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Estratégias para interpretação de espectros de massas
• Composição elementar dos íons a partir de medidas exatas de massas.
• Resolução em espectrometria de massas.
• Padrões isotópicos.
• Etapas na identificação de espectros de massas: a) íon molecular ou íon pseudo-molecular; b) fragmentos e mecanismos de fragmentação.
Na presença de um campo
magnético homogêneo, íons
descrevem uma trajetória circular
v
Br
ze
m
r
mvvBze
2
)(
Usando a energia cinética, T =
(½)mv2 = zeV, ou
zeB
mTr
V
rB
ze
m
mVze
rB
v
rB
ze
m
2
2
)/(2)(
22
22
2
22
2
2
Setor magnético como
analisador de massas:
resolução ditada pela
fenda de saída dos íons
15.01500 15.01820 15.02140 15.02460 15.02780 15.03100
Mass (m/z )
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
te
ns
ity
ISO:CH3
15.0229M
FWHM = DM
R = M/DM
Parâmetros para definir
resolução em
espectrometria de
massas
Determinação de massas moleculares e conceito de resolução
em espectrometria de massa
• Resolução capaz de distinguir íons com massas nominais iguais, m/z = 60
• Resolução necessária para distinguir estas espécies: considerar os íons com a menor diferença de massas, Dm = 60,03242 – 60,02112 = 0,0113
m
mR
D
C3H8O C2H8N2 C2H4O2 CH4N2O
60,05754 60,06884 60,02112 60,03242
53100113,0
60R
Mass measurement accuracy depends on resolution
0
2000
4000
6000
8000
Co
un
ts
2840 2845 2850 2855
Mass (m/z)
Resolution = 14200
Resolution = 4500
Resolution =18100 15 ppm error
24 ppm error
55 ppm error
High resolution means better mass accuracy
Para íons contendo C, H, O, N (C0-100, H3-74, O0-4 e N0-4), atribuição da composição sem ambiguidade em m/z =118 requer apenas um erro menor do que 34 ppm, enquanto que para m/z =750 atribuição da composição sem ambiguidade requer uma precisão melhor de que 0.018 ppm.
Exemplo de medidas exatas de
massa para determinar
composição química e resolução
necessária para distinguir entre
as diversas possibilidades
Type
Resolving Power (FWHM)
FT-ICR-MS
1,000,000
FT-Orbitrap
100,000
High-Res-TOF 60,000
TOF
10,000
Quadrupole / IonTrap in UltraZoom mode
10,000
Quadrupole / Iontrap
1,000
Poder de resolução típico de diversos tipos de espectrômetros de massas
Massa exata e
abundancia natural de isotopos
dos elementos
mais comuns
Defeito de massa: uso para identificação de composição química,
D = mverdadeira - mnominal
Massa nominal e defeito de massa
• Por exemplo, para o íon hipotético 12C50H100+.,
massa nominal = 5012 + 1001 = 700
massa real = 5012,0000 + 1001,0078 = 700,7800
• Perfluorbutilamina (usado para calibrar a escala de massa)
massa nominal = 671
massa real = 670,9599 Da
Abundancia natural de
isotopos dos elementos
mais comuns e influencia
nos espectros de massas
Padrões isotópicos
para substancias
contendo um ou mais
átomos de Cl e Br
Abundância Natural
35Cl - 75,77% 37Cl - 24,23%
79Br - 50,5% 81Br - 49,5%
1981.84
1982.84
1983.84
Mass spectrum of peptide with 94 C-atoms
(19 amino acid residues)
No 13C atoms (all 12C)
One 13C atom
Two 13C atoms
“Monoisotopic mass”
Massa exata e
abundancia natural de isotopos
dos elementos
mais comuns
m/z
4360.45
4361.45
Isotope pattern for a larger peptide (207 C-atoms)
Mass spectrum of insulin
12C : 5730.61
13C
2 x 13C
Insulin has 257 C-atoms. Above this mass, the monoisotopic
peak is too small to be very useful, and the average mass is
usually used.
Monoisotopic mass
Monoisotopic mass
corresponds tolowest mass peak
When the isotopes are clearly resolved the monoisotopic mass
is used as it is the most accurate measurement.
Average mass
Average mass corresponds
to the centroid of the
unresolved peak cluster
When the isotopes are not resolved, the centroid of the envelope
corresponds to the weighted average of all the the isotope peaks in
the cluster, which is the same as the average or chemical mass.
6130 6140 6150 6160 6170
Poorer
resolution
Better
resolution
What if the resolution is not so good?
At lower resolution, the mass measured is the average mass.
Mass
Interpretação de espectros de massas: considerações iniciais
• Espectros de massa de substancias orgânicas obtidas por ionização por elétrons podem apresentar o íon molecular, M+,
(não necessariamente), e fragmentos iônicos. • Como reconhecer o íon molecular, M+, que é um cátion radical? a) Íon de maior massa (excluindo isótopos) no espectro; b) Regra do nitrogênio: íon molecular de substancia (CxHyOzNv) com um número impar (1,3, etc) de atomos de nitrogênio possui uma massa nominal de numero impar, e vice-versa; c) Íon molecular deve ser capaz de formar os principais íons fragmentos por perdas de neutros “lógicos”.
Ionização de íons moleculares 1
• Ionização de uma molécula simples e formação do íon molecular,
• Ionização representada como ocorrendo no sítio de menor
energia de ionização,
Interpretação de espectros de massa: considerações iniciais Reconhecimento do íon molecular, M+, cátion radical.
122 M+.
C7H6O2
m/z RI 121 0.51 122 84 123 6.8 124 0.51
C6H7O2
N = 0, 2, 4, ...
Regra do nitrogênio b) Regra do nitrogênio: íon molecular de substancia (CxHyOzNv) contendo um número impar (1,3, etc) de N deve ser impar, e vice-versa;
Identificação simples dos fragmentos iônicos em espectros de massas
• Identificação do neutro eliminado na fragmentação, p.ex. (M-1)+, (M-15)+, (M-18)+, (M-44)+, etc. (Ver tabela 6.6 para formula do neutro e possível precursor).
• Identificação da fórmula do íon através da sua relação m/z. (Ver tabela 6.7 para as possíveis estruturas).
• Identificação de íons característicos, indicativos da estrutura da molécula precursora. (Ver tabela 6.8)
Perda de neutros e íons típicos - Fragmentações
M+. 122
[M-17]+.
-OH ou
-NH3
-C2H5O ou
-COOH
C7H6O2 ins. = C – H/2 + N/2 +1
[M-45]+.