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A UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: Estudo comparativo in vitro Luciana Bastos Alves Natal/ RN 2008

Estudo comparativo in vitro - Universidade Federal do Rio … · 2017-11-04 · Biociências da UFRN, na pessoa do Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, ... Maria Celeste Nunes

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A UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA

Adesão de células mesenquimais da medula óssea de

camundongos e do ligamento periodontal de ratos a

diferentes superfícies de titânio:

Estudo comparativo in vitro

Luciana Bastos Alves

Natal/ RN

2008

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Luciana Bastos Alves

Adesão de células mesenquimais da medula óssea de

camundongos e do ligamento periodontal de ratos a

diferentes superfícies de titânio:

Estudo comparativo in vitro

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Odontologia, com

área de concentração em Periodontia e

Prótese Dentária, da Faculdade de

Odontologia da UFRN, como requisito

parcial para obtenção do grau de mestre.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza

Natal – 2008

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Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

Alves, Luciana Bastos. Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: estudo comparativo in vitro / Luciana Bastos Alves. – Natal, RN, 2008.

70 p. : il.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.

Dissertação (Mestrado) – Departamento de Odontologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Ligamento periodontal - Dissertação. 2. Medula óssea – Dissertação. 3. Titânio – Dissertação. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título.

RN/UF/BSO Black D64

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Dedico este trabalho

A Deus, pelo seu amor e sua

presença em minha vida que me faz mais

forte e segura.

Aos meus pais Edmar e Lúcia, que

sempre me apoiaram, incentivaram e se

esforçaram para a concretização de mais

uma etapa da minha vida. Sem vocês eu

nada seria. Muito obrigada!

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AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, pela confiança

depositada em meu trabalho, pela sua disponibilidade irrestrita, pelos ensinamentos

compartilhados, pelo incentivo e estímulo na área de cultivo celular que me abriram as portas

para a próxima etapa, pelo apoio nos momentos difíceis e pelo carinho e amizade.

À aluna de iniciação científica do curso de Biomedicina da UFRN, Fernanda Ginani,

pelos primeiros passos na área de cultivo de células, pela sua disponibilidade e amizade que

construímos e “cultivamos” junto com este trabalho.

Ao colega e Prof. José Sandro Pereira da Silva, pelas amostras de titânio e completa

contribuição na caracterização de superfícies, pelas orientações nesta área, pelo apoio, atenção

e disponibilidade na elaboração deste trabalho.

Ao LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), na pessoa do Prof. Dr. Clodomiro

Alves Júnior, pelo espaço e estrutura cedidos para o tratamento das amostras.

Ao laboratório de cultura de células do Departamento de Bioquímica do Centro de

Biociências da UFRN, na pessoa do Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pelo

espaço e estrutura cedidos para o cultivo celular.

Ao Departamento de Energia Nuclear da UFPE, na pessoa da Prof. Dra. Helen Jamil

Khoury, pela irradiação das amostras.

Ao Laboratório de Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, pela

concessão dos animais utilizados neste trabalho.

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A Faculdade de Odontologia da UFRN, na pessoa do chefe do departamento Prof. Dr.

Antônio Ricardo Calazans Duarte,

Aos Professores Dra. Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa e Dr. Adriano Rocha

Germano, pela participação na banca da qualificação, o que contribuiu para qualidade desta

dissertação.

Aos Professores Dra. Adriana da Fonte Porto Carreiro, Dr. Antônio Ricardo

Calazans Duarte, Dr. Gustavo Augusto Seabra Barbosa, pelos ensinamentos em Prótese

Dentária, e em especial ao Prof. Dr. Eduardo Gomes Seabra pelos ensinamentos em

Periodontia.

Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFRN, Dra.

Maria Ângela Ferreira, Dr. Kênio Costa Lima, Dr. Ângelo Giuseppe Roncalli, Dra.

Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, Dra. Maria do Socorro Costa Feitosa Alves, Dra.

Íris do Céu Clara costa, e Dra. Maria Celeste Nunes de Melo, pelas orientações e

ensinamentos partilhados.

A todos os funcionários da Faculdade que contribuíram de alguma forma para a

concretização deste trabalho, em especial a Sandra, Ocian e Cecília.

Aos meus colegas de turma, Luana, Eudivar Alessandra, Lidiane, Miguel, Pedro

Henrique, Ana Rafaela e Arcelino, pela convivência amiga e alegre durante todo o curso.

Ao aluno de iniciação científica do curso de Odontologia da UFRN, Marcel Cortês

Bonifácio Varela Cavalcanti, pelo seu apoio no cultivo de células.

Ao aluno do curso de Odontologia da Universidade Potiguar, Almir Nery, pela

contribuição no tratamento de superfícies das amostras.

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Ao meu irmão Rafael Bastos Alves, que mesmo distante se fez presente através do

amor, amizade e cumplicidade, o que me deu forças para realização desta etapa.

As minhas amigas Alinne Alice e Renata Filgueira, pelo carinho, apoio e amizade

durante os momentos de convivência alegre fora da faculdade.

A Tony, pelo incentivo, compreensão, carinho e boas energias transmitidas durante a

realização deste trabalho.

As minhas primas de sangue, irmãs de coração e colegas de profissão Nathália Bastos

e Ludmila Alves, pelo carinho e apoio nos momentos difíceis.

A minha “grande família”: tios, primos, sobrinhos e especial aos meus amados avós

Geraldo e Lysia, que estiveram sempre na torcida por mim.

A todos que de acreditaram em mim e de alguma forma contribuíram para a realização

deste trabalho.

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Se as coisas são inatingíveis... ora!

Não é motivo para não querê-las...

Que tristes os caminhos, se não fora

a mágica presença das estrelas!

(DAS UTOPIAS – Mário Quintana)

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RESUMO

O presente trabalho utilizou a cultura celular para analisar a capacidade de adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio. Para tanto, foram utilizados discos de titânio grau II ASTM F86 nas dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, os quais receberam diferentes tratamentos de superfície em 2 grupos distintos (polido e nitretação a plasma por gaiola catódica). As células foram isoladas da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos e cultivadas em meio de cultura meio básico α-MEM contendo antibióticos e suplementado com 10% de FBS, por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37ºC. No subcultivo as células foram cultivadas em 1 placa de 24 poços, na densidade de 1 x 104 células por poço, onde os discos de titânio foram distribuídos de acordo com os grupos, incluindo-se controles positivos sem os discos de titânio. Após 24 horas de cultivo, as células foram submetidas a contagem em câmara de Neubauer. Os resultados analisados mostraram que tanto as células mesenquimais da medula óssea de camundongos como as células do ligamento periodontal de ratos tiveram melhor adesão à superfície controle. O número de células da medula óssea aderidas a superfície de Ti polido não foi estatisticamente significante quando comparado ao mesmo tipo celular aderido à superfície de Ti tratada por plasma na configuração de gaiola catódica, entretanto diferença significante foi encontrada entre o grupo controle e o grupo Ti polido. Com relação à adesão das células do ligamento periodontal, diferença significativa foi encontrada apenas entre as superfícies controle e as superfícies de Ti tratadas por plasma. No que diz respeito às comparações entre superfícies iguais com células diferentes, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significante. Portanto, conclui-se que o titânio é um bom biomaterial para a adesão de células mesenquimais e que as diferentes formas de tratamento de superfície dada ao material podem influenciar neste processo.

Palavras-chave: Células mesenquimais; medula óssea; ligamento periodontal; titânio.

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ABSTRACT

The present experiment used cell culture to analyze the adhesion capacity of mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament to different titanium surfaces. Grade II ASTM F86 titanium discs 15mm in diameter and 1.5mm thick were used and received 2 distinct surface treatments (polished and cathodic cage plasma nitriding). The cells were isolated from the mouse bone marrow and rat periodontal ligament and cultured in α-MEM basic culture medium containing antibiotics and supplemented with 10% FBS and 5% CO2, for 72 hours at 37ºC in a humidified atmosphere. Subculture cells were cultured in a 24-well plate with a density of 1 x 104 cells per well. The titanium discs were distributed in accordance with the groups, including positive controls without titanium discs. After a 24-hour culture, the cells were counted in a Neubauer chamber. The results show that both the mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament cells had better adhesion to the control surface. The number of bone marrow cells adhered to the polished Ti surface was not statistically significant when compared to the same type of cell adhered to the Ti surface treated by cathodic cage plasma nitriding. However a significant difference was found between the control and polished Ti groups. In relation to periodontal ligament cell adhesion, a significant difference was only found between the control and plasma-treated Ti surfaces. When comparing equal surfaces with different cells, no statistically significant difference was observed. We can therefore conclude that titanium is a good material for mesenchymal cell adhesion and that different material surface treatments can influence this process.

Key words: Mesenchymal cells; bone marrow; periodontal ligament; titanium.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995).

Figura 2. Equipamento para nitretação iônica.

Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação iônica em gaiola catódica (SOUSA, et

al.2008).

Figura 4. Corte das epífises ósseas.

Figura 5. Extração da medula óssea.

Figura 6. Rato Wistar.

Figura 7. Incisivos no meio básico alfa-MEM.

Figura 8. Remoção do ligamento periodontal.

Figura 9. Fragmentos de ligamento periodontal cultivados em tripsina.

Figura 10. Suspensão centrifugada.

Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico alfa-MEM supletmentado com 10% de

SFB.

Figura 12. Suspensão centrifugada.

Figura 13. Placa de cultura com discos e células.

Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de cultura de 24 poços.

Figura 15. Adesão de células às diferentes superfícies de titânio.

Figura 16. Adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies de titânio.

Figura 17. Adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies de titânio.

Figura 18. Adesão de células às superfícies controle.

Figura 19. Adesão de células à superfície Ti Polido.

Figura 20. Adesão de células à superfície Ti Gaiola.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.

Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes

superfícies.

Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies

Controle e Ti Polido.

Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies

Controle e Ti Gaiola.

Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti

Polido e Ti Gaiola.

Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes

superfícies.

Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies

Controle e Ti Polido.

Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies

Controle e Ti Gaiola.

Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti

Polido e Ti Gaiola.

Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle.

Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido.

Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola.

Tabela 13. Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro.

Tabela 14. Valores da média e desvio padrão de molhabilidade.

