Estrutura dos Ácidos Nucléicos Aspectos Moleculares & Enfoques Conceituais

Estrutura dos Ácidos Nucléicos

Aspectos Moleculares &

Enfoques Conceituais

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR

1866: Gregor Mendel


1869 → Johann Friedrich Miescher

# Buscava determinar os componentes químicos do núcleo celular.

# Usava os glóbulos brancos contidos no pus para suas pesquisas (células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma).

# Descobriu a presença de um composto de natureza ácida desconhecido até o momento (rico em fósforo e em nitrogênio, desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina - enzima proteolítica)) → nucleína

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Friedrich_Miescher.jpg


1880 → Albrecht Kossel

# Demonstrou que a nucleína continha bases nitrogenadas em sua estrutura.

1889 → Richard Altmann

# Obteve nucleína com alto grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e dando-lhe o nome de ácido nucléico.


1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns

Redescoberta de Mendel

Leis da HereditariedadeLeis de Mendel


1928: Frederick Griffith:Transformação



1944: Avery, MacLeod e MacCarty: Princípio transformante


1953: Alfred Hershey e Martha Chase

DNA 32P

Proteína 35S


1953: James Watson e Francis Crick

Maurice Wilkins e Rosalind Franklin

DNA → INTRODUÇÃO

• Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicação é fundamental.

• Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas.

• Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de DNA.

• DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que controlam a expressão gênica

ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA



Autossomos x Sexuais99%

1%

GENOMA HUMANO

Nucleotídeo

DNACromossomo

Genoma

GENOMA HUMANO

rRNA

Ribossomos

snRNARNP

tRNA AA

mRNA

Proteína

DEFINIÇÃO DE GENE

Pentose (Açúcar)

Ribose-D-Ribofuranose

OH

-

R

2’-Desoxirribose-D-2-desoxirribofuranose

H

ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA

PURINASBicíclicas

PIRIMIDINASMonocíclicas

Adenina = Timina Guanina Citosina Uracil

Purina Adenina Guanina

Pirimidina Citosina Uracil Timina

Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos


PIRIMIDINAS

Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas

Uracil Timina

5-Metiluracil


Posições dos Átomos

Grupamento Fosfato

Bases NitrogenadasPentose



Nucleotídeo

Nucleosídeo

Nucleosídeo

(2’-) Desoxirribonucleotídeo

Ribonucleotídeo

Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato

-

Monofosfato

-

Difosfato

-

Trifosfato

5’-Difosfato de Adenosina - ADP

5’-Difosfato de Desoxiadenosina - dADP

5’-Trifosfato de Adenosina - ATP

5’-Trifosfato de Desoxiadenosina - dATP

5’-Monofosfato de Adenosina - AMP

5’-Monofosfato de Desoxiadenosina - dAMP


Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato


Bases Nitrogenadas


5’AACGTTGCTATCGT3’

5’ 3’

Base

Base

Base

Sentido da Fita de DNA



Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH2)

Chargaff

Relação Molar (1949)

AT

= 1,0CG

= 1,0 AT = CG (?)

(A+G) = (T+C)

Bases Nitrogenadas


Ligações Fosfodiéster

Ligação (-) Glicosídica (Glicosílica)

Ligações Importantes


Ligações Covalentes

Sítios Hidrofóbicos

Sítios Hidrofílicos

Forças de Van der Walls

Pontes de Hidrogênio

Interações Iônicas (Mg+2)

Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade

DUPLA-HÉLICE DO DNA

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO

• Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação.

• DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA.

• RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA.

• Esses processos podem ser observados in vitro


A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através dos seguintes mecanismos:

→ aumento de temperatura

→ titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis aromáticos)

→ agentes desnaturantes (formamida)

# Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice (levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares).

Efeito Hipercrômico


A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de absorbância de luz ultravioleta (UV).


A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases.

Adenina = Timina Guanina Citosina Uracil

Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)

• Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é muito estável.

• Para que estes processos ocorram há a necessidade da participação de enzimas especializadas (DNA-helicases e SSBs)

Rompimento das Pontes de Hidrogênio

Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)

T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC



• Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas, o processo pode ser revertido.

• Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente resfriada, as fitas complementares reassociam-se.

T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC

• No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta.

• Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação

# Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua renaturação.



As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno:

→ cavidade maior

→ cavidade menor

# Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente.

# Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas) podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da dupla-hélice.

Antiparalelas


0.34 nm

Cavidade Menor

Cavidade Maior

Volta

Cavidades Maior e Menor






TIPOS DE DNA

O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua composição de bases e do meio em que se encontra

→ DNA A

→ DNA B

→ DNA Z

Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de dupla-hélice clássica)

Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal no meio em que se encontra o Tipo A.

