerando se os resultados obtidos quando da modulação das proteínas PTEN e
COX-2 após as células terem sido induzidas com Ang II a 10 µM em diferentes intervalos, os
miRNAs miR-1, -21, -26a e -26b foram analisados. Os resultados obtidos mostraram que o
miR-1 teve uma expressão relativa aumentada em 7 vezes em relação ao controle (Figura
23A). Ainda, quando analisado os níveis de expressão relativa do miR-21 (Figura 23B),
notou-se uma queda significativa na expressão deste miRNA no tempo de 24 horas e logo em
seguida, no intervalo de 48 horas de indução houve um aumento significativo de 3 vezes em
relação ao controle.
A B
miR-1
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
2
4
6
8 ***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
miR-21
0h 2h 6h 12h 24h 48h0
1
2
3
**
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 23. Análise da expressão relativa dos miR-1(A) e -21(B) em células H9c2 induzidas
com os peptídeos vasoativo AngII a 10 µM foi realizada pelo método do 2-ΔCt
. A
normalização foi feita em relação à expressão do miRU6. Os experimentos foram realizados
em triplicata biológica e técnica onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
Ainda, dados obtidos da análise do perfil de expressão gênica relativa do miR-26a
(Figura 24A) mostrou que há uma aumento significativo nos níveis de expressão deste
miRNA no intervalo de 6 horas de indução. Esta análise também revelou uma queda na
expressão gênica relativa do miR-26b (Figura 24B) após 24 horas de indução com Ang II.
Porém, no intervalo de 48 horas de indução, o efeito foi oposto ao observado no tempo
anterior, com um aumento significativo de 2 vezes na expressão deste miRNA.
54
A B
miR-26a
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
miR-26b
0h 2h 6h 12h 24h 48h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
**
***
Tempo de Indução com AngII
Nív
eis
re
lati
vo
s d
e e
xp
res
sã
o
Figura 24. Análise da expressão relativa dos miR-26a(A) e -26b(B) em células H9c2
induzidas com os peptídeos vasoativo AngII a 10 µM foi realizada pelo método do 2-ΔCt
. A
normalização foi feita em relação à expressão do miRU6. Os experimentos foram realizados
em triplicata biológica e técnica, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
4.11 miRNAs – 1, -21, -26a, -26b podem modular a expressão de outros genes
relacionada a via hipertrófica/ inflamatória
Para identificar potenciais alvos dos miRNAs -1, -21, -26a, -26b, ferramentas básicas
de bioinformáticas disponíveis na internet tais como Blast (www.ncbi.lm.nih.gov/Blast),
mirDB (http://mirdb.org/miRDB/), MiRBase (http://www.mirbase.org/), TargetScan
(http://www.targetscan.org/) foram utilizadas para busca de putativos alvos. Pelo fato dos
miR não necessitarem de pareamento perfeito com seus alvos, muitas vezes a busca gera listas
extensas de alvos validados. Dentre os alvos já validados, foram selecionados aqueles
relacionados à via envolvida na promoção do processo hipertrófico mediado por inflamação.
Estes alvos podem ser visualizados na Tabela 5. Baseado nessa análise uma pequena rede de
interação entres os miRNAs analisados e os alvos que eles poderiam regular no processo
hipertrófico mediado por inflamação é representada na Figura 25.
55
Tabela-5. miRNAs e seus alvos envolvidos no processo hipertrófico mediado por
inflamação.
miR SCORE ALVO miR SCORE ALVO
miR-1 70 Akt miR-21 76 Proteina G
miR-1 66 PLA2 miR-21 50 PI3K
miR-1 57 PKA miR-21 62 PLA2
miR-1 52 MAPK miR-21 54 Nfat-3
miR-26a 54 PTGS2 miR-26b 72 AP1
miR-26a 94 SUMO1 miR-26b 77 Nfat-3
miR-26a 78 Ub spec peptidasemiR-26b 56 Akt
miR-26a 79 PLA2 miR-26b 53 MapK 4
miR-26a 86 Pten miR-26b 51 Ras
Figura-25. Diagrama ilustrando a interação entre miRNAs e seus alvos relacionados ao
processo hipertrófico mediado por inflamação.