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABCG-2 - Marcador de células-tronco mesenquimais

ALP- Fosfatase alcalina

AOs - Osteoblastos alveolares

α -MEM – Meio essencial mínimo tipo alfa

α-SMA – Actina de músculo liso tipo alfa

ASTM – Sociedade Americana de Análise e Padronização de Materiais

β-FGF- Fator de crescimento fibroblástico beta

BSP- Sialoproteína óssea

β-TCP - Fosfato tricálcio beta

ºC - Grau Celsus

Cbfa-1 - Subunidade alfa 1 do fator de ligação ao core

CD - Marcador de superfície celular

CFU-F – Unidades formadoras de colônias de fibroblastos

c-KIT - Marcador de células-tronco mesenquimais.

cm2 - Centímetro quadrado

CO2 - Gás carbônico

Col I - Colágeno tipo I

Col XII - Colágeno tipo XII

CTM - Célula-tronco mesenquimal

EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGF- Fator de crescimento epidérmico

FBS - Soro fetal bovino

g - Grama

GFAP – Proteína glial ácida fibrilar

GFs - Fibroblastos gengivais

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H - Hidrogênio

hESCs - Células-tronco embrionárias humanas

HNK1 - Marcador para células de cristas neurais indiferenciadas

H2O2 - Peróxido de hidrogênio

hPDLF - Fibroblastos do ligamento periodontal humano

I-11 - Interleucina-11

kGy - KiloGray

L1 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície controle

L2 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio polido

L3 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio tratado

M1 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície controle

M2 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio polido

M3 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio nitretado

mA - Miliampére

Mbar - Milésimo de bar (pressão)

MC3T3-E1 – Linhagem de células osteoblásticas da calvária de embrião de camundongos

MEV - Microscopia eletrônica de varredura

MG-63 – Linhagem de células osteoblásticas

mg/L - Miligramas por litro

mL- Mililitro

mm - Milímetro

mM - Milimolar

mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro

MUC18 - Marcador de células-tronco mesenquimais

µl - Microlitro

N - Nitrogênio

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NFM - Neurofilamento M

Oct-4 - Fator crítico transcripicional para manutenção da pluripotencialidade

OCNE - Marcador de células-tronco mesenquimais

OCN - Osteocalcina

OP-CHEM - Tipo de pano de polimento

OPG - osteoprotegerina

OPN - Osteopontina

OSC – Osteocalcina

Osteo-1- Linhagem celular

p75 – Proteína associada a células das cristas neurais indiferenciadas

PBS - Tampão fosfato-salino

PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular

PDL - Ligamento periodontal

PDLFs - Fibroblastos do ligamento peridontal

pH - Potencial hidrogeniônico

Ra – Parâmetro de rugosidade média

RANKL – Ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa

rpm – Rotação por minuto

RTG - Regeneração tecidual uuiada

RUNX-2 – Fator de transcrição associado ao Runt

sccm - Centímetro cúbico padrão por minuto (medida de fluxo de gás)

SiC- Carbeto de silício

Slug - Fator de transcrição associado à crista neural

STRO-1 - Marcador de superfície de células-tronco mesenquimais

Sox2 - Fator de transcrição

Sox9 - Fator de transcrição

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Ti - Titânio

Ti6A14V - Liga de Titânio

Twist - Fator de transcrição

U-2 OS – Linhagem de células osteoblásticas de ostessarcoma

V -Voltz

Vol. - Volume

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................17

2 REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................20

2.1 Células mesenquimais da medula óssea.........................................................................20

2.2 Regeneração periodontal.................................................................................................21

2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal..........................................................22

2.4 Osseointegração................................................................................................................31

2.4.1 Titânio (Ti).....................................................................................................................31

2.4.2 Características superficiais e respostas celulares.......................................................32

2.4.3 Tratamento de superfície..............................................................................................35

2.4.3.1 Nitretação iônica.........................................................................................................35

3 OBJETIVOS........................................................................................................................38

3.1 Objetivo geral....................................................................................................................38

3.2 Objetivos específicos.........................................................................................................38

4 METODOLOGIA................................................................................................................39

4.1 Preparo das amostras.......................................................................................................39

4.1.1 Protocolo de nitretação..................................................................................................39

4.2 Caracterização das amostras...........................................................................................41

4.2.1 Composição da camada.................................................................................................41

4.2.2 Textura superficial.........................................................................................................41

4.2.3 Rugosidade.....................................................................................................................41

4.2.4 Molhabilidade................................................................................................................41

4.3 Esterelização das amostras..............................................................................................42

4.4 Cultura de células.............................................................................................................42

4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos...........................................42

4.4.2 Cultivo das células da medula óssea............................................................................43

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4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos..........................................43

4.4.4 Cultivo das células do ligamento periodontal.............................................................43

4.4.5 Cultivo nos discos de Titânio........................................................................................45

4.5 Viabilidade e adesão celular............................................................................................46

4.6 Análise estatística..............................................................................................................46

5 RESULTADOS....................................................................................................................47

5.1 Resultados da análise de superfície.................................................................................47

5.2 Resultados de adesão celular...........................................................................................47

5.2.1 Adesão das células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies.....47

5.2.2 Adesão das células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies.....49

5.2.3 Adesão de células da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de

ratos à mesma superfície........................................................................................................50

6 DISCUSSÃO........................................................................................................................52

7 CONCLUSÕES...................................................................................................................58

REFERÊNCIAS.....................................................................................................................59

APÊNDICE.............................................................................................................................67

ANEXOS ................................................................................................................................69

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1 INTRODUÇÃO

As células mesenquimais indiferenciadas, ou células-tronco como são conhecidas, são

células com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular

altamente especializado. Existem duas categorias de células-tronco: as células-tronco

embriononárias pluripotentes que são procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula

do embrião e que são capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo; e a

categoria de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas, que

têm capacidade de dar origem a tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003).

A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua capacidade de

proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Contudo, existem desvantagens,

como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros

imunocomprometidos e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética. Já as

células-tronco adultas apresentam a vantagem de serem autogênicas, não incorrendo em

limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro. No

entanto, também apresentam desvantagens, como o fato de não serem pluripotentes, a

dificuldade de obtêlas, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor

quantidade nos tecidos (SONG et al., 2004; SOARES, 2007).

A principal fonte de células-tronco adultas é a medula óssea. Constituem uma pequena

população celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se

diferenciarem em múltiplas linhagens em condições de cultura definidas. Estas células têm a

capacidade de se diferenciarem em células dos tecidos ósseo, adiposo, cartilaginoso e

muscular, o que demonstra sua alta plasticidade. O interesse neste tipo celular cresceu

vertiginosamente nos últimos anos devido ao seu grande potencial de uso na regeneração de

tecidos e órgãos lesados (PITTENGER et al., 1999; ROSADA et al., 2003;, SHORT et al.,

2003; BARRY, MURPHY, 2004).

Inúmeros estudos também têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas

dos tecidos orais, tais como polpa dentária (GRONTHOS, MANKANI, BRAHIM, 2000;

GRONTHOS et al, 2002; MIURA et al., 2003; SHI, ROBEY, GRONTHOS, 2001; SHI,

GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e ligamento periodontal (SEO et al, 2004;

CHEN et al., 2006; AKIZUKI et al. 2005; NAGATOMO et al., 2006; GRONTHOS et al,

2006). A identificação desta população celular nos tecidos dentais tem estimulado o interesse

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no potencial regenerativo destas células e na sua aplicabilidade na engenharia tecidual, ou

bioengenharia.

A bioengenharia é usada para construção ou para regeneração dos tecidos injuriados

ou perdidos, decorrentes de doenças degenerativas, trauma, câncer ou doença periodontal, tais

como o tecido ósseo. Baseia-se na terapia celular envolvendo células mesenquimais

associadas ou não aos biomateriais (SILVÉRIO et al., 2008).

Dentre os biomateriais, diversos estudos têm mostrado que o titânio atualmente é

considerado o biomaterial de escolha para a confecção de implantes osseointegrados em

implantodontia e ortopedia, devido à característica osteocondutora e às propriedades

mecânicas, estabilidade química e biocompatibilidade, que varia de acordo com o tratamento

dado a esse metal. (AMARANTE, LIMA, 2001). Portanto, a natureza da superfície determina

a resposta biológica ao redor do biomaterial e, como conseqüência, o sucesso da interação

célula-superfície.

A interação das células ao biomaterial pode ser dividida em três fases. Na primeira

fase as células em contato com a superfície primeiramente se ligam, aderem e se espalham.

Esta fase é a mais importante, pois a qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na

capacidade para proliferação e diferenciação das células. Durante a segunda fase, as células se

proliferam e se diferenciam. Finalmente, durante a terceira fase, ocorre a deposição da matriz

extracelular mineralizada. (KASEMO, 2002; ANSELME, 2000).

Na busca por superfícies que melhoram a essa interação e supram à necessidade de

obter uma boa adesão, e conseqüentemente uma maior proliferação e formação óssea,

contribuindo para a osseointegração, vários métodos de tratamento de superfície têm sido

utilizados, tais como: a aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio,

deposição a laser de carbeto de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG,

2004).

Dentre os diferentes métodos, pode-se citar a nitretação iônica ou nitretação a plasma,

um processo de introdução do elemento nitrogênio na superfície dos metais com o objetivo de

alterar as propriedades superficiais desse material (COOPER, MASUDA,WHITSON, 1999;

BRAMA, 2007).

Devido ao importante papel das células mesenquimais nos processos de regeneração

óssea e fixação dos implantes, o presente estudo busca avaliar a capacidade de adesão das

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células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos

às superfícies de titânio lisas e nitretadas por plasma na configuração de gaiola catódica.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Células mesenquimais da medula óssea

A medula óssea não é apenas o local onde ocorre a hematopoese na vida pós-natal,

mas também é um reservatório de células-tronco adultas (CANCEDDA, BIANCHI,

DERUBEIS, 2003) Um tipo específico de célula-tronco adulta é a célula-tronco mesenquimal

(CTM) (PITTENGER et al., 1999; HU et al., 2002) também denominada de célula-tronco

estromal da medula (BIANCO et al., 2001) ou apenas célula estromal da medula (PROCKOP,

1997).

As células-tronco mesenquimais (CTM) foram isoladas pela primeira vez por

Friedenstein e colaboradores no início da década 70, a partir de uma suspensão celular da

medula óssea, e caracterizadas como células aderentes, fibroblastóide e clonogênica, sendo

inicialmente denominadas de células formadoras de colônia fibroblastóides (CFU-F = colony

forming units – fibroblastic) (FRIEDENSTEIN et al., 1966) ou células mesenquimais

estromais multipotentes, de acordo com a nova nomeclatura proposta pela Sociedade

Internacional para Terapia Celular, em 2005 (HOROWITZ et al., 2005). Essas células

mostraram ser multipotenciais e não apenas participam como estroma de mielosuporte, como

também se diferenciam em linhagens mesodérmicas quando implantadas in vivo (OWEN,

1988).

Atualmente, muitos estudos têm isolado as CTM e têm controlado, in vitro, a sua

diferenciação em tecido cartilaginoso e ósseo, utilizando fatores de crescimento específico,

com o objetivo de usar esta nova tecnologia no reparo de tecidos lesados de origem

mesenquimal (PITTENGER et al., 1999; MARTIN et al., 2002; MEIRELES, NARDI, 2003).

Além disso, células estromais da medula óssea também têm sido bastante utilizadas no reparo

de grandes defeitos ósseos, através da associação com biomateriais e injeção sistêmica de

células osteogênicas para o tratamento de doenças ósseas genéticas, como a osteogênese

imperfeita (CANCEDDA, BIANCHI, DERUBEIS, 2003; SHANTI et al., 2007).

As células-tronco mesenquimais podem se diferenciar em osteoblastos e promover

mineralização quando cultivadas na presença de ácido ascórbico, betaglicerol fosfato e

dexametasona (MAEDA et al. 2007). As células adquirem morfologia de osteoblastos, após

14 a 21 dias (KIM et al., 2004) com aumento da atividade da fosfatase alcalina, deposição de

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uma matriz extracelular rica em cálcio (BARRY, MURPHY, 2004) e formação de cristais de

hidroxiapatita (BARRY, 2003).

Pesquisas recentes sinalizam para a possibilidade de implantação de tecido ósseo

desenvolvido a partir de cultura de células-tronco do próprio paciente, diferenciadas em

osteoblasto. A regeneração óssea guiada utiliza a implantação de células-tronco no local

afetado, sem a necessidade de enxertos ósseos, usando um biomaterial como veiculo

(BORDJI, 1996). A associação dos implantes de titânio com o tecido ósseo em cultura poderá

contribuir para a engenharia tecidual e o sucesso na regeneração periodontal e

osseointegração (FRAZOLIN et al. 2008).

2.2 Regeneração periodontal

O reparo do aparato de inserção e sustentação do periodonto, destruído como resultado

da progressão da doença periodontal, tem sido a meta principal da terapia periodontal. A

regeneração periodontal busca a formação de novo cemento e novo osso alveolar além da

nova inserção e reinserção das fibras do ligamento periodontal ao novo cemento e superfície

radicular (BARTOLD et al., 2000).

