Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias

2013

Estandarización de un protocolo de criopreservación de Estandarización de un protocolo de criopreservación de

espermatozoides bovinos recuperados de la cola del epidídimo espermatozoides bovinos recuperados de la cola del epidídimo

José Álvaro Novoa Buitrago Universidad de La Salle, Bogotá

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ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO DE CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS RECUPERADOS DE LA COLA DEL

EPIDÍDIMO

Presentado por:

José Álvaro Novoa Buitrago

14061600

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Programa de Medicina Veterinaria

Bogotá, Colombia

2013

ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO DE CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS RECUPERADOS DE LA COLA DEL

EPIDÍDIMO

Director Doctor: JAIR PÉREZ OSORIO.

Co Director Doctor: JOSÉ CARLÓS COELHO DE OLIVEIRA BASSO

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Programa de Medicina Veterinaria

Bogotá, Colombia

2013

DIRECTIVOS

RECTOR Hno. CARLOS GABRIEL GOMEZ.

VICERRECTOR ACADÉMICO Hno. ENRIQUE CARVAJAL COSTA.

VICERECTOR DE PROMOCIÓN Hno. FRAN LEONARDO RAMOS VAQUERO.

VICERRECTOR VRIT Dr. LUIS FERNANDO RAMÍREZ.

DECANO DE LA FACULTAD Dra. CLAUDIA AIXA MUTIS BARRETO.

DE MEDICINA VETERINARIA Dr. JUAN FERNANDO VELA JIMENEZ.

SECRETARIA ACADEMICA Dra. ADRIANA PATRICIA LOPEZ.

ACEPTACIÓN

DIRECTOR _________________________________________

Dr. JAIR PÉREZ OSORIO

JURADO _________________________________________

Dr. MARIA ALEXANDRA TORRES ARTUNDUAGA

JURADO _________________________________________

Dr. CÉSAR AUGUSTO GÓMEZ.

COMPROMISO.

Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina de

La Iglesia Católica en asuntos de norma y moral.

Ni la universidad, ni los asesores, ni el jurado calificador son responsables de las

Ideas expuestas por el graduado.

DEDICATORIA.

A Dios por la vida, mis triunfos y mi familia.

A mis padres, mis hermanos por su amor, dedicación y sacrificios, por su apoyo,

ayuda y porque con sus ejemplos contribuyeron a formar mi actitud frente a la

vida.

A Karen Dayana Montaño Suarez además de su infinita bondad y amor quien

estuvo apoyándome y colaborando incondicionalmente y quien me ayudó y me

dio fortaleza en los momentos más difíciles de éste trabajo.

Expreso mis agradecimientos más sinceros a:

Dr. Jair Pérez Osorio Director de tesis. Por su confianza, guía, tiempo y

desinterés para transmitir sus conocimientos.

A los jurados Dr. César Augusto Gómez, Dr. María Alexandra Torres

Artunduaga por sus indicaciones y colaboración en la investigación.

Flor Marina, Antonio Ávila, Aquilino Rincón, amigos. En general a todos aquellos

que, de alguna forma, colaboraron en el desarrollo de éste proyecto con apoyo

y voz de aliento.

José Álvaro Novoa Buitrago.

TABLA DE CONTENIDO.

RESUMEN ....................................................................................................................................... 11

SUMMARY ...................................................................................................................................... 12

INTRODUCCION ............................................................................................................................ 13

1. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 14

GENERAL .................................................................................................................................... 14

ESPECIFICOS ............................................................................................................................ 14

2. MARCO TEÓRICO. ............................................................................................................... 15

CRIOPRESERVACIÓN. ................................................................................................................ 15

CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES RECUPERADOS A TRAVÉS DE LA

COLA DEL EPIDÍDIMO. ................................................................................................................ 16

FACTORES QUE AFECTAN LA CÉLULA ESPERMÁTICA EN LA CRIOPRESERVACIÓN.

........................................................................................................................................................... 16

Shock Térmico. ............................................................................................................................... 16

Estrés Osmótico y Formación de Cristales de Hielo. ............................................................... 17

Estrés Oxidativo. ............................................................................................................................. 18

CRIOPRESERVACIÓN A PARTIR DEL EPIDÍDIMO. .............................................................. 19

EL INTERVALO ENTRE LA MUERTE, RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL

EPIDÍDIMO. ..................................................................................................................................... 20

DILUYENTES. ................................................................................................................................. 21

3.0 MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................................................. 22

3.1 Localización. ............................................................................................................................. 22

3.2 Población y muestra. ............................................................................................................... 22

3.3 Variables. .................................................................................................................................. 22

3.4 Análisis Estadístico. ................................................................................................................. 22

3.5 Métodos y Procedimientos. .................................................................................................... 23

Toma de la Muestra. .................................................................................................................. 23

Limpieza Del Material. ............................................................................................................... 23

Recolección de Espermatozoides Epidídimarios En El Laboratorio. ................................. 23

DIAGRAMA DE FLUJO ................................................................................................................. 28

Motilidad Espermática. .................................................................................................................. 30

Vigor. ................................................................................................................................................ 30

Concentración Espermática. ......................................................................................................... 30

Morfología Espermática. ............................................................................................................... 30

Evaluación del Semen pos descongelación. .............................................................................. 31

Test de Termo Resistencia (TTR). .............................................................................................. 31

Test Hiposmótico (HOST). ............................................................................................................ 31

RESULTADOS y DISCUSIÓN. .................................................................................................... 31

Morfología. ................................................................................................................................... 35

TEST HIPOSMÓTICO. .............................................................................................................. 37

Conclusiones y Recomendaciones. ............................................................................................ 38

Bibliografía. ...................................................................................................................................... 39

ANEXOS. ......................................................................................................................................... 45

LISTA DE TABLAS.

Tabla 1. Estadística Descriptiva Para Motilidad

Total, Motilidad Progresiva Y Vigor. 31

Tabla 2. Estadística Descriptiva Para Motilidad Total

Prueba De Termo Resistencia. 33

Tabla 3. Estadística Descriptiva Para Motilidad Progresiva

Prueba De Termo Resistencia. 33

Tabla 4. Estadística descriptiva para vigor

En la prueba de termo resistencia. 34

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Disección De las túnicas del Epidídimo. 23

Figura 2. Disección Del Epidídimo. 24

Figura 3. Llenado Del Epidídimo. 24

Figura 4.Lavado Del Epidídimo. 25

Figura 5. Muestra Inicial. 25

Figura 6. Curva De Enfriamiento. 26

Figura 7. Descongelación De Pajillas. 27

Figura 8. Motilidad Total. 31

Figura 9.Motilidad Progresiva. 32

Figura 10. Vigor. 32

Figura 11. Representación Esquemática De Las Diferentes Características Morfológicas

De La Muestra De Semen Pre Congelamiento. 35

Figura 12. Test Hiposmótico. 36

RESUMEN

El objetivo de esta investigación es de estandarizar un protocolo de criopreservación para obtener, evaluar y crío preservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de toros de la raza Bos Taurus Indicus. El tamaño de la muestra fue de cinco pares de testículos obtenidos de animales recién sacrificados tomados al azar como número total de las muestras estas procedieron de la planta de sacrificio del frigorífico de Guadalupe en la ciudad de Bogotá (autopista sur). Cada testículos fue limpiado y secado con gasa estéril y se colocó cada uno de ellos dentro de bolsas plásticas selladas transportados en una cava a una temperatura de entre los 20 y 25 ºC con hielo seco fueron transportados hacia el laboratorio de la Universidad de La Salle. Se realizó la disección de los testículos retirando todas las túnicas, bolsa escrotal y estructuras adyacentes, y así poder canular el lumen del ducto deferente del epidídimo, inmediatamente se procedió a realizar el ordeño con medio diluyente Triladyl®. Los espermatozoides obtenidos fueron evaluados parámetros espermáticos con relación a Motilidad Total, Motilidad Progresiva, y vigor espermáticos fueron evaluados aproximadamente de 15 a 45 pos lavados e inclusive 1hora posterior a la recuperación; fue envasado y solo las muestras que obtuvieran una motilidad progresiva superior a 50 millones de espermatozoides viables en el momento de la congelación. Y se les procedió realizar la curva de refrigeración los resultados obtenidos se observó, La concentración promedio por epidídimo fue de 575X106 millones de espermatozoides /ml en los primeros lavados; en el porcentaje de motilidad hay una diferencia estadística significativa (p<0.05), entre la motilidad en Pre congelación 70.5±13.21 y para pos congelación los valores fueron 40.0±5.77; En relación al vigor espermático se observó diferencia significativa (p≤0.05) El porcentaje de espermatozoides anormales encontrado en esta investigación fue de 34%, y 66% de normales; La recuperación y criopreservación de espermatozoides tomados del epidídimo se constituye una manera útil de rescatar el germoplasma de especímenes y se podrían usar en biotecnologías de la reproducción.

