8!BliOTECA~NST'TUrODE QUíRfliCAUmv€rsidarie de São Paulo

~.~;76

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Instituto de Química

Departamento de Bioquímica

Efeitos de lípides sintéticos na solubilização e

estabilidade coloidaI do miconazol e sobre

células de Candida albicans

Luis Femando~checo Otálora

Tese de Doutorado

ORIENTADORA: Prof. Dra. Ana Maria~Carmona-Ribeiro

São Paulo 2004

íNDICE

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. - INTRODUÇÃO 2

1.1.- SICAMADAS LIPíDICAS .41.2.- SICAMADA DE ANFIFíLlCOS SINTÉTICOS 51.3.- MEMBRANAS BIOLÓGiCAS 8

1.3. 1. - Parede celular de procariotos.. 131.3.2. - Membrana de eucariotos e parede celular de fungos 151.4.1.- Polienos 21

1.4.1.1.-Formulaçães Lipídicas dos Políênícos 231.4.2.- Azóis 25

1.4.2.1.-Novos azólicos 311.4.3.- Nova Classe de Antifúngicos: os Lipopeptídeo 32

1.5.- lipOSSOMOS COMO CARREADORES DE AGENTES ANTIMICROBIANOS 331.6.- INTERAÇÃO ENTRE BROMETO DE DIOCTADECILMETILAM<JNIO OU DIHEXADECILFOSFATO DE SÓDIO E CÉLULAS 391.7.- PRINCípIOS TEÓRICOS DOS MÉTODOS UTILIZADOS 41

1.7.1.- Isotermas de adsorção 411.7.2.- Mobilidade eletroforética e determinação de potencial zeta 431.7.3.- Espectrofotometria de UV-visível 481.7.4.- Espalhamento de luz dinâmico 49

2. • OBJETiVOS 52

PARTE I: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO DE MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA CATI<JNICO (DaDAS) 52PARTE 11: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO E/OU ESTABILIZAÇÃO COLOIDAL DO MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA

ANI<JNICA (DHP) 52PARTE 111: ASPECTOS FíSICQ-QuíMICOS DA INTERAÇÃO ENTRE ANFIFiLlCOS CATI<JNICOS DE DaDAS E CÉLULAS DE C.

ALBICANS.............. 53

3.- MATERIAIS E MÉTODOS 53

3.1.- REAGENTES 533.2.- EQUIPAMENTOS 54

3.2.1.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus) para determinações de diâmetro médio das partículas emdispersão 543.2.2.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus) para determinações do potencial zeta das partículas emdispersão 553.2.3.- Espectrofotómetro Hitachi-Modelo U-2000 553.2.4.- Espectrofotómetro (Model Spectrascan 2800 CIBA-CaRNING) 563.2.5.- Sonicador Lab-Line UltraTip (Modelo 9100 com tip de titânio) 563.2.6.- Centrífugas 57

3.3.- MÉTODOS PREPARATIVOS PARA OBTENÇÃO DAS DISPERS<JES DE LIPíDIOS, DROGA E CÉLULA 573.3.1.- Dispersão de lípides sintéticos por sonicação com sonda 573.3.2.- Dispersão de lípides sintéticos por injeção clorofórmica 573.3.3.- Dispersão de fosfatidilcolina ou brometo de dioctadecildimetilamônio por injeção etanólica583.3.4.- Dispersão de brometo de dioctadecildimetila-mônio por aquecimento e agitação 583.3.5.- Preparação da solução estoque de miconazol 583.3.6.- Cultivo de Candída albícans, determinação da curva de crescimento e contagem de célulasem câmara de Neubauer 59

3.4.- MÉTODOS ANALíTICOS 613.4.1.- Determinação da concentração de fosfati-dilcolina e dihexadecilfosfato por dosagem defósforo inorgânico 613.4.2.- Determinação da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio por microtitulação

................................................................................................................................................. 633.4.3.- Determinação da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio pelo método de Brij

................................................................................................................................................. 63

3.5.- DETERMINAÇÃO DE TAMANHO E POTENCIAL-ZETA DAS PARTícULAS 673.6.- DETERMINAÇÃO DE ISOTERMA DE ADSORÇÃO DE BROMETO DE DIOCTADECILDIMETILAMÔNIO SOBRE CÉLULAS DE

C. ALBICANS 683.7.- DETERMINAÇÃO DE ADSORÇÃO DE BROMETO DE DIOCTADECILDIMETILAMÔNIO SOBRE C. ALBICANS 693.8.- DETERMINAÇÃO DA MOBILIDADE ELETROFORÉTICA 69

4. - RESULTADOS E DiSCUSSÃO 72

PARTE I: ESTUDO DASOLUBILlZAÇÃO DE MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADACATIÔNICO (DODAB) 724.1.- Características das dispersões de Iípides: 724.2.- Solubilização de miconazol em dispersões de Iípides por espectroscopia de UV-Visível 744.3.- Absorptividade molar (c) do miconazol em algumas dispersões lipídicas 754.4.- Solubilização de miconazol em dispersões de brometo de dioctadecildimetilamônio ou defosfatidilcolina 764.5.- Inserção de miconazol nas bicamadas vista por determinações de diâmetro médio (Oz) epotencial zeta (Ç) 79

CONCLUSÕES 80

Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de bicamada catiônico (OOOAB) 80PARTE 11: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO E/OU ESTABILIZAÇÃO COLOIDAL DO MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA

ANIÔNICA (DHP) 814.6.- Floculação ou estabilização de dispersões de miconazol por bicamadas de OHP 814.7.- Efeito de concentração de miconazol em pH 6,3 sobre sua agregação em dihexadecilfosfatode sódío 0,05 mM. 824.8.- Efeitos de pH sobre o diâmetro médio (Oz) e potencíal zeta (Ç) de dispersões de droga,dihexadecilfosfato de sódio ou dihexadecilfosfato de sódio e droga 844.9.- Efeito de concentração de dihexadecilfosfato de sódio sobre a cinética de agregação dadroga 0.2 mM, em diferentes pHs 87

CONCLUSÕES 89

Parte 11: Estudo da solubilização e/ou estabilização coloidal do MCZ em fragmentos de bicamadaaniônica (OHP) 89

PARTE 111: ASPECTOS FíSICO-QuíMICOS DA INTERAÇÃO ENTRE ANFIFíLlCOS CATIÔNICOS DE DODAB E CÉLULAS DE C.ALBICANS 90

4.10.- Interação entre bicamadas catiônicas e células de Candida albicans 904.10.1.- Isoterma de adsorção de brometo de dioctadecildimetilamônio em células de Candidaalbicans fixa a concentração de células em 10

8células/mL 91

4.10.2.-Efeito da concentração de células sobre a adsorção de DODAB.................................................................................................................................................................94

4.10.3.- Efeíto da concentração de brometo de díoctadecildimetilamônio sobre a mobilidadeeletroforétíca das células 96

CONCLUSÕES 99

Parte 111: Aspectos físico-químicos da interação entre anfifílicos catiônicos de OOOAB e células de C.albícans 99

5.- PERSPECTiVAS 10O

6.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101

1

Dedico este trabalho à minha família.

Obrigado pela paciência e força

"Escolha um trabalho que você ame e não terás que trabalhar um único dia em sua vida ". (Confúcio)

A minha amiga, amante e se Deus,

quiser, minha esposa Karen.

"O amor talvez seja o único olhar que possamos lançar à eternidade", (Helen Haynes)

AGRADECIMENTOS BIBLIOTECAiNSTiTUTO DE QUíMICAUOlversida,je de São Paulo

À Dra. Ana Maria Carmona-Ribeiro, pela orientação, apoio e incentivo.

Aos colegas do Laboratório, que decisivamente contribuíram para realização

desse trabalho: Edla, Claudia, Débora, Nilton, Felipe, e Sergio. Em especial a

Débora e Sergio pela grande ajuda na digitação da Tese.

A cada uns de vocês pela paciência e compreensão nestes últimos quatro

anos, pelos intermináveis cafezinhos, e as conversas nos corredores que terminavam

em discussões e brigas intelectuais. Bom gostaria de falar de cada uns de vocês mais

eu não terminaria esta tese... , então decidi identificara a cada uns vocês com uma

frase celebre.

Edla. "Nós geralmente descobrimos o que fazer percebendo aquilo que não devemos fazer. E

provavelmente aquele que nunca cometeu um erro nunca fez uma descoberta ".(Samuel Smiles)

Claudia. "Hay que endurecerse sin perder la ternura, jamas ". (Che Guevara)

Débora. "Qualquer um pode zangar-se - isto é fácil. Mas zangar-se com a pessoa certa, na medida certa,

na hora certa, pelo motivo certo e da maneira certa - não é fácil". (Aristóteles)

Nilton. "O importante é o principal. O resto é secundário ".

Felipe. "Eujá não sou o que era: devo ser o que me tornei". (Coco Chanel)

Sergio. "Há duas coisas infinitas: o Universo e a tolice dos homens ". (Alhert Einstein)

suporte financeiro da FAPESP e CNPq que amparou o laboratório de Biocolóides e à CAPES pela

bolsa de Doutorado concedida. Ao Instituto de Química da USP pelas facilidades oferecidas.

A Diego y esposa por la facilidades que me brindaron a mi llegada a Brasil, a

Miguel y Glenda por el apoyo en estos últimos aftos, a los Toribios por sua amistad y apoyo

en todo momento, a Frejol por su amistad y ayuda desinteresada, aI sapito por sus criticas y

comentários en el desarrollo de esta tesis, a papa Celso por su objetividad y ayuda para

resolver problemas aI tigre a coyote por los buenos momentos pasados em CRUSP

AS

[AnB]

ATCC

DODAB

DHP

Dz

BF

GUV

LV

L-AnB

LUV

ME

[MCZ]

MCZ-DODAB

MCZ-DHP

MCZ-BF

MCZ-LV

MCZ-PC

MLV

N s

PC

SUV

TEM

Tc

UFC

UV

ç

Àmax.

LISTA DE ABREVIATURAS

Ágar Sabouraud

Concentração de anfotericina B

American Type Culture Collection

Brometo de dioctadecildimetilamônio

Dihexadecilfosfato de sódio

Diâmetro de partículas obtido por espalhamento de luz dinâmico

Fragmentos de bicamada

Vesículas unilamelares gigantes

Vesículas grandes

Formulação liposomal de anfotericina B

Vesículas unilamelares grandes

Mobilidade eletroforética

Concentração de miconazol

Miconazol solubilizado em DODAB

Miconazol solubilizado em DHP

Miconazol solubilizado em BF

Miconazol solubilizado em LV

Miconazol solubilizado em PC

Vesículas multilamelares

Parâmetro geométrico

Fosfatidilcolina

Vesículas unilamelares pequenas

Microscopia eletrônica de transmissão

Temperatura de transição de fase

Unidade formadora de colônia

Ultra-violeta

Potencial zeta

Comprimento de onda correspondente a um máximo de absorção de

luz

RESUMO

Bicamadas de lípides sintéticos como o brometo de dioctadecildimetilamônio

(DODAB) ou dihexadecilfosfato de sódio (DHP) foram avaliadas como carreadores em

potencial de miconazol (MCZ), uma droga altamente hidrofóbica. A solubilização e/ou

estabilização do MCZ foi avaliada através de métodos de espectrofotometria no UV-visível,

determinações de tamanho por espalhamento de luz dinâmico, determinações de potencial

zeta e cinéticas de agregação da droga por medidas turbidez em presença ou ausência das

dispersões dos anfifílicos. Os resultados mostram que há uma notável capacidade de

solubilização de MCZ em fragmentos de membrana (BF) de dispersões de DODAB, o que

não ocorre para vesículas grandes (LV) dos mesmos anfifilicos. Ainda, demonstrou-se uma

evidente estabilização coloidal do particulado de droga em dispersão aquosa por deposição

de bicamadas aniônicas de DHP sobre os grânulos catiônicos do miconazo1. Em elevadas

proporções molares drogai lípide sintético observou-se um aumento na estabilidade coloidal

do particulado de droga que foi atribuído ao recobrimento do particulado catiônico de droga

com bicamadas aniônicas. Posteriormente, foram avaliadas as possíveis interações

existentes entre células de Candida albicans e fragmentos e/ou vesículas de DODAB.

Isotermas de adsorção foram obtidas em função do método de dispersão, concentração do

anfifílico e densidade numérica de células. Para os fragmentos de bicamada, as isotermas

mostraram-se de alta afinidade (adsorção não-reversivel) não havendo desorção, ao

contrário do resultado obtido para as vesículas grandes, onde foi observada desorção a

partir da superficie celular. A desorção é favorecida pelo aumento da quantidade de

vesículas livres no sobrenadante, sugerindo assim que existe uma significante interação

intervesicular de natureza hidrofóbica entre DODAB adsorvido e as vesículas livres.

Experimentos de mobilidade eletroforética (ME) mostram a mesma tendência. Dois tipos

de interações puderam ser notados. As interações de natureza eletrostática estão presentes

em ambas condições (interação das células com fragmento e/ou vesícula). A interação

ocorre entre a cabeça carregada do anfifilico e a membrana do fungo. Interações

hidrofóbicas possivelmente ocorrem somente em fragmentos de bicamada devido a

interações extra-atrativas entre regiões hidrofóbicas da parede celular e as bordas

hidrofóbicas dos fragmentos.

ABSTRACT

Bilayer of synthetic lipids such as sodium dioctadecyldimethylarnrnoniurn bromide

(DüDAB) or dihexadecylphosphate (DHP) were assessed as potential carriers for

miconazol (MCZ), a very hydrophobic drug. The solubilization anel/or stabilization of the

drug were tested by UV-visible spectrophotometry methods, size deterrninations by

dynamic light scattering, zeta-potential detenninations and drug aggregations kinetics by

turbidity changes in the presence or absence of amphiphiles dispersions. Our results show

an outstanding capacity solubilization of MCZ in bilayer fragrnents (BF) of DODAB

dispersions, what doesn't occur with large vesicles (LV) from the same amphiphiles. Still,

we have demonstrated a colloidal stabilization of drug partic1es in water dispersion by

deposition of anionic bilayers of DHP on the cationic MCZ granules. In high molar ratio

drug/synthetic lipid we observed an increasing colloidal stabilization of drug partic1es that

was attributed to the covering of the drug cationic partic1es with anionic bilayers.

Subsequent1y, were evaluated the possible interactions that existed between Candida

albicans cells and DODAB fragrnents anel/or vesic1es. Adsorption isotherrns were obtained

as a function of the method of dispersion, concentration of the amphiphiles and cells

number density. For the bilayer fragrnents, the isotherrns showed high affinity (irreversible

adsorption) without desorption, in contrast with the isotherrns obtained for large vesic1es,

where we observed desorption of these vesic1es over the cellular surface. The desorption

was favored by the increase of free vesic1es in the supematant, thus suggesting that there is

a significant inter-vesic1e interaction ofhydrophobic nature between adsorbed DODAB and

the free vesic1es. Electrophoretic mobility (ME) experiments showed the same tendency.

Two types of interactions could be observed. The electrostatic nature interactions were

present in both conditions (cellular interaction with fragrnent and/or vesic1e). The

interaction occurs between the charged head of the amphiphilic and the fungus membrane.

Hydrophobic interactions possibly only occur with bilayer fragrnents due the extra­

attractive interaction existing between hydrophobic regions of the cell wall and the

hydrophobic borders ofthe fragrnents.

1. - INTRODUÇÃO

Ao longo do tempo, a utilização da maioria dos compostos terapêuticos tem sido

limitada pela impossibilidade do aumento da sua dosagem. A retenção ou degradação

do agente terapêutico; baixa solubilidade e, em especial, os efeitos colaterais inerentes à

sua utilização em concentrações elevadas, tomam muitas vezes difícil à utilização da

dosagem necessária para que este cumpra sua função. Este problema levou, durante o

século XX, e em especial no decorrer das ultimas décadas, que houvesse um grande

esforço no sentido de desenvolver um sistema capaz de carrear um composto

terapêutico (drogas, em especial as dirigidas a tumores, antibióticos, enzimas, agentes

quelantes ou compostos modificadores da célula).

A primeira proposta de um sistema direcionado de carreamento de fármacos data

do início do século XX (EHRLICH, 1906) quando Paul Ehrlich propôs o seu modelo,

que ficou conhecido por "Bala Mágica de Ehrlich" (Ehrlich 's Magic Bullet). Neste

modelo, o fármaco é ligado ao carreador direcionado, e idealmente exibirá a sua

atividade farmacológica apenas no tecido alvo (mecanismos de especificidade, como a

ligação entre antígeno e anticorpo, eram já conhecidos). Assim, os efeitos indesejáveis

resultantes da sua ação em outros tecidos são largamente diminuídos, enquanto o

aumento da eficiência permite o aumento da dose administrada. Porém, por mais

atrativos e simples que possam parecer os conceitos de Ehrlich, são muito poucos os

sucessos até agora obtidos (CAMMAS & KATAüKA, 1996). As primeiras tentativas

para a obtenção de um sistema carreador eficaz tiveram como base o encapsulamento

das biomoléculas a serem transportados em vesículas de nylon e outros polímeros

sintéticos (CHANG, 1964; 1968 e 1971). Contudo, esta abordagem mostrou-se

totalmente inadequada, visto que estas vesículas de material artificial se acumulam no

orgamsmo.

ü primeiro grande passo em frente nesta área deu-se em 1965, com a publicação

por Alec Bangham e colaboradores de um trabalho de investigação fundamental sobre a

difusão de íons através de membranas lipídicas artificiais, embora sem qualquer ligação

imediata aos estudos de sistemas carreadores de fármacos (BANGHAM et al., 1965).

Neste trabalho foi feita a caracterização de um sistema de vesículas fosfolipídicas ao

qual, três anos mais tarde, seria dado o nome de lipossomos (SESSA & WEISSMANN

1968). No entanto, estas estruturas multilamelares obtidas da hidratação de fosfolipídios

SIBlIOI:INSTITUTO DE Ql

já eram anteriormente conhecidas, sendo denominadas "figuras de mielina" Universidade de Sãl

(STOECKENIUS, 1959). Imediatamente após o trabalho de Bangham, os lipossomos

Impuseram-se como um sistema modelo simples para o estudo de membranas

biológicas. O sucesso da incorporação de enzimas em lipossomos (SESSA &

WEISSMANN 1970) despertou também o interesse da comunidade científica para a sua

aplicação médica e farmacológica. Em 1971, Gregory Gregoriadis propôs pela primeira

vez a utilização dos lipossomos como sistema carreadores de fánnacos

(GREGORIADIS et aI., 1971), mantendo desde então um papel preponderante no

desenvolvimento desta área.

Os lipossomos são um caso evidente de um sistema que teve uma passagem

extremamente rápida do campo da investigação para a aplicação comercial

(especialmente na área da cosmética), sem mesmo que as suas propriedades e eficácia

estivessem completamente estudadas (GREGORIADIS, 1994). Este fato ficou a dever­

se, fundamentalmente, à euforia desencadeada na década de 70 e início da década de 80

pelo potencial de aplicação dos lipossomos nas industrias médica e farmacêutica, o que

veio mesmo a lançar sérias dúvidas sobre o rigor de alguns resultados relevantes

(LASIC, 1992).

O uso de sistemas artificiais capazes de carrear uma droga, genes, ácidos

nucléicos terapêuticos, como antisense de oligonucleotídeos (ONs), ribozimas e DNA

plasmidial oferecem uma estratégia potencial para alvos específicos de enfermidades

celulares a nível molecular (CEVC, 2004; SCHNYDER, et aI. 2004; SCHIFFELER,

2003; ARIKAN & REX, 2001; STUAR & ALLEN, 2000; AGRAWAL & ZHANG,

1997; HERBRECHT, et al., 2003). No entanto, estas macromoléculas polianiônicas ou

drogas hidrofóbicas possuem algumas características inerentes que restringem sua

utilidade pré-clinica e clinica, na terapia de enfermidades crônicas, devido à dificuldade

destes serem administrados intracelularmente e, sua rápida eliminação pelo sistema

reticulo endotelial, ou degradação e inativação por exo e endo nucleases do plasma ou

da célula (AKHTAR et aI., 1991). A encapsulação de drogas de importância clinica em

vesículas lipídicas ou lipossomos vem sendo avaliada para aumentar a eficiência e

entrega ao órgão alvo (TEMPLETON, 2003; GARCIA-CHAUMONT et aI., 2000;

SEMPLE et aI., 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003; VIEIRA &

CARMONA-RIBEIRO, 2001; LINCOPAN & CARMONA-RIBEIRO, 2003).

Lipossomos catiônicos são comumente os mais usados como sistema de entrega de ONs

ou genes (DASS & SU, 2000; AGRAWAL & IYER, 1997). Três modelos de interação

3

do complexo lipossomos catiônicos/ONs com células são propostos (i) a fusão direta

com membranas lipídicas (ii) endocitose e fusão ou desestabilização com a membrana

do endosomo e (iii) transposição através de poros da membrana plasmática.

A interação eletrostática de lipossomos catiônicos com membranas lipídicas

carregadas negativamente, facilitam o processo de fusão (MONKKONEN & URTTI,

1998). A interação de ONs com lipossomos catiônicos facilita o ingresso dentro da

célula via endocitose (ZELPRATI & SZOKA, 1996; JAASK.ELAINEN et aI., 1998).

Não obstante, a eficiência na encapsu1ação assim como a entrega ao órgão alvo in vivo,

se vê dificultada pela rápida desestabilização dos lipossomos catiônicos por proteínas do

soro ou do sistema imune (CICCARONE et aI., 1993). Melhoras na estabilização assim

como o aumento no tempo de circulação se viu facilitado com o emprego de polímeros

ou 1ipídeos modificados com po1ieti1enog1icol (PEG), tanto como seu direcionamento

com vetores ou anticorpos que reconheçam receptores específicos no endotélio do

cérebro como a transferrina (SINGR, 1999; LI & QIAN, 2002).

Sistemas carreadores de droga, como os 1ipossomos, terão um futuro brilhante

como componentes de fármacos por diversas razões: (i) Aspectos como a entrega

passiva à alvos específicos, podem substancialmente aumentar a quantidade de droga

em sítios infectados. (ii) A tecnologia destes carreadores segue o índice terapêutico para

drogas já previamente estabelecidas. Isto remove alguns dos riscos consideráveis

associados com o desenvolvimento de novas drogas. (iii) Novas drogas com alto

potencial farmacêutico estão surgindo com os avanços da biotecnologia, que podem se

constituir de biomoléculas como proteínas, peptídeos, ONs, e plasmídeos. O

desenvolvimento clínico destes tipos de drogas 7dependem, muitas vezes, da sua

associação à um carreador (ALLEN, et aI., 2004).

1.1.- Bicamadas lipídicas

A bicamada lipídica é a estrutura básica comum a todas as membranas

biológicas e, como nos lipossomos, serve como uma barreira impermeável à maioria dos

íons e moléculas hidrossolúveis. Nas células, as membranas associadas a proteínas,

viabilizam o transporte de determinados solutos, ou seja, as membranas são

impermeáveis a compostos para os quais dispõem de transportadores específicos.

A formação de bicamadas lipídicas é um processo de automontagem. Em outras

palavras, a estrutura de uma lâmina bimolecular é inerente à estrutura das moléculas

4

lipídicas constituintes, e decorrente de seu caráter anfipático. As interações hidrofóbicas

se constituem na principal força diretora da formação de bicamadas lipídicas. Moléculas

de água são liberadas das caudas hidrocarbônicas dos lipídeos quando estas ficam

seqüestradas no interior apoIar da bicamada. Além disso, há forças atrativas de van der

Waals entre as caudas, favorecendo o seu íntimo empacotamento. Finalmente, existem

ainda interações de pontes de hidrogênio entre as cabeças polares dos lipídios e as

moléculas de água. Desse modo, as bicamadas lipídicas são estabilizadas por todo o

conjunto de forças que participam nas interações intermoleculares em sistemas

biológicos.

Outra característica importante das bicamadas lipídicas se deve ao fato desta

formar estruturas cooperativas que são mantidas juntas por interações não covalentes de

reforço. A aglomeração é também favorecida pelas forças atrativas de van der Waals

entre cadeias hidrocarbônicas adjacentes. Esses fatores energéticos possuem três

conseqüências biológicas significativas: (i) as bicamadas lipídicas possuem uma

tendência inerente a serem extensas, (ii) as bicamadas lipídicas tendem a fechar-se sobre

si mesmas para que não haja bordas com cadeias hidrocarbônicas expostas, o que

resultaria na formação de um compartimento e (iii) as bicamadas são autoselantes

porque um orifício em uma bicamada é energeticamente desfavorável (STRYER, 1996).

Em uma situação ideal, a bicamada se estenderia indefinidamente na direção lateral. Na

realidade, amostras finitas, como fragmentos de membrana, mostram defeitos

hidrofóbicos nas bordas (HAMMARSTROM, et aI., 1995), e bicamadas tendem a

fechar sobre si mesmas, formando estruturas conhecidas como lipossomos (EVANS &

WENNERSTRÓM, 1994).

1.2.- Bicamada de anfifílicos sintéticos

Bicamadas formadas por moléculas de anfifilicos têm uma posição central no

estudo de auto-organização, apresentando papel crucial em processos biológicos e

industriais (EVANS & WENNERSTRÓM, 1994). Para formar bicamadas os anfifilicos

devem possuir forma molecular cilíndrica. O tamanho e forma do agregado de anfifílico

são dependentes dos parâmetros moleculares (volume da porção hidrofóbica da

molécula, comprimento de cadeia, e área da cabeça polar) e variáveis intensivas

(temperatura e força iônica). O modelo de auto-associação de Israelachvili prevê o

agregado ótimo para um determinado conjunto de parâmetros moleculares e variáveis

5

Oit.~,_ .._ ...... ,"\

INSTITUTO DE {)UiMICAUniversidade de São Paulo

intensivas usando um critério de minimização de energia livre para o monômero no

agregado (ISRAELACHVILI et a1., 1977).

Pode-se assumir que a energia livre de auto-associação dos surfactantes em

soluções diluídas é constituída de três termos (EVANS & WENNERSTROM, 1994):

- Uma favorável contribuição hidrofóbica, devido às cadeias hidrofóbicas isoladas no

interior do agregado.

- Um termo de superficie, que reflete duas tendências opostas dos grupos polares: i) a

tendência de se aglomerarem para minimizar o contato entre as cadeias hidrocarbônicas

e a água; ii) a tendência de se manterem separados, decorrente da repulsão eletrostática,

repulsão de hidratação e impedimento estérico.

- Um termo de empacotamento, que no nível mais simples, requer que o interior

hidrofóbico do agregado exclua a água.

Termos de superficie e empacotamento assumem diferentes formas funcionais

para cada agregado geométrico específico. A forma que dá o mínimo de energia livre

para um determinado conjunto de condições determina a estrutura ótima do agregado.

Para soluções diluídas em que interações entre agregados não são importantes,

pode-se assumir essas concepções convenientemente no parâmetro geométrico (Ns), que

é dado por:

N _ vs - .

aol

Eq.1.2.1

onde, v é o volume da porção hidrofóbica da molécula do surfactante; I é o comprimento

da cadeia hidrocarbônica e ao é a área ótima da cabeça polar.

Além dos aspectos energético-estruturais, uma série de outras propriedades se

originam devido às características coloidais destes agregados supramoleculares. Como

já foi dito anteriormente, esses agregados estão dispersos num meio, apresentando uma

interface de separação bem definida. Estas interfaces são geralmente regiões de alta

energia livre onde fenômenos de superficie, tais como adsorção e formação de duplas

camadas elétricas podem ocorrer.

Lipídios que formam bicamadas são aqueles que não podem empacotar em

estruturas micelares devido à sua cadeia hidrocarbônica muito volumosa para se ajustar

em agregados micelares, enquanto mantêm uma área superficial ótima. Para lipídios

formadores de bicamadas, o valor de v/(aolJ deve ser próximo de 1 e, para que isso

ocorra é necessário que a área do grupo polar, ao, e o comprimento da cadeia

6

hidrocarbônica, I, sejam iguais aos valores dos lipídios formadores de micela, e o

volume da cadeia hidrocarbônica, v, deve ser cerca de duas vezes aquele dos lipídios

formadores de micela. (para que v/(ao!) esteja entre 113 e 112). Por essa razão, lipídios

com duas cadeias são prováveis formadores de bicamadas e, de fato, a maioria deles

formam bicamadas. Por exemplo, lisolecitinas formam micelas pequenas, mas não

esféricas, enquanto lecitinas com duas cadeias formam bicamadas.

A Tabela 1.2.1 ilustra a associação entre o parâmetro geométrico e os agregados

supramoleculares formados. À medida que o parâmetro geométrico aumenta, a estrutura

supramolecular formada também aumenta.

Particularmente, o aumento do volume hidrocarbônico afeta as propriedades dos

agregados. Como exemplo tem-se o aumento da hidrofobicidade do lipídio, que diminui

drasticamente sua concentração micelar crítica (CMC). A CMC de lipídios formadores

de micelas é em tomo de 10-2 a 10-5 M, enquanto a CMC de lipídios formadores de

bicamada está entre 10-6 elO-la M. Para lipídios formadores de micelas o tempo 1 de

permanência da molécula dentro do agregado é aproximadamente de 10-4 s, enquanto

que para os formadores de bicamada este tempo é de aproximadamente 10+4 s

(ISRAELACHIVILI, 1992).

7

wl9' I'~""-U i:l...tili:CA

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paula

Tabela 1.2.1 Forma de empacotamento de moléculas anfifilicas e estruturas formadas por esses lipídios

(ISRAELACHVILl, 1992).

Anfifilico

Anfifilico de cadeia simples (surfactantes) com área da cabeça polar

grande: SDS em baixa concentração de sal.

Anfifilico de cadeia simples com área de cabeça polar pequena:

SDS e CrAB em alta concentração de sal, /ipidios não-iônicos.

N,

< 1/3

1/3 - 1/2

Forma do

empacotamento

Cone

fj::::":~__::::~-i:-I----

v /

Tronco de cone

fJ

Estrutura formada

Micela esférica

-Micela cilíndrica

~~\\'I~~~~

Lipídios de cadeia dupla com área de cabeça polar grande, cadeias

fluidas:

Fosfatidi/colina (lecitina), fosfatidilserina, fosfatidi/glicerol,

fosfatidilinositol, ácido fosfatidico, esjingomielina,

diexadecilfosfato, sais de dialqui/dimetilamônio.

1/2 - I

Tronco de cone

r:JBicamadas

vesículas.

flexíveis,

Lipídios de dupla cadeia com área de cabeça polar pequena, lipídios

aniônicos em alta concentração salina, cadeias saturadas rígidas: -1

Fosfatidi/etanolamina,fosfatidil serina J + Ca'·.

