Estudio de biomarcadores en gliomas y su utilidad clínica · A mi hermano . ÍNDICE ... A Pilar, Miguel y Mari Carmen Barea. A Javier Gómez, gracias por tu interés y por enseñarme

Estudio de biomarcadores en gliomas y su

utilidad clínica

Araceli García Martínez

http://www.ua.es/

http://www.eltallerdigital.com/

TESIS DOCTORAL

ESTUDIO DE BIOMARCADORES EN GLIOMAS

Y SU UTILIDAD CLÍNICA

ARACELI GARCÍA MARTÍNEZ

OCTUBRE 2016

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, GENÉTICA Y MICROBIOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESTUDIO DE BIOMARCADORES EN GLIOMAS Y SU UTILIDAD CLÍNICA


Tesis presentada para aspirar al grado de DOCTORA POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL Y APLICADA

Dirigida por:

Dr. Víctor Manuel Barberá Juan

Dr. José Luis Soto Martínez

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, GENÉTICA Y MICROBIOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESTUDIO DE BIOMARCADORES EN GLIOMAS Y SU UTILIDAD CLÍNICA


Tesis presentada para aspirar al grado de DOCTORA POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL Y APLICADA

Dirigida por:

Dr. Víctor Manuel Barberá Juan

Dr. José Luis Soto Martínez

Dr. Víctor Manuel Barberá Juan, facultativo de la Unidad de Genética Molecular

del Hospital General Universitario de Elche y profesor asociado del

Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de

Alicante,

CERTIFICA:

Que el trabajo titulado “Estudio de biomarcadores en gliomas y su utlidad

clínica” ha sido realizado por Dña. Araceli García Martínez bajo mi dirección en

la Unidad de Genética Molecular del Hospital General Universitario de Elche,

para optar al grado de Doctora por la Universidad de Alicante.

Alicante a 1 de septiembre de 2016

Fdo. Dr. Víctor Manuel Barberá Juan

Dr. Víctor Manuel Barberá Juan, facultativo de la Unidad de Genética Molecular

del Hospital General Universitario de Elche y profesor asociado del

Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de

Alicante,

CERTIFICA:






Fdo. Dr. Víctor Manuel Barberá Juan

Dr. José Luis Soto Martínez, jefe de la Unidad de Genética Molecular del

Hospital General Universitario de Elche y profesor asociado del Departamento

de Biotecnología de la Universidad de Alicante,

CERTIFICA:






Fdo. Dr. José Luis Soto Martínez

Dr. José Luis Soto Martínez, jefe de la Unidad de Genética Molecular del

Hospital General Universitario de Elche y profesor asociado del Departamento

de Biotecnología de la Universidad de Alicante,

CERTIFICA:






Fdo. Dr. José Luis Soto Martínez

Tesis financiada por el proyecto:

“Estudio piloto de validación de marcadores moleculares con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta en tumores gliales”. FIBElx 10/08 Convocatoria de proyectos de investigación Fundación

Investigación Biomédica Hospital General Universitario de Elche

Entidad de realización: Unidad de Genética Molecular del Hospital General

Universitario de Elche

Ciudad entidad realización: Elche, Comunidad Valenciana, España

IP: Víctor Manuel Barberá Juan

Tesis financiada por el proyecto:

“Estudio piloto de validación de marcadores moleculares con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta en tumores gliales”. FIBElx 10/08 Convocatoria de proyectos de investigación Fundación

Investigación Biomédica Hospital General Universitario de Elche

Entidad de realización: Unidad de Genética Molecular del Hospital General

Universitario de Elche

Ciudad entidad realización: Elche, Comunidad Valenciana, España

IP: Víctor Manuel Barberá Juan

Es preciso sacudir enérgicamente

el bosque de las neuronas cerebrales adormecidas;

es menester hacerlas vibrar con la emoción de lo nuevo

e infundirles nobles y elevadas inquietudes.

(Santiago Ramón y Cajal, 1852-1934)

Es preciso sacudir enérgicamente

el bosque de las neuronas cerebrales adormecidas;

es menester hacerlas vibrar con la emoción de lo nuevo

e infundirles nobles y elevadas inquietudes.

(Santiago Ramón y Cajal, 1852-1934)

A mis padres

A mi hermano

ÍNDICE

Introducción �� 371. Introducción �� 39 1.1. Cáncer �� 39 1.2. Sistema nervioso central �� 44

1.2.1. Glía �� 44 1.3. Tumores gliales �� 46

1.3.1. Clasificación �� 46 1.3.2. Etiología �� 49 1.3.3. Epidemiología �� 50 1.3.4. Factores de riesgo�� 51

1.3.4.1. Ambientales �� 511.3.4.2. Genéticos �� 51

1.3.5. Diagnóstico y estadificación �� 52 1.3.6. Supervivencia y tratamiento �� 53

1.4. Alteraciones genéticas asociadas a gliomas �� 55 1.5. Epigenética �� 63

1.5.1. Metilación del ADN �� 63 1.5.2. Modi icación de histonas �� 65 1.5.3. ARN no codi icante �� 65

1.6. Marcadores moleculares (biomarcadores) en gliomas �� 66 1.6.1. TP53 y ki67 �� 66 1.6.2. Codeleción de los brazos cromosómicos 1p/19q �� 67 1.6.3. Mutaciones en los genes IDH1/IDH2 �� 68 1.6.4. Metilación del gen MGMT �� 73

1.6.5. Fenotipo hipermetilador en islas CpG en gliomas �� 78 1.6.5.1. SOCS1 �� 81

1.8. Citomegalovirus humano y gliomas �� 83 Hipótesis y objetivos �� 87 Material y métodos �� 91

3. Material y métodos �� 93 3.1. Pacientes y muestras biológicas �� 93 3.2. Procesamiento de las muestras �� 94

Índice

3.2.1. Extracción de ADN �� 94 3.2.2. Extracción de ARN �� 95

3.3. Análisis de deleciones en los brazos cromosómicos 1p/19q �� 96 3.4. Análisis del estado de hipermetilación del gen MGMT �� 99 3.5. Análisis del fenotipo hipermetilador en gliomas �� 104 3.6. Análisis de IDH1 e IDH2 por secuenciación directa �� 106 3.7. Retrotranscripción-PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) �� 108

3.7.1. Detección de CMV �� 110 3.7.1.1. qPCR �� 110 3.7.1.2. Nested PCR �� 112

3.7.2. Determinación del nivel de expresión genética de SOCS1y MGMT por RT-qPCR �� 113

3.7.2.1. Retrotranscripción �� 113 3.7.2.2. PCR cuantitativa a tiempo real �� 114

3.8. Estudio inmunohistoquímico de IDH1, ki67, p53 y HCMV �� 116 3.9. Microarray de expresión �� 117

3.9.1. Amplificación del ARN, marcaje e hibridación a microarrays agilent �� 1173.9.2. Análisis bioinformático de expresión genética �� 118

3.10. Análisis estadístico �� 119 Resultados �� 121

4. Resultados �� 1234.1. Caracterización de los principales marcadores molecularesen gliomas �� 123

4.1.1. Análisis de la metilación del promotor del gen MGMT y suasociación con las variables clínicas �� 1234.1.2. Análisis de las codeleciones 1p/19q �� 1264.1.3. Análisis de 8 marcadores epigenéticos en gliomas (G-CIMP):CACNA16, CDKN2A, CRABP1, IGF2, MLH1, NEUROG1, RUNX3y SOCS1 �� 1274.1.4. Análisis de SOCS1 �� 1294.1.5. Análisis de la expresión génica de SOCS1 y MGMT �� 132

4.1.5.1. PCR cuantitativa a tiempo real �� 1324.1.5.2. Análisis de la asociación entre metilación y expresiónde SOCS1 y MGMT �� 134

4.1.6. Análisis de las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 y suasociación con las variables clínicas �� 135

Índice

4.1.7. Análisis por IHQ de ki67 y p53 �� 140 4.2. Variables clínicas �� 142 4.3. Asociación entre marcadores moleculares �� 145

4.3.1. Mutaciones en IDH y metilación de MGMT �� 145 4.3.2. Mutaciones en IDH y G-CIMP �� 1464.3.3. Mutaciones en IDH, metilación de MGMT y metilación de SOCS1 �� 1464.3.4. Metilación de SOCS1 y G-CIMP �� 147

4.4. Análisis multivariante por regresión de COX �� 148 4.5. Detección de citomegalovirus humano en tumores gliales �� 150

4.5.1. Análisis por PCR cuantitativa a tiempo real �� 150 4.5.2. Análisis por NESTED-PCR en casos seleccionados �� 150 4.5.3. Inmunohistoquímica �� 151

4.6. Glioblastomas de larga supervivencia �� 1514.7. Clasificación clinicopatológica y molecular de gliomas. Perfiles moleculares �� 1534.8. Estudio de expresión génica a gran escala en gliomas.Microarray de expresión �� 162

4.8.1. Funciones diferencialmente expresadas �� 168 Discusión �� 177

5.1. Biomarcadores en gliomas �� 179 5.2. HCMV y gliomas �� 192 5.3. Microarray de expresión �� 197

Limitaciones del estudio �� 211 Conclusiones �� 215 Bibliografía �� 219 Anexos �� 255

Índice

Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS

Y después de tantos obstáculos, por fin me encuentro escribiendo esta

parte de mi tesis, quizás la más importante, ya que no hubiera sido posible

acabar este trabajo sin vosotros/as.

En primer lugar, agradecer a mis co-directores el haberme dado la

oportunidad de poder empezar mi carrera en el mundo de la ciencia. A Víctor,

por confiar tanto en mí, por valorarme y dedicarme tantas palabras de ánimo y

de cariño. Los dos sabemos que el camino ha sido complicado, pero al final

todo da sus frutos y me alegro muchísimo de haber llegado hasta aquí con tu

ayuda. Gracias por enseñarme tantas cosas y no dejar que tirara la toalla. A

José Luis, por transmitirme esa pasión por la ciencia, por todas tus

aportaciones y consejos, porque de cualquier conversación contigo se aprende

algo. A Cristina, a pesar de que por temas burocráticos no me sea posible

ponerte como directora de esta tesis, para mí lo eres. Gracias por tu

dedicación, por estar siempre disponible para ayudarme, porque realmente

esta línea de investigación ha sido posible gracias a ti.

A los pacientes, porque son las parte más importante para que este tipo

de investigaciones se puedan llevar a cabo.

A todas las personas que conocí en el laboratorio del Hospital de Elche.

Adela, gracias por todos tus consejos y por hacer que me sintiera como en

casa cada vez que llegaba al laboratorio. Isa, por mucho trabajo que tuvieras,

siempre has estado dispuesta a ayudarme y a responderme a cualquier duda

que me surgiera. No he conocido persona con tanta capacidad para trabajar en

un laboratorio, eres una máquina. A Pilar, Miguel y Mari Carmen Barea. A

Javier Gómez, gracias por tu interés y por enseñarme el porgrama que me ha

permitido hacer todos los análisis de este trabajo. Y en especial a Esperanza,

gracias por haberme enseñado tantas cosas, entre ellas a sacar datos de

MLPA a la velocidad de la luz. Si no hubiera sido por aquella carpeta de

“Traspaso de poderes” que creaste, ahora mismo no tendría esta tesis entre las

manos. Vas a ser una gran investigadora y quién sabe si algún día volvemos a

trabajar juntas, a mí me encantaría.

Agradecimientos

A las chicas de la fundación, Silvia, Estefa, Lorena y María José, por

esos almuerzos tan divertidos y por estar siempre disponibles para

solucionarme todas las dudas que me iban surgiendo.

A Pepe, por todo tu apoyo y por hacerme ver que esta tesis es un buen

trabajo. Por poner esa pasión tan contagiosa en tus clases, hablar contigo

siempre significa aprender algo más. A Edu…qué decir! Te escribiría una tesis

entera dándote las gracias por todo. Si no hubiera sido por ti, esto habría sido

imposible. Eres una máquina y te mereces llegar muy lejos, sé que vas a

conseguir lo que te propongas.

A mis pinholes!! Reyes, Zeneida, Sasito y Shaila. Cómo echo de menos

aquel máster, creo que no me reído más en mi vida. Espero que algún día

consigamos reunirnos de nuevo y recordar viejos tiempos.

A Gloria, por dejarme formar parte de tu equipo, por confiar en mí y por

supuesto…por haberme enseñado a usar el Endnote!! Que si no fuera por

eso…creo que aún estaría terminando de escribir la bibliografía!

A mis compañeras y amigas de laboratorio. Ana, por todas las cosas que

me has enseñado, por estar siempre dispuesta a ayudarme y, como no, por

todas las sesiones de críticas de cine durante el almuerzo; Mar, llevas poquito

tiempo, pero ya eres de la familia. Vas a ser una gran investigadora. Marta,

realmente nos conocemos de hace poquito, pero para mí ya eres una gran

amiga. Gracias por toda tu ayuda (tan tediosa como la de buscar genes), por el

entusiasmo que transmites y por darme siempre tanto apoyo. Aún tienes que

seguir organizándome viajes, así que espero que sigamos compartiendo mesa

por mucho tiempo. Cecilia, eres un ejemplo. Gracias por enseñarme tanto y por

todos tus consejos. Algún día tenemos que ver juntas le película de “Chicos

Malosos” de Tarantino. Aún está pendiente que vengas a mi casa a aprender a

hacer arroz y conejo! Laura, ya me lo dijiste una vez tú…pero ahora te lo

confirmo yo: tendríamos que habernos conocido antes! Gracias por

transmitirme aunque sea una mínima parte de todo el conocimiento que tienes,

nos dejas con la boca abierta cada vez que te pones a explicarnos tantas cosas

y cada vez que nos demuestras lo fuerte que puede llegar a ser una persona.

Miri, si es que es imposible no quererte. El laboratorio no funcionaría si no

Agradecimientos

A las chicas de la fundación, Silvia, Estefa, Lorena y María José, por

esos almuerzos tan divertidos y por estar siempre disponibles para

solucionarme todas las dudas que me iban surgiendo.

A Pepe, por todo tu apoyo y por hacerme ver que esta tesis es un buen

trabajo. Por poner esa pasión tan contagiosa en tus clases, hablar contigo

siempre significa aprender algo más. A Edu…qué decir! Te escribiría una tesis

entera dándote las gracias por todo. Si no hubiera sido por ti, esto habría sido

imposible. Eres una máquina y te mereces llegar muy lejos, sé que vas a

conseguir lo que te propongas.

A mis pinholes!! Reyes, Zeneida, Sasito y Shaila. Cómo echo de menos

aquel máster, creo que no me reído más en mi vida. Espero que algún día

consigamos reunirnos de nuevo y recordar viejos tiempos.

A Gloria, por dejarme formar parte de tu equipo, por confiar en mí y por

supuesto…por haberme enseñado a usar el Endnote!! Que si no fuera por

eso…creo que aún estaría terminando de escribir la bibliografía!

A mis compañeras y amigas de laboratorio. Ana, por todas las cosas que

me has enseñado, por estar siempre dispuesta a ayudarme y, como no, por

todas las sesiones de críticas de cine durante el almuerzo; Mar, llevas poquito

tiempo, pero ya eres de la familia. Vas a ser una gran investigadora. Marta,

realmente nos conocemos de hace poquito, pero para mí ya eres una gran

amiga. Gracias por toda tu ayuda (tan tediosa como la de buscar genes), por el

entusiasmo que transmites y por darme siempre tanto apoyo. Aún tienes que

seguir organizándome viajes, así que espero que sigamos compartiendo mesa

por mucho tiempo. Cecilia, eres un ejemplo. Gracias por enseñarme tanto y por

todos tus consejos. Algún día tenemos que ver juntas le película de “Chicos

Malosos” de Tarantino. Aún está pendiente que vengas a mi casa a aprender a

hacer arroz y conejo! Laura, ya me lo dijiste una vez tú…pero ahora te lo

confirmo yo: tendríamos que habernos conocido antes! Gracias por

transmitirme aunque sea una mínima parte de todo el conocimiento que tienes,

nos dejas con la boca abierta cada vez que te pones a explicarnos tantas cosas

y cada vez que nos demuestras lo fuerte que puede llegar a ser una persona.

Miri, si es que es imposible no quererte. El laboratorio no funcionaría si no

Agradecimientos

estuvieras, créetelo, tienes todas las cualidades necesarias para llegar a donde

quieras. Sabes que siempre voy a estar para darte un abrazo cuando te den

ataques de agobio. Eva, sé que no te gusta, pero sigo pensando que tienes un

don para la enseñanza. Gracias por todo. Tu manera de ver la vida es

admirable, con las ideas siempre claras y luchando por lo que quieres. Gracias

por compartirlo conmigo. En general a todas tengo que agradeceros el haber

estado ahí en todo momento, gracias por todos vuestros consejos y por

vuestros ánimos, sois las mejores.

A mis On Babies, Loli, Belén, Asun, Fina, Encar, Rosa, Judith, Alba. Sois

capaces de hacerme reir aunque sea al final del día, cuando ya no me quedan

ni fuerzas. Gracias por todos esos momentos y por los que quedan.

A Noemí, porque siempre me has hecho sentir que soy capaz de todo.

Gracias por no dejar nunca que me venga abajo. Espero que sigas

aprendiendo a darte cuenta de lo que vales.

A Vadim, gracias por creer siempre en mí.

A mis dos biólogas preferidas, Ali y Noe. Habéis sido lo mejor de

estudiar la carrera. No olvido ningún momento vivido con vosotras, aunque

ahora os vea menos, sé que siempre estáis ahí. Noe, gracias por haberme

ayudado a superar mi “fobia” con la sangre y los hospitales, siempre serás mi

Súper Noelia. Ali, desde aquel día en el 24, sabía que íbamos a convertirnos en

grandes amigas (aún tenemos pendiente una noche de pelis y magdalenas de

chocolate).

Irene, aunque también eres una de mis biólogas preferidas, tenía que

ponerte aparte. 26 años juntas y lo que nos queda. Son tantas cosas las que

hemos vivido…que me faltan páginas. Gracias por haberme acompañado en

todo este camino.

Carlos, gracias por haber aparecido en mi vida, por enseñarme tantos

valores y por hacerme sentir capaz de comerme el mundo. Gracias por tu

paciencia y por demostrarme que no hay nada imposible.

Agradecimientos

A mi familia, en especial a mi tío Ginés. Gracias por haber despertado en

mí desde pequeña esa motivación por la ciencia, siempre te he admirado y

gran parte de las fuerzas que he sacado para llegar hasta aquí han sido por

intentar parecerme un poquito a ti. Y por supuesto, a mi padre, mi madre y mi

hermano. Gracias por hacerme ser quien soy, por apoyarme y aconsejarme en

todos los momentos, por creer siempre que podía superar cualquier obstáculo

que apareciera en mi vida, no hubiera podido llegar hasta aquí sin vosotros.

GRACIAS POR TODO.

Agradecimientos

A mi familia, en especial a mi tío Ginés. Gracias por haber despertado en

mí desde pequeña esa motivación por la ciencia, siempre te he admirado y

gran parte de las fuerzas que he sacado para llegar hasta aquí han sido por

intentar parecerme un poquito a ti. Y por supuesto, a mi padre, mi madre y mi

hermano. Gracias por hacerme ser quien soy, por apoyarme y aconsejarme en

todos los momentos, por creer siempre que podía superar cualquier obstáculo

que apareciera en mi vida, no hubiera podido llegar hasta aquí sin vosotros.

GRACIAS POR TODO.

Abreviaturas

ABREVIATURAS

αKG α-Cetoglutarato 2HG 2-Hidroxiglutarato 5-hmC 5-Hidroximetilcitosina 5-mL 5-Metilcitosina ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc ADN complementario AI Astrocitoma pilocítico de grado I AII Astrocitoma difuso de grado II AIII Astrocitoma anaplásico de grado III ARN Ácido ribonucleico ARNm ARN mensajero BMPs Bone morfogenic proteins (Proteínas morfogénicas óseas) CIMP CpG Island Methylator Phenotype (Fenotipo metilador en islas

CpG) CIMP+ CIMP positivo CMV Citomegalovirus CpG Citosina-fosfato-guanina DEG Differential expression genes (Genes diferencialmente

expresados) DFG F-2-deoxifluoroglucosa DMR1 Differentially Methylated Region 1 DMR2 Differentially Methylated Region 2 DNMTs DNA methyltransferases (ADN metiltransferasas) dNTP Deoxinucleósidos trifosfato EpiTYPER Agena Bioscience’s DNA Methylation Technology FC Fold Change FDA Food and Drug Administration (Administración de alimentos y

medicamentos F-DFG F-2-deoxifluoroglucosa-6-fosfato FISH Fluorescence in situ hybridization (Hibridación fluorescente in situ) FPPE Formalin-fixed, paraffin-embedded (Fijado en formalina, incluído

en parafina) g Aceleración de la gravedad GBM Glioblastoma multiforme G-CIMP CIMP en gliomas GO Gene Ontology HCMV Citomegalovirus humano HGUA Hospital General Universitario de Alicante HGUE Hospital General Universitario de Elche IC Intervalo de confianza IHQ Inmunohistoquímica

Abreviaturas

ISH In situ hybridization (Hibridación in situ) Kb Kilobase KDa KiloDalton Limma Linear Models for Microaray LOH Loss of heterozygosity (Pérdidad de heterocigosidad) MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight Máx Máximo mg Miligramos miARN MicroARN Mín Mínimo mL Mililitros MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification MS-MLPA Methylation specific-MLPA MS-PCR Methylation specific-PCR NAD(+) Nicotinamida adenina dinucleótido NADP(+) Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato ng Nanogramos nm Nanometros NTC Non template control OA Oligoastrocitoma OCT Optimal cutting temperature OD Oligodendroglioma OMS Organización Mundial de la Salud OR Odds Ratio PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la

polimerasa) PCV Procarbazine-Lomustine-Vincristine PET Positron Emission Tomography (Tomografía por emisión de

positrones) PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PIP2 Phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate qPCR Quantitative PCR QT Quimioterapia Qx Cirugía RMN Resonancia magnética nuclear Rpm Revoluciones por minuto RT Radioterapia RT-qPCR Retotranscriptase-qPCR SGZ Subgranular zone (Capa subgranular del giro dentado del

hipocampo) SH2 Src homology 2 (Dominio homólogo conservado Src) SHH Sonic Hedgehog SN Sistema nervioso

Abreviaturas

ISH In situ hybridization (Hibridación in situ) Kb Kilobase KDa KiloDalton Limma Linear Models for Microaray LOH Loss of heterozygosity (Pérdidad de heterocigosidad) MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight Máx Máximo mg Miligramos miARN MicroARN Mín Mínimo mL Mililitros MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification MS-MLPA Methylation specific-MLPA MS-PCR Methylation specific-PCR NAD(+) Nicotinamida adenina dinucleótido NADP(+) Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato ng Nanogramos nm Nanometros NTC Non template control OA Oligoastrocitoma OCT Optimal cutting temperature OD Oligodendroglioma OMS Organización Mundial de la Salud OR Odds Ratio PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la

polimerasa) PCV Procarbazine-Lomustine-Vincristine PET Positron Emission Tomography (Tomografía por emisión de

positrones) PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PIP2 Phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate qPCR Quantitative PCR QT Quimioterapia Qx Cirugía RMN Resonancia magnética nuclear Rpm Revoluciones por minuto RT Radioterapia RT-qPCR Retotranscriptase-qPCR SGZ Subgranular zone (Capa subgranular del giro dentado del

hipocampo) SH2 Src homology 2 (Dominio homólogo conservado Src) SHH Sonic Hedgehog SN Sistema nervioso

Abreviaturas

SNC Sistema nervioso central SNP Sistema nervioso periférico SQ-MSP Semiquantitative-methylation specific PCR SSI STAT-induced STAT inhibitor (Inhibidores de STAT inducidos por

STAT) SVZ Subventricular zone (Capa subventricular de los ventrículos

laterales) TAC Tomografía axial computerizada TMA Tissue microarray (Micromatriz de tejido) TMZ Tomozolomida TSS Transcription start site (Sitio de inicio de la transcripción) TTO Tratamiento V Volumen VPA Valproic acid (Ácido valproico) y col y colaboradores GENES Y PROTEÍNAS

ACP5 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 agt O6-Alquilguanina-alquiltransferasa AKT V-akt murine thymoma viral oncogene homolog AMH Muellerian-inhibiting factor ANXA1 Annexin 1 ANXA2 Annexin 2 ANXA2P2 Annexin A2 pseudogene 2 ATM Ataxia telangiectasia mutated ASIC1 Acid sensing ion channel subunit 1 ATP6V1G2 ATPase, H+ Transporting, Lysosomal 13kDa, V1 Subunit G2 Bcl2 B-cell CLL/lymphoma 2 BIRC5 Baculoviral IAP Repeat Containing 5 BMP Bone Morphogenetic Proteins BRAF V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 CA9 Carbonic anhydrase 9 CA12 Carbonic anhydrase 12 CACNA1B calcium voltage-gated channel subunit alpha1 B CACNA1G Calcium channel, voltage-dependent, T type, alpha 1G subunit CAMK2A Calcium/calmodulin dependent protein kinase II alpha CCL2 C-C motif chemokine ligand 2 CD44 Cycline dependent kinase 4 CD63 CD63 molecule CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A CDKN2B Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B CENPF Centromere protein F

Abreviaturas

CNGA3 Cyclic nucleotide-gated cation channel alpha-3 COL4A1 Collagen alpha-1(IV) chain COL4A2 Collagen alpha-2(IV) chain CRABP1 Cellular retinoic acid binding protein 1 DCC Neutrin 1 receptor DNAH9 DNAH9 protein E2F Transcription factor 1 EGFR Epidermal growth factor receptor FAM129A Family With Sequence Similarity 129, Member A GABA Gamma-Aminobutyric Acid GABRA1 Gamma-Aminobutyric Acid A Receptor, Alpha 1 GABRG2 Gamma-Aminobutyric Acid A Receptor, Gamma 2 GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GDF15 Growth/differentiation factor 15 GPR158 Probable G-protein coupled receptor 158 GRB10 Growth factor receptor-bound protein 10 HCN1 Hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated potassium

channel 1 HIF Hypoxia-inducible factor HJURP Holliday Junction Recognition Protein HIST1H1B Histone cluster 1 H1b HIST1H3A Histone cluster 1, H3a HIST2H3A Histone cluster 2, H3a HIST2H3C Histone cluster 2, H3c IGF Insuline like growth factor IGF2 Insuline like growth factor 2 IGFBP5 Insulin-like growth factor-binding protein 5 IGFBP7 Insulin-like growth factor-binding protein 7 IL1 Interleukin 1 JAK Janus kinase JPA4 Junctophilin 4 IDH Isocitrate dehydrogenase KCNC2 Potassium voltage-gated channel subfamily C member 2 KCNK1 Potassium voltage-gated channel subfamily K member 1 KiAA1683 Uncharacterized protein KRAS Kristen rat sarcoma viral oncogene homolog LPGAT1 Lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 MAD2L2 MAD2 mitotic arrest deficient-like 2 MAL mal, T-cell differentiation protein MDM2 Protooncogene E3 ubiquitin protein ligase MDM4 p53 regulator MGMT O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase MIB1 Mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1 MLH1 MutL homolog 1

Abreviaturas

CNGA3 Cyclic nucleotide-gated cation channel alpha-3 COL4A1 Collagen alpha-1(IV) chain COL4A2 Collagen alpha-2(IV) chain CRABP1 Cellular retinoic acid binding protein 1 DCC Neutrin 1 receptor DNAH9 DNAH9 protein E2F Transcription factor 1 EGFR Epidermal growth factor receptor FAM129A Family With Sequence Similarity 129, Member A GABA Gamma-Aminobutyric Acid GABRA1 Gamma-Aminobutyric Acid A Receptor, Alpha 1 GABRG2 Gamma-Aminobutyric Acid A Receptor, Gamma 2 GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GDF15 Growth/differentiation factor 15 GPR158 Probable G-protein coupled receptor 158 GRB10 Growth factor receptor-bound protein 10 HCN1 Hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated potassium

channel 1 HIF Hypoxia-inducible factor HJURP Holliday Junction Recognition Protein HIST1H1B Histone cluster 1 H1b HIST1H3A Histone cluster 1, H3a HIST2H3A Histone cluster 2, H3a HIST2H3C Histone cluster 2, H3c IGF Insuline like growth factor IGF2 Insuline like growth factor 2 IGFBP5 Insulin-like growth factor-binding protein 5 IGFBP7 Insulin-like growth factor-binding protein 7 IL1 Interleukin 1 JAK Janus kinase JPA4 Junctophilin 4 IDH Isocitrate dehydrogenase KCNC2 Potassium voltage-gated channel subfamily C member 2 KCNK1 Potassium voltage-gated channel subfamily K member 1 KiAA1683 Uncharacterized protein KRAS Kristen rat sarcoma viral oncogene homolog LPGAT1 Lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 MAD2L2 MAD2 mitotic arrest deficient-like 2 MAL mal, T-cell differentiation protein MDM2 Protooncogene E3 ubiquitin protein ligase MDM4 p53 regulator MGMT O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase MIB1 Mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1 MLH1 MutL homolog 1

Abreviaturas

MSH2 MutS homolog 2 MSH6 MutS homolog 6 MT1X Metallothionein-1X mTOR mechanistic target of rapamycin NEUROG1 Neurogenin 1 NF1 Neurofibromin 1 NF-ΚB Nuclear factor kappa B subunit 1 NTN1 Netrin 1 OGDHC 2-Oxoglutarate dehydrogenase complex OGDHL 2-oxoglutarate dehydrogenase-like, mitochondrial O6-mG O6-metilguanina P14ARF P14 ADP-ribosylation factor P16INK4 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A PACSIN1 Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1 PHLDB1 Pieckstrin homology-like domain family 13 member 1 PI3K Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PTEN Phsphatase and tensin homolog PTX3 Pentraxin 3 RAS Ras sarcoma viral oncogene-homolog RB1 Retinoblastoma 1 RTEL1 Regulator of telomere elongation helicase 1 RUNX3 Run related transcription factor 3 RYR2 Ryanodine receptor 2 SCN2B Sodium voltage-gated channel beta subunit 2 SHH Sonic Hedgehog SLC8A2 Solute carrier family 8 member A2 SLC30A3 Solute carrier family 30 member A3 SNAP25 Synaptosome associated protein 25kDa SNARE Soluble NSF Attachment Protein Receptor SOCS1 Suppressor of cytokine signaling 1 SOCS3 Suppressor of cytokine signaling 3 SPOCK1 Testican-1 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 STAT5 Signal transducer and activator of transcription 5 SYT1 Synaptotagmin 1 SYT4 Synaptotagmin 4 TBX2 T-box 2 TEL Telomere elongation TERT Telomerase reverse transcriptase TET Ten-eleven translocation family protein TGFβ Transforming growth factor beta TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 TNFRSF12A Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A

Abreviaturas

TP53 Tumor protein p53 TRIB3 Tribbles homolog 3 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C UCHL1 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 VEGF Vascular endotelial growth factor VEGFA Vascular endotelial growth factor A

Abreviaturas

TP53 Tumor protein p53 TRIB3 Tribbles homolog 3 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C UCHL1 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 VEGF Vascular endotelial growth factor VEGFA Vascular endotelial growth factor A

Tablas

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación histológica y por grados de los gliomas.

Tabla 2. Mutaciones en IDH1.

Tabla 3. Mutaciones en IDH2.

Tabla 4. Descripción de las muestras.

Tabla 5. Criterios para determinar el estado de metilación de MGMT.

Tabla 6. Cebadores para IDH1 e IDH2.

Tabla 7. Reactivos para la PCR de IDH1 e IDH2.

Tabla 8. Programa de temperaturas PCR IDH1/IDH2.

Tabla 9. Cebadores internos de secuenciación para IDH1 e IDH2.

Tabla 10. Estándares de cuantificación.

Tabla 11. Mix de reacción para la PCR. Tabla 12. Condiciones de la qPCR para la detección de CMV.

Tabla 13. Reactivos y sus correspondientes volúmenes para la PCR de

retrotranscripción.

Tabla 14. Volúmenes para la preparación de los master mixes de PCR. Tabla 15. Porcentajes de metilación de MGMT.

Tabla 16. Frecuencias de deleciones en 1p/19q. Tabla 17. Porcentajes de muestras CIMP+ (CIMP positivas) en base al grado

tumoral.

Tabla 18. Porcentajes de tumores metilados de cada uno de los genes del

panel CIMP según el grado tumoral y el p-valor.

Tabla 19. Porcentajes de metilación de SOCS1 según el grado tumoral de las

muestras.

Tabla 20. Tabla de contingencia para la metilación de SOCS1 y la edad. Tabla 21. Resumen de la metilación y expresión de MGMT y SOCS1 de las

muestras de gliomas analizadas.

Tabla 22. Mutaciones en los genes IDH.

Tabla 23. Porcentajes de mutación de IDH.

Tabla 24. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH y la edad.

Tabla 25. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH y el tratamiento (Tto). Tabla 26. Tabla de contingencia para las mutaciones en IDH por secuenciación

directa y por IHQ.

Tablas

Tabla 27. Frecuencia de muestras positivas y negativas para ki67 y p53.

Tabla 28. Correlación de Spearman para las variables cuantitativas Ki67 y p53.

Tabla 29. Asociación entre las variables cualitativas ki67 y p53 mediante le

prueba de Chi cuadrado.

Tabla 30. Resultado del análisis de supervivencia por Kaplan-Meier para ki67.

Tabla 31. Tabla de contingencia para las variables grado tumoral y edad.

Tabla 32. Tabla de contingencia para las variables grado tumoral y tto.

Tabla 33. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en

MGMT y mutaciones en IDH.

Tabla 34. Tabla de contingencia para las variables moleculares CIMP y

mutaciones en IDH.


SOCS1 y mutaciones en IDH.


SOCS1 y CIMP.

Tabla 37. Análisis multivariante por Regresión de Cox, variables

independientes con respecto a la supervivencia.


independientes con respecto a la metilación de SOCS1.


independientes en cada grupo de edad con respecto a la supervivencia.

Tabla 40. Características de los pacientes cuyas muestras fueron analizadas

para HCMV.

Tabla 41. . Resultados de las diferentes técnicas empleadas para la detección

de HCMV.

Tabla 42. Características clínicas y moleculares de los GBM de supervivencia

normal y de larga supervivencia. p-valor del test X2.

Tabla 43. Perfiles basados en tres marcadores moleculares.

Tabla 44. Características clinicopatológicas de las muestras de GBM de los 8

pacientes incluídos en el análisis de expresión.

Tabla 45. Resultados del análsis del microarray de 13K sondas.

Tabla 46. Tabla resumen de los 26 genes diferencialmente expresados en

GBM.

Tabla 47. Rutas KEEG diferencialmente expresadas.

Tablas

Tabla 27. Frecuencia de muestras positivas y negativas para ki67 y p53.


Tabla 29. Asociación entre las variables cualitativas ki67 y p53 mediante le

prueba de Chi cuadrado.



Tabla 32. Tabla de contingencia para las variables grado tumoral y tto.


MGMT y mutaciones en IDH.

Tabla 34. Tabla de contingencia para las variables moleculares CIMP y

mutaciones en IDH.


SOCS1 y mutaciones en IDH.


SOCS1 y CIMP.


independientes con respecto a la supervivencia.


independientes con respecto a la metilación de SOCS1.


independientes en cada grupo de edad con respecto a la supervivencia.

Tabla 40. Características de los pacientes cuyas muestras fueron analizadas

para HCMV.

Tabla 41. . Resultados de las diferentes técnicas empleadas para la detección

de HCMV.

Tabla 42. Características clínicas y moleculares de los GBM de supervivencia

normal y de larga supervivencia. p-valor del test X2.

Tabla 43. Perfiles basados en tres marcadores moleculares.

Tabla 44. Características clinicopatológicas de las muestras de GBM de los 8

pacientes incluídos en el análisis de expresión.

Tabla 45. Resultados del análsis del microarray de 13K sondas.

Tabla 46. Tabla resumen de los 26 genes diferencialmente expresados en

GBM.


Tablas

Tabla 48. Funciones diferencialmente sobreexpresadas en base a la anotación funcional de GO.

Tabla 49. Funciones diferencialmente infraexpresadas en base a la anotación

funcional de GO.

Tabla 50. Valores de metilación de MGMT según el grado histológico en

diferentes estudios y revisiones.

Figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Enfoque terapéutico de las características del cáncer. Figura 2. Mecanismos moleculares y celulares esenciales que guían la

diferenciación neuronal y glial en el ectodermo neural.

Figura 3. Histología de los astrocitomas de grado II y III.

Figura 4. Aspecto histológico de un Glioblastoma Multiforme.

Figura 5. Alteraciones moleculares en gliomas.

Figura 6. Principales vías de señalización implicadas en la patogénesis de los

gliomas.

Figura 7. Visión simplificada de Notch en células madre neurales y desarrollo

de gliomas.

Figura 8. Vías de señalización de Shh y Wnt/β-catenina alteradas en gliomas.

Figura 9. Metilación del ADN. Figura 10. Silenciamiento epigenético.

Figura 11. Localización y función de las enzimas IDH1 e IDH2.

Figura 12. Supervivencia en gliomas de alto grado con y sin mutaciones en

IDH1 e IDH2.

Figura 13. Representación esquemática de la estructura lineal del ARNm del

gen MGMT (en azul) y de la proteína agt (en verde).

Figura 14. Mecanismo de reparación de MGMT.

Figura 15. Representación de las regiones DMR1 y DMR2 y el nivel de

metilación (%) de cada sitio CpG analizado.

Figura 16. Estructura del gen SOCS1. Figura 17. Vía de señalización de SOCS1.

Figura 18. Estructura del HCMV.

Figura 19. Patrón de picos de un MLPA tras la separación de fragmentos por

electroforesis capilar.

Figura 20. Secuencia del promotor de MGMT e islas CpGs.

Figura 21. Esquema del MS-MLPA.

Figura 22. Patrón de electroforesis capilar de una muestra de ADN control

humano masculino de, aproximadamente, 50ng digerido y analizado con el kit

SALSA MLPA KIT ME042-B1 CIMP para determinar el estado de metilación.

Figuras


humano masculino de, aproximadamente, 50ng no digerido y analizado con el

kit SALSA MLPA KIT ME042-B1 CIMP para cuantificar el número de copias.

Figura 24. Esquema del funcionamiento de las sondas TaqMan en la qPCR.

Figura 25. Curva tipo de una reacción cuantitativa a tiempo real.

Figura 26. Condiciones de la PCR para la retrotranscripción. Figura 27. Esquema de placa para la PCR cuantitativa a tiempo real.

Figura 28. Patrones de metilación de las distintas sondas de MS-MLPA para

MGMT. Figura 29. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en

las muestras analizadas en el estudio.

Figura 30. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en

las muestras tratadas. Figura 31. Curva de supervivencia Kaplan-Meier del G-CIMP en las muestras

analizadas en el estudio. Figura 32. Patrones de metilación de SOCS1.

Figura 33. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación en SOCS1 en


Figura 34. Expresión de MGMT de las muestras tumorales normalizada con

respecto al control.

Figura 35. Expresión de SOCS1 de las muestras tumorales normalizada con


Figura 36. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de las mutaciones en IDH en

las muestras analizadas en el estudio. Figura 37. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de los cuatro grupos

establecidos en base a las mutaciones en IDH y la edad.

Figura 38. Curvas de Kaplan-Meier para las distintas variables clínicas.

Figura 39. Curvas de Kaplan-Meier para el perfil E de los GBM largos

supervivientes. Figura 40. Curvas de Kaplan-Meier para la metilación de MGMT en base a los

diferentes grados histológicos.

Figura 41. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH en base a los


Figuras


humano masculino de, aproximadamente, 50ng no digerido y analizado con el

kit SALSA MLPA KIT ME042-B1 CIMP para cuantificar el número de copias.


Figura 25. Curva tipo de una reacción cuantitativa a tiempo real.

Figura 26. Condiciones de la PCR para la retrotranscripción. Figura 27. Esquema de placa para la PCR cuantitativa a tiempo real.

Figura 28. Patrones de metilación de las distintas sondas de MS-MLPA para

MGMT. Figura 29. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en


Figura 30. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en

las muestras tratadas. Figura 31. Curva de supervivencia Kaplan-Meier del G-CIMP en las muestras

analizadas en el estudio. Figura 32. Patrones de metilación de SOCS1.

Figura 33. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación en SOCS1 en


Figura 34. Expresión de MGMT de las muestras tumorales normalizada con


Figura 35. Expresión de SOCS1 de las muestras tumorales normalizada con


Figura 36. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de las mutaciones en IDH en

las muestras analizadas en el estudio. Figura 37. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de los cuatro grupos

establecidos en base a las mutaciones en IDH y la edad.

Figura 38. Curvas de Kaplan-Meier para las distintas variables clínicas.

Figura 39. Curvas de Kaplan-Meier para el perfil E de los GBM largos

supervivientes. Figura 40. Curvas de Kaplan-Meier para la metilación de MGMT en base a los


Figura 41. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH en base a los


Figuras

Figura 42. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH agrupando los

AII y AIII.

Figura 43. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las

mutaciones en IDH y P53.


mutaciones en IDH y ki67.


mutaciones en IDH, metilación en MGMT y metilación en SOCS1.


mutaciones en IDH, metilación en MGMT, metilación en SOCS1, mutaciones

en P53 e índice de proliferación ki67.

Figura 47. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a los cinco

marcadores.

Figura 48. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a la metilación de

SOCS1 y la edad. Figura 49. Diagramas de Venn realizado con Venny 2.0. Figura 50. Mapa de expresión de los 26 genes que mostraron diferencias en

los distintos análisis.

Figura 51. Funciones diferencialmente expresadas tras el análisis con DAVID

Bioinformatics Resources 6.7.

Figura 52. Red de proteínas para los genes relacionados con los GBM de esta

serie.

INTRODUCCIÓN

39

Introducción

1. INTRODUCCIÓN

1.1. CÁNCER

El cáncer es considerado como un amplio grupo de patologías de

distinto origen histológico caracterizadas por un crecimiento celular

descontrolado que, en ocasiones, puede llegar a colonizar otros tejidos

circundantes o totalmente alejados (metástasis). Este crecimiento anormal es

consecuencia de la acumulación de alteraciones genéticas en la progresiva

transformación de una célula normal en neoplásica. Las células cancerosas

presentan defectos en los sistemas reguladores que gobiernan la proliferación

y homeostasis de las células normales. No sólo alteraciones genéticas, si no

también alteraciones en los patrones de metilación del ADN (epigenéticos) y

otras formas de regulaciones transcripcionales contribuyen a la complejidad del

cáncer (Renault & Golgher, 2015).

Hanahan y Weinberg establecieron en el año 2000 una serie de

características comunes del cáncer (Hanahan & Weinberg, 2000). Esta revisión

fue actualizada en 2011 por los mismos autores (Hanahan & Weinberg, 2011);

en ella, se añaden nuevas características asociadas al cáncer (Figura 1). Los

autores sugieren que los diferentes genotipos de las células cancerosas se

manifiestan como una serie de alteraciones en la fisiología celular que dan

lugar al crecimiento neoplásico:

Autosuficiencia de señales de crecimiento: mientras que las células

normales requieren señales para poder proliferar, las células tumorales

generan sus propias señales de crecimiento. Existen mutaciones

somáticas en ciertos tumores que producen activación constitutiva de los

circuitos de señalización que, finalmente, dan lugar a la producción de

factores de crecimiento. Son importantes ciertos bucles de

retroalimentación negativa cuya función, normalmente, es la inhibición

de diferentes tipos de señales y, por tanto, garantizan la regulación

homeostática de los flujos de señalización intracelulares (Amit, et al.,

40

Introducción

2007; Cabrita & Christofori, 2008; Mosesson, Mills, & Yarden, 2008;

Wertz & Dixit, 2010). Defectos en estos mecanismos de

retroalimentación son capaces de aumentar las señales proliferativas.

Insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento: la

quiescencia celular y homeostasis tisular se mantienen gracias a

múltiples señales antiproliferativas que bloquean el crecimiento. Las

células cancerosas deben evadir dichas señales para poder proliferar.

Muchas de estas señales dependen de las acciones de los genes

supresores de tumores. Los contactos célula-célula, formados en las

poblaciones celulares normales, sirven para suprimir la proliferación

celular. La inhibición por contacto es un mecanismo que garantiza la

homeostasis normal de los tejidos, pero se encuentra suprimida durante

la tumorigénesis.

Evasión de la apoptosis: la apoptosis es un mecanismo de muerte

celular programada que presentan las células normales. Este proceso se

activa cuando se produce daño celular. Las células cancerosas son

capaces de adquirir resistencia a la apoptosis a través de diferentes

mecanismos, como la acumulación de mutaciones inactivantes en

aquellos genes implicados en la activación de este proceso.

Potencial replicativo ilimitado: mientras que las células en cultivo

poseen un potencial replicativo limitado (Hayflick, 1997), la mayoría de

las células tumorales en un cultivo parecen estar inmortalizadas, es

decir, adquieren la capacidad de multiplicarse sin límite (Wright, Pereira-

Smith, & Shay, 1989). Las células normales están sometidas a una

progresiva erosión de la longitud de los telómeros (extremos de los

cromosomas), compuestos por múltiples repeticiones de

hexanucleótidos en tándem. El acortamiento progresivo de los telómeros

tras cada división celular puede generar aberraciones cromosómicas en

las sucesivas mitosis incompatibles con la vida celular. La telomerasa,

ADN polimerasa especializada en mantener la longitud de los telómeros,

está casi ausente en la células diferenciadas, pero se encuentra

41

Introducción

2007; Cabrita & Christofori, 2008; Mosesson, Mills, & Yarden, 2008;

Wertz & Dixit, 2010). Defectos en estos mecanismos de

retroalimentación son capaces de aumentar las señales proliferativas.

Insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento: la

quiescencia celular y homeostasis tisular se mantienen gracias a

múltiples señales antiproliferativas que bloquean el crecimiento. Las

células cancerosas deben evadir dichas señales para poder proliferar.

Muchas de estas señales dependen de las acciones de los genes

supresores de tumores. Los contactos célula-célula, formados en las

poblaciones celulares normales, sirven para suprimir la proliferación

celular. La inhibición por contacto es un mecanismo que garantiza la

homeostasis normal de los tejidos, pero se encuentra suprimida durante

la tumorigénesis.

Evasión de la apoptosis: la apoptosis es un mecanismo de muerte

celular programada que presentan las células normales. Este proceso se

activa cuando se produce daño celular. Las células cancerosas son

capaces de adquirir resistencia a la apoptosis a través de diferentes

mecanismos, como la acumulación de mutaciones inactivantes en

aquellos genes implicados en la activación de este proceso.

Potencial replicativo ilimitado: mientras que las células en cultivo

poseen un potencial replicativo limitado (Hayflick, 1997), la mayoría de

las células tumorales en un cultivo parecen estar inmortalizadas, es

decir, adquieren la capacidad de multiplicarse sin límite (Wright, Pereira-

Smith, & Shay, 1989). Las células normales están sometidas a una

progresiva erosión de la longitud de los telómeros (extremos de los

cromosomas), compuestos por múltiples repeticiones de

hexanucleótidos en tándem. El acortamiento progresivo de los telómeros

tras cada división celular puede generar aberraciones cromosómicas en

las sucesivas mitosis incompatibles con la vida celular. La telomerasa,

ADN polimerasa especializada en mantener la longitud de los telómeros,

está casi ausente en la células diferenciadas, pero se encuentra

Introducción

expresada en la gran mayoría de las que requieren mayor capacidad

proliferativa, incluidas las células madre y las células cancerígenas. Las

células tumorales son capaces, por tanto, de conservar los telómeros, lo

que permite una multiplicación ilimitada de las células descendientes.

Neoangiogénesis: el proceso de formación de vasos sanguíneos

(angiogénesis) en células normales está estrictamente regulado y ocurre

de forma transitoria. Las células tumorales adquieren la habilidad de

generar nuevos vasos (neoangiogénesis) para conseguir aporte de

nutrientes y oxígeno, altamente demandado por dichas células que

tienen una elevada actividad metabólica y mitótica.

Invasión tisular y metástasis: las células cancerosas adquieren

capacidad de invadir los tejidos circundantes y colonizar nuevos tejidos a

distancia para formar nuevas colonias. El proceso de invasión y

metástasis sigue una secuencia de pasos diferenciados: invasión local,

intravasación de células cancerígenas en vasos sanguíneos y linfáticos

circundantes, tránsito de células cancerígenas a través de los sistemas

linfático y hematológico seguido de la salida de dichas células de la

lúmina de cada vaso al parénquima de tejidos distantes (extravasación),

formación de pequeños nódulos de células cancerígenas

(micrometástasis) y, finalmente, crecimiento de lesiones

micrometastásicas a tumores macroscópicos, este último paso llamado

“colonización”.

Inflamación: el microambiente de los tumores presenta un componente

inflamatorio que contribuye a la proliferación y supervivencia de las

células cancerosas, angiogénesis, metástasis, escape a la respuesta

inmune y una menor respuesta a hormonas y agentes

quimioterapéuticos. La inflamación ha sido considerada como un rasgo

común de los diferentes tipos de cáncer (Colotta, Allavena, Sica,

Garlanda, & Mantovani, 2009). Las células implicadas en la inflamación

pueden liberar compuestos (especies reactivas del oxígeno) que son

42

Introducción

mutagénicos para las células cancerígenas, acelerando su evolución

genética a través de los diferentes grados de malignidad.

Inestabilidad genómica y mutación: las células normales tienen

sistemas de conservación del genoma muy eficientes que detectan y

reparan defectos en el ADN. Gracias a estos sistemas, la probabilidad

de que se produzcan mutaciones espontáneas es muy baja. Sin

embargo, en las células cancerígenas con frecuencia se ve

incrementada esta probabilidad (Negrini, Gorgoulis, & Halazonetis, 2010;

Salk, Fox, & Loeb, 2010). Los genes más afectados por estas

mutaciones son aquellos cuyos productos están implicados en: detectar

daño en el ADN y activar la maquinaria de reparación, reparar

directamente el daño en el ADN e inactivar o interceptar moléculas

mutagénicas antes de que dañen el ADN. Estos genes, normalmente, se

comportan como genes supresores de tumores ya que sus funciones se

pierden durante la progresión tumoral.

Reprogramación del metabolismo energético: las células

cancerígenas pueden reprogramar su metabolismo energético y, por

ende, su producción energética. Las células tumorales presentan un

metabolismo anaeróbico, utilizando la glucolisis como fuente de energía

(efecto Warburg). Al aumentar la glicólisis, los intermediarios de la

misma se distribuyen hacia diferentes vías de biosíntesis dando lugar a

la formación de macromoléculas y orgánulos requeridos para formar

nuevas células.

Evasión del sistema inmune: el sistema inmune es capaz de

reconocer y eliminar células cancerígenas incipientes, pero estas células

son capaces de evitar la acción del sistema inmune mediante diferentes

procesos.

Existen grandes diferencias entre los diferentes tipos de tumores sólidos en

cuanto a su etipatogenia molecular, su evolución y pronóstico y, lógicamente,

su tratamiento. De la misma forma, existen grandes diferencias entre los

43

Introducción

mutagénicos para las células cancerígenas, acelerando su evolución

genética a través de los diferentes grados de malignidad.

Inestabilidad genómica y mutación: las células normales tienen

sistemas de conservación del genoma muy eficientes que detectan y

reparan defectos en el ADN. Gracias a estos sistemas, la probabilidad

de que se produzcan mutaciones espontáneas es muy baja. Sin

embargo, en las células cancerígenas con frecuencia se ve

incrementada esta probabilidad (Negrini, Gorgoulis, & Halazonetis, 2010;

Salk, Fox, & Loeb, 2010). Los genes más afectados por estas

mutaciones son aquellos cuyos productos están implicados en: detectar

daño en el ADN y activar la maquinaria de reparación, reparar

directamente el daño en el ADN e inactivar o interceptar moléculas

mutagénicas antes de que dañen el ADN. Estos genes, normalmente, se

comportan como genes supresores de tumores ya que sus funciones se

pierden durante la progresión tumoral.

Reprogramación del metabolismo energético: las células

cancerígenas pueden reprogramar su metabolismo energético y, por

ende, su producción energética. Las células tumorales presentan un

metabolismo anaeróbico, utilizando la glucolisis como fuente de energía

(efecto Warburg). Al aumentar la glicólisis, los intermediarios de la

misma se distribuyen hacia diferentes vías de biosíntesis dando lugar a

la formación de macromoléculas y orgánulos requeridos para formar

nuevas células.

Evasión del sistema inmune: el sistema inmune es capaz de

reconocer y eliminar células cancerígenas incipientes, pero estas células

son capaces de evitar la acción del sistema inmune mediante diferentes

procesos.

Existen grandes diferencias entre los diferentes tipos de tumores sólidos en

cuanto a su etipatogenia molecular, su evolución y pronóstico y, lógicamente,

su tratamiento. De la misma forma, existen grandes diferencias entre los

Introducción

tumores de un mismo tipo, de diferentes pacientes (De Palma & Hanahan,

2012). Esta gran variabilidad hace que la eficacia de los tratamientos contra el

cáncer no sea la esperada en muchos casos. Es necesario poder establecer

las causas funcionales que definen un tumor concreto para poder desarrollar

una medicina personalizada que permita mejorar la eficacia de los tratamientos

(Figura 1).

Figura 1. Enfoque terapéutico de las características del cáncer. Representación de las

diferentes características del cáncer y las posibles opciones terapéuticas dirigidas hacia cada

una de ellas (Hanahan D, 2011).

44

Introducción

1.2. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

El sistema nervioso central es el centro estructural y funcional del sistema

nervioso (SN) y está formado por el encéfalo y la médula espinal. Integra

piezas aferentes de información sensitiva, evalúa la información e inicia una

respuesta eferente. La sustancia que forma el sistema nervioso central (SNC),

llamada sustancia nerviosa, está integrada por diferentes tejidos: nervioso,

conectivo y vascular. Esta sustancia nerviosa en el SNC se distribuye bajo dos

formas diferentes: la sustancia gris, formada por los cuerpos neuronales y por

las terminaciones de fibras nerviosas procedentes de otros niveles, y la

sustancia blanca, formada por fibras nerviosas (fundamentalmente mielínicas),

células de la glía y capilares sanguíneos.

Las células del SN se pueden dividir en dos categorías: células

nerviosas (neuronas) y células de soporte llamadas neuroglía (glía). Las

neuronas están especilizadas en la señalización eléctrica, a diferencia de las

células de la glía que tienen otras funciones esenciales en el desarrollo del

cerebro adulto.

1.2.1. GLÍA

Significa literalmente “pegamento”. El número de células de la glía en el

SN humano adulto es aproximadamente de 900 billones, tres veces más

cantidad de células gliales que de neuronas. Las células gliales conservan su

capacidad de división celular durante toda su madurez y, aunque no participan

directamente en la señalización eléctrica, ayudan a establecer los contactos

sinápticos y a mantener la capacidad de señalización de las neuronas. Dentro

de las funciones de estas células se encuentran: mantener el medio iónico de

las células nerviosas, modular la velocidad de propagación de la señal

nerviosa, modular la acción sináptica mediante el control de la absorción de

neurotransmisores y ayudar a la recuperación de una lesión neural o prevenirla.

45

Introducción

1.2. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

El sistema nervioso central es el centro estructural y funcional del sistema

nervioso (SN) y está formado por el encéfalo y la médula espinal. Integra

piezas aferentes de información sensitiva, evalúa la información e inicia una

respuesta eferente. La sustancia que forma el sistema nervioso central (SNC),

llamada sustancia nerviosa, está integrada por diferentes tejidos: nervioso,

conectivo y vascular. Esta sustancia nerviosa en el SNC se distribuye bajo dos

formas diferentes: la sustancia gris, formada por los cuerpos neuronales y por

las terminaciones de fibras nerviosas procedentes de otros niveles, y la

sustancia blanca, formada por fibras nerviosas (fundamentalmente mielínicas),

células de la glía y capilares sanguíneos.

Las células del SN se pueden dividir en dos categorías: células

nerviosas (neuronas) y células de soporte llamadas neuroglía (glía). Las

neuronas están especilizadas en la señalización eléctrica, a diferencia de las

células de la glía que tienen otras funciones esenciales en el desarrollo del

cerebro adulto.

1.2.1. GLÍA

Significa literalmente “pegamento”. El número de células de la glía en el

SN humano adulto es aproximadamente de 900 billones, tres veces más

cantidad de células gliales que de neuronas. Las células gliales conservan su

capacidad de división celular durante toda su madurez y, aunque no participan

directamente en la señalización eléctrica, ayudan a establecer los contactos

sinápticos y a mantener la capacidad de señalización de las neuronas. Dentro

de las funciones de estas células se encuentran: mantener el medio iónico de

las células nerviosas, modular la velocidad de propagación de la señal

nerviosa, modular la acción sináptica mediante el control de la absorción de

neurotransmisores y ayudar a la recuperación de una lesión neural o prevenirla.

Introducción

Dentro de la glía existen tres tipos de células: astrocitos,

oligodendrocitos y células microgliales (Figura 2). Los astrocitos, como su

nombre indica, tienen forma de estrella. Están presentes de forma exclusiva en

el SNC y constituyen el tipo de glía más numeroso. Desempeñan múltiples

funciones importantes, como mantener un entorno químico adecuado para la

señalización neuronal. Captan la glucosa de la sangre y la convierten en ácido

láctico que llevan a las neuronas a las que se encuentran conectadas. Los

astrocitos forman vainas ceñidas en torno a los capilares sanguíneos del

encéfalo que contribuyen a crear la barrera hematoencefálica. Los

oligodendrocitos, que también están restringidos al SNC, forman una envoltura

rica en lípidos, llamada mielina, alrededor de algunos, pero no todos, los

axones. Las células microgliales son las más pequeñas y derivan de células

madre hematopoyéticas (aunque algunas pueden derivar directamente de las

células madre neurales). Estas células comparten muchas características con

los macrófagos y se encargan de eliminar los restos celulares de las zonas

lesionadas o de la renovación celular normal (Purves, 2004).

Figura 2. Mecanismos moleculares y celulares esenciales que guían la diferenciación neuronal y glial en el ectodermo neural (Purves, 2004).

46

Introducción

1.3. TUMORES GLIALES

Los gliomas son los tumores cerebrales más frecuentes e incluyen una gran

variedad de tipos histológicos y grados de malignidad. Proceden de células de

la glía y representan aproximadamente el 70% de los tumores cerebrales

primarios (Ohgaki, 2009; Riemenschneider, 2010).

1.3.1. CLASIFICACIÓN

Según el criterio de la OMS (Organización Mundial de la Salud) (D. N.

Louis, et al., 2007), la mayoría de los gliomas pueden ser clasificados en cuatro

grados de malignidad (I-IV). Esta clasificación es la siguiente:

Grado I: presentan un bajo potencial proliferativo y la posibilidad de cura

tras la resección quirúrgica.

Grado II: generalmente infiltrantes, presentan un bajo nivel de actividad

proliferativa y suelen recidivar.

Grado III: estas lesiones se caracterizan por núcleos atípicos y una

elevada actividad mitótica.

Grado IV: gliomas mitóticamente activos y propensos a necrosis con

una extensa capacidad infiltrante. Se asocian a una rápida evolución de

la enfermedad pre y postoperatoria.

Dependiendo de distintas características histológicas, los gliomas se

pueden clasificar de esta forma ("Gliomas del Encéfalo," 2008; Nikiforova &

Hamilton, 2011; Oliveros, 2008):

Tumores astrocíticos:

o Astrocitoma pilocítico (grado I) (AI): tumor bien delimitado y

demarcado del tejido adyacente, puede ser reseccionado.

47

Introducción

1.3. TUMORES GLIALES

Los gliomas son los tumores cerebrales más frecuentes e incluyen una gran

variedad de tipos histológicos y grados de malignidad. Proceden de células de

la glía y representan aproximadamente el 70% de los tumores cerebrales

primarios (Ohgaki, 2009; Riemenschneider, 2010).

1.3.1. CLASIFICACIÓN

Según el criterio de la OMS (Organización Mundial de la Salud) (D. N.

Louis, et al., 2007), la mayoría de los gliomas pueden ser clasificados en cuatro

grados de malignidad (I-IV). Esta clasificación es la siguiente:

Grado I: presentan un bajo potencial proliferativo y la posibilidad de cura

tras la resección quirúrgica.

Grado II: generalmente infiltrantes, presentan un bajo nivel de actividad

proliferativa y suelen recidivar.

Grado III: estas lesiones se caracterizan por núcleos atípicos y una

elevada actividad mitótica.

Grado IV: gliomas mitóticamente activos y propensos a necrosis con

una extensa capacidad infiltrante. Se asocian a una rápida evolución de

la enfermedad pre y postoperatoria.

Dependiendo de distintas características histológicas, los gliomas se

pueden clasificar de esta forma ("Gliomas del Encéfalo," 2008; Nikiforova &

Hamilton, 2011; Oliveros, 2008):

Tumores astrocíticos:

o Astrocitoma pilocítico (grado I) (AI): tumor bien delimitado y

demarcado del tejido adyacente, puede ser reseccionado.

Introducción

o Astrocitoma difuso (grado II) (AII): tumor con un alto grado de

diferenciación celular, crecimiento lento, infiltración difusa y atipia

citológica (Figura 3).

o Astrocitoma anaplásico (grado III) (AIII): astrocitoma difuso e

infiltrante y con un elevado potencial proliferativo. Presenta atipia,

anaplasia y actividad mitótica (Figura 3).

o Glioblastoma multiforme (grado IV) (GBM): tumor astrocítico de

mayor grado de malignidad, compuesto por células astrocitarias

neoplásicas poco diferenciadas. Muestran, además, proliferación

microvascular y/o necrosis (Figura 4).

Figura 3. Histología de los astrocitomas de grado II y III. (A) Aspecto histológico de un

astrocitoma difuso (Grado II). (B) Aspecto histológico de un astrocitoma anaplásico (Grado III),

presencia de gran cantidad de mitosis (Flecha)

(http://neuropathology-web.org/chapter7/chapter7bGliomas.html#astro).

Figura 4. Aspecto histológico de un Glioblastoma Multiforme con sus características como (A) anaplasia, (B) necrosis y células en pseudoempalizada y (C) proliferación microvascular.

(http://neuropathology-web.org/chapter7/chapter7bGliomas.html#astro).

A B

A B C

C

48

Introducción

Tumores Oligodendrogliales (OD): tumores derivados de células de la

oligodendroglía.

Tumores Oligoastrocíticos (OA): tumores compuestos por células

neoplásicas derivadas de la oligodendroglía y astrocitos.

Existe un consenso general de que los oligodendrogliomas tienen mejor

pronóstico que los astrocitomas de igual grado. Los astrocitomas con

componente oligodendroglial tienen mejor pronóstico que los astrocitomas

difusos del mismo grado.

Tumores ependimarios:

o Ependimomas (grado II): tumores cuyas células presentan

diferenciación en sentido ependimario (las células

ependimarias forman el revestimiento de los ventrículos

del encéfalo y del conducto ependimario de la médula espinal).

Pueden aparecer en cualquier localización a lo largo del sistema

ventricular y del canal medular.

Existen más tipos histológicos aparte de los descritos en este apartado. No

obstante, este trabajo de investigación se centra en los tumores astrocíticos

difusos, anaplásicos y glioblastomas multiformes (Tabla 1).

49

Introducción

Tumores Oligodendrogliales (OD): tumores derivados de células de la

oligodendroglía.

Tumores Oligoastrocíticos (OA): tumores compuestos por células

neoplásicas derivadas de la oligodendroglía y astrocitos.

Existe un consenso general de que los oligodendrogliomas tienen mejor

pronóstico que los astrocitomas de igual grado. Los astrocitomas con

componente oligodendroglial tienen mejor pronóstico que los astrocitomas

difusos del mismo grado.

Tumores ependimarios:

o Ependimomas (grado II): tumores cuyas células presentan

diferenciación en sentido ependimario (las células

ependimarias forman el revestimiento de los ventrículos

del encéfalo y del conducto ependimario de la médula espinal).

Pueden aparecer en cualquier localización a lo largo del sistema

ventricular y del canal medular.

Existen más tipos histológicos aparte de los descritos en este apartado. No

obstante, este trabajo de investigación se centra en los tumores astrocíticos

difusos, anaplásicos y glioblastomas multiformes (Tabla 1).

Introducción

Tabla 1. Clasificación histológica y por grados de los gliomas (D. N. Louis, et al., 2007)

1.3.2. ETIOLOGÍA El origen celular de los gliomas aún no está completamente esclarecido.

Los primeros datos sugieren que se originan a partir de células gliales normales

que han ido acumulando alteraciones genéticas y epigenéticas. Sin embargo,

datos más recientes indican que pueden surgir de células madre neurales.

Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas y glía

(astrocitos y oligodendrocitos). Este proceso de neurogénesis ocurre en dos

principales regiones del cerebro adulto de mamíferos: en la SVZ (zona

subventricular de los ventrículos laterales) y en la SGZ (capa subgranular del

giro dentado del hipocampo). Cuando se desregula el proceso de

50

Introducción

neurogénesis, las células madre neurales pueden dar lugar a la formación de

ciertos tipos de tumores cerebrales (Batista, et al., 2014). Las células madre

neurales, además de la capacidad de diferenciarse, son capaces de

autorrenovarse, proliferar y migrar. Estas características son adquiridas por las

células madre cancerígenas mediante la acumulación de mutaciones a lo largo

del tiempo y, como resultado, esto da lugar a la iniciación tumoral, recurrencia y

metástasis. Existen evidencias de que las células madre cancerígenas, en este

caso de gliomas, pueden contribuir a la resistencia de estos tumores a los

tratamientos. En 2011, un estudio realizado por Gong y col (y colaboradores)

demostró que los fármacos más recientes (como bortezomib y erlotinib)

disminuían la fracción de células madre cancerígenas mientras que afectaban

mínimamente a las células madre neurales en líneas celulares de gliomas de

alto grado. Sin embargo, fármacos más antiguos (como temozolomida y

cisplatino), disminuían mayoritariamente la población de células madre

neurales y apenas afectaban a las células madre cancerígenas (Gong,

Schwartz, Linskey, & Bota, 2011). Es necesario identificar marcadores de

superficie específicos para aislar y caracterizar estas células madre

cancerígenas y, de este modo, establecer estrategias terapéuticas dirigidas

hacia este tipo de células para poder erradicar completamente el tumor

(Batista, et al., 2014; Jovcevska, Kocevar, & Komel, 2013; Pointer, Clark,

Zorniak, Alrfaei, & Kuo, 2014; P. Y. Wen & S. Kesari, 2008).

1.3.3. EPIDEMIOLOGÍA

Los países desarrollados presentan una mayor incidencia de gliomas

(Ohgaki & Kleihues, 2005). Diferentes estudios indican que la población

caucásica muestra una mayor incidencia que las poblaciones africana y

asiática. En adultos, los tumores cerebrales primarios ocupan el decimotercer

lugar en frecuencia de todos los cánceres. Los ratios de incidencia varían

significativamente en función del tipo histológico, edad al diagnóstico, género,

raza y país. La incidencia anual de estas neoplasias oscila entre 4.8 y 10.6 por

cien mil habitantes y el ratio de incidencia ajustado a la edad varía entre 4.67 y

5.73 por cien mil habitantes. Los astrocitomas anaplásicos y glioblastomas

aumentan su ratio de incidencia con la edad, apareciendo un pico entre los 75 y

51

Introducción

neurogénesis, las células madre neurales pueden dar lugar a la formación de

ciertos tipos de tumores cerebrales (Batista, et al., 2014). Las células madre

neurales, además de la capacidad de diferenciarse, son capaces de

autorrenovarse, proliferar y migrar. Estas características son adquiridas por las

células madre cancerígenas mediante la acumulación de mutaciones a lo largo

del tiempo y, como resultado, esto da lugar a la iniciación tumoral, recurrencia y

metástasis. Existen evidencias de que las células madre cancerígenas, en este

caso de gliomas, pueden contribuir a la resistencia de estos tumores a los

tratamientos. En 2011, un estudio realizado por Gong y col (y colaboradores)

demostró que los fármacos más recientes (como bortezomib y erlotinib)

disminuían la fracción de células madre cancerígenas mientras que afectaban

mínimamente a las células madre neurales en líneas celulares de gliomas de

alto grado. Sin embargo, fármacos más antiguos (como temozolomida y

cisplatino), disminuían mayoritariamente la población de células madre

neurales y apenas afectaban a las células madre cancerígenas (Gong,

Schwartz, Linskey, & Bota, 2011). Es necesario identificar marcadores de

superficie específicos para aislar y caracterizar estas células madre

cancerígenas y, de este modo, establecer estrategias terapéuticas dirigidas

hacia este tipo de células para poder erradicar completamente el tumor

(Batista, et al., 2014; Jovcevska, Kocevar, & Komel, 2013; Pointer, Clark,

Zorniak, Alrfaei, & Kuo, 2014; P. Y. Wen & S. Kesari, 2008).

1.3.3. EPIDEMIOLOGÍA

Los países desarrollados presentan una mayor incidencia de gliomas

(Ohgaki & Kleihues, 2005). Diferentes estudios indican que la población

caucásica muestra una mayor incidencia que las poblaciones africana y

asiática. En adultos, los tumores cerebrales primarios ocupan el decimotercer

lugar en frecuencia de todos los cánceres. Los ratios de incidencia varían

significativamente en función del tipo histológico, edad al diagnóstico, género,

raza y país. La incidencia anual de estas neoplasias oscila entre 4.8 y 10.6 por

cien mil habitantes y el ratio de incidencia ajustado a la edad varía entre 4.67 y

5.73 por cien mil habitantes. Los astrocitomas anaplásicos y glioblastomas

aumentan su ratio de incidencia con la edad, apareciendo un pico entre los 75 y

Introducción

84 años (Ostrom, et al., 2014). En España se calcula una incidencia de 8.73

por cien mil habitantes por año en varones y 5.41 en mujeres (AECC 2012).

1.3.4. FACTORES DE RIESGO 1.3.4.1. AMBIENTALES

Una serie de factores ambientales y estilos de vida se han relacionado con

un elevado riesgo de gliomas. Entre estos factores destaca la radiación

terapéutica (radiografías), inequívocamente asociada con un incremento del

riesgo de padecer gliomas. Varios estudios muestran un elevado riesgo de

desarrollo de tumores cerebrales en niños con leucemia linfoblástica aguda que

han recibido radiación profiláctica del SNC. No se ha demostrado que los

teléfonos móviles sean causantes de una mayor incidencia de los gliomas, ni

tampoco la ingesta de alcohol ni el hábito tabáquico. En cuanto a otros factores

como químicos, pesticidas y disolventes, aún no existe una asociación clara

entre dichos factores y el riesgo de gliomas (Omuro & DeAngelis, 2013;

Ostrom, et al., 2014).

1.3.4.2. GENÉTICOS

Síndromes como Turcot (causados por mutaciones en línea germinal en

MLH1(mutL homolog 1), MSH2 o MSH6 (mutS homolog 2 o 6)), y Li Fraumeni

(mutaciones en TP53 (tumor protein p53)) cursan frecuentemente con tumores

cerebrales (Ohgaki & Kleihues, 2005). A pesar de que numerosos síndromes

familiares de cáncer se asocian con un incremento del riesgo de padecer

gliomas, estos desórdenes sólo representan una pequeña proporción de la

incidencia de gliomas en adultos a nivel poblacional (Ostrom, et al., 2014).

Mediante análisis de segregación se ha observado que un modelo

poligénico explica mejor el patrón de incidencia de gliomas en adultos.

Diferentes estudios de secuenciación masiva de genomas han identificado

ocho variantes genéticas (SNPs, Single Nucleotide Polymosphism) comunes en

siete genes que aumentan el riesgo de padecer gliomas. Variantes en cuatro

52

Introducción

de estos genes (TERT, telomerase reverse transcriptase; RTEL1, regulator of

telomere elongation helicase 1; EGFR, epidermal growth factor receptor y

TP53) se asocian con un elevado riesgo de padecer cualquier tipo de glioma,

mientras que variantes en los otros tres genes (CDKN2B, cyclin-dependent

kinase inhibitor 2B; PHLDB1, pieckstrin homology-like domain y CCDC26,

coiled-coil domain containing 26) contribuyen sólo al desarrollo de grados

específicos (Rajaraman, et al., 2012).

1.3.5. DIAGNÓSTICO Y ESTADIFICACIÓN

La neuroimagen tiene un papel muy importante en el diagnóstico y

evaluación de la localización, extensión y actividad biológica del tumor antes,

durante y después del tratamiento (Ahmed, Oborski, Hwang, Lieberman, &

Mountz, 2014). La técnica de elección para el diagnóstico es la RMN

(Resonancia Magnética Nuclear), ya que posee una mayor sensibilidad y

permite distinguir entre grados histológicos, sin embargo, no puede diferenciar

entre la necrosis producida por la radiación y la reaparición del tumor tras el

tratamiento. En aquellos pacientes clínicamente inestables, la técnica

empleada es el TAC (tomografía axial computerizada), sin embargo, esta

técnica presenta una menor resolución. Otra de las técnicas utilizadas es el

PET (tomografía por emisión de positrones), que mide la actividad metabólica y

se basa en la detección de la captación de glucosa marcada (DFG, F-2-

deoxifluoroglucosa) que se introduce en el organismo por vía intravenosa. Esta

DFG es transportada activamente a través de la barrera hematoencefálica

hacia el interior de la células, donde se forma F-DFG (F-2-deoxifluoroglucosa-

6-fosfato) que impide su propio metabolismo. Como resultado, la distribución de

la F-DFG es un buen reflejo de la distribución del consumo de glucosa y la

utilización de la misma por las células en el cuerpo (Ahmed, et al., 2014). Las

células tumorales, al poseer un metabolismo acelerado, consumen más

cantidad de glucosa que las normales (www.aecc.es, 2012). Otra técnica de

neuroimagen es la espectroscopía de resonancia magnética que se basa en la

representación de diferentes metabolitos mediante patrones de picos cuyas

áreas representan las concentraciones correspondientes de cada uno de ellos.

53

Introducción

de estos genes (TERT, telomerase reverse transcriptase; RTEL1, regulator of

telomere elongation helicase 1; EGFR, epidermal growth factor receptor y

TP53) se asocian con un elevado riesgo de padecer cualquier tipo de glioma,

mientras que variantes en los otros tres genes (CDKN2B, cyclin-dependent

kinase inhibitor 2B; PHLDB1, pieckstrin homology-like domain y CCDC26,

coiled-coil domain containing 26) contribuyen sólo al desarrollo de grados

específicos (Rajaraman, et al., 2012).

1.3.5. DIAGNÓSTICO Y ESTADIFICACIÓN

La neuroimagen tiene un papel muy importante en el diagnóstico y

evaluación de la localización, extensión y actividad biológica del tumor antes,

durante y después del tratamiento (Ahmed, Oborski, Hwang, Lieberman, &

Mountz, 2014). La técnica de elección para el diagnóstico es la RMN

(Resonancia Magnética Nuclear), ya que posee una mayor sensibilidad y

permite distinguir entre grados histológicos, sin embargo, no puede diferenciar

entre la necrosis producida por la radiación y la reaparición del tumor tras el

tratamiento. En aquellos pacientes clínicamente inestables, la técnica

empleada es el TAC (tomografía axial computerizada), sin embargo, esta

técnica presenta una menor resolución. Otra de las técnicas utilizadas es el

PET (tomografía por emisión de positrones), que mide la actividad metabólica y

se basa en la detección de la captación de glucosa marcada (DFG, F-2-

deoxifluoroglucosa) que se introduce en el organismo por vía intravenosa. Esta

DFG es transportada activamente a través de la barrera hematoencefálica

hacia el interior de la células, donde se forma F-DFG (F-2-deoxifluoroglucosa-

6-fosfato) que impide su propio metabolismo. Como resultado, la distribución de

la F-DFG es un buen reflejo de la distribución del consumo de glucosa y la

utilización de la misma por las células en el cuerpo (Ahmed, et al., 2014). Las

células tumorales, al poseer un metabolismo acelerado, consumen más

cantidad de glucosa que las normales (www.aecc.es, 2012). Otra técnica de

neuroimagen es la espectroscopía de resonancia magnética que se basa en la

representación de diferentes metabolitos mediante patrones de picos cuyas

áreas representan las concentraciones correspondientes de cada uno de ellos.

Introducción

Los datos de los metabolitos del tumor se comparan con los datos de la zona

opuesta sana. Los metabolitos que más se estudian son: el lactato, producto de

la glicólisis anaeróbica; el N-acetilaspartato, representante de la viabilidad y

densidad neuronal; la colina, indicador de la rotación de las membranas y

proliferación celular y la creatina, indicadora del gasto de energía celular. El

incremento de los ratios colina/creatina, el aumento de la concentración de

lactato y la disminución de N-acetilaspartato, correlacionan con una progresión

del tumor.

Existen otras técnicas de neuroimagen menos utilizadas. Los diagnósticos

por imagen son siempre de sospecha y han de ser confirmados, en la medida

de lo posible, por el diagnóstico histopatológico a través de una biopsia que

permitirá su estadificación.

1.3.6. SUPERVIVENCIA Y TRATAMIENTO

En la mayoría de las áreas geográficas el ratio de mortalidad es similar al

ratio de incidencia. Algunos estudios indican que el ratio de mortalidad para

tumores del SN en el Norte de América, Europa del Este y Australia oscila,

aproximadamente, entre 4-7 por cada cien mil personas cada año en el caso de

hombres y entre 3-5 en el caso de mujeres (Parkin, Bray, Ferlay, & Pisani,

2005). En general, la supervivencia de los pacientes con gliomas es muy baja.

Los gliomas con un componente oligodendroglial tienen una mayor

supervivencia en comparación con los gliomas con un componente astrocítico

(Ostrom, et al., 2014). En el caso de los glioblastomas, sólo un 3.3% de los

pacientes sobrevive a los dos años tras el diagnóstico y el tiempo medio de

supervivencia se encuentra entre 9 y 12 meses (Ohgaki, 2009; Ohgaki, et al.,

2004)

Esta baja supervivencia se asocia al hecho de que no exista un tratamiento

eficaz. Siempre que sea posible, los pacientes con gliomas son sometidos a

exéresis completa de la lesión preservando la función neurológica. Si esto no

es posible, se opta por la máxima reducción del volumen tumoral con la mínima

morbilidad para el paciente. Actualmente, se están aplicando técnicas

54

Introducción

neuroquirúrgicas mínimamente invasivas como, por ejemplo, técnicas de

resección endoscópica. Estas técnicas facilitan una resección mayor de

aquellos tumores localizados en regiones poco accesibles. Además, se están

investigando técnicas neuroquirúrgicas para la liberación de fármacos a nivel

intratumoral (Ahmed, et al., 2014).

El tratamiento post-cirugía más utilizado, sobretodo en gliomas de alto

grado, es el protocolo de Stupp (Stupp & Weber, 2005), basado en RT

(radioterapia) más QT (quimioterapia) con TMZ (Temozolomida) concominante

y adyuvante. La TMZ es un agente alquilante que mata las células

cancerígenas mediante la formación de O6-mG (O6-metilguanina) en el ADN

(Jovcevska, et al., 2013). Generalmente, la dosis de RT es de 60 Grays (1

Gray= 1 Julio/Kg). Esta radiación se dirige hacia toda la masa tumoral más un

margen alrededor de la masa de entre 1 y 3 centímetros de tejido,

aparentemente, normal (Ahmed, et al., 2014).

Las nuevas terapias dirigidas actúan directamente sobre diferentes

características tumorales: vías moleculares alteradas, angiogénesis y

microambiente del tumor. Gracias a los recientes estudios sobre el genoma y

características moleculares de los gliomas, se han desarrollado nuevos

fármacos y se han iniciado numerosos ensayos clínicos. Sin embargo, dada la

gran heterogeneidad de estos tumores, sólo ha habido un éxito relativo en la

eficacia de dichos tratamientos (Polivka, Polivka, Rohan, Topolcan, & Ferda,

2012).

Las áreas de investigación sobre nuevas terapias dirigidas se clasifican en

(Ahmed, et al., 2014; Polivka, et al., 2012; Renault & Golgher, 2015):

Receptores de factores de crecimiento y sus correspondientes

inhibidores.

Inhibidores de vías de señalización intracelulares.

Inhibidores de la angiogénesis. Cabe destacar en este grupo el fármaco

Bevacizumab (anticuerpo contra el VEGF, vascular endotelial growth

55

Introducción

neuroquirúrgicas mínimamente invasivas como, por ejemplo, técnicas de

resección endoscópica. Estas técnicas facilitan una resección mayor de

aquellos tumores localizados en regiones poco accesibles. Además, se están

investigando técnicas neuroquirúrgicas para la liberación de fármacos a nivel

intratumoral (Ahmed, et al., 2014).

El tratamiento post-cirugía más utilizado, sobretodo en gliomas de alto

grado, es el protocolo de Stupp (Stupp & Weber, 2005), basado en RT

(radioterapia) más QT (quimioterapia) con TMZ (Temozolomida) concominante

y adyuvante. La TMZ es un agente alquilante que mata las células

cancerígenas mediante la formación de O6-mG (O6-metilguanina) en el ADN

(Jovcevska, et al., 2013). Generalmente, la dosis de RT es de 60 Grays (1

Gray= 1 Julio/Kg). Esta radiación se dirige hacia toda la masa tumoral más un

margen alrededor de la masa de entre 1 y 3 centímetros de tejido,

aparentemente, normal (Ahmed, et al., 2014).

Las nuevas terapias dirigidas actúan directamente sobre diferentes

características tumorales: vías moleculares alteradas, angiogénesis y

microambiente del tumor. Gracias a los recientes estudios sobre el genoma y

características moleculares de los gliomas, se han desarrollado nuevos

fármacos y se han iniciado numerosos ensayos clínicos. Sin embargo, dada la

gran heterogeneidad de estos tumores, sólo ha habido un éxito relativo en la

eficacia de dichos tratamientos (Polivka, Polivka, Rohan, Topolcan, & Ferda,

2012).