56
5. DISCUSSÃO
57
Cultura de células de mamíferos tem desempenhado um papel importante no avanço das
pesquisas na área biomédica refletindo numa melhoria da qualidade de vida humana,
principalmente a partir da década de 1950. Este modelo de estudo, tem sido considerado um
fator chave a investigação biotecnológica e para o desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas. A técnica da cultura celular é considerada uma importante ferramenta na
descoberta de hormônios, fatores de crescimento e outros componentes biológicos essenciais
para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos a nível molecular (McKeehan et
al. 1990; Min-Hsien, Song-Bin, Gwo-Bin, 2010). Os benefícios da cultura de células de
mamíferos têm se mostrado cada vez mais importante para a produção de novos produtos
biofarmacêuticos, incluindo anticorpos monoclonais e citoquinas, bem como o fornecimento
de uma nova estratégia para a geração de vacinas (Merten, 2006). Tendo em vista sua
importância para produção de novos produtos biotecnológicos voltados ao diagnóstico ou
mesmo tratamento de certas doenças, incluindo doenças cardiovasculares, seria importante o
estabelecimento de um modelo celular, no qual os mecanismo moleculares envolvidos no
desenvolvimento das hipertrofias cardíacas mediadas por inflamação pudessem ser melhor
compreendidos.
Paralelamente, trabalhos recentes têm demonstrado a importância do SRA,
principalmente da Ang II e da Ang-(1-7), no desenvolvimento das hipertrofias dos
cardiomiócitos (Zhang et al., 2007; Oigman e Neves 2000). Assim como a importância
destes peptídeos na modulação dos níveis da enzima COX-2, importante na produção de
PGE2 apontada como um fator pró-inflamatório atuante na instalação do processo hipertrófico
mediado por inflamação (Ohnaka et al., 2000). Outro elemento importante no
desenvolvimento do processo inflamatório crônico é o supressor tumoral PTEN, que em
tumores apresenta-se frequentemente deletado ou mutado (Li et al., 2011), visto que a
diminuição da síntese desta proteína está intimamente relacionada ao desenvolvimento de um
quadro inflamatório crônico, além de ter sido descrito que a diminuição dos níveis de PTEN
está relacionado à modulação da proteína COX-2 em tumores (Serra et al., 2012). Portanto,
neste trabalho, procuramos estabelecer um modelo celular que nos auxiliasse a entender
melhor a ligação entre as proteínas COX-2 e PTEN num processo de corregulação dos seus
níveis de expressão, e também avaliar o envolvimento de pequenas moléculas reguladoras da
expressão gênica destas proteínas em um modelo de hipertrofia cardíaca mediado por
inflamação induzida por peptídeos vasoativos do SRA (Wang e Yang, 2012; Cheng et al.,
2007).
58
Encontram-se descritos na literatura trabalhos utilizando diferentes concentrações que
variam de 1 nM a 100 µM para a Ang II (Pellieux et al., 2009; Ohnaka et al., 2000; Liu et al.,
1998; Orth et al., 1995; Sadoshima e Izumo, 1993; Wolf et al., 1993) e 1 nM a 100 nM para
Ang-(1-7) (Sampaio et al., 2007; Zhang et al., 2007; Santos et al., 2003; Machado, Santos e
Andrade, 2000). Utilizando dados da literatura como referência (Smmets et al., 2008), células
da linhagem H9c2 foram induzidas com os peptídeos vasoativos Ang II a 10 µM, em
diferentes intervalos. No ensaio de viabilidade celular, não houve alteração significativa no
número de células (Figura 11A). Em seu trabalho Li et al. (2010) avaliaram a citotoxidade da
Ang II em concentrações que variavam de 1 nM a 10 µM sobre células da musculatura lisa
vascular e também constataram que não houve alteração na viabilidade celular. Por outro
lado, Pang et al. (2003) analisando a viabilidade de células obtidas de cultura primária de
ratos neonatos, observaram que houve uma diminuição do número após 48 h de indução com
Ang II a 10 µM. Ao avaliarmos ainda a viabilidade celular das mesmas células quando da
indução pelo peptídeo vasoativo Ang-(1-7) a 1 µM como descrito por Santos et al. (2003),
observou-se que também que não houve alteração significativa da viabilidade celular (Figura
11B). Corroborando com nossos resultados, Zhang et al. (2010) demonstraram que a Ang-(1-
7) a 1 µM também não alterou significativamente o número de células glomerulares. Porém,
McKay et al. (1998) avaliando a viabilidade de células da musculatura lisa vascular
constataram que houve um aumento no número de células após 48 horas de indução com
Ang-(1-7) a 1nM. Sugere-se que esta diferença nos resultados se deva a diferença nas
concentrações utilizadas e aos tipos celulares. Assim, nossos dados mostram que as
concentrações utilizadas não foram capazes de promover morte celular e estas concentrações
foram utilizadas para a realização dos ensaios seguintes. A análise de viabilidade celular foi
realizada com o objetivo de validar, em nosso modelo celular, as concentrações descritas na
literatura em modelos de estudo diferente ao que utilizamos.
