Emílio López Couto

Estudo da Catepsina B e da Heparanase em Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço

MOGI DAS CRUZES 2006

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES EMÍLIO LÓPEZ COUTO

ESTUDO DA CATEPSINA B E DA HEPARANASE EM CARCINOMA ESPINOCELULAR DE CABEÇA E PESCOÇO

Dissertação Apresentada à Universidade de

Mogi das Cruzes para a Obtenção de Título de

Mestre em Biotecnologia

Prof Orientador: Dr. Ivarne Luis dos Santos Tersariol Profa a Co-Orientadora: Dr Maria Aparecida da Silva Pinhal

MOGI DAS CRUZES, SP 2006

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Dedicatória

Terminando uma nova fase da vida acadêmica, vislumbramos novos desafios, e

relembramos o caminho percorrido. O prazer que advém do estudo gera a ansiedade de mais

querer saber, e humildemente nos restringimos à nossa incapacidade de tudo aprender.

Foram tantas as pessoas que participaram da minha formação, familiares, professores,

amigos...Com certeza se fosse descrever o nome de todos, cometeria o erro imperdoável de

esquecer alguém. Meus pais que me deram as primeiras lições, minha tia Martha e família,

com eles, pela primeira vez, falei corretamente frases longas (já tinha cinco anos), minha

primeira professora, primeira escola, primeiras provas, trabalhos.

Fiquei cerca de seis anos afastado dos bancos escolares, resolvi ganhar a vida, mas

sempre sentia falta das discussões e das descobertas. Sentia que faltava algo, exercitar a

mente... Difícil foi a volta, mas com encontro do meu orientador, pesquisador de invejável

conhecimento, sempre entusiasmado, nos estimulando a procurar o saber, foi mais fácil.

Dedico a cada um deles a participação neste trabalho, e os convido a continuar na

minha jornada

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Agradecimentos

Aos meus pais, meus primeiros mestres, sempre me estimularam ao estudo e à leitura, e com

seus exemplos de esforço, dedicação e superação das dificuldades, ainda são o norte em

minha vida.

À minha esposa, Elizabete Nunes Giarola, quanta paciência precisou ter para me ajudar nos

momentos de estresse. E nas discussões sobre o trabalho e a pesquisa, sem ela com certeza

seria muito mais difícil a realização do projeto.

Ao meu orientador Prof Dr Ivarne Luis dos Santos Tersariol, grande pesquisador, mesmo

quando os resultados não eram o esperado consegue retirar conhecimento e vislumbrar uma

nova linha de pesquisa. Nunca desiste.

À minha co – orientadora Profa a Dr Maria Aparecida da Silva Pinhal, abriu seu laboratório

e nos forneceu um inestimável auxílio em recursos humanos para a realização de nossos

estudos imunoistoquímicos.

Ao colega de mestrado Luís Gabriel Nunes, e à colega Thais Peretti inestimável ajuda na

realização dos ensaios de atividade enzimática e de imunoistoquímica

Aos amigos e cirurgiões que me auxiliaram nos procedimentos e coleta de material César

Augusto Simões, Francisco Amorim, Sérgio Uchoa, Marcos Loretto, e mais recentemente

Samara Novak

a aÀ Prof Dr Cláudia Bincoletto Trindade e à Profa a Dr Regina L. B. C. Oliveira que

participaram da banca de qualificação, pelas observações e orientações.

Ao meu irmão Arthur López Couto, pudera eu escrever com a clareza e precisão que ele

tem.

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Ao meu primo Lincoln Gonçalves Couto, desde a adolescência um grande parceiro em

discussões científicas e no xadrez.

A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram da elaboração e realização deste

projeto

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“O caminho da vida, o mais agradável e o mais inofensivo, passa pelas avenidas da ciência e

do saber; e quem quer que possa remover quaisquer obstáculos desta via ou abrir uma nova

perspectiva, deve ser considerado um benfeitor da humanidade. Embora estas pesquisas

possam parecer árduas e fatigantes, ocorre aqui como com certos espíritos e corpos que, por

estarem dotados de grande vitalidade, necessitam de exercícios severos e colhem prazer

daquilo que, para a maioria dos homens, parece penoso e laborioso. A obscuridade é, de fato

penosa tanto para o espírito como para os olhos, todavia, trazer luz da obscuridade, por mais

trabalhoso que seja, deve ser agradável e regozijado.”