SUMMARY

The objective of this research is to standardize a protocol for cryopreservation, evaluate, and cryo preserve sperm obtained from the cauda epididymis of bulls breed Bos Indicus Taurus. The sample size was from five pairs of testes obtained from freshly slaughtered animals. The sample was take at random. Those samples came from the slaughterhouse refrigerator of Guadalupe located in Bogotá (Southern Highway).

The testis, each one was cleaned and dried with sterile gauze. Also was placed each of them in sealed plastic bags transported in a cellar at a temperature of between 20 and 25 ° C. with dry ice. Finally they were transported to the laboratory at the University of La Salle. The dissection of the testes was performed by removing all the robes, scrotum and adjacent structures, for later being cannulate the lumen of the deferent duct of the epididymis, immediately proceeded to do the extraction with a diluent medium Triladyl ®.

The sperm obtained were tested against sperm parameters such as regarding Motility, Total progressive motility and sperm force. The evaluated approximately 15 and 45 washes post and even after recovery 1hour. Only the samples to obtain a gradual motility greater than 50 millions of viable spermatozoa in the moment of freezing were packaged. Later it proceeded to perform the cooling curve and observed the results obtained. The average concentration was of 575X106 epididymis million sperm / ml in the first wash , the percentage motility is a statistically significant difference ( p <0.05) , between Pre freeze motility 70.5 ± 13.21 and after freezing the values were 40.0 ± 5.77 . Regarding the spermatic force significant difference (p ≤ 0.05) was observed percentage of abnormal sperm found in this study was 34 %, and 66 % normal. In conclusion the recovery and cryopreservation of epididymal sperm is a useful way to rescue germplasm specimens and it could be used in reproductive biotechnology.

INTRODUCCION

La muerte inesperada de un animal de alto valor genético puede ser aprovechada ya sea con fin zootécnico, o para preservar animales en vías de extinción así como la dificultad para obtener semen fresco en especies silvestres ha impulsado el desarrollo y la aplicación de tecnologías de reproducción asistida que permiten preservar y mejorar la biodiversidad animal. La importancia de conservar recursos genéticos para el futuro es ampliamente reconocido, considerando que la conservación de espermatozoides es de gran importancia ya que contribuye con grandes aplicaciones potenciales en biotecnología como: conservación de especies, apoyando las técnicas de reproducción asistida que presentan numerosas posibilidades para ser empleadas en la propagación y conservación de las distintas especies animales (Garde & López, 1998). Por otro lado esta investigación busca establecer un método que permita la recolección de espermatozoides de toros élites (alto valor genético) que hayan muerto repentinamente, de manera tal que pueda obtenerse descendencia de esos reproductores, mediante la inseminación artificial o la fertilización in vitro (Barrios D. , 2002). Así que podría implementarse la recolección de espermatozoides de la cola del epidídimo para propagar la calidad genética de toros post-mortem, puesto que los espermatozoides que se encuentran allí, según se ha reportado tienen capacidad fertilizante (Chung, 1997; Reyes-Moreno C, 2002). Los espermatozoides son células más frágiles, y estas no sobreviven por largos periodos fuera del tracto reproductivo del macho, hay que recordar que la función principal del epidídimo es: la maduración y el almacenamiento espermático (Chenoweth.P, 1997; Mortimer.s, 1997). La maduración o desarrollo progresivo de la capacidad fertilizante de los espermatozoides ocurre en la cabeza, cuerpo del epidídimo; el almacenamiento ocurre en la cola del epidídimo (Schanbacher, 1983; Hermo, 1988; Viger, 1995). Con esta consideración, es importante señalar que se podrían obtener espermatozoides viables provenientes de la cola del epidídimo con movilidad y capacidad fertilizante poco tiempo después de la muerte del animal que podrían ser procesados y congelados para su posterior uso en inseminación artificial. (Fouchécourt, 2000; Hafez, 2000). La obtención de espermatozoides de animales muertos es un método de gran importancia para la preservación de animales en peligro de extinción como también de animales de alto valor genético o de laboratorio (Wada, Edashige, & Sakurai, 1999). Para prevenir un deterioro en más especies de animales es necesario implementar o crear bancos de recursos genéticos de animales en vías de extinción o de alto valor genético para la reproducción de éstos ligados con técnicas como: maduración in vitro (IVM), fertilización in vitro (IVF), cultivo in vitro (IVC) e Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Loskutoff, Bartels, Meintjes, & Godke, 1995).

Los espermatozoides epididimales han sido crío conservados exitosamente en rumiantes silvestres como por ejemplo: el ciervo ibérico (Ortíz & López, 1998) antílopes africanos, impala (Bartels, Meintjes, & Godke, 1995) sin embargo existen pocos reportes en cuanto a los espermatozoides obtenidos de epidídimos y crio preservados en toros domésticos. Con esta consideraciones es importante marcar que se podrían obtener espermatozoides viables provenientes de la cola del epidídimo con movilidad y capacidad fertilizante; poco tiempo después de la muerte del animal que podrían ser procesados y congelados para su posterior uso en inseminación artificial. Por lo cual el objetivo de esta investigación fue el obtener, evaluar y congelar espermatozoides recuperados de colas de epidídimos de toros seleccionados al azar y establecer un protocolo para la obtención de espermatozoides de la cola del epidídimo de toros post mortem para evaluar su viabilidad y vitalidad en casos que ocurra la muerte súbita de toros reproductores valiosos.

1. OBJETIVOS

GENERAL

Estandarizar un protocolo de criopreservación de espermatozoides bovinos recuperados a partir de la cola del epidídimo.

ESPECIFICOS

Analizar los parámetros espermáticos motilidad total, motilidad progresiva, vigor, morfología del semen pos recuperación epidídimaria a través de lavados.

Determinar la viabilidad de la célula espermática en el proceso pos descongelamiento mediante la realización del test de termoresistencia.

Determinar la viabilidad de la membrana plasmática de la cola de los espermatozoides a través del test Hiposmótico.

Analizar las alteraciones morfológicas de las células espermáticas recuperadas a través de lavados epididimarios en el proceso pos descongelación.

2. MARCO TEÓRICO.

CRIOPRESERVACIÓN.

El proceso de criopreservación es el mantenimiento del metabolismo celular en un estado de inactividad lo que permite la preservación de células y tejidos durante largos períodos de tiempo (Pérez, 2006). Este proceso se ha estudiado desde muchos años atrás y aunque las referencias actuales de la criobiología y criopreservación de espermatozoides se remontan a los años 1600 (D.C), no fue hasta el desarrollo de la inseminación artificial (IA) en los tardíos años 50’s y tempranos 60’s, cuando la industria lechera encontró necesarios métodos de almacenamiento a largo plazo de espermatozoides de toro y la criopreservación de semen se convirtió en un área de investigación científica importante (Walters, 2009).

La recuperación y criopreservación de espermatozoides tomados del epidídimo se constituye una manera útil de rescatar el germoplasma de especímenes que estén en peligro de extinguirse, o que hayan muerto por causas naturales o accidentes (Brooke, 2003). Esta técnica es particularmente indispensable en casos donde la colecta de semen es difícil como sucede en los animales salvajes, siendo el campo de mayor aplicación en la investigación (Anel, et al., 2002).