Cilindro

bJBicamadas planas

mmilffmmnnmm

Lipídio de dupla cadeia com área de cabeça polar pequena, lipídios

nào iônicos, cadeias poli (eis) insaturadas:

Fosfatidi/etanolamina insa/urada, cardiolipina + Ca'·, ácido

fosfatidico + Ca h, colesterol.

>1

Cunha

C]MiceIas invertidas

~~~1.3.- Membranas biológicas

As membranas biológicas são estruturas lamelares, com tipicamente 75 Á de

espessura, compostas de moléculas de proteínas e de lipídios mantidas juntas por

interações não covalentes. As membranas são barreiras de permeabilidade altamente

seletivas. Criam compartimentos fechados, que podem ser células inteiras ou organelas

dentro de uma célula. Bombas protéicas e poros em membranas regulam as

composições moleculares e iônicas desses compartimentos. As membranas também

controlam o fluxo de informações entre células. Por exemplo, muitas membranas

contêm receptores para hormônios como a insulina. Além disso, as membranas estão

8

intimamente implicadas em processos de transformação de energia, tais como a

fotossíntese e a fosforilação oxidativa (STRYER, 1996).

Membranas biológicas são estruturas indispensáveis para os organismos vivos.

São estas membranas que dão as células a capacidade de se separar do meio externo. A

própria célula também contem membranas internas presentes nas organelas, tais como

lisossomos ou mitocôndria, para separar compartimentos com diferentes funções

fisiológicas. As membranas biológicas funcionam como uma barreira permeável

altamente seletiva nos processos bioquímicos. Assim, uma célula pode se comunicar

com o meio externo através de canais iônicos ou receptores específicos e, portanto, as

membranas têm importante papel na comunicação biológica, necessária para manter a

vida (STRYER, 1996).

As membranas biológicas são compostas principalmente de lipídios e proteínas.

Entretanto, os lipídios, em sua maioria fosfolipídios, são os responsáveis pela formação

espontânea de estrutura de bicamada em meio aquoso, como mostra a Figura 1.3.1,

devido ao caráter anfifilico dessas moléculas, ficando uma parte exposta a água (cabeça

polar) e outra excluída pelo efeito hidrofóbico (cadeia hidrocarbônica).

Macroscopicamente, estas bicamadas podem se agregar formando estruturas lamelares,

separadas por camadas hidratadas da parte hidrofilica dos lipídeos. Elas podem se

organizar em multicamadas planas, ou camadas esféricas que podem ser vesículas

muItilamelares ou unilamelares.

9

I. Bicamada de fosfolípidos2. Lado externo da membrana3. Lado interno da membrana4. Proteína intrínseca da membrana5. Proteína canal iônico da membrana6. Glicoprotéina7. Moléculas de fosfolípidos organizadas

em bicamada

8. Moléculas de colesterol9. Cadeias de carboidratos10. GlicolipídeoslI. Região polar (hidrofilica) da molécula

de fosfolipídio12. Região hidrofóbica da molécula de

fosfolipídio

1

Figura 1.3.1. Modelo de Mosaico Fluido da membrana foi proposto por Singer e Nicolson em 1972.

A bicamada fosfolipídicas, a estrutura básica de todas as membranas celulares, consiste de duas camadas

de moléculas de fosfolipídios, onde as cadeias de ácidos graxos formam o interior hidrofóbico da

bicamada, e as cabeças polares, a parte exterior hidrofilica.

Nos sistemas vivos, os lipídios são raramente encontrados como moléculas

livres; em vez disso, estão associados a outras moléculas, em geral outros lipídios.

Fosfolipídios são abundantes nas membranas biológicas, constituintes das paredes

celulares (Figura 1.3.2). Eles derivam de um glicerol esterificado por dois ácidos

graxos, enquanto um grupo polar é ligado ao terceiro OH do glicerol, constituindo um

triacilglicerol. Nos mamíferos, esse terceiro grupo é fosforilado e então modificado,

formando um fosfolipídio. O intervalo típico de comprimento de cadeia hidrocarbônica

é de 16 a 18 carbonos e o grau de insaturação tende a aumentar com o aumento do

comprimento da cadeia (VOET, 1995; STRYER, 1996).

Figura 1.3.2. Modelo ilustrativo da estrutura química de um fosfolipídio (L-a-

phosphatidyJ ethanolamine).

As variações do tipo de álcool e carga a este associado, ligado ao grupo fosfato

da cabeça polar, e o comprimento e saturação das cadeias hidrocarbônicas, são

determinantes na capacidade de empacotamento das moléculas fosfolipídicas e,

portanto, da fluidez da membrana, que e biologicamente importante. Por exemplo,

certos processos de transporte de membrana e atividades enzimáticas podem ser

interrompidos quando a viscosidade da bicamada é aumentada acima de um

determinado nível. A fluidez da bicamada lipídica depende de sua composição. Porém,

ela também é dependente da temperatura. Se a bicamada de uma membrana sintética,

composta por um único tipo de fosfolipídio resfriar abaixo de uma temperatura

característica, denominada temperatura de transição principal Tc (gel-cristal-liquido),

ela sofrerá uma mudança de fase, passando assim para uma fase gel, onde a bicamada

encontra-se mais empacotada. Acima dessa temperatura (T >Tc), na denominada fase

líquido-cristalina, os fosfolipídios têm maior liberdade de movimento, conferindo a

bicamada um aumento da fluidez. A fluidez e carga das membranas lipossomais podem

ser alteradas para objetivos específicos, como no caso de reconhecimento de

macrófagos, nos quais lipossomos carregados negativamente e com maior fluidez nas

membranas são preferencialmente fagocitados. Normalmente, a incorporação de

esteróides na membrana aumenta a rigidez e estabilidade biológica dos lipossomos

(LüPEZ-BERESTEIN et aI., 1987).

Uma das características mais importante das bicamadas fosfolipídicas e o seu

comportamento ténnico, intimamente relacionada ao estudo de cristais líquidos. Cristais

líquidos são substâncias que apresentam propriedades de líquidos e sólidos, ou seja,

pode ser fluido como a água, ou pode apresentar uma ordem orientacional ao longo de

um eixo local, o eixo diretor. Este comportamento também e característico das

11

bicamadas lipídicas, que pode ser considerado um fluido bi-dimensional anisotrópico ou

um cristal-liquido liotrópico (VOET, 1995; STRYER, 1996).

Um entendimento de transição de fase e fluidez das membranas fosfolipídicas é

importante na preparação e exploração dos lipossomos, desde que a fase de uma

membrana lisossômica determina propriedades como permeabilidade, fusão, agregação

e ligação com proteína; fatores estes que podem afetar a estabilidade dos lipossomos e o

comportamento deles em sistemas biológicos (CEVC, 1987). A permeabilidade da

membrana aos prótons aumenta na temperatura de transição de fase (Tc) e assim

permanece se a temperatura for aumentada, contrastando com os íons sódio e outros

solutos onde a permeabilidade acima e abaixo da temperatura de transição de fase é

mais baixa do que na temperatura de transição de fase. Assim prótons e moléculas de

água, para os quais o transporte é consideravelmente mais rápido do que para íons de

sódio, possuem rotas extras através de membrana que são qualitativamente diferentes,

possivelmente na forma de canais aquosos (PAPAHADJOPOULOS et al., 1991). Isto se

refere a lipossomos nos quais os compartimentos interno e externo estão em equilíbrio.

Na transição de fase, as interfaces entre domínios de membrana em uma e outra fase

representam regiões defeituosas que permitem a passagem de diversos solutos e íons.

A literatura traz relatos da ação de drogas hidrofóbicas e anestésicos locais que

interferem na temperatura de transição de fase dos lipídios (LEE, 1978; ULRICH,

2002). Estudos que avaliaram a transição de fase lipídica por calorimetria diferencial de

varredura, reportaram uma diminuição na Te de vesículas de fosfatidilcolina, causada

pela partição da benzocaína e tetracaína. A perturbação causada por anestésicos locais

sobre o empacotamento dos fosfolipídios, também foi bastante estudada utilizando-se da

técnica ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e outras técnicas espectroscópicas,

como ressonância magnética nuclear (RMN), infravermelho e fluorescência 5, trazendo

enorme contribuição para o entendimento da interação de drogas hidrofóbicas e

anestésicos locais e a membrana (XU et al., 2002).

A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica tem sido muito utilizada no

estudo da estrutura dinâmica de biomembranas. Sua escala de tempo favorável e a

disponibilidade comercial de marcadores de spin facilmente incorporáveis em tais

membranas permitem o estudo das diferentes fases lipídicas e como estas variam em

função de fatores externos (por exemplo, temperatura) e/ou componentes das

membranas (SALGADO et al., 2001; ULRICH, 2002; XU et al., 2002)

12

1.3.1.- Parede celular de procariotos

Os procariotos foram, provavelmente, os primeiros organismos a colonizar a

Terra, e isto ocorreu há cerca de 2,6 bilhões de anos. Todos os procariotos

compartilham três características invariáveis: membrana celular, ribossomos 70 S

citoplasmáticos e região nuclear não limitada por membrana.

Os procariotos são divididos em eubactérias e arqueobactérias. As

arqueobactérias não possuem peptidoglicano, vivem em condições adversas (ex: altas

temperaturas, pH baixo ou elevado teor de sal) e efetuam reações metabólicas pouco

comuns, como a formação de metano. Já as eubactérias são subdivididas baseando-se

nas características da parede celular. Assim, as quatro categorias principais de bactérias

são: Eubactérias Gram-positivas e Gram-negativas com parede celular; Eubactérias sem

parede celular e Arqueobactérias (DANSON & HOUGH, 1998).

• Eubactérias Gram-negativas dotadas de parede celular.

As paredes celulares das bactérias gram-negativas consistem de uma ou algumas

camadas de peptídeoglicano e uma membrana externa. O peptídeoglicano está ligado a

lipoproteínas (lipídeos unidos covalentemente a proteínas) na membrana externa e está

no espaço periplasmático, um espaço entre a membrana externa e a membrana

plasmática. O espaço periplasmático contém uma alta concentração de enzimas de

degradação e proteínas de transporte. As paredes celulares gram-negativas não contem

ácidos teicóicos. Como as paredes celulares das bactérias gram-negativas contêm

somente uma pequena quantidade de peptideoglicano, são mais suscetíveis ao

rompimento mecânico (TORTORA et al., 2002).

A membrana externa da célula gram-negativa consiste de lipoproteínas,

lipopolissacarídeos (LPS) e fosfolipídeos. A membrana externa tem várias funções

especializadas. Sua forte carga negativa é um fator importante para a evasão da

fagocitose e da ação do complemento, dois componentes da defesa do hospedeiro. A

membrana externa também fornece uma barreira para certos antibióticos (por exemplo,

penicilina), enzimas digestivas como a lisozíma, aos detergentes, aos metais pesados,

aos sais biliares e certos corantes. Entretanto, a membrana externa não se constitui numa

má barreira para todas as substâncias do ambiente, pois os nutrientes devem atravessá-la

para manter o metabolismo da célula. Parte da permeabilidade da membrana externa é

devida a proteínas da membrana denominadas porinas, que formam canais. As porinas

permitem a passagem de moléculas como nucleotídeos, os dissacarídeos, os peptídeos,

13

os aminoácidos, a vitaminas B12 e o ferro. Contudo, elas também podem tomar as

bactérias vulneráveis ao ataque, fomecendo locais de fixação para vírus e substanciam

nocivas (TORTORA et aI., 2002) ..

O componente lipopolissacarídeo (LPS) da membrana extema fomece como

uma das características importantes das bactérias gram-negativas o fato da porção

polissacarídica ser composta de açúcares, denominados polissacarídeos O, que atua

como antígenos e são úteis para diferenciar as espécies de bactérias gram-negativas

(TORTORA et aI., 2002).

• Eubactérias Gram-positivas dotadas de parede celular.

Na maioria das bactérias gram-positivas, a parede celular consiste de muitas

camadas de peptideoglicano, formado por uma estrutura espessa e rígida. Esta é uma

razão pela qual as bactérias gram-positivas são mais sensíveis à penicilina do que as

bactérias gram-negativas. Além disso, as paredes celulares das bactérias gram-positivas

contêm ácidos teicóicos, que consistem primariamente de um álcool (como o glicerol ou

ribitol) e fosfato. Existem duas classes de ácidos teicóicos; ácido lipoteicóico que

atravessa a camada de peptideoglicano e está ligado à membrana plasmática, e ácido

teicóico da parede, que está ligado à camada de peptideoglicano (TORTORA et aI.,

2002).

Devido à sua carga negativa (presença de grupos fosfatos), os ácidos teicóicos

podem-se ligar e regular o movimento de cátions para dentro da célula. Eles também

podem assumir um papel no crescimento da célula, impedindo a ruptura extensa da

parede e possível lise celular. Finalmente os ácidos teicóicos fomecem boa parte da

especificidade antigênica da parede; portanto, tomam possível identificar bactérias por

certos testes de laboratório (TORTORA et aI., 2002).

• Eubactérias carentes de parede celular.

Compreendem os micoplasmas, que não possuem parede celular, não sintetizam

os precursores do peptidoglicano e são delimitados por uma membrana plasmática.

Assemelham-se às formas L eubacterianas, nunca podendo, no entanto, reverter ao

estado com parede celular. São altamente pleomórficos e seu tamanho varia desde

formas vesiculares a formas filtráveis muito pequenas. Sua reprodução é por

brotamento, fragmentação ou divisão binária, isoladamente ou em combinação. Formam

colônias em aspecto de "ovo frita" em meio sólido. Podem necessitar de colesterol para

seu crescimento (ex: Mollicutes).

14

• Arqueobactérias.

São microorganismos procarióticos residentes em ambientes terrestres e

aquáticos em condições adversas ou simbiontes do trato digestivo de animais. Têm

formas esféricas, espiraladas, em placa ou bastonete; uni ou multicelulares. Podem ser

aeróbios, anaeróbios e anaeróbios facultativos, que são quimiolitotrójicos,

heterotrójicos ou heterotrójicos facultativos. Podem ser termofilicos, isto é, capazes de

crescer em temperaturas acima de 60°C. Sua multiplicação é por divisão binária,

brotamento, constrição, fragmentação ou através de mecanismos desconhecidos.

Apresentam seqüências características de RNA ribossômico (DANSON & HOUGH,

1998).

1.3.2.­

celular de fungos

Membrana de eucariotos e parede

As membranas constituintes das células procarióticas como eucarióticas, são

lâminas finas e deformáveis, mas mecanicamente resistentes; são todas estruturadas de

acordo com o mesmo modelo de arquitetura molecular, ainda que possam apresentar

diferentes espessuras (6 -10 nm), razão pela qual foram designadas membrana unitária

por ROBERTSON J. D.

A composição química das membranas oscila em tomo dos valores médios de

60% de proteínas e 40% de lipídeos. Associados a estes componentes maioritários

identificam-se ainda glucídios, quase sempre em quantidades muito menores e

associados às proteínas e aos lipídeos, constituindo glicoproteínas e glicolipídeos.

As proteínas constituintes da membrana são de tipo globular; entre estas, cerca de

80% são enzimas. Os lipídios das membranas são moléculas longas e anfipáticas:

possuem duas extremidades com propriedades de solubilidade, diferentes. Enquanto que

uma das extremidades é hidrofilica (polar) e, portanto solúvel em meio aquoso; a outra é

hidrofóbica (apoIar), conseqüentemente insolúvel em meio aquoso, mas com afinidade

para outros lipídios. Entre os lipídios mais freqüentes nas membranas celulares,

distinguem-se os fosfolipídeos, com uma representação de 70 a 90%. As membranas das

células animais contêm colesterol, o que não acontece nas células vegetais, que possuem

outros esteróis. Como se verá adiante, quanto maior for a concentração de esteróis,

menos fluida será a membrana. As membranas das células procarióticas não contêm

esteróis, salvo raras exceções (DE ROBERTIS, 1993).

15

C> I B L I O T L J~

INSTITUTO DE tlUíMICAUniversidade de São Paulo

Todas as membranas biológicas têm uma estrutura geral comum: é um filme

muito fino de lipídeos e de proteínas mantidas juntas principalmente por interações não

covalentes. As membranas celulares são estruturas dinâmicas, fluídas, e a maior parte de

suas moléculas são capazes de mover-se no plano da membrana. As moléculas

individuais de lipídeos são capazes de difundirem-se rapidamente dentro de sua própria

monocamada e raramente saltam de uma monocamada para outra. As moléculas

lipídicas são arranjadas como uma dupla camada contínua com cerca de 5 nm de

espessura. Essa bicamada lipídica fornece a estrutura básica da membrana e atua como

uma barreira relativamente impermeável à passagem da maioria das moléculas

hidrossolúveis (DE ROBERTIS, 1993).

Os glicolipídeos são encontrados na metade não citoplasmática da bicamada

lipídica. Na membrana plasmática os seus grupos açúcar estão expostos na superfície

celular, sugerindo que eles desempenham algum papel nas interações da célula com a

sua vizinhança. As membranas plasmáticas de eucariotos contêm quantidades

particularmente grandes de colesterol. As moléculas de colesterol aumentam as

propriedades da barreira da bicamada lipídica e devido as seus rígidos anéis planos de

esteróide diminui a mobilidade e toma a bicamada lipídica menos fluida. A maioria dos

lipídeos que compõem a membrana são fosfolipídeos dos quais predominam:

fosfatidi1colina, esfingomielina, fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina (DE

ROBERTIS, 1993).

Enquanto a bicamada lipídica determina a estrutura básica das membranas

biológicas, as proteínas são responsáveis pela maioria das funções da membrana,

atuando como receptores específicos, enzimas, proteínas transportadoras, entre outras

funções.

Muitas proteínas da membrana estendem-se através da bicamada lipídica: em

algumas dessas proteínas transmembrana a cadeia polipeptídica cruza a bicamada como

uma alfa-hélice única (proteínas unipasso); em outras, inclusive naquelas responsáveis

pelo transporte transmembrana de íons e pequenas moléculas hidrossolúveis, a camada

polipeptídica cruza a bicamada múltiplas vezes, seja como uma série de alfas-hélices,

seja como uma folha beta na forma de um barril fechado (proteína multipasso) (DE

ROBERTIS, 1993).

Outras proteínas associadas à membrana não cruzam a bicamada, mas ao

contrário são presas a um ou ao outro lado da membrana. Muitas dessas são ligadas por

interações não covalentes à proteína transmembrana, enquanto outras são ligadas

16

através de grupos lipídicos ligados covalentemente. Como as moléculas lipídicas na

bicamada, muitas proteínas da membrana são capazes de difundir-se rapidamente no

plano da membrana. Por outro lado, as células têm mecanismos para imobilizar

proteínas específicas da membrana e para confinar moléculas lipídicas e protéicas a

domínios específicos (DE RüBERTIS, 1993).

ü termo cobertura celular ou glicocálix é freqüentemente utilizado para

descrever a região rica em carboidratos na superficie celular. Esses carboidratos

ocorrem tanto como cadeias de oligossacarídeos ligada covalente a proteínas da

membrana (glicoproteínas) e lipídeos (glicolipídeos), e na forma de proteoglicanos que

consistem de longas cadeias de polissacarídeos ligados covalentemente a um núcleo

protéico (DE RüBERTIS, 1993).

As cadeias laterais de oligossacarídeos são extremamente diversificadas no

arranjo de seus açúcares. Essa cobertura de carboidratos ajuda a proteger a superficie

celular de lesões mecânicas e químicas e recentemente descobriu-se que

oligossacarídeos específicos funcionam como intermediários em diversos processos

transitórios de adesão célula-célula, inclusive aqueles que ocorrem em interações

espermatozóide-óvulo, coagulação sangüínea, e recirculação de linfócitos em respostas

inflamatórias (DE RüBERTIS, 1993).

Por outro lado a parede celular é um envoltório rígido que envolve a célula de

bactérias, fungos e plantas. Tem a função de proteger a célula de danos mecânicos e

também evita que a célula arrebente quando mergulhada em um meio hipotônico. A

parede celular é permeável a diversas substâncias; possui constituição química distinta

em vegetais, fungos e bactérias.

A parede celular de um fungo (Figura 1.3.2.3), como a de bactérias, fica do lado

imediatamente externo da membrana limitante do citoplasma e, em algumas leveduras,

está envolvida por um polissacarídeo capsular externo. Contudo, ao contrário das

bactérias, cujas paredes celulares freqüentemente contém unidades estruturais como se

fossem tijolos, as paredes celulares dos fungos parecem ser entrelaçadas. Polímeros de

hexoses e hexosaminas constituem os elementos estruturais fundamentais da parede dos

fungos. Em muitos bolores e leveduras, a principal macromolécula estrutural da parede

é a quitina, que é constituída de resíduos de N-acetil-glicosamina. Esses são ligados

entre si por ligações. l3-l,4-glicosídicas, como os resíduos de glicose em celulose, o

principal material da parede celular de plantas superiores. A quitina também é o

principal material estrutural do esqueleto dos crustáceos. Por isso essa substância

17

representa, em nível molecular, um exemplo interessante de evolução convergente, em

que organismos pouco relacionados desenvolveram, presumivelmente por uma

seqüência evolucionária independente, estruturas semelhantes ou idênticas para servir as

necessidades semelhantes (PEBERDY, 1990).

Nas leveduras, a extração da parede celular com álcalis a quente, resulta numa

glicana insolúvel, formada de resíduos de D-glicose ligados em 13-1-6 com ramificações

ligadas em 13-1,3 surgindo a intervalos freqüentes (a glicana assemelha-se a celulose em

sua insolubilidade e rigidez). Um polissacarideo solúvel adicional é a manana, um

polímero de D-manose ligado em a-I, 6, com ramificações a-I ,2 e a-1,3 (PEBERDY,

1990). Nas leveduras, o componente da matriz é um complexo de manoproteína. As

mano-proteínas de leveduras são divididas em classes distintas, que diferem em

tamanho e característica de ligação. Moléculas maiores, que podem ter peso molecular

de l50kDa, tem uma ramificação polissacaridica no meio, com mais de 150 unidades

manosil. A cadeia principal da molécula é composta de ligações a-(1-6) das quais

emergem cadeias curtas com mistura de ligações a-(1-2) e ligações a-(1-3). Ligações

com o componente protéico ocorrem através de ligações N-glucosídicas, envolvendo

diacetilquitobiose, da região intema do core do polímero. Outro grupo de manoproteinas

são moléculas menores; algumas são compostas de manosídios curtos ligados a-(1-2)/

a-(1-3) e anexados a proteína por ligações O-glicosídicas. Manoproteínas pequenas de

Candida albicans mostram reação cruzada antigênica, sugerindo um grau de

conservação do componente protéico (PEBERDY, 1990; ROSE & HARRlSON, 1991).

Do mesmo modo que nas bactérias, os polissacarídeos da parede celular dos

fungos são sintetizados de vários nucleotídeos de açúcares (UDP-N-acetil-glicosamina,

GDP-manose, etc.) (ROSE & HARRlSON, 1991). A quitina-sintetase está ligada a

membrana celular. In vitro, ela necessita de um iniciador, que deve conter pelo menos

seis ou sete resíduos conectados, como acontece na quitina. Um antibiótico nucleotídico

apoloxina D, é um inibidor seletivo da quitina-sintetase. Ele inibe a incorporação de 14

C-glicosamina na parede celular de Neurospora crassa, o que resulta num aumento do

acúmulo de uridina-difosfato-N-acetil-glicosamina (ROSE & HARRlSON, 1991). As

paredes de várias leveduras contêm complexos de polissacarídeos com proteínas ricas

em resíduos de cistina e a redução reversível de ligações -S-S- tem sido implicada na

formação de brotos. Em algumas leveduras, lipídeos contendo fósforo e nitrogênio

também são abundantes na parede (até 10% do peso seco). As paredes celulares dos

18

fungos podem ser digeridas por enzimas contidas nos sucos digestivos do caracol Helix

pomatia. Esses sucos contêm mais de 30 atividades enzimáticas conhecidas, incluindo

glucanase, quitanase e mananase (PEBERDY, 1990).

Glicoproteínas são também encontradas nas paredes de fungos filamentosos, e

são mais heterogêneas do que aquelas encontradas nas leveduras, em relação ao

componente polissacaridico e ligação proteína-carboidrato. O polissacarídeo pode ser

um homopolímero ou heteropolímeros com ligações N-glucosídicas e O-glicosídicas. a­

(1-3)-D-glicanas é o principal polímero da matriz na maioria dos fungos. As a-glicanas

são normalmente encontrada na superficie externa da parede como fibrilas irregulares

compactas (PEBERDY, 1990).

A organização dos polímeros na parede celular esta em forma de camadas.

Normalmente, o componente esquelético está localizado no lado interno da parede e se

encontra imerso em material amorfo da matriz. A superficie interna da parede é,

portanto caracterizada pela sua aparência fibrilar. A superficie externa que é

normalmente constituída do material amorfo é geralmente lisa ou em leve forma de rede

(PEBERDY, 1990).A parede celular de Candida albicans parece conter no mínimo

cinco camadas distintas (começando da membrana plasmática para fora), manoproteína,

,6-glicana/quitina, ,6-glicana, manoproteína, e uma camada fibrilar (RINALDI, 1993).

Na Candida albicans, há uma camada externa indistinta contendo a camada fibrilar, que

é considerada importante para a virulência por afetar a aderência e fagocitose. Os

principais elementos estruturais da parede são as ,6-glicanas, ligadas covalentemente a

quitina, levando a estrutura secundária da parede. O principal componente antigênico é

a manoproteína (PEBERDY, 1990; ROSE & HARRISON, 1991) Figura 1.3.2.3.

19

QUITINA 9.9.9.9.51.9.9.

GLUCANAS ocP~MANOPROTEINAS l(

ENZIMA EXTRA (JCELULAR

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Figura 1.3.2.3 Esquema ilustrativo da parede celular de fungos (cedida por RlNALDü FERREIRA

GANDRA, ICB, USP).

1.4.- Drogas antifúngicas

Sob a denominação geral de antifúngico ou antimicótico, inclui-se uma ampla

variedade de substâncias com diferentes estruturas químicas e mecanismos de ação

(VANDENBOSSCHE et aI., 1989). Entre os principais agentes antifúngicos estão os

poliênicos (anfotericina B, nistatina, pimaricina). Estes antimicrobianos variam

consideravelmente em seu potencial, margem de segurança e efeito sobre diferentes

fungos. Dependendo do modo de ação podem ser fungicidas ou fungistáticos, e podem

agir especificamente contra um fungo em particular ou exibir um amplo espectro de

atividade. A anfotericina B (AnB) e a nistatina são compostos poliênicos que se ligam

aos esteróis nas membranas celulares, resultando em extravasamento dos conteúdos

celulares e a morte celular. Além do mecanismo de ação e a resistência, a interação

sinérgica entre hospedeiro e a droga, as propriedades imunomoduladoras, a

20

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

biodisponibilidade, e a fánnacocinética devem ser consideradas (MCGINNIS &

RINALDI, 1995).

Os azóis constituem uma das famílias de antifúngicos com maior número de

derivados e com grande diversidade de espectros de atividade, potência e toxicidade,

sem que em muitos casos se demonstre grande diferença entre eles

(VANDENBOSSCHE et aI., 1990). Trata-se de moléculas sintéticas com estruturas

químicas e anéis heteropentacíc1icos com dois (imidazóis) ou três (triazóis), átomos de

nitrogênio unidos por átomos de carbono a outros anéis aromáticos (BORGERS, 1980).

Eles atuam sobre a célula fúngicas impedindo a síntese do ergosterol (BORGERS,

1986; VANDENBOSSCHE, 1986), principal componente da membrana plasmática dos

