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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA E SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES Roberta Dias da Silva Orientadora: Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti GOIÂNIA 2014

ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS …estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS

ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA E SUPLEMENTADOS

COM ANTIOXIDANTES

Roberta Dias da Silva

Orientadora: Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti

GOIÂNIA 2014

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ROBERTA DIAS DA SILVA

ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS

ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA E SUPLEMENTADOS

COM ANTIOXIDANTES

Tese apresentada para a obtenção do título de

Doutor em Ciência Animal junto à Escola de

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal

de Goiás

Área de concentração:

Patologia, Clínica e Cirurgia Animal

Orientadora:

Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti – EVZ/UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo – EVZ/UFG

Pesq. Dr. Marcos Fernando Oliveira e Costa – Embrapa/CNPAF

GOIÂNIA

2014

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DEDICO,

Aos meus pais, Divino Roberto da Silva e Gysele Aparecida de Oliveira Silva por terem acreditado na minha capacidade e força de vontade e, que apesar da distância, sempre se fizeram presente. As minhas irmãs Viviane Peixoto Dias Silva e Wanessa Peixoto Dias da Silva, que são minhas companheiras em todos os momentos. E ao meu namorado Paulo Henrique Jorge da Cunha pelo apoio imensurável em todas as etapas desse trabalho.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e a oportunidade concedida de poder sempre alcançar de uma

forma ou outra meus objetivos, iluminando os meus passos e dando-me forças nos momentos

de angústias e dificuldades.

À Universidade Federal de Goiás/Escola de Veterinária e de Zootecnia, pela

oportunidade de realizar este estudo.

À orientadora e amiga, Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti, pela

confiança em meu trabalho. Meu muito obrigada pela oportunidade, pela amizade, pelos

conselhos e ensinamentos dedicados sem os quais não seria possível a realização deste

trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, a todos os professores, pelos

ensinamentos e oportunidades.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pela bolsa de estudos concedida e pelo financiamento do projeto de pesquisa.

Aos professores Andreza Amaral da Silva e Vitor Barbosa Fascina pelos

ensinamentos dedicados nas avaliações de estresse oxidativo. Aos Professores Paulo Henrique

Jorge da Cunha e Percílio Brasil dos Passos por cederem as dependências do Laboratório de

Toxicologia para o processamento das análises.

Aos amigos, Laudicéia Oliveira da Rocha, Juliana Luis e Silva, Claudia Paula de

Oliveira e Luma Tatiane Silva e Castro pela amizade e pelos momentos de descontração.

Aos condutores do experimento em campo Gustavo Lage Costa, Thiago de Jesus

do Carmo e Ulisses Reis Correia Pinto um agradecimento em especial, pois sem o auxílio e

colaboração de vocês não seria possível realizar e obter as amostras desejadas.

Aos alunos do Curso de Graduação em Medicina Veterinária Weyguer Cirillo

Fernandes e Helton Freire de Oliveira pela participação e ajuda nas atividades em campo do

experimento.

Às alunas de Residência, Neryssa Oliveira Alencar e Daniela Cardoso no

processamento e análise das amostras.

Aos funcionários da Escola de Veterinária e Zootecnia e do Departamento de

Patologia Animal agradeço pela ajuda, apoio, paciência e amizade.

A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste projeto e

contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada!

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SUMÁRIO

CAPITULO I – CONSIDERAÇÕES INICIAIS................................................................................ 1

Introdução........................................................................................................................................... 1

Revisão de literatura......................................................................................................................... 2

Referências.........................................................................................................................................

18

CAPITULO II – ERITROGRAMA E ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES............................................................................................................................

30

Resumo...............................................................................................................................................

29

Abstract...............................................................................................................................................

29

Introdução...........................................................................................................................................

30

Material e métodos.............................................................................................................................

32

Resultados...........................................................................................................................................

34

Discussão............................................................................................................................................

38

Conclusão...........................................................................................................................................

41

Referências.........................................................................................................................................

41

CAPITULO III – LIPOPEROXIDAÇÃO HEPÁTICA EM BOVINOS CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES............................................................................................................................

47

Resumo...............................................................................................................................................

47

Abstract...............................................................................................................................................

48

Introdução...........................................................................................................................................

48

Material e métodos.............................................................................................................................

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Resultados...........................................................................................................................................

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Discussão............................................................................................................................................

57

Conclusão...........................................................................................................................................

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Referências.........................................................................................................................................

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CAPÍTULO IV – CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................

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LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

FIGURA 1 - Etapas de reações de peroxidação lipídica................................................. 3

FIGURA 2 - Reações químicas de formação de radicais livres...................................... 6

FIGURA 3 - Reação de Haber-Weiss............................................................................. 7 FIGURA 4 - Mecanismo de ação do complexo glutationa. H2O2: peróxido de hidrogênio,

RO2H: hidroperóxido orgânico, GPX: glutationa peroxidase, ROH: peróxido, H2O: água, GSH: glutationa, GS-SG: glutationa oxidada, NADP: nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato, forma reduzida, FAD: flavina adenina dinucleotídeo, NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada, FADH2: flavina adenina dinucleotídeo, forma reduzida........................

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CAPÍTULO III

FIGURA 1 - Aglomerado de macrófagos espumosos com macrófagos espumosos isolados (seta fina) e com formação de célula gigante de Touton (seta grossa) em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes, HE, 40x..............................................................................................................

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FIGURA 2 - Correlação positiva forte entre macrófagos espumosos e concentração de MDA em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes................................................................................................

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LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II TABELA 1 - Médias ( X = média em cada momento e Média = média geral

considerando todos os momentos) de eritrócitos, hemoglobina e volume globular de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes.............................................................

36

TABELA 2 - Médias de TBARS (nM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................

37

TABELA 3 - Médias de GSH-T (µM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................

38

TABELA 4 - Médias de GSH-Px (UI/gHb) em células sanguíneas de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................

38

TABELA 5 - Médias de SOD (UI/mgHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E).............................................

39

TABELA 6 - Médias de CAT (UI/mgHb) em eritrócitos bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................

39

CAPÍTULO III

TABELA 1 - Médias da concentração de TBARS (µmol/Kg) em tecido hepático de

bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1 - Grupo controle, G2 - Grupo selênio e vitamina E, G3 - Grupo zinco, G4 - Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)......................................................................................

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TABELA 2 - Médias de GGT (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1 - Grupo controle, G2 - Grupo selênio e vitamina E, G3 - Grupo Zinco, G4 - Grupo Selênio e G5 - Grupo vitamina E)...................................................

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TABELA 3 - Médias de AST (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)...............................................................................

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TABELA 4 - Frequência total (%) por grupo de alterações hepáticas em bovinos alimentados com feno de Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)................ 58

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LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Espécies reativas de oxigênio (EROs).......................................................... 5 QUADRO 2 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica.................................... 9 QUADRO 3 - Principais flavonoides estudados em pesquisas científicas.......................... 13

CAPÍTULO II

QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento.....................................................

34

QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais.

34

QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ).

34

CAPÍTULO III

QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento.....................................................

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QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais.

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QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ).

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LISTA DE ABREVIATURAS 1O2 oxigênio singlet 4-HNE 4-hidroxynonenal AST aspartato aminotransferase CAT catalase CuZnSOD superóxido dismutase cobre-zinco dependente DTNB ácido 5,5 µ-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico e- elétron EDTA ácido etilediaminotetracético, sal dissódico EROs espécies reativas de oxigênio FAD flavina-adenina-dinucleotídeo FADH2 flavina-adenina-dinucleotídeo, forma reduzida Fe+2 íon ferroso Fe+3 íon férrico

GGT gama-glutamiltransferase GR glutationa redutase GS glutationa sintetase GSH glutationa GSH-Px glutationa peroxidase GSH-t glutationa total GSSG glutationa oxidada H2O2 peróxido de hidrogênio Hb hemoglobina HCl ácido clorídrico HO• radical hidroxila HO2• radical perhidroxil HOCl ácido hipocloroso LDL lipoproteína de baixa densidade MDA malondialdeído MnSOD superóxido dismutase dependente do manganês NADP nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada NO• óxido nítrico NOS óxido nítrico sintetase O2• ânion superóxido OH• radical hidroxila ONOO− peroxinitrito PBS solução tampão-salina-fosfato R• radical alquila RO• radical alquila ROO• radical peróxido ROOH hidroperóxido orgânico R-SH grupos tióis R-SSG componentes dissulfeto -SH grupos sulfidrilas SOD superóxido dismutase TBA ácido tiobarbitúrico TBARS substância reativa ao ácido tiobarbitúrico TCA ácido tricloroacético

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RESUMO

O estresse oxidativo está relacionado ao desenvolvimento de diferentes processos patológicos. Intervenções que diminuem a geração ou os efeitos dos radicais livres têm apresentado resultados controversos em modelos animais. Neste estudo, avaliou-se os efeitos da suplementação com diferentes antioxidantes, por meio de avaliação de biomarcadores de estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa peroxidase e catalase), em hepatócitos (malondialdeído) e de exames laboratoriais e histológicos. Foram avaliados 40 bovinos da raça Nelore, distribuídos em cinco grupos, o controle sem suplementação, três grupos suplementados individualmente com vitamina E, selênio e, zinco e um grupo suplementado com a associação de selênio e vitamina E. Durante o período de 105 dias de confinamento experimental, os bovinos foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado (ração), na proporção de 70:30. A avaliação dos biomarcadores de estresse oxidativo nos eritrócitos não indicou presença de lipoperoxidação nos eritrócitos. Na avaliação de estresse oxidativo em fragmentos hepáticos, a suplementação com o antioxidante selênio associado à vitamina E reduziu as alterações histopatológicas (número de macrófagos espumosos) no parênquima hepático e a lipoperoxidação tecidual. No período do confinamento, os bovinos não desenvolveram alterações hepáticas clínicas e laboratoriais, apresentando atividade sérica de gama glutamiltransferase e aspartato aminotrasferase dentro dos valores de normalidade. Houve correlação positiva entre a concentração do biomarcador malondialdeído e a quantidade de macrófagos espumosos. Em conclusão, bovinos confinados ingerindo feno de Brachiaria sp apresentam lipoperoxidação de hepatócitos e a associação dos antioxidantes selênio e vitamina E reduz os efeitos do estresse oxidativo. Palavras-chave: enzimas antioxidantes, lipoperoxidação, ruminantes e suplementação.

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ABSTRACT

Oxidative stress is related to the development of different pathological processes. Interventions that reduce the generation or the effects of free radicals have shown controversial results in animal models. In this study, we evaluated the effects of supplementation with different antioxidants through assessment of oxidative stress biomarkers in erythrocytes (thiobarbituric acid reactive substances, superoxide dismutase, glutathione full, glutathione peroxidase and catalase) in hepatocytes (malondialdehyde), clinical laboratory tests and histological exam. 40 Nelore bovines were sorted into five groups, as follows: one control without supplementation, three groups individually supplemented with vitamin E, selenium and zinc and one group supplemented with the combination of selenium and vitamin E. For 105 days, all animals were fed roughage (brachiaria hay) and concentrate (feed) in a 70:30 ratio. The Biomarkers of oxidative stress evaluation in erythrocytes did not indicate the presence of lipid peroxidation. In the liver, supplementation with antioxidant selenium and vitamin E reduced the number of foamy macrophages in the parenchyma, as well as tissue lipid peroxidation. The animals did not develop clinical liver abnormalities throughout the experimental period, since aspartate aminotransferase and gamma glutamyltransferase serum activity remained within normal range. There was positive correlation between the concentration of the biomarker malondialdehyde and foamy macrophages. In conclusion, feedlot cattle ingesting Brachiaria sp present lipid peroxidation in hepatocytes and the combination of the antioxidants selenium and vitamin E reduces the effects of oxidative stress. Keywords: antioxidant enzymes, lipid peroxidation, ruminants and supplementation.

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CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1 INTRODUÇÃO

O estresse oxidativo caracteriza-se pelo desequilíbrio entre moléculas oxidantes e

antioxidantes, que resulta na indução de danos às biomoléculas pelos radicais livres. Nas

últimas décadas tem-se observado um vertiginoso aumento no interesse pelo estudo de

estresse oxidativo. Este fato não ocorreu por mera casualidade, foi decorrência do rápido

crescimento do conhecimento técnico científico, que permitiu o estabelecimento da

participação dos radicais livres nos mecanismos desencadeadores de enfermidades, bem como

a adoção de antioxidantes na prevenção dessas doenças.

Na medicina de produção animal, o campo do estresse oxidativo encontrasse em

desenvolvimento. Pesquisas têm relacionado à participação dos radicais livres no

desenvolvimento de mastites, quadros anêmicos, deficiências reprodutivas, inflamações,

qualidade de carcaça e imunidade que poderiam comprometer a cadeia produtiva. No entanto,

inúmeros questionamentos encontram-se sem elucidação, pois há muito a ser descoberto sobre

o papel desses agentes oxidantes sobre a sanidade e a produção animal.

Atualmente existe na produção animal uma preocupação constante em minimizar

custos e gerar aumento de lucros. Na pecuária brasileira, em particular bovinos confinados,

essa busca incessante faz com que os animais sejam submetidos a uma pressão produtiva

elevada, o que tem proporcionado o desenvolvimento de estresse oxidativo elevado nos

animais e, consequentemente, a produção de radicais livres.

Uma das vantagens da cadeia produtiva nacional reside na possibilidade de criar

bovinos a pasto com a oferta de espécies do gênero Brachiaria. Entretanto, algumas espécies

desse gênero têm sido descritas como agentes de fotossensibilização hepatógena. Porém,

ainda não há um consenso entre os pesquisadores sobre a causa da fotossensibilização em

bovinos, que poderia ser provocada pela ingestão da toxina esporidesmina produzida pelo

fungo Pithomyces chartarum ou por saponinas esteróides litogênicas que poderiam

desencadear a lipoperoxidação de biomolécula e ocasionar alterações sobre as células.

Nesse contexto, objetivou-se discutir a temática estresse oxidativo, desde a

formação de radicais livres, a ação dos antioxidantes e os efeitos resultantes do desequilíbrio

geral que levam a sua formação, bem como abordar ação à etiopatogenia de algumas doenças

com a participação dos mesmos, de modo a reconhecer a ocorrência de estresse oxidativo e

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minimizar os efeitos deletérios dos radicais livres no organismo. Além disso, verificar se a

adoção de antioxidantes na forma de suplemento alimentar poderia reduzir as alterações

devido ao desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Estresse oxidativo

O desequilíbrio resultante dos processos de produção e remoção de radicais livre

pelos sistemas de defesa antioxidante é chamado de estresse oxidativo. Seu efeito deletério

apresenta variação considerável de um ser vivo para o outro, dependendo da idade, estado

fisiológico e da dieta (NIESS et al., 1999). O estresse oxidativo, decorrente da diminuição dos

antioxidantes endógenos ou do aumento da formação de espécies oxidantes, gera um estado

pró-oxidante que favorece a ocorrência de lesões oxidativas em macromoléculas e estruturas

celulares, como a lipoperoxidação, com consequente alteração funcional e prejuízo das

funções vitais em vários órgãos e tecidos (DROGE, 2002).