Trabajos que han sido desarrollados para crear técnicas de criopreservación de esperma extraído a partir del epidídimo; aunque se ha limitado su uso en algunas especies. En los bovinos esta práctica fue reportada inicialmente por (Watson, 1978); en los gatos el primer informe fue dado por (Goodrowe, 1993) y en los cerdo (Kikuchi K, 1998); en ratones (An TZ, 1999) (Sato M, 2004); ciervos (Yonai M, 1998); (Hishinuma M, 2003), equinos (Bruemmer JE, 2002); ovinos (Kaabi M, 2003);caninos y felinos (Hay & KLGoodrowe, 1993); (Pope CE, 1998); en otras especies se ha adelantado con gran velocidad aunque las investigaciones han sido orientadas primordialmente a la preservación de especies silvestres en vía de extinción (Hewitt, 2001). En el humano hay muchos estudios en los que se ha logrado la fertilización de oocitos e incluso la preñez usando gametos recuperados del epidídimo luego de su fallecimiento (Yu I, 2002).

CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES RECUPERADOS A TRAVÉS DE LA COLA DEL EPIDÍDIMO.

Las técnicas para la crio-conservación de espermatozoides inicialmente han tenido un progreso lento (Hammerstedt R., 1990); los efectos de la crio-conservación sobre la función espermática y la fertilidad han sido ampliamente estudiados y descritos, particularmente en bovinos (Prathalingam N. S. & al, 2006). Las tasas de enfriamiento y descongelación han sido ensayadas en la crio- conservación seminal de diferentes especies sin que se haya determinado con exactitud una curva estándar (Velasco, Medina, Robles, & Cruz, 2006); esto se debe principalmente a que los resultados dependen de factores tales como el diluyente, el crioprotectores usado y el tamaño del sistema de empaque; así como también de la calidad seminal y parámetros que son altamente variables entre individuos (Landsverk, 2000).

Por otro lado, es importante establecer un método que permita recolectar espermatozoides de toros genéticamente superiores que hayan muerto repentinamente, de manera tal que pueda obtenerse descendencia de esos toros, mediante la inseminación artificial o la fertilización In Vitro (Barrios D. , 2002). Siendo así podría implementarse la recolección de espermatozoides de la cola del epidídimo para propagar la calidad genética de toros pos-mortem, puesto que los espermatozoides que se encuentran allí tienen capacidad fertilizante (Reyes, C, M, R, & MA, 2002).

FACTORES QUE AFECTAN LA CÉLULA ESPERMÁTICA EN LA CRIOPRESERVACIÓN.

Shock Térmico.

El enfriamiento del semen disminuye la actividad metabólica de los espermatozoides y reduce el crecimiento bacteriano gracias a esto se prolonga la viabilidad de los espermatozoides (Gustavo, 2001). El shock térmico en bovinos es el conjunto de alteraciones que los espermatozoides sufren cuando son sometidos a un enfriamiento rápido pasando de 20°C a 5°C. Estas alteraciones están representadas por la pérdida rápida de motilidad; la alteración del tipo de motilidad con un movimiento retrogrado y circular, reducción del metabolismo, lesión del acrosoma y de la membrana plasmática acompañada de pérdida de los componentes intracelulares (Brass, 2001).

Se evaluaron las membranas de los espermatozoides que están compuestas principalmente por una cadena doble de fosfolípidos distribuidos aleatoriamente en la cual se localizan complejos proteicos cuando están inalterados los espermatozoides y se encuentran en estado fluido esencial para su eficiente función con el enfriamiento; los lípidos sufren una transición a la fase liquida cristalina y posteriormente a una de gel una vez que se encuentran en estado de gel los lípidos tienden a agregarse formando microdominios en áreas aún fluidas; estos lípidos agregados no se integran comúnmente con las proteínas asociadas con otros lípidos, los bordes de los microdominios se convierten en áreas más frágiles sujetas a la fusión o ruptura, además de volverse más permeables a los iones (Hammerstedt R., 1990).

Se comprobó que cuando los espermatozoides están alterados los iones Na+ y Ca++ entran en las células espermáticas y son retirados por medio de transporte activo. A 5°C la permeabilidad del Ca++ crece significativamente superando la capacidad de eliminación de los iones por medio de las bombas de Ca++ de esta forma, el Ca++ se acumula en el espermatozoide alcanzando niveles tóxicos (Brass, 2001).

Estrés Osmótico y Formación de Cristales de Hielo.

Otras alteraciones o fenómenos que ocurren en el proceso son el choque térmico y la formación de grandes cristales de hielo intracelular. Estos procesos ocurren si la curva de congelación es muy rápida, lo que genera la deshidratación progresiva de la célula (Pérez, 2006).

(Mazur, 1970) Estableció que cada tipo celular posee una velocidad óptima de congelación que garantiza su supervivencia luego de la criopreservación si la velocidad de congelación es demasiado rápida o demasiado lenta el estrés producido por el proceso de criopreservación aumenta y el estrés inducido por la formación de cristales de hielo está asociado a los cambios en la presión osmótica de la fracción no congelada. Cuando una solución es enfriada por debajo del punto de congelación los cristales de hielo se enuclean y el agua pura se cristaliza formando hielo, los solutos permanecen disueltos en la fracción de agua líquida y por lo tanto la presión osmótica de la solución aumenta. La proporción de agua cristalizada como hielo y la presión osmótica de la solución restante depende de: la temperatura, la velocidad de descenso de la misma y el volumen de la fracción no congelada (Stornelli MC, 2005).

(Crabo, 2001) Según Crabo (2001), la tasa de congelación está directamente relacionada con la permeabilidad de la membrana celular y las células que tienen una mayor permeabilidad al agua requieren de una mayor tasa de congelación para sobrevivir idealmente el hielo formado durante la congelación se conducirá a un aumento de la presión osmótica en el medio sin congelar, que a su vez sacara más agua de la célula; la concentración de sales aumentará tanto intra como extracelular mientras el agua se congela y la temperatura tiene que disminuir para proteger a las proteínas de la concentración de sales por lo tanto las tasas de congelación demasiado rápidas causa

daños estructurales por la formación de hielo intracelular y las tasas de congelación demasiado lentas causaran daño a las proteínas debido a las sales; el daño de la mayoría de las células se produce durante la congelación y el deshielo, por esta razón la descongelación del semen en general debe hacerse muy rápido para disminuir la posibilidad de daños por el crecimiento extracelular de cristales de hielo.

Estrés Oxidativo.

El estrés oxidativo en los espermatozoides consiste en el daño de los componentes estructurales y fisiológicos que surgen en ellos cuyo efecto está directamente relacionado con la disminución de la sobrevivencia y capacidad fecundante (Villa, 2009).

El estrés oxidativo es provocado por la formación de gran cantidad de especies reactivas al oxígeno (ROS) o moléculas que contienen radicales libres, las cuales se hacen presentes durante el manejo y manipulación del eyaculado, comprometiendo la viabilidad de los espermatozoides (Córdova, et al., 2009). Las membranas de los espermatozoides contienen alto porcentaje de ácidos grasos poli-insaturados y baja concentración de enzimas protectoras de las formas tóxicas del O2 (catalasas, dismutasas, peroxidasas y glutatión reductasas) esta relación entre ácidos grasos insaturados y enzimas protectoras convierte a los espermatozoides en células muy sensibles a las peroxidaciones por ROS (Villa, 2009). Las principales ROS que se conocen y que tienen relación con la funcionalidad espermática son: anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2, precursor de radical) y la mayoría de radicales hidroxilos (-OH); cuya presencia en el ambiente espermático se relaciona con el aumento de espermatozoides muertos (Córdova, et al., 2009).