Ao utilizarmos peptídeos vasoativos com efeitos antagônicos em linhagem celular
cardíaca, precisamos verificar a presença de receptores específicos para cada um dos
peptídeos utilizados. Dessa maneira, células H9c2 induzidas com os diferentes peptídeos
foram utilizadas para análise da expressão do mRNA dos receptores AT1a, AT1b, AT2 e
Mas. Os resultados obtidos mostram que quando da indução com Ang II não houve expressão
do mRNA dos receptores AT1a e AT2 (dados não mostrados), o mesmo acontecendo quando
estas células foram induzidas com Ang-(1-7). A ausência da expressão do mRNA do receptor
AT1a pode ser devido a sua expressão ser exclusiva ao período de desenvolvimento fetal dos
59
tecidos conforme demonstrado por Shanmugam, et al (1994). Ainda Moalic et al. (1989) e
Viswanathan et al. (1991) descreveram que o mRNA do receptor AT2 é também altamente
expresso em tecidos em desenvolvimento fetal, porém, sua expressão diminui
significativamente após o nascimento. Isto, de fato, poderia ocorrer no nosso modelo celular
uma vez que apesar das células da linhagem H9c2 serem células neonatais, elas respondem a
estímulos como cardiomiócitos adultos de cultura primária (Watkins, Borthwick e Arthur,
2012; Wollert e Drexler, 1999).
Analisando ainda a expressão dos mRNAs dos receptores AT1b e Mas, quando as
células foram induzidas com Ang II (Figura 12A/B) e Ang-(1-7) (Figura 12C/D), houve a
expressão do mRNA destes receptores. Shanmugam, et al (1994) demonstraram que a
isoforma AT1b do receptor encontra-se se expressa predominantemente em tecidos cardíacos
adultos, e modulam a resposta ao peptídeo Ang II . Analisando ainda a expressão do receptor
MAS, específico para a Ang-(1-7), foram identificados aumento dos níveis de expressão deste
mRNA. Em seu trabalho Filho et al. (2007) também demonstraram um aumento na expressão
deste mRNA em células cardíacas de cultura primária induzidas com Ang-(1-7). Nossos
resultados sugerem, portanto, que estes receptores podem estar sendo expressos no nosso
modelo de estudo, contudo, uma limitação do nosso trabalho foi não avaliar os níveis de
expressão proteica destes receptores, que muitas vezes podem não corresponder com os níveis
do seu respectivo mRNA.
Considerando os efeitos do SRA sobre a modulação do processo hipertrófico mediado
por inflamação. Foram avaliados também os efeitos destes peptídeos vasoativos sobre o
aumento da área celular. Quando induzidas com Ang II (Figura 13A) as células H9c2
apresentaram um aumento da área celular após seis horas de indução. Backer et al. (2004)
demonstraram em seu trabalho utilizando cardiomiócitos de ratos neonatos que a Ang II
promove um aumento da área celular e também aumento da utilização de H3-Leucina e H
3-
Timidina indicando um aumento da síntese de proteínas e DNA respectivamente. Ainda,
Gomes et al. (2009) demonstraram um aumento no volume de células cardíacas de ratos
neonatos. Juntos estes dados sugerem um aumento da atividade metabólica destas células
relacionando-o ao aumento da área celular. Por outro lado, quando as células foram induzidas
com a Ang-(1-7) (Figura 13B) não houve aumento significativo da área celular. Em seu
trabalho Tallant, et al (2005) demonstraram que Ang-(1-7) promove inibição do crescimento
celular em cardiomiócitos de ratos neonatos via receptor MAS. Estes dados reforçam a ideia
60
deste peptídeo atuar em via oposta a aquela promovida pela Ang II, reforçando também a
veracidade dos resultados por nós obtidos.
Além dos marcadores fenotípicos da hipertrofia cardíaca, alguns autores descrevem a
alteração nos níveis de alguns mRNA expressos durante o desenvolvimento fetal cardíaco
como marcadores de alterações patológicas neste tecido (Bianciotti e Bold, 2000). Analisando
os níveis de expressão relativa dos mRNA de Anf, Bnp e β-Myhc, notamos que quando H9c2
foram induzidas com Ang II houve aumento na expressão de Anf (Figura 15A) após 2 horas
de indução, o mesmo ocorrendo com os níveis de Bnp (Figura 15B). Por outro lado, os níveis
de expressão de β-Myhc (Figura 15C) aumentaram somente após 48 horas de indução
indicando uma possível remodelação tardia das miofibrilas. Corroborado com nossos achados,
em seu estudo in vivo, Izumo et al. (1987), demonstraram que em corações de ratos com
alterações cardíacas, houve uma aumento da expressão do mRNA de β-Myhc após dois dias
de estímulo, destacando o efeito tardio que este peptídeo exerce na remodelação cardíaca.
McGrath et al. (2012) trabalhando em modelo in vivo, demonstraram em seu trabalho o
aumento dos níveis do transcrito e da proteína de Anf e Bnp de acordo com a evolução do
quadro hipertrófico, contudo, estes aumentos foram detectados somente após 2, 7 e 28 dias de
estímulos, caracterizando os assim, como bons marcadores num período longo de indução.