O estresse oxidativo pode ser benéfico nos casos de infecção, quando ocorre

produção de radicais livres por células fagocitárias para matar microrganismos invasores.

Porém, torna-se prejudicial quando a inflamação atinge o estágio sistêmico (sepse) e a perda

do controle da produção dos radicais livres pode causar lesões distantes do seu ponto de

origem (SIES, 1991; SIES, 1993). Os radicais livres lesam a célula de modo direto ou

danificam os ácidos nucleicos e as proteínas, tornando-os mais suscetíveis à degradação

(HALLIWELL, 1987; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Em ruminantes, o excesso de

radicais livres é responsável por vários processos patológicos, como por exemplo,

hepatopatias, inflamações, mastites, anemias dentre outros (MARÇAL, 2006; PASCHOAL et

al., 2006; BRITO et al, 2008; JUARÉZ et al, 2009; NICOLODI et al, 2010; SORDILLO,

2013).

2.1.1 Peroxidação lipídica

A peroxidação de lipídeos pode ser definida como uma cascata de eventos

bioquímicos, resultantes da ação de radicais livres sobre os lipídeos presentes em membrana

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celulares (CURI et al., 2002), gerando principalmente radicais alcoxila (RO•) e peroxila

(OH•).

O processo é dividido em três etapas: iniciação, propagação e terminação (Figura

1). Na iniciação é removido um átomo de hidrogênio da molécula de ácido graxo insaturado,

que acarreta na formação de um dieno conjugado. Esse composto pode sofrer inúmeras

reações e, em meio aeróbico, ocorre a combinação com o oxigênio que leva a formação de um

peróxido, o qual pode remover outro hidrogênio de outro ácido graxo, promovendo assim a

etapa de propagação. O dieno também pode se combinar com um átomo de hidrogênio

retirado para formar um hidroperóxido lipídico ou romper a dupla ligação presente na cadeia,

gerando peróxidos cíclicos, aos quais também podem propagar a peroxidação lipídica

(KOWALE et al., 1996).

Na decomposição dos hidroperóxidos são gerados radicais peroxila e alcoxila, em

que íons metálicos, como o selênio, podem catalisar essa reação (ESTERBAUER et al.,

1992). A etapa de terminação se caracteriza pela destruição dos radicais pelos antioxidantes,

ou pela reação de dois radicais lipídicos originando outros produtos, principalmente aldeídos

que podem ser oxidados dando origem a outros hidrocarbonetos, aldeídos e ácidos

(KOWALE et al., 1996; CURI et al., 2002).

FIGURA 1 - Etapas de reações de peroxidação lipídica. Fonte: Adaptado de KOWALE et al. (1996)

Para acompanhar a evolução da peroxidação, o número de substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido utilizado como valor empírico e tem sido relacionado

com outros métodos para determinação de lipídeos. O malondialdeído é um produto

secundário, formado durante a oxidação de ácidos graxos polinsaturados e reage com o

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TBARS formando um complexo com absorbância máxima a 530 a 532nm. A mensuração de

TBARS é considerada adequada para determinar e avaliar o comprometimento que a oxidação

lipídica poderia promover no organismo (KOWALE et al., 1996).

GUIMARÃES et al. (2006), ao avaliarem a relação entre grau de estresse

oxidativo e a integridade de hepatócitos, concluíram que um dos mecanismos responsáveis

pela formação da fibrose hepática poderia ser a indução de peroxidação lipídica. Outro estudo

também demonstrou que a depleção de GSH, frequentemente encontrada nas doenças

hepáticas, poderia favorecer produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a

peroxidação lipídica (HAN et al., 2006).

2.2 Radicais livres

A presença de radicais livres em materiais biológicos foi descoberta há menos de

70 anos. Em 1956, Denham Harman elaborou a hipótese de que radicais de oxigênio

poderiam ser formados como subprodutos de reações enzimáticas in vivo. Assim, descreveu

os radicais livres como a “Caixa de Pandora” responsável por danos celulares em algumas

enfermidades, como o processo de mutagênse, o câncer, o processo degenerativo do

envelhecimento biológico, dentre outros (DROGE, 2002).

A ciência dos radicais livres nos organismos vivos encontrou uma segunda fase

depois que McCord e Fridovich, em 1969, descobriram a enzima superóxido dismutase

(SOD) e, finalmente, convenceram a maioria dos colegas que os radicais livres são

importantes na biologia. A partir desse momento, vários pesquisadores foram inspirados a

investigar os danos oxidativos causados por tais agentes oxidantes sobre ácido

desoxirribonucleico (DNA), proteínas, lipídeos e outros componentes celulares

(VASCONCELOS et al., 2007).

Um radical livre é qualquer átomo, molécula ou íon que possui um ou mais

elétrons livres na sua órbita externa. Essas partículas, formadas por elétrons livres ou não

pareados têm instabilidade elétrica muito grande e, por esta razão, apresentam também grande

capacidade reativa. Isso pode afetar qualquer composto que esteja próximo, a fim de captar

um elétron desse composto para sua estabilização. Devido a esta característica, é denominada

de substância oxidante (PERCIVAL, 1998; BIANCHI & ANTUNES, 1999; LEITE &

SARNI, 2003).

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A formação de radicais livres pelo organismo em condições normais é inevitável,

pois são necessários no processo de respiração celular que ocorre nas mitocôndrias, a fim de

gerar a energia na forma de adenosina trifosfato (ATP). Entretanto, a formação de radicais

livres não se restringe somente as mitocôndrias, pode ocorrer no citoplasma, na membrana

e/ou em seu alvo celular, tais como: proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA (ANDERSON,

1996; YU & ANDERSON, 1997).

Grande parte das moléculas biológicas pode ser oxidada pelos radicais livres. No

entanto, CHEESEMAN & SLATER (1993) descreveram que os lipídeos são os mais afetados

pelo estresse oxidativo e dano celular. As consequências oriundas da lesão de lipídeos pelos

radicais livres são evidentes, pois eles são componentes estruturais das membranas celulares,

alterando desta maneira sua função metabólica e permeabilidade. Como consequência, ocorre

passagem de substâncias entre o meio intra e extracelular e até danos ao DNA intranuclear

(RADAK et al., 1999). Tal fato, em última instância altera e prejudica o metabolismo

intracelular, podendo inclusive ocasionar a morte celular (HALLIWELL & GUTTERIDGE,

2007).

No metabolismo celular normal existe a produção constante de EROs (Quadro 1)

e, condições em que sua concentração está elevada acarretam ações deletérias em todos os

componentes celulares (LEITE & SARNI, 2003).

QUADRO 1 – Principais espécies reativas de oxigênio (EROs) O2•- Ânion superóxido ou radical superóxido

HO2• Radical perhidroxil

H2O2 Peróxido de hidrogênio

OH• Radical hidroxila

RO• Radical alquila

ROO• Radical peróxido

ROOH Hidroperóxido orgânico 1O2 Oxigênio singlet

Fonte: Adaptado de SIES (1991)

Devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio, principal oxidante em virtude

do metabolismo aeróbico, tende a receber um elétron de cada vez, o que resulta na formação

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de compostos intermediários altamente reativos (Figura 2). O primeiro composto obtido é o

O2•-, que é gerado pela reação entre moléculas de substâncias que participam da cadeia de

transporte de elétrons na mitocôndria e no retículo endoplasmático. As células fagocitárias

produzem o O2•- como parte do mecanismo de defesa imunológica e inflamatória para

eliminar microrganismos patogênicos ou corpos estranhos. Os fagócitos o produzem com

auxílio da enzima leucocitária nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH oxidase),

que catalisa a redução por um elétron do O2 com gasto de uma molécula de NADPH

(BARREIROS & DAVID, 2006). Nas doenças inflamatórias crônicas esta produção torna-se

excessiva, provocando lesões nos tecidos (LEITE & SARNI, 2003).

FIGURA 2 - Reações químicas de formação de

radicais livres. Fonte: Adaptado de SORDILLO et al. (2009)

O radical O2•- ao contrário da maioria dos radicais livres é inativo, visto que sua

principal função é auxiliar na produção de radical HO•, por meio da redução de quelatos de

Fe+3 em Fe+2 (reação de Haber-Weiss) (Figura 3). Além disso, esse radical possui a habilidade

de liberação de Fe2+ das proteínas de armazenamento e de ferro-sulfoproteínas, tais como

ferritina e aconitase, respectivamente, e de reagir com o radical HO• produzindo oxigênio

singlet 1O2 e com o óxido nítrico (NO•) produzindo peroxinitrito (ONOO−) (SORDILLO et

al., 2009).

A atuação do radical O2•- como oxidante direto é irrelevante, pois dentre os

aminoácidos, o único que sofre oxidação com esse radical é a cisteína. Outro fato que

corrobora com sua baixa capacidade oxidante é a sua eliminação pela enzima SOD, que

catalisa a dismutação de duas moléculas de O2•- em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Sendo

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que, este último, quando não eliminado do organismo pelas enzimas peroxidases e catalase,

pode gerar radicais hidroxila (HALLIWELL et al., 2000). Apesar destes efeitos danosos, o

radical O2•- apresenta importância vital para as células de defesa e sem ele o organismo

encontra-se desprotegido contra infecções causadas por vírus, bactérias e fungos

(ANDERSON, 1996).

FIGURA 3 - Reação de Haber-Weiss. Fonte: Adaptado de SORDILLO et al. (2009)

O O2•- formado é bactericida fraco, capaz de inativar proteínas ferro-sulfurosas

das bactérias, entretanto gera alguns produtos que possuem forte atividade antimicrobiana,

tais como ácido hipocloroso (HOCl), peróxido de hidrogênio (H2O2) e peroxinitrito (ONOO–),

que são os principais responsáveis pelo combate a corpos estranhos. Em alguns casos, o

radical O2•- age como antioxidante, reduzindo semiquinonas para que elas possam retomar

suas atividades metabólicas na célula, como por exemplo, a redução da ubiquinona em

ubiquinol no interior da mitocôndria (BABIOR & BRAZ, 1997; HALLIWELL et al., 2000).

Por fim, o radical O2•- funciona como sinalizador molecular por meio da sua capacidade de

oxidar grupos –SH em ligações dissulfeto, podendo ativar e desativar enzimas que contenham

metionina (POLIDORI et al., 2001).

Outro exemplo de radical que apresenta pouca reatividade frente às moléculas

orgânicas na ausência de metais de transição é o H2O2. Sua formação ocorre por meio da

redução parcial do radical O2•- pela recepção de dois elétrons. Porém, o H2O2 não é

considerado um verdadeiro radical livre, por ter sua órbita externa pareada (HALLIWELL et

al., 2000). Entretanto, por ser altamente hidrossolúvel e penetrar facilmente na célula, esse

radical exerce papel importante no estresse oxidativo por ser capaz de transpor as membranas

celulares facilmente e gerar o radical hidroxila. Desse modo, ele tem sido qualificado como

precursor da formação de outros radicais livres (HALLIWELL, 1990).

O radical H2O2 atua oxidando proteínas que apresentem resíduos de metionina ou

grupos tiol muito reativos, como a glutationa (GSH). A sua formação in vivo ocorre pela

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dismutação do O2•- por enzimas oxidases ou pela β-oxidação de ácidos graxos

(HALLIWELL, 1990). O peróxido de hidrogênio gerado é então parcialmente eliminado por

CAT, GSH-Px e peroxidases ligadas à tioredoxina, mas como essa eliminação tem baixa

eficiência, grande parte do H2O2 é liberado para a célula (HALLIWELL et al., 2000). O H2O2,

assim como o O2• têm sido considerados extremamente tóxicos em quantidades elevadas no

organismo, por danificar os ácidos graxos presentes nas membranas celulares, o que leva a

lesão celular (HALLIWELL, 1987; HALLIWELL, 1990).

A toxicidade do H2O2 se deve, em grande parte, à conversão da molécula em

radical hidroxila (OH•) por hidrólise. Este último radical é reativo, pois precisa de apenas

mais um elétron para se estabilizar (VASCONCELOS et al., 2007). Este radical

frequentemente danifica as moléculas por retirada de hidrogênio e por adição a ligações

insaturadas em decorrência de sua eletrofilicidade (BARREIROS & DAVID, 2006). Uma vez

formado, o OH• promove quebra e modificações nas bases de DNA das células, resultando

em alterações na expressão genética, mutação, apoptose celular, modificações em proteínas e

peroxidação lipídica (CHEESEMAN & SLATER, 1993). No DNA, esse radical compromete

tanto as bases nitrogenadas quanto a desoxirribose, sendo que a agressão ao monossacarídeo

pode ocorrer por retirada de um dos átomos de hidrogênio e quase sempre leva à ruptura da

cadeia de DNA (SINGAL, 1999; BARREIROS & DAVID, 2006).

Nos aminoácidos e proteínas, o radical HO• pode reagir na cadeia lateral, em que

agride preferencialmente cisteína, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina, e, em

menores proporções, arginina e asparagina. As agressões aos aminoácidos que compõem as

proteínas podem promover danos como clivagem de ligações, com ou sem geração de

fragmentos e ligações cruzadas, o que pode ocasionar perda de atividade enzimática,

dificuldade no transporte ativo por meio das membranas celulares, citólise e morte celular

(VASCONCELOS et al., 2007).

Além do oxigênio, o nitrogênio também participa da estrutura dos radicais livres,

em especial o óxido nítrico. O seu efeito tóxico contribui de modo importante para a lesão

tecidual que ocorre nos processos inflamatórios crônicos, assim como na sepse

(ANDERSON, 1996). O óxido nítrico é sintetizado a partir da arginina por ação da enzima

óxido nítrico sintetase (NOS), que está presente no endotélio e nos macrófagos. O óxido

nítrico promove relaxamento do endotélio vascular (vasodilatação com redução da resistência

periférica), inibe a agregação plaquetária e desempenha papel importante na lesão por

isquemia e reperfusão (POMPELLA, 1997; YU & ANDERSON, 1997).