Desde a década de 70, inúmeras técnicas têm sido utilizadas a fim de interromper a

progressão da doença e obter a reconstituição da arquitetura e função das estruturas de suporte

perdidas. A terapia periodontal inclui raspagem e alisamento radicular, cirurgias para

descontaminação e biomodificação da superfície radicular, enxertos, substitutos ósseos,

biomateriais, fatores de crescimento e regeneração tecidual guiada (RTG) (POLIMENI,

XIROPAIDIS, WIKESJO, 2006).

Melcher, em 1976, sugeriu que o tipo de células que repovoam a superfície radicular

após o tratamento cirúrgico periodontal determina a natureza da inserção que formará. A

superfície radicular tratada pode ser repovoada por células epiteliais, células do tecido

conjuntivo, células ósseas e células do ligamento periodontal. Foi sugerido também que a

regeneração do periodonto envolve células progenitoras presentes no ligamento periodontal,

capazes de se diferenciarem em fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos.

Baseada nestas hipóteses, a técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão

celular seletiva através da utilização de uma barreira física interposta entre o retalho

periodontal e a superfície radicular tratada. Seu objetivo é excluir o tecido conjuntivo, além

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de desviar a proliferação epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que

poderá ser repovoado por células derivadas do ligamento periodontal, conduzindo assim a

regeneração do periodonto (GOTTLOW, 1984; CAFESSE et al., 1988).

Entretanto estas terapias são limitadas pela severidade da doença periodontal, tipo de

defeito e por fatores locais e sistêmicos, dentre outros. Desta forma, busca-se uma nova

terapia de reconstrução do periodonto destruído pela doença periodontal. Recentes técnicas de

engenharia tecidual baseadas na biologia de células-tronco têm sido propostas para

desenvolver tal terapia (NEEDLEMAN et al., 2006; HASEGAWA et al., 2005; GRONTHOS

et al, 2006; FUJII et al., 2008).

Desta maneira, o ligamento periodontal tem sido de fundamental importância no

processo de reparo e regeneração do periodonto, uma vez que apresentam células como

cementoblastos, osteoblastos, mifibroblastos, células endoteliais, células epiteliais e células

nervosas, além de “células progenitoras” ou células mesenquimais indiferenciadas (células-

tronco) que têm sido identificadas através de vários estudos (IVANOVSKI et al., 2006).

2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal

O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo frouxo interposto entre as superfícies

radiculares dos dentes e a parede interna do osso alveolar. Suas fibras formam uma malha que

se estende entre o cemento e osso e está firmemente ancorada pelas fibras de Sharpey. O

ligamento periodontal une o dente ao osso alveolar propriamente dito, promovendo suporte,

proteção, sensitividade, nutrição, homeostase e reparo (BEERTSENC, MCCULLOC,

SODEK, 1997).

O conceito de que células mesenquimais indiferenciadas podem estar presentes no

ligamento periodontal foi inicialmente proposto por Melcher em 1976, o qual observou que

estas células presentes no ligamento periodontal eram capazes de formarem fibroblastos,

cementoblastos e osteoblastos A partir de então, a capacidade regeneradora das células do

ligamento periodontal tem sido pesquisada através de vários estudos (BARTOLD, SHI,

GRONTHOS, 2006).

Seo et al. (2004) levantaram a hipótese de que o ligamento periodontal pode conter

células indiferenciadas multipotentes que podem ser usadas para regenerar cemento e

ligamento periodontal in vivo. Os autores isolaram células do ligamento periodontal de

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terceiros molares extraídos de humanos, e analisaram através da imunohistoquímica para

identificar marcadores de células-tronco. Quando transplantadas em ratos

imunocomprometidos, as mesmas mostraram a capacidade de formar estruturas como

cemento e ligamento e contribuir para o reparo tecidual periodontal. Os resultados da pesquisa

mostraram que células do ligamento periodontal expressaram os marcadores de células-tronco

mesenquimais: STRO-1 e CD146/MUC18. Em condições de cultura, células do ligamento

periodontal diferenciaram-se em cementoblastos, adipócitos e fibroblastos.

Vários antígenos de superfície celular têm sido usados como marcadores para células-

tronco e são importantes para isolar essas células de outros tecidos. Chen et al. (2006)

realizaram um estudo com o objetivo de identificar e localizar células indiferenciadas no

ligamento periodontal humano sadio e doente usando marcadores de superfície celular para

células mesenquimais (STRO-1, CD146 e CD44). Dentes afetados pela doença periodontal e

sadios foram coletados, fixados em formal a 10%, descalcificados e embebidos em parafina

para análise imunohistoquímica. Anticorpos contra STRO-1, CD146 e CD44 foram usados

para identificar células-tronco no ligamento periodontal. Os resultados mostraram que células

mesenquimais indiferenciadas foram identificadas tanto no ligamento de periodonto sadio

quanto em doente.

Akizuki et al. (2005) em um estudo piloto isolaram e cultivaram células do ligamento

periodontal de pré-molares extraídos de cães e aplicaram essas células juntamente com

condutor de ácido hialurônico em cinco defeitos ósseos criados cirurgicamente nas superfícies

mesiais das raízes dos primeiros molares mandibulares de uma hemi-arcada de cada cão. A

outra hemi-arcada foi usada como grupo controle, onde foram criados os mesmos defeitos e

neles aplicados apenas condutor de ácido hialurônico. Após oito semanas, os animais foram

sacrificados e os espécimes preparados a fim de avaliar histologicamente e histometricamente

a cicatrização dos defeitos periodontais. Os resultados mostraram ausência de inflamação

clínica ou recessão gengival em ambos os lados. No grupo experimental foi observada a

cicatrização periodontal com formação de osso, ligamento periodontal e cemento em três dos

cinco defeitos, e no grupo controle não foi constatada a formação de tecido periodontal,

exceto em um defeito. A análise histométrica revelou que a formação de novo cemento no

grupo experimental foi altamente significante quando comparada ao grupo controle. Deste

modo, os autores concluíram que as células do ligamento periodontal têm o potencial de

promover regeneração tecidual, sendo de grande importância para a terapia regenerativa.

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Nagatomo et al. (2006) isolaram células do ligamento periodontal de pré-molares e

terceiros molares extraídos de humanos a fim de verificar as propriedades de renovação,

multiplicação e expressão de marcadores dessas células. Análise de fluorescência ativada

revelou que essas células expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e

STRO-1. Esses resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem células-

tronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras.

Gronthos, Mankani e Brahim (2000) demonstraram que as células mesenquimais da

polpa dentária expressavam a molécula de adesão celular CD106 (VCAM-1). Em 2003,

Gronthos, Zannettino e Hay observaram que esta mesma molécula CD106 (VCAM-1) era

expressa nas células-tronco da medula óssea. Em 2006, usaram uma estratégia de

imunoseleção para purificar as células mesenquimais clonogênicas do ligamento periodontal

de ovinos baseada na reatividade ao anticorpo que identifica o CD106. A positividade para

este antígeno CD106 das células do ligamento periodontal de ovinos demonstrou a capacidade

de formarem um agregado de células semelhantes a fibroblastos quando manipuladas em

baixa densidade in vitro. A expanção ex-vivo dessas células exibiu alto grau de proliferação in

vitro e expressaram um fenótipo (CD44+, CD166+, CBFA-1+, colágeno-I+, sialoproteína

óssea+) consistente com células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos, além da

capacidade de regenerarem, tanto tecido mineralizado semelhante ao cemento, quanto

ligamento periodontal, quando transplantadas em ratos imunocomprometidos.

Kawanabe, Murakami e Yamamoto (2006) observaram que as células mesenquimais

do ligamento periodontal exibiam um perfil funcional de células-tronco e expressavam

ABCG-2 (um marcador usual de células-tronco) e Oct-4 (um fator crítico transcripicional para

manutenção da pluripotencialidade), entretanto somente 3,9% das células do ligamento

periodontal cultivadas exibiam tais características.

Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo onde células do ligamento

periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e separadas em meio de

cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e

tecido adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas condições

de cultivo e indução. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm

células mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e

adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea.

Fujii et al. (2008) isolaram e cultivaram três linhagens celulares (linhas 1-4, 1-11 e 1-

24) que expressam os marcadores celulares RUNX-2, Col I, ALP, OPN, OCN, RANKL,

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OPG, escreráxe , periostina, Col XII, e α-SMA mRNA. A análise histoquímica demonstrou

que o marcador celular CD146 foi expresso nas células das linhagens 1-4 e 1-11 e o STRO-1

foi expresso nas linhagens 1-11 e 1-24. As células das linhagens 1-4 e 1-11 se diferenciaram

em células osteoblásticas e adipócitos quando cultivadas em meio de diferenciação de

linhagem específica. Quatro semanas depois das células da linhagem 1-11 serem

transplantadas em ratos imunodeficientes com fosfato β-tricálcio (β-TCP), o transplante

produziu tecidos semelhantes a cemento e osso ao redor do β-TCP. Oito semanas depois, as

células 1-11 transplantadas formaram estruturas semelhantes ao ligamento periodontal na

superfície do β-TCP. Estes resultados sugerem que as células da linhagem 1-11 eram

derivadas das células progenitoras/ células mesenquimais do ligamento periodontal e pode ser

bastante útil para estudar a biologia e regeneração do periodonto humano.

Coura (2008) buscando verificar a possibilidade de o ligamento periodontal conter

células mesenquimais cresto neurais, isolou e cultivou células do ligamento em dois grupos

distintos (um com células do ligamento de 10 dentes de 7 indivíduos diferentes e outro grupo

com células do ligamento de 4 dentes de um mesmo indivíduo). Após serem cultivadas em

um meio indutivo específico e as analisadas através de imunohistoquímica, observou-se a

presença de um marcador de células-tronco neurais e também marcadores para células cresto

neurais indiferenciadas (HNK1, p75). Os resultados foram similares nos dois grupos,

sugerindo evidências de que o ligamento periodontal humano em adição a derivados

mesodermas, produzem células semelhantes às células cresto neurais.

Lin et al. (2008) realizaram um estudo a fim de identificar e localizar células

mesenquimais indiferenciadas em biópsias em bloco e em cultura de expansão celular dos

tecidos periodontais humanos regenerados. Para tal, foi utilizada a técnica de regeneração

tecidual guiada com membranas em defeitos de furca e superfície dentária dos terceiros

molares de humanos voluntários. Após o período de cicatrização de 6 semanas, os dentes e os

tecidos ao seu redor (tecidos regenerados e osso alveolar) foram removidos cirurgicamente

para o preparo das amostras em bloco as quais foram processadas para análise

imunohistoquímica, e para obtenção de células para cultura. Os marcadores de células-tronco

mesenquimais STRO-1, CD146 e CD44 foram utilizados para identificar as células. Culturas

celulares obtidas dos tecidos regenerados foram analisadas pela citometria fluida, e os

resultados revelaram positividade para tais marcadores. Mineralização, concentração de cálcio

e potencial adipogênico das células dos tecidos regenerados foram acessados e comparados

com as células mesenquimais do ligamento periodontal, células-tronco da medula óssea e

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fibroblastos gengivais. Os resultados mostraram a capacidade desses tecidos formarem

depósitos minerais e adipócitos. Entretanto, o nível de mineralização das células do tecido

regenerado foi mais baixo que o de células mesenquimais do ligamento periodontal e de

células-tronco da medula óssea.