Considerando essas observações podemos interpretar que a baixa expressão destes
marcadores nos intervalos de indução celular que utilizamos como mais um dado positivo de
validação do nosso modelo de estudo. Ainda, quando a indução foi realizada com a Ang-(1-7)
os níveis de expressão do mRNA do Anf (Figura 16A) não alterou. Contudo os níveis de
expressão do Bnp (Figura 16B) diminuíram possivelmente devido a ação anti-hipertrófica do
peptídeo indutor. Observando ainda os níveis de expressão do mRNA de β-Myhc (Figura
16C) houve um aumento somente após 48 horas de indução e assim como na indução por Ang
II podendo ser indicativo de remodelamento das miofibrilas cardíacas.
A sensibilização de receptores de membrana pelos peptídeos vasoativos, ativa
diferentes vias de sinalização que promoveram a expressão de genes relacionados ao processo
hipertrófico/inflamatório, entre eles alguns relacionados à síntese de eicosanoides
fundamentais na manutenção da homeostasia cardiovascular. Neste contexto surge a PGE2,
considerada um fator pró-inflamatório devido sua atuação na modulação da resposta
inflamatória, foi utilizada para medir de maneira indireta a atividade da enzima COX-2 e
assim relacioná-la ao estabelecimento do estímulo hipertrofiante em nossa cultura celular
assim como descrito na literatura (Mendez e La Pointe, 2002). Estudando o papel dos
61
peptídeos vasoativos na síntese de PGE2, Rao et al. (1994) demostraram que em células
musculares lisas eles fosforilam PLA2 , enzima essencial na síntese do ácido araquidônico,
reforçando a atividade moduladora dos mesmos sobre a síntese de PGE2. Em nosso modelo o
ensaio de dosagem deste eicosanoide em células induzidas com ambos os peptídeos
vasoativos foram observados aumentos da síntese de PGE2 após 12 horas de indução (Figura
14A/B). Scharschmidt e Dunn (1983) também demonstraram um aumento da síntese de PGE2
quando células glomerulares foram induzidas com Ang II. Paralelamente também observamos
aumentos nos níveis de expressão da proteína COX-2 neste intervalo em ambas às condições
estudadas (Figuras 19A e 20A), sugerindo uma coordenação na síntese deste prostanoide.
Ainda observamos, quando da indução com Ang II, que no intervalo de 12 h ocorreu o maior
aumento da área celular (Figura 13A), correlacionando assim o aumento na síntese de PGE2 e
dos níveis de COX-2 com o aumento do volume celular. Corroborando com nossos
resultados Mendez e La Point (2005) demonstraram que em cultura primária de células
ventriculares induzidas com PGE2, houve um aumento do tamanho celular e da expressão de
Anf e Bnp reforçando assim, o envolvimento da PGE2 no desenvolvimento da hipertrofia de
cardiomiócitos, e reforçando mais uma vez o potencial do nosso modelo celular na elucidação
de particularidades mecanísticas do processo hipertrófico/ inflamatório visando uma futura
aplicação terapêutica.
Além da ativação da via de sinalização relacionada à síntese de PGE2, estes estímulos
podem sensibilizar outras vias de sinalização ativando alguns fatores transcricionais
fundamentais na promoção do processo hipertrófico. Conhecer as particularidades de vias
pelas quais estes estímulos podem conduzir a um quadro patológico em células cardíacas é
importante, uma vez que conhecer um ponto crítico no controle da expressão de genes
relacionado ao processo hipertrófico cardíaco poderia ser útil desenvolvimento de métodos
inibitórios desta ativação transcricional. Considerando-se nosso modelo de estudo como uma
ferramenta de estudo na elucidação das particularidades mecanísticas do processo hipertrófico
cardíaco mediado pela inflamação, e diante dados resultados preliminares, células H9c2 foram
induzidas com Ang II. Assim como Wong et al. (1998) e Appleby et al., (1994)
demonstraram em seus trabalhos o envolvimento do fator transcricional Nf-κB na expressão
de Cox-2, nossos resultados demonstraram uma expressão basal do mRNA de Nf-κB (Figura
17A) até 6 horas de indução e após esse intervalo os níveis transcricionais de NF-kb
diminuiram. Quando comparados com os níveis de expressão do mRNA de Cox-2,
curiosamente nossos dados mostram uma correlação entre os níveis de Nf-κB com aumento
62
nos níveis de expressão de Cox-2, indicando um possível envolvimento desse fator
transcricional na ativação do gene cox-2. A queda dos níveis do mRNA deste fator
transcricional no nosso modelo de estudo pode ser devido ao tempo de indução com o agente
hipertrofiante, uma vez que trabalhos mostram o envolvimento deste fator transcricional em
intervalos maiores de indução ou ainda sua ativação estar ligada a outras vias de sinalização
que não pelas MAPKs, podendo ser alternativamente mediado pelas vias PI3K/AKT e
Cálcio/NFAT-3 (Li et al., 2004). Comprando ainda os níveis do mRNA de Pten e Nf-κB,
parece não haver correlação entre eles. Contudo, Vasudevan et al(2004) mostraram que Nf-κB
está envolvido com a supressão da expressão de Pten, assim como, a restauração dos níveis de
Pten regulou os níveis de expressão de Nf-κB, portando envolvendo-se indiretamente. Quando
da indução com Ang-(1-7) (Figura 18A) as células mostraram em todos os tempos uma
redução da expressão deste mRNA. Este resultado talvez seja pelo fato de Ang-(1-7) como
descrito anteriormente, antagonizar os efeitos promovidos pela Ang II.