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2.3 Antioxidantes

A produção contínua de radicais livres durante os processos metabólicos levou ao

desenvolvimento de vários mecanismos orgânicos de defesa antioxidante para limitar as

concentrações intracelulares e impedir a indução de danos (SIES, 1993). Os antioxidantes são

agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas pelos radicais livres nas

células. Define-se antioxidante como “qualquer substância que, presente em baixas

concentrações em comparação ao substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste

substrato de maneira eficaz” (SIES & STAHL, 1995). Essas substâncias que representam a

defesa dos organismos contra as EROs são divididas em dois tipos, os não enzimáticos e os

enzimáticos (Quadro 2).

QUADRO 2 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica Não enzimático Enzimático

L-cisteína Superóxido dismutase

α-tocoferol (vitamina E) Catalase

β-caroteno NADPH-quinona oxidoredutase

Glutationa Glutationa peroxidase

Ácido ascórbico (vitamina C) Enzimas de reparo

Flavonoides

Proteínas do plasma

Selênio

Clorofilina

Fonte: Adaptado de SIES (1993)

É importante salientar que o efeito prejudicial dos radicais livres ocorre quando

eles estão em quantidade excessiva no organismo, ultrapassando a capacidade do organismo

de neutralizá-los com os seus sistemas naturais (VASCONCELOS et al., 2007). E que essas

proteções abrangem a proteção enzimática ou por micromoléculas, que podem ter origem no

próprio organismo ou são adquiridas por meio da dieta (BARREIROS & DAVID, 2006).

2.3.1 Antioxidantes enzimáticos

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O sistema enzimático de defesa é o primeiro a agir, sendo formado por diversas

enzimas, em especial SOD, CAT e GSH-Px, que representam os três sistemas enzimáticos

antioxidantes (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).

A SOD tem papel fundamental na defesa do organismo contra as espécies reativas

de oxigênio, pois atua na remoção do O2•-. Antes da sua descoberta em 1969, a SOD já havia

sido descrita por alguns autores como uma proteína que continha cobre (Cu), mas sem a

descrição de atividade catalítica (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Seu papel foi

estabelecido na dismutação (oxidação e redução) do O2•- e até hoje, apesar de inúmeras

pesquisas realizadas com essa enzima, nenhum outro substrato foi descrito, mostrando a sua

especificidade para esse radical livre (BASU et al., 1999; BELLÓ, 2002; HALLIWELL &

GUTTERIDGE, 2007). Essa enzima apresenta associação de um metal a sua estrutura

molecular, o que lhe confere formas diferenciadas (PERCIVAL, 1998).

A forma que contém cobre (Cu2+) e zinco (Zn2

+), denominada de superóxido

dismutase cobre-zinco dependente (CuZnSOD), é muito estável e encontra-se presente em

praticamente todas as células eucarióticas (plantas ou animais). A CuZnSOD é constituída de

duas subunidades proteicas idênticas, com um átomo de cobre e um de zinco em cada uma

delas, e que atua como catalisadora da decomposição do O2•- (BELLÓ, 2002; HALLIWELL

& GUTTERIDGE, 2007).

A superóxido dismutase dependente do manganês (MnSOD), tem sua atividade

diminuída em pH alcalino. A remoção do Mn dos sítios ativos causa perda da atividade

catalítica, não podendo ser reposto por nenhum íon de transição, pois perde a sua atividade

funcional. As sequencias de aminoácidos de todas as MnSOD, em todas as espécies, são

parecidas e não estão relacionadas com a CuZnSOD (HALLIWELL & GUTTERIDGE,

2007). É salutar que, o local de ocorrência dessas enzimas influencia em sua atividade, a

CuZnSOD por ocorrer no citosol celular, não sofre efeitos em sua atividade pelo estresse

oxidativo. Entretanto, MnSOD por ocorrer na mitocôndria, que é considerada centro redox,

tem sua atividade aumentada em situações de estresse oxidativo (SORDILLO et al., 2009).

A GSH também apresenta importante papel na defesa das células contra o estresse

oxidativo, em que concentrações baixas de GSH têm sido associadas a maior risco de

desiquilíbrio oxidativo. Sua ação ocorre por meio da redução do peróxido de hidrogênio e da

detoxificação de hidropeptídeos orgânicos em água e oxigênio, em que a GSH é usada como

substrato pela enzima GSH-Px, na eliminação de peróxidos. Essa reação resulta na oxidação

de GSH à glutationa oxidada (GSSG), que uma vez formada, é então, reduzida pela glutationa

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redutase (GR) por meio de um ciclo catalítico, que regenera a GSH, num processo as custas

da transferência de hidrogênio do NADPH (Figura 4) (BASU et al., 2009).

Outro antioxidante enzimático é a CAT, que está presente na maioria das células

aeróbicas, sendo encontrada principalmente no fígado, rins e eritrócitos (HALLIWELL &

GUTTERIDGE, 2007). Os nutrientes mais importantes coadjuvantes da CAT são o ferro e os

tocoferóis (vitamina E), que se acham distribuídos na fase hidrofóbica da membrana celular

(MARRONI & MARRONI, 2002). A CAT evita o acúmulo de metahemoglobina, resultante

da oxidação da hemoglobina (MAZULLO FILHO et al, 2012) e a decomposição do peróxido

de hidrogênio em água e oxigênio molecular (NOVAS et al, 2007).

FIGURA 4 - Mecanismo de ação do complexo glutationa. H2O2: peróxido de hidrogênio,

RO2H: hidroperóxido orgânico, GPX: glutationa peroxidase, ROH: peróxido, H2O: água, GSH: glutationa, GS-SG: glutationa oxidada, NADP: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida, FAD: flavina adenina dinucleotídeo, NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada, FADH2: flavina adenina dinucleotídeo, forma reduzida.

Fonte: Adaptado de BASU et al., 2009

Experimentos têm sido realizados para avaliar a competição entre as enzimas

CAT e GSH-Px em eritrócitos. A CAT é a enzima que se encarrega de realizar a conversão de

H2O2 em água e oxigênio, quando esse radical livre encontra-se em elevadas concentrações.

Quando o peróxido de hidrogênio está presente em baixas concentrações, ou seja, condições

fisiológicas normais, a GSH-Px se encarrega de transformá-lo em água (CHEESEMAN &

SLATER, 1993; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).

2.3.2 Antioxidantes não enzimáticos

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Alguns nutrientes essenciais podem atacar diretamente os radicais de oxigênio. A

vitamina E (alfa-tocoferol) é o antioxidante lipossolúvel mais eficiente presente em todas as

membranas celulares. Cada tocoferol pode reagir com até dois radicais peroxila e, nesse caso,

o tocoferol é irreversivelmente desativado, ou seja, atua inibindo a peroxidação de lipídeos.

Assim, a vitamina E atua minimizando os danos provocados pelos radicais livres nas

membranas biológicas e as protege contra o ataque de radicais superóxido (BARREIROS &

DAVID, 2006).

Os carotenóides, principalmente o beta-caroteno, podem funcionar como

precursores da vitamina A. Essa vitamina tem pouca ação antioxidante e é incapaz de agir

sobre o oxigênio singlet, mas seu precursor, o beta-caroteno, é o mais eficiente ligante desta

forma reativa de oxigênio encontrada na natureza e pode agir como antioxidante, devido a sua

velocidade de reação que é superior aos tocoferóis (MACHLIN & BENDICH, 1987). Além

de desativar o oxigênio singlet, os carotenoides atuam como sequestradores dos radicais

peroxila, que reduzem a oxidação do DNA e lipídeos (SIES & STAHL, 1995).

A vitamina C (ácido ascórbico) é sintetizada por plantas e animais, com exceção

dos primatas, que necessitam obtê-lo na dieta (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O

ácido ascórbico é necessário in vivo como cofator de várias enzimas, sendo as mais

conhecidas a prolina-hidroxilase e a lisina-hidroxilase, envolvidas na biossíntese do colágeno.

A deficiência do ascorbato na dieta humana causa o escorbuto. A mais impressionante

propriedade química do ascorbato é a sua habilidade para agir como agente redutor - doador

de elétrons (CHAIYOTWITTAYAKUN et al., 2002).

Existe, ainda, uma série de outros antioxidantes não enzimáticos que participam

da defesa contra as espécies reativas do oxigênio nos sistemas biológicos como, por exemplo,

a ubiquinona, a ceruloplasmina, o ácido úrico, a bilirrubina, a biliverdina, a taurina, os

flavonoides e outros compostos fenólicos de origem vegetal (POLIDORI et al., 2001;

VASCONCELOS et al.,2007).

Os flavonoides são substâncias polifenólicas, amplamente distribuídas em plantas,

frutas, verduras e em diversas bebidas. O termo fenólico ou polifenólico é empregado para

definir uma substância que apresenta um ou mais núcleos aromáticos na sua estrutura

molecular, e que contém substituintes hidroxilados e/ou derivados funcionais, como ésteres,

glicosídeos e outros. A atividade antioxidante dos flavonoides depende da sua estrutura e

pode ser determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e elétrons,

estabilidade do radical flavanoil formado, reatividade frente a outros antioxidantes,

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capacidade de quelar metais de transição e solubilidade e interação com as membranas

(LYKKESFELDT & SVENDSEN, 2007).

Existe na literatura muita controvérsia sobre o mecanismo de ação dos

flavonoides, pois a atividade de sequestro está diretamente ligada ao potencial de oxidação

dos flavonoides e das espécies a serem sequestradas. Quanto menor o potencial de oxidação

do flavonoide, maior é sua atividade como sequestrador de radicais livres (Quadro 3).

Atualmente, já foram identificados mais de 5.000 flavonoides diferentes. Entretanto, alguns

flavonoides ganharam destaque em pesquisas (MILTERSTEINER et al., 2003).

A melatonina é um antioxidante conhecido, produzido pela glândula pineal

(GUYTON, 1997). Recentemente, a melatonina foi descrita como participante da função

imunológica dos organismos e como um potente antioxidante; conferindo proteção

substancial contra os radicais livres que são gerados em uma variedade de situações

experimentais, incluindo dano por isquemia e reperfusão. Por essa razão, vem sendo utilizada

terapeuticamente em cirurgias e transplantes (REITER & MAESTRONI, 1999).

QUADRO 3 - Principais flavonoides estudados em

pesquisas científicas Ácido caféico Miricetina

Ácido gálico Naringenina

Ácido elágico Epicatequina

Curcumina Epigalocatequina

Isoflavona Rutina

Quercetina

Fonte: Adaptado de SIES (1993)

Existem vários nutrientes essenciais de origem mineral, que participam do

processo antioxidante em associação com enzimas. São eles, zinco, cobre, manganês, selênio

e ferro (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O papel exato do zinco como antioxidante

não foi ainda elucidado, mas as evidências disponíveis indicam ação desse mineral

envolvendo vários mecanismos. Esses mecanismos incluem a regulação da expressão de

metalotioneína, a atividade da enzima S e a proteção de grupamentos sulfidrila de proteínas de

membranas celulares por antagonismo com metais pró-oxidantes como cobre e ferro

(KOURY & DONANGELO, 2003). O selênio tem sido empregado na dieta animal sob forma

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de selenito associado à vitamina E, com função protetora das membranas biológicas contra a

degeneração oxidativa promovida por radicais livres (LIMA & DOMINGUES, 2007).

2.4 Relação da sanidade e produção animal com o estresse oxidativo e o uso de

antioxidantes

O agronegócio brasileiro caminha para a próxima década com foco na

competitividade e na modernidade, fazendo da utilização permanente da tecnologia um

caminho para a sustentabilidade. Em 2012, foram abatidos 31 milhões de cabeças em todo o

país, sendo que os estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, São Paulo, Minas

Gerais, Pará e Rondônia, lideram os abates, com 70,6% dos abates no país (BRASIL, 2013).

As projeções da produção de carne para o Brasil mostram que esse setor deve

apresentar intenso crescimento nos próximos anos. Sendo que, a carne bovina apresenta

crescimento projetado para os próximos anos de 3% ao ano. As estimativas também projetam

um quadro favorável para as exportações brasileiras. As carnes bovina e suína lideram as

taxas de crescimento anual das exportações para os próximos anos e a taxa anual prevista para

carne bovina deve situar-se numa média anual de 2,5%, exportada para numerosos países

(BRASIL, 2013; CARDOSO, 2014).

Em 2012, o Brasil situou-se como segundo colocado no ranking mundial do

número de cabeças bovinas, enquanto que a Índia manteve a primeira colocação. Entre os oito

primeiros colocados nos últimos dois anos analisados, somente Índia, Brasil, Argentina e

Austrália apresentaram crescimento no rebanho. Os outros países avaliados (China, Estados

Unidos, União Europeia, México, Paquistão, Rússia, Canadá e Colômbia) apresentaram

decréscimo, devido a problemas climáticos (principalmente a seca), econômicos e

conjunturais (MEZZADRI, 2013; CARDOSO, 2014).

Apesar deste cenário favorável é importante enfatizar que o Brasil ainda apresenta

potencial de crescimento na pecuária de corte. Uma das vantagens competitivas da cadeia

produtiva da carne brasileira reside na possibilidade de criar os bovinos a pasto, mas esse

sistema de criação pode acarretar algumas ineficiências na produção (FIORAVANTI, 1999).

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No Brasil, dentre as diversas variedades de pastagens oferecidas ao rebanho, as

espécies de Brachiaria sp foram consideradas a “salvação da pecuária nacional” em virtude

de sua adaptação ao clima tropical e ao solo brasileiro (GHISI, 1991). Algumas espécies

como B. brizantha, B. humidicola e, especialmente, B. decumbens têm sido descritas como

causadoras de fotossensibilização hepatógena em ruminantes (TOKARNIA et al., 2000;

LEMOS & PURISCO, 2002). A sua primeira descrição ocorreu em 1975 (RUSSOMANNO et

al, 2003) em bovinos alimentados por pastagens formadas com as sementes de B. decumbens

cv. Basilisk. Posteriormente, a doença foi diagnosticada em bovinos mantidos em pastagens

de B. brizantha (LEMOS et al., 1996).

A causa principal da fotossensibilização hepatógena em bovinos é a ingestão da

toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo Pithomyces chartarum, habitante natural

das espécies de Brachiaria sp (MOTA et al., 2000; MACEDO et al., 2006). O principal efeito

tóxico da esporidesmina deve-se à formação de quantidade excessiva de radicais livres,

responsáveis pela lipoperoxidação das membranas celulares (MUNDAY, 1982).

Laboratorialmente, as principais disfunções hepáticas observadas em ruminantes com

fotossensibilização são as alterações na atividade sérica de gama glutamiltransferase (GGT).

Esta elevação indica lesão hepática semelhante a provocada por esporidesmina (TOWERS &

STRATTON, 1978).