Considerando que as células do ligamento periodontal são muito importantes para o

processo de regeneração dos tecidos periodontais devido a sua localização e suas propriedades

de células indiferenciadas, e que a interleucina-11 (I-11) é uma citocina multifuncional que

participa ativamente do metabolismo ósseo, Leon et al. (2006) realizaram um estudo para

examinar o efeito da I-11 na diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal

de humanos. As células do ligamento periodontal cultivadas foram estimuladas com I-11 e/ou

ácido ascórbico, com ou sem inibidores para o colágeno tipo 1. A diferenciação osteoblástica

foi analisada pela atividade de fosfatase alcalina e expressão gênica do marcador RUNX2,

ostocalcina e sialoproteína óssea utilizando a cadeia de reação da polimerase transcripção

reversa. O colágeno tipo 1 e o tecido inibidor da produção da metaloproteinase-1 foram

medidos usando imunoensaios ligados à enzimas. Os resultados mostraram que a I-11

aumentou a atividade da fosfatase alcanina e do marcador RUNX2, e que na presença de

ácido ascórbico, aumentaram a osteocalcina e expressão gênica da sialoproteína óssea. A I-11

induziu a produção de células do ligamento periodontal pelo colágeno tipo 1 e o tecido

inbidor da metaloproteinase-1. Os autores concluíram que a interleucina-11 e/ou o ácido

ascórbico induzem a diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal através

da produção de colágeno tipo 1. Os resultados também sugerem que a I-11 pode funcionar

como uma citocina osteopromotora, estimulando a diferenciação osteoblástica das células do

ligamento periodontal principalmente através da síntese de colágeno tipo 1 e possivelmente

pela indução do tecido inibidor da metaloproteinase-1.

Isaka et al. (2001) realizaram um estudo a fim de determinar se as células do

ligamento periodontal tinham um papel importante no reparo ósseo durante o processo de

regeneração periodontal. Para tal, foi investigada, in vitro, a expressão de fenótipo

osteoblástico, tal como atividade da fosfatase alcalina, paratireóide hormônio-dependente 3`e

acúmulo de adenosina monofosfato cíclica 5´ utilizando células isoladas do ligamento

periodontal e células isoladas da mandíbula de cães. As raízes de pré-molares extraídos de

cães foram divididas em grupos: grupo PDL(+), no qual o ligamento periodontal foi

preservado e grupo PDL(-), no qual o ligamento periodontal foi removido. Essas raízes foram

respectivamente transplantadas em defeitos ósseos criados cirurgicamente e cobertas com

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uma membrana biológica. Seis semanas após o transplante, os resultados mostraram o

fenótipo osteoblático em ambas as culturas de células ósseas e do ligamento. Um nova

inserção de tecido conjuntivo foi observada somente no grupo PDL(+), entretanto o osso

alveolar foi quase completamente regenerado em ambos os grupos PDL(+) e PDL(-) e a

quantidade de novo osso formado não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Os

autores concluíram que as células do ligamento periodontal de cães demonstravam a

capacidade de se diferenciarem em linhagem de células osteobláticas e contribuírem para a

regeneração periodontal.

Inanç, Elçin e Elçin (2007) investigaram o potencial de diferenciação de células-tronco

embrionárias (hESCs) quando co-cultivadas com fibroblastos do ligamento periodontal

(hPDLF). Após serem expandidas e caracterizadas morfologicamente e

imunohistoquimicamente, hESC foram co-cultivadas com hPDLF por 28 dias. Dois grupos

foram determinados: (i) grupo de indução osteogênica com ácido ascórbico, β-glicerofosfato e

dexametazona contendo as hESC num meio de diferenciação; e (ii) grupo de diferenciação

espontânea com as hESC também num meio de diferenciação. Mudanças morfológicas nas

células foram analisadas em um microscópio invertido, e a himunohistoquímica foi realizada

em espécimes fixados nos dias 1 e 28 usando anticorpos para fosfatase alcalina, osteonectina,

osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), e osteocalcina (OSC). A reação em cadeia da

polimerase transcriptase reversa foi utilizada para a detecção da ligação octamérica da

proteína 4, BSP, e o nível de expressão da OSC no mRNA. A mineralização foi observada

usando Alizarin Red, e as mudanças na superfície nas colônias foram demonstradas com

microscopia eletrônica de varredura. Os resultados indicaram a viabilidade da diferenciação

osteogênica das hESCs em co-cultura com hPDLF, e sugeriram o papel dos fibroblastos do

ligamento periodontal no modelo de diferenciação. Os autores concluíram que avanços neste

campo podem permitir a aplicação das hESCs na da engenharia tecidual periodontal,

envolvendo regeneração óssea em áreas de destruição decorrente da doença periodontal.

Ohta et al. (2008) criaram cavidades dentinárias nas raízes mesiais dos primeiros

molares de ratos, os quais formam sacrificados 1, 3, 5, 7 e 14 dias após a cirurgia. Em cada

um destes tempos de sacrifício, as secções foram marcadas histoquimicamente para CD44s,

CD34, c-KIT, OCNE, cbfa-1 e 5-bromo-deoxiuridina usando anticorpos primários. Para

análise morfométrica, os níveis de Cbfa-1 e PCNA células positivas foram calculados de um

número total de células positivas/ 104 µ2 nas cavidades. Os resultados obtidos mostraram que

células positivas para 5-bromo-2-deoxiuridina foram observadas no ligamento periodontal e

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tinham migrado para áreas de cicatrização. Um pequeno número de células positivas para

CD44s-, CD34- e c-KIT- foram observadas na medula óssea, mas nada foi observado no

ligamento periodontal. Células positivas para CD44s- foram observadas somente em cavidade

do osso alveolar no 5 dia após a cirurgia. Células positivas para CD23- e c-KIT- foram

observadas somente na cavidade dentinária no 7 dia após a cirurgia. Os valores de Cbfa-1 e

PCNA tenderam a mostrar um aumento no 7 dia após a cirurgia. Os autores puderam concluir

que células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas na medula óssea não estão

envolvidas na regeneração do periodonto. Células que migraram do ligamento periodontal

residual regeneraram novo osso alveolar num estágio mais cedo, e a regeneração ao redor da

dentina nas cavidades foi mais tardia que nas outras partes.

Seo et al. (2005) utilizaram o ligamento periodontal de humanos para testar a hipótese

que o ligamento periodontal criopreservado conteria células-tronco pós-natais recuperáveis.

Estas células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal preservadas pelo frio

mantiveram as características normais das células mesenquimais do ligamento periodontal,

incluindo a expressão do marcador de superfície celular STRO-1, a formação de colônias

celulares, o potencial de diferenciação, a formação de cemento e tecido de regeneração

semelhante ao ligamento periodontal, além de um cariótipo diplóide normal. Este estudo

demonstrou que as células-tronco pós-natal podem ser recuperadas a partir de células do

ligamento periodontal criopreservadas. Promovendo, desta forma, uma acessível prática

clínica para a utilização de tecidos congelados para isolamento de células-tronco e

regeneração tecidual.

Silvério et al.(2008) realizaram um estudo de revisão da literatura focando na

caracterização in vitro e in vivo das células mesenquimais derivadas de tecidos dentais, e seu

potencial para promover regeneração dos tecidos periodontais. Os primeiros resultados

enfatizaram a necessidade de investigações adicionais para determinar a eficácia da expansão

ex-vivo de células mesenquimais no reparo das estruturas dentais e tecidos periodontais.

Mesmo com as limitações de cada estudo, as células mesenquimais indiferenciadas do

ligamento periodontal mostraram uma habilidade de formarem estruturas semelhantes ao

cemento radicular e ligamento periodontal. Contudo, como estas células são heterogêneas

devido a sua capacidade de se proliferarem e se diferenciarem em células formadoras do

tecido periodontal, mais estudos são necessários para investigar a função destas células no

processo de regeneração. Além disto, células percursoras do folículo dental humano de

terceiros molares podem ser no futuro, geneticamente modificada in vitro então elas estarão

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hábeis para se diferenciarem em células do tecido periodontal antes de serem transplantadas in

vivo. Apesar de novos estudos serem necessários para colocar em prática estas terapias

alternativas, neste momento o melhor entendimento das células-tronco e seus possíveis papéis

na regeneração tecidual podem ajudar a desenvolver novas abordagens para um tratamento

mais previsível dos defeitos periodontais.

Trubiani et al. (2008) utilizaram células mesenquimais indiferenciadas do ligamento

periodontal de humanos que foram induzidas a osteogênese, semeadas em arcabouços tri-

dimensionais biocompatíveis (esponja de fibrina, substitutos de derivados ósseos) e

examinadas usando microscopia de luz e eletrônica de varredura e transmissão. Observações

morfológicas mostraram crescimento extensivo da biomassa celular cobrindo parcialmente os

arcabouços após 4 semanas de incubação no meio de mineralização. Estes resultados

indicaram que o ligamento periodontal pode ser facilmente e eficientemente uma fonte

autológa de células mesenquimais indiferenciadas com uma grande capacidade de expansão e

habilidade de se diferenciarem em células osteogênicas que podem colonizar e crescerem

conectadas ao arcabouço biocompatível.

Células-tronco adultas multipotentes têm sido isoladas de vários tecidos não neurais.

Techawattanawisal et al. (2007) relataram pela primeira vez o isolamento de células

mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal com características de

células-tronco neurais primitivas. Células mesenquimais multipotentes do ligamento

periodontal de ratos foram cultivadas utilizando sistema de cultura formadora de neurosferas.

As células foram dissociadas enzimaticamente e cultivadas em meio básico livre de soro

contendo EGFe β-FGF. Esferas livres expressando, GFAP e vimentina foram formadas em 7

dias de cultura. Em adição, as esferas expressaram RNAm de fatores de transcripção

associados à crista neural: Twist, Slug, Sox2 e Sox9. As esferas derivadas do ligamento

periodontal diferenciaram-se em miotubos multinucledos, células semelhantes a neurônios

NFM-positivas, células semelhantes a astrócitos e a oligodentrócito Análise da formação de

colônias de metilcelulose revelou que uma simples célula do ligamento periodontal poderia

formar uma esfera numa freqüência e aproximadamente 0,01 % do total de células. Estes

dados indicam que as esferas derivadas do ligamento periodontal contêm células-tronco

adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em ambas as linhagens neural e

mesodermal, o que sugere que o ligamento periodontal pode ser uma nova fonte de células-

tronco adultas multipotentes, e estas células possam ser usadas no tratamento de várias

doenças tais como doenças neuronais degenerativas e distrofia muscular.

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Zhou et al. (2008) investigaram a diferença dos marcadores de superfície celular em

diferentes células periodontais, tais como osteoblastos alveolares (AOs), fibroblastos do

ligamento peridontal (PDLFs) e fibroblastos gengivais (GFs), e seus potencias de

diferenciação em fenótipos osteogênicos e adipogênicos. Estas células periodontais foram

isoladas e a expressão padrão do antígeno de superfície foi analisada pela citometria fluida e

as caracterizações moleculares e hitológicas das induções osteogênicas e adipogênicas foram

monitoradas pela reação de cadeia da transcriptase reversa, Western blot e

imunocitohistologia. Os resultados mostraram que os fenótipos celulares dos AOs foram

verificados pela alta expressão de CD29 e CD49a, enquanto PDLFs mostraram

distintivamente baixos níveis de CD63 e CD73. Em indução adipogênica, limitados AOs

formaram células semelhantes a adipócitos de formato cúbico, enquanto PDLFs formaram

células semelhantes a adipócitos fusiformes. Todos os três tipos celulares expressaram genes

osteorelacionados a linha de base. Os AOs demonstraram maior habilidade osteogênica,

seguidos dos PDLFs e GFs. Através deste estudo, pôde-se concluir que células no osso

alveolar e ligamento periodontal possuem progenitoras osteogênicas e adipogênicas,

indicando a possibilidade de sua aplicação para regeneração dos tecidos periodontais.

Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento periodontal de cães

e investigaram se essas células eram capazes de formar uma nova inserção do ligamento

periodontal quando utilizadas sobre a superfície de implantes de titânio. Os implantes com as

células cultivadas do ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3

meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas superfícies do implante,

uma camada com tecido semelhante ao cemento com inserção de fibras colágenas tinha sido

alcançada.Estes resultados demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal

podem formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio,

o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia através do

processo de osseointegração.