fungos, ao inibir a enzima lanosterol demetilase dependente do citocromo P-450

(VANDENBOSSCHE et aI., 1987; RINGEL, 1990; SAAG, 1988; GRAYBILL, 1989;

DROUHET, 1987). Seu efeito é fungistático e não fungicida.

As drogas mais comumente usadas para infecções fúngicas sistêmicas e locais

são anfotericina B e agentes azóis (BEN-JOSEF et aI., 1997). A anfotericina B é ainda a

droga de escolha em muitas micoses sistêmicas, devido a seu amplo espectro e atividade

fungicida, contudo ela é nefrotóxica e é administrada intravenosamente (BEN-JOSEF et

aI., 1997). A introdução de antifúngicos como fluconazol (LOUIE et aI., 1998) e

itraconazol, de amplo espectro de atividade e com menor toxicidade, tem fornecido aos

clínicos alternativas orais à anfotericina B, marcando um significante avanço na terapia

antifúngica (ERNST et aI., 1996). Porém, o recente aumento da resistência entre

espécies, bem como a natureza fungistática dos azóis, levou a procura por novos agentes

fungicidas (ERNST et aI., 1996).

1.4.1.- Polienos

Historicamente a AnB tem sido a droga de escolha para o tratamento de

infecções fúngicas graves, por ser o único agente fungicida de amplo espectro. Este

antifúngico produzido por algumas cepas de Streptomyces nodosus age em nível de

membrana na célula eucariótica, exercendo seu efeito tóxico pela fonnação de

complexos com o ergosterol, colesterol ou derivados, com os quais fonna uma espécie

de canal transmembrana produzindo a liberação de íons e componentes celulares vitais,

para a manutenção da integridade celular (ANDREOLI, 1973; GONDAL et aI., 1989;

21

BRAJTBURG & BOLARD, 1996). Esta ligação preferencial ao ergosterol em

detrimento do colesterol é a base da toxicidade seletiva.

Adicionalmente, a toxicidade da droga tem sido associada a sua insolubilidade,

conseqüência direta da sua hidrofobicidade (LEGRAND et al., 1992) (Figura 1.4.1.1).

HQ

OH

o

ftJHP ...NH.

° OH

OH

CO,H

Anfotericina

Figura 1.4.1.1 Estrutura da anfotericina B, um antifúngico fungicida poliênico, produzido por algumas

cepas de Streptomyces nodosus.

A baixa solubilidade da AnB nos diferentes solventes orgânicos tem dificultado

sua manipulação para fins terapêuticos, sendo comumente administrada em associação

ao sal biliar desoxicolato de sódio - Fungizon® -, detergente com O qual forma um

complexo micelar instável altamente tóxico (BRAJTBURG & BOLARD, 1996;

SCHREIER, 2000). Pelo fato da AnB ser altamente lipofilica, modernas tecnologias

baseadas em sistemas de liberação controlada de drogas tem diminuído sua toxicidade

por incorporá-la em carreadores lipídicos, sejam estes lipossomos, emulsões lipídicas ou

coc1eatos, entre outros. Porém, a incorporação nos sistemas citados requer

administração de doses muito mais elevadas para atingir a mesma efetividade que a

formulação comercial Fungizon® (DOCIAnB), além de encarecer o valor do produto, o

que finalmente pesa na relação custoibeneficio (LOPEZ-BERESTEIN, 1985; GONDAL

et al., 1989; CLARK et al., 1991; BRAJTBURG & BOLARD, 1996; BEKERSKY et

al., 1999; SOUZA et aI., 1993; SOUZA & CAMPA, 1999; DUPONT, 2002; ZARlF et

al.,2000).

22

1.4.1.1.- Formulações Lipídicas dos Poliênicos

A solubilização de anfotericina B em lipossomos parece reduzir os seus efeitos

tóxicos e melhorar a eficácia clinica, permitindo que dosagens maiores possam ser

dadas (JANKNEGT et a1., 1992). A solubilização da anfotericina B em lipossomos

resulta em um decréscimo da toxicidade e melhora no índice terapêutico da droga, no

tratamento e profilaxia de candidíase sistêmica em camundongos (LOPEZ-BERESTEIN

et a1., 1984). A solubilização de anfotericina B em lipossomos (L-AnB), reduz os efeitos

imunossupressivos exercidos pela droga livre, e é menos tóxico a macrófagos e

linfócitos T, os principais componentes imunes responsáveis pela resistência do

hospedeiro ao fungo e outros patógenos (MEHTA et a1., 1985).

A droga de origem das formulações lipídicas é a anfotericina B, que na sua

formulação clássica apresenta um estreito índice terapêutico. As formulações lipídicas

de anfotericina B apresentam toxicidade bem menor (tabela 1.4.1.1).

Tabela 1.4.1.1 Poliênicos

Nome genérico

Anfotericina B

Anfotericina B liposomal

Anfotericina B dispersão coloidal (ABCD)

Anfotericina B complexo lipídico (ABLC)

Nome comercial

Fungizone

Ambisome

Amphotec ou Amphocil

Abelcet

Quando nos referimos genericamente ao grupo das fOffi1Ulações lipídicas de

anfotericina B deveríamos empregar o termo "formulação lipídica de anfotericina B" ou

LFAB e não apresentação liposoma1. O uso do termo liposomal pode trazer confusão,

pois apenas um dos produtos é um verdadeiro liposoma. Este composto tem o nome

genérico de anfotericina B liposomal e o nome comercial é Ambisome. Os outros dois

produtos, anfotericina B complexo lipídico (ABLC; nome comercial é Abelcet) e

anfotericina B dispersão coloidal (ABCD; nome comercial é Amphotec, Amphocil), não

são liposomas verdadeiros. O ABCD é associado com uma maior toxicidade à

administração e não oferece vantagens quando comparado com os outros dois produtos.

(DE MARIE S, 1996)

Todos os três, porém, geralmente são menos nefrotóxicos que a anfotericina B.

Todas as formulações lipídicas da anfotericina B ainda causam aumento dos níveis

23

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

séricos de creatinina e distúrbios nos eletrólitos, podendo raramente nos casos mais

graves, devido a hipocalemia ou hipomagnisemia, desestabilizar o sistema de condução

cardíaco, provocando fibrilação ventricular e óbito durante a infusão. Por isso, é crítico

monitorar os eletrólitos nos pacientes que recebem qualquer forma desta droga.

Um estudo randomizado, publicado no The New England Journal ofMedicine,

demonstrou eficácia comparável e a mesma taxa de sobrevivência entre pacientes

neutropênicos que receberam anfotericina liposomal e anfotericina convencional na

terapêutica antifúngica empírica. (WALSH et aI., 1999)

Porém, os pacientes que receberam a droga liposomica tiveram

significativamente menos reações relacionadas à infusão, como febre (17% vs 44%) e

calafrios (18% vs 54%). A nefrotoxicidade também foi significativamente menor (19%

vs 34%). Em um outro estudo, a anfotericina convencional demonstrou-se menos

efetiva que a anfotericina liposomal no tratamento de aspergilose disseminada em

pacientes imunossuprimidos (LEENDERS et aI., 1998).

Pacientes que receberam a formulação liposomal tiveram uma melhor resposta

(50% vs 20%, nas infecções confirmadas; 52% vs 29%, nas suspeitas de infecção) e

uma menor letalidade (22% vs 38%). O complexo lipídico de anfotericina B foi

estudado em pacientes intolerantes à anfotericina convencional. Uma resposta completa

ou parcial foi demonstrada em 42% de pacientes com aspergilose, 67% de pacientes

com candidíase disseminada, 71% de pacientes com zigomicose e 82% de pacientes

com fusariose. Apesar destes dados não serem comparativos, eles sugerem que as

formulações lipídicas de anfotericina B podem ser efetivas contra várias micoses.

Comparado-se com a droga convencional, as formulações lipídicas podem ser

administradas em dose mais alta para a eficácia terapêutica (OTSUBO et aI., 1999,

CICOGNA et aI., 1997). A droga convencional normalmente é empregada até 1

mg/kg/dia, já as doses dos LFABs podem variar de 3 a 6 mg/kg/dia. A atividade

antifúngica melhora com doses crescentes do agente (ALLENDE et aI., 1994).

Mas, o LFABs oferecem um índice terapêutico muito mais amplo que a

anfotericina B e sua toxicidade é menos provável até mesmo com as doses mais altas

administradas por períodos de tempo mais longos. Estes agentes são indicados para

tratar infecções fúngicas invasivas em pacientes que são refratários ou intolerantes à

formulação convencional. A anfotericina B liposomal (Ambisome) apresenta também

uma indicação específica para uso como terapia empírica para possíveis infecções

fúngicas em pacientes neutropênicos.

24

Os LFABs são drogas de alto custo. Enquanto a dose de um dia de tratamento

com a anfotericina convencional sai nos EUA por cerca de $20, uma formulação

lipídica pode chegar a $1000 por dia. O diferencial de custo exige para o clínico um

rigoroso balanço entre os beneficios do maior índice terapêutico contra o aumento do

custo. Poderíamos prever quando um paciente recebendo anfotericina convencional vai

desenvolver nefrotoxicidade? O risco pode ser quantificado? Quando tomar a decisão

entre droga convencional e as formulações lipídicas de anfotericina? Geralmente as

LFABs são indicadas para os pacientes refratários ou intolerantes à droga convencional,

mas pode haver uma predição da nefrotoxicidade em alguns pacientes. Por exemplo, eu

acredito que um paciente diabético com proteinuria e uma creatinina sérica pré-existente

de 2.5 mg/dL deve receber já inicialmente um formulação lipídica. Este conceito é

apoiado por um estudo de 239 pacientes imunossuprimidos, com creatinina superior a

2,5 mg/dL, que receberam anfotericina B convencional e pioraram sua função renal,

evoluindo para insuficiência renal e diálise, o que aumentou sua mortalidade

(WINGARD et aI., 1999). Outra situação é a associação de drogas nefrotóxicas em um

único paciente, como os aminoglicosídeos a ciclosporina, que apresentam sinergismo

nesta ação tóxica. Nestes casos, Gubbins e coI., recomendam em recente publicação,

que seja introduzido uma formulação lipídica da anfotericina. (GUBBINS et aI:

Antifungal agents. In: PISCITELLI, S.C, RODVOLD, KA(ed): Drug Interactions in the

Infectious Diseases. Totowa, Humana Press, Pag 185-217,2001).

1.4.2.- Azóis

O principal mecanismo de ação dos azólicos é a inibição da biossíntese do

ergosterol, trazendo como conseqüência alterações na fluidez e permeabilidade da

membrana citoplasmática do fungo (BODEY, 1992). Na célula fúngica íntegra, a

biossíntese do ergosterol envolve a participação da enzima 14a -demetilase, que é

dependente da citocromo P-450. Em termos moleculares, um nitrogênio disponível (N-3

nos imidazólicos e N-4 nos triazólicos) estabelece uma ligação com o ferro do grupo

heme na sexta posição de coordenação. O restante da molécula do antifúngico interage

com a apoproteína da citocromo P-450, onde, a estrutura de cada azol determinará sua

especificidade na dependência desta ligação (VANDENBOSSCHE et aI., 1987). Esta

ligação inibe a atividade da enzima 14-a-demetilase e, como conseqüência, se observa

25

acúmulo de esteróis metilados comprometendo a fluidez e permeabilidade da

membrana, o que se traduz por inibição do crescimento fúngico.

Os azólicos, atualmente considerados como a principal classe de antifúngicos,

surgiram primeiramente para uso tópico, como o clotrimazoI. Posteriormente, foram

lançados os de uso sistêmico, como o miconazol e cetoconazoI. Mais recentemente, a

sub-classe dos triazólicos tem recebido maior destaque; sobretudo o fluconazol,

disponível para uso oral, e o itraconazol, ambos com largo espectro de ação e efeitos

tóxicos bastante reduzidos (BENSON & NAHATA, 1988; BODEY, 1992;

RICHADSON & WARNOCK, 1993). O espectro de ação dos azólicos inclui grande

variedade de fungos, e os casos de resistência natural, são raros e/ou pouco

evidenciados pela literatura (RICHADSON & WARNOCK, 1993) ver tabela 1.4.2.1.

Tabela 1.4.2.1.- Os azólicos

Imidazóis

Cetoconazol

Miconazol

Triazólicos

Fluconazol

Itraconazol

Segunda geração dos triazólicos

Voriconazol (derivado do fluconazol)

Ravuconazol (derivado do fluconazol)

Posaconazol (derivado do itraconazol)

Os imidazóis (Figura 1.4.2.1) rapidamente induzem danos à membrana, com

perda de cátions, proteínas, aminoácidos, nucleotídeos intracelulares e troca no

metabolismo da glicose. Sistemas de modelo de membrana, contendo ácidos graxos

insaturados livres, são muito susceptíveis aos imidazóis. Fungos e bactérias Gram­

positivas são susceptíveis aos imidazóis, porque são ricos em ácidos graxos livres,

enquanto, células de mamíferos e bactérias Gram-negativas são resistentes a eles,

porque contêm níveis mais baixos de ácidos graxos livres (KURODA et aI., 1978; SUD

et aI., 1979; YAMAGUCHI, 1978).

26

oA ±>-CH-O-o- ~\Nv

N-

CH2o 2 ~ /; N~N-COCH3

~ _CI

~I

CI

Ketoconazol

CI

~ CH O-CH"N- '21~ ~_CI

~I

~CI

Miconazol

Figura 1.4.2.1.- Estrutura de imidazáis Ketoconazol e Miconazol.

o miconazol é um derivado imidazólico, pertencente a um grande grupo de compostos

sintéticos, e apresenta-se na forma de pó cristalino branco. É muito pouco solúvel em

água, pouco solúvel em clorofórmio, solúvel na maioria dos solventes orgânicos,

principalmente em metanol com um pKMcz 6.5 (BEGGS, 1988; CLARKE'S 1989), e foi

o primeiro composto azol introduzido para terapia de infecções fúngicas sistêmicas.

Em altas concentrações, o miconazol também interage com triglicerídios e

interfere na síntese de ácidos graxos, em adição aos seus efeitos sobre a biossíntese do

ergosterol sobre a membrana citoplasmáticà do fungo, levando ao acúmulo de l4a metil

esteróis (BORGERS, 1980). Estes esteróis metílicos podem romper o íntimo

agrupamento das cadeias acil dos fosfolipídios, alterando as funções de certos sistemas

enzimáticos ligados à membrana, inibindo o crescimento celular e, eventualmente, à

destruição e morte das células (GEORGOPAPAKOU, 1998).

O efeito de miconazol sobre as membranas fúngicas decolTe da inibição de

síntese ergosterol conforme ilustrado na Figura 1.4.2.2

Outros sítios de ação também colaboram na inibição, de onde se conclui que é

na heterogeneidade dos mecanismos de ação dos azólicos, que se obtém a inibição do

crescimento, permitindo então, a ação dos leucócitos e macrófagos (SAAG &

DISMUKES, 1988).

27

Nos últimos dez anos, o uso de novas e mais efetivas drogas antibacterianas e

imunossupressoras, os transplantes de órgãos, os tratamentos do câncer e da AIDS, etc.,

aumentaram a sobrevida dos pacientes com diversas enfermidades. No entanto, tais

pacientes tomaram-se mais susceptíveis às infecções fúngicas, refletindo na maior

permanência hospitalar e aumento de taxas de morbidade e mortalidade (BODEY,

1992; JOHNSON & WARNOCK, 1995; ODDS, 1993; REX et aI., 1995).

Allylamine

~

"\

SQUALENE

1Epoxidase (ERG1)

1Cyc1ase (ERG7)

LANOSTEROLOH

Azoles

Morpholines

Azoles

Morpholine

OH

14 a demethylase (ERG11)~ 14 reductase (ERG24)4 a demethylase (ERG25)-24 methyltransferase (ERG6)7 ~8 isomerase (ERG2)5,6 desnaturase (ERG3)22·23 desnaturase (ERG5)

ERGOSTEROL

Figura 1.4.2.2.- Biossíntese do ergosterol em fungos. À esquerda estão indicados alguns agentes

antifúngicos atuando em diferentes etapas da biossíntese do ergosterol (Georgopapakou, 1998).

28

BI8l,iOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

A resistência secundária dos fungos aos azólicos se manifestaram como um

problema clínico importante, a partir do lançamento do fluconazol que, por ser menos

tóxico e melhor absorvido, passou a ser utilizado rotineiramente. Nos tratamentos de

curta duração parece não haver problemas de resistência, sobretudo, em pacientes

imunocompetentes. Entretanto, nos imunocomprometidos submetidos a longos

tratamentos, ocorre a substituição das espécies sensíveis ao azólico, por aquelas

naturalmente resistentes, especialmente C. krusei e C. glabrata (VANDENBOSSCHE,

1997). Desta nova situação, emergiu em dimensões ainda não avaliadas, o fenômeno da

resistência de Candida a estes antifúngicos, com aproximadamente quatro dezenas de

relatos até 1996 (JOHNSON & WARNOCK, 1995; REX et aI., 1995; D'ANTONIO et

aI., 1996; WARNOCK, 1992).

Em menor proporção, a resistência ao fluconazol também tem sido observada

em outras espécies como: C. albicans, C. tropicalis (ODDS, 1993), C. parapsilosis

(TUMBARELLO M. et aI., 1996), ocorrendo predominantemente como conseqüência

ao tratamento com este triazólico. Cabe ressaltar, que nos pacientes aidéticos com

candidíase de orofaringe, 9 - 11 % dos isolados evidenciam resistência a este triazólico

(TUMBARELLO et aI., 1996).

Até recentemente, os testes de susceptibilidade aos antifúngicos não eram

julgados necessários, porque a maioria dos fungos clinicamente importantes

evidenciavam sensibilidade à anfotericina B. Entretanto, nas situações acima referidas,

a possibilidade do desenvolvimento de cepas resistentes aos antifúngicos passou a ser

considerada, requerendo assim, o estudo de novas drogas antifúngicas com amplo

espectro de ação. Por estes motivos, justifica-se o interesse em se comparar um

anfifílico inócuo para a célula como o DHP, com um anfifílico antimicrobiano e

bactericida como o DODAB, tanto isoladamente quanto em conjunto com a droga

dirigida, sendo ambos os anfifílicos de baixo custo em comparação com os lipídios

convencionais que usualmente constituem os lipossomos transportadores de drogas.

O itraconazol é uma droga triazólica (Figura 1.4.2.3) que esteve durante muito

tempo disponível em cápsulas e, mais recentemente, em solução. Tem um amplo

espectro de atividade com eficácia e segurança. Não é mais eficaz para candidíase que a

anfotericina B, mas atua sobre outras micoses sistêmicas como histoplasmose,

blastomicose e aspergilose (VAN'T WOUT, 1991; DISMUKES, 1994; SINGH, et aI.,

2004).

29

A absorção oral a partir da cápsula de itraconazol é variável e melhora quando

administrada próxima às refeições, mas atualmente uma formulação líquida está

disponível, conferindo 30% a mais de biodisponibilidade. Esta formulação, uma solução

com ciclodextrina deve ser administrada preferencialmente à cápsula, para todos os

pacientes imunocomprometidos com micoses sistêmicas. A ciclodextrina é um anel de

moléculas de glicose que estabiliza o medicamento e aumenta sua absorção, resultando

em maiores níveis séricos e teciduais do itraconazo1.

N OH N? \ ± f ~I N-CH CH-N IN0 2 2 ~N

?" _F

F

Fluconazol

° CH3

0\ -O- \\ tHN ;-CH O r-\ - /-W'" I

~\N-C±HO 2" ~!Í N"-----JN-o-N~N C(H2

r- .CI CH3

CI

Itraconazol

Figura 1.4.2.3.- Estrutura dos triazáis Fluconazol e ltraconazol

A utilidade clínica de itraconazol esteve previamente limitada pela falta de

formulação de parenteraI. Uma formulação intravenosa da droga, também solubilizada

em ciclodextrina, há pouco tempo está disponível, oferecendo maiores absorção e nível

sérico, comparada com qualquer preparação oral. A droga é indicada como uma agente

de segunda linha contra aspergilose e como agente de primeira linha para histoplasmose

e blastomicose.

A administração intravenosa durante 2 semanas, seguida por administração oral

de itraconazol durante 12 semanas demonstrou ser efetiva em cerca da metade dos

pacientes imunocomprometidos com aspergilose pulmonar invasiva. (GRYSCZYK et

aI., 2002).Os níveis de itraconazol excederam 250 mg/mL em 91% dos pacientes.

30

Porque o itraconazol é metabolizado pelo fígado e a ciclodextrina é excretada pela

urina, a droga deve ser usada com precaução em pacientes com função renal reduzida;

inclusive, dados sobre a sua utilização em pacientes com insuficiência renal ainda não

estão disponíveis. Portanto, esta droga é contra-indicada na presença de nefrotoxicidade

(clearence de creatinina menor que 30 mLlmin).

Os efeitos adversos ao itraconazol incluem náusea, dor abdominal, insuficiência

hepática e, a doses muito altas, hipocalemia e edema. Como seu metabolismo esta

ligado ao sistema enzimático do citocromo P-450, o itraconazol é associado com

múltiplas interações com outros medicamentos.

1.4.2.1.- Novos azólicos

Novos azólicos, uma segunda geração de triazólicos, estão sendo desenvolvidos.

Eles oferecerão um espectro mais amplo de atividade comparado aos triazólicos

atualmente disponíveis. Em particular, eles são ativos contra Candida krusei, uma

espécie freqüentemente resistente ao fluconazo1. Voriconazol é um derivado de segunda

geração de fluconazol ativo contra várias espécies de Candida (DRAGO, et al., 2004)

(Figura 1.4.2.1.1), apresentando atividade mais potente que o fluconazol contra as

espécie de Candida, inclusive a C. krusei (FRATTI et a1., 1998) Ele também

demonstrou in-vitro atividade contra espécies de Aspergillus resistentes à anfotericina B

(BATTEGA et a1.,2003), como também contra uma variedade de fungos filamentosos

(DIEKEMA, et a1., 2003). Um estudo em pacientes com aspergilose invasiva

demonstrou resposta completa ou parcial à administração intravenosa, seguida pela oral,

de voriconazol. Também apresenta um perfil de segurança satisfatório. Estará

disponível para administração duas vezes ao dia por via oral ou intravenosa.

Ravuconazol (BMS-207,147) também é um derivado de segunda geração do

fluconazo1. Tem um largo espectro de atividade, particularmente contra espécies de

Candida (YAMAZUMI et a1., 2000). Esta droga apresenta biodisponibilidade oral

adequada. Ensaios clínicos deste agente estão sendo realizados no momento.

Posaconazol é atualmente um derivado do itraconazol sob investigação. Tem um

perfil de segurança excelente e é eficaz in-vitro contra muitas espécies de Candida

(HERBRECHT, 2004) e também apresenta ação contra o Mucor ssp, em camundongos

imunossuprimidos (SUN, et aI., 2004). Este agente está na fase de ensaios clínicos

avançados.

31

FOH "~H ",,-N l.'? "_'\r I .~ "

;---" \ "

N-CH+CH-(.", .. r'JN:::J F "r:"j-!ll

F

Voriconazol

Figura 1.4.2.1.1.- Estrutura do azol de segunda geração Voriconazol

peptídeos

1.4.3.- Nova Classe de Antifúngicos: Os lipo-

Pela primeira vez em muitos anos, uma nova classe de antifúngicos, as candinas,

está sendo desenvolvida. Elas inibem a síntese da parede celular do fungo, sendo

chamada analogamente de "penicilina para fungos". O seu alvo de ação, a enzima (1,3)­

beta-D-glucan sintase, (DENNING; HOSPENTHAL, 2004) não está presente nas

células dos mamíferos. Pelo contrário, tanto os poliênicos, como os azólicos agem em

uma membrana celular comum aos fungos e mamíferos, explicando assim, a toxicidade

destes agentes.

As candinas em desenvolvimento incluem a caspofungina (antigamente MK­

991) e o equinocandina LY-303,366 e FK-463. Todos são fungicidas contra todas as

espécies de Candida, (PFALLER, et al., 1999) sendo também ativas contra o

Aspergillus (ODDS F.C, et aI., 2004).

A caspofungina é o primeiro agente em desenvolvimento (Figura 1.4.3.1). É

ativa contra espécies de Candida e Aspergillus, (DUPONT B. 2003, ODDS F.C, et al.,

2004) inclusive as cepas resistentes aos azólicos de primeira geração. (MASCHMEYER

& RUHNKE, 2004) Em camundongos também foi eficaz contra o histoplasma e o

Pneumocystis (KOHLER, et al., 2000). Não apresenta atividade in-vitro contra

Fusarium (ARIKAN, et aI., 2001). Por apresentar uma baixa biodisponibilidade por via

oral, só estará disponível como medicamento por via parenteral. Esta droga está

atualmente nas fases II e III dos ensaios clínicos. A LY-303,366 e a FK-463 são duas

32

equinocandinas sob investigação. Seus espectros de ação são semelhantes ao da

caspofungina.

H2N~~o '. ..oH

Hd~Nr-\. oH'~

H2N ~yo HN ~.OH H,C

H6 NH o h CH3

CH3

tH

=< 'cH3

HO N N'. W .., ·2H3CCO H"O 'o 2

_ OH H

~ !JHO

Caspofungina

Figura 1.4.3.1.- Estrutura de uma echinocandina.

1.5.-

microbianos

Lipossomos como carreadores de agentes anti-

Desde 1965, quando Bangham descreveu pela primeira vez os lipossomos, se

conhecem cada vez mais aplicações no uso destas vesículas como transportadores de

agentes antimicrobianos ou drogas (BANGHAM et aI., 1965). Eles, pelas suas

propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas, podem ser usados para incorporar compostos

aquosos e lipofílicos (Figura 1.5.1) (LOPEZ-BERESTEIN, 1987).

Lipossomos são vesículas microscópicas ou submicroscópicas constituídas de

bicamadas concêntricas simples ou múltiplas, resultantes da auto-associação de

moléculas anfifílicas, tais como fosfolipídios em meio aquoso. Os grupos de cabeça

polar estão localizados na superfície das membranas em contato com o meio, enquanto

as cadeias hidrocarbônicas formam o centro hidrofóbico das membranas, protegidos da

água. Estas vesículas possuem parte da fase aquosa no seu interior e, conseqüentemente,

podem capturar e segregar moléculas polares. Além disso, por causa das propriedades

fisico-químicas de seus constituintes, podem também dissolver moléculas hidrofóbicas

em suas bicamadas (SCHUBER et aI., 1998). Os lipossomos têm sido usados como

modelos de membrana celular e como transportadores de cosméticos, de aditivos

alimentares e de drogas. Neste ultimo caso, as vantagens dos lipossomos incluem a

33

biodegradabilidade, a baixa toxicidade, a possibilidade de dissolver substancias

lipofílicas (nas bicamadas lipídicas) ou hidrofílicas (na fase aquosa de seu interior), a

possibilidade de direcionar o local ou de controlar a velocidade de liberação de uma

determinada droga (LIU, 2000).

Figura 1.5.1 Esquema ilustrativo de um lipossomo.

~I Cabeça polar

Cauda. \ hidmcarbônica

Como seria de esperar, os lipossomos têm sido o tema de inúmeros artigos de

revisão, quer em termos gerais (LASIC, 1989; TYRRELL, et aI., 1976; LASIC, 1998),

quer focados especialmente nas suas propriedades físicas, preparação (SZOKA &

PAPAHADJOPOULOS, 1980; HOPE et aI., 1986; NEW, 1990), mecanismos de

formação e fusão (LASIC, 1988; PAPAHADJOPOULOS, et aI., 1990), gradientes de

pH e transporte de membrana (CULLIS et aI., 1991), métodos de caracterização (NEW,

1990), aplicação genérica em medicina (GREGORlADIS, 1976;

PAPAHADJOPOULOS & GABIZON, 1987) utilização como carreadores (JULIANO,

1981; GREGORlADIS, 1976), técnicas de encapsulamento de agentes bioativos

(MAYER et aI., 1986), interação com células (MARGOLIS, 1984), utilização em

vacinas (KERSTEN, 1995), aplicações veterinárias (SALLOVITZ, 1998), utilização em

substituição de eritrócitos (CHANG, 1999; WINSLOW, 1999) ou aplicações cosméticas

(GREGORlADIS, 1994).

Os lipossomos podem ser definidos como associações coloidais de lipídios

anfipáticos, que se organizam espontaneamente em estruturas fechadas tipo concha

esférica. Podem ser preparados a partir de misturas lipídicas naturais extraídas e

purificadas, ou a partir de lipídeos sintéticos, disponíveis comercialmente. Confonne é

indicado na Figura 1.5.2, os lipossomos podem ser classificados em termos de tamanho,

34

número de lamelas (e sua posição relativa), constituição lipídica (o que também

condiciona a sua carga), estabilidade e modo de preparação (UCHTENBERG et aI.,

1988).

Durante muito tempo, a classificação estrutural dos vários tipos de lipossomos esteve

rodeada de uma grande falta de uniformização e coerência, o que originou alguma

confusão na literatura desta área. Devido, em parte, à falta de uma correta caracterização

das diversas estruturas, o tipo de lipossomo era indicado pelo seu processo de

preparação (e.g., sonicação, congelação e descongelação, evaporação em fase reversa),

pelo nome do investigador que caracterizou pela primeira vez o seu processo de

preparação (e.g., "Banghamossomas", "Huangomossomas") ou simplesmente omitido

(UCHTENBERG et aI., 1988).

35

Sistema modeloAplicações industriais,de membranacosméticas e agrícolas.

Física química Outras aplicaçõesbiomédicasde lipídeos

Interações Sistema de transportecelulares

Utillzacao

I~------------------I

: Lipossomos :I I

'--------1---------:

Caracterização

Numero debicamadas

Constituição damembrana

Presença deesteráis

Figura 1.5.2.- Esquema representativo das várias utilizações dos Iipossomos e inter-relação entre os

diversos parâmetros que os caracterizam. Adaptado de LICHTENBERG et aI., 1988.

A partir do início da década de 80, foi definitivamente adotada uma