CRUZ et al. (2000, 2001) e BRUM et al. (2007, 2009) relatam que a intoxicação

não seria causada pela presença do fungo, mas por saponinas esteróides litogênicas presentes

nas espécies de Brachiaria sp. Essas saponinas ao sofrerem hidrólise no metabolismo do

animal acarretam em formação de radicais livres, conjugações com ácido glicurônico e

ligações com íons cálcio que levam a formação de sais insolúveis que se depositam na forma

de cristais no sistema biliar (MILES et al., 1991). Os cristais causam inflamação e obstrução

do sistema biliar, além de necrose dos hepatócitos periportais resultando em hepatite, icterícia

e fotossensibilização. Encontram-se, também, cristais aciculares nos hepatócitos, células de

Kupffer e células dos túbulos renais (RADOSTITS et al., 2002).

Microscopicamente as principais alterações observadas no fígado de ruminantes

com fotossensibilização são colangite, pericolangite, proliferação de ductos biliares e de

tecido fibroso (FIORAVANTI, 1999, MOREIRA et al., 2009). É bastante comum, nos casos

de fotossensibilização de animais que pastejam Brachiaria sp, a presença de macrófagos e

células gigantes multinucleadas com citoplasma espumoso, localizadas principalmente na

região periacinar. Macrófagos espumosos são células de citoplasma abundante, com inúmeros

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vacúolos pequenos opticamente vazios, que dão ao citoplasma aparência de espuma

(BARBOSA et al., 2006).

De acordo com KINSCHERF et al. (1997), o macrófago espumoso deriva da

internalização da lipoproteína de baixa densidade (LDL) modificada por mecanismos de

oxidação, via receptores inespecíficos. O estresse oxidativo, por diminuição dos mecanismos

de proteção do organismo ou pela presença de uma substância exógena capaz de produzir

lipoperoxidação, também promove a oxidação da LDL e consequentemente o surgimento dos

macrófagos espumosos. A esporidesmina é rapidamente auto-oxidada, gerando radicais

superóxidos (FAGLIARI et al., 2003; MOREIRA et al., 2009) Estes radicais podem ocasionar

no fígado a peroxidação de lipídeos, que, por sua vez, poderia desencadear o surgimento de

macrófagos espumosos (FIORAVANTI,1999).

As primeiras descrições da presença de macrófagos espumosos no fígado de

bovinos se seguiram a disseminação da Brachiaria sp como principal pastagem no Brasil.

Observou-se que macrófagos de citoplasma espumoso não estavam presentes em bovinos que

não ingeriram Brachiaria sp, o que indicou a relação entre a sua presença e a ingestão da

planta (DRIEMEIER et al., 1999). Aglomerados de macrófagos espumosos no fígado e em

linfonodos, com algumas células contendo cristais birrefringentes, foram observados em

bovinos ingerindo feno de Brachiaria brizantha (TORRES & COELHO, 2003).

Segundo JIMÉNEZ et al. (2005) e PENHA-SILVA et al. (2005), os antioxidantes

de maior importância para os ruminantes são vitamina E, selênio, carotenoides (vitamina A e

β-carotenos) e zinco.

A suplementação de vitamina A em bovinos foi avaliada por PASCHOAL &

ZANETTI (2004) e MARÇAL (2006) que verificaram que a utilização do antioxidante atuaria

na prevenção do edema de úbere e da mastite pós-parto em vacas leiteiras. BRYANT et al.

(2010) ao trabalharem com o mesmo antioxidante em garrotes confinados, relataram que uma

concentração até duas vezes maior que a recomendada para bovinos apresenta pouco efeito

sobre o desempenho e o acabamento de carcaça do animal. AMARAL et al. (2004) ao

avaliarem o efeito da vitamina A sobre a atividade reprodutiva em vacas de corte concluíram

que a suplementação aumenta o número de embriões viáveis sem interferir na quantidade de

embriões produzidos.

Conforme McDOWELL (1992), o papel do selênio na nutrição animal foi

descoberto quando se observou que a suplementação evitava necrose hepática em ratos. Após

essa constatação, também foram relatadas prevenções de distrofia muscular nutricional

quando bovinos e ovinos foram suplementados com selênio (PASCHOAL et al., 2003). Em

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ruminantes, os problemas com selênio são mais tipicamente observados próximos ao parto,

com maior incidência de mastite e retenção de placenta na fêmea, e doença do músculo

branco nos recém-nascidos (TOKARNIA et al., 2000; SORDILLO, 2013)

LIMA & DOMINGUES (2007) recomendaram a suplementação de selênio na

forma de mistura mineral para bovinos, a fim de proporcionar efeitos positivos sobre a

produção (ganho de peso, reprodução), tanto na saúde e bem estar animal, como na eficiência

dos processos e produtos. PASCHOAL et al. (2003) confirmaram a teoria de promoção da

saúde animal pela suplementação de selênio associado a vitamina E, ao concluírem que a

administração conjunta desses antioxidantes diminuiu a incidência de mastite clínica nas 12

primeiras semanas de lactação.

Inúmeros pesquisadores demonstraram os efeitos da suplementação da vitamina E

em bovinos na qualidade da carne de bovinos Nelore (PEREIRA, 2002; FACO et al., 2009),

no período de pré e pós-parto em vacas leiteiras (PASCHOAL et al., 2004), no metabolismo

oxidativo de neutrófilos (COSTA et al., 2004), na infecção por herpesvírus tipo 1 (CUSACK

et al., 2005) e na ocorrência de mastite em vacas (VALLE, 2005; FERREIRA et al., 2007;

BRITO et al., 2008). No entanto, nenhum desses trabalhos conseguiu demonstrar o efeito da

suplementação com a vitamina E de forma isolada. Segundo VALLE (2005), a suplementação

isolada de vitamina E não foi capaz de evidenciar diferenças estatísticas sobre a quantidade de

neutrófilos presente no leite em virtude da complexidade dos mecanismos envolvidos na

atividade funcional deste antioxidante.

HADDAD & ALVES (2006) constataram que o selênio e vitamina E apresentam

forte relação de sinergismo prevenindo a oxidação de fosfolipídeos da membrana, enquanto

que NICOLODI et al. (2010) verificaram que a administração conjunta desses antioxidantes

em ruminantes propiciou melhor resposta imune. PASCHOAL et al. (2006) relataram que o

selênio e a vitamina E são antioxidantes importantes na defesa de células e tecidos que atuam

diretamente na manutenção da saúde do úbere, e que na dosagem utilizada no ensaio não se

constatou influencia do antioxidante sobre a contagem de células somáticas (CCS), que é

considerada uma prova indicadora de mastite. VALLE (2000) não observou efeito da

vitamina E sobre a incidência de mastite subclínica. JUARÉZ et al. (2009) ao trabalharem

com vacas de leite, relataram que o uso da suplementação de selênio e vitamina E nos dias 60

e 21 pré-parto e nos dias 30 e 90 pós-parto, também diminui a incidência de enfermidades

uterinas pós-parto e melhora as taxas de gestação aos 150 dias após o parto.

Em estudo avaliando o acréscimo de zinco na alimentação de bezerros verificou-

se que a suplementação melhorou a resposta imunológica mediada por células e a resposta de

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anticorpos para vacinas comerciais de vírus mortos ou vivos modificados, com reflexo

positivo sobre o desempenho dos animais devido ao seu efeito (KEGLEY et al., 2001). COPE

et al. (2008) ao avaliar os efeitos da quantidade e da forma de suplementação com zinco sobre

o desempenho e a saúde de vacas leiteiras, concluíram que a suplementação proporcionou

diminuição da quantidade de células somáticas e na concentração de leite amiloide em vacas

leiteiras. WAGNER et al. (2008) ao estudarem as diferentes fontes orgânicas de zinco

concluíram que independente da fonte mineral utilizada os animais apresentaram resultados

semelhantes para o desempenho e de característica de carcaça.

Embora haja na literatura informações sobre a utilização de antioxidantes na dieta

animal e seus efeitos sobre a sanidade animal, pouco se sabe sobre a influência da

suplementação com antioxidantes sobre a medicina de produção animal. Diante dessa

realidade, muitos pesquisadores deram início aos estudos abrangendo esse eixo temático.

Sabe-se que a suplementação mineral tem contribuído muito para a produção animal, o que

leva a um desempenho de alta performance e obtenção de carcaças com qualidade superior.

Resultados estes que também têm sido obtidos com a utilização de antioxidantes nos animais

e que têm contribuído de forma significativa para a diminuição de enfermidades durante a

cadeia produtiva.

3 OBJETIVOS

No presente estudo, objetivou-se avaliar o efeito da suplementação com

antioxidantes de forma isolada (selênio, zinco e vitamina E) ou associada (selênio e vitamina

E) em bovinos confinados alimentados com feno de braquiária, por meio da determinação de

biomarcadores de estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa peroxidase e catalase) e em

hepatócitos (malondialdeído), complementando as informações com exames laboratoriais e

histológicos.

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CAPÍTULO 2 - ERITROGRAMA E ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS

CONFINADOS ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E

SUPLEMENTADOS COM ANTIOXIDANTES

RESUMO

As Brachiaria sp contêm esporidesminas que podem ser oxidadas por lipoperoxidação e ocasionar estresse oxidativo. No presente estudo foram avaliados os efeitos de diferentes antioxidantes na lipoperoxidação dos eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno de Brachiaria sp. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em que 40 bovinos machos inteiros foram divididos, com cinco tratamentos (G1: controle - sem suplementação; G2: suplementação de selênio e vitamina E; G3: suplementação de zinco; G4: suplementação de selênio e G5: suplementação de vitamina E) e alocados em baias de confinamento, por 105 dias. Os animais foram alimentados duas vezes ao dia e receberam água ad libitum. Na dieta foi seguida a proporção de volumoso e concentrado de 70:30. Para a obtenção das amostras foi realizada a punção venosa e o sangue foi coletado em tubos com anticoagulantes (EDTA e heparina). Para a avaliação do estresse oxidativo, com o objetivo de analisar as características da membrana do eritrócito foram determinadas as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), glutationa total (GSH-t), glutationa peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD). Os resultados demonstraram que independente do tratamento não houve estresse oxidativo durante o período do confinamento experimental e que a associação conjunta de selênio e vitamina E na dieta dos bovinos proporcionou menor incidência de alterações deletérias sobre os eritrócitos.

Palavras chaves: enzimas antioxidantes, eritrócito, lipoperoxidação, Nelore, radical livre,

TBARS.

ABSTRACT

Brachiaria sp species contain sporidesmins, which lead to lipid peroxidation and oxidative stress due oxidation. The aim of the present study was to evaluate the effects of different antioxidants in Nelore cattle fed with Brachiaria sp in the prevention of lipid peroxidation in cell membranes. A total number of 40 animals were divided into five groups being confined for 105 days. The experimental design was completely randomized with five treatments (G1: control group - no supplementation; G2: supplementation of selenium and vitamin E; G3: zinc supplementation; G4: selenium supplementation and G5: vitamin E supplementation). Animals were fed twice a day and had access to water ad libitum. The diet followed the proportion of 70:30 for forage and concentrate, respectively. Blood samples were harvested by venous puncture. The samples were stored in heparinized tubes and then analyzed. To evaluate oxidative stress, erythrocyte membrane characterization, TBARS, GSH-T, GSH-Px, SOD and CAT were performed. No oxidative stress was detected during the experimental period when animals were confined even when using antioxidants. Additionally, selenium and vitamin E combined in same diet seemed to cause less deleterious alterations on the erythrocyte.

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Keys-words: antioxidants enzymes, erythrocyte, lipid peroxidation, Nelore, free radical, TBARS. 1 INTRODUÇÃO

A pecuária brasileira tem se desenvolvido muito nos últimos anos, o que resultou

em uma contribuição de 384 bilhões de reais para economia, com valorização de 11,6% do

PIB brasileiro de 2013 (CEPEA/USP, 2013). Uma das vantagens competitivas da cadeia

produtiva da carne brasileira é o sistema extensivo, porém esse sistema de criação a pasto

pode acarretar algumas ineficiências na produção (FIORAVANTI, 1999). Na tentativa de

minimizar essas ineficiências têm sido buscadas novas tecnologias, como a adoção de

aditivos, que visam melhorar a eficiência da cadeia produtiva tendo como foco a

sustentabilidade (BRASIL, 2013).

As espécies de gênero braquiária são importantes forrageiras consideradas como a

“salvação da pecuária nacional” (GHISI, 1991). Entretanto, algumas espécies como B.

brizantha, B. humidicola e, especialmente, B. decumbens foram descritas como causadoras de

fotossensibilização hepatógena em ruminantes (TOKARNIA et al. 2000, LEMOS &

PURISCO, 2002). A causa principal da fotossensibilização hepatógena em bovinos é a

ingestão da toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo Pithomyces chartarum,

(MOTTA et al., 2000; MACEDO et al., 2006).

O principal efeito tóxico da esporidesmina deve-se à ocorrência da peroxidação de

lipídeos e da carboxilação de proteínas presentes nas células, resultantes da quantidade

excessiva de radicais livres (CHILAUFF VIVANCO et al., 2006). Entretanto, alguns

pesquisadores tem atribuído como causa da intoxicação as saponinas esteróides litogênicas

presentes nas espécies de Brachiaria sp (CRUZ et al., 2001; BRUM et al., 2009). Essas

saponinas, ao serem metabolizadas no organismo animal formam sais insolúveis que se

depositam sob a forma de cristais no sistema biliar (MILES et al., 1991). Os cristais causam

inflamação e obstrução do sistema biliar, provoca necrose dos hepatócitos periportais

resultando em icterícia, fotossensibilização e hepatite (SANTOS et al., 2008).

O estresse oxidativo pode ser definido como um desequilíbrio entre produção de

radicais livres e a remoção pelos sistemas de defesa antioxidante (SIES, 1993), que ocasiona

danos moleculares às estruturas celulares, com consequente alteração funcional e prejuízo das

funções vitais em vários órgãos e tecidos (DROGE, 2002). Do ponto de vista funcional, o

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dano oxidativo promove alterações sobre a fluidez, permeabilidade e função metabólica, o

que resulta em um incremento em sua fragilidade da membrana eritrocitária (CHILAUFF

VIVANCO et al., 2006). Dentre os mamíferos, os bovinos exibem uma particularidade, na

qual apresentam uma menor susceptibilidade à ação dos radicais livres (BREZEZISKA-

SLEBODZISKA, 2003), em decorrência da composição e organização da membrana

eritrocitária que contém baixas quantidades de fosfatidilcolina, um fosfolipídio altamente

peroxidável (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 2001).