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2.4 Osseointegração

O advento da osseointegração, fenômeno descrito por Brånemark no final dos anos 60,

refletiu em avanços notáveis na reabilitação de pacientes com perdas dentárias. Ao descrever

a possibilidade de integração entre um material metálico e o tecido ósseo, o pesquisador sueco

lançou as bases de uma das áreas mais estudadas pela comunidade odontológica. (NETO,

2005).

A reposição de elementos dentários por meio de uma raiz artificial que pode sustentar

uma prótese gerou uma expectativa positiva de impacto funcional e psicossocial aos

pacientes, uma vez que a reabilitação com implantes osseointegrados é capaz de melhorar a

capacidade mastigatória e a satisfação estética dos pacientes (ADELL et al, 1981; LOCKER,

1998).

Além das funções reabilitadoras, os implantes osseointegrados possuem a propriedade

de manter a função, forma e volume ósseo nas regiões onde estiverem instalados, pois

desempenham a função de estimular a produção de matriz óssea calcificada podendo muitas

vezes aumentar a densidade óssea na região onde foi inserido o implante. Os implantes atuam

na biologia óssea local como se fossem uma raiz dental, estimulando a remodelação óssea de

forma equilibrada (DAVIES, 2003)

Com a evolução da implantodontia, vários materiais têm sido testados com o objetivo

de aprimorar os resultados, sejam eles no que tangem a aceleração do processo de

osseointegração, estabilidade óssea, gengival e estética. Durante as últimas décadas, implantes

metálicos têm sido os mais freqüentemente utilizados, sendo que o titânio, em sua forma

comercial pura, se tornou o material de escolha para a fabricação de implantes em cirurgia

oral e craniofacial (HURÉ et al., 1996).

2.4.1 Titânio (Ti)

Dentre muitos materiais possíveis, o titânio (Ti) é atualmente considerado o material

de escolha para a confecção dos implantes intraósseos, pois esse metal possui características

físicas e químicas excepcionais que permitem a sua instalação nos tecidos vivos sem que haja

incompatibilidade entre eles. Propriedades físicas como seu coeficiente elástico, de

deformação e sua resistência à tração são diferentes do tecido ósseo, porém não influenciam

no sucesso deste tipo de tratamento. Sua grande resistência à fratura possibilita resistir aos

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esforços necessários para uma boa função mastigatória. Quimicamente o titânio é um metal

muito estável, embora haja uma pequena formação de óxidos em sua superfície, que facilita a

deposição e adesão da matriz extracelular na interface osso-implante. Estes óxidos se formam

durante o processo de corte, limpeza e esterilização do implante e ficam aderidos à superfície

não sendo liberados para o meio. As propriedades supracitadas permitem a cicatrização e a

manutenção da adesão das estruturas teciduais à superfície do titânio (HANSSON et al, 1983).

O comportamento osseointegrador do titânio pode também ser otimizado através da

compreensão das características da superfície sobre as respostas biológicas iniciais (adesão

celular, proliferação, diferenciação, produção de matriz extracelular, maturação e calcificação

óssea) (KASEMO, 2002). Diferentes superfícies têm diferentes propriedades de adsorção, e

estas diferenças estão intimamente relacionadas com aspectos de biocompatibilidade e

osseointegração (MEACHIM, WILLIAMS, 1993).

Vários trabalhos têm sido realizados com as mais diferentes abordagens a fim de

investigar detalhadamente todos os possíveis efeitos da superfície do titânio sobre o

comportamento das células.

Maeda et al. (2007) mostraram que a adesão e proliferação celular e a diferenciação

osteogênica de células-tronco mesenquimais de camundongos em disco de titânio foram

significativamente similares a aqueles na superfície plástica de cultura, elegendo o titânio

como um excelente material para o uso no reparo de tecido duro no campo da engenharia de

tecido ósseo.

2.4.2 Características superficiais e respostas celulares

Dentre as etapas pré-clinicas do desenvolvimento de uma nova superfície, os ensaios

com cultura de células proporcionam um ambiente semelhante ao fisiológico com as

vantagens de poder controlar fatores bioquímicos, determinar a citotoxicidade do material e a

expressão fenotípica do tipo celular investigado (DELIGIANNI et al., 2001).

A interação das células e um biomaterial, ou biocompatibilidade, depende das

propriedades de superfície do material, tais como a energia superficial (hidrofilicidade),

textura, rugosidade e composição química. Estas propriedades determinam como as moléculas

biológicas vão aderir à superfície e, mais particularmente, determinam a orientação das

moléculas aderidas. Elas também determinam o comportamento celular no contato. A

comparação do comportamento de diferentes tipos de células mostra que elas reagem

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diferentemente de acordo com a energia superficial (hidrofilicidade ou molhabilidade),

rugosidade e composição química das superfícies (KASEMO, 2002; STIEHLER et al., 2007;

BOYAN et al. 2002).

O termo “adesão” no biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase de adsorção, a

qual ocorre rapidamente e envolve pequenas ligações físico-químicas entre as células e o

material, tais como ligações iônicas, força de Van der Walls, etc., e a fase de adesão, que

ocorre lentamente envolvendo moléculas biológicas, tais como proteínas da matriz celular,

proteínas de membrana celular e proteínas do citoesqueleto, as quais interagem juntas para

induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcripção e

consequentemente regulando a expressão gênica. Esta fase é a mais importante, pois a

qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na capacidade para proliferação e

diferenciação das células (ANSLME, 2000).

Características hidrofóbicas e hidrofílicas de um material são de grande importância

para a adesão celular. A adesão celular é geralmente melhor em superfícies hidrofílicas.

Quando inserido no meio biológico, o material é condicionado pelos componentes do fluido

biológico. O pH, composição iônica, energia de ligação, temperatura, grupo funcional de

proteínas são fatores determinantes para adsorção protéica. A energia da superfície pode

influenciar a adsorção protéica e o arranjo estrutural das proteínas no material. O papel

principal das proteínas ósseas é atrair as células ósseas. Quando ocorrem mudanças

conformacionais destas devido a superfícies hidrofóbicas e/ou baixa energia superficial, sua

afinidade com o receptor da superfície celular das células ósseas é diminuída, atraindo

fibroblastos e formando tecido fibroso em torno do material (ANSELME, 2000).

A molhabilidade, avaliada pela medição do ângulo de contato de um líquido com a

superfície do material, sofre influência da rugosidade superficial do titânio, o que interfere na

resposta inicial do hospedeiro principalmente no que diz respeito à adsorção de proteínas

plasmáticas, as quais desempenham um processo importante na sinalização para a migração

de células indiferenciadas para a superfície do material (RUPP et al. 2004).

Atribui-se à rugosidade de superfície um papel importante no desempenho clínico do

biomaterial na osseointegração tornando, portanto, a caracterização de superfície do

biomaterial um aspecto necessário para a interpretação adequada do efeito da rugosidade para

a aposição óssea. A rugosidade da superfície do implante foi descrita como um dos fatores

que favorecem a interação do material com os componentes plasmáticos e celulares

responsáveis pela sinalização e iniciação da deposição de matriz extracelular por células

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ósseas e influenciam diretamente a cicatrização no sítio de colocação e posteriormente a

osseointegração (ALBREKTSON et al. 1981), propiciando a aplicação precoce de carga

mecânica sobre esses implantes, além de assegurar estabilidade a longo prazo, que é o

objetivo primordial de qualquer material para uso protético.

Alguns estudos encontrados na literatura têm comparado o efeito de várias superfícies

em estudos in vitro. Embora não se saiba qual a rugosidade ideal para um material para

implantação no tecido ósseo, há larga concordância de que a topografia é um poderoso

modulador do comportamento celular e, portanto, um fator de influência direta na

performance clínica do material.

Buser et al. (1991) e Frazolin et al. (2008), em estudos experimentais comparando

diferentes tipos de superfície, concluíram que os melhores resultados foram os das superfícies

texturizadas. Deligiannni et al. (2001), Anselme et al.(2002) e Keller (1998) observaram que

células da medula óssea e osteoblastos cultivados em diferentes superfícies de titânio, se

aderem e respondem melhor em superfícies com maior rugosidade. Os estudos de Perizzolo,

Lacifield e Brunette (2001), Sul et al. (2002) e Sena et al. (2003) também indicaram que a

proliferação de células osteobálsticas pode ser melhor em superfícies rugosas.

Entretanto, Lange et al. (2002), em seus experimentos com células osteoblásticas MG-

63, Huang et al. (2004) , com as U-2 OS, e Cochran et al. (1994) e Gay et al. (2007) com

células do ligamento periodontal, mostraram que a adesão e proliferação celular foi melhor

em superfícies de titânio lisas quando comparadas com as rugosas.

Anselme (2000), Faghihi et al. (2006), Guehennec et al. (2007) analisaram a adesão,

proliferação e diferenciação de células osteoblásticas da calvária de ratos (MC3T3-E1) e

células osteoblásticas humanas em superfícies de titânio Ti6A14V com variadas rugosidades,

e observaram que textura superficial do biomaterial influenciava na resposta celular e que a

rugosidade influencia na adesão e proliferação das células à superfície do titânio.

As alterações superficiais resultam em variações não apenas nos aspectos físicos do

material, mas também em sua composição química. Superfícies obtidas por diferentes tipos de

tratamento podem apresentar características topográficas semelhantes embora com

desempenho biológico distintos, sugerindo que há grande probabilidade de não apenas a

alteração topográfica como também a modificação na estrutura química da superfície, possam

ter efeito na resposta celular.

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Santiago et al. (2005) em seu experimento com células osteoblásticas de camundongo,

analisaram amostras de titânio comercialmente puro (Ti) com diferentes propriedades de

superfície por meio de ataques químico e físicos, e os resultados sugeriram que os tratamentos

utilizados foram favoráveis às respostas biológicas.

Wang et al (2008) mostraram que os métodos de tratamentos químicos de superfície

do titânio utilizados em seu estudo influenciavam positivamente na adesão, proliferação e

diferenciação das células-tronco mesenquimais da medula de coelhos.

A diferenciação dos efeitos químicos e topográficos da superfície não está clara.

Entretanto é unânime entre os pesquisadores que as propriedades físico-químicas das

superfícies dos implantes exercem um papel fundamental no sucesso do fenômeno biológico

da osseointegração. As interações moleculares e celulares que norteiam o destino biológico

dos implantes ocorrem nos estágios iniciais da cicatrização (AMARANTE, 2001).

Na busca por superfícies que melhorem as respostas biológicas e supram à necessidade

de obter uma rápida osseointegração, várias pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando

estas superfícies pelos processos mais variados (SILVA, 2005) que envolvem métodos

mecânicos, químicos, e físicos de tratamento de superfície, tais como: a aspersão com plasma

de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto de titânio,

condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, PAUL, CHUANXIAN, 2004).

2.4.3 Tratamento de superfície

Dentre os métodos de tratamento da superfície pode-se citar a nitretação iônica ou

nitretação a plasma, que apresenta excelentes propriedades mecânicas, estabilidade química e

biocompatibilidade quando aplicada ao titânio (PARK et al., 2003).

2.4.3.1 Nitretação iônica

A nitretação iônica (ion-nitriding) é um processo de tratamento termoquímico, usado

para endurecimento superficial de metais ferrosos e um crescente número de materiais não

ferrosos como ligas de titânio e alumínio (MICHEL et al.,1995), pela obtenção de uma

camada de nitretos, que eleva a resistência ao desgaste das superfícies tratadas (NICOLETO,

TUCCI, ESPOSITO, 1996).

Além dos fatores ambientais, várias são as vantagens desta técnica sobre as

convencionais. As mais importantes são: baixa temperatura de tratamento, melhor controle da

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espessura da camada, tempo de tratamento inferior, uniformidade na espessura da camada,

nitretação de partes da peça, mais economia (ALVES Jr, 1995).