(David Hume)

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Resumo Metástase e invasão tumoral das células malignas envolvem interação célula a célula e célula-matriz, as quais são reguladas pela expressão e localização de proteinases e glicosidases nas células tumorais. O objetivo deste estudo é elucidar relações entre a expressão de Heparanase e a Catepsina B (Cat B) nos carcinomas espinocelulares primários de cabeça e pescoço. As amostras de tecidos foram tiradas da cavidade oral, orofaringe, laringe e hipofaringe de pacientes com carcinoma espinocelulares de cabeça e pescoço. A expressão imunoistoquímica da heparanase e da cat B foram analisadas em 20 amostras de carcinoma espinocelulares. O método de coloração padrão de imunoperoxidase avidina-biotina foi realizado nas lâminas de tecidos fixadas em parafina de 4 µm com anticorpos murinos de anti-heparanase e anticorpos monoclonais anti-catepsina. Também foram realizadas dosagens da atividade enzimática da catepsina B com adição do substrato fluorogênico Z-F-R-MCA em fragmentos de tecidos coletados a fresco. Níveis elevados de catepsina B apresentaram uma significativa correlação com o estadiamento avançado dos tumores (p<0,05), os níveis de catepsina B aumentam com o avançar do estadiamento tumoral, 3,4 ± 0,5 UAF/min/μg em lesões benignas, 15 ± 2 UAF/min/μg para tumores T1-3 e 25 ± 5 UAF/min/μg nos T4. Foi estatisticamente significativa a associação da expressão de catepsina B nos tumores primários de orofaringe e o comprometimento linfonodal (p<0,05), os níveis de catepsina B na presença de metástase (26 ± 5 UAF/min/μg) foram maiores do que na ausência de metástase (15 ± 2 UAF/min/μg). Também os níveis elevados de catepsina B observados em cânceres de laringe invasivos estavam fortemente associados a fenotipos mais agressivos tumorais. Entretanto, não observamos correlação da catepsina B, nos tumores de laringe, com o comprometimento linfonodal. Aumento da expressão da catepsina B correlaciona-se significativamente com a presença de metástase, invasão local tumoral, piores graus histológicos de malignidade e altas taxas de proliferação celular. Esses achados indicam uma forte relação causa/efeito entre a expressão da catepsina B em carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço e sua invasibilidade local e metastatização. Diferentemente da catepsina B, a heparanase, em tecidos normais (não displásicos), como em adenomas de baixa displasia , apresentou uma reatividade grande com o anticorpo anti-heparanase e até maior em focos de moderada displasia. Contudo, interessantemente, essa reatividade com o anticorpo anti-heparanase foi marcadamente reduzida em displasias intensas e em carcinomas espinocelulares. Esses resultados indicam que a heparanase é um bom marcador da diferenciação celular. Esses resultados, em conjunto, indicam que a transformação epitélio-mesênquimal de desdiferenciação do carcinoma espinocelular aumenta a expressão da catepsina B e diminui a expressão da heparanase. Palavras-chaves: Catepsina B, heparanase, carcinoma espinocelular, cabeça e pescoço