Devido ao transporte de oxigênio realizado pela hemoglobina, os eritrócitos estão

constantemente expostos às espécies reativas de oxigênio (EROs) (FLORIN-CHRISTENSEN

et al., 2001). O eritrócito apresenta em sua membrana grande número de grupos sulfidrilas,

que ao serem oxidados acarretam em desnaturação das proteínas de membrana. Nesse

processo, pode ocorrer lesão intracelular, com oxidação da hemoglobina à meta-hemoglobina,

que precipita e forma os corpúsculos de Heinz (CALDIN et al., 2005; TANG et al., 2007).

Para evitar os danos causados pela peroxidação, as células possuem sistema de

defesa antioxidante composto pelas enzimas glutationa reduzida (GSH), superóxido-

dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSHpx) e vitamina E (ÖZTÜRK &

GÜMÜSLÜ, 2004). Os agentes antioxidantes não enzimáticos são constituídos pelo ácido

ascórbico, pela glutationa-redutase (GSH-Rd), carotenos, ácido úrico e proteínas quelantes de

metais de transição (CIMEN, 2008).

A avaliação de ocorrência de estresse oxidativo em eritrócitos para acompanhar a

evolução da peroxidação nas biomembranas é a mensuração de TBARS (substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico) por meio da quantificação de malondialdeído (MDA) que é produzido

na peroxidação lipídica de ácidos graxos polinsaturados (TODOVORA et al., 2005;

MACHADO et al., 2007).

O emprego de antioxidantes adicionados à ração ofertada ao animal tem

constituído uma opção eficiente de melhoramento no sistema produtivo. Sua utilização tem

propiciado aos animais melhora na sanidade, reprodução e na produção (conversão alimentar

e ganho de peso). Isso significa que a eficiência alimentar exerce grande impacto sobre a

lucratividade da pecuária, que pode resultar em redução de custos de produção e aumentar a

eficiência do processo produtivo (SIQUEIRA et al., 2014).

Nesse contexto, objetivou-se com o presente estudo avaliar se a suplementação de

diferentes fontes de antioxidantes, na dieta de bovinos confinados alimentados com feno de

Brachiaria sp poderia reduzir a ocorrência de estresse oxidativo sobre os eritrócitos.

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33

2 MATERIAL E MÉTODOS

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

Universidade Federal de Goiás (UFG) e foi registrado sob o número 360/2010. O estudo foi

desenvolvido na Fazenda Tomé Pinto de propriedade da Escola de Veterinária e Zootecnia da

UFG, localizada no Município de São Francisco de Goiás, Estado de Goiás, distante a 110 km

da capital.

Foram utilizados 40 bovinos machos não castrados de peso médio inicial de 360

Kg e idade entre 24 a 36 meses, criados em pastos de Brachiaria sp. O delineamento

experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e oito repetições, em que

cada repetição foi representada por um animal. Os tratamentos foram representados pelos

diferentes antioxidantes e pelo grupo controle.

Após um período de adaptação de 14 dias nas instalações e com a alimentação, os

animais foram divididos em cinco grupos, que receberam os tratamentos seguintes:

• Grupo 1 (G1 = GC) - controle (sem suplementação);

• Grupo 2 (G2 = Se + Vit.E) - suplementação com 1000UI de vitamina E e 10mg de

selênio/animal/dia (2g na forma de acetato de α-tocoferol à 50% e 10g na forma de selênio

metionina);

• Grupo 3 (G3 = Zn) - suplementação de 600mg de zinco/animal/dia (6g na forma de zinco

metionina);

• Grupo 4 (G4 = Se) - suplementação com selênio 10mg de selênio/animal/dia (10g na forma

de selênio metionina);

• Grupo 5 (G5 = Vit.E)- suplementação com 1000UI de vitamina E/animal/dia (2g na forma

de acetato de α-tocoferol a 50%).

Durante o período de experimentação, os animais permaneceram alojados em baias

de confinamento e foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado

(ração). A dieta obedeceu à proporção entre volumoso e concentrado de 70:30, em que o

concentrado foi balanceado de acordo com a análise bromatológica do feno ofertado (Quadro

1), com base na estimativa de um ganho diário de 0,880kg/dia e para atender as exigências

nutricionais dos animais de acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC (1996).

O concentrado formulado (Integral Nutrição Animal, Goiânia, GO) teve uma concentração de

34% de proteína e 71% de NDT, sendo os principais constituintes, farelo de soja, farelo de

milho e mistura mineral (Quadro 2).

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QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento

Parâmetros % DP Materia seca 94,43 2,34

Nutrientes digestíveis totais 55,13 14,29 Proteína bruta 1,43 0,27

Fibra detergente ácida 37,30 8,51 Fibra detergente neutra 72,36 5,06

QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais

Ingredientes % em materia seca Feno capim Brachiaria sp 70,0 Milho moído 20,5 Farelo de soha 45% 7,5 Minerais1 2,0 *A formulação foi realizada utilizando o software RLM 3.2 (2009)

1 Minerais sem ureia e sem ionóforos

O feno de B. brizantha foi produzido e armazenado na própria Fazenda Tomé Pinto

e na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG, sendo que durante o período

experimental foram colhidas amostras para a contagem de esporos DIMENNA & BAILEY

(1973) e para extração e análise de saponina (Quadro 3) que foram realizadas no United States

Department of Agriculture – Poisonous Plant Research Laboratory (USDA-PPRL), Logan,

Utah, EUA. O manejo, vacinação, tratamento com ecto e endoparasiticidas foi similar para

todos os grupos.

QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ)

Procedência das gramíneas

Mês da análise

% de protodioscina % da redução da

protodioscina CAPIM FENO FTP – B. brizantha maio 1,08 0,75 30,55

FTP – B. decumbens maio 1,20 0,65 45,83 EVZ – B. brizantha agosto 0,55 0,38 30,55

Valores médios maio a agosto 0,94 0,59 35,64 *Valores estimados baseado na análise de maio

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Os antioxidantes foram pesados em uma balança de precisão da marca

Shimadzu®, modelo AY 220, diariamente em copos descartáveis, nas quantidades de 10g de

selênio metionina, 6g de zinco, 2g de vitamina E, de forma a propiciar que cada animal

recebesse a quantidade diária de antioxidante, conforme o seu tratamento no cocho. Para

melhorar o consumo da quantidade acima especificada, era colocado sobre o antioxidante um

pouco de ração, sendo ofertados individualmente por animal e monitorados pelo auxiliar até a

ingestão do antioxidante e do concentrado na sua totalidade, impedindo que outro bovino se

aproximasse do cocho. Os animais foram mantidos confinados em grupo por um período de

105 dias, de acordo com o tratamento, em baias sombreadas providas de bebedouros e

comedouros.

Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, às 8:00 e às 15:00 horas. A

alimentação foi fornecida sob a forma de dieta total. As sobras de alimentos foram pesadas e

descartadas diariamente antes do fornecimento matinal, para se determinar o consumo de

alimento pelo grupo e evitar que as sobras não ultrapassassem mais de 10% do total

fornecido, sendo que a água foi fornecida à vontade.

Para a colheita das amostras, os bovinos foram mantidos em estação e contidos no

brete. As amostras sanguíneas foram obtidas a cada período de 28 dias (0, 28, 56, 84 e 105

dias) por meio de punção da jugular em tubos contendo EDTA a 10% (ácido

etilediaminotetracético, sal dissódico) e tubo com heparina.

Em seguida a colheita, os tubos foram armazenados em caixas térmicas a 10ºC e

encaminhados ao Laboratório Multiusuário do Programa de Pós-Graduação em Ciência

Animal da EVZ/UFG, no período máximo de duas horas para a realização do hemograma e

obtenção do hemolisado. Após a obtenção das alíquotas para os ensaios de estresse oxidativo

(SOD, TBARS, grupamento tióis, CAT e glutationas), as amostras foram armazenadas no

freezer a -80ºC.

As amostras destinadas ao eritrograma foram processadas à medida que chegavam

ao laboratório, não ultrapassando seis horas a partir do momento da colheita. Para a obtenção

do hemograma, as amostras armazenadas em tubo de ensaio com EDTA, foram analisadas no

equipamento semiautomático BC 2800 VET (Mindray, Shenzhen), sendo determinadas as

variáveis: eritrócitos e hemoglobina. O volume globular (VG) foi obtido por meio de

microcentrifugação pela técnica de microhematócrito (JAIN, 1993).

O hemolisado obtido a partir das amostras destinadas à análise de estresse oxidativo

foi preparado segundo o protocolo utilizado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

de Universidade Estadual Paulista – UNESP/Botucatu (FERREIRA et al., 1999).

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36

Inicialmente, os dados foram submetidos à estatística descritiva e posteriormente,

foram analisados por análise de variância (ANOVA), empregando-se o teste de Tukey, por

meio do pacote computacional do SAS, com grau de significância de 5%.

3 RESULTADOS

Os valores médios (eritrócitos, hemoglobina e volume globular) estão descritos na

Tabela 1 e não sofreram influência dos diferentes esquemas de suplementação ao longo do

experimento (p<0,05). Os resultados referentes à quarta colheita foram descartados em

virtude do equipamento não estar devidamente calibrado no dia da execução dos exames

laboratoriais.

TABELA 1 - Médias ( X = média em cada momento e Média = média geral considerando

todos os momentos) de eritrócitos, hemoglobina e volume globular de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas Eritrócitos (x106/µl) Hemoglobina (g/dL) Volume globular (%)

X Média X Média X Média

G1

1º (Basal) 7,74

7,81a

11,96

11,37a

36,48

37,68a 2° 8,21A* 11,95AB* 39,24A* 3° 8,01A* 10,99A* 38,84A* 5° 7,27A* 10,58A* 36,15A*

G2

1° (Basal) 7,33

7,35a

11,78

11,05a

35,09

36,67a 2° 7,44AB* 11,06AB* 36,68A* 3° 7,49A* 10,61A* 37,99A* 5° 7,12A* 10,73A* 36,91A*

G3

1° (Basal) 7,51

7, 92a

11,74

11,44a

35,98

38,52a 2° 8,42A* 12,32A* 40,95A* 3° 7,85A* 10,74A* 38,55A* 5° 7,58B* 11,01B* 38,60A*

G4

1° (Basal) 7,45

7,38a

11,65

10,68a

34,95

35,43a 2° 7,33B* 10,35B* 34,41A*

3° 7,47A* 10,24A* 35,96A* 5° 7,26A* 10,46A* 36,38A*

G5 1°

(Basal) 8,09 7,84a 12,45 11,42a 36,28 37,46a

2° 7,91AB* 11,06AB* 36,66A*

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37

3° 8,12A* 11,05A* 39,11A* 5° 7,56A* 11,11A* 37,80A*

Media 7,66 11,19 37,15 Probabilidade 0,471 0,528 0,215 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas colunas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

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38

Na avaliação hematológica (eritrócitos, hemoglobina e VG) foram encontradas

alterações numéricas nos parâmetros mensurados que não produziram diferenças estatísticas

entre os diferentes tratamentos. Em relação às colheitas foram observadas as ocorrências de

distanciamento dos valores médios obtidos para as variáveis avaliadas nas amostras referentes

à segunda e quinta colheita. Na contagem de eritrócitos, observados nessa colheita constatou-

se que G4 apresentou valores menores de eritrócitos que G1 e G3 (p<0,05). Na determinação

de hemoglobina houve variações estatísticas (p<0,05) em que o maior valor encontrado foi em

G3 e o menor em G4. O volume globular (%) não apresentou variações numéricas (p>0,05),

no período experimental.

Na determinação de TBARS (Tabela 2) ao analisar as colheitas realizadas,

verificou-se que houve interação grupos/tempo (p<0,05), com diferença significativa entre os

grupos na primeira, segunda, terceira e quinta colheitas. Foram identificadas diferenças

estatísticas (p<0,05) entre os grupos avaliados, de modo que G3 apresentou o maior valor

médio e o G2 o menor. As médias marginais entre as colheitas foram semelhantes (p>0,05).

TABELA 2 - Médias da concentração de TBARS (nM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Dia 0) 22,38 19,98 23,58 21,13 21,72 21,76ª

<0,0001 0,1079 0,001 2 (28 dias) 21,18A* 18,62B* 22,88A* 22,63A* 21,90A* 21,44ª 3 (56 dias) 23,54A* 18,93C* 23,26A* 20,55BC* 22,23AB* 21,70ª 4 (84 dias) 21,44A* 20,91A* 22,68A* 22,12A* 22,38A* 21,90a

5 (105 dias) 21,80B* 21,45B* 23,68A* 22,23AB* 22,69AB* 22,37ª Média 21,99B 19,98C 23,12A 21,88B 22,30AB

Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

Na avaliação da atividade enzimática da GSH-T (Tabela 3), não foi observada

interação em relação grupo/tempo (p>0,05). Verificou-se diferença significativa entre as

médias dos grupos (p<0,05), sendo que o G5 apresentou o menor valor médio e o G1 o mais

elevado. No entanto, entre as colheitas não houve diferença significativa (p>0,05).

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39

TABELA 3 - Médias de GSH-T (µM/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 42,58 42,85 44,86 44,19 41,18 43,13a

0,0112 0,4867 0,9196 2 (28 dias) 43,71A* 42,63A* 43,13A* 42,04A* 41,03A* 42,51a

3 (56 dias) 45,26A* 40,97A* 46,09A* 44,27A* 40,45A* 43,41a

4 (84 dias) 45,83A* 42,01A* 43,78A* 45,48A* 42,54A* 43,93a

5 (105 dias) 43,62A* 42,91A* 42,81A* 44,18A* 39,05A* 42,52a

Média 44,60A 42,13AB 43,95AB 44,00AB 40,77B Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

Na determinação da atividade enzimática de GSH-Px houve interação em relação

grupo/tempo (p<0,05), com diferença significativa em todos os momentos de colheita. Houve

diferença significativa (p<0,05) entre os grupos experimentais, sendo que o G3 apresentou o

menor valor médio e o G2 os maiores (Tabela 4). Considerando os momentos de colheita,

verificou-se as maiores médias no dia 56 e as menores aos 28 e 84 dias (p<0,05), entretanto,

sem diferença significativa (p>0,05) entre o início e o fim do estudo.

TABELA 4 - Médias de GSH-Px (UI/gHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 0,67 0,82 0,58 0,76 0,71 0,71ab

<0,0001 0,0022 0,0352

2 (28 dias) 0,66ABC* 0,79A* 0,53C* 0,63BC* 0,67AB* 0,66b

3 (56 dias) 0,69AB* 0,83A* 0,61B* 0,75AB* 0,87A* 0,75a

4 (84 dias) 0,62B* 0,86A* 0,52B* 0,67B* 0,68B* 0,67b

5 (105 dias) 0,72AB* 0,82A* 0,60B* 0,70AB 0,79A* 0,73ab

Média 0,68B 0,82A 0,56C 0,68B 0,75AB Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

Na mensuração da SOD foi observada interação em relação grupo/tempo (p<0,05)

nos valores médios verificou-se diferença significativa, nos grupos experimentais na terceira,

quarta e quinta colheita (Tabela 5). O G3 apresentou resultados estatisticamente inferiores aos

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dos demais tratamentos e G1 e G4 apresentaram os valores mais elevados (p<0,05). As

médias marginais entre as colheitas foram semelhantes (p>0,05).