Este processo, também conhecido como nitretação por plasma, consiste em ionizar um

gás ou mistura gasosa, contendo nitrogênio, através de uma descarga luminescente, gerada por

uma diferença de potencial entre a amostra (catodo) e o anodo, em uma atmosfera a baixa

pressão. Os íons produzidos no plasma são acelerados em direção a amostra (catodo),

chocando-se com ela e fornecendo energia suficiente para aquecê-la até a temperatura de

nitretação (O’BRIEN J.M.; GOODMAN D, 1991).

Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995).

O conceito básico no uso da nitretação iônica para melhorar as propriedades

superficiais de uma liga de titânio é fundamentado na possibilidade de formar nitretos ou

carbetos abaixo da superfície da liga. Os nitretos e carbetos de titânio são materiais duros que

melhoram as propriedades tribológicas da superfície, ou seja: aumentam a resistência ao

desgaste e a dureza superficial (YILBAS, 1996).

Pereira (2008) com o objetivo de melhorar as propriedades tribológicas da superfície

do titânio usado em implantes dentais, particularmente sua resistência ao desgaste,

investigaram o efeito da nitretaçäo em plasma sobre as referidas propriedades de amostras de

titânio. A análise dos dados obtidos indicou que a nitretaçäo em plasma aumenta a resistência

superficial do titânio.

Com modelo de linhagem celular (L929 fibroblastos de ratos), Abidzina et al. (2007)

observaram que a adesão celular à superfície do titânio é favorecida pelo tratamento de

superfície com irradiação iônica de baixa energia (plasma).

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Neto (2005) utilizou amostras de titânio nitretadas a plasma a fim de analisar suas

propriedades de superfícies e puderam concluir que as superfícies nitretadas apresentaram

melhores resultados no que se refere a molhabilidade e rugosidade que as amostras sem

tratamento, e que tanto a adesão como a proliferação de células (linhagem Osteo-1) nas placas

nitretadas foram superiores às placas sem tratamento.

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral:

• O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de experimentos in vitro

utilizando cultura celular, a capacidade de adesão das células mesenquimais

provenientes da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de

ratos quando postas em contato com diferentes superfícies de Titânio (polida e

tratada por plasma).

3.2 Objetivos específicos:

• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais da medula óssea de

camundongos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por nitretação

iônica (plasma).

• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais do ligamento

periodontal de ratos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por

nitretação iônica (plasma).

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4 METODOLOGIA

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte - UFRN (pareceres nº 022/07 e 102/08) e foi dividido em

duas etapas. Na primeira foi realizado o preparo das amostras através do tratamento de

superfície das placas de titânio no Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Na

segunda foi realizado um ensaio in vitro com células isoladas da medula óssea de

camundongos e do ligamento periodontal de ratos e cultivadas sobre as placas de titânio

tratadas e a superfície controle (plástico). Esta etapa foi realizada no laboratório de cultura de

células do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN.

4.1 Preparo das amostras

De acordo com a literatura, o número de amostras utilizadas não têm sido elucidado

em nenhum dos estudos analisados, presumindo-se que o número das amostras de titânio não

influencia nos resultados de adesão celular. Assim sendo, o número de amostras deste

experimento foi determinado aleatoriamente.

As amostras de titânio foram preparadas segundo o protocolo estabelecido no

Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Doze discos de titânio grau II ASTM F86 nas

dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, foram embutidas em resina

poliéster e lixados gradualmente com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400, 600, 1200 e

2000 água corrente e depois polidas (politriz AROTEC, modelo APL-2 e série 212560,

BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, sílica coloidal e água oxigenada (H2O2) 20Vol.

até um acabamento final de 0,04μm.

Em seguida, as amostras foram desembutidas e limpas em banho de ultrasom com

acetona por 10 minutos com objetivo de remover contaminantes que pudessem interferir no

processo de nitretação iônica. As amostras foram secadas em temperatura ambiente e

colocadas no sistema de nitretação a plasma.

4.1.1 Protocolo de Nitretação

Após o polimento e limpeza, seis amostras foram colocadas em uma câmara de aço

inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de comprimento, hermeticamente

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fechada para receber o tratamento de superfície. Foi utilizada a configuração no reator de

plasma para nitretação em gaiola catódica.

Internamente, a câmara possuia um eletrodo em forma de disco, sobre o qual foi

colocada a amostra. Inicialmente foi feito um vácuo no reator até uma pressão de 10-1 mbar e

então foi introduzido hidrogênio com um fluxo de 12sccm, como gás de arraste de impurezas,

até uma pressão de 1,6 mbar por 20 minutos. Após esta etapa, o N2 a 3sccm foi introduzido

até conseguir uma atmosfera de trabalho estável em torno de 680V, 0,5 miliampére (mA),

temperatura de 450ºC e pressão de nitretação de 2,5mbar. Nestas condições as amostras foram

nitretadas por 60minutos.

As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo um fluxo de gases de

15sccm (tabela 1).

Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.

Grupo

experimental

Atmosfera do

plasma

Tempo de

tratamento

Pressão do

plasma

Temperatura do

plasma

Fluxo do gás

total

Polidas - - - - -

Gaiola catódica N20%H80% 1h 2,5mbar 450°C/17.5mA 15sccm

Figura 2. Equipamento para nitretação iônica Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação

iônica em gaiola catódica (SOUSA, et al.2008).

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4.2 Caracterização das amostras

Depois de terminado o tratamento de superfície, as amostras foram seqüencialmente

submetidas a ensaio de caracterização superficial como segue:

4.2.1Composição de camada

A composição da camada superficial foi avaliada pela difração de raios-X.

4.2.2 Textura superficial

Uma amostra de cada grupo foi submetida à microscopia eletrônica de varredura

(MEV) para análise das características de textura superficial em ampliações de 25, 100 e 200

vezes.

4.2.3 Rugosidade

Para análise da rugosidade foi mensurado o parâmetro Ra, utilizando um rugosímetro

modelo SURTRONIC 3, (Taylor-Hobson Inc, USA) com cut-off igual a 0.25. As medidas

foram tomadas em três direções diferentes, em ângulos de aproximadamente 1200 com

dispersão nestas três direções inferior a 10%.

4.2.4 Molhabilidade

Após o tratamento a plasma, cinco amostras de cada grupo experimental foram

submetidas ao ensaio de molhabilidade. A técnica utilizada foi a determinação do ângulo de

contato estático ou técnica da gota séssil para cada uma das amostras e mensurada por dois

observadores. As amostras foram colocadas em uma superfície plana e utilizando uma

micropipeta digital de volume ajustável funcionando com uma solução fisiológica,

posicionada de forma perpendicular e muito próxima à superfície depositando 0,25mL da

solução sobre a superfície da amostra.

De forma a padronizar o teste e por serem gotas muito pequenas, foram feitos

acompanhamento da mudança do ângulo por 01 seg., 30 seg. e 60 seg.

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4.3 Esterelização das amostras

Em seguida, todas as amostras (nitretadas em gaiola catódica e polidas) foram

acondicionadas em placas de cultura de 24 poços de 2cm2 de área e esterilizadas por radiação

gama no DEN (Departamento de Energia Nuclear da UFPE – Universidade Federal de

Pernambuco). A dose total de radiação por amostra foi de 25 kGy, liberada a uma dose

média de 8,993 kGy/h (2h 46minutos a uma distância de 50mm), em irradiador

GAMMACELL 220 Excel (MDS Nordion, Ca).

4.4 Cultura de células

4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos

Foi realizada a extração da medula óssea de dois camundongos albinos machos Swiss,

com 2 meses de idade, com peso em média de 28,5 g, procedentes do Laboratório de

Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, seguindo-se o protocolo de

Maniatopoulos, Sodek e Melcher (1988). Os animais, depois de anestesiados, foram

dissecados sob condições assépticas para remoção dos fêmures e tíbias.

Os ossos recém-dissecados foram mantidos em um tubo cônico contendo PBS (pH

7.4), até que foi feita a remoção de toda porção de tecido muscular aderido aos ossos. Com

auxílio de uma tesoura de ponta reta foram feitos cortes nas epífises dos ossos (figura 4) e,

utilizando uma seringa de 1mL, a medula foi extraída através da inserção da agulha no canal

medular e posterior lavagem do canal utilizando meio de cultura básico α-MEM enriquecido

com 50 mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) e

suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) (figura5).

Figura 4. Corte das epífises ósseas. Figura 5. Extração da medula.

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4.4.2 Cultivo das células da medula óssea

A medula extraída foi cultivada em meio básico (α-MEM contendo antibióticos e

suplementado com 10% de FBS), por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37ºC.

Após esta etapa, o meio foi trocado - o que possibilitou a remoção das células não-aderidas da

cultura - e incubado novamente por três dias em meio básico. Depois dessas etapas as células

foram tripsinizadas em 0,25% de Tripsina contendo 1mM de EDTA (Gibco) e uma alíquota

de 0,1 mL foi retirada para se fazer a contagem das células na Câmara de Neubauer,

utilizando o método da exclusão de células coradas pelo Azul de Trypan.

4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos

Para obtenção do ligamento periodontal dois ratos albinos, machos, saudáveis, da

linhagem Wistar com quatro meses de idade, pesando em média 250 gramas (figura 6),

obtidos do biotério do Departamento de Farmacologia do Centro de Biociências da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foram sacrificados com dose letal do

anestésico (Ketamina) administrado por via intramuscular.

Seguindo-se o protocolo de Akizuki et al.(2005), em uma câmara de fluxo laminar e

sob condições assépticas os animais foram dissecados para remoção dos elementos dentários

(incisivos), os quais foram imediatamente mantidos em um meio básico α-MEM contendo 50

mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) (figura 7).

Figura 6. Rato Wistar. Figura 7. Incisivos no meio básico α-MEM.

O ligamento periodontal foi removido através da raspagem delicada da superfície

radicular com o uso de uma lâmina de bisturi (figuras 8 e 9) e encubado em uma solução de

tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA – Cultilab/Brasil) por 10

minutos. Em seguida, foi adicionado o meio α-MEM suplementado com 10% de soro fetal

bovino – FBS (Cultilab, Brasil) com o objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi

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centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos (figura 10) e sobrenadante retirado, as células

ressuspensas e cultivadas.

Figura 8. Remoção do PDL Figura 9. Fragmentos de PDL cultivados em tripsina

Figura 10. Suspensão centrifugada

4.4.4 Cultivo das células do ligamento periodontal

As células foram cultivadas em poços de placas de cultura contendo o meio básico α-

MEM suplementado com 10% de FBS (figura 11). As culturas foram mantidas a 37ºC em 5%

de CO2 até atingirem 70 – 90% de confluência, com troca de meio a cada 3 dias.

Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico α-MEM supletmentado com 10% de SFB.

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No subcultivo o meio básico foi removido e então adicionado aos poços 2 mL de

tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA – Cultilab/Brasil). A suspensão

celular foi então colocada em um tubo cônico com o mesmo volume de meio α-MEM

suplementado com 10% de FBS com o objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi

centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos (figura 12), sobrenadante retirado, as células

ressuspensas em 1 mL de meio α-MEM, e então uma alíquota dessa suspensão foi separada

para a contagem na Câmara de Neubauer, utilizando o método da exclusão de células coradas

pelo Azul de Trypan.

Figura 12. Suspensão centrifugada

4.4.5 Cultivo nos discos de Titânio

As células da medula óssea e do ligamento periodontal foram cultivadas em 2 placas

de 24 poços (TTP®), na densidade de 1 x 104 células por poço (figura 13). Foram utilizados

12 discos de titânio, 6 de cada grupo (polido e gaiola catódica). A mesma densidade celular

foi cultivada em seis poços sem disco, como controle positivo.

Figura 13. Placa de cultura com discos e células. Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de cultura de 24 poços.