nomenclatura para os lipossomos baseada no seu número de bicamadas lipídicas

(lamelas) e tamanho (SZOKA & PAPAHADJOPOULOS, 1980). Assim, para os

lipossomos de preparação mais imediata, utilizados em todos os primeiros estudos,

ficou consagrado o nome de vesículas multilamelares ou MLV ("multilamellar

vesicles"). Como o nome indica, estas vesículas são constituídas por várias bicamadas

lipídicas, aproximadamente concêntricas, podendo o seu diâmetro variar entre 400 e

3500 nm (JULIANO, 1981). Para muitas das aplicações dos lipossomos, toma-se

36

BIBLIU II:.\,H

INSTITUTO DE QUíMICAUnIversidade de São Paulo

importante a utilização de um sistema de interpretação mais simples e melhor definido

em termos estruturais. Deste modo, em grande parte dos estudos, as MLV foram

substituídas por lipossomos unilamelares. Destes lipossomos, os mais utilizados são as

vesículas unilamelares grandes ou LUV ("large unilamellar vesicles"), de diâmetro

superior a 100 nm, bem como as vesículas unilamelares pequenas ou SUV ("small

unilamellar vesicles"), com diâmetro entre 20 e 50 nm (UCHTENBERG et al., 1988).

Para além destas vesículas unilamelares, devem-se ainda considerar as vesículas

unilamelares gigantes ou GUV ("giant unilamellar vesicles"), com dimensões superiores

a 1 )lm, podendo chegar às dezenas de )lm (LASIC & NEEDHAM, 1995), tamanho

comparável ao de uma célula eucariótica. Alguns autores definem ainda uma classe de

vesículas unilamelares médias ou MUV ("medium-sized unilamellar vesicles"), com

dimensões compreendidas entre os SUV e os LUV (UCHTENBERG et al., 1988). De

menor importância, mas também caracterizados (LASIC & NEEDHAM, 1995),

encontram-se os lipossomos multivesiculares ou MVL ("multivesicular liposomes") e as

vesículas oligolamelares ou OLV ("oligolamellar vesicles") que, à semelhança das

unilamelares, podem ser subdivididas em pequenas, grandes e gigantes (SOV, LOV e

GOV).

Para além do tamanho e número de lamelas, outro fator essencial para a

caracterização de um lipossomo é a constituição das bicamadas lipídicas. A composição

fosfolipídica, a presença de esteróis, a proporção destes componentes e a inserção de

outras moléculas nas bicamadas vão condicionar vários parâmetros da membrana e do

próprio lipossomo; como, a sua carga, estabilidade, curvatura da(s) bicamada(s), fase da

membrana e formação de domínios lipídicos (BAGATTOLU & GRATTON, 2000).

Os lipossomos são conhecidos como carregadores de agentes antimicrobianos

(LOPEZ-BERESTEIN, 1987), estes reduzem a toxicidade de drogas no órgão alvo pela

modificação na distribuição destas, aumentam a ação terapêutica de vários antimoniais

(LOPEZ-BERESTEIN et al., 1984, LOPEZ-BERESTEIN et al., 1985),

imunomoduladores (LOPEZ-BERESTEIN 1987), agentes antifúngicos e antibióticos

(LOPEZ-BERESTEIN et al., 1984; LOPEZ-BERESTEIN et al., 1985). Lipossomos

carregados positivamente mostraram-se mais eficientes na incorporação de antibióticos

comparados aos lipossomos carregados negativamente, possibilitando o tratamento de

infecções por Pseudomonas. (OMRI et al., 1995).

O uso do carreamento de antibióticos por lipossomos tem sido extensivamente

estudado, principalmente para aumentar a eficácia na tentativa de diminuir a toxicidade.

37

Um exemplo desta aplicação foi um estudo feito com os aminoglicosídios amicacina,

netilmicina e tobramicina, incorporados em lipossomos aniânicos e catiânicos

preparados por sonicação, que foram utilizados para avaliar a influência das cargas

lipídicas sobre a eficiência de encapsulamento dos lipossomos e aumento da atividade

bactericida em infecções pulmonares causadas por Pseudomonas aeruginosa (OMRI et

aI., 1995). Lipossomos carregados positivamente mostraram-se mais eficientes na

incorporação de antibióticos comparados aos lipossomos carregados negativamente

(OMRI et aI., 1995).

Lipossomos catiânicos sintéticos compostos de brometo de

dioctadecildimetilamânio bromide (DODAB) podem ter múltiplos usos (CARMONA­

RIBEIRO, 2000). Partículas de sílica (RAPUANO & CARMONA-RIBEIRO, 2000).

Microesferas de poliestireno podem ser funcionalizadas pela cobertura com bicamadas

de DODAB ou monocamadas de fosfolipídios (LESSA & CARMONA-RIBEIRO,

1996; CARMONA-RIBEIRO & HERRINGTON, 1993). Os lipossomos catiânicos

podem agir como agentes antimicrobianos, causando morte de bactérias e fungos em

concentrações que não afetam células de mamífero em cultura. (CARMONA-RIBEIRO,

2000).

Desde 1994, a citotoxicidade de dispersões de DODAB e outros lipossomos

catiânicos, vem sendo descrita contra espécies bacterianas e cultivos de células de

mamíferos, (MARTINS et aI., 1997; CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997; TÁPIAS et aI.,

1994; SICCHIEROLLI et aI., 1995; CAMPANHA et aI., 1999; CARMONA-RIBEIRO,

2000), como também, sua habilidade para solubilizar drogas hidrofóbicas como o

miconazol (MCZ) e a anfotericina B (CARMONA-RIBEIRO, 2000; VIEIRA &

CARMONA-RIBEIRO, 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003;

LINCOPAN et aI., 2003). No entanto, a atividade antifúngica dos imidazóis derivados

de miconazol e cetonazol mostrou-se reduzida em decorrência do encapsulamento dos

mesmos em lipossomos, ocorrendo diferenças significativas de atividade para

encapsulamento por vesículas unilamelares pequenas (SUV) ou por vesículas

multilamelares (MLV). A associação de imidazol-colesterol-fosfolipídios induziu um

efeito inibidor sobre a atividade antifúngica, sendo essa redução, maior para MLV do

que para SUV (DE LOGU et aI., 2000).

38

Citotoxicidade diferencial de DÜDAB

.Tipo de célula [Cel/mL]Células viável [DüDAB]mM 50%Referências.

sobrevida

Balb-c3T3 104 1.0 Caml0na, 1997

(Fibrob1astos)

SV40- 104 1.0 Caffi1ona, 1997

Transfoffi1ado

C. albicans 106 0.010 Campanhã, 2001

E. CoZi 107 0.028 Martin, 1997

S. typhimurium 107 0.010 Campanhã, 1999

P. aeruginosa 107 0.005 Campanhã, 1999

1.6.- Interação entre brometo de dioctadeci/-

meti/amônio ou dihexadeci/fosfato de sódio e células

Desde sua introdução como compostos sintéticos fOffi1adores de bicamada

(FENDLER, 1980), dihexadeci1fosfato de sódio (DHP) ou as sais de

dioctadecilmetilamônio (DODA) (Figura 1.6.1), têm encontrado diferentes usos em

áreas estratégicas (CARMONA-RIBEIRO, 1992). Em particular lipossomos catiônicos

de sais de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), têm sido satisfatoriamente

empregados para interagir com superfícies carregadas negativamente tais como: células

procariontes (TÁPIAS et aI., 1994; SICCHIEROLLI et aI., 1995; MARTINS et aI.,

1997; CAMPANHÃ et aI., 1999), eucariotes (CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997;

CAMPANHÃ et aI., 2001), proteínas séricas (CARVALHO & CARMONA-RIBEIRO,

1998), polímeros sintéticos como látex (CARMONA-RIBEIRO & MIDMORE, 1992;

VIEIRA et aI., 2003) e superfícies minerais (RAPUANO & CARMONA-RIBEIRO,

1997; MOURA & CARMONA-RIBEIRO, 2003).

39

CH2' /CH3N+ Sr"

CH2/ "CH3

DODAB

o o'\ ~

P0/ '\ ONa+

DHP

Figura 1.6.1.- Estrutura molecular de dihexadecilfosfato de sódio (DHP) e brometo de

dioctadecilmetilamônio (DODAB).

Uma outra propriedade promissora bastante explorada tem sido a liberação

controlada de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) para células mamíferas, como uma

estratégia para imunoterapia e proteção antiviral (KIKUCHI et aI., 1999; 2000; LASIC,

et aI., 1997; VAN ROOIJ et aI., 2002; NANTES et aI., 2003). Porém, a principal

utilidade terapêutica tem sido associada a sua intrínseca atividade imunoadjuvante e

interação com proteínas antigênicas, potencial amplamente estudado por mais de 35

anos (GALL, 1966; VERONESI et aI., 1970; STANFIELD et aI., 1973; SNIPPE et aI.,

1980b; HILGERS & SNIPPE, 1992; KATZ et aI., 1995; TSURUTA et aI., 1997;

KLINGUER-HAMOUR, 2002; DASCHER et aI., 2003; HOLTEN-ANDERSEN et aI.,

2004; LARSEN et aI., 2004), já sendo utilizado em humanos em combinação com o

toxóide tetânico (STANFIELD et aI., 1973; VERONESI et aI., 1970).

Por outro lado, anfifilicos catiônicos, de modo geral, são reconhecidamente

tóxicos tanto para células procarióticas como para as eucarióticas (SALT &

WISEMAN, 1970). TÁPIAS et aI. caracterizaram o efeito bactericida de vesículas de

brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) usando Escherichia calí, como modelo

(TÁPIAS et aI., 1994, SICCHIEROLLI et aI., 1995). Essa investigação foi estendida ao

efeito do DODAB sobre a viabilidade de fibroblastos normais e transformados em

cultura (CARMONA-RIBEIRO, et aI., 1997). Após meia hora de interação com células

eucarióticas em monocamada subconfluente, observou-se morte celular a partir de

O,lmM de DODAB tanto para as células normais quanto para as transformadas

(CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997).

40

A interação de anfifilicos sintéticos de DODAB com propriedades

antibacterianas, foi avaliada para uma concentração fixa de bactérias viáveis (2,5 x 107

bactérias viáveis/mL) de E. coZi, S. typhimurium, P. aeruginosa, e S. aureus. A

susceptibilidade frente ao DODAB aumentou de E. coZi para S. aureus na ordem acima.

A viabilidade celular diminui para 5% com tempo de interação de até 1 h em

concentrações de DODAB iguais a 50 e 5 j.tM para E. coZi e S. aureus, respectivamente.

Para bactérias e C. albicans, a determinação simultânea de viabilidade celular e

mobilidade eletroforética em função da concentração de DODAB, mostraram uma

correlação muito boa entre carga da superfície celular e viabilidade celular. Células

carregadas negativamente são 100% viáveis, enquanto, células carregadas positivamente

não sobrevivem (CAMPANHÃ et aI., 1999; 2001).

1.7.- Princípios teóricos dos métodos utilizados

1.7.1.- Isotermas de adsorção

o contato de uma substância tensoativa diluída em solução aquosa com uma

grande superfície absorvente, poderá levar a uma adsorção extensiva com uma redução

contínua na concentração da solução. Para se ter uma superfície grande para adsorção, o

sólido - que é chamado de adsorvente - deve ser finamente dividido. A partir de dados

analíticos que descrevem a mudança de concentração na solução, assim como o

conhecimento da quantidade total de sólido da solução equilibrada, é possível

determinar a quantidade de soluto adsorvido, que é chamado de adsorbato, por unidade

de peso do sólido. Se a área específica do sólido é conhecida, então os resultados podem

ser expressos como quantidade adsorvida por unidade de área. Esses estudos são

geralmente conduzidos a temperatura constante, e os resultados, que relacionam a

quantidade de material adsorvido com a concentração de equilíbrio em solução, definem

uma isoterma de adsorção (HIEMENZ, 1986).

Isotermas para adsorção de solutos orgânicos são divididas em quatro classes

principais, de acordo com a natureza do coeficiente angular da porção inicial da curva.

As principais classes são:

curvas S, indicativas de orientação vertical de moléculas do adsorbato na

superfície;

41

BII:SLIV I L:;Vn,

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

curvas L, isotermas normais ou de "Langmuir", usualmente indicativas de

adsorbatos "deitados" sobre a superficie, ou às vezes, adsorbatos iônicos orientados

verticalmente com atração intermolecular particularmente forte;

curvas H, ("alta afinidade") (começando de um valor positivo no eixo de

concentração adsorvida sobre o sólido), freqüentemente resultando da adsorção de

solutos como micelas iônicas, ou de troca iônica de alta-afinidade com íons de baixa­

afinidade;

curvas C ("partição constante"), curva linear, resultando da adsorção de solutos

que adsorvem no sólido mais rapidamente do que o solvente (GILES et aI., 1960).

Os subgrupos destas classes estão arranjados de acordo com a forma das curvas

depois do ponto de origem e da posição do platô. Assim, se as moléculas do soluto que

estão adsorvidas na nova superficie apresentam baixa atração por mais moléculas, a

curva apresenta um longo platô. Se as moléculas que estão adsorvidas na superficie

apresentam alta afinidade por mais soluto, a curva cresce continuamente e não apresenta

platô.

Um dos tipos mais comuns é a isoterma de Langmuir, importante por ser

facilmente entendida teoricamente, e largamente aplicada aos mais diferentes dados

experimentais. Uma das fórmulas deste modelo pode ser expressa por:

2xska~

ka~ +1

Eq. 1.7.1.1

onde x; é a fração molar do soluto na superficie, a~ é a atividade do soluto na solução,

e k é uma constante. Tal isoterma decorre do fato de se considerar a adsorção do soluto

segundo a Equação 1.7.1.2.

Solvente adsorvido + Soluto em solução !:; Soluto adsorvido + Solvente em Eq. 1.7.1.2

adsorção

A constante de equilíbrio para essa reação pode ser definida como:

42

aS b

k =--.J!!:..LaS b1 az

Eq. 1.7.1.3

Nesta teoria é suposto que uma solução em que ambos solvente (componente 1)

e soluto (componente 2) possuem moléculas que ocupam a mesma área ao adsorverem à

superfície. Assumindo que a solução na superfície bidimensional é ideal, podemos

substituir atividade na superfície por fração molar na superfície XS definida como:

kxSab

= _Z_~I

xS b1 az

Eq. 1.7.1.4

Uma forma equivalente da equação de Langmuir expressa em variáveis

ligeiramente diferentes é obtida multiplicando ambos x; e x~ na equação 1.7.1.4 pela

área total da superfície. Como foi postulado que tanto o solvente como o soluto ocupam

áreas iguais sobre a superfície, então, x: A é igual a fração da superfície ocupada pelo

componente i ,81 . Desde que 81 + 82 =1, a relação 81/82 rearranja da mesma maneira

que x~ /x; para dar:

8 2 kab

s = __ 2

ka~ +1

Eq. 1.7.1.5

Nesta forma a equação de Langmuir mostra como a fração dos sítios de adsorção

da superfície ocupada pelo soluto aumenta com a atividade do soluto em soluções com

concentrações crescentes.

1.7.2.- Mobilidade e/etroforética e determina-

ção de potencial zeta

A maioria das substâncias adquire uma carga elétrica superficial quando

colocada em um meio polar, como o aquoso, por exemplo. Os possíveis mecanismos de

obtenção dessas cargas são a ionização, a adsorção de íons e a dissolução iônica. Esta

43

carga superficial adquirida influencia a distribuição de íons próximos, no meio polar.

Íons de carga oposta (contra-íons) são atraídos para a superficie e íons de mesma carga

(co-íons) são repelidos. Incluindo a isso ao movimento térmico, tem-se a formação de

uma dupla camada elétrica feita pela superfície carregada e um excesso neutralizante

de contra-íons sobre os co-íons, distribuídos de uma maneira difusa no meio polar.

A teoria da dupla camada elétrica trabalha com esta distribuição de íons, assim

como com a intensidade dos potenciais elétricos na superfície carregada e no restante do

melO.

A dupla camada elétrica pode ser considerada como consistindo de duas regiões:

uma região interna que pode incluir além da superfície carregada, íons adsorvidos sobre

esta e uma região na qual íons estão distribuídos de acordo com a influência das forças

elétricas e do movimento térmico.

o modelo de Gouy e Chapman, para a parte difusa da bicamada, (Fig. 1.7.2.1)

considera que:

_ A superfície carregada é plana, de comprimento infinito e uniformemente carregada.

_ Os íons na parte difusa, são consideradas cargas pontuais, distribuídos segundo a

distribuição de Boltzman.

_ O solvente influencia a bicamada somente através de sua constante dielétrica, a qual é

considerada constante em toda a parte difusa.

Ge e.f.I:\ e\Ve (i) . e e

e G· eee ~

ee $ e e $

Distância

~oc:

~

.;.

n.

Figura 1.7.2.1 Representação esquemática de uma dupla camada difusa

_ <Po é O potencial elétrico na superfície plana e <p é o potencial em uma distância x da

superfície na solução eletrolítica.

44

Aplicando a distribuição de Boltzman temos que:

n+ = no exp (-ze<p/kT) e n_ = no exp(ze<p/kT ), onde -ze<p e ze<p representam as energias

potenciais e n+ e lL são os respectivos números de íons positivos e negativos por unidade

de volume em pontos onde o potencial é <p e no é a correspondente concentração de cada

espécie no seio da solução.

Seja p, a densidade volumétrica resultante de carga: p = ze(n+ + n.) Aplicando a

Equação de Poisson para o potencial: 82<p182x = - P lê, e adotando as condições de

contorno: <p=<po, x=O e <p =0 e d<p/dx =0, quando x -7 00 e a aproximação de Debye­

Huckel: ze<p/2kT ~ I, temos para o potencial: <p = <po exp(-kx), onde k = ( 2e2NAcz2 I

êkT )1/2 e <po o potencial na superfície.

A dupla camada Stern propôs um modelo no qual a dupla camada é dividida

em duas partes separadas por um plano (plano de Stem), localizado acerca de um raio

hidratado de íon da superfície carregada, considerando também a possibilidade de

adsorção de íons neste plano (Fig. 1.7.2.2).

11.( Distância

(j)

eEf)

e

e

Ef)

Ef)

eCamadadJfusa

\ Camada de Stem

(ij"o2 Y,doo..

Figura 1.7.2.2 Representação esquemática da estrutura da dupla camada elétrica, segundo a teoria de

Stem.

Onde <Pd é o potencial no plano de Stem, onde os íons adsorvidos (por interação

eletrostática e/ou por forças de van der Waals, suficientes fortes para vencer a agitação

45

térmica), ficam na região entre a superfície e o plano de Stern.Àqueles que têm centros

além do plano formam a parte difusa da dupla camada onde o modelo de Gouy­

Chapman é aplicado. 8 é a largura da camada

Um pouco além do plano de Stern, incluindo a solução eletrolítica, fica o plano

de cisalhamento ("shear plane") que define a unidade eletrocinética que é constituída

por partículas, moléculas e íons ligados à superfície, e que se move com ela quando é

deslocada por movimento browniano ou sob a influência de força elétrica. O potencial

eletrocinético é chamado de potencial-zeta, ç .Percebe-se que ele é um pouco menor que

o potencial <Pd. Geralmente, se considera o potencial-zeta igual ao potencial de Stern,

com uma pequena margem de erro. O mesmo não acontece em altas concentrações

eletrolíticas e altos potenciais.

O ZetaPlus trabalha com o fenômeno da eletroforese, que corresponde ao

movimento da unidade eletrocinética (superficie carregada + íons ligados) em relação

ao líquido estacionário, sob a ação de um campo elétrico externo.Na Figura 1.7.2.3

mostramos o esquema ótico usado na determinação do potencial Zeta.

Laser diodo

M2Modulador

Raio de referência

/ YSIDivisor de raio

Eletrodos

I I 11-1) YMIEspelho

Figura 1.7.2.3 Sistema ótico utilizado na medição do potencial Zeta

Como já vimos anteriormente, partículas dispersadas em um líquido,

freqüentemente adquirem uma carga superficial. Se aplicarmos um campo no líquido, as

partículas carregadas mover-se-ão na direção do pólo positivo ou negativo deste campo

(Eletroforese). A direção selecionada pelas partículas é uma clara indicação do sinal da

carga que elas carregam. A velocidade com que estas cargas se movimentam sob a ação

do campo, numa certa faixa de tamanho, depende da quantidade de carga que elas

apresentam.

46

Ao se aplicar um campo pulsado de baixa intensidade no líquido, teremos que as

partículas se movem ora para um lado ora para o outro .lado. Ao incidir um feixe de luz

laser com freqüência devidamente ajustada em 250 Hz (MANUAL DE INSTRUÇÕES,

BROOKHAVEN, 1997) tem-se espalhamento de luz, cuja freqüência (Efeito Doppler)

será proporcional à velocidade da partícula, que por sua vez será proporcional à carga,

considerando uma certa faixa de tamanho.

Seja Vef- velocidade eletroforética ou velocidade de deslocamento, então:

Vef = ).tef E, onde ).tef- mobilidade eletroforética.

E - intensidade do campo elétrico aplicado

Com o campo dado, mede-se a velocidade eletroforética e calcula-se a

mobilidade. A partir da mobilidade eletroforética e a aproximação de Smoluchowski

abaixo, o potencial Zeta é determinado.

Equação de Smoluchowski _ ).tef = ErEo ç /11 ~ ç = 11 ).!ef / ErEO, ka» I

).tef = mobilidade eletroforética

Er = permissividade elétrica relativa do líquido

Eo = permissividade elétrica do vácuo

ç =Potencial Zeta, onde o limite ka» I corresponde à aproximação da partícula

ter um raio muito grande o que leva a supor que tanto a dupla camada quanto a

própria partícula são planas.

Para medidas de pequenas mobilidades eletroforéticas, o ZetaPlus utiliza a

análise de fase de luz espalhada-CPALS), para determinação da mobilidade

eletroforética, ).ter e, a partir disso, usando a aproximação de Smoluchowski calcular o

potencial. Na Figura 1.7.2.4 apresentamos o esquema PALS.

47

BIBLiOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

Análise de Fase de Luz Espalhada (PALS)

q=iL-q.

1_'1 4ltno ' eq = q = -----SIII-

"o 2

-1 ~.. ~r--Ê(l) ~ Ê. ';11«" r, t)

(Q(t) - Q(O») == ~Q(t)

tlQ( t) = (/l.)q • [E( t) / (O E - "\ t]

Figura 1.7.2.4 Esquema PALS

Onde, E(t) é o campo oscilante dado, ~Q(t) é a variação de fase sofrida pela luz

espalhada ,q o vetor de onda, com I q I= 4 rr no /À<J sen 8/2, onde:

no é o índice de refração do líquido

À<J comprimento de onda da luz laser no vácuo e 8 é o ângulo de espalhamento.

A partir da aplicação do campo E(t) oscilante, mede-se a diferença de fase ~Q(t)

da função e, através de ajustes feitos internamente pelo sistema ótico do aparelho (de

modular cada novo ciclo para remover termo linear Vc, ajustar a função retificada para

termo residual linear mais termo oscilante) determina-se a mobilidade eletroforética

média. e finalmente, calcula-se o potencial Zeta.

O potencial Zeta é útil na determinação de:

_cargas sobre partículas.

_mudança da carga sobre as partículas com o tempo

_medida do ponto isoelétrico e estabilidade

_efeito de força iônica e PH m líquidos polares etc

1.7.3.- Espectrofotometria de UV-visível

A espectroscopia para o bioquímica ou biofísico, geralmente significa a

observação de espectros de absorção. A maior parte dos estudos realiza-se em soluções,

geralmente diluídas. Em tais circunstâncias, a lei de Lambert-Beer governará os

processos de absorção,

II = Ioe -&1e = 10 10 -&1e I Eq. 1.7.3.1 I

48

Onde lo é a intensidade de radiação incidente e I a intensidade da radiação

transmitida através de uma célula de I cm de espessura, contendo uma solução de

concentração c moles/litro. A quantidade E é coeficiente de extinção, em unidades de

litro por moI por centímetro. Freqüentemente os dados são apresentados em transmissão

porcentual (I/Ia x 100) ou em absorbância [A = log (IIIo)]. Esta última é particularmente

conveniente, pois, da equação 1.7.3.1, pode ser escrita a equação abaixo:

'- ----'-I_A_=_Elc_____ Eq.1.7.3.21

Um espectro de absorção no ultravioleta obtido diretamente de um instrumento

nada mais é do que um gráfico da intensidade de absorção (absorbância ou

transmitância) versus o comprimento de onda ou (freqüência). Para a medição dos

espectros de absorção exige-se a produção de uma luz monocromática de comprimento

de onda conhecido a medição do decréscimo em intensidade que ocorre quando a luz

passa através de uma espessura conhecida de solução.

1.7.4.- Espalhamento de luz dinâmico

Espectroscopia de correlação de fótons (PCS) é uma técnica de espalhamento

dinâmico quase-elástico de luz, comumente usada para caracterizar partículas coloidais

de tamanhos na faixa de submícrons a nanômetros. Radiação a laser em partículas

coloidais em movimento Browniano produz flutuações desordenadas no sinal de

intensidade de luz espalhada, com um procedimento temporal dependente do tamanho e

forma da partícula. A dependência temporal das flutuações pode ser determinada por

autocorrelação do sinal de intensidade espalhada. Para partículas esféricas, a função de

autocorrelação decai exponencialmente com uma constante de decaimento rproporcional ao coeficiente Browniano médio de difusão, Do, das partículas , que por

sua vez está relacionado com o seu tamanho (raio hidrodinâmico). No limite de baixa

concentração de partículas, interações hidrodinâmicas podem ser desprezadas, e o

diâmetro médio da partícula, d, pode ser calculado, usando a equação de Stokes­

Einstein (HANUS; PLOEHN, 1999):

49

IDo = kb T /3 7t 1](t) d---------

Eq. 1.7.4.1 I

onde kb é a constante de Boltzmann (1.38054 x 1O-16ergs/deg), T é a temperatura

em °K, 1](t) (em centésimos de poise) é a viscosidade do solvente. As partículas, fontes

secundárias de luz espalhada, estão em movimento Browniano, assim à distância

percorrida pelas ondas espalhadas até o detector varia com o tempo. As ondas

eletromagnéticas podem interferir construtivamente ou destrutivamente, dependendo da

distância ao detector. O tempo de decaimento das flutuações está relacionado com a

constante de difusão, Do, das partículas, que por sua vez depende do raio hidrodinâmico.

As partículas pequenas com coeficiente de difusão maior produzem flutuações com

decaimentos mais rápidos que as partículas maiores que se movem mais devagar.

No espalhamento quase-elástico de luz, o tempo de decaimento dessas

flutuações é medido, usando um correlator, cuja função de autocorrelação é formada

pela média dos produtos das intensidades espalhadas medidas em pequenos intervalos

de tempo (delay time), comparados com o tempo necessário para a flutuação voltar

(decair) ao valor médio de intensidade espalhada. Quando t aumenta a correlação é

perdida, e a função aproxima-se de um valor médio B. Para tempos pequenos a

correlação é alta.

Para uma suspensão monodispersa de partículas esféricas, globulares, rígidas, a

função de autocorrelação é dada por:

C(t) = A e-Lfl· + B Eq. 1.7.4.2 ]

onde A é uma constante ótica, determinada pelo aparelho e r é relacionada ao

tempo de relaxação das flutuações por:

2r =Doq Eq. 1.7.4.31

Com Do = coeficiente de difusão das partículas; q vetor de onda da luz

espalhada, dado por: I q I= 4 7t n/l..on sen8/2.

A partir de medidas da função de autocorrelação ,determina-se r através do

ajuste da função à C(t). Com isso, calcula-se o coeficiente de difusão, Do, a partir de 1..0,

n e 8 dados.

50

INSTITUTO DE UUIMIIA\

Universidade de São Pa:.ilO

Finalmente, obtêm-se o diâmetro da partícula, usando a relação de Stokes­

Einstein:

Do=kb T /3 7t YJ(t)d Eq. 1.7.4.41

o software, MAS OPTION (Manual de Instrução - Potencial Zeta, Brookhaven,

1999), instalado no Zeta Plus, faz as medidas das intensidades espalhadas nos pequenos

intervalos de tempo, ajusta a função C(t), calcula Do e d automaticamente.

A função de autocorrelação é mais complexa que a apresentada na equação

(1.7.3.3), a qual é adotada para sistemas monodispersos de partículas rígidas esféricas.

Quando a amostra é constituída de esferas de tamanhos variáveis, um sistema

polidisperso, a função C(t) da equação 1.7.3.4 é modificada. Cada tamanho de partícula

contribui com sua própria exponencial, de tal forma que para a amostra temos a seguinte

função:

g(t) = fG(t) e-r tdt Eq. 1.7.4.5]

A solução desta equação, Equação da Transformada de Laplace, não é trivial.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para obtenção da solução de g(t), utilizando

diversos modelos para as distribuições de partículas. Entre elas podemos citar: Ajuste

para uma Distribuição Conhecida, Análise de Cumulantes.Transformada Inversa de

Laplace, entre outras. O Zeta Plus, através do software, MAS OPTION, utiliza para seus

cálculos da função de autocorrelação o método mais geral, análise de cumulantes,

(BERNE & PECORA, 1988; INSTRUCTION MANUAL, BROOKHAVEN, 1995).

Neste método nenhuma hipótese é feita acerca da forma da função de distribuição. A

exponencial da equação 1.7.3.5 é expandida em uma série de Taylor em tomo do valor