TABELA 5 - Médias de SOD (UI/mgHb) em eritrócitos de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e submetidos a tratamento com diferentes antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação

1 (Basal) 276,38 280,38 267,25 264,50 265,00 270,70a

<0,0001 0,0583 0,0125 2 (28 dias) 278,12A* 265,37A* 253,87A* 275,12A* 266,62A* 267,82a

3 (56 dias) 290,87A* 279,87AB* 255,00C* 298,37A* 266,00BC* 278,02a

4 (84 dias) 297,00A* 274,87AB* 246,75C* 297,25A* 268,50BC* 276,87a

5 (105 dias) 284,50AB 279,50AB* 239,50C* 304,00A* 274,25B* 276,35a

Média 287,63A 274,90B 248,78C 293,69A 268,84B

Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

A determinação da CAT apresentou interação em relação grupo/tempo (p<0,05)

nos grupos experimentais somente na quarta e quinta colheitas (Tabela 6). Constatou-se, que

no G3, o valor médio foi superior (p<0,05) aos demais tratamentos, enquanto que o G2

apresentou os menores valores (p<0,05). As médias marginais entre as colheitas foram

similares (p>0,05).

TABELA 6 - Médias de catalase (UI/mgHb) em eritrócitos bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e submetidos a tratamento com diferentes antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Basal) 58,91 56,53 56,27 55,83 54,28 56,36a

<0,0001 0,8829 0,0087 2 (28 dias) 60,08A* 54,87A* 56,92A* 59,28A* 52,17A* 56,66a

3 (56 dias) 59,78A* 51,10A* 59,36A* 56,89A* 56,84A* 56,80a

4 (84 dias) 54,32A* 50,33A* 68,73B* 56,80A* 58,95AB* 57,82a

5 (105 dias) 53,13A* 51,07A* 66,88B* 57,81A* 56,33A* 57,04a

Média 56,82B 51,84C 62,97A 57,70AB 56,07BC Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indica diferença significativa entre colheita. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indica diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas

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41

4 DISCUSSÃO

O perfil eritrocitário dos animais durante todo o experimento manteve-se dentro

dos limites de referência proposto por FAGLIARI (1998). MOREIRA et al. (2009) ao

avaliarem bovinos alimentados com capim Brachiaria sp observaram resultados similares

para a contagem de eritrócitos. CHIHUAILAF VIVANCO et al. (2006) ao estudarem o efeito

da suplementação de selênio em vacas observaram resultados semelhantes para hemoglobina.

SHARMA et al. (2011) ao trabalharem com vacas em período de transição com a adição de

vitamina E à ração encontraram resultados semelhantes ao perfil hematológico para

hemoglobina deste estudo. CALAMARI et al. (2011) divergiram aos resultados obtidos nesse

experimento, em que os valores médios de eritrócitos, hemoglobina e VG obtidos com a

suplementação de diferentes fontes (orgânica e inorgânica) em dietas de vacas leiteiras foram

maiores aos obtidos no grupo controle. MACHADO et al. (2009) ao avaliarem a lesão

oxidativa eritrocitária concluíram que a associação de antioxidantes promove menos

alterações eritrocitárias com benefícios potenciais do tratamento por meio da suplementação

com antioxidantes sobre os eritrócitos.

Dentro dos momentos houve uma tendência de elevação dos eritrócitos no grupo

zinco, embora essa diferença numérica não refletisse em alterações biológicas. De acordo com

KOURY & DONANGELO (2003), a elevação dos valores médios dos eritrócitos poderia ser

explicada na função exercida pelo zinco na manutenção da integridade das membranas

celulares dos eritrócitos. A ação desempenhada por esse microelemento favorece a associação

das proteínas presentes na membrana com os demais componentes do citoesqueleto celular,

que por sua vez conferem a proteção antioxidante as membranas frente à oxidação de lipídeos

e proteínas e antagoniza possíveis efeitos deletérios por elementos iônicos.

A mensuração de TBARS nos eritrócitos evidenciou que durante as colheitas não

houve diferença significativa entre as médias marginais das colheitas. Porém, constatou-se

diferença significativa entre os tratamentos propostos (p<0,05). O malondialdeído (MDA) é

um dos principais marcadores da peroxidação lipídica e por meio dele são mensuradas as

TBARS. O acréscimo na concentração sanguínea desse marcador está relacionado ao aumento

da peroxidação lipídica e dano oxidativo (DRAPER & HADLEY, 1990). Os animais que

receberam a suplementação de selênio e vitamina E demonstraram maior estabilidade lipídica.

LIU et al. (2008) ao trabalharem com suplementação isolada e associada de selênio e vitamina

E de em bovinos também relataram a melhoria no estado redox do sangue quando ocorreu a

associação dos antioxidantes.

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42

Os valores obtidos na mensuração de TBARS no grupo suplementado com

vitamina E associada ao selênio, demonstraram resultados similares aos observados por

KRIZANOVIC et al. (2008) em bovinos da raça Simental com idade próxima a 20 meses, que

relataram valores de TBARS inferiores no grupo que recebeu a suplementação associada de

vitamina E e selênio. CHANDRA et al. (2013) obtiveram resultados análogos ao avaliarem a

influência de alguns antioxidantes (zinco e vitamina E, de forma isolada e associada) sobre a

peroxidação lipídica no sangue de bovinos, em que observou-se que a associação dos

antioxidantes ocasionou a obtenção de menores índices de lipoperoxidação. Entretanto, os

resultados obtidos no presente estudo foram diferentes aos encontrados por CASTILLO et al.

(2005, 2006) e KUMAR et al. (2011) que obtiveram resultados maiores e por SHARMA

(2011) que encontrou resultados menores aos obtidos neste trabalho ao se avaliar a

lipoperoxidação em bovinos. Este fato ocorreu provavelmente, pela utilização de diferentes

metodologias e unidades de concentração que foram empregadas na mensuração do MDA

como indicador de estresse oxidativo.

Cabe ressaltar também que a manutenção dos níveis de GSH-t deveu-se ao fato de

que a glutationa em maior concentração na maioria das células, inclusive nos eritrócitos de

mamíferos, está sob a forma reduzida (GSH). A depleção dos níveis de GSH pode ocorrer

diretamente, por conjugação com radicais livres e, indiretamente por inibidores da sua síntese

e regeneração (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).

Como o consumo de GSH provavelmente ocorreu apenas por sua propriedade

antioxidante, a permanência de altas concentrações de GSH nos eritrócitos contribuiu para a

manutenção dos níveis de GSH-t. Aliado a isso, a manutenção dos valores de GSH-t pode ter

ocorrido também em função do “aumento compensatório” na produção de GSH por outros

órgãos, na tentativa de auxiliar o organismo a combater o aumento na produção das EROs

(MACHEFER et al., 2004). Sendo que, por conseguinte, estes podem aumentar o grau de

peroxidação lipídica e danos celulares. Comportamento semelhante ao que ocorreu neste

estudo foi relatado por LIU et al. (2008), ao descreverem que a associação de selênio e

vitamina E proporcionou aos bovinos analisados um sinergismo entre o efeito dos

antioxidantes administrados resultando em menor efeitos deletérios sobre as células

eritrocitárias.

Ainda em relação à GSH, os resultados obtidos neste ensaio para a suplementação

isolada de selênio e vitamina E foram menores aos encontrados por CHIHUAILAF

VIVANCO et al. (2006), ao avaliar os benefícios da suplementação de selênio em bovinos

sobre a estabilidade da membrana dos eritrócitos. SHARMA et al. (2011), ao analisar os

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43

efeitos da adição de vitamina E em vacas em período de transição, encontraram resultados

maiores e correlação negativa entre a atividade enzimática e o marcador de lipoperoxidação.

Acredita-se que essa divergência ocorreu em virtude do sexo, da concentração de antioxidante

fornecido e do estado fisiológico dos animais, além da metodologia empregada, com a

utilização de reagentes comerciais diferentes dos empregados neste estudo.

As médias de SOD entre as colheitas apresentaram diferença estatística

significativa (p<0,05) para os grupos analisados em função da variação na concentração de

H2O2 provocada pela ação da SOD, indicando que houve ativação do ciclo redutor da

glutationa, em que os grupos suplementados com selênio e vitamina E (G2), selênio (G4) e

vitamina E (G5) apresentaram valores crescentes ao longo das colheitas. ABD ELLAH et al.

(2009) ao trabalharem com mensurações de estresse oxidativo em bovinos por meio da

atividade de SOD e do percentual da atividade CAT, obtiveram resultados similares ao deste

estudo, o que demonstra que elevadas concentrações de H2O2 não produzem desequilíbrio com

os antioxidantes. DOBBELLAR et al. (2010) ao avaliarem a influência de distúrbios

metabólicos sobre o estresse oxidativo verificaram que a inclusão de vitamina E não propiciou

alterações em SOD e GSH-Px.

A avaliação da atividade enzimática da CAT promoveu elevação nas médias do

grupo que recebeu a suplementação com zinco (G3). Essa enzima apresenta um papel

importante na avaliação do estresse oxidativo, pois ela atua na neutralização do H2O2 em altas

concentrações, formado por meio da dismutação do radical O2- promovida pela SOD.

Entretanto, em baixas concentrações desse radical livre, a GSH atua exercendo a

neutralização do H2O2 (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Segundo FELTON &

SUMMERS (1995), é importante estabelecer a inter-relação entre as atividades dessas

enzimas para avaliar os mecanismos de defesa dos antioxidantes presentes no organismo.

LINKE et al. (2005) afirmaram que a atividade das enzimas SOD, GSH-Px e CAT é

comumente utilizada para avaliar a capacidade de defesa do organismo contra a ação das

EROs. As observações de variações entre as colheitas para CAT obtidos por KUMAR et al.

(2011) foram similares ao identificados neste estudo para ruminantes, indicando que essa

variação é provavelmente atribuída à condição de estresse.

A avaliação conjunta dos biomarcadores de estresse oxidativo avaliados neste

estudo revela que os eritrócitos não sofreram peroxidação lipídica, o que foi confirmado

principalmente pela não alteração dos valores de TBARS nas células eritrocitárias.

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5 CONCLUSÃO

A suplementação, de bovinos confinados da raça Nelore alimentados com feno de

Brachiaria sp, com antioxidantes de forma isolada (zinco, selênio e vitamina E) ou associada

(selênio e vitamina E), não altera o estresse oxidativo nos eritrócitos.

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CAPÍTULO 3 - LIPOPEROXIDAÇÃO HEPÁTICA EM BOVINOS CONFINADOS

ALIMENTADOS COM FENO DE BRACHIARIA SP E SUPLEMENTADOS COM

ANTIOXIDANTES

RESUMO

A esporidesmina é uma toxina facilmente oxidada, produzida pelo fungo Pithomyces chartarum que coloniza as espécies de Brachiaria sp, que tem sido descrita como causadora de lesão hepática em ruminantes. O presente estudo foi concebido para elucidar se a administração de antioxidantes na forma de suplementação minimiza a lipoperoxidação hepática em bovinos, por meio da determinação de malondialdeído (MDA) nos tecidos hepáticos. Durante 105 dias foram avaliados 40 bovinos da raça Nelore, com idade entre 24 e 36 meses, distribuídos em cinco tratamentos G1 (controle - sem suplementação), G2 (10mg de selênio e 1000UI de vitamina E), G3 (600mg de zinco/animal/dia), G4 (10mg de selênio/animal/dia) e G5 (1000UI de vitamina E/animal/dia). Foram colhidas amostras sanguíneas nos dias 0, 56 e 105 de tratamento para a mensuração da atividade sérica de gama glutamiltransferase (GGT) e aspartato aminotransferase (AST). Para as avaliações de estresse oxidativo e análise histopatológica foram obtidos fragmentos hepáticos por meio de biópsias (0 e 56 dias de confinamento) e por colheita de tecidos hepáticos durante o abate dos animais, ao final de 105 dias de confinamento. Os resultados demonstraram que os animais não apresentaram diferença estatística para as variáveis de GGT e AST durante o experimento. Na mensuração de MDA observou-se que não houve lipoperoxidação nos hepatócitos dos animais. Na avaliação histopatológica observou-se a redução quantitativa das alterações no parênquima hepático ao longo do ensaio. Dentre os antioxidantes utilizados como suplemento, a associação do selênio com a vitamina E apresentou os melhores resultados. Palavras-chaves: enzimas hepáticas, estresse oxidativo, fígado, malondialdeído, Nelore. ABSTRACT

Sporidesmin is an easily oxidized toxin produced by Pithomyces chartarum, a fungus that that colonizes Brachiaria spp, and has been associated to cause liver injury in ruminants. The present study was designed to clarify, through malondialdehyde (MDA) determination in liver tissues, if administration of antioxidant supplementation reduces hepatic lipid peroxidation in bovines. 40 Nelore bulls, aged between 24 and 36 months, were sorted into five treatments: G1 (non-supplemented control) G2 (10 mg of selenium and 1000 IU of vitamin E), G3 (600 mg zinc / animal - / day), G4 (10 mg selenium / animal / day) and G5 (1000 IU vitamin E / animal / day). Animals were evaluated for 105 days and blood samples harvested on days 0, 56 and 105 for measurement of gamma glutamyl transferase (GGT) and aspartate aminotransferase (AST) serum activity. Liver fragments were obtained through biopsies (0 and 56 days of confinement) and by harvesting liver tissue during the slaughter of animals at the end of 105 days of confinement. The animals showed no statistical difference for GGT and AST during the experiment. No hepatocyte lipid peroxidation was detected by measuring MDA. Histological evaluation showed reduction in the quantitative changes in the liver parenchyma throughout the experiment. Among the antioxidants used as a supplement, the association of selenium with vitamin E showed the best results.

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Keywords: liver enzymes, oxidative stress, liver, malondialdehyde, Nelore.