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Abstract Metastasis and local invasion of malignant tumor cells involve cell-cell and cell-matrix interactions, which is regulated by the expression and localization of proteinases and glycosidases secreted by tumoral cells. The aim of this study was to clarify the relationship between the expression of heparanase and Cathepsin B (CathB) at the main tumor mass of head and neck squamous cell carcinoma. The tissues samples were taken from oral cavity, oropharynxes, larynxes and hypopharynxes of patients with squamous cell carcinoma. The immunohistochemical expressions of heparanase and CathB were studied in 20 specimens of squamous cell carcinoma. A standard avidin-biotin immunoperoxidase staining method was performed on 4-micrometer paraffin-embedded tissue sections with a mouse anti-human heparanase and cathepsin B monoclonal antibody. Also, we determined the enzymatic activity of cathepsin B with the aid of fluorogenic substrate Z-F-R-MCA in biopsies of fresh tumor tissues. Increased level of cathepsin B in oral carcinomas was significantly associated with advanced tumor stage (p < 0.05), the amount of cathepsin B increases with advanced tumor stage, 3.4 ± 0.5 AFU/min/μg for benign lesions, 15 ± 2 AFU/min/μg for T1-3 stage and 25 ± 5 AFU/min/μg for T4 stage. A statistically significant association was found between the expressions of cathepsin B in the primary tumor of oropharynxes cavity and lymph node involvement (p<0.05), the amount of cathepsin B in the presence of metastasis (26 ± 5 AFU/min/μg) was higher than without metastasis (15 ± 2 AFU/min/μg). Also, the high levels of cathepsin B observed in larynx cancer were strongly associated with more aggressive tumor phenotype. However, cathepsin B in larynx tumors was not associated with lymph node involvement. Increased expression of cathepsin B correlated significantly with the presence of metastasis, local tumoral invasion, poor histologic malignancy grade and high proliferation rate. These findings indicate that there is a strong cause/effect relationship between the expression levels of cathepsin B in squamous cell head and neck cancers and their local invasive and metastatic growth patterns. Different from cathepsin B, heparanase in normal epithelium (nondysplastic), as well as areas of mild dysplasia in adenomas, exhibited a strong reactivity with antibody anti-heparanase that became even stronger in foci of moderate dysplasia. Interestingly, the reactivity with antibody anti-heparanase was markedly reduced in severe dysplasia and in squamous cell carcinoma. These results indicate that heparanase is a good marker of squamous cell differentiation. Taken together, these results show that the epithelial to mesenchymal transformation process in squamous cells carcinoma increases cathepsin B expression and decreases heparanase expression. Key words: cathepsin B, heparanase, squamous cell carcinoma

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Lista de Tabelas

Tabela 1 Catepsina B em Tumores Humanos............................................ ..............................17

Tabela 2 Localização Celular Alterada da Catepsina B em Tumores..... ..............................21

Tabela 3 Estadiamento conforme AJCC e UICC, 2002............................ ..............................32

Tabela 4 Patologia, Estadio, Sexo e Idade dos Pacientes.......................... ..............................69

Tabela 5 Atividade da Catepsina B, Estadiamento e Patologia................ ..............................70

Tabela 6 Atividade da Catepsina B nas Lesões Benignas e nos

diferentes Estadiamentos dos Cânceres...................................... ..............................71

Tabela 7 Expressão Enzimática da Catepsina B e a Classificação do

Tumor...........................................................................................................................74

Tabela 8 Expressão Enzimática da Catepsina B nas Diferentes Regiões

Anatômicas.................................................................................... ..............................75

Tabela 9 Expressão Quantitativa de Heparanase, Estadiamento e

Patologia dos Pacientes................................................................. ..............................76

Tabela 10 Classificação quantitativa da Heparanase por Índice de

Positividade.................................................................................... ..............................77

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Representação Esquemática da Estrutura

Tridimensional da Catepsina B...................................... ..................................15

Estadiamento Linfonodal..........................................................Figura 2 .................................28

Estadiamento de Tumores de Laringe.....................................Figura 3 .................................29

Estadiamento dos Tumores de Cavidade Oral....................... Figura 4 .................................30

Figura 5 Atividade da Catepsina B em Função da Idade dos

Pacientes..................................................................................... .................................31

Figura 6 Atividade Enzimática da Catepsina B em Carcinomas

Espinocelulares e Hiperplasias Benignas................................................................39

Figura 7 Representação Gráfica dos Valores Médios da Atividade

da Catepsina B...............................................................................................40

Figura 8 Detecção de Catepsina B por Reações de Imunoistoquímica

em Carcinomas Espinocelulares e Hiperplasias

Benignas..................................................................................... .................................41

Atividade da Catepsina B e Classificação do Tumor.............Figura 9 .................................43

Atividade de Catepsina B em Tumores Espinocelulares....... Figura 10 .................................44

Figura 11 Quantidade de Catepsina B em Relação ao Estadiamento

dos Tumores de Laringe........................................................... .................................45

Atividade de Catepsina B em Tumores de Laringe............... Figura 12 .................................46