médio. A serie resultante é integrada para dar um resultado mais geral, o qual mostra

que o logaritmo da função de autocorrelação pode ser expresso como um polinômio no

tempo (delay time). Os coeficientes das potências de t são chamados de cumulantes da

distribuição, os quais durante uma medida com o, MAS OPTION, geram os resultados

cumulantes que são: diâmetro efetivo e índice de polidispersidade. que por sua vez são

usados para calcular os dois parâmetros da distribuição Lognormal, escolhida pelo

programa para representar a distribuição por peso dos diâmetros das partículas.

51

Grabowski e Morrison (GRABOWSKI & MORRISON, 1983) formularam uma

aproximação mais complexa para g(t), denominado algoritmo de mínimos quadráticos

não negativos (NNLS), aplicada a análise de distribuições multimodais de tamanho

(MSD).a qual encontra-se como opção para determinação de tamanho no, MAS

OPTION (INSTRUCTION MANUAL, BROOKHAVEN, 1995).

2. - OBJETIVOS

Objetivo geral:

• Estudos fisico-químicos da interação entre miconazol e lípides

sintéticos catiânicos ou aniânicos e da interação entre os lípides

sintéticos e as células de C. albicans.

Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de

bicamada catiônico (DODAS)

Objetivos específicos:

• Determinar tamanhos médios e potenciais zeta das dispersões de lípides

Solubilização de miconazol em dispersões de lípides por espectroscopia de UV­

Visível.

• Determinar absorptividade molar (E) do miconazol em algumas dispersões

lipídicas.

• Determinar a inserção de miconazol nas bicamadas vista por determinações de

diâmetro médio (Dz) e potencial zeta (Ç) nas dispersoes de DODAB e Pc.

Parte 1/: Estudo da solubilização e/ou estabilização co/oidal do

MCZ em fragmentos de bicamada aniônica (DHP)

Objetivos específicos:

• Determinar a floculação ou estabilização de dispersões de miconazol por

vesícula de carga oposta.

52

• Avaliar o efeito de concentração de miconazol em pH 6,3 sobre sua agregação

em dihexadecilfosfato de sódio 0,05 mM.

• Avaliar o efeito de pH sobre o diâmetro médio (Dz) e potencial zeta (Ç) de

dispersões de droga, dihexadecilfosfato de sódio ou dihexadecilfosfato de sódio

e droga

• Avaliar o efeito de concentração de dihexadecilfosfato de sódio sobre a cinética

de agregação da droga 0.2mM, em diferentes pHs.

Parte 11/: Aspectos físico-químicos da interação entre

anfifílicos catiônicos de DODAB e células de C. albicans

Objetivos específicos:

• Avaliar o efeito da concentração de células sobre a adsorção de DODAB.

• Determinar as isotermas de adsorção de brometo de dioctadecildimetilamônio

em células de Candida albicans fixa a concentração de células em 108

células/mL.

• Avaliar o efeito da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio sobre

a mobilidade eletroforética das células.

3.- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.- Reagentes

•

•

•

•

•

•

•

•

Água Milli-Q ultrapura.

Brometo de dioctadecilmetilamônio (DODAB) foi obtido de Sigma, 99,9% de

pureza.

Dihexadecilfosfato de sódio (DHP) foi obtido de Sigma, 99,9% de pureza.

L-a Fosfatidilcolina : solução etanólica (solução mãe) 100 mglmL, produzida

pela Sigma Chemical Co.

Miconazol nitrato. Obtido de Janssen Research Foundation, 99,9% de pureza.

Metanol. 95,5% de pureza marca Merck.

Etanol p.a 99,8% de pureza marca Merck.

Clorofórmio 99,0% de pureza marca Merck.

53

•

•

•

•

•

•

•

•

Solução tampão tris HCI IOmM

Solução de molibdato de amônio 1,25%

Solução de ácido ascórbico 5%

Ácido perclórico marca Quimex.

Membrana de celulose para diálise marca Sigma.

Solução padrão de fosfato de sódio (NaH2P04) ImM

Solução indicadora de difenilcarbazona em etanol

NaCI p.a 99,5% de pureza, marca Merck.

3.2.- Equipamentos

3.2.1.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus)

para determinações de diâmetro médio das partículas em

dispersão

o Zeta Plus Analyzer aparelho utilizado para a medida de tamanho médio de

partículas. A técnica empregada - Espectroscopia de correlação de fótons de

espalhamento quase-elástico de luz dinâmico (QELS).

Especificações:

Faixa de tamanhos medidos:

Controle de temperatura:

Volume da amostra:

Resultados:

2 nm a 3 Jlm

5°C a 75°C

0.5 a 3 mL

Diâmetros médios (Dz) e desvio médio são calculados

para a distribuição de tamanho por peso, assumindo

uma distribuição lognormal.Análise de distribuição

multimodal de tamanho (MSD) é opcional.

54

3.2.2.- Zeta Potential Ana/yzer (Zetaplus)

para determinações do potencial zeta das partículas em

dispersão

Zeta Potential Analyzer ZetaPlus aparelho utilizado para a medição de potencial

zeta das partículas. Utiliza a técnica de espalhamento eletroforético de luz, e está

baseada na análise das diferenças de fase da luz espalhada (PALS).

Especificações:

Faixa de potencial Zeta:

Faixa de tamanhos:

Precisão:

Reprodutibi Iidade:

Fonte de luz:

Controle de temperatura:

Volume da amostra:

Tempo de medida:

Resultados:

3.2.3.-

2000

-150 a + 150 mV

10 nm a 30 ~m (dependendo da densidade

partícula)

±2%

±2%

laser de 30 mW , estado sólido, de À = 532 nm

6 DC a 74 DC em passos de 0.1 DC

1.5 mL

tipicamente de 1 a 2 minutos.

valores modais para potencial Zeta e mobilidade

eletroforética e distribuições de potencial Zeta

Espectrofotõmetro Hitachi-Mode/o U-

Aparelho utilizado para medidas de absorbância e espectros ópticos das

dispersões. O equipamento é acoplado ao registrador gráfico para registro contínuo de

medidas de absorbância em função do tempo ou comprimento de onda.

Especificações:

Fonte de luz:

Precisão na absorbância:

Reprodutibilidade:

Na faixa de UV-VIS (190-1100 nm) com precisão de

±OAnm

Na escala de 0.0 a 0.5 ± 0.002

Na escala de 0.5 a 1.0 ± 0.004

0.001 de absorbância na escala de Oa 0.5

0.002 de absorbância na escala de Oa 1.0

55

3.2.4.- Espectrofotómetro (Model Spectrascan

2800 CIBA-CORNING)

. Aparelho utilizado para medições de absorbâncias das dispersões em

temperatura controlada. Aparelho equipado com um sistema óptico de feixe duplo de

luz monocromática.

Especificações:

Fonte de luz Lâmpada de deutério (200 a 350 nm)

Lâmpada de Iodo-Tungstênio (330 a 1100 nm)

Precisão na absorbância Na escala de 0.0 a 0.5 ± 0.002

Na escala de 0.5 a 1.0 ± 0.004

Reprodutibilidade ± 0.001 de absorbância na escala de Oa 0.5

± 0.002 de absorbância na escala de Oa 1.0

3.2.5.- Sonicador Lab-Line UltraTip (Modelo

9100 com tip de titânio)

Aparelho desenvolvido para romper, através de ondas sonoras emitidas de um

ultra-som, as paredes ou membranas celulares de células em experimentos

microbiológicos. Aqui ele foi utilizado para formar vesículas e fragmentos de vesículas

de anfifílicos pelo mesmo princípio de ultra-som.

Especificações:

Requerimento elétrico 120 VAC, 60 Hz, 400 Watts

Energia acústica (do Tip) Gerador de freqüência de Oa 200 watts

Emissão de nível do sonido 97 d BA's a 150 watts

99 d BA's a 200 watts

56

3.2.6.- Centrífugas

• Centrífuga refrigerada-modelo Himac SeR 20B da Hitachi,

com velocidade de rotação entre O a 2000 rpm e temperatura

entre -10 e 40°C.

• Microcentrífuga-Eppendorf-modelo 540, refrigerada, com

velocidade de rotação entre 1000 e 14000 rpm e temperatura

entre -9 e 40°C.

3.3.- Métodos preparativos para obtenção das

dispersões de lipídios, droga e célula

3.3.1.- Dispersão de /ípides sintéticos por

sonicação com sonda

As vesículas e/ou pequenos fragmentos de dihexadecilfosfato de sódio (DHP),

brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), cujas fórmulas estruturais se

encontram nas Figuras 3.3.1.1, foram preparadas de uma maneira geral, calculando-se a

massa necessária para a concentração final desejada, utilizando um balão volumétrico

para a pesagem e completando com água Milli-Q para obter o volume pré-estabelecido.

Em seguida, a mistura é colocada no ultra-som, em um béquer de 10 mL, apropriado

para o encaixe da sonda (tip) de titânio (MORTARA et al., 1978; KANO et al., 1979) a

uma temperatura entre 60 e 80 °e durante 15 minutos, em uma potência média nominal

de 80 watts. Para precipitação do titânio ejetado da sonda e possíveis vesículas

multilamelares produzidas durante a sonicação, procedeu-se a uma centrifugação em

10000 g por 1 hora a 25°C. (FENDLER, 1980).

3.3.2.- Dispersão de /ípides sintéticos por

injeção c/orofórmica

Vesículas grandes foram preparadas por injeção c1orofórmica de DODAB e

DHP em água. O DHP e o DODAB foram pesados para uma concentração 10 vezes

maior que aquela desejada, e diluído em 1 mL de clorofórmio, que foi injetado a uma

57

velocidade de aproximadamente 0,2 mL/min em 10 mL de uma solução termostatizada

a 70 ± 0,5 °C, e borbulhada com nitrogênio para facilitar a vaporização do clorofórmio.

Quando todo o clorofórmio evaporou, a dispersão foi então retirada da coluna com uma

pipeta. A dispersão assim obtida corresponde às vesículas unilamelares grandes de

DODAB e DHP. Seguiu-se com a microtitulação de DODAB e a dosagem de fósforo

inorgânico de DHP.

3.3.3.- Dispersão de fosfatidilcolina ou

brometo de dioctadecildimetilamônio por injeção etanólica

Vesículas pequenas unilamelares de fosfatidilcolina, PC, cuja fórmula estrutural

se encontra na Figura 3.3.3.1, foram preparadas por injeção etanólica (BATZRI &

KORN, 1973; KREMER et a1., 1977) em água, seguida por 4 horas de diálise em água

pura para eliminar o etano1. O diâmetro médio obtido foi de 70 nm (CARMONA­

RIBEIRO & HERRINGTON, 1993).

3.3.4.- Dispersão de brometo de dioctadecil-

dimetilamônio por aquecimento e agitação

Vesículas grandes de DODAB foram obtidas pelo o método do SNIPPE - por

aquecimento (KATZ et a1., 1995). Os sais foram pesados analiticamente e transferidos

para um frasco, onde foi adicionada quantidade suficiente de água Milli-Q para a

concentração desejada.A dispersão dos lípides se deu por aquecimento em banho, a uma

temperatura média de 50°C, valor acima da temperatura de transição de fase dos sais,

durante 30 minutos. Em seguida foram homogeneizadas por agitação.

3.3.5.-

miconazol

Preparação da solução estoque de

Foi pesado miconazol para preparar a concentração desejada em metanol 96 %

(lOmg/mL solução mãe). A seguir, vortexou-se para a completa dissolução dos cristais

da droga.

58

3.3.6.-

BIBLIOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUnlversid.de de São Paulo

Cultivo de Candida albicans, determina­

ção da curva de crescimento e contagem de células em

câmara de Neubauer

Candida albicans ATCC 90028 isolada em ágar Sabouraud dextrose 4%, foi

semeada em ágar Sabouraud dextrose 4%. Partindo desta cultura de 24 h, foi preparado

um inoculo que inicialmente apresentou uma turbidez compreendida entre 0,080 e 0,100

de absorbância num comprimento de onda de 625 nm. O inóculo foi incubado em

shaker a 30°C, 160 rpm, durante 6 h. Posteriormente, 30 mL foram centrifugados a 5000

rpm, por 15 min; centrifugados mais duas vezes com água Milli-Q esterilizada, a 5000

rpm, por 10 min, para lavagem. O sedimento foi suspenso em 30 mL de água Milli-Q

estéril.

A curva de crescimento da Candida albicans foi realizada para tentar reproduzir

as condições anteriormente padronizadas no laboratório, comparando-se o tempo

necessário ao crescimento exponencial (fase log da levedura). Os métodos escolhidos

foram de dosagem de fosfato (ROUSER, et aI., 1970) e determinação da turbidez a 625

nm.

A suspensão foi separada em tubos eppendorf estéreis e conservadas até o seu

uso (l mL de cada amostra). Para a determinação de fosfato, todas as amostras foram

centrifugadas a 5000 rpm, 4°C, durante 30 minutos. Os sedimentos foram então

suspendidos com 1 mL de água Milli-Q estéril, com exceção das amostras de O e 3h,

que foram suspensas com 0,2 mL de água Milli-Q estéril. A concentração de fosfato foi

colocada em gráfico, em função do tempo (Figura 3.3.6.1).

59

2.0 .. g,,---I"rg

~ 1.5 Ig

E~

o.. 1.0.....!!"E.,()c 0.5 1o /gu

O

I .,i i , I , I /,. IO 4 8 12 23 24

Tempo de cultivo (h)

Figura 3.3.6.1 Crescimento de C. albicans monitorado por dosagem de fosfato inorgânico (P j , em mM)

em função do tempo de cultivo (h). Inóculo inicial com turbidez compreendida entre 0,080 e O, I00 de

absorbância a 625 nm foi cultivado em ágar Sabouraud, lavado e suspendido em água Milli-Q antes das

determinações.

Alternativamente, o crescimento foi seguido por medidas de turbidez a 625 nm em

função do tempo de cultivo. Alíquotas dos cultivos foram centrifugadas a 5000 rpm e

lavadas duas vezes com água Milli-Q e depois resuspendidas também em água Milli-Q.

O branco era constituído de água Milli-Q. A turbidez a 625 nm foi colocada em gráfico,

em função do tempo de cultivo (Figura 3.3.6.2).

16

12

"Ec:

\t)

'"'" 8~

N.,:!!-e

4::ll-

oL,.

O 4

o

8 1223

o'f-

24

Tempo de cultivo (~

Figura 3.3.6.2 Turbidez relacionada com a concentração de células, em função do tempo de cultivo

(h). A leitura de turbidez foi realizada após o cultivo da levedura em caldo Sabouraud, lavagem e

suspensão em água Milli-Q, em comprimento de onda de 625 nm, espectrofotômetro Hitachi U-2000.

60

Para a contagem das células utilizou-se um hemocitômetro (câmara de

Neubauer) - que possui duas redes quadriculadas, permitindo a contagem de duas

amostras na mesma lâmina. Cada rede é formada por 9 quadrados grandes (separados

por traços), os quais, por sua vez, estão subdivididos em 16 quadrados menores. O

volume de cada quadrado grande é igual a 10-4 mL. Contou-se todas as células do

quadrado grande central (16 quadrados menores) com aumento 100x. Se o número de

células ficasse entre 100 e 200, bastava contar 1 quadrado grande. O cálculo da

concentração de células na suspensão é dado por numero de células contadas x 104 e

igual a número de células/mL. Se o número de células em cada quadrado grande for

menor que 100 contar dois ou mais quadrados dependendo do número de células. Neste

caso a concentração será dada por número de células contadas x 104 dividido entre o

numero de quadrados grandes contados que e igual número de células/mL.

3.4.- Métodos analíticos

3.4.1.- Determinação da concentração de

fosfati-dilcolina e dihexadecilfosfato por dosagem de

f6sforo inorgânico

O método da dosagem de fósforo inorgânico (ROUSER et aI., 1970) se aplica

tanto ao PC quanto ao DHP. Neste método alíquotas da solução problema (50, 75 e 100

~L) e da solução padrão (O, 10, 30, 50, 70, 90 e 100 ~L) são colocados em tubos de

ensaio reservados para dosagem de fosfato e então secos em estufa (~l00 0c). Em

seguida, são adicionados 0.3 mL de ácido perclórico concentrado aos tubos secos, sendo

então colocados em um banho na capela, a 180°C por 4 horas, com os tubos tampados.

Depois disso, espera-se esfriar e adiciona-se 1 mL de água pura e 0.4 mL de

molibdato de amônio, agitando-se em seguida. Após isso, adiciona-se em cada tubo 0.4

mL de ácido ascórbico e agita-se novamente. Em seguida, os tubos são colocados em

banho de água fervente, fechados, por 5 minutos, e depois disso a absorbância é lida a

795-797 nm contra o ponto zero da curva padrão.

61

A partir dos valores obtidos de absorbância é feito um ajuste linear no qual é

possível se determinar o valor de concentração da solução analisada como mostrado na

Tabela 3A.1.1.

Tabela 3.4.1.1.- Curva padrão de fosfato

Fosfato de sódio Absorbância

(nrnolar) (795 nrn)

O O

10 0.177

30 0.356

50 0.627

70 0.845

90 1.060

100 1.184

Na Tabela 3A.1.l, apresentadas as concentrações de fosfato e as respectivas

leituras espectrofotométricas para a construção da curva padrão de fosfato da Figura

3A.1.1.

Neste caso, através da curva padrão de fosfato, obteve-se a equação da reta y = 0.00565

+ 0.01186 x, onde.

x = teor de fosfato (nmolar)

y = leitura de absorbância na amostra

1.2 T,----------------ni.'

..0'

ê 0.9

=In0\r--:;- 0.6....=(~

,Qlooo.c 0.3-<

..0"

.c/

,/0'

o·'/

~~,/' Y:::A+B"X

Parlllmeter Vlllue Error

0.00565 0.010170.01186 0.00017

50 N

0.99951 0.01568 7 <0.0001

o f' I I , I20 40 60 80 100

Concentração de fosfato (nrnoles)

Figura 3.4.1.1 Curva padrão de fosfato.

62

3.4.2.-

3.4.3.-

Determinação da concentração de

brometo de dioctadecildimetilamônio por microtitulação

Este método é empregado quando as dispersões estão em água, e consiste em

uma microtitulação da solução em estudo com o titulante nitrato de mercúrio

[Hg(N03)2] 10 mM utilizando-se como indicador a difenilcarbazona (SCHALES;

SCHALES, 1941), tendo-se o cuidado de adicionar etanol absoluto à dispersão para

garantir a solubilização das moléculas de DODAB que compõem a bicamada.

[DODAB] = 2x[(HgN03)2]X~HgNOJ), Eq.3.4.2.1

VCDODAB)

Onde, [(HgN03)2] = Concentração (M)

V = Volume (L)

(limite de detecção na ordem de micromoles).

Determinação da concentração de

brometo de dioctadecildimetilamônio pelo método de Brij

Este método é empregado quando o DODAB esta disperso em uma solução

aquosa salina de KCl ou tampão Tris que contém algum haleto como cloreto, brometo

ou iodeto, os quais poderiam interferir com a determinação do brometo, contraíon do

anfifilico DODAB (STELMO et aI 1987). O método baseia-se na formação de

complexos estáveis entre o Orange G e íones de DODAB que podem ser solubilizados

em soluções aquosa contendo micelas neutras de Brij 35. As variações na absorbância,

devido à formação do complexo na presença de Brij 35, foram usadas por STELMO et

aI. Para desenvolver este método para análise quantitativa de anfifilico de cadeia longa

de alqui1amônios, baseou-se na diminuição de leituras de absorbância do complexo

colorido ao interagir com as micelas de Brij. A solução de Brij foi preparada da seguinte

maneIra:

• 0.0271 g de orange G,

• 0.0718 g de Brij 35,

63

• 5.844 g de NaCl,

• e 1 litro água Milli-Q; agitação até solubilização total.

ü método de Brij consiste na obtenção da curva padrão de DüDAB através de

uma dispersão já padronizada do mesmo anfifilico, assim, para uma dispersão de

DüDAB 2mM, foram tomadas alíquotas de O a 100 p,L, variando de lOuL cada ponto.

Da amostra a ser analisada, foram tomadas três alíquotas de 100 f.lL. Foram adicionados

2 mL da solução de Brij em cada alíquota de padrão ou amostra e foram deixados em

banho-maria a 50°C por 30 minutos. Depois, foram transferidos para banho-maria a 37

°C e, após estabilização da temperatura, os padrões e as amostras que interagiram com a

solução de Brij, foram submetidas às leituras de absorbância a 480 nm no

espectrofotômetro CIBA-CüRNING 2800, com o controle de temperatura a 37°C para

este experimento. Como branco, foi utilizada a solução de NaCI 0.1 M.

A seguir mostramos um exemplo do doseamento de fosfato pelo método de Brij

Tabela 3.4.3.1.- Leituras e correção de leituras de absorbância pelo método de Brij para curva padrão de

DüDAB.

DODAR ABS480 ABSCORRlGIDA MBS [DODAR] mM

padrão (J..lL)

10 1.077 1.082 0.011 0.008

20 1.060 1.071 0.022 0.016

30 1.036 1.052 0.041 0.024

40 1.019 1.039 0.054 0.031

50 0.996 1.021 0.072 0.039

60 0.978 1.007 0.086 0.047

70 0.957 0.990 0.103 0.054

80 0.936 0.973 0.120 0.062

90 0.914 0.955 0.138 0.069

100 0.891 0.936 0.157 0.076

64

<0.0001

P

0.001060.01201

N

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0.07

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0.02

0.01

0.160.140.120.100.080.060.040.020.00 ~ i I I I I I i I i I i I i I i I I

0.00

[OOOAB]mM

Figura 3.4.3.1 Curva padrão de DODAB obtida pelo método de Brij

Pela interpolação na curva padrão ou pela equação da reta foram retirados os

parâmetros A e B, com os quais, foi obtida a concentração no sobrenadante.

Onde:

ABSCORRlG =ABS (V + 2000)iDA 480

V

Eq.3.4.3.l

MBS = ABSBRANCO - ABSCOÚIGIDA Eq.3.4.3.2

Da equação da reta da curva padrão, foi obtida a concentração em cada tubo (YJ -

[DODAB]mM)

7]=Y-A

B

Eq.3.4.3.3

Tabela 3.3.4.2.- Doseamento da dispersão de DODAB obtidas por sonicação com tip em presença de C.

albicans, para um tempo de interação de uma hora ver tabela 3.3.4.3. Leituras e correção de leituras de

absorbância pelo método de Brij.

65

N° doV deABS ABS (ABS CDODAB Conc_tubo COOOAB noCOOOAB N° deN° de

tubo DODAB(480nm) corrigida BR. -adicionado(mM) s.obre. adsorvidamoléculas moléculas

(llL) AbscOR)(mM) (mM) adsorvidas Icélulas.

100 1.028 1.079 0.014 0.480 0.Ql O 0.212 0.268 1.61E+17 5.38E+08

100 1.029 1.080 0.013 0.480 0.010 0.201 0.279 1.68E+17 5.60E+08

100 1.031 1.083 0.Ql0 0.480 0.009 0.180 0.300 1.81E+17 6.02E+08

2 100 1.030 1.082 0.011 0.528 0.009 0.191 0.337 2.03E+17 6.77E+08

2 100 1.023 1.074 0.019 0.528 0.013 0.265 0.263 1.58E+17 5.28E+08

2 100 1.018 1.069 0.024 0.528 0.015 0.318 0.210 1.26E+17 4.22E+08

C n Eg.3.4.3.4SOBRENADANrE = TUBO

VAMOSTRA (mL)

onde: VAMOSTRA = volume da amostra (100 ,uL), nTUBO = [DODAB]mM,

CADSORVJDA =CADlCfONADA - CSOBRENADANrE

NADSORVJDAS =60.22xl023

XCADSORVJDAXVMfSTURA(L)

N ADSORBJDAS = número de moléculas adsorvidas

Eg. 3.4.3.5

Eg.3.4.3.6

N= N ADSORVJDAS

Eg. 3.4.3.7 1

ADSORBJDAYcCELULA 7:- celulas tubo

CI~ =C2V2 = [DODAB]PADRÃOXVDODABPADRÃo/V2 Eg.3.4.3.8

Onde C 2 e (DODAB] adicionado em cada eppendorf em mM. 2000,uL e volume de

Brij, V volume de DODAB padrão em ,uL V2 = (Brij + VDODAB PADRÃO), UFC = Unidade

formadora de colônias.

66

Tabela 3.4.3.3.- Interação de células de C. albicans e dispersões de DODAB feitas por sonicação com

tipo Tempo de interação Ih.

N° de tubos V DODAB (rnL) Células (rnL) Água (rnL)

0.03 0.50 0.47

2 0.06 0.50 0.44

3 0.09 0.50 0.41

4 0.12 0.50 0.38 B1BLIOTE.CA5 0.15 0.50 0.35 INSilnJTO DE QUIMICA

6 0.18 0.50 0.32Universidade de Sáo Paulo

7 0.21 0.50 0.29

8 0.24 0.50 0.26

9 0.27 0.50 0.23

10 0.30 0.50 0.20

1I 0.33 0.50 0.17

12 0.36 0.50 0.14

13 0.39 0.50 0.11

14 0.42 0.50 0.08

15 0.45 0.50 0.05

16 0.48 0.50 0.02

17 0.50 0.50 0.00

3.5.-

partículas

Determinação de tamanho e potencial-zeta das

As medidas de tamanho, Dz, e potencial-zeta, r , foram feitas com um -Zeta

Potencial Analyzer (BROOKHAVEN INSTRUMENTS CORP., HOLTSVILLE,NY),

equipado com um laser estado sólido de 630 nm e ângulo de detecção de 90 0.

Para as medidas das distribuições de tamanho das vesículas, fragmentos de

membranas e das formulações, PC/miconazol, DHP/miconazol, DODAB/miconazol, e

miconazol, foram adicionados 2 mL de cada preparação descrita no item 3.3.1 ao 3.3.5,

em cubetas de poliestireno. As leituras foram feitas à 25°C no caso das vesículas,

fragmentos de membrana e formulação mantida em interação à temperatura ambiente,

sempre observando se os parâmetros do aparelho estavam dentro do recomendado pelo

fabricante.

Devido à insolubilidade do miconazol em água, há ocorrência de agregados, isto

é, grânulos ou partículas insolúveis, tomando possível a medida de tamanho de seus

67

agregados. Foram adicionados a 2,7 mL de água, 0.3 mL de miconazol em metanol 96

%.

Para as medidas de potencial-zeta para as vesículas, fragmentos de membranas,

formulações, PC/miconazol, DHP/miconazol, DODAB/miconazol e miconazol em

água, foram adicionados 2 mL de cada preparação descrita no item 3.3.1 ao 3.3.5, em

cubetas de poliestireno. As leituras foram feitas à 25°C, sempre observando se os

parâmetros do aparelho estavam dentro do recomendado pelo fabricante.

3.6.- Determinação de isoterma de adsorção de

brometo de dioctadecildimetilamônio sobre células de C.

albicans

A interação entre vesículas e C. albicans foi induzida pela adição de vesículas às

células e vortexadas por alguns minutos em eppendorf fechados. Em seguida deixar

interagir por uma hora à temperatura ambiente, logo depois centrifugar por 30 minutos a

5000 rpm e 4 cC em uma centrifuga Eppendorf 5402, retirar o sobrenadante com ajuda

de uma micropipeta sem remover o pelet, analisá-lo pelo método de colorimetria (Brij).

As misturas de células e vesículas de 1 ou 2 mL continham 0.5 mL de células y volumes

crescentes de vesículas 0.03 a 0.5 mL.

Os resultados foram expressos como o número de moléculas de DüDAB

adsorvida por célula de Candida albicans em função do numero de células.

Como as isotermas seguem o modelo de Langmuir, estas foram linearizadas

utilizando a seguinte equação:

c

xlm

c 1---+----(xl m)máx k(xl m)máx

Eq.3.6.1

onde x/m é o número de moles de anfifílico adsorvidos, c é a concentração de anfifílico

no sobrenadante e k é a constante de afinidade entre o anfifílico e a célula.

A partir do gráfico de _c_ versus c podemos obter a adsorção máximaxlm

(x/m)max pelo coeficiente angular e a constante de afinidade k pelo coeficiente linear da

reta obtida.

68

3.7.- Determinação de adsorção de brometo de

dioctadecildimetilamônio sobre C. albicans

As vesículas de DODAB foram preparadas por sonicação com tip, e por

agitação, para depois serem medidas com o ZetaPlus para a determinação de tamanho

dos lipossomos e dosadas por microtitulação; tomou-se 1.00 mL das dispersões de

DODAB para misturá-la com volumes crescentes de fungo (0.1 a 1 ml) de concentração

de células 2.0xl08 e completadas com água Milli-Q estéril até 2 mL, volume final das

mistura no epperdorf. Em seguida deixar interagir por uma hora à temperatura ambiente,

logo depois centrifugar por 30 minutos a 5,000 rpm e 4 °C em uma centrifuga

Eppendorf 5402, retirar o sobrenadante com ajuda de uma micropipeta sem remover o

pelet, analisá-lo pelo método de colorimetria (Brij).

3.8.- Determinação da mobilidade eletroforética

Um aparelho Mark II/ Rank Brothers (CAMBRIDGE, ENGLAND), para

microeletroforese de partículas com configuração para cela chata foi utilizado, para

determinação da mobilidade eletroforética das células.

Foi registrado o tempo que um fungo leva para atravessar uma distância

conhecida, em um campo, à temperatura media de 25°C. A amostra foi colocada na

célula de eletroforese, os eletrodos da platina foram conectados e aplicou-se uma

diferença de potencial de ± 60 V. Para cada célula, a velocidade eletroforética foi

medida nos dois sentidos, tanto para + 60 V, quanto para - 60 V. A média das

velocidades eletroforética foi calculada para pelo menos 20 células de cada amostra e,

depois, aplicada na fórmula a seguir:

ME=(_I) di'lV x t

Onde:

I = distância intereletrodos (6.606cm)

d= distância percorrida pela partícula monitorada (120 ~m)

t = tempo gasto pela partícula para percorres "d "

tlV= ± 60V

Eq.3.8.l

69

Para as leituras, foi utilizado o equipamento de Rank Brothers Mark li

(Microelectroforesis Apparatus) aplicando voltagens de -60 ou +60 V sucessivamente

para cada partícula, à temperatura de 25°C e no nível estacionário (NE) determinado

pela seguinte formula:

NE = (d x 1,333 x 0,194) + di l

Onde:

NE = posição do nível estacionário

d = distancia entre as paredes internas da cela do aparelho (em)

di I = posição da Ira parede interna

1,333 = índice de refração do sistema

0,194 = constante da cela chata

Eg.3.8.2

Para cada mistura, a velocidade eletroforética foi determinada para, pelo menos

20 partículas e determinada uma media para 15 melhores medições e mobilidade

eletroforética (ME) calculada segundo a equação 3.8.1.

Tabela 3.8.1.- Exemplo de cálculo de mobilidade eletroforética (ME) para uma densidade de células 1

x 106 células /mL e uma concentração de 0,05 mM de DODAB'na mistura para percurso de 60 Jlm e

aplicação de ±60 V de diferença de potencial.

N° de

partículas te td lIte lItd medía lIt ME (em. J.lm. V·I.S·I)

7.21 7.18 0.1387 0.1393

2 4.81 4.92 0.2079 0.2033

3 5.26 5.36 0.1901 0.1866

4 7.29 7.31 0.1372 0.1368

5 6.23 6.31 0.1605 0.1585

6 5.48 5.55 0.1825 0.1802

7 7.03 7.11 0.1422 0.1406

8 7.24 7.31 0.1381 0.1368

lO 5.04 5.12 0.1984 0.1953

11 6.91 6.89 0.1447 0.1451

12 6.21 6.39 0.1610 0.1565

13 4.33 4.44 0.2309 0.2252