Las áreas de investigación sobre nuevas terapias dirigidas se clasifican en

(Ahmed, et al., 2014; Polivka, et al., 2012; Renault & Golgher, 2015):

Receptores de factores de crecimiento y sus correspondientes

inhibidores.

Inhibidores de vías de señalización intracelulares.

Inhibidores de la angiogénesis. Cabe destacar en este grupo el fármaco

Bevacizumab (anticuerpo contra el VEGF, vascular endotelial growth

Introducción

factor) que ha sido aprobrado por la FDA (Food and Drug Administration)

para el tratamiento de GBM.

Inmunoterapia y vacunas (con antígenos tumorales, células dendríticas,

células T específicas y péptidos). Como la vacuna Rindopepimut

(basada en péptidos) que se encuentra, actualmente, en un ensayo

clínico en fase III y que parece ser una terapia prometedora en el

tratamiento de los GBM. Dada la gran complejidad de los tumores cerebrales y su elevada tasa

de mortalidad, junto con la escasez de tratamientos de gran efectividad, es

necesario tanto la identificación de nuevos biomarcadores como un

esfuerzo cooperativo entre investigadores y clínicos para conseguir terapias

más eficaces (Kerrie L. McDonald 2011).

1.4. ALTERACIONES GENÉTICAS ASOCIADAS A GLIOMAS En los gliomas, tanto en la iniciación como en la progresión, pueden estar

involucradas múltiples alteraciones genéticas (Nikiforova & Hamilton, 2011) que

afectan a oncogenes, genes supresores de tumores y genes de reparación del

ADN. Estas alteraciones genéticas afectan a la regulación del ciclo celular,

proliferación, motilidad, neoangiogénesis y reconocimiento por el sistema

inmune.

Los GBM han sido clasificados en dos tipos: primarios (o de novo) y

secundarios. Los GBM primarios aparecen como tumores avanzados al

diagnóstico, representan entre el 90-95% de los GBM, los pacientes presentan

edades más avanzadas y peor pronóstico. Por el contrario, los GBM

secundarios presentan evidencias clínicas, radiológicas y/o histopatológicas de

una progresión maligna desde un tumor preexistente de bajo grado,

representan entre el 5-10% de los GBM, aparecen en pacientes más jóvenes y

tienen un mejor pronóstico (Parsons, et al., 2008; Renault & Golgher, 2015).

56

Introducción

Los GBM primarios muestran alteraciones genéticas (amplificación de

EGFR y mutaciones en PTEN, phosphatase and tensin homolog),

cromosómicas y epigenéticas complejas que implican a genes de vías celulares

importantes. Los AII, AIII, oligodendrogliomas y GBM secundarios portan,

frecuentemente, mutaciones en IDH1 e IDH2 (Isocitrate dehydrogenase 1 y 2).

Los gliomas astrocíticos difusos, en ocasiones, contienen mutaciones en TP53,

mientras que los tumores oligodendrogliales se caracterizan por codeleciones

en las regiones cromosómicas 1p/19q. La mayoría de los oligoastrocitomas

tienen ambas alteraciones (Figura 5).

Los cambios moleculares asociados con la progresión a glioma anaplásico

incluyen pérdidas en el brazo cromosómico 9p e inactivación de los genes

CDKN2A, CDKN2B y p14ARF (p14 ADP-ribosylation factor) en 9p21. La

progresión a GBM secundario se asocia a pérdidas en el brazo cromosómico

10q (LOH, loss of heterocygosity) y a pérdidas de expresión de DCC (netrin 1

receptor). La mayoría de los astrocitomas pilocíticos se caracterizan por

duplicación/fusión o mutaciones puntuales del gen BRAF (B-Raf proto-

oncogene, serine/threonine kinase) en 7q34. De entre todas, la alteración más

frecuente que aparece en GBM es la pérdida de heterocigosidad en 10q (Ware,

Berger, & Binder, 2003) (Figura 5).

57

Introducción

Los GBM primarios muestran alteraciones genéticas (amplificación de

EGFR y mutaciones en PTEN, phosphatase and tensin homolog),

cromosómicas y epigenéticas complejas que implican a genes de vías celulares

importantes. Los AII, AIII, oligodendrogliomas y GBM secundarios portan,

frecuentemente, mutaciones en IDH1 e IDH2 (Isocitrate dehydrogenase 1 y 2).

Los gliomas astrocíticos difusos, en ocasiones, contienen mutaciones en TP53,

mientras que los tumores oligodendrogliales se caracterizan por codeleciones

en las regiones cromosómicas 1p/19q. La mayoría de los oligoastrocitomas

tienen ambas alteraciones (Figura 5).

Los cambios moleculares asociados con la progresión a glioma anaplásico

incluyen pérdidas en el brazo cromosómico 9p e inactivación de los genes

CDKN2A, CDKN2B y p14ARF (p14 ADP-ribosylation factor) en 9p21. La

progresión a GBM secundario se asocia a pérdidas en el brazo cromosómico

10q (LOH, loss of heterocygosity) y a pérdidas de expresión de DCC (netrin 1

receptor). La mayoría de los astrocitomas pilocíticos se caracterizan por

duplicación/fusión o mutaciones puntuales del gen BRAF (B-Raf proto-

oncogene, serine/threonine kinase) en 7q34. De entre todas, la alteración más

frecuente que aparece en GBM es la pérdida de heterocigosidad en 10q (Ware,

Berger, & Binder, 2003) (Figura 5).

Introducción

Figura 5. Alteraciones moleculares en gliomas. Resumen de las alteraciones moleculares

más frecuentes en gliomas astrocíticos, oligodendrogliomas y oligoastrocitomas

(Riemenschneider, 2010).

Existen, además, varias vías que pueden estar alteradas en gliomas (Figura

6):

Vía EGFR/RAS/NF1/PTEN/PI3K: EGFR es un tipo de receptor tirosin-

quinasa que participa en la división celular, migración, adhesión,

diferenciación y apoptosis (Chakravarti, Dicker, & Mehta, 2004;

Mellinghoff, et al., 2005). La activación de los receptores de crecimiento

se produce por la unión de sus respectivos ligandos al dominio

extracelular, lo que da lugar al reclutamiento de PI3K

(phosphatidylinositol 3-kinase) a la membrana celular. PI3K fosforila al

PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate) a PIP3 (phosphatidylinositol

58

Introducción

3,4,5-triphsphate), lo que activa a AKT (v-akt murine thymoma viral

oncogene homolog) y mTOR (mechanistic target of rapamycin). Esto da

lugar a un aumento de la proliferación y un incremento de la

supervivencia mediante el bloqueo de la apoptosis. PTEN inhibe a PIP3

y, por tanto, se inhibe la proliferación celular. A su vez, el gen supresor

tumoral NF1 (neurofibromin 1) codifica la neurofibromina que funciona

principalmente como regulador negativo de RAS (rat sarcoma viral

oncogene homolog)(X. Li, et al., 2016). La amplificación de EGFR ocurre

en un 40% de los GBM primarios, mientras que es muy poco frecuente

en los GBM secundarios. Esta amplificación en ocasiones se asocia con

mutaciones en este gen, siendo la más frecuente la EGFRvIII (mutación

oncogénica resultado de una deleción entre los exones 2 y 7, que

ocasiona la pérdida de 801pb en pauta de lectura) que provoca una

activación constitutiva del receptor (Franco-Hernandez, Martinez-Glez, &

Rey, 2007).

PTEN está mutado en un 15-40% de los GBM primarios y esta

mutación es muy rara en los GBM secundarios. En general, esta vía

está alterada en un 88% de los GBM y en un porcentaje muy bajo de los

oligondendrogliomas anaplásicos (Ohgaki, 2009).

Vía TP53/MDM2/MDM4/P14ARF : TP53 codifica una proteína que juega

un papel importante en algunos procesos celulares como en el ciclo

celular, en la respuesta celular al daño del ADN, en la muerte celular y

en la diferenciación celular. En condiciones normales, p53 está

secuestrado por su represor MDM2 (proto-oncogene, E3 ubiquitin

protein ligase) que forma un complejo heterodimérico con MDM4 (p53

regulator) promoviendo la degradación de p53. Cuando la célula entra

en división, MDM2 libera a p53, lo que da lugar a la transcripción de

genes implicados en la reparación del ADN y/o apoptosis (Franco-

Hernandez, et al., 2007). P14ARF, cuya función está reprimida por p53,

inhibe la función de MDM2. Mutaciones en TP53 hacen que el material

genético dañado no se repare y, además, provocan un aumento de la

división celular y una disminución de la apoptosis. La función de

59

Introducción

3,4,5-triphsphate), lo que activa a AKT (v-akt murine thymoma viral

oncogene homolog) y mTOR (mechanistic target of rapamycin). Esto da

lugar a un aumento de la proliferación y un incremento de la

supervivencia mediante el bloqueo de la apoptosis. PTEN inhibe a PIP3

y, por tanto, se inhibe la proliferación celular. A su vez, el gen supresor

tumoral NF1 (neurofibromin 1) codifica la neurofibromina que funciona

principalmente como regulador negativo de RAS (rat sarcoma viral

oncogene homolog)(X. Li, et al., 2016). La amplificación de EGFR ocurre

en un 40% de los GBM primarios, mientras que es muy poco frecuente

en los GBM secundarios. Esta amplificación en ocasiones se asocia con

mutaciones en este gen, siendo la más frecuente la EGFRvIII (mutación

oncogénica resultado de una deleción entre los exones 2 y 7, que

ocasiona la pérdida de 801pb en pauta de lectura) que provoca una

activación constitutiva del receptor (Franco-Hernandez, Martinez-Glez, &

Rey, 2007).

PTEN está mutado en un 15-40% de los GBM primarios y esta

mutación es muy rara en los GBM secundarios. En general, esta vía

está alterada en un 88% de los GBM y en un porcentaje muy bajo de los

oligondendrogliomas anaplásicos (Ohgaki, 2009).

Vía TP53/MDM2/MDM4/P14ARF : TP53 codifica una proteína que juega

un papel importante en algunos procesos celulares como en el ciclo

celular, en la respuesta celular al daño del ADN, en la muerte celular y

en la diferenciación celular. En condiciones normales, p53 está

secuestrado por su represor MDM2 (proto-oncogene, E3 ubiquitin

protein ligase) que forma un complejo heterodimérico con MDM4 (p53

regulator) promoviendo la degradación de p53. Cuando la célula entra

en división, MDM2 libera a p53, lo que da lugar a la transcripción de

genes implicados en la reparación del ADN y/o apoptosis (Franco-

Hernandez, et al., 2007). P14ARF, cuya función está reprimida por p53,

inhibe la función de MDM2. Mutaciones en TP53 hacen que el material

genético dañado no se repare y, además, provocan un aumento de la

división celular y una disminución de la apoptosis. La función de

Introducción

p14ARF, por tanto, no será reprimida por p53 y esto desencadenará una

acumulación de MDM2 libre que, a su vez, secuestrará a p53 en niveles

superiores a los normales. Todo esto da como resultado una

acumulación de daños en el ADN. Al menos una alteración en esta vía

se observa en un 50% de los GBM primarios, en más de un 70% de los

GBM secundarios, en un 21% de los oligodendrogliomas y en un 50% de

los oligodendrogliomas anaplásicos (Ohgaki, 2009); Christopher J,

2009).

Vía P16INK4/RB1/CDK4: la proteína rb1 (retinoblastoma 1) está implicada

en la progresión de la fase G1 a la fase S del ciclo celular. Esta proteína

es fosforilada por el complejo CDK4/Ciclina D1, lo que provoca la

liberación del factor de transcripción E2F (transcription factor 1) que

activa la transcripción de genes involucrados en la transición de G1 a S

del ciclo celular. En cuanto a p16INK4 (CDKN2A), esta proteína se une a

CDK4 (cyclin-dependent kinase 4) e inhibe al complejo CDK4/Ciclina D1,

lo que da lugar a la inhibición de la transición de G1 a S. La deleción

homocigota de p16INK4, la amplificación de CDK4 y la pérdida de RB1

ocurren en un 50% de los GBM primarios, en un 40% de los GBM

secundarios, en un 4% de los oligodendrogliomas y en un 65% de los

oligodendrogliomas anaplásicos (Ohgaki, 2009).

60

Introducción

Figura 6. Principales vías de señalización implicadas en la patogénesis de los gliomas (Huse & Holland, 2010).

En base a la hipótesis de las células madre neurales como origen de las

células precursoras de los gliomas, existen una serie de vías de señalización

importantes en la biología de las células madre normales que, al perder la

regulación normal, pueden dar lugar a la iniciación tumoral, progresión y

metástasis. Algunas de estas vías implicadas en el desarrollo de tumores

cerebrales son:

Vía de señalización Notch: en las células madre de gliomas esta vía se

encuentra sobreexpresada dando lugar a patrones de autorrenovación

incontrolados y promoviendo la resistencia a los tratamientos

antitumorales (Teodorczyk & Schmidt, 2014) (Figura 7).

61

Introducción

Figura 6. Principales vías de señalización implicadas en la patogénesis de los gliomas (Huse & Holland, 2010).

En base a la hipótesis de las células madre neurales como origen de las

células precursoras de los gliomas, existen una serie de vías de señalización

importantes en la biología de las células madre normales que, al perder la

regulación normal, pueden dar lugar a la iniciación tumoral, progresión y

metástasis. Algunas de estas vías implicadas en el desarrollo de tumores

cerebrales son:

Vía de señalización Notch: en las células madre de gliomas esta vía se

encuentra sobreexpresada dando lugar a patrones de autorrenovación

incontrolados y promoviendo la resistencia a los tratamientos

antitumorales (Teodorczyk & Schmidt, 2014) (Figura 7).

Introducción

Figura 7. Visión simplificada de Notch en células madre neurales y desarrollo de gliomas

(Stockhausen, Kristoffersen, & Poulsen, 2010).

Vía de las BMPs (proteínas morfogenéticas óseas): estas proteínas

pertenecen a una familia de citoquinas que regulan la proliferación,

apoptosis y diferenciación de las células madre neurales (González-

Gómez, Anselmo, & Mira, 2014).

Vía Wnt/β-catenina: esta vía participa en la proliferación celular,

diferenciación y morfogénesis (Morris & Huang, 2016). La acumulación

de β-catenina, por una alteración de esta vía en GBM, da lugar a la

sobreexpresión de genes relacionados con la proliferación y esto se

asocia con un mal pronóstico.

Vía Shh (Sonic Hedgehog): está asociada con la neurogénesis adulta y

con el desarrollo tumoral, proliferación, tumorigénesis y metástasis

(Carpenter, et al., 2015; Matteo, et al., 2013). Tanto esta vía como la vía

Wnt/β-catenina se asocian con un aumento de la invasividad tumoral

62

Introducción

debida a una regulación positiva de la actividad de las metaloproteinasas

(Morris & Huang, 2016) (Figura 8).

Figura 8. Vías de señalización de Shh y Wnt/β-catenina alteradas en gliomas

(Huse & Holland, 2010).

Vía STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3): está

implicada en el desarrollo de las células madre neurales y en la

formación de muchos tipos de tumores, incluyendo GBM (Swiatek-

Machado & Kaminska, 2013).

63

Introducción

debida a una regulación positiva de la actividad de las metaloproteinasas

(Morris & Huang, 2016) (Figura 8).

Figura 8. Vías de señalización de Shh y Wnt/β-catenina alteradas en gliomas

(Huse & Holland, 2010).

Vía STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3): está

implicada en el desarrollo de las células madre neurales y en la

formación de muchos tipos de tumores, incluyendo GBM (Swiatek-

Machado & Kaminska, 2013).

Introducción

1.5. EPIGENÉTICA

El término “epigenética” fue propuesto en 1939 por Conrad Hal

Waddington, que lo definió como “la interacción causal entre los genes y sus

productos, de los cuales emerge el fenotipo final”. Por tanto, la epigenética son

aquellos mecanismos heredables que afectan a la expresión génica y que no

proceden de alteraciones en la secuencia de nucleótidos del ADN (Baylin,

2005).

Los eventos epigenéticos juegan, además, un papel importante en el

desarrollo y progresión del cáncer. Existen tres mecanismos básicos asociados

al fenómeno de la epigenética y que, por tanto, regulan la transcripción génica:

metilación del ADN, modificación de histonas y ARN (ácido ribonucleico) no

codificante.

1.5.1. METILACIÓN DEL ADN

La metilación del ADN se produce por la adición de un grupo metilo al

quinto átomo de carbono del anillo de citosina, creando la 5mC (5-

metilcitosina). Esta modificación covalente se lleva a cabo por un conjunto de

enzimas llamadas DNMTs (DNA methyltransferases) (Figura 9).

Figura 9. Metilación del ADN. Adición de un grupo metilo en el carbono 5 de la citosina por

acción de las DNMTs.

64

Introducción

Estas proteínas reconocen secuencias de dinucleótidos CpG (citosina-

guanina unidas por un fosfato) que se encuentran con mayor frecuencia en

regiones del ADN llamadas islas CpGs que, a su vez, se localizan en, o cerca de, secuencias promotoras de genes. En mamíferos, participan tres DNMTs: la

DNMT1 que se encarga de la metilación de mantenimiento, esto es, reconocer

hemimetilaciones (metilaciones en sólo en una hebra del ADN) y metilar la

hebra complementaria para poder mantener la metilación durante la división

celular y las DNMTs 3a y 3b que se encargan de la metilación de novo, metilan

genes concretos para silenciarlos en momentos determinados de la fisiología

celular (Taby & Issa, 2010).

La estructura de la cromatina cerca de las regiones promotoras de los

genes afecta a la metilación del ADN y a la actividad transcripcional. La

heterocromatina, condensada y transcripcionalmente inactiva, se encuentra

mayoritariamente metilada; mientras que la eucromatina se encuentra

generalmente no metilada independientemente del estado transcripcional del

gen. Las islas CpGs no metiladas presentan nucleosomas (unidades

funcionales de la cromatina formadas por un octámero de histonas y la cadena

de ADN alrededor de las mismas) con una configuración más abierta que

permite el acceso de factores de transcripción. Por el contrario, las islas CpGs

metiladas presentan nucleosomas más compactos que no permiten el acceso

de estos factores (Baylin, 2005) (Figura 10).

Figura 10. Silenciamiento epigenético. Esquema de algunos procesos moleculares que

ocurren en los promotores ricos en CpGs sometidos a silenciamiento epigenético en células

65

Introducción

Estas proteínas reconocen secuencias de dinucleótidos CpG (citosina-

guanina unidas por un fosfato) que se encuentran con mayor frecuencia en

regiones del ADN llamadas islas CpGs que, a su vez, se localizan en, o cerca de, secuencias promotoras de genes. En mamíferos, participan tres DNMTs: la

DNMT1 que se encarga de la metilación de mantenimiento, esto es, reconocer

hemimetilaciones (metilaciones en sólo en una hebra del ADN) y metilar la

hebra complementaria para poder mantener la metilación durante la división

celular y las DNMTs 3a y 3b que se encargan de la metilación de novo, metilan

genes concretos para silenciarlos en momentos determinados de la fisiología

celular (Taby & Issa, 2010).

La estructura de la cromatina cerca de las regiones promotoras de los

genes afecta a la metilación del ADN y a la actividad transcripcional. La

heterocromatina, condensada y transcripcionalmente inactiva, se encuentra

mayoritariamente metilada; mientras que la eucromatina se encuentra

generalmente no metilada independientemente del estado transcripcional del

gen. Las islas CpGs no metiladas presentan nucleosomas (unidades

funcionales de la cromatina formadas por un octámero de histonas y la cadena

de ADN alrededor de las mismas) con una configuración más abierta que

permite el acceso de factores de transcripción. Por el contrario, las islas CpGs

metiladas presentan nucleosomas más compactos que no permiten el acceso

de estos factores (Baylin, 2005) (Figura 10).

Figura 10. Silenciamiento epigenético. Esquema de algunos procesos moleculares que

ocurren en los promotores ricos en CpGs sometidos a silenciamiento epigenético en células

Introducción

cancerígenas. La imagen superior representa la estructura abierta de la cromatina de genes

transcripcionalmente activos con nucleosomas espaciados. En la imagen superior se observan

nucleosomas compactos y, por tanto, un silenciamiento epigenético. Los óvalos de colores

representan las diferentes proteínas que participan (factores de transcripción, histonas

acetiltransferasas, histonas deacetilasas, ADN metiltransferasas, etc). Los dinucleótidos CpG

aparecen en la imagen como círculos unidos al ADN (línea negra que envuelve a los

nucleosomas). Estos cícurlos pueden ser verdes si no están metilados, o rojos si lo están.

Se ha observado, además, otro proceso mediado por proteínas de la

familia TET (ten-eleven translocation family protein) que reconocen citosinas

metiladas y las oxidan a 5-hmC (5-hidroximetilcitosinas). No se conoce

totalmente el papel de estas 5-hmC, pero parecen estar involucradas en la

activación de la desmetilación del ADN y, por tanto, en la activación de

expresión génica (Malzkorn, Wolter, Riemenschneider, & Reifenberger, 2011).

1.5.2. MODIFICACIÓN DE HISTONAS

Las histonas (H2A, H2B, H3 y H4) asociadas como octámeros con el

ADN para formar el nucleosoma, pueden sufrir modificaciones post-

transcripcionales mediante diferentes procesos: acetilación, metilación,

fosforilación, ubiquitinación y otros. La combinación de todos estos procesos

tiene como resultado final la regulación de la expresión génica.

1.5.3. ARN NO CODIFICANTE

Análisis transcriptómicos recientes han revelado que más del 90% del

genoma humano se transcribe, y esta transcripción no se limita a regiones

codificantes de proteínas. La expresión de ARNs no codificantes parece estar

asociada con modificadores epigenéticos mediante la interacción directa o

mediante la regulación post-transcripcional de los mismos. Estos ARNs no

codificantes no sólo están implicados en la diferenciación celular y proliferación,

66

Introducción

sino que también tienen funciones oncogénicas o supresoras de tumores en

muchos tipos de cáncer (Kondo, Katsushima, Ohka, Natsume, & Shinjo, 2014).

1.6. MARCADORES MOLECULARES (BIOMARCADORES) EN GLIOMAS

El desarrollo de una medicina personalizada va a permitir una mejora en la

eficacia de los programas de tratamiento en los pacientes con cáncer. La

medicina personalizada se basa en biomarcadores que muestran sensibilidad y

especificidad para el diagnóstico, pronóstico y predicción de la respuesta a

terapias. Un marcador puede ser un patrón proteómico y genético, una proteína

o gen individual, una irregularidad cromosómica, un patrón epigenético, un

microARN anormal o un cambio en la imagen tomada por RMN, PET u otra

técnica de neuroimagen (Kerrie L. McDonald 2011). Dentro de los marcadores

moleculares cabe distinguir varios tipos (Riemenschneider, 2010):

Biomarcador diagnóstico: debe permitir una clasificación de los tumores

con utilidad clínica.

Biomarcador pronóstico: debe proporcionar información relevante sobre

la supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global

independientemente del tratamiento recibido o, incluso, en ausencia de

tratamiento.

Biomarcador predictivo: debe proporcionar información importante sobre

la respuesta a un determinado tratamiento.

Además de las alteraciones genéticas descritas en el apartado anterior,

existen una serie de marcadores moleculares relevantes en gliomas.

1.6.1. TP53 y ki67

En los tumores astrocíticos, la mutación en TP53 está entre los eventos

más frecuentes y tempranos durante la transformación maligna. Las

mutaciones en este gen favorecen la tumorigénesis a través de la pérdida de la

67

Introducción

sino que también tienen funciones oncogénicas o supresoras de tumores en

muchos tipos de cáncer (Kondo, Katsushima, Ohka, Natsume, & Shinjo, 2014).

1.6. MARCADORES MOLECULARES (BIOMARCADORES) EN GLIOMAS

El desarrollo de una medicina personalizada va a permitir una mejora en la

eficacia de los programas de tratamiento en los pacientes con cáncer. La

medicina personalizada se basa en biomarcadores que muestran sensibilidad y

especificidad para el diagnóstico, pronóstico y predicción de la respuesta a

terapias. Un marcador puede ser un patrón proteómico y genético, una proteína

o gen individual, una irregularidad cromosómica, un patrón epigenético, un

microARN anormal o un cambio en la imagen tomada por RMN, PET u otra

técnica de neuroimagen (Kerrie L. McDonald 2011). Dentro de los marcadores

moleculares cabe distinguir varios tipos (Riemenschneider, 2010):

Biomarcador diagnóstico: debe permitir una clasificación de los tumores

con utilidad clínica.

Biomarcador pronóstico: debe proporcionar información relevante sobre

la supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global

independientemente del tratamiento recibido o, incluso, en ausencia de

tratamiento.

Biomarcador predictivo: debe proporcionar información importante sobre

la respuesta a un determinado tratamiento.

Además de las alteraciones genéticas descritas en el apartado anterior,

existen una serie de marcadores moleculares relevantes en gliomas.

1.6.1. TP53 y ki67

En los tumores astrocíticos, la mutación en TP53 está entre los eventos

más frecuentes y tempranos durante la transformación maligna. Las

mutaciones en este gen favorecen la tumorigénesis a través de la pérdida de la

Introducción

capacidad de inducir la apoptosis (Sarkar, et al., 2005). Una de las técnicas

empleadas para determinar las mutaciones en TP53 en estos tumores es la

IHQ (inmunohistoquímica). El resultado negativo de esta técnica es indicativo

de p53 funcional, mientras que la detección por inmunotinción de la proteína

indica que p53 no es funcional y, por tanto, que se encuentra mutado. Esto se

debe a que dichas mutaciones anulan la función normal de p53 en el ciclo

celular, aumentando la estabilidad y, por tanto, la vida media de la molécula, lo

que provoca una acumulación de la misma (Royds & Iacopetta, 2006; Sarkar,

et al., 2005). Sin embargo, hay que tener en cuenta que no siempre un

resultado negativo por IHQ es indicativo de que no hay mutación, en algunos

casos puede existir una deleción del gen o una mutación diferente a la

mutación para la cual está diseñado el anticuerpo de la IHQ.

La acitividad proliferativa de los tumores puede ser evaluada por medio

de la IHQ de ki67 (MIB1, mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1). Burguer y

col. fueron los primeros en demostrar una asociación entre la inmunopositividad

de ki67 y el grado tumoral en muestras de astrocitomas (Burger, Shibata, &

Kleihues, 1986). La clasificación de la OMS de 2007 (D. Louis, et al., 2007)

incluye a ki67 como herramienta adicional para el tipificado histológico.

Varios estudios han demostrado una correlación entre el incremento de

expresión de ki67 y p53 y un peor pronóstico (Cunningham, et al., 1997; Jaros,

et al., 1992; Johannessen & Torp, 2006).

1.6.2. CODELECIÓN DE LOS BRAZOS CROMOSÓMICOS 1p/19q Una característica de los OD a nivel molecular es la codeleción de los

brazos cromosómicos 1p/19q (Kerrie L. McDonald 2011). Se observa en un 80-

90% de OD de grado II, en un 60% de OD de grado III, en un 30-50% de OA de

grado II, en un 20-30% de OA de grado III y en menos de un 10% de

astrocitomas (incluyendo GBM) (Riemenschneider, 2010).

68

Introducción

El hecho de que la pérdida combinada de 1p/19q en los gliomas es

específica de los OD, indica su utilidad como marcador diagnóstico (Aldape,

Burger, & Perry, 2007).

La translocación no recíproca t(1;19)(q10;p10), descrita por Jenkins y col

en 2006, explica el hecho de que la pérdida de ambos brazos cromosómicos

sea total en la mayoría de los casos (R. B. Jenkins, et al., 2006). Esta

translocación origina un cromosoma derivado con las regiones 1p/19q que se

pierde en la siguiente división celular y un cromosoma derivado con las

regiones 1q/19p que se conserva durante la replicación (G. Cairncross &

Jenkins, 2008; Franco-Hernandez, et al., 2009). Sin embargo, también se ha

observado una pérdida parcial del brazo 1p en algunos casos, preferentemente

en astrocitomas (Blesa, et al., 2009).

En 1998, Cairncross y col, fueron los primeros en demostrar que, tanto la

pérdida de 1p como la pérdida combinada de 1p y 19q, predice una mejor

respuesta a la QT con PCV (Procarbazine-Lomustine-Vincristine) y mayor

supervivencia en los pacientes con OD (J. G. Cairncross, et al., 1998). A partir

de este trabajo, se han realizado numerosos estudios y ensayos clínicos que

demuestran que la codeleción 1p/19q es un marcador pronóstico y predictivo

de respuesta, no sólo a PCV, si no a otros tipos de QT y RT (Gupta & Salunke,

2012; Nikiforova & Hamilton, 2011).

Las técnicas más empleadas para determinar esta alteración son: FISH

(Fluorescence in situ hybridization), LOH (loss of heterocygosity) y MLPA

(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) (Franco-Hernandez, et al.,

2009; Robert B. Jenkins, et al., 2006; J. Jeuken, Cornelissen, Boots-Sprenger,

Gijsen, & Wesseling, 2006).

1.6.3. MUTACIONES EN LOS GENES IDH1/IDH2

Los genes IDH1 e IDH2 codifican proteínas implicadas en la conversión

de citrato a α-KG (α-cetoglutarato) en el ciclo de Krebs. Estas proteínas se

clasifican en dos grupos: las que utilizan NAD(+) (nicotinamida adenina

69

Introducción

El hecho de que la pérdida combinada de 1p/19q en los gliomas es

específica de los OD, indica su utilidad como marcador diagnóstico (Aldape,

Burger, & Perry, 2007).

La translocación no recíproca t(1;19)(q10;p10), descrita por Jenkins y col

en 2006, explica el hecho de que la pérdida de ambos brazos cromosómicos

sea total en la mayoría de los casos (R. B. Jenkins, et al., 2006). Esta

translocación origina un cromosoma derivado con las regiones 1p/19q que se

pierde en la siguiente división celular y un cromosoma derivado con las

regiones 1q/19p que se conserva durante la replicación (G. Cairncross &

Jenkins, 2008; Franco-Hernandez, et al., 2009). Sin embargo, también se ha

observado una pérdida parcial del brazo 1p en algunos casos, preferentemente

en astrocitomas (Blesa, et al., 2009).

En 1998, Cairncross y col, fueron los primeros en demostrar que, tanto la

pérdida de 1p como la pérdida combinada de 1p y 19q, predice una mejor

respuesta a la QT con PCV (Procarbazine-Lomustine-Vincristine) y mayor

supervivencia en los pacientes con OD (J. G. Cairncross, et al., 1998). A partir

de este trabajo, se han realizado numerosos estudios y ensayos clínicos que

demuestran que la codeleción 1p/19q es un marcador pronóstico y predictivo

de respuesta, no sólo a PCV, si no a otros tipos de QT y RT (Gupta & Salunke,

2012; Nikiforova & Hamilton, 2011).

Las técnicas más empleadas para determinar esta alteración son: FISH

(Fluorescence in situ hybridization), LOH (loss of heterocygosity) y MLPA

(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) (Franco-Hernandez, et al.,

2009; Robert B. Jenkins, et al., 2006; J. Jeuken, Cornelissen, Boots-Sprenger,

Gijsen, & Wesseling, 2006).

1.6.3. MUTACIONES EN LOS GENES IDH1/IDH2

Los genes IDH1 e IDH2 codifican proteínas implicadas en la conversión

de citrato a α-KG (α-cetoglutarato) en el ciclo de Krebs. Estas proteínas se

clasifican en dos grupos: las que utilizan NAD(+) (nicotinamida adenina

Introducción

dinucleótido) como aceptor de electrones y las que utilizan NADP(+)

(nicotinamida adenina dinucleótido fosfato).

La proteína codificada por IDH1 es la isocitrato deshidrogenasa

dependiente de NADP(+) citosólica, mientras que la proteína codificada por

IDH2 es la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP(+) mitocondrial.

Ambas proteínas están involucradas en diferentes procesos como la síntesis

lipídica, defensa celular contra el estrés oxidativo, respiración oxidativa y

transducción de señales.

En 2008, Parsons y col, identificaron una mutación en IDH1 mediante un

análisis genómico de GBM. Además observaron una asociación entre los GBM

que presentaban esta mutación y edad más joven de los pacientes, GBM

secundarios y mayor supervivencia (Parsons, et al., 2008). Posteriormente, se

descubrió la mutación en IDH2 (H. Yan, et al., 2009).

El gen IDH1, localizado en 2q33.3, es un gen de aproximadamente 19 kb

(kilobases) cuyo ARNm (ARN mensajero), con 10 exones, codifica una proteína

de 414 aminoácidos. La proteína activa es un homodímero que se localiza en el

citoplasma y en los peroxisomas. En el residuo 132 de la proteína, que

corresponde a una arginina (R132) altamente conservada en todas las

especies, se han descrito varias mutaciones que afectan a su función (Tabla 2).

De todas las mutaciones observadas, la más frecuente produce un cambio de

arginina a histidina en el residuo 132 (R132H) (Parsons, et al., 2008).

70

Introducción

Tabla 2. Mutaciones en IDH1. En la primera columna están indicados los cambios

nucleotídicos que generan el cambio de aminoácido en IDH1; en la segunda, los cambios de

aminoácido; en la tercera, el porcentaje de mutaciones de cada tipo respecto al total de

mutaciones descritas (Balss, et al., 2008).

Cambio nucleótido Cambio aminoácido N(%)

G395A R132H 92,7

C394T R132C 3,6

C394A R132S 1,8

C394G R132G 0,9

G395T R132L 0,5

C394G G395T R132V 0,5

El gen IDH2, localizado en 15q26.1, tiene un tamaño aproximado de

18Kb cuyo ARNm, con 11 exones, codifica una proteína de 452 aminoácidos.

La proteína activa es un homodímero que se localiza en las mitocondrias. En el

residuo 172, homólogo de la R132 de IDH1, también se han descrito varias

mutaciones que afectan a su función del mismo modo que en IDH1 (Tabla 3).




mutaciones descritas.

(https://www.mycancergenome.org/content/disease/glioma/idh2/).

Cambio nucleótido Cambio aminoácido N (%)

G515A R172K 58.2

G515T R172M 19.1

A514T R172W 8.2

G516C/T R172S 3.6

A514G R172G 2.7

71

Introducción




mutaciones descritas (Balss, et al., 2008).

Cambio nucleótido Cambio aminoácido N(%)

G395A R132H 92,7

C394T R132C 3,6

C394A R132S 1,8

C394G R132G 0,9

G395T R132L 0,5

C394G G395T R132V 0,5

El gen IDH2, localizado en 15q26.1, tiene un tamaño aproximado de

18Kb cuyo ARNm, con 11 exones, codifica una proteína de 452 aminoácidos.

La proteína activa es un homodímero que se localiza en las mitocondrias. En el

residuo 172, homólogo de la R132 de IDH1, también se han descrito varias

mutaciones que afectan a su función del mismo modo que en IDH1 (Tabla 3).




mutaciones descritas.

(https://www.mycancergenome.org/content/disease/glioma/idh2/).

Cambio nucleótido Cambio aminoácido N (%)

G515A R172K 58.2

G515T R172M 19.1

A514T R172W 8.2

G516C/T R172S 3.6

A514G R172G 2.7

Introducción

Estas mutaciones llevan a la reducción de la afinidad de la enzima por el

isocitrato y el aumento de la afinidad por α-KG. Esto da lugar a la ganancia de

función en la actividad catalítica para producir el oncometabolito 2-HG (2-

hidroxiglutarato), en lugar de α-KG, cuyo exceso contribuye al desarrollo y

progresión maligna de los gliomas (Figura 11) (Dang, et al., 2009; Xu, et al.,

2011). En un primer momento se pensó que los genes IDH1/2 eran supresores

tumorales (Zhao, et al., 2009). El hecho de que esta mutación ocurra en un

residuo específico y sólo en un alelo (efecto dominante) y el descubrimiento de

la nueva función de producción de 2-HG (Dang, et al., 2009), hicieron que se

replantearan la hipótesis anterior y comenzaron a considerarse estos genes

como oncogenes.

Figura 11. Localización y función de las enzimas IDH1 e IDH2. Las enzimas IDH1 e IDH2

catalizan la conversión del isocitrato del ciclo de Krebs (o ciclo de los ácidos tricarboxílicos) en

α-KG. Cuando la enzima está mutada adquiere otra función nueva, la de convertir el α-KG en 2-

HG. La acumulación de este nuevo compuesto parece estar implicada en la tumorigénesis

(Prensner & Chinnaiyan, 2011).

72

Introducción

Las mutaciones en IDH1 se observan mayoritariamente en AII, AIII y en

GBM secundarios (50-93%). Las mutaciones en IDH2 son mucho menos

frecuentes. Ambas mutaciones son raras en GBM primarios. Entre un 70-80%

de los OD y OA de grado II y III presentan mutaciones en IDH1 (Appin & Brat,

2014; Nikiforova & Hamilton, 2011). Esto sugiere que las mutaciones en IDH no

ocurren durante la progresión tumoral, si no en las fases iniciales de la

tumorigénesis y que podrían producirse en las células gliales precursoras de

astrocitos y oligodendrocitos (Ichimura, 2012; Ichimura, et al., 2009).

En 2009, Yan y col. observaron que los pacientes con mutaciones en

IDH tenían una mayor supervivencia en comparación con aquellos pacientes

con IDH normal (Figura 12) (H. Yan, et al., 2009).

Figura 12. Supervivencia en gliomas de alto grado con y sin mutaciones en IDH1 e IDH2.

La imagen muestra las gráficas de supervivencia de pacientes con GBM y AIII con y sin

mutación en los genes IDH. En ambos tipos de glioma se observa un aumento significativo de

la supervivencia media cuando los genes están mutados (en GBM se duplica y en AIII se

triplica) (H. Yan, et al., 2009).

Se han realizado numerosos estudios que han corroborado el papel

como marcador pronóstico de las mutaciones en IDH (Christensen, et al., 2011;

Hartmann, et al., 2011; Houillier, et al., 2010; Sanson, et al., 2009; von

Deimling, Korshunov, & Hartmann, 2011). Las mutaciones en IDH1/2 no se

73

Introducción

Las mutaciones en IDH1 se observan mayoritariamente en AII, AIII y en

GBM secundarios (50-93%). Las mutaciones en IDH2 son mucho menos

frecuentes. Ambas mutaciones son raras en GBM primarios. Entre un 70-80%

de los OD y OA de grado II y III presentan mutaciones en IDH1 (Appin & Brat,

2014; Nikiforova & Hamilton, 2011). Esto sugiere que las mutaciones en IDH no

ocurren durante la progresión tumoral, si no en las fases iniciales de la

tumorigénesis y que podrían producirse en las células gliales precursoras de

astrocitos y oligodendrocitos (Ichimura, 2012; Ichimura, et al., 2009).

En 2009, Yan y col. observaron que los pacientes con mutaciones en

IDH tenían una mayor supervivencia en comparación con aquellos pacientes

con IDH normal (Figura 12) (H. Yan, et al., 2009).

Figura 12. Supervivencia en gliomas de alto grado con y sin mutaciones en IDH1 e IDH2.

La imagen muestra las gráficas de supervivencia de pacientes con GBM y AIII con y sin

mutación en los genes IDH. En ambos tipos de glioma se observa un aumento significativo de

la supervivencia media cuando los genes están mutados (en GBM se duplica y en AIII se

triplica) (H. Yan, et al., 2009).

Se han realizado numerosos estudios que han corroborado el papel

como marcador pronóstico de las mutaciones en IDH (Christensen, et al., 2011;

Hartmann, et al., 2011; Houillier, et al., 2010; Sanson, et al., 2009; von

Deimling, Korshunov, & Hartmann, 2011). Las mutaciones en IDH1/2 no se

Introducción

encuentran en condiciones no neoplásicas que pueden imitar histológicamente

a los gliomas (gliosis reactiva, infecciones virales, etc), lo que permite el

diagnóstico diferencial con estas lesiones (Nikiforova & Hamilton, 2011).

Además, el estado mutacional de IDH1/2 puede ayudar a diferenciar entre

GBM primarios y GBM secundarios (Gupta & Salunke, 2012).

El papel temprano de las mutaciones en IDH en la transformación

neoplásica ha llevado al desarrollo de inhibidores específicos de IDH mutado

(Rohle, et al., 2013). IDH podría, por tanto, asumir un papel adicional como

biomarcador predictivo (Haynes, Camelo-Piragua, & Kurian, 2014).

La secuenciación Sanger es el método de detección de estas

mutaciones más comúnmente utilizado. Otra estrategia es la pirosecuenciación,

que tiene más sensibilidad que la secuenciación. Una técnica más nueva es la

amplificación por PCR (Polymerase Chain Reaction) a tiempo real y análisis de

la curva de fusión. A través de la IHQ también es posible detectar la mutación

R132H de IDH1 mediante un anticuerpo monoclonal específico que presenta

una sensibilidad y especificidad del 100% (Capper, Zentgraf, Balss, Hartmann,

& von Deimling, 2009; Y. Kato, et al., 2009; Nikiforova & Hamilton, 2011). La

IHQ puede ser usada como parte del examen histopatológico de rutina y es

particularmente útil para identificar el margen tumoral y, de esta forma, poder

estimar la extensión de la invasión (Ichimura, 2012).

Por último, también es posible detectar el oncometabolito 2-HG mediante

resonancia magnética espectroscópica del cerebro (Pope, et al., 2012) (Choi, et

al., 2012).

1.6.4. METILACIÓN DEL GEN MGMT

El gen MGMT (O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase), localizado en

la región cromosómica 10q26, se expande en 300Kb mientras que el ARNm es

poco mayor que 1Kb. Este gen codifica la proteína agt (O6-alkylguanine-

alkyltransferase) (Figura 13). La proteína tiene como principal función la

eliminación de grupos alquilo de la posición O6 de la guanina en el ADN y es

74

Introducción

expresada constitutivamente en todas la células del organismo, aunque con

diferentes niveles en función del tejido. Aunque elimina grupos alquilo en

general, elimina preferentemente la metilguanina por ser el grupo alquilo de

menor tamaño.

Figura 13. Representación esquemática de la estructura lineal del ARNm del gen MGMT (en azul) y de la proteína agt (en verde). El ARNm, de 1265 pb, está formado por 5 exones.

La proteína, de 238 aminoácidos, muestra (en una región ampliada) el sitio activo (formado por

5 aminoácidos representados por los bloques negros, entre los que se encuentra la cisteína

aceptora del grupo alquilo que se elimina del ADN) y la región de unión al ADN (formada por 15

aminoácidos).

Lawley y Brookes fueron los pioneros en los años 60 en los estudios que

mostraron que los agentes alquilantes están implicados en la etiología del

cáncer (Brookes & Lawley, 1960). Durante las décadas siguientes se llevaron a

cabo varios estudios que demostraron un efecto carcinogénico y mutagénico de

la O6mG (Goth & Rajewsky, 1974; Kleihues & Margison, 1974; Loechler, Green,

& Essigmann, 1984; Loveless, 1969).

La actividad de la proteína codificada por el gen MGMT fue descubierta

por Foote y col en 1980 (Foote, Mitra, & Pal, 1980). Unos años más tarde se

descubrió, primero en la proteína homóloga en Escherichia Coli (Demple, et al.,

1985) y posteriormente en la proteína humana (Tano, Shiota, Collier, Foote, &

Mitra, 1990), que la eliminación de los grupos alquilo se lleva a cabo mediante

la transferencia de los mismos a una cisteína interna de la propia proteína.

75

Introducción

expresada constitutivamente en todas la células del organismo, aunque con

diferentes niveles en función del tejido. Aunque elimina grupos alquilo en

general, elimina preferentemente la metilguanina por ser el grupo alquilo de

menor tamaño.

Figura 13. Representación esquemática de la estructura lineal del ARNm del gen MGMT (en azul) y de la proteína agt (en verde). El ARNm, de 1265 pb, está formado por 5 exones.

La proteína, de 238 aminoácidos, muestra (en una región ampliada) el sitio activo (formado por

5 aminoácidos representados por los bloques negros, entre los que se encuentra la cisteína

aceptora del grupo alquilo que se elimina del ADN) y la región de unión al ADN (formada por 15

aminoácidos).

Lawley y Brookes fueron los pioneros en los años 60 en los estudios que

mostraron que los agentes alquilantes están implicados en la etiología del

cáncer (Brookes & Lawley, 1960). Durante las décadas siguientes se llevaron a

cabo varios estudios que demostraron un efecto carcinogénico y mutagénico de

la O6mG (Goth & Rajewsky, 1974; Kleihues & Margison, 1974; Loechler, Green,

& Essigmann, 1984; Loveless, 1969).

La actividad de la proteína codificada por el gen MGMT fue descubierta

por Foote y col en 1980 (Foote, Mitra, & Pal, 1980). Unos años más tarde se

descubrió, primero en la proteína homóloga en Escherichia Coli (Demple, et al.,

1985) y posteriormente en la proteína humana (Tano, Shiota, Collier, Foote, &

Mitra, 1990), que la eliminación de los grupos alquilo se lleva a cabo mediante

la transferencia de los mismos a una cisteína interna de la propia proteína.

Introducción

La expresión de MGMT protege a las células del efecto tóxico y

carcinogénico de los agentes alquilantes. La pérdida de expresión de MGMT

está frecuentemente asociada a silenciamiento transcripcional del gen MGMT

por metilación de islas CpG del promotor (Costello, Futscher, Kroes, & Pieper,

1994; Qian & Brent, 1997; von Wronski & Brent, 1994). Esta alteración se ha

descrito en varias neoplasias (Esteller et al, 1999) y se ha postulado que la

frecuencia de hipermetilación en la región promotora de MGMT se encuentra

entre el 35-73% en GBM, entre un 50-84% en AIII y entre un 43-93% en AII

(von Deimling, et al., 2011).

Como se ha comentado anteriormente, la TMZ es un fármaco alquilante

que se usa en QT y la expresión de MGMT es un factor clave que confiere

resistencia a este tipo de fármacos. Esto ocurre porque la TMZ actúa dañando

el ADN mediante la incorporación de residuos alquilo, mientras que el MGMT

revierte este proceso (Figura 14). Las células tumorales que expresan MGMT

muestran resistencia a este tipo de fármacos (Pegg, 1990). Hegi y col (Hegi, et

al., 2005) demuestran en su estudio que pacientes cuyos tumores no

mostraban expresión de MGMT por metilación del promotor tenían una mayor

supervivencia tras el tratamiento combinado de TMZ y RT. Otros estudios han

corroborado estas conclusiones (Esteller, et al., 2000; Esteller & Herman, 2004;

Ohgaki & Kleihues, 2009; Riemenschneider, 2010)Kerrie L. McDonald 2011).

Figura 14. Mecanismo de reparación de MGMT. La TMZ actúa dañando el ADN mediante la

incorporación de residuos alquilo en la posición O6 de la guanina. El gen MGMT revierte la

76

Introducción

formación de aductos en dicha posición ya que transfiere los residuos alquilo de forma

irreversible a una cisteína interna de su centro activo. Una vez que la proteína ha realizado su

función queda inactiva y es marcada por ubiquitinación para ser degradada por el complejo del

proteasoma (Martinez, 2012).

Existe, sin embargo, controversia sobre el valor pronóstico de este

biomarcador. Mientras que algunos estudios demuestran que la metilación de

MGMT en GBM por sí sola es un factor de buen pronóstico (Hegi, et al., 2005;

Mellai, et al., 2012; Nikiforova & Hamilton, 2011), Esteller y col no apoyan dicha

hipótesis (Esteller, et al., 2000; Esteller & Herman, 2004). Además, en algunos

casos que no presentaban metilación en MGMT también se ha observado una

prolongación en la supervivencia, lo que indica que existen otros factores que

confieren un pronóstico favorable (D. Krex, et al., 2007; Murat, et al., 2008;

Rivera, et al., 2010).

Otro enfoque del tratamiento en estos pacientes se basa en la

disminución de los niveles de MGMT (Fan, et al., 2013; Quinn, et al., 2005;

Quinn, et al., 2002). En un estudio realizado por Ryu y col (Ryu, et al., 2012)

tratan líneas celulares tumorales con VPA (valproic acid), fármaco

anticancerígeno cuya función es la inhibición de las histonas deacetilasas que

son encargadas de la remodelación de la cromatina, y TMZ. Este tratamiento

combinado, tanto in vitro como in vivo en ratones, tiene efectos anticancerosos

en células resistentes a TMZ a través de la regulación de la expresión del gen

MGMT.

A la hora de detectar la metilación de MGMT se emplean diferentes

técnicas como la MS-PCR (Methylation-specific PCR) o la SQ-MSP

(Semiquantitative-specific PCR), ambas técnicas son específicamente

recomendadas para tejido FPPE (Formalin-fixed, paraffin-embedded). Otro

método utilizado es la pirosecuanciación, en un estudio realizado por Karayan-

Tapon y col (Karayan-Tapon, et al., 2010) determinan que esta técnica tiene un

mejor valor predictivo cuando la comparan con otras metodologías. La técnica

MS-MLPA (Methylation-specific MLPA) da información semicuantitativa del

porcentaje de metilación del ADN, por tanto, es otra técnica que establece la

77

Introducción

formación de aductos en dicha posición ya que transfiere los residuos alquilo de forma

irreversible a una cisteína interna de su centro activo. Una vez que la proteína ha realizado su

función queda inactiva y es marcada por ubiquitinación para ser degradada por el complejo del

proteasoma (Martinez, 2012).

Existe, sin embargo, controversia sobre el valor pronóstico de este

biomarcador. Mientras que algunos estudios demuestran que la metilación de

MGMT en GBM por sí sola es un factor de buen pronóstico (Hegi, et al., 2005;

Mellai, et al., 2012; Nikiforova & Hamilton, 2011), Esteller y col no apoyan dicha

hipótesis (Esteller, et al., 2000; Esteller & Herman, 2004). Además, en algunos

casos que no presentaban metilación en MGMT también se ha observado una

prolongación en la supervivencia, lo que indica que existen otros factores que

confieren un pronóstico favorable (D. Krex, et al., 2007; Murat, et al., 2008;

Rivera, et al., 2010).

Otro enfoque del tratamiento en estos pacientes se basa en la

disminución de los niveles de MGMT (Fan, et al., 2013; Quinn, et al., 2005;

Quinn, et al., 2002). En un estudio realizado por Ryu y col (Ryu, et al., 2012)

tratan líneas celulares tumorales con VPA (valproic acid), fármaco

anticancerígeno cuya función es la inhibición de las histonas deacetilasas que

son encargadas de la remodelación de la cromatina, y TMZ. Este tratamiento

combinado, tanto in vitro como in vivo en ratones, tiene efectos anticancerosos

en células resistentes a TMZ a través de la regulación de la expresión del gen

MGMT.

A la hora de detectar la metilación de MGMT se emplean diferentes

técnicas como la MS-PCR (Methylation-specific PCR) o la SQ-MSP

(Semiquantitative-specific PCR), ambas técnicas son específicamente

recomendadas para tejido FPPE (Formalin-fixed, paraffin-embedded). Otro

método utilizado es la pirosecuanciación, en un estudio realizado por Karayan-

Tapon y col (Karayan-Tapon, et al., 2010) determinan que esta técnica tiene un

mejor valor predictivo cuando la comparan con otras metodologías. La técnica

MS-MLPA (Methylation-specific MLPA) da información semicuantitativa del

porcentaje de metilación del ADN, por tanto, es otra técnica que establece la

Introducción

metilación de MGMT (J. W. Jeuken, et al., 2007; C.-K. Park, et al., 2011;

Riemenschneider, 2010).

A pesar de que existe una cierta asociación entre la metilación de MGMT

y una disminución de la expresión, esta asociación no es absoluta (Everhard, et

al., 2009). Algunos estudios en gliomas muestran que no existe correlación

entre la metilación del promotor de MGMT y la expresión de proteína detectada

por IHQ (Cao, et al., 2009; Hawkins, et al., 2009; Mellai, et al., 2009; Preusser,

et al., 2008). Malley y col (Malley, et al., 2011) llevaron a cabo un estudio en el

que delimitan dos regiones en el promotor de MGMT según los niveles de

metilación de cada sitio CpG: la DMR1 (Differentially Methylated Region 1) y la

DMR2 (Differentially Methylated Region 2). Ambas eran las regiones que mejor

correlacionaban con la expresión. DMR2 siempre aparecía metilada en las

líneas celulares tumorales de GBM cuando DMR1 también lo estaba. Los

resultados de este estudio indican que algunos sitios CpG en DMR2 juegan un

papel crítico en el control de la transcripción de MGMT. Por tanto, la región

DMR2 es un objetivo importante a la hora de establecer la metilación de MGMT

(Figura 15).

Figura 15. Representación de las regiones DMR1 y DMR2 y el nivel de metilación (%) de cada sitio CpG analizado (Malley, et al., 2011).

No todos los pacientes con metilación en MGMT responden igual al

tratamiento con TMZ, además, algunos pacientes cuyos tumores no están

78

Introducción

metilados en MGMT experimentan un sorprendente curso favorable de la

enfermedad. Esto podría ser explicado por las relaciones discordantes entre la

metilación y el patrón de expresión del ARNm, aunque estos mecanismos no

están claros. Se ha hipotetizado que la combinación de baja expresión y no

metilación del gen podría ser resultado de la desestabilización del transcrito y/o

factores de represión de la transcripción, como la regulación de miARN

(microARN) o modificación de histonas (Thon, Kreth, & Kreth, 2013).

1.6.5. FENOTIPO HIPERMETILADOR EN ISLAS CpG EN GLIOMAS

La metilación de los promotores de genes supresores de tumor es un

fenómeno frecuente en todos los tipos de cáncer (Esteller, 2008; Taby & Issa,

2010). El ADN puede estar metilado en la posición 5’ de las citosinas,

frecuentemente en los dinucleótidos citosina-guanina. Las islas CpG se

caracterizan por contener una gran cantidad de sitios CG. Estas islas CpG se

localizan en regiones cortas del ADN en más de la mitad de las regiones

promotoras de los genes humanos (Doi, et al., 2009; Malzkorn, et al., 2011; Y.

Wang & Leung, 2004). Cuando los tumores muestran un aumento global en la

metilación del ADN en estas islas CpG, se dicen que presentan fenotipo

metilador o CIMP (CpG Island Methylator Phenotype) (Noushmehr, et al.,

2010). La hipermetilación en islas CpG es un evento epigenético común en

algunos cánceres humanos (Cecener, et al., 2012). En el cáncer colorrectal, los

marcadores para definir el fenotipo metilador están bien establecidos (Toyota,

et al., 1999), mientras que en los gliomas no hay nada claro ni definitivo, de

momento, si bien diferentes estudios han propuesto diferentes perfiles de

marcadores mostrando potenciales utilidades como marcadores diagnósticos,

pronósticos y de predicción de respuesta a tratamientos.

Varios métodos se emplean para la detección de la metilación en genes

(Malzkorn, et al., 2011). Entre ellos se encuentra el método basado en el

tratamiento del ADN con bisulfito de sodio que convierte las citosinas no

metiladas en uracilos, mientras que las citosinas metiladas permanecen

inalteradas. El ADN modificado se analiza, posteriormente, mediante diferentes

técnicas como la MS-PCR (Herman, Graff, Myohanen, Nelkin, & Baylin, 1996),

79

Introducción

metilados en MGMT experimentan un sorprendente curso favorable de la

enfermedad. Esto podría ser explicado por las relaciones discordantes entre la

metilación y el patrón de expresión del ARNm, aunque estos mecanismos no

están claros. Se ha hipotetizado que la combinación de baja expresión y no

metilación del gen podría ser resultado de la desestabilización del transcrito y/o

factores de represión de la transcripción, como la regulación de miARN

(microARN) o modificación de histonas (Thon, Kreth, & Kreth, 2013).

1.6.5. FENOTIPO HIPERMETILADOR EN ISLAS CpG EN GLIOMAS

La metilación de los promotores de genes supresores de tumor es un

fenómeno frecuente en todos los tipos de cáncer (Esteller, 2008; Taby & Issa,

2010). El ADN puede estar metilado en la posición 5’ de las citosinas,

frecuentemente en los dinucleótidos citosina-guanina. Las islas CpG se

caracterizan por contener una gran cantidad de sitios CG. Estas islas CpG se

localizan en regiones cortas del ADN en más de la mitad de las regiones

promotoras de los genes humanos (Doi, et al., 2009; Malzkorn, et al., 2011; Y.

Wang & Leung, 2004). Cuando los tumores muestran un aumento global en la

metilación del ADN en estas islas CpG, se dicen que presentan fenotipo

metilador o CIMP (CpG Island Methylator Phenotype) (Noushmehr, et al.,

2010). La hipermetilación en islas CpG es un evento epigenético común en

algunos cánceres humanos (Cecener, et al., 2012). En el cáncer colorrectal, los

marcadores para definir el fenotipo metilador están bien establecidos (Toyota,

et al., 1999), mientras que en los gliomas no hay nada claro ni definitivo, de

momento, si bien diferentes estudios han propuesto diferentes perfiles de

marcadores mostrando potenciales utilidades como marcadores diagnósticos,

pronósticos y de predicción de respuesta a tratamientos.

Varios métodos se emplean para la detección de la metilación en genes

(Malzkorn, et al., 2011). Entre ellos se encuentra el método basado en el

tratamiento del ADN con bisulfito de sodio que convierte las citosinas no

metiladas en uracilos, mientras que las citosinas metiladas permanecen

inalteradas. El ADN modificado se analiza, posteriormente, mediante diferentes

técnicas como la MS-PCR (Herman, Graff, Myohanen, Nelkin, & Baylin, 1996),

Introducción

la PCR a tiempo real basada en la detección fluorescente (MethylLight) (Eads,

et al., 2000), el análisis de restricción con bisulfito combinado (COBRA) (Xiong

& Laird, 1997), la secuenciación o la pirosecuenciación (Frommer, et al., 1992)

y el ensayo EpiTYPER (Agena Bioscience’s DNA methylation analysis

technology) que utiliza la espectofotometría de masas MALDI-TOF (Matrix-

assisted laser desorption/ionization Time Of Flight). Por último, en este estudio

se emplea la técnica MS-MLPA que se describe con más detalle

posteriormente (Apartado de Material y Métodos).

El fenotipo CIMP en gliomas se ha definido en base a análisis a gran

escala, en los que se ha determinado el estado de metilación de miles de

regiones CpG para dividir estos tumores en dos grupos: lo que presentan un

estado de hipermetilación global (CIMP positivos) y los que no (CIMP

negativos) (Laffaire, et al., 2011; Mur, et al., 2015; Noushmehr, et al., 2010;

Turcan, et al., 2012). Los gliomas CIMP positivos presentan una mayor

supervivencia. Además, el fenotipo CIMP no sólo correlaciona con la

supervivencia, también con la metilación de MGMT, con la codeleción de

1p/19q y con las mutaciones en el gen IDH1. El fenotipo CIMP es un factor

pronóstico de supervivencia global fuerte (M. J. van den Bent, et al., 2011). En

gliomas, este fenotipo parece estar correlacionado con mutaciones en el gen

TP53. Los gliomas CIMP positivos suelen ser astrocitomas de grado II y III, y

estos subtipos histológicos presentan un gran porcentaje de mutaciones en

TP53 (Collins, 2004; Noushmehr, et al., 2010). El fenotipo CIMP se ha asociado

con un incremento en la expresión de las DNMTs (Etoh, et al., 2004). Como

resultado, algunos genes involucrados en la iniciación y/o progresión tumoral

están metilados en los tumores CIMP positivos (Teodoridis, Strathdee, &

Brown, 2004; Teodoridis, Strathdee, Plumb, & Brown, 2004). Existe una fuerte

asociación entre el fenotipo CIMP y la metilación en MGMT, lo que sugiere que

dicha alteración epigenética en la región promotora del gen MGMT forma parte

de un perfil más general de metilación del genoma que determina un pronóstico

favorable (M. J. van den Bent, et al., 2011).

Otro estudio identifica dos grupos de gliomas de acuerdo a su perfil de

metilación. Por un lado, un grupo de GBM primarios y, por otro lado, un grupo

80

Introducción

de gliomas de bajo grado y GBM secundarios. Se describe que el perfil de

metilación de los gliomas se mantenía estable a lo largo de la evolución del

tumor. Estudiaron, además, la correlación entre el perfil de metilación y el perfil

de expresión génica. A partir de estos resultados identificaron una serie de

genes que presentan un papel importante en la gliomagénesis (Laffaire, et al.,

2011). Tanto en este estudio como en el estudio realizado por Turcan y col

(Turcan, et al., 2012) demuestran que el fenotipo G-CIMP (CIMP en gliomas)

se asocia a mutaciones en IDH1 y a un mejor pronóstico. Turcan y col

introducen las mutaciones en IDH1 en cultivos primarios de astrocitos humanos

y esto altera específicamente las histonas, induce hipermetilación extensa del

ADN y remodela el metiloma de una forma que refleja los cambios observados

en los gliomas de bajo grado G-CIMP positivos, sugiriendo que las mutaciones

en IDH1 están implicadas en el desarrollo del fenotipo CIMP en gliomas.

Aunque también se ha descrito que no todos los tumores con mutaciones en

IDH1 eran CIMP positivos, lo que indica que las mutaciones en IDH1 no son

determinante exclusivo de este fenotipo (M. J. van den Bent, et al., 2011).

Como se ha comentado anteriormente, IDH1 mutado cataliza la reducción de α-

KG a 2-HG. Este oncometabolito puede afectar a la expresión génica mediante

diferentes mecanismos (Hughes, et al., 2013) (Figura 9):

Mediante la inhibición competitiva de las dioxigenasas dependientes de

α-KG y, por tanto, alterando los niveles de metilación de las histonas.

Mediante la inhibición de las hidroxilasas 5-mC de la familia TET por

competitividad directa con el α-KG, resultando en la acumulación de

5mC que alterará los niveles de expresión de un gran número de genes.

Mediante un mecanismo que altera la expresión de los HIF (Hypoxia-

inducible factor).

La hipermetilación de las islas CpG en la regiones promotoras puede causar

silenciamiento transcripcional de genes supresores de tumores y otros genes

(Baylin, 2008; Rodriguez-Paredes & Esteller, 2011). Sin embargo, no siempre

se produce una disminución de la expresión del gen cuando se encuentra

hipermetilado (Houshdaran, et al., 2010; Noushmehr, et al., 2010; Pike, et al.,

81

Introducción

de gliomas de bajo grado y GBM secundarios. Se describe que el perfil de

metilación de los gliomas se mantenía estable a lo largo de la evolución del

tumor. Estudiaron, además, la correlación entre el perfil de metilación y el perfil

de expresión génica. A partir de estos resultados identificaron una serie de

genes que presentan un papel importante en la gliomagénesis (Laffaire, et al.,

2011). Tanto en este estudio como en el estudio realizado por Turcan y col

(Turcan, et al., 2012) demuestran que el fenotipo G-CIMP (CIMP en gliomas)

se asocia a mutaciones en IDH1 y a un mejor pronóstico. Turcan y col

introducen las mutaciones en IDH1 en cultivos primarios de astrocitos humanos

y esto altera específicamente las histonas, induce hipermetilación extensa del

ADN y remodela el metiloma de una forma que refleja los cambios observados

en los gliomas de bajo grado G-CIMP positivos, sugiriendo que las mutaciones

en IDH1 están implicadas en el desarrollo del fenotipo CIMP en gliomas.

Aunque también se ha descrito que no todos los tumores con mutaciones en

IDH1 eran CIMP positivos, lo que indica que las mutaciones en IDH1 no son

determinante exclusivo de este fenotipo (M. J. van den Bent, et al., 2011).

Como se ha comentado anteriormente, IDH1 mutado cataliza la reducción de α-

KG a 2-HG. Este oncometabolito puede afectar a la expresión génica mediante

diferentes mecanismos (Hughes, et al., 2013) (Figura 9):

Mediante la inhibición competitiva de las dioxigenasas dependientes de

α-KG y, por tanto, alterando los niveles de metilación de las histonas.

Mediante la inhibición de las hidroxilasas 5-mC de la familia TET por

competitividad directa con el α-KG, resultando en la acumulación de

5mC que alterará los niveles de expresión de un gran número de genes.

Mediante un mecanismo que altera la expresión de los HIF (Hypoxia-

inducible factor).

La hipermetilación de las islas CpG en la regiones promotoras puede causar


(Baylin, 2008; Rodriguez-Paredes & Esteller, 2011). Sin embargo, no siempre

se produce una disminución de la expresión del gen cuando se encuentra

hipermetilado (Houshdaran, et al., 2010; Noushmehr, et al., 2010; Pike, et al.,

Introducción

2008). La falta de una relación inversa entre la hipermetilación del promotor y la

expresión génica para muchos genes, puede ser atribuida a varios factores

incluyendo la falta de factores de transcripción adecuados para algunos genes

no metilados y el uso de promotores alternativos para algunos genes con

promotores metilados. En algunos casos como en CDKN2A se ha descrito que

el silenciamiento de la expresión génica por metilación es debido a la

metilación de citosinas específicas y críticas, que pueden no ser

necesariamente interrogadas en el análisis de la metilación, más que la

metilación de amplias regiones. La epigenética, por tanto, controla el potencial

de expresión antes que el estado de expresión (Noushmehr, et al., 2010).

1.6.5.1. SOCS1

El gen SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) está altamente

conservado en muchas especies. Se localiza en el cromosoma 16p13 y

contiene dos exones que se transcriben en 1215 nucleótidos de ARNm que

codifican una proteína de 211 aminoácidos (Yandava, Pillari, & Drazen, 1999).

SOCS1 codifica un miembro de la familia SSI (STAT-induced STAT inhibitor),

también conocido como supresor de la señalización por citoquinas (Figura 16).

Los miembros de la familia SSI son reguladores negativos de la señalización de

citoquinas inducida por citoquinas. La proteína codificada por este gen funciona

aguas abajo de los receptores de citoquinas y participa en un bucle de

retroalimentación negativa para atenuar la señalización de las citoquinas (Sasi,

Sharma, & Mokbel, 2014; J. Zhang, Li, Yu, Wang, & Ren, 2012).

Figura 16. Estructura del gen SOCS1. Presenta un SH2 (Src homology 2), una caja SOCS C-

terminal y una región N-terminal de longitud variable. En esta última región existe una zona de

82

Introducción

12 aminoácidos denominada región inhibidora kinasa (Mallette, Calabrese, Ilangumaran, &

Ferbeyre, 2010).

Las citoquinas se unen a su receptor y lo activan, de manera que la

proteína jak (janus kinase) fosforila el receptor creando un sitio de unión para

las STATs. A continuación, JAK fosforila a las STAT5 (signal transducer and

activator of transcription 5) causando su liberación del receptor, lo que permite

la dimerización y traslocación al núcleo para activar la transcripción de genes

específicos que incluyen miembros de la familia SOCS. El gen SOCS1 inhibe la

señalización por citoquinas mediante cuatro posibles mecanismos: 1)

bloqueando el reclutamiento de las STATs al receptor de citoquinas a través

del enmascaramiento de los sitios de unión de STAT al receptor, 2) reclutando

proteínas para la degradación proteosomal vía ubiquitinación, 3) uniéndose a

las JAKs e inhibiendo sus quinasas o 4) reclutando a las JAKs para su

degradación vía proteosoma (Inagaki-Ohara, Kondo, Ito, & Yoshimura, 2013;

Sasi, et al., 2014) (Figura 17, izquierda). Sin embargo, la activación aberrante

de STAT5 provocada por las kinasas de fusión oncogénicas, como TEL

(telomere elongation)-JAK2, pueden resultar en niveles sostenidos de SOCS1

que pueden activar a la proteína p53 mediante la formación de un complejo con

ATM (ataxia telangiectasia mutated) y p53 (Figura 17, derecha).

83

Introducción

12 aminoácidos denominada región inhibidora kinasa (Mallette, Calabrese, Ilangumaran, &

Ferbeyre, 2010).

Las citoquinas se unen a su receptor y lo activan, de manera que la

proteína jak (janus kinase) fosforila el receptor creando un sitio de unión para

las STATs. A continuación, JAK fosforila a las STAT5 (signal transducer and

activator of transcription 5) causando su liberación del receptor, lo que permite

la dimerización y traslocación al núcleo para activar la transcripción de genes

específicos que incluyen miembros de la familia SOCS. El gen SOCS1 inhibe la

señalización por citoquinas mediante cuatro posibles mecanismos: 1)

bloqueando el reclutamiento de las STATs al receptor de citoquinas a través

del enmascaramiento de los sitios de unión de STAT al receptor, 2) reclutando

proteínas para la degradación proteosomal vía ubiquitinación, 3) uniéndose a

las JAKs e inhibiendo sus quinasas o 4) reclutando a las JAKs para su

degradación vía proteosoma (Inagaki-Ohara, Kondo, Ito, & Yoshimura, 2013;

Sasi, et al., 2014) (Figura 17, izquierda). Sin embargo, la activación aberrante

de STAT5 provocada por las kinasas de fusión oncogénicas, como TEL

(telomere elongation)-JAK2, pueden resultar en niveles sostenidos de SOCS1

que pueden activar a la proteína p53 mediante la formación de un complejo con

ATM (ataxia telangiectasia mutated) y p53 (Figura 17, derecha).

Introducción

Figura 17. Vía de señalización de SOCS1 (Mallette, et al., 2010).

SOCS1 se asocia a diferentes tipos de cánceres (Sasi, et al., 2014), sin

embargo, no existen apenas estudios sobre este gen en gliomas (Zhou, et al.,

2007).

1.8. CITOMEGALOVIRUS HUMANO Y GLIOMAS

En los gliomas, como en la mayoría de los cánceres, están involucradas

una serie de alteraciones genéticas de origen intrínseco y ambiental. En la

última década se ha aumentado el conocimiento sobre las alteraciones

genéticas y vías de señalización implicadas en estos tumores (Patrick Y. Wen

& Santosh Kesari, 2008), pero, como se ha comentado anteriormente, los

factores etiológicos aún no están claros.

Un factor que ha llamado la atención en los últimos años es la infección

por HCMV (Citomegalovirus humano) y su asociación con este tipo de tumores.

84

Introducción

Sin embargo, el papel etiológico de este virus en la génesis de los gliomas está

generando una gran controversia.

Existen varios cánceres de origen viral. La oncogénesis viral humana

tiene características comunes: los oncovirus son necesarios pero no suficientes

para el desarrollo del cáncer, los cánceres de origen viral ocurren mucho

tiempo después de la infección viral aguda y el sistema inmune puede jugar un

papel destructor o protector ya que algunos cánceres de origen viral aumentan

en casos de pacientes inmunosuprimidos o con inflamación crónica (Mesri,

Feitelson, & Munger, 2014). En los últimos años ha habido una mayor

evidencia de que los genes víricos son uno de los principales elementos

reguladores de la metilación del ADN, modificación de histonas, alteraciones a

nivel de ARNm y condensación de la cromatina en los cánceres asociados a

virus. La infección por virus (especialmente virus de ADN y retrovirus) puede

causar la inserción de la secuencia de ADN viral en el genoma del hospedador

y esto, a menudo, desencadena un mecanismo de defensa del huésped, en

particular, la maquinaria de metilación del ADN para silenciar la expresión

génica viral (H. P. Li, Leu, & Chang, 2005; Vedham & Verma, 2015). Por tanto,

las oncoproteínas de los virus tumorales humanos interactúan con la

maquinaria epigenética celular, alterando el epigenoma de la célula huésped y

reprogramando el patrón de expresión génica (Kaneda, Matsusaka, Sakai, &

Funata, 2014; Minarovits, Demcsak, Banati, & Niller, 2016).

El HCMV es un virus de doble cadena de ADN perteneciente a la familia

Herpesviridae con, aproximadamente, un tamaño de genoma de 230kb, unos

200 genes que codifican proteínas, algunos ARNs no codificantes y unos 14

miARNs (Boeckh & Geballe, 2011; Dey, Ahmed, & Lesniak, 2015; Mocarski &

Kemble, 1996). Este virus es extremadamente prevalente en la población

mundial, afectando al 50-90% de la misma (Cobbs, 2011; Dey, et al., 2015).

Tras la primera infección, el sistema inmune del hospedador es incapaz de

eliminar el virus, lo que da lugar a una infección latente que puede persistir a lo

largo de toda la vida del hospedador y puede ser reactivada en cualquier

momento. En estado latente, el HCMV reside en la células del linaje mieloide y

la activación inmune y diferenciación de estas células en macrófagos parece

85

Introducción

Sin embargo, el papel etiológico de este virus en la génesis de los gliomas está

generando una gran controversia.

Existen varios cánceres de origen viral. La oncogénesis viral humana

tiene características comunes: los oncovirus son necesarios pero no suficientes

para el desarrollo del cáncer, los cánceres de origen viral ocurren mucho

tiempo después de la infección viral aguda y el sistema inmune puede jugar un

papel destructor o protector ya que algunos cánceres de origen viral aumentan

en casos de pacientes inmunosuprimidos o con inflamación crónica (Mesri,

Feitelson, & Munger, 2014). En los últimos años ha habido una mayor

evidencia de que los genes víricos son uno de los principales elementos

reguladores de la metilación del ADN, modificación de histonas, alteraciones a

nivel de ARNm y condensación de la cromatina en los cánceres asociados a

virus. La infección por virus (especialmente virus de ADN y retrovirus) puede

causar la inserción de la secuencia de ADN viral en el genoma del hospedador

y esto, a menudo, desencadena un mecanismo de defensa del huésped, en

particular, la maquinaria de metilación del ADN para silenciar la expresión

génica viral (H. P. Li, Leu, & Chang, 2005; Vedham & Verma, 2015). Por tanto,

las oncoproteínas de los virus tumorales humanos interactúan con la

maquinaria epigenética celular, alterando el epigenoma de la célula huésped y

reprogramando el patrón de expresión génica (Kaneda, Matsusaka, Sakai, &

Funata, 2014; Minarovits, Demcsak, Banati, & Niller, 2016).

El HCMV es un virus de doble cadena de ADN perteneciente a la familia

Herpesviridae con, aproximadamente, un tamaño de genoma de 230kb, unos

200 genes que codifican proteínas, algunos ARNs no codificantes y unos 14

miARNs (Boeckh & Geballe, 2011; Dey, Ahmed, & Lesniak, 2015; Mocarski &

Kemble, 1996). Este virus es extremadamente prevalente en la población

mundial, afectando al 50-90% de la misma (Cobbs, 2011; Dey, et al., 2015).

Tras la primera infección, el sistema inmune del hospedador es incapaz de

eliminar el virus, lo que da lugar a una infección latente que puede persistir a lo

largo de toda la vida del hospedador y puede ser reactivada en cualquier

momento. En estado latente, el HCMV reside en la células del linaje mieloide y

la activación inmune y diferenciación de estas células en macrófagos parece

Introducción

ser necesaria para la reactivación y replicación viral (Soderberg-Naucler,

2006a, 2006b) (Figura 18).

.

Figura 18. Estructura del HCMV.

(https://scienceforscientists.wordpress.com/tag/cytomegalovirus-cmv/, 2012)

Cobbs y col fueron los primeros en informar sobre la presencia de HCMV

en gliomas (Cobbs, et al., 2002). A partir de este estudio, varios grupos

(Bhattacharjee, Renzette, & Kowalik, 2012; Libard, et al., 2014; Mitchell, et al.,

2008; Rahbar, et al., 2012; Scheurer, Bondy, Aldape, Albrecht, & El-Zein, 2008)

han conseguido detectar ADN y proteínas de HCMV en muestras de gliomas

mediante diferentes técnicas (IHQ, ISH (in situ hybridization), PCR, qPCR

(quantitative PCR)) en, aproximadamente, la misma proporción que Cobbs (90-

100%). Otros grupos han sido capaces también de detectar el HCMV en

muestras de gliomas, pero en una proporción más baja, entre un 12-70% (Ding,

Han, Wang, Guo, & Wu, 2014; Fonseca, et al., 2012; Lucas, Bao, Bruggeman,

Dunham, & Specht, 2011; Sabatier, et al., 2005). Por último, existen estudios

que no han sido capaces de detectar la presencia de ADN y proteínas de este

virus en gliomas (Baumgarten, et al., 2014; Lau, et al., 2004; Poltermann, et al.,

2006; Solomon, Ramkissoon, Milner, & Folkerth, 2014; K.-W. Tang, Hellstrand,

& Larsson, 2015; Yamashita, et al., 2014). Por tanto, no está claro el papel de

este virus en la génesis de los gliomas, ni siquiera se sabe con certeza si está

realmente presente en todos los gliomas o no.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Hipótesis y objetivos

51

Hipótesis

Determinadas alteraciones genético-moleculares en tumores cerebrales

tienen un valor clínico en el diagnóstico, pronóstico y/o predicción de respuesta

al tratamiento, por lo que su identificación puede constituir una importante

herramienta en el manejo clínico de estos tumores.

Objetivos El objetivo principal del presente trabajo es la determinación del valor

diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta de marcadores moleculares

como la hipermetilación del promotor del gen MGMT, las mutaciones en los

genes IDH1 e IDH2 y el fenotipo hipermetilador en tumores gliales, así como la

búsqueda de nuevos posibles biomarcadores que permitan mejorar el

conocimiento y manejo clínico de estos tumores.

Los objetivos específicos son:

Determinar el patrón de hipermetilación del promotor del gen MGMT y

evaluar el valor pronóstico y predictivo de respuesta a la quimioterapia

con temozolomida (TMZ) en gliomas.

Analizar el fenotipo hipermetilador en islas CpG en gliomas. Estudiar la

asociación de estos marcadores con las variables clínicas y moleculares.

Estudiar el valor de las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 en el

diagnóstico diferencial entre gliomas de bajo y alto grado, así como su

valor pronóstico.

Analizar el potencial diagnóstico y pronóstico de la sobrexpresión de la

proteína p53 mutada y el índice de proliferación celular ki67 en tumores

gliales.

Determinar el papel de la infección por HCMV en la carcinogénesis de

los gliomas y su asociación con la hipermetilación genómica en islas

CpG.

Determinar si la relación conjunta de los diferentes marcadores

moleculares definen un subgrupo de tumores gliales de mejor pronóstico

y estudiar la asociación entre los marcadores moleculares y con las

variables clínicas.

89


51

Hipótesis

Determinadas alteraciones genético-moleculares en tumores cerebrales

tienen un valor clínico en el diagnóstico, pronóstico y/o predicción de respuesta

al tratamiento, por lo que su identificación puede constituir una importante

herramienta en el manejo clínico de estos tumores.

Objetivos El objetivo principal del presente trabajo es la determinación del valor

diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta de marcadores moleculares

como la hipermetilación del promotor del gen MGMT, las mutaciones en los

genes IDH1 e IDH2 y el fenotipo hipermetilador en tumores gliales, así como la

búsqueda de nuevos posibles biomarcadores que permitan mejorar el

conocimiento y manejo clínico de estos tumores.

Los objetivos específicos son:

Determinar el patrón de hipermetilación del promotor del gen MGMT y

evaluar el valor pronóstico y predictivo de respuesta a la quimioterapia

con temozolomida (TMZ) en gliomas.

Analizar el fenotipo hipermetilador en islas CpG en gliomas. Estudiar la

asociación de estos marcadores con las variables clínicas y moleculares.

Estudiar el valor de las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 en el

diagnóstico diferencial entre gliomas de bajo y alto grado, así como su

valor pronóstico.

Analizar el potencial diagnóstico y pronóstico de la sobrexpresión de la

proteína p53 mutada y el índice de proliferación celular ki67 en tumores

gliales.

Determinar el papel de la infección por HCMV en la carcinogénesis de

los gliomas y su asociación con la hipermetilación genómica en islas

CpG.

Determinar si la relación conjunta de los diferentes marcadores

moleculares definen un subgrupo de tumores gliales de mejor pronóstico

y estudiar la asociación entre los marcadores moleculares y con las

variables clínicas.

90


52

Describir las funciones moleculares alteradas en los tumores gliales a

través de estudios de transcriptómica.

MATERIAL Y MÉTODOS


52

Describir las funciones moleculares alteradas en los tumores gliales a

través de estudios de transcriptómica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y métodos

55

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. PACIENTES Y MUESTRAS BIOLÓGICAS

El estudio se realizó en una serie retrospectiva de tumores astrocíticos

diagnosticados entre 2000 y 2013 en el HGUA (Hospital General Universitario

de Alicante) y el HGUE (Hospital General Universitario de Elche). Las muestras

fueron obtenidas del Biobanco del HGUE y del Biobanco del HGUA. Los

estudios realizados han sido revisados y evaluados por las Comisiones de

Investigación y los Comités de Ética de Investigación Clínica de los Hospitales

de Elche y Alicante en el contexto de los proyectos financiados que se

relacionan al principio del presente trabajo. Las variables de filiación, clínicas y

patológicas consideradas fueron: edad, sexo, tipo histológico, estadío o grado

tumoral, tratamiento, situación actual y supervivencia. Los tumores fueron

clasificados, atendiendo a los criterios revisados de la OMS de 2007 (Louis DN,

2007) en AII, AIII y GBM. El estudio incluyó un total de 124 muestras de 118

pacientes del HGUA y un total de 111 muestras de 101 pacientes del HGUE

(total: 235 muestras). En base a la clasificación histopatológica, 28 fueron AII,

28 AIII y 179 GBM. El intervalo de edades de los pacientes fue de los 4 a los 81

años y la mediana 55 años. Del total de muestras, 137 fueron hombres y 98

mujeres. Estos datos se resumen en la Tabla 4.


Variables Frecuencias n % Sexo

Hombre 137 58.30 Mujer 98 41.70

Edad (años) Mediana 55

Ratio 4-81 Grado tumoral

II 28 11.91 III 28 11.91 IV 179 76.17

93

Material y métodos

55

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. PACIENTES Y MUESTRAS BIOLÓGICAS

El estudio se realizó en una serie retrospectiva de tumores astrocíticos

diagnosticados entre 2000 y 2013 en el HGUA (Hospital General Universitario

de Alicante) y el HGUE (Hospital General Universitario de Elche). Las muestras

fueron obtenidas del Biobanco del HGUE y del Biobanco del HGUA. Los

estudios realizados han sido revisados y evaluados por las Comisiones de

Investigación y los Comités de Ética de Investigación Clínica de los Hospitales

de Elche y Alicante en el contexto de los proyectos financiados que se

relacionan al principio del presente trabajo. Las variables de filiación, clínicas y

patológicas consideradas fueron: edad, sexo, tipo histológico, estadío o grado

tumoral, tratamiento, situación actual y supervivencia. Los tumores fueron

clasificados, atendiendo a los criterios revisados de la OMS de 2007 (Louis DN,

2007) en AII, AIII y GBM. El estudio incluyó un total de 124 muestras de 118

pacientes del HGUA y un total de 111 muestras de 101 pacientes del HGUE

(total: 235 muestras). En base a la clasificación histopatológica, 28 fueron AII,

28 AIII y 179 GBM. El intervalo de edades de los pacientes fue de los 4 a los 81

años y la mediana 55 años. Del total de muestras, 137 fueron hombres y 98

mujeres. Estos datos se resumen en la Tabla 4.