(Maia & S.D, 2009) La susceptibilidad al estrés oxidativo varía entre las especies, los individuos y eyaculados por lo tanto la incidencia y severidad del daño oxidativo también varía. Cuando el semen se manipula para su uso en inseminación artificial se expone al oxígeno y varios pasos de su procesamiento pueden conducir a la producción de ROS y la reducción de las defensas antioxidantes. El lavado y dilución por ejemplo puede retirar o reducir la protección antioxidante proporcionada por el plasma seminal. Todos estos factores pueden contribuir a aumentar el daño oxidativo de los espermatozoides en el semen manipulado.

CRIOPRESERVACIÓN A PARTIR DEL EPIDÍDIMO.

(Hewitt-DA, 2001)según Hewitt-DA, 2001 Cuando se pretende congelar y descongelar gametos de un macho es importante considerar las diferencias que existen entre los espermatozoides del eyaculado y los que son extraídos del epidídimo tanto morfológico como funcional; tales diferencias en el momento de la congelación pueden influir en la estabilidad de la membrana frente al choque térmico y a la presión osmótica por lo tanto los métodos empleados para la criopreservación de espermatozoides eyaculados no son convenientes para ser usados con los espermatozoides obtenidos del epidídimo a menos que sean añadidos componentes similares a los encontrados dentro del epidídimo en la solución de congelación.

(Hewitt-DA, 2001) En la actualidad pueden encontrarse múltiples alternativas para preservar los espermatozoides dentro de los que se incluyen: congelación de células (gametos), de tejidos (epidídimo), la refrigeración de epidídimos obtenidos luego de la muerte y otras en las que se pretenden simular las condiciones fisiológicas del epidídimo in vitro muchas investigaciones se han realizado especialmente con espermatozoides bovinos para entender la función de los gametos y diseñar un medio útil de conservación para mantener los espermatozoides vivos en un estado diferente al de congelación.

Hasta ahora ha sido muy difícil imitar las condiciones del epidídimo in vitro (por razones como: pH bajo, altas concentraciones de células, baja tensión de oxígeno, etc.) los espermatozoides pueden exhibir la capacidad de fertilizar después de ser almacenados por varios días en epidídimos refrigerados de diferentes especies desafortunadamente la refrigeración del epidídimo no es una alternativa práctica para almacenar espermatozoides (De Pauw, 2003), formando a la criopreservación una herramienta viable para conservar el material genético.

Existen muchas variables que afectan la fertilidad y la supervivencia de los espermatozoides mamíferos cuando son congelados por lo tanto hay que considerar algunos factores esenciales para establecer el procedimiento de congelación (Brooke, 2003).

EL INTERVALO ENTRE LA MUERTE, RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL EPIDÍDIMO.

Dentro de los factores que determinan la viabilidad de los espermatozoides es el tiempo transcurrido desde la muerte del animal hasta la congelación de los gametos y el manejo que se le dé al epidídimo durante ese tiempo será uno de los factores más condicionantes para la supervivencia y capacidad fecundante de los espermatozoides en el futuro (Anel, et al., 2002). Para estos mismos autores la viabilidad de los espermatozoides depende del tratamiento dado al epidídimo. En ratones, el 30% de los espermatozoides conservan su motilidad cuando son mantenidos a 4oC por 10 días, considerando que la motilidad decrece de 10 a 15% en las 24 horas siguientes a la muerte de los animales que son conservados a temperatura ambiente (Anel, et al., 2002).

En ciervo (Cervus nippon) ha sido usado como un modelo potencialmente bueno para aplicar estas técnicas asistidas de reproducción con el fin de evitar que siga en peligro de extinguirse. En él ciervo los espermatozoides han sido recuperados y usados para la criopreservación y posterior inseminación artificial y fertilización in vitro. Sin embargo la información sobre el almacenamiento de los epidídimos es limitada. (Hishinuma M, 2003).

En ratones se han producido fertilizaciones in vitro (FIV) de oocitos con espermatozoides tomados en la cola del epidídimo de cadáveres que fueron conservados en un cuarto a temperatura fija por 24 horas también estos han sido recuperados del epidídimo gametos viables después de haberse refrigerado por 7 días post-mortem; posteriormente fueron producidos embriones jóvenes derivados de la FIV. (An TZ, 1999).

Utilizando la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (Hishinuma M, 2003) se promovieron fetos normales de ratón usando espermatozoides recuperados después de 20 días de la muerte del ratón.

Los espermatozoides recuperados de especímenes luego de su muerte, incluso muchas horas después, mantienen su función normal (Yu I, 2002). Espermatozoides del epidídimo con una motilidad de 70 a 90% pueden ser obtenidos varias horas después siempre y cuando los órganos sean refrigerados inmediatamente (Gerber & al., 2002).

(Anel, et al., 2002), observaron que dependiendo del intervalo entre la recuperación de los espermatozoides y la muerte, la motilidad espermática disminuirá significativamente entre las 24 y 48 horas. Después de las 48 horas pos-mortem, todas las medidas de calidad del

esperma declinan progresivamente. Estos autores, sugiriere que el tejido del epidídimo debe refrigerarse antes de las 48 horas después de la muerte con el fin de asegurar una mayor probabilidad de vida de los espermatozoides.

DILUYENTES.

Los diluyentes para la congelación de semen bovino son de gran importancia para la supervivencia de los espermatozoides durante la criopreservación. Se deben considerar varias características como: la concentración del crioprotectores, la concentración de sal y de la inclusión de detergentes (Chaveiro A, 2006). Los componentes básicos de los diluyentes de congelación son:

1. Crioprotectores: Glicerol. DMF, EDTA.

2. Antibióticos: Penicilina G-potásica o sódica cristalina, la Gentamicina o Amikacina,

la Estreptomicina o Penicilina G-potásica cristalina.

3. Buffer o tampón: Tris, Hepes, citrato.

4. Azúcar: Fructosa, Glucosa, Lactosa, Rafinosa, Azucares de Alto Peso Molecular.

5. Lipoproteínas: Yema de huevo.

(Borges, 2003).Un sistema tampón debe ser uno de los constituyentes de los disolventes para neutralizar los iones de hidrógeno producidos por el metabolismo espermático manteniendo el pH de la solución cercano a la neutralidad (6,8 a 7,1). Los búferes más utilizado en los diluyentes para semen bovino son el citrato por sus propiedades tampón como mejorar la solubilidad fracciones de proteína de yema de huevo y Tris hidroximetil-aminometano (TRYLADIL®).

3.0 MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1 Localización.

El proyecto se llevó a cabo en las instalaciones del laboratorio de reproducción animal perteneciente al programa de Medicina Veterinaria de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de La Salle sede Floresta.

3.2 Población y muestra.

Se utilizaron cinco pares de testículos de la raza Bos Taurus Indicus, estos fueron recolectados de la planta de sacrificio de la ciudad de Bogotá.

3.3 Variables.

Las variables qué se analizaron en el estudio fueron: motilidad espermática (%), morfología espermática (%), vigor espermático (escala de 0 a 5). y viabilidad del espermatozoide (%).

3.4 Análisis Estadístico.

Para el análisis de los datos la investigación se apoyó de la herramienta estadística descriptiva en el programa Excel®. Además los datos fueron sometidos a un análisis de varianza ANOVA SIMPLE utilizando el programa STATGRAPHICS® Centurión XVI versión 2013, los parámetros como la motilidad total, motilidad progresiva y vigor fueron analizados como variables independientes.

3.5 Métodos y Procedimientos.

El tamaño de la muestra fue de cinco pares de testículos tomados al azar como número total de la muestra, estos procedieron de la planta de sacrificio del frigorífico de Guadalupe en la ciudad de Bogotá (autopista sur), a partir de los cuales se procedió a realizar el ordeño epidídimal, poder realizar el protocolo de criopreservación y finalmente el análisis y evaluación post-congelamiento (Henowethlarg, 2004).

Toma de la Muestra.