14 6.55 6.48 0.1527 0.1543

15 5.16 5.21 0.1938 0.1919

0.1699 0.1679 0.1689 2.232

te~ Tempo para a vesícula percorrer 60 Jlm ao aplicar +60 V

td = Tempo para a vesícula percorrer 60 Jlm ao aplicar -60 V

70

Tabela 3.8.1 apresenta um exemplo de calculo de mobilidade eletroforética

(ME). Na primeira etapa, foram medidos os tempos da cada partícula para percorrer a

distancia de 60 Ilm ao aplicar o potencial de ± 60 V. Quando a polaridade das cargas

dos eletrodos era trocada, a direção de movimento mudava conforme a localização do

eletrodo negativo, isto é, as partículas estavam carregadas positivamente e se moviam

para o sentido do eletrodo carregado negativamente.

Na segunda etapa, foram obtidas as velocidades, ou seja, o inverso dos tempos.

Em seguida, foram calculadas as medias das velocidades, Cada valor de velocidade foi

aplicado na equação 3.8.1 para obtenção dos valores de ME. E finalmente, a ME para

cada partícula a resultante da media destes dois valores de ME.

71

4.- RESULTADOS E DISCUSSÃO

BIBLIOTECAINSTiTUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paul.

Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de bicamada catiônico

(DODAB)

4.1.- Características das dispersões de Iípides:

Na Tabela 4.1.1, pode-se observar características das dispersões lipídicas

dependentes do método de dispersão. Foram determinados tamanho e o potencial zeta

para cada uma das preparações a serem avaliadas como possíveis candidatas à

solubilização e/ou estabilização coloidal para o miconazoI.

Tabela 4.1.1.- Diâmetro médio (D) e potencial zeta (C;) para dispersões de Iípides em água pura a 25 o

C. õ é desvio padrão médio.

Conceotração/lipide Método de dispersão D±õ ç±õ Tipo de bicamada

[mM] (om) (mV)

DODAB/l,34 Injeção etanólica <10 27 ± 1 Aberta (fragmento)

DODAB/l,30 Sonicação com tip 107 ± 1 41 ± 2 Aberta (fragmento)

DODABII,OS Injeção c\orofórmica 492±6 68± 3 Fechada (vesícula)

PC/O,84 Injeção etanólica 61 ± 1 O Fechada (vesícula)

DHPII,20 Sonicação com tip 153 ± -67±4 Aberta (fragmento)

Fragmentos de bicamada de DODAB e DHP podem ser gerados pelo método de

sonicação com tip (Figura 4.1.1). Evidências experimentais que comprovaram a

existência destas estruturas estão na ausência do compartimento aquoso (ausência de

resposta osmótica da dispersão diante de gradientes de concentração de substâncias que

não permeiam a bicamada) (CARMONA-RIBEIRO & CHAIMOVICH, 1983;

CARMONA-RIBEIRO et aI., 1984), microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

(CARMONA-RIBEIRO et aI., 1991), crio-TEM (HAMMARSTRÓM et aI., 1995),

espalhamento de luz quase elástico (QELS) e espectroscopia de ressonância

paramagnética eletrônica (EPR) (PANSU, et aI., 1990; FEITOSA & BROWN, 1997);

solubilização de anfotericina B em dispersões com fragmentos e ausência de

solubilização em vesículas integras do mesmo material lipídico (VIEIRA &

CARMONA-RIBEIRO, 2001). Possivelmente, fragmentos de bicamada de DODAB

72

também podem ser gerados pelo método de injeção etanólica. O fato de considerar que

o método de injeção etanólica produz fragmentos de bicamada de DODAB se deve à

solubilização de anfotericina B nessas dispersões obtidas por injeção etanólica (VIEIRA

& CARMONA-RIBEIRO, 2001). Outra evidência se deve à possível restrição

geométrica de raio de curvatura para a formação de agregados tão pequenos quanto

aqueles obtidos por injeção etanólica (menores do que 10 nm de diâmetro médio)

(Tabela 4.1.1).

Vesículas fechadas de DHP podem ser fom1adas pelo método de injeção

c1orofórmica (CARMONA-RIBEIRO et aI., J 984) e vesículas fechadas de PC, por

injeção etanólica (BATZRI & KORN, 1973; KREMER et aI., 1977). Os valores médios

de diâmetro (D) e ç para as diferentes dispersões são mostrados na Tabela 4.1.1. Os

valores de potencial ç foram determinados por medidas de mobilidade eletroforética J..l. e

equação de Smoluchowski ç = J..l.T]/ê, onde T] é a viscosidade e ê é a constante dielétrica

do meio.

b

. Cabeça polar

\Caudahidrocarbônica

Figura 4.1.1.- Micrografia crio-TEM (Hammarstrom, 1995) em (a) de DHP sonicado a 80°C em

solução aquosa. No mesmo sistema, o caráter de fragmentos de bicamada obtidos por sonicação com tip

foi identificado e caracterizado pela primeira vez por Carmona-Ribeiro et aI., 1991. Observa-se

fragmentos de bicamada vistas de forma lateral "edge-on" (I), frontal "face-on" (2) e em conjunto com

estruturas maiores e irregulares (3). (b) Esquema ilustrativo do fragmento de bicamada, a barra em (a)

representa 100 nm.

73

4.2.- So/ubiJização de miconazo/ em dispersões de

lípides por espectroscopia de UV-Visíve/

A Figura 4.2.1 mostra espectros ópticos de absorção de luz para o miconazol em

metanol que é seu melhor solvente e permite obter a droga em sua forma monomérica

ou em presença de DODAB disperso pelos métodos de sonicação com tip e injeção

etanólica (Figura 4.2.1 B e 4.2.1 C). Observando-se estes espectros, vemos que estes

apresentam espectros ópticos muito similares aos obtidos pela solubilização da droga

em metanol (Figura 4.2.1 A).

D

320

FP C disperso porinjeçãoeianólica

B

A

Jl.>letanol

2.80 320 240 280

Comprimento de onda. (nm)

o 240

1

.~

(~-eol;'l

~llid~~- i llili~ I

Figura 4.2.1.- Espectros ópticos do miconazol nas seguintes concentrações a 25°C: 0.1 (a), 0.2 (b), 0.3

(c), 0.4 (d) e O.5mg/mL MCZ (e). a miconazol foi disperso em metanol (A), DaDAB 1,34mM, (B),

DaDAB 1,30mM, (C), em água (D), DaDAB 1,08 mM, (E), e PC 0,84mM, (F). a método de dispersão

de DaDAB está indicado na figura. Como branco foram utilizadas as dispersões correspondentes dos

anfifilicos.

No entanto, espectros ópticos de miconazol em presença de vesículas grandes de

DODAB obtidas por injeção clorofórmica (Figura 4.2.1E) apresentaram espectros

similares aos obtidos para a droga em água, devido à tendência que droga possui em

formar agregados (Figura 4.2.1D). Por outro lado, pode-se observar que vesículas

fechadas de lípides zwitteriânicos como PC que estão formando bicamadas no estado

líquido-cristalino, mais fluidas, solubilizam um pouco mais a droga que as vesículas

74

grandes de DODAB, possivelmente, devido ao estado físico tipo gel das bicamadas de

DODAB à temperatura ambiente (comparar Fig. 4.2.lE e F).

Em água, o aparecimento de agregados de droga, isto é partículas ou grânulos

insolúveis, geram um espectro composto decorrente da superposição de dois espectros:

o espectro de espalhamento de luz devido à presença de particulado de droga e o

espectro de absorção de luz com seus picos característicos. Os dois fenômenos

contribuíram para o espectro composto obtido (Figura 4.2.1 D, E, F). Comparando-se os

espectros ópticos para a droga em água (Figura 4.2.lD), em seu melhor solvente (Figura

4.2.1 A) ou em diferentes dispersões de lípides (Figuras 4.2.1: B, C, E, e F) nota-se

claramente que a melhor solubilização ocorreu em Fig. 4.2.1 B e C, que corresponderam

a dispersões lipídicas em forma de fragmentos de bicamada. Possivelmente, espaços ou

bordas hidrofóbicas nos fragmentos ofereceu sítios adicionais para solubilização da

droga. A natureza hidrofóbica do miconazol desprotonado permitiria adesão da droga às

bordas hidrofóbicas dos fragmentos de bicamada, com a conseqüente estabilização dos

mesmos. Cálculos de absorptividade molar em 271 nm foram feitos apenas para

espectros da Figura 4.2.1 de caráter simples (não-composto) e assumindo-se que o

espectro derivou somente da absorção de luz sem qualquer contribuição do

espalhamento de luz, uma vez que não ocorreram grânulos insolúveis de droga. Abaixo,

os valores de absorptividade molar para miconazol em metano1 ou em fragmentos de

bicamada de DODAB revelam-se bastante próximos, fornecendo mais uma evidencia da

solubilização da droga nos fragmentos de bicamada.

4.3.- Absorptividade molar (8) do miconazol em

algumas dispersões lipídicas

Na Tabela 4.3.1 estão os valores calculados de absorptividade molar (8) das

dispersões lipídicas que produziram espectros ópticos semelhantes àqueles da droga

monomérica solubilizada em seu melhor solvente, o metano!. Alíquotas de 10-50 uL de

uma solução estoque de nitrato de miconazol 10 mg/mL em metanol (ca. 24 mM MCZ)

foram adicionados em 1 mL de água ou em dispersões de lípides. A droga em presença

de fragmentos de bicamada de DODAB feitos por sonicação com tip, ou por injeção

etanólica apresentou absorptividades molares em 271 nm próximas às da droga em

metano1(595 ± 61 M -lcm-1).

75

Anterionnente, em nosso grupo, mostrou-se solubilização

BIBLiOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUnly.ersidade de São Paulo

em dIspersões de

DüDAB ou DHP compostas por fragmentos de bicamada de uma outra droga de

importância clínica, a anfotericina B, AnB (VIEIRA & CARMüNA-RIBEIRü, 2001) ..

Estudos físico-químicos similares foram realizados para o MCZ através da obtenção de

espectros ópticos de espalhamento de luz e detenninações de distribuições de tamanho

por espalhamento dinâmico quase-elástico de luz (QELS).

Tabela 4.3.1.- Absorptividades molares (E) calculadas a partir do máximo de absorção de luz do

miconazol (À,máx) em dispersões de DODAB e PC em água pura ou em CH30H.

Meio de Método de Comprimento de onda para À,Max. E±Õ

solubilização dispersão absorbâncias máximas (nm) (om) (M'I em'l)

À,I ~ À,3

Água milli-Q 264 271 278 271

CH30H 264 271 278 271 595 ± 61

DODABIl,30mM Sonicação com tip 264 271 278 271 531 ± 75

DODABIl,34mM Injeção etanólica 264 271 278 271 455 ± 44

DODABIl,08mM Injeção c1orofórmica 264 271 278 271

PC/O,84mM Injeção etanólica 264 271 278 271

4.4.- So/ubilização de miconazo/ em dispersões de

brometo de dioctadecildimetilamônio ou de fosfatidilcolina

A Figura 4.4.1 mostra as distribuições de tamanho para a droga (Figura 4.4.1 A),

dispersões de lipídeos (Figura 4.4.1B e 4.4.1D) e droga adicionada às dispersões

lipídicas (Figura 4.4.1 C e 4.4.1E). Vesículas de PC foram dispersas em água pelo

método de injeção etanólica e fragmentos de DüDAB foram obtidos pelo método de

sonicação com tipo ü efeito da adição da droga nas dispersões lipídicas foi o notável

desaparecimento dos agregados grandes de MCZ que ocorrem em água pura.

76

A

Dl = 319mn

I

MCZ

•ri!\. itllRl

B

Dl = 93mll

I l~ PC1Q)

"C C('a

"C

iJM~VI D, • 104nm +t:Q) PC-t:

D

Dl = 107mn

E

Dl = 101nIn

5 50D (nm)'

500

Figura 4.4.1.- Distribuição de diâmetros (D) e diâmetros médios (D), das dispersões da droga, lipídio

ou droga/lipídeo em água pura a 25°C. (A) 0,4 mM de miconazo! em água; (B) 0,84 mM dispersões de

PC feito por injeção etanólica; (C) mistura de (A) + (B); (D) 1,30 mM dispersões de DODAB feito por

sonicação com tip; (E) mistura de (A) + (D).

A Figura 4.4.1 também apresenta o deslocamento da distribuição de tamanho

entre os limites de 280 - 500 nm (típicos dos agregados de drogas sozinho em água

pura) para os limites de 50 - 100 nm (típicos das dispersões de lipídeos sozinhos) como

mostrado na Fig 4.4.1 C e 4.4.1E. Estes resultados estão consistentes com os dados

espectrais para a droga em fragmentos de bicamada de DüDAB que indicaram sua

solubilização (Figura 4.2.1C). No entanto, espectros para droga em vesículas de PC, que

não mostraram ser tão eficiente para a solubilização de MCZ pelos espectros ópticos

(Figura 4.2.1. F), evidenciaram um comportamento similar aos fragmentos de DüDAB

quanto ao desaparecimento dos agregados grandes de MCZ, indicando uma certa

77

solubilização (Figura 4.4.1. C). No entanto, o diâmetro médio para o MCZ + PC (104

nm), foi maior que o diâmetro para vesículas de PC sozinha. Isto contrastou com a

redução do tamanho médio para MCZ + DODAB (101 nm) em comparação com

DODAB sozinho.

Devido à ocorrência de agregados da droga em água foi possível medir a

distribuição de tamanho da droga sozinha (Figura 4.4.1 A), dos fragmentos de

membrana de DODAB (Figura 4.4.1 D) e dos fragmentos de membrana com a adição da

droga (Figura 4.4.1 E). O efeito da adição dos fragmentos de membranas à solução

contendo a droga, causa o desaparecimento dos agregados desta. O diâmetro (D) e o

potencia1-zeta (n para todas as preparações estão indicados na Tabela 4.5.1 apresentada

adiante.

No estado liquido cristalino da bicamada do PC a temperatura ambiente

favoreceu a solubilização de MCZ até certo ponto, onde a droga dispersa em vesículas

de PC produziram espectros de espalhamento de luz similares aos da água (Figura 4.2.1

D) e não similares ao melhor solvente para a droga (Figura 4.2.1 A), o que sugere que a

droga se mantém agregada, possivelmente como pequenos agregados dentro da

bicamada de PC. Assim a intercalação de monômeros de MCZ entre as caudas

hidrocarbônicas da vesícula de PC não se mostra tão simples como se havia pensado

preliminarmente nas caudas hidrocarbônicas de qualquer lipídeo, que nem sempre são

bons candidatos para solubilizar drogas hidrofóbicas. O MCZ é um bom exemplo da

competência para ocupar sítios hidrofóbicos, como os oferecidos pelas bicamadas do

PC. Como já relatado na literatura, as drogas hidrofóbicas passariam a estar dentro da

bicamada não só como monômeros assim como também como agregados

(BRAJTBURG & BOLARD, 1996; SCHREIER et al., 2000). A Figura 4.4.1 A, B e C

confirmam a interpretação da solubilização de MCZ em bicamadas de PC,

possivelmente pela intercalação de monômeros entre as caudas da bicamada da vesícula

do Pc. O pequeno aumento do tamanho da mistura de PC + MCZ (11 nm) quando

comparado com a vesícula sozinha, podem explicar a inserção dos pequenos agregados

de droga.

Levando-se em consideração esta discussão feita até aqui, a solubilização de MCZ

obtida graças aos fragmentos de bicamada sintética, pode ser considerada importante

(Figura 4.4.1 E), não só pelo desaparecimento dos agregados de MCZ quando misturado

com a dispersão de DODAB (Figura 4.4.1 E), como também pela redução no tamanho

da mistura foi menos em 6 nm quando comparado com os fragmentos de bicamada

78

sozinhos. Analisando em conjunto os dados espectrais mostrados na Figura 4.2.1B e as

distribuições de tamanhos da Figura 4.4.1 E sugere-se que a solubilização da droga em

sua forma monomérica é dependente dos espaços hidrofóbicos disponíveis nas bordas

dos fragmentos de bicamada.

4.5.- Inserção de miconazol nas bicamadas vista por

determinações de diâmetro médio (DzJ e potencial zeta (ÇJ

Na Tabela 4.5.1 observa-se a diminuição dos tamanhos das dispersões da droga

quando estas são misturadas com vesículas fechadas de PC ou fragmentos de bicamada

de DODAB. A solubilização de miconazol em PC resultou em potencial ç de +20 mY.

Assim, a inserção de MCZ em bicamadas de PC deve corresponder à forma protonada

(MCZ+).

O pK da droga é 6,5 (BEGGS, 1988; COPE, 1980). Em água, a pH 6,3, a droga

estará predominantemente em sua forma positivamente carregada. Pelos resultados da

Tabela 4.5.1, podemos afirmar que droga carregada positivamente msere-se em

vesículas fechadas de Pc. Não obstante, houve pouca solubilização do MCZ em

vesículas fechadas de DODAB. Uma possível explicação estaria no fato da fluidez da

bicamada facilitar a inserção de partículas de droga, pois bicamadas de PC encontram­

se no estado líquido-cristalino enquanto que as de DODAB estão no estado gel menos

fluido (maior rigidez da bicamada dificulta a inserção de droga desprotonada).

A solubilização da droga em fragmentos de bicamada de DODAB gera um

potencial ç igual a 20 mV que é menor do que aquele da droga sozinha +32 mV ou do

lipossomo sozinho +52 mY. Assim, a inserção da droga na bicamada de DODAB deve

corresponder à forma deprotonada do MCZ (MCZO). Nesta mesma tabela observa-se a

agregação espontânea da droga induzida por fragmento de bicamada de carga oposta

como DHP que foram monitorados por distribuições de tamanho e potencial ç .O aumento na distribuição do tamanho do agregado (MCZ + DHP) é devido às

interações eletrostáticas entre bicamadas de DHP aniânicas e agregados de miconazol

catiânicos (MCZ+). A adição de fragmentos aniânicos de bicamada de DHP induz à

agregação de droga. Nos agregados de (DHP + MCZ) é possível observar-se uma

mudança do potencial ç quando comparados com a dispersão do lipídio sozinho -67 mV

tomando-se um potencial positivo de + 18 mV.

79

Tabela 4.5.1.-Diâmetro médio (D) e potencial zeta (Ç) para dispersões de

lipídios catiânicos, aniânicos e zwitteriânicos, droga e droga/lipídio em água pura, pH

6,3 a 25°C.

Concentração de lipídio ou Método de dispersão D ±çdroga (mM)

ç±ô

MCZIO,48

DODAB/I,30

MCZIDODAB

PCIO,84

PC/MCZ

DHPIl,20

DHP/MCZ

CONCLUSÕES

Agua 334 ± 3

Sonicação com tip 107±1

102±1

Injeção etanólica 93 ± 1

104 ± 1

Sonicação com tip 154 ± 3

717± 13

32 ± 2

52 ± 6

20±2

O

20 ± 3

- 67 ± 5

18±4

Parte I: Estudo da solubilização

fragmentos de bicamada catiônico (DODAS)

de MCZ em

• Fragmentos de bicamada de DüDAB oferecem excelentes sítios para.

solubilização de uma droga hidrofóbica como o miconazo1.

• Solubilização de drogas hidrofóbicas em dispersões aquosas, lipídicas ou

não, pode ser monitorada por distribuições de tamanho

• Absorptividade molar da droga em dispersões de DODAB obtidas por

sonicação com tip ou por injeção etanólica é próxima àquela da droga em

metano1.

80

Parte lI: Estudo da solubilização e/ou estabilização coloidal do MCZ em fragmentos de

bicamada aniânica (DHP)

4.6.- Agregação ou estabilização de dispersões de

miconazo/ por bicamadas de DHP

A estratégia para induzir a formação de partículas de miconazol em água foi

adicionar água ao MCZ solubilizado em sua forma monomérica em seu melhor solvente

(metanol). Na ausência de qualquer lipídeo a pH 6.3, a formação de agregados de

miconazol em água foi praticamente instantânea, com tamanhos de agregados quase não

variáveis com o tempo sobre a primeira hora depois de adicionar água (Figura 4.6.1).

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L.,

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O

Tempo (min)

Figura 4.6.1.- Efeito de adição de fragmentos de bicamadas aniânicas sobre o diâmetro médio D (A),

de agregados da droga lmM, em presença de água Milli-Q (6), DHP (O) ou NaCl (o) O.OSmM, e a

turbidez 400nm (B), ante a água Milli-Q (-), DHP (---) ou NaCI (...). A cinética se inicia por adição de

SO~L de MCZ (20mM) em lmL de solução aquosa ou em lmL de dispersão de DHP.

A Figura 4.6.1 mostra o efeito de fragmentos de bicamada de DHP 0.05 mM sobre a

cinética de agregação de MCZ 1mM. O MCZ agrega espontaneamente em água ou em

81

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INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

NaCl 0.05 mM em pH 6.3. Os dados observados estão apresentados na Figura 4.2.1 e

Tabela 4.5.1. Observa-se maior agregação da droga induzida por DHP em água quando

comparados com os resultados obtidos na ausência de DHP (Figura 4.6.1). Em 1 mM de

droga, turbidez e diâmetro médio dos agregados do miconazol aumentam com o tempo

após adição de 0,05 mM de fragmentos de DHP previamente disperso por sonicação

com tipo

4.7.- Efeito de concentração de miconazoJ em pH 6,3

sobre sua agregação em dihexadecilfosfato de sódio 0,05 mM

Observou-se o efeito da concentração final de MCZ sobre a turbidez de

dispersões da droga induzida por adição de 0.05 mM de DHP (Figura 4.7.1). Nota-se

dois efeitos opostos na concentração de miconazol sobre a agregação da droga. O

primeiro efeito é o aumento na velocidade e extensão de agregação em função da

concentração do miconazol (0.05-0.3 mM) (Figura 4.7.1 A); e o segundo efeito é a

diminuição de velocidade e extensão de agregação em outra faixa de concentrações de

droga (0.4-1.0 mM) (Figura 4.7.1 B).

Os experimentos foram realizados em água pura, condição na qual encontram-se

duas formas de miconazol (MCzo/MCZ+), conforme mostrado na Figura 4.6.1.

Partículas de cargas opostas induzem a floculação do miconazo1. Este aumento na

floculação dos agregados MCZ+ induzida por partículas de DHP (0.05 mM) se deve

possivelmente a uma rápida agregação do MCZ+, com a conseqüente floculação dos

agregados de droga atraídos pelos fragmentos de bicamada (Figura 4.7.1 A). Entretanto,

um aumento da concentração da droga na faixa 0.4-1.0 mM, notas-se a estabilização

destes agregados. A possível explicação para este fenômeno é que os fragmentos de

bicamada de DHP estão estabilizando os agregados do MCZ+.

Possivelmente, acima dos valores maiores da concentração de droga (> 0.4 mM),

grandes agregados de MCZ com baixa proporção de superfície-volume foram formados,

para depois serem recobertos por uma pequena quantidade de fragmentos de bicamada

aniônica de DHP. Isto induz uma alta estabilidade coloidal dos agregados de droga com

a conseqüente diminuição da velocidade de agregação com o aumento da concentração

de MCZ (Figura 4.7.1B). Na Figura 4.7.2 tentou-se mostrar uma possível explicação

para a floculação induzida por DHP em baixa concentração de MCZ (Figura 4.7.1A) e

estabilização em alta concentração de MCZ (Figura 4.7.1 B), baseado sobre a alta e

82

baixa proporção superfície-volume para as partículas de droga, respectivamente. Uma

possível explicação para este fato seria que com o aumento da concentração de MCZ, o

tamanho dos agregados pode haver aumentado e como conseqüência a relação

superfície-volume dos agregados de droga diminuiu em presença de uma pequena

quantidade constante de DHP (Figura 4.7.1B).

0.45 A 0.30 ______..---­/'........-

0.30/

/0.25

--'-

----_._- ------

0.20_ j.---

0.4 ...............

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QQ~

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o 5

Tempo (mio)10

Figura 4.7.1.- Efeito da concentração de miconazol sobre a cinética de turbidez induzida por

fragmentos de bicamada de DHP 0,05 mM em água em função do tempo. Concentrações crescentes de

miconazo! (0,05- 1,0 mM) são mostradas para cada curva de floculação.

INTERAÇÃO ENTRE PARTÍCULAS DE DROGA HIDROFÓBICA E BICAMADAS

SINTÉTICAS DE CARGA OPOSTA EM DISPERSÃO.

A Figura 4.7.2 mostra um modelo que explica a floculação ou a estabilização

coloida1 dos agregados da droga em solução aquosa por fragmentos de bicamadas

aniânicas de DHP. Até um limite critico de concentração de MCZ, a velocidade de

agregação pode ser diminuída com o aumento da concentração do MCZ (Figura 4.7.1),

83

por exemplo, fragmentos de bicamada de DHP começaram a diminuir a velocidade de

agregação de MCZ (Figura 4.7.1B). No esquema abaixo mostrado, tenta-se explicar este

efeito em associação com a área total da superficie dos agregados da droga, permitindo

assim um recobrimento pelos fragmentos de bicamada de DHP com a conseqüente

estabilização coloidal. Está área seria maior para agregados de droga, menores que em

baixas concentrações de MCZ, que para agregados de droga maiores que ocorrem em

altas concentrações de MCZ.

FLOCULAÇÃO ESTABILIZAÇÃO

+ ++.+ +

+ +

+.++ ++

+++.++

+

+++0+

+

+ +- +-++

t

O,OSmMOHP

+.++++ +

+

+ +

+.++ +

+

+.++++ +

+

1

0,OS-0,3 mM

MCZ

0.4-1,0 mM

MCZ

Figura 4.7.2.- Esquema de interação entre miconazol e fragmentos de bicamada sintética aniânica de

DHP. A agregação ou estabilização coloidal de partículas de droga insolúvel depende da proporção entre

a densidade numérica de fragmentos de bicamada e partículas de droga.

4.8.- Efeitos de pH sobre o diâmetro médio (DzJ e

potencial zeta (Ç) de dispersões de droga, dihexadecilfosfato de

sódio ou dihexadecilfosfato de sódio e droga

Sabe-se que o pKa para o miconazol é igual a 6,5 (BEGGS, 1986,1992). Em

valores de pH abaixo de 7,3; encontram-se agregados de drogas positivamente

carregados (Figura 4.8.1 B). Só que a positividade da carga decresce com o aumento do

valor de pH, devido à diminuição da concentração de droga positivamente carregada

84

(MCZ), ou seja, aumento da concentração da droga desprotonada (MCZO). Com o

aumento da proporção de [MCZO]/[MCZ+], temos um aumento no diâmetro médio dos

agregados (Figura 4.8.1 A), que aumentam ainda mais de tamanho quando ocorre a

desprotonação total da droga, em valores de pH acima de 7,3. A agregação do MCZ em

água ocorre possivelmente devido à existência de interações hidrofóbicas geradas entre

moléculas de MCZo. Tem-se assim que uma maior estabilidade coloidal dos agregados

dependem da presença de miconazol positivamente carregado. Uma possível explicação

para a estabilização destes agregados de droga em água seria o rearranjo de MCZ+ sobre

os agregados do MCZo dando certa estabilidade aos agregados já formados.

Os fragmentos de DHP apresentaram carga negativa para todos os valores de pH

testados (Figura 4.8.1 B). No entanto, vemos um aumento nestes valores. Em pH 6,3, os

fragmentos apresentavam um potencial de -66,6 mV, aumentando seu valor para -31, 5

mV em pH 8,8(Tabela 4.8.1). Esta diminuição no tamanho pode ser explicada devido à

ocorrência de maior repulsão eletrostática entre as cabeças adjacentes com o aumento de

pH e conseqüente aumento da dissociação das cabeças polares dos fosfatos (pKa 5.8 ­

6.3) (CARMONA-RIBEIRO & HIX, 1991).

Quando se adicionou DHP 0,5 mM em uma solução aquosa contendo MCZ 1 mM,

observou-se uma maior estabilização coloidal dos agregados de droga (diminuição do

tamanho do agregado) para valores acima de pH 7,8; onde a droga já se encontrava

totalmente sem carga. Uma explicação possível se deve ao fato de que os agregados de

MCZ sozinhos são instáveis do ponto de vista da estabilidade coloidal. Porém, quando

se adicionou uma quantidade mínima de fragmentos de bicamada de DHP, os agregados

neutros de MCZ se tomam negativamente carregados e notavelmente estáveis,

apresentando-se em tamanhos menores que aqueles que tinham antes de se adicionar

DHP. Nota-se que fragmentos de DHP induzem à diminuição dos agregados de MCZ

em valores de pH fisiológicos (7.3-7.8). O potencial zeta negativo obtido para as

partículas de (MCZ-DHP) concorda com a hipótese de que existe um recobrimento de

bicamada sobre as partículas de droga em valores de pH acima de 7.

85

BIBLIOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

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o DHPMCZ

6. MCZ+ DHP

-100 I i I i I o I I I I6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

pU

Figura 4.8.1.- Efeito do pH sobre diâmetro médio e potencial zeta (Ç), dos agregados de MCZ (O),

dispersões de DHP (o) ou mistura de ambos (6), em Tris-HCl, IOmM, em diferentes valores de pHs,

com concentrações finais de 1 e O.OSmM de MCZ e DHP respectivamente.

A medida para as partículas de droga em ausência ou presença de 0,05 mM de

DHP para os distintos valores de pH testados são uma evidencia de que o tamanho e

potencial ç dos agregados do MCZ mudam significativamente em função ao pH (Figura

4.8.1 e Tabela 4.8.1). Os agregados de MCZ são menores abaixo de seu pK (120 nm em

pH 6.0) onde a forma de MCZ+ se encontra em maior número. Observa-se também que

há um aumento destes agregados em função do aumento de pH alcançando um máximo

de 750 nm acima de pH 7.5, onde a maior parte da droga encontra-se na forma MCZO.

Mais detalhadamente, a Tabela 4.8.1 mostra uma diminuição do tamanho dos

fragmentos de bicamada de DHP de 153 nm para 64 nm.

86

Tabela 4.8.1.- Diâmetro médio (D) e potenciais ç pra dispersões de DHP feitas por sonicação com tip

em tampão Tris-HCl 10 mM, em diferentes valores de pH, õ significa desvio padrão médio.

DHP MCZ MCL-DHPpH

D ± õ (nm) DZõ(rnV) D ± õ (nrn) ç± õ (rnV) D ± õ (nrn) ç± õ (rnV)

6.3 153,3 ± 2,8 -66,6 ± 4,4 269,7 ± 2,6 31,9±2,2 716,8 ± 12,9 18,2 ± 3,7