1 INTRODUÇÃO

As espécies de Brachiaria sp são importantes forrageiras que têm sido descritas

como causadoras de lesões hepáticas em ruminantes. Segundo MACEDO et al. (2006), a

causa principal é a ingestão da toxina esporidesmina, presente nos esporos do fungo

Pithomyces chartarum. Acredita-se que o principal efeito tóxico da esporidesmina é a

formação de quantidade excessiva de radicais livres, responsáveis pela lipoperoxidação das

membranas celulares (MUNDAY, 1982). Outra causa de lesão hepática em ruminantes

alimentados com a Brachiaria sp é a intoxicação por saponinas esteróides litogênicas

presentes nessas gramíneas (CRUZ et al., 2001; BRUM et al., 2009) que promovem a

formação de sais insolúveis que se depositam na forma de cristais no sistema biliar (RIET-

CORREA et al, 2009). Esses cristais podem causar inflamação e obstrução do sistema biliar,

dificultando a metabolização e excreção da filoeritrina que ao se acumular nos tecidos,

provoca necrose dos hepatócitos periportais resultando em icterícia, fotossensibilização e

hepatite (SANTOS et al. 2008).

Laboratorialmente, as principais disfunções hepáticas observadas em ruminantes

com hepatotoxicidade são as alterações na atividade sérica das enzimas hepatobiliares. A

elevação da atividade de gama glutamiltransferase (GGT) indica a ocorrência de lesão de

ductos biliares (SANTOS et al., 2008). A mensuração da atividade da aspartato

aminotransferase (AST) também é empregada na investigação de hepatopatias. Porém, por

não apresentar especificidade é necessário realizar a mensuração de outras enzimas hepáticas

para concluir o diagnóstico (KERR, 2003).

Independente da causa da lesão hepática de ruminantes que se alimentaram de

pastagens do gênero Brachiaria, microscopicamente, as principais alterações observadas são

colangite, pericolangite, colangiohepatite, proliferação de ductos biliares e tecido fibroso

(MOREIRA et al, 2009b). É frequente a presença de macrófagos e células gigantes

multinucleadas com citoplasma espumoso (FIORAVANTI, 1999; MOREIRA et al., 2009b).

De acordo com KINSCHERF et al. (1997), o macrófago espumoso deriva da

internalização da lipoproteína de baixa densidade (LDL) por mecanismos de oxidação. O

estresse oxidativo, por diminuição dos mecanismos de proteção do organismo ou pela

presença de uma substância exógena capaz de produzir lipoperoxidação, também promove a

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oxidação da LDL e, consequentemente, o surgimento dos macrófagos espumosos. FAGLIARI

et al. (2003) relataram que a esporidesmina é rapidamente auto-oxidada, gerando radicais

superóxidos. Segundo FIORAVANTI (1999), esses radicais podem ocasionar, no fígado a

peroxidação de lipídeos, que, por sua vez, poderia desencadear o surgimento de macrófagos

espumosos.

A lipoperoxidação é um fenômeno de lesão celular, em que ocorre a oxidação de

lipídeos constituintes da membrana celular devido à ação de radicais livres. Durante a

peroxidação, os ácidos graxos poli-insaturados presentes na membrana celular são

decompostos em malondialdeído (MDA) e o 4-hidroxynonenal (4-HNE) (DROGE, 2002;

ABD ELLAH et al., 2013), que por sua vez provocam danos sobre o metabolismo celular e as

características funcionais da célula. PESSAYRE et al. (2001) afirmaram que essas substâncias

induzem diretamente danos nos hepatócitos com geração de citocinas pró-inflamatórias,

ativação de células fusiformes e fibrogênese.

Para acompanhar a evolução da peroxidação, o número de substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido empregado como metodologia de escolha. Pois nessa

reação, o MDA formado durante a oxidação de ácidos graxos poli-insaturados reage com o

TBARS sob altas temperaturas e baixo pH formando complexo com cor e absorbância

definida. A mensuração de TBARS é considerada adequada para detecção de produtos finais

de lipoperoxidação (ABDALLA & SENA, 2008) e avaliar o comprometimento que a

oxidação lipídica poderia promover no organismo (KOWALE et al., 1996).

GUIMARÃES et al. (2006), ao avaliarem a relação entre a ocorrência de estresse

oxidativo e a permanência de integridade de hepatócitos concluíram que um dos mecanismos

responsáveis pela formação da fibrose hepática poderia ser a indução de peroxidação lipídica.

HAN et al. (2006) verificaram que a depleção de glutationa, frequentemente encontrada nas

doenças hepáticas, favoreceria a produção de radicais livres e consequentemente a

peroxidação lipídica.

Com o presente estudo objetivou-se elucidar se a suplementação de diferentes

fontes de antioxidantes poderia reduzir a lipoperoxidação hepática em bovinos confinados

alimentados com feno de Brachiaria sp.

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53

2 MATERIAL E MÉTODOS

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

Universidade Federal de Goiás (UFG) e foi registrado sob o número 360/2010. O estudo foi

desenvolvido na Fazenda Tomé Pinto de propriedade da Escola de Veterinária e Zootecnia da

UFG, localizada no Município de São Francisco de Goiás, Estado de Goiás, distante a 110 km

da capital.

Foram utilizados 40 bovinos machos não castrados de peso médio aproximado de

360 Kg e idade entre 24 a 36 meses, criados em pastos de Brachiaria sp. O delineamento

experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e oito repetições, em que

cada repetição foi representada por um animal. Os tratamentos foram representados pelos

diferentes antioxidantes e pelo grupo controle.

Após um período de adaptação de 14 dias nas instalações e com a alimentação, os

animais foram divididos em cinco grupos, que receberam os tratamentos seguintes:

• Grupo 1 (G1 = GC) - controle (sem suplementação);

• Grupo 2 (G2 = Se + Vit.E) - suplementação com 1000UI de vitamina E e 10mg de

selênio/animal/dia (2g na forma de acetato de α-tocoferol à 50% e 10g na forma de selênio

metionina);

• Grupo 3 (G3 = Zn) - suplementação de 600mg de zinco/animal/dia (6g na forma de zinco

metionina);

• Grupo 4 (G4 = Se) - suplementação com selênio 10mg de selênio/animal/dia (10g na forma

de selênio metionina);

• Grupo 5 (G5 = Vit.E)- suplementação com 1000UI de vitamina E/animal/dia (2g na forma

de acetato de α-tocoferol a 50%).

Durante o período de experimentação, os animais permaneceram alojados em baias

de confinamento e foram alimentados com volumoso (feno de braquiária) e concentrado

(ração). A dieta obedeceu à proporção entre volumoso e concentrado de 70:30, em que o

concentrado foi balanceado de acordo com a análise bromatológica do feno ofertado (Quadro

1), com base na estimativa de um ganho diário de 0,880kg/dia e para atender as exigências

nutricionais dos animais de acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC (1996).

O concentrado formulado (Integral Nutrição Animal, Goiânia, GO) teve uma concentração de

34% de proteína e 71% de NDT, sendo os principais constituintes, farelo de soja, farelo de

milho e mistura mineral (Quadro 2).

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QUADRO 1 - Valores médios da composição bromatológica do feno de capim Brachiaria sp. utilizado no experimento

Parâmetros % DP Materia seca 94,43 2,34

Nutrientes digestíveis totais 55,13 14,29 Proteína bruta 1,43 0,27

Fibra detergente ácida 37,30 8,51 Fibra detergente neutra 72,36 5,06

QUADRO 2 - Composição da ração total formulada com base na matéria seca utilizada para alimentar os animais dos diferentes grupos experimentais

Ingredientes % em materia seca Feno capim Brachiaria sp 70,0 Milho moído 20,5 Farelo de soha 45% 7,5 Minerais1 2,0 *A formulação foi realizada utilizando o software RLM 3.2 (2009)

1 Minerais sem ureia e sem ionóforos

O feno de B. brizantha foi produzido e armazenado na própria Fazenda Tomé Pinto

e na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG, sendo que durante o período

experimental foram colhidas amostras para a contagem de esporos DIMENNA & BAILEY

(1973) e para extração e análise de saponina (Quadro 3) que foram realizadas no United States

Department of Agriculture – Poisonous Plant Research Laboratory (USDA-PPRL), Logan,

Utah, EUA. O manejo, vacinação, tratamento com ecto e endoparasiticidas foi similar para

todos os grupos.

QUADRO 3 - Valores das concentrações e porcentagens de redução de saponina protodioscina encontrada nas partidas de feno analisadas, nas Fazenda Tomé Pinto (FTP) e Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EVZ)

Procedência das gramíneas

Mês da análise

% de protodioscina % da redução da

protodioscina CAPIM FENO FTP – B. brizantha maio 1,08 0,75 30,55

FTP – B. decumbens maio 1,20 0,65 45,83 EVZ – B. brizantha agosto 0,55 0,38 30,55

Valores médios maio a agosto 0,94 0,59 35,64 *Valores estimados baseado na análise de maio

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Os antioxidantes foram pesados em uma balança de precisão da marca

Shimadzu®, modelo AY 220, diariamente em copos descartáveis, nas quantidades de 10g de

selênio metionina, 6g de zinco, 2g de vitamina E, de forma a propiciar que cada animal

recebesse a quantidade diária de antioxidante, conforme o seu tratamento no cocho. Para

melhorar o consumo da quantidade acima especificada, era colocado sobre o antioxidante um

pouco de ração, sendo ofertados individualmente por animal e monitorados pelo auxiliar até a

ingestão do antioxidante e do concentrado na sua totalidade, impedindo que outro bovino se

aproximasse do cocho. Os animais foram mantidos confinados em grupo por um período de

105 dias, de acordo com o tratamento, em baias sombreadas providas de bebedouros e

comedouros.

Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, às 8:00 e às 15:00 horas. A

alimentação foi fornecida sob a forma de dieta total. As sobras de alimentos foram pesadas e

descartadas diariamente antes do fornecimento matinal, para se determinar o consumo de

alimento pelo grupo e evitar que as sobras não ultrapassassem mais de 10% do total

fornecido, sendo que a água foi fornecida à vontade.

Para a colheita das amostras, os bovinos foram mantidos em estação e contidos

em brete. As amostras sanguíneas foram obtidas nos dias 0, 56 e 105 por meio de punção da

jugular em tubos sem anticoagulantes. Para a avaliação do estresse oxidativo e análise

histopatológica foram obtidos fragmentos hepáticos por meio de biópsias nos dias 0 e 56 de

confinamento e por colheita de tecidos hepáticos durante o abate dos animais, ao final de 105

dias de confinamento. Para a realização da biópsia hepática empregou-se à técnica descrita

por SMART & NORTHCOLE (1985) e McDOWELL (2003) adaptada com a confecção de

agulha com as seguintes dimensões: comprimento do mandril 25 cm, comprimento da cânula

23 cm, diâmetro interno da cânula 0,7 cm e externo 0,9 cm.

A biópsia foi realizada após anestesia local com lidocaína a 2% e antissepsia com

álcool iodado. Foram colhidos dois fragmentos hepáticos, um deles foi fixado em formalina

tamponada a 10% e depois de 48 horas armazenados em álcool a 70%. O outro fragmento foi

embalado por plástico filme, colocado em tubo do tipo falcon e congelado imediatamente em

nitrogênio líquido, sendo posteriormente transferido para freezer a -80ºC.

Durante o abate foram colhidas amostras de tecido hepático com as dimensões 1 x

1x 4 cm de altura, largura e comprimento, respectivamente. Todas as amostras foram

embaladas e seladas com plástico filme de forma a minimizar o contato com o oxigênio e a

formação de radicais livres. As amostras foram armazenadas em tubos plásticos previamente

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identificados e acondicionados em nitrogênio líquido para o transporte, sendo transferidas

posteriormente para o freezer a -80°C até o seu processamento.

As amostras sanguíneas destinadas à análise bioquímica (GGT e AST) foram

processadas antes do congelamento das amostras. Os exames bioquímicos foram realizados

com reagentes comerciais padronizados (Labtest®, Lagoa Santa, MG) e analisados em

espectrofotômetro semiautomático (Bioplus 2000®, Barueri, SP), de acordo com a

metodologia descrita pelo fabricante. As atividades enzimáticas foram determinadas na

temperatura de 37ºC. A atividade sérica da AST foi determinada pelo método ultravioleta

(UV) otimizado, sem piridoxal fosfato. A atividade sérica da GGT pelo método cinético

utilizando-se como substrato glutamil-p-nitroanilida.

A metodologia utilizada para a mensuração de TBARS foi a descrita por

VYNCKE (1970 e 1975) e SORENSEN & JØRGENSEN (1996). Por oxidação lipídica, o

MDA formado reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) produzindo complexo com

pigmentação vermelha (TBARS) que é determinado por espectrofotometria com a

absorbância máxima de 532nm, em que o valor de malondialdeído é indicado como µmol por

quilo (µmol/Kg) de amostra.

As amostras histopatológicas foram processadas no Laboratório do Setor de

Patologia da EVZ/UFG. Os fragmentos de hepáticos foram fixados em formol tamponado,

clivados por 24 horas após a colheita, quando foi realizada a troca do fixador. Os fragmentos

permaneceram por mais 24 horas, para completar a fixação. Em seguida foram transferidos

para pequenas caixas plásticas individuais (unicassetes) e permaneceram estocados em álcool

a 70%. Ao final do período de colheita, as amostras foram processadas pelo método

convencional histopatológico e coradas pela técnica da hematoxilina e eosina (LUNA, 1968).

Os valores de TBARS, GGT e AST foram analisados por estatística descritiva e

foram analisados por análise de variância (ANOVA), empregando-se o teste de Tukey, por

meio do pacote computacional do SAS, com grau de significância de 5%. Para a avaliação de

frequência das alterações histopatológicas e a obtenção da correlação entre malondialdeído e

quantidade de macrófagos espumosos foi empregado o programa EXCEL for Windows 2010.

3 RESULTADOS

Os valores médios de MDA para cada grupo e por colheitas estão descritos na

Tabela 1 e não sofreram influência de interação grupo/tempo, dos diferentes esquemas de

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suplementação e do tempo de duração do experimento (p>0,05). Entretanto verificou-se que a

suplementação de antioxidantes propiciou, ao longo do período de confinamento, redução na

mensuração de MDA para três grupos. Os bovinos que receberam selênio e vitamina E (G2)

tiveram a redução de 37,5%; os que receberam zinco (G3) de 36,7% e os que receberam

selênio (G4) de 2,2%.

TABELA 1 - Médias das concentrações de MDA (µmol/Kg) em tecido hepático de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Média Grupo Tempo Interação 1 (Dia 0) 9,06 8,47 9,93 7,25 6,98 8,34a

0,5755 0,2389 0,2230 2 (56 dias) 9,09A* 6,88A* 7,96A* 7,17A* 7,93A* 7,80a

3 (105 dias) 9,11A* 5,29A* 5,99A* 7,09A* 8,88A* 7,27a

Média 9,09A 6,88A 7,96A 7,17A 7,93A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita

A atividade sérica da GGT (Tabela 2) não sofreu influência de interação

grupo/tempo, assim como não apresentou diferença significativa entre os grupos e as colheitas

(p>0,05). Em todos os grupos ocorreu pequeno acréscimo da atividade sérica da enzima

quando comparou-se o momento basal com o final do estudo.