La recolección de las muestras (testículos) se realizó posterior al sacrificio de los bovinos mayores de 2 años de la raza Bos Taurus Indicus, inmediatamente fueron colocadas pinzas mosquito Halsted para obstruir los ductos deferentes e impedir la contaminación con emacías y detritos celulares, estos fueron lavados con una solución de Ringer Lactato para su posterior transporte.

Limpieza Del Material.

Cada testículos fue limpiado y secado con gasa estéril y se colocó cada uno de ellos dentro de bolsas plásticas selladas (tipo “zip-lock”), previamente identificado el material (testículos) y estas a su vez se colocaron en una cava con una temperatura entre los 20 y 25 ºC con hielo seco, los testículos fueron aislados del hielo seco cubriéndolos con papel periódico, para evitar el choque térmico, de esta forma fueron transportados en cavas hacia el laboratorio de la Universidad de La Salle.

El transporte de los testículos al laboratorio de la Universidad de la Salle se demoró entre 1 a 1 ½. Hora

Recolección de Espermatozoides Epidídimarios En El Laboratorio.

Para este paso se procedió a colocar en una bandeja esterilizada el materias se realizó la disección de los testículos retirando todas las túnicas, bolsa escrotal y estructuras adyacentes, y así poder canular el lumen del ducto deferente, además fue introducida una aguja Pericraneal calibre 22Gx3/4 – 19x 0, 7 (ver Figura 1). Inmediatamente se procedió a adaptar al catéter una jeringa que contenía 6 ml de medio diluyente Triladyl®. Esta jeringa

se acoplo junto con el catéter lentamente dentro del lumen de cada vaso deferente. Las paredes de los vasos deferentes se pinzaron con una Pinzas mosquito Halsted contra la aguja para evitar pérdida del líquido de lavado.

Figura 1. Disección Del Túnicas Epidídimo.

Fuente: Novoa, 2013

Se localizó el septum del epidídimo, correspondiente a la porción cercana de la zona media de la cola del epidídimo. Allí se realizaron varios cortes horizontales con cuchillas minora, justo antes que el diámetro del epidídimo se redujera, para obtener la mayor cantidad de espermatozoides posibles (ver Figura 2)

Figura 2. Disección del Epidídimo.

Fuente: Novoa, 2013

La porción seccionada de la cola del epidídimo se colocó en una Caja de Petri y se sujeta con una gasa con los dedos pulgar e índice. (Ver Figura 3)

Figura 3. Llenado del Epidídimo.

Fuente: Novoa, 2013

A medida que se hace el lavado se observó un llenado visible de la cola del epidídimo. Al continuar con presión suave y continua con la jeringa, apareció en el extremo seccionado de la cola del epidídimo el contenido epididímario, representado por un líquido espeso y de un color crema amarillo pálido o blanco cremoso, dependiendo de la concentración espermática obtenida, se obtuvo una concentración promedio aproximadamente en los primeros lavados de 575X106 millones de espermatozioides /mL. (Ver Figura 4)

Figura 4.Lavado del Epidídimo.

Fuente: Novoa, 2013

Fueron evaluados parámetros espermáticos con relación a Motilidad Total, Motilidad Progresiva, y vigor espermáticos. Estos parámetros fueron evaluados aproximadamente de 15 a 45 pos lavados e inclusive 1hora posterior a la recuperación, ya que movimientos progresivos espermáticos epididimarios adquieren su mejor expresión durante este periodo.

Después de haber realizado la dilución seminal 1:1 con el medio diluyente que contiene el crioprotector, el semen se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. (Ver Figura 5) Posterior a la dilución se realizó nuevamente la evaluación de todos los parámetros seminales (Motilidad progresiva, motilidad total, y vigor).

Figura 5. Muestra Inicial.

Fuente: Novoa, 2013

Posteriormente el semen fue envasado y se realizó la curva de refrigeración durante un periodo aproximadamente de 12 horas, después de haber finalizada esta curva de enfriamiento el semen fue congelado en vapores de nitrógeno exponiendo las pajillas durante 15 minutos a 4 cm por encima del nivel del nitrógeno a una distancia de 6cm, pasado este tiempo se realizó la inmersión de las pajillas en el nitrógeno líquido a una temperatura de -196 ºC. (Ver figuras 6).

Figuras 6. Curva De Enfriamiento.

Fuente: Novoa 2013

La descongelación de pajillas fue realizada en un baño de María a una curva de descongelación de 37°C por 40 segundos, e inmediatamente se evaluaron las variables descritas. (Ver figura 7)

Figura 7. Descongelación De Pajillas.

Fuente: Novoa 2013

DIAGRAMA DE FLUJO

Si

Limpieza

No

Testículos Con

Túnicas

Dilución 1:1

MT, MP, V

Identificación Aislamiento

Cava Hielo Seco

Evaluación

MT, MP, V

I, A,

Fertilización

In Vitro.

Transporte

Remover

Túnicas

Identificación

Estructuras Jeringas

Medio Realizar

Corte Cola

epidídimo

Lavado

Recolección Descartar

DIAGRAMA DE FLUJO

Fuente Novoa, 2013

Curvas De

Refrigeración 12-24 h

Empaque

Pajillas

Limpiado Y Secado

Bolsas “Zip-Lock”

Recolección

Post-Mortem

Motilidad Espermática.

Este parámetro fue determinado mediante la utilización de microscopia óptica con un aumento de 400 X, utilizando 10 µg de semen colocado entre el portaobjetos y el cubreobjetos, esta evaluación fue realizada a una temperatura de 37°C. La motilidad progresiva fue determinada por la evaluación del porcentaje de células espermáticas que presenten movimiento circular abierto, en la evaluación de mínimo 6 campos visuales (Pineda, 2002).

Vigor.

El vigor o el movimiento de los espermatozoides fue clasificado de cero (ausente) a cinco (máximo). La evaluación de los parámetros anteriormente mencionados como motilidad progresiva y vigor se realizó por un grupo de profesionales con experiencia y habilidad en la manipulación y evaluación de estos parámetros, y en compañía del equipo de investigación de este proyecto según los parámetros de evaluación descritos por (Jasko, 1994).

Concentración Espermática.

La concentración se determinó en las muestra de semen fresco, realizando una dilución en una solución de formol salina tamponada en una proporción 1:200. Para el conteo de células y fue utilizada la cámara de Newbauer, para la lectura se realizará se empleó la microscopia óptica con aumento de 400X (Guimarães, et al., 2010).

Morfología Espermática.

Las muestras de semen fresco, se evaluaron inmediatamente se realizó el lavado y ordeño epididímario, colocándose una gota de semen suficiente (100 µL) para evaluarla en solución de formol salino tamponado según metodología descrita por (Barth & Oko, 1989). La evaluación se realizó en microscopia óptica y se consideraron mínimo 100 células, de acuerdo al protocolo descrito por (Nie & Wenze, 2001). Además fueron utilizadas diferentes tipos de coloraciones celulares como Verde Malaquita, Rojo Congo, Eosina Nigrosina para poder determinar y analizar los cambios morfoestructurales y observas defectos en los espermatozoides en el proceso pre y pos congelamiento.

Evaluación del Semen pos descongelación.

Después de la descongelación del semen se evaluaron los parámetros anteriormente nombrados como la motilidad total, motilidad progresiva, vigor y morfología, además fueron realizadas pruebas para determinar la integridad de la membrana espermática de la cola del espermatozoide empleándose el Test Hiposmótico (HOST), y también fue evaluada la viabilidad de la muestra en relación al tiempo mediante el Test de Termo resistencia.

Test de Termo Resistencia (TTR).

Las muestras se sometieron a un test de resistencia, inmediatamente después de la descongelación la prueba fue realizada empleándose un Eppendorff para depositar la muestra, incubando-se a 37ºC y fueron evaluados los parámetros (motilidad total, progresiva y vigor) las evaluaciones se realizaron a intervalos de 30 minutos hasta que el porcentaje de la motilidad llego al 5% (Pérez, 2006).

Test Hiposmótico (HOST).