Tomando os níveis de expressão de Fos e Jun juntos, podemos sugerir um possível
envolvimento do fator transcricional AP-1, uma vez que este se caracteriza como um
heterodímero constituído por Fos e Jun (Sharma e Richards, 2000). Na indução por Ang II
poderia haver a participação deste fator transcricional, uma vez que foi observado um
aumento coordenado nos níveis destes mRNAs no mesmo intervalo (Figuras 17C e D). De
fato, Zohn et al. (1995) demonstraram em seu trabalho o envolvimento da Ang II na
promoção da ativação do fator transcricional AP-1 dimerizados por Fos e Jun. Além disto,
Alport et al. (2000) demonstraram em seu trabalho que AP-1 possui sítios de ligação na
região promotora do gene Cox-2 e que juntamente com Nf-κB promovem um aumento na
expressão deste mRNA. Quando comparado os níveis de expressão do mRNA de Fos e Jun
com os de Pten, houve um aumento de ambos transcritos o que poderia indicar um possível
envolvimento. Por outro lado, Koul et al. (2007) estudando células de glioma demonstraram
que Pten diminui a expressão de AP-1. Quando induzidos com Ang-(1-7) não houve aumento
da expressão do mRNA de Fos e Jun (Figura 18C e D). Corroborando com nossos achados,
Mc Collum et al. (2012) quando da indução por Ang-(1-7) demonstraram a inibição da
fosforilação de MAPKs como ERK1/2, p38 e JNK importantes na ativação do AP-1.
Paralelamente, a análise da expressão do mRNA Nfat-3 em ambas as condições
(Figura 17B e 18B) desencadeou uma sutil modulação no nível de expressão desse gene.
Diferente dos nossos resultados Abrahan et al. (2012) mostram em seus estudos que Ang II
promove aumento intracelular de cálcio, que estimula a expressão de genes da via
63
calcineurina/ NFAT. Ainda, Macián et al (2001) relataram o envolvimento de um mecanismo
na transativação positiva da ação do fator transcricional NFAT por outros elementos
promotores como AP-1, Nf-κB e GATA que podem interagir entre si na promoção do
crescimento de cardiomiócitos ou mesmo na promoção da expressão de Cox-2. Esse
mecanismo talvez explique a expressão basal ou baixa desses fatores transcricionais.
Utilizando um modelo celular para estudo do processo hipertrófico mediado por
inflamação, e sabendo do possível envolvimento de COX-2 e PTEN em células tumorais, foi
avaliado a correlação da expressão dos mRNA de Cox-2, Pten e Akt, para estabelecer uma
possível correlação entre essas moléculas neste modelo de estudo. Quando induzidas com
Ang II estas células aumentaram o mRNA de Cox-2 após duas horas de indução e retornaram
aos níveis basais nos tempos seguintes (Figura 19A). Estes dados são suportados por Ohnaka
et al (2000) que em seus experimentos demonstraram o envolvimento da Ang II induzindo o
aumento do mRNA Cox-2 de maneira dose dependente e, quando utilizado um inibidor
seletivo dos receptores AT1, Losartan, não foi observado aumento na expressão deste mRNA.
Por outro lado, observando os níveis de Pten (Figura 19B), notamos uma permanência nos
níveis basais exatamente em 2 horas e aumentando nos tempos seguintes, exatamente quando
Cox-2 retornou aos níveis basais. Estes resultados chamaram nossa atenção uma vez que já foi
descrito em tumores uma possível correlação entre estas duas moléculas, num mecanismo de
regulação entre si (Serra et al., 2012). Ainda nesta condição, Akt apenas diminuiu sua
expressão (Figura 19C), indicando um mecanismo de controle da ativação da expressão de
genes relacionados ao processo hipertrófico. St-Germain et al. (2004) reforçando esta ideia,
demonstraram que AKT é importante na ativação do fator transcricional Nf-κB, portanto, a
diminuição dos níveis de expressão de Akt, além de interferir na via AKT/NFAT-3, também
poderia interferir na expressão de COX-2 que curiosamente tem os níveis de expressão do seu
mRNA majoritariamente reduzidos.