TIPOS DE DNA

Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA Tipo B ou Tipo A.

# Fatores que estabilizam sua formação:

→ metilação ou bromação de bases

→ estresse torcional

→ ligação de proteínas específicas ao DNA

• Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do DNA com proteínas.

TIPOS DE DNA

DNA B DNA A DNA Z

TIPOS DE DNA

TIPOS DE DNA

DNA B DNA A DNA Z

Conformação anti e syn

C2’-endo

C3’-endo

DNA B DNA A

DNA Z

Etanol 75%

[Sal]

Dupla RNA

Metilação ou Bromação

Umidade Relativa (92%)


Principais características dos DNAs A, B e Z

CARACTERÍSTICAS FORMA A FORMA B FORMA Z

Sentido helicoidal (Giro)

Direita Direita Esquerda

Diâmetro (nm) ~2,6 ~2,0 ~1,8

Pb por giro (n) 11 10 12

Espaço entre as bases (nm)

0,26 0,34 0,37

Inclinação da base 20o 6o 7o

Sulco maior Estreito/Profundo Largo/Profundo Achatado

Sulco menor Largo/Raso Estreito/Profundo Estreito/Profundo

Ligação glicosídica anti anti anti(pir) sin(pur)


RNA x DNA

H

H

H

H

RNA x DNA

RNA mensageiro (mRNA)

Fim da mensagem

Sinal de ligação ao Ribossomo

Códon de Iniciação (Start Códon)

Início da Transcrição

Hairpin

AAAAA

CAUAGGAGGU

AUG

RNA transportador (tRNA)

RNA ribossomal (rRNA)

OUTROS RNAs

hnRNA

snRNA snoRNA

http://biochem.ncsu.edu/faculty/maxwell/sRNP%20structure.jpg

RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi)

Andrew Fire e Craig Mello Premio Nobel de Medicina 2006

O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear).

# Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente, formam-se as chamadas estruturas circulares.

FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO

Linear x Circular

Plamídeos e Vírus


• Além da estrutura secundária da dupla-hélice, o DNA assume uma conformação tridimensional supertorcida.

# A dupla-hélice enrola-se sob si mesma (extremamente importante nos processos de replicação, transcrição, recombinação e expressão gênica).


Supertorções


Estrutura Supertorcida, Suprerenrolada ou Super-hélice

AB

C

Grau de superenrolamento crescente

A: Relaxada B: Superenrolamentos parciais C: Totalmente Superenrolado

Top

ois

ôm

ero

s


• Plectonêmico → DNA em solução.

• Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os nucleossomos.

# O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas criciformes, triplex ou DNA Tipo Z.


Tipos de Superenrolamentos

Tipos de Superenrolamentos

Plectonêmico

Toroidal

Solução

Histonas



Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que diferem apenas na sua topologia.

Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos.

• A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras.

• Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas.

TOPOISOMERASES

Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA

Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice

Participam de importantes etapas nos processos de replicação, transcrição e recombinação

# o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas de DNA pode ser medido de diferentes maneiras.

TOPOISOMERASES

Topoisomerase do tipo I

Topo I: Monômero de 100 kDa (+ e –) Mutação no Gene topA Inviável Topo III: Monômero de 74 kDa (+) Mutação no Gene topB Viável

Relaxamento de Superenrolamento

ATP

Ligação e Desnaturação

Ligação Fosfotirosina

Restauraçãodo DNA

E. coli

TOPOISOMERASES

Topoisomerase do tipo II

Topo II Tetrâmero 400 kDa DNA-Girase Sub A e B Adiciona Supertorções – Gene gyrA e gene gyrB Topo IV Catenadas Antibióticos e Antitumorais

E. coli

105 a 140 pbCentral: 20 pb (AT)Lateral: Rica em GC

5’-Tyr(122)A

TOPOISOMERASES

Métodos de aferição do grau de superenrolamento

• Eletroforese em gel de agarose

→ separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação (funções diretas do superenrolamento)

→ o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu tamanho e forma)

# Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou supertorcida.


Métodos de aferição do grau de superenrolamento

Gel Agarose

Velocidade de Sedimentação

Microscopia Eletrônica


Tratamento com Topoisomerase

5 Min 30 Min


CONSIDERAÇÕES FINAIS

Ácidos Nucléicos maiores representantes do genótipo (DNA)

Proteínas maiores representantes do fenótipo

DNA Envolvido com todo metabolismo do organismo

Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas Informações

DNA Moléculas principais

RNA Moléculas intermediárias

Proteína Resultado final da informação

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