La evaluación de la integridad funcional de la membrana plasmática de la cola de los espermatozoides se evaluó mediante el test Hiposmótico, el cual consiste en la mezcla de una gota de 100 µg de semen en un ml de solución de sacarosa a 100 mOsm/L, a una temperatura de 37°C. Posteriormente la muestra es incubada en baño maría por un periodo de treinta minutos, luego las muestras se fijaron en 0.5 ml de solución de formol salino tamponado y se realizó la lectura en microscopia de óptica convencional con un aumento de 400X veces. El índice de integridad de la membrana plasmática de la cola de los espermatozoides fue calculado empleando la siguiente fórmula: HO (%) = (% de alteraciones en la región de la cola del espermatozoide HO) – (% de alteraciones en la región de la cola del espermatozoide en semen en fresco antes del test hiposmótico HO), (Melo & Henry, 1999).

RESULTADOS y DISCUSIÓN.

Los valores encontrados en la Tabla 1, representan los resultados de la estadística descriptiva y prueba de comparación de medias (Tukey), para las características espermáticas (motilidad total, motilidad progresiva y vigor) pre y post-descongelación de espermatozoides obtenidos de los cinco pares de colas de epidídimo de toros. Demás salidas estadísticas y análisis de varianza ver anexo 1.

Tabla 1. Estadística Descriptiva Resultados De Test De Comparación De Medias (Tukey) Para Motilidad Total, Motilidad Progresiva Y Vigor.

TRATAMIENTO N Promedio Desviación Estándar

Pre congelación 10 70.5 ± 13.21 A Motilidad total Pos congelación 10 40.0 ± 5.77 B

Total 20 ±

Pre congelación 10 64.5 ± 14.61 A

Motilidad Progresiva Pos congelación 10 34.5 ± 3.94 B Total 20 ±

Pre congelación 10 3,5 ± 0,52 A

Vigor Pos congelación 10 3,1 ± 0,31 A Total 20 ±

* Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p≤0.05) Como se observa en la tabla 1 y Figuras 8, 9, 10 la motilidad total espermática presentó valores promedios de 70.5±13.21 pre congelación y para pos congelación los valores fueron 40.0±5.77, resultados que son similares al ser comparados con los encontrados y reportados por Gutiérrez et al. (2004), donde estudiando testículos recuperados en una central de sacrificio en México, encontraron valores de 59.16±10.58 para motilidad espermática pre congelación y 35.83±11.77 para motilidad espermática pos congelación utilizando la técnica de maceración de epidídimos de 35 toros de diferentes razas con edades que oscilaban entre 2-12 años.

Figura 8 Motilidad Total.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T 8 T 9 T 10

Motilidad Total.

MOTILIDAD TOTAL PRECONGELACIÓN MOTILIDAD TOTAL POSCONGELACIÓN

%

Testículos.

Figura 9 Motilidad Progresiva.

Figura 10 Vigor.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T 8 T 9 T 10

Motilidad Progresiva.

MOTILIDAD PROGRESIVA PRE CONGELACIÓN

MOTILIDAD PROGRESIVA POS CONGELACIÓN

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T 8 T 9 T 10

Vigor.

VIGOR PRE CONGELACIÓN VIGOR POS CONGELACIÓN

La viabilidad espermática se pierde por proceso de criopreservación debido a factores como: Shock Térmico, Estrés Osmótico y Formación de Cristales de Hielo y Estrés Oxidativo hay que considerar que existen reportes en los que se señala, que los espermatozoides obtenidos de epidídimo son más resistentes a sufrir daños durante el proceso de criopreservación que los espermatozoides obtenidos por medio de la eyaculación efecto que coincide con los resultados obtenidos en este trabajo (Reyes, Boilar, & Sullivan, 2000).

Se realizó además el test de termo resistencia (TTR) el cual evalúa la viabilidad de la célula espermática con relación a los parámetros como motilidad total, progresiva y vigor después del descongelamiento del semen. Se encontró diferencia significativa (p≤0.05). La tabla 2 representa un análisis de regresión qué establece la variación de la motilidad espermática con relación al tiempo de descongelación. En relación al vigor espermático se observó diferencia significativa (p≤ 0.05) (Tablas 2, 3, 4).

Tabla 2. Estadística Descriptiva Resultados De Test De Comparación De Medias (Tukey) Para Motilidad Total Prueba De Termo Resistencia.

Tiempo Promedio ± Desviación Estándar

0 min 35,0 ± 10,54 BC 30 min 41,0 ± 8,75 AB 60min 43,0 ± 7,14 A 90 min 37,0 ± 6,74 ABC 120 min 33,0 ± 8,56 CD 150 min 25,5 ± 3,68 D

Total 35,75 ± 9,47

* Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p≤0.05)

Tabla 3. Estadística Descriptiva Resultados De Test De Comparación De Medias (Tukey) Para Motilidad Progresiva Prueba De Termo Resistencia.

Tiempo Promedio ± Desviación Estándar

0 25,0 ± 5,27 CD

30 37,5 ± 10,06 A

60 34,5 ± 8,64 AB

90 34,5 ± 8,95 AB

120 29,0 ± 8,75 BC

150 20,5 ± 4,97 D

Total 30,16 ± 9,74

* Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p≤0.05)

Tabla 4. Estadística Descriptiva Resultados De Test De Comparación De Medias (Tukey) Para Vigor En La Prueba De Termo Resistencia.

Tiempo Promedio ± Desviación Estándar

0 3,0 ± 0 B 30 3,3 ± 0,48 A 60 3,3 ± 0,48 A 90 3,3 ± 0,48 A

120 3,1 ± 0,31 A 150 2,8 ± 0,42 B

Total 3,08 ± 0,38

* Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p≤0.05)

En el test de termo resistencia (TTR) ocurre una notoria perdida de las características espermáticas en función de tiempo que se comparan en trabajos descritos con semen obtenido por recolecta normal.

Morfología.

Según los estudios realizados, no existen prácticamente diferencias en la calidad de los espermatozoides procedentes de epidídimo en comparación con los obtenidos de eyaculados (Tebet JM, 2006; Luvoni GC., 2006). (Tanto en fresco como a la descongelación) siempre que se obtengan de la cola del epidídimo y vasos deferentes, pues de lo contrario, aparecerán células inmaduras con diversos defectos morfológicos. Sólo se ha observado un menor porcentaje de espermatozoides con acrosoma intacto en esperma de epidídimo comparado con el eyaculado, posiblemente debido a la ausencia de interacción con factores estabilizantes de membrana, potencialmente presentes en el plasma seminal (Luvoni GC., 2006).

Este porcentaje de células que presentan anomalías debido a su inmadurez suele ser de un 57.2% (Goodrowe KL, 1993), 52.7% (Lengwinat T, 1994), 50.6% (Axnér E, 2004), 51.0% (Villaverde AI, 2006), o incluso del 72.7% (Siemieniuch M, 2007).

Como es de esperar, los espermatozoides epididimarios presentan un alto porcentaje de gotas citoplasmáticas proximales, como describen (Axnér & al, 1999) y (Villaverde AI, 2006), (34.5% y 20.9%, respectivamente), al igual que ocurre con las distales, según indican según 44.5% (Axnér & al, 1999), 12.1% (Pukazhenthi B, 2002).y 9.8% (Villaverde AI, 2006)

El porcentaje de espermatozoides anormales encontrado en esta investigación (Figura 11) fue de 34%, siendo este mayor a lo reportado por (Henault & al, 1995) , lo cual indica que el protocolo de recolección, el medio de transporte, el tiempo de procesamiento de la muestra estén indicando la presentación de este porcentaje tan alto encontrado y reportado estén posiblemente en este estudio posiblemente a estos factores que se han mencionado anteriormente. Los estudios relatan que el porcentaje de células con alteraciones el 20% siendo de la cola de epidídimo, ya que puede influir en la fertilización. (Cupps, 1998; Barrios A. , 2002), señalan que al menos el 70% de los espermatozoides de cola de epidídimo deben ser normales. (Barrios A. , 2002), menciona que el nivel de tolerancia máxima para anormalidades primarias y secundarias debe ser del 20%, mientras que el nivel de tolerancia para los defectos del acrosoma es del 12% en espermatozoides recolectados de la cola de epidídimo, antes de su congelación. Siendo esto diferente para (Cupps, 1998), obteniendo para anormalidades en primarias y secundarias un total del 20% y en anormalidades de acrosoma solo el 5%.