Por outro lado, analisando os níveis de expressão destes mesmos mRNAs quando da
indução por Ang-(1-7), os níveis de expressão relativa de Cox-2 mostraram-se aumentados
nos intervalos de 2 e 48 horas (Figura 20A). Este aumento dos níveis do mRNA de Cox-2
pode ser explicado pelo fato de Ang-(1-7) em certas concentrações também possuir a
capacidade de estimular, pela ativação de vias de sinalização cruzadas a atividade PLA2 e de
MAPK (Mubarack et al., 1998). Ao contrário do que observamos para Cox-2, Pten mostrou-
se diminuído nestes intervalos de tempo (Figura 20B) e Akt aumentou somente após 2 horas
de indução (Figura 20C). Estes resultados mostram mais uma vez uma correlação entre o
64
aumento dos níveis de Cox-2 com a diminuição dos níveis de Pten e vice e versa no nosso
modelo celular, além dos efeitos sobre Pten e Cox-2 terem sido opostos aos observados
quando mediado por Ang II.
A análise os níveis de expressão das proteínas COX-2 e PTEN, correlacionando os
entre si e com seus respectivos mRNAs tornam-se importantes na geração de conhecimento
de mecanismos básicos de funcionamento deste modelo celular dentro da sinalização celular
de interesse em nosso modelo de estudo. Ao analisarmos os níveis de expressão da proteína
COX-2 diante da indução com Ang II, notamos que houve um aumento da expressão desta
proteína em todos os intervalos (Figura 21A), fato também observado por Ohnaka et al
(2000). Ao correlacionarmos os níveis de expressão desta proteína com os níveis de expressão
da proteína PTEN, notamos que exatamente nos intervalos de tempo onde os níveis de COX-2
encontram-se elevados, os níveis de PTEN encontram-se diminuídos (Figura 21B). Dong et
al. (2013) demonstrou em seu estudo que Ang II induz a diminuição dos níveis de expressão
da proteína PTEN e que quando utilizado o antagonista do receptor AT1, Losartan, houve um
aumento na expressão desta proteína, além disto, a diminuição dos níveis de PTEN poderiam
de maneira indireta, pela via AKT, promover o aumento nos níveis de COX-2 (Figura 26).
Este aspecto foi observado para os níveis de expressão do mRNA, o que poderia sugerir um
mecanismo de modulação entre estas proteínas. Contudo, para compreendermos melhor a
mecanística do processo, futuros experimentos de RNA de interferência (RNAi) serão
realizado.
Comparando-se ainda a proteína com o mRNA Cox-2, nota-se que este volta a níveis
basais após 6 horas de indução, porém, os níveis proteicos permanecem aumentados. Uma
explicação pode ser sugerida pela observação descrita em Ohanaka et al., (2000) que a Ang II
possuir a capacidade de estabilizar o mRNA de Cox-2, aumentando assim, seu tempo de meia
vida. Neste mesmo intervalo foram analisados os níveis de expressão da proteína PTEN, onde
se notou majoritariamente diminuição nos níveis da proteína corroborando com Wu e He,
(2005), que utilizaram cardiomiócitos de ratos neonatais e demonstraram que a Ang II
promove diminuição da expressão de PTEN. Li et al. (2010) estudando como COX-2 poderia
interferir na via AKT, demonstraram em seu estudo que o aumento dos níveis de COX-2
poderia de maneira indireta ativar a Caseína quinase-2 (CK-2), envolvida na fosforilação de
algumas proteínas preferencialmente em resíduos de serina e treonina, inclusive a proteína
PTEN, tornando-a inativa na sua função fosfatásica, promovendo assim aumento dos níveis
de PIP3/AKT/NFAT-3 e indiretamente COX-2.
65
Analisando os níveis de expressão destas proteínas diante a ação da Ang-(1-7), notou-
se um aumento nos níveis da COX-2 nos intervalos de 2 h, 12 h e 24 horas de indução (Figura
22A). Em paralelo, houve um aumento dos níveis de expressão do mRNA deste gene nos
tempos de 2 e 6 horas retornando aos níveis basais em 12 e 24 horas, para novamente ter um
aumento de expressão significativa no intervalo de 48 h. Pela análise dos resultados podemos
sugerir que a variação nos níveis proteicos de maneira não sincronizada com os níveis de
mRNA, deva-se a alteração na cinética de degradação da molécula mensageira e ao estímulo
latente do peptídeo, que estimula o aumento do nível transcricional de Cox-2 após 48 h de
incubação com a cultura celular. Ainda acompanhando os níveis de expressão da proteína
PTEN (Figura 22B), observou-se uma queda acompanhando a diminuição dos níveis de
expressão do mRNA deste gene. Este resultado pode ser explicado por ação da Ang-(1-7)
como agente promotor da diminuição dos níveis de expressão de importantes fatores
transcricionais envolvidos no processo hipertrófico no nosso modelo celular.