6.8 134,5 ± 2,2 -54,6 ± 3.4 369,7 ± 14,9 10,8 ± 1,8 1122 ±41,2 32,3 ± 2,6

7.3 80 ± 1,7 -48,5 ± 1,3 584,4 ± 39,8 5,1 ± 0,98 345,1 ± 3,2 -36,9 ± 0,6

7.8 72,5 ± 0,6 -37,9 ± 3,5 710,5 ± 11,6 O 478,8 ± 3,1 -44,6 ± 1,3

8.3 64,5 ± 1,0 -34, I ± 8,5 805,5 ± 57,5 O 477,7 ± 2,6 -44,3 ± 1,2

8.8 64,5 ± 0,4 -31,5 ± 8,8 710,5 ± 11,8 O 514,7 ± 5,1 -38,7 ± 1,7

4.9.- Efeito de concentração de dihexadecilfosfato

de sódio sobre a cinética de agregação da droga 0.2 mM, em

diferentes pHs.

o efeito da concentração de DHP sobre a turbidez de 0,2 mM dos agregados de

MCZ em três valores diferentes de pH está na Figura 4.9.1. A pH 6,3 observa-se que a

variação de velocidade e extensão das agregações registradas como turbidez a 400 nm

diminui com o aumento de concentrações de DHP (Figura 4.9.1 A). O mesmo efeito foi

também observado em pH 6,8 e 7,3 (Figura. 4.9.1 B e C). Um aspecto em comum para

os três valores de pH é a ausência de agregação a concentrações altas de DHP (0,25 ­

0,50mM).

87

BIBLiOTECAiNSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

B 0.010pH 6.8

~S

0.050

..Q..251l

0.500I

C0.025pH 7.3 -0.050-0.150--

0.250--

0.500i

105Tim e (m in.)

pH 6.3 A 0.025

~0.050

0.150

0.250

0.5

0.4

0.3

0.2

1.0

S=oo"!'N 0.5c.l

"'O:c...:=

E-<

0.01.0

0.5

Figura 4.9.1.- Turbidez a 400nm de agregados de droga em função ao tempo, depois da adição de

concentrações variáveis de vesículas de DHP (O.025-0.5mM), preparadas por sonicação com tip, em

tampão Tris-HCl IOmM, a pH 6.3, 6.8 e 7.3. A cinética se inicia por adição de IOI-lL de MCZ estoque

(20mM) a ImL de dispersões de DHP.

A invariância de turbidez de dispersões de droga e DHP em função do tempo

ocorreu em duas situações extremas: (i) baixa concentração de droga e alta

concentração de DHP (como nas cinéticas descritas nessa seção); (ii) alta concentração

de droga e baixa concentração de DHP (como na seção 4.7). A explicação para esses

dois grupos de resultados baseia-se respectivamente na solubilização da droga (baixa

proporções molares droga/lípide) e na estabilização coloidal de grânulos grandes da

droga por fragmentos de bicamada em quantidades mínimas (altas proporções molares

droga/lípide).

88

CONCLUSÕES

Parte 11: Estudo da solubilização e/ou estabilização

co/oidal do MCZ em fragmentos de bicamada aniânica (DHP)

Neste trabalho duas importantes conclusões são essenciais para a

formulação de drogas:

A solubilização de drogas esta restringida pela concentração dos fragmentos de

bicamada (O.25-0.5mM DHP).

A estabilização coloidal de partículas de drogas insolúveis podem ser

estabilizadas contra uma agregação posterior de pequenas quantidades de

fragmentos de bicamada com carga oposta (O.05mM DHP)

89

Parte UI: Aspectos fisico-químicos da interação entre anfifilicos catiônicos de DODAB

e células de C. albicans

4.10.- Interação entre bicamadas catiônicas e

células de Candida albicans.

Bicamadas catiônicas sintéticas têm recebido atenção crescente como potenciais

sistemas para de entrega de drogas, gene e vacinas devido à sua capacidade de interagir

com biomoléculas e estruturas biológicas de cargas opostas como, por exemplo, as

membranas celulares (CARMONA-RIBEIRO, 2003). DODAB é interessante quanto à

entrega de drogas a microorganismos devido à sua atividade antimicrobiana (TÁPIAS et

aI., 1994; SICCHIEROLLI, et aI., 1995; MARTINS et aI., 1997; CAMPANHÃ et aI.,

1999; CAMPANHÃ et aI., 2001). Além do mais, fragmentos de bicamadas de DODAB

solubilizaram drogas antifúngicas como a anfotericina B (VIEIRA & CARMONA­

RIBEIRO, 2001; CAMPANHÃ et aI., 2001; LINCOPAN et aI., 2003) e miconazol

(CAMPANHÃ et aI., 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003) e melhoraram

a estabilidade coloidal de particulados hidrofóbicos de drogas (VIEIRA & CARMONA­

RIBEIRO, 2001; LINCOPAN et aI., 2003) permitindo também uma terapia contra

infecções fúngicas in vivo (LINCOPAN et aI., 2003). Decorre daí o grande interesse em

se definir os fatores fisico-químicos que estão envolvidos na interação entre bicamadas

catiônicas de DODAB e células de C. albicans.

As bicamadas catiônicas usadas para estudos de interação com as células de C.

albicans foram fragmentos de bicamada (BF) e vesículas fechadas (LV) de DODAB. A

Tabela 4.10 mostra características de tamanho e potencial-zeta em água para as

dispersões utilizadas.

Tabela 4.10.- Diâmetro médio e potencial-Zeta para as dispersões de DODAB.

Concentração

(mM)

2.0

2.1

Método de dispersão

sonicação com tip

SNIPPE por aquecimento

Diâmetro±õ

(nm)

74 ± 1

S09±4

Potencial-Zeta ±õ

(mV)

41 ± 2

90

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

4.10.1.- Isoterma de adsorção de brometo de

dioctadecildimetilamônio em células de Candida albicans

fixa a concentração de células em 1()8 célulaslmL

A Figura 4.10.1 mostra uma isotenna de adsorção de DODAB obtida a partir de

DODAB BF sobre células de Candida albicans. Assemelha-se a isotenna do tipo de

Langmuir e demonstra ser de alta afinidade (adsorção não-reversível) com limite

máximo de adsorção obtido no platô da curva correspondente a 1.7 x 109 moléculas por

célula. Para fragmentos de bicamada (BF), observou-se uma maior adsorção sobre a

célula de Candida albicans quando comparada com as vesículas fechadas (LV), nas

quais observa-se uma típica isotenna de adsorção competitiva. Uma explicação para

este fato seria o surgimento de uma competição, acima de uma dada concentração, entre

as vesículas para se adsorverem na superfície celular ou fundirem-se ou agregarem-se

umas com as outras, já que o número de moléculas adsorvidas sobre a célula diminui

com o aumento da concentração de DüDAB.

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BF T

~ LV~

O 0.5 1.0Concentração de DODAB no sobrenadante (mM)

Figura 4.10.1.- Isoterma de adsorção de DODAB a partir de DODAB BF ou LV sobre I,OxIOs células/

mL de C. albicans em água pura a 25°C.

A diferença entre as isotennas de adsorção para BF ou LV possivelmente ocorre

porque no método de sonicação com tip, obtêm-se fragmentos de membrana possuem

sítios hidrofóbicos expostos e livres, que possivelmente não ocorrem em vesículas

91

fechadas tipo LV, podendo ligar-se a sítios hidrofóbicos das diversas espécies protéicas

que habitam a parede celular da célula de C. albicans.

Desde que é a superficie celular microbiana que fortemente determina o

processo de interação com as dispersões lipídicas, faz-se necessária a descrição da

organização típica da parede celular. A parede celular dos fungos é composta

basicamente de polissacarídeos, que podem encontrar-se como homo ou

heteropolímeros. Em alguns fungos, proteínas são também componentes significantes

da célula e freqüentemente estão associadas com alguns constituintes polissacarídeos

(CüPE, 1980). Lipídios e melaninas encontram-se em quantidades menores na parede

de muitos fungos, mais isso não diminui suas respectivas importâncias, como exemplo

da melanina, que confere resistência ao ataque e lise por enzimas e irradiações. Os

principais lipídios apoIares são os triacilgliceróis e os esteróis, e os polares são os

diacilglicerofosfocolinas e diacilgliceroctanolaminas (PEBERDY, 1990).

Um tipo de interação pode ser reconhecido entre os anfifilicos estudados e as

células de Candida albicans. Esta interação se dá possivelmente através de interações

eletrostáticas ou iônicas, já que a vesícula é carregada positivamente e a célula

negativamente (TÁPIAS et aI., 1994; REBülRAS, 1997). Fragmentos de bicamada com

tamanhos médios de 74 nm têm maior afinidade por C. albicans, explicada por

interações hidrofóbicas adicionais entre BF e a célula chegando a um máximo de

adsorção de 1.9xl09 moléculas/célula. Dispersões de DODAB feitas por vortexação,

com tamanho médio de 500 nm, têm menor valor de adsorção máxima pela C. albicans,

adsorvendo 9.5x108 moléculas/célula no pico de adsorção (Figura 4.10.1). Ainda, o

aumento da concentração de DODAB livre para as LV, favorece a desorção sugerindo

que a interação DüDAB-cé1ula é de caráter reversível e que a interação vesícula

adsorvida-vesícula livre pode competir com a interação vesícula-célula.

Para as isotermas que se caracterizaram como isotermas de adsorção com um

platô de adsorção máxima, foi possível obter parâmetros de adsorção como constantes

de afinidade (k) e adsorção máxima (x/m) máx através de linearização das isotermas.

A Tabela 4.10.1 mostra a linearização da isoterma obtida para DODAB BF e

mostrada na Figura 4.10.1.

92

BI8LIOTECA,

INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São P.wIQ

Tabela 4.10.1.- Linearização das curvas pelo plot da 5" coluna em função da 4" coluna.

Método de n ad,l célula Cone. DODAB no DODAB adsorvido DODABsobrelladallte

dispersão sobrenadante (moVcélula) /OODABAdsor\"ido

(moI/L) (célula/L)

2.67 x 109 1.4 X 10,5 4.43 x 10- 15 3.16x 109

2.94 x 109 2.2 X 10'5 4.88 X 10-15 4.51 X 109

3.01 X 109 2.5 X 10-5 5.00 X 10-15 5.00 X 109

3.06 X 109 2.7 X 10'5 5.08 X 10'15 5.31 X 109

sonicação com tip 3.08 x 109 3.0 X 10-5 5.12 X 10-15 5.86 X 109

3.14 X 109 3.2 X 10,5 5.22 X 10-15 6.13 X 109

3.15x 109 3.5 x 10-5 5.23 x 10-15 6.69x 109

3.20 x 109 3.8 X 10'5 5.32 X 10,15 7.14 X 109

3.24 X 109 4.0 X 10-5 5.38 X 10,15 7.43 x 109

Através da equação da reta (y = a + bx), por comparação com a equação (3.6.1

de método analíticos), temos que: x corresponde a c; a = intercepto = l/k(x/m)máx; y

correspondendo a c/(x/m) e b correspondendo a 1/(x/m)máx,

A Tabela 4.10.2 contém os coeficientes lineares (a) e coeficientes angulares (b),

para a linearização de DODAB sonicado.

Tabela 4.10.2.- Coeficiente linear (a) e angular (b) da reta obtida a partir da linearização da isoterma de

adsorção de BF sobre C. albicans (Figura 4.11.2).

Método de dispersão

sonicação com tip

Coeficiente linear (a)

8.55x101l

Coeficiente angular (b)

1.65 x 1014

A Tabela 4.10.3 contém uma comparação entre parâmetros de adsorção para as

isotermas de adsorção das de DODAB BF sobre algumas superficies-modelo, incluindo

sobre as células de Candida albicans.

Determinação de isotermas de adsorção de lipossomos sobre látex (CARMONA­

RIBEIRO.; MIDMORE, 1992) e bactéria (TÁPIAS, et aI., 1994), seguidas de

linearização para a obtenção dos parâmetros de adsorção foram realizadas. A ocorrência

de cargas opostas entre lipossomo-superficie pode dirigir para uma deposição na forma

de bicamada sobre a superfície. Um exemplo desta interação pode ser vista quando se

põe para interagir vesículas grandes ou pequenas de DODAB que são carregados

positivamente com a superfície negativa de partículas de poliestireno sulfato.

93

Entretanto, células de E. coZi que são carregadas negativamente, interagem com as

vesículas de modo que ocorre apenas uma mera adesão devido à complexidade e

rugosidade da parede da bactéria (MARTINS, et aI., 1997).

A Tabela 4.10.3 contém os parâmetros de adsorção para as isotermas de

adsorção das vesículas lipídicas sobre algumas superfícies-modelo, incluindo sobre as

células de Candida albicans.

Tabela 4.10.3.- Afinidades (k) e adsorção máxima (x/m)max para DüDAB a partir de diferentes

dispersões sobre superficies orgânicas ou biológicas. Modelos de superficies orgânicas sintéticas foram

partículas de látex (poliestireno sulfato, PS) de dois diferentes diâmetros, 100 e 277 nm, e para superfícies

de células de E. coli e Candida albicans.

Superfície Afinidade (x/m)Max Método de dispersão do DODAB

k(M-1) (l0- 17 moléculas.m-2

)

célula de C. albicans 19.2 x 104 606 sonicação com tip

célula de C. albicans 32.4 x 104 291 injeção etanólica

célula de C. albicans 3.5x 104 189 vaporização clorofórmica

célula de E. coZi 23.1 X 104 200 sonicação com tip

PSI00 35.6 x 104 36 sonicação com tip

PS277 2.6 x 104 43 vaporização clorofórmica

4.10.2.- Efeito da concentração de células

sobre a adsorção de DODAB

Na Figura 4.10.2 observa-se o efeito da adsorção de DODAB 1 mM sobre a

concentração de células de Candida albicans. Observou-se uma diminuição da adsorção

de DODAB em função da concentração de células tanto para BF quanto para LV.

Uma possível explicação para este fato seria que a suspensão de células está

possivelmente mais agregada à medida que se aumenta a densidade numérica de células

em suspensão, como mostra o Esquema 4.10.2 (B). Dessa forma, a agregação celular

diminuiria a área superficial total de células disponível para adsorção das bicamadas

catiônicas.

94

5

0\

o"'"""~ 4..-~-=-'aJ 3C.J-l:'l<~ 2O~

'""tO

'" 1:::'-"

BF

LV

o 246

(Número de células/mL) x 108

Figura 4.10.2. Efeito da densidade numérica de células sobre a adsorção de I mM de DODAB BF ou

LV. A interação célula-dispersão de DODAB ocorreu por uma ho~a antes de se centrifugar as misturas e

se dosar DODAB no sobrenadante.

A adsorção por célula é maior para a situação de maior área de interação

disponível: aquela em que as células estão menos agregadas na suspensão como

mostrado no Esquema 4.10.2 (A). Efeitos similares a este já foram observados para

bactérias de E. coli (TAPJAS, et a!., 1994) ou para outras dispersões lipídicas sobre C.

a/bicans (REBülRAS et a!., 1997).

o

n1

o

o

o

A

o

n2

Cf]

c§co

Cf)

B

08

Esquema 4.10.2.- Ilustração da agregação celular em função da densidade numérica de células menor

(A) ou maior (B). A área superficial por célula na situação (A) seria maior do que aquela em (B).

95

4.10.3.- Efeito da concentração de brometo de

dioctadecildimetilamônio sobre a mobilidade e/etroforética

das células

o efeito da concentração de DODAB sobre a mobilidade eletroforética das

células está na Figura 4.10.3. A Figura também mostra o efeito do tipo de dispersão de

DODAB, BF ou LV, sobre a mobilidade eletroforética das células de C. albicans de

concentração fixa lxl06 UFC/mL. Observa-se que neutralização da carga superficial da

célula ocorre em concentração mais baixa de BF que as de LV de DODAB. Convem

ressaltar que, quando as LV interagiam com as células e as mobilidades celulares foram

medidas em função do DODAB adicionado, não foi possível diluir as misturas de LV

com células sem modificar o equilíbrio de adsorção, então não foi possível eliminar o

aumento de mobilidade induzido pelo DODAB. O efeito da concentração de DODAB

na mobilidade e1etroforética da C. albicans foi parecido para BF e LV acima do regime

de baixas concentrações com algumas diferenças significativas ocorreram acima de 0.1

mM de DODAB: mobilidades foram maiores para as misturas com LV do que para

aquelas com BF.

6

4-~

rn

'>2

S 0- - --u

-3 1

- --

(.Ll - 2~o

;:;s-4

10°10-3 10-2 10-1

[DODAB]mM

-6 I10-4 ' , "''', """"1 """"1 """",'

Figura. 4.10.3.- Curvas de mobilidade eletroforética (ME) para Candida albicans (l x106 células/mL)

em função da concentração das dispersões de DODAB para fragmentos de bicamada (BF) ou vesículas

grandes (LV).

A fim de eliminar o efeito de concentração nas mobilidades das LV, a curva de

mobilidade eletroforética foi extrapolada a diluição infinita em ausência virtual de

96

interações intervesiculares. A mobilidade eletroforética aumentou em função da

concentração de DODAB para DODAB LV na ausência de células. A Figura 4.10.4

mostra mobilidades eletroforéticas para DODAB LV apenas, em ausência de células.

7

A ()LV sozinhas ~,

\..)r,..-.., .'

'J! 5 ,~ 5.0~~

>- h jB "8

3 bv

('; 00u ';, '

::L I 2.5'--' !~ L-'. ~. v~ iJ

1 " )

o 0.0125 0.0250

o 0.5 1.0

[DODAB]mM

Figura 4.10.4.- Efeito da concentração de DüDAB LV sobre a ME em água e em ausência de células

(A). Extrapolação a diluição infinita permitiu obtenção dos valores de mobilidade mostrados na Figura

4.10.3. (B).

No inserto (Figura 4.l0.4B), para uma faixa de baixas concentrações de

DODAB, as mobilidades aumentaram linearmente em função da concentração de

DODAB. Este efeito foi previamente explicado como devido à repulsões eletrostáticas

LVILV acelerando as mobilidades em uma densa população de vesículas grandes livres

(CARMONA-RIBEIRO & MIDMORE, 1992). A fim de eliminar este efeito de

concentração nas mobilidades das LV, conforme explicado, a curva de mobilidade

eletroforética foi extrapolada até uma concentração de DODAB de zero, uma situação

onde infinitas diluições iriam produzir a ausência de interações intervesiculares.

Entretanto, quando as LV interagiam com as células e as mobilidades celulares foram

medidas em função do DODAB adicionado, não foi possível diluir as misturas de LV

com células sem modificar o equilíbrio de adsorção, então não foi possível eliminar o

aumento de mobilidade induzido pelo DODAB. Portanto, nas misturas DODAB

LV/células (Figura 4.10.4 A), os maiores valores de mobilidade eletroforética para as

LV em comparação com BF acima do maior valor de concentração de DODAB

poderiam muito bem ser devidos a um aumento na concentração de LV livres. Os

maiores valores de mobilidade eletroforética para as LV em comparação com BF acima

do maior valor de concentração de DODAB poderiam muito bem ser devidos a um

97

aumento na concentração de LV livres. Deve-se relembrar da adsorção competitiva

obtida para LV (Figura 4.10.1); o LV livre possivelmente seqüestra o LV adsorvido nas

células e o que contribui para uma concentração maior de DODAB livre e, portanto, a

um aumento da mobilidade.

A porcentagem de vazamento dos conteúdos internos das células a 1 mM de

anfifilico é mostrada na Tabela 4.10.4. As porcentagens para anfifilicos de uma cadeia,

formadores de micelas ou de lipídios catiônicos de duas cadeias foram similares,

chegando a 4-10% depois de se desconsiderar o controle. Isso poderia ser compreendido

pela baixa concentração de anfifilico empregada, então 1 mM de CTAB ou SDS

induziram quase o mesmo vazamento que 1 mM de DODAB BF ou LV. Ao menos

esses resultados foram consistentes com as porcentagens de vazamento de 5-8%

previamente determinados para duas espécies de bactérias, E. coli e Staphylococcus

aureus, usando o mesmo método para a mesma concentração final de anfifilico para os

três anfifilicos utilizados (MARTINS et aI., 1997). De fato, grandes porcentagens de

vazamento como 50-60% foram obtidas previamente para os anfifilicos formadores de

micela somente acima dos limites de 4-10 mM de concentração de SDS ou CTAB, ou

seja, nas concentrações bem acima da concentração micelar crítica para cada surfactante

(MARTINS et aI., 1997). Basicamente, as células (106 células/mI) atingiam carga zero

acima do limite micromolar de DODAB, mas no caso de LV, a desorção de LV

interferiu com as medições de mobilidade eletroforética causando superestimações das

mobilidades das células. Em 1 mM de anfifilicos, nenhuma diferença significativa entre

o vazamento de células induzido por anfifilicos formadores de micelas ou de bicamadas

pode ser detectada não tendo ocorrido vazamento dos conteúdos intracelulares.

Tabela 4.10.4.- Efeito de ImM de anfifilico OOOAB LV ou BF, CfAB e SOS sobre a porcentagem de

vazamento do conteúdo interno de células de C. albicans 2x l08células /mL depois de Ih de interação.

Amostra

C. albicans (controle)

OOOAB + LV + C. albicans

OOOAB + BF + C. albicans

CfAB + C. albicans

SOS + C. albicans

Porcentagem de vazamento

4

12

14

14

8

98

CONCLUSÕES

Parte 11/: Aspectos físico-químicos da interação

entre anfifílicos catiônicos de DODAB e células de C. albicans

• Houve uma grande afinidade entre DüDAB BF ou LV e células de C. albicans;

entretanto, houve desorção de DüDAB LV com o aumentá da concentração de

DüDAB no sobrenadante, a desorção de LV ocorreu, ao passo que a adsorção

de BF alcançou um máximo. Esta diferença no comportamento foi

compreensível pelos menores tamanhos de BF e a maior interação hidrofóbica

com os componentes da superfície celular.

• ü efeito da elevação da concentração celular foi a diminuição da adsorção de

DüDAB possivelmente devido à redução da área superficial celular disponível

para a adsorção decorrente de agregação celular.

• Alta afinidade entre dispersões de DüDAB e células foi reconfirmada pelo

efeito da concentração de DüDAB na mobilidade eletroforética; células (106

células/ml) obtiveram carga zero acima do limite micromolar de concentrações

de DüDAB, mas no caso de LV, a desorção de LV interferiu com as medições

de mobilidade eletroforética, causando valores superestimados de mobilidade

eletroforética das células.

• A adsorção de DüDAB nas células de C. albicans foi parecida com a

previamente descrita para bactérias relativa à alta afinidade e a ausência de lise

celular.

99

BIBLIOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo

5.- PERSPECTIVAS

• Determinar a permeabilidade da membrana do fungo através de determinações

de vazamento de compostos fosforados, e viabilidade celular em presença dos

anfifilicos aniônicos ou catiônicos carreando miconazol, ou não, e do miconazol

sozinho.

• Determinar doses fungicidas mínimas para as formulações de miconazol/BF,

miconazollLv.• Determinação da transição de fase das vesículas fechadas em presença de

miconazol

• Determinar cinéticas de floculação de C. albicans induzida pelas vesículas.

• Testes in vivo em modelos de candidíase sistêmica desenvolvida em animais,

com as novas formulações de miconazol através de avaliação de sobrevida dos

animais e de recuperação de C. albicans em órgãos dos animais.

100

6.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências segundo a NBR 6023:2002 da ABNT.

AGRAWAL, S.; ZHANG, RPharmacokinetics of oligonucleotides. Ciba F. Symp., v.209,p. 60-75.1997.

AGRAWAL, S.; IYER, RP. Perspectives in antisense therapeutics. Pharmacol. Ther.,v. 76, p. 151-160. 1997.

ALLEN, T.M.; CULLIS P.R Drug delivery systems: Entering the mainstream .Sciencev. 303, n.5665, p. 1818-1822.2004

ARIKAN, S. et aI. In vitro susceptibility testing methods for caspofungin againstAspergillus and Fusarium isolates Antimicrob. Agents Ch., v. 45, n. 1, p. 327-330.2001.

ARIKAN, S.; REX, lH. Lipid-based antifungaI agents: Current status Curr. Pharm.Design, v.7, n.5, p. 393-415. 2001.

ALLENDE, M.C. et aI. Dose-dependent antifungaI activity and nephrotoxicity ofamphotericin B colloidal dispersion in experimental pulmonary asperigillosis.Antimicrob Agents Ch., v.38, p.518-522.1994.

AKHTAR, S.; KOLE, R; JULIANO, RL. Stability ofantisense DNAoligodexoxynucluotide analogs in cellular extracts and sera. Life Sei., v. 49, p. 1793­1801. 1991.

ANDREOLI, T.E. Anatomy of amphotericin-b-cholesterol pores in lipid bilayermembranes. Kidney Int., v. 4, n. 5, p. 337-345. 1973.

BAGATOLLI, L.A.; GRATTON, E. A correlation between lipid domain shape andbinary phospholipid mixture composition in free standing bilayers: A two-photonfluorescence microscopy study. Biophys. J., v. 79, n. 1, p. 434-447.2000.

BANGHAM, A.D.; STANDISH, M.M.; WATKINS, I.C. Diffusion ofunivalent ionsacross the lamellae of swollen phospholipids. J. MoI. BioI., v. 13, n. 1, p. 238-252.1965.

BATTEGAY, M.; FLUCKIGER, U. Therapy ofsevere fungaI infections Internist.,v.44, n.12, p. 1549-1556,2003.

BATZRI, S.; KORN, E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication.Biochim. Biophys. Acta, v. 298, n. 4, p. 1015-1019. 1973.

BEAULAC, c.; SACHETELLI, S.; LAGACE, l In-vitro bactericidal efficacy ofsub­MIC concentrations of liposome-encapsulated antibiotic against Gram-negative andGram-positive bacteria. J. Antimicrob. Chemother., v. 41, n. 1, p. 35-41. 1998.

101

BEGGS, W.H.; HUGHES, C.E. Role ofpH in the lethal direct cell damaging action ofmiconazole. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., v. 53, n. 3, p. 407-410. 1986.

BEGGS, W.H. Requirement for nonprotonated drug molecules in the direct lethal actionofmiconazole against Candida albicans. Mycopathologia, v. 103, n. 2, p. 91-94. 1988.

BEGGS, W.H. Influence of alkaline ph on the direct lethal action of miconazole againstCandida albicans. Mycopathologia, v. 120, n. 1, p. 11-13. 1992.

BEN-JOSEF, A.M.; et aI. In vitro antifungal activity ofCAN-296: a naturally occurringcomplex carbohydrate. J. Antibiot., v. 50, n. 11, p. 937-943. 1997.

BENSON, J.M.; NAHATA, M.C. ClinicaI use ofsystemic antifungal agents. Clin.Pharm., v. 7, n. 6, p. 424-438. 1988.

BEKERSKY, r. et aI. Lipid-based amphotericin B formulations: from animaIs to manoPharm. Sei. Technol. Today, v. 2, n. 6, p. 230-236. 1999.

BERNE, B.; PECORA, R. Dynamic light scattering with applications to chemistry,biology and physics. EVERETT, D.H. 1988.

BODEY, G.P. Azole antifungaI agents. CUn. Infect. Dis., Suppl.1, p. S161-S169. 1992.

BOLARD, J. et aI. One-sided action of amphotericin B on cholesterol-containingmembranes is determined by its self-association in the medium. Biochemistry, v. 30, n.23, p. 5707-5715. 1991.

BORGERS, M. Mechanism of action of antifungaI drugs, with special reference to theimidazole derivatives. Rev. Infect. Dis., V. 2, n. 4, p. 520-534. 1980.

BORGERS, M.; VANDENBOSSCHE, H. Structural and molecular action of azoleantifungal agents. Parasitology., v. 262, n. 1, p. 144-144. 1986.

BRAJTBURG, J.; BOLARD, J. Carrier effects on biological activity of amphotericin B.Clin. Microbiol. Rev., V. 9, n. 4, p. 512- &.1996.

BROOKHAVEN, INSTRUMENTS CORPORATION. Instruction Manual for BI­MAS Multi Angle Sizing Option on the ZetaPlus. Brookhaven Corporate park,Holtsville NY, USA. 1995.

BROOKHAVEN, INSTRUMENTS CORPORATION. Instruction for ZetaPlus ZetaPotential Analizer. Brookhaven Corporate park, Holtsville NY, USA. 1997.

CAMMAS, S.; KATAOKA, K. En: Solvents and Self-Organization ofPolymers;WEBBER, S.E.; MUNK, P.; TUZAR, Z.; E.D.S.; KLUWER Academic Publishers:Dordrecht, 1996, p. 83-113.

CAMPANHÃ, M.T.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, A.M. Interactionsbetween cationic liposomes and bacteria: the physical-chemistry of the bactericidalaction J. Lipid. Res., v. 40, n. 8, p. 1495-1500. 1999.

102

S I e l.. , o TE. c AINSTITUTO DE QUíMICAUntversidade de Sào Paulo

CAMPANHÃ, M.TN.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Interactionsbetween cationic vesicles and Candida albicans. J. Phys. Chem. B., v. 105, n. 34, p.8230-8236. 2001.

CARMONA-RIBEIRO, AM. et aI. Permeabi1ities and stabilities oflargedihexadecy1phosphate and dioctadecyldimethylammonium ch10ride vesicles. J. Colloid.Interf. Sei., v. 100, n. 2, p. 433-443. 1984.

CARMONA-RIBEIRO, AM.; HIX, S. pH effects on properties ofdihexadecy1phosphate vesicles. J. Phys. Chem-US, v. 95, n. 4, p. 1812-1817. 1991.

CARMONA-RIBEIRO, AM. et aI. Bilayer structure and stability indihexadecylphosphate dispersions. J. Phys. Chem- US, v. 95, n. 13, p. 5361-5366.1991.

CARMONA-RIBEIRO, A.M.; MIDMORE, B.R. Synthetic bilayer adsorption ontopolystyrene microspheres. Langmuir, v. 8, n. 3, p. 801-806. 1992.

CARMONA-RIBEIRO, A.M.; MIDMORE, B.R. Surface-potential in charged syntheticamphiphile vesicles. J. Phys Chem-US, v. 96, n. 8, p. 3542-3547. 1992.

CARMONA-RIBEIRO, AM.; HERRINGTON, T.M. Phospho1ipid adsorption ontopolystyrene microspheres J. Colloid. Interf. Sei., v. 156, n. 1, p. 19-23. 1993.

CARMONA-RIBEIRO, AM. et aI. Interactions between cationic vesicles and culturedmammalian cells. Langmuir, v. 13, n. 8, p. 2215-2218. 1997.

CARMONA-RIBEIRO, AM.; LESSA, M.D. Interactions between bilayer membranesand latex. Colloids Surfaces. A, v. 153, n. 1-3, p. 355-361. 1999.

CARMONA-RIBEIRO, AM. Interactions between cationic liposomes and drugs orbiomolecules. An. Acad. Bras. Ciene., v. 72, n. 1, p. 39-43. 2000.

CARVALHO, L.A; CARMONA-RIBEIRO, AM. Interactions between cationicvesicles and serum proteins. Langmuir, v. 14, n. 21, p. 6077-6081. 1998.

CEVC, G. Lipid vesicles and other colloids as drug carriers on the skinAdv. Drug Detiver. Rev., v. 56, n.5. p. 675-711. 2004.