La morfología pre congelación esta alta (34%) debido a los cambios de temperatura, ambiente, transporte, tiempo o intervalo de colecta y procesamiento, en el proceso de congelación aumenta más la presencia la incidencia de gota citoplasmática los cual nos indica que las células recolectadas son provenientes de la cola, cuerpo del epidídimo, son células inmaduras y deben transitar hacia la uretra pélvica mezclándose con plasma seminal y adquiriendo su madurez y su capacidad para fertilizar (Barth y Oko, 1989)..

La gota protoplásmica o citoplasma, se considera anormal, esta suele desprenderse de los espermatozoides tras la eyaculación, y está compuesta de citoplasma residual. Puede localizarse en la región del cuello, donde se conoce como gota proximal, o cerca del anillo citoplásmico, donde se le denomina gota distal (Donald's., 1981).

Figura 11. Representación Esquemática De Las Diferentes Características Morfológicas De La Muestra De Semen Pre Congelamiento.

5%17%

12%66%

Pre Congelamiento.

DEFECTOS CABEZA PIEZA INTERMEDIARIA PIEZA TERMINAL NORMALES

TEST HIPOSMÓTICO.

Con relación al test Hiposmótico (Figura 12) existe una respuesta muy individual al observar los resultados este tipo de hallazgo en el presente estudio sugiere que las células inmaduras al ser sometidas a un estrés (criopreservación) este proceso ejerce mayores daños celulares y morfo estructurales en las membranas plasmáticas, que posiblemente este orientado al proceso de deshidratación y rehidratación de la célula y a los cambios posiblemente de osmolaridad.

Los espermatozoides recolectados de la cola del epidídimo post mortem evidenciaron sobrevivencia, aunque tienen menor movilidad que los del semen bovino recolectado por métodos convencionales como el electro; los espermatozoides epididimarios tuvieron una mayor movilidad individual en la segunda lectura de cada muestra, es decir, una 45 min post-lavado del epidídimo. Para poder alcanzar su plena movilidad de los espermatozoides.

El tiempo que se requiere para la activación de los espermatozoides epididimarios se ha asociado, en la mayoría de las especies, con el hecho que los espermatozoides, una vez formados en el testículo se mezclan con fluidos epididimarios donde permanecen inmóviles y con un nivel de metabolismo muy bajo. Esto puede interpretar como una necesidad de preservar las reservas energéticas espermáticas y para disminuir los riesgos de alteraciones de membrana, estructuras internas y composición bioquímica, por efecto de agentes oxidantes endógenos producidos por la actividad mitocondrial (Brooks, 1983).

Figura 12 Test Hiposmótico.

0

10

20

30

40

50

60

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10

Series1 Series2

Test Hiposmótico.

Conclusiones y Recomendaciones.

los medios usados para crio preservar espermatozoides tomados del epidídimo pueden ser similares a los empleados para preservar espermatozoides eyaculados; solamente debe tenerse presente que dentro del epidídimo, las células espermáticas se encuentran inmóviles por lo que el medio debe estar enriquecido con sustancias que puedan activar su motilidad.

Los espermatozoides viables pueden ser recuperados de la cola de epidídimo de toros que murieron recientemente y ser diluidos, congelados y descongelados para ser utilizados en biotecnologías como inseminación artificial, fertilización in vitro e inyección Intracitoplasmática.

El protocolo utilizado se puede emplear para crio preservar gametos recuperados a través de epidídimo de Toros de alta genética, de toros de casta y animales de alto valor genético.

Esta investigación preliminar puede ser el inicio para realizar otros estudios

como cual tipo de medios diluyentes, crioprotectores y curvas de enfriamiento y congelamiento son más eficaces para la criopreservación de semen epididímario de cualquier especie.

La célula espermática se mantiene su viabilidad pos descongelación, este

trabajo constituye un estudio preliminar para futuras investigaciones.

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ANEXOS.

ANOVA SIMPLE - MOTILIDAD TOTAL POR TRATAMIENTO. Variable dependiente: MOTILIDAD TOTAL. Factor: TRATAMIENTO. Número de observaciones: 20 Número de niveles: 2 RESUMEN ESTADÍSTICO PARA MOTILIDAD TOTAL.

TRATAMIENTO Recuento Promedio Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo

Pos congelación

10 40,0 5,77 14,43% 30,0

Pre congelación 10 70,5 13,21 18,74% 50,0

Total 20 55,25 18,52 33,53% 30,0

TRATAMIENTO Máximo Rango Sesgo Estandarizado Curtosis Estandarizada

Pos congelación 45,0 15,0 -0,69 -0,89 Pre congelación 85,0 35,0 -0,63 -0,96

Total 85,0 55,0 0,82 -1,18

TABLA DE MEDIAS PARA MOTILIDAD TOTAL POR TRATAMIENTO CON INTERVALOS DE CONFIANZA DEL 95,0%.

Error Est. TRATAMIENTO Casos Media (s agrupada) Límite Inferior Límite Superior

Pos congelación 10 40,0 3,22 35,20 44,79 Pre congelación 10 70,5 3,22 65,70 75,29

Total 20 55,25

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA MOTILIDAD TOTAL POR TRATAMIENTO.

Método: 95,0 porcentaje LSD

TRATAMIENTO Casos Media Grupos Homogéneos

Pos congelación 10 40,0 X Pre congelación 10 70,5 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

Pos congelación - Pre congelación * -30,5 9,58

* indica una diferencia significativa.

ANOVA SIMPLE - MOTILIDAD PROGRESIVA POR TRATAMIENTO. Variable dependiente: MOTILIDAD PROGRESIVA. Factor: TRATAMIENTO. Número de observaciones: 20 Número de niveles: 2

Poscongelación Precongelación

Medias y 95,0% de Fisher LSD

TRATAMIENTO

35

45

55

65

75

85

MO

TIL

IDA

D T

OT

AL

RESUMEN ESTADÍSTICO PARA MOTILIDAD PROGRESIVA.

TRATAMIENTO Recuento Promedio Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo

Poscongelación 10 34,0 3,94 11,60% 30,0 Pre congelación

10 66,5 14,15 21,28% 45,0

Total 20 50,25 19,49 38,80% 30,0

TRATAMIENTO Máximo Rango Sesgo Estandarizado

Curtosis Estandarizada

Pos congelación 40,0 10,0 0,52 -0,69 Pre congelación 80,0 35,0 -0,82 -0,84

Total 80,0 50,0 0,98 -1,32

TABLA ANOVA PARA MOTILIDAD PROGRESIVA POR TRATAMIENTO.

Fuente Suma de Cuadrados

Gl Cuadrado Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos

5281,25 1 5281,25 48,94 0,0000

Intra grupos 1942,5 18 107,917

Total (Corr.) 7223,75 19

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA MOTILIDAD PROGRESIVA POR TRATAMIENTO. Método: 95,0 porcentaje LSD

TRATAMIENTO Casos Media Grupos Homogéneos

Pos congelación 10 34,0 X

Pre congelación 10 66,5 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

Pos congelación - Pre congelación * -32,5 9,76

* indica una diferencia significativa.

ANOVA SIMPLE - VIGOR POR TRATAMIENTO. Variable dependiente: VIGOR. Factor: TRATAMIENTO. Número de observaciones: 20 Número de niveles: 2 RESUMEN ESTADÍSTICO PARA VIGOR.