A correlação dos níveis de expressão do mRNA e da proteína PTEN quando da
indução com Ang II, mostrou uma interessante relação entre estas moléculas. Devido aos
curiosos resultados obtidos quando da indução por este peptídeo, foram avaliados os níveis de
expressão de alguns miRNAs que possuem sítio de ligação na região 3’UTR no mRNAs de
Cox-2 e Pten e assim a suposta capacidade controle da sua expressão gênica. Neste contexto,
os miRNAs se tornam ferramentas importantes no estabelecimento de um método de
diagnóstico ou tratamento das hipertrofias cardíacas mediadas por inflamação.
Os níveis de expressão relativa do miR-1 aumentou no intervalo de 48 horas de
indução com Ang II (Figura 23A), indicando portanto seu possível envolvimento com as
instalação de um quadro de hipertrofia, uma vez que encontra-se descrito na literatura seu
envolvimento com a promoção desta alteração em células cardíacas (Wang e Yang, 2012).
Avaliando também a expressão do miR-21 (Figura 23B), há uma aumento na sua expressão
após 48 horas de indução correlacionando o com uma redução dos níveis de expressão da
proteína PTEN. De fato, Meng et al. (2007) estudando o desenvolvimento de câncer
hepatocelular, notaram que houve um aumento da expressão do miR-21 e uma diminuição
dos níveis proteicos de PTEN. Também foram realizados inibição e superexpressão deste
miRNA e assim confirmaram sua influência na expressão de PTEN. Roy et al. (2009) também
demonstraram o envolvimento do miRNA-21 na diminuição dos níveis de expressão de
PTEN. Juntos estes resultados apontam o miR-21 como importante elemento envolvido na
regulação de PTEN e indiretamente de COX-2, ampliando as possibilidades de investigação
66
do processo hipertrófico medido por inflamação neste modelo celular. De fato este miRNA já
têm sido relacionado ao processo hipertrófico em células da musculatura lisa vascular (Yang,
et al., 2007). Também foram analisados os níveis de expressão do miR-26a onde notamos um
aumento significativo da sua expressão no tempo de 6 horas. No mesmo intervalo foi
observado diminuição dos níveis de expressão de PTEN (Figura 24A), havendo, portanto,
indício de um mecanismo de controle da expressão de PTEN pelo miR-26a. Da mesma forma,
Kin et al. (2010) demonstraram em seu estudo, o aumento na expressão deste miRNA e sua
correlação com a diminuição da expressão de PTEN na proliferação e crescimento celular em
células tumorais. Quando comparadas com os níveis de expressão de COX-2, não houve
relação uma vez que ambos, miR-26a e proteína estavam aumentados neste intervalo. Esta
diferença nos resultados pode ser explicado devido à diferença no tipo de célula utilizada, o
que implica numa resposta celular diferente.
Por fim, foram também analisados os níveis de expressão do miR-26b em células
induzidas com Ang II (Figura 24B), onde observamos um aumento dos níveis de expressão
após 48 horas de indução, não correlacionando diretamente com os níveis de expressão da
proteína COX-2 no nosso modelo celular. Porém, Ji et al. (2010) demonstraram o
envolvimento do miR-26b na regulação da expressão de COX-2. Analisando também o efeito
da expressão deste miRNA sobre PTEN, notamos um possível efeito regulador na sua
expressão. De fato, como já mencionado, quando há redução dos níveis de expressão de
PTEN, há uma aumento dos níveis de COX-2 indicando um possível envolvimento indireto
deste miRNA. Para estabelecermos uma correlação mais confiável entre os miRNAs e os
mRNA que eles poderiam regular, seria necessário a realização de uma super-expressão ou
repressão da expressão destes miRNAs, para assim, avaliarmos os reais efeitos destes sobre as
moléculas de mRNA que eles regulariam.