TABELA 2 - Médias de GGT (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Médi

a Grupo Tempo

Interação

1 (Dia 0) 20,08 19,60 18,65 20,72 20,56 19,95a

0,9321

0,9086 0,8415 2 (56

dias) 19,92A

* 21,04A

* 20,24A

* 20,89A

* 21,52A

* 20,72

a

3 (105 dias)

20,72A

* 21,20A

* 22,47A

* 22,63A

* 21,54A

* 21,71

a

Média 20,24A 20,61A 20,45A 21,41A 21,20A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita

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58

Na determinação da atividade de AST (Tabela 3), os valores médios não

apresentaram diferença estatística entre grupos, colheita e interação grupo/tempo (p>0,05).

Observou-se que, independente do tratamento adotado, os resultados obtidos apresentaram

elevação ao longo do período experimental, mais acentuada que a observada para a GGT.

TABELA 3 - Médias de AST (U/I) de bovinos da raça Nelore alimentados com feno Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Colheitas G1 G2 G3 G4 G5 Médi

a Grupo Tempo

Interação

1 (Dia 0) 61,52 66,78 73,99 59,07 71,37 66,55a

0,2913

0,1847 0,8902 2 (56

dias) 72,02A

* 71,80A

* 72,03A

* 65,41A

* 73,34A

* 70,92

a

3 (105 dias)

78,51A

* 84,40A

* 83,05A

* 74,49A

* 85,56A

* 81,20

a

Média 70,68A 74,33A 76,36A 66,32A 76,75A Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na linha indicam diferença significativa entre grupos experimentais. Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes com asterisco (*) nas linhas indicam diferença significativa entre grupos experimentais em função das colheitas. Médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença significativa entre colheita

A avaliação histopatológica dos fragmentos hepáticos colhidos por meio das

biópsias e durante o abate demonstraram pelo menos um tipo de alteração em todas as lâminas

avaliadas. Os achados de microscopia foram presença de degenerações, seguida de colangite,

associada ou não a presença dos macrófagos espumosos (Tabela 4).

A frequência de aparecimento das alterações foi semelhante, nos três momentos

avaliados, para as variáveis: degeneração, colangite, fibrose e necrose. Para essas variáveis

houve um aumento do número de ocorrência entre a primeira e a segunda biópsia e um

decréscimo entre a segunda biópsia e a colheita do frigorífico. Quanto à presença dos

macrófagos espumosos a frequência de aparecimento demonstrou um perfil diferente, uma

vez que houve diminuição de sua ocorrência ao longo experimento (Figura 1).

Foi estabelecida a presença de correlação positiva forte (Figura 2) entre o número

macrófagos espumosos e a concentração do MDA no fígado dos bovinos.

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TABELA 4 - Frequência total (%) por grupo de alterações hepáticas em bovinos alimentados com feno de Brachiaria sp. e suplementados com antioxidantes (G1- Grupo controle, G2- Grupo selênio e vitamina E, G3- Grupo zinco, G4- Grupo selênio e G5- Grupo vitamina E)

Grupos MOMENTOS

0 dias (biópsia 1) 56 dias (biópsia 2) 105 dias (frigorífico) Degeneração

G1 7 8 7 G2 8 8 7 G3 7 8 8 G4 8 7 8 G5 8 8 6

Frequência n=38 / 95% n=39 / 98% N=36 / 90% Colangite

G1 6 8 7 G2 8 8 7 G3 7 8 7 G4 6 6 8 G5 7 8 8

Frequência n=34 / 85% n=36 / 95% N=37 / 93% Fibrose

G1 1 4 2 G2 1 1 1 G3 2 5 0 G4 1 2 1 G5 2 5 1

Frequência n=6 / 18% n=17 / 43% n=5 / 13% Necrose

G1 1 3 0 G2 0 0 0 G3 0 3 1 G4 1 0 0 G5 0 1 0

Frequência n=2 / 5% n=7 / 15% n=1 / 3% Macrófagos espumosos

G1 5 7 5 G2 6 5 4 G3 8 6 6 G4 7 5 4 G5 5 4 4

Frequência n=31 / 75% n=27 / 68% n=23 / 58%

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60

FIGURA 1 – Aglomerado de macrófagos espumosos com

macrófagos espumos isolados (seta fina) e com formação de célula gigante de Touton (seta grossa) em fígado de bovinos suplementados com antioxidantes, HE, 40x

FIGURA 2 – Correlação positiva forte entre a quantidade de

macrófagos espumosos e concentração de MDA em fígado de bovinos

y=0,0723x+2,9258R²=0,75176

0

2

4

6

8

10

12

0 25 50 75 100

MDA

númerodemacrófagosespumosos

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61

4 DISCUSSÃO

FAGLIARI et al. (1998), ao avaliarem o perfil bioquímico de bovinos da raça

Nelore hígidos encontraram resultados semelhantes os obtidos nesse experimento, o que

demonstra que os animais avaliados não desenvolveram disfunções hepáticas. MOREIRA et

al. (2009a) ao trabalharem com bovinos da mesma raça alimentados com pastagem de

Brachiaria sp. também encontraram valores similares de GGT e AST aos deste ensaio. A

presença de atividade sérica de AST dentro dos valores de referência indicou que não houve

dano significativo às membranas dos hepatócitos (YASUDA et al., 1988). A manutenção dos

valores de GGT dentro da normalidade para a espécie evidenciou que os animais não

apresentaram obstrução do sistema biliar decorrente da intoxicação (SANTOS et al., 2008).

Diversos estudos relatam a elevação de GGT tanto em casos naturais, como

nos experimentais da micotoxicoses (MORRIS et al., 2002) e, ainda, na intoxicação por

saponina (LEMOS et al., 2002). Os resultados mensurados para esse parâmetro

bioquímico revelaram uma tendência na elevação das atividades séricas da GGT durante o

período experimental. Entretanto, os animais não apresentavam sinais clínicos de

enfermidade hepática, podendo-se aventar a possibilidade de intoxicação subclínica por

esporidesmina e/ou saponina.

Neste estudo, a suplementação com zinco não propiciou a diminuição da

atividade sérica enzimática da GGT como observado por FAGLIARI et al. (2003). Esses

autores ao verificarem o efeito da suplementação mineral com zinco na dieta de bovinos,

observaram que a adição do mineral reduziu os valores séricos de GGT. Uma vez que,

esse elemento mineral atua sobre a estabilidade de esporidesmina, evitando a sua oxidação

e consequentemente a lipoperoxidação por meio da formação de radicais livres.

Avaliando-se em conjunto a AST e GGT notou-se o mesmo padrão de

comportamento nos grupos experimentais, ou seja, tendência de aumento gradativo ao

longo das colheitas. A AST elevou-se em 22,01% e a GGT em 8,82% durante o

confinamento experimental, o que demonstra que tais alterações percentuais poderiam

sugerir a presença de alterações hepáticas, que nos casos destes animais poderia estar

associada à ingestão contínua de pequenas quantidades de esporidesmina ou saponinas

provenientes do feno de Brachiaria sp (FAGLIARI et al., 2003; RIET-CORREA et al,

2009). Portanto, mesmo que as saponinas ou a esporidesmina tenham provocado lesão no

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parênquima hepático, sua magnitude não foi suficiente para desencadear aumentos

importantes na atividade sérica da AST e da GGT.

Para MUDRON et al. (1999), bovinos com comprometimento hepático

apresentam um maior propensão de lipoperoxidação, em virtude do acúmulo de MDA com

elevação dos valores mensurados de MDA, GGT e AST quando comparados aos grupo

controle. No entanto, tal observação não pode ser correlacionada no presente estudo, pois os

animais não apresentaram quadro característico de disfunção hepática.

O perfil de estresse oxidativo dos animais apresentou redução ao longo do

experimento (8,34; 7,80 e 7,27µmol/Kg em 0, 56 e 105 dias, respectivamente), e dentre os

tratamentos propostos, a associação de selênio e vitamina E possibilitou a obtenção de

melhores resultados na contenção de peroxidação lipídica. Os resultados obtidos na

associação de selênio e vitamina E foram diferentes aos encontrados por SKRIVANOVÁ et

al. (2007) que identificaram um redução dos índices de MDA quando comparado aos grupos

controle e com suplementação de selênio.

Segundo ABD ELLAH (2011), a mensuração do estado oxidativo hepático

possibilitaria a obtenção de estimativa sobre a integridade do tecido avaliado, permitindo o

diagnóstico de disfunção hepática, além de propiciar a determinação do grau de deterioração

dos hepatócitos. E que a lipoperoxidação e o surgimento de alterações hepáticas seriam

diretamente proporcionais. Esta observação é corroborada pelos resultados do presente

estudo, uma vez que ficou estabelecida a correlação positiva entre o número de macrófagos

espumosos e a concentração de MDA. ABD ELLAH et al. (2013) reforçam a existência de

correlação entre lipoperoxidação e dano hepático, de modo que a presença do radical livre

resulta em aparecimento de degenerações, inflamações e fibrose, detectadas nas biópsias

hepáticas.

Na avaliação histopatológica observou-se que o G5 (suplementado com

vitamina E) demonstrou menor frequência de células espumosas ao longo do

experimento quando comparado aos demais grupos. LUCIANO et al. (2011)

verificaram que a inclusão de antioxidantes (vitamina E) na dieta dos ruminantes

possibilitou uma menor ocorrência de lipoperoxidação sobre as amostras avaliadas. A

vitamina E devido a sua característica lipossolúvel, atuaria minimizando os danos

provocados pelos radicais livres nas membranas biológicas e protegendo-as contra o

ataque de radicais livres. Além disso, a diminuição de vitamina E hepática favoreceria

a ocorrência de peroxidação lipídica (MUDRON et al., 1997). E que a suplementação

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63

de vitamina E apresenta efeito supressor sobre a formação de MDA quando a

peroxidação lipídica for provocada artificialmente (SOKOL et al.,1993).

5 CONCLUSÃO

A suplementação com antioxidantes, por meio de aditivos na alimentação de

bovinos, da raça Nelore confinados alimentados com feno de Brachiaria sp, reduz o número

de macrófagos espumosos presentes no parênquima hepático e a suplementação com a

associação do selênio e vitamina E e com o zinco minimiza a ocorrência do dano oxidativo

hepático.

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68

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nas últimas décadas, tem-se observado um grande aperfeiçoamento na produção

animal, com melhoras nas práticas de manejo a fim de se desenvolver espécies animais

consideradas biologicamente eficientes, capazes de traduzir a ingestão balanceada de massa

orgânica e mineral em produção proteica. Na produção animal, existe uma constante

preocupação em minimizar as perdas produtivas e gerar aumento de lucros. Em particular,

bovinos confinados encontram-se submetidos a condições produtivas com alta pressão, que

tem desencadeado a ocorrência de estresse devido ao sistema produtivo, e consequentemente

a excessiva produção de radicais livres.

O campo do estresse oxidativo na medicina de produção ainda encontra-se nas

fases iniciais de desenvolvimento. Pesquisas têm comprovado a participação de radicais livres

no desenvolvimento de enfermidades, como por exemplo, doença do músculo branco,

deficiências reprodutivas, hepatopatias, mastites dentre outras. No entanto, há muito a ser

descoberto sobre o seu papel na sanidade e na produção de ruminantes. A clareza da

compreensão da fisiopatologia sobre a ação dos radicais livres nos animais permitirá a

concepção de terapias antioxidativas específicas. Assim como delinear padronização de

técnicas, metodologias e valores de referência para os biomarcadores de ocorrência de

estresse oxidativo.

Na medicina veterinária, isso configura um desafio na área da investigação

laboratorial, em que esses biomarcadores sanguíneos, sorológicos e teciduais possam refletir

de forma confiável no estado clínico do animal. Vários questionamentos ainda precisam ser

respondidos na investigação do estresse oxidativo veterinária.

A adoção de aditivos na suplementação de bovinos confinados tem como

finalidade potencializar o desempenho animal, por meio de melhorias nos índices de produção

e na sanidade geral. O sucesso da utilização de antioxidantes na dieta de bovinos está

associado principalmente ao tipo de alimentação fornecida aos animais, rica ou não em

forragens verde, e na minimização dos efeitos deletérios ocasionado por estresse oxidativo.

Dentre os diferentes antioxidantes ofertados aos animais no presente estudo, verificou-se que

a associação de antioxidantes propicia a obtenção de melhores resultados quando comparado

à administração isolada do aditivo.

Este estudo buscou-se analisar o efeito do estresse oxidativo em bovinos

confinados alimentados com feno de Brachiaria sp sobre as alterações hematológicas,

Page 83: ESTRESSE OXIDATIVO EM BOVINOS CONFINADOS …estresse oxidativo em eritrócitos (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, superóxido dismutase, glutationa total, glutationa

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bioquímicas e histopatológicas. Além disso, avaliar se o fornecimento de suplementação

poderia minimizar essas alterações. Observou-se que a utilização de suplementos minimizou

a ocorrência de estresse oxidativo nos animais confinados e que a associação conjunta de

selênio e vitamina E propiciou a obtenção de melhores resultados, seguida pela

suplementação com zinco. Verificou-se também que os animais apresentaram uma redução na

quantidade de macrófagos espumosos, e que essa redução foi diretamente proporcional ao

biomarcador de estresse oxidativo utilizado (MDA).

Ainda há muito a ser estudado e descoberto nessa área, e neste aspecto pode-se

aprofundar ainda mais os estudos sobre o assunto a partir dos resultados obtidos com o

presente trabalho:

a) Avaliar a influência do tempo sobre as alterações avaliadas, de modo que os animais

permaneceriam por um período maior de intoxicação por esporidesmina ou por saponinas

esteróides.

b) Administrar doses mais altas de suplementação por um período mais extenso, antes da

ingestão de feno de Brachiaria sp.

c) Estabelecer o perfil de estresse oxidativo, bem como os biomarcadores a serem

empregados nessa avaliação em diferentes espécies de ruminantes.

d) Realizar avaliações com diferentes metodologias com o intuito de se comparar os

resultados obtidos além de proporcionar a obtenção e a padronização dos valores de

referência adotados para a espécie, em que a mensuração dos parâmetros de estresse

oxidativo reflete na condição clínica.

e) Desenvolver um índice de estresse (cálculo entre relação de oxidantes e antioxidantes) para

correlacionar o grau de estresse oxidativo com a enfermidade do animal.