Variables Frecuencias n % Sexo

Hombre 137 58.30 Mujer 98 41.70

Edad (años) Mediana 55

Ratio 4-81 Grado tumoral

II 28 11.91 III 28 11.91 IV 179 76.17

94

Material y métodos

56

3.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

La mayoría de las muestras tumorales, en concreto 212, fueron

obtenidas a partir de tejidos FPPE y las 28 muestras restantes, fueron

obtenidas a partir de tejidos congelados incluidos en medio OCT (Optimal

Cutting Temperature).

Las secciones cortadas de los bloques de parafina fueron

desparafinizadas mediante disolución de la parafina en aceite mineral (Sigma

Aldrich) a 95ºC. Tras la eliminación de la parafina, el tejido fue incubado con

proteinasa K (proteasa de amplio espectro que degrada las proteínas de las

membranas celulares provocando la lisis celular) a 56ºC durante 16 horas y, en

caso necesario, se volvió a incubar a 56ºC, tras la adición de más proteinasa K,

hasta la total digestión del tejido.

En el caso del procesamiento de las muestras obtenidas de tejido

congelado, éste se llevo a cabo de dos formas diferentes. En aquellas

muestras que contenían sólo tejido tumoral se realizaron entre cuatro y cinco

cortes de 10 micras de cada uno y se colocaron en tubos eppendorf, mientras

que en aquellas muestras de tejido tumoral que, además, presentaban zonas

de tejido normal, necrosis, etc. se realizaron los mismos cortes pero se

colocaron en portaobjetos para la posterior microdisección manual, utilizando

una sección contigua teñida con hematoxilina-eosina como guía, con bisturí en

un criostato (a -20ºC). Una vez aislados los fragmentos del tejido de interés, se

colocaron en tubos eppendorf.

3.2.1. EXTRACIÓN DE ADN Tras el procesamiento de las muestras se llevó a cabo la extracción y

purificación del ADN. Se usaron dos kits de extracción manual de ADN

diferentes. Para las muestras procedentes de tejidos fijados e incluidos en

parafina se usó el kit QIAamp DNA Investigator (Qiagen), que permite la

obtención de ADN de elevada pureza y con un buen rendimiento a partir de

Material y métodos

57

muestras con poco tejido o que suelen dar bajos rendimientos al utilizar

métodos convencionales de extracción de ADN. El kit optimiza la extracción

gracias a un carrier de ARN transferente que favorece la precipitación del ADN

y a unas columnas con membrana de sílice que retienen el ADN precipitado

favoreciendo su purificación (QIAamp MinElute Columns). Para las muestras

procedentes de tejido congelado se usó el kit Forensic DNA (D3591-02

OMEGA bio-tek). Ambos protocolos se describen detalladamente en el Anexo I.

La concentración de ADN de cada muestra se cuantificó por

espectrofotometría utilizando el NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo

Scientific). Este instrumento calcula la concentración de ADN (en ng/μL) a partir

de un volumen mínimo de muestra (2μL) mediante la determinación de la

absorbancia de la muestra a 260nm (nanometros) (longitud de onda específica

de absorción de los ácidos nucleicos). Además, ofrece un ratio de la

absorbancia a 260nm frente a la absorbancia a 280nm que determina la pureza

del ADN. La longitud de onda a 280nm es específica de la absorción de

posibles contaminantes del ADN como las proteínas. Un ratio 260/280

comprendido entre 1,8 y 2 denota una buena pureza del ADN. El ADN de las

muestras se mantuvo a 4ºC durante el tiempo en el que iba a ser utilizado para

las distintas determinaciones y posteriormente se almacenó a -20ºC.

3.2.2. EXTRACCIÓN DE ARN

Se extrajo ARN de las muestras procedentes de tejido congelado. Para

ello, se usó el kit RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit (Ambion) que se

utiliza para el aislamiento de ARN de muestras con pocas células mediante una

desnaturalización basada en sales caotrópicas y una tecnología de separación

basada en filtros de fibra de vidrio.

Debido a la facilidad para degradarse que tienen estas moléculas por

acción de las enzimas ARNasas presentes de manera estable en el ambiente,

es necesario mantener unas condiciones óptimas y controladas durante el

95

Material y métodos

56

3.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

La mayoría de las muestras tumorales, en concreto 212, fueron

obtenidas a partir de tejidos FPPE y las 28 muestras restantes, fueron

obtenidas a partir de tejidos congelados incluidos en medio OCT (Optimal

Cutting Temperature).

Las secciones cortadas de los bloques de parafina fueron

desparafinizadas mediante disolución de la parafina en aceite mineral (Sigma

Aldrich) a 95ºC. Tras la eliminación de la parafina, el tejido fue incubado con

proteinasa K (proteasa de amplio espectro que degrada las proteínas de las

membranas celulares provocando la lisis celular) a 56ºC durante 16 horas y, en

caso necesario, se volvió a incubar a 56ºC, tras la adición de más proteinasa K,

hasta la total digestión del tejido.

En el caso del procesamiento de las muestras obtenidas de tejido

congelado, éste se llevo a cabo de dos formas diferentes. En aquellas

muestras que contenían sólo tejido tumoral se realizaron entre cuatro y cinco

cortes de 10 micras de cada uno y se colocaron en tubos eppendorf, mientras

que en aquellas muestras de tejido tumoral que, además, presentaban zonas

de tejido normal, necrosis, etc. se realizaron los mismos cortes pero se

colocaron en portaobjetos para la posterior microdisección manual, utilizando

una sección contigua teñida con hematoxilina-eosina como guía, con bisturí en

un criostato (a -20ºC). Una vez aislados los fragmentos del tejido de interés, se

colocaron en tubos eppendorf.

3.2.1. EXTRACIÓN DE ADN Tras el procesamiento de las muestras se llevó a cabo la extracción y

purificación del ADN. Se usaron dos kits de extracción manual de ADN

diferentes. Para las muestras procedentes de tejidos fijados e incluidos en

parafina se usó el kit QIAamp DNA Investigator (Qiagen), que permite la

obtención de ADN de elevada pureza y con un buen rendimiento a partir de

Material y métodos

57

muestras con poco tejido o que suelen dar bajos rendimientos al utilizar

métodos convencionales de extracción de ADN. El kit optimiza la extracción

gracias a un carrier de ARN transferente que favorece la precipitación del ADN

y a unas columnas con membrana de sílice que retienen el ADN precipitado

favoreciendo su purificación (QIAamp MinElute Columns). Para las muestras

procedentes de tejido congelado se usó el kit Forensic DNA (D3591-02

OMEGA bio-tek). Ambos protocolos se describen detalladamente en el Anexo I.

La concentración de ADN de cada muestra se cuantificó por

espectrofotometría utilizando el NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo

Scientific). Este instrumento calcula la concentración de ADN (en ng/μL) a partir

de un volumen mínimo de muestra (2μL) mediante la determinación de la

absorbancia de la muestra a 260nm (nanometros) (longitud de onda específica

de absorción de los ácidos nucleicos). Además, ofrece un ratio de la

absorbancia a 260nm frente a la absorbancia a 280nm que determina la pureza

del ADN. La longitud de onda a 280nm es específica de la absorción de

posibles contaminantes del ADN como las proteínas. Un ratio 260/280

comprendido entre 1,8 y 2 denota una buena pureza del ADN. El ADN de las

muestras se mantuvo a 4ºC durante el tiempo en el que iba a ser utilizado para

las distintas determinaciones y posteriormente se almacenó a -20ºC.

3.2.2. EXTRACCIÓN DE ARN

Se extrajo ARN de las muestras procedentes de tejido congelado. Para

ello, se usó el kit RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit (Ambion) que se

utiliza para el aislamiento de ARN de muestras con pocas células mediante una

desnaturalización basada en sales caotrópicas y una tecnología de separación

basada en filtros de fibra de vidrio.

Debido a la facilidad para degradarse que tienen estas moléculas por

acción de las enzimas ARNasas presentes de manera estable en el ambiente,

es necesario mantener unas condiciones óptimas y controladas durante el

96

Material y métodos

58

proceso de extracción de las mismas. Para ello, todo el material utilizado y la

bancada de trabajo fueron esterilizados y se usó una mascarilla durante todo el

proceso. El protocolo detallado se describe en el Anexo I.

Las muestras se mantuvieron en hielo durante la cuantificación para

evitar la degradación del ARN. Una vez cuantificadas, se guardaron a -80ºC.

3.3. ANÁLISIS DE DELECIONES EN LOS BRAZOS CROMOSÓMICOS 1p/19q

Este análisis se realizó mediante la técnica MLPA, que permite la

detección simultánea de pequeños cambios en el número de copias de varias

secuencias. Mediante un único experimento, basado en una PCR

semicuantitativa, pueden interrogarse hasta 40-50 regiones diferentes del

genoma. Las secuencias detectadas son pequeñas (de unos 60 nucleótidos)

permitiendo el análisis de ADN fragmentado. Esto es posible gracias al diseño

específico de las sondas de MLPA, que corresponden a secuencias únicas (no

repetidas) del genoma humano y que contienen varias regiones características.

Cada sonda consta de: dos oligonucleótidos (de unos 40-50 nucleótidos) que

hibridan de forma consecutiva en la región complementaria correspondiente del

ADN de la muestra y que posteriormente se unirán por acción de una enzima

específica (ADN-ligasa) formando una cadena única que pueda ser amplificada

por PCR; cada uno de estos oligonucleótidos tiene una región no

complementaria al ADN de la muestra que servirá como cebador universal para

amplificar simultáneamente todas las regiones analizadas; por último, uno de

los dos oligonucleótidos contiene además una secuencia stuffer cuyo tamaño

es diferente para cada sonda. La secuencia stuffer permite dar a cada sonda

un tamaño conocido para su identificación en el patrón de picos resultante de la

separación por electroforesis capilar, como se explica más adelante. Las

sondas tienen un tamaño total comprendido entre 120 y 500 nucleótidos.

Material y métodos

59

Para determinar si las muestras con diagnóstico de astrocitoma tenían

deleciones en los brazos cromosómicos 1p y/o 19q, se utilizó el kit SALSA

MLPA kit P088 B1 Oligodendroglioma (MRC-Holland). Este kit contiene 43

sondas, 15 de las cuales son sondas control. Estas sondas control

corresponden a regiones no alteradas del genoma. Las restantes sondas están

distribuidas a lo largo de los cromosomas 1 y 19: 15 sondas en 1p, 3 en 1q, 2

en 19p y 8 en 19q. La localización de cada una de las sondas del kit en estos

cromosomas está especificada en el Anexo II.

En cada experimento de MLPA se incluyeron dos controles: ADN de dos

tejidos normales incluidos en parafina. El proceso se llevó a cabo siguiendo las

instrucciones del fabricante, con alguna pequeña modificación. Este protocolo

se describe en detalle en el Anexo III.

El producto de la PCR fue separado mediante electroforesis capilar (ABI-

PRISM 3100 Avant, Applied Biosystems). El análisis de los datos de la

separación electroforética se llevó a cabo mediante el software GeneScan

(Applied Biosystems) y plantillas de hojas de cálculo en formato Microsoft®

Excel facilitadas por el fabricante del kit. En estas plantillas se calcula un ratio

para cada sonda: dicho ratio resulta del cociente entre la altura del pico

normalizada de cada sonda de la muestra y la altura del pico normalizada de la

sonda correspondiente del control. La altura normalizada de cada pico

corresponde al promedio de los cocientes entre la altura del pico en cuestión y

la altura de cada una de las sondas control. Esta normalización se lleva a cabo

para compensar las posibles diferencias en la eficiencia de la PCR de las

distintas sondas.

A partir del ratio muestra/control de cada sonda se puede determinar si la

muestra tumoral tiene alteraciones genéticas (deleciones) en una región

concreta: la muestra se considera normal si todas las sondas tienen un ratio

comprendido entre 0,7 y 1,4. Valores por debajo de 0.7 indican una deleción y

valores por encima de 1.4 indican una amplificación (Anexo III).

97

Material y métodos

58

proceso de extracción de las mismas. Para ello, todo el material utilizado y la

bancada de trabajo fueron esterilizados y se usó una mascarilla durante todo el

proceso. El protocolo detallado se describe en el Anexo I.

Las muestras se mantuvieron en hielo durante la cuantificación para

evitar la degradación del ARN. Una vez cuantificadas, se guardaron a -80ºC.

3.3. ANÁLISIS DE DELECIONES EN LOS BRAZOS CROMOSÓMICOS 1p/19q

Este análisis se realizó mediante la técnica MLPA, que permite la

detección simultánea de pequeños cambios en el número de copias de varias

secuencias. Mediante un único experimento, basado en una PCR

semicuantitativa, pueden interrogarse hasta 40-50 regiones diferentes del

genoma. Las secuencias detectadas son pequeñas (de unos 60 nucleótidos)

permitiendo el análisis de ADN fragmentado. Esto es posible gracias al diseño

específico de las sondas de MLPA, que corresponden a secuencias únicas (no

repetidas) del genoma humano y que contienen varias regiones características.

Cada sonda consta de: dos oligonucleótidos (de unos 40-50 nucleótidos) que

hibridan de forma consecutiva en la región complementaria correspondiente del

ADN de la muestra y que posteriormente se unirán por acción de una enzima

específica (ADN-ligasa) formando una cadena única que pueda ser amplificada

por PCR; cada uno de estos oligonucleótidos tiene una región no

complementaria al ADN de la muestra que servirá como cebador universal para

amplificar simultáneamente todas las regiones analizadas; por último, uno de

los dos oligonucleótidos contiene además una secuencia stuffer cuyo tamaño

es diferente para cada sonda. La secuencia stuffer permite dar a cada sonda

un tamaño conocido para su identificación en el patrón de picos resultante de la

separación por electroforesis capilar, como se explica más adelante. Las

sondas tienen un tamaño total comprendido entre 120 y 500 nucleótidos.

Material y métodos

59

Para determinar si las muestras con diagnóstico de astrocitoma tenían

deleciones en los brazos cromosómicos 1p y/o 19q, se utilizó el kit SALSA

MLPA kit P088 B1 Oligodendroglioma (MRC-Holland). Este kit contiene 43

sondas, 15 de las cuales son sondas control. Estas sondas control

corresponden a regiones no alteradas del genoma. Las restantes sondas están

distribuidas a lo largo de los cromosomas 1 y 19: 15 sondas en 1p, 3 en 1q, 2

en 19p y 8 en 19q. La localización de cada una de las sondas del kit en estos

cromosomas está especificada en el Anexo II.

En cada experimento de MLPA se incluyeron dos controles: ADN de dos

tejidos normales incluidos en parafina. El proceso se llevó a cabo siguiendo las

instrucciones del fabricante, con alguna pequeña modificación. Este protocolo

se describe en detalle en el Anexo III.

El producto de la PCR fue separado mediante electroforesis capilar (ABI-

PRISM 3100 Avant, Applied Biosystems). El análisis de los datos de la

separación electroforética se llevó a cabo mediante el software GeneScan

(Applied Biosystems) y plantillas de hojas de cálculo en formato Microsoft®

Excel facilitadas por el fabricante del kit. En estas plantillas se calcula un ratio

para cada sonda: dicho ratio resulta del cociente entre la altura del pico

normalizada de cada sonda de la muestra y la altura del pico normalizada de la

sonda correspondiente del control. La altura normalizada de cada pico

corresponde al promedio de los cocientes entre la altura del pico en cuestión y

la altura de cada una de las sondas control. Esta normalización se lleva a cabo

para compensar las posibles diferencias en la eficiencia de la PCR de las

distintas sondas.

A partir del ratio muestra/control de cada sonda se puede determinar si la

muestra tumoral tiene alteraciones genéticas (deleciones) en una región

concreta: la muestra se considera normal si todas las sondas tienen un ratio

comprendido entre 0,7 y 1,4. Valores por debajo de 0.7 indican una deleción y

valores por encima de 1.4 indican una amplificación (Anexo III).

98

Material y métodos

60

Además de los picos correspondientes a la amplificación de cada una de

las sondas, en cada producto de PCR pueden observarse nueve fragmentos

control: cuatro fragmentos (fragmentos Q) que indican la cantidad de ADN (a

64-70-76-82 nucleótidos), tres que indican la eficiencia de la desnaturalización

(fragmentos D, a 88-92-96 nt), un fragmento específico del cromosoma X a los

100nt y otro específico del cromosoma Y a los 105nt. Para una buena fiabilidad

del resultado del MLPA, la altura de los fragmentos Q debe ser lo más pequeña

posible y, en cualquier caso, no debe superar la mitad de la altura de los

fragmentos D (Figura 19).

Figura 19. Patrón de picos de un MLPA tras la separación de fragmentos por electroforesis capilar. El eje vertical indica la altura de los picos y el horizontal el tamaño de

los fragmentos (en nucleótidos). Señalados con flechas rojas se observan los picos

correspondientes a los fragmentos Q, indicadores de la cantidad de ADN; en verde, los

fragmentos D, indicadores de la eficiencia de desnaturalización; en negro, el fragmento del

cromosoma X; y en naranja, el fragmento del cromosoma Y.

Este protocolo se llevó a cabo exclusivamente para descartar o incluir

aquellas muestras cuyo diagnóstico era dudoso, en concreto para diferenciar

entre astrocitomas y oligodendrogliomas y descartar estos últimos.

Material y métodos

61

3.4. ANÁLISIS DEL ESTADO DE HIPERMETILACIÓN DEL GEN MGMT

Para la determinación del estado de metilación del promotor del gen

MGMT se empleó la técnica MS-MLPA, variante de la técnica explicada en el

apartado anterior. Esta determinación se llevó a cabo en 227 muestras de la

serie para el estudio de MGMT como posible marcador pronóstico y predictivo

de respuesta al tratamiento. Frente a la MS-PCR, más ampliamente utilizada

para la detección de regiones metiladas, el MS-MLPA presenta varias ventajas

por las cuales se decidió emplear esta técnica:

1. Permite detectar el estado de metilación en varias islas CpG

simultáneamente.

2. No está basada en la conversión de citosinas no metiladas en uracilo

mediante el tratamiento con bisulfito (Técnica MSP).

3. Puede analizarse ADN de bajo peso molecular debido al pequeño

tamaño de las sondas empleadas (50-60 pb).

4. Requiere pequeñas cantidades de ADN (100ng).

5. Además del estado de metilación, permite detectar alteraciones en el

número de copias de los loci analizados (deleciones, duplicaciones).

6. Es semicuantitativa. Permite detectar distintos porcentajes de

metilación, que vienen determinados por el ratio de cada sonda (J.

W. Jeuken, et al., 2007). En este aspecto, podría hacerse la

determinación por MS-PCR a tiempo real, pero esta técnica sigue

requiriendo la conversión con bisulfito. Además, a la hora de elegir un

control interno hay que tener en cuenta que el gen elegido puede

estar alterado en gliomas. Este problema también se evita con el MS-

MLPA, ya que el ratio de metilación se calcula comparando la

cantidad total de ADN de la muestra no digerida con la cantidad de

ADN presente después de la digestión de la muestra, que sólo

contiene fragmentos no metilados.

99

Material y métodos

60

Además de los picos correspondientes a la amplificación de cada una de

las sondas, en cada producto de PCR pueden observarse nueve fragmentos

control: cuatro fragmentos (fragmentos Q) que indican la cantidad de ADN (a

64-70-76-82 nucleótidos), tres que indican la eficiencia de la desnaturalización

(fragmentos D, a 88-92-96 nt), un fragmento específico del cromosoma X a los

100nt y otro específico del cromosoma Y a los 105nt. Para una buena fiabilidad

del resultado del MLPA, la altura de los fragmentos Q debe ser lo más pequeña

posible y, en cualquier caso, no debe superar la mitad de la altura de los

fragmentos D (Figura 19).

Figura 19. Patrón de picos de un MLPA tras la separación de fragmentos por electroforesis capilar. El eje vertical indica la altura de los picos y el horizontal el tamaño de

los fragmentos (en nucleótidos). Señalados con flechas rojas se observan los picos

correspondientes a los fragmentos Q, indicadores de la cantidad de ADN; en verde, los

fragmentos D, indicadores de la eficiencia de desnaturalización; en negro, el fragmento del

cromosoma X; y en naranja, el fragmento del cromosoma Y.

Este protocolo se llevó a cabo exclusivamente para descartar o incluir

aquellas muestras cuyo diagnóstico era dudoso, en concreto para diferenciar

entre astrocitomas y oligodendrogliomas y descartar estos últimos.

Material y métodos

61

3.4. ANÁLISIS DEL ESTADO DE HIPERMETILACIÓN DEL GEN MGMT

Para la determinación del estado de metilación del promotor del gen

MGMT se empleó la técnica MS-MLPA, variante de la técnica explicada en el

apartado anterior. Esta determinación se llevó a cabo en 227 muestras de la

serie para el estudio de MGMT como posible marcador pronóstico y predictivo

de respuesta al tratamiento. Frente a la MS-PCR, más ampliamente utilizada

para la detección de regiones metiladas, el MS-MLPA presenta varias ventajas

por las cuales se decidió emplear esta técnica:

1. Permite detectar el estado de metilación en varias islas CpG

simultáneamente.

2. No está basada en la conversión de citosinas no metiladas en uracilo

mediante el tratamiento con bisulfito (Técnica MSP).

3. Puede analizarse ADN de bajo peso molecular debido al pequeño

tamaño de las sondas empleadas (50-60 pb).

4. Requiere pequeñas cantidades de ADN (100ng).

5. Además del estado de metilación, permite detectar alteraciones en el

número de copias de los loci analizados (deleciones, duplicaciones).

6. Es semicuantitativa. Permite detectar distintos porcentajes de

metilación, que vienen determinados por el ratio de cada sonda (J.

W. Jeuken, et al., 2007). En este aspecto, podría hacerse la

determinación por MS-PCR a tiempo real, pero esta técnica sigue

requiriendo la conversión con bisulfito. Además, a la hora de elegir un

control interno hay que tener en cuenta que el gen elegido puede

estar alterado en gliomas. Este problema también se evita con el MS-

MLPA, ya que el ratio de metilación se calcula comparando la

cantidad total de ADN de la muestra no digerida con la cantidad de

ADN presente después de la digestión de la muestra, que sólo

contiene fragmentos no metilados.

100

Material y métodos

62

Estas características hacen del MS-MLPA una técnica apta para la

determinación del estado de metilación del promotor de MGMT en este estudio,

dada la baja cantidad y escasa calidad del ADN extraído de tejidos de archivo

histológico fijados en parafina. Este tipo de muestras dificulta la obtención de

ADN de buena calidad. Para estudios moleculares, además de la

fragmentación del ADN asociada al proceso de inclusión de los tejidos en

bloques de parafina, también se ha de tener en cuenta la antigüedad de las

muestras procesadas. En cuanto a las muestras procedentes de tejido

congelado, se analizaron también mediante esta técnica a pesar de que la

calidad del ADN en este caso era superior.

Para la determinación se empleó el kit SALSA MLPA kit ME011 B1

Mismatch Repair genes (MRC-Holland) que contiene 38 sondas, 16 de las

cuales (sondas control) no tienen punto de corte para la enzima de restricción

sensible a metilación HhaI (reconoce la secuencia GCGC). Las restantes 22

sondas sí tienen esta secuencia y son digeridas por la enzima de restricción

sólo cuando la secuencia de reconocimiento no está metilada. De entre éstas,

6 corresponden a distintas zonas de la región 5’ del gen MGMT. Tomando

como referencia el TSS (Transcription start site), la distribución de las sondas

es la siguiente: sonda 1 de -409 a -334, sonda 2 de -294 a -241, sonda 3 de -

41 a +10, sonda 4 de +205 a +259, sonda 5 de +286 a +339 y sonda 6 de +517

a +568 (Figura 20).

Material y métodos

63

Figura 20. Secuencia del promotor de MGMT e islas CpGs. La zona subrayada corresponde

a la isla CpG completa, en amarillo el sitio de inicio de la transcripción, en verde el exón 1 y los

recuadros rojos corresponden a las zonas de reconocimiento de la enzima HhaI.

El fundamento de la técnica es el mismo que el MLPA explicado en el

apartado anterior, con una pequeña modificación en el paso previo a la PCR

(Figura 21). El protocolo detallado se explica en el Anexo IV.

101

Material y métodos

62

Estas características hacen del MS-MLPA una técnica apta para la

determinación del estado de metilación del promotor de MGMT en este estudio,

dada la baja cantidad y escasa calidad del ADN extraído de tejidos de archivo

histológico fijados en parafina. Este tipo de muestras dificulta la obtención de

ADN de buena calidad. Para estudios moleculares, además de la

fragmentación del ADN asociada al proceso de inclusión de los tejidos en

bloques de parafina, también se ha de tener en cuenta la antigüedad de las

muestras procesadas. En cuanto a las muestras procedentes de tejido

congelado, se analizaron también mediante esta técnica a pesar de que la

calidad del ADN en este caso era superior.

Para la determinación se empleó el kit SALSA MLPA kit ME011 B1

Mismatch Repair genes (MRC-Holland) que contiene 38 sondas, 16 de las

cuales (sondas control) no tienen punto de corte para la enzima de restricción

sensible a metilación HhaI (reconoce la secuencia GCGC). Las restantes 22

sondas sí tienen esta secuencia y son digeridas por la enzima de restricción

sólo cuando la secuencia de reconocimiento no está metilada. De entre éstas,

6 corresponden a distintas zonas de la región 5’ del gen MGMT. Tomando

como referencia el TSS (Transcription start site), la distribución de las sondas

es la siguiente: sonda 1 de -409 a -334, sonda 2 de -294 a -241, sonda 3 de -

41 a +10, sonda 4 de +205 a +259, sonda 5 de +286 a +339 y sonda 6 de +517

a +568 (Figura 20).

Material y métodos

63

Figura 20. Secuencia del promotor de MGMT e islas CpGs. La zona subrayada corresponde

a la isla CpG completa, en amarillo el sitio de inicio de la transcripción, en verde el exón 1 y los

recuadros rojos corresponden a las zonas de reconocimiento de la enzima HhaI.

El fundamento de la técnica es el mismo que el MLPA explicado en el

apartado anterior, con una pequeña modificación en el paso previo a la PCR

(Figura 21). El protocolo detallado se explica en el Anexo IV.

102

Material y métodos

64

Figura 21. Esquema del MS-MLPA. El proceso de MS-MLPA comienza con la

desnaturalización de la muestra y la hibridación de las sondas. Tras la hibridación se procede a

la ligación de los dos oligonucleótidos de cada sonda y la digestión con la enzima de restricción

sensible a metilación HhaI. Si para una región concreta la muestra no está metilada, la enzima

cortará por su secuencia diana y no habrá amplificación de la sonda correspondiente. Pero si la

muestra está metilada la enzima no reconoce su secuencia diana y no digiere la muestra, por

lo que sí habrá amplificación de las sondas correspondientes a regiones metiladas. Después de

la PCR se separan los fragmentos por electroforesis capilar.

Los productos de PCR se separaron por electroforesis capilar de igual

modo que en el apartado anterior. También se utilizaron plantillas de hojas de

cálculo Microsoft Excel para interpretar los resultados de la electroforesis

(GeneScan software). En este caso, los ratios son el resultado del cociente

Material y métodos

65

entre la altura normalizada de cada pico de la muestra digerida y la altura

normalizada de su pico correspondiente del control no digerido.

El ratio establecido para discriminar entre el estado metilado y no

metilado de cada sonda se estableció en 0.25 según lo descrito por Jeuken y

col (J. W. Jeuken, et al., 2007) por lo cual, tomando este ratio como punto de

corte, la determinación de la metilación mediante MS-MLPA y MS-PCR en la

misma serie de casos coincidía. Siguiendo las indicaciones del fabricante del kit

(MRC-Holland), se descartaron del análisis la cuarta y sexta sondas (la cuarta

porque por lo general nunca aparece metilada y la sexta porque aparece

metilada en la mayoría de las muestras). Por tanto, el análisis se centró en las

restantes 4 sondas, 2 en el promotor y 2 en el intrón 1. Para determinar el

estado global de metilación de cada muestra teniendo en cuenta todas las

sondas de MGMT, se siguieron los siguientes criterios (Tabla 5):

Tabla 5: Criterios para determinar el estado de metilación de MGMT (J. W. Jeuken, et al.,

2007) (Anexo V).

Metilado

3 sondas tienen un ratio superior a 0.25

1 sonda tiene un ratio superior a 0.4 y al menos otra sonda con un ratio superior a 0.25

1 única sonda tiene un ratio superior a 0.7

Parcialmente Metilado

1 ó 2 sondas con un ratio ligeramente superior a 0.25

1 sonda con un ratio entre 0.4 y 0.6

No Metilado

Todas las sondas tienen un ratio inferior a 0.25

103

Material y métodos

64

Figura 21. Esquema del MS-MLPA. El proceso de MS-MLPA comienza con la

desnaturalización de la muestra y la hibridación de las sondas. Tras la hibridación se procede a

la ligación de los dos oligonucleótidos de cada sonda y la digestión con la enzima de restricción

sensible a metilación HhaI. Si para una región concreta la muestra no está metilada, la enzima

cortará por su secuencia diana y no habrá amplificación de la sonda correspondiente. Pero si la

muestra está metilada la enzima no reconoce su secuencia diana y no digiere la muestra, por

lo que sí habrá amplificación de las sondas correspondientes a regiones metiladas. Después de

la PCR se separan los fragmentos por electroforesis capilar.


modo que en el apartado anterior. También se utilizaron plantillas de hojas de

cálculo Microsoft Excel para interpretar los resultados de la electroforesis

(GeneScan software). En este caso, los ratios son el resultado del cociente

Material y métodos

65

entre la altura normalizada de cada pico de la muestra digerida y la altura

normalizada de su pico correspondiente del control no digerido.

El ratio establecido para discriminar entre el estado metilado y no

metilado de cada sonda se estableció en 0.25 según lo descrito por Jeuken y

col (J. W. Jeuken, et al., 2007) por lo cual, tomando este ratio como punto de

corte, la determinación de la metilación mediante MS-MLPA y MS-PCR en la

misma serie de casos coincidía. Siguiendo las indicaciones del fabricante del kit

(MRC-Holland), se descartaron del análisis la cuarta y sexta sondas (la cuarta

porque por lo general nunca aparece metilada y la sexta porque aparece

metilada en la mayoría de las muestras). Por tanto, el análisis se centró en las

restantes 4 sondas, 2 en el promotor y 2 en el intrón 1. Para determinar el

estado global de metilación de cada muestra teniendo en cuenta todas las

sondas de MGMT, se siguieron los siguientes criterios (Tabla 5):

Tabla 5: Criterios para determinar el estado de metilación de MGMT (J. W. Jeuken, et al.,

2007) (Anexo V).

Metilado

3 sondas tienen un ratio superior a 0.25

1 sonda tiene un ratio superior a 0.4 y al menos otra sonda con un ratio superior a 0.25

1 única sonda tiene un ratio superior a 0.7

Parcialmente Metilado

1 ó 2 sondas con un ratio ligeramente superior a 0.25

1 sonda con un ratio entre 0.4 y 0.6

No Metilado

Todas las sondas tienen un ratio inferior a 0.25

104

Material y métodos

66

3.5. ANÁLISIS DEL FENOTIPO HIPERMETILADOR EN GLIOMAS El análisis del fenotipo hipermetilador de los gliomas se llevó a cabo

mediante la técnica MS-MLPA. Se utilizó el kit SALSA MLPA KIT ME042-B1

CIMP (MRC-Holland) que contiene 44 sondas, 12 de las cuales (sondas

control) no tienen punto de corte para la enzima de restricción sensible a

metilación HhaI (reconoce la secuencia GCGC, cortando entre la CG centrales

y cuando la C no está metilada). Las otras 31 sondas sí tienen esta secuencia y

son digeridas por la enzima de restricción sólo cuando la secuencia de

reconocimiento no está metilada. Las 31 sondas MS-MLPA detectan la

metilación de las regiones promotoras de 8 genes diferentes: CACNA1G

(calcium channel voltage-dependent T type alpha 1G subunit), CDKN2A,

CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), IGF2 (insulin like growth

factor 2), MLH1, NEUROG1 (neurogenin 1), RUNX3 (run related transcription

factor 3) y SOCS1. Estas regiones promotoras no están metiladas en el ADN

derivado de sangre de individuos sanos, pero se ha demostrado que están

frecuentemente metiladas en tumores CIMP. La sonda que falta detecta la

mutación V600E en BRAF. Este kit contiene los 8 marcadores que definen el

fenotipo CIMP en cáncer colorrectal.

Cada reacción de MS-MLPA genera dos muestras para análisis por

electroforesis capilar: una muestra no digerida de referencia y una muestra

digerida para detectar la metilación. El protocolo detallado, al igual que el de

MGMT, se describe en el Anexo IV. La única diferencia radica en la sonda

añadida al primer mástermix de hibridación.


modo que en los apartados anteriores. También se utilizaron plantillas de hojas

de cálculo Microsoft Excel para interpretar los resultados de la electroforesis

(GeneScan software). En este caso, como en el caso de la metilación de

MGMT, los ratios son el resultado del cociente entre la altura normalizada de

cada pico de la muestra digerida y la altura normalizada de su pico

correspondiente del control no digerido (Figura 22 y 23).

Material y métodos

67

Figura 22. Patrón de electroforesis capilar de una muestra de ADN control humano

masculino de, aproximadamente, 50ng digerido y analizado con el kit SALSA MLPA KIT

ME042-B1 CIMP para determinar el estado de metilación.


masculino de, aproximadamente, 50ng no digerido y analizado con el kit SALSA MLPA KIT

ME042-B1 CIMP para cuantificar el estado de metilación.

La determinación del estado de metilación de cada uno de los genes del

panel de CIMP se basa en el comportamiento de las diferentes sondas para

cada gen, siguiendo los siguientes criterios:

105

Material y métodos

66

3.5. ANÁLISIS DEL FENOTIPO HIPERMETILADOR EN GLIOMAS El análisis del fenotipo hipermetilador de los gliomas se llevó a cabo

mediante la técnica MS-MLPA. Se utilizó el kit SALSA MLPA KIT ME042-B1

CIMP (MRC-Holland) que contiene 44 sondas, 12 de las cuales (sondas

control) no tienen punto de corte para la enzima de restricción sensible a

metilación HhaI (reconoce la secuencia GCGC, cortando entre la CG centrales

y cuando la C no está metilada). Las otras 31 sondas sí tienen esta secuencia y

son digeridas por la enzima de restricción sólo cuando la secuencia de

reconocimiento no está metilada. Las 31 sondas MS-MLPA detectan la

metilación de las regiones promotoras de 8 genes diferentes: CACNA1G

(calcium channel voltage-dependent T type alpha 1G subunit), CDKN2A,

CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), IGF2 (insulin like growth

factor 2), MLH1, NEUROG1 (neurogenin 1), RUNX3 (run related transcription

factor 3) y SOCS1. Estas regiones promotoras no están metiladas en el ADN

derivado de sangre de individuos sanos, pero se ha demostrado que están

frecuentemente metiladas en tumores CIMP. La sonda que falta detecta la

mutación V600E en BRAF. Este kit contiene los 8 marcadores que definen el

fenotipo CIMP en cáncer colorrectal.

Cada reacción de MS-MLPA genera dos muestras para análisis por

electroforesis capilar: una muestra no digerida de referencia y una muestra

digerida para detectar la metilación. El protocolo detallado, al igual que el de

MGMT, se describe en el Anexo IV. La única diferencia radica en la sonda

añadida al primer mástermix de hibridación.


modo que en los apartados anteriores. También se utilizaron plantillas de hojas

de cálculo Microsoft Excel para interpretar los resultados de la electroforesis

(GeneScan software). En este caso, como en el caso de la metilación de

MGMT, los ratios son el resultado del cociente entre la altura normalizada de

cada pico de la muestra digerida y la altura normalizada de su pico

correspondiente del control no digerido (Figura 22 y 23).

Material y métodos

67


masculino de, aproximadamente, 50ng digerido y analizado con el kit SALSA MLPA KIT

ME042-B1 CIMP para determinar el estado de metilación.


masculino de, aproximadamente, 50ng no digerido y analizado con el kit SALSA MLPA KIT

ME042-B1 CIMP para cuantificar el estado de metilación.

La determinación del estado de metilación de cada uno de los genes del

panel de CIMP se basa en el comportamiento de las diferentes sondas para

cada gen, siguiendo los siguientes criterios:

106

Material y métodos

68

Metilado: 3 sondas tienen un ratio superior a 0.25, 1 sonda tiene un ratio

superior a 0.4 y al menos otra sonda con un ratio superior a 0.25, 1

única sonda tiene un ratio superior a 0.7.

Parcialmente Metilado: 1 ó 2 sondas con un ratio ligeramente superior

a 0.25, 1 sonda con un ratio entre 0.4 y 0.6.

No Metilado: todas las sondas tienen un ratio inferior a 0.25.

La metilación global se basa en el número de genes metilados con

respecto al total de los genes interrogados por el kit de MS-MLPA, en este caso

un total de ocho genes. Aquellas muestras que presentan cinco o más genes

metilados en base a los criterios anteriores, se consideran CIMP positivas

(Anexo VI).

3.6. ANÁLISIS DE IDH1 E IDH2 POR SECUENCIACIÓN DIRECTA

Tanto para el gen IDH1 como para IDH2 se amplificó mediante la PCR el

exón 4, que codifica para la región del dominio catalítico que contiene el codón

en el que se han descrito las mutaciones somáticas (R132 para IDH1 y R172

para IDH2). Para ello se utilizaron los cebadores descritos por Martin van den

Bent (Martin J. van den Bent, et al., 2010) (Tabla 6). Los reactivos de la PCR y

el programa de temperaturas se describen en las tablas 7 y 8.


IDH1 forward CTCCTGATGAGAAGAGGGTTG

IDH1 reverse TGGAAATTTCTGGGCCATG

IDH2 forward TGGAACTATCCGGAACATCC

IDH2 reverse AGTCTGTGGCCTTGTACTGC

Materiales y métodos

69


REACTIVOS PCR IDH1/IDH2

Type-it ……………………………7.5µL

Glicerol (50%)……………………2.4µL

H2O……………………………….1.85µL

Primers 20pm (F+R)…………….1.25µL

ADN……………………………….2µL

Volumen total………………….....15µL


El producto de PCR se purificó con el reactivo Exosap-it (usb-Affymetrix)

para eliminar los reactivos sobrantes de la reacción de PCR (dNTP,

deoxinucleósidos trifosfato) y cebadores no utilizados.

Un total de 1.5µL del producto de PCR purificado se utilizaron como

ADN molde para la reacción de secuencia usando el BigDye® Terminator

Sequencing kit V3.1 (Applied Biosystems). Para mejorar la especificidad de

esta reacción se diseñó un cebador interno en un único sentido para IDH1 y

5 min a 95ºC 1 ciclo

30 seg a 95ºC

45 seg a 57ºC (IDH1)


45ºC a 72ºC


∞ a 10ºC 1 ciclo

40 ciclos

107

Material y métodos

68

Metilado: 3 sondas tienen un ratio superior a 0.25, 1 sonda tiene un ratio

superior a 0.4 y al menos otra sonda con un ratio superior a 0.25, 1

única sonda tiene un ratio superior a 0.7.

Parcialmente Metilado: 1 ó 2 sondas con un ratio ligeramente superior

a 0.25, 1 sonda con un ratio entre 0.4 y 0.6.

No Metilado: todas las sondas tienen un ratio inferior a 0.25.

La metilación global se basa en el número de genes metilados con

respecto al total de los genes interrogados por el kit de MS-MLPA, en este caso

un total de ocho genes. Aquellas muestras que presentan cinco o más genes

metilados en base a los criterios anteriores, se consideran CIMP positivas

(Anexo VI).

3.6. ANÁLISIS DE IDH1 E IDH2 POR SECUENCIACIÓN DIRECTA

Tanto para el gen IDH1 como para IDH2 se amplificó mediante la PCR el

exón 4, que codifica para la región del dominio catalítico que contiene el codón

en el que se han descrito las mutaciones somáticas (R132 para IDH1 y R172

para IDH2). Para ello se utilizaron los cebadores descritos por Martin van den

Bent (Martin J. van den Bent, et al., 2010) (Tabla 6). Los reactivos de la PCR y

el programa de temperaturas se describen en las tablas 7 y 8.


IDH1 forward CTCCTGATGAGAAGAGGGTTG

IDH1 reverse TGGAAATTTCTGGGCCATG

IDH2 forward TGGAACTATCCGGAACATCC

IDH2 reverse AGTCTGTGGCCTTGTACTGC


69


REACTIVOS PCR IDH1/IDH2

Type-it ……………………………7.5µL

Glicerol (50%)……………………2.4µL

H2O……………………………….1.85µL

Primers 20pm (F+R)…………….1.25µL

ADN……………………………….2µL

Volumen total………………….....15µL


El producto de PCR se purificó con el reactivo Exosap-it (usb-Affymetrix)

para eliminar los reactivos sobrantes de la reacción de PCR (dNTP,

deoxinucleósidos trifosfato) y cebadores no utilizados.

Un total de 1.5µL del producto de PCR purificado se utilizaron como

ADN molde para la reacción de secuencia usando el BigDye® Terminator

Sequencing kit V3.1 (Applied Biosystems). Para mejorar la especificidad de

esta reacción se diseñó un cebador interno en un único sentido para IDH1 y


30 seg a 95ºC



45ºC a 72ºC


∞ a 10ºC 1 ciclo

40 ciclos

108


70

otro para IDH2. Los cebadores internos de secuenciación se diseñaron con el

programa informático Primer3 V 0.4.0 y fueron los siguientes (Tabla 9):


IDH1-sec GAAATATTCTGGGTGGCACG

IDH2-sec AGCCCATCATCTGCAAAAAC

Los productos de las reacciones de secuencia se purificaron por

centrifugación en columnas DTR Gel Filtration Cartridges (EdgeBio) según las

instrucciones del fabricante. Una vez purificadas, las secuencias se resolvieron

mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático (ABI-PRISM

3100 Avant, Applied Biosystems) y se visualizaron mediante el programa

Sequencing Analysis V 5.4 (Applied Biosystems). El límite de detección de una

mutación somática por secuenciación está en torno al 10%. Si el número de

alelos mutados está por debajo de ese límite, puede no detectarse, por lo que

se asume la posibilidad de falsos negativos.

3.7. RETROTRANSCRIPCIÓN-PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (RT-qPCR)

La RT-qPCR (qPCR con transcriptasa reversa) se realiza mediante dos

procesos consecutivos. En primer lugar se realiza una retro-transcripción, o

transcripción reversa, a partir de ARN de las muestras para sintetizar ADNc

(ADN complementario), por acción de la enzima retrotranscriptasa. Este ADNc

se utiliza como material de partida para el segundo proceso: la qPCR en tiempo

real, que mide la liberación de fluorescencia en la amplificación por PCR, de

modo que es posible determinar la concentración inicial de ácido nucleico. Para

llevar a cabo esta detección se utiliza un fragmento de ADN (en este caso

sondas TaqMan) complementario a la región del ADN que se quiere amplificar.

Material y métodos

71

Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente en el extremo 5’ y otra

molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher") en el extremo 3’. Cuando

la secuencia diana está presente, la sonda hibrida y se escinde por la actividad

5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa durante la extensión. De tal forma que,

cuando la sonda es desplazada de su sitio, la molécula fluorescente se libera

de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con una luz

de determinada longitud de onda. La cantidad de la fluorescencia emitida

durante cada ciclo de PCR será exponencialmente proporcional a la cantidad

de ADN que se está amplificando (Figura 24).


La qPCR (Figura 25) se centra en la fase exponencial, fase no saturada

de la reacción, que proporciona los datos más precisos y exactos para la

cuantificación. Durante la esta fase se calculan dos parámetros:

109


70

otro para IDH2. Los cebadores internos de secuenciación se diseñaron con el

programa informático Primer3 V 0.4.0 y fueron los siguientes (Tabla 9):


IDH1-sec GAAATATTCTGGGTGGCACG

IDH2-sec AGCCCATCATCTGCAAAAAC

Los productos de las reacciones de secuencia se purificaron por

centrifugación en columnas DTR Gel Filtration Cartridges (EdgeBio) según las

instrucciones del fabricante. Una vez purificadas, las secuencias se resolvieron

mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático (ABI-PRISM

3100 Avant, Applied Biosystems) y se visualizaron mediante el programa

Sequencing Analysis V 5.4 (Applied Biosystems). El límite de detección de una

mutación somática por secuenciación está en torno al 10%. Si el número de

alelos mutados está por debajo de ese límite, puede no detectarse, por lo que

se asume la posibilidad de falsos negativos.

3.7. RETROTRANSCRIPCIÓN-PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (RT-qPCR)

La RT-qPCR (qPCR con transcriptasa reversa) se realiza mediante dos

procesos consecutivos. En primer lugar se realiza una retro-transcripción, o

transcripción reversa, a partir de ARN de las muestras para sintetizar ADNc

(ADN complementario), por acción de la enzima retrotranscriptasa. Este ADNc

se utiliza como material de partida para el segundo proceso: la qPCR en tiempo

real, que mide la liberación de fluorescencia en la amplificación por PCR, de

modo que es posible determinar la concentración inicial de ácido nucleico. Para

llevar a cabo esta detección se utiliza un fragmento de ADN (en este caso

sondas TaqMan) complementario a la región del ADN que se quiere amplificar.

Material y métodos

71

Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente en el extremo 5’ y otra

molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher") en el extremo 3’. Cuando

la secuencia diana está presente, la sonda hibrida y se escinde por la actividad

5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa durante la extensión. De tal forma que,

cuando la sonda es desplazada de su sitio, la molécula fluorescente se libera

de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con una luz

de determinada longitud de onda. La cantidad de la fluorescencia emitida

durante cada ciclo de PCR será exponencialmente proporcional a la cantidad

de ADN que se está amplificando (Figura 24).


La qPCR (Figura 25) se centra en la fase exponencial, fase no saturada

de la reacción, que proporciona los datos más precisos y exactos para la

cuantificación. Durante la esta fase se calculan dos parámetros:

110

Material y métodos

72

Umbral (threshold): nivel de detección en el que una reacción alcanza

una intensidad fluorescente por encima del ruido de fondo (background).

Ct (Ciclo umbral): ciclo de la PCR en el que la muestra alcanza el

umbral. Es inversamente proporcional al número de copias de ADNc de

la muestra, por lo que a mayor concentración de ADNc, menor Ct y, por

lo tanto, mayor expresión del gen de interés.

Figura 25. Curva tipo de una reacción cuantitativa a tiempo real. En la imagen están

representadas las diferentes fases: línea basal, fase exponencial, fase lineal y meseta. Se

observa, además, el Ct.

3.7.1. DETECCIÓN DE CMV 3.7.1.1. qPCR Para la detección de CMV se utilizó el kit RealStar CMV PCR Kit 1.2

(Altona Diagnostics GmbM). Se trata de un test diagnóstico in vitro, basado en

la tecnología de la PCR a tiempo real, para la detección y cuantificación de

Fase exponencial Fase lineal

Meseta

Material y métodos

73

ADN específico de CMV en humanos. El test utiliza la reacción de PCR para la

amplificación de secuencias específicas y sondas específicas de interés para la

detección y amplificación de ADN. La sonda específica para ADN de CMV está

marcada con el fluoróforo FAM, y la sonda específica para el control interno

está marcada con fluoróforo JOE.

El kit está formado por:

Dos reactivos Máster (Máster A y Máster B), que contienen todos los

componentes para que sea posible la amplificación y detección, por

PCR, del ADN específico de CMV y el control interno.

Un ADN control interno.

Cuatro estándares de cuantificación, que contienen concentraciones

específicas de CMV para generar una curva estándar, y de esta forma

poder determinar la concentración de CMV en la muestra (Tabla 10).

Agua de calidad para PCR.

Tabla 10. Estándares de cuantificación. Los cuatro estándares y sus

correspondientes concentraciones de CMV.

Estándares de cuantificación Concentración [IU/µL] QS1 1.00E+04

QS2 1.00E+03

QS3 1.00E+02

QS4 1.00E+01

El protocolo (Tablas 11 y 12) llevado a cabo se describe en el Anexo VII.

111

Material y métodos

72

Umbral (threshold): nivel de detección en el que una reacción alcanza

una intensidad fluorescente por encima del ruido de fondo (background).

Ct (Ciclo umbral): ciclo de la PCR en el que la muestra alcanza el

umbral. Es inversamente proporcional al número de copias de ADNc de

la muestra, por lo que a mayor concentración de ADNc, menor Ct y, por

lo tanto, mayor expresión del gen de interés.

Figura 25. Curva tipo de una reacción cuantitativa a tiempo real. En la imagen están

representadas las diferentes fases: línea basal, fase exponencial, fase lineal y meseta. Se

observa, además, el Ct.

3.7.1. DETECCIÓN DE CMV 3.7.1.1. qPCR Para la detección de CMV se utilizó el kit RealStar CMV PCR Kit 1.2

(Altona Diagnostics GmbM). Se trata de un test diagnóstico in vitro, basado en

la tecnología de la PCR a tiempo real, para la detección y cuantificación de

Fase exponencial Fase lineal

Meseta

Material y métodos

73

ADN específico de CMV en humanos. El test utiliza la reacción de PCR para la

amplificación de secuencias específicas y sondas específicas de interés para la

detección y amplificación de ADN. La sonda específica para ADN de CMV está

marcada con el fluoróforo FAM, y la sonda específica para el control interno

está marcada con fluoróforo JOE.

El kit está formado por:

Dos reactivos Máster (Máster A y Máster B), que contienen todos los

componentes para que sea posible la amplificación y detección, por

PCR, del ADN específico de CMV y el control interno.

Un ADN control interno.

Cuatro estándares de cuantificación, que contienen concentraciones

específicas de CMV para generar una curva estándar, y de esta forma

poder determinar la concentración de CMV en la muestra (Tabla 10).

Agua de calidad para PCR.

Tabla 10. Estándares de cuantificación. Los cuatro estándares y sus

correspondientes concentraciones de CMV.

Estándares de cuantificación Concentración [IU/µL] QS1 1.00E+04

QS2 1.00E+03

QS3 1.00E+02

QS4 1.00E+01

El protocolo (Tablas 11 y 12) llevado a cabo se describe en el Anexo VII.

112

Material y métodos

74

Tabla 11. Mix de reacción para la PCR.

Tabla 12. Condiciones de la qPCR para la detección de CMV.


5 seg a 95ºC

30 seg a 60ºC

10 seg a 72ºC

30 seg a 40ºC 1 ciclo

Las muestras se analizaron por duplicado. Se usó una curva estandar de

seis puntos (Coeficiente de correlación de Pearson >0.99) para interpolar la

carga viral de HCMV de 10 a 10000 copias por célula.

3.7.1.2. Nested PCR

Se usó una segunda técnica, Nested PCR, para detectar HCMV en un

subconjunto de las muestras anteriores con el fin de corroborar los resultados

obtenidos mediante RT-qPCR. El proceso de pre-amplificación se llevó a cabo

Número de reacciones 1

Máster A 2.5µL

Máster B 5µL

Control Interno 0.5µL

Volumen Máster Mix 8µL

45 ciclos

Material y métodos

75

en un espacio de trabajo aislado, en una cabina de flujo vertical tratada con luz

UV para evitar contaminaciones y falsos positivos. Se analizaron con este

método 2 muestras incluídas en parafina y 28 muestras de tejido congelado. El

esquema de la Nested PCR seguido fue el descrito previamente por

Bhattacharjee y col (Bhattacharjee, et al., 2012) (Anexo VIII).

3.7.2. DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE EXPRESIÓN GÉNICA DE SOCS1 Y MGMT POR RT-qPCR 3.7.2.1. Retrotranscripción

Para la retrotranscripción se utilizó el TaqMan Reverse Transcription kit

de Applied Biosystems.

1. Preparar Máster Mix de retrotranscripción (volumen final por muestra de

ARN: 25µL). Se aconseja añadir la enzima retrotranscriptasa en último lugar y,

mientras, se mantiene en frío en un termobloque (Tabla 13).

Tabla 13. Reactivos y sus correspondientes volúmenes para la PCR de retrotranscripción.

Reactivos para la retrotranscripción

10X Reverse Transcription Buffer………………………………………5µL

25X dNTPs………………………………………………….....................2µL

10X Random Primers………………………………………...................5µL

MultiScribeTM Reverse Transcriptase MMLV (50U/µL)…..................2.5µL

Oligo dT………………………………………………………..................2.5µL

Inhibidor de RNasa…………………………………………...................2.5µL

H2O libre de nucleasa……………………………………......................5.5µL

Volumen total por reacción………………………………....................25µL

2. Añadir 250ng ARN/reacción. Las muestras de ARN de partida tienen

concentración conocida, por lo que se calcula el V (volumen) necesario para

113

Material y métodos

74

Tabla 11. Mix de reacción para la PCR.

Tabla 12. Condiciones de la qPCR para la detección de CMV.


5 seg a 95ºC

30 seg a 60ºC

10 seg a 72ºC

30 seg a 40ºC 1 ciclo

Las muestras se analizaron por duplicado. Se usó una curva estandar de

seis puntos (Coeficiente de correlación de Pearson >0.99) para interpolar la

carga viral de HCMV de 10 a 10000 copias por célula.

3.7.1.2. Nested PCR

Se usó una segunda técnica, Nested PCR, para detectar HCMV en un

subconjunto de las muestras anteriores con el fin de corroborar los resultados

obtenidos mediante RT-qPCR. El proceso de pre-amplificación se llevó a cabo

Número de reacciones 1

Máster A 2.5µL

Máster B 5µL

Control Interno 0.5µL

Volumen Máster Mix 8µL

45 ciclos

Material y métodos

75

en un espacio de trabajo aislado, en una cabina de flujo vertical tratada con luz

UV para evitar contaminaciones y falsos positivos. Se analizaron con este

método 2 muestras incluídas en parafina y 28 muestras de tejido congelado. El

esquema de la Nested PCR seguido fue el descrito previamente por

Bhattacharjee y col (Bhattacharjee, et al., 2012) (Anexo VIII).

3.7.2. DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE EXPRESIÓN GÉNICA DE SOCS1 Y MGMT POR RT-qPCR 3.7.2.1. Retrotranscripción

Para la retrotranscripción se utilizó el TaqMan Reverse Transcription kit

de Applied Biosystems.

1. Preparar Máster Mix de retrotranscripción (volumen final por muestra de

ARN: 25µL). Se aconseja añadir la enzima retrotranscriptasa en último lugar y,

mientras, se mantiene en frío en un termobloque (Tabla 13).

Tabla 13. Reactivos y sus correspondientes volúmenes para la PCR de retrotranscripción.

Reactivos para la retrotranscripción

10X Reverse Transcription Buffer………………………………………5µL

25X dNTPs………………………………………………….....................2µL

10X Random Primers………………………………………...................5µL

MultiScribeTM Reverse Transcriptase MMLV (50U/µL)…..................2.5µL

Oligo dT………………………………………………………..................2.5µL

Inhibidor de RNasa…………………………………………...................2.5µL

H2O libre de nucleasa……………………………………......................5.5µL

Volumen total por reacción………………………………....................25µL

2. Añadir 250ng ARN/reacción. Las muestras de ARN de partida tienen

concentración conocida, por lo que se calcula el V (volumen) necesario para

114

Material y métodos

76

obtener los 250ng en un volumen final de 25µL (si es necesario, se añade agua

destilada hasta alcanzar dicho volumen).

VARN (µL) = 250ng/[ARN]0 (ng/µL)

VH2O = 25µL - VARN (µL)

3. Añadir y mezclar con la pipeta 25µl de Máster Mix a cada una de las

muestras, siendo 50µL el volumen total por reacción.

4. Dar un pulso a los tubos y colocarlos en el termociclador con el programa

siguiente (Figura 26):

Figura 26. Condiciones de la PCR para la retrotranscripción.

3.7.2.2. PCR cuantitativa a tiempo real

1. Programar el termociclador para realizar la qPCR (Applied Biosystems

7300 Real-Time PCR System) y crear una plantilla. El gen GAPDH

(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) es un “housekeeping

gene” o gen de expresión constitutiva, que sirve como control positivo

para poder cuantificar la expresión relativa de los genes SOCS1 y

MGMT. El NTC (Non Template Control) es el control negativo y no

contiene ADNc, sino agua.

2. Preparar 3 Máster Mix de PCR (Tabla 14), uno para cada gen: SOCS1,

MGMT, GAPDH.

∞

Material y métodos

77

Tabla 14. Volúmenes para la preparación de los Máster Mixes de PCR.

Reactivo Volumen (µL)

TaqMan®Universal PCR Master Mix 2X 7.5

TaqMan®Gene Expressión Assay 20X (SOCS1, MGMT,

GAPDH)

0.75

H2O destilada 2.75

ADNc muestra 4

Total por reacción 15

3. Añadir 11 µl Máster Mix/ pocillo en la placa.

4. Añadir 4 µl ADNc de cada muestra en el pocillo correspondiente según

el esquema de la placa (Figura 27).

5. Adherir el papel óptico en la superficie de la placa para evitar la

evaporación de las muestras y prevenir su posible contaminación.

6. Dar un pulso de centrífuga a la placa e introducirla en el termociclador.

Figura 27. Esquema de placa para la PCR cuantitativa a tiempo real. Cada muestra por

triplicado para cada uno de los genes.

115

Material y métodos

76

obtener los 250ng en un volumen final de 25µL (si es necesario, se añade agua

destilada hasta alcanzar dicho volumen).

VARN (µL) = 250ng/[ARN]0 (ng/µL)

VH2O = 25µL - VARN (µL)

3. Añadir y mezclar con la pipeta 25µl de Máster Mix a cada una de las

muestras, siendo 50µL el volumen total por reacción.

4. Dar un pulso a los tubos y colocarlos en el termociclador con el programa

siguiente (Figura 26):

Figura 26. Condiciones de la PCR para la retrotranscripción.

3.7.2.2. PCR cuantitativa a tiempo real

1. Programar el termociclador para realizar la qPCR (Applied Biosystems

7300 Real-Time PCR System) y crear una plantilla. El gen GAPDH

(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) es un “housekeeping

gene” o gen de expresión constitutiva, que sirve como control positivo

para poder cuantificar la expresión relativa de los genes SOCS1 y

MGMT. El NTC (Non Template Control) es el control negativo y no

contiene ADNc, sino agua.

2. Preparar 3 Máster Mix de PCR (Tabla 14), uno para cada gen: SOCS1,

MGMT, GAPDH.

∞

Material y métodos

77

Tabla 14. Volúmenes para la preparación de los Máster Mixes de PCR.

Reactivo Volumen (µL)

TaqMan®Universal PCR Master Mix 2X 7.5

TaqMan®Gene Expressión Assay 20X (SOCS1, MGMT,

GAPDH)

0.75

H2O destilada 2.75

ADNc muestra 4

Total por reacción 15

3. Añadir 11 µl Máster Mix/ pocillo en la placa.

4. Añadir 4 µl ADNc de cada muestra en el pocillo correspondiente según

el esquema de la placa (Figura 27).

5. Adherir el papel óptico en la superficie de la placa para evitar la

evaporación de las muestras y prevenir su posible contaminación.

6. Dar un pulso de centrífuga a la placa e introducirla en el termociclador.

Figura 27. Esquema de placa para la PCR cuantitativa a tiempo real. Cada muestra por

triplicado para cada uno de los genes.

116

Material y métodos

78

Para analizar los resultados de expresión extraídos de la RT-qPCR se

elaboró una hoja de cálculo predefinida en la cual se calculó el cociente entre la

expresión relativa de cada una de las muestras tumorales con respecto a la

expresión relativa del control sano (Fórmula 1), así como la desviación

estándar para cada conjunto de determinaciones por triplicado de Ct (réplicas

técnicas).

Fórmula 1. Ratio entre la expresión del tejido tumoral con respecto al tejido normal

sano. Se calcula para cada una de las muestras que componen la serie.

Se consideró que las muestras que presentaron valores de expresión por

debajo de 1.3 o por encima de 0.7, la expresión era prácticamente igual a la del

tejido normal (±30% de margen que incluye la variabilidad experimental) y no

se espera que haya una repercusión a nivel funcional.

3.8. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO DE idh1, ki67, p53 Y HCMV

La detección de la expresión a nivel de proteínas se realizó por IHQ

sobre secciones de TMA (Tissue microarray) en el Servicio de Anatomía

Patológica del HGUA y del HGUE. Los TMAs se construyeron con inclusión de

2 cilindros de tejido tumoral por caso (cilindros de 1mm, un total 80 cilindros por

bloque) utilizando un dispositivo manual adecuado para ello (MTA-1, manual

tissue arrayer, Beecher Instruments). Los TMAs permiten estudiar de forma

simultánea todos los casos, minimizando el número de secciones y el coste en

reactivos y proporcionando una reacción inmunohistoquímica uniforme a todos

los casos incluidos en el TMA. Las técnicas inmunohistoquímicas se realizan

sobre cortes de los TMAs, de forma automatizada con equipo Techmate-500,

Material y métodos

79

con sistema de visualización de alta sensibilidad Envision® (DakoCytomation).

La valoración inmunohistoquímica se realizó por visualización al microscopio

óptico de forma independiente por dos patólogos.

idh1: se consideran positivos los casos con tinción

nuclear/citoplasmática de las células tumorales. Se consideran

negativos los casos que no muestren tinción.

ki67: se determina el porcentaje de células tumorales con tinción

nuclear.

p53: se determina el porcentaje de células tumorales con tinción nuclear.

HCMV: se utiliza el anticuerpo monoclonal Anti-CMV clones

CCH2/DDG9 (prediluído de DAKO) que se corresponde con las

proteínas p52 y p76 del HCMV.

3.9. MICROARRAY DE EXPRESIÓN

3.9.1. AMPLIFICACIÓN DEL ARN, MARCAJE E HIBRIDACIÓN A MICROARRAYS AGILENT

Esta parte se realizó en la empresa Bioarray S.L. (www.bioarray.es). La

calidad del ARN se evaluó usando TapeStation (Agilent Technologies). La

concentración del ARN y la incorporación del colorante se midieron usando un

espectrofotómetro UV-VIS (Nanodrop 1000, Agilent Technologies, Wilmington,

DE, USA). La hibridación al Microarray de Expresión Génica Custom 8x15K (ID

048848, Agilent Technologies) (genes analizados en el enlace

https://mynotebook.labarchives.com/share/Araceli/MjIuMXwxOTg1OTEvMTcvV

HJlZU5vZGUvODIwNTEwNjczfDU2LjE) se llevó a cabo siguiendo el protocolo

de dos colores del fabricante (Two-Color Microarray-Based Gene Expression

Analysis v.6.5, Agilent Technologies) y los colorantes de intercambio (Cy3 y

Cy5) se realizaron para el ARN amplificado a partir de cada muestra. Los chips

de Microarray se lavaron e, inmediatamente, se escanearon utilizando un DNA

Microarray Scanner (Modelo G2505C, Agilent Technologies).

117

Material y métodos

78

Para analizar los resultados de expresión extraídos de la RT-qPCR se

elaboró una hoja de cálculo predefinida en la cual se calculó el cociente entre la

expresión relativa de cada una de las muestras tumorales con respecto a la

expresión relativa del control sano (Fórmula 1), así como la desviación

estándar para cada conjunto de determinaciones por triplicado de Ct (réplicas

técnicas).

Fórmula 1. Ratio entre la expresión del tejido tumoral con respecto al tejido normal

sano. Se calcula para cada una de las muestras que componen la serie.

Se consideró que las muestras que presentaron valores de expresión por

debajo de 1.3 o por encima de 0.7, la expresión era prácticamente igual a la del

tejido normal (±30% de margen que incluye la variabilidad experimental) y no

se espera que haya una repercusión a nivel funcional.

3.8. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO DE idh1, ki67, p53 Y HCMV

La detección de la expresión a nivel de proteínas se realizó por IHQ

sobre secciones de TMA (Tissue microarray) en el Servicio de Anatomía

Patológica del HGUA y del HGUE. Los TMAs se construyeron con inclusión de

2 cilindros de tejido tumoral por caso (cilindros de 1mm, un total 80 cilindros por

bloque) utilizando un dispositivo manual adecuado para ello (MTA-1, manual

tissue arrayer, Beecher Instruments). Los TMAs permiten estudiar de forma

simultánea todos los casos, minimizando el número de secciones y el coste en

reactivos y proporcionando una reacción inmunohistoquímica uniforme a todos

los casos incluidos en el TMA. Las técnicas inmunohistoquímicas se realizan

sobre cortes de los TMAs, de forma automatizada con equipo Techmate-500,

Material y métodos

79

con sistema de visualización de alta sensibilidad Envision® (DakoCytomation).

La valoración inmunohistoquímica se realizó por visualización al microscopio

óptico de forma independiente por dos patólogos.

idh1: se consideran positivos los casos con tinción

nuclear/citoplasmática de las células tumorales. Se consideran

negativos los casos que no muestren tinción.

ki67: se determina el porcentaje de células tumorales con tinción

nuclear.

p53: se determina el porcentaje de células tumorales con tinción nuclear.

HCMV: se utiliza el anticuerpo monoclonal Anti-CMV clones

CCH2/DDG9 (prediluído de DAKO) que se corresponde con las

proteínas p52 y p76 del HCMV.


3.9.1. AMPLIFICACIÓN DEL ARN, MARCAJE E HIBRIDACIÓN A MICROARRAYS AGILENT

Esta parte se realizó en la empresa Bioarray S.L. (www.bioarray.es). La

calidad del ARN se evaluó usando TapeStation (Agilent Technologies). La

concentración del ARN y la incorporación del colorante se midieron usando un

espectrofotómetro UV-VIS (Nanodrop 1000, Agilent Technologies, Wilmington,

DE, USA). La hibridación al Microarray de Expresión Génica Custom 8x15K (ID

048848, Agilent Technologies) (genes analizados en el enlace

https://mynotebook.labarchives.com/share/Araceli/MjIuMXwxOTg1OTEvMTcvV

HJlZU5vZGUvODIwNTEwNjczfDU2LjE) se llevó a cabo siguiendo el protocolo

de dos colores del fabricante (Two-Color Microarray-Based Gene Expression

Analysis v.6.5, Agilent Technologies) y los colorantes de intercambio (Cy3 y

Cy5) se realizaron para el ARN amplificado a partir de cada muestra. Los chips

de Microarray se lavaron e, inmediatamente, se escanearon utilizando un DNA

Microarray Scanner (Modelo G2505C, Agilent Technologies).

118

Material y métodos

80

3.9.2. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE EXPRESIÓN GÉNICA

El análisis bioinformático se llevó a cabo con la ayuda del Dr. Eduardo

Larriba. La extracción de datos de las características del Microarray se realizó

utilizando el Feature Extraction Software (v.10.7) disponible en Agilent, usando

las variables predeterminadas. Las características atípicas en los arrays fueron

marcadas con el mismo paquete de software. El análisis de datos se llevó a

cabo utilizando la caja de herramientas para R Bioconductor

(www.bioconductor.org). El preprocesamiento de datos y el análisis de

expresión diferencial se realizaron utilizando el paquete de R/Bioconductor

Limma y se utilizaron las últimas anotaciones de genes disponibles RefSeq.

Las intensidades brutas de las características fueron corregidas utilizando un

algoritmo de corrección Normex Background. Dentro del array, la normalización

se realizó utilizando una regresión polinómica ponderada implementada en el

paquete de R/Bioconductor LOESS. Para la normalización entre arrays se

utilizó una normalización Aquantil. La expresión de cada gen se determinó

como el logaritmo en base 2 de la relación entre el valor obtenido de cada

condición relativa y el valor de cada condición control. Un gen se considera

diferencialmente expresado si muestra un p-valor ajustado menor que 0.05 por

test paramétrico. Estos análisis de enriquecimiento se realizaron utilizando el

web-tool DAVID bioinformatics Resources 6.7 (Huang da, Sherman, &

Lempicki, 2009a), siguiendo el protocolo publicado en Nature Protocols (Huang

da, Sherman, & Lempicki, 2009b). Estos análisis de enriquecimiento se basan,

en primer lugar, en utilizar la anotación funcional (asignación de términos

funcionales obtenidos de diferentes sistemas de anotación funcional, como por

ejemplo la anotación Gene Ontology) de los genes expresados

diferencialmente. En segundo lugar, las anotaciones presentes en los genes

expresados se contrastaron con las anotaciones de todos los genes presentes

en nuestra micromatriz de ADN y se observó estadísticamente qué funciones

se encontraban sobre o infra representadas (términos enriquecidos).

Material y métodos

81

3.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Toda la información sobre las variables incluidas en el estudio fue

introducida en una base de datos creada a tal efecto. En primer lugar se

realizó un análisis descriptivo de los casos incluidos en el estudio. El análisis

de las variables cualitativas se realizó mediante el cálculo de la frecuencia

relativa en porcentajes, y el de las cuantitativas, calculando la mediana. Los

datos obtenidos se analizaron mediante diferentes test estadísticos para

valorar su significación estadística. Las variables cuantitativas fueron

dicotomizadas usando el percentil 75 de cada una como punto de corte. Para

el contraste de las hipótesis planteadas se utilizó una p≤0.05. La comparación

de las variables cualitativas se realizó mediante análisis univariante con tablas

de contingencia cuyo valor estadístico se estimó mediante la prueba chi-

cuadrado, y en los casos en los que la n fue menor de 5 se utilizó el Test de

Fisher. Se calculó el Odds Ratio (OR) y el Intervalo de Confianza al 95% (IC

95%).

La supervivencia global fue analizada mediante curvas Kaplan-Meier y

se realizó un análisis multivariante con Regresión de Cox.

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa R-

Commander.

119

Material y métodos

80

3.9.2. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE EXPRESIÓN GÉNICA

El análisis bioinformático se llevó a cabo con la ayuda del Dr. Eduardo

Larriba. La extracción de datos de las características del Microarray se realizó

utilizando el Feature Extraction Software (v.10.7) disponible en Agilent, usando

las variables predeterminadas. Las características atípicas en los arrays fueron

marcadas con el mismo paquete de software. El análisis de datos se llevó a

cabo utilizando la caja de herramientas para R Bioconductor

(www.bioconductor.org). El preprocesamiento de datos y el análisis de

expresión diferencial se realizaron utilizando el paquete de R/Bioconductor

Limma y se utilizaron las últimas anotaciones de genes disponibles RefSeq.

Las intensidades brutas de las características fueron corregidas utilizando un

algoritmo de corrección Normex Background. Dentro del array, la normalización

se realizó utilizando una regresión polinómica ponderada implementada en el

paquete de R/Bioconductor LOESS. Para la normalización entre arrays se

utilizó una normalización Aquantil. La expresión de cada gen se determinó

como el logaritmo en base 2 de la relación entre el valor obtenido de cada

condición relativa y el valor de cada condición control. Un gen se considera

diferencialmente expresado si muestra un p-valor ajustado menor que 0.05 por

test paramétrico. Estos análisis de enriquecimiento se realizaron utilizando el

web-tool DAVID bioinformatics Resources 6.7 (Huang da, Sherman, &

Lempicki, 2009a), siguiendo el protocolo publicado en Nature Protocols (Huang

da, Sherman, & Lempicki, 2009b). Estos análisis de enriquecimiento se basan,

en primer lugar, en utilizar la anotación funcional (asignación de términos

funcionales obtenidos de diferentes sistemas de anotación funcional, como por

ejemplo la anotación Gene Ontology) de los genes expresados

diferencialmente. En segundo lugar, las anotaciones presentes en los genes

expresados se contrastaron con las anotaciones de todos los genes presentes

en nuestra micromatriz de ADN y se observó estadísticamente qué funciones

se encontraban sobre o infra representadas (términos enriquecidos).

Material y métodos

81

3.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Toda la información sobre las variables incluidas en el estudio fue

introducida en una base de datos creada a tal efecto. En primer lugar se

realizó un análisis descriptivo de los casos incluidos en el estudio. El análisis

de las variables cualitativas se realizó mediante el cálculo de la frecuencia

relativa en porcentajes, y el de las cuantitativas, calculando la mediana. Los

datos obtenidos se analizaron mediante diferentes test estadísticos para

valorar su significación estadística. Las variables cuantitativas fueron

dicotomizadas usando el percentil 75 de cada una como punto de corte. Para

el contraste de las hipótesis planteadas se utilizó una p≤0.05. La comparación

de las variables cualitativas se realizó mediante análisis univariante con tablas

de contingencia cuyo valor estadístico se estimó mediante la prueba chi-

cuadrado, y en los casos en los que la n fue menor de 5 se utilizó el Test de

Fisher. Se calculó el Odds Ratio (OR) y el Intervalo de Confianza al 95% (IC

95%).

La supervivencia global fue analizada mediante curvas Kaplan-Meier y

se realizó un análisis multivariante con Regresión de Cox.

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa R-

Commander.

RESULTADOS

RESULTADOS

Resultados

4. RESULTADOS 4.1. CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPALES MARCADORES

MOLECULARES EN GLIOMAS

4.1.1. ANÁLISIS DE LA METILACIÓN DEL PROMOTOR DEL GEN MGMT Y SU ASOCIACIÓN CON LAS VARIABLES CLÍNICAS

La determinación del estado de metilación del promotor de MGMT

realizada mediante MS-MLPA mostró que los tumores astrocíticos están

frecuentemente metilados. En total se analizaron 227 muestras de las 235

totales (96.59%).

Para determinar el estado global de metilación de cada muestra en

metilado, parcialmente metilado y no metilado, se siguieron los criterios

descritos en el Materiales y Métodos (Tabla 5).

Del total de muestras analizadas, el 60.35% presentaron metilación en

MGMT (137 de 227). Los resultados de la metilación por grado tumoral se

resumen en la siguiente tabla (Tabla 15).

Tabla 15. Porcentajes de metilación de MGMT. Tasa de metilación de los distintos tipos de

tumores incluidos en el estudio.

Grado tumoral MGMT metilado MGMT no metilado

AII (n= 25) 84% (n= 21) 16% (n= 4)

AIII (n= 26)

GBM (n= 176)

61.5% (n= 16)

56.8% (n= 100)

38.5% (n= 10)

43.2% (n= 76)

Tras el análisis global de la metilación se realizó un análisis más

detallado de cada sonda individualmente con el fin de determinar si alguna

región del promotor estaba preferentemente metilada. Descartando las sondas

número 4 y 6, como se explicó en el apartado de Materiales y Métodos, se

123

Resultados

4. RESULTADOS 4.1. CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPALES MARCADORES

MOLECULARES EN GLIOMAS

4.1.1. ANÁLISIS DE LA METILACIÓN DEL PROMOTOR DEL GEN MGMT Y SU ASOCIACIÓN CON LAS VARIABLES CLÍNICAS

La determinación del estado de metilación del promotor de MGMT

realizada mediante MS-MLPA mostró que los tumores astrocíticos están

frecuentemente metilados. En total se analizaron 227 muestras de las 235

totales (96.59%).

Para determinar el estado global de metilación de cada muestra en

metilado, parcialmente metilado y no metilado, se siguieron los criterios

descritos en el Materiales y Métodos (Tabla 5).

Del total de muestras analizadas, el 60.35% presentaron metilación en

MGMT (137 de 227). Los resultados de la metilación por grado tumoral se

resumen en la siguiente tabla (Tabla 15).

Tabla 15. Porcentajes de metilación de MGMT. Tasa de metilación de los distintos tipos de

tumores incluidos en el estudio.

Grado tumoral MGMT metilado MGMT no metilado

AII (n= 25) 84% (n= 21) 16% (n= 4)

AIII (n= 26)

GBM (n= 176)

61.5% (n= 16)

56.8% (n= 100)

38.5% (n= 10)

43.2% (n= 76)

Tras el análisis global de la metilación se realizó un análisis más

detallado de cada sonda individualmente con el fin de determinar si alguna

región del promotor estaba preferentemente metilada. Descartando las sondas

número 4 y 6, como se explicó en el apartado de Materiales y Métodos, se

124

Resultados

realizó un agrupamiento de los patrones de metilación de todos los casos y se

calculó la frecuencia de metilación de cada sonda (Figura 28). Los resultados

mostraron una mayor frecuencia de metilación de las sondas 5 y 1, localizadas

en el promotor y en el primer intrón, respectivamente, seguidas por la sonda 3,

localizada en el intrón 1. La sonda 2 del promotor se encontró metilada en

menor medida.

Figura 28. Patrones de metilación de las distintas sondas de MS-MLPA para MGMT. Los recuadros rojos corresponden a las sondas metiladas y los recuadros

blancos a las sondas no metiladas. En el eje vertical, el número de casos que

Resultados

presentan el patrón de metilación de cada línea horizontal. En el eje horizontal el

número de casos que presentan al menos la sonda correspondiente metilada.

En resumen, los tumores astrocíticos de esta serie mostraron un elevado

porcentaje de metilación del promotor del gen MGMT, siendo los tumores de

bajo grado los que presentaron mayor porcentaje de metilación (Tabla 15). Se

observó una asociación entre dicha metilación y el grado histológico del tumor

(p-valor 0.029). No se observó ninguna asociación con los marcadores clínicos

de sexo y edad (p-valor 0.439, 0.528, respectivamente).

Como se ha descrito en otros estudios, la metilación en MGMT se asocia

a una mayor supervivencia, es decir, es un factor de buen pronóstico. La curva

de supervivencia Kaplan-Meier de esta serie mostró que la diferencia de

supervivencia era estadísticamente significativa, con un p-valor de 0.004

(Figura 29).

Figura 29. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en las muestras analizadas en el estudio. Línea negra: MGMT metilado; línea roja: MGMT no

metilado.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

MGMT metilado MGMT no metilado

p-valor 0.004

125

Resultados

realizó un agrupamiento de los patrones de metilación de todos los casos y se

calculó la frecuencia de metilación de cada sonda (Figura 28). Los resultados

mostraron una mayor frecuencia de metilación de las sondas 5 y 1, localizadas

en el promotor y en el primer intrón, respectivamente, seguidas por la sonda 3,

localizada en el intrón 1. La sonda 2 del promotor se encontró metilada en

menor medida.

Figura 28. Patrones de metilación de las distintas sondas de MS-MLPA para MGMT. Los recuadros rojos corresponden a las sondas metiladas y los recuadros

blancos a las sondas no metiladas. En el eje vertical, el número de casos que

Resultados

presentan el patrón de metilación de cada línea horizontal. En el eje horizontal el

número de casos que presentan al menos la sonda correspondiente metilada.

En resumen, los tumores astrocíticos de esta serie mostraron un elevado

porcentaje de metilación del promotor del gen MGMT, siendo los tumores de

bajo grado los que presentaron mayor porcentaje de metilación (Tabla 15). Se

observó una asociación entre dicha metilación y el grado histológico del tumor

(p-valor 0.029). No se observó ninguna asociación con los marcadores clínicos

de sexo y edad (p-valor 0.439, 0.528, respectivamente).

Como se ha descrito en otros estudios, la metilación en MGMT se asocia

a una mayor supervivencia, es decir, es un factor de buen pronóstico. La curva

de supervivencia Kaplan-Meier de esta serie mostró que la diferencia de

supervivencia era estadísticamente significativa, con un p-valor de 0.004

(Figura 29).

Figura 29. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en las muestras analizadas en el estudio. Línea negra: MGMT metilado; línea roja: MGMT no

metilado.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


p-valor 0.004

126

Resultados

Teniendo en cuenta sólo los casos que recibieron tratamiento antitumoral

(n= 139, 61.23%), se observó que los casos metilados para MGMT que

recibieron tratamiento antitumoral (TMZ) (n= 79, 56.83%) presentaban una

mayor supervivencia que los casos tratados no metilados (p<0.000), es decir,

se trata de un marcador predictivo de respuesta al tratamiento (Figura 30).

Figura 30. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en las muestras tratadas. Línea negra: MGMT metilado; línea roja: MGMT no metilado.

4.1.2. ANÁLISIS DE LAS CODELECIONES 1p/19q

La determinación de la codeleción 1p/19q mediante la técnica MLPA se

realizó sólo en aquellas muestras en las que el diagnóstico histológico no

estuviera totalmente claro, con el fin de identificar oligodendrogliomas. El total

de muestras analizadas fue de 37, de estas, el 64.86% no presentaron deleción

(24 de 37), el 10.81% presentó deleción parcial de 1p (4 de 37) y el 18.92%

presentó codelecion de 1p/19q (7 de 37). De estas últimas 7 muestras, se

descartaron 2 por ser oligodendrogliomas (2 de 37, 5.4%). Por último, las 2

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


p-valor <0.000

Resultados

muestras restantes dieron resultados no valorables (2 de 37, 5.4%). Los

resultados se detallan en la siguiente tabla (Tabla 16):

Tabla 16. Frecuencias de deleciones en 1p/19q. La tabla recoge las frecuencias de

deleción parcial, codeleción y no deleción de 1p/19q en las muestras analizadas en base al

grado tumoral.

Grado tumoral No deleción Deleción 1p Codeleción 1p/19q

AII (n= 20) 75% (15/20) 10% (2/20) 10% (2/20)

AIII (n= 15)

Oligos (n= 2)

60% (9/15)

0

13.3% (2/15)

0

20% (3/15)

100% (2/2)*

*Se descartaron los dos oligodendrogliomas de la serie al confirmarse el diagnóstico histológico

mediante este análisis.