Como alguns dos miRNAs analisados não mostraram um possível envolvimento na
regulação da expressão de COX-2 e PTEN no nosso modelo de estudo, utilizando ferramentas
de bioinformática disponíveis na internet, foram buscados outros alvos para os miRNAs
analisados que estariam envolvidos na instalação do processo hipertrófico mediado por
inflamação. Para o miR-1 foram identificados possíveis alvos envolvidos indiretamente na
expressão de COX-2 e PTEN como AKT que possui papel fundamental na regulação da via
Calcineurina/NFAT, além de possuir sítios de ligação na região promotora de COX-2 e assim
regular diretamente sua expressão. PLA2 também seria uma importante alvo deste miRNA e
sua regulação limitaria a produção de PGE2 pela COX-2 modulando assim, o processo
67
inflamatório. Apesar de estímulos conduzirem a ativação MAPK, sua regulação por este
miRNA influenciaria na ativação de importantes fatores transcricionais promotores da
hipertrofia, além de regular os níveis de PKA envolvido na sinalização depende de Cálcio.
Para o miR-21 foram identificados alvos como a Proteína G, elemento fundamental na
promoção da hipertrofia cardíaca induzida pelos peptídeos vasoativos do SRA, Também foi
relatado o envolvimento deste miRNA regulando PI3K, envolvido na via de sinalização
AKT/NFAT, além de regular os níveis de expressão do fator transcricional NFAT,
relacionado a expressão de genes hipertróficos. Também regula a expressão gênica de PLA2
influenciando indiretamente a expressão de COX-2 e PTEN.
Os alvos descrito para o miR-26a, também estão envolvidos na modulação do
processo hipertrófico mediado por inflamação tais como PLA2, SUMO e Ubiquitina. Por fim
os alvos do miR-26b potencialmente envolvidos na modulação da expressão de COX-2 e
PTEN são os fatores transcricionais AP-1 e NFAT-3, além de AKT, MAPK e Ras. Todos
estes alvos como descrito anteriormente, são importantes elementos envolvidos diretamente
ou indiretamente na instalação do processo hipertrófico e inflamatório quando da indução
pelos peptídeos vasoativos do SRA. Assim, foi montado uma pequena rede (Figura 25) que
mostra a interação dos miRNAs analisados com outros possíveis alvos que poderiam regular
relacionados as vias que conduzem a hipertrofia cardíaca mediada por inflamação e ainda
poderiam ser possíveis alvos de investigações futuras utilizando o modelo celular que
estabelecemos.
O conjunto destes resultados foi importante para a obtenção de um modelo de estudo
das hipertrofias cardíacas mediadas por inflamação, além disto, neste modelo celular parece
haver um mecanismo de co-regulação entre as proteínas COX-2 e PTEN modulando assim o
processo hipertrófico/inflamatório e também o possível envolvimento de um mecanismo de
controle pós-transcricional na expressão destas proteínas mediado pelos miRNAs miR-26a e
miR-26b como sumarizado na figura 26. Assim, o conhecimento gerado poderá futuramente
promover o desenvolvimento de um produto biotecnológico para diagnóstico ou mesmo
tratamento de hipertrofias cardíacas inflamatórias, importante alteração nas doenças
cardiovasculares.
68
Figura 26. Esquema do mecanismo de co-regulação das proteínas COX-2 e PTEN no
modelo celular para estudo das hipertrofias mediada por inflamação quando induzida por
peptídeos vasoativos.
69
6. CONCLUSÕES
70
1. O modelo celular estabelecido funciona para estudo das hipertrofias cardíacas mediada
pela inflamação, possuindo assim uma aplicação na pesquisa dos mecanismo
moleculares da hipertrofia.
2. Angiotensina II a 10 µM e Angiotensina-(1-7) a 1 µM não promoveram a diminuição
na viabilidade celular de células H9c2.
3. Células H9c2 expressam mRNA dos receptores AT1b e Mas.
4. Ang II e Ang-(1-7) modulam os níveis de expressão dos marcadores de alterações
cardíacas ANF, BNP e MYHC-β.
5. Ang II e Ang-(1-7) modulam da síntese de PGE2.
6. Ang II induz aumento da área celular enquanto a Ang-(1-7) não.
7. Ang II promove modulação dos níveis de expressão dos fatores transcricionais Nf-κB,
Fos e Jun (AP-1), porém não altera os níveis de Nfat-3, reforçando seu papel como
indutor de hipertrofia neste modelo celular.
8. Ang-(1-7) não promoveu aumento dos níveis de expressão dos fatores transcricionais
Nf-κB, Fos e Jun (AP-1) e Nfat-3.
9. Em ambas as condições de indução, COX-2 e PTEN parecem envolver-se num
mecanismo de co-regulação no modelo celular hipertrófico/inflamatório.
10. Em células induzidas com Ang II, os miR-26a e 26b podem estar relacionados
diretamente com a regulação da expressão de PTEN e indiretamente de COX-2.
71
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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![Maggie Cox - [Aposta No Desejo] - Coração Marcado (Jessica 146.2)](https://img.document.onl/doc/110x75/577cc3d71a28aba711974d0b/maggie-cox-aposta-no-desejo-coracao-marcado-jessica-1462.jpg)