CEVC, G.; MARSH, D. Phospholipid bilayers: Physica1 principIes and models. NewYork: Wiley-Intersience Publication, 1987, p. 442.

CHANG, TM.S. Semipermeable Microcapsules. Seience, v. 146, n. 364, p. 524. 1964.

CHANG, TM.S.; POZNANSK, M.I. Semipermeable microcapsules containing cata1asefor enzyme replacement in acatalasaemic mice. Nature, v. 218, n. 5138, p. 243. 1968.

103

CHANG, T.M.S. In-vivo effects of semipermeable micracapsules containing 1­asparaginase on 6c3hed lymphosarcoma. Nature, v. 229, n. 5280, p. 117. 1971.

CHANG, T.M.S. Future prospects for artificial blood. Trends Biotechnol., v. 17, n. 2,p. 61-67.1999.

CICOGNA, C.E. et aI. Efficacy of prophylactic aerosol amphotericin B lipid complexin a rat model ofpulmonary aspergillosis. Antimicrob Agents Ch., vAI, p. 259-261.1997.

CICCARONE, V. et aI. Cationic liposome-mediated transfection of eukaryotic cells ­high-efficiency nucleic-acid delivery with lipofectin(r), lipofectace(tm), andlipofectamine(tm) reagents. Faseb J., v. 7, p. 1131-1131.1993.

CLARK, J.M. et aI. Amphotericin B lipid complex therapy of experimental fungaIinfections in mice. Antimicrob. Agents Chemother., v. 35, n. 4, p. 615-621. 1991.

CLARKE'S. Isolation and Identification ofDrugs. London The Pharmaceutical Press2.ed. 1989,p. 784-785.

COMO, J.A.; DISMUKES, W.E. Oral azole drugs as systemic antifungai therapy. N.Engl. J. Med., v.330, p. 263-272. 1994.

COPE, J.E. Mode of action ofmiconazole on Candida albicans effect on growth,viability and K+ release. J. Gen. Microbiol., v. 119, p. 245-251. 1980.

COPE, J.E. The interaction of [R3] miconazole with Candida albicans. Sabouraudia,

v. 18, n. 3, p. 211-228.1980.

COPE, J.E. The porosity ofthe cell-wall of Candida albicans. J. Gen. Microbiol.,v.119, p. 253-255.1980.

CULLIS, P.R. et aI. pH gradients and membrane-transport in liposomal systems.Trends Biotechnol., v. 9, n. 8, p. 268-272. 1991.

D'ANTONIO, D. et aI. Emergence of fluconazole-resistant strains of Blastoschizomycescapitatus causing nosocomial infections in cancer patients. J. Clin. Microbiol., v. 34, n.3, p. 753-755.1996.

DANSON, M.J.; HOUGH, D.W, M.J.; HOUGH, D.W. Structure, function and stabilityof enzymes fram the Archaea. Trends Microbiol., v. 6, n. 8, p. 307-313. 1998.

DASCHER, C.C. et aI. Immunization with a mycobacteriallipid vaccine improvespulmonary pathology in the guinea pig model of tuberculosis. Int. Immunol., v. 15, n.8, p. 915-925. 2003.

DASS, c.R.; SU, T. Delivery of lipoplexes for genotherapy of solid tumours: Role ofvascular endothelial cells. J. Pharm. PharmacoL, v. 52, p. 1301-1317.2000.

104

DE LOGU, A. et aI. Prevention by L-alpha-phosphatidiylcholine of antifungal activityin vitro of Liposome-encapsulated imidazoles determined by using time-killing curves.Int. J. Antimicrob. Ag., v. 15, n. I, p. 43-48.2000.

DE MARIE, S. Liposomal and lipid-based fonnulations of amphotericin B. Leukemia,v.IO. Suppl2: p 93-96. 1996.

DENNING, D.W. Echinocandin antifungaI drugs Lancet, v. 362, n. 9390, p. 1142­1151.2003.

DE ROBERTIS e DE ROBERTIS, J.R. Bases da Biologia Celular e Molecular 2.ed.Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. 1993.

DIEKEMA, D.J. et aI. Activities of caspofungin, itraconazole, posaconazole,ravuconazole, voriconazole, and amphotericin B against 448 recent clinicaI isolates offilamentous fungiJ. Clin. Microbiol., v.41, n.8, p.3623-3626.2003.

DRAGO, M.; SCALTRITO, M.M.; MORACE, G. In vitro activity ofvoriconazoIe andother antifungaI agents against clinicaI isolates ofCandida glabrata and Candida kruseiEur. J. Clin. Microbiol., v. 23, n.8, p. 619-624 .2004.

DROUHET, E.; DUPONT, B. Evolution ofantifungal agents: past, present, and future.Rev. Infect. Dis., SupI. 1, v. 9, s. 1, p. 4-14. 1987.

DUPONT, B. Overview ofthe lipid fonnulations ofamphotericin B. J. Antimicrob.Chemother., v. 49, SupI. 1, p. 31-36. 2002.

DUPONT B. New antifungaI agents: voriconazole and caspofungin. Arch. Pediatrie,v.l0, p. 592-598, SuppI. 5. 2003.

EHRLICH, P. Collocted Studies on immunology; EHRLICH, P.; ed., JOHN WILEY& SONS: Londres, 1906, p. 404-442.

ERNST, M.E. et aI. Antifungal dynamics ofLY 303366, an investigationalechinocandin B analog, against Candida ssp. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v. 26, n.3-4, p. 125-131. 1996.

EVANS, D. F.; WENNERSTROM, H. The ColIoidal Domain-Where Physics,Chemistry, Biology and Technology Meet., 1 ed., VCH Publishers. Inc. 1994.

FEITOSA, E.; BROWN, W. Fragment and vesicle structures in sonicated dispersions ofdioctadecyldimethylammonium bromide. Langmuir, v.I3, n. 18, p. 4810-4816.1997.

FRATTI, R.A.; BELANGER, P.H.; SANATI, H. The effect ofthe new triazole,voriconazole (UK-I09,496), on the interactions ofCandida albicans and Candida kruseiwith endothelial cells. J. Chemother., v.IO, p.7-16.1998.

FENDLER, J.H. Surfactant vesicles as membrane mimetic agents: characterization andutilization. Accounts. Chem. Res., v. 13, n. 1, p. 7-13. 1980.

105

GALL, D. The adjuvant activity of a1iphatic nitrogenous bases. Immunology, v. 11, n.4, p. 369-386. 1966.

GARCIA-CHAUMONT, C; SEKSEK, O.; JOLLES, B.; BOLARD, lA cationicderivative of amphotericin B as a novel de1ivery system for antisense oligonucleotides.Antisense Nucleic. A, v. 10, n. 3, p. 177-184.2000.

GARBER G. An overview offunga1 infections. Drug, v. 61(suppll):1-12. 2001.

GEORGOPAPADAKOU, N.H. Antifunga1s: mechanism ofaction and resistance,estab1ished and novel drugs. Curr. Opino Microbiol., v. 1, n. 5, p. 547-557.1998.

GILES, CH. et aI. Studies in adsorption. Part 11. A system of classification of solutionsadsorption isotherms, and its use in diagnosis of adsorption mechanisms and inmeasurements of specifics surface areas of solids. J. Chem. Soe., (Oct). p.3973-3993.1960.

GOLDAGRE, RJ. Surface phenomena in chemistry and biology, lF. DANIELLIK.G.A PANKHURST, A.C RIDDOFORD (eds.). Pergamom Pres., Oxford 1958.Introduction. In: New, RRCed. Liposomes: A practica1 approach. Oxford: IRLPRESS, 1994. p. 1-32.

GONDAL, J.A.; SWAETZ, R P.; RAHMAN, A. Therapeutic eva1uation of free andliposome-encapsu1ated amphotericin B in the treatment of systemic candidiasis in mice.Antimicrob. Agents Chemother., v. 33, n. 9, p. 1544-1548. 1989.

GUBBINS et aI: Antifunga1 agents. In: PISCITELLI, S.C, RODVOLD, KA(ed): DrugInteractions in the Infectious Diseases. Totowa, Humana Press, Pag 185-217, 2001.

GRABOWSKI, E.F.; MORRISON, I.D. Particle Size Distribution from Ana1ysis ofQuasi-Elastic Light Scattering Data. In Measurements of Suspended Particles byQuasi-Elastic Light Scattering; DAHNEKE, B., Ed.; Wi1ey-Interscience: New York,1983; Chapter 7.

GRAYBILL, J.R New antifungai agents. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis., v. 8, n.5,p.402-412.1989.

GREGORIADIS, G.; LEATHWOO, P.D.; RYMAN, B.E. Enzyrne entrapment in1iposomes. FEBS. Lett., v. 14, n. 2, p. 95. 1971.

GREGORIADIS, G. The carrier potentia1 of1iposomes in bio1ogy and medicine. N.Engl. J. Med., v. 295, n. 14, p. 765-770. 1976.

GREGORIADIS, G. The immuno1ogica1 adjuvant and vaccine carrier properties of1iposomes. J. Drug Target, v. 2, n. 5, p. 351-356. 1994.

GRYSCZYK, H. et aI. Antimycotic treatrnent ofpu1monary aspergilloma in patientswithout neutropenia Deut. Med. Wochenschr., v.127, n.lO, p. 492-496. 2002.

106

HAMMARSTROM, L. et aI. Cryo-TEM Evidence: Sonication of dihexadecy1phosphatedoes not produce closed bi1ayers with smooth curvature: Langmuir, v. 11, n. 2, p. 408­410. 1995.

HANUS, L.H, PLOEHN, H.J. Conversion ofintensity-averaged photon corre1ationspectroscopy measurements to number-averaged particle size distributions 1.Theoretica1 deve10pment. Langmuir, v. 15, n. 9, p. 3091-3100.1999.

HERBRECHT, R. Posaconazo1e: a potent, extended-spectrum triazo1e anti-fungaI forthe treatrnent ofserious fungaI infections. Int. J. Clin. Pract., v.58 n.6, p. 612-624.2004.

HERBRECHT, R. et aI. The 1ipid formu1ations of amphotericin B. Expert OpinoPharmaco., vA, n.8, p. 1277-1287.2003.

HIEMENZ, P.c. PrincipIes of colloid and surface chemistry. 2 ed. New York,MARCEL DEKKER, INC, 1986.

HILGERS, L. A.; SNIPPE, H. DDA as an immuno10gica1 adjuvant. Res. Immunol., v.143,n. 5,p.494-503. 1992.

HOLTEN-ANDERSEN, L. et aI. Combination ofthe cationic surfactantdimethy1dioctadecylammonium bromide and synthetic mycobacteria1 cord factor as anefficient adjuvant for tubercu10sis subunit vaccines. Infect. Immun., v. 72, n. 3, p.1608­1617.2004.

HOSPENTHAL, D.R. Echinocandin antifungal drugs Infect. Med., v.21, n.10, pA76­478,2004.

HOPE, M.1. et aI. Generation of multilamellar and unilamellar phospholipid-vesicles.Chem. Phys. Lipids, v. 40, n. 2-4, p. 89-107. 1986.

ISRAELACHIVILI, 1. N.; MITCHELL, D. 1.; NINHAM, B. W. Theory ofse1f­assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochim. Biophys. Acta, v. 470, n. 2, p.185­201. 1977.

ISRAELACHIVILI, 1. N. Intermolecular and Surface Forces. 2 ed. London,Academic Press, 1992.

JAASKELAINEN, I et aI. Physicochemical and morphological properties of complexesmade ofcationic 1iposomes and oligonucleotides. Int. J. Pharm., v. 167, p. 191-203.1998.

JANKNEGT, R. et aI. Liposomal and lipid formu1ations of amphotericin-b - clinicaIpharmacokinetics. Clin. Pharmacokinet, v. 23, n. 4, p. 279-291. 1992.

JOHNSON, E.M.; WARNOCK, D.W. Azo1e drug resistance in yeasts. J. Antimicrob.Chemoth., v. 36, n. 5, p. 751-755. 1995.

107

JULIANO, R.L. Liposomes as a drug delivery system. Trends Pharmacol. Sci., v. 2, n.2, p. 39-42. 1981.

KANO, K. et aI. Characterization of surfactant vesicle as a membrane mimetic agent. 2temperature-dependent changes of turbidity, viscosity, fluorescence polarization of 2­methylantracene, and positron annihilation in sonicated dioctadecyldimethylammoniumchloride. J. Am. Chem. Soc., v. 101, n. 15, p. 4030. 1979.

KATZ, D.; KRAAIJEVELD, C.A; SNIPPE, H .. Synthetic lipid compound as antigen­specific immunostimulators for improving the efficacy ofkilled-virus vaccines. In:Theory and practical application of adjuvants. Chichester: Stewart-Tull, D.E.S., ed.JOHN WILLEY & SONS. 1995.

KERSTEN, G.F.A; CROMMELIN, D.J.A Liposomes and iscoms as vaccineformulations BBA-Rev. Biomembranes, v. 1241, n. 2, p. 117-138. 1995.

KIKUCHI, I.S.; VIVIANI, W.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Nucleotide insertion incationic bilayers. J. Phys. Chem. A, v. 103, n. 40, p. 8050-8055. 1999.

KIKUCHI, I.S.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Interactions between DNA andsynthetic cationic liposomes. J. Phys. Chem. B, v. 104, n. 103, p. 2829-2835. 2000.

KLINGUER-HAMOUR, C. et aI. DDA adjuvant induces a mixed Th1/Th2 immuneresponse when associated with BBG2Na, a respiratory syncytial virus potential vaccine.Vaccine, v. 20, n. 21-22, p. 2743-2751. 2002.

KOHLER, S. et aI. Comparison ofthe echinocandin caspofungin with amphotericin Bfor treatment ofhistoplasmosis following pulmonary challenge in a murine modelAntimicrob. Agents Ch., v. 44, n.7, p.1850-1854, 2000.

KREMER, J. M. H. et aI. Vesicles ofvariable diameter prepared by a modified injectionmethod Biochemistry-US, v. 16, n. 17, p. 3932-3935. 1977.

KURODA, S.; UNO. 1.; ARAI, T. Target substances of some antifungal agents in cell­membrane. Antimicrob. Agents Chemother., v. 13, n. 3, p. 454-945. 1978.

LARSEN, S.T. Adjuvant effect of quatemary ammonium compounds in a murinemodeI. Toxicol. Lett., v. 151, n. 2, p. 389-398. 2004.

LASIC, D.D. The mechanism of vesicle formation. Biochem. J., v. 256, n. 1, p.1-11.1988.

LASIC, D.D. Liposomes. Recherche, v. 20, n. 212, p. 904-913. 1989.

LASIC, D.D.; NEEDHAM, D. The "Stealth" liposome: A prototypical biomateriaI.Chem. Rev., v. 95, n. 8, p. 2601-2628. 1995.

LASIC, D.D. et aI. The structure ofDNA-Liposome complex. J. Am. Chem. Soc., v.119, n. 4, p. 832-833. 1997.

108

LASIC, D.D. Novel applications ofliposomes. Trends Biotechnol., v. 16, n. 7, p. 307­321. 1998.

LEENDERS, AC. et aI. Liposomal amphotericin B compared with amphotericin Bdeoxycholate in the treatment of documented and suspected neutropenia-associatedinvasive fungaI infections. Br. J. Haematol., v.l 03, p.205-212. 1998.

LEE, A G. Effects of charged drugs on phase-transition temperatures ofphospholipidbilayers. Biochim. Biophys. Acta 514,95.1978.

LEGRAND, P.; et aI. Effect of aggregation and solvent on the toxicity of AmphotericinB to human erythrocytes. Antimicrob. Agents Ch., v.36, n. 11, p. 2518-2522.1992.

LESSA, M.M.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Bilayer wetting on polymer surfaces J.CoUoid. Interf. Sci., v. n. 1, 182, p. 166-171. 1996.

LETSCHER-BRU, V.; HERBRECHT R. Caspofungin: the first representative of a newantifungal class. J. Antimicrob. Chemoth., v.51, n.3, p.513-21. 2003.

LI, H.Y.; QIAN, Z.M. Transferrinitransferrin receptor-mediated drug delivery. Med.Res. Ver., v. 22, p. 225-250.2002.

LICHTENBERG, D.; BARENHOLZ, Y. Liposomes - preparation, characterization, andpreservation. Method. Biochem. Anal., v. 33, p. 337-462. 1988.

LINCOPAN, N.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, AM. In vivo activity ofa novel amphotericin B forrnulation with synthetic cationic bilayer fragment. J.Antimicrob. Chemoth., v. 52, n. 3, p. 412-418. 2003.

LITZINGER, D.e.; HUANG, L. Phosphatidylethanolamine liposomes-drug delivery,gene-transfer and immunodiagnostic applications. Biochim. Biophys. Acta, v. 1113, n.2, p. 201-227. 1992.

LOPEZ-BERESTEIN, G. et aI. Liposome-encapsulated amphotericin B for thetreatment of disseminated candidiasis in neutropenic mice. J. Infect. Dis., v. 150, n. 2,p. 278-283. 1984.

LOPEZ-BERESTEIN, G.; MCQUEEN, T.; MEHTA, K. Protective effect ofliposomal­amphotericin-B against C. albicans infection in mice. Canc. Drug. Del., v. 2, n. 3, p.183-189. 1985.

LOPEZ-BERESTEIN, G. Liposomes as carriers of antimicrobial agents. Antimicrob.Agents Ch., v. 31, n. 5, p. 675-678. 1987.

LOUIE, A et aI. Pharrnacodynamics of fluconazole in a murine model of systemiccandidiasis. Antimicrob. Agents Chemother., v. 42, n. 5, p. 1105-1109. 1998.

MACCALLUM, D.M.; ODDS F.e. Need for Eady Antifungal Treatment Confirrned inExperimental Disseminated Candida albicans Infection Antimicrob. Agents Ch., v.48,n.12,p.11-4. 2004.

109

MADIGAN, M.T. et aI, Brock biology ofmicroorganisms, 8. ed 1997, editora PrenticeHalI.

MAERTENS, 1. et aI., Efficacy and safety of caspofungin for treatment of invasiveaspergillosis in patients refractory to or intolerant of conventional antifungal therapy.Clin. Infect. Dis., v. 39, n.ll, p. 1563-71. 2004.

MARGOLIS, L.B. Cell-interaction with model membranes - probing, modification andsimulation ofcell-surface functions. Biochim. Biophys. Acta, v. 779, n. 2, p. 161-189.1984.

MASCHMEYER G, RUHNKE M.Update on antifungal treatment ofinvasive Candidaand Aspergillus infections. Mycoses, v.47, n.7. p. 263-76. 2004.

MARTINS, L.M.S.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Cationicvesicles as bactericides. Langmuir, v. 13, n. 21, p. 5583-5587. 1997.

MAYER, L.D.; BALLY, M.B.; HOPE, M.1.; CULLIS, P.R Techniques forencapsulating bioactive agents into liposomes. Chem. Phys. Lipids, v. 40, n. 2-4, p.333-345. 1986.

MCGINNIS, M.R; RINALDI, M.G. Antifungal drugs: mechanisms of action, drugresistance, susceptibility testing, and assays of activity in biological fluids. In:LORIAN, v., ed. Antibiotic in laboratory medicine 4.ed.Baltimore: Williams &Wilkins, 1996, p. 176-211.

MEHTA, R.T.; MEHTA, K.; LOPEZBERESTEIN, G.; JULIANO, RL. Effect ofliposomal amphotericin-B on murine macrophages and lymphocytes. Infect. Immun.,v.47,n.2,p.429-433.1985.

MONKKONEN, 1.; URTTI, A. Lipid fusion in oligonucleotide and gene delivery withcationic lipids. Adv. Drug Deliver. Rev., v.34, p. 37-49.1998.

MORTARA, R A; QUINA, F.H.; CHAIMOVICHI, H. Fonnation of closed vesiclesfrom a simple phosphate diester. Preparation and some properties ofvesicles ofdihexadecylphosphate. Biochem. Biophys. Research Commun., v. 81, n. 4, p. 1080­1086. 1978.

MOURA, S.P.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Cationic bilayer fragments on silica at10w ionic strength: Competitive adsorption and colloid stability. Langmuir, v. 19, n.17,p.6664-6667.2003.

NANTES, I. L. et aI. Nucleotide confonnational change induced by cationic bilayers.Arch. Biochem. Biophys., v. 416, n. 1, p. 25-30. 2003.

NEW, RRC. Preparation ofliposomes. In: New, R.RC., ed. Liposomes: A practicalapproach. Oxford: IRL PRESS, 1994. p. 33-104.

110

ODDS F.C, et aI. Interlaboratory comparison ofresu1ts ofsusceptibi1ity testing withcaspofungin against Candida and Aspergillus species J. Clin. Microbiol., vA2. n. 8, p.3475-3482.2004.

ODDS, F.C. Resistance ofyeasts to azo1e-derivative antifunga1s. J. Antimicrob.Chemoth., v. 31, n. 4,p. 463-471. 1993.

OHLWEILER, O.A Fundamentos de análises instrumentais. Livro técnico ecientífico, Rio de Janeiro, 1981.

OMRI, A; RAVAOARINORO, M.; POISSON. M. Incorporation, release and in-vitroantibacteria1 activity ofliposoma1 aminog1ycosides against Pseudomonas aeruginosa. J.Antimicrob. Chemoth., v. 36, n. 4, p. 631-639,1995.

OTSUBO, T. et aI. In vitro and in vivo activities ofNS-718, a new 1ipid nanosphereincorporating amphotericin B, against Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Ch.,v.43, p. 471-475. 1999.

OTTEWILL, R.H. Surfactants - Introduction in: TADROS, T.H.F. Surfactants.London, Academic Press: 1984, p. 1-18.

PACHECO, L.F.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Effects ofsynthetic lipids onsolubi1ization and colloid stabi1ity ofhydrophobic drugs. J. Colloid. Interf. Sei., v. 258,n. 1, p. 146-154.2003.

PAPAHADJOPOULOS, D.; GABIZON. A Targeting of1iposomes to tumor-cells invivo. Ann. NY. Acad. Sei., 507: 64-74 DEC 22 1987.

PAPAHADJOPOULOS, D.; NIR, S.; DUZGUNES, N. Mo1ecu1armechanisms ofcalcium-induced membrane-fusion. J. Bioenerg. Biomembr., v. 22, n. 2, p. 157-179.1990.

PAPAHADJOPOULOS, D.; et aI. Sterically stabi1ized 1iposomes - improvements inpharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. P. Natl. Acad. Sei., v. 88, n. 24,p. 11460-11464. 1991.

PANSU, R.B. et aI.Vesicles versus membrane fragments in DODAC suspensions. J.Phys. Chem., v. 94, n. 2, p. 796-801. 1990.

PEBERDY, J.F. FungaI cell walls-A review. In: KUNH, P.J.; TRINCI, A.P.J.; JUNG,M.J.; GOOSEY, M.W.; COPPING, L.G. eds. Biochemistry of cell walls andmembranes in fungi., 1990. p. 5-30.

PFALLER, M.A, , et aI. Intemationa1 surveillance ofb100d stream infections due toCandida species in the European SENTRY Program: species distribution and antifungaIsusceptibi1ity inc1uding the investigationa1 triazo1e and echinocandin agents. SENTRYParticipant Group (Europe). Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v. 35, p.19-25.1999.

111

IN~ 11' U I um: UUIIIIII\6A

Universidade de São Pauto

POWLES, M.A et aI. Efficacy ofMK-991 (L-743,872), a semisynthetic pneumocandin,in murine models ofPneumocystis carinii. Antimicrob. Agents Ch., v.42, n.8, p. 1985­9.1998.

RAPUANO, R.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Physical adsorption ofbilayermembrane on silica. J. Colloid Interf. Scí., v. 193, n. 1, p. 104-109. 1997.

RAPUANO, R.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Supported bilayers on silica J. Colloid.Interf. Scí., v. 226, n. 2, p. 299-307. 2000.

REBOIRAS, M.D.; MILLER, M.J.; JONES, M.N. Liposome adsorption to Candidaalbicans. Colloid Surface B., v. 9, n. 1-2, p. 101-107. 1997.

REX, J.H.; RINALDI, M.G.; PFALLER, M.A. Resistance of Candida species tofluconazole. Antimicrob. Agents Ch., v. 39, n. 1, p. 1-8. 1995.

RIBEIRO, AM.; CHAIMOVICH, H. Preparation and characterization oflargedioctadecyldimethylammonium chloride liposomes and comparison with smallsonicated vesicles. Biochim. Biophys. Acta, v. 733, n. 1, p. 172-179. 1983.

RICHARDSON, M.D.; WARNOCK, D.W. FungaI Infections Diagnosis andManagment. Blackwell, London. 1993, p. 207.

RINALDI, M.G. Biology and pathogenicity of Candida species. In: BODEY, G.P., ed.Candidiasis-Pathogenesis, diagnosis, and treatment. 2 ed. New York: Raven Press,1993. p. 1-20.

RINGEL, S.M. New antifungaI agents for the systemic mycoses. MycopathoIogia, v.109,n.2,p. 75-87.1990.

ROBERTSON, J.D. The cell membrane concept J. PhysioI-London, v.140, n.3, p.58­59. 1958.

ROSE, A.H.; HARRISON, J.S. The yeasts 2.ed. London: Academic Press, v. 4, 1991,p.765.

ROUSER, G.; FLEISCHE, S.; YAMAMOTO, A 2 dimensional thin layerchromatographic separation of polar lipids and determination ofphospholipids byphosphorus analysis of spots . Lipids, v. 5, n. 5, p. 494. 1970.

SAAG, M.S.; DISMUKES, W.E. Azole antifungal agents: emphasis on new triazoles.Antimicrob. Agents Ch., v. 32, n. 1, p. 1-8. 1988.

SALGADO, J. et aI. Membrane-bound structure and alignment ofthe antimicrobialbeta-sheet peptide gramicidin S derived from angular and distance constraints by solidstate F-19-NMR J. Biomol. NMR, v.21, n. 3, p.191-208. 2001.

112

SALLOVITZ, J.M.; MENGHINI, M.I.Z.; LANUSSE, C.E. Impact ofliposomes asdelivery systems in veterinary medicine. Veto Res., v. 29, n. 5, p. 409-430. 1998.

SALT, W.G.; WISEMAN, D. Relation between uptake ofcetyltri-methylammoniumbromide by Escherichi coli and its effects on cell growth and viability. J. Pharm.PharmacoI., v. 22, n. 4, p. 261. 1970.

SCHALES, O.; SCHALES, S.S. A simple and accurate method for the determinationof chloride in biological fluids. J. BioI. Chem., v. 140, p. 879-884. 1941.

SCHREIER, S.; MALHEIROS, S.V.P.; DE PAULA, E. Surface active drugs: self­association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical andbiological aspects. BBA-Biomembranes, v. 1508, n. 1-2, p. 210-234. 2000.

SCHUBER, F. et aI. Lipossomes: from membrane modeis to gene therapy. Pure AppI.Chem., v. 70, n. 1, p. 89-96. 1998.

SCHNYDER A, et aI. Targeting of skeletal muscle in vitro using biotinylatedimmunoliposomes. Biochem. J., v.377.p.61-67.2004.

SCHIFFELERS, R.M.; BAKKER-WOUDENBERG, I.A.J.M. Innovations in liposomalformulations for antimicrobial therapy Expert Opino Ther. Pat., v.13, n. 8, p 1127­1140.2003.

SEMPLE, S.e. et aI., Efficient encapsulation of antisense oligonucleotídeos in lipidvesicles using ionizable aminolipids: formation ofnovel small multilamellar vesiclestructures. Biochim. Biophy. Acta, v. 1510, p. 152-166.2001.

SESSA, G.; WEISSMAN, G. Phospholipid spherules (Liposomes) as a model forbiological membranes J. Lipid Res., v. 9, n. 3, p. 310.1968.

SESSA, G.; WEISSMAN, G. Incorporation oflysozyme into liposomes a model forstructure-linked latency. J. BioI. Chem., v. 245, n. 13, p. 3295. 1970.

SICCHIEROLLI, S.M.; CARMONA-RIBEIRO, A.M. Incorporation ofthe cholera­toxin receptor in phospholipid-covered polystyrene microspheres. Colloid Surface B.,v. 5, n. 1-2, p. 57-61. 1995.

SICCHIEROLLI, S.M.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, A.M. Bacteriaflocculation and death by cationic vesicles. Langmuir, v.11, n. 8, p. 2991-2995.1995.

SINGH, M. Transferrin as a targeting ligand for liposomes and anticancer drugs. Curr.Pharm. Design., v. 5, p. 443-451.1999.

SINGH, V. et aI. Invasive pulmonary Aspergillosis in a neonate treated successfullywith amphotericin B and itraconazole. A case report J. MycoI. Med., v.14, n.3, p. 129­133.2004.

113

SNIPPE, H. et aI. Variable expression of delayed hypersensitivity in different mousestrain using dimethyl-dioctadecyl-ammonium-bromide as an adjuvant. Immunology, v.39, n. 3,p. 399-405. 1980.

SOUZA, L.c. et aI. In-vitro and in-vivo studies of the decrease of amphotericin-Btoxicity upon association with a triglyceride-rich emulsion. J. Antimierob.Chemother., V. 32, n. 1, p. 123-132. 1993.

SOUZA, L. c.; CAMPA, A. Pharmacological parameters ofintravenously administeredamphotericin B in rats: comparison ofthe conventional formulation with amphotericinB associated with a triglyceride-rich emulsion. J. Antiniicrob. Chemother., V. 44, n. I,p.77-84. 1999.

SUN, Q.N. et aI. In vivo activity ofposaconazole against Mucor spp. in animmunosuppressed-mouse modeI. Antimicrob. Agents Ch., v.46, n.7, p.2310-2312.2002.

STANFIELD, J.P.; GALL, D.; BRACKEN, P. M. Single-dose antetetal tetanusimmunization. Laneet, V. 1, n. 7797, p. 215-219.1973.

STELMO M, CHAIMOVICH H, CUCCOVIA IM. Quantitative-determination ofalkylammonium amphiphiles using neutral detergents. J. Colloid. Interf. Sei., v.117, n.1, p. 200-204. 1987.

STOECKENIUS, W. An electron microscope study ofmyelin figures J. Bioehemen.Biophys. Cytol., V. 5, n. 3, p. 491. 1959.

STUAR, D.D.; ALLEN, T.M. A new liposomal formulation for antisenseoligodeoxynucleotides with small size, high incorporation efficiency and good stability.Bioehim. Biophys. Aeta. V. 1463, p. 219-229. 2000.

STRYER, L. Bioquímica. Tradução da 4 edição americana, supervisão: João Paulo deCampos. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A. 1996, p. 245-252.

SUD, I.J.; CHOU, D.L.; FEINGOLD, D.S. Effect of free fatty-acids on liposomesusceptibility to imidazole anti-fungaIs. Antimierob. Agents Ch., v. 16, n. 5, p. 660.1979.

SZOKA, F.; PAPAHADJOPOULOS, D. Comparative properties and methods ofpreparation oflipid vesicles (liposomes). Annu. Rev. Biophys. Bio., V. 9, p. 467-508.1980.

TAPIAS, G.N. et aI. Interactions between cationic vesicle and Escherichia coZiLangmuir, V. lO, n. lO, p. 3461-3465.1994.

TEMPLETON, N.S. Cationic liposomes as in vivo delivery vehicles. Curr. Med. Che.,v.l0, n.14, p. 1279-1287.2003.

TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia 6a ed. Porto Alegre;Artmed p. 77-106. 2002.

114

TSURUTA, L.R. et aI. Interactions between cationic liposomes and antigenic protein:the physical chemistry of the immunoadjuvant action. J. Lipid Res., v. 38, n. 10, p.2003-2011. 1997.

TUMBARELLO, M. et aI. Fluconazole-resistant Candida parapsilosis fungemia in apatient with AIDS. Clin. Infect. Dis., v. 22, p. 179-180. 1996.

TYRRELL, D.A et aI. New aspects ofliposomes. Biochim. Biophys. Acta, v. 457, n.3, p. 259-302. 1976.

VANDENBOSSCHE, H. From garlic to ergosterol biosynthesis inhibitors. En: IWATA,K.; VANDENBOSSCHE, H. (Eds.) In vitro and in vivo evaluation of antifungal agents.Elsevier, 1986, p. 1-16.

VANDENBOSSCHE, H. et aI. Interaction of azole derivatives with cytochrome-P-450isozymes in yeast, fungi, plants and mammalian-cells. Pesticide Science, v. 21, n. 4, p.289-306. 1987.

VANDENBOSSCHE, H.; WILLEMSENS, G.; MARICHAL, P. Anti-Candida drugs ­the biochemical basis for their activity. Crit. Rev. MicrobioI., v. 5, n. 1, p. 57-72. 1987.

VANDENBOSSCHE, H. et aI. Biochemical Approaches to Selective AntifungalActivity - Focus on Azole Antifungals. Mycoses, v. 32, p. 35-52. 1989.

VANDENBOSSCHE, H. et aI. Biochemical basis for the activity and selectivity of oralantifungal drugs. Brit. J. Clin. Pract., v. 44, n. 9. p. 41-46. 1990.

VANDENBOSSCHE, H. Mechanisms of antifungal resistance. Rev. Iberoam. MicoI.,v. 14, p. 44 - 49. 1997.

VAN'T WOUT, J.W. Therapy of systemic mycoses in neutropenic patients usingitraconazole. A comparative, randomized study with amphotericin B. Med. Klin., v. 86,(suppl1). p.11-13.1991.

VAN ROOU, E.M.A et aI. Protective antiviral immune responses to pseudorabies virusinduced by DNA vaccination using dimethyldioctadecylammonium bromide as anadjuvant. J. ViroI., v. 76, n. 20, p. 10540-10545.2002.

VERONESI, R.; CORREA, A; ALTERIO, D. Single dose immunization againsttetanus: promising results in human trials. Rev. Inst. Trop. Med., v. 12, p. 46-54. 1970.

VIEIRA, D.B.; CARMONA-RIBEIRO, AM. Synthetic bilayer fragments forsolubilization of amphotericin B. J. Colloid. Interf. Sei., v. 244, n. 2, p. 427-431. 2001.

VIEIRA D.B. et aI. Competitive adsorption of cationic bilayers and chitosan on latex:Optimal biocidal action. Langmuir. v. 19, n. 3, p. 924-932.2003.

115