Plástico

Titânio Polido

Titânio Gaiola

ADESÃO

Medula óssea Ligamento Periodontal

M1 M2 M3 L1 L2 L3

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4.5 Viabilidade e Adesão celular

O meio básico foi removido, realizada a lavagem com PBS. Em seguida foram

adicionados às placas 300µl de tripsina – (Cultilab/Brasil) por 10 min. A suspensão celular foi

então colocada em um microtubo cônico com o mesmo volume de meio α-MEM com o

objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos,

sobrenadante retirado, as células ressuspensas em 300µl de meio α-MEM, e então uma

alíquota dessa suspensão separada para a contagem celular foi somada ao mesmo volume de

Azul de Trypan e então realizada a contagem de células viáveis e não viáveis na câmara de

Neubauer. As células viáveis expulsam o corante do seu citoplasma e não são coradas, ao

contrário das células mortas na qual o corante permanece no interior da célula, sendo então

coradas de azul.

Para análise da adesão celular foram utilizados os dados obtidos das contagens de

células aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo gaiola catódica) e à superfície

de plástico (grupo controle), no período de 24 horas após o plaqueamento. O número de

células colhidas de cada poço foi obtido pela contagem de células viáveis através do uso de

hemocitômetro e o método da exclusão de células coradas pelo Azul de Trypan, obedecendo-

se a seguinte equação matemática: Número total de células contadas x diluição x 104/ Número

de quadrados do hemocitômetro usados para contagem.

4.6 Análise Estatística

Os dados foram submetidos a análise não paramétrica. Cada dado das contagens

corresponde à média ± dp (desvio padrão da média) de 6 amostras por grupo. As diferenças

entre os grupos foram comparadas pelos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Mann Whitney U.

A diferença estatística foi considerada quando p<0.05.

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5 RESULTADOS

5.1 Resultados da análise de superfície

Os resultados da análise de superfície (Apêndice) foram obtidos através de um

experimento em andamento no LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), no qual foram

utilizadas amostras e metodologias de tratamento idênticas às utilizadas no presente estudo.

5.2 Resultados da adesão celular

As médias de adesão foram maiores às superfícies controles, tanto para as células da

medula óssea de camundongos, como também para as células do ligamento periodontal de

ratos (figura 15). Entretanto, diferenças estatísticas só foram observadas quando cada grupo

celular foi analisado separadamente.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

M1 M2 M3 L1 L2 L3

mer

o d

e cé

lula

s (x

10^

4)

Figura 15. Médias e desvios padrões da adesão de células às diferentes superfícies.

5.2.1 Adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes

superfícies

A média de adesão entre as células da medula óssea de camundongos foi maior no

grupo controle (figura 16), mas a análise estatística da adesão deste tipo celular às três

superfícies não mostrou nenhuma diferença significativa (tabela 2). Contudo, quando os

grupos foram pareados entre si (tabelas 3, 4 e 5), pode-se observar diferença estatisticamente

significante apenas entre o grupo controle (M1) e o titânio polido (M2), conforme mostra a

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tabela 3. Podendo-se afirmar que a superfície de titânio tratado por plasma na configuração de

gaiola catódica (M3) apresentou bons resultados de adesão para este tipo celular, uma vez que

se mostrou similar ao grupo controle.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

M1 M2 M3

mer

o d

e cé

lula

s d

a m

edu

la (

x10^

4)

Figura 16. Médias e desvios padrões da adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies.

Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies.

p* Kruskal-Wallis

Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Polido.

p* Mann Whitney

Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Gaiola.

Superfície controle (M1) Ti Gaiola (M3)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células da Medula óssea 0.77 ± 0.25 0.61 ± 0.27 0.37

p* Mann Whitney

Controle (M1) Ti Polido (M2) Ti Gaiola (M3)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p

Células da Medula óssea

0.77 ± 0.25 0.34 ± 0.87 0.61 ± 0.27 0.16

Superfície controle (M1) Ti Polido (M2)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células da Medula óssea

0.77 ± 0.25 0.34 ± 0.87 0.04*

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Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola.

p* Mann Whitney

5.2.2 Adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes

superfícies

A comparação da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às três

superfícies distintas mostrou que também a média de adesão foi maior na superfície controle

(figura 17), mas não houve diferença estatística entre os três grupos (tabela 6). Entretanto,

quando as superfícies foram analisadas por pareamento (tabelas 7, 8 e 9), apenas pode-se

observar diferença estatisticamente significante entre os grupos L1 e L3 (tabela 8), o que leva

a inferir que a superfície polida mostrou-se semelhante à superfície controle, com bons

resultados de adesão para este tipo celular.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

L1 L2 L3

mer

o d

e cé

lula

s d

o

lig

amen

to p

erio

do

nta

l (x

10^

4)

Figura 17. Médias e desvios padrões da adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies.

Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies.

Ti Controle (L1) Ti Polido (L2) Ti Gaiola (L3)

Média ± Desvio padrão Média± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p

Células do Ligamento 0.62 ± 0.22 0.46± 0.14 0.33 ± 0.10 0.12

p* Kruskal-Wallis.

Ti Polido (M2) Ti Gaiola (M3)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células da Medula óssea 0.34 ± 0.08 0.61 ± 0.27 0.12

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Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Polido.

p* Mann Whitney

Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Gaiola.

Controle (L1) Ti Gaiola (L3)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células do ligamento periodontal

0.62 ± 0.22 0.33 ± 0.10 0.04*

p* Mann Whitney

Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola.

Ti Polido (L2) Ti Gaiola (L3)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células do ligamento periodontal

0.46 ± 0.14 0.33 ± 0.13 0.21

p* Mann Whitney

5.2.3 Adesão de células da medula de camundongos e do ligamento

periodontal de ratos à mesma superfície

Os gráficos (figuras 18, 19 e 20) ilustram a análise da adesão dos diferentes tipos

celulares sobre a mesma superfície. Entretanto não foram observadas diferenças estatísticas

significativas em nenhum dos grupos (tabelas 10, 11 e 12).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

M1 L1Nú

mer

o d

e cé

lula

s ad

erid

as (

x 10

^4)

Figura 18. Média e desvios padrões da adesão de células às superfícies controle.

Controle (L1) Ti Polido (L2)

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Células do ligamento periodontal 0.62 ± 0.22 0.46 ± 0.14 0.12

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00,10,20,30,40,50,60,7

M2 L2N

úm

ero

de

célu

las

ader

idas

(x

10^

4)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

M3 L3Nú

mer

o d

e cé

lula

s ad

erid

as

(x10

^4)

Figura 19. Média e desvios padrões Figura 20. Média e desvios padrões da adesão de células à superfície Ti Polido da adesão de células à superfície Ti Gaiola.

Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle.

Medula óssea Ligamento Periodontal

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Controle 0.77 ± 0.25 0.62 ± 0.22 0.21

p* Mann Whitney

Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido.

Medula óssea Ligamento Periodontal

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Ti Polido 0.34 ± 0.87 0.46 ± 0.14 0.12

p* Mann Whitney

Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola.

Medula óssea Ligamento Periodontal

Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*

Ti Gaiola 0.61 ± 0.27 0.33 ± 0.10 0.12

p* Mann Whitney

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6 DISCUSSÃO

Além do embrião, as células-tronco também são encontradas em vários órgãos e

tecidos do indivíduo adulto, onde participam da homeostase tecidual, gerando novas células

devido à renovação fisiológica e abrindo novas perspectivas para a regeneração e recuperação

de tecidos e órgãos, pois são entidades capazes de se auto-renovarem e se diferenciarem em

células de diversos tecidos. Tais populações celulares, ou células-tronco adultas, têm sido

facilmente identificadas pela sua morfologia e localização em alguns tecidos que são fontes

principais das células mesenquimais indiferenciadas, tais como a medula óssea. Já em outros

tecidos, como no ligamento periodontal, a presença destas células mesenquimais ainda vem

sendo recentemente identificada através de marcadores celulares (GRONTHOS, MANKANI,

BRAHIM, 2003; SEO et al., 2004; SEO et al 2005; CHEN et al., 2006; NAGATOMO et al.,

2006; GRONTHOS et al., 2006; KAWANABE, MURAKAMI, YAMAMOTO, 2006; LEON

et al., 2006; GAY, CHEN, MACDOUGALL, 2007; FUJII et al., 2008; COURA, 2008; LIN et

al., 2008; OHTA et al., 2008; ZHOU et al., 2008).

Na medula óssea as células-tronco mesenquimais constituem uma pequena população

celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se diferenciarem em

múltiplas linhagens em condições de cultura definidas (PITTENGER et al. 1999; ROSADA et

al., 2003; SHORT et al., 2003). São capazes de se aderirem e formarem colônias celulares

clonogênicas com aspecto fibroblastóide (CFU-F) in vitro. Cada colônia representa uma

linhagem de células derivadas da proliferação de uma única célula precursora. À microscopia

de luz ou em contraste de fase, apresentam-se como células fibroblastóides alongadas,

fusiformes e pontiagudas, com núcleo eucromático, oval, grande e central e citoplasma

abundante (GRONTHOS et al, 2006).

A identificação de marcadores de superfície celular que são específicos para células-

tronco mesenquimais é muito importante no processo de identificação das mesmas. O STRO-

1 é um anticorpo que tem sido utilizado para identificar o antígeno de superfície expressado

pelo estroma de células precursoras da medula óssea e apresenta positividade na detecção das

unidades formadores de colônia clonogênica, as quais morfologicamente se assemelham a

fibroblastos. Outros marcadores de superfícies, tais como CD146/MUC-18 e CD44, também

vêm sendo utilizados em combinação para a identificação das células com propriedades

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clonogênicas e potencial de se transformarem em múltiplas linhagens (IVANOVSKI et al.,

2006).

Através da utilização destes marcadores de superfície, células mesenquimais também

vêm sendo identificadas em tecidos orais, tais como polpa e ligamento periodontal

(GRONTHOS et al., 2000; GRONTHOS et al., 2002; SEO et al., 2004). Desta maneira, a

regeneração periodontal que busca reconstituir os tecidos destruídos ou lesados pelo avanço

da doença tem ganhado novas perspectivas através da identificação destas células sua

aplicabilidade na bioengenharia ou engenharia tecidual.

As células-tronco mesenquimais apresentam uma série de características que as

tornam a fonte celular ideal para o uso na engenharia de tecidos: 1) o uso das CTM não

oferece complicações éticas e legais; 2) elas são facilmente acessíveis; 3) possuem extensiva

capacidade de expansão, auto-renovação e diferenciação em tecidos mesenquimais; e 5) as

CTM são pouco imunogênicas ou tumorogênicas (SONG et al., 2004).

O conceito básico de biengenharia baseada em células-tronco consiste no isolamento e

expansão celular, seguido pelo procedimento de reimplantação combinado com um arcabouço

material. As células mesenquimais têm sido utilizadas através de experimentos in vitro nos

estudos de bioengenharia como meta de entender os eventos biológicos que ocorrem na

interação entre as células e as superfícies dos biomateriais empregados em cirurgias

maxilofaciais, implantodontia e regeneração óssea (SHANTI et al., 2007).

Uma grande variedade de biomateriais tem sido testada, visando um melhor

aproveitamento do potencial osteogênico das CTM para a engenharia de tecido ósseo, dentre

os quais, o titânio (Ti) é o mais utilizado, devido às suas propriedades mecânicas, estabilidade

química e biocompatibilidade (AMARANTE, LIMA, 2001).

A biocompatibilidade de um material está relacionada não só à sua composição

química, mas também ao tipo de superfície utilizada, o e que reflete no comportamento das

células quando em contato com a superfície. A adesão celular é provavelmente o aspecto mais

importante desta interação célula/superfície, pois é pré-requisito para as outras etapas, tais

como proliferação e diferenciação (ANSELME, 2000).