4.1.3. ANÁLISIS DE 8 MARCADORES EPIGENÉTICOS EN GLIOMAS (G-CIMP): CACNA1G, CDKN2A, CRABP1, IGF2, MLH1, NEUROG1, RUNX3 Y SOCS1

Siguiendo los criterios descritos en Material y Métodos, al menos cinco de

los ocho genes analizados mostraron hipermetilación, los resultados del CIMP

según el grado tumoral fueron: 38.5% (10/26) tumores G-CIMP positivos en AII,

44% (11/25) en AIII y 22.3% (35/157) en GBM. Es decir, de las 208 muestras

de gliomas analizadas en el estudio, 56 presentaron un fenotipo hipermetilador

de islas CpG, esto es, un 26.9% de muestras CIMP positivas (Tabla 17).

127

Resultados

Teniendo en cuenta sólo los casos que recibieron tratamiento antitumoral

(n= 139, 61.23%), se observó que los casos metilados para MGMT que

recibieron tratamiento antitumoral (TMZ) (n= 79, 56.83%) presentaban una

mayor supervivencia que los casos tratados no metilados (p<0.000), es decir,

se trata de un marcador predictivo de respuesta al tratamiento (Figura 30).

Figura 30. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación de MGMT en las muestras tratadas. Línea negra: MGMT metilado; línea roja: MGMT no metilado.

4.1.2. ANÁLISIS DE LAS CODELECIONES 1p/19q

La determinación de la codeleción 1p/19q mediante la técnica MLPA se

realizó sólo en aquellas muestras en las que el diagnóstico histológico no

estuviera totalmente claro, con el fin de identificar oligodendrogliomas. El total

de muestras analizadas fue de 37, de estas, el 64.86% no presentaron deleción

(24 de 37), el 10.81% presentó deleción parcial de 1p (4 de 37) y el 18.92%

presentó codelecion de 1p/19q (7 de 37). De estas últimas 7 muestras, se

descartaron 2 por ser oligodendrogliomas (2 de 37, 5.4%). Por último, las 2

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


p-valor <0.000

Resultados

muestras restantes dieron resultados no valorables (2 de 37, 5.4%). Los

resultados se detallan en la siguiente tabla (Tabla 16):

Tabla 16. Frecuencias de deleciones en 1p/19q. La tabla recoge las frecuencias de

deleción parcial, codeleción y no deleción de 1p/19q en las muestras analizadas en base al

grado tumoral.

Grado tumoral No deleción Deleción 1p Codeleción 1p/19q

AII (n= 20) 75% (15/20) 10% (2/20) 10% (2/20)

AIII (n= 15)

Oligos (n= 2)

60% (9/15)

0

13.3% (2/15)

0

20% (3/15)

100% (2/2)*

*Se descartaron los dos oligodendrogliomas de la serie al confirmarse el diagnóstico histológico

mediante este análisis.

4.1.3. ANÁLISIS DE 8 MARCADORES EPIGENÉTICOS EN GLIOMAS (G-CIMP): CACNA1G, CDKN2A, CRABP1, IGF2, MLH1, NEUROG1, RUNX3 Y SOCS1

Siguiendo los criterios descritos en Material y Métodos, al menos cinco de

los ocho genes analizados mostraron hipermetilación, los resultados del CIMP

según el grado tumoral fueron: 38.5% (10/26) tumores G-CIMP positivos en AII,

44% (11/25) en AIII y 22.3% (35/157) en GBM. Es decir, de las 208 muestras

de gliomas analizadas en el estudio, 56 presentaron un fenotipo hipermetilador

de islas CpG, esto es, un 26.9% de muestras CIMP positivas (Tabla 17).

128

Resultados

Tabla 17. Porcentajes de muestras CIMP+ (CIMP positivas) en base al grado tumoral.

Grado tumoral AII AIII GBM TOTAL

% CIMP + 38.5% (10/26) 44% (11/25) 22.3% (35/157) 26.9% (56/208)

A continuación, se muestra el porcentaje de metilación de cada uno de los

genes que componen el panel analizado con respecto al grado tumoral de las

diferentes muestras. Para cada uno de los genes se ha calculado el p-valor con

respecto al grado tumoral y, como se observa, SOCS1, NEUROG1 y CDKN2A

presentan un resultado estadísticamente significativo (Tabla 18).

Concretamente, la metilación de SOCS1 y CDKN2A se asoció a estadíos más

tempranos, mientras que una mayor metilación de NEUROG1 se observó en

tumores más avanzados.

Tabla 18. Porcentajes de tumores metilados de cada uno de los genes del panel CIMP

según el grado tumoral y el p-valor.

PORCENTAJES DE METILACIÓN

RUNX3 CACNA1G IGF2 MLH1 NEUROG CRABP SOCS1 CDKN2A

AII

(n= 26) 58.33 20.83 50 12.5 83.33 50 76.92 41.67

AIII

(n= 25) 82.14 28.57 53.57 10.71 96.43 53.57 44 35.71

GBM

(n= 157) 75.79 19.74 46.49 9.55 95.54 43.95 32.48 21.65

p-valor 0.116 0.573 0.768 0.902 0.049 0.587 <0.000 0.050

Resultados

Se observó una asociación estadísticamente significativa entre el G-CIMP

y el grado histológico (p-valor 0.028) (Tabla 17). Con respecto a la

supervivencia, también se observó una diferencia estadísticamente significativa

entre los casos con fenotipo hipermetilador positivo y los casos negativos,

siendo este fenotipo un biomarcador de buen pronóstico (p-valor 0.021) (Figura

31).

Figura 31. Curva de supervivencia Kaplan-Meier del G-CIMP en las muestras analizadas en el estudio. Línea roja: CIMP positivo; línea negra: CIMP negativo.

4.1.4. ANÁLISIS DE SOCS1

La determinación del fenotipo hipermetilador de las muestras mediante la

técnica MS-MLPA mostró que sólo uno de los marcadores moleculares

analizados (RUNX3, CACNA1G, IGF2, MLH1, NEUROG1, CRABP1, SOCS1,

CDKN2A) se asociaba con la metilación en MGMT, las mutaciones en IDH1,

con la edad y con el grado tumoral. Este marcador molecular fue SOCS1.

Profundizando en los resultados de CIMP del apartado anterior, se

observaron hasta siete patrones de metilación diferentes en SOCS1 (n= 208).

De estas muestras, 126 no mostraron metilación (60.6%) y 82 sí (39.4%).

Además, el análisis mostró siete patrones de metilación diferentes que se

CIMP positivo

CIMP negativo

p-valor 0.021

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

129

Resultados

Tabla 17. Porcentajes de muestras CIMP+ (CIMP positivas) en base al grado tumoral.


% CIMP + 38.5% (10/26) 44% (11/25) 22.3% (35/157) 26.9% (56/208)

A continuación, se muestra el porcentaje de metilación de cada uno de los

genes que componen el panel analizado con respecto al grado tumoral de las

diferentes muestras. Para cada uno de los genes se ha calculado el p-valor con

respecto al grado tumoral y, como se observa, SOCS1, NEUROG1 y CDKN2A

presentan un resultado estadísticamente significativo (Tabla 18).

Concretamente, la metilación de SOCS1 y CDKN2A se asoció a estadíos más

tempranos, mientras que una mayor metilación de NEUROG1 se observó en

tumores más avanzados.

Tabla 18. Porcentajes de tumores metilados de cada uno de los genes del panel CIMP

según el grado tumoral y el p-valor.

PORCENTAJES DE METILACIÓN

RUNX3 CACNA1G IGF2 MLH1 NEUROG CRABP SOCS1 CDKN2A

AII

(n= 26) 58.33 20.83 50 12.5 83.33 50 76.92 41.67

AIII

(n= 25) 82.14 28.57 53.57 10.71 96.43 53.57 44 35.71

GBM

(n= 157) 75.79 19.74 46.49 9.55 95.54 43.95 32.48 21.65

p-valor 0.116 0.573 0.768 0.902 0.049 0.587 <0.000 0.050

Resultados

Se observó una asociación estadísticamente significativa entre el G-CIMP

y el grado histológico (p-valor 0.028) (Tabla 17). Con respecto a la

supervivencia, también se observó una diferencia estadísticamente significativa

entre los casos con fenotipo hipermetilador positivo y los casos negativos,

siendo este fenotipo un biomarcador de buen pronóstico (p-valor 0.021) (Figura

31).

Figura 31. Curva de supervivencia Kaplan-Meier del G-CIMP en las muestras analizadas en el estudio. Línea roja: CIMP positivo; línea negra: CIMP negativo.

4.1.4. ANÁLISIS DE SOCS1

La determinación del fenotipo hipermetilador de las muestras mediante la

técnica MS-MLPA mostró que sólo uno de los marcadores moleculares

analizados (RUNX3, CACNA1G, IGF2, MLH1, NEUROG1, CRABP1, SOCS1,

CDKN2A) se asociaba con la metilación en MGMT, las mutaciones en IDH1,

con la edad y con el grado tumoral. Este marcador molecular fue SOCS1.

Profundizando en los resultados de CIMP del apartado anterior, se

observaron hasta siete patrones de metilación diferentes en SOCS1 (n= 208).

De estas muestras, 126 no mostraron metilación (60.6%) y 82 sí (39.4%).

Además, el análisis mostró siete patrones de metilación diferentes que se

CIMP positivo

CIMP negativo

p-valor 0.021

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

130

Resultados

describen en la Figura 32. 39 casos mostraron metilación en la primera sonda

(154pb), 67 casos mostraron metilación en la segunda sonda (239pb), 10 casos

mostraron metilación en la tercera sonda (300pb) y 13 casos mostraron

metilación en la cuarta sonda (399pb). Los AII presentaron un 76.92% (20/26)

de metilación en SOCS1, los AIII un 44% (11/25) y los GBM un 32.48%

(51/157) (Tabla 19).

Tabla 19. Porcentajes de metilación de SOCS1 según el grado tumoral de las muestras.


% Metilación SOCS1

76.9% (20/26)

44% (11/25)

32.5% (51/157)

39.4% (82/208)

Figura 32. Patrones de metilación de SOCS1. Los recuadros rojos corresponden a las

sondas metiladas y los recuadros blancos a las sondas no metiladas. En el eje vertical, el

número de casos que presentan el patrón de metilación de cada línea horizontal. En el eje

horizontal el número de casos que presentan al menos la sonda correspondiente metilada.

Resultados

En el caso de la metilación de SOCS1, también se observó una

asociación con el grado tumoral y con la edad (p-valor <0.000 en ambos casos)

(Tabla 19 y 20). En general, el porcentaje de metilación en los diferentes

grados tumorales fue elevado, sobre todo en los AII (Tabla 19). El Tto no se

asoció con este marcador (p-valor 0.590).

Tabla 20. Tabla de contingencia para la metilación de SOCS1 y la edad.

≤ Mediana > Mediana p-valor

SOCS1 metilado (n= 82) 69.5% (n= 57) 30.5% (n= 25)

<0.000 SOCS1 no metilado (n= 127) 33.8% (n= 43) 64.6% (n= 82)

La curva de supervivencia Kaplan-Meier reveló que la metilación de este

gen tiene un valor pronóstico en estos tumores, con p-valor estadísticamente

significativo <0.000 (Figura 33).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

Resultados













0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

131

Resultados

describen en la Figura 32. 39 casos mostraron metilación en la primera sonda

(154pb), 67 casos mostraron metilación en la segunda sonda (239pb), 10 casos

mostraron metilación en la tercera sonda (300pb) y 13 casos mostraron

metilación en la cuarta sonda (399pb). Los AII presentaron un 76.92% (20/26)

de metilación en SOCS1, los AIII un 44% (11/25) y los GBM un 32.48%

(51/157) (Tabla 19).

Tabla 19. Porcentajes de metilación de SOCS1 según el grado tumoral de las muestras.


% Metilación SOCS1

76.9% (20/26)

44% (11/25)

32.5% (51/157)

39.4% (82/208)

Figura 32. Patrones de metilación de SOCS1. Los recuadros rojos corresponden a las

sondas metiladas y los recuadros blancos a las sondas no metiladas. En el eje vertical, el

número de casos que presentan el patrón de metilación de cada línea horizontal. En el eje

horizontal el número de casos que presentan al menos la sonda correspondiente metilada.

Resultados













0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

Resultados













0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

132

Resultados

Figura 33. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de la metilación en SOCS1 en las muestras analizadas en el estudio. Línea roja: SOCS1 metilado; línea negra: SOCS1 no

metilado.

4.1.5. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE SOCS1 Y MGMT

Se realizó un análisis de expresión génica mediante RT-qPCR en una

serie de muestras para realizar una posterior comparación con el estado de

metilación de las mismas. Se seleccionaron 13 muestras de tejido congelado

de la serie total diagnosticadas como GBM y un pool de tejido normal. Esta

selección se hizo en base a la calidad y cantidad de las muestras.

4.1.5.1 PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL A continuación, se muestran las gráficas con los valores de expresión

para cada uno de los dos genes analizados (Figuras 34 y 35). Los niveles de

expresión se muestran normalizados con respecto al tejido normal, que es el

mismo para todas las muestras, y al que se asignó el valor de 1.

p-valor <0.000

Resultados

Figura 34. Expresión de MGMT de las muestras tumorales normalizada con respecto al control. (Línea horizontal roja, valor 1). En el eje Y se observan los valores de expresión y en

el eje X cada una de las muestras analizadas.

Figura 35. Expresión de SOCS1 de las muestras tumorales normalizada con respecto al control. En el eje Y se observan los valores de expresión y en el eje X cada una de las

muestras analizadas.

Resultados


metilado.











p-valor <0.000

Resultados













0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

Resultados


metilado.











p-valor <0.000

133

Resultados


metilado.











p-valor <0.000

Resultados

Figura 34. Expresión de MGMT de las muestras tumorales normalizada con respecto al control. (Línea horizontal roja, valor 1). En el eje Y se observan los valores de expresión y en

el eje X cada una de las muestras analizadas.

Figura 35. Expresión de SOCS1 de las muestras tumorales normalizada con respecto al control. En el eje Y se observan los valores de expresión y en el eje X cada una de las

muestras analizadas.

Resultados


metilado.











p-valor <0.000

Resultados













0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SOCS1 metilado

SOCS1 no metilado

p-valor 3.04e-06

Resultados


metilado.











p-valor <0.000

134

Resultados

En el caso de MGMT la mayoría de las muestras presentaron valores de

expresión más bajos que el tejido normal, tres se mantuvieron dentro de los

niveles normales de expresión y una presentó sobreexpresión del gen. Por el

contrario, los valores de expresión de SOCS1 en las muestras tumorales

presentaron valores muy por encima.

4.1.5.2. ANÁLISIS DE LA ASOCIACIÓN ENTRE METILACIÓN Y EXPRESIÓN DE SOCS1 Y MGMT

Una vez obtenidos los datos, se llevó a cabo una comparación entre el

estado de metilación y la expresión, tanto de MGMT como de SOCS1, en cada

una de las muestras analizadas en el apartado anterior (Tabla 21).

Tabla 21. Resumen de la metilación y expresión de MGMT y SOCS1 de las muestras de gliomas analizadas. En rojo los valores de expresión relativa normalizada sobreexpresados,

en azul los infraexpresados y en negro los que presentaban expresión igual a la del tejido

normal.

Muestra Grado Metilación MGMT Sondas MGMT

Metilación SOCS1

Sondas SOCS1

Expresión relativa normalizada

5 2 4 3 1 6 3 1 2 4 MGMT SOCS1 1 GBM Metilado No Metilado 6,868 6746,858 2 GBM No Metilado No Metilado 0,346 3956,475 3 AIII Metilado Metilado 0,098 55,908 4 GBM Metilado No Metilado 0,039 88,340 5 GBM No Metilado No Metilado 0,113 13,548 6 GBM Parcialm. Metilado No Metilado 0,073 33,128 7 GBM No Metilado No Metilado 0,936 181,648 8 GBM No Metilado No Metilado 1.133 144,507 9 AIII Metilado No Metilado 0,724 106,891

10 GBM Metilado No Metilado 0,541 1136,199 11 AII Metilado No Metilado 0,613 91,773 12 GBM No Metilado No Metilado 0,124 82,424 13 GBM Parcialm. Metilado No Metilado 0,697 403,102

Resultados

Como se observa en la tabla anterior, 6 muestras cumplieron lo esperado

para MGMT, es decir, estaban metiladas y la expresión fue menor (6/13,

46.15%), 1 muestra estaba metilada y dos no metiladas y la expresión fue igual

a la del tejido normal, 3 muestras no metiladas y con expresión disminuída y 1

muestra metilada y con la expresión aumentada. En cuanto a la correlación

entre la metilación y la expresión en SOCS1, en este caso todas las muestras

estuvieron sobreexpresadas, incluso la muestra metilada para este gen. Todas

dieron valores de expresión muy por encima del tejido normal.

Las variables cuantitativas (expresión relativa normalizada de MGMT y

SOCS1) se dicotomizaron para transformarlas en cualitativas (igual o mayor

expresión que el tejido normal y menor expresión). En el caso de la metilación-

expresión de MGMT, el análisis estadístico por Test de Fisher no dió un

resultado estadísticamente significativo (p-valor= 1, IC 95%= 0.025-10.812,

OR= 0.528), lo que quiere decir que no se observa una asociación entre

hipermetilación del promotor y pérdida de expresión a nivel de ARN. En cuanto

a SOCS1, al estar sobreexpresado en todas las muestras, no se pudo realizar

el análisis estadístico.

4.1.6. ANÁLISIS DE LAS MUTACIONES EN LOS GENES IDH1 E IDH2 Y SU ASOCIACIÓN CON LAS VARIABLES CLÍNICAS

La secuenciación directa de las mutaciones puntuales en los puntos

calientes (Hotspot) de IDH1 e IDH2 reveló que en los tumores analizados

ocurren con frecuencia mutaciones en IDH1 pero rara vez en IDH2.

Globalmente, se encontraron 45 muestras mutadas en las 235 muestras

analizadas (19.1%), de las cuales 43 se detectaron en IDH1 (95.56%) y

solamente 2 en IDH2 (4.44%). De las mutaciones descritas en estos dos genes

(Tablas 2 y 3), se detectaron tres tipos en IDH1 (CGT>CAT, Arg132His;

CGT>GGT, Arg132Gly y CGT>CTT, Arg132Leu) y un solo tipo en IDH2

(AGG>AGT, Arg172Ser) (Tabla 22).

135

Resultados

En el caso de MGMT la mayoría de las muestras presentaron valores de

expresión más bajos que el tejido normal, tres se mantuvieron dentro de los

niveles normales de expresión y una presentó sobreexpresión del gen. Por el

contrario, los valores de expresión de SOCS1 en las muestras tumorales

presentaron valores muy por encima.

4.1.5.2. ANÁLISIS DE LA ASOCIACIÓN ENTRE METILACIÓN Y EXPRESIÓN DE SOCS1 Y MGMT

Una vez obtenidos los datos, se llevó a cabo una comparación entre el

estado de metilación y la expresión, tanto de MGMT como de SOCS1, en cada

una de las muestras analizadas en el apartado anterior (Tabla 21).

Tabla 21. Resumen de la metilación y expresión de MGMT y SOCS1 de las muestras de gliomas analizadas. En rojo los valores de expresión relativa normalizada sobreexpresados,

en azul los infraexpresados y en negro los que presentaban expresión igual a la del tejido

normal.

Muestra Grado Metilación MGMT Sondas MGMT

Metilación SOCS1

Sondas SOCS1

Expresión relativa normalizada

5 2 4 3 1 6 3 1 2 4 MGMT SOCS1 1 GBM Metilado No Metilado 6,868 6746,858 2 GBM No Metilado No Metilado 0,346 3956,475 3 AIII Metilado Metilado 0,098 55,908 4 GBM Metilado No Metilado 0,039 88,340 5 GBM No Metilado No Metilado 0,113 13,548 6 GBM Parcialm. Metilado No Metilado 0,073 33,128 7 GBM No Metilado No Metilado 0,936 181,648 8 GBM No Metilado No Metilado 1.133 144,507 9 AIII Metilado No Metilado 0,724 106,891

10 GBM Metilado No Metilado 0,541 1136,199 11 AII Metilado No Metilado 0,613 91,773 12 GBM No Metilado No Metilado 0,124 82,424 13 GBM Parcialm. Metilado No Metilado 0,697 403,102

Resultados

Como se observa en la tabla anterior, 6 muestras cumplieron lo esperado

para MGMT, es decir, estaban metiladas y la expresión fue menor (6/13,

46.15%), 1 muestra estaba metilada y dos no metiladas y la expresión fue igual

a la del tejido normal, 3 muestras no metiladas y con expresión disminuída y 1

muestra metilada y con la expresión aumentada. En cuanto a la correlación

entre la metilación y la expresión en SOCS1, en este caso todas las muestras

estuvieron sobreexpresadas, incluso la muestra metilada para este gen. Todas

dieron valores de expresión muy por encima del tejido normal.

Las variables cuantitativas (expresión relativa normalizada de MGMT y

SOCS1) se dicotomizaron para transformarlas en cualitativas (igual o mayor

expresión que el tejido normal y menor expresión). En el caso de la metilación-

expresión de MGMT, el análisis estadístico por Test de Fisher no dió un

resultado estadísticamente significativo (p-valor= 1, IC 95%= 0.025-10.812,

OR= 0.528), lo que quiere decir que no se observa una asociación entre

hipermetilación del promotor y pérdida de expresión a nivel de ARN. En cuanto

a SOCS1, al estar sobreexpresado en todas las muestras, no se pudo realizar

el análisis estadístico.

4.1.6. ANÁLISIS DE LAS MUTACIONES EN LOS GENES IDH1 E IDH2 Y SU ASOCIACIÓN CON LAS VARIABLES CLÍNICAS

La secuenciación directa de las mutaciones puntuales en los puntos

calientes (Hotspot) de IDH1 e IDH2 reveló que en los tumores analizados

ocurren con frecuencia mutaciones en IDH1 pero rara vez en IDH2.

Globalmente, se encontraron 45 muestras mutadas en las 235 muestras

analizadas (19.1%), de las cuales 43 se detectaron en IDH1 (95.56%) y

solamente 2 en IDH2 (4.44%). De las mutaciones descritas en estos dos genes

(Tablas 2 y 3), se detectaron tres tipos en IDH1 (CGT>CAT, Arg132His;

CGT>GGT, Arg132Gly y CGT>CTT, Arg132Leu) y un solo tipo en IDH2

(AGG>AGT, Arg172Ser) (Tabla 22).

136

Resultados

Tabla 22. Mutaciones en los genes IDH. La tabla muestra las distintas mutaciones

encontradas en los genes IDH1 e IDH2 en los tumores analizados. Arg (Arginina), Ser (Serina),

His (Histidina), Gly (Glicina), Leu (Leucina).

AII AIII GBM

IDH1

CGT>CAT (Arg132His) 18 8 13

CGT>GGT (Arg132Gly)

CGT>CTT (Arg132Leu)

1

0

1

1

0

1

IDH2

AGG>AGT (Arg172Ser) 0 0 2

Atendiendo a la clasificación de los tumores, las frecuencias de las

mutaciones fueron las siguientes: 75% (21 de 28) en los AII, 28.6% (8 de 28)

en los AIII, 8.9% (16 de 179) en los GBM (Tabla 23).

Tabla 23. Porcentajes de mutación de IDH. La tabla recoge las frecuencias de mutación en

IDH de los distintos tipos de tumores incluidos en el estudio.

Grado tumoral IDH mutado IDH no mutado

AII (n= 28) 75% (n= 21) 25% (n= 7)

AIII (n= 28)

GBM (n= 179)

28.6% (n= 8)

8.9% (n= 16)

71.4% (n= 20)

91.1% (n= 163)

Por último, para la determinación de las mutaciones en IDH mediante IHQ

se consideraron positivos los casos con tinción nuclear/citoplasmática de las

células tumorales y negativos los casos que no presentaron dicha tinción. Se

analizaron mediante esta técnica 223 muestras, de las cuales 44 presentaron

Resultados

inmunotinción positiva (44/223, 19.7%). Al igual que en el análisis de este gen

por secuenciación directa, el mayor porcentaje de casos mutados se

corresponde con los AII (15/26, 57.7%), seguido de los AIII (6/26, 23.1%) y, por

último, de los GBM (23/171, 13.4%).

La secuenciación de IDH demostró una fuerte asociación con el grado

histológico (p-valor <0.000), el mayor porcentaje de mutaciones se da en los

AII y va disminuyendo conforme aumenta el grado tumoral (Tabla 23). Además,

se observó una asociación con la edad. A mayor edad del paciente, menos

porcentaje de mutaciones en dicho gen (p-valor <0.000, IC (Intervalo de

confianza) 95% 8.003-280.906; OR (Odds Ratio) 32.297). Por último, se

observó una asociación entre este marcador y el Tto (Tratamiento), dicha

variable abarca cuatro posibilidades: Qx (Cirugía) + RT y/o QT, sólo Qx, biopsia

+ RT y/o QT o sólo biopsia (p-valor 0.025) (Tablas 24 y 25).



IDH mutado (n= 45) 95.5% (n= 43) 4.4% (n= 2) <0.000

IDH wt (n= 190) 39.3% (n= 75) 59.7% (n= 114)

Tabla 25. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH y Tto.

Qx + RT y/o QT Sólo Qx Biopsia + RT

y/o QT Sólo Biopsia p-valor

IDH mutado (n= 45)

42.2% (n= 19)

8.9% (n= 4)

11.1% (n= 5)

2.2% (n= 1)

0.025 IDH wt (n= 190)

37.2% (n= 71)

1.6% (n= 3)

23% (n= 44)

4.2% (n= 8)

En cuanto a la IHQ de IDH (n= 223), como era de esperar, también se

asocia con la edad y el diagnóstico (p-valor 0.000 y <0.000, respectivamente).

137

Resultados

Tabla 22. Mutaciones en los genes IDH. La tabla muestra las distintas mutaciones

encontradas en los genes IDH1 e IDH2 en los tumores analizados. Arg (Arginina), Ser (Serina),

His (Histidina), Gly (Glicina), Leu (Leucina).

AII AIII GBM

IDH1

CGT>CAT (Arg132His) 18 8 13

CGT>GGT (Arg132Gly)

CGT>CTT (Arg132Leu)

1

0

1

1

0

1

IDH2

AGG>AGT (Arg172Ser) 0 0 2

Atendiendo a la clasificación de los tumores, las frecuencias de las

mutaciones fueron las siguientes: 75% (21 de 28) en los AII, 28.6% (8 de 28)

en los AIII, 8.9% (16 de 179) en los GBM (Tabla 23).

Tabla 23. Porcentajes de mutación de IDH. La tabla recoge las frecuencias de mutación en

IDH de los distintos tipos de tumores incluidos en el estudio.

Grado tumoral IDH mutado IDH no mutado

AII (n= 28) 75% (n= 21) 25% (n= 7)

AIII (n= 28)

GBM (n= 179)

28.6% (n= 8)

8.9% (n= 16)

71.4% (n= 20)

91.1% (n= 163)

Por último, para la determinación de las mutaciones en IDH mediante IHQ

se consideraron positivos los casos con tinción nuclear/citoplasmática de las

células tumorales y negativos los casos que no presentaron dicha tinción. Se

analizaron mediante esta técnica 223 muestras, de las cuales 44 presentaron

Resultados

inmunotinción positiva (44/223, 19.7%). Al igual que en el análisis de este gen

por secuenciación directa, el mayor porcentaje de casos mutados se

corresponde con los AII (15/26, 57.7%), seguido de los AIII (6/26, 23.1%) y, por

último, de los GBM (23/171, 13.4%).

La secuenciación de IDH demostró una fuerte asociación con el grado

histológico (p-valor <0.000), el mayor porcentaje de mutaciones se da en los

AII y va disminuyendo conforme aumenta el grado tumoral (Tabla 23). Además,

se observó una asociación con la edad. A mayor edad del paciente, menos

porcentaje de mutaciones en dicho gen (p-valor <0.000, IC (Intervalo de

confianza) 95% 8.003-280.906; OR (Odds Ratio) 32.297). Por último, se

observó una asociación entre este marcador y el Tto (Tratamiento), dicha

variable abarca cuatro posibilidades: Qx (Cirugía) + RT y/o QT, sólo Qx, biopsia

+ RT y/o QT o sólo biopsia (p-valor 0.025) (Tablas 24 y 25).



IDH mutado (n= 45) 95.5% (n= 43) 4.4% (n= 2) <0.000

IDH wt (n= 190) 39.3% (n= 75) 59.7% (n= 114)

Tabla 25. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH y Tto.



IDH mutado (n= 45)

42.2% (n= 19)

8.9% (n= 4)

11.1% (n= 5)

2.2% (n= 1)

0.025 IDH wt (n= 190)

37.2% (n= 71)

1.6% (n= 3)

23% (n= 44)

4.2% (n= 8)

En cuanto a la IHQ de IDH (n= 223), como era de esperar, también se

asocia con la edad y el diagnóstico (p-valor 0.000 y <0.000, respectivamente).

138

Resultados

Sin embargo, se pierde la asociación con la Tto (p-valor 0.242) y aparece una

nueva asociación con el sexo (p-valor 0.045). Por último, se observó una

asociación muy significativa entre las dos técnicas empleadas para detectar las

mutaciones en IDH: la secuenciación directa y la IHQ (p-valor <0.000) (Tabla

26).

Tabla 26. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH por secuenciación directa y por

IHQ.

IHQ

IDH mut IDH no mut p-valor

Secuenciación directa

IDH mut 62.79% (n= 27)

37.21% (n= 16)

<0.000 IDH no mut 9.44%

(n= 17) 90.55% (n= 163)

El valor pronóstico de este biomarcador, al igual que MGMT, está bien

establecido. Tras el análisis de supervivencia se observó una diferencia

estadísticamente significativa entre las curvas en esta serie de tumores (p-valor

<0.000) (Figura 36). Además, se realizó un análisis de supervivencia

estableciendo cuatro grupos, en base a la edad y al estado mutacional de IDH.

Los grupos fueron los siguientes:

1: IDH mutado y edad ≤ mediana

2: IDH mutado y edad > mediana

3: IDH no mutado y edad ≤ mediana

4: IDH no mutado y edad > mediana

Los resultados de este análisis se observan en la Figura 37 (p=0).

Resultados

Figura 36. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de las mutaciones en IDH en las muestras analizadas en el estudio. Línea negra: IDH mutado; línea roja: IDH no mutado.

Figura 37. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de los cuatro grupos establecidos en base a las mutaciones en IDH y la edad. Línea negra: IDH mutado y edad igual o menor que

la mediana; línea roja: IDH mutado y edad mayor que la mediana; línea verde: IDH no mutado y

edad menor o igual que la mediana; línea azul: IDH no mutado y edad mayor que la mediana.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH mutado IDH no mutado

p-valor 5.37e-09

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH mutado y edad ≤ mediana

IDH mutado y edad > mediana

IDH no mutado y edad ≤ mediana

IDH no mutado y edad > mediana

p-valor 0

p-valor <0.000

139

Resultados

Sin embargo, se pierde la asociación con la Tto (p-valor 0.242) y aparece una

nueva asociación con el sexo (p-valor 0.045). Por último, se observó una

asociación muy significativa entre las dos técnicas empleadas para detectar las

mutaciones en IDH: la secuenciación directa y la IHQ (p-valor <0.000) (Tabla

26).

Tabla 26. Tabla de contingencia para mutaciones en IDH por secuenciación directa y por

IHQ.

IHQ

IDH mut IDH no mut p-valor

Secuenciación directa

IDH mut 62.79% (n= 27)

37.21% (n= 16)

<0.000 IDH no mut 9.44%

(n= 17) 90.55% (n= 163)

El valor pronóstico de este biomarcador, al igual que MGMT, está bien

establecido. Tras el análisis de supervivencia se observó una diferencia

estadísticamente significativa entre las curvas en esta serie de tumores (p-valor

<0.000) (Figura 36). Además, se realizó un análisis de supervivencia

estableciendo cuatro grupos, en base a la edad y al estado mutacional de IDH.

Los grupos fueron los siguientes:

1: IDH mutado y edad ≤ mediana

2: IDH mutado y edad > mediana

3: IDH no mutado y edad ≤ mediana

4: IDH no mutado y edad > mediana

Los resultados de este análisis se observan en la Figura 37 (p=0).

Resultados

Figura 36. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de las mutaciones en IDH en las muestras analizadas en el estudio. Línea negra: IDH mutado; línea roja: IDH no mutado.

Figura 37. Curva de supervivencia Kaplan-Meier de los cuatro grupos establecidos en base a las mutaciones en IDH y la edad. Línea negra: IDH mutado y edad igual o menor que

la mediana; línea roja: IDH mutado y edad mayor que la mediana; línea verde: IDH no mutado y

edad menor o igual que la mediana; línea azul: IDH no mutado y edad mayor que la mediana.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH mutado IDH no mutado

p-valor 5.37e-09

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH mutado y edad ≤ mediana

IDH mutado y edad > mediana

IDH no mutado y edad ≤ mediana

IDH no mutado y edad > mediana

p-valor 0

p-valor <0.000

140

Resultados

4.1.7. ANÁLISIS POR IHQ DE ki67 y p53. Tanto para ki67 como para p53, el índice de marcaje por IHQ se calculó

como porcentaje de núcleos marcados por 1000 células (Arshad, Ahmad, &

Hasan, 2010). En ambos casos se establecieron varios puntos de corte para

determinar la positividad o negatividad de las muestras y, de esta forma,

encontrar el porcentaje más restrictivo y que mostrara una mejor correlación

con el resto de marcadores y valores clínicos. Los puntos de corte para ki67

fueron un 3%, un 10% y un 20%. En el caso de p53 fueron un 10% y un 50%.

Los porcentajes por debajo del punto de corte serían negativos y por encima

positivos. En el caso de p53, un porcentaje por encima del punto de corte

indicaría que la muestra presenta mutación en dicho gen. Del total de muestras

de la serie, 221 fueron analizadas para ki67 (94.04%) y 222 para p53 (94.47%).

Los resultados para cada uno de los puntos de corte se resumen en la tabla 27.

Tabla 27. Frecuencia de muestras positivas y negativas para ki67 y p53. Positividad y

negatividad determinada en base a diferentes puntos de corte (al 3, 10 y 20% para ki67 y al 10

y 50% para p53).

ki67 ≤3% >3% ≤10% >10% ≤20% >20%

n (%)

AII 19 (76) 6 (24) 23 (92) 2 (8) 24 (96) 1 (4)

AIII 18 (66.67) 9 (33.33) 24 (88.89) 3 (11.11) 26 (96.29) 1 (3.7)

GBM 75 (44.38) 94 (55.62) 126 (74.56) 43 (25.44) 151 (89.35) 18 (10.65)

Total 112 (50.7) 109 (49.3) 173 (78.3) 48 (21.7) 201 (91) 20 (9)

p-valor 0.003 0.05 0.326

Resultados

Como se ha comentado anteriormente, se establecieron diferentes puntos

de corte, tanto en ki67 como en p53, para determinar la positividad o

negatividad de las muestras. En el caso de ki67, se observó una asociación

entre ki67 al 3% con el grado tumoral (p-valor 0.003). y con el Tto (p-valor

0.015). En cuanto a p53, se observó una asociación entre p53 al 10% con el

grado tumoral (p-valor 0.021) y con la edad (p-valor 0.018).

Por otro lado, la comparación de ambos marcadores entre sí demostró

una serie de asociaciones (Tabla 28 y 29):


p-valor Rho

ki67 p53 0.002 0.208*

*El valor de rho indica una posible asociación directa entre ambas variables, sin embargo (y a

pesar de que el p-valor es estadísticamente significativo) es un valor muy cercano a cero y, por

tanto, no se puede confirmar que exista dicha asociación.

p53 ≤10% >10% ≤50% >50%

n (%)

AII 8 (32) 17 (68) 20 (80) 5 (20%)

AIII 10 (71.43) 4 (28.57) 11 (78.57) 3 (7.14)

GBM 85 (50) 85 (50) 123 (72.35) 47 (27.65)

Total 112 (50.4) 110 (49.5) 164 (73.9) 58 (26.19)

p-valor 0.021 0.637

141

Resultados

4.1.7. ANÁLISIS POR IHQ DE ki67 y p53. Tanto para ki67 como para p53, el índice de marcaje por IHQ se calculó

como porcentaje de núcleos marcados por 1000 células (Arshad, Ahmad, &

Hasan, 2010). En ambos casos se establecieron varios puntos de corte para

determinar la positividad o negatividad de las muestras y, de esta forma,

encontrar el porcentaje más restrictivo y que mostrara una mejor correlación

con el resto de marcadores y valores clínicos. Los puntos de corte para ki67

fueron un 3%, un 10% y un 20%. En el caso de p53 fueron un 10% y un 50%.

Los porcentajes por debajo del punto de corte serían negativos y por encima

positivos. En el caso de p53, un porcentaje por encima del punto de corte

indicaría que la muestra presenta mutación en dicho gen. Del total de muestras

de la serie, 221 fueron analizadas para ki67 (94.04%) y 222 para p53 (94.47%).

Los resultados para cada uno de los puntos de corte se resumen en la tabla 27.

Tabla 27. Frecuencia de muestras positivas y negativas para ki67 y p53. Positividad y

negatividad determinada en base a diferentes puntos de corte (al 3, 10 y 20% para ki67 y al 10

y 50% para p53).

ki67 ≤3% >3% ≤10% >10% ≤20% >20%

n (%)

AII 19 (76) 6 (24) 23 (92) 2 (8) 24 (96) 1 (4)

AIII 18 (66.67) 9 (33.33) 24 (88.89) 3 (11.11) 26 (96.29) 1 (3.7)

GBM 75 (44.38) 94 (55.62) 126 (74.56) 43 (25.44) 151 (89.35) 18 (10.65)

Total 112 (50.7) 109 (49.3) 173 (78.3) 48 (21.7) 201 (91) 20 (9)

p-valor 0.003 0.05 0.326

Resultados

Como se ha comentado anteriormente, se establecieron diferentes puntos

de corte, tanto en ki67 como en p53, para determinar la positividad o

negatividad de las muestras. En el caso de ki67, se observó una asociación

entre ki67 al 3% con el grado tumoral (p-valor 0.003). y con el Tto (p-valor

0.015). En cuanto a p53, se observó una asociación entre p53 al 10% con el

grado tumoral (p-valor 0.021) y con la edad (p-valor 0.018).

Por otro lado, la comparación de ambos marcadores entre sí demostró

una serie de asociaciones (Tabla 28 y 29):


p-valor Rho

ki67 p53 0.002 0.208*

*El valor de rho indica una posible asociación directa entre ambas variables, sin embargo (y a

pesar de que el p-valor es estadísticamente significativo) es un valor muy cercano a cero y, por

tanto, no se puede confirmar que exista dicha asociación.

p53 ≤10% >10% ≤50% >50%

n (%)

AII 8 (32) 17 (68) 20 (80) 5 (20%)

AIII 10 (71.43) 4 (28.57) 11 (78.57) 3 (7.14)

GBM 85 (50) 85 (50) 123 (72.35) 47 (27.65)

Total 112 (50.4) 110 (49.5) 164 (73.9) 58 (26.19)

p-valor 0.021 0.637

142

Resultados

Tabla 29. Asociación entre las variables cualitativas ki67 y p53 mediante le prueba de Chi

cuadrado.

ki67 p53 p-valor

3% 50% 0.024

10% 50% 0.045

20% 50% 0.011

Ni p53 al 10% ni p53 al 50% se asociaron con la supervivencia (p-valor

0.557 y 0.905, respectivamente). Sin embargo, ki67 sí mostró tener un valor

pronóstico (Tabla 30):


ki67 p-valor

3% 0.044

10% 0.025

20% 0.040

Por otro lado, la asociación entre las mutaciones en TP53 y las

mutaciones en IDH en esta serie sólo mostraron una cierta tendencia hacia la

significación estadística (p-valor= 0.053).

4.2. VARIABLES CLÍNICAS

Además de las asociaciones descritas anteriormente, se observaron

relaciones estadísticamente significativas entre variables clínicas. Por un lado,

Resultados

el grado tumoral correlaciona con la edad de los pacientes (p-valor <0.000), es

decir, a mayor edad de los pacientes mayor grado del tumor (Tabla 31).


AII AIII GBM p-valor

Mediana n % n % n %

<0.000 ≤ 55 26 92.8 15 53.6 77 43.2

> 55 2 7.1 13 46.4 101 56.7

El tratamiento de elección viene determinado por el estadío del tumor, por

lo que, el grado tumoral también correlacionó con el Tto (p-valor 0.001) (Tabla

32).

Tabla 32. Tabla de contingencia para las variables grado tumoral y Tto.



AII (n=13) 38.5% (n= 5) 30.8% (n= 4) 23.1% (n= 3) 7.7% (n= 1)

0.001 AIII (n= 20) 45% (n= 9) 10% (n= 2) 45% (n= 9) 0% (n= 0)

GBM (n= 121) 62% (n= 75) 0.8% (n= 1) 30.6% (n= 37) 6.6% (n= 8)

En cuanto al valor pronóstico de estas variables clínicas, el grado

tumoral mostró una asociación con la supervivencia (p-valor <0.000), al igual

que la edad (p-valor= 0) y el tto (p-valor= 0), siendo el grado tumoral II, la edad

por debajo de la mediana y la cirugía las variables con mayor supervivencia

(Figura 38).

143

Resultados

Tabla 29. Asociación entre las variables cualitativas ki67 y p53 mediante le prueba de Chi

cuadrado.

ki67 p53 p-valor

3% 50% 0.024

10% 50% 0.045

20% 50% 0.011

Ni p53 al 10% ni p53 al 50% se asociaron con la supervivencia (p-valor

0.557 y 0.905, respectivamente). Sin embargo, ki67 sí mostró tener un valor

pronóstico (Tabla 30):


ki67 p-valor

3% 0.044

10% 0.025

20% 0.040

Por otro lado, la asociación entre las mutaciones en TP53 y las

mutaciones en IDH en esta serie sólo mostraron una cierta tendencia hacia la

significación estadística (p-valor= 0.053).

4.2. VARIABLES CLÍNICAS

Además de las asociaciones descritas anteriormente, se observaron

relaciones estadísticamente significativas entre variables clínicas. Por un lado,

Resultados

el grado tumoral correlaciona con la edad de los pacientes (p-valor <0.000), es

decir, a mayor edad de los pacientes mayor grado del tumor (Tabla 31).


AII AIII GBM p-valor

Mediana n % n % n %

<0.000 ≤ 55 26 92.8 15 53.6 77 43.2

> 55 2 7.1 13 46.4 101 56.7

El tratamiento de elección viene determinado por el estadío del tumor, por

lo que, el grado tumoral también correlacionó con el Tto (p-valor 0.001) (Tabla

32).

Tabla 32. Tabla de contingencia para las variables grado tumoral y Tto.



AII (n=13) 38.5% (n= 5) 30.8% (n= 4) 23.1% (n= 3) 7.7% (n= 1)

0.001 AIII (n= 20) 45% (n= 9) 10% (n= 2) 45% (n= 9) 0% (n= 0)

GBM (n= 121) 62% (n= 75) 0.8% (n= 1) 30.6% (n= 37) 6.6% (n= 8)

En cuanto al valor pronóstico de estas variables clínicas, el grado

tumoral mostró una asociación con la supervivencia (p-valor <0.000), al igual

que la edad (p-valor= 0) y el tto (p-valor= 0), siendo el grado tumoral II, la edad

por debajo de la mediana y la cirugía las variables con mayor supervivencia

(Figura 38).

144

Resultados

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII

p-valor <0.000

AIII

GBM

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Edad ≤ 55 años

p-valor 0

Edad >55 años

A

B

Resultados

Figura 38. Curvas de Kaplan-Meier para las distintas variables clínicas. (A) Línea negra:

AII; línea roja: AIII; línea verde: GBM. (B) Línea negra: edad igual o por debajo de la mediana;

línea roja: edad por encima de la mediana. (C) Línea negra: QX + RT y/o QT; línea roja: sólo

Qx; línea verde: biopsia + RT y/o QT; línea azul: sólo biopsia.

4.3. ASOCIACIÓN ENTRE MARCADORES MOLECULARES 4.3.1. Mutaciones en IDH y metilación de MGMT

Casi todas las muestras analizadas que presentaban mutación en IDH se

encontraban metiladas para MGMT (95.24%), mientras que las muestras con

IDH no mutado presentaban metilación en MGMT (52.43%) o no (47.57%).

Como era de esperar, el análisis combinado de ambas alteraciones mostró una

fuerte asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000, IC 95% 4.438-

157.878, OR 17.993) (Tabla 33).

Qx + RT y/o QT QT

p-valor 0

Sólo Qx

Biopsia + RT y/o QT

Sólo biopsia

C

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

145

Resultados

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII

p-valor <0.000

AIII

GBM

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Edad ≤ 55 años

p-valor 0

Edad >55 años

A

B

Resultados

Figura 38. Curvas de Kaplan-Meier para las distintas variables clínicas. (A) Línea negra:

AII; línea roja: AIII; línea verde: GBM. (B) Línea negra: edad igual o por debajo de la mediana;

línea roja: edad por encima de la mediana. (C) Línea negra: QX + RT y/o QT; línea roja: sólo

Qx; línea verde: biopsia + RT y/o QT; línea azul: sólo biopsia.

4.3. ASOCIACIÓN ENTRE MARCADORES MOLECULARES 4.3.1. Mutaciones en IDH y metilación de MGMT

Casi todas las muestras analizadas que presentaban mutación en IDH se

encontraban metiladas para MGMT (95.24%), mientras que las muestras con

IDH no mutado presentaban metilación en MGMT (52.43%) o no (47.57%).

Como era de esperar, el análisis combinado de ambas alteraciones mostró una

fuerte asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000, IC 95% 4.438-

157.878, OR 17.993) (Tabla 33).

Qx + RT y/o QT QT

p-valor 0

Sólo Qx

Biopsia + RT y/o QT

Sólo biopsia

C

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

146

Resultados

Tabla 33. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en MGMT y

mutaciones en IDH.

MGMT metilado

MGMT no metilado p-valor IC 95% OR

IDH mutado 95.24% (n= 40)

4.76% (n= 2) <0.000 4.438-157.878 17.993

IDH no mutado 52.43% (n= 97)

47.57% (n= 88)

4.3.2. Mutaciones en IDH y G-CIMP

El biomarcador IDH mutado también presentó asociación con el G-CIMP

(p-valor 0.013). De las muestras con mutación en IDH, 21 fueron CIMP

negativas y 16 CIMP positivas. Por otro lado, de las muestras con IDH sin

mutación, 132 fueron CIMP negativas y 40 CIMP positivas (Tabla 34).

Tabla 34. Tabla de contingencia para las variables moleculares CIMP y mutaciones en

IDH.

CIMP negativo CIMP positivo p-valor

IDH mutado 56.76% (n= 21) 43.24% (n= 16) 0.013

IDH no mutado 76.61% (n= 131) 23.39% (n= 40)

4.3.3. Mutaciones en IDH, metilación de MGMT y metilación de SOCS1

La metilación en SOCS1 no sólo se encontró asociada con el grado

tumoral y la edad, si no que también se observó una asociación con las

mutaciones en IDH (p-valor <0.000, IC 95% 0.006-0.119, OR 0.035) y con la

metilación de MGMT (p-valor 0.021). Las mutaciones en IDH se asociaron a la

metilación de SOCS1 en un 91.89%, ya que sólo un 8.11% de las muestras con

mutación en IDH no presentaban metilación en SOCS1. El 61.50% de los

Resultados

casos no presentaron ni mutaciones en IDH ni metilación en SOCS1. El

45.24% de las muestras presentaron tanto metilación en MGMT como

metilación en SOCS1 mientras que sólo el 28.95% estaban metiladas para

SOCS1 cuando MGMT no presentaba metilación. Estos resultados se resumen

en la siguiente tabla (Tabla 35):

Tabla 35. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en SOCS1 y mutaciones en IDH.

SOCS1 metilado SOCS1 no metilado p-valor

IDH mutado 91.89% (n=34) 8.11% (n= 3) <0.000

IDH no wt 28.07% (n= 48) 71.93% (n= 123)

MGMT metilado 45.24% (n=57) 54.76% (n=69) 0.021

MGMT no metilado 28.95% (n=22) 71.05% (n=54)

4.3.4. Metilación de SOCS1 y G-CIMP

Por último, se observó una correlación entre la metilación de SOCS1 y el

fenotipo G-CIMP (p-valor <0.000). Esta asociación era de esperar, ya que

SOCS1 forma parte del panel de genes del CIMP, por lo que se consideró sólo

la variable metilación en SOCS1 en el análisis multivariante que se realizó

posteriormente (Tabla 36).

Tabla 36. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en SOCS1 y

CIMP.


G-CIMP positivo 85.71% (n= 48) 14.81% (n= 8) <0.000

G-CIMP negativo 23.37% (n= 34) 77.63% (n= 118)

147

Resultados

Tabla 33. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en MGMT y

mutaciones en IDH.

MGMT metilado

MGMT no metilado p-valor IC 95% OR

IDH mutado 95.24% (n= 40)

4.76% (n= 2) <0.000 4.438-157.878 17.993

IDH no mutado 52.43% (n= 97)

47.57% (n= 88)

4.3.2. Mutaciones en IDH y G-CIMP

El biomarcador IDH mutado también presentó asociación con el G-CIMP

(p-valor 0.013). De las muestras con mutación en IDH, 21 fueron CIMP

negativas y 16 CIMP positivas. Por otro lado, de las muestras con IDH sin

mutación, 132 fueron CIMP negativas y 40 CIMP positivas (Tabla 34).

Tabla 34. Tabla de contingencia para las variables moleculares CIMP y mutaciones en

IDH.

CIMP negativo CIMP positivo p-valor

IDH mutado 56.76% (n= 21) 43.24% (n= 16) 0.013

IDH no mutado 76.61% (n= 131) 23.39% (n= 40)

4.3.3. Mutaciones en IDH, metilación de MGMT y metilación de SOCS1

La metilación en SOCS1 no sólo se encontró asociada con el grado

tumoral y la edad, si no que también se observó una asociación con las

mutaciones en IDH (p-valor <0.000, IC 95% 0.006-0.119, OR 0.035) y con la

metilación de MGMT (p-valor 0.021). Las mutaciones en IDH se asociaron a la

metilación de SOCS1 en un 91.89%, ya que sólo un 8.11% de las muestras con

mutación en IDH no presentaban metilación en SOCS1. El 61.50% de los

Resultados

casos no presentaron ni mutaciones en IDH ni metilación en SOCS1. El

45.24% de las muestras presentaron tanto metilación en MGMT como

metilación en SOCS1 mientras que sólo el 28.95% estaban metiladas para

SOCS1 cuando MGMT no presentaba metilación. Estos resultados se resumen

en la siguiente tabla (Tabla 35):

Tabla 35. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en SOCS1 y mutaciones en IDH.


IDH mutado 91.89% (n=34) 8.11% (n= 3) <0.000

IDH no wt 28.07% (n= 48) 71.93% (n= 123)

MGMT metilado 45.24% (n=57) 54.76% (n=69) 0.021

MGMT no metilado 28.95% (n=22) 71.05% (n=54)

4.3.4. Metilación de SOCS1 y G-CIMP

Por último, se observó una correlación entre la metilación de SOCS1 y el

fenotipo G-CIMP (p-valor <0.000). Esta asociación era de esperar, ya que

SOCS1 forma parte del panel de genes del CIMP, por lo que se consideró sólo

la variable metilación en SOCS1 en el análisis multivariante que se realizó

posteriormente (Tabla 36).

Tabla 36. Tabla de contingencia para las variables moleculares metilación en SOCS1 y

CIMP.


G-CIMP positivo 85.71% (n= 48) 14.81% (n= 8) <0.000

G-CIMP negativo 23.37% (n= 34) 77.63% (n= 118)

148

Resultados

4.4. ANÁLISIS MULTIVARIANTE POR REGRESIÓN DE COX

Teniendo en cuenta las variables moleculares y clínicas que fueron

estadísticamente significativas en el análisis univariante por Kaplan-Meier, se

realizó un análisis multivariante por Regresión de Cox. Las variables mutación

en IDH, grado tumoral, edad y Tto resultaron ser factores pronósticos

independientes en el análisis multivariante, siendo la edad la variable con una

mayor significancia estadística (p-valor <0.000). Se repitió el análisis

eliminando la variable Tto, ya que no se disponía de esa información en

muchas de las muestras de la serie. Todos estos resultados se resumen en la

Tabla 37.

Tabla 37. Análisis multivariante por Regresión de Cox. Variables independientes, con

respecto a la supervivencia.

Análisis Multivariante

Variables p-valor IC 95%

Edad* 0.000 1.693-3.813

Tto* 0.001 1.148-1.648

Mutaciones IDH* 0.006 1.252-3.728

Grado tumoral* 0.044 1.009-1.944

Edad* 0.000 1.709-3.367

Grado tumoral* 0.015 1.063-1.726

Mutaciones IDH* 0.012 1.136-2.795

Posteriormente, se realizó un nuevo análisis multivariante teniendo en

cuenta aquellas variables, tanto clínicas como moleculares, que se asociaban a

la metilación de SOCS1. Fueron cuatro dichas variables: mutaciones en IDH,

metilación en MGMT, grado tumoral y edad. Sólo mantuvieron la razón de

Resultados

variables independientes las dos variables clínicas (grado tumoral y edad) y las

mutaciones en IDH (Tabla 38).


respecto a la metilación de SOCS1.



Edad* 0.000 1.723-3.459

Grado tumoral* 0.040 1.013-1.722

Mutaciones IDH* 0.043 1.017-2.734

Tras estos análisis, lo que se observa es que la edad es la variable

independiente que ejerce una mayor influencia y que presenta un mayor poder

estadístico. En base a ello, se dividieron las muestras en dos grupos: el grupo

de los pacientes con una edad igual o por debajo de la mediana, y el grupo de

los pacientes con una edad por encima. En cada grupo se realizó un análisis

multivariante (en base a la supervivencia y sin tener en cuenta la variable Tto.),

de forma que no se tuvo en cuenta la variable edad en dicho análisis. Los

resultados de este último análisis se resumen en la siguiente tabla (Tabla 39):

Tabla 39. Análisis multivariante por Regresión de Cox. Variables independientes en cada

grupo de edad con respecto a la supervivencia.

Análisis multivariante

Edad Variables p-valor IC 95%

≤ Mediana Grado tumoral 0.004 1.413-5.916

Mutaciones IDH 0.126* 0.854-3.588

> Mediana Ninguna

*Existe una cierta tendencia a que esta variable pudiera ser independiente

149

Resultados

4.4. ANÁLISIS MULTIVARIANTE POR REGRESIÓN DE COX

Teniendo en cuenta las variables moleculares y clínicas que fueron

estadísticamente significativas en el análisis univariante por Kaplan-Meier, se

realizó un análisis multivariante por Regresión de Cox. Las variables mutación

en IDH, grado tumoral, edad y Tto resultaron ser factores pronósticos

independientes en el análisis multivariante, siendo la edad la variable con una

mayor significancia estadística (p-valor <0.000). Se repitió el análisis

eliminando la variable Tto, ya que no se disponía de esa información en

muchas de las muestras de la serie. Todos estos resultados se resumen en la

Tabla 37.


respecto a la supervivencia.



Edad* 0.000 1.693-3.813

Tto* 0.001 1.148-1.648

Mutaciones IDH* 0.006 1.252-3.728

Grado tumoral* 0.044 1.009-1.944

Edad* 0.000 1.709-3.367

Grado tumoral* 0.015 1.063-1.726

Mutaciones IDH* 0.012 1.136-2.795

Posteriormente, se realizó un nuevo análisis multivariante teniendo en

cuenta aquellas variables, tanto clínicas como moleculares, que se asociaban a

la metilación de SOCS1. Fueron cuatro dichas variables: mutaciones en IDH,

metilación en MGMT, grado tumoral y edad. Sólo mantuvieron la razón de

Resultados

variables independientes las dos variables clínicas (grado tumoral y edad) y las

mutaciones en IDH (Tabla 38).


respecto a la metilación de SOCS1.



Edad* 0.000 1.723-3.459

Grado tumoral* 0.040 1.013-1.722

Mutaciones IDH* 0.043 1.017-2.734

Tras estos análisis, lo que se observa es que la edad es la variable

independiente que ejerce una mayor influencia y que presenta un mayor poder

estadístico. En base a ello, se dividieron las muestras en dos grupos: el grupo

de los pacientes con una edad igual o por debajo de la mediana, y el grupo de

los pacientes con una edad por encima. En cada grupo se realizó un análisis

multivariante (en base a la supervivencia y sin tener en cuenta la variable Tto.),

de forma que no se tuvo en cuenta la variable edad en dicho análisis. Los

resultados de este último análisis se resumen en la siguiente tabla (Tabla 39):

Tabla 39. Análisis multivariante por Regresión de Cox. Variables independientes en cada

grupo de edad con respecto a la supervivencia.

Análisis multivariante

Edad Variables p-valor IC 95%

≤ Mediana Grado tumoral 0.004 1.413-5.916

Mutaciones IDH 0.126* 0.854-3.588

> Mediana Ninguna

*Existe una cierta tendencia a que esta variable pudiera ser independiente

150

Resultados

4.5. DETECCIÓN DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO EN TUMORES GLIALES

4.5.1. ANÁLISIS POR PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL

El análisis por PCR cuantitativa a tiempo real para detectar HCMV se

realizó en 122 de las muestras de la serie (94 muestras embebidas en parafina

y 28 muestras de tejido congelado) (Tabla 40). Inesperadamente no se detectó

ADN de HCMV en 119 muestras de esta serie de gliomas. Tres casos (2 AIII y

1 GBM) mostraron un bajo número de copias virales (<10) (3/122, 2.46%)

(Tabla 41). La precisión analítica requeridos para caracterizar el test

cuantitativo (veracidad, precisión y límite de detección) estaba asegurado por la

metodología empleada, ya que se utilizó un kit cuantitativo con validación para

uso diagnóstico.

Tabla 40. Características de los pacientes cuyas muestras fueron analizadas para HCMV.

Min (Mínimo), Max (Máximo)

Variables Frecuencias

Género Hombre 72 59.02% Mujer 50 40.98%

Edad (años) Media 54 Min-Max 4-81 Grado II 16 13.11% III 19 15.57% IV 87 71.31%

4.5.2. ANÁLISIS POR NESTED-PCR EN CASOS SELECCIONADOS

De las muestras analizadas por RT-PCR, se seleccionaron 30 para su

análisis por la metodología utilizada en el reciente artículo de Bhattacharjee y

Resultados

col. (Bhattacharjee, et al., 2012). Ninguna de estas muestras fue positiva para

HCMV (Tabla 41).

4.5.3. INMUNOHISTOQUÍMICA

Por último, de esta serie de muestras se analizaron 110 (85 muestras

embebidas en parafina y 25 muestras de tejido congelado) por IHQ. En este

caso tampoco se encontró ninguna muestra positiva para HCMV (Tabla 41).

Tabla 41. Resultados de las diferentes técnicas empleadas para la detección de HCMV.

Técnicas Muestras totales Positivas Negativas

RT-PCR 122 3* 119

Nested PCR 30 0 30

IHQ 110 0 110

* Menos de 10 copias del virus por célula.

4.6. GLIOBLASTOMAS DE LARGA SUPERVIVENCIA

De 177 GBM de la serie (de dos de los GBM del total de la serie, 179, no

se tenía el dato de la supervivencia), 29 (16.38%) presentaron una

supervivencia por encima de lo normal (supervivencia media de 73.2 meses en

esta serie), en comparación con la supervivencia media de este tipo de tumores

(12.2 meses en esta serie). El punto de corte para definir los dos grupos de

GBM se estableció en 36 meses (Dietmar Krex, et al., 2007). Las característas

clínicas y moleculares de cada uno de los dos grupos, así como el resultado de

las asociaciones con dichos factores se resume en la tabla 42.

151

Resultados

4.5. DETECCIÓN DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO EN TUMORES GLIALES

4.5.1. ANÁLISIS POR PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL

El análisis por PCR cuantitativa a tiempo real para detectar HCMV se

realizó en 122 de las muestras de la serie (94 muestras embebidas en parafina

y 28 muestras de tejido congelado) (Tabla 40). Inesperadamente no se detectó

ADN de HCMV en 119 muestras de esta serie de gliomas. Tres casos (2 AIII y

1 GBM) mostraron un bajo número de copias virales (<10) (3/122, 2.46%)

(Tabla 41). La precisión analítica requeridos para caracterizar el test

cuantitativo (veracidad, precisión y límite de detección) estaba asegurado por la

metodología empleada, ya que se utilizó un kit cuantitativo con validación para

uso diagnóstico.

Tabla 40. Características de los pacientes cuyas muestras fueron analizadas para HCMV.

Min (Mínimo), Max (Máximo)


Género Hombre 72 59.02% Mujer 50 40.98%

Edad (años) Media 54 Min-Max 4-81 Grado II 16 13.11% III 19 15.57% IV 87 71.31%

4.5.2. ANÁLISIS POR NESTED-PCR EN CASOS SELECCIONADOS

De las muestras analizadas por RT-PCR, se seleccionaron 30 para su

análisis por la metodología utilizada en el reciente artículo de Bhattacharjee y

Resultados

col. (Bhattacharjee, et al., 2012). Ninguna de estas muestras fue positiva para

HCMV (Tabla 41).

4.5.3. INMUNOHISTOQUÍMICA

Por último, de esta serie de muestras se analizaron 110 (85 muestras

embebidas en parafina y 25 muestras de tejido congelado) por IHQ. En este

caso tampoco se encontró ninguna muestra positiva para HCMV (Tabla 41).

Tabla 41. Resultados de las diferentes técnicas empleadas para la detección de HCMV.

Técnicas Muestras totales Positivas Negativas

RT-PCR 122 3* 119

Nested PCR 30 0 30

IHQ 110 0 110

* Menos de 10 copias del virus por célula.

4.6. GLIOBLASTOMAS DE LARGA SUPERVIVENCIA

De 177 GBM de la serie (de dos de los GBM del total de la serie, 179, no

se tenía el dato de la supervivencia), 29 (16.38%) presentaron una

supervivencia por encima de lo normal (supervivencia media de 73.2 meses en

esta serie), en comparación con la supervivencia media de este tipo de tumores

(12.2 meses en esta serie). El punto de corte para definir los dos grupos de

GBM se estableció en 36 meses (Dietmar Krex, et al., 2007). Las característas

clínicas y moleculares de cada uno de los dos grupos, así como el resultado de

las asociaciones con dichos factores se resume en la tabla 42.

152

Resultados

Tabla 42. Características clínicas y moleculares de los GBM de supervivencia normal y de larga supervivencia. P-valor del test X2.

Supervivencia normal Supervivencia larga p-valor n % n % 148 83.62 29 16.38 Edad ≤ Mediana 55 37.16 21 72.41 <0.000 > Mediana 93 62.84 8 27.59 IDH Mutado 5 3.38 11 37.93 <0.000 No mutado 143 96.62 18 62.07 MGMT Metilado 78 52.70 20 71.43 0.078 No metilado 68 45.94 8 28.57 SOCS1 Metilado 38 28.78 13 56.52 0.009 No metilado 94 71.21 10 43.48

Sin tener en cuenta la variable metilación en MGMT por no ser

estadísticamente significativa (p=0.078), se llevaron a cabo una serie de

análisis de supervivencia por Kaplan-Meier en base a diferentes perfiles

moleculares en los GBM de larga supervivencia. Estos perfiles se establecieron

en base a la combinación de una, dos o tres variables:

Perfil A (edad): p-valor=0.358

Perfil B (mutaciones en IDH): p-valor=0.053

Perfil C (metilación en SOCS1): p-valor=0.065

Perfil D (edad y mutaciones en IDH): p-valor=0.053

Perfil E (edad y metilación en SOCS1): p-valor=0.03

Perfil F (mutaciones en IDH y metilación en SOCS1): p-valor=0.053

Perfil G (mutaciones en IDH, metilación en SOCS1 y edad): p-valor=0.053

Resultados

Como se observa, el perfil con un valor estadísticamente significativo fue

el formado por la combinación de la edad y la metilación en SOCS1 (p=0.03).

Esto es, la supervivencia fue mayor en los pacientes con GBM (largos

supervivientes) que presentaron metilación en SOCS1 y edad igual o por

debajo de la mediana (Figura 39):

Figura 39. Curvas de Kaplan-Meier para el perfil E de los GBM largos supervivientes: Línea negra: metilación en SOCS1 y edad igual o por debajo de la mediana. Línea roja: resto

de combinaciones.

4.7. CLASIFICACIÓN CLINICOPATOLÓGICA Y MOLECULAR DE GLIOMAS. PERFILES MOLECULARES

Se llevaron a cabo varios análisis de supervivencia en base a diferentes

perfiles moleculares y al grado tumoral. En primer lugar, teniendo en cuenta la

metilación de MGMT, se observa una mayor supervivencia en los casos

metilados, siendo los AII los de mejor pronóstico (p-valor <0.000) (Figura 40).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil.EMetilación SOCS1 y edad<=medianaOtras combinaciones

p-valor=0.03

153

Resultados

Tabla 42. Características clínicas y moleculares de los GBM de supervivencia normal y de larga supervivencia. P-valor del test X2.

Supervivencia normal Supervivencia larga p-valor n % n % 148 83.62 29 16.38 Edad ≤ Mediana 55 37.16 21 72.41 <0.000 > Mediana 93 62.84 8 27.59 IDH Mutado 5 3.38 11 37.93 <0.000 No mutado 143 96.62 18 62.07 MGMT Metilado 78 52.70 20 71.43 0.078 No metilado 68 45.94 8 28.57 SOCS1 Metilado 38 28.78 13 56.52 0.009 No metilado 94 71.21 10 43.48

Sin tener en cuenta la variable metilación en MGMT por no ser

estadísticamente significativa (p=0.078), se llevaron a cabo una serie de

análisis de supervivencia por Kaplan-Meier en base a diferentes perfiles

moleculares en los GBM de larga supervivencia. Estos perfiles se establecieron

en base a la combinación de una, dos o tres variables:

Perfil A (edad): p-valor=0.358

Perfil B (mutaciones en IDH): p-valor=0.053

Perfil C (metilación en SOCS1): p-valor=0.065

Perfil D (edad y mutaciones en IDH): p-valor=0.053

Perfil E (edad y metilación en SOCS1): p-valor=0.03

Perfil F (mutaciones en IDH y metilación en SOCS1): p-valor=0.053

Perfil G (mutaciones en IDH, metilación en SOCS1 y edad): p-valor=0.053

Resultados

Como se observa, el perfil con un valor estadísticamente significativo fue

el formado por la combinación de la edad y la metilación en SOCS1 (p=0.03).

Esto es, la supervivencia fue mayor en los pacientes con GBM (largos

supervivientes) que presentaron metilación en SOCS1 y edad igual o por

debajo de la mediana (Figura 39):

Figura 39. Curvas de Kaplan-Meier para el perfil E de los GBM largos supervivientes: Línea negra: metilación en SOCS1 y edad igual o por debajo de la mediana. Línea roja: resto

de combinaciones.

4.7. CLASIFICACIÓN CLINICOPATOLÓGICA Y MOLECULAR DE GLIOMAS. PERFILES MOLECULARES

Se llevaron a cabo varios análisis de supervivencia en base a diferentes

perfiles moleculares y al grado tumoral. En primer lugar, teniendo en cuenta la

metilación de MGMT, se observa una mayor supervivencia en los casos

metilados, siendo los AII los de mejor pronóstico (p-valor <0.000) (Figura 40).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil.EMetilación SOCS1 y edad<=medianaOtras combinaciones

p-valor=0.03

154

Resultados

Figura 40. Curvas de Kaplan-Meier para la metilación de MGMT en base a los diferentes grados tumorales. Línea negra: AII y MGMT metilado; AIII y MGMT metilado; línea verde:

GBM y MGMT metilado; línea azul: AII y MGMT no metilado; línea azul claro: AIII y MGMT no

metilado; línea lila: GBM y MGMT no metilado.

En cuanto a las mutaciones en IDH, se observa que los AIII mutados son

los que presentan una mayor supervivencia y los GBM y AII no mutados los de

peor pronóstico (p-valor <0.000) (Figura 41).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII y MGMT metilado

p-valor <0.000

AIII y MGMT metilado

GBM y MGMT metilado

AII y MGMT no metilado

AIII y MGMT no metilado

GBM y MGMT no metilado

Resultados

Figura 41. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH en base a los diferentes grados histológicos. Línea negra: AII e IDH mutado; AIII e IDH mutado; línea verde: GBM e

IDH mutado; línea azul: AII e IDH no mutado; línea azul claro: AIII e IDH no mutado; línea lila:

GBM e IDH no mutado.

Se repitió el análisis agrupando los AII y AIII como bajo grado. En este

caso, se observa que los bajo grado mutados son los de mayor supervivencia

(p-valor <0.000) (Figura 42).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado

AII e IDH no mutado AIII e IDH no mutado

GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

GBM e IDH mutado

AII y AIII e IDH mutado

AII y AIII e IDH no mutado

GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados







0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado


GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

GBM e IDH mutado



GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados







0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado


GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 1500.

00.

20.

40.

60.

81.

0

GBM e IDH mutado



GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

155

Resultados

Figura 40. Curvas de Kaplan-Meier para la metilación de MGMT en base a los diferentes grados tumorales. Línea negra: AII y MGMT metilado; AIII y MGMT metilado; línea verde:

GBM y MGMT metilado; línea azul: AII y MGMT no metilado; línea azul claro: AIII y MGMT no

metilado; línea lila: GBM y MGMT no metilado.

En cuanto a las mutaciones en IDH, se observa que los AIII mutados son

los que presentan una mayor supervivencia y los GBM y AII no mutados los de

peor pronóstico (p-valor <0.000) (Figura 41).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII y MGMT metilado

p-valor <0.000

AIII y MGMT metilado

GBM y MGMT metilado

AII y MGMT no metilado

AIII y MGMT no metilado

GBM y MGMT no metilado

Resultados







0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado


GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

GBM e IDH mutado



GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados







0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado


GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

GBM e IDH mutado



GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados







0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AII e IDH mutado

AIII e IDH mutado

GBM e IDH mutado


GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

GBM e IDH mutado



GBM e IDH no mutado

p-valor <0.000

156

Resultados

Figura 42. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH agrupando los AII y AIII. Línea negra: AII y AIII e IDH mutado; línea roja: GBM e IDH mutado; línea verde: AII y AIII e

IDH no mutado; línea azul: GBM e IDH no mutado.

Al tener en cuenta las mutaciones en IDH y en TP53, se observa una

asociación estadísticamente significativa, tanto con el corte de TP53 en el 10%

como en el 50% (p-valor <0.000 en ambos casos) (Figura 43). Los perfiles

establecidos son:

IDH mutado y TP53 mutado

IDH mutado y TP53 no mutado

IDH no mutado

Las muestras con IDH mutado y TP53 no mutado presentaron la mayor

supervivencia.

Figura 43. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH y TP53. En la imagen de la izquierda el punto de corte para p53 es de un 10% y en la imagen de

la derecha es de un 50%. Línea negra: IDH y TP53 mutados; línea roja: IDH mutado y TP53

no mutado; línea verde: IDH no mutado.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH y TP53 mutados


IDH no mutado

p-valor <0.000

IDH y TP53 mutados


IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados

Por otro lado, si se agrupan las mutaciones en IDH y el índice de

proliferación ki67 (bajo ≤ 10%, moderado 11-29%, alto ≥ 30%), también se

observa una asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000) (Figura

44). En este caso, se establecieron cinco perfiles:

IDH mutado y ki67 bajo y/o moderado

IDH mutado y ki67 alto

IDH no mutado y ki67 bajo

IDH no mutado y ki67 moderado

IDH no mutado y ki67 alto

En este caso, el perfil que mostró mejor pronóstico fue el de IDH mutado

y ki67 bajo y/o moderado.

Figura 44. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH y ki67. Línea negra: IDH mutado y ki67 bajo y/o moderado; línea roja: IDH mutado y

ki67 alto; línea verde: IDH no mutado y ki67 bajo; línea azul: IDH no mutado y ki67 moderado;

línea azul claro: IDH no mutado y ki67 alto.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


IDH mutado y ki67 bajo/moderado




p-valor <0.000

157

Resultados

Figura 42. Curvas de Kaplan-Meier para las mutaciones en IDH agrupando los AII y AIII. Línea negra: AII y AIII e IDH mutado; línea roja: GBM e IDH mutado; línea verde: AII y AIII e

IDH no mutado; línea azul: GBM e IDH no mutado.

Al tener en cuenta las mutaciones en IDH y en TP53, se observa una

asociación estadísticamente significativa, tanto con el corte de TP53 en el 10%

como en el 50% (p-valor <0.000 en ambos casos) (Figura 43). Los perfiles

establecidos son:

IDH mutado y TP53 mutado


IDH no mutado

Las muestras con IDH mutado y TP53 no mutado presentaron la mayor

supervivencia.

Figura 43. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH y TP53. En la imagen de la izquierda el punto de corte para p53 es de un 10% y en la imagen de

la derecha es de un 50%. Línea negra: IDH y TP53 mutados; línea roja: IDH mutado y TP53

no mutado; línea verde: IDH no mutado.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IDH y TP53 mutados


IDH no mutado

p-valor <0.000

IDH y TP53 mutados


IDH no mutado

p-valor <0.000

Resultados

Por otro lado, si se agrupan las mutaciones en IDH y el índice de

proliferación ki67 (bajo ≤ 10%, moderado 11-29%, alto ≥ 30%), también se

observa una asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000) (Figura

44). En este caso, se establecieron cinco perfiles:

IDH mutado y ki67 bajo y/o moderado





En este caso, el perfil que mostró mejor pronóstico fue el de IDH mutado

y ki67 bajo y/o moderado.

Figura 44. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH y ki67. Línea negra: IDH mutado y ki67 bajo y/o moderado; línea roja: IDH mutado y

ki67 alto; línea verde: IDH no mutado y ki67 bajo; línea azul: IDH no mutado y ki67 moderado;

línea azul claro: IDH no mutado y ki67 alto.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


IDH mutado y ki67 bajo/moderado




p-valor <0.000

158

Resultados

En base a los marcadores IDH, MGMT y SOCS1, se crearon 8 perfiles

(Tabla 43).

Tabla 43. Perfiles basados en tres marcadores moleculares. Mutaciones en IDH, metilación

en SOCS1 y metilación en MGMT.

Perfil IDH SOCS1 MGMT

1 Mutado Metilado Metilado

2 No Mutado Metilado Metilado

3 Mutado No Metilado Metilado

4 No Mutado No Metilado Metilado

5 Mutado Metilado No Metilado

6 No Mutado Metilado No Metilado

7 Mutado No Metilado No Metilado

8 No Mutado No Metilado No Metilado

Al analizar las supervivencias con respecto a estos perfiles, se observó

una asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000). En esta serie,

ninguna de las muestras presentó el perfil 5 ni 7, por lo que no aparecen en la

gráfica de las curvas de supervivencia. Como se observa en la gráfica, el perfil

1 correspondiente a IDH mutado y MGMT y SOCS1 metilados, fue el que tuvo

el mejor valor pronóstico con una diferencia significativa con respecto a los

otros perfiles (Figura 45).

Resultados

Figura 45. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH, metilación en MGMT y metilación en SOCS1. Perfiles descritos en la tabla 40.

Por último, se combinaron los ocho perfiles anteriores con las variables

moleculares TP53 y ki67. De esta combinación resultaron treinta y dos perfiles,

de los cuales trece se descartaron debido a la falta de muestras que se

correspondieran con dichos perfiles. Los diferentes perfiles obtenidos se

describen en el Anexo IX. El análisis por Kaplan-Meier de los restantes perfiles

resultó ser estadísticamente significativo (p-valor <0.000) (Figura no mostrada).

Debido a la gran cantidad de curvas, se procedió a simplificar la gráfica.

Para ello se descartaron aquellos perfiles cuya cantidad de muestras fuera

baja. El resultado fue el siguiente (p-valor <0.000) (Figura 46):

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil 1

Perfil 2

Perfil 3 Perfil 4

Perfil 8

Perfil 6

p-valor <0.000

159

Resultados

En base a los marcadores IDH, MGMT y SOCS1, se crearon 8 perfiles

(Tabla 43).

Tabla 43. Perfiles basados en tres marcadores moleculares. Mutaciones en IDH, metilación

en SOCS1 y metilación en MGMT.

Perfil IDH SOCS1 MGMT

1 Mutado Metilado Metilado

2 No Mutado Metilado Metilado

3 Mutado No Metilado Metilado

4 No Mutado No Metilado Metilado

5 Mutado Metilado No Metilado

6 No Mutado Metilado No Metilado

7 Mutado No Metilado No Metilado

8 No Mutado No Metilado No Metilado

Al analizar las supervivencias con respecto a estos perfiles, se observó

una asociación estadísticamente significativa (p-valor <0.000). En esta serie,

ninguna de las muestras presentó el perfil 5 ni 7, por lo que no aparecen en la

gráfica de las curvas de supervivencia. Como se observa en la gráfica, el perfil

1 correspondiente a IDH mutado y MGMT y SOCS1 metilados, fue el que tuvo

el mejor valor pronóstico con una diferencia significativa con respecto a los

otros perfiles (Figura 45).

Resultados

Figura 45. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH, metilación en MGMT y metilación en SOCS1. Perfiles descritos en la tabla 40.

Por último, se combinaron los ocho perfiles anteriores con las variables

moleculares TP53 y ki67. De esta combinación resultaron treinta y dos perfiles,

de los cuales trece se descartaron debido a la falta de muestras que se

correspondieran con dichos perfiles. Los diferentes perfiles obtenidos se

describen en el Anexo IX. El análisis por Kaplan-Meier de los restantes perfiles

resultó ser estadísticamente significativo (p-valor <0.000) (Figura no mostrada).

Debido a la gran cantidad de curvas, se procedió a simplificar la gráfica.

Para ello se descartaron aquellos perfiles cuya cantidad de muestras fuera

baja. El resultado fue el siguiente (p-valor <0.000) (Figura 46):

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil 1

Perfil 2

Perfil 3 Perfil 4

Perfil 8

Perfil 6

p-valor <0.000

160

Resultados

Figura 46. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH, metilación en MGMT, metilación en SOCS1, mutaciones en TP53 e índice de proliferación ki67. Los diferentes perfiles se describen en el Anexo XII.

Como se observa en la gráfica anterior, los perfiles 1 y 3 (descritos en el

Anexo X) presentan una mayor supervivencia con respecto al resto de perfiles.

Para observar más claramente esta diferencia, se establecieron sólo dos

grupos, por un lado los casos que presentaron MGMT metilado, SOCS1

metilad, IDH mutado, TP53 mutado o no mutado y ki67 bajo (que se

corresponden a los perfiles 1 y 3 del análisis anterior) y, por otro lado, el resto

de casos. Se observó una clara diferencia estadísticamente significativa entre

ambos grupos (p-valor <0.000) (Figura 47).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil 1

Perfil 3

Perfil 7

Perfil 13

Perfil 15

Perfil 31

Perfil 29

Perfil 23

p-valor <0.000

Resultados

Figura 47. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a los cinco marcadores. 1:

MGMT metilado, SOCS1 metilado e IDH mutado, independientemente de TP53 y ki67; 2: resto

de combinaciones.

Por tanto, de este último análisis se establece que los tumores con IDH

mutado, MGMT metilado, SOCS1 metilado y un índice de proliferación (ki67)

bajo son los que van a tener un mejor pronóstico. Por el contrario, los que

presentan IDH no mutado, MGMT y SOCS1 no metilados (independientemente

del estado de TP53 y ki67, ya que en esta serie no se dispone de muestras que

se correspondan con todos los perfiles posibles), son los que tienen una

supervivencia más baja. Puesto que en el análisis realizado en los GBM de

larga supervivencia se observó que el perfil correspondiente a los casos con

metilación en SOCS1 y edad igual o por debajo de la mediana predecía un

mejor pronóstico (p=0.03), se deicidió realizar el mismo análisis con todas las

muestras del presente trabajo (en este caso 206 muestras, ya que el análisis

de la metilación en SOCS1 no se realizó en toda la serie). Se observó una clara

diferencia estadísticamente significativa (p<0.000) entre ambos grupos (Figura

48):

MGMT y SOCS1 metilados e IDH mutado

p-valor 2.79e-07

Otras combinaciones

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

p-valor <0.000

161

Resultados

Figura 46. Curvas de Kaplan-Meier para los diferentes perfiles en base a las mutaciones en IDH, metilación en MGMT, metilación en SOCS1, mutaciones en TP53 e índice de proliferación ki67. Los diferentes perfiles se describen en el Anexo XII.

Como se observa en la gráfica anterior, los perfiles 1 y 3 (descritos en el

Anexo X) presentan una mayor supervivencia con respecto al resto de perfiles.

Para observar más claramente esta diferencia, se establecieron sólo dos

grupos, por un lado los casos que presentaron MGMT metilado, SOCS1

metilad, IDH mutado, TP53 mutado o no mutado y ki67 bajo (que se

corresponden a los perfiles 1 y 3 del análisis anterior) y, por otro lado, el resto

de casos. Se observó una clara diferencia estadísticamente significativa entre

ambos grupos (p-valor <0.000) (Figura 47).

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Perfil 1

Perfil 3

Perfil 7

Perfil 13

Perfil 15

Perfil 31

Perfil 29

Perfil 23

p-valor <0.000

Resultados

Figura 47. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a los cinco marcadores. 1:

MGMT metilado, SOCS1 metilado e IDH mutado, independientemente de TP53 y ki67; 2: resto

de combinaciones.

Por tanto, de este último análisis se establece que los tumores con IDH

mutado, MGMT metilado, SOCS1 metilado y un índice de proliferación (ki67)

bajo son los que van a tener un mejor pronóstico. Por el contrario, los que

presentan IDH no mutado, MGMT y SOCS1 no metilados (independientemente

del estado de TP53 y ki67, ya que en esta serie no se dispone de muestras que

se correspondan con todos los perfiles posibles), son los que tienen una

supervivencia más baja. Puesto que en el análisis realizado en los GBM de

larga supervivencia se observó que el perfil correspondiente a los casos con

metilación en SOCS1 y edad igual o por debajo de la mediana predecía un

mejor pronóstico (p=0.03), se deicidió realizar el mismo análisis con todas las

muestras del presente trabajo (en este caso 206 muestras, ya que el análisis

de la metilación en SOCS1 no se realizó en toda la serie). Se observó una clara

diferencia estadísticamente significativa (p<0.000) entre ambos grupos (Figura

48):

MGMT y SOCS1 metilados e IDH mutado

p-valor 2.79e-07

Otras combinaciones

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

p-valor <0.000

162

Resultados

Figura 48. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a la metilación de SOCS1 y la edad. Línea negra:SOCS1 metilado y edad ≤ mediana. Línea roja: otras combinaciones.

4.8. ESTUDIO DE EXPRESIÓN GÉNICA A GRAN ESCALA EN GLIOMAS. MICROARRAY DE EXPRESIÓN

Se analizaron 9 muestras (8 pacientes) de tejido congelado de GBM

pertenecientes a la serie analizada en este trabajo (Tabla 44). De estas

muestras, 7 eran tumores de pacientes no tratados con QT y/o RT y 2 eran

tumores de pacientes tratados previamente con QT y RT. Esto permitió,

además de comparar los tumores con respecto al tejido normal, comparar el

tumor de un mismo paciente no tratado y tratado posteriormente.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Edad<=mediana y SOCS1 metiladoOtras combinaciones

p-valor <0.000

Resultados

Tabla 44. Características clinicopatológicas de las 9 muestras de GBM de los 8 pacientes incluídos en el análisis de expresión.


n % Género

Hombre 4 50 Mujer 4 50

Edad (años) Mediana 59 Mín-Máx 41-81

Tratamiento No tratados 7 77.78

Tratados 2 22.22

El análisis de expresión génica se llevó a cabo mediante micromatrices de

ADN (microarrays) en las 9 muestras de GBM y un pool de tejido cerebral

normal de cinco individuos sanos. Se utilizaron los valores de cambio de

expresión (FC, Fold Change) obtenidos del contraste de cada paciente frente al

control de ARN de tejido cerebral normal. El número medio de genes con

aumento de expresión en el tumor con respecto al tejido normal fue de 1435,

mientras que el número medio de genes infraexpresados en el tumor con

respecto al tejido normal fue de 1790, esto es, una media de 3225 genes

diferencialmente expresados en el tumor (Pacientes vs Control, Tabla 45).

163

Resultados

Figura 48. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en base a la metilación de SOCS1 y la edad. Línea negra:SOCS1 metilado y edad ≤ mediana. Línea roja: otras combinaciones.

4.8. ESTUDIO DE EXPRESIÓN GÉNICA A GRAN ESCALA EN GLIOMAS. MICROARRAY DE EXPRESIÓN

Se analizaron 9 muestras (8 pacientes) de tejido congelado de GBM

pertenecientes a la serie analizada en este trabajo (Tabla 44). De estas

muestras, 7 eran tumores de pacientes no tratados con QT y/o RT y 2 eran

tumores de pacientes tratados previamente con QT y RT. Esto permitió,

además de comparar los tumores con respecto al tejido normal, comparar el

tumor de un mismo paciente no tratado y tratado posteriormente.

0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Edad<=mediana y SOCS1 metiladoOtras combinaciones

p-valor <0.000

Resultados

Tabla 44. Características clinicopatológicas de las 9 muestras de GBM de los 8 pacientes incluídos en el análisis de expresión.


n % Género

Hombre 4 50 Mujer 4 50

Edad (años) Mediana 59 Mín-Máx 41-81

Tratamiento No tratados 7 77.78

Tratados 2 22.22

El análisis de expresión génica se llevó a cabo mediante micromatrices de

ADN (microarrays) en las 9 muestras de GBM y un pool de tejido cerebral

normal de cinco individuos sanos. Se utilizaron los valores de cambio de

expresión (FC, Fold Change) obtenidos del contraste de cada paciente frente al

control de ARN de tejido cerebral normal. El número medio de genes con

aumento de expresión en el tumor con respecto al tejido normal fue de 1435,

mientras que el número medio de genes infraexpresados en el tumor con

respecto al tejido normal fue de 1790, esto es, una media de 3225 genes

diferencialmente expresados en el tumor (Pacientes vs Control, Tabla 45).

164

Resultados

Tabla 45. Resultados del análsis del microarray de 13K sondas. DEGs: differential

expression genes.

A partir de estos resultados se estableció un panel de 26 genes que

mostraron una expresión diferencial en los GBM con respecto al control de

tejido cerebral normal (Figuras 49 y 50). Para los diferentes contrastes

realizados, los datos normalizados se ajustaron a un modelo lineal con Limma

(Linear Models for Microarray) Bioconductor a fin de extraer los genes con

expresión diferencial significativa. Para cada contraste se construyó una matriz

de datos de la que se obtuvo un listado de genes con expresión diferencial con

un p-valor ajustado inferior a 0,01 (99% de confianza estadística) y una tasa de

cambio de logFC (Fold Change) >1 ó <1. En un futuro, estos genes se

someterán a validación por qPCR para su posterior estudio como potenciales

nuevos marcadores con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta.

Tipo de análisis Comparación Up Down Total DEGs % of Array

Pacientes vs control

P10.3459 vs Control 1363 2028 3391 26,77 P10.4307 vsControl 1337 1732 3069 24,23 P10.5423 vs Control 1685 1915 3600 28,42 P10.6815 vs Control 1379 1733 3112 24,57

P10.7411 vs Control 1070 1340 2410 19,02 P11.3496 vs Control 1412 1661 3073 24,26 P11.8030 vs Control 1801 2122 3923 30,97 Todos vs control 1047 1514 2561 20,22

Efecto del tratamiento P10.3459 vs P10.6635 552 628 1180 9,31

P10-6635-P10-4438 vs Control 932 1486 2418 19,09

No tratados vs tratados 36 88 124 0,98

Resultados

Figura 49. Diagramas de Venn realizado con Venny 2.0. Análisis de los genes expresados

diferencialmente según diferentes contrastes. PvsC: pacientes versus control; TvsC: tumores

con tratamiento versus control

(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

165

Resultados

Tabla 45. Resultados del análsis del microarray de 13K sondas. DEGs: differential

expression genes.

A partir de estos resultados se estableció un panel de 26 genes que

mostraron una expresión diferencial en los GBM con respecto al control de

tejido cerebral normal (Figuras 49 y 50). Para los diferentes contrastes

realizados, los datos normalizados se ajustaron a un modelo lineal con Limma

(Linear Models for Microarray) Bioconductor a fin de extraer los genes con

expresión diferencial significativa. Para cada contraste se construyó una matriz

de datos de la que se obtuvo un listado de genes con expresión diferencial con

un p-valor ajustado inferior a 0,01 (99% de confianza estadística) y una tasa de

cambio de logFC (Fold Change) >1 ó <1. En un futuro, estos genes se

someterán a validación por qPCR para su posterior estudio como potenciales

nuevos marcadores con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta.

Tipo de análisis Comparación Up Down Total DEGs % of Array

Pacientes vs control

P10.3459 vs Control 1363 2028 3391 26,77 P10.4307 vsControl 1337 1732 3069 24,23 P10.5423 vs Control 1685 1915 3600 28,42 P10.6815 vs Control 1379 1733 3112 24,57

P10.7411 vs Control 1070 1340 2410 19,02 P11.3496 vs Control 1412 1661 3073 24,26 P11.8030 vs Control 1801 2122 3923 30,97 Todos vs control 1047 1514 2561 20,22

Efecto del tratamiento P10.3459 vs P10.6635 552 628 1180 9,31

P10-6635-P10-4438 vs Control 932 1486 2418 19,09

No tratados vs tratados 36 88 124 0,98

Resultados

Figura 49. Diagramas de Venn realizado con Venny 2.0. Análisis de los genes expresados

diferencialmente según diferentes contrastes. PvsC: pacientes versus control; TvsC: tumores

con tratamiento versus control

(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

166

Resultados

Figura 50. Mapa de expresión de los 26 genes que mostraron diferencias en los distintos análisis. La intensidad de color indica los valores de log2 Fold Change (veces que cambia) de

cada gen. El mapa de expresión se ha realizado con el software Multiexperiment Viewer

(http://www.tm4.org/mev.html).

El nombre y función de cada uno de estos 26 genes (www.uniprot.org)

diferencialmente expresados se resume en la siguiente tabla (Tabla 46):

Resultados

Tabla 46. Tabla resumen de los 26 genes diferencialmente expresados en GBM.

Símbolo Número acceso Nombre del gen Función Molecular FC

HJURP NM_018410 Holliday Junction Recognition Protein Chaperona: ciclo celular, formación cromatina 8,84

HIST1H1B NM_005322 Histone Cluster 1 H1b Formación cromatina, regulación transcripción 8,99

CENPF NM_016343.3 Centromere protein F Función cinetocoro y segregación cromosómica

14,52

COL4A2 NM_001846.2 Collagen alpha-2(IV) chain Formación matriz extracelular, angiogénesis

14,95

UBE2C NM_007019 Ubiquitin-conjugating enzyme E2C Ubiquitinación 20,58

BIRC5 NM_001168 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Promover proliferación celular y prevenir apoptosis 26,61

HIST2H3A/ 2H3C

NM_001005464/ NM_021059 Histone cluster 2, H3a/H3c Regulación, replicación, reparación

ADN 26,62

MT1X NM_005952 Metallothionein-1X Apoptosis, transporte proteínas 27,00 AMH NM_000479 Muellerian-inhibiting factor Factor de crecimiento 2,19

KIAA1683 NM_025249 Uncharacterized protein 2,32

GRB10 NM_005311 Growth factor receptor-bound protein 10 Proteína de adaptación, modula el

acoplamiento de receptores quinasa. Apoptosis

2,32

CA9 NM_001216 Carbonic anhydrase 9 Hidratación reversible del hidróxido de carbono 2,36


DNAH9 NM_001372 DNAH9 protein Actividad ATPasa 2,91

ACP5 NM_001611 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Defosforilación sialoproteica OPN 3,00

CNGA3 NM_001298 Cyclic nucleotide-gated cation channel alpha-3 Receptor ionotrópico 3,30

TRIB3 NM_021158 Tribbles homolog 3 Bloqueo akt. Apoptosis 3,33

IGFBP5 NM_000599 Insulin-like growth factor-binding protein 5 Proteína unión al IGF que prolonga su vida media 3,34

FAM129A XM_011509140 Family With Sequence Similarity 129 A Regula la fosforilación de proteínas involucradas en la regulación de la

traducción 5,78

GDF15 NM_004864 Growth/differentiation factor 15 Actividad citoquina. Regulación inflamación y apoptosis 7,36

OGDHL NM_018245 2-oxoglutarate dehydrogenase-like, mitochondrial Oxidorreductasa 12,59

GPR158 XM_166110 Probable G-protein coupled receptor 158 Actividad receptora acoplada a proteína G. Regulación: visión,

memoria etc -9,90

UCHL1 NM_004181 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Proteína ubiquitina hidrolasa -5,38

SPOCK1 NM_004598 Testican-1 Interacción célula-célula, matriz- -6,69

167

Resultados

Figura 50. Mapa de expresión de los 26 genes que mostraron diferencias en los distintos análisis. La intensidad de color indica los valores de log2 Fold Change (veces que cambia) de

cada gen. El mapa de expresión se ha realizado con el software Multiexperiment Viewer

(http://www.tm4.org/mev.html).

El nombre y función de cada uno de estos 26 genes (www.uniprot.org)

diferencialmente expresados se resume en la siguiente tabla (Tabla 46):

Resultados

Tabla 46. Tabla resumen de los 26 genes diferencialmente expresados en GBM.

Símbolo Número acceso Nombre del gen Función Molecular FC

HJURP NM_018410 Holliday Junction Recognition Protein Chaperona: ciclo celular, formación cromatina 8,84

HIST1H1B NM_005322 Histone Cluster 1 H1b Formación cromatina, regulación transcripción 8,99

CENPF NM_016343.3 Centromere protein F Función cinetocoro y segregación cromosómica

14,52

COL4A2 NM_001846.2 Collagen alpha-2(IV) chain Formación matriz extracelular, angiogénesis

14,95

UBE2C NM_007019 Ubiquitin-conjugating enzyme E2C Ubiquitinación 20,58

BIRC5 NM_001168 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Promover proliferación celular y prevenir apoptosis 26,61

HIST2H3A/ 2H3C

NM_001005464/ NM_021059 Histone cluster 2, H3a/H3c Regulación, replicación, reparación

ADN 26,62

MT1X NM_005952 Metallothionein-1X Apoptosis, transporte proteínas 27,00 AMH NM_000479 Muellerian-inhibiting factor Factor de crecimiento 2,19

KIAA1683 NM_025249 Uncharacterized protein 2,32

GRB10 NM_005311 Growth factor receptor-bound protein 10 Proteína de adaptación, modula el

acoplamiento de receptores quinasa. Apoptosis

2,32



DNAH9 NM_001372 DNAH9 protein Actividad ATPasa 2,91

ACP5 NM_001611 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Defosforilación sialoproteica OPN 3,00

CNGA3 NM_001298 Cyclic nucleotide-gated cation channel alpha-3 Receptor ionotrópico 3,30

TRIB3 NM_021158 Tribbles homolog 3 Bloqueo akt. Apoptosis 3,33

IGFBP5 NM_000599 Insulin-like growth factor-binding protein 5 Proteína unión al IGF que prolonga su vida media 3,34

FAM129A XM_011509140 Family With Sequence Similarity 129 A Regula la fosforilación de proteínas involucradas en la regulación de la

traducción 5,78

GDF15 NM_004864 Growth/differentiation factor 15 Actividad citoquina. Regulación inflamación y apoptosis 7,36

OGDHL NM_018245 2-oxoglutarate dehydrogenase-like, mitochondrial Oxidorreductasa 12,59

GPR158 XM_166110 Probable G-protein coupled receptor 158 Actividad receptora acoplada a proteína G. Regulación: visión,

memoria etc -9,90

UCHL1 NM_004181 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Proteína ubiquitina hidrolasa -5,38

SPOCK1 NM_004598 Testican-1 Interacción célula-célula, matriz- -6,69

168

Resultados

4.8.1. FUNCIONES DIFERENCIALMENTE EXPRESADAS

Los genes que presentaron expresión diferencial en el microarray de

GBM se anotaron funcionalmente mediante un procedimiento bioinformático.

Se les sometió a un análisis de enriquecimiento mediante Gene Ontology

(http://geneontology.org/), genes presentes en la base de datos de OMIM

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) y rutas presentes en la enciclopedia de

genes y genomas de Kyoto, KEGG (http://www.genome.jp/kegg/).

El análisis de los perfiles de expresión génica de la comparación entre

las muestras y el control mostró 27 rutas KEEG diferencialmente expresadas

(Tabla 47).


Término p-valor Fold Enrichment hsa04610:Complemento y cascadas de coagulación 0,0006 2,06 hsa05332:Enfermedad de injerto contra huésped 0,0042 2,06 hsa03030:Replicación del ADN 0,0042 2,06 hsa04672:Red inmune intestinal para la producción de IgA 0,0042 2,06 hsa05320:Enfermedad tiroidea autoinmune 0,0080 2,06 hsa05330:Rechazo de aloinjertos 0,0080 2,06 hsa05310:Asma 0,0524 2,06 hsa04330:Vía de señalización de Notch 0,0524 2,06 hsa03420:Reparación por escisión de nucleótidos 0,0950 2,06 hsa04623:Vía de detección de ADN citosólico 0,0152 2,06 hsa05222:Cáncer de pulmón de células pequeñas 0,0002 1,95 hsa04630:Vía de señalización de JAK-STAT 0,0080 1,90 hsa04060:Interacción receptor de citoquina-citoquina 0,0000 1,84 hsa05322:Lupus eritematoso sistémico 0,0002 1,81 hsa04512:Interacción receptor-ECM 0,0001 1,78 hsa00240:Metabolismo de las pirimidinas 0,0124 1,78 hsa04612:Procesamiento y presentación de antígenos 0,0062 1,73 hsa04640:Linaje celular hematopoyético 0,0581 1,71

célula

LPGAT1 NM_014873 Lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Acetiltransferasa específica de lisofosfatidilglicerol -4,57

Resultados

hsa04110:Ciclo celular 0,0001 1,71 hsa05416:Miocarditis viral 0,0104 1,71 hsa04670:Migración transendotelial de leucocitos 0,0026 1,66 hsa04115:Vía de señalización de p53 0,0222 1,62 hsa04510:Adhesión focal 0,0002 1,54 hsa04620:Vía de señalización del receptor de tipo Toll 0,0540 1,46 hsa04650:Citotoxicidad mediada por células asesinas naturales 0,0597 1,42 hsa04514:Moléculas de adhesión celular (CAMs) 0,0651 1,40 hsa05200:Vías en cáncer 0,0135 1,32

Por otro lado, el análisis de enriquecimiento mediante Gene Ontology dió

lugar a una serie de funciones diferencialmente expresadas en los tumores con

respecto al tejido normal. Tras el filtrado (mediante la selección de los genes

cuyos valores de FC estuvieran por encima de 7, en el caso de los

sobreexpresados, y por debajo de -7, en el caso de los infraexpresados) se

obtuvieron 33 funciones sobreexpresadas y 38 funciones infraexpresadas.

Dentro de las funciones diferencialmente sobreexpresadas, la mayoría se

relacionaron con el ciclo celular, angiogénesis, respuesta inmune e inflamatoria

y regulación positiva de procesos biosintéticos y de proliferación (Tabla 48). En

el caso de las funciones diferencialmente infraexpresadas, se relacionaron con

la actividad de canales iónicos, transporte de iones y procesos de

neurotransmisión y sinapsis (Tabla 49).


ANOTACIÓN FUNCIONAL GO

Desarrollo de vasos sanguíneos GO:0001568 Ciclo celular GO:0007049 Fase del ciclo celular GO:0022403 Proceso del ciclo celular GO:0022402 Parte cromosómica GO:0044427 Cromosoma GO:0005694 Respuesta de defensa GO:0006952 Unión al ADN GO:0003677 Proceso de ADN metabólico GO:0006259 Matriz extracelular GO:0031012 Parte de la región extracelular GO:0044421

169

Resultados

4.8.1. FUNCIONES DIFERENCIALMENTE EXPRESADAS

Los genes que presentaron expresión diferencial en el microarray de

GBM se anotaron funcionalmente mediante un procedimiento bioinformático.

Se les sometió a un análisis de enriquecimiento mediante Gene Ontology

(http://geneontology.org/), genes presentes en la base de datos de OMIM

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) y rutas presentes en la enciclopedia de

genes y genomas de Kyoto, KEGG (http://www.genome.jp/kegg/).

El análisis de los perfiles de expresión génica de la comparación entre

las muestras y el control mostró 27 rutas KEEG diferencialmente expresadas

(Tabla 47).


Término p-valor Fold Enrichment hsa04610:Complemento y cascadas de coagulación 0,0006 2,06 hsa05332:Enfermedad de injerto contra huésped 0,0042 2,06 hsa03030:Replicación del ADN 0,0042 2,06 hsa04672:Red inmune intestinal para la producción de IgA 0,0042 2,06 hsa05320:Enfermedad tiroidea autoinmune 0,0080 2,06 hsa05330:Rechazo de aloinjertos 0,0080 2,06 hsa05310:Asma 0,0524 2,06 hsa04330:Vía de señalización de Notch 0,0524 2,06 hsa03420:Reparación por escisión de nucleótidos 0,0950 2,06 hsa04623:Vía de detección de ADN citosólico 0,0152 2,06 hsa05222:Cáncer de pulmón de células pequeñas 0,0002 1,95 hsa04630:Vía de señalización de JAK-STAT 0,0080 1,90 hsa04060:Interacción receptor de citoquina-citoquina 0,0000 1,84 hsa05322:Lupus eritematoso sistémico 0,0002 1,81 hsa04512:Interacción receptor-ECM 0,0001 1,78 hsa00240:Metabolismo de las pirimidinas 0,0124 1,78 hsa04612:Procesamiento y presentación de antígenos 0,0062 1,73 hsa04640:Linaje celular hematopoyético 0,0581 1,71

célula

LPGAT1 NM_014873 Lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Acetiltransferasa específica de lisofosfatidilglicerol -4,57

Resultados

hsa04110:Ciclo celular 0,0001 1,71 hsa05416:Miocarditis viral 0,0104 1,71 hsa04670:Migración transendotelial de leucocitos 0,0026 1,66 hsa04115:Vía de señalización de p53 0,0222 1,62 hsa04510:Adhesión focal 0,0002 1,54 hsa04620:Vía de señalización del receptor de tipo Toll 0,0540 1,46 hsa04650:Citotoxicidad mediada por células asesinas naturales 0,0597 1,42 hsa04514:Moléculas de adhesión celular (CAMs) 0,0651 1,40 hsa05200:Vías en cáncer 0,0135 1,32

Por otro lado, el análisis de enriquecimiento mediante Gene Ontology dió

lugar a una serie de funciones diferencialmente expresadas en los tumores con

respecto al tejido normal. Tras el filtrado (mediante la selección de los genes

cuyos valores de FC estuvieran por encima de 7, en el caso de los

sobreexpresados, y por debajo de -7, en el caso de los infraexpresados) se

obtuvieron 33 funciones sobreexpresadas y 38 funciones infraexpresadas.

Dentro de las funciones diferencialmente sobreexpresadas, la mayoría se

relacionaron con el ciclo celular, angiogénesis, respuesta inmune e inflamatoria

y regulación positiva de procesos biosintéticos y de proliferación (Tabla 48). En

el caso de las funciones diferencialmente infraexpresadas, se relacionaron con

la actividad de canales iónicos, transporte de iones y procesos de

neurotransmisión y sinapsis (Tabla 49).


ANOTACIÓN FUNCIONAL GO

Desarrollo de vasos sanguíneos GO:0001568 Ciclo celular GO:0007049 Fase del ciclo celular GO:0022403 Proceso del ciclo celular GO:0022402 Parte cromosómica GO:0044427 Cromosoma GO:0005694 Respuesta de defensa GO:0006952 Unión al ADN GO:0003677 Proceso de ADN metabólico GO:0006259 Matriz extracelular GO:0031012 Parte de la región extracelular GO:0044421

170

Resultados

Respuesta inmune GO:0006955 Respuesta inflamatoria GO:0006954 Orgánulos del lumen intracelular GO:0070013 Lumen adjunto a la membrana GO:0031974 Ciclo celular mitótico GO:0000278 Ciclo celular mitótico de la fase M GO:0000087 División nuclear GO:0000280 Lumen Nuclear GO:0031981 Nucleoplasma GO:0005654 Orgánulo del lumen GO:0043233 Regulación positiva de procesos biosintéticos GO:0009891 Regulación positiva de la proliferación celular GO:0008284 Regulación positiva de procesos biosintéticos celulares GO:0031328 Regulación positiva de procesos del sistema inmune GO:0002684 Regulación positiva de procesos biosintéticos de macromoléculas GO:0010557 Regulación positiva de procesos metabólicos del ARN GO:0051254 Matriz extracelular proteínica GO:0005578 Regulación del ciclo celular GO:0051726 Respuesta a heridas GO:0009611 Secuencia específica de ADN GO:0043565 Actividad de factores de transcripción GO:0003700 Desarrollo de la vasculatura GO:0001944

Tabla 49. Funciones diferencialmente infraexpresadas en base a la anotación funcional de GO.

ANOTACIÓN FUNCIONAL GO Unión a iones metálicos alcalinos GO:0031420 Actividad canales de calcio GO:0005262 Transporte iónico de calcio GO:0006816 Transporte catiónico GO:0006812 Actividad del canal GO:0015267 Vesícula recubierta de clatrina GO:0030136 Vesícula recubierta GO:0030135 Actividad del canal iónico dependiente de ligando extracelular GO:0005230 Actividad dependiente del canal GO:0022836 Generación de señal involucrada en la señalización célula-célula GO:0003001 Actividad de canal iónico GO:0005216 Complejo de canal iónico GO:0034702 Transporte iónico GO:0006811 Actividad del canal dependiente de ligando GO:0022834 Actividad del canal iónico dependiente de ligando GO:0015276 Transporte de iones metálicos GO:003001

Resultados

Transporte de cationes inorgánicos monovalentes GO:0015672 Actividad receptores de la neurotransmisión GO:0030594 Unión del neurotransmisor GO:0042165 Secreción del neurotransmisor GO:0007269 Actividad transporte pasivo transmembrana GO:0022803 Membrana postsináptica GO:0045211 Actividad canales de potasio GO:0005267 Complejo de canal de potasio GO:0034705 Unión de iones potasio GO:0030955 Regulación de los niveles de neurotransmisor GO:0001505 Unión de iones sodio GO:0031402 Transporte de iones sodio GO:0006814 Actividad del canal específico de sustrato GO:0022838 Parte sináptica GO:0044456 Transmisión sináptica GO:0007268 Vesícula sináptica GO:0008021 Transmisión del impulso nervioso GO:0019226 Actividad del canal catiónico dependiente de voltaje GO:0022843 Actividad del canal dependiente de voltaje GO:0022832 Actividad del canal iónico dependiente de voltaje GO:0005244 Actividad del canal de potasio dependiente de voltaje GO:0005249 Complejo del canal de potasio dependiente de voltaje GO:0008076

Los resultados obtenidos del análisis de enriquecimiento se visualizaron

utilizando el plugin Enrichment Map de Cytoscape (http://www.cytoscape.org/).

La representación de las funciones sobre o infra expresadas se realizó

generando nodos (donde se representa el término funcional enriquecido)

conectados por líneas que representan la relación entre los diferentes términos

funcionales. Estas redes permiten estudiar de una forma gráfica y global las

relaciones funcionales de los diferentes genes expresados diferencialmente, de

manera que permiten identificar grupos de genes implicados en la biología de

esta enfermedad. La Figura 51 representa las funciones diferencialmente

expresadas tras el enriquecimiento con la web-tool DAVID bioinformatics

Resources 6.7.

171

Resultados

Respuesta inmune GO:0006955 Respuesta inflamatoria GO:0006954 Orgánulos del lumen intracelular GO:0070013 Lumen adjunto a la membrana GO:0031974 Ciclo celular mitótico GO:0000278 Ciclo celular mitótico de la fase M GO:0000087 División nuclear GO:0000280 Lumen Nuclear GO:0031981 Nucleoplasma GO:0005654 Orgánulo del lumen GO:0043233 Regulación positiva de procesos biosintéticos GO:0009891 Regulación positiva de la proliferación celular GO:0008284 Regulación positiva de procesos biosintéticos celulares GO:0031328 Regulación positiva de procesos del sistema inmune GO:0002684 Regulación positiva de procesos biosintéticos de macromoléculas GO:0010557 Regulación positiva de procesos metabólicos del ARN GO:0051254 Matriz extracelular proteínica GO:0005578 Regulación del ciclo celular GO:0051726 Respuesta a heridas GO:0009611 Secuencia específica de ADN GO:0043565 Actividad de factores de transcripción GO:0003700 Desarrollo de la vasculatura GO:0001944

Tabla 49. Funciones diferencialmente infraexpresadas en base a la anotación funcional de GO.

ANOTACIÓN FUNCIONAL GO Unión a iones metálicos alcalinos GO:0031420 Actividad canales de calcio GO:0005262 Transporte iónico de calcio GO:0006816 Transporte catiónico GO:0006812 Actividad del canal GO:0015267 Vesícula recubierta de clatrina GO:0030136 Vesícula recubierta GO:0030135 Actividad del canal iónico dependiente de ligando extracelular GO:0005230 Actividad dependiente del canal GO:0022836 Generación de señal involucrada en la señalización célula-célula GO:0003001 Actividad de canal iónico GO:0005216 Complejo de canal iónico GO:0034702 Transporte iónico GO:0006811 Actividad del canal dependiente de ligando GO:0022834 Actividad del canal iónico dependiente de ligando GO:0015276 Transporte de iones metálicos GO:003001

Resultados

Transporte de cationes inorgánicos monovalentes GO:0015672 Actividad receptores de la neurotransmisión GO:0030594 Unión del neurotransmisor GO:0042165 Secreción del neurotransmisor GO:0007269 Actividad transporte pasivo transmembrana GO:0022803 Membrana postsináptica GO:0045211 Actividad canales de potasio GO:0005267 Complejo de canal de potasio GO:0034705 Unión de iones potasio GO:0030955 Regulación de los niveles de neurotransmisor GO:0001505 Unión de iones sodio GO:0031402 Transporte de iones sodio GO:0006814 Actividad del canal específico de sustrato GO:0022838 Parte sináptica GO:0044456 Transmisión sináptica GO:0007268 Vesícula sináptica GO:0008021 Transmisión del impulso nervioso GO:0019226 Actividad del canal catiónico dependiente de voltaje GO:0022843 Actividad del canal dependiente de voltaje GO:0022832 Actividad del canal iónico dependiente de voltaje GO:0005244 Actividad del canal de potasio dependiente de voltaje GO:0005249 Complejo del canal de potasio dependiente de voltaje GO:0008076

Los resultados obtenidos del análisis de enriquecimiento se visualizaron

utilizando el plugin Enrichment Map de Cytoscape (http://www.cytoscape.org/).

La representación de las funciones sobre o infra expresadas se realizó

generando nodos (donde se representa el término funcional enriquecido)

conectados por líneas que representan la relación entre los diferentes términos

funcionales. Estas redes permiten estudiar de una forma gráfica y global las

relaciones funcionales de los diferentes genes expresados diferencialmente, de

manera que permiten identificar grupos de genes implicados en la biología de

esta enfermedad. La Figura 51 representa las funciones diferencialmente

expresadas tras el enriquecimiento con la web-tool DAVID bioinformatics

Resources 6.7.

172

Resultados

A

B

C

Resultados

C

B

A

173

Resultados

A

B

C

Resultados

173C

B

A

174

Resultados

Figura 51. Funciones diferencialmente expresadas tras el análisis con DAVID bioinformatics Resources 6.7. En verde las funciones sobreexpresadas y en azul las

infraexpresadas. Las regiones seleccionadas se amplían en las siguientes figuras (A,B,C,D,E).

Una vez seleccionados los nodos más importantes de las redes

obtenidas tras el análisis con DAVID, se obtuvieron los genes diferencialmente

expresados en cada una de las funciones. Tras el filtrado, se seleccionaron 23

E

D

Resultados

genes diferencialmente sobreexpresados y 19 genes diferencialmente

infraexpresados. Los valores de FC de cada uno de dichos genes, así como las

funciones asociadas a cada uno se detallan en el Anexo X. Además, se

construyó una red de proteínas de los genes seleccionados mediante un

software online (http://string-db.org/) (Figura 52).

Figura 52. Red de proteínas para los genes relacionados con los GBM de esta serie.

175

Resultados

Figura 51. Funciones diferencialmente expresadas tras el análisis con DAVID bioinformatics Resources 6.7. En verde las funciones sobreexpresadas y en azul las

infraexpresadas. Las regiones seleccionadas se amplían en las siguientes figuras (A,B,C,D,E).

Una vez seleccionados los nodos más importantes de las redes

obtenidas tras el análisis con DAVID, se obtuvieron los genes diferencialmente

expresados en cada una de las funciones. Tras el filtrado, se seleccionaron 23

E

D

Resultados

genes diferencialmente sobreexpresados y 19 genes diferencialmente

infraexpresados. Los valores de FC de cada uno de dichos genes, así como las

funciones asociadas a cada uno se detallan en el Anexo X. Además, se

construyó una red de proteínas de los genes seleccionados mediante un

software online (http://string-db.org/) (Figura 52).

Figura 52. Red de proteínas para los genes relacionados con los GBM de esta serie.

176

Resultados

Dentro del conjunto de genes sobreexpresados, las funciones

específicas asociadas a los mismos incluyen la promoción de la angiogénesis y

proliferación celular (TNFRSF12A,BIRC5), aceptar y catalizar la unión

covalente de la ubiquitina así como promover la anafase del ciclo celular

(UBE2C), mediar la síntesis de ADN translesión (MAD2L2), regular reacciones

inflamatorias (PTX3), participar en la tumorigénesis mediante la regulación de

la apoptosis (NTN1) e inducir la permeabilidad de los vasos sanguíneos

(VEGF), entre otras.

Por otro lado, las funciones específicas de los genes diferencialmente

infraexpresados tienen relación con los canales de potasio, sodio y calcio

(KCNK1, HCN1, KCNC2, RYR2), mantenimiento de la transmisión sináptica en

las neuronas GABAérgicas (KCNC2), liberación de neurotransmisores (RYR2,

CACNA1B, SYT1, SYT4), sostenimiento de la activación de CaMKII, que se

encuentra involucrada en cascadas de señalización celular y es necesaria para

la activación de las células T citotóxicas (CAMK2A), acidificación de los

compartimentos celulares (ATP6V1G2), inhibición del impulso nervioso y

reducción de la excitabilidad neuronal (GABRG2, GABRA1), procesos de

exocitosis de vesículas presinápticas (SNAP25) y neurogénesis (PACSIN1,

MAL), entre otras.

Resultados

Dentro del conjunto de genes sobreexpresados, las funciones

específicas asociadas a los mismos incluyen la promoción de la angiogénesis y

proliferación celular (TNFRSF12A,BIRC5), aceptar y catalizar la unión

covalente de la ubiquitina así como promover la anafase del ciclo celular

(UBE2C), mediar la síntesis de ADN translesión (MAD2L2), regular reacciones

inflamatorias (PTX3), participar en la tumorigénesis mediante la regulación de

la apoptosis (NTN1) e inducir la permeabilidad de los vasos sanguíneos

(VEGF), entre otras.

Por otro lado, las funciones específicas de los genes diferencialmente

infraexpresados tienen relación con los canales de potasio, sodio y calcio

(KCNK1, HCN1, KCNC2, RYR2), mantenimiento de la transmisión sináptica en

las neuronas GABAérgicas (KCNC2), liberación de neurotransmisores (RYR2,

CACNA1B, SYT1, SYT4), sostenimiento de la activación de CaMKII, que se

encuentra involucrada en cascadas de señalización celular y es necesaria para

la activación de las células T citotóxicas (CAMK2A), acidificación de los

compartimentos celulares (ATP6V1G2), inhibición del impulso nervioso y

reducción de la excitabilidad neuronal (GABRG2, GABRA1), procesos de

exocitosis de vesículas presinápticas (SNAP25) y neurogénesis (PACSIN1,

MAL), entre otras.

DISCUSIÓN

179

Discusión

Cada vez adquiere más importancia la búsqueda de biomarcadores en el

manejo de las enfermedades, como el cáncer. Estos biomarcadores son

importantes, puesto que facilitan el diagnóstico y permiten predecir el

pronóstico y respuesta al tratamiento de cada tipo de tumor.

5.1. BIOMARCADORES EN GLIOMAS

La regulación epigenética de la expresión génica, mediante la metilación

del ADN y modificación de histonas, está frecuentemente alterada en los

cánceres humanos, incluyendo a los gliomas (Malzkorn, et al., 2011). La

hipermetilación de las islas CpG en la regiones promotoras puede causar


(Rodriguez-Paredes & Esteller, 2011). Las diferentes metodologías utilizadas

para el estudio de la metilación producen la variabilidad observada en los

resultados de los diferentes trabajos. Frente a la MS-PCR, más ampliamente

utilizada para la detección de regiones metiladas, el MS-MLPA presenta varias

ventajas (descritas anteriormente) por las cuales se decidió emplear esta

técnica en nuestra serie (Riemenschneider, 2010). Dada la baja cantidad y

calidad del ADN extraído de los tejidos de archivo histológico fijados e incluidos

en parafina y con un tiempo de almacenamiento en un rango de 3 a 9 años, la

técnica de MS-MLPA fue la opción más adecuada en este trabajo para la

determinación de la metilación de forma semicuantitativa en estos tumores.

Tras el análisis de la metilación de MGMT en esta serie, se observó un

60.35% de metilación en dicho gen (137 de 227). Además, este marcador se

asoció al grado tumoral (p= 0.029) observándose una disminución del

porcentaje de metilación al aumentar el grado histológico. Estos valores están

dentro de los observados por otros grupos de investigación y revisados por von

Deimling y col (von Deimling, et al., 2011) y Nikiforova en 2011 (Nikiforova &

Hamilton, 2011) para cada uno de los grados tumorales y son similares a los

obtenidos en otros estudios (Tabla 50).

180

Discusión

Tabla 50. Valores de metilación de MGMT según el grado histológico en diferentes estudios y revisiones.

Grado tumoral (% metilación MGMT)

Estudio AII AIII GBM

Von Deimling 2011 43-93 50-84 35-73

Nikiforova 2011 40-50 50 40-60

Cankovik 2007 33 38 44

Esteller 2000 - 39 41

Hegi 2005 - - 44.7

Jeuken 2007 - 75 55

Presente estudio 84 61.5 56.8

Las diferencias en los porcentajes pueden ser debidas a las distintas

técnicas empleadas y a las diferentes secuencias diana analizadas. Como se

ha explicado anteriormente, de las sondas empleadas se descartaron dos por

recomendación del fabricante (la sonda 4 y la 6). De las cuatros sondas

informativas empleadas para el análisis, la sonda 5 presentó el mayor

porcentaje de metilación (68.6%), seguida de la sonda 1 (64.2%), de la sonda 3

(59.1%) y, por último, de la sonda 2 (43%).

Qian y col (Qian & Brent, 1997) determinaron el estado de metilación de

cada una de las CpG del gen desde la posición -249 a la +259, tomando como

referencia el inicio de la transcripción. Descubrieron dos regiones o puntos

calientes con elevada frecuencia de metilación (hot-spots). El hot-spot1 en la

región de -249 a -103 y el hot-spot2 en la región de +107 a +196. El primer hot-

spot corresponde con la DMR1 de Malley y col (CpG 25-50), mientras que el

segundo hot-spot coincide con la DMR2 (CpG 73-90) (Malley, et al., 2011). Al

comparar los resultados de este trabajo con los dos estudios mencionados, se

observa que las cuatro sondas se corresponden con las regiones

frecuentemente metiladas descritas, siendo la sonda 5 y 1 las más metiladas y

181

Discusión

Tabla 50. Valores de metilación de MGMT según el grado histológico en diferentes estudios y revisiones.

Grado tumoral (% metilación MGMT)

Estudio AII AIII GBM

Von Deimling 2011 43-93 50-84 35-73

Nikiforova 2011 40-50 50 40-60

Cankovik 2007 33 38 44

Esteller 2000 - 39 41

Hegi 2005 - - 44.7

Jeuken 2007 - 75 55

Presente estudio 84 61.5 56.8

Las diferencias en los porcentajes pueden ser debidas a las distintas

técnicas empleadas y a las diferentes secuencias diana analizadas. Como se

ha explicado anteriormente, de las sondas empleadas se descartaron dos por

recomendación del fabricante (la sonda 4 y la 6). De las cuatros sondas

informativas empleadas para el análisis, la sonda 5 presentó el mayor

porcentaje de metilación (68.6%), seguida de la sonda 1 (64.2%), de la sonda 3

(59.1%) y, por último, de la sonda 2 (43%).

Qian y col (Qian & Brent, 1997) determinaron el estado de metilación de

cada una de las CpG del gen desde la posición -249 a la +259, tomando como

referencia el inicio de la transcripción. Descubrieron dos regiones o puntos

calientes con elevada frecuencia de metilación (hot-spots). El hot-spot1 en la

región de -249 a -103 y el hot-spot2 en la región de +107 a +196. El primer hot-

spot corresponde con la DMR1 de Malley y col (CpG 25-50), mientras que el

segundo hot-spot coincide con la DMR2 (CpG 73-90) (Malley, et al., 2011). Al

comparar los resultados de este trabajo con los dos estudios mencionados, se

observa que las cuatro sondas se corresponden con las regiones

frecuentemente metiladas descritas, siendo la sonda 5 y 1 las más metiladas y

Discusión

diseñadas, concordantemente, en las zonas con mayor frecuencia de

metilación (Anexo XI).

Los estudios de Qian y Malley se llevaron a cabo con el propósito de

determinar si la metilación del ADN daba lugar a silenciamiento génico y, por

tanto, a una disminución de la expresión. En estos casos, las regiones más

frecuentemente metiladas no eran las que más se correlacionaron con la

expresión. Más estudios se han realizado con este fin, no existiendo hasta

ahora una asociación completa entre metilación y expresión. Por un lado, por

ejemplo, varios grupos han establecido que la pérdida de expresión de MGMT

se asocia frecuentemente con el silenciamiento transcripcional mediante la

metilación de sus islas CpGs (Brell, et al., 2005; Esteller, et al., 2000; Hegi, et

al., 2005; Kamiryo, et al., 2004; Nakamura, Watanabe, Yonekawa, Kleihues, &

Ohgaki, 2001; Paz, et al., 2004; Riemenschneider, 2010). Por otro lado,

muchos otros grupos han observado que esta correlación no siempre existe

(Cao, et al., 2009; Hawkins, et al., 2009; Mellai, et al., 2009; Preusser, et al.,

2008). En el presente trabajo, sólo en el 46.15% de las muestras correlacionó

la metilación con la expresión. Por tanto, no se ha podido establecer una

asociación estadísticamente significativa entre ambos fenómenos (p-valor= 1).

Esto podría ser debido a que el silenciamiento transcripcional de este gen está

influenciado por la metilación en otras regiones no necesariamente cercanas al

sitio de inicio de la transcripción ni incluídas en el promotor (Everhard, et al.,

2009; Noushmehr, et al., 2010). Se ha hipotetizado que en aquellos casos en

los que se observa una disminución de la expresión combinada con la no

metilación del promotor podría ser resultado de la desestabilización del

transcrito y/o factores de represión de la transcripción, como la regulación de

miARN o modificación de histonas (Thon, et al., 2013). Un estudio llevado a

cabo por Danam y col (Danam, Howell, Brent, & Harris, 2005) puso de

manifiesto que el silenciamiento mediado por metilación parece estar asociado

con la reducción de histonas acetiladas unidas a la región del promotor. El

complejo multiproteico de histonas unidas al ADN metilado resulta en una

cromatina cerrada y condensada que da lugar a la inactivación transcripcional

de MGMT.

182

Discusión

En cualquier caso, la metilación de MGMT es un biomarcador predictivo

de respuesta al tratamiento (Esteller, et al., 2000; Esteller & Herman, 2004;

Hegi, et al., 2005; Kerrie L. McDonald, 2011; Ohgaki & Kleihues, 2009).

Pacientes tratados con radioterapia y temozolomida y cuyos tumores presentan

metilación en MGMT, sobreviven más que aquellos que no tienen metilado este

gen (Riemenschneider, 2010). Resultados similares se han obtenido del

presente trabajo, de los pacientes tratados sobreviven más los que presentan

metilado este gen (p-valor <0.000). No sólo eso, si no que, independientemente

del tratamiento, la metilación de MGMT es un biomarcador de buen pronóstico

(p-valor= 0.004). Esto confirma los resultados de otros estudios (Hegi, et al.,

2005; Mellai, et al., 2012; Nikiforova & Hamilton, 2011), aunque existe cierta

controversia ya que otros grupos (Brabender, et al., 2003; Hayashi, et al., 2002;

Kohya, et al., 2002), como el de Esteller y col (Esteller, et al., 2000; Esteller &

Herman, 2004) no llegaron a la misma conclusión, de hecho, consideraron que

la metilación de este gen por sí sola era un marcador de mal pronóstico,

argumentando que, probablemente, los pacientes con silenciamiento

epigenético de MGMT acumulan más mutaciones en genes como TP53 y

KRAS (Kristen rat sarcoma viral oncogene homolog). Sin embargo, en el

presente trabajo no se observó una asociación estadísticamente significativa

entre la metilación de MGMT y las mutaciones en TP53.

En el conjunto de muestras de este estudio, se observa CIMP positivo en

un 26.9% (Tabla 17). Actualmente, no existe un panel de genes consensuado

que defina el fenotipo hipermetilador en gliomas. En 2010, Noushmehr y col.

establecen un panel de genes que definen el fenotipo CIMP en gliomas, sin

embargo, se trata de un panel con un número demasiado elevado de genes, lo

que dificulta su aplicabilidad en la práctica clínica (Noushmehr, et al., 2010). A

raiz de este estudio, varios son los grupos que han determinado paneles de

genes hipermetilados o hipometilados en gliomas que permiten establecer

grupos con diferentes supervivencias (Gonda, et al., 2014; Hill, et al., 2014;

Laffaire, et al., 2011). Al igual que en el caso anterior, el número de genes

establecido es demasiado alto. En nuestro trabajo se optó por utilizar el panel

de genes que define el CIMP en cáncer de colon. Esta elección se hizo por el

hecho de que existe un kit comercial de MS-MLPA que contiene los genes que

183

Discusión

En cualquier caso, la metilación de MGMT es un biomarcador predictivo

de respuesta al tratamiento (Esteller, et al., 2000; Esteller & Herman, 2004;

Hegi, et al., 2005; Kerrie L. McDonald, 2011; Ohgaki & Kleihues, 2009).

Pacientes tratados con radioterapia y temozolomida y cuyos tumores presentan

metilación en MGMT, sobreviven más que aquellos que no tienen metilado este

gen (Riemenschneider, 2010). Resultados similares se han obtenido del

presente trabajo, de los pacientes tratados sobreviven más los que presentan

metilado este gen (p-valor <0.000). No sólo eso, si no que, independientemente

del tratamiento, la metilación de MGMT es un biomarcador de buen pronóstico

(p-valor= 0.004). Esto confirma los resultados de otros estudios (Hegi, et al.,

2005; Mellai, et al., 2012; Nikiforova & Hamilton, 2011), aunque existe cierta

controversia ya que otros grupos (Brabender, et al., 2003; Hayashi, et al., 2002;

Kohya, et al., 2002), como el de Esteller y col (Esteller, et al., 2000; Esteller &

Herman, 2004) no llegaron a la misma conclusión, de hecho, consideraron que

la metilación de este gen por sí sola era un marcador de mal pronóstico,

argumentando que, probablemente, los pacientes con silenciamiento

epigenético de MGMT acumulan más mutaciones en genes como TP53 y

KRAS (Kristen rat sarcoma viral oncogene homolog). Sin embargo, en el

presente trabajo no se observó una asociación estadísticamente significativa

entre la metilación de MGMT y las mutaciones en TP53.

En el conjunto de muestras de este estudio, se observa CIMP positivo en

un 26.9% (Tabla 17). Actualmente, no existe un panel de genes consensuado

que defina el fenotipo hipermetilador en gliomas. En 2010, Noushmehr y col.

establecen un panel de genes que definen el fenotipo CIMP en gliomas, sin

embargo, se trata de un panel con un número demasiado elevado de genes, lo

que dificulta su aplicabilidad en la práctica clínica (Noushmehr, et al., 2010). A

raiz de este estudio, varios son los grupos que han determinado paneles de

genes hipermetilados o hipometilados en gliomas que permiten establecer

grupos con diferentes supervivencias (Gonda, et al., 2014; Hill, et al., 2014;

Laffaire, et al., 2011). Al igual que en el caso anterior, el número de genes

establecido es demasiado alto. En nuestro trabajo se optó por utilizar el panel

de genes que define el CIMP en cáncer de colon. Esta elección se hizo por el

hecho de que existe un kit comercial de MS-MLPA que contiene los genes que

Discusión

definen el CIMP en cáncer colorrectal. Este kit analiza la metilación

semicuantitativamente de este conjunto de ocho genes, lo que facilita la

realización de los experimentos y confiere cierta seguridad y precisión a la hora

de obtener los resultados. Algunos de los genes que componen este panel son

poco informativos para los gliomas, son los casos del gen NEUROG1 que se

encuentra metilado prácticamente en el total de las muestras analizadas y

MLH1, que apenas presenta metilación (Tabla 18). Se ha descrito que la

expresión de RUNX3 está relacionada con el desarrollo de gliomas (Mei, et al.,

2011). Este gen pertenece a una familia de factores de transcripción que

juegan un papel relevante en los procesos normales de desarrollo y

carcinogénesis (Lund & van Lohuizen, 2002). La hipermetilación del promotor

de RUNX3 es una de las alteraciones epigenéticas más comunes en cáncer

(Mei, et al., 2011; Mueller, et al., 2007), lo que sugiere que la inactivación de

RUNX3 es importante en el proceso de tumorigénesis. En este caso, las

muestras analizadas presentaron un elevado porcentaje de metilación en dicho

gen (Tabla 23), lo que corrobora lo establecido en el estudio de Mei y col. De

este panel de genes analizado, sólo SOCS1 correlacionó con varias variables

clínicas y moleculares, postulándose como un potencial biomarcador en este

tumor. De este posible biomarcador se habla posteriormente.

El CIMP se ha observado en diferentes tipos de cáncer, y se asocia

tanto a mal como a buen pronóstico, así como a diferentes características

clínicas dependiendo del tumor. Estas discrepancias pueden ser debidas a que

para algunos cánceres los paneles de genes y umbrales de corte para

determinar el estado de metilación no están correctamente definidos para

definir el verdadero fenotipo hipermetilador (Hughes, et al., 2013). En el caso

de los gliomas, al igual que en el cáncer de colon, el CIMP se asocia con un

pronóstico favorable. Esta serie corrobora lo establecido en la bilibografía, ya

que los tumores con un G-CIMP positivo mostraron una mayor supervivencia

(p-valor= 0.021).

En general, el porcentaje de casos con mutaciones en IDH en la

presente serie fue de un 19.1%. Este biomarcador se asocia con el grado

histológico (p-valor <0.000), disminuyendo el porcentaje de metilación con el

184

Discusión

grado tumoral. Es necesario puntualizar que existe una gran diferencia entre

los porcentajes de mutaciones en IDH en GBM primarios y secundarios. Según

lo descrito en la bibliografía, IDH1/IDH2 están mutados (Balss, et al., 2008;

Capper, et al., 2009; Parsons, et al., 2008; Ru, Williams, Chakravarti, & Guo,

2013; H. Yan, et al., 2009) en torno a un 85% en los GBM secundarios y un 5%

en los primarios. En nuestra serie, el porcentaje de mutaciones en los GBM fue

de un 8.9%, por lo que podrían considerarse GBM primarios.

Williams Parsons y col realizaron un estudio en 2008 en el que, entre

otros resultados, establecen que las mutaciones en IDH1 ocurren,

preferentemente, en pacientes con gliomas de edad más joven, esto es, con

una edad media de 33 años en comparación con una edad media de 53 años

en pacientes con IDH1 no mutado (Parsons, et al., 2008). Otros estudios

también afirman que las mutaciones en dicho gen se asocian con edad joven

de los pacientes (Bleeker, et al., 2010; Nobusawa, Watanabe, Kleihues, &

Ohgaki, 2009). Yan y col demuestran en su estudio que los pacientes con

astrocitomas anaplásicos o GBM que presentan IDH1 mutado eran

significativamente más jóvenes que los pacientes cuyos tumores no

presentaban dicha mutación (H. Yan, et al., 2009). En nuestra serie, al igual

que en los estudios mencionados anteriormente, los pacientes con edades por

debajo de la mediana (55 años) presentan mutaciones en IDH1 en sus

tumores, siendo la asociación entre este marcador y la edad estadísticamente

significativa (p-valor <0.000).

Además, los resultados obtenidos confirman otros estudios en los que se

observó que las mutaciones en IDH1 e IDH2 no ocurren simultáneamente en

un mismo tumor, si no que son mutuamente excluyentes (Christensen, et al.,

2011; Labussiere, et al., 2010; Martin J. van den Bent, et al., 2010; H. Yan, et

al., 2009). Esto sugiere que están implicadas en mecanismos similares de

tumorigénesis. Debido a esto y, dado el bajo porcentaje de mutaciones en

IDH2, en el presente trabajo ambas mutaciones se agrupan.

El hecho de que exista una elevada frecuencia de mutaciones en este

gen en los AII (75%) apoya la hipótesis de Balss y col que establece que esta

185

Discusión

grado tumoral. Es necesario puntualizar que existe una gran diferencia entre

los porcentajes de mutaciones en IDH en GBM primarios y secundarios. Según

lo descrito en la bibliografía, IDH1/IDH2 están mutados (Balss, et al., 2008;

Capper, et al., 2009; Parsons, et al., 2008; Ru, Williams, Chakravarti, & Guo,

2013; H. Yan, et al., 2009) en torno a un 85% en los GBM secundarios y un 5%

en los primarios. En nuestra serie, el porcentaje de mutaciones en los GBM fue

de un 8.9%, por lo que podrían considerarse GBM primarios.

Williams Parsons y col realizaron un estudio en 2008 en el que, entre

otros resultados, establecen que las mutaciones en IDH1 ocurren,

preferentemente, en pacientes con gliomas de edad más joven, esto es, con

una edad media de 33 años en comparación con una edad media de 53 años

en pacientes con IDH1 no mutado (Parsons, et al., 2008). Otros estudios

también afirman que las mutaciones en dicho gen se asocian con edad joven

de los pacientes (Bleeker, et al., 2010; Nobusawa, Watanabe, Kleihues, &

Ohgaki, 2009). Yan y col demuestran en su estudio que los pacientes con

astrocitomas anaplásicos o GBM que presentan IDH1 mutado eran

significativamente más jóvenes que los pacientes cuyos tumores no

presentaban dicha mutación (H. Yan, et al., 2009). En nuestra serie, al igual

que en los estudios mencionados anteriormente, los pacientes con edades por

debajo de la mediana (55 años) presentan mutaciones en IDH1 en sus

tumores, siendo la asociación entre este marcador y la edad estadísticamente

significativa (p-valor <0.000).

Además, los resultados obtenidos confirman otros estudios en los que se

observó que las mutaciones en IDH1 e IDH2 no ocurren simultáneamente en

un mismo tumor, si no que son mutuamente excluyentes (Christensen, et al.,

2011; Labussiere, et al., 2010; Martin J. van den Bent, et al., 2010; H. Yan, et

al., 2009). Esto sugiere que están implicadas en mecanismos similares de

tumorigénesis. Debido a esto y, dado el bajo porcentaje de mutaciones en

IDH2, en el presente trabajo ambas mutaciones se agrupan.

El hecho de que exista una elevada frecuencia de mutaciones en este

gen en los AII (75%) apoya la hipótesis de Balss y col que establece que esta

Discusión

alteración es un evento temprano que ocurre durante la progresión tumoral

(Balss, et al., 2008). Otros estudios respaldan esta hipótesis (Ichimura, et al.,

2009; H. Yan, et al., 2009).

Los porcentajes de mutación obtenidos mediante IHQ, con el anticuerpo

que reconoce específicamente la forma mutada de IDH1 (Arg132His), fueron

muy similares a los obtenidos por secuenciación directa. Además, al realizar los

análisis, se mantuvo la asociación de este biomarcador con la edad (p-valor

<0.000) y con el grado tumoral (p-valor <0.000). Al comparar ambas técnicas,

se demostró una asociación estadísticamente significativa entre las dos (p-valor

<0.000). Dado que el anticuerpo utilizado sólo reconoce las proteínas con la

mutación en IDH1 Arg132His y, por tanto, las otras mutaciones, aunque son

poco frecuentes, no serían detectables por esta técnica, la IHQ no es una

técnica coste-eficaz en el caso de los gliomas. La secuenciación directa ha de

ser la primera opción a la hora de detectar dichas mutaciones.

Algunos trabajos demuestran que los tumores G-CIMP positivos son más

comunes en gliomas de bajo grado que, frecuentemente, portan mutaciones en

IDH1 y están asociados a una mayor supervivencia (Noushmehr, et al., 2010).

Sin embargo, en el presente estudio, el mayor porcentaje de metilación global

se da en los astrocitomas de grado III (44%), porcentaje similar al observado en

los astrocitomas de grado II (38.5%). Además, de los 56 gliomas CIMP

positivos analizados, 16 portan mutaciones en IDH. De estos 16 gliomas CIMP

positivos y mutados para IDH, sólo 7 son AII (6 son AIII y 3 GBM). Esto podría

deberse a que algunos de los gliomas diagnosticados como AIII son, en

realidad, AII y viceversa. Además, como se observa en la Figura 37, los AIII

con IDH mutado presentan una mayor supervivencia que los AII mutados,

cuando se esperaría que ocurriese lo contrario. Por otra parte, en esta serie los

AII no mutados se comportan de forma similar a los GBM no mutados (Figura

37) como se ha establecido en la bibliografía (Brat, et al., 2015). Existe una

gran dificultad a la hora de diferenciar ambos grados sólo en base a criterios

histopatológicos. Ya en 1997, Coons y col. evidenciaron que la precisión

diagnóstica y reproducibilidad están comprometidos por los criterios

histológicos subjetivos que se usan normalmente para clasificar los gliomas

186

Discusión

(Coons, Johnson, Scheithauer, Yates, & Pearl, 1997). Además de estos

criterios, se suma la variabilidad histológica intratumoral y el hecho de que los

gliomas de alto grado pueden presentar diferenciación celular (Nutt, et al.,

2003). Uno de los mayores riesgos del diagnóstico erróneo radica en la

posibilidad de sobre o infratratar a los pacientes, ya que las decisiones

terapéuticas están basadas en el diagnóstico histológico (M. J. van den Bent,

2010). Cabe resaltar lo descrito anteriormente sobre la importancia de aplicar

criterios moleculares en la práctica clínica, como podría ser la IHQ y/o

secuenciación de IDH (Hartmann, et al., 2010). La publicación de la nueva

clasificación de la OMS (Louis, et al., 2016) ha coincidido con el cierre de la

escritura del presente trabajo de Tesis Doctoral. Se evidencia una apuesta

decidida a la utilización de biomarcadores moleculares como herramienta

diagnóstica esencial o de apoyo al diagnóstico patológico con marcadores

morfológicos e inmunohistoquímicos.

Actualmente, hay estudios que apoyan que las mutaciones en IDH son la

base molecular del fenotipo G-CIMP. Esta afirmación se basa en el hecho de

que la actividad del gen TET2, que codifica una dioxigenasa que convierte la 5-

metilcitosina en 5-hidroximetilcitosina dando lugar a la desmetilación del ADN

en el loci específico, se encuentra inhibida por la expresión de IDH1 mutado

(Figura 11). Esto da lugar a la acumulación de metilación del ADN y favorece la

tumorigénesis (Ko, et al., 2010; Turcan, et al., 2012; Xu, et al., 2011; L. Yu & Qi,

2012). Los resultados del presente estudio apoyan esta hipótesis ya que existe

una clara asociación entre el G-CIMP y las mutaciones en IDH (p-valor= 0.013).

Al igual que el G-CIMP, las mutaciones en IDH determinan un mejor

pronóstico. Del resultado obtenido tras el análisis multivariante, se puede

establecer que la variable que realmente tiene un valor pronóstico por sí misma

son las mutaciones en IDH. El G-CIMP sería un factor dependiente de dicho

biomarcador. Esto confirma lo explicado en el párrafo anterior. Muchos son los

estudios en los que se ha otorgado el papel de biomarcador de buen pronóstico

a las mutaciones en IDH (Christensen, et al., 2011; Nobusawa, et al., 2009;

Noushmehr, et al., 2010; Parsons, et al., 2008; H. Yan, et al., 2009), al igual

que en el presente trabajo (p-valor <0.000). En 2010, Bleeker y col. (Bleeker, et

al., 2010) estudiaron si la producción de NADPH en gliomas está afectada por

187

Discusión

(Coons, Johnson, Scheithauer, Yates, & Pearl, 1997). Además de estos

criterios, se suma la variabilidad histológica intratumoral y el hecho de que los

gliomas de alto grado pueden presentar diferenciación celular (Nutt, et al.,

2003). Uno de los mayores riesgos del diagnóstico erróneo radica en la

posibilidad de sobre o infratratar a los pacientes, ya que las decisiones

terapéuticas están basadas en el diagnóstico histológico (M. J. van den Bent,

2010). Cabe resaltar lo descrito anteriormente sobre la importancia de aplicar

criterios moleculares en la práctica clínica, como podría ser la IHQ y/o

secuenciación de IDH (Hartmann, et al., 2010). La publicación de la nueva

clasificación de la OMS (Louis, et al., 2016) ha coincidido con el cierre de la

escritura del presente trabajo de Tesis Doctoral. Se evidencia una apuesta

decidida a la utilización de biomarcadores moleculares como herramienta

diagnóstica esencial o de apoyo al diagnóstico patológico con marcadores

morfológicos e inmunohistoquímicos.

Actualmente, hay estudios que apoyan que las mutaciones en IDH son la

base molecular del fenotipo G-CIMP. Esta afirmación se basa en el hecho de

que la actividad del gen TET2, que codifica una dioxigenasa que convierte la 5-

metilcitosina en 5-hidroximetilcitosina dando lugar a la desmetilación del ADN

en el loci específico, se encuentra inhibida por la expresión de IDH1 mutado

(Figura 11). Esto da lugar a la acumulación de metilación del ADN y favorece la

tumorigénesis (Ko, et al., 2010; Turcan, et al., 2012; Xu, et al., 2011; L. Yu & Qi,

2012). Los resultados del presente estudio apoyan esta hipótesis ya que existe

una clara asociación entre el G-CIMP y las mutaciones en IDH (p-valor= 0.013).

Al igual que el G-CIMP, las mutaciones en IDH determinan un mejor

pronóstico. Del resultado obtenido tras el análisis multivariante, se puede

establecer que la variable que realmente tiene un valor pronóstico por sí misma

son las mutaciones en IDH. El G-CIMP sería un factor dependiente de dicho

biomarcador. Esto confirma lo explicado en el párrafo anterior. Muchos son los

estudios en los que se ha otorgado el papel de biomarcador de buen pronóstico

a las mutaciones en IDH (Christensen, et al., 2011; Nobusawa, et al., 2009;

Noushmehr, et al., 2010; Parsons, et al., 2008; H. Yan, et al., 2009), al igual

que en el presente trabajo (p-valor <0.000). En 2010, Bleeker y col. (Bleeker, et

al., 2010) estudiaron si la producción de NADPH en gliomas está afectada por

Discusión

las mutaciones en IDH, ya que la nueva función adquirida de producción de 2-

HG se produce por la reducción dependiente de NADPH del α-KG. La hipótesis

planteada por este grupo se basa en que la disminución de los niveles de

NADPH citoplasmático resulta en una reducción del glutation (GSH), que se

encarga de la eliminación de radicales de oxígeno en la célula. Esta reducción

de GSH da lugar a estrés oxidativo que puede causar daño en el ADN e inducir

la apoptosis. El estrés oxidativo se incrementa por la radiación y la

quimioterapia y, por tanto, los tumores con mutaciones en IDH son menos

resistentes a los tratamientos radio y quimioterapéuticos, lo que explicaría el

aumento de la supervivencia en estos pacientes.

Se ha descrito, además, una fuerte asociación entre el fenotipo G-CIMP

y la metilación en MGMT (Teodoridis, Strathdee, & Brown, 2004; M. J. van den

Bent, et al., 2011), mostrando que la metilación en MGMT puede constituir un

buen marcador de hipermetilación global en tumores gliales. Los resultados del

presente estudio no apoyan lo descrito en la bibliografía, ya que no se observa

una asociación estadísticamente significativa entre ambos biomarcadores. Una

posibilidad radica en el hecho de que el conjunto de genes seleccionados como

panel del G-CIMP no se corresponde con las regiones analizadas por otros

grupos.

En cuanto a la asociación entre las mutaciones en IDH y la metilación

en MGMT, los resultados obtenidos en el estudio muestran una correlación

estadísticamente significativa entre estos dos marcadores en nuestra serie de

gliomas y confirman lo que ya ha sido establecido en estudios anteriores

(Boots-Sprenger, et al., 2013; Hartmann, et al., 2011; Noushmehr, et al., 2010;

Wick & Weller, 2009; Xu, et al., 2011). La metilación de MGMT es parte del

fenotipo hipermetilador en muchos gliomas (Weller, et al., 2013), por tanto,

como se ha comentado anteriormente, la producción de 2-HG inhibiría la

desmetilación de las histonas, en parte porque las histonas desmetilasas y las

TET 5-metilcitosina hidroxilasas son dioxigenasas dependientes de α-KG y

están involucradas en el control epigenético, lo que predispondría a la

hipermetilación del ADN de las células del glioma (Haynes, et al., 2014;

Loenarz & Schofield, 2008).

188

Discusión

La alteración en la expresión del gen SOCS1 se han descrito en

diferentes tumores humanos, sin embargo, el papel de SOCS1 como marcador

diagnóstico o diana terapéutica no está completamente establecido (J. Zhang,

et al., 2012). Existe una cierta controversia ya que en ciertos tumores la

expresión de SOCS1 se encuentra reducida, como en el cáncer de próstata,

carcinoma hepatocelular, carcinoma laríngeo, mieloma múltiple y cáncer de

páncreas. Esta diminución de la expresión se relaciona con invasión tumoral y

angiogénesis. Estos datos indican que SOCS1 es un gen supresor tumoral (F.

J. Huang, et al., 2008; J. Zhang, et al., 2012). De las muestras analizadas de

este estudio, un 39.4% presentaron metilación en SOCS1. Si observamos la

metilación de SOCS1 según el grado tumoral, el 76.9% de los astrocitomas de

grado II presentan metilación en dicho gen (Tabla 19). Nuestros hallazgos

apoyarían la hipótesis del comportamiento del gen SOCS1 como supresor de

tumores. Sin embargo, la controversia radica en el hecho de que en otros tipos

de cáncer, como en el cáncer de mama, la expresión de SOCS1 está

aumentada. Estos estudios sugieren una función de SOCS1 promotora de

tumores en lugar de la conocida función supresora (Z. Li, et al., 2004; Raccurt,

et al., 2003; Tomic, Chughtai, & Ali, 1999). Los resultados contradictorios en

diferentes tumores pueden ser debidos al diferente origen del tumor y/o a los

diferentes microambientes donde reside (Raccurt, et al., 2003; Tomic, et al.,

1999; J. Zhang, et al., 2012). Los mecanismos que están implicados en la

disminución de la expresión de SOCS1 incluyen la pérdida de heterocigosidad

y la hipermetilación del ADN. En varios estudios se ha demostrado que la

generación secuencial de células neuronales y de la glía está regulada por

citoquinas, como el LIF, a través de la vía JAK-STAT (Emery, et al., 2006; He,

et al., 2005). La ausencia de inhibición de SOCS1 sobre LIF u otras citoquinas

por hipermetilación de este gen parece estar implicada en el proceso de

desdiferenciación que ocurre en los tumores astrogliales (He, et al., 2005).

Li y col. establecieron, en un estudio realizado en 2004, que una mayor

expresión de SOCS1 está asociada a progresión tumoral (Z. Li, et al., 2004).

Por tanto, la hipermetilación del promotor de SOCS1 sería un factor de mejor

pronóstico, ya que en este caso la expresión del gen estaría disminuida. Sin

embargo, cuando se estudió la expresión de este gen en un subgrupo de las

189

Discusión

La alteración en la expresión del gen SOCS1 se han descrito en

diferentes tumores humanos, sin embargo, el papel de SOCS1 como marcador

diagnóstico o diana terapéutica no está completamente establecido (J. Zhang,

et al., 2012). Existe una cierta controversia ya que en ciertos tumores la

expresión de SOCS1 se encuentra reducida, como en el cáncer de próstata,

carcinoma hepatocelular, carcinoma laríngeo, mieloma múltiple y cáncer de

páncreas. Esta diminución de la expresión se relaciona con invasión tumoral y

angiogénesis. Estos datos indican que SOCS1 es un gen supresor tumoral (F.

J. Huang, et al., 2008; J. Zhang, et al., 2012). De las muestras analizadas de

este estudio, un 39.4% presentaron metilación en SOCS1. Si observamos la

metilación de SOCS1 según el grado tumoral, el 76.9% de los astrocitomas de

grado II presentan metilación en dicho gen (Tabla 19). Nuestros hallazgos

apoyarían la hipótesis del comportamiento del gen SOCS1 como supresor de

tumores. Sin embargo, la controversia radica en el hecho de que en otros tipos

de cáncer, como en el cáncer de mama, la expresión de SOCS1 está

aumentada. Estos estudios sugieren una función de SOCS1 promotora de

tumores en lugar de la conocida función supresora (Z. Li, et al., 2004; Raccurt,

et al., 2003; Tomic, Chughtai, & Ali, 1999). Los resultados contradictorios en

diferentes tumores pueden ser debidos al diferente origen del tumor y/o a los

diferentes microambientes donde reside (Raccurt, et al., 2003; Tomic, et al.,

1999; J. Zhang, et al., 2012). Los mecanismos que están implicados en la

disminución de la expresión de SOCS1 incluyen la pérdida de heterocigosidad

y la hipermetilación del ADN. En varios estudios se ha demostrado que la

generación secuencial de células neuronales y de la glía está regulada por

citoquinas, como el LIF, a través de la vía JAK-STAT (Emery, et al., 2006; He,

et al., 2005). La ausencia de inhibición de SOCS1 sobre LIF u otras citoquinas

por hipermetilación de este gen parece estar implicada en el proceso de

desdiferenciación que ocurre en los tumores astrogliales (He, et al., 2005).

Li y col. establecieron, en un estudio realizado en 2004, que una mayor

expresión de SOCS1 está asociada a progresión tumoral (Z. Li, et al., 2004).

Por tanto, la hipermetilación del promotor de SOCS1 sería un factor de mejor

pronóstico, ya que en este caso la expresión del gen estaría disminuida. Sin

embargo, cuando se estudió la expresión de este gen en un subgrupo de las

Discusión

muestras del presente trabajo, el resultado no fue el previsto. Todas

presentaron sobreexpresión del gen, incluída la muestra que estaba metilada.

Como se ha comentado anteriormente sobre las posibles causas de esta

controversia entre metilación y expresión en MGMT, en este caso se podría

deber a causas similares. Otros estudios también han encontrado una minoría

de genes con hipermetilación del promotor y una disminución significativa de la

expresión (Houshdaran, et al., 2010; Noushmehr, et al., 2010; Pike, et al.,

2008) y esto puede atribuirse a la falta de factores de transcripción adecuados

para algunos genes no metilados, así como al uso de promotores alternativos

para algunos genes metilados (Noushmehr, et al., 2010). El silenciamiento de

la expresión génica por metilación del promotor parece deberse en mucho

casos a la metilación específica de citosinas concretas dentro de la secuencia

core del promotor. Los diferentes estudios de metilación pueden utilizar

diferentes técnicas e interrogar diferentes puntos específicos que pueden

conllevar a resultados muy dispares. Hay que considerar también el hecho de

que se han analizado muy pocas muestras (n=13) de las que se disponía de

tejido congelado o ARN tumoral, y de éstas, sólo una estaba metilada. Por lo

que sería necesario ampliar el número de muestras del análisis para poder

comparar de una forma más exacta la metilación y la expresión.

En cuanto al valor pronóstico de este gen, se observa una mayor

supervivencia en los casos en los que dicho gen se encuentra metilado (p-valor

<0.000). Asimismo se ha encontrado una asociación entre metilación en

SOCS1 y metilación en MGMT (p-valor= 0.021), así como entre metilación en

SOCS1 e IDH1 mutado (p-valor <0.000). En contraposición, un estudio

realizado por Martini y col (Martini et al, 2008) establece que no existe una

asociación entre la metilación en MGMT y la metilación en SOCS1 en GBM.

Las diferencias en estos resultados con respecto a los obtenidos en este

estudio posiblemente radican en el hecho de que la técnica utilizada es la MS-

PCR en lugar de la técnica MS-MLPA. Además, la serie de tumores del estudio

de Martini y col. sólo incluye GBM, mientras que en la serie estudiada en este

trabajo las muestras proceden de tumores astrocíticos de diferentes grados de

malignidad. Por el mismo motivo, la correlación entre estas tres alteraciones

moleculares indica que la metilación en SOCS1 podría ser un marcador

190

Discusión

indirecto de predicción de respuesta al tratamiento basado en TMZ. Además,

no sólo el gen IDH1 se asocia con la edad, si no que en este estudio también

se observa que la metilación de SOCS1 correlaciona con edades de los

pacientes por debajo de la mediana (Tabla 20). Los resultados de un estudio

realizado en 2007 por Zhou y col. (Zhou, et al., 2007) en líneas celulares de

GBM sugieren que SOCS1 sensibiliza a las células a la RT, mientras que

SOCS3 (al igual que SOCS1, se trata de un supresor de la señalización de

citoquinas que inhibe de forma endógena la vía de señalización JAK-STAT3)

tiene un efecto radioprotector, ya que al analizar las expresión de ambos genes

en las líneas no observan expresión de SOCS1 (debida a la hipermetilación del

gen) y expresión constitutiva de SOCS3. Estos genes pueden modular algunas

vías de señalización (STATs, MAPK, Fosfatidilinositol) capaces de afectar al

fenotipo radiorresistente de las células de GBM (De Sepulveda, et al., 1999; S.

H. Park, Kim, Hwang, & Kim, 2003; Rui, Yuan, Frantz, Shoelson, & White,

2002). Las diferencias observadas con los resultados de este trabajo pueden

ser debidas al hecho de que este grupo analiza líneas celulares y no muestras

de tejido. Unos años atrás, en 2003, Martini y col. analizaron 46 muestras de

pacientes con GBM. En el 24% y en el 35% de la muestras se observó una

disminución de la expresión de SOCS1 y de SOCS3, respectivamente, como

consecuencia de la hipermetilación de ambos genes. En este caso, y en

contraposición con lo establecido en este trabajo, observan que la

hipermetilación de ambos genes se asocia con un peor pronóstico. No sólo

eso, sino que, al contrario de lo observado por Zhou y col., sugieren que la

expresión de SOCS3 (debida a la no metilación del mismo) mejora la respuesta

al tratamiento (RT y TMZ) de estos pacientes. Todos estos resultados

contradictorios pueden deberse al hecho de que la serie analizada es mucho

menor (n= 46) que la serie analizada en este trabajo (n= 235). Además, las

regiones estudiadas para determinar la metilación de SOCS1 no son las

mismas que las interrogadas en el presente estudio. Diferencias metodológicas

(MS-MLPA vs MS-PCR), así como diferencias en el material biológico de

partida y en el microambiente tumoral podrían contribuir a los resultados

observados en los diferentes estudios.

191

Discusión

indirecto de predicción de respuesta al tratamiento basado en TMZ. Además,

no sólo el gen IDH1 se asocia con la edad, si no que en este estudio también

se observa que la metilación de SOCS1 correlaciona con edades de los

pacientes por debajo de la mediana (Tabla 20). Los resultados de un estudio

realizado en 2007 por Zhou y col. (Zhou, et al., 2007) en líneas celulares de

GBM sugieren que SOCS1 sensibiliza a las células a la RT, mientras que

SOCS3 (al igual que SOCS1, se trata de un supresor de la señalización de

citoquinas que inhibe de forma endógena la vía de señalización JAK-STAT3)

tiene un efecto radioprotector, ya que al analizar las expresión de ambos genes

en las líneas no observan expresión de SOCS1 (debida a la hipermetilación del

gen) y expresión constitutiva de SOCS3. Estos genes pueden modular algunas

vías de señalización (STATs, MAPK, Fosfatidilinositol) capaces de afectar al

fenotipo radiorresistente de las células de GBM (De Sepulveda, et al., 1999; S.

H. Park, Kim, Hwang, & Kim, 2003; Rui, Yuan, Frantz, Shoelson, & White,

2002). Las diferencias observadas con los resultados de este trabajo pueden

ser debidas al hecho de que este grupo analiza líneas celulares y no muestras

de tejido. Unos años atrás, en 2003, Martini y col. analizaron 46 muestras de

pacientes con GBM. En el 24% y en el 35% de la muestras se observó una

disminución de la expresión de SOCS1 y de SOCS3, respectivamente, como

consecuencia de la hipermetilación de ambos genes. En este caso, y en

contraposición con lo establecido en este trabajo, observan que la

hipermetilación de ambos genes se asocia con un peor pronóstico. No sólo

eso, sino que, al contrario de lo observado por Zhou y col., sugieren que la

expresión de SOCS3 (debida a la no metilación del mismo) mejora la respuesta

al tratamiento (RT y TMZ) de estos pacientes. Todos estos resultados

contradictorios pueden deberse al hecho de que la serie analizada es mucho

menor (n= 46) que la serie analizada en este trabajo (n= 235). Además, las

regiones estudiadas para determinar la metilación de SOCS1 no son las

mismas que las interrogadas en el presente estudio. Diferencias metodológicas

(MS-MLPA vs MS-PCR), así como diferencias en el material biológico de

partida y en el microambiente tumoral podrían contribuir a los resultados

observados en los diferentes estudios.

Discusión

Dado que la metilación de SOCS1 forma parte del G-CIMP y presenta

una fuerte asociación estadísticamente significativa con este fenotipo (p-valor

<0.000), cabría considerarlo como un gen esencial que funciona como predictor

de la hipermetilación global en gliomas.

En 2015 varios estudios se centraron en el valor pronóstico de la

combinación entre varios marcadores. Nakae y col clasificaron los gliomas en

tres subgrupos en base a las mutaciones en IDH y TP53, siendo el subgrupo

que presentaba IDH mutado y TP53 no mutado el de mejor pronóstico (Nakae,

et al., 2015). Este análisis se repitió con las muestras de este trabajo

obteniendo el mismo resultado que Nakae y col. En ese mismo año, Zeng y col

examinaron si la combinación de la expresión de ki67 y las mutaciones en IDH

mejoraban la definición de entidades con diferente pronóstico (Zeng, et al.,

2015). Al igual que en el caso anterior, este análisis se llevó a cabo con las

muestras de la presente serie y los resultados fueron los mismos, aquellos

casos con mutaciones en IDH y un ki67 bajo y/o moderaro fueron los de mejor

pronóstico.

En el contexto de la identificación de subgrupos en base a

características moleculares, en 2008 se estableció “The Cancer Genome Atlas

(TCGA) Rearch Network” con el fin de generar un catálogo de las alteraciones

genómicas que conducen la tumorigénesis, de forma que proveen una vista

detallada de los cambios genómicos en una gran cohorte de 206 GBM (TCGA,

2008). A partir de los datos generados, Verhaak y col definieron cuatro

subgrupos de GBM en base a la expresión génica de un conjunto de 840

genes. Estos subgrupos (Proneural, Neural, Clásico y Mesenquimal)

caracterizados por determinadas alteraciones moleculares, difieren en la

eficacia de los tratamientos (Verhaak, et al., 2010). Dada la importancia en la

práctica clínica de clasificar entidades pronósticamente diferentes y que

responden al tratamiento con distinta eficacia, en este trabajo se pretendió

definir una serie de perfiles moleculares basados en biomarcadores y cuya

aplicación en la práctica clínica podría llevarse a cabo de forma relativamente

rápida y económica. Tras los análisis realizados, se observó que el perfil con un

pronóstico más favorable estaba caracterizado por presentar mutaciones en

IDH, metilación de MGMT y SOCS1 y un ki67 bajo. En contraposición, los

192

Discusión

tumores con IDH no mutado y no metilación en MGMT y SOCS1

(independientemente del estado de TP53 y ki67) presentaron las

supervivencias más bajas. Un perfil basado en dos marcadores definió un perfil

de mejor pronóstico en los GBM de larga supervivencia (SOCS1 metilado y

edades iguales o por debajo de la mediana), así como en todos los gliomas, lo

que confirma el valor pronóstico de la metilación en SOCS1.

Por consiguiente, el establecimiento de una serie de marcadores

moleculares e inmunohistoquímicos que aporten información y mejoren el

diagnóstico y decisiones terapéuticas, además de predecir el pronóstico, de los

pacientes con este tipo de tumores cerebrales es esencial dada la falta de

conocimiento y de tratamientos eficaces en estos tumores. La determinación de

las mutaciones en IDH y TP53, bien por secuenciación directa o bien por

inmunohistoquímica, así como el análisis del estado de metilación de los genes

MGMT y SOCS1 y la determinación del índice de proliferación ki67, podrían ser

análisis de rutina en la práctica clínica de estos tumores.

5.2. HCMV Y GLIOMAS

A lo largo de los últimos 15 años se han venido publicando una serie de

estudios donde se sugiere, o parece evidenciar, la presencia de antígenos y

ADN viral en los gliomas. En el año 2011, y fruto de estos hallazgos, se celebró

un simposio sobre la asociación entre el HCMV y los gliomas en el que se llegó

a la conclusión de que existe suficiente evidencia que sugiere que el HCMV

podría modular el fenotipo maligno de los gliomas de alto grado (Dziurzynski, et

al., 2012). Este virus no es considerado oncogénico si no que se encuadra en

la categoría de oncomodulador, es decir, tiene capacidad para modificar el

comportamiento a nivel molecular y celular del tumor, no siendo un factor

imprescindible en el proceso oncogénico, pero sí actuando como un factor

adyuvante como modulador de la génesis y progresión tumoral (Cinatl, et al.,

1996; Cobbs, 2011; Michaelis, Doerr, & Cinatl, 2009; Soderberg-Naucler,

2006a).

Existen varias hipótesis sobre cómo el HCMV llega al cerebro. La

barrera hematoencefálica en gliomas de alto grado es defectuosa y esto puede

193

Discusión

tumores con IDH no mutado y no metilación en MGMT y SOCS1

(independientemente del estado de TP53 y ki67) presentaron las

supervivencias más bajas. Un perfil basado en dos marcadores definió un perfil

de mejor pronóstico en los GBM de larga supervivencia (SOCS1 metilado y

edades iguales o por debajo de la mediana), así como en todos los gliomas, lo

que confirma el valor pronóstico de la metilación en SOCS1.

Por consiguiente, el establecimiento de una serie de marcadores

moleculares e inmunohistoquímicos que aporten información y mejoren el

diagnóstico y decisiones terapéuticas, además de predecir el pronóstico, de los

pacientes con este tipo de tumores cerebrales es esencial dada la falta de

conocimiento y de tratamientos eficaces en estos tumores. La determinación de

las mutaciones en IDH y TP53, bien por secuenciación directa o bien por

inmunohistoquímica, así como el análisis del estado de metilación de los genes

MGMT y SOCS1 y la determinación del índice de proliferación ki67, podrían ser

análisis de rutina en la práctica clínica de estos tumores.

5.2. HCMV Y GLIOMAS

A lo largo de los últimos 15 años se han venido publicando una serie de

estudios donde se sugiere, o parece evidenciar, la presencia de antígenos y

ADN viral en los gliomas. En el año 2011, y fruto de estos hallazgos, se celebró

un simposio sobre la asociación entre el HCMV y los gliomas en el que se llegó

a la conclusión de que existe suficiente evidencia que sugiere que el HCMV

podría modular el fenotipo maligno de los gliomas de alto grado (Dziurzynski, et

al., 2012). Este virus no es considerado oncogénico si no que se encuadra en

la categoría de oncomodulador, es decir, tiene capacidad para modificar el

comportamiento a nivel molecular y celular del tumor, no siendo un factor

imprescindible en el proceso oncogénico, pero sí actuando como un factor

adyuvante como modulador de la génesis y progresión tumoral (Cinatl, et al.,

1996; Cobbs, 2011; Michaelis, Doerr, & Cinatl, 2009; Soderberg-Naucler,

2006a).

Existen varias hipótesis sobre cómo el HCMV llega al cerebro. La

barrera hematoencefálica en gliomas de alto grado es defectuosa y esto puede

Discusión

deberse a que las células de gliomas desdiferenciadas han perdido la

capacidad de inducir las características de la barrera hematoencefálica en

células endoteliales haciendo que las proliferaciones vasculares de novo,

típicas de los GBM, funcionen de manera defectuosa. Por otro lado, puede

deberse a que las células de los gliomas secretan sustancias solubles

(proteasas y otros factores) que provocan áreas de ruptura, donde la barrera

hematoencefálica pierde sus propiedades. El virus podría entrar al cerebro por

estas áreas de ruptura temporales. En el caso de los gliomas de bajo grado, la

barrera hematoencefálica está normalmente preservada. Otro mecanismo de

entrada podría ser a través de la circulación de las células endoteliales y

monocitos infectados (Reuter, Gomez, Wilson, & van den Pol, 2004; Schneider,

Meyer-Koenig, & Hufert, 2008). Pero el hecho de que el virus sea capaz de

entrar en el cerebro no implica que juegue un papel en la gliomagénesis. No

está claramente definido si le infección del virus es un epifenómeno o causa de

este tipo de tumores (Soderberg-Naucler, 2006a), de hecho, se sabe que es

necesario un sistema inmune deprimido para la invasión de HCMV en el

cerebro, por lo que esto podría sugerir que se trata de un efecto secundario a la

presencia de un glioma y no la causa de este tipo de tumor.

La inflamación juega un papel central en la patogénesis del HCMV. Este

virus ha desarrollado varios mecanismos que le permiten ocultarse del sistema

inmune, mediante la infección latente en las células del linaje mieloide. Varios

productos génicos de este virus están implicados en el control de las funciones

principales de la respuesta inmune innata y adaptativa. Mediante su influencia

en la regulación de diferentes procesos celulares (ciclo celular, apoptosis,

migración, angiogénesis, invasión) el HCMV puede participar en el desarrollo

de esta enfermedad (Soderberg-Naucler, 2006a, 2006b). Ciertos tipos de

cáncer pueden proveer un microambiente idóneo para la reactivación del virus

en estado latente. Este virus activado podría mantener y empeorar la

inflamación existente.

Por otro lado, la metilación del ADN es importante en el mantenimiento

de la integridad genómica. Se ha hipotetizado que esta metilación podría

formar parte de los sistemas de defensa de la célula hospedadora ya que

suprimiría la expresión de los genes víricos. Cambios epigenéticos podrían

194

Discusión

llevar a la reactivación del HCMV latente y a la persistencia de la infección viral

activa en la células tumorales (Hsu, Lu, Chin, & Yang, 2010; Soderberg-

Naucler, 2006a, 2006b). En el presente trabajo, ninguna muestra resultó ser

positiva para HCMV por diferentes métodos y, por lo tanto, no se encontró

ninguna correlación con el fenotipo hipermetilador de las mismas.

El HCMV puede inducir numerosos cambios moleculares en las células

infectadas que podrían contribuir al fenotipo oncogénico: aumenta la expresión

de factores angiogénicos, crea un microambiente inflamatorio, media

numerosos cambios inmunosupresores, aumenta la motilidad e invasión

celular, suprime la función de los genes supresores TP53 y RB, induce la

actividad de la telomerasa y aumenta la resistencia a la apoptosis producida

por la quimioterapia, ya que varias proteínas del virus inhiben específicamente

la apoptosis (Cobbs, 2011; Cobbs, Soroceanu, Denham, Zhang, & Kraus, 2008;

John H. Sampson & Duane A. Mitchell, 2011; Straat, et al., 2009).

Por otro lado, el papel de STAT3 en la patogénesis de los glioblastomas

ha ganado importancia en los últimos años. En concreto, la activación

aberrante de STAT3 induce progresión del ciclo celular, angiogénesis y evasión

de la respuesta inmune. El HCMV puede activar esta vía a través de varios

mecanismos: las células de glioblastoma infectadas secretan altos niveles de

IL6 que estimulan la vía de transducción a través del receptor de IL6, estas

células también expresan US28 (receptor de la quimiocina codificado por el

HCMV y activado constitutivamente) que es capaz de activar la vía de

señalización y, por último, los viriones producidos por el HCMV pueden activar

esta vía a través del PDGFRα (Hollon, Price, Kwon, & Chiocca, 2013).

A pesar de las diferentes hipótesis acerca del papel de este virus en la

gliomagénesis, en el presente estudio, como en otros cuantos, no se detectó

ADN del HCMV por un método diagnóstico validado mediante PCR a tiempo

real, como en un experimento similar llevado a cabo por Yamashita y col en

2014 (Yamashita, et al., 2014). Tampoco se detectó por nested PCR ni se

detectaron proteínas virales por IHQ.

195

Discusión

llevar a la reactivación del HCMV latente y a la persistencia de la infección viral

activa en la células tumorales (Hsu, Lu, Chin, & Yang, 2010; Soderberg-

Naucler, 2006a, 2006b). En el presente trabajo, ninguna muestra resultó ser

positiva para HCMV por diferentes métodos y, por lo tanto, no se encontró

ninguna correlación con el fenotipo hipermetilador de las mismas.

El HCMV puede inducir numerosos cambios moleculares en las células

infectadas que podrían contribuir al fenotipo oncogénico: aumenta la expresión

de factores angiogénicos, crea un microambiente inflamatorio, media

numerosos cambios inmunosupresores, aumenta la motilidad e invasión

celular, suprime la función de los genes supresores TP53 y RB, induce la

actividad de la telomerasa y aumenta la resistencia a la apoptosis producida

por la quimioterapia, ya que varias proteínas del virus inhiben específicamente

la apoptosis (Cobbs, 2011; Cobbs, Soroceanu, Denham, Zhang, & Kraus, 2008;

John H. Sampson & Duane A. Mitchell, 2011; Straat, et al., 2009).

Por otro lado, el papel de STAT3 en la patogénesis de los glioblastomas

ha ganado importancia en los últimos años. En concreto, la activación

aberrante de STAT3 induce progresión del ciclo celular, angiogénesis y evasión

de la respuesta inmune. El HCMV puede activar esta vía a través de varios

mecanismos: las células de glioblastoma infectadas secretan altos niveles de

IL6 que estimulan la vía de transducción a través del receptor de IL6, estas

células también expresan US28 (receptor de la quimiocina codificado por el

HCMV y activado constitutivamente) que es capaz de activar la vía de

señalización y, por último, los viriones producidos por el HCMV pueden activar

esta vía a través del PDGFRα (Hollon, Price, Kwon, & Chiocca, 2013).

A pesar de las diferentes hipótesis acerca del papel de este virus en la

gliomagénesis, en el presente estudio, como en otros cuantos, no se detectó

ADN del HCMV por un método diagnóstico validado mediante PCR a tiempo

real, como en un experimento similar llevado a cabo por Yamashita y col en

2014 (Yamashita, et al., 2014). Tampoco se detectó por nested PCR ni se

detectaron proteínas virales por IHQ.

Discusión

Por tanto, hay una gran controversia con este tema con grupos que han

detectado el virus (Bhattacharjee, et al., 2012; Cobbs, et al., 2002; Ding, et al.,

2014; Fonseca, et al., 2012; Libard, et al., 2014; Lucas, et al., 2011; Mitchell, et

al., 2008; Rahbar, et al., 2012; Sabatier, et al., 2005; Scheurer, et al., 2008) y

otros que han fracasado en detectar la presencia del HCMV en estos tumores

(Baumgarten, et al., 2014; Lau, et al., 2004; Poltermann, et al., 2006; Solomon,

et al., 2014; K.-W. Tang, et al., 2015; Yamashita, et al., 2014). Esta

discrepancia es probablemente atribuíble a diferencias metodológicas (J. H.

Sampson & D. A. Mitchell, 2011). El nivel de infección de HCMV en muestras

de gliomas en la mayoría de los estudios es muy bajo, por lo tanto, se

necesitan métodos más sensibles para detectar la infección persistente por

HCMV en células tumorales (Michaelis, et al., 2011). El proceso de

optimización en la recuperación de antígenos así como una alta concentración

de anticuerpos se piensa que son factores clave requeridos para la detección

IHQ de estos bajos niveles de infección de HCMV (Solomon, et al., 2014).

A pesar de haberse usado una técnica diagnóstica validada por PCR a

tiempo real, no se detectó ADN de HCMV en la serie de este trabajo (sólo en 3

casos se observaron menos de 10 copias del virus por célula fuera del rango

cuantitativo que ofrece el kit). En términos de la IHQ, se usaron anticuerpos

optimizados (Anticuerpo Anti-citomegalovirus coktail CCH2/DDG9)

correspondientes a las proteínas p52/p76 (Solomon, et al., 2014) y también se

obtuvieron resultados negativos en la cohorte. La nested PCR se llevó a cabo

siguiendo el esquema de Bhattarchjee y col (Bhattacharjee, et al., 2012), y

tampoco se encontraron resultados positivos. Es posible que esta aproximación

metodológica, nested PCR, no sea muy fiable, ya que el número de ciclos de

amplificación de la PCR que se utiliza es demasiado elevado (90 ciclos) lo que

aumenta el riesgo de contaminación y, por consiguiente, de falsos positivos.

Si el ratio de infección es tan bajo y ningún estudio ha demostrado la

detección transcriptómica del CMV o ADN genómico del mismo empleando

secuenciación de última generación (Next Generation Sequencing), incluso

cuando otros virus sí han sido detectados (Hellstrand, Martner, & Bergstrom,

2013; Lawler, 2015; K. W. Tang, Alaei-Mahabadi, Samuelsson, Lindh, &

Larsson, 2013), es necesario considerar si la carga del HCMV es suficiente

196

Discusión

para llevar a cabo los procesos inmunosupresores y oncogénicos y si este virus

tiene realmente relevancia como blanco terapético en estos tumores (J. H.

Sampson & D. A. Mitchell, 2011).

Hay varios ensayos clínicos, incluyendo el agente antiviral valganciclovir,

pero no existe una clara evidencia científica de la eficacia biológica de estos

agentes antivirales en gliomas. Además, se debe tener en cuenta que los

tratamientos antivirales pueden actuar en las diferentes vías

independientemente del HCMV, por ejemplo, sinergizando con las terapias

antitumorales que podrían explicar el efecto beneficioso observado en algunos

casos. Esto se ha demostrado en un estudio preclínico animal con el fármaco

cidofovir (otro análogo nucleósido antiviral). En este estudio observan que este

fármaco tiene efecto tanto in vitro como in vivo al interferir con la síntesis de

ADN, independientemente de la infección o no infección por HCMV (Hadaczek,

et al., 2013; Lawler, 2015).

Otro aspecto a considerar es que, a pesar de que el HCMV es un virus

ubicuo, su prevalencia varía en las diferentes poblaciones. Esto es importante a

tener en cuenta en futuros estudios (Dey, et al., 2015; Fonseca, et al., 2012).

En conclusión, la controversia sobre la relación entre HCMV y los

gliomas persiste, lo que hace necesario estudios multicéntricos con una

metodología estandarizada y validada para determinar si el virus está

realmente presente en los tumores gliales. En este momento, los tratamientos

antivirales no deberían ser usados fuera de los ensayos clínicos en pacientes

con gliomas. En este trabajo se analizó un elevado número de muestras, tanto

fijadas e incluidas en parafina como de tejido congelado, con metodología de

alta especificidad y sensibilidad y, aún así, no se detectó ni ADN ni proteínas

de HCMV. Consideramos que se deberían revisar los criterios que dicen que

hay suficiente evidencia para establecer que el HCMV es un virus

oncomodulador en gliomas y ampliarse el número de estudios con una

metodología estandarizada y validada para diagnóstico molecular.

197

Discusión

para llevar a cabo los procesos inmunosupresores y oncogénicos y si este virus

tiene realmente relevancia como blanco terapético en estos tumores (J. H.

Sampson & D. A. Mitchell, 2011).

Hay varios ensayos clínicos, incluyendo el agente antiviral valganciclovir,

pero no existe una clara evidencia científica de la eficacia biológica de estos

agentes antivirales en gliomas. Además, se debe tener en cuenta que los

tratamientos antivirales pueden actuar en las diferentes vías

independientemente del HCMV, por ejemplo, sinergizando con las terapias

antitumorales que podrían explicar el efecto beneficioso observado en algunos

casos. Esto se ha demostrado en un estudio preclínico animal con el fármaco

cidofovir (otro análogo nucleósido antiviral). En este estudio observan que este

fármaco tiene efecto tanto in vitro como in vivo al interferir con la síntesis de

ADN, independientemente de la infección o no infección por HCMV (Hadaczek,

et al., 2013; Lawler, 2015).

Otro aspecto a considerar es que, a pesar de que el HCMV es un virus

ubicuo, su prevalencia varía en las diferentes poblaciones. Esto es importante a

tener en cuenta en futuros estudios (Dey, et al., 2015; Fonseca, et al., 2012).

En conclusión, la controversia sobre la relación entre HCMV y los

gliomas persiste, lo que hace necesario estudios multicéntricos con una

metodología estandarizada y validada para determinar si el virus está

realmente presente en los tumores gliales. En este momento, los tratamientos

antivirales no deberían ser usados fuera de los ensayos clínicos en pacientes

con gliomas. En este trabajo se analizó un elevado número de muestras, tanto

fijadas e incluidas en parafina como de tejido congelado, con metodología de

alta especificidad y sensibilidad y, aún así, no se detectó ni ADN ni proteínas

de HCMV. Consideramos que se deberían revisar los criterios que dicen que

hay suficiente evidencia para establecer que el HCMV es un virus

oncomodulador en gliomas y ampliarse el número de estudios con una

metodología estandarizada y validada para diagnóstico molecular.

Discusión


El análisis de expresión génica a gran escala mediante análisis de

micromatrices de expresión o microarrays permite tener una visión global de las

funciones alteradas en lo diferentes tipos de tumores, así como de los genes

diferencialmente expresados implicados en dichas funciones y que pueden

llegar a ser potenciales biomarcadores. Del análisis llevado a cabo en este

trabajo se han observado una serie de funciones alteradas y genes infra o

sobreexpresados en GBM. Es necesario tener en cuenta que dichos resultados

han de validarse por otras técnicas (especificado en el apartado “Limitaciones

del estudio”, expuesto más adelante).

Muchas son las vías y funciones alteradas en estos tumores. Tras el

análisis y filtrado bioinformático de los resultados obtenidos del microarray, se

observan numerosas funciones sobreexpresadas. Uno de los procesos

alterados es la exocitosis, en el que los genes ANXA1, ANXA 2 y ANXA2P2 se

encuentran implicados ya que se trata de genes que codifican proteínas de

unión a fosfolípidos que promueven la fusión a la membrana plasmática.

Existen varios estudios en los que se ha observado un aumento de la expresión

de ANXA1 y ANXA2 en gliomas (Andersen, et al., 2016; Ruano, et al., 2008) y

este hecho se asocia a un aumento del crecimiento tumoral (Y. Yang, et al.,

2011), mayor capacidad invasiva y angiogénesis (Onishi, et al., 2015) y una

peor supervivencia (Cheng, Tu, & Zhang, 2013; Mallawaaratchy, et al., 2015).

Otros de los genes sobreexpresados en este estudio es BIRC5, se trata

de un miembro de la familia de inhibidores de la apoptosis. Algunos estudios

han encontrado un asociación entre la expresión de dicho gen y un mal

pronóstico en gliomas de alto grado (Chakravarti, et al., 2002; Y. Huang, et al.,

2011). Tal y como se ha descrito en la introducción, una de las características

del cáncer es la evasión de la apoptosis (Hanahan & Weinberg, 2011), por

tanto, es de esperar que aquellos genes capaces de inhibir o evadir este

proceso se encuentren sobreexpresados en estos tumores. Al igual que BIRC5,

se observó un aumento de la expresión de VEGFA capaz, también, de inhibir la

apoptosis. Se trata de un factor de crecimiento activo en la angiogénesis,

198

Discusión

vasculogénesis y crecimiento endotelial capaz de inducir la proliferación celular,

promover la migración e inducir la permeabilidad de los vasos sanguíneos.

Todos estos procesos se ven favorecidos en estos tumores como se ha

observado en otras series (Hung, et al., 2000; Said, et al., 2007). Liu y col., en

2015, detectaron la expresión de VEGFA en sangre en pacientes con gliomas.

Por tanto, este gen podría ser usado como biomarcador diagnóstico en este

tipo de tumores (Q. Liu, et al., 2015). No sólo como marcador diagnóstico, si no

pronóstico, puesto que se ha establecido una asociación entre el aumento de

expresión del mismo y un pronóstico desfavorable en los pacientes con gliomas

(S. D. Zhang, Leung, McCrudden, & Kwok, 2015).

Siguiendo con aquellos genes sobreexpresados que de una forma

directa o indirecta afectan a la apoptosis, se encuentra GRB10. La proteína

codificada por este gen interactúa con BimL (miembro proapoptótico de la

familia Bcl2) e inhibe su actividad proapoptótica de manera dependiente de

fosforilación (Hu, et al., 2010). Dentro de la superfamilia beta de factores de

crecimiento transformantes (TGFβ), se encuentra el gen GDF15 cuya función

está relacionada con la regulación de las vías de señalización de la inflamación

y la apoptosis en tejidos lesionados o durante los procesos de enfermedad

(Zimmers, et al., 2005). Está involucrado en la patogénesis y progresión de

muchos cánceres (Bauskin, et al., 2006; Karan, et al., 2003) y se encuentra

sobreexpresado, como en esta serie, en gliomas (Scrideli, et al., 2008). En

2008, Strelan y col. observaron un aumento de la expresión de este gen en AII,

AIII y GBMs en comparación con la expresión observada en GBMp (Strelau, et

al., 2008), por lo que podría considerarse como posible biomarcador

diagnóstico en gliomas. Se ha demostrado, además, que p53 induce la

expresión de GDF15, lo que indica una conexión entre p53 y la superfamilia

TGFβ (Bottone, Baek, Nixon, & Eling, 2002; Kannan, Amariglio, Rechavi, &

Givol, 2000; Tan, Wang, Guan, & Sun, 2000). Esta superfamilia incluye una

serie de citoquinas secretadas por células del sistema inmune, células

tumorales y células estromales. Alteraciones en esta vía contribuyen en la

iniciación y progresión de muchos tumores, incluidos los gliomas (Han, Alvarez-

Breckenridge, Wang, & Yu, 2015). Por una parte puede promover la

angiogénesis a través de la vía VEGF (descrita anteriormente) e IGFBP7,

199

Discusión

vasculogénesis y crecimiento endotelial capaz de inducir la proliferación celular,

promover la migración e inducir la permeabilidad de los vasos sanguíneos.

Todos estos procesos se ven favorecidos en estos tumores como se ha

observado en otras series (Hung, et al., 2000; Said, et al., 2007). Liu y col., en

2015, detectaron la expresión de VEGFA en sangre en pacientes con gliomas.

Por tanto, este gen podría ser usado como biomarcador diagnóstico en este

tipo de tumores (Q. Liu, et al., 2015). No sólo como marcador diagnóstico, si no

pronóstico, puesto que se ha establecido una asociación entre el aumento de

expresión del mismo y un pronóstico desfavorable en los pacientes con gliomas

(S. D. Zhang, Leung, McCrudden, & Kwok, 2015).

Siguiendo con aquellos genes sobreexpresados que de una forma

directa o indirecta afectan a la apoptosis, se encuentra GRB10. La proteína

codificada por este gen interactúa con BimL (miembro proapoptótico de la

familia Bcl2) e inhibe su actividad proapoptótica de manera dependiente de

fosforilación (Hu, et al., 2010). Dentro de la superfamilia beta de factores de

crecimiento transformantes (TGFβ), se encuentra el gen GDF15 cuya función

está relacionada con la regulación de las vías de señalización de la inflamación

y la apoptosis en tejidos lesionados o durante los procesos de enfermedad

(Zimmers, et al., 2005). Está involucrado en la patogénesis y progresión de

muchos cánceres (Bauskin, et al., 2006; Karan, et al., 2003) y se encuentra

sobreexpresado, como en esta serie, en gliomas (Scrideli, et al., 2008). En

2008, Strelan y col. observaron un aumento de la expresión de este gen en AII,

AIII y GBMs en comparación con la expresión observada en GBMp (Strelau, et

al., 2008), por lo que podría considerarse como posible biomarcador

diagnóstico en gliomas. Se ha demostrado, además, que p53 induce la

expresión de GDF15, lo que indica una conexión entre p53 y la superfamilia

TGFβ (Bottone, Baek, Nixon, & Eling, 2002; Kannan, Amariglio, Rechavi, &

Givol, 2000; Tan, Wang, Guan, & Sun, 2000). Esta superfamilia incluye una

serie de citoquinas secretadas por células del sistema inmune, células

tumorales y células estromales. Alteraciones en esta vía contribuyen en la

iniciación y progresión de muchos tumores, incluidos los gliomas (Han, Alvarez-

Breckenridge, Wang, & Yu, 2015). Por una parte puede promover la

angiogénesis a través de la vía VEGF (descrita anteriormente) e IGFBP7,

Discusión

ambas regulan el crecimiento tumoral y la invasión y se encuentran

sobreexpresadas en GBM (Santosh, et al., 2010; van den Boom, et al., 2003) al

igual que en esta serie de tumores. Diferentes estudios han implicado a la vía

IGF (factor de crecimiento similar a la insulina) en la progresión de los gliomas

(Trojan, Cloix, Ardourel, Chatel, & Anthony, 2007; H. Wang, et al., 2003),

asociando la sobreexpresión de determinados elementos de la vía con un

mayor potencial invasivo y peor pronóstico (K. L. McDonald, et al., 2007;

Sallinen, et al., 2000). Por otro lado, la vía TGFβ induce inmunosupresión a

través de la inhibición de células del sistema inmune, promueve la invasión

mediante diferentes genes, incluido el TIMP1 y aumenta la proliferación a

través de la ciclina D y de la vía NF-κB. TIMP1 es otro de los genes

sobreexpresados en este estudio. Es un inhibidor de las metaloproteinasas,

que contribuyen al desarrollo y progresión del cáncer (Coussens, Fingleton, &

Matrisian, 2002; C. Yan & Boyd, 2007), que regula la diferenciación celular,

migración y muerte celular. Es uno de los genes diana de la vía NF-κB, se

encuentra sobreexpresado en GBM y juega un papel importante en el

crecimiento y proliferación tumoral (Friedmann-Morvinski, et al., 2016). Podría

tratarse de una diana terapéutica, ya que la inhibición de NF-κB o de alguno de

sus genes diana, como en este caso TIMP1, mediante fármacos administrados

localmente tras la cirugía, podría bloquear el crecimiento tumoral y reducir la

toxicidad. En un estudio realizado en 2011 por Bommarito y col., establecen

que la mutación BRAF V600E activa la vía NF-κB, provocando un aumento de

la expresión de TIMP1 que, a su vez, se une a CD63 en la membrana

plasmática y activa la vía PI3K (otra de las vías alteradas en gliomas y

descritas anteriormente) dando lugar a la fosforilación de AKT y, por tanto,

activando la anti-apoptosis y la proliferación (Bommarito, et al., 2011). Otro de

los genes sobreexpresados en el presente trabajo y que forman parte de la vía

TGFβ es la AMH (hormona antimulleriana), glicoproteína que inhibe el

desarrollo de los conductos de Müller en el embrión masculino (Massague,

2008; Phillips, et al., 2016). Hasta ahora no se ha establecido ninguna relación

entre esta hormona y los tumores gliales, sí se ha utilizado como marcador de

eficacia de la cirugía y/o QT en cáncer de ovario y de mama (Marca & Volpe,

2007; Phillips, et al., 2016).

200

Discusión

Si bien cabe esperar que los genes cuya función esté relacionada con la

evasión/inhibición de la apoptosis se encuentren sobreexpresados en estos

tumores, en varios casos el efecto es el contrario. Por ejemplo, TRIB3 se

encuentra sobreexpresado y, sin embargo, su función es la de regular

negativamente la vía NF-κB y a AKT1 (implicada en la supervivencia celular) y

es capaz de sensibilizar a la células para que sufran apoptosis (Hegedus,

Czibula, & Kiss-Toth, 2006; Salazar, et al., 2009). Otra caso es del de MTX1, se

trata de un gen que codifica una metalotioneína involucrada en el transporte de

proteínas en la mitocondria y en la apoptosis inducida por TNF (Cartron, Petit,

Bellot, Oliver, & Vallette, 2014). Por otra parte se encuentra OGDHL,

componente del complejo multienzimático OGDHC cuyo mal funcionamiento

está asociado con la neurodegeneración. Este gen se encuentra metilado en

algunos tipos de cáncer (mama, cervical, pulmón, esófago, páncreas y colon),

mientras que en otros tipos no lo está (ovario, riñón y vejiga) (Hoque, et al.,

2008; Ostrow, et al., 2009). El aumento de la expresión de OGDHL provoca un

aumento de las ROS (especies reactivas del oxígeno) y un aumento de la

peroxidación lipídica. Al igual que TRIB3, este gen es capaz de inactivar a AKT

y, por consiguiente, la vía de NF-κB (Sen, et al., 2012). En este caso, el

aumento de ROS es indicativo de un ambiente hipóxico en el tumor, lo que

concuerda con el hecho de que OGDHL se encuentre sobreexpresado. La

hipoxia es un factor pronóstico negativo en tumores sólidos. Un microambiente

hipóxico puede promover la capacidad de auto-renovación de las células de

glioma, llevando a las células hacia un fenotipo similar al de las células madre

(Heddleston, Li, McLendon, Hjelmeland, & Rich, 2009).

Continuando con el proceso de hipoxia, dos genes relacionados con el

mismo se encuentran sobreexpresados en este estudio. CA9 y CA12 son

anhidrasas carbónicas que participan en la hidratación reversible del dióxido de

carbono. En concordancia con los presentes resultados, otros grupos han

observado un aumento de expresión de CA9 (Irshad, et al., 2015; Said, et al.,

2010) y de CA12 (Scrideli, et al., 2008) en GBM. En concreto, CA9 contribuye a

la acidificación del medio dando lugar a fenotipos metastásicos y

quimiorresistencia a fármacos anticancerígenos (Said, et al., 2010). Juega un

papel importante en la apoptosis, angiogénesis, invasión y metástasis y, como

201

Discusión

Si bien cabe esperar que los genes cuya función esté relacionada con la

evasión/inhibición de la apoptosis se encuentren sobreexpresados en estos

tumores, en varios casos el efecto es el contrario. Por ejemplo, TRIB3 se

encuentra sobreexpresado y, sin embargo, su función es la de regular

negativamente la vía NF-κB y a AKT1 (implicada en la supervivencia celular) y

es capaz de sensibilizar a la células para que sufran apoptosis (Hegedus,

Czibula, & Kiss-Toth, 2006; Salazar, et al., 2009). Otra caso es del de MTX1, se

trata de un gen que codifica una metalotioneína involucrada en el transporte de

proteínas en la mitocondria y en la apoptosis inducida por TNF (Cartron, Petit,

Bellot, Oliver, & Vallette, 2014). Por otra parte se encuentra OGDHL,

componente del complejo multienzimático OGDHC cuyo mal funcionamiento

está asociado con la neurodegeneración. Este gen se encuentra metilado en

algunos tipos de cáncer (mama, cervical, pulmón, esófago, páncreas y colon),

mientras que en otros tipos no lo está (ovario, riñón y vejiga) (Hoque, et al.,

2008; Ostrow, et al., 2009). El aumento de la expresión de OGDHL provoca un

aumento de las ROS (especies reactivas del oxígeno) y un aumento de la

peroxidación lipídica. Al igual que TRIB3, este gen es capaz de inactivar a AKT

y, por consiguiente, la vía de NF-κB (Sen, et al., 2012). En este caso, el

aumento de ROS es indicativo de un ambiente hipóxico en el tumor, lo que

concuerda con el hecho de que OGDHL se encuentre sobreexpresado. La

hipoxia es un factor pronóstico negativo en tumores sólidos. Un microambiente

hipóxico puede promover la capacidad de auto-renovación de las células de

glioma, llevando a las células hacia un fenotipo similar al de las células madre

(Heddleston, Li, McLendon, Hjelmeland, & Rich, 2009).

Continuando con el proceso de hipoxia, dos genes relacionados con el

mismo se encuentran sobreexpresados en este estudio. CA9 y CA12 son

anhidrasas carbónicas que participan en la hidratación reversible del dióxido de

carbono. En concordancia con los presentes resultados, otros grupos han

observado un aumento de expresión de CA9 (Irshad, et al., 2015; Said, et al.,

2010) y de CA12 (Scrideli, et al., 2008) en GBM. En concreto, CA9 contribuye a

la acidificación del medio dando lugar a fenotipos metastásicos y

quimiorresistencia a fármacos anticancerígenos (Said, et al., 2010). Juega un

papel importante en la apoptosis, angiogénesis, invasión y metástasis y, como

Discusión

expuso Erpolat y col. en 2013, los gliomas de alto grado con sobreexpresión de

CA9 presentan un comportamiento más agresivo, resistencia a RT y menor

supervivencia (Erpolat, Gocun, Akmansu, Ozgun, & Akyol, 2013). Este grupo

también concluye que para mejorar el pronóstico de los pacientes con estos

tumores sería importante seleccionar aquellos pacientes con tumores hipóxicos

para la terapia dirigida. La IHQ de algunos marcadores de hipoxia podría ser

útil para hacer esta selección.

Otro de los procesos evadidos en el cáncer es la senescencia, proceso

fisiológico de cese irreversible del crecimiento que puede desencadenarse por

el acortamiento de los telómeros (senescencia replicativa) o por diferentes

formas de estrés (senescencia acelerada) (Roninson, 2003). Los principales

mediadores de la senescencia, que la inhiben durante la transformación

neoplásica, son los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas (como

p21 y p16INK4) (Stein, Drullinger, Soulard, & Dulic, 1999). En este contexto se

encuentra TBX2, miembro de la familia de genes que comparten un dominio

común al ADN, la caja T. Este gen está implicado en el desarrollo del

hipotálamo, interactuando con las vías de Shh y BMPs (alteradas en el

desarrollo y progresión de los gliomas) (Abrahams, Parker, & Prince, 2010).

Además, este gen podría tener un papel potencial en la tumorigénesis como

agente inmortalizante. Se ha encontrado sobreexpresado en varios tipos de

cáncer (melanoma, mama, hígado y páncreas) (Shen, et al., 2014) y esta

sobreexpresión provoca la evasión por parte de las células cancerígenas de la

senescencia, dando lugar a una proliferación incrontrolada, así como defectos

en el proceso de mitosis e inestabilidad cromosómica, haciendo a esta células

resistentes a los fármacos (Abrahams, et al., 2010).

Tanto la evasión del sistema inmune como un microambiente

inflamatorio del tumor son aspectos característicos en la iniciación y progresión

neoplásica. A este respecto, varios son los genes sobreexpresados en esta

serie y que tienen alguna implicación en dichos procesos. CCL2 es un factor

quimiotáctico capaz de atraer monocitos y basófilos y de aumentar su actividad

antitumoral. Las poblaciones de células no neoplásicas más abundantes en el

microambiente de los GBM son macrófagos, microglía y monocitos infiltrantes,

202

Discusión

el aumento de estos últimos se asocia con el aumento de expresión de CCL2

(Feng, et al., 2015). En otro estudio realizado por Lindemann y col, en 2015,

observan que el aumento de expresión de CCL2 se asocia con mayor

capacidad invasiva y migración de los GBM (Lindemann, Marschall, Weigert,

Klingebiel, & Fulda, 2015). Este aumento de expresión puede ser inducido por

IL1, como se demostró en 2015 por Tarassishin y col. en células de GBM

(Tarassishin, Lim, Weatherly, Angeletti, & Lee, 2014). En este mismo estudio

observaron el mismo efecto en la expresión de PTX3, otro de los genes

sobreexpresados en el presente trabajo. Componente de la rama humoral de la

inmunidad innata y marcador de la inflamación. Anteriormente ya se había

observado un aumento de su expresión en gliomas de alto grado y se había

considerado como un nuevo marcador de la inflamación asociada al cáncer y

de la malignidad de los gliomas (Locatelli, et al., 2013).

COL4A1 y COL4A2 son componentes estructurales de las membranas

basales glomerulares, que participan en la formación de la matriz extracelular y

en la angiogénesis. Al igual que en esta serie, Van den Boom y col. observaron

un aumento de expresión de ambos genes en gliomas (van den Boom, et al.,

2003). Varios estudios aparte han demostrado un aumento de la expresión de

COL4A2 en estos tumores (Nigro, et al., 2005; Ruano, et al., 2006; van den

Boom, et al., 2003). En 2006, Tso y col. establecieron que éste es uno de los

15 genes altamente sobreexpresados tanto en GBMp como en GBMs y se

asocia con la progresión y proliferación vascular de los gliomas (Tso, et al.,

2006).

TNFRSF12A (Fn14) es un receptor de superficie celular para TWEAK

(inductor débil de la apoptosis similar a TNF), normalmente expresado en

niveles bajos en tejido normal y aumentando su expresión en varios tumores

como en GBM. La primera vez que se observó la acción del complejo

TWEAK:Fn14 en GBM fue en 2003 por Tran y col., conviertiéndose así en un

objetivo potencial para dianas terapéuticas (Tran, et al., 2003). Tanto la acción

de este complejo como la sobreexpresión de Fn14 pueden estimular la

migración celular, invasión y resistencia a la QT en gliomas a través de la

203

Discusión

el aumento de estos últimos se asocia con el aumento de expresión de CCL2

(Feng, et al., 2015). En otro estudio realizado por Lindemann y col, en 2015,

observan que el aumento de expresión de CCL2 se asocia con mayor

capacidad invasiva y migración de los GBM (Lindemann, Marschall, Weigert,

Klingebiel, & Fulda, 2015). Este aumento de expresión puede ser inducido por

IL1, como se demostró en 2015 por Tarassishin y col. en células de GBM

(Tarassishin, Lim, Weatherly, Angeletti, & Lee, 2014). En este mismo estudio

observaron el mismo efecto en la expresión de PTX3, otro de los genes

sobreexpresados en el presente trabajo. Componente de la rama humoral de la

inmunidad innata y marcador de la inflamación. Anteriormente ya se había

observado un aumento de su expresión en gliomas de alto grado y se había

considerado como un nuevo marcador de la inflamación asociada al cáncer y

de la malignidad de los gliomas (Locatelli, et al., 2013).

COL4A1 y COL4A2 son componentes estructurales de las membranas

basales glomerulares, que participan en la formación de la matriz extracelular y

en la angiogénesis. Al igual que en esta serie, Van den Boom y col. observaron

un aumento de expresión de ambos genes en gliomas (van den Boom, et al.,

2003). Varios estudios aparte han demostrado un aumento de la expresión de

COL4A2 en estos tumores (Nigro, et al., 2005; Ruano, et al., 2006; van den

Boom, et al., 2003). En 2006, Tso y col. establecieron que éste es uno de los

15 genes altamente sobreexpresados tanto en GBMp como en GBMs y se

asocia con la progresión y proliferación vascular de los gliomas (Tso, et al.,

2006).

TNFRSF12A (Fn14) es un receptor de superficie celular para TWEAK

(inductor débil de la apoptosis similar a TNF), normalmente expresado en

niveles bajos en tejido normal y aumentando su expresión en varios tumores

como en GBM. La primera vez que se observó la acción del complejo

TWEAK:Fn14 en GBM fue en 2003 por Tran y col., conviertiéndose así en un

objetivo potencial para dianas terapéuticas (Tran, et al., 2003). Tanto la acción

de este complejo como la sobreexpresión de Fn14 pueden estimular la

migración celular, invasión y resistencia a la QT en gliomas a través de la

Discusión

activación de dos de las vías alteradas en estos tumores: PI3K/AKT y NF-κB

(Perez, et al., 2016).

En 2011, Tayrac y col. (de Tayrac, et al., 2013) desarrollaron un modelo

de riesgo en gliomas de alto grado basado en la expresión de cuatro genes.

Uno de esos genes se encuentra sobreexpresado en esta serie. Se trata de

HJURP, gen que codifica una chaperona indispensable para la regulación del

ciclo celular, formación de la cromatina centromérica (Foltz, et al., 2009) y

estabilidad cromosómica de las células cancerígenas inmortalizadas (T. Kato,

et al., 2007). En el trabajo de Tyrac y col. observaron que el incremento en el

nivel de expresión de este gen se asociaba con la progresión de los gliomas de

bajo a alto grado y a una peor supervivencia. Otra de sus funciones es la del

mantenimiento de mecanismos de reparación más eficientes que son cruciales

para que las células tumorales continúen proliferando sin colapsar debido a la

inestabilidad genómica masiva (Valente, et al., 2013).

Las células cancerígenas poseen un potencial replicativo ilimitado, por

tanto, el mantenimiento del ciclo celular es un factor clave en el desarrollo del

cáncer. El gen UBE2C actúa como factor esencial del complejo promotor de la

anafase y es necesario para la destrucción de las ciclinas mitóticas y para la

progresión del ciclo celular. Los niveles de expresión de este gen están

aumentados en muchos tumores sólidos, incluyendo los gliomas (Bredel, et al.,

2005; Donato, et al., 2008; Jiang, et al., 2008) y este aumento en la expresión,

al igual que el observado en este trabajo, se correlaciona con la agresividad del

tumor y una menor supervivencia (Hao, Zhang, & Cowell, 2012; R. Ma, et al.,

2016). Se ha postulado la incorporación de la IHQ de este gen en el

diagnóstico de los gliomas (Hao, et al., 2012).

Las histonas son componentes básicos del nucleosoma y tienen una

función central en la regulación, reparación y replicación del ADN. Están

ligadas al desarrollo del múltiples cánceres a través de alteraciones en sus

modificaciones post-traduccionales y en la maquinaria epigenética que controla

dichas modificaciones. Numerosos estudios han mejorado el conocimiento

sobre la asociación entre las enzimas que modifican las histonas,

204

Discusión

modificaciones post-traduccionales específicas de histonas y la tumorigénesis

(Suva, Riggi, & Bernstein, 2013). Uno de los procesos epigenéticos, como se

ha descrito en la introducción, es la acetilación de las histonas. Este

mecanismo de acetilación/desacetilación permite regular la transcripción de

diversos genes. Alteraciones en estos procesos pueden dar lugar, por ejemplo,

a la no transcripción de genes supresores de tumores y, por consiguiente, esto

podría dar lugar al desarrollo neoplásico (Esteller, 2007; Kim, 2014). Cuatro

genes que codifican para histonas se encuentran sobreexpresados en este

análisis: HIST1H3A, HIST2H3A, HIST2H3C e HIST1H1B, lo cual indicaría que

muchos procesos celulares están alterados en estos tumores.

La expresión de NTN1, al igual que en esta serie, se encuentra

aumentada en muchos tumores (Harter, et al., 2014), sin embargo no se

conoce su asociación con los gliomas. Se postula que la proteína codificada

por este gen está involucrada en la dirección de los axones y la migración

celular durante el desarrollo. La función de la barrera hematoencefálica se

activa por la influencia de factores secretados por los astrocitos. Durante la

respuesta neuroinflamatoria, la barrera hematoencefálica queda comprometida

provocando daño en el SNC. En 2015, Podjaski y col. identifican la expresión

de NTN1 como respuesta vascular a SHH derivado de los astrocitos, y ésta

promueve las propiedades autocrinas de la barrera hematoencefálica durante

la homeostasis y aumenta con la inflamación. NTN1 soporta la integridad de la

barrera a través de la regulación positiva de la expresión de proteínas de unión

endotelial (Podjaski, et al., 2015). Además, ejerce una función angiogénica, con

el incremento de la ramificación vascular y de la densidad de vasos

(Navankasattusas, et al., 2008; Wilson, et al., 2006), anti-inflamatoria

(Rosenberger, et al., 2009) y aumenta la proliferación endotelial. Todo esto

mejora los síntomas patológicos en condiciones de isquemia (Durrani, Haider,

Ahmed, Jiang, & Ashraf, 2012; Hoang, Liauw, Choi, Guzman, & Steinberg,

2009; Wilson, et al., 2006).

Otro de los genes implicados en la regulación de la síntesis de ADN y

progresión del ciclo celular (de Tayrac, et al., 2011) y que se encuentra

sobreexpresado en esta serie de tumores es el CENPF. Es necesario para la

205

Discusión

modificaciones post-traduccionales específicas de histonas y la tumorigénesis

(Suva, Riggi, & Bernstein, 2013). Uno de los procesos epigenéticos, como se

ha descrito en la introducción, es la acetilación de las histonas. Este

mecanismo de acetilación/desacetilación permite regular la transcripción de

diversos genes. Alteraciones en estos procesos pueden dar lugar, por ejemplo,

a la no transcripción de genes supresores de tumores y, por consiguiente, esto

podría dar lugar al desarrollo neoplásico (Esteller, 2007; Kim, 2014). Cuatro

genes que codifican para histonas se encuentran sobreexpresados en este

análisis: HIST1H3A, HIST2H3A, HIST2H3C e HIST1H1B, lo cual indicaría que

muchos procesos celulares están alterados en estos tumores.

La expresión de NTN1, al igual que en esta serie, se encuentra

aumentada en muchos tumores (Harter, et al., 2014), sin embargo no se

conoce su asociación con los gliomas. Se postula que la proteína codificada

por este gen está involucrada en la dirección de los axones y la migración

celular durante el desarrollo. La función de la barrera hematoencefálica se

activa por la influencia de factores secretados por los astrocitos. Durante la

respuesta neuroinflamatoria, la barrera hematoencefálica queda comprometida

provocando daño en el SNC. En 2015, Podjaski y col. identifican la expresión

de NTN1 como respuesta vascular a SHH derivado de los astrocitos, y ésta

promueve las propiedades autocrinas de la barrera hematoencefálica durante

la homeostasis y aumenta con la inflamación. NTN1 soporta la integridad de la

barrera a través de la regulación positiva de la expresión de proteínas de unión

endotelial (Podjaski, et al., 2015). Además, ejerce una función angiogénica, con

el incremento de la ramificación vascular y de la densidad de vasos

(Navankasattusas, et al., 2008; Wilson, et al., 2006), anti-inflamatoria

(Rosenberger, et al., 2009) y aumenta la proliferación endotelial. Todo esto

mejora los síntomas patológicos en condiciones de isquemia (Durrani, Haider,

Ahmed, Jiang, & Ashraf, 2012; Hoang, Liauw, Choi, Guzman, & Steinberg,

2009; Wilson, et al., 2006).

Otro de los genes implicados en la regulación de la síntesis de ADN y

progresión del ciclo celular (de Tayrac, et al., 2011) y que se encuentra

sobreexpresado en esta serie de tumores es el CENPF. Es necesario para la

Discusión

función del cinetocoro y segregación de los cromosomas en la mitosis, por lo

que su aumento de expresión en GBM que, como en otros tipos de cáncer

tiene un potenacial replicativo ilimitado, es esperable. Otros grupos han

observado un aumento de expresión de este gen en gliomas y, más

concretamente, un aumento conforme aumenta el grado de malignidad. Por

este motivo podría considerarse útil en el diagnóstico como biomarcador de

proliferación en tumores gliales (Korkolopoulou, et al., 2001; van den Boom, et

al., 2003). A su vez, participa en el reciclaje de la membrana plasmática a

través de su asociación con SNAP25, subunidad catalítica del complejo V1 de

la ATPasa vacuolar responsable de la acidificación de compartimentos

intracelulares e infraexpresado en los tumores analizados en este trabajo. Se

ha observado que tiene un papel en la regulación de los receptores de

glutamato y en la plasticidad sináptica (Selak, et al., 2009). Además, media la

neurosecreción a través de su participación en el complejo SNARE excitotóxico

y regulando el potencial de membrana y la entrada de calcio a través de su

interacción con los canales de potasio rectificadores tardíos (Ji, et al., 2002).

Por tanto, el producto codificado por SNAP25 es una de las proteínas

implicadas en el anclaje y fusión de las vesículas sinápticas en la membrana

plasmática de los terminales nerviosos (Bruce Alberts, 2004). No se ha

observado expresión de dicho gen en gliomas (www.proteinatlas.org), lo que

concuerda con estos resultados. Sin embargo, sí se ha establecido un aumento

de expresión de SNAP25 en carcinoma de pulmón de células pequeñas (Graff,

Castrop, Bauer, Höfler, & Gratzl, 2001). Otra subunidad catalítica del complejo

V1 de la ATPasa vacuolar es la proteína codificada por el gen ATP6V1G2,

también infraexpresada en esta serie.

Mientras que los procesos asociados a los genes que se encuentran con

una tasa de expresión alta están relacionados con la angiogénesis, ciclo

celular, respuesta inmune, respuesta inflamatoria y regulación positiva de

diferentes procesos de biosíntesis, entre otros, los procesos asociados a los

genes infraexpresados tienen relación con la transmisión sináptica, liberación

de neurotransmisores, actividad de los canales iónicos y transporte de iones.

206

Discusión

La mayoría de los genes cuya expresión se encuentra por debajo de la

del tejido cerebral normal, codifican proteínas que regulan, o forman parte de

diferentes canales iónicos. La expresión y actividad de estos canales regulan y

establecen determinadas etapas de la progresión del cáncer. Pueden contribuir

al fenotipo neoplásico controlando la proliferación celular y la apoptosis y

regulando la invasión y diseminación metastásica, así como estimulando la

angiogénesis, mediando en las interacciones célula-matriz y regulando la

motilidad celular. Muchos son los estudios que revelan que estos canales

iónicos podrían ser dianas farmacológicas prometedoras en oncología

(Arcangeli & Becchetti, 2015; Arcangeli, et al., 2009).

La proteína codificada por CACNA1B es una subunidad formadora de

poros de los canales de calcio dependientes de voltaje. Este gen está implicado

en la liberación de neurotransmisores por las neuronas y, en concreto, la

subunidad 1B está implicada en la migración de las neuronas inmaduras. Se

desconoce su implicación en el cáncer, lo que sí se ha observado en un estudio

llevado a cabo por Wang y col. (C. Y. Wang, Lai, Phan, Sun, & Lin, 2015), es

un aumento de su expresión en cáncer de mama y próstata, lo que no

concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo, ya que es un gen

infraexpresado en esta serie.

Por otra parte, CAMK2A (infraexpresado en estos tumores) codifica una

quinasa del SNC que participa en la potenciación a largo plazo, en la liberación

de neurotransmisores, en las sinapsis excitatorias y en la plasticidad sináptica.

En 2013, Sun y col., establecen que este gen regula la actividad de ASIC1

(canal iónico sensible a ácido), que se asocia con la habilidad de las células de

GBM para migrar (Sun, et al., 2013).

El neurotransmisor inhibitorio más importante del cerebro de vertebrados

en el GABA (Gamma-Aminobutyric acid). Dos componentes del receptor

heteropentamérico de este neurotransmisor se encuentran infraexpresados en

este análisis: GABRA1 y GABRG2. Se ha observado que conforme aumenta el

grado tumoral en gliomas, disminuye la expresión de estos receptores

(Poltronieri, D'Urso, Mezzolla, & D'Urso, 2013; Smits, et al., 2012). La expresión

207

Discusión

La mayoría de los genes cuya expresión se encuentra por debajo de la

del tejido cerebral normal, codifican proteínas que regulan, o forman parte de

diferentes canales iónicos. La expresión y actividad de estos canales regulan y

establecen determinadas etapas de la progresión del cáncer. Pueden contribuir

al fenotipo neoplásico controlando la proliferación celular y la apoptosis y

regulando la invasión y diseminación metastásica, así como estimulando la

angiogénesis, mediando en las interacciones célula-matriz y regulando la

motilidad celular. Muchos son los estudios que revelan que estos canales

iónicos podrían ser dianas farmacológicas prometedoras en oncología

(Arcangeli & Becchetti, 2015; Arcangeli, et al., 2009).

La proteína codificada por CACNA1B es una subunidad formadora de

poros de los canales de calcio dependientes de voltaje. Este gen está implicado

en la liberación de neurotransmisores por las neuronas y, en concreto, la

subunidad 1B está implicada en la migración de las neuronas inmaduras. Se

desconoce su implicación en el cáncer, lo que sí se ha observado en un estudio

llevado a cabo por Wang y col. (C. Y. Wang, Lai, Phan, Sun, & Lin, 2015), es

un aumento de su expresión en cáncer de mama y próstata, lo que no

concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo, ya que es un gen

infraexpresado en esta serie.

Por otra parte, CAMK2A (infraexpresado en estos tumores) codifica una

quinasa del SNC que participa en la potenciación a largo plazo, en la liberación

de neurotransmisores, en las sinapsis excitatorias y en la plasticidad sináptica.

En 2013, Sun y col., establecen que este gen regula la actividad de ASIC1

(canal iónico sensible a ácido), que se asocia con la habilidad de las células de

GBM para migrar (Sun, et al., 2013).

El neurotransmisor inhibitorio más importante del cerebro de vertebrados

en el GABA (Gamma-Aminobutyric acid). Dos componentes del receptor

heteropentamérico de este neurotransmisor se encuentran infraexpresados en

este análisis: GABRA1 y GABRG2. Se ha observado que conforme aumenta el

grado tumoral en gliomas, disminuye la expresión de estos receptores

(Poltronieri, D'Urso, Mezzolla, & D'Urso, 2013; Smits, et al., 2012). La expresión

Discusión

de estos receptores correlaciona inversamente con el ratio de proliferación de

los astrocitos en los astrocitomas, esto lleva a la hipótesis de que la

expresión/activación de los receptores de GABA pueden funcionar como

represores de la proliferación celular (Desrues, et al., 2012).

El gen MAL se considera un supresor tumoral en varios cánceres, por lo

que la infraexpresión observada en esta serie corroboraría su papel supresor.

La baja expresión se asocia con un aumento de metástasis en cáncer gástrico

y un peor pronóstico (Kurashige, et al., 2013). Esta disminución en la expresión

es debida a la hipermetilación del gen, evento común en cánceres esofágicos y

que se asocia con la progresión neoplásica (Jin, et al., 2013). Además, esta

hipermetilación se considera un marcador pronóstico en cáncer gástrico

(Buffart, et al., 2008).

Uno de los eventos afectados en los gliomas es la endocitosis/exocitosis

de vesículas sinápticas. Tanto SYT1, regulador de las interacciones entre la

membrana durante el tráfico de vesículas sinápticas en la zona activa de la

sinapsis, como SYT4, involucrado en la exocitosis dependiente de calcio de las

vesículas secretoras, presentan una baja expresión en las muestras

analizadas. SYT1 es considerado un oncogen en GBM (Nord, et al., 2009), sin

embargo, los resultados observados en este trabajo no apoyarían esta

hipótesis, pudiendo tener un papel supresor de tumores en GBM en

determinadas situaciones. El cáncer, a pesar de compartir ciertas

características comunes, es desencadenado por una gran variedad de

alteraciones genéticas y epigenéticas de los procesos celulares fundamentales,

lo que da lugar a que cada tumor sea diferente (Sacco, Coulson, Clague, &

Urbe, 2010). Otro caso en el que existe controversia acerca de su función en

los diferentes tipos de cáncer es UCHL1(Gu, et al., 2015). En condiciones

normales, se expresa específicamente en las neuronas y en las células del

sistema neuroendocrino difuso. Codifica una deubiquitinasa capaz de regular

vías relacionadas con el cáncer y la estabilidad de oncogenes. En condiciones

neoplásicas este gen puede encontrase sobre o infraexpresado, dependiendo

del tipo de tumor. Por ejemplo, varios estudios han demostrado un aumento de

su expresión en cáncer de pulmón, colon, gástrico, esofágico y páncreas (Hibi,

208

Discusión

et al., 1998; Hibi, et al., 1999; X. Liu, Zeng, Ma, & Wan, 2009; Takase, et al.,

2003; Tezel, Hibi, Nagasaka, & Nakao, 2000; Yamazaki, et al., 2002); mientras

que otros trabajos han determinado una baja expresión de este gen como

consecuencia de la metilación del mismo en tumores cerebrales, cáncer de

ovario, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer gástrico y en líneas

celulares de cáncer de páncreas (Kumagai, et al., 2009; Mandelker, et al.,

2005; Sato & Meltzer, 2006)

Los astrocitos están involucrados en la homeostasis del potasio. Este

equilibrio se pierde en los gliomas debido a la pérdida de expresión de ciertos

canales de la membrana de las células gliales (Olsen & Sontheimer, 2008). En

relación a este aspecto se encuentran los genes KCNC2 y KCNK1,

infraexpresados en esta serie. Se expresan en cerebro normal y son

necesarios para la generación del impulso nervioso. Forman parte de los

canales de potasio dependientes de voltaje, en concreto, KCNK1 está

implicado en la regulación del potencial de membrana en reposo de los

astrocitos y KCNC2 participa en el mantenimiento del potencial de acción.

Otros genes con una expresión disminuida en esta serie de tumores son

el PACSIN1, que participa en la reorganización de los microtúbulos del

citoesqueleto, en el transporte celular y en la endocitosis de las vesículas

sinápticas; el RYR2, componente de los canales de calcio; el SCN2B,

componente de los canales de sodio; el SLC8A2, expresado en cerebro pero

no en gliomas (Qu, et al., 2010) e implicado en el transporte de calcio el

acoplamiento de la contracción-excitación; el SLC30A3, que participa en la

acumulación de zinc en las vesículas; el HCN1, que en condiciones normales

se expresa en cerebro y se encarga de modular la excitabilidad así como de

conformar la actividad autónoma de las neuronas y el JPH4, gen específico del

cerebro cuya función es la de formar complejos que unen la membrana

plasmática con el retículo endoplasmático en células excitables.

GPR158 se encuentra altamente expresado en el cerebro (Orlandi, et al.,

2012). Se trata de un gen regulador de la función de RGS7 (miembro de la

familia R7 de reguladores de la señalización de proteínas G) en el SN (Orlandi,

209

Discusión

et al., 1998; Hibi, et al., 1999; X. Liu, Zeng, Ma, & Wan, 2009; Takase, et al.,

2003; Tezel, Hibi, Nagasaka, & Nakao, 2000; Yamazaki, et al., 2002); mientras

que otros trabajos han determinado una baja expresión de este gen como

consecuencia de la metilación del mismo en tumores cerebrales, cáncer de

ovario, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer gástrico y en líneas

celulares de cáncer de páncreas (Kumagai, et al., 2009; Mandelker, et al.,

2005; Sato & Meltzer, 2006)

Los astrocitos están involucrados en la homeostasis del potasio. Este

equilibrio se pierde en los gliomas debido a la pérdida de expresión de ciertos

canales de la membrana de las células gliales (Olsen & Sontheimer, 2008). En

relación a este aspecto se encuentran los genes KCNC2 y KCNK1,

infraexpresados en esta serie. Se expresan en cerebro normal y son

necesarios para la generación del impulso nervioso. Forman parte de los

canales de potasio dependientes de voltaje, en concreto, KCNK1 está

implicado en la regulación del potencial de membrana en reposo de los

astrocitos y KCNC2 participa en el mantenimiento del potencial de acción.

Otros genes con una expresión disminuida en esta serie de tumores son

el PACSIN1, que participa en la reorganización de los microtúbulos del

citoesqueleto, en el transporte celular y en la endocitosis de las vesículas

sinápticas; el RYR2, componente de los canales de calcio; el SCN2B,

componente de los canales de sodio; el SLC8A2, expresado en cerebro pero

no en gliomas (Qu, et al., 2010) e implicado en el transporte de calcio el

acoplamiento de la contracción-excitación; el SLC30A3, que participa en la

acumulación de zinc en las vesículas; el HCN1, que en condiciones normales

se expresa en cerebro y se encarga de modular la excitabilidad así como de

conformar la actividad autónoma de las neuronas y el JPH4, gen específico del

cerebro cuya función es la de formar complejos que unen la membrana

plasmática con el retículo endoplasmático en células excitables.

GPR158 se encuentra altamente expresado en el cerebro (Orlandi, et al.,

2012). Se trata de un gen regulador de la función de RGS7 (miembro de la

familia R7 de reguladores de la señalización de proteínas G) en el SN (Orlandi,

Discusión

et al., 2015), cuya función es la de regular diversos procesos fisiológicos

fundamentales como la visión, memoria, control motor y nocicepción

(Anderson, Posokhova, & Martemyanov, 2009; Cowan, He, & Wensel, 2001).

No hay estudios que asocien a este gen con los gliomas, sin embargo, sí se ha

observado un aumento de expresión del mismo en líneas celulares de cáncer

de próstata. Este aumento estimula la proliferación de las células y se asocia

con una peor supervivencia (Patel, et al., 2015). Como se ha mencionado en

varias ocasiones, el cáncer es una entidad heterogénea y diferente en cada

tejido, por tanto, podría ser previsible que este gen pudiera encontrarse

infraexpresado en gliomas mientras que en otros tumores, como en este caso

en cáncer de próstata, se encuentre sobreexpresado. No sólo existen

diferencias entre los diferentes tipos de tumores, si no que también pueden

darse diferencias entre tumores del mismo tipo. Este es el caso del gen

SPOCK1, cuyo papel en tejido normal es el mediar en las interacciones célula-

célula, célula-matriz, así como contribuir en varios mecanismos neuronales en

el SNC. Varios son los estudios en los que se ha observado un aumento de

expresión del mismo en gliomas y otros cánceres, como carcinoma urotelial (L.

J. Ma, et al., 2016), carcinoma esofágico de células escamosas (Song, et al.,

2015) y en cáncer de vesícula biliar, en el que actúa activando la vía PI3K/Akt

para bloquear la apoptosis y promover la proliferación y apoptosis (Shu, et al.,

2015). Tanto Yang y col. como Yu y col en 2016, observan un aumento de

expresión de este gen en gliomas. Esta sobreexpresión promueve la

proliferación, migración e invasión, así como inhibe la apoptosis de las células

neoplásicas mediante la activación de las vías PI3K/Akt y Wnt/β-catenina (J.

Yang, et al., 2016; F. Yu, et al., 2016), mediando la resistencia a la TMZ a

través de esta última vía activada. A pesar de que afirman en estos trabajos

que el silenciamiento de SPOCK1 tendría un efecto contrario en los gliomas, en

la presente serie este gen se encuentra infraexpresado.

La neurogénesis adulta desencadena la remodelación de los circuitos

neuronales a través de la incorporación de nuevas neuronas, sin embargo, se

ha demostrado que cuando se altera su regulación el SNC y sus progenitores

pueden dar lugar a la formación de tumores cerebrales como los gliomas

(Batista, et al., 2014). En general, estos tumores interfieren con las funciones

210

Discusión

normales del cerebro mediante la interrupción de la conectividad funcional de

las redes cerebrales dentro de las áreas cerebrales peritumorales y distantes

(Beaumont & Whittle, 2000). Ademas, en los gliomas la barrera

hematoencefálica está alterada, exponiendo al cerebro a los componentes del

suero de la sangre y a factores de crecimiento endotelial vascular (Buckingham

& Robel, 2013). Todo esto provoca un desequilibrio entre la excitación y la

inhibición del impulso nervioso, así como la desdifereciación de las neuronas,

promoviendo la progresión tumoral y dando lugar a los síntomas asociados a

estos tumores, como epilepsia y otros déficits neurológicos (Jovcevska, et al.,

2013; Pallud, Capelle, & Huberfeld, 2013).

Discusión

normales del cerebro mediante la interrupción de la conectividad funcional de

las redes cerebrales dentro de las áreas cerebrales peritumorales y distantes

(Beaumont & Whittle, 2000). Ademas, en los gliomas la barrera

hematoencefálica está alterada, exponiendo al cerebro a los componentes del

suero de la sangre y a factores de crecimiento endotelial vascular (Buckingham

& Robel, 2013). Todo esto provoca un desequilibrio entre la excitación y la

inhibición del impulso nervioso, así como la desdifereciación de las neuronas,

promoviendo la progresión tumoral y dando lugar a los síntomas asociados a

estos tumores, como epilepsia y otros déficits neurológicos (Jovcevska, et al.,

2013; Pallud, Capelle, & Huberfeld, 2013).

LIMITACIONES DEL ESTUDIO

213

Limitaciones del estudio

El presente trabajo tiene una serie de limitaciones que quedan recogidas

en los siguientes puntos:

1. Del total de la serie estudiada en el presente trabajo (n=235), no se

pudieron analizar todas ellas para cada uno de los biomarcadores

(metilación en MGMT, G-CIMP…) debido a la falta de material disponible

o la mala calidad de alguna de las muestras. En algunos casos, la n es

insuficiente para poder establecer asociaciones y algunos datos clínicos

se han perdido.

2. Como se ha mencionado anteriormente, es un estudio preliminar de

expresión a gran escala que ha de validarse por otras técnicas. Se trata

de una prueba de concepto que, como tal, presenta esta serie de

limitaciones: tamaño muestral bajo (n=9), número de genes analizados

bajo (12954 genes), falta de tejido normal de cada una de las muestras

(el pool de tejido de cerebro normal podría mejorarse de esta forma).

CONCLUSIONES

217

Conclusiones

1. La hipermetilación en MGMT y las mutaciones en IDH son

biomarcadores de buen pronóstico. Además, la metilación en MGMT es

un biomarcador predictivo de respuesta al tratamiento en gliomas.

2. El estatus CIMP+ es un marcador de buen pronóstico en gliomas.

3. La hipermetilación en SOCS1 podría ser un marcador de fenotipo

hipermetilador de gliomas.

4. La implicación del HCMV en gliomas es irrelevante.

5. La edad es un marcador pronóstico independiente. Los pacientes más

jóvenes tienen mejor pronóstico.

6. Los tumores con IDH mutado, MGMT metilado, SOCS1 metilado, TP53

mutado y un índice de proliferación (ki67) bajo son los que van a tener

un mejor pronóstico.

7. El perfil definido como pacientes con edades iguales o por debajo de la

mediana y cuyos tumores presentan metilación en SOCS1, determina un

mejor pronóstico en los gliomas. Dentro del subgrupo de GBM de larga

supervivencia (>36 meses) los pacientes con este perfil presentan una

mayor supervivencia.

8. SOCS1 tiene utilidad potencial como marcador pronóstico en gliomas.

9. Las funciones moleculares sobreexpresadas en los tumores gliales están

relacionadas con la carcinogénesis, como angiogénesis, proliferación y

regulación del ciclo celular, respuesta inmune e inflamatoria y regulación

de la apoptosis, mientras que las funciones moleculares infraexpresadas

están involucradas en procesos de desdiferenciación celular del sistema

nervioso, como sinapsis, neurotransmisión y neurogénesis, entre otras.

Bibliografía

BIBLIOGRAFÍA

221

Bibliografía

Abrahams, A., Parker, M. I., & Prince, S. (2010). The T-box transcription factor Tbx2: its role in development and possible implication in cancer. IUBMB Life, 62(2), 92-102.

Ahmed, R., Oborski, M. J., Hwang, M., Lieberman, F. S., & Mountz, J. M. (2014). Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res, 6, 149-170.

Aldape, K., Burger, P. C., & Perry, A. (2007). Clinicopathologic aspects of 1p/19q loss and the diagnosis of oligodendroglioma. Arch Pathol Lab Med, 131(2), 242-251.

Amit, I., Citri, A., Shay, T., Lu, Y., Katz, M., Zhang, F., et al. (2007). A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nat Genet, 39(4), 503-512.

Andersen, B. M., Xia, J., Epstein, A. L., Ohlfest, J. R., Chen, W., Blazar, B. R., et al. (2016). Monomeric annexin A2 is an oxygen-regulated toll-like receptor 2 ligand and adjuvant. J Immunother Cancer, 4, 11.

Anderson, G. R., Posokhova, E., & Martemyanov, K. A. (2009). The R7 RGS protein family: multi-subunit regulators of neuronal G protein signaling. Cell Biochem Biophys, 54(1-3), 33-46.

Appin, C. L., & Brat, D. J. (2014). Molecular genetics of gliomas. Cancer J, 20(1), 66-72.

Arcangeli, A., & Becchetti, A. (2015). Novel perspectives in cancer therapy: Targeting ion channels. Drug Resist Updat, 21-22, 11-19.

Arcangeli, A., Crociani, O., Lastraioli, E., Masi, A., Pillozzi, S., & Becchetti, A. (2009). Targeting ion channels in cancer: a novel frontier in antineoplastic therapy. Curr Med Chem, 16(1), 66-93.

Arshad, H., Ahmad, Z., & Hasan, S. H. (2010). Gliomas: correlation of histologic grade, Ki67 and p53 expression with patient survival. Asian Pac J Cancer Prev, 11(6), 1637-1640.

Balss, J., Meyer, J., Mueller, W., Korshunov, A., Hartmann, C., & von Deimling, A. (2008). Analysis of the IDH1 codon 132 mutation in brain tumors. Acta Neuropathol, 116(6), 597-602.

Batista, C. M., Mariano, E. D., Barbosa, B. J., Morgalla, M., Marie, S. K., Teixeira, M. J., et al. (2014). Adult neurogenesis and glial oncogenesis: when the process fails. Biomed Res Int, 2014, 438639.

222

Bibliografía

Baumgarten, P., Michaelis, M., Rothweiler, F., Starzetz, T., Rabenau, H. F., Berger, A., et al. (2014). Human cytomegalovirus infection in tumor cells of the nervous system is not detectable with standardized pathologico-virological diagnostics. Neuro Oncol, 16(11), 1469-1477.

Bauskin, A. R., Brown, D. A., Kuffner, T., Johnen, H., Luo, X. W., Hunter, M., et al. (2006). Role of macrophage inhibitory cytokine-1 in tumorigenesis and diagnosis of cancer. Cancer Res, 66(10), 4983-4986.

Baylin, S. B. (2005). DNA methylation and gene silencing in cancer. Nat Clin Pract Oncol, 2 Suppl 1, S4-11.

Baylin, S. B. (2008). Stem cells, cancer, and epigenetics.

Beaumont, A., & Whittle, I. R. (2000). The pathogenesis of tumour associated epilepsy. Acta Neurochir (Wien), 142(1), 1-15.

Bhattacharjee, B., Renzette, N., & Kowalik, T. F. (2012). Genetic analysis of cytomegalovirus in malignant gliomas. J Virol, 86(12), 6815-6824.

Bleeker, F. E., Atai, N. A., Lamba, S., Jonker, A., Rijkeboer, D., Bosch, K. S., et al. (2010). The prognostic IDH1( R132 ) mutation is associated with reduced NADP+-dependent IDH activity in glioblastoma. Acta Neuropathol, 119(4), 487-494.

Blesa, D., Mollejo, M., Ruano, Y., de Lope, A. R., Fiano, C., Ribalta, T., et al. (2009). Novel genomic alterations and mechanisms associated with tumor progression in oligodendroglioma and mixed oligoastrocytoma. J Neuropathol Exp Neurol, 68(3), 274-285.

Boeckh, M., & Geballe, A. P. (2011). Cytomegalovirus: pathogen, paradigm, and puzzle. J Clin Invest, 121(5), 1673-1680.

Bommarito, A., Richiusa, P., Carissimi, E., Pizzolanti, G., Rodolico, V., Zito, G., et al. (2011). BRAFV600E mutation, TIMP-1 upregulation, and NF-kappaB activation: closing the loop on the papillary thyroid cancer trilogy. Endocr Relat Cancer, 18(6), 669-685.

Boots-Sprenger, S. H., Sijben, A., Rijntjes, J., Tops, B. B., Idema, A. J., Rivera, A. L., et al. (2013). Significance of complete 1p/19q co-deletion, IDH1 mutation and MGMT promoter methylation in gliomas: use with caution. Mod Pathol, 26(7), 922-929.

Bottone, F. G., Jr., Baek, S. J., Nixon, J. B., & Eling, T. E. (2002). Diallyl disulfide (DADS) induces the antitumorigenic NSAID-activated gene (NAG-1) by a p53-dependent mechanism in human colorectal HCT 116 cells. J Nutr, 132(4), 773-778.

223

Bibliografía

Baumgarten, P., Michaelis, M., Rothweiler, F., Starzetz, T., Rabenau, H. F., Berger, A., et al. (2014). Human cytomegalovirus infection in tumor cells of the nervous system is not detectable with standardized pathologico-virological diagnostics. Neuro Oncol, 16(11), 1469-1477.

Bauskin, A. R., Brown, D. A., Kuffner, T., Johnen, H., Luo, X. W., Hunter, M., et al. (2006). Role of macrophage inhibitory cytokine-1 in tumorigenesis and diagnosis of cancer. Cancer Res, 66(10), 4983-4986.

Baylin, S. B. (2005). DNA methylation and gene silencing in cancer. Nat Clin Pract Oncol, 2 Suppl 1, S4-11.

Baylin, S. B. (2008). Stem cells, cancer, and epigenetics.

Beaumont, A., & Whittle, I. R. (2000). The pathogenesis of tumour associated epilepsy. Acta Neurochir (Wien), 142(1), 1-15.

Bhattacharjee, B., Renzette, N., & Kowalik, T. F. (2012). Genetic analysis of cytomegalovirus in malignant gliomas. J Virol, 86(12), 6815-6824.

Bleeker, F. E., Atai, N. A., Lamba, S., Jonker, A., Rijkeboer, D., Bosch, K. S., et al. (2010). The prognostic IDH1( R132 ) mutation is associated with reduced NADP+-dependent IDH activity in glioblastoma. Acta Neuropathol, 119(4), 487-494.

Blesa, D., Mollejo, M., Ruano, Y., de Lope, A. R., Fiano, C., Ribalta, T., et al. (2009). Novel genomic alterations and mechanisms associated with tumor progression in oligodendroglioma and mixed oligoastrocytoma. J Neuropathol Exp Neurol, 68(3), 274-285.

Boeckh, M., & Geballe, A. P. (2011). Cytomegalovirus: pathogen, paradigm, and puzzle. J Clin Invest, 121(5), 1673-1680.

Bommarito, A., Richiusa, P., Carissimi, E., Pizzolanti, G., Rodolico, V., Zito, G., et al. (2011). BRAFV600E mutation, TIMP-1 upregulation, and NF-kappaB activation: closing the loop on the papillary thyroid cancer trilogy. Endocr Relat Cancer, 18(6), 669-685.

Boots-Sprenger, S. H., Sijben, A., Rijntjes, J., Tops, B. B., Idema, A. J., Rivera, A. L., et al. (2013). Significance of complete 1p/19q co-deletion, IDH1 mutation and MGMT promoter methylation in gliomas: use with caution. Mod Pathol, 26(7), 922-929.

Bottone, F. G., Jr., Baek, S. J., Nixon, J. B., & Eling, T. E. (2002). Diallyl disulfide (DADS) induces the antitumorigenic NSAID-activated gene (NAG-1) by a p53-dependent mechanism in human colorectal HCT 116 cells. J Nutr, 132(4), 773-778.

Bibliografía

Brabender, J., Usadel, H., Metzger, R., Schneider, P. M., Park, J., Salonga, D., et al. (2003). Quantitative O(6)-methylguanine DNA methyltransferase methylation analysis in curatively resected non-small cell lung cancer: associations with clinical outcome. Clin Cancer Res, 9(1), 223-227.

Brat, D. J., Verhaak, R. G., Aldape, K. D., Yung, W. K., Salama, S. R., Cooper, L. A., et al. (2015). Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. N Engl J Med, 372(26), 2481-2498.

Bredel, M., Bredel, C., Juric, D., Harsh, G. R., Vogel, H., Recht, L. D., et al. (2005). Functional network analysis reveals extended gliomagenesis pathway maps and three novel MYC-interacting genes in human gliomas. Cancer Res, 65(19), 8679-8689.

Brell, M., Tortosa, A., Verger, E., Gil, J. M., Vinolas, N., Villa, S., et al. (2005). Prognostic significance of O6-methylguanine-DNA methyltransferase determined by promoter hypermethylation and immunohistochemical expression in anaplastic gliomas. Clin Cancer Res, 11(14), 5167-5174.

Brookes, P., & Lawley, P. D. (1960). The reaction of mustard gas with nucleic acids in vitro and in vivo. Biochemical Journal, 77(3), 478-484.

Bruce Alberts, A. J., Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter (2004). Biología Molecular de la célula (Cuarta ed.).

Buckingham, S. C., & Robel, S. (2013). Glutamate and tumor-associated epilepsy: glial cell dysfunction in the peritumoral environment. Neurochem Int, 63(7), 696-701.

Buffart, T. E., Overmeer, R. M., Steenbergen, R. D., Tijssen, M., van Grieken, N. C., Snijders, P. J., et al. (2008). MAL promoter hypermethylation as a novel prognostic marker in gastric cancer. Br J Cancer, 99(11), 1802-1807.

Burger, P. C., Shibata, T., & Kleihues, P. (1986). The Use of the Monoclonal Antibody Ki-67 in the Identification of Proliferating Cells: Application to Surgical Neuropathology. The American Journal of Surgical Pathology, 10(9), 611-617.

Cabrita, M. A., & Christofori, G. (2008). Sprouty proteins, masterminds of receptor tyrosine kinase signaling. Angiogenesis, 11(1), 53-62.

Cairncross, G., & Jenkins, R. (2008). Gliomas with 1p/19q codeletion: a.k.a. oligodendroglioma. Cancer J, 14(6), 352-357.

Cairncross, J. G., Ueki, K., Zlatescu, M. C., Lisle, D. K., Finkelstein, D. M., Hammond, R. R., et al. (1998). Specific genetic predictors of

224

Bibliografía

chemotherapeutic response and survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas. J Natl Cancer Inst, 90(19), 1473-1479.

Cao, V. T., Jung, T. Y., Jung, S., Jin, S. G., Moon, K. S., Kim, I. Y., et al. (2009). The correlation and prognostic significance of MGMT promoter methylation and MGMT protein in glioblastomas. Neurosurgery, 65(5), 866-875; discussion 875.

Capper, D., Zentgraf, H., Balss, J., Hartmann, C., & von Deimling, A. (2009). Monoclonal antibody specific for IDH1 R132H mutation. Acta Neuropathol, 118(5), 599-601.

Carpenter, R. L., Paw, I., Zhu, H., Sirkisoon, S., Xing, F., Watabe, K., et al. (2015). The gain-of-function GLI1 transcription factor TGLI1 enhances expression of VEGF-C and TEM7 to promote glioblastoma angiogenesis. Oncotarget, 6(26), 22653-22665.

Cartron, P. F., Petit, E., Bellot, G., Oliver, L., & Vallette, F. M. (2014). Metaxins 1 and 2, two proteins of the mitochondrial protein sorting and assembly machinery, are essential for Bak activation during TNF alpha triggered apoptosis. Cell Signal, 26(9), 1928-1934.

Cecener, G., Tunca, B., Egeli, U., Bekar, A., Tezcan, G., Erturk, E., et al. (2012). The promoter hypermethylation status of GATA6, MGMT, and FHIT in glioblastoma. Cell Mol Neurobiol, 32(2), 237-244.

Cinatl, J., Jr., Cinatl, J., Vogel, J. U., Rabenau, H., Kornhuber, B., & Doerr, H. W. (1996). Modulatory effects of human cytomegalovirus infection on malignant properties of cancer cells. Intervirology, 39(4), 259-269.

Cobbs, C. S. (2011). Evolving evidence implicates cytomegalovirus as a promoter of malignant glioma pathogenesis. Herpesviridae, 2(1), 10.

Cobbs, C. S., Harkins, L., Samanta, M., Gillespie, G. Y., Bharara, S., King, P. H., et al. (2002). Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer Res, 62(12), 3347-3350.

Cobbs, C. S., Soroceanu, L., Denham, S., Zhang, W., & Kraus, M. H. (2008). Modulation of oncogenic phenotype in human glioma cells by cytomegalovirus IE1-mediated mitogenicity. Cancer Res, 68(3), 724-730.

Colotta, F., Allavena, P., Sica, A., Garlanda, C., & Mantovani, A. (2009). Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis, 30(7), 1073-1081.

Collins, V. P. (2004). Brain tumours: classification and genes. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75 Suppl 2, ii2-11.

225

Bibliografía

chemotherapeutic response and survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas. J Natl Cancer Inst, 90(19), 1473-1479.

Cao, V. T., Jung, T. Y., Jung, S., Jin, S. G., Moon, K. S., Kim, I. Y., et al. (2009). The correlation and prognostic significance of MGMT promoter methylation and MGMT protein in glioblastomas. Neurosurgery, 65(5), 866-875; discussion 875.

Capper, D., Zentgraf, H., Balss, J., Hartmann, C., & von Deimling, A. (2009). Monoclonal antibody specific for IDH1 R132H mutation. Acta Neuropathol, 118(5), 599-601.

Carpenter, R. L., Paw, I., Zhu, H., Sirkisoon, S., Xing, F., Watabe, K., et al. (2015). The gain-of-function GLI1 transcription factor TGLI1 enhances expression of VEGF-C and TEM7 to promote glioblastoma angiogenesis. Oncotarget, 6(26), 22653-22665.

Cartron, P. F., Petit, E., Bellot, G., Oliver, L., & Vallette, F. M. (2014). Metaxins 1 and 2, two proteins of the mitochondrial protein sorting and assembly machinery, are essential for Bak activation during TNF alpha triggered apoptosis. Cell Signal, 26(9), 1928-1934.

Cecener, G., Tunca, B., Egeli, U., Bekar, A., Tezcan, G., Erturk, E., et al. (2012). The promoter hypermethylation status of GATA6, MGMT, and FHIT in glioblastoma. Cell Mol Neurobiol, 32(2), 237-244.

Cinatl, J., Jr., Cinatl, J., Vogel, J. U., Rabenau, H., Kornhuber, B., & Doerr, H. W. (1996). Modulatory effects of human cytomegalovirus infection on malignant properties of cancer cells. Intervirology, 39(4), 259-269.

Cobbs, C. S. (2011). Evolving evidence implicates cytomegalovirus as a promoter of malignant glioma pathogenesis. Herpesviridae, 2(1), 10.

Cobbs, C. S., Harkins, L., Samanta, M., Gillespie, G. Y., Bharara, S., King, P. H., et al. (2002). Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer Res, 62(12), 3347-3350.

Cobbs, C. S., Soroceanu, L., Denham, S., Zhang, W., & Kraus, M. H. (2008). Modulation of oncogenic phenotype in human glioma cells by cytomegalovirus IE1-mediated mitogenicity. Cancer Res, 68(3), 724-730.

Colotta, F., Allavena, P., Sica, A., Garlanda, C., & Mantovani, A. (2009). Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis, 30(7), 1073-1081.

Collins, V. P. (2004). Brain tumours: classification and genes. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75 Suppl 2, ii2-11.

Bibliografía

Coons, S. W., Johnson, P. C., Scheithauer, B. W., Yates, A. J., & Pearl, D. K. (1997). Improving diagnostic accuracy and interobserver concordance in the classification and grading of primary gliomas. Cancer, 79(7), 1381-1393.

Costello, J. F., Futscher, B. W., Kroes, R. A., & Pieper, R. O. (1994). Methylation-related chromatin structure is associated with exclusion of transcription factors from and suppressed expression of the O-6-methylguanine DNA methyltransferase gene in human glioma cell lines. Mol Cell Biol, 14(10), 6515-6521.

Coussens, L. M., Fingleton, B., & Matrisian, L. M. (2002). Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science, 295(5564), 2387-2392.

Cowan, C. W., He, W., & Wensel, T. G. (2001). RGS proteins: lessons from the RGS9 subfamily. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 65, 341-359.

Cunningham, J. M., Kimmel, D. W., Scheithauer, B. W., O'Fallon, J. R., Novotny, P. J., & Jenkins, R. B. (1997). Analysis of proliferation markers and p53 expression in gliomas of astrocytic origin: relationships and prognostic value. J Neurosurg, 86(1), 121-130.

Chakravarti, A., Dicker, A., & Mehta, M. (2004). The contribution of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathway to radioresistance in human gliomas: a review of preclinical and correlative clinical data. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 58(3), 927-931.

Chakravarti, A., Noll, E., Black, P. M., Finkelstein, D. F., Finkelstein, D. M., Dyson, N. J., et al. (2002). Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas. J Clin Oncol, 20(4), 1063-1068.

Cheng, S. X., Tu, Y., & Zhang, S. (2013). FoxM1 promotes glioma cells progression by up-regulating Anxa1 expression. PLoS One, 8(8), e72376.

Choi, C., Ganji, S. K., DeBerardinis, R. J., Hatanpaa, K. J., Rakheja, D., Kovacs, Z., et al. (2012). 2-hydroxyglutarate detection by magnetic resonance spectroscopy in IDH-mutated glioma patients. Nature medicine, 18(4), 624-629.

Christensen, B. C., Smith, A. A., Zheng, S., Koestler, D. C., Houseman, E. A., Marsit, C. J., et al. (2011). DNA methylation, isocitrate dehydrogenase mutation, and survival in glioma. J Natl Cancer Inst, 103(2), 143-153.

226

Bibliografía

Danam, R. P., Howell, S. R., Brent, T. P., & Harris, L. C. (2005). Epigenetic regulation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene expression by histone acetylation and methyl-CpG binding proteins. Mol Cancer Ther, 4(1), 61-69.

Dang, L., White, D. W., Gross, S., Bennett, B. D., Bittinger, M. A., Driggers, E. M., et al. (2009). Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature, 462(7274), 739-744.

De Palma, M., & Hanahan, D. (2012). The biology of personalized cancer medicine: facing individual complexities underlying hallmark capabilities. Mol Oncol, 6(2), 111-127.

De Sepulveda, P., Okkenhaug, K., Rose, J. L., Hawley, R. G., Dubreuil, P., & Rottapel, R. (1999). Socs1 binds to multiple signalling proteins and suppresses steel factor-dependent proliferation. The EMBO Journal, 18(4), 904-915.

de Tayrac, M., Aubry, M., Saikali, S., Etcheverry, A., Surbled, C., Guenot, F., et al. (2011). A 4-gene signature associated with clinical outcome in high-grade gliomas. Clin Cancer Res, 17(2), 317-327.

de Tayrac, M., Saikali, S., Aubry, M., Bellaud, P., Boniface, R., Quillien, V., et al. (2013). Prognostic significance of EDN/RB, HJURP, p60/CAF-1 and PDLI4, four new markers in high-grade gliomas. PLoS One, 8(9), e73332.

Demple, B., Sedgwick, B., Robins, P., Totty, N., Waterfield, M. D., & Lindahl, T. (1985). Active site and complete sequence of the suicidal methyltransferase that counters alkylation mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 82(9), 2688-2692.

Desrues, L., Lefebvre, T., Lecointre, C., Schouft, M. T., Leprince, J., Compere, V., et al. (2012). Down-regulation of GABA(A) receptor via promiscuity with the vasoactive peptide urotensin II receptor. Potential involvement in astrocyte plasticity. PLoS One, 7(5), e36319.

Dey, M., Ahmed, A. U., & Lesniak, M. S. (2015). Cytomegalovirus and glioma: putting the cart before the horse. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 86(2), 191-199.

Ding, D., Han, S., Wang, Z., Guo, Z., & Wu, A. (2014). Does the existence of HCMV components predict poor prognosis in glioma? J Neurooncol, 116(3), 515-522.

Doi, A., Park, I. H., Wen, B., Murakami, P., Aryee, M. J., Irizarry, R., et al. (2009). Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island

227

Bibliografía

Danam, R. P., Howell, S. R., Brent, T. P., & Harris, L. C. (2005). Epigenetic regulation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene expression by histone acetylation and methyl-CpG binding proteins. Mol Cancer Ther, 4(1), 61-69.

Dang, L., White, D. W., Gross, S., Bennett, B. D., Bittinger, M. A., Driggers, E. M., et al. (2009). Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature, 462(7274), 739-744.

De Palma, M., & Hanahan, D. (2012). The biology of personalized cancer medicine: facing individual complexities underlying hallmark capabilities. Mol Oncol, 6(2), 111-127.

De Sepulveda, P., Okkenhaug, K., Rose, J. L., Hawley, R. G., Dubreuil, P., & Rottapel, R. (1999). Socs1 binds to multiple signalling proteins and suppresses steel factor-dependent proliferation. The EMBO Journal, 18(4), 904-915.

de Tayrac, M., Aubry, M., Saikali, S., Etcheverry, A., Surbled, C., Guenot, F., et al. (2011). A 4-gene signature associated with clinical outcome in high-grade gliomas. Clin Cancer Res, 17(2), 317-327.

de Tayrac, M., Saikali, S., Aubry, M., Bellaud, P., Boniface, R., Quillien, V., et al. (2013). Prognostic significance of EDN/RB, HJURP, p60/CAF-1 and PDLI4, four new markers in high-grade gliomas. PLoS One, 8(9), e73332.

Demple, B., Sedgwick, B., Robins, P., Totty, N., Waterfield, M. D., & Lindahl, T. (1985). Active site and complete sequence of the suicidal methyltransferase that counters alkylation mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 82(9), 2688-2692.

Desrues, L., Lefebvre, T., Lecointre, C., Schouft, M. T., Leprince, J., Compere, V., et al. (2012). Down-regulation of GABA(A) receptor via promiscuity with the vasoactive peptide urotensin II receptor. Potential involvement in astrocyte plasticity. PLoS One, 7(5), e36319.

Dey, M., Ahmed, A. U., & Lesniak, M. S. (2015). Cytomegalovirus and glioma: putting the cart before the horse. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 86(2), 191-199.

Ding, D., Han, S., Wang, Z., Guo, Z., & Wu, A. (2014). Does the existence of HCMV components predict poor prognosis in glioma? J Neurooncol, 116(3), 515-522.

Doi, A., Park, I. H., Wen, B., Murakami, P., Aryee, M. J., Irizarry, R., et al. (2009). Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island

Bibliografía

shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nat Genet, 41(12), 1350-1353.

Donato, G., Iofrida, G., Lavano, A., Volpentesta, G., Signorelli, F., Pallante, P. L., et al. (2008). Analysis of UbcH10 expression represents a useful tool for the diagnosis and therapy of astrocytic tumors. Clin Neuropathol, 27(4), 219-223.

Durrani, S., Haider, K. H., Ahmed, R. P., Jiang, S., & Ashraf, M. (2012). Cytoprotective and proangiogenic activity of ex-vivo netrin-1 transgene overexpression protects the heart against ischemia/reperfusion injury. Stem Cells Dev, 21(10), 1769-1778.

Dziurzynski, K., Chang, S. M., Heimberger, A. B., Kalejta, R. F., McGregor Dallas, S. R., Smit, M., et al. (2012). Consensus on the role of human cytomegalovirus in glioblastoma. Neuro Oncol, 14(3), 246-255.

Eads, C. A., Danenberg, K. D., Kawakami, K., Saltz, L. B., Blake, C., Shibata, D., et al. (2000). MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res, 28(8), E32.

Emery, B., Merson, T. D., Snell, C., Young, K. M., Ernst, M., & Kilpatrick, T. J. (2006). SOCS3 negatively regulates LIF signaling in neural precursor cells. Mol Cell Neurosci, 31(4), 739-747.

Erpolat, O. P., Gocun, P. U., Akmansu, M., Ozgun, G., & Akyol, G. (2013). Hypoxia-related molecules HIF-1alpha, CA9, and osteopontin : predictors of survival in patients with high-grade glioma. Strahlenther Onkol, 189(2), 147-154.

Esteller, M. (2007). Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nat Rev Genet, 8(4), 286-298.

Esteller, M. (2008). Epigenetics in cancer. N Engl J Med, 358(11), 1148-1159.

Esteller, M., Garcia-Foncillas, J., Andion, E., Goodman, S. N., Hidalgo, O. F., Vanaclocha, V., et al. (2000). Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. N Engl J Med, 343(19), 1350-1354.

Esteller, M., & Herman, J. G. (2004). Generating mutations but providing chemosensitivity: the role of O6-methylguanine DNA methyltransferase in human cancer. Oncogene, 23(1), 1-8.

Etoh, T., Kanai, Y., Ushijima, S., Nakagawa, T., Nakanishi, Y., Sasako, M., et al. (2004). Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression correlates significantly with poorer tumor differentiation and

228

Bibliografía

frequent DNA hypermethylation of multiple CpG islands in gastric cancers. Am J Pathol, 164(2), 689-699.

Everhard, S., Tost, J., El Abdalaoui, H., Criniere, E., Busato, F., Marie, Y., et al. (2009). Identification of regions correlating MGMT promoter methylation and gene expression in glioblastomas. Neuro Oncol, 11(4), 348-356.

Fan, C. H., Liu, W. L., Cao, H., Wen, C., Chen, L., & Jiang, G. (2013). O6-methylguanine DNA methyltransferase as a promising target for the treatment of temozolomide-resistant gliomas. Cell Death Dis, 4, e876.

Feng, X., Szulzewsky, F., Yerevanian, A., Chen, Z., Heinzmann, D., Rasmussen, R. D., et al. (2015). Loss of CX3CR1 increases accumulation of inflammatory monocytes and promotes gliomagenesis. Oncotarget, 6(17), 15077-15094.

Foltz, D. R., Jansen, L. E., Bailey, A. O., Yates, J. R., 3rd, Bassett, E. A., Wood, S., et al. (2009). Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell, 137(3), 472-484.

Fonseca, R. F., Kawamura, M. T., Oliveira, J. A., Teixeira, A., Alves, G., & Carvalho Mda, G. (2012). The prevalence of human cytomegalovirus DNA in gliomas of Brazilian patients. Mem Inst Oswaldo Cruz, 107(7), 953-954.

Foote, R. S., Mitra, S., & Pal, B. C. (1980). Demethylation of O6-methylguanine in a synthetic DNA polymer by an inducible activity in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun, 97(2), 654-659.

Franco-Hernandez, C., Martinez-Glez, V., & Rey, J. A. (2007). [Biology molecular of glioblastomas]. Neurocirugia (Astur), 18(5), 373-382.

Franco-Hernandez, C., Martinez-Glez, V., Torres-Martin, M., de Campos, J. M., Isla, A., Vaquero, J., et al. (2009). [Identification of genetic alterations by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis in oligodendrogliomas]. Neurocirugia (Astur), 20(2), 117-123.

Friedmann-Morvinski, D., Narasimamurthy, R., Xia, Y., Myskiw, C., Soda, Y., & Verma, I. M. (2016). Targeting NF-kappaB in glioblastoma: A therapeutic approach. Sci Adv, 2(1), e1501292.

Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W., et al. (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A, 89(5), 1827-1831.

Gliomas del Encéfalo. (2008). Revista argentina de neurocirugía, 22, 0-0.

229

Bibliografía

frequent DNA hypermethylation of multiple CpG islands in gastric cancers. Am J Pathol, 164(2), 689-699.

Everhard, S., Tost, J., El Abdalaoui, H., Criniere, E., Busato, F., Marie, Y., et al. (2009). Identification of regions correlating MGMT promoter methylation and gene expression in glioblastomas. Neuro Oncol, 11(4), 348-356.

Fan, C. H., Liu, W. L., Cao, H., Wen, C., Chen, L., & Jiang, G. (2013). O6-methylguanine DNA methyltransferase as a promising target for the treatment of temozolomide-resistant gliomas. Cell Death Dis, 4, e876.

Feng, X., Szulzewsky, F., Yerevanian, A., Chen, Z., Heinzmann, D., Rasmussen, R. D., et al. (2015). Loss of CX3CR1 increases accumulation of inflammatory monocytes and promotes gliomagenesis. Oncotarget, 6(17), 15077-15094.

Foltz, D. R., Jansen, L. E., Bailey, A. O., Yates, J. R., 3rd, Bassett, E. A., Wood, S., et al. (2009). Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell, 137(3), 472-484.

Fonseca, R. F., Kawamura, M. T., Oliveira, J. A., Teixeira, A., Alves, G., & Carvalho Mda, G. (2012). The prevalence of human cytomegalovirus DNA in gliomas of Brazilian patients. Mem Inst Oswaldo Cruz, 107(7), 953-954.

Foote, R. S., Mitra, S., & Pal, B. C. (1980). Demethylation of O6-methylguanine in a synthetic DNA polymer by an inducible activity in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun, 97(2), 654-659.

Franco-Hernandez, C., Martinez-Glez, V., & Rey, J. A. (2007). [Biology molecular of glioblastomas]. Neurocirugia (Astur), 18(5), 373-382.

Franco-Hernandez, C., Martinez-Glez, V., Torres-Martin, M., de Campos, J. M., Isla, A., Vaquero, J., et al. (2009). [Identification of genetic alterations by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis in oligodendrogliomas]. Neurocirugia (Astur), 20(2), 117-123.

Friedmann-Morvinski, D., Narasimamurthy, R., Xia, Y., Myskiw, C., Soda, Y., & Verma, I. M. (2016). Targeting NF-kappaB in glioblastoma: A therapeutic approach. Sci Adv, 2(1), e1501292.

Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W., et al. (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A, 89(5), 1827-1831.

Gliomas del Encéfalo. (2008). Revista argentina de neurocirugía, 22, 0-0.

Bibliografía

Gonda, D. D., Cheung, V. J., Muller, K. A., Goyal, A., Carter, B. S., & Chen, C. C. (2014). The Cancer Genome Atlas expression profiles of low-grade gliomas. Neurosurg Focus, 36(4), E23.

Gong, X., Schwartz, P. H., Linskey, M. E., & Bota, D. A. (2011). Neural stem/progenitors and glioma stem-like cells have differential sensitivity to chemotherapy. Neurology, 76(13), 1126-1134.

González-Gómez, P., Anselmo, N. P., & Mira, H. (2014). BMPs as Therapeutic Targets and Biomarkers in Astrocytic Glioma. BioMed Research International, 2014, 549742.

Goth, R., & Rajewsky, M. F. (1974). Persistence of O6-ethylguanine in rat-brain DNA: correlation with nervous system-specific carcinogenesis by ethylnitrosourea. Proc Natl Acad Sci U S A, 71(3), 639-643.

Graff, L., Castrop, F., Bauer, M., Höfler, H., & Gratzl, M. (2001). Expression of Vesicular Monoamine Transporters, Synaptosomal-associated Protein 25 and Syntaxin1: A Signature of Human Small Cell Lung Carcinoma. Cancer Research, 61(5), 2138-2144.

Gu, Y. Y., Yang, M., Zhao, M., Luo, Q., Yang, L., Peng, H., et al. (2015). The de-ubiquitinase UCHL1 promotes gastric cancer metastasis via the Akt and Erk1/2 pathways. Tumour Biol, 36(11), 8379-8387.

Gupta, K., & Salunke, P. (2012). Molecular markers of glioma: an update on recent progress and perspectives. J Cancer Res Clin Oncol, 138(12), 1971-1981.

Hadaczek, P., Ozawa, T., Soroceanu, L., Yoshida, Y., Matlaf, L., Singer, E., et al. (2013). Cidofovir: a novel antitumor agent for glioblastoma. Clin Cancer Res, 19(23), 6473-6483.

Han, J., Alvarez-Breckenridge, C. A., Wang, Q. E., & Yu, J. (2015). TGF-beta signaling and its targeting for glioma treatment. Am J Cancer Res, 5(3), 945-955.

Hanahan, D., & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell, 100(1), 57-70.

Hanahan, D., & Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 144(5), 646-674.

Hao, Z., Zhang, H., & Cowell, J. (2012). Ubiquitin-conjugating enzyme UBE2C: molecular biology, role in tumorigenesis, and potential as a biomarker. Tumour Biol, 33(3), 723-730.

230

Bibliografía

Harter, P. N., Zinke, J., Scholz, A., Tichy, J., Zachskorn, C., Kvasnicka, H. M., et al. (2014). Netrin-1 expression is an independent prognostic factor for poor patient survival in brain metastases. PLoS One, 9(3), e92311.

Hartmann, C., Hentschel, B., Tatagiba, M., Schramm, J., Schnell, O., Seidel, C., et al. (2011). Molecular markers in low-grade gliomas: predictive or prognostic? Clin Cancer Res, 17(13), 4588-4599.

Hartmann, C., Hentschel, B., Wick, W., Capper, D., Felsberg, J., Simon, M., et al. (2010). Patients with IDH1 wild type anaplastic astrocytomas exhibit worse prognosis than IDH1-mutated glioblastomas, and IDH1 mutation status accounts for the unfavorable prognostic effect of higher age: implications for classification of gliomas. Acta Neuropathol, 120(6), 707-718.

Hawkins, N. J., Lee, J. H., Wong, J. J., Kwok, C. T., Ward, R. L., & Hitchins, M. P. (2009). MGMT methylation is associated primarily with the germline C>T SNP (rs16906252) in colorectal cancer and normal colonic mucosa. Mod Pathol, 22(12), 1588-1599.

Hayashi, H., Yazawa, T., Okudela, K., Nagai, J., Ito, T., Kanisawa, M., et al. (2002). Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase in human lung adenocarcinoma relates to high-grade histology and worse prognosis among smokers. Jpn J Cancer Res, 93(2), 184-189.

Hayflick, L. (1997). Mortality and immortality at the cellular level. A review. Biochemistry (Mosc), 62(11), 1180-1190.

Haynes, H. R., Camelo-Piragua, S., & Kurian, K. M. (2014). Prognostic and predictive biomarkers in adult and pediatric gliomas: toward personalized treatment. Front Oncol, 4, 47.

He, F., Ge, W., Martinowich, K., Becker-Catania, S., Coskun, V., Zhu, W., et al. (2005). A positive autoregulatory loop of Jak-STAT signaling controls the onset of astrogliogenesis. Nat Neurosci, 8(5), 616-625.

Heddleston, J. M., Li, Z., McLendon, R. E., Hjelmeland, A. B., & Rich, J. N. (2009). The hypoxic microenvironment maintains glioblastoma stem cells and promotes reprogramming towards a cancer stem cell phenotype. Cell Cycle, 8(20), 3274-3284.

Hegedus, Z., Czibula, A., & Kiss-Toth, E. (2006). Tribbles: novel regulators of cell function; evolutionary aspects. Cell Mol Life Sci, 63(14), 1632-1641.

Hegi, M. E., Diserens, A. C., Gorlia, T., Hamou, M. F., de Tribolet, N., Weller, M., et al. (2005). MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med, 352(10), 997-1003.

231

Bibliografía

Harter, P. N., Zinke, J., Scholz, A., Tichy, J., Zachskorn, C., Kvasnicka, H. M., et al. (2014). Netrin-1 expression is an independent prognostic factor for poor patient survival in brain metastases. PLoS One, 9(3), e92311.

Hartmann, C., Hentschel, B., Tatagiba, M., Schramm, J., Schnell, O., Seidel, C., et al. (2011). Molecular markers in low-grade gliomas: predictive or prognostic? Clin Cancer Res, 17(13), 4588-4599.

Hartmann, C., Hentschel, B., Wick, W., Capper, D., Felsberg, J., Simon, M., et al. (2010). Patients with IDH1 wild type anaplastic astrocytomas exhibit worse prognosis than IDH1-mutated glioblastomas, and IDH1 mutation status accounts for the unfavorable prognostic effect of higher age: implications for classification of gliomas. Acta Neuropathol, 120(6), 707-718.

Hawkins, N. J., Lee, J. H., Wong, J. J., Kwok, C. T., Ward, R. L., & Hitchins, M. P. (2009). MGMT methylation is associated primarily with the germline C>T SNP (rs16906252) in colorectal cancer and normal colonic mucosa. Mod Pathol, 22(12), 1588-1599.

Hayashi, H., Yazawa, T., Okudela, K., Nagai, J., Ito, T., Kanisawa, M., et al. (2002). Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase in human lung adenocarcinoma relates to high-grade histology and worse prognosis among smokers. Jpn J Cancer Res, 93(2), 184-189.

Hayflick, L. (1997). Mortality and immortality at the cellular level. A review. Biochemistry (Mosc), 62(11), 1180-1190.

Haynes, H. R., Camelo-Piragua, S., & Kurian, K. M. (2014). Prognostic and predictive biomarkers in adult and pediatric gliomas: toward personalized treatment. Front Oncol, 4, 47.

He, F., Ge, W., Martinowich, K., Becker-Catania, S., Coskun, V., Zhu, W., et al. (2005). A positive autoregulatory loop of Jak-STAT signaling controls the onset of astrogliogenesis. Nat Neurosci, 8(5), 616-625.

Heddleston, J. M., Li, Z., McLendon, R. E., Hjelmeland, A. B., & Rich, J. N. (2009). The hypoxic microenvironment maintains glioblastoma stem cells and promotes reprogramming towards a cancer stem cell phenotype. Cell Cycle, 8(20), 3274-3284.

Hegedus, Z., Czibula, A., & Kiss-Toth, E. (2006). Tribbles: novel regulators of cell function; evolutionary aspects. Cell Mol Life Sci, 63(14), 1632-1641.

Hegi, M. E., Diserens, A. C., Gorlia, T., Hamou, M. F., de Tribolet, N., Weller, M., et al. (2005). MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med, 352(10), 997-1003.

Bibliografía

Hellstrand, K., Martner, A., & Bergstrom, T. (2013). Valganciclovir in patients with glioblastoma. N Engl J Med, 369(21), 2066.

Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B. (1996). Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A, 93(18), 9821-9826.

Hibi, K., Liu, Q., Beaudry, G. A., Madden, S. L., Westra, W. H., Wehage, S. L., et al. (1998). Serial analysis of gene expression in non-small cell lung cancer. Cancer Res, 58(24), 5690-5694.

Hibi, K., Westra, W. H., Borges, M., Goodman, S., Sidransky, D., & Jen, J. (1999). PGP9.5 as a candidate tumor marker for non-small-cell lung cancer. Am J Pathol, 155(3), 711-715.

Hill, V. K., Shinawi, T., Ricketts, C. J., Krex, D., Schackert, G., Bauer, J., et al. (2014). Stability of the CpG island methylator phenotype during glioma progression and identification of methylated loci in secondary glioblastomas. BMC Cancer, 14, 506.

Hoang, S., Liauw, J., Choi, M., Guzman, R. G., & Steinberg, G. K. (2009). Netrin-4 enhances angiogenesis and neurologic outcome after cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 29(2), 385-397.

Hollon, T. C., Price, R. L., Kwon, C.-H., & Chiocca, E. A. (2013). Mutations in glioblastoma oncosuppressive pathways pave the way for oncomodulatory activity of cytomegalovirus. Oncoimmunology, 2(9), e25620.

Hoque, M. O., Kim, M. S., Ostrow, K. L., Liu, J., Wisman, G. B., Park, H. L., et al. (2008). Genome-wide promoter analysis uncovers portions of the cancer methylome. Cancer Res, 68(8), 2661-2670.

Houillier, C., Wang, X., Kaloshi, G., Mokhtari, K., Guillevin, R., Laffaire, J., et al. (2010). IDH1 or IDH2 mutations predict longer survival and response to temozolomide in low-grade gliomas. Neurology, 75(17), 1560-1566.

Houshdaran, S., Hawley, S., Palmer, C., Campan, M., Olsen, M. N., Ventura, A. P., et al. (2010). DNA methylation profiles of ovarian epithelial carcinoma tumors and cell lines. PLoS One, 5(2), e9359.

Hsu, C. R., Lu, T. M., Chin, L. W., & Yang, C. C. (2010). Possible DNA viral factors of human breast cancer. Cancers (Basel), 2(2), 498-512.

http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html.

http://geneontology.org/.

232

Bibliografía

http://string-db.org/.

http://www.cytoscape.org/.

http://www.genome.jp/kegg/.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim.

http://www.tm4.org/mev.html.

https://scienceforscientists.wordpress.com/tag/cytomegalovirus-cmv/. (2012).

https://www.mycancergenome.org/content/disease/glioma/idh2/.

Hu, Z. Q., Zhang, J. Y., Ji, C. N., Xie, Y., Chen, J. Z., & Mao, Y. M. (2010). Grb10 interacts with Bim L and inhibits apoptosis. Mol Biol Rep, 37(7), 3547-3552.

Huang da, W., Sherman, B. T., & Lempicki, R. A. (2009a). Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 37(1), 1-13.

Huang da, W., Sherman, B. T., & Lempicki, R. A. (2009b). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc, 4(1), 44-57.

Huang, F. J., Steeg, P. S., Price, J. E., Chiu, W. T., Chou, P. C., Xie, K., et al. (2008). Molecular basis for the critical role of suppressor of cytokine signaling-1 in melanoma brain metastasis. Cancer Res, 68(23), 9634-9642.

Huang, Y., Chen, X., Chen, N., Nie, L., Xu, M., & Zhou, Q. (2011). Expression and prognostic significance of survivin splice variants in diffusely infiltrating astrocytoma. J Clin Pathol, 64(11), 953-959.

Hughes, L. A., Melotte, V., de Schrijver, J., de Maat, M., Smit, V. T., Bovee, J. V., et al. (2013). The CpG island methylator phenotype: what's in a name? Cancer Res, 73(19), 5858-5868.

Hung, K. S., Hong, C. Y., Lee, J., Lin, S. K., Huang, S. C., Wang, T. M., et al. (2000). Expression of p16(INK4A) induces dominant suppression of glioblastoma growth in situ through necrosis and cell cycle arrest. Biochem Biophys Res Commun, 269(3), 718-725.

233

Bibliografía

http://string-db.org/.

http://www.cytoscape.org/.

http://www.genome.jp/kegg/.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim.

http://www.tm4.org/mev.html.

https://scienceforscientists.wordpress.com/tag/cytomegalovirus-cmv/. (2012).

https://www.mycancergenome.org/content/disease/glioma/idh2/.

Hu, Z. Q., Zhang, J. Y., Ji, C. N., Xie, Y., Chen, J. Z., & Mao, Y. M. (2010). Grb10 interacts with Bim L and inhibits apoptosis. Mol Biol Rep, 37(7), 3547-3552.

Huang da, W., Sherman, B. T., & Lempicki, R. A. (2009a). Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 37(1), 1-13.

Huang da, W., Sherman, B. T., & Lempicki, R. A. (2009b). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc, 4(1), 44-57.

Huang, F. J., Steeg, P. S., Price, J. E., Chiu, W. T., Chou, P. C., Xie, K., et al. (2008). Molecular basis for the critical role of suppressor of cytokine signaling-1 in melanoma brain metastasis. Cancer Res, 68(23), 9634-9642.

Huang, Y., Chen, X., Chen, N., Nie, L., Xu, M., & Zhou, Q. (2011). Expression and prognostic significance of survivin splice variants in diffusely infiltrating astrocytoma. J Clin Pathol, 64(11), 953-959.

Hughes, L. A., Melotte, V., de Schrijver, J., de Maat, M., Smit, V. T., Bovee, J. V., et al. (2013). The CpG island methylator phenotype: what's in a name? Cancer Res, 73(19), 5858-5868.

Hung, K. S., Hong, C. Y., Lee, J., Lin, S. K., Huang, S. C., Wang, T. M., et al. (2000). Expression of p16(INK4A) induces dominant suppression of glioblastoma growth in situ through necrosis and cell cycle arrest. Biochem Biophys Res Commun, 269(3), 718-725.

Bibliografía

Huse, J. T., & Holland, E. C. (2010). Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. [10.1038/nrc2818]. Nat Rev Cancer, 10(5), 319-331.

Ichimura, K. (2012). Molecular pathogenesis of IDH mutations in gliomas. Brain Tumor Pathol, 29(3), 131-139.

Ichimura, K., Pearson, D. M., Kocialkowski, S., Backlund, L. M., Chan, R., Jones, D. T., et al. (2009). IDH1 mutations are present in the majority of common adult gliomas but rare in primary glioblastomas. Neuro Oncol, 11(4), 341-347.

Inagaki-Ohara, K., Kondo, T., Ito, M., & Yoshimura, A. (2013). SOCS, inflammation, and cancer. JAK-STAT, 2(3), e24053.

Irshad, K., Mohapatra, S. K., Srivastava, C., Garg, H., Mishra, S., Dikshit, B., et al. (2015). A Combined Gene Signature of Hypoxia and Notch Pathway in Human Glioblastoma and Its Prognostic Relevance. PLoS ONE, 10(3), e0118201.

Jaros, E., Perry, R. H., Adam, L., Kelly, P. J., Crawford, P. J., Kalbag, R. M., et al. (1992). Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumours. Br J Cancer, 66(2), 373-385.

Jenkins, R. B., Blair, H., Ballman, K. V., Giannini, C., Arusell, R. M., Law, M., et al. (2006). A t(1;19)(q10;p10) mediates the combined deletions of 1p and 19q and predicts a better prognosis of patients with oligodendroglioma. Cancer Res, 66(20), 9852-9861.

Jenkins, R. B., Blair, H., Ballman, K. V., Giannini, C., Arusell, R. M., Law, M., et al. (2006). A t(1;19)(q10;p10) Mediates the Combined Deletions of 1p and 19q and Predicts a Better Prognosis of Patients with Oligodendroglioma. Cancer Research, 66(20), 9852-9861.

Jeuken, J., Cornelissen, S., Boots-Sprenger, S., Gijsen, S., & Wesseling, P. (2006). Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification : A Diagnostic Tool for Simultaneous Identification of Different Genetic Markers in Glial Tumors. The Journal of molecular diagnostics : JMD, 8(4), 433-443.

Jeuken, J. W., Cornelissen, S. J., Vriezen, M., Dekkers, M. M., Errami, A., Sijben, A., et al. (2007). MS-MLPA: an attractive alternative laboratory assay for robust, reliable, and semiquantitative detection of MGMT promoter hypermethylation in gliomas. Lab Invest, 87(10), 1055-1065.

Ji, J., Tsuk, S., Salapatek, A. M., Huang, X., Chikvashvili, D., Pasyk, E. A., et al. (2002). The 25-kDa synaptosome-associated protein (SNAP-25) binds

234

Bibliografía

and inhibits delayed rectifier potassium channels in secretory cells. J Biol Chem, 277(23), 20195-20204.

Jiang, L., Huang, C. G., Lu, Y. C., Luo, C., Hu, G. H., Liu, H. M., et al. (2008). Expression of ubiquitin-conjugating enzyme E2C/UbcH10 in astrocytic tumors. Brain Res, 1201, 161-166.

Jin, Z., Wang, L., Zhang, Y., Cheng, Y., Gao, Y., Feng, X., et al. (2013). MAL hypermethylation is a tissue-specific event that correlates with MAL mRNA expression in esophageal carcinoma. Sci Rep, 3, 2838.

Johannessen, A. L., & Torp, S. H. (2006). The clinical value of Ki-67/MIB-1 labeling index in human astrocytomas. Pathol Oncol Res, 12(3), 143-147.

Jovcevska, I., Kocevar, N., & Komel, R. (2013). Glioma and glioblastoma - how much do we (not) know? Mol Clin Oncol, 1(6), 935-941.

Kamiryo, T., Tada, K., Shiraishi, S., Shinojima, N., Kochi, M., & Ushio, Y. (2004). Correlation between promoter hypermethylation of the O6-methylguanine-deoxyribonucleic acid methyltransferase gene and prognosis in patients with high-grade astrocytic tumors treated with surgery, radiotherapy, and 1-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3-(2-chloroethyl)-3-nitrosourea-based chemotherapy. Neurosurgery, 54(2), 349-357; discussion 357.

Kaneda, A., Matsusaka, K., Sakai, E., & Funata, S. (2014). DNA methylation accumulation and its predetermination of future cancer phenotypes. J Biochem, 156(2), 63-72.

Kannan, K., Amariglio, N., Rechavi, G., & Givol, D. (2000). Profile of gene expression regulated by induced p53: connection to the TGF-beta family. FEBS Lett, 470(1), 77-82.

Karan, D., Chen, S. J., Johansson, S. L., Singh, A. P., Paralkar, V. M., Lin, M. F., et al. (2003). Dysregulated expression of MIC-1/PDF in human prostate tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 305(3), 598-604.

Karayan-Tapon, L., Quillien, V., Guilhot, J., Wager, M., Fromont, G., Saikali, S., et al. (2010). Prognostic value of O6-methylguanine-DNA methyltransferase status in glioblastoma patients, assessed by five different methods. J Neurooncol, 97(3), 311-322.

Kato, T., Sato, N., Hayama, S., Yamabuki, T., Ito, T., Miyamoto, M., et al. (2007). Activation of Holliday junction recognizing protein involved in the chromosomal stability and immortality of cancer cells. Cancer Res, 67(18), 8544-8553.

235

Bibliografía

and inhibits delayed rectifier potassium channels in secretory cells. J Biol Chem, 277(23), 20195-20204.

Jiang, L., Huang, C. G., Lu, Y. C., Luo, C., Hu, G. H., Liu, H. M., et al. (2008). Expression of ubiquitin-conjugating enzyme E2C/UbcH10 in astrocytic tumors. Brain Res, 1201, 161-166.

Jin, Z., Wang, L., Zhang, Y., Cheng, Y., Gao, Y., Feng, X., et al. (2013). MAL hypermethylation is a tissue-specific event that correlates with MAL mRNA expression in esophageal carcinoma. Sci Rep, 3, 2838.

Johannessen, A. L., & Torp, S. H. (2006). The clinical value of Ki-67/MIB-1 labeling index in human astrocytomas. Pathol Oncol Res, 12(3), 143-147.

Jovcevska, I., Kocevar, N., & Komel, R. (2013). Glioma and glioblastoma - how much do we (not) know? Mol Clin Oncol, 1(6), 935-941.

Kamiryo, T., Tada, K., Shiraishi, S., Shinojima, N., Kochi, M., & Ushio, Y. (2004). Correlation between promoter hypermethylation of the O6-methylguanine-deoxyribonucleic acid methyltransferase gene and prognosis in patients with high-grade astrocytic tumors treated with surgery, radiotherapy, and 1-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3-(2-chloroethyl)-3-nitrosourea-based chemotherapy. Neurosurgery, 54(2), 349-357; discussion 357.

Kaneda, A., Matsusaka, K., Sakai, E., & Funata, S. (2014). DNA methylation accumulation and its predetermination of future cancer phenotypes. J Biochem, 156(2), 63-72.

Kannan, K., Amariglio, N., Rechavi, G., & Givol, D. (2000). Profile of gene expression regulated by induced p53: connection to the TGF-beta family. FEBS Lett, 470(1), 77-82.

Karan, D., Chen, S. J., Johansson, S. L., Singh, A. P., Paralkar, V. M., Lin, M. F., et al. (2003). Dysregulated expression of MIC-1/PDF in human prostate tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 305(3), 598-604.

Karayan-Tapon, L., Quillien, V., Guilhot, J., Wager, M., Fromont, G., Saikali, S., et al. (2010). Prognostic value of O6-methylguanine-DNA methyltransferase status in glioblastoma patients, assessed by five different methods. J Neurooncol, 97(3), 311-322.

Kato, T., Sato, N., Hayama, S., Yamabuki, T., Ito, T., Miyamoto, M., et al. (2007). Activation of Holliday junction recognizing protein involved in the chromosomal stability and immortality of cancer cells. Cancer Res, 67(18), 8544-8553.

Bibliografía

Kato, Y., Jin, G., Kuan, C. T., McLendon, R. E., Yan, H., & Bigner, D. D. (2009). A monoclonal antibody IMab-1 specifically recognizes IDH1R132H, the most common glioma-derived mutation. Biochem Biophys Res Commun, 390(3), 547-551.

Kim, Y. Z. (2014). Altered histone modifications in gliomas. Brain Tumor Res Treat, 2(1), 7-21.

Kleihues, P., & Margison, G. P. (1974). Carcinogenicity of N-methyl-N-nitrosourea: possible role of excision repair of O6-methylguanine from DNA. J Natl Cancer Inst, 53(6), 1839-1841.

Ko, M., Huang, Y., Jankowska, A. M., Pape, U. J., Tahiliani, M., Bandukwala, H. S., et al. (2010). Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature, 468(7325), 839-843.

Kohya, N., Miyazaki, K., Matsukura, S., Yakushiji, H., Kitajima, Y., Kitahara, K., et al. (2002). Deficient expression of O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase combined with mismatch-repair proteins hMLH1 and hMSH2 is related to poor prognosis in human biliary tract carcinoma. Ann Surg Oncol, 9(4), 371-379.

Kondo, Y., Katsushima, K., Ohka, F., Natsume, A., & Shinjo, K. (2014). Epigenetic dysregulation in glioma. Cancer Sci, 105(4), 363-369.

Korkolopoulou, P. A., Konstantinidou, A. E., Patsouris, E. S., Christodoulou, P. N., Thomas-Tsagli, E. A., & Davaris, P. S. (2001). Detection of apoptotic cells in archival tissue from diffuse astrocytomas using a monoclonal antibody to single-stranded DNA. J Pathol, 193(3), 377-382.

Krex, D., Klink, B., Hartmann, C., von Deimling, A., Pietsch, T., Simon, M., et al. (2007). Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain, 130(10), 2596-2606.

Krex, D., Klink, B., Hartmann, C., von Deimling, A., Pietsch, T., Simon, M., et al. (2007). Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain, 130(Pt 10), 2596-2606.

Kumagai, T., Akagi, T., Desmond, J. C., Kawamata, N., Gery, S., Imai, Y., et al. (2009). Epigenetic regulation and molecular characterization of C/EBPalpha in pancreatic cancer cells. Int J Cancer, 124(4), 827-833.

Kurashige, J., Sawada, G., Takahashi, Y., Eguchi, H., Sudo, T., Ikegami, T., et al. (2013). Suppression of MAL gene expression in gastric cancer correlates with metastasis and mortality. Fukuoka Igaku Zasshi, 104(10), 344-349.

236

Bibliografía

Labussiere, M., Idbaih, A., Wang, X. W., Marie, Y., Boisselier, B., Falet, C., et al. (2010). All the 1p19q codeleted gliomas are mutated on IDH1 or IDH2. Neurology, 74(23), 1886-1890.

Laffaire, J., Everhard, S., Idbaih, A., Criniere, E., Marie, Y., de Reynies, A., et al. (2011). Methylation profiling identifies 2 groups of gliomas according to their tumorigenesis. Neuro Oncol, 13(1), 84-98.

Lau, S. K., Chen, Y.-Y., Chen, W.-G., Diamond, D. J., Mamelak, A. N., Zaia, J. A., et al. (2004). Lack of association of cytomegalovirus with human brain tumors. Mod Pathol, 18(6), 838-843.

Lawler, S. E. (2015). Cytomegalovirus and glioblastoma; controversies and opportunities. J Neurooncol, 123(3), 465-471.

Li, H. P., Leu, Y. W., & Chang, Y. S. (2005). Epigenetic changes in virus-associated human cancers. Cell Res, 15(4), 262-271.

Li, X., Wu, C., Chen, N., Gu, H., Yen, A., Cao, L., et al. (2016). PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and targeted therapy for glioblastoma. Oncotarget.

Li, Z., Metze, D., Nashan, D., Muller-Tidow, C., Serve, H. L., Poremba, C., et al. (2004). Expression of SOCS-1, suppressor of cytokine signalling-1, in human melanoma. J Invest Dermatol, 123(4), 737-745.

Libard, S., Popova, S. N., Amini, R. M., Karja, V., Pietilainen, T., Hamalainen, K. M., et al. (2014). Human cytomegalovirus tegument protein pp65 is detected in all intra- and extra-axial brain tumours independent of the tumour type or grade. PLoS One, 9(9), e108861.

Lindemann, C., Marschall, V., Weigert, A., Klingebiel, T., & Fulda, S. (2015). Smac Mimetic-Induced Upregulation of CCL2/MCP-1 Triggers Migration and Invasion of Glioblastoma Cells and Influences the Tumor Microenvironment in a Paracrine Manner. Neoplasia, 17(6), 481-489.

Liu, Q., Liao, F., Wu, H., Cai, T., Yang, L., & Fang, J. (2015). Different expression of miR-29b and VEGFA in glioma. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 1-6.

Liu, X., Zeng, B., Ma, J., & Wan, C. (2009). Comparative proteomic analysis of osteosarcoma cell and human primary cultured osteoblastic cell. Cancer Invest, 27(3), 345-352.

Locatelli, M., Ferrero, S., Martinelli Boneschi, F., Boiocchi, L., Zavanone, M., Maria Gaini, S., et al. (2013). The long pentraxin PTX3 as a correlate of cancer-related inflammation and prognosis of malignancy in gliomas. J Neuroimmunol, 260(1-2), 99-106.

237

Bibliografía

Labussiere, M., Idbaih, A., Wang, X. W., Marie, Y., Boisselier, B., Falet, C., et al. (2010). All the 1p19q codeleted gliomas are mutated on IDH1 or IDH2. Neurology, 74(23), 1886-1890.

Laffaire, J., Everhard, S., Idbaih, A., Criniere, E., Marie, Y., de Reynies, A., et al. (2011). Methylation profiling identifies 2 groups of gliomas according to their tumorigenesis. Neuro Oncol, 13(1), 84-98.

Lau, S. K., Chen, Y.-Y., Chen, W.-G., Diamond, D. J., Mamelak, A. N., Zaia, J. A., et al. (2004). Lack of association of cytomegalovirus with human brain tumors. Mod Pathol, 18(6), 838-843.

Lawler, S. E. (2015). Cytomegalovirus and glioblastoma; controversies and opportunities. J Neurooncol, 123(3), 465-471.

Li, H. P., Leu, Y. W., & Chang, Y. S. (2005). Epigenetic changes in virus-associated human cancers. Cell Res, 15(4), 262-271.

Li, X., Wu, C., Chen, N., Gu, H., Yen, A., Cao, L., et al. (2016). PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and targeted therapy for glioblastoma. Oncotarget.

Li, Z., Metze, D., Nashan, D., Muller-Tidow, C., Serve, H. L., Poremba, C., et al. (2004). Expression of SOCS-1, suppressor of cytokine signalling-1, in human melanoma. J Invest Dermatol, 123(4), 737-745.

Libard, S., Popova, S. N., Amini, R. M., Karja, V., Pietilainen, T., Hamalainen, K. M., et al. (2014). Human cytomegalovirus tegument protein pp65 is detected in all intra- and extra-axial brain tumours independent of the tumour type or grade. PLoS One, 9(9), e108861.

Lindemann, C., Marschall, V., Weigert, A., Klingebiel, T., & Fulda, S. (2015). Smac Mimetic-Induced Upregulation of CCL2/MCP-1 Triggers Migration and Invasion of Glioblastoma Cells and Influences the Tumor Microenvironment in a Paracrine Manner. Neoplasia, 17(6), 481-489.

Liu, Q., Liao, F., Wu, H., Cai, T., Yang, L., & Fang, J. (2015). Different expression of miR-29b and VEGFA in glioma. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 1-6.

Liu, X., Zeng, B., Ma, J., & Wan, C. (2009). Comparative proteomic analysis of osteosarcoma cell and human primary cultured osteoblastic cell. Cancer Invest, 27(3), 345-352.

Locatelli, M., Ferrero, S., Martinelli Boneschi, F., Boiocchi, L., Zavanone, M., Maria Gaini, S., et al. (2013). The long pentraxin PTX3 as a correlate of cancer-related inflammation and prognosis of malignancy in gliomas. J Neuroimmunol, 260(1-2), 99-106.

Bibliografía

Loechler, E. L., Green, C. L., & Essigmann, J. M. (1984). In vivo mutagenesis by O6-methylguanine built into a unique site in a viral genome. Proc Natl Acad Sci U S A, 81(20), 6271-6275.

Loenarz, C., & Schofield, C. J. (2008). Expanding chemical biology of 2-oxoglutarate oxygenases. Nat Chem Biol, 4(3), 152-156.

Louis, D., Ohgaki, H., Wiestler, O., Cavenee, W., Burger, P., Jouvet, A., et al. (2007). The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Acta Neuropathologica, 114(2), 97-109.

Louis, D. N., Ohgaki, H., Wiestler, O. D., Cavenee, W. K., Burger, P. C., Jouvet, A., et al. (2007). The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Acta Neuropathologica, 114(2), 97-109.

Louis, D. N., Perry, A., Reifenberger, G., von Deimling, A., Figarella-Branger, D., Cavenee, W. K., et al. (2016). The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathol, 131(6), 803-820.

Loveless, A. (1969). Possible relevance of O-6 alkylation of deoxyguanosine to the mutagenicity and carcinogenicity of nitrosamines and nitrosamides. Nature, 223(5202), 206-207.

Lucas, K. G., Bao, L., Bruggeman, R., Dunham, K., & Specht, C. (2011). The detection of CMV pp65 and IE1 in glioblastoma multiforme. J Neurooncol, 103(2), 231-238.

Lund, A. H., & van Lohuizen, M. (2002). RUNX: a trilogy of cancer genes. Cancer Cell, 1(3), 213-215.

Ma, L. J., Wu, W. J., Wang, Y. H., Wu, T. F., Liang, P. I., Chang, I. W., et al. (2016). SPOCK1 Overexpression Confers a Poor Prognosis in Urothelial Carcinoma. J Cancer, 7(4), 467-476.

Ma, R., Kang, X., Zhang, G., Fang, F., Du, Y., & Lv, H. (2016). High expression of UBE2C is associated with the aggressive progression and poor outcome of malignant glioma. Oncol Lett, 11(3), 2300-2304.

Malzkorn, B., Wolter, M., Riemenschneider, M. J., & Reifenberger, G. (2011). Unraveling the glioma epigenome: from molecular mechanisms to novel biomarkers and therapeutic targets. Brain Pathol, 21(6), 619-632.

Mallawaaratchy, D. M., Buckland, M. E., McDonald, K. L., Li, C. C., Ly, L., Sykes, E. K., et al. (2015). Membrane proteome analysis of glioblastoma cell invasion. J Neuropathol Exp Neurol, 74(5), 425-441.

238

Bibliografía

Mallette, F. A., Calabrese, V., Ilangumaran, S., & Ferbeyre, G. (2010). SOCS1, a novel interaction partner of p53 controlling oncogene-induced senescence. Aging (Albany NY), 2(7), 445-452.

Malley, D. S., Hamoudi, R. A., Kocialkowski, S., Pearson, D. M., Collins, V. P., & Ichimura, K. (2011). A distinct region of the MGMT CpG island critical for transcriptional regulation is preferentially methylated in glioblastoma cells and xenografts. Acta Neuropathol, 121(5), 651-661.

Mandelker, D. L., Yamashita, K., Tokumaru, Y., Mimori, K., Howard, D. L., Tanaka, Y., et al. (2005). PGP9.5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 65(11), 4963-4968.

Marca, A. L., & Volpe, A. (2007). The Anti-Mullerian hormone and ovarian cancer. Human Reproduction Update, 13(3), 265-273.

Martinez, R. (2012). Beyond Genetics in Glioma Pathways: The Ever-Increasing Crosstalk between Epigenomic and Genomic Events. J Signal Transduct, 2012, 519807.

Massague, J. (2008). A very private TGF-beta receptor embrace. Mol Cell, 29(2), 149-150.

Matteo, S., Luciano, B., Massimo, N., Maria Beatrice, M., Rossana, B., Giorgio, S., et al. (2013). Essential Role of Gli Proteins in Glioblastoma Multiforme. Current Protein & Peptide Science, 14(2), 133-140.

McDonald, K. L. (2011). Biomarker Discovery, Validation and Clinical Application for Patients Diagnosed with Glioma. In A. Ghosh (Ed.), Glioma - Exploring Its Biology and Practical Relevance.

McDonald, K. L., O'Sullivan, M. G., Parkinson, J. F., Shaw, J. M., Payne, C. A., Brewer, J. M., et al. (2007). IQGAP1 and IGFBP2: valuable biomarkers for determining prognosis in glioma patients. J Neuropathol Exp Neurol, 66(5), 405-417.

Mei, P. J., Bai, J., Liu, H., Li, C., Wu, Y. P., Yu, Z. Q., et al. (2011). RUNX3 expression is lost in glioma and its restoration causes drastic suppression of tumor invasion and migration. J Cancer Res Clin Oncol, 137(12), 1823-1830.

Mellai, M., Caldera, V., Annovazzi, L., Chio, A., Lanotte, M., Cassoni, P., et al. (2009). MGMT promoter hypermethylation in a series of 104 glioblastomas. Cancer Genomics Proteomics, 6(4), 219-227.

239

Bibliografía

Mallette, F. A., Calabrese, V., Ilangumaran, S., & Ferbeyre, G. (2010). SOCS1, a novel interaction partner of p53 controlling oncogene-induced senescence. Aging (Albany NY), 2(7), 445-452.

Malley, D. S., Hamoudi, R. A., Kocialkowski, S., Pearson, D. M., Collins, V. P., & Ichimura, K. (2011). A distinct region of the MGMT CpG island critical for transcriptional regulation is preferentially methylated in glioblastoma cells and xenografts. Acta Neuropathol, 121(5), 651-661.

Mandelker, D. L., Yamashita, K., Tokumaru, Y., Mimori, K., Howard, D. L., Tanaka, Y., et al. (2005). PGP9.5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 65(11), 4963-4968.

Marca, A. L., & Volpe, A. (2007). The Anti-Mullerian hormone and ovarian cancer. Human Reproduction Update, 13(3), 265-273.

Martinez, R. (2012). Beyond Genetics in Glioma Pathways: The Ever-Increasing Crosstalk between Epigenomic and Genomic Events. J Signal Transduct, 2012, 519807.

Massague, J. (2008). A very private TGF-beta receptor embrace. Mol Cell, 29(2), 149-150.

Matteo, S., Luciano, B., Massimo, N., Maria Beatrice, M., Rossana, B., Giorgio, S., et al. (2013). Essential Role of Gli Proteins in Glioblastoma Multiforme. Current Protein & Peptide Science, 14(2), 133-140.

McDonald, K. L. (2011). Biomarker Discovery, Validation and Clinical Application for Patients Diagnosed with Glioma. In A. Ghosh (Ed.), Glioma - Exploring Its Biology and Practical Relevance.

McDonald, K. L., O'Sullivan, M. G., Parkinson, J. F., Shaw, J. M., Payne, C. A., Brewer, J. M., et al. (2007). IQGAP1 and IGFBP2: valuable biomarkers for determining prognosis in glioma patients. J Neuropathol Exp Neurol, 66(5), 405-417.

Mei, P. J., Bai, J., Liu, H., Li, C., Wu, Y. P., Yu, Z. Q., et al. (2011). RUNX3 expression is lost in glioma and its restoration causes drastic suppression of tumor invasion and migration. J Cancer Res Clin Oncol, 137(12), 1823-1830.

Mellai, M., Caldera, V., Annovazzi, L., Chio, A., Lanotte, M., Cassoni, P., et al. (2009). MGMT promoter hypermethylation in a series of 104 glioblastomas. Cancer Genomics Proteomics, 6(4), 219-227.

Bibliografía

Mellai, M., Monzeglio, O., Piazzi, A., Caldera, V., Annovazzi, L., Cassoni, P., et al. (2012). MGMT promoter hypermethylation and its associations with genetic alterations in a series of 350 brain tumors. J Neurooncol, 107(3), 617-631.

Mellinghoff, I. K., Wang, M. Y., Vivanco, I., Haas-Kogan, D. A., Zhu, S., Dia, E. Q., et al. (2005). Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors. N Engl J Med, 353(19), 2012-2024.

Mesri, E. A., Feitelson, M. A., & Munger, K. (2014). Human viral oncogenesis: a cancer hallmarks analysis. Cell Host Microbe, 15(3), 266-282.

Michaelis, M., Baumgarten, P., Mittelbronn, M., Driever, P. H., Doerr, H. W., & Cinatl, J., Jr. (2011). Oncomodulation by human cytomegalovirus: novel clinical findings open new roads. Med Microbiol Immunol, 200(1), 1-5.

Michaelis, M., Doerr, H. W., & Cinatl, J. (2009). The story of human cytomegalovirus and cancer: increasing evidence and open questions. Neoplasia, 11(1), 1-9.

Minarovits, J., Demcsak, A., Banati, F., & Niller, H. H. (2016). Epigenetic Dysregulation in Virus-Associated Neoplasms. Adv Exp Med Biol, 879, 71-90.

Mitchell, D. A., Xie, W., Schmittling, R., Learn, C., Friedman, A., McLendon, R. E., et al. (2008). Sensitive detection of human cytomegalovirus in tumors and peripheral blood of patients diagnosed with glioblastoma. Neuro Oncol, 10(1), 10-18.

Mocarski, E. S., Jr., & Kemble, G. W. (1996). Recombinant cytomegaloviruses for study of replication and pathogenesis. Intervirology, 39(5-6), 320-330.

Morris, S.-A. L., & Huang, S. (2016). Crosstalk of the Wnt/β-catenin pathway with other pathways in cancer cells. Genes & Diseases, 3(1), 41-47.

Mosesson, Y., Mills, G. B., & Yarden, Y. (2008). Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nat Rev Cancer, 8(11), 835-850.

Mueller, W., Nutt, C. L., Ehrich, M., Riemenschneider, M. J., von Deimling, A., van den Boom, D., et al. (2007). Downregulation of RUNX3 and TES by hypermethylation in glioblastoma. Oncogene, 26(4), 583-593.

Mur, P., Rodriguez de Lope, A., Diaz-Crespo, F. J., Hernandez-Iglesias, T., Ribalta, T., Fiano, C., et al. (2015). Impact on prognosis of the regional distribution of MGMT methylation with respect to the CpG island

240

Bibliografía

methylator phenotype and age in glioma patients. J Neurooncol, 122(3), 441-450.

Murat, A., Migliavacca, E., Gorlia, T., Lambiv, W. L., Shay, T., Hamou, M. F., et al. (2008). Stem cell-related "self-renewal" signature and high epidermal growth factor receptor expression associated with resistance to concomitant chemoradiotherapy in glioblastoma. J Clin Oncol, 26(18), 3015-3024.

Nakae, S., Sasaki, H., Hayashi, S., Hattori, N., Kumon, M., Nishiyama, Y., et al. (2015). PCR-Based Simple Subgrouping Is Validated for Classification of Gliomas and Defines Negative Prognostic Copy Number Aberrations in IDH Mutant Gliomas. PLoS One, 10(11), e0142750.

Nakamura, M., Watanabe, T., Yonekawa, Y., Kleihues, P., & Ohgaki, H. (2001). Promoter methylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G:C --> A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene. Carcinogenesis, 22(10), 1715-1719.

Navankasattusas, S., Whitehead, K. J., Suli, A., Sorensen, L. K., Lim, A. H., Zhao, J., et al. (2008). The netrin receptor UNC5B promotes angiogenesis in specific vascular beds. Development, 135(4), 659-667.

Negrini, S., Gorgoulis, V. G., & Halazonetis, T. D. (2010). Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(3), 220-228.

Nigro, J. M., Misra, A., Zhang, L., Smirnov, I., Colman, H., Griffin, C., et al. (2005). Integrated array-comparative genomic hybridization and expression array profiles identify clinically relevant molecular subtypes of glioblastoma. Cancer Res, 65(5), 1678-1686.

Nikiforova, M. N., & Hamilton, R. L. (2011). Molecular diagnostics of gliomas. Arch Pathol Lab Med, 135(5), 558-568.

Nobusawa, S., Watanabe, T., Kleihues, P., & Ohgaki, H. (2009). IDH1 mutations as molecular signature and predictive factor of secondary glioblastomas. Clin Cancer Res, 15(19), 6002-6007.

Nord, H., Hartmann, C., Andersson, R., Menzel, U., Pfeifer, S., Piotrowski, A., et al. (2009). Characterization of novel and complex genomic aberrations in glioblastoma using a 32K BAC array. Neuro Oncol, 11(6), 803-818.

Noushmehr, H., Weisenberger, D. J., Diefes, K., Phillips, H. S., Pujara, K., Berman, B. P., et al. (2010). Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell, 17(5), 510-522.

241

Bibliografía

methylator phenotype and age in glioma patients. J Neurooncol, 122(3), 441-450.

Murat, A., Migliavacca, E., Gorlia, T., Lambiv, W. L., Shay, T., Hamou, M. F., et al. (2008). Stem cell-related "self-renewal" signature and high epidermal growth factor receptor expression associated with resistance to concomitant chemoradiotherapy in glioblastoma. J Clin Oncol, 26(18), 3015-3024.

Nakae, S., Sasaki, H., Hayashi, S., Hattori, N., Kumon, M., Nishiyama, Y., et al. (2015). PCR-Based Simple Subgrouping Is Validated for Classification of Gliomas and Defines Negative Prognostic Copy Number Aberrations in IDH Mutant Gliomas. PLoS One, 10(11), e0142750.

Nakamura, M., Watanabe, T., Yonekawa, Y., Kleihues, P., & Ohgaki, H. (2001). Promoter methylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G:C --> A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene. Carcinogenesis, 22(10), 1715-1719.

Navankasattusas, S., Whitehead, K. J., Suli, A., Sorensen, L. K., Lim, A. H., Zhao, J., et al. (2008). The netrin receptor UNC5B promotes angiogenesis in specific vascular beds. Development, 135(4), 659-667.

Negrini, S., Gorgoulis, V. G., & Halazonetis, T. D. (2010). Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(3), 220-228.

Nigro, J. M., Misra, A., Zhang, L., Smirnov, I., Colman, H., Griffin, C., et al. (2005). Integrated array-comparative genomic hybridization and expression array profiles identify clinically relevant molecular subtypes of glioblastoma. Cancer Res, 65(5), 1678-1686.

Nikiforova, M. N., & Hamilton, R. L. (2011). Molecular diagnostics of gliomas. Arch Pathol Lab Med, 135(5), 558-568.

Nobusawa, S., Watanabe, T., Kleihues, P., & Ohgaki, H. (2009). IDH1 mutations as molecular signature and predictive factor of secondary glioblastomas. Clin Cancer Res, 15(19), 6002-6007.

Nord, H., Hartmann, C., Andersson, R., Menzel, U., Pfeifer, S., Piotrowski, A., et al. (2009). Characterization of novel and complex genomic aberrations in glioblastoma using a 32K BAC array. Neuro Oncol, 11(6), 803-818.

Noushmehr, H., Weisenberger, D. J., Diefes, K., Phillips, H. S., Pujara, K., Berman, B. P., et al. (2010). Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell, 17(5), 510-522.

Bibliografía

Nutt, C. L., Mani, D. R., Betensky, R. A., Tamayo, P., Cairncross, J. G., Ladd, C., et al. (2003). Gene expression-based classification of malignant gliomas correlates better with survival than histological classification. Cancer Res, 63(7), 1602-1607.

Ohgaki, H. (2009). Epidemiology of brain tumors. Methods Mol Biol, 472, 323-342.

Ohgaki, H., Dessen, P., Jourde, B., Horstmann, S., Nishikawa, T., Di Patre, P. L., et al. (2004). Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study. Cancer Res, 64(19), 6892-6899.

Ohgaki, H., & Kleihues, P. (2005). Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol, 109(1), 93-108.

Ohgaki, H., & Kleihues, P. (2009). Genetic alterations and signaling pathways in the evolution of gliomas. Cancer Sci, 100(12), 2235-2241.

Oliveros, F. R. (2008). Gliomas del Encéfalo. Revista argentina de neurocirugía, 22, 0-0.

Olsen, M. L., & Sontheimer, H. (2008). Functional implications for Kir4.1 channels in glial biology: from K+ buffering to cell differentiation. J Neurochem, 107(3), 589-601.

Omuro, A., & DeAngelis, L. M. (2013). Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA, 310(17), 1842-1850.

Onishi, M., Ichikawa, T., Kurozumi, K., Inoue, S., Maruo, T., Otani, Y., et al. (2015). Annexin A2 regulates angiogenesis and invasion phenotypes of malignant glioma. Brain Tumor Pathol, 32(3), 184-194.

Orlandi, C., Posokhova, E., Masuho, I., Ray, T. A., Hasan, N., Gregg, R. G., et al. (2012). GPR158/179 regulate G protein signaling by controlling localization and activity of the RGS7 complexes. J Cell Biol, 197(6), 711-719.

Orlandi, C., Xie, K., Masuho, I., Fajardo-Serrano, A., Lujan, R., & Martemyanov, K. A. (2015). Orphan Receptor GPR158 Is an Allosteric Modulator of RGS7 Catalytic Activity with an Essential Role in Dictating Its Expression and Localization in the Brain. J Biol Chem, 290(22), 13622-13639.

Ostrom, Q. T., Bauchet, L., Davis, F. G., Deltour, I., Fisher, J. L., Langer, C. E., et al. (2014). The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol, 16(7), 896-913.

242

Bibliografía

Ostrow, K. L., Park, H. L., Hoque, M. O., Kim, M. S., Liu, J., Argani, P., et al. (2009). Pharmacologic unmasking of epigenetically silenced genes in breast cancer. Clin Cancer Res, 15(4), 1184-1191.

Pallud, J., Capelle, L., & Huberfeld, G. (2013). Tumoral epileptogenicity: how does it happen? Epilepsia, 54 Suppl 9, 30-34.

Park, C.-K., Kim, J., Yim, S. Y., Lee, A. R., Han, J. H., Kim, C.-Y., et al. (2011). Usefulness of MS-MLPA for detection of MGMT promoter methylation in the evaluation of pseudoprogression in glioblastoma patients. Neuro-Oncology, 13(2), 195-202.

Park, S. H., Kim, K. E., Hwang, H. Y., & Kim, T. Y. (2003). Regulatory effect of SOCS on NF-kappaB activity in murine monocytes/macrophages. DNA Cell Biol, 22(2), 131-139.

Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., & Pisani, P. (2005). Global Cancer Statistics, 2002. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 55(2), 74-108.

Parsons, D. W., Jones, S., Zhang, X., Lin, J. C., Leary, R. J., Angenendt, P., et al. (2008). An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science, 321(5897), 1807-1812.

Patel, N., Itakura, T., Jeong, S., Liao, C. P., Roy-Burman, P., Zandi, E., et al. (2015). Expression and functional role of orphan receptor GPR158 in prostate cancer growth and progression. PLoS One, 10(2), e0117758.

Paz, M. F., Yaya-Tur, R., Rojas-Marcos, I., Reynes, G., Pollan, M., Aguirre-Cruz, L., et al. (2004). CpG island hypermethylation of the DNA repair enzyme methyltransferase predicts response to temozolomide in primary gliomas. Clin Cancer Res, 10(15), 4933-4938.

Pegg, A. E. (1990). Mammalian O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 50(19), 6119-6129.

Perez, J. G., Tran, N. L., Rosenblum, M. G., Schneider, C. S., Connolly, N. P., Kim, A. J., et al. (2016). The TWEAK receptor Fn14 is a potential cell surface portal for targeted delivery of glioblastoma therapeutics. Oncogene, 35(17), 2145-2155.

Phillips, K.-A., Collins, I. M., Milne, R. L., McLachlan, S. A., Friedlander, M., Hickey, M., et al. (2016). Anti-Müllerian hormone serum concentrations of women with germline BRCA1 or BRCA2 mutations. Human Reproduction (Oxford, England), 31(5), 1126-1132.

243

Bibliografía

Ostrow, K. L., Park, H. L., Hoque, M. O., Kim, M. S., Liu, J., Argani, P., et al. (2009). Pharmacologic unmasking of epigenetically silenced genes in breast cancer. Clin Cancer Res, 15(4), 1184-1191.

Pallud, J., Capelle, L., & Huberfeld, G. (2013). Tumoral epileptogenicity: how does it happen? Epilepsia, 54 Suppl 9, 30-34.

Park, C.-K., Kim, J., Yim, S. Y., Lee, A. R., Han, J. H., Kim, C.-Y., et al. (2011). Usefulness of MS-MLPA for detection of MGMT promoter methylation in the evaluation of pseudoprogression in glioblastoma patients. Neuro-Oncology, 13(2), 195-202.

Park, S. H., Kim, K. E., Hwang, H. Y., & Kim, T. Y. (2003). Regulatory effect of SOCS on NF-kappaB activity in murine monocytes/macrophages. DNA Cell Biol, 22(2), 131-139.

Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., & Pisani, P. (2005). Global Cancer Statistics, 2002. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 55(2), 74-108.

Parsons, D. W., Jones, S., Zhang, X., Lin, J. C., Leary, R. J., Angenendt, P., et al. (2008). An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science, 321(5897), 1807-1812.

Patel, N., Itakura, T., Jeong, S., Liao, C. P., Roy-Burman, P., Zandi, E., et al. (2015). Expression and functional role of orphan receptor GPR158 in prostate cancer growth and progression. PLoS One, 10(2), e0117758.

Paz, M. F., Yaya-Tur, R., Rojas-Marcos, I., Reynes, G., Pollan, M., Aguirre-Cruz, L., et al. (2004). CpG island hypermethylation of the DNA repair enzyme methyltransferase predicts response to temozolomide in primary gliomas. Clin Cancer Res, 10(15), 4933-4938.

Pegg, A. E. (1990). Mammalian O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 50(19), 6119-6129.

Perez, J. G., Tran, N. L., Rosenblum, M. G., Schneider, C. S., Connolly, N. P., Kim, A. J., et al. (2016). The TWEAK receptor Fn14 is a potential cell surface portal for targeted delivery of glioblastoma therapeutics. Oncogene, 35(17), 2145-2155.

Phillips, K.-A., Collins, I. M., Milne, R. L., McLachlan, S. A., Friedlander, M., Hickey, M., et al. (2016). Anti-Müllerian hormone serum concentrations of women with germline BRCA1 or BRCA2 mutations. Human Reproduction (Oxford, England), 31(5), 1126-1132.

Bibliografía

Pike, B. L., Greiner, T. C., Wang, X., Weisenburger, D. D., Hsu, Y. H., Renaud, G., et al. (2008). DNA methylation profiles in diffuse large B-cell lymphoma and their relationship to gene expression status. Leukemia, 22(5), 1035-1043.

Podjaski, C., Alvarez, J. I., Bourbonniere, L., Larouche, S., Terouz, S., Bin, J. M., et al. (2015). Netrin 1 regulates blood-brain barrier function and neuroinflammation. Brain, 138(Pt 6), 1598-1612.

Pointer, K. B., Clark, P. A., Zorniak, M., Alrfaei, B. M., & Kuo, J. S. (2014). Glioblastoma cancer stem cells: Biomarker and therapeutic advances. Neurochem Int, 71, 1-7.

Polivka, J., Jr., Polivka, J., Rohan, V., Topolcan, O., & Ferda, J. (2012). New molecularly targeted therapies for glioblastoma multiforme. Anticancer Res, 32(7), 2935-2946.

Poltermann, S., Schlehofer, B., Steindorf, K., Schnitzler, P., Geletneky, K., & Schlehofer, J. R. (2006). Lack of association of herpesviruses with brain tumors. J Neurovirol, 12(2), 90-99.

Poltronieri, P., D'Urso, P. I., Mezzolla, V., & D'Urso, O. F. (2013). Potential of anti-cancer therapy based on anti-miR-155 oligonucleotides in glioma and brain tumours. Chem Biol Drug Des, 81(1), 79-84.

Pope, W. B., Prins, R. M., Albert Thomas, M., Nagarajan, R., Yen, K. E., Bittinger, M. A., et al. (2012). Non-invasive detection of 2-hydroxyglutarate and other metabolites in IDH1 mutant glioma patients using magnetic resonance spectroscopy. J Neurooncol, 107(1), 197-205.

Prensner, J. R., & Chinnaiyan, A. M. (2011). Metabolism unhinged: IDH mutations in cancer. Nat Med, 17(3), 291-293.

Preusser, M., Charles Janzer, R., Felsberg, J., Reifenberger, G., Hamou, M. F., Diserens, A. C., et al. (2008). Anti-O6-methylguanine-methyltransferase (MGMT) immunohistochemistry in glioblastoma multiforme: observer variability and lack of association with patient survival impede its use as clinical biomarker. Brain Pathol, 18(4), 520-532.

Purves, D. (2004). Neuroscience: Sinauer Associates Incorporated.

Qian, X. C., & Brent, T. P. (1997). Methylation hot spots in the 5' flanking region denote silencing of the O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene. Cancer Res, 57(17), 3672-3677.

244

Bibliografía

Qu, M., Jiao, H., Zhao, J., Ren, Z. P., Smits, A., Kere, J., et al. (2010). Molecular genetic and epigenetic analysis of NCX2/SLC8A2 at 19q13.3 in human gliomas. Neuropathol Appl Neurobiol, 36(3), 198-210.

Quinn, J. A., Desjardins, A., Weingart, J., Brem, H., Dolan, M. E., Delaney, S. M., et al. (2005). Phase I trial of temozolomide plus O6-benzylguanine for patients with recurrent or progressive malignant glioma. J Clin Oncol, 23(28), 7178-7187.

Quinn, J. A., Pluda, J., Dolan, M. E., Delaney, S., Kaplan, R., Rich, J. N., et al. (2002). Phase II trial of carmustine plus O(6)-benzylguanine for patients with nitrosourea-resistant recurrent or progressive malignant glioma. J Clin Oncol, 20(9), 2277-2283.

Raccurt, M., Tam, S. P., Lau, P., Mertani, H. C., Lambert, A., Garcia-Caballero, T., et al. (2003). Suppressor of cytokine signalling gene expression is elevated in breast carcinoma. Br J Cancer, 89(3), 524-532.

Rahbar, A., Stragliotto, G., Orrego, A., Peredo, I., Taher, C., Willems, J., et al. (2012). Low levels of Human Cytomegalovirus Infection in Glioblastoma multiforme associates with patient survival; -a case-control study. Herpesviridae, 3, 3.

Rajaraman, P., Melin, B. S., Wang, Z., McKean-Cowdin, R., Michaud, D., Wang, S. S., et al. (2012). Genome-wide Association Study of Glioma and Meta-Analysis. Human genetics, 131(12), 1877-1888.

Renault, I. Z., & Golgher, D. (2015). Molecular Genetics of Glioblastomas: Defining Subtypes and Understanding the Biology. Neuroimaging Clinics of North America, 25(1), 97-103.

Reuter, J. D., Gomez, D. L., Wilson, J. H., & van den Pol, A. N. (2004). Systemic Immune Deficiency Necessary for Cytomegalovirus Invasion of the Mature Brain. Journal of Virology, 78(3), 1473-1487.

Riemenschneider, M. (2010). Molecular diagnostics of gliomas: state of the art. Acta Neuropathol 120(5), 567-584.

Rivera, A. L., Pelloski, C. E., Gilbert, M. R., Colman, H., De La Cruz, C., Sulman, E. P., et al. (2010). MGMT promoter methylation is predictive of response to radiotherapy and prognostic in the absence of adjuvant alkylating chemotherapy for glioblastoma. Neuro Oncol, 12(2), 116-121.

Rodriguez-Paredes, M., & Esteller, M. (2011). Cancer epigenetics reaches mainstream oncology. Nat Med, 17(3), 330-339.

245

Bibliografía

Qu, M., Jiao, H., Zhao, J., Ren, Z. P., Smits, A., Kere, J., et al. (2010). Molecular genetic and epigenetic analysis of NCX2/SLC8A2 at 19q13.3 in human gliomas. Neuropathol Appl Neurobiol, 36(3), 198-210.

Quinn, J. A., Desjardins, A., Weingart, J., Brem, H., Dolan, M. E., Delaney, S. M., et al. (2005). Phase I trial of temozolomide plus O6-benzylguanine for patients with recurrent or progressive malignant glioma. J Clin Oncol, 23(28), 7178-7187.

Quinn, J. A., Pluda, J., Dolan, M. E., Delaney, S., Kaplan, R., Rich, J. N., et al. (2002). Phase II trial of carmustine plus O(6)-benzylguanine for patients with nitrosourea-resistant recurrent or progressive malignant glioma. J Clin Oncol, 20(9), 2277-2283.

Raccurt, M., Tam, S. P., Lau, P., Mertani, H. C., Lambert, A., Garcia-Caballero, T., et al. (2003). Suppressor of cytokine signalling gene expression is elevated in breast carcinoma. Br J Cancer, 89(3), 524-532.

Rahbar, A., Stragliotto, G., Orrego, A., Peredo, I., Taher, C., Willems, J., et al. (2012). Low levels of Human Cytomegalovirus Infection in Glioblastoma multiforme associates with patient survival; -a case-control study. Herpesviridae, 3, 3.

Rajaraman, P., Melin, B. S., Wang, Z., McKean-Cowdin, R., Michaud, D., Wang, S. S., et al. (2012). Genome-wide Association Study of Glioma and Meta-Analysis. Human genetics, 131(12), 1877-1888.

Renault, I. Z., & Golgher, D. (2015). Molecular Genetics of Glioblastomas: Defining Subtypes and Understanding the Biology. Neuroimaging Clinics of North America, 25(1), 97-103.

Reuter, J. D., Gomez, D. L., Wilson, J. H., & van den Pol, A. N. (2004). Systemic Immune Deficiency Necessary for Cytomegalovirus Invasion of the Mature Brain. Journal of Virology, 78(3), 1473-1487.

Riemenschneider, M. (2010). Molecular diagnostics of gliomas: state of the art. Acta Neuropathol 120(5), 567-584.

Rivera, A. L., Pelloski, C. E., Gilbert, M. R., Colman, H., De La Cruz, C., Sulman, E. P., et al. (2010). MGMT promoter methylation is predictive of response to radiotherapy and prognostic in the absence of adjuvant alkylating chemotherapy for glioblastoma. Neuro Oncol, 12(2), 116-121.

Rodriguez-Paredes, M., & Esteller, M. (2011). Cancer epigenetics reaches mainstream oncology. Nat Med, 17(3), 330-339.

Bibliografía

Rohle, D., Popovici-Muller, J., Palaskas, N., Turcan, S., Grommes, C., Campos, C., et al. (2013). An inhibitor of mutant IDH1 delays growth and promotes differentiation of glioma cells. Science, 340(6132), 626-630.

Roninson, I. B. (2003). Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Res, 63(11), 2705-2715.

Rosenberger, P., Schwab, J. M., Mirakaj, V., Masekowsky, E., Mager, A., Morote-Garcia, J. C., et al. (2009). Hypoxia-inducible factor-dependent induction of netrin-1 dampens inflammation caused by hypoxia. Nat Immunol, 10(2), 195-202.

Royds, J. A., & Iacopetta, B. (2006). p53 and disease: when the guardian angel fails. Cell Death Differ, 13(6), 1017-1026.

Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., & Guo, D. (2013). Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel), 5(4), 1469-1484.

Ruano, Y., Mollejo, M., Camacho, F. I., Rodriguez de Lope, A., Fiano, C., Ribalta, T., et al. (2008). Identification of survival-related genes of the phosphatidylinositol 3'-kinase signaling pathway in glioblastoma multiforme. Cancer, 112(7), 1575-1584.

Ruano, Y., Mollejo, M., Ribalta, T., Fiano, C., Camacho, F. I., Gomez, E., et al. (2006). Identification of novel candidate target genes in amplicons of Glioblastoma multiforme tumors detected by expression and CGH microarray profiling. Mol Cancer, 5, 39.

Rui, L., Yuan, M., Frantz, D., Shoelson, S., & White, M. F. (2002). SOCS-1 and SOCS-3 block insulin signaling by ubiquitin-mediated degradation of IRS1 and IRS2. J Biol Chem, 277(44), 42394-42398.

Ryu, C. H., Yoon, W. S., Park, K. Y., Kim, S. M., Lim, J. Y., Woo, J. S., et al. (2012). Valproic acid downregulates the expression of MGMT and sensitizes temozolomide-resistant glioma cells. J Biomed Biotechnol, 2012, 987495.

Sabatier, J., Uro-Coste, E., Pommepuy, I., Labrousse, F., Allart, S., Tremoulet, M., et al. (2005). Detection of human cytomegalovirus genome and gene products in central nervous system tumours. Br J Cancer, 92(4), 747-750.

Sacco, J. J., Coulson, J. M., Clague, M. J., & Urbe, S. (2010). Emerging roles of deubiquitinases in cancer-associated pathways. IUBMB Life, 62(2), 140-157.

246

Bibliografía

Said, H. M., Hagemann, C., Staab, A., Stojic, J., Kuhnel, S., Vince, G. H., et al. (2007). Expression patterns of the hypoxia-related genes osteopontin, CA9, erythropoietin, VEGF and HIF-1alpha in human glioma in vitro and in vivo. Radiother Oncol, 83(3), 398-405.

Said, H. M., Supuran, C. T., Hageman, C., Staab, A., Polat, B., Katzer, A., et al. (2010). Modulation of carbonic anhydrase 9 (CA9) in human brain cancer. Curr Pharm Des, 16(29), 3288-3299.

Salazar, M., Carracedo, A., Salanueva, I. J., Hernandez-Tiedra, S., Lorente, M., Egia, A., et al. (2009). Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells. J Clin Invest, 119(5), 1359-1372.

Salk, J. J., Fox, E. J., & Loeb, L. A. (2010). Mutational heterogeneity in human cancers: origin and consequences. Annu Rev Pathol, 5, 51-75.

Sallinen, S. L., Sallinen, P. K., Haapasalo, H. K., Helin, H. J., Helen, P. T., Schraml, P., et al. (2000). Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques. Cancer Res, 60(23), 6617-6622.

Sampson, J. H., & Mitchell, D. A. (2011). Is Cytomegalovirus a Therapeutic Target in Glioblastoma? Clinical Cancer Research, 17(14), 4619-4621.

Sampson, J. H., & Mitchell, D. A. (2011). Is cytomegalovirus a therapeutic target in glioblastoma? Clin Cancer Res, 17(14), 4619-4621.

Sanson, M., Marie, Y., Paris, S., Idbaih, A., Laffaire, J., Ducray, F., et al. (2009). Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol, 27(25), 4150-4154.

Santosh, V., Arivazhagan, A., Sreekanthreddy, P., Srinivasan, H., Thota, B., Srividya, M. R., et al. (2010). Grade-specific expression of insulin-like growth factor-binding proteins-2, -3, and -5 in astrocytomas: IGFBP-3 emerges as a strong predictor of survival in patients with newly diagnosed glioblastoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 19(6), 1399-1408.

Sarkar, C., Karak, A. K., Nath, N., Sharma, M. C., Mahapatra, A. K., Chattopadhyay, P., et al. (2005). Apoptosis and proliferation: correlation with p53 in astrocytic tumours. J Neurooncol, 73(2), 93-100.

Sasi, W., Sharma, A. K., & Mokbel, K. (2014). The Role of Suppressors of Cytokine Signalling in Human Neoplasms. Molecular Biology International, 2014, 630797.

247

Bibliografía

Said, H. M., Hagemann, C., Staab, A., Stojic, J., Kuhnel, S., Vince, G. H., et al. (2007). Expression patterns of the hypoxia-related genes osteopontin, CA9, erythropoietin, VEGF and HIF-1alpha in human glioma in vitro and in vivo. Radiother Oncol, 83(3), 398-405.

Said, H. M., Supuran, C. T., Hageman, C., Staab, A., Polat, B., Katzer, A., et al. (2010). Modulation of carbonic anhydrase 9 (CA9) in human brain cancer. Curr Pharm Des, 16(29), 3288-3299.

Salazar, M., Carracedo, A., Salanueva, I. J., Hernandez-Tiedra, S., Lorente, M., Egia, A., et al. (2009). Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells. J Clin Invest, 119(5), 1359-1372.

Salk, J. J., Fox, E. J., & Loeb, L. A. (2010). Mutational heterogeneity in human cancers: origin and consequences. Annu Rev Pathol, 5, 51-75.

Sallinen, S. L., Sallinen, P. K., Haapasalo, H. K., Helin, H. J., Helen, P. T., Schraml, P., et al. (2000). Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques. Cancer Res, 60(23), 6617-6622.

Sampson, J. H., & Mitchell, D. A. (2011). Is Cytomegalovirus a Therapeutic Target in Glioblastoma? Clinical Cancer Research, 17(14), 4619-4621.

Sampson, J. H., & Mitchell, D. A. (2011). Is cytomegalovirus a therapeutic target in glioblastoma? Clin Cancer Res, 17(14), 4619-4621.

Sanson, M., Marie, Y., Paris, S., Idbaih, A., Laffaire, J., Ducray, F., et al. (2009). Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol, 27(25), 4150-4154.

Santosh, V., Arivazhagan, A., Sreekanthreddy, P., Srinivasan, H., Thota, B., Srividya, M. R., et al. (2010). Grade-specific expression of insulin-like growth factor-binding proteins-2, -3, and -5 in astrocytomas: IGFBP-3 emerges as a strong predictor of survival in patients with newly diagnosed glioblastoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 19(6), 1399-1408.

Sarkar, C., Karak, A. K., Nath, N., Sharma, M. C., Mahapatra, A. K., Chattopadhyay, P., et al. (2005). Apoptosis and proliferation: correlation with p53 in astrocytic tumours. J Neurooncol, 73(2), 93-100.

Sasi, W., Sharma, A. K., & Mokbel, K. (2014). The Role of Suppressors of Cytokine Signalling in Human Neoplasms. Molecular Biology International, 2014, 630797.

Bibliografía

Sato, F., & Meltzer, S. J. (2006). CpG island hypermethylation in progression of esophageal and gastric cancer. Cancer, 106(3), 483-493.

Scrideli, C. A., Carlotti, C. G., Jr., Okamoto, O. K., Andrade, V. S., Cortez, M. A., Motta, F. J., et al. (2008). Gene expression profile analysis of primary glioblastomas and non-neoplastic brain tissue: identification of potential target genes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol, 88(3), 281-291.

Scheurer, M. E., Bondy, M. L., Aldape, K. D., Albrecht, T., & El-Zein, R. (2008). Detection of human cytomegalovirus in different histological types of gliomas. Acta Neuropathol, 116(1), 79-86.

Schneider, K., Meyer-Koenig, U., & Hufert, F. T. (2008). Human cytomegalovirus impairs the function of plasmacytoid dendritic cells in lymphoid organs. PLoS One, 3(10), e3482.

Selak, S., Paternain, A. V., Aller, M. I., Pico, E., Rivera, R., & Lerma, J. (2009). A role for SNAP25 in internalization of kainate receptors and synaptic plasticity. Neuron, 63(3), 357-371.

Sen, T., Sen, N., Noordhuis, M. G., Ravi, R., Wu, T. C., Ha, P. K., et al. (2012). OGDHL Is a Modifier of AKT-Dependent Signaling and NF-κB Function. PLoS ONE, 7(11), e48770.

Shen, J., Lu, J., Sui, L., Wang, D., Yin, M., Hoffmann, I., et al. (2014). The orthologous Tbx transcription factors Omb and TBX2 induce epithelial cell migration and extrusion in vivo without involvement of matrix metalloproteinases. Oncotarget, 5(23), 11998-12015.

Shu, Y. J., Weng, H., Ye, Y. Y., Hu, Y. P., Bao, R. F., Cao, Y., et al. (2015). SPOCK1 as a potential cancer prognostic marker promotes the proliferation and metastasis of gallbladder cancer cells by activating the PI3K/AKT pathway. Mol Cancer, 14, 12.

Smits, A., Jin, Z., Elsir, T., Pedder, H., Nister, M., Alafuzoff, I., et al. (2012). GABA-A channel subunit expression in human glioma correlates with tumor histology and clinical outcome. PLoS One, 7(5), e37041.

Soderberg-Naucler, C. (2006a). Does cytomegalovirus play a causative role in the development of various inflammatory diseases and cancer? J Intern Med, 259(3), 219-246.

Soderberg-Naucler, C. (2006b). Human cytomegalovirus persists in its host and attacks and avoids elimination by the immune system. Crit Rev Immunol, 26(3), 231-264.

248

Bibliografía

Solomon, I. H., Ramkissoon, S. H., Milner, D. A., Jr., & Folkerth, R. D. (2014). Cytomegalovirus and glioblastoma: a review of evidence for their association and indications for testing and treatment. J Neuropathol Exp Neurol, 73(11), 994-998.

Song, X., Han, P., Liu, J., Wang, Y., Li, D., He, J., et al. (2015). Up-regulation of SPOCK1 induces epithelial-mesenchymal transition and promotes migration and invasion in esophageal squamous cell carcinoma. J Mol Histol, 46(4-5), 347-356.

Stein, G. H., Drullinger, L. F., Soulard, A., & Dulic, V. (1999). Differential roles for cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p16 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts. Mol Cell Biol, 19(3), 2109-2117.

Stockhausen, M.-T., Kristoffersen, K., & Poulsen, H. S. (2010). The functional role of Notch signaling in human gliomas. Neuro-Oncology, 12(2), 199-211.

Straat, K., Liu, C., Rahbar, A., Zhu, Q., Liu, L., Wolmer-Solberg, N., et al. (2009). Activation of telomerase by human cytomegalovirus. J Natl Cancer Inst, 101(7), 488-497.

Strelau, J., Schmeer, C., Peterziel, H., Sackmann, T., Herold-Mende, C., Steiner, H., et al. (2008). Expression and putative functions of GDF-15, a member of the TGF-beta superfamily, in human glioma and glioblastoma cell lines. Cancer Lett, 270(1), 30-39.

Stupp, R., & Weber, D. C. (2005). The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie, 28(6-7), 315-317.

Sun, X., Zhao, D., Li, Y. L., Sun, Y., Lei, X. H., Zhang, J. N., et al. (2013). Regulation of ASIC1 by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in human glioblastoma multiforme. Oncol Rep, 30(6), 2852-2858.

Suva, M. L., Riggi, N., & Bernstein, B. E. (2013). Epigenetic reprogramming in cancer. Science, 339(6127), 1567-1570.

Swiatek-Machado, K., & Kaminska, B. (2013). STAT Signaling in Glioma Cells. In J. Barańska (Ed.), Glioma Signaling (pp. 189-208). Dordrecht: Springer Netherlands.

Taby, R., & Issa, J. P. (2010). Cancer epigenetics. CA Cancer J Clin, 60(6), 376-392.

249

Bibliografía

Solomon, I. H., Ramkissoon, S. H., Milner, D. A., Jr., & Folkerth, R. D. (2014). Cytomegalovirus and glioblastoma: a review of evidence for their association and indications for testing and treatment. J Neuropathol Exp Neurol, 73(11), 994-998.

Song, X., Han, P., Liu, J., Wang, Y., Li, D., He, J., et al. (2015). Up-regulation of SPOCK1 induces epithelial-mesenchymal transition and promotes migration and invasion in esophageal squamous cell carcinoma. J Mol Histol, 46(4-5), 347-356.

Stein, G. H., Drullinger, L. F., Soulard, A., & Dulic, V. (1999). Differential roles for cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p16 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts. Mol Cell Biol, 19(3), 2109-2117.

Stockhausen, M.-T., Kristoffersen, K., & Poulsen, H. S. (2010). The functional role of Notch signaling in human gliomas. Neuro-Oncology, 12(2), 199-211.

Straat, K., Liu, C., Rahbar, A., Zhu, Q., Liu, L., Wolmer-Solberg, N., et al. (2009). Activation of telomerase by human cytomegalovirus. J Natl Cancer Inst, 101(7), 488-497.

Strelau, J., Schmeer, C., Peterziel, H., Sackmann, T., Herold-Mende, C., Steiner, H., et al. (2008). Expression and putative functions of GDF-15, a member of the TGF-beta superfamily, in human glioma and glioblastoma cell lines. Cancer Lett, 270(1), 30-39.

Stupp, R., & Weber, D. C. (2005). The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie, 28(6-7), 315-317.

Sun, X., Zhao, D., Li, Y. L., Sun, Y., Lei, X. H., Zhang, J. N., et al. (2013). Regulation of ASIC1 by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in human glioblastoma multiforme. Oncol Rep, 30(6), 2852-2858.

Suva, M. L., Riggi, N., & Bernstein, B. E. (2013). Epigenetic reprogramming in cancer. Science, 339(6127), 1567-1570.

Swiatek-Machado, K., & Kaminska, B. (2013). STAT Signaling in Glioma Cells. In J. Barańska (Ed.), Glioma Signaling (pp. 189-208). Dordrecht: Springer Netherlands.

Taby, R., & Issa, J. P. (2010). Cancer epigenetics. CA Cancer J Clin, 60(6), 376-392.

Bibliografía

Takase, T., Hibi, K., Yamazaki, T., Nakayama, H., Taguchi, M., Kasai, Y., et al. (2003). PGP9.5 overexpression in esophageal squamous cell carcinoma. Hepatogastroenterology, 50(53), 1278-1280.

Tan, M., Wang, Y., Guan, K., & Sun, Y. (2000). PTGF-beta, a type beta transforming growth factor (TGF-beta) superfamily member, is a p53 target gene that inhibits tumor cell growth via TGF-beta signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, 97(1), 109-114.

Tang, K.-W., Hellstrand, K., & Larsson, E. (2015). Absence of cytomegalovirus in high-coverage DNA sequencing of human glioblastoma multiforme. International Journal of Cancer, 136(4), 977-981.

Tang, K. W., Alaei-Mahabadi, B., Samuelsson, T., Lindh, M., & Larsson, E. (2013). The landscape of viral expression and host gene fusion and adaptation in human cancer. Nat Commun, 4, 2513.

Tano, K., Shiota, S., Collier, J., Foote, R. S., & Mitra, S. (1990). Isolation and structural characterization of a cDNA clone encoding the human DNA repair protein for O6-alkylguanine. Proc Natl Acad Sci U S A, 87(2), 686-690.

Tarassishin, L., Lim, J., Weatherly, D. B., Angeletti, R. H., & Lee, S. C. (2014). Interleukin-1-induced changes in the glioblastoma secretome suggest its role in tumor progression. J Proteomics, 99, 152-168.

TCGA. (2008). Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature, 455(7216), 1061-1068.

Teodorczyk, M., & Schmidt, M. H. H. (2014). Notching on Cancer’s Door: Notch Signaling in Brain Tumors. Frontiers in Oncology, 4, 341.

Teodoridis, J. M., Strathdee, G., & Brown, R. (2004). Epigenetic silencing mediated by CpG island methylation: potential as a therapeutic target and as a biomarker. Drug Resist Updat, 7(4-5), 267-278.

Teodoridis, J. M., Strathdee, G., Plumb, J. A., & Brown, R. (2004). CpG-island methylation and epigenetic control of resistance to chemotherapy. Biochem Soc Trans, 32(Pt 6), 916-917.

Tezel, E., Hibi, K., Nagasaka, T., & Nakao, A. (2000). PGP9.5 as a prognostic factor in pancreatic cancer. Clin Cancer Res, 6(12), 4764-4767.

Thon, N., Kreth, S., & Kreth, F. W. (2013). Personalized treatment strategies in glioblastoma: MGMT promoter methylation status. Onco Targets Ther, 6, 1363-1372.

250

Bibliografía

Tomic, S., Chughtai, N., & Ali, S. (1999). SOCS-1, -2, -3: selective targets and functions downstream of the prolactin receptor. Mol Cell Endocrinol, 158(1-2), 45-54.

Toyota, M., Ahuja, N., Ohe-Toyota, M., Herman, J. G., Baylin, S. B., & Issa, J. P. (1999). CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 96(15), 8681-8686.

Tran, N. L., McDonough, W. S., Donohue, P. J., Winkles, J. A., Berens, T. J., Ross, K. R., et al. (2003). The human Fn14 receptor gene is up-regulated in migrating glioma cells in vitro and overexpressed in advanced glial tumors. Am J Pathol, 162(4), 1313-1321.

Trojan, J., Cloix, J. F., Ardourel, M. Y., Chatel, M., & Anthony, D. D. (2007). Insulin-like growth factor type I biology and targeting in malignant gliomas. Neuroscience, 145(3), 795-811.

Tso, C. L., Freije, W. A., Day, A., Chen, Z., Merriman, B., Perlina, A., et al. (2006). Distinct transcription profiles of primary and secondary glioblastoma subgroups. Cancer Res, 66(1), 159-167.

Turcan, S., Rohle, D., Goenka, A., Walsh, L. A., Fang, F., Yilmaz, E., et al. (2012). IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature, 483(7390), 479-483.

Valente, V., Serafim, R. B., de Oliveira, L. C., Adorni, F. S., Torrieri, R., Tirapelli, D. P., et al. (2013). Modulation of HJURP (Holliday Junction-Recognizing Protein) levels is correlated with glioblastoma cells survival. PLoS One, 8(4), e62200.

van den Bent, M. J. (2010). Interobserver variation of the histopathological diagnosis in clinical trials on glioma: a clinician's perspective. Acta Neuropathol, 120(3), 297-304.

van den Bent, M. J., Dubbink, H. J., Marie, Y., Brandes, A. A., Taphoorn, M. J. B., Wesseling, P., et al. (2010). IDH1 and IDH2 Mutations Are Prognostic but not Predictive for Outcome in Anaplastic Oligodendroglial Tumors: A Report of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor Group. Clinical Cancer Research, 16(5), 1597-1604.

van den Bent, M. J., Gravendeel, L. A., Gorlia, T., Kros, J. M., Lapre, L., Wesseling, P., et al. (2011). A hypermethylated phenotype is a better predictor of survival than MGMT methylation in anaplastic oligodendroglial brain tumors: a report from EORTC study 26951. Clin Cancer Res, 17(22), 7148-7155.

251

Bibliografía

Tomic, S., Chughtai, N., & Ali, S. (1999). SOCS-1, -2, -3: selective targets and functions downstream of the prolactin receptor. Mol Cell Endocrinol, 158(1-2), 45-54.

Toyota, M., Ahuja, N., Ohe-Toyota, M., Herman, J. G., Baylin, S. B., & Issa, J. P. (1999). CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 96(15), 8681-8686.

Tran, N. L., McDonough, W. S., Donohue, P. J., Winkles, J. A., Berens, T. J., Ross, K. R., et al. (2003). The human Fn14 receptor gene is up-regulated in migrating glioma cells in vitro and overexpressed in advanced glial tumors. Am J Pathol, 162(4), 1313-1321.

Trojan, J., Cloix, J. F., Ardourel, M. Y., Chatel, M., & Anthony, D. D. (2007). Insulin-like growth factor type I biology and targeting in malignant gliomas. Neuroscience, 145(3), 795-811.

Tso, C. L., Freije, W. A., Day, A., Chen, Z., Merriman, B., Perlina, A., et al. (2006). Distinct transcription profiles of primary and secondary glioblastoma subgroups. Cancer Res, 66(1), 159-167.

Turcan, S., Rohle, D., Goenka, A., Walsh, L. A., Fang, F., Yilmaz, E., et al. (2012). IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature, 483(7390), 479-483.

Valente, V., Serafim, R. B., de Oliveira, L. C., Adorni, F. S., Torrieri, R., Tirapelli, D. P., et al. (2013). Modulation of HJURP (Holliday Junction-Recognizing Protein) levels is correlated with glioblastoma cells survival. PLoS One, 8(4), e62200.

van den Bent, M. J. (2010). Interobserver variation of the histopathological diagnosis in clinical trials on glioma: a clinician's perspective. Acta Neuropathol, 120(3), 297-304.

van den Bent, M. J., Dubbink, H. J., Marie, Y., Brandes, A. A., Taphoorn, M. J. B., Wesseling, P., et al. (2010). IDH1 and IDH2 Mutations Are Prognostic but not Predictive for Outcome in Anaplastic Oligodendroglial Tumors: A Report of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor Group. Clinical Cancer Research, 16(5), 1597-1604.

van den Bent, M. J., Gravendeel, L. A., Gorlia, T., Kros, J. M., Lapre, L., Wesseling, P., et al. (2011). A hypermethylated phenotype is a better predictor of survival than MGMT methylation in anaplastic oligodendroglial brain tumors: a report from EORTC study 26951. Clin Cancer Res, 17(22), 7148-7155.

Bibliografía

van den Boom, J., Wolter, M., Kuick, R., Misek, D. E., Youkilis, A. S., Wechsler, D. S., et al. (2003). Characterization of Gene Expression Profiles Associated with Glioma Progression Using Oligonucleotide-Based Microarray Analysis and Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. The American Journal of Pathology, 163(3), 1033-1043.

Vedham, V., & Verma, M. (2015). Cancer-associated infectious agents and epigenetic regulation. Methods Mol Biol, 1238, 333-354.

Verhaak, R. G., Hoadley, K. A., Purdom, E., Wang, V., Qi, Y., Wilkerson, M. D., et al. (2010). Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell, 17(1), 98-110.

von Deimling, A., Korshunov, A., & Hartmann, C. (2011). The next generation of glioma biomarkers: MGMT methylation, BRAF fusions and IDH1 mutations. Brain Pathol, 21(1), 74-87.

von Wronski, M. A., & Brent, T. P. (1994). Effect of 5-azacytidine on expression of the human DNA repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase. Carcinogenesis, 15(4), 577-582.

Wang, C. Y., Lai, M. D., Phan, N. N., Sun, Z., & Lin, Y. C. (2015). Meta-Analysis of Public Microarray Datasets Reveals Voltage-Gated Calcium Gene Signatures in Clinical Cancer Patients. PLoS One, 10(7), e0125766.

Wang, H., Wang, H., Shen, W., Huang, H., Hu, L., Ramdas, L., et al. (2003). Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 Enhances Glioblastoma Invasion by Activating Invasion-enhancing Genes. Cancer Research, 63(15), 4315-4321.

Wang, Y., & Leung, F. C. (2004). An evaluation of new criteria for CpG islands in the human genome as gene markers. Bioinformatics, 20(7), 1170-1177.

Ware, M. L., Berger, M. S., & Binder, D. K. (2003). Molecular biology of glioma tumorigenesis. Histol Histopathol, 18(1), 207-216.

Weller, M., Pfister, S. M., Wick, W., Hegi, M. E., Reifenberger, G., & Stupp, R. (2013). Molecular neuro-oncology in clinical practice: a new horizon. Lancet Oncol, 14(9), e370-379.

Wen, P. Y., & Kesari, S. (2008). Malignant gliomas in adults. N Engl J Med, 359(5), 492-507.

Wen, P. Y., & Kesari, S. (2008). Malignant Gliomas in Adults. New England Journal of Medicine, 359(5), 492-507.

252

Bibliografía

Wertz, I. E., & Dixit, V. M. (2010). Signaling to NF-kappaB: regulation by ubiquitination. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(3), a003350.

Wick, W., & Weller, M. (2009). Classification and management of anaplastic gliomas. Curr Opin Neurol, 22(6), 650-656.

Wilson, B. D., Ii, M., Park, K. W., Suli, A., Sorensen, L. K., Larrieu-Lahargue, F., et al. (2006). Netrins promote developmental and therapeutic angiogenesis. Science, 313(5787), 640-644.

Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., & Shay, J. W. (1989). Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol, 9(7), 3088-3092.

www.aecc.es. (2012). www.aecc.es.

www.bioarray.es.

www.bioconductor.org.

www.proteinatlas.org.

www.uniprot.org.

Xiong, Z., & Laird, P. W. (1997). COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res, 25(12), 2532-2534.

Xu, W., Yang, H., Liu, Y., Yang, Y., Wang, P., Kim, S. H., et al. (2011). Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenases. Cancer Cell, 19(1), 17-30.

Yamashita, Y., Ito, Y., Isomura, H., Takemura, N., Okamoto, A., Motomura, K., et al. (2014). Lack of presence of the human cytomegalovirus in human glioblastoma. Mod Pathol, 27(7), 922-929.

Yamazaki, T., Hibi, K., Takase, T., Tezel, E., Nakayama, H., Kasai, Y., et al. (2002). PGP9.5 as a marker for invasive colorectal cancer. Clin Cancer Res, 8(1), 192-195.

Yan, C., & Boyd, D. D. (2007). Regulation of matrix metalloproteinase gene expression. J Cell Physiol, 211(1), 19-26.

Yan, H., Parsons, D. W., Jin, G., McLendon, R., Rasheed, B. A., Yuan, W., et al. (2009). IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. N Engl J Med, 360(8), 765-773.

253

Bibliografía

Wertz, I. E., & Dixit, V. M. (2010). Signaling to NF-kappaB: regulation by ubiquitination. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(3), a003350.

Wick, W., & Weller, M. (2009). Classification and management of anaplastic gliomas. Curr Opin Neurol, 22(6), 650-656.

Wilson, B. D., Ii, M., Park, K. W., Suli, A., Sorensen, L. K., Larrieu-Lahargue, F., et al. (2006). Netrins promote developmental and therapeutic angiogenesis. Science, 313(5787), 640-644.

Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., & Shay, J. W. (1989). Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol, 9(7), 3088-3092.

www.aecc.es. (2012). www.aecc.es.

www.bioarray.es.

www.bioconductor.org.

www.proteinatlas.org.

www.uniprot.org.

Xiong, Z., & Laird, P. W. (1997). COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res, 25(12), 2532-2534.

Xu, W., Yang, H., Liu, Y., Yang, Y., Wang, P., Kim, S. H., et al. (2011). Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenases. Cancer Cell, 19(1), 17-30.

Yamashita, Y., Ito, Y., Isomura, H., Takemura, N., Okamoto, A., Motomura, K., et al. (2014). Lack of presence of the human cytomegalovirus in human glioblastoma. Mod Pathol, 27(7), 922-929.

Yamazaki, T., Hibi, K., Takase, T., Tezel, E., Nakayama, H., Kasai, Y., et al. (2002). PGP9.5 as a marker for invasive colorectal cancer. Clin Cancer Res, 8(1), 192-195.

Yan, C., & Boyd, D. D. (2007). Regulation of matrix metalloproteinase gene expression. J Cell Physiol, 211(1), 19-26.

Yan, H., Parsons, D. W., Jin, G., McLendon, R., Rasheed, B. A., Yuan, W., et al. (2009). IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. N Engl J Med, 360(8), 765-773.

Bibliografía

Yandava, C. N., Pillari, A., & Drazen, J. M. (1999). Radiation hybrid and cytogenetic mapping of SOCS1 and SOCS2 to chromosomes 16p13 and 12q, respectively. Genomics, 61(1), 108-111.

Yang, J., Yang, Q., Yu, J., Li, X., Yu, S., & Zhang, X. (2016). SPOCK1 promotes the proliferation, migration and invasion of glioma cells through PI3K/AKT and Wnt/beta-catenin signaling pathways. Oncol Rep, 35(6), 3566-3576.

Yang, Y., Liu, Y., Yao, X., Ping, Y., Jiang, T., Liu, Q., et al. (2011). Annexin 1 released by necrotic human glioblastoma cells stimulates tumor cell growth through the formyl peptide receptor 1. Am J Pathol, 179(3), 1504-1512.

Yu, F., Li, G., Gao, J., Sun, Y., Liu, P., Gao, H., et al. (2016). SPOCK1 is upregulated in recurrent glioblastoma and contributes to metastasis and Temozolomide resistance. Cell Prolif, 49(2), 195-206.

Yu, L., & Qi, S. (2012). Ten-Eleven Translocation-2 gene mutations: A potential new molecular marker in malignant gliomas (Review). Oncol Lett, 3(1), 7-10.

Zeng, A., Hu, Q., Liu, Y., Wang, Z., Cui, X., Li, R., et al. (2015). IDH1/2 mutation status combined with Ki-67 labeling index defines distinct prognostic groups in glioma. Oncotarget, 6(30), 30232-30238.

Zhang, J., Li, H., Yu, J. P., Wang, S. E., & Ren, X. B. (2012). Role of SOCS1 in tumor progression and therapeutic application. Int J Cancer, 130(9), 1971-1980.

Zhang, S. D., Leung, K. L., McCrudden, C. M., & Kwok, H. F. (2015). The Prognostic Significance of Combining VEGFA, FLT1 and KDR mRNA Expressions in Brain Tumors. J Cancer, 6(9), 812-818.

Zhao, S., Lin, Y., Xu, W., Jiang, W., Zha, Z., Wang, P., et al. (2009). Glioma-Derived Mutations in IDH1 Dominantly Inhibit IDH1 Catalytic Activity and Induce HIF-1α. Science, 324(5924), 261-265.

Zhou, H., Miki, R., Eeva, M., Fike, F. M., Seligson, D., Yang, L., et al. (2007). Reciprocal regulation of SOCS 1 and SOCS3 enhances resistance to ionizing radiation in glioblastoma multiforme. Clin Cancer Res, 13(8), 2344-2353.

Zimmers, T. A., Jin, X., Hsiao, E. C., McGrath, S. A., Esquela, A. F., & Koniaris, L. G. (2005). Growth differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine-1 induction after kidney and lung injury. Shock, 23(6), 543-548.

Anexos

ANEXOS

Anexos

ANEXO I: Protocolos de extracción de ADN y ARN.

Protocolo kit QIAamp DNA Investigator (Qiagen)

1. Añadir 200µL (microlitros) de Buffer AL a la muestra, mezclar mediante

agitación con vórtex.

2. Añadir 200µL de etanol (96-100%) y volver a mezclar mediante vórtex.

3. Pasar todo el volumen de la muestra a una columna Dneasy Mini Spin

colocada dentro de un tubo de 2mL (mililitros). Centrifugar a 8000rpm

(revoluciones por minuto) durante 1 minuto. Descartar el sobrenadante y

el tubo de recogida.

4. Colocar la columna en un nuevo tubo de recogida, añadir 500µL de

Buffer AW1 y centrifugar durante 1 minuto a 8000rpm. Descartar el

sobrenadante y el tubo de recogida.


Buffer AW2 y centrifugar durante 3 minutos a 14000rpm para secar la

membrana de la columna. Descartar el sobrenadante y el tubo de

recogida.

6. Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5mL y pipetear 200µL de

Buffer AE, disolución adecuadamente tamponada, directamente sobre la

membrana. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centifugar

a 8000rpm otro minuto para eluir.

Protocolo kit Forensic DNA (D3591-02 OMEGA bio-tek)

1. Añadir 225µL de Buffer BL y 1µL de RNA carrier e incubar a 60ºC

durante 10 minutos. Dar un pulso de centrifugación.

2. Equilibrar la columna HiBind DNA Mini en un tubo de recogida de 2mL y

añadir 100µL de Equilibration Buffer. Incubar a temperatura ambiente

257

Anexos

ANEXO I: Protocolos de extracción de ADN y ARN.

Protocolo kit QIAamp DNA Investigator (Qiagen)

1. Añadir 200µL (microlitros) de Buffer AL a la muestra, mezclar mediante

agitación con vórtex.

2. Añadir 200µL de etanol (96-100%) y volver a mezclar mediante vórtex.

3. Pasar todo el volumen de la muestra a una columna Dneasy Mini Spin

colocada dentro de un tubo de 2mL (mililitros). Centrifugar a 8000rpm

(revoluciones por minuto) durante 1 minuto. Descartar el sobrenadante y

el tubo de recogida.


Buffer AW1 y centrifugar durante 1 minuto a 8000rpm. Descartar el

sobrenadante y el tubo de recogida.


Buffer AW2 y centrifugar durante 3 minutos a 14000rpm para secar la

membrana de la columna. Descartar el sobrenadante y el tubo de

recogida.

6. Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5mL y pipetear 200µL de

Buffer AE, disolución adecuadamente tamponada, directamente sobre la

membrana. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centifugar

a 8000rpm otro minuto para eluir.

Protocolo kit Forensic DNA (D3591-02 OMEGA bio-tek)

1. Añadir 225µL de Buffer BL y 1µL de RNA carrier e incubar a 60ºC

durante 10 minutos. Dar un pulso de centrifugación.

2. Equilibrar la columna HiBind DNA Mini en un tubo de recogida de 2mL y

añadir 100µL de Equilibration Buffer. Incubar a temperatura ambiente

258

Anexos

durante 4 minutos. A continuación, centrifugar a máxima velocidad

durante 20 segundos.

3. Pasar todo el volumen del paso 1 a la columna. Centrifugar 1 minuto a

8000g (aceleración de la gravedad). Descartar el sobrenadante y el tubo

de recogida.

4. Colocar la columna en un nuevo tubo de recogida y añadir 500µL de

Buffer HB. Centrifugar 1 minuto a 8000g. Tirar el sobrenadante y re-

utilizar el tubo de recogida.

5. Añadir 750µL de Wash Buffer. Centrifugar 1 minuto a 8000g. Descartar

el sobrenadante y el tubo de recogida.

6. Usar un nuevo tubo de recogida y añadir 750µL de Wash Buffer.

Centrifugar 1 minuto a 8000g. Tirar el sobrenadante y reusar el tubo de

recogida.

7. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para secar la

columna.

8. Colocar la columna en un nuevo tubo de 1.5mL y añadir 50µL de Elution

Buffer precalentado a 70ºC. Incubar durante 3 minutos a temperatura

ambiente.

9. Centrifugar 1 minuto a 8000g para eluir el ADN de la columna.

10. Si es necesario realizar una segunda elución, repetir los pasos 8 y 9.

Protocolo RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation kit (Ambion)

1. Añadir 100µL de Solución de Lisis a 10X a la muestra (ya que el

material de partida fue menor de 10mg (miligramos)).

2. Homogeneizar con ayuda de una aguja de insulina.

3. Añadir 50µL de etanol al 100%. Vórtex y un pulso en la centrífuga.

Anexos

4. Pasar todo el volumen a una columna Microfilter Cartridge Assembly

y centrifugar 10 segundos a velocidad máxima (13200 rpm). En este

paso el ARN se queda retenido en la membrana de la columna.

5. Lavar la columna con 180µL de Wash Solution 1. Centrifugar durante

10 segundos.

6. Lavar la columna con 180µL de Wash Solution 2/3. Centrifugar


7. Repetir el paso 6.

8. Descartar el eluido y centrifugar durante 1 minuto a velocidad

máxima.

9. Pasar la columna a un tubo eppendorf nuevo (1.5mL) rotulado

adecuadamente. Eluir con 15µL de Elution Solution precalentada a

75ºC. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 30

segundos a velocidad máxima. Realizar una segunda elución en el

mismo tubo.

10. Tratamiento con ADNasa: añadir al ARN eluido 1µL de ADNse I y

3µL de ADNse I Buffer 10X. Mezclar vigorosamente. Incubar 20

minutos a 37ºC.

11. Vortear el ADNse I Inactivation Reagent y añadir un volumen igual a

1/10 del volumen de elución (Ejemplo: 30µL de ARN más 1µL de

ADNse I más 3µL de ADNse I Buffer 10X hacen un total de 34µL, por

lo que se tendrán que añadir 3.4µL de ADNse I Inactivation Reagent).

Incubar 2 minutos a temperatura ambiente, vorteando una vez al

pasar un minuto.

12. Centrifugar 1.5 minutos a velocidad máxima, de manera que se forma

un pellet. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y

rotulado.

13. Cuantificar el ARN en el NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo

Scientific), usando como blanco Elution Solution.

259

Anexos

durante 4 minutos. A continuación, centrifugar a máxima velocidad


3. Pasar todo el volumen del paso 1 a la columna. Centrifugar 1 minuto a

8000g (aceleración de la gravedad). Descartar el sobrenadante y el tubo

de recogida.

4. Colocar la columna en un nuevo tubo de recogida y añadir 500µL de

Buffer HB. Centrifugar 1 minuto a 8000g. Tirar el sobrenadante y re-

utilizar el tubo de recogida.

5. Añadir 750µL de Wash Buffer. Centrifugar 1 minuto a 8000g. Descartar

el sobrenadante y el tubo de recogida.

6. Usar un nuevo tubo de recogida y añadir 750µL de Wash Buffer.

Centrifugar 1 minuto a 8000g. Tirar el sobrenadante y reusar el tubo de

recogida.

7. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para secar la

columna.

8. Colocar la columna en un nuevo tubo de 1.5mL y añadir 50µL de Elution

Buffer precalentado a 70ºC. Incubar durante 3 minutos a temperatura

ambiente.

9. Centrifugar 1 minuto a 8000g para eluir el ADN de la columna.

10. Si es necesario realizar una segunda elución, repetir los pasos 8 y 9.

Protocolo RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation kit (Ambion)

1. Añadir 100µL de Solución de Lisis a 10X a la muestra (ya que el

material de partida fue menor de 10mg (miligramos)).

2. Homogeneizar con ayuda de una aguja de insulina.

3. Añadir 50µL de etanol al 100%. Vórtex y un pulso en la centrífuga.

Anexos

4. Pasar todo el volumen a una columna Microfilter Cartridge Assembly

y centrifugar 10 segundos a velocidad máxima (13200 rpm). En este

paso el ARN se queda retenido en la membrana de la columna.

5. Lavar la columna con 180µL de Wash Solution 1. Centrifugar durante

10 segundos.

6. Lavar la columna con 180µL de Wash Solution 2/3. Centrifugar


7. Repetir el paso 6.

8. Descartar el eluido y centrifugar durante 1 minuto a velocidad

máxima.

9. Pasar la columna a un tubo eppendorf nuevo (1.5mL) rotulado

adecuadamente. Eluir con 15µL de Elution Solution precalentada a

75ºC. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 30

segundos a velocidad máxima. Realizar una segunda elución en el

mismo tubo.

10. Tratamiento con ADNasa: añadir al ARN eluido 1µL de ADNse I y

3µL de ADNse I Buffer 10X. Mezclar vigorosamente. Incubar 20

minutos a 37ºC.

11. Vortear el ADNse I Inactivation Reagent y añadir un volumen igual a

1/10 del volumen de elución (Ejemplo: 30µL de ARN más 1µL de

ADNse I más 3µL de ADNse I Buffer 10X hacen un total de 34µL, por

lo que se tendrán que añadir 3.4µL de ADNse I Inactivation Reagent).

Incubar 2 minutos a temperatura ambiente, vorteando una vez al

pasar un minuto.

12. Centrifugar 1.5 minutos a velocidad máxima, de manera que se forma

un pellet. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y

rotulado.

13. Cuantificar el ARN en el NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo

Scientific), usando como blanco Elution Solution.

260

Anexos

ANEXO II: Localización cromosómica de las sondas del kit SALSA MLPA kit

P088 B1 Oligodendroglioma

Cromosoma 1 Cromosoma 19

Anexos

ANEXO III: Protocolo para determinar las co-deleciones en los brazos

cromosómicos 1p y/o 19q mediante el kit SALSA MLPA kit P088 B1

Oligodendroglioma (MRC-Holland) y resultados.

1. Desnaturalización de la muestra y de los controles y posterior

enfriamiento a 25ºC. La cantidad de muestra inicial recomendada por

el fabricante es de 100-200 ng de ADN en 5µL. No obstante, debido

a la fragmentación de los ADNs tumorales incluidos en parafina, se

decidió partir de una cantidad de ADN algo mayor (200-300ng).

2. Adición de la mezcla de sondas (Mástermix de hibridación: 1.5µL de

buffer MLPA y 1.5µL de probemix por cada tubo), desnaturalización

de la muestra (5 minutos a 98ºC) e hibridación de las sondas al ADN

de la muestra tumoral y de los controles. La hibridación, a 60ºC, se

llevó a cabo durante 16-20 horas.

3. Ligación de las sondas. Tras la hibridación, se disminuye la

temperatura a 54ºC y se adiciona la ADN-ligasa con su

correspondiente tampón (Mástermix ligasa 65 por cada tubo: 25µL

H2O, 3µL buffer ligasa A, 3µL buffer ligasa B y 1µL enzima ligasa 65).

Se incuba durante 15 minutos a 54ºC. A continuación, se

desnaturaliza la ADN-ligasa durante 5 minutos a 98ºC. La adición de

esta enzima ligasa provoca la unión covalente de los dos fragmentos

consecutivos de cada sonda. Sólo si las dos partes de la sonda han

hibridado correctamente se producirá la ligación (esta característica

permite detectar cambios en la secuencia de un único nucleótido). Se

baja la temperatura a 20ºC.

4. Amplificación de las sondas (no del ADN tumoral) mediante PCR.

Cada sonda será amplificada si los dos fragmentos que la componen

han sido ligados en el paso 3 del proceso. Si en la muestra tumoral

ha habido una deleción de la región en la que tiene que hibridar una

sonda concreta, no habrá amplificación de la sonda correspondiente.

261

Anexos

ANEXO II: Localización cromosómica de las sondas del kit SALSA MLPA kit

P088 B1 Oligodendroglioma

Cromosoma 1 Cromosoma 19

Anexos

ANEXO III: Protocolo para determinar las co-deleciones en los brazos

cromosómicos 1p y/o 19q mediante el kit SALSA MLPA kit P088 B1

Oligodendroglioma (MRC-Holland) y resultados.

1. Desnaturalización de la muestra y de los controles y posterior

enfriamiento a 25ºC. La cantidad de muestra inicial recomendada por

el fabricante es de 100-200 ng de ADN en 5µL. No obstante, debido

a la fragmentación de los ADNs tumorales incluidos en parafina, se

decidió partir de una cantidad de ADN algo mayor (200-300ng).

2. Adición de la mezcla de sondas (Mástermix de hibridación: 1.5µL de

buffer MLPA y 1.5µL de probemix por cada tubo), desnaturalización

de la muestra (5 minutos a 98ºC) e hibridación de las sondas al ADN

de la muestra tumoral y de los controles. La hibridación, a 60ºC, se

llevó a cabo durante 16-20 horas.

3. Ligación de las sondas. Tras la hibridación, se disminuye la

temperatura a 54ºC y se adiciona la ADN-ligasa con su

correspondiente tampón (Mástermix ligasa 65 por cada tubo: 25µL

H2O, 3µL buffer ligasa A, 3µL buffer ligasa B y 1µL enzima ligasa 65).

Se incuba durante 15 minutos a 54ºC. A continuación, se

desnaturaliza la ADN-ligasa durante 5 minutos a 98ºC. La adición de

esta enzima ligasa provoca la unión covalente de los dos fragmentos

consecutivos de cada sonda. Sólo si las dos partes de la sonda han

hibridado correctamente se producirá la ligación (esta característica

permite detectar cambios en la secuencia de un único nucleótido). Se

baja la temperatura a 20ºC.

4. Amplificación de las sondas (no del ADN tumoral) mediante PCR.

Cada sonda será amplificada si los dos fragmentos que la componen

han sido ligados en el paso 3 del proceso. Si en la muestra tumoral

ha habido una deleción de la región en la que tiene que hibridar una

sonda concreta, no habrá amplificación de la sonda correspondiente.

262

Anexos

Por el contrario, si la región de hibridación de la sonda ha sufrido una

amplificación (hay más de una copia de esa región en el genoma), el

producto de amplificación será más abundante de lo esperado. Para

ello, se añaden 10µL de mástermix de reacción de PCR por tubo

(7.5µL H2O, 2µL SALSA PCR primer mix y 0.5µL SALSA polimerasa).

Se continúa con el programa del termociclador con 35 ciclos de: 30

segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC y 1 minuto a 72ºC. A

continuación, se incubar durante 20 minutos a 72ºC y se baja la

temperatura a 15ºC.

Anexos

Resultados

A) Resultado correspondiente a una muestra sin deleciones: las sondas

están dentro de los límites establecidos (entre 0.7 y 1.4) B) Resultado

correspondiente a una muestra con deleción parcial de 1p: hay algunas

sondas de 1p que no llegan al límite inferior C) Resultado

correspondiente a una muestra con codeleción de 1p/19q: muchas de

las sondas de 1p y 19q no llegan al límite inferior. Las barras negras

corresponden a los controles internos, las verde oscuro son sondas de

1p, las verde claro de 1q, las azul claro de 19p y las azul oscuro a 19q.

A

B

C

263

Anexos

Por el contrario, si la región de hibridación de la sonda ha sufrido una

amplificación (hay más de una copia de esa región en el genoma), el

producto de amplificación será más abundante de lo esperado. Para

ello, se añaden 10µL de mástermix de reacción de PCR por tubo

(7.5µL H2O, 2µL SALSA PCR primer mix y 0.5µL SALSA polimerasa).

Se continúa con el programa del termociclador con 35 ciclos de: 30

segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC y 1 minuto a 72ºC. A

continuación, se incubar durante 20 minutos a 72ºC y se baja la

temperatura a 15ºC.

Anexos

Resultados

A) Resultado correspondiente a una muestra sin deleciones: las sondas

están dentro de los límites establecidos (entre 0.7 y 1.4) B) Resultado

correspondiente a una muestra con deleción parcial de 1p: hay algunas

sondas de 1p que no llegan al límite inferior C) Resultado

correspondiente a una muestra con codeleción de 1p/19q: muchas de

las sondas de 1p y 19q no llegan al límite inferior. Las barras negras

corresponden a los controles internos, las verde oscuro son sondas de

1p, las verde claro de 1q, las azul claro de 19p y las azul oscuro a 19q.

A

B

C

264

Anexos

ANEXO IV: Protocolo para la determinación del estado de metilación del gen

MGMT mediante el kit SALSA MLPA ME011 B1 Mismatch Repair Genes y para

la determinación del fenotipo hipermetilador en gliomas mediante el kit SALSA

MLPA ME042 B1 CIMP (MRC-Holland).

DÍA 1

1) Desnaturalización (termociclador). En este caso, cada muestra tiene su

propio control interno.

Se preparan 200-300ng de ADN en 5µL.

2) Hibridación (termociclador).

Se añade a cada tubo 3µL de mix de hibridación:

SALSA Probe Mix (MMR o CIMP)………….1.5µL MLPA buffer……………………………........1.5µL

DÍA 2

3) Ligación-Digestión. Este paso es el que diferencia el MS-MLPA del

MLPA convencional. En este punto del proceso, se divide en dos tubos

distintos el producto resultante de la hibridación. A uno de los tubos se le

añade la ligasa para unir los dos fragmentos de cada sonda; al otro, la

ligasa más la enzima de restricción sensible a metilación HhaI. El

primero de los tubos de cada muestra servirá de control ya que no está

98ºC 25º

C 10 min 2

min

95ºC 60º

C 1

min 16-20 horas

Anexos

digerido. En el segundo tubo se producirá la digestión de las sondas con

punto de corte para la enzima, sólo si la secuencia de reconocimiento no

está metilada. En las muestras en las que el ADN tumoral esté metilado,

la enzima no reconocerá su secuencia diana y no habrá digestión.

Muestras a temperatura ambiente.

Se preparan 3 mixes:

Mix A

Ligase-buffer A………………………………3µL H2O………………………………………….10µL Ligase-65 mix

Ligase-65 buffer B………………………….1.5µL H2O………………………………………….8.25µL Ligase-65 enzyme………………………….0.25µL

Ligase-Digestion mix

Ligase-65 buffer B………………………….1.5µL H2O………………………………………….7.75µL Ligase-65 enzyme………………………….0.25µL Hha1 enzyme……………………………….0.5µL

Se añaden 13µL del Mix A a cada muestra a temperatura

ambiente. Se divide cada muestra en dos (se tranfieren 10µL a un

segundo tubo).

Se colocan los tubos en el termociclador a 54ºC. Se añaden 10µL

de Ligase-65 mix a los primeros tubos y 10µL de Ligase-Digestion

mix a los segundos.

Se preparan los mixes para la PCR en hielo. En el tubo digerido

con HhaI sólo se amplificarán las sondas control que no tienen

98ºC 10º

C 5

min ∞

54ºC

30 min

265

Anexos

ANEXO IV: Protocolo para la determinación del estado de metilación del gen

MGMT mediante el kit SALSA MLPA ME011 B1 Mismatch Repair Genes y para

la determinación del fenotipo hipermetilador en gliomas mediante el kit SALSA

MLPA ME042 B1 CIMP (MRC-Holland).

DÍA 1

1) Desnaturalización (termociclador). En este caso, cada muestra tiene su

propio control interno.

Se preparan 200-300ng de ADN en 5µL.

2) Hibridación (termociclador).

Se añade a cada tubo 3µL de mix de hibridación:

SALSA Probe Mix (MMR o CIMP)………….1.5µL MLPA buffer……………………………........1.5µL

DÍA 2

3) Ligación-Digestión. Este paso es el que diferencia el MS-MLPA del

MLPA convencional. En este punto del proceso, se divide en dos tubos

distintos el producto resultante de la hibridación. A uno de los tubos se le

añade la ligasa para unir los dos fragmentos de cada sonda; al otro, la

ligasa más la enzima de restricción sensible a metilación HhaI. El

primero de los tubos de cada muestra servirá de control ya que no está

98ºC 25º

C 10 min 2

min

95ºC 60º

C 1

min 16-20 horas

Anexos

digerido. En el segundo tubo se producirá la digestión de las sondas con

punto de corte para la enzima, sólo si la secuencia de reconocimiento no

está metilada. En las muestras en las que el ADN tumoral esté metilado,

la enzima no reconocerá su secuencia diana y no habrá digestión.

Muestras a temperatura ambiente.

Se preparan 3 mixes:

Mix A

Ligase-buffer A………………………………3µL H2O………………………………………….10µL Ligase-65 mix

Ligase-65 buffer B………………………….1.5µL H2O………………………………………….8.25µL Ligase-65 enzyme………………………….0.25µL

Ligase-Digestion mix

Ligase-65 buffer B………………………….1.5µL H2O………………………………………….7.75µL Ligase-65 enzyme………………………….0.25µL Hha1 enzyme……………………………….0.5µL

Se añaden 13µL del Mix A a cada muestra a temperatura

ambiente. Se divide cada muestra en dos (se tranfieren 10µL a un

segundo tubo).

Se colocan los tubos en el termociclador a 54ºC. Se añaden 10µL

de Ligase-65 mix a los primeros tubos y 10µL de Ligase-Digestion

mix a los segundos.

Se preparan los mixes para la PCR en hielo. En el tubo digerido

con HhaI sólo se amplificarán las sondas control que no tienen

98ºC 10º

C 5

min ∞

54ºC

30 min

266

Anexos

punto de corte para la enzima y las sondas cuya región

complementaria del ADN esté metilada. El resto de las sondas,

como han sido digeridas en el paso anterior, no generan ningún

producto de amplificación. En el tubo control sin digerir se

amplificarán todas las sondas.

Mix sin enzima

Salsa PCR buffer……………………………2µL H2O…………………………………………...13µL

Mix con enzima

Salsa PCR primers………………………………1µL Salsa enzyme dilution buffer…………………….1µL

H2O…………………………………………......2.75µL Salsa Polymerase……………………………..0.25µL

Se pasan a tubos nuevos 5µL de cada muestra y se añaden 15µL

de mix sin enzima. Se colocan los tubos en el termociclador

precalentado a 72ºC. Se añaden 5µL de mix con enzima a cada

tubo y se continúa con el programa del termociclador.

Se carga una placa de 0.2µL de 96 pocillos. Se añade a cada

pocillo 2µL de muestra, 23µL de formamida y 0.5µL de ROX.

Se desnaturaliza la placa a 95ºC durante 5 minutos.

Se coloca la placa en el secuenciador:

o Programa: 3100 Avant Program Gen Scan o Dye Set: D o Run Mode: MLPA o Analysis Mo GS 500 Analysis.gsp

72ºC

30 seg

95ºC

60ºC

30 seg

72ºC

72ºC

1 min

20 min

35 ciclos

Anexos

ANEXO V: Resultados del MS-MLPA para MGMT

A

B

C

Resultados correspondientes a una muestra no metilada (A), parcialmente metilada (B) y metilada (C)

267

Anexos

punto de corte para la enzima y las sondas cuya región

complementaria del ADN esté metilada. El resto de las sondas,

como han sido digeridas en el paso anterior, no generan ningún

producto de amplificación. En el tubo control sin digerir se

amplificarán todas las sondas.

Mix sin enzima

Salsa PCR buffer……………………………2µL H2O…………………………………………...13µL

Mix con enzima

Salsa PCR primers………………………………1µL Salsa enzyme dilution buffer…………………….1µL

H2O…………………………………………......2.75µL Salsa Polymerase……………………………..0.25µL

Se pasan a tubos nuevos 5µL de cada muestra y se añaden 15µL

de mix sin enzima. Se colocan los tubos en el termociclador

precalentado a 72ºC. Se añaden 5µL de mix con enzima a cada

tubo y se continúa con el programa del termociclador.

Se carga una placa de 0.2µL de 96 pocillos. Se añade a cada

pocillo 2µL de muestra, 23µL de formamida y 0.5µL de ROX.

Se desnaturaliza la placa a 95ºC durante 5 minutos.

Se coloca la placa en el secuenciador:

o Programa: 3100 Avant Program Gen Scan o Dye Set: D o Run Mode: MLPA o Analysis Mo GS 500 Analysis.gsp

72ºC

30 seg

95ºC

60ºC

30 seg

72ºC

72ºC

1 min

20 min

35 ciclos

Anexos

ANEXO V: Resultados del MS-MLPA para MGMT

A

B

C

Resultados correspondientes a una muestra no metilada (A), parcialmente metilada (B) y metilada (C)

268

Anexos

ANEXO VI: Resultados del MS-MLPA del CIMP

A

B

A) Resultado correspondiente a una muestra CIMP positiva, cinco de los ocho genes del panel están metilados, B) Resultado correspondiente a una muestra CIMP negativa, sólo dos de los ocho genes del panel se encuentran metilados.

Anexos

ANEXO VII: Protocolo de detección de HCMV por el kit RealStar CMV PCR Kit

1.2 (Altona Diagnostics GmbM).

1. Extraer el ADN de las muestras siguiendo los protocolos anteriormente

descritos.

2. Descongelar, mezclar y centrifugar los reactivos y muestras.

3. Preparar la mezcla de reacción (Tabla 11), añadir 8µL de esta mezcla a

cada pocillo de la placa.

4. Añadir 5µL de cada muestra/estándar/control en el pocillo

correspondiente de la placa y mezclar con la pipeta.

5. Cubrir la placa con papel óptico.

6. Dar un pulso a la placa y colocarla en la qPCR.

7. Programar la qPCR según las indicaciones del fabricante (Tabla 12).

269

Anexos

ANEXO VI: Resultados del MS-MLPA del CIMP

A

B

A) Resultado correspondiente a una muestra CIMP positiva, cinco de los ocho genes del panel están metilados, B) Resultado correspondiente a una muestra CIMP negativa, sólo dos de los ocho genes del panel se encuentran metilados.

Anexos

ANEXO VII: Protocolo de detección de HCMV por el kit RealStar CMV PCR Kit

1.2 (Altona Diagnostics GmbM).

1. Extraer el ADN de las muestras siguiendo los protocolos anteriormente

descritos.

2. Descongelar, mezclar y centrifugar los reactivos y muestras.

3. Preparar la mezcla de reacción (Tabla 11), añadir 8µL de esta mezcla a

cada pocillo de la placa.

4. Añadir 5µL de cada muestra/estándar/control en el pocillo

correspondiente de la placa y mezclar con la pipeta.

5. Cubrir la placa con papel óptico.

6. Dar un pulso a la placa y colocarla en la qPCR.

7. Programar la qPCR según las indicaciones del fabricante (Tabla 12).

270

Anexos

ANEXO VIII: Nested PCR, detección de HCMV en muestras de tejido

congelado de gliomas

El método se obtuvo del artículo “Genetic Analysis of Cytomegalovirus in

Malignant Gliomas” (Bornali Bhattacharjee, NicholascRenzette and Timothy F.

Kowalik; Journal of Virology, June 2012, Volumen 86 Number 12).

Los cebadores externos amplifican una región de 1.3kbp del “major

immediate-early promoter”. Los cebadores internos amplifican una región

dentro del amplicón de 1.3kbp generado por los primers externos:

CMVextern_forward: 5’-CCGAAATACGCGTTTTGAGAT-3’

CMVextern_reverse: 5’-CCAAGCCAAAAACAGTATAGC-3’

CMVintern_forward: 5’-GGCGGAGTTRTTACGACATTT-3’

CMVintern_reverse: 5’-ATGCGGTTTTGGCAGTACAT-3’

Los primers llegaron a una concentración de 100pmol. Se

resuspendieron y se hizo una alícuota a 20pmol (4µL de primer a 100pmol +

16µL agua).

Para la primera prueba se usaron dos muestras de gliomas procedentes de

parafina del HGUE, un control positivo (parafina) y un control negativo (agua).

Se calculó el volumen de cada muestra para obtener 100ng de ADN.

Primera PCR:

Reactivos Muestra 1 Muestra 2 Control + Control - Amplitaq (µL) 10 10 10 10 Glicerol 50% (µL) 3.2 3.2 3.2 3.2 PrimerExt_F (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 PrimerExt_R (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 ADN (100ng) (µL) 1.15 1.4 0.9 2 H2O (µL) 4.4 4.15 4.65 3.55 Volumen final (µL) 20

Anexos

Condiciones de la primera PCR:

Segunda PCR:

Reactivos Muestra 1 Muestra 2 Control + Control - Amplitaq (µL) 10 10 10 10 Glicerol 50% (µL) 3.2 3.2 3.2 3.2 PrimerInt_F (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 PrimerInt_R (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 ADN (producto 1ªPCR) (µL) 4 4 4 4 H2O (µL) 1.55 1.55 1.55 1.55 Volumen final (µL) 20

Condiciones segunda PCR:

Se realizó un segundo experimento con 25 muestras de gliomas

procedentes de tejido congelado del HGUE. El procedimiento fue exactamente

el mismo que el realizado en la prueba anterior.

271

Anexos

ANEXO VIII: Nested PCR, detección de HCMV en muestras de tejido

congelado de gliomas

El método se obtuvo del artículo “Genetic Analysis of Cytomegalovirus in

Malignant Gliomas” (Bornali Bhattacharjee, NicholascRenzette and Timothy F.

Kowalik; Journal of Virology, June 2012, Volumen 86 Number 12).

Los cebadores externos amplifican una región de 1.3kbp del “major

immediate-early promoter”. Los cebadores internos amplifican una región

dentro del amplicón de 1.3kbp generado por los primers externos:

CMVextern_forward: 5’-CCGAAATACGCGTTTTGAGAT-3’

CMVextern_reverse: 5’-CCAAGCCAAAAACAGTATAGC-3’

CMVintern_forward: 5’-GGCGGAGTTRTTACGACATTT-3’

CMVintern_reverse: 5’-ATGCGGTTTTGGCAGTACAT-3’

Los primers llegaron a una concentración de 100pmol. Se

resuspendieron y se hizo una alícuota a 20pmol (4µL de primer a 100pmol +

16µL agua).

Para la primera prueba se usaron dos muestras de gliomas procedentes de

parafina del HGUE, un control positivo (parafina) y un control negativo (agua).

Se calculó el volumen de cada muestra para obtener 100ng de ADN.

Primera PCR:

Reactivos Muestra 1 Muestra 2 Control + Control - Amplitaq (µL) 10 10 10 10 Glicerol 50% (µL) 3.2 3.2 3.2 3.2 PrimerExt_F (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 PrimerExt_R (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 ADN (100ng) (µL) 1.15 1.4 0.9 2 H2O (µL) 4.4 4.15 4.65 3.55 Volumen final (µL) 20

Anexos

Condiciones de la primera PCR:

Segunda PCR:

Reactivos Muestra 1 Muestra 2 Control + Control - Amplitaq (µL) 10 10 10 10 Glicerol 50% (µL) 3.2 3.2 3.2 3.2 PrimerInt_F (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 PrimerInt_R (20pmol) 0.625 0.625 0.625 0.625 ADN (producto 1ªPCR) (µL) 4 4 4 4 H2O (µL) 1.55 1.55 1.55 1.55 Volumen final (µL) 20

Condiciones segunda PCR:

Se realizó un segundo experimento con 25 muestras de gliomas

procedentes de tejido congelado del HGUE. El procedimiento fue exactamente

el mismo que el realizado en la prueba anterior.

272

Anexos

ANEXO IX: Descripción de los perfiles moleculares establecidos en base a los

marcadores IDH, SOCS1, MGMT, P53 y ki67.

Perfil IDH SOCS1 MGMT P53 Ki67

1 Mutado Metilado Metilado Mutado Bajo

2 Mutado Metilado Metilado Mutado Alto

3 Mutado Metilado Metilado No mutado Bajo

4 Mutado Metilado Metilado No mutado Alto

5 No mutado Metilado Metilado Mutado Bajo

6 No mutado Metilado Metilado Mutado Alto

7 No mutado Metilado Metilado No mutado Bajo

8 No mutado Metilado Metilado No mutado Alto

9 Mutado No metilado Metilado Mutado Bajo

10 Mutado No metilado Metilado Mutado Alto

11 Mutado No metilado Metilado No mutado Bajo

12 Mutado No metilado Metilado No mutado Alto

13 No mutado No metilado Metilado Mutado Bajo

14 No mutado No metilado Metilado Mutado Alto

15 No mutado No metilado Metilado No mutado Bajo

16 No mutado No metilado Metilado No mutado Alto

17 Mutado Metilado No metilado Mutado Bajo

18 Mutado Metilado No metilado Mutado Alto

19 Mutado Metilado No metilado No mutado Bajo

20 Mutado Metilado No metilado No mutado Alto

21 No mutado Metilado No metilado Mutado Bajo

22 No mutado Metilado No metilado Mutado Alto

23 No mutado Metilado No metilado No mutado Bajo

24 No mutado Metilado No metilado No mutado Alto

25 Mutado No metilado No metilado Mutado Bajo

26 Mutado No metilado No metilado Mutado Alto

27 Mutado No metilado No metilado No mutado Bajo

Anexos

28 Mutado No metilado No metilado No mutado Alto

29 No mutado No metilado No metilado Mutado Bajo

30 No mutado No metilado No metilado Mutado Alto

31 No mutado No metilado No metilado No mutado Bajo

32 No mutado No metilado No metilado No mutado Alto

273

Anexos

ANEXO IX: Descripción de los perfiles moleculares establecidos en base a los

marcadores IDH, SOCS1, MGMT, P53 y ki67.

Perfil IDH SOCS1 MGMT P53 Ki67

1 Mutado Metilado Metilado Mutado Bajo

2 Mutado Metilado Metilado Mutado Alto

3 Mutado Metilado Metilado No mutado Bajo

4 Mutado Metilado Metilado No mutado Alto

5 No mutado Metilado Metilado Mutado Bajo

6 No mutado Metilado Metilado Mutado Alto

7 No mutado Metilado Metilado No mutado Bajo

8 No mutado Metilado Metilado No mutado Alto

9 Mutado No metilado Metilado Mutado Bajo

10 Mutado No metilado Metilado Mutado Alto

11 Mutado No metilado Metilado No mutado Bajo

12 Mutado No metilado Metilado No mutado Alto

13 No mutado No metilado Metilado Mutado Bajo

14 No mutado No metilado Metilado Mutado Alto

15 No mutado No metilado Metilado No mutado Bajo

16 No mutado No metilado Metilado No mutado Alto

17 Mutado Metilado No metilado Mutado Bajo

18 Mutado Metilado No metilado Mutado Alto

19 Mutado Metilado No metilado No mutado Bajo

20 Mutado Metilado No metilado No mutado Alto

21 No mutado Metilado No metilado Mutado Bajo

22 No mutado Metilado No metilado Mutado Alto

23 No mutado Metilado No metilado No mutado Bajo

24 No mutado Metilado No metilado No mutado Alto

25 Mutado No metilado No metilado Mutado Bajo

26 Mutado No metilado No metilado Mutado Alto

27 Mutado No metilado No metilado No mutado Bajo

Anexos

28 Mutado No metilado No metilado No mutado Alto

29 No mutado No metilado No metilado Mutado Bajo

30 No mutado No metilado No metilado Mutado Alto

31 No mutado No metilado No metilado No mutado Bajo

32 No mutado No metilado No metilado No mutado Alto

274

Anex

os

AN

EXO

X

Fun

cio

nes

so

bre

exp

resa

das

GEN

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02

Par

te c

rom

osóm

ica

GO

:004

4427

C

rom

osom

a

GO

:000

5694

O

rgán

ulos

del

lum

en in

trace

lula

r G

O:0

0700

16

Lum

en a

djun

to a

la m

embr

ana

GO

:003

1978

C

iclo

cel

ular

mitó

tico

GO

:000

0279

C

iclo

cel

ular

mitó

tico

de la

fase

M

GO

:000

0087

D

ivis

ión

nucl

ear

GO

:000

0280

Lu

men

Nuc

lear

G

O:0

0319

84

Org

ánul

o de

l lum

en

GO

:004

3238

R

egul

ació

n de

l cic

lo c

elul

ar

GO

:005

1727

275

Anex

os

C1O

RF2

4 Fa

mily

With

Seq

uenc

e S

imila

rity

129,

Mem

ber A

8,

076

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

G

O:0

0098

91

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

cel

ular

es

GO

:003

1328

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s bi

osin

tétic

os d

e m

acro

mol

écul

as

GO

:001

0557

CC

L2

Che

mok

ine

Liga

nd 2

15

,798

Res

pues

ta d

e de

fens

a G

O:0

0069

52

Par

te d

e la

regi

ón e

xtra

celu

lar

GO

:004

4421

Res

pues

ta in

mun

e

GO

:000

6959

Res

pues

ta in

flam

ator

ia

GO

:000

6957

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

la p

rolif

erac

ión

celu

lar

GO

:000

8288

R

espu

esta

a h

erid

as

GO

:000

9613

CE

NP

F C

entro

mer

e P

rote

in F

13

,058

Cic

lo c

elul

ar

GO

:000

7049

Fa

se d

el c

iclo

cel

ular

G

O:0

0224

03

Pro

ceso

del

cic

lo c

elul

ar

GO

:002

2402

P

arte

cro

mos

ómic

a

GO

:004

4427

C

rom

osom

a

GO

:000

5694

P

roce

so d

e A

DN

met

aból

ico

G

O:0

0062

59

Org

ánul

os d

el lu

men

intra

celu

lar

GO

:007

0014

Lu

men

adj

unto

a la

mem

bran

a G

O:0

0319

75

Cic

lo c

elul

ar m

itótic

o G

O:0

0002

80

Cic

lo c

elul

ar m

itótic

o de

la fa

se M

G

O:0

0000

88

Div

isió

n nu

clea

r G

O:0

0002

81

Lum

en N

ucle

ar

GO

:003

1982

O

rgán

ulo

del l

umen

G

O:0

0432

35

Reg

ulac

ión

del c

iclo

cel

ular

G

O:0

0517

28

CFI

C

ompl

emen

t Fac

tor I

7,

593

Res

pues

ta d

e de

fens

a G

O:0

0069

52

Par

te d

e la

regi

ón e

xtra

celu

lar

GO

:004

4421

276

Anex

os

Res

pues

ta in

mun

e

GO

:000

6957

Res

pues

ta in

flam

ator

ia

GO

:000

6955

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s de

l sis

tem

a in

mun

e G

O:0

0026

85

Res

pues

ta a

her

idas

G

O:0

0096

12

CO

L4A

1 C

olla

gen,

Typ

e IV

, Alp

ha 1

12

,732

M

atriz

ext

race

lula

r G

O:0

0310

12

Par

te d

e la

regi

ón e

xtra

celu

lar

GO

:004

4421

M

atriz

ext

race

lula

r pro

teín

ica

GO

:000

5581

CO

L4A

2 C

olla

gen,

Typ

e IV

, Alp

ha 2

13

,850

M

atriz

ext

race

lula

r G

O:0

0310

12

Par

te d

e la

regi

ón e

xtra

celu

lar

GO

:004

4421

HIS

T1H

3B

His

tone

Clu

ster

1, H

3b

11,9

84

Par

te c

rom

osóm

ica

GO

:004

4427

C

rom

osom

a

GO

:000

5694

U

nión

al A

DN

G

O:0

0036

77

HIS

T2H

3A

His

tone

Clu

ster

2, H

3a

22,8

79

Par

te c

rom

osóm

ica

GO

:004

4427

C

rom

osom

a

GO

:000

5694

U

nión

al A

DN

G

O:0

0036

77

MA

D2L

2 M

itotic

Arre

st D

efic

ient

2-L

ike

Pro

tein

2

24,5

29

Cic

lo c

elul

ar

GO

:000

7049

NTN

1 N

etrin

1

8,92

9

Mat

riz e

xtra

celu

lar

GO

:003

1012

P

arte

de

la re

gión

ext

race

lula

r G

O:0

0444

21

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de la

pro

lifer

ació

n ce

lula

r G

O:0

0082

84

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de la

pro

lifer

ació

n ce

lula

r G

O:0

0082

85

Mat

riz e

xtra

celu

lar p

rote

ínic

a

GO

:000

5578

PTX

3 P

entra

xin

3 11

,691

Res

pues

ta d

e de

fens

a G

O:0

0069

52

Res

pues

ta in

mun

e

GO

:000

6958

Res

pues

ta in

flam

ator

ia

GO

:000

6956

277

Anex

os

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

G

O:0

0098

93

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

cel

ular

es

GO

:003

1331

PX

DN

P

erox

idas

in

12,8

83

Res

pues

ta in

mun

e G

O:0

0069

55

TBX

2 T-

Box

2

8,90

2

Org

ánul

os d

el lu

men

intra

celu

lar

GO

:007

0017

Lu

men

adj

unto

a la

mem

bran

a G

O:0

0319

79

Lum

en N

ucle

ar

GO

:003

1985

N

ucle

opla

sma

GO

:000

5655

O

rgán

ulo

del l

umen

G

O:0

0432

39

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de la

pro

lifer

ació

n ce

lula

r G

O:0

0082

87

Sec

uenc

ia e

spec

ífica

de

AD

N

GO

:004

3565

A

ctiv

idad

de

fact

ores

de

trans

crip

ción

G

O:0

0037

00

TGFB

1I1

Tran

sfor

min

g G

row

th F

acto

r Bet

a 1

Indu

ced

Tran

scrip

t 1

7,30

8

Org

ánul

os d

el lu

men

intra

celu

lar

GO

:007

0015

Lu

men

adj

unto

a la

mem

bran

a G

O:0

0319

77

Lum

en N

ucle

ar

GO

:003

1983

O

rgán

ulo

del l

umen

G

O:0

0432

37

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

G

O:0

0098

92

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

cel

ular

es

GO

:003

1329

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s bi

osin

tétic

os d

e m

acro

mol

écul

as

GO

:001

0558

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s m

etab

ólic

os d

el A

RN

G

O:0

0512

55

TGFB

I Tr

ansf

orm

ing

Gro

wth

Fac

tor,

Beta

-Indu

ced

18,7

63

Mat

riz e

xtra

celu

lar

GO

:003

1012

P

arte

de

la re

gión

ext

race

lula

r G

O:0

0444

21

TIM

P1

TIM

P M

etal

lope

ptid

ase

Inhi

bito

r 1

19,0

13

Par

te d

e la

regi

ón e

xtra

celu

lar

GO

:004

4421

Lu

men

adj

unto

a la

mem

bran

a G

O:0

0319

76

Org

ánul

o de

l lum

en

GO

:004

3236

M

atriz

ext

race

lula

r pro

teín

ica

GO

:000

5579

TN

FRS

F12A

Tu

mor

Nec

rosi

s Fa

ctor

Rec

epto

r Sup

erfa

mily

, 15

,199

D

esar

rollo

de

vaso

s sa

nguí

neos

G

O:0

0015

68

278

Anex

os

Mem

ber 1

2A

Des

arro

llo d

e la

vas

cula

tura

G

O:0

0019

46

UB

E2C

U

biqu

itin-

Con

juga

ting

Enz

yme

E2C

18

,996

Cic

lo c

elul

ar

GO

:000

7049

Fa

se d

el c

iclo

cel

ular

G

O:0

0224

03

Pro

ceso

del

cic

lo c

elul

ar

GO

:002

2402

O

rgán

ulos

del

lum

en in

trace

lula

r G

O:0

0700

13

Cic

lo c

elul

ar m

itótic

o

GO

:000

0278

C

iclo

cel

ular

mitó

tico

de la

fase

M

GO

:000

0089

D

ivis

ión

nucl

ear

GO

:000

0282

L

umen

Nuc

lear

G

O:0

0319

81

Nuc

leop

lasm

a

GO

:000

5654

O

rgán

ulo

del l

umen

G

O:0

0432

33

Reg

ulac

ión

del c

iclo

cel

ular

G

O:0

0517

26

VE

GF

Vas

cula

r end

othe

lial g

row

th fa

ctor

7,

652

Mat

riz e

xtra

celu

lar

GO

:003

1012

P

arte

de

la re

gión

ext

race

lula

r G

O:0

0444

21

Res

pues

ta in

mun

e

GO

:000

6956

Lu

men

adj

unto

a la

mem

bran

a

GO

:003

1974

O

rgán

ulo

del l

umen

G

O:0

0432

34

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de la

pro

lifer

ació

n ce

lula

r G

O:0

0082

86

Reg

ulac

ión

posi

tiva

de p

roce

sos

bios

inté

ticos

cel

ular

es

GO

:003

1330

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s de

l sis

tem

a in

mun

e

GO

:000

2684

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s bi

osin

tétic

os d

e m

acro

mol

écul

as

GO

:001

0559

R

egul

ació

n po

sitiv

a de

pro

ceso

s m

etab

ólic

os d

el A

RN

G

O:0

0512

54

Mat

riz e

xtra

celu

lar p

rote

ínic

a G

O:0

0055

82

Des

arro

llo d

e la

vas

cula

tura

G

O:0

0019

44

279

Anex

os

Fun

cio

nes

infr

aexp

resa

das

GEN

N

OM

BR

E FC

AN

OTA

CIÓ

N FU

NCIO

NAL

G

O

ATP

6V1G

2 A

TPas

e, H

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ansp

ortin

g, L

ysos

omal

13k

Da,

V1

Sub

unit

G2

-19,

614

Tran

spor

te c

atió

nico

G

O:0

0068

20

Ves

ícul

a re

cubi

erta

de

clat

rina

GO

:003

0140

Tr

ansp

orte

ióni

co

GO

:000

6821

Tr

ansp

orte

de

catio

nes

inor

gáni

cos

mon

oval

ente

s G

O:0

0156

77

Par

te s

ináp

tica

GO

:004

4462

V

esíc

ula

siná

ptic

a G

O:0

0080

24

CA

CN

A1B

C

alci

um C

hann

el, V

olta

ge-D

epen

dent

, N T

ype,

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ha 1

B

Sub

unit

-8,6

83

Act

ivid

ad c

anal

es d

e ca

lcio

G

O:0

0052

63

Tran

spor

te c

atió

nico

G

O:0

0068

12

Act

ivid

ad d

e ca

nal i

ónic

o G

O:0

0052

17

Com

plej

o de

can

al ió

nico

G

O:0

0347

03

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

12

Tran

spor

te d

e io

nes

met

álic

os

GO

:003

002

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

04

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2839

Tr

ansm

isió

n si

nápt

ica

GO

:000

7268

Tr

ansm

isió

n de

l im

puls

o ne

rvio

so

GO

:001

9226

A

ctiv

idad

del

can

al c

atió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2843

A

ctiv

idad

del

can

al d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

32

CA

MK2

A C

alci

um/C

alm

odul

in-D

epen

dent

Pro

tein

Kin

ase

II A

lpha

-2

2,86

9

Tran

spor

te ió

nico

de

calc

io

GO

:000

6819

Tr

ansp

orte

cat

ióni

co

GO

:000

6813

Tr

ansp

orte

ióni

co

GO

:000

6813

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

3

280

Anex

os

Par

te s

ináp

tica

GO

:004

4456

GA

BR

A1

Gam

ma-

Am

inob

utyr

ic A

cid

(GA

BA) A

Rec

epto

r, Al

pha

1 -3

2,11

4

Act

ivid

ad d

el c

anal

G

O:0

0152

72

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e lig

ando

ex

trace

lula

r G

O:0

0052

31

Act

ivid

ad d

epen

dien

te d

el c

anal

G

O:0

0228

40

Act

ivid

ad d

e ca

nal i

ónic

o G

O:0

0052

21

Com

plej

o de

can

al ió

nico

G

O:0

0347

07

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

17

Act

ivid

ad d

el c

anal

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:002

2837

A

ctiv

idad

del

can

al ió

nico

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:001

5279

A

ctiv

idad

rece

ptor

es d

e la

neu

rotra

nsm

isió

n G

O:0

0305

95

Uni

ón d

el n

euro

trans

mis

or

GO

:004

2166

A

ctiv

idad

tran

spor

te p

asiv

o tra

nsm

embr

ana

GO

:002

2810

M

embr

ana

post

siná

ptic

a G

O:0

0452

12

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2843

P

arte

sin

áptic

a G

O:0

0444

61

GA

BR

G2

Gam

ma-

Am

inob

utyr

ic A

cid

(GA

BA) A

Rec

epto

r, G

amm

a 2

-27,

747

Act

ivid

ad d

el c

anal

G

O:0

0152

70

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e lig

ando

ex

trace

lula

r G

O:0

0052

30

Act

ivid

ad d

epen

dien

te d

el c

anal

G

O:0

0228

38

Act

ivid

ad d

e ca

nal i

ónic

o G

O:0

0052

19

Com

plej

o de

can

al ió

nico

G

O:0

0347

05

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

16

Act

ivid

ad d

el c

anal

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:002

2834

A

ctiv

idad

del

can

al ió

nico

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:001

5276

A

ctiv

idad

rece

ptor

es d

e la

neu

rotra

nsm

isió

n G

O:0

0305

94

Uni

ón d

el n

euro

trans

mis

or

GO

:004

2165

A

ctiv

idad

tran

spor

te p

asiv

o tra

nsm

embr

ana

GO

:002

2808

281

Anex

os

Mem

bran

a po

stsi

nápt

ica

GO

:004

5211

A

ctiv

idad

del

can

al e

spec

ífico

de

sust

rato

G

O:0

0228

41

Par

te s

ináp

tica

GO

:004

4460

Tr

ansm

isió

n si

nápt

ica

GO

:000

7272

Tr

ansm

isió

n de

l im

puls

o ne

rvio

so

GO

:001

9230

HC

N1

Hyp

erpo

lariz

atio

n A

ctiv

ated

Cyc

lic N

ucle

otid

e G

ated

P

otas

sium

Cha

nnel

1

-16,

889

Uni

ón a

ione

s m

etál

icos

alc

alin

os

GO

:003

1423

Tr

ansp

orte

cat

ióni

co

GO

:000

6819

A

ctiv

idad

del

can

al

GO

:001

5274

A

ctiv

idad

dep

endi

ente

del

can

al

GO

:002

2842

A

ctiv

idad

de

cana

l ión

ico

GO

:000

5223

Tr

ansp

orte

ióni

co

GO

:000

6820

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0301

0 Tr

ansp

orte

de

catio

nes

inor

gáni

cos

mon

oval

ente

s G

O:0

0156

75

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

12

Act

ivid

ad c

anal

es d

e po

tasi

o G

O:0

0052

68

Uni

ón d

e io

nes

pota

sio

GO

:003

0955

U

nión

de

ione

s po

tasi

o G

O:0

0309

59

Uni

ón d

e io

nes

sodi

o G

O:0

0314

04

Tran

spor

te d

e io

nes

sodi

o G

O:0

0068

16

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2845

A

ctiv

idad

del

can

al c

atió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2847

A

ctiv

idad

del

can

al d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

36

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0052

47

Act

ivid

ad d

el c

anal

de

pota

sio

depe

ndie

nte

de

volta

je

GO

:000

5249

JP

H4

Junc

toph

ilin 4

-1

5,64

9 Tr

ansp

orte

ióni

co d

e ca

lcio

G

O:0

0068

17

Tran

spor

te c

atió

nico

G

O:0

0068

16

282

Anex

os

Ves

ícul

a re

cubi

erta

de

clat

rina

GO

:003

0137

V

esíc

ula

recu

bier

ta

GO

:003

0137

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

7

KC

NC

2 P

otas

sium

Cha

nnel

, Vol

tage

Gat

ed S

haw

Rel

ated

S

ubfa

mily

C, M

embe

r 2

-21,

140

Uni

ón a

ione

s m

etál

icos

alc

alin

os

GO

:003

1424

Tr

ansp

orte

cat

ióni

co

GO

:000

6815

A

ctiv

idad

del

can

al

GO

:001

5269

A

ctiv

idad

dep

endi

ente

del

can

al

GO

:002

2843

A

ctiv

idad

de

cana

l ión

ico

GO

:000

5224

C

ompl

ejo

de c

anal

ióni

co

GO

:003

4709

Tr

ansp

orte

ióni

co

GO

:000

6815

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

5 Tr

ansp

orte

de

catio

nes

inor

gáni

cos

mon

oval

ente

s G

O:0

0156

76

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

06

Act

ivid

ad c

anal

es d

e po

tasi

o G

O:0

0052

69

Com

plej

o de

can

al d

e po

tasi

o G

O:0

0347

05

Uni

ón d

e io

nes

pota

sio

GO

:003

0956

U

nión

de

ione

s po

tasi

o G

O:0

0309

60

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2846

A

ctiv

idad

del

can

al c

atió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2848

A

ctiv

idad

del

can

al d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

37

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0052

48

Act

ivid

ad d

el c

anal

de

pota

sio

depe

ndie

nte

de

volta

je

GO

:000

5250

C

ompl

ejo

del c

anal

de

pota

sio

depe

ndie

nte

de

volta

je

GO

:000

8076

KC

NK1

P

otas

sium

Cha

nnel

, Tw

o Po

re D

omai

n Su

bfam

ily K

, M

embe

r 1

-18,

492

Uni

ón a

ione

s m

etál

icos

alc

alin

os

GO

:003

1420

Tr

ansp

orte

cat

ióni

co

GO

:000

6814

A

ctiv

idad

del

can

al

GO

:001

5268

283

Anex

os

Act

ivid

ad d

epen

dien

te d

el c

anal

G

O:0

0228

39

Act

ivid

ad d

e ca

nal i

ónic

o G

O:0

0052

20

Com

plej

o de

can

al ió

nico

G

O:0

0347

06

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

14

Act

ivid

ad d

el c

anal

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:002

2836

A

ctiv

idad

del

can

al ió

nico

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:001

5278

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

4 Tr

ansp

orte

de

catio

nes

inor

gáni

cos

mon

oval

ente

s G

O:0

0156

72

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

05

Act

ivid

ad c

anal

es d

e po

tasi

o G

O:0

0052

67

Com

plej

o de

can

al d

e po

tasi

o G

O:0

0347

07

Uni

ón d

e io

nes

pota

sio

GO

:003

0957

U

nión

de

ione

s po

tasi

o G

O:0

0309

58

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2842

A

ctiv

idad

del

can

al c

atió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2845

A

ctiv

idad

del

can

al d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

34

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0052

45

Act

ivid

ad d

el c

anal

de

pota

sio

depe

ndie

nte

de

volta

je

GO

:000

5252

C

ompl

ejo

del c

anal

de

pota

sio

depe

ndie

nte

de

volta

je

GO

:000

8078

MA

L M

al, T

-Cel

l Diff

eren

tiatio

n P

rote

in

-21,

062

Act

ivid

ad d

el c

anal

G

O:0

0152

71

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

09

Tran

smis

ión

del i

mpu

lso

nerv

ioso

G

O:0

0192

31

PA

CS

IN1

Pro

tein

kin

ase

C a

nd C

asei

n ki

nase

sub

stra

te in

neu

rons

1

-42,

105

Ves

ícul

a re

cubi

erta

G

O:0

0301

36

RY

R2

Rya

nodi

ne R

ecep

tor 2

-9

,764

A

ctiv

idad

can

ales

de

calc

io

GO

:000

5262

Tr

ansp

orte

ióni

co d

e ca

lcio

G

O:0

0068

16

284

Anex

os

Act

ivid

ad d

el c

anal

G

O:0

0152

67

Act

ivid

ad d

epen

dien

te d

el c

anal

G

O:0

0228

36

Act

ivid

ad d

e ca

nal i

ónic

o G

O:0

0052

16

Com

plej

o de

can

al ió

nico

G

O:0

0347

02

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

11

Act

ivid

ad d

el c

anal

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:002

2835

A

ctiv

idad

del

can

al ió

nico

dep

endi

ente

de

ligan

do

GO

:001

5277

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

1 A

ctiv

idad

tran

spor

te p

asiv

o tra

nsm

embr

ana

GO

:002

2803

A

ctiv

idad

del

can

al e

spec

ífico

de

sust

rato

G

O:0

0228

38

SC

N2B

S

odiu

m C

hann

el, V

olta

ge G

ated

, Typ

e II

Bet

a S

ubun

it -1

5,11

4

Uni

ón a

ione

s m

etál

icos

alc

alin

os

GO

:003

1421

Tr

ansp

orte

cat

ióni

co

GO

:000

6817

A

ctiv

idad

del

can

al

GO

:001

5273

A

ctiv

idad

dep

endi

ente

del

can

al

GO

:002

2841

A

ctiv

idad

de

cana

l ión

ico

GO

:000

5222

C

ompl

ejo

de c

anal

ióni

co

GO

:003

4708

Tr

ansp

orte

ióni

co

GO

:000

6818

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

8 Tr

ansp

orte

de

catio

nes

inor

gáni

cos

mon

oval

ente

s G

O:0

0156

73

Act

ivid

ad tr

ansp

orte

pas

ivo

trans

mem

bran

a G

O:0

0228

11

Uni

ón d

e io

nes

sodi

o G

O:0

0314

02

Tran

spor

te d

e io

nes

sodi

o G

O:0

0068

14

Act

ivid

ad d

el c

anal

esp

ecífi

co d

e su

stra

to

GO

:002

2844

Tr

ansm

isió

n si

nápt

ica

GO

:000

7273

Tr

ansm

isió

n de

l im

puls

o ne

rvio

so

GO

:001

9232

A

ctiv

idad

del

can

al c

atió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2846

A

ctiv

idad

del

can

al d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

35

285

Anex

os

Act

ivid

ad d

el c

anal

ióni

co d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0052

46

SLC

30A3

S

olut

e C

arrie

r Fam

ily 3

0 (Z

inc

Tran

spor

ter),

Mem

ber 3

-1

8,49

6

Ves

ícul

a re

cubi

erta

de

clat

rina

GO

:003

0136

V

esíc

ula

recu

bier

ta

GO

:003

0135

Tr

ansp

orte

de

ione

s m

etál

icos

G

O:0

0300

6 P

arte

sin

áptic

a G

O:0

0444

57

Ves

ícul

a si

nápt

ica

GO

:000

8021

SLC

8A2

Sol

ute

Car

rier F

amily

8 (S

odiu

m/C

alci

um E

xcha

nger

), M

embe

r 2

-11,

995

Uni

ón a

ione

s m

etál

icos

alc

alin

os

GO

:003

1422

Tr

ansp

orte

ióni

co d

e ca

lcio

G

O:0

0068

18

Tran

spor

te c

atió

nico

G

O:0

0068

18

Tran

spor

te ió

nico

G

O:0

0068

19

Tran

spor

te d

e io

nes

met

álic

os

GO

:003

009

Tran

spor

te d

e ca

tione

s in

orgá

nico

s m

onov

alen

tes

GO

:001

5674

U

nión

de

ione

s so

dio

GO

:003

1403

Tr

ansp

orte

de

ione

s so

dio

GO

:000

6815

SN

AP2

5 S

ynap

toso

mal

-ass

ocia

ted

prot

ein

-89,

741

Act

ivid

ad d

epen

dien

te d

el c

anal

G

O:0

0228

37

Gen

erac

ión

de s

eñal

invo

lucr

ada

en la

se

ñaliz

ació

n cé

lula

-cél

ula

GO

:000

3003

A

ctiv

idad

de

cana

l ión

ico

GO

:000

5218

C

ompl

ejo

de c

anal

ióni

co

GO

:003

4704

S

ecre

ción

del

neu

rotra

nsm

isor

G

O:0

0072

71

Sec

reci

ón d

el n

euro

trans

mis

or

GO

:000

7274

A

ctiv

idad

tran

spor

te p

asiv

o tra

nsm

embr

ana

GO

:002

2807

A

ctiv

idad

can

ales

de

pota

sio

GO

:000

5270

C

ompl

ejo

de c

anal

de

pota

sio

GO

:003

4706

R

egul

ació

n de

los

nive

les

de n

euro

trans

mis

or

GO

:000

1507

A

ctiv

idad

del

can

al e

spec

ífico

de

sust

rato

G

O:0

0228

40

Tran

smis

ión

siná

ptic

a G

O:0

0072

71

Tran

smis

ión

del i

mpu

lso

nerv

ioso

G

O:0

0192

29

286

Anex

os

Act

ivid

ad d

el c

anal

cat

ióni

co d

epen

dien

te d

e vo

ltaje

G

O:0

0228

44

Act

ivid

ad d

el c

anal

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:002

2833

A

ctiv

idad

del

can

al ió

nico

dep

endi

ente

de

volta

je

GO

:000

5244

A

ctiv

idad

del

can

al d

e po

tasi

o de

pend

ient

e de

vo

ltaje

G

O:0

0052

51

Com

plej

o de

l can

al d

e po

tasi

o de

pend

ient

e de

vo

ltaje

G

O:0

0080

77

SY

T1

Syn

apto

tagm

in I

-36,

531

Ves

ícul

a re

cubi

erta

de

clat

rina

GO

:003

0138

V

esíc

ula

recu

bier

ta

GO

:003

0138

G

ener

ació

n de

señ

al in

volu

crad

a en

la

seña

lizac

ión

célu

la-c

élul

a G

O:0

0030

01

Sec

reci

ón d

el n

euro

trans

mis

or

GO

:000

7269

S

ecre

ción

del

neu

rotra

nsm

isor

G

O:0

0072

72

Reg

ulac

ión

de lo

s ni

vele

s de

neu

rotra

nsm

isor

G

O:0

0015

05

Par

te s

ináp

tica

GO

:004

4458

Tr

ansm

isió

n si

nápt

ica

GO

:000

7269

V

esíc

ula

siná

ptic

a G

O:0

0080

22

Tran

smis

ión

del i

mpu

lso

nerv

ioso

G

O:0

0192

27

SY

T4

Syn

apto

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Anex

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28

287

Anexos

ANEXO XI: Comparación de las regiones metiladas descritas por Malley y col.

(arriba) y Qian y col (abajo).

Distribución de las sondas del kit de MS-MLPA respecto a las CpG

descritas por Malley y col. En cada una de las sondas está marcada, con una

línea vertical, la posición en la que digiere la enzima de restricción HhaI.

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Estudio de biomarcadores en gliomas y su utilidad clínica · A mi hermano . ÍNDICE ... A Pilar, Miguel y Mari Carmen Barea. A Javier Gómez, gracias por tu interés y por enseñarme