TRATAMIENTO Recuento Promedio Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo

Poscongelación 10 3,1 0,31 10,20% 3,0

Pre congelación

10 3,5 0,52 15,05% 3,0

Total 20 3,3 0,47 14,24% 3,0

TRATAMIENTO Máximo Rango Sesgo Estandarizado

Curtosis Estandarizada

Pos congelación 4,0 1,0 4,08 6,45 Pre congelación 4,0 1,0 0 -1,65

Total 4,0 1,0 1,72 -1,13

Poscongelación Precongelación

Medias y 95,0% de Fisher LSD

TRATAMIENTO

29

39

49

59

69

79

MO

TIL

IDA

D P

RO

GR

ES

IVA

TABLA ANOVA PARA VIGOR POR TRATAMIENTO.

Fuente Suma de Cuadrados

Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 0,8 1 0,8 4,24 0,0544

Intra grupos 3,4 18 0,188

Total (Corr.) 4,2 19

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA VIGOR POR TRATAMIENTO. Método: 95,0 porcentaje LSD

TRATAMIENTO Casos Media Grupos Homogéneos

Pos congelación 10 3,1 X pre congelación 10 3,5 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

Poscongelación - Precongelación -0,4 0,40

* indica una diferencia significativa.

ANOVA SIMPLE - MOTILIDA TOTAL POR TIEMPOS.

Variable dependiente: MOTILIDA TOTAL (10) Factor: TIEMPOS (0) Número de observaciones: 60 Número de niveles: 6 RESUMEN ESTADÍSTICO PARA MOTILIDA TOTAL.

TIEMPOS Recuento Promedio Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo Máximo Rango

0 10 35,0 10,54 30,11% 25,0 45,0 20,0

30 10 41,0 8,75 21,35% 25,0 50,0 25,0

60 10 43,0 7,14 16,62% 30,0 55,0 25,0

90 10 37,0 6,74 18,24% 25,0 45,0 20,0

120 10 33,0 8,56 25,95% 20,0 45,0 25,0

150 10 25,5 3,68 14,46% 20,0 30,0 10,0

Total 60 35,75 9,47 26,48% 20,0 55,0 35,0

Poscongelación Precongelación

Medias y 95,0% de Fisher LSD

TRATAMIENTO

2,8

3

3,2

3,4

3,6

3,8

VIG

OR

TIEMPOS Sesgo Estandarizado Curtosis Estandarizada

0 0 -1,65 30 -0,48 -0,50 60 -0,32 0,22 90 -0,31 -0,38 120 0,15 -0,68 150 -0,21 -0,47

Total 0,17 -1,94

TABLA ANOVA PARA MOTILIDA TOTAL POR TIEMPOS.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 1948,75 5 389,75 6,30 0,0001

Intra grupos 3342,5 54 61,89

Total (Corr.) 5291,25 59

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA MOTILIDA TOTAL POR TIEMPOS. Método: 95,0 porcentaje LSD

TIEMPOS Casos Media Grupos Homogéneos

150 10 25,5 X 0 11 32,72 XX 120 10 33,0 XX 90 10 37,0 XX 30 10 41,0 X 60 10 43,0 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

0 - 30 -6,0 7,05 0 - 60 * -8,0 7,05

0 - 90 -2,0 7,05 0 - 120 2,0 7,05

0 - 150 * 9,5 7,05 30 - 60 -2,0 7,05

30 - 90 4,0 7,05 30 - 120 * 8,0 7,05

30 - 150 * 15,5 7,05 60 - 90 6,0 7,05

60 - 120 * 10,0 7,05 60 - 150 * 17,5 7,05

90 - 120 4,0 7,05 90 - 150 * 11,5 7,05

120 - 150 * 7,5 7,05

* indica una diferencia significativa.

ANOVA SIMPLE - MOTILIDAD PROGRESIVA POR TIEMPOS. Variable dependiente: MOTILIDAD PROGRESIVA (20) Factor: TIEMPOS (0) Número de observaciones: 60 Número de niveles: 6 RESUMEN ESTADÍSTICO PARA MOTILIDAD PROGRESIVA.

TIEMPOS

Recuento

Promedio

Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo Máximo Rango

0 10 25,0 5,27 21,08% 20,0 30,0 10,0 30 10 37,5 10,06 26,85% 30,0 55,0 25,0 60 10 34,5 8,64 25,05% 30,0 55,0 25,0 90 10 34,5 8,95 25,97% 25,0 50,0 25,0 120 10 29,0 8,75 30,19% 20,0 50,0 30,0 150 10 20,5 4,97 24,25% 15,0 30,0 15,0

Total 60 30,16 9,741 32,29% 15,0 55,0 40,0

TIEMPOS Sesgo Estandarizado Curtosis Estandarizada

0 0 -1,65 30 1,51 -0,01 60 2,53 2,03 90 1,36 0,10 120 2,29 2,11 150 0,78 -0,10

Total 3,17637 1,42

TABLA ANOVA PARA MOTILIDAD PROGRESIVA POR TIEMPOS.

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 2128,33 5 425,66 6,62 0,0001

Intra grupos 3470,0 54 64,25

Total (Corr.) 5598,33 59

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA MOTILIDAD PROGRESIVA POR TIEMPOS. Método: 95,0 porcentaje LSD

TIEMPOS Casos Media Grupos Homogéneos

150 10 20,5 X 0 11 24,5 XX 120 10 29,0 XX 60 10 34,5 XX 90 10 34,5 XX 30 10 37,5 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

0 - 30 * -12,5 7,18 0 - 60 * -9,5 7,18

0 - 90 * -9,5 7,18 0 - 120 -4,0 7,18

0 - 150 4,5 7,18 30 - 60 3,0 7,18

30 - 90 3,0 7,18 30 - 120 * 8,5 7,18

30 - 150 * 17,0 7,18 60 - 90 0 7,18

60 - 120 5,5 7,18 60 - 150 * 14,0 7,18

90 - 120 5,5 7,18 90 - 150 * 14,0 7,18

120 - 150 * 8,5 7,18

* indica una diferencia significativa.

ANOVA SIMPLE - VIGOR POR TIEMPOS. Variable dependiente: VIGOR (2) Factor: TIEMPOS (0) Número de observaciones: 60 Número de niveles: 6 RESUMEN ESTADÍSTICO PARA VIGOR.

TIEMPOS

Recuento

Promedio

Desviación Estándar

Coeficiente de Variación

Mínimo Máximo Rango

0 10 3,0 0 0% 3,0 3,0 0 30 10 3,3 0,48 14,63% 3,0 4,0 1,0 60 10 3,3 0,48 14,63% 3,0 4,0 1,0 90 10 3,0 0 0% 3,0 3,0 0 120 10 3,1 0,31 10,20% 3,0 4,0 1,0 150 10 2,8 0,42 15,05% 2,0 3,0 1,0

Total 60 3,08 0,38 12,37% 2,0 4,0 2,0

TIEMPOS Sesgo Estandarizado Curtosis Estandarizada

0 30 1,33 -0,79 60 1,33 -0,79 90 120 4,08 6,45 150 -2,29 0,90

Total 2,81 5,79

TABLA ANOVA PARA VIGOR POR TIEMPOS.

Fuente Suma de Cuadrados

Gl Cuadrado Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos

1,88 5 0,37 3,04 0,0174

Intra grupos 6,7 54 0,12

Total (Corr.) 8,58 59

PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA VIGOR POR TIEMPOS. Método: 95,0 porcentaje LSD

TIEMPOS Casos Media Grupos Homogéneos

150 10 2,8 X

0 10 3,0 XX

90 10 3,0 XX

120 10 3,1 XX

60 10 3,3 X

30 10 3,3 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

0 - 30 -0,3 0,31 0 - 60 -0,3 0,31

0 - 90 0 0,31 0 - 120 -0,1 0,31

0 - 150 0,2 0,31 30 - 60 0 0,31

30 - 90 0,3 0,31 30 - 120 0,2 0,31

30 - 150 * 0,5 0,31 60 - 90 0,3 0,31

60 - 120 0,2 0,31 60 - 150 * 0,5 0,31

90 - 120 -0,1 0,31 90 - 150 0,2 0,31

120 - 150 0,3 0,31

* indica una diferencia significativa.