Estudo Comparativo entre Metodos de Contagem de Plaquetas

Tayne Anderson Cortez Dantas', Isabelle Ribeiro Barbosa', Joaquim Otaviano da Costa Neto',Maria das Gra~as Moreira Araujo2, Rosinete Guedes Carvalho de Miranda2, Tereza Maria Dantas de Medeiros)

I - Farmaceutico-Bioqufmico2 - Farmaceutica-Bioqufmica. Laborat6rio de Anci/ises C1fnicas do Hospital Universitcirio Onofre Lopes,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte3 - Professora-Adjunta da disciplina Hematologia C1fnica, Departamento de AncilisesC1fnicas e Toxicol6gicas (DACT). Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Trabalho realizado no Laborat6rio de Hematologia/DACT/UFRN como parteexperimental de Trabalho de Conclusao de Curso de alunos do Curso de Farmacia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte - Habilita~ao Farmaceutico-Bioquimico Analista Clfnico.

Estudo comparativo entre metodos de contagem de

plaquetasA contagem de plaquetas pode ser realizada por metodos manu-

ais ou eletr6nicos. Com 0 objetivo de comparar os metodos manual

e automatizado de contagem de plaquetas, foram examinadas 81

amostras de sangue (48 com valores norma is de plaquetas e 33 com

plaquetopenia) de individuos atendidos no Laborat6rio de Analises

Clfnicas do Hospital Universitario Onofre Lopes e no Laborat6rio

Integrado de Analises Clinicas, ambos da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte. Cada amostra foi submetida a contagem de

plaquetos pelos metodos automatizado (Cell Dyn 3500) e manual. A

contagem automatizada foi realizada em sangue total e a contagem

manual em camara de Neubauer utilizando sangue total e plasma

obtido ap6s 30, 60 e 120 minutos de sedimenta~ao espontanea

diluidos na propor~ao 1:200. Os resultados obtidos mostram que

nao houve diferen~a significativa entre as contagens em sangue

total, obtidas pelo metodo automatizado e pelo metodo manual,

independente da area contada (lmm2 ou 1/5mm2) e do tipo da

amostra (normal e plaquetopenica). Entre as amostras com valores

normais de plaquetas, observou-se diferen~a significativa entre as

contagens obtidas pela automa~ao e contagem manual em plasma

obtido ap6s 120 minutos de sedimenta~ao. 0 metodo manual que

mais se aproximou dos resultados obtidos pela automa~ao foi 0

realizado em sangue total com a contagem de plaquetas efetuada

em 1mm2 ou em apenas 1/5 mm2 do reticulo central da camara de

Neubauer, com emissao de resultados precisos e com 0 beneficio da

diminui~ao de tempo gasto para a realiza~ao do mesmo.

Palavras-chave: Contagem de plaquetas, metodo manual,

metodo automatizado

Summary

Comparative study between platelets count methodsThe platelet count can be conducted by electronic or manual

methods. The purpose of this study was to compare the methodsof manual and automated platelet counts. We examined 81 bloodsamples (48 with normal values of platelets and 33 with throm-bocytopenia) of individuals attending in the Clinical LaboratoryAnalyses of Hospital Universitario Onofre Lopes and in ClinicalAnalyses Integrate Laboratory, both from Universidade Federal doRio Grande do Norte. Each sample was submitted to the plateletcount by automated methods (Cell Dyn 3500) and manual. Theautomated counting was done in whole blood. The manual countingof the Neubauer chamber was held in whole blood and plasmaobtained after 30, 60 and 120 minutes of spontaneous sedimenta-tion. There wasn't significant difference between counts of plateletsin whole blood, obtained by the automated method and the manualmethod, independent of the told area (1 mm2 or 1/5mm2) and ofthe sample type (normal and with thrombocytopenia). Consideringthe platelet count in the normal samples in the central reticulumof Neubauer chamber (1 mm2), there was significant differencebetween counts obtained by automated and manual methods inplasma after 120 minutes of sedimentation. The manual methodthat gets closer to the results obtained by the automation is the onerealized in total blood through Rees-Ecker method, being able tobe accomplished in 1/5 of a mm2 or 1mm2 in the center of thecounting chamber, with a safe result emission and a reduction oftime waste, which is a benefit.

Introdufiio

r!investiga<;ao laboratorial dosa disturbios da hemostasia

inclui a avalia<;ao do numerode plaquetas e testes de fun<;ao pla-quetaria. A contagem de plaquetas eum importante metodo utilizado nainvestiga<;ao c1fnica para evitar riscosde sangramento. No sangue perifericode indivfduos saudaveis, 0 numerode plaquetas esta entre 150 - 400x 109jL, podendo ser modificado emresposta a uma variedade de estfmu-105 (1, 2, 3).

A contagem manual de plaquetasainda e usada rotineiramente em la-boratorios de pequeno porte, sendotambem necessaria em laboratoriosbem equipados, para analise de san-gues com grande propor<;ao de pla-quetas gigantes. Fora esta exce<;ao,a contagem de plaquetas feita emcontadores total mente automatizadostem precisao bastante superior a dascontagens manuais (4).

Os metodos de contagem manualde plaquetas mais comumente empre-gados utilizam camara de Neubauercom dilui<;ao do sangue de 1: 100ou 1:200. 0 metoda de Rees-Eckerutiliza uma solu<;ao tamponada decitrato-formaldefdo com azul de cresilbrilhante. Essediluente fixa e preservaos eritrocitos, bem como as plaque-tas, prevenindo a sua desintegra<;ao.Nesse metodo, as plaquetas visua-lizadas ao microscopio otico comumsaG pequenas e altamente refrateiscoradas em azul brilhante e com formaredonda, oval ou alongada (1).

o uso de metodos de contagemde plaquetas que tem como amostraplasma rico em plaquetas, alem detornar facil a identifica<;ao de plaque-tas suspensas no plasma (nao saGvisualizados os eritrocitos), atravesde microscopio optico comum, tem

a vantagem de proporcionar grandenumero de celulas por campo, alemda op<;aode poder diminuir 0 grau dedilui<;ao para amostras severa menteplaquetopenicas (5).

Esse estudo teve como objetivoa compara<;ao dos metodos manuale automatizado de contagem de pla-quetas utilizando amostras de sanguetotal e de plasma rico em plaquetas,a fim de observar 0 metodo manualmais adequado e segura para quepossa ser usado nos laboratorios quenao dispuserem de automa<;ao.

No periodo de janeiro a abril de2004 foram examinadas 81 amostrasde sangue de indivfduos de ambosos sexos, sem faixa eta ria definida,atendidos no Laboratorio de AnalisesClfnicas do Hospital UniversitarioOnofre Lopes (HUOL) e no LaboratorioIntegrado de Analises Clfnicas (LIAC),ambos da Universidade Federal do RioGrande do Norte.

As amostras foram obtidas porpun<;aovenosa e colocadas em tuboscontendo anticoagulante EDTA na

propor<;ao de 1mg para cada mL desangue. Cada amostra foi submetida acontagem de plaquetas pelos metodosautomatizado e manual (em sanguetotal e no plasma obtido apos 30,60 e 120 minutos de sedimenta<;aoespontanea) (Figura 1).

Inicialmente, todas as amostras fo-ram analisadas pelo metodo automa-tizado utilizando contador automaticoCell-Dyn 3500 (Abbott). As analisesforam realizadas no Laboratorio deAnalises Cllnicas do HUOLjUFRN.Aposa contagem automatizada as amostrasforam submetidas a contagem manualem camara de Neubauer realizadano Laboratorio de Hematologia doDepartamento de Analises Clfnicas eToxicologicas da Universidade Federaldo Rio Grande do Norte. Todas as con-tagens foram realizadas ate 4 horasapos a coleta do sangue.

No metodo manual, foi realizadainicialmente a contagem de plaquetasno sangue total diluindo 0 sangue napropor<;ao de 1: 200 com 0 diluidorde Rees-Ecker (1) e procedendo acontagem contagem das plaquetas(objetiva x40) nos 25 quadrados doretfculo central (lmm2) da camara de

Neubauer e em cinco quadrados doreticulo central (quatro dos cantos ex-ternos e 0 do centro), correspondendoa 1/5mm2. 0 numero de plaquetas pormm3 de sangue foi obtido mediante aseguinte formula:

Plaquetas contadas X inverso dadilui<;aoX inverso da area conta-da X inverso da profundidade da

camara = nO de plaquetasjmm3

Em seguida, as amostras foramdeixadas a temperatura ambiente por3D, 60 e 120 minutos para obten<;aodo plasma rico em plaquetas. A con-tagem de plaquetas foi realizada di-luindo 0 plasma obtido nos diferentestempos de sedimenta<;ao em solu<;aosalina-formol 1% (6) na propor<;aode 1:200 e realizada a contagem emcamara de Neubauer (objetiva x40)nos 25 quadrados do retlculo central(lmm2) e em cinco quadrados doreticulo central (quatro dos cantos ex-ternos e 0 do centro), correspondendoa 1/5mm2• 0 numero de plaquetas pormm3 de sangue foi obtido mediante aseguinte formula:

Plaquetas contadas X inverso dadilui<;ao X volume plasmatico*/10 = nO de plaquetasjmm3

(*) Volume plasmatico =100 - valor do hematocrito

A analise estatfstica foi baseadaem calculo da media e desvio-padraodas variaveis analisadas. 0 teste t deStudent foi usado para comparar asmedias das contagens nas diferentesareas da camara de Neubauer. Paracompara<;ao entre os metodos reali-zou-se a analise de variancia (ANOVA)e, quando necessario, aplicou-se 0

teste de Tukey. Em todos os casas foiconsiderado 0 nivel de significanciade 5%. A parte computacional foi re-

alizada com base na planilha do Excel

by Microsoft e no programa estatisticoStatistica for Windows by Statsoft,Inc. Versao 5.1, edi<;ao97.

Resultados eDiscussiio

As amostras foram classificadasem dois grupos de acordo com osvalores obtidos na contagem por au-toma<;ao:

• Grupo 1: 48 amostras com 0

numero normal de plaquetas (fai-xa compreendida entre 150.000 a400.000/mm3)

• Grupo 2: 33 amostras com pla-quetopenia (valores da contagem deplaquetas inferior a 150.000/mm3)

A Figura 2 apresenta os valoresmedios da contagem de plaquetasdas 48 amostras nao plaquetopenicas.Os valores medios obtidos no plasmaforam inferiores aos das contagensrealizadas em sangue total, tanto pelaautoma<;ao como pelo metoda manu-al, independente da area contada (1mm2 ou 1/5 mm2).

Para as contagens realizadas emtodo reticulo central da camara, aanalise de variancia (ANOVA) rea-lizada entre os valores obtidos porautoma<;ao e pelo metoda manual(sangue total e plasma apos 30, 60 e120 minutos de sedimenta<;ao) mos-trou que ha diferen<;aestatisticamentesignificativa (p = 0,0219).

Utilizando 0 teste de Tukey decompara<;6es multiplas, verificou-seque estas diferen<;as estao entre ascontagens realizadas pelo metodaautomatizado e a contagem manu-al no plasma apos 120 minutos desedimenta<;ao (p = 0,0491), entreas contagens manuais realizadas nosangue total e no plasma apos 60 mi-nutos de sedimenta<;ao (p = 0,0373)e no plasma apos 120 minutos de

sedimenta<;ao (p = 0,0105).Quanto as contagens realizadas

em 1/5 da area do reticulo centralda camara de Neubauer, a analiseestatistica (ANOVA) tambem mostroudiferen<;a estatisticamente significati-va (p = 0,0004) entre as contagens.

Aplicando-se 0 teste de Tukeyverificou-se que as diferen<;asocorrementre os valores das contagens deplaquetas obtidas no sangue total eas realizadas no plasma apos 30, 60e 120 minutos de sedimenta<;ao (p= 0,0046, P = 0,0043 e p = 0,0142,respectivamente) .

Na mesma Figura, nota-se umatendencia a redu<;ao do numero deplaquetas com 0 aumento do tempode sedimenta<;ao para a obten<;ao doplasma, nas contagens realizadas em1mm2 do reticulo central da camara.Nas contagens realizadas em 1/5mm2

da area observa-se a mesma tenden-cia, com exce<;ao dos valores obtidosno plasma apos 120 minutos de se-dimenta<;ao, que se apresentam maiselevados, porem inferiores aos obtidosnas contagens em sangue total e pelaautoma<;ao.

A precisao e a acuracia dos me-todos eletronicos de contagem deplaquetas, em compara<;ao com osmetodos manuais, sao maiores emvirtude do maior numero de celulascontadas (7). A contagem automati-zada de plaquetas se mostra precisae exata em individuos norma is. En-tretanto, a contagem em pacientestrombocitopenicos e controversa (2).

A Figura 3 mostra os valoresmedios de plaquetas das 33 amos-tras de sangue com plaquetopenia.Independente da area contada, osvalores medios obtidos pela automa-<;aoe pelo metoda manual em sangueforam superiores aos observados nascontagens de plaquetas dos plasmasapos 30, 60 e 120 minutos de sedi-

mentac;ao espontanea. A analise de

variancia (ANOVA) realizada entre

as contagens por automac;ao e pelo

metoda manual (sangue total e plas-

ma apos 30, 60 e 120 minutos de

sedimentac;ao espontanea) mostrou

que nao ha diferenc;a estatisticamente

significativa entre as contagens em

1 mm2 e 1/5 mm2 (p = 0,8261 e p =0,8624, respectivamente).

Semelhante ao observado nas

amostras sem plaquetopenia, as con-

tagens de plaquetas no plasma obtido

em diferentes tempos de sedimen-

tac;ao foram inferiores as contagensdo sangue total e automac;ao com

tendencia a diminuir a medida que

aumenta 0 tempo de sedimentac;ao.

A importancia da contagem precisa

e exata de plaquetas e crucial para se

indicar ou nao a transfusao de pla-

quetas em pacientes plaquetopenicos,

principalmente quando as contagens

estao abaixo de 30.000/mm3 (2, 8).

As plaquetopenias persistentes tem

que ser minuciosamente investigadas,

considerando a possibilidade de doenc;a

grave (9). A contagem de plaquetas e

uma das muitas variaveis que deter-

minam 0 risco de uma hemorragia. Os

analisadores hematologicos automati-

cos empregam inovac;5es tecnologicaspossibilitando contagens mais precisas

de plaquetas (10).

A acuidade e precisao na contagem

automatizada de plaquetas dependem

da habilidade do sistema em separar

as plaquetas de interferentes como

partfculas que tem as mesmas pro-

priedades ffsicas como fragmentos de

eritrocitos e de blastos, degranulac;5esde leucocitos (especialmente eosinofi-

105), bacterias e microcitose acentua-

da. Estes interferentes favorecem uma

falsa plaquetocitose (8, 9).

A presenc;a de plaquetas gigantes,

agregac;ao plaquetaria e/ou satelitis-mo plaquetario (frequentemente indu-

Automatico

OSangue total

DPlasma 30

DPlasma 60

OPlasma 120

Figura 2. Representa~oo gr6fica dos valores medios de plaquetas das 48 amostras de sangue

sem plaquetopenia

Automatico

o Sangue total

OPlasma 30

oPlasma 60

OPlasma 120

Figura 3. Representa~oo grafica dos valores medios de plaquetas das 33 amostras de sangue

com plaquetopenia

450.000

400.000

350.000~S 300.000-€

250.000E<I> 200.000;:3g'

150.000p:;100.000

50.000

0I 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 2325272931 33 35 37 39 41434547

Amastras

Figura 4. Distribui~oo gr6fica das contagens de plaquetas pelos metodos automatizado e

manual (1 mm2) em sangue total de 48 amostras noo plaquetopenicas

300.000

250.000

~S 200.000.§

E 150.000<l>6-'"0:: 100.000

50.000

01mm' 1/5 mm'

120.000

100.000

~~ 80.000

'"tl 60.000;::>0'

'"0:: 40.000

20.000

01mm' 1/5 mm'

-240.000

200.000

'"S 160.000S---'"«l 120.000.•...(1);:l0"'«l

80.000p:;

40.000

0

I -+-- Automayiio -- Metodo manual IFigura S. Distribui<;aogr6fica das contagens de plaquetas pelos metodos automatizado emanual (1 mm2) em sangue total de 33 amostras plaquetopenicas

400.000

350.000

.., 300.000a

250.000a---'"oj 200.000.•...(1)

~ 150.000p:;

100.000

50.000

01 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

Amootras

1-- Plasma 30 --- Plasma 60 -+- Plasma 120 IFigura 6. Distribui<;aogr6fica das contagens de plaquetas pelo metodo manual em plasmade 48 amostras de sangue sem plaquetopenia apos 30,60 e 120 minutos de sedimenta<;aoespontanea contadas em todo 0 retlculo central do camara de Neubauer (1mm2).

zido por EDTA) e coagulos de fibrinaindetectaveis, resultam em uma falsaplaquetopenia (9).

As Figuras 4 e 5 mostram a dis-tribui<;ao das contagens de plaquetasobtidas pelos metodos automatizadoe manual em sangue total (em todoo reticulo central da camara), em 48amostras nao plaquetopenicas e em

33 amostras plaquetopenicas, res-pectivamente.

A analise estatfstica mostra quenao ha diferen<;a significativa entreos valores das contagens pelo metodaautomatico e manual em sangue total,para as amostras plaquetopenicas(p = 0,9992), assim como para asamostras nao plaquetopenicas (p =

0,9869). Esses resultados mostramque a contagem de plaquetas nosangue total pelo metoda manual emcamara de Neubauer e uma tecnicasimples e segura para a contagem deplaquetas.

Lasmar et al. (9) realizaram umestudo a fim de comparar os metodosmanual e automatizado. Os autoressubmeteram 65 amostras de sanguea contagem automatizada e em segui-da a contagem manual pelo metodade Rees Ecker. Foi observado que adiferen<;a entre os dois metodos emenor quando ha plaquetopenia, 0

que permite inferir que uma plaque-topenia inicialmente determinada pelaautoma<;ao geralmente e confirmadapelo metodo manual sem grandesdiscrepancias de resultados.

A contagem de plaquetas noplasma e bastante reprodutivel,embora a grande duvida seja saberse diferentes condi<;5es de obten<;aoda amostra (plasma rico em plaque-tas), tais como tempo e velocidadede centrifuga<;ao e/ou sedimenta<;ao(separa<;ao de plasma), local de re-tirada da amostra no plasma, alemda propor<;ao de hemacias/plasma(hemat6crito), interferem na exatidaodos resultados (5).

As Figuras 6 e 7 mostram a distri-bUi<;aodas contagens de plaquetas noplasma de amostras nao plaquetope-nicas e plaquetopenicas, respectiva-mente, ap6s 30, 60 e 120 minutos desedimenta<;ao espontanea, realizadasem todo 0 reticulo central da cama-ra de Neubauer. Observa-se que hauma proximidade dos valores dascontagens nos diferentes plasmas. Aanalise estatfstica mostrou que nao hadiferen<;asignificativa entre os valoresobtidos nas contagens dos diferentesplasmas, tanto nas amostras plaque-topenicas (p = 0,9564) quanta nasnao plaquetopenicas (p = 0,7924).

Oliveira et al., (2) realizaram es-tudo comparativo em 295 amostrassangufneas, tendo como parametrode referencia a contagem automa-tizada, com a finalidade de avaliaros metodos diretos manuais decontagem de plaquetas em camarade Neubauer segundo metodologiasde Maspes-Jamra e de Rees-Ecker,quanta a precisao e exatidao.

Os autores observaram que 0

metodo de Maspes-Jamra a partirda obtenc.;ao do plasma rico emplaquetas apos 3 horas de sedi-mentac.;ao espontanea demonstrouresultados aceitaveis. Entretanto,a interpretac.;ao de seus resu Itadosdeve levar em conta os graus deinexatidao obtidos principalmentepara plaquetopenicos.

No presente estudo, as amostrasforam submetidas a contagem manu-al, utilizando a diluic.;aode 1:200 emsoluc.;aode Rees Ecker, para 0 sanguetotal, e salina-formol 1%, para ascontagens no plasma. Essa diluic.;aoproporciona um menor numero deplaquetas por campo 0 que facilita eagiliza 0 processo para a realizac.;aodas contagens manuais.

Quando foram comparados osvalores obtidos nas contagens em 1

mm2 e em 1/5 mm2 do reticulo centralda camara de Neubauer a analiseestatistica (teste t de Student) naodetectou diferenc.;asignificativa entreos valores das contagens em sanguetotal, quer seja nas amostras plaque-topenicas (p = 0,8628), quer seja nasamostras com valores consideradosnormais (p = 0,6194) (Figuras 8 e 9).

De modo semelhante, no plasmanao houve diferenc.;aestatisticamen-te significativa entre as contagensrealizadas em 1 mm2 e em 1/5 mm2,

independente do tempo de sedimen-tac.;aopara obtenc.;aodos mesmos eda c1assificac.;aodas amostras.

240.000

200.000

Me 160.000-e'"~ 120.000Q);:l0"«lp:; 80.000

40.000

0

Amostras

I-+- Plasma 30 ---- Plasma 60 --6- Plasma 120 IFigura 7. Distribui~ao gr6fica das contagens de plaquetas pelo metodo manual em plasma

de 33 amostras de sangue com plaquetopenia apos 30, 60 e 120 minutos de sedimenta~ao

espontanea contadas em todo 0 retrculo central da camara de Neubauer (1mm2)

450.000

400.000

350.000

M§ 300.000•.•...

250.000'"isQ) 200.000;:;0"«l

150.000p:;100.000

50.000

01 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 434547

IAmostras

--- J mm2 --115 mm2 p=0,6194

Figura 8. Distribui~ao gr6fica das contagens de plaquetas em sangue total de 48 amostras sem

plaquetopenia realizadas em 1mm2 e em 1/5 mm2 do retrculo central da camara de Neubauer

Em laboratorios que nao dis-poem de automac.;ao e convenientea padronizac.;ao de uma tecnica quedinamize a rotina laboratorial. Umaalternativa para tornar a contagemde plaquetas menos laboriosa seriaa realizac.;ao das contagens em 1/5mm2 do reticulo central da camarade Neubauer.

o estudo realizado mostra que os

resultados obtidos pelas contagensem sangue total pelo metoda deRees-Ecker utilizando 1/5 da areado reticulo central e confiavel, poisquando comparados com as conta-gens em 1 mm2 e com os resultadosda automac.;ao nao houve diferenc.;asignificativa, tanto para as amostrasnormais quanta para as amostrasplaquetopenicas.

240oo0

200000

} 160000'";S 120000";:l0"os 80000ii:

40000

--+-1 mm2 -1/5 mm21

Figura 9. Distribuic;:oo grafica das contagens de plaquetas em sangue total de 33 amostras com

plaquetopenia realizadas em 1mm2 e em 1/5 mm2 do retlculo central da camara de Neubauer

• Considerando a contagem de pla-quetas nas amostras nao plaqueto-penicas, em todo 0 reticulo centralda camara de Neubauer, observou-sediferenc;a significativa entre 0 me-todo automatizado e as contagensobtidas no plasma apos 120 minutosde sedimentac;ao espontanea.

• Nao houve diferenc;a estatisticamen-te significativa entre as contagens

• Nao houve diferenc;a estatisticamen-te significativa entre as contagens deplaquetas em sangue total, obtidaspelo metoda automatizado e pelometodo manual tanto para as amos-tras normais quanta para as amos-tras plaquetopenicas, independenteda area contada.

Referencias Bibliogrdficas

realizadas em 1 mm2 e em 1/5 mm2

do reticulo central da camara, tantono sangue total como nos diferentesplasmas das amostras nao plaque-topenicas. 0 mesmo foi observadopara as amostras plaquetopenicas.

• 0 metodo manual que mais se apro-xima dos resultados obtidos pelaautomac;ao e 0 realizado em sanguetotal pelo metodo de Rees-Ecker,podendo ser realizado em 1 mm2

ou em apenas 1/5 mm2 do reticulocentral da camara de Neubauer,com emissao de resultados precisose com 0 beneficio da diminuiC;ao detempo gasto.

AgradecimentosOs autores agradecem it chefia do

Laboratorio de Analises Clinicas doHospital Universitario Onofre Lopespor permitir a coleta de amostras eaos tecnicos de laboratorio pelo auxflioe colaboraC;ao. iJ

Correspondencias para:Tereza Maria Dantas de Medeirostdantas@ufrnet.br

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