Figura 13 Atividade de Catepsina B em Tumores da Cavidade

Orofaríngea................................................................................ ..................................47

Figura 14 Reações de Imunoistoquímica de Heparanase em

Carcinomas Espinocelulares.................................................... .................................48

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Lista de Abreviaturas e Siglas

AJCC American Joint Comittee on Cancer

AMP Adenosina Monofosfato

AMPc AMP cíclico

Arg Arginina

Asp Ácido aspártico

ATP Adenosina Trifosfato

Cat B Catepsina B

Cys Cisteína

DNA Ácido Desoxirribonucléico

cDNA DNA complementar

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

Glu Glutamina

HEMC Hospital Estadual Mário Covas – Santo André – SP

His Histidina

HPV Papiloma Vírus Humano

INCA Instituto Nacional do Cancer

IP Índice de positividade

MS Ministério da Saúde

PBS Tampão Fosfato de Sódio

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

TNF Fator de Necrose Tumoral

TNM Sistema de Estadiamento do Câncer sendo, T: tumor;

N: linfonodos regionais comprometidos; M: metástase

à distância

TSH Hormônio Estimulante da Tireóide

UAF Unidade de Atividade Formadora

UICC União Internacional Contra o Câncer

UMC Universidade de Mogi das Cruzes

Z-F-R-MCA Carbobenzoxil-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-

metilcoumarina

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12-S-HETE Ácido 12-S-hidroxitetraeônico

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO: ESTADO DA ARTE...............................................................................................14

1.1 CatepsinaB.........................................................................................................................14

1.1.1 Estrutura, Função e Localização celular da catepsina B............... ............................14

1.1.2 Participação de Catepsina B na Metástase Tumoral...................................................16

1.1.3 Controle da Expressão Gênica e da Secreção de Catepsina B.................... ............................19

1.1.4 Papel da Catepsina B e dos Lisossomos na Apoptose de Células

Tumorais....................................................................................................... ............................22

1.2 Heparanase em Células Tumorais e Metástases............................................. ............................24

1.3 Câncer de Cabeça e Pescoço...........................................................................................25

2 MATERIAIS......................................................................................................................................31

2.1 Obtenção do tecido tumoral.............................................................................. ............................31

2.2 Detecção das Enzimas em Cortes Histológicos................................................ ............................33

2.3 Obtenção do Extrato Bruto Tecidual............................................................... ............................33

2.4 Dosagem da Atividade Enzimática da Catepsina B nos Tecidos................. ............................34

2.5 Quantificação e Interpretação de Heparanase nas Reações de

Imunoistoquímica.................................................................................................... ............................34

2.6 Análise Estatística da Atividade Enzimática................................................... ............................35

3 Resultados.............................................................................................................. ............................36

3.1 Atividade da Catepsina B.................................................................................. ............................36

3.2 Classificação TNM e Região Anatômica.......................................................... ............................42

3.3 Atividade da Heparanase.................................................................................. ............................48

4 Discussão.............................................................................................................. ............................49

5 Conclusões e Sugestões........................................................................................ ............................54

REFERÊNCIAS....................................................................................................... ............................55

Anexo – Comitê de Ética........................................................................................ ............................64 Apêndices.................................................................................................................. ............................66

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1 INTRODUÇÃO: ESTADO DA ARTE

1.1 CATEPSINA B

1.1.1 ESTRUTURA, FUNÇÃO E LOCALIZAÇÃO CELULAR DA CATEPSINA B

A catepsina B é uma cisteíno-proteinase lisossomal que possui tanto atividade

endopeptidásica quanto atividade carboxidipeptidil-peptidásica, este fato a distingue das

demais enzimas da família da papaína (BARRET, 1981; NÄGLER et al., 1997). A principal

característica estrutural que difere a catepsina B das demais cisteíno-peptidases é a inserção

de uma alça estrutural, denominada alça de oclusão (Fig.1), que ocupa os subsítios S2’ ’– S3 da

enzima (MUSIL et al., 1991). O sítio catalítico da catepsina B é formado pelos resíduos Cys29

e His199. Os dois resíduos de His110 e His111, presentes na alça de oclusão, determinam a

atividade carboxidipeptidil