A partir da extração e cultivo da medula óssea de camundongos é possível obter uma

população de células aderidas, com aspecto fibroblastóide, denominadas de células

mesenquimais estromais multipotentes (HOROWITZ et al., 2005). Estas células também

podem ser obtidas a partir de outros tecidos. Alguns estudos foram publicados com células-

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tronco oriundas de ligamento periodontal humano (SEO et al., 2005; CHEN et al., 2006;

NAGATOMO et al, 2006; LEON et al., 2006; KAWANABE, MURAKAMI, YAMAMOTO,

2006; GAY, CHEN, MACDOUGALL, 2007; INANÇ, ELÇIN, ELÇIN, 2007; COURA,

2008; LIN et al., 2008; TRUBIANI et al., 2008; ZHOU et al., 2008) e implantados em

animais submetidos à imunossupressão para avaliar a capacidade de diferenciação destas

células (SEO et al., 2004; FUJII et al., 2008). Outros estudos em modelos experimentais com

animais, principalmente ratos (TECHAWATTANAWISAL et al., 2007; OHTA, 2008),

também foram utilizados para o isolamento de células do ligamento periodontal.

No presente experimento foi analisada, sob condições de cultivo celular, a capacidade

de adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e células mesenquimais

do ligamento periodontal de ratos à diferentes superfícies de titânio (Ti). A superfície plástica

ou placa de cultura celular de polistireno foi usada como controle positivo, pois é superfície

padrão no cultivo de células por apresentar excelentes características hidrofílicas (MAEDA et

al., 2007).

As características de superfície do material apresentam um papel importante na adesão

celular, pois estas dão condições de adesão das proteínas adsorverem e ajudarem no processo

de adesão celular. Dentre quais, as mais importantes são a composição química da superfície,

rugosidade e molhabilidade (ANSELME, 2000). Contudo, atualmente existem várias técnicas

de tratamento de superfície dos metais que buscam otimizar estas características, tais como a

aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto

de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, 2004).

Neste estudo, foi utilizada a técnica de nitretação iônica ou nitretação a plasma, pois a

camada de nitreto formada sobre a superfície do titânio contribui positivamente para as

propriedades tribológicas da superfície, ou seja: aumentam a rugosidade, a molhabilidade, a

resistência ao desgaste e a dureza superficial (YILBAS, 1996; NICOLETO, TUCCI,

ESPOSITO, 1996). Os resultados da caracterização superficial das amostras utilizadas

mostraram que as superfícies nitretadas a plasma apresentaram maiores médias de rugosidade

e melhor molhabilidade que as superfícies polidas (Anexo I), assim como mostrado na

literatura (YILBAS, 1996; PEREIRA, 2008).

A observação do comportamento celular é muito importante para esclarecer a

interação célula/ material. O comportamento celular, incluindo a adesão é geralmente

observado pelo microscópio óptico. Entretanto, observar as culturas celulares sobre o titânio é

difícil pelo microscópio óptico uma vez que o titânio é opaco. Portanto, o método utilizado

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neste estudo para análise da adesão celular foi o uso de hemocitômetro para contagem de

células viáveis. Para tal, as células foram submetidas à tripsinização a fim de romper as

ligações e então as células soltas fossem obtidas através de uma alíquota da suspensão

separada para contagem celular.

Os melhores resultados de adesão celular foram à superfície controle (plástica) tanto

para as células da medula óssea de camundongos (M1) com para as células do ligamento

periodontal de ratos (L1), mas nenhuma diferença estatística significante foi obtida quando

comparadas aos grupos experimentais (M2, M3, L2 e L3). Apesar de mais experimentos

serem necessários para esclarecer o mecanismo de adesão celular sobe o titânio, os resultados

sugerem que as características de superfície do titânio são similares às da superfície plástica, o

que resulta na boa capacidade de adesão celular, como visto no estudo de Maeda et al.(2007).

No que diz respeito à influência destas características superficiais do titânio sobre à

adesão celular, pode-se observar que a superfície polida (M2) obteve diferença

estatisticamente significante (p=0,04) na adesão de células da medula óssea de camundongos

quando comparada com o grupo controle (M1). Este resultado reforça o argumento de que o

tratamento de nitretação iônica dado à superfície (M3) contribui para melhor adesão deste tipo

celular, corroborando com alguns trabalhos na literatura no que se refere à rugosidade e à

molhabilidade, tais como Frazolin et al. (2008), cultivando células-tronco hematopoiética

humana periférica sobre implantes de titânio (Ti); Anselme et al. (2002) utilizando células de

linhagem osteoblástica da calvária de ratos (MC3T3-E1); Deligiannni et al. (2001) com

células da medula óssea humana; Sena et al. (2003) e Sul et al. (2002) através da cultura de

células osteoblásticas. Todos estes experimentos demostraram que as superfícies de titânio

rugosas apresentavam maior adesão e proliferação celular. Adicionalmente outros estudos

como o de Perizzolo, Lacifield e Brunette (2001) também mostraram que a topografia da

superfície influenciou no comportamento de células osteoblásticas de ratos.

No presente trabalho, entretanto, quando a superfície tratada (M3) foi comparada à

superfície controle (M1) não houve diferença estatística entre os grupos (p=0.37), o que

permite afirmar que a superfície tratada (M3) apresenta boas características para adesão deste

tipo celular, mas que o tratamento de superfície não influenciou na adesão, diferente dos

estudos de Abidzina et al. (2007) com células do tecido conjuntivo de ratos semelhantes à

fibroblastos (L929) e Neto (2005) com linhagem celular Osteo-1, os quais observaram uma

melhor adesão e proliferação sobre as superfícies de titânio tratadas a plasma.

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Quando comparou-se a superfície tratada a plasma (M3) com a superfície polida (M2),

também nenhuma diferença estatística significante foi observada (p=<0.12). Os dados

sugerem que o método de nitretação a plasma não têm efeito no comportamento celular, no

que se refere à capacidade de adesão in vitro de células da medula óssea de camundongos à

superfície de titânio polido.

As células mesenquimais do ligamento periodontal de ratos exibiram respostas

diferentes daquelas observadas nas células da medula óssea de camundongos. Apesar da

adesão celular também ter sido melhor à superfície controle quando analisadas as três

superfícies, os resultados mostraram que diferença estatística só foi encontrada entre as

superfícies controle (L1) e tratada por plasma (L3) (p=0.04), o que poderia sugerir que a

superfície polida (L2) teve melhores resultados de adesão das células do ligamento

periodontal, como visto na literatura nos estudos de Lange et al. (2002) com células

osteobláticas MG-63, Huang et al. (2004) com células osteoblásticas U2-OS e Cochran et al.

(1994) e Gay et al. (2007) com células do ligamento periodontal, os quais observaram que o

comportamento celular teve melhores respostas sobre as superfícies polidas.

Quando a superfície polida (L2) foi comparada à superfície nitretada (L3), nenhuma

diferença estatística foi observada (p=0.021), podendo-se afirmar que o tratamento de

superfície do titânio utilizado neste estudo não teve influência sobre a adesão de células do

ligamento periodontal de ratos in vitro.

Ao comparar a adesão dos dois tipos celulares (medula óssea de camundongos e

ligamento periodontal de ratos) sobre as mesmas superfícies (plástico, titânio polido e titânio

tratado), nenhuma diferença estatística foi encontrada, o que mostra a semelhança no

comportamento entre os tipos de células analisados in vitro.

De uma forma geral, as CTM podem ser expandidas in vitro, seja numa placa de

cultura ou em algum arcabouço, ou podem ser injetadas diretamente no local da lesão. O

crescente número de trabalhos na área da engenharia de tecidos mostra que a associação de

CTM com biomateriais osteoindutores parece ser uma técnica promissora no reparo do tecido

ósseo, porém ainda é muito cedo para se eleger o biomaterial mais indicado para esse tipo de

aplicação e a forma de tratamento dada a esse material (CANCEDDA, BIANCHI,

DERUBEIS, 2003).

De acordo com a literatura, o ligamento periodontal pode ser uma fonte autógena fácil

e eficiente de células mesenquimais indiferenciadas, com capacidade de expansão e

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habilidade de se diferenciarem em células fibroblásticas, cementoblásticas e osteoblásticas. A

plausividade da engenharia tecidual baseada na utilização de células-tronco na regeneração

periodontal é suportada por estudos em animais mostrando que as células do ligamento

periodontal cultivadas in vitro podem ser reimplantadas com sucesso em defeitos periodontais

promovendo a regeneração periodontal (ISAKA et al., 2001; HASEGAWA et al., 2005,

IVANOVSKI et al., 2006; AKIZUKI et al., 2006).

Contudo, poucos estudos, dentre os quais Cochran et al. (1994) e Gay et al. (2007),

têm avaliado a capacidade de adesão de células do ligamento periodontal sobre as superfícies

de biomateriais, tais como o titânio, bastante usado em implantodontia. Este contexto reflete a

importância do presente trabalho, onde através do qual foi observado que estas células do

ligamento periodontal também são capazes de se aderirem ao biomaterial, o que traz novas

perspectivas na terapia de regeneração periodontal e na bioengenharia em periodontia e

implantodontia.

Novas pesquisas são necessárias, pois apesar de bastante evidente o papel crucial que

as células do ligamento desempenham na formação e no reparo do periodonto in vivo, o exato

mecanismo pelo o qual as células-tronco mesenquimais agem ainda permaneça obscuro.

Estudos posteriores avaliando a capacidade de proliferação e diferenciação destes tipos

celulares em contato com o biomaterial poderão contribuir para a compreensão do processo de

osseointegração, ou mesmo estudos moleculares para avaliar os tipos de ligações envolvidos

na adesão, poderão ser importantes para esclarecer o mecanismo pelo qual cada tipo celular se

adere à diferentes superfícies.

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7 CONCLUSÕES

• Os resultados mostraram que a adesão de células mesenquimais de camundongos e do

ligamento periodontal de ratos em discos de titânio foram similares àqueles na

superfície plástica de cultura, podendo-se concluir que o titânio apresenta-se como um

bom material para o uso no reparo e regeneração na engenharia de tecidual.

• O tratamento com nitretação iônica por configuração de gaiola catódica foi efetivo

para a adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos. Contudo,

esta forma de tratamento de superfície não apresentou benefício à adesão das células

do ligamento periodontal de ratos ao titânio.

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APÊNDICE

Resultados da análise de superfície

Composição de camada

A composição da camada superficial avaliada pela difração de raios-x revelou a incorporação

de nitreto de titânio no grupo gaiola e a fase formada foi preferencialmente de TiN.

Textura superficial

Uma amostra de cada grupo foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

com a finalidade de observar a textura da superfície após o tratamento. Os dois grupos

apresentaram texturas de superfície distintas, embora o tratamento por gaiola catódica tenha

criado micro-granulações uniformemente distribuídas pelo disco.

Rugosidade

As medidas de rugosidade foram obtidas por profilômetro de contato. Os valores estão

demonstrados na tabela (x). As medidas de rugosidade foram feitas considerando-se quatro

direções diferentes da amostra variando-se os ângulos de medida em 45º em uma mesma

imagem. Os valores de rugosidade representam a média das quatro medidas.

Tabela 13 -Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro

Tratamento amostra Ra

polido 1 0.04

polido 1 0.04

polido 1 0.04

polido 1 0.04

polido 1 0.04

polido 1 0.04

gaiola 3 0.04

gaiola 3 0.11

gaiola 3 0.09

gaiola 3 0.07

gaiola 3 0.13

gaiola 3 0.08

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Molhabilidade

Tabela 14 – Valores da média e desvio padrão de molhabilidade

1 Hora 1 Dia

Liso 13.93

0.594

53.045

1.8

Gaiola 9.85

0.335

28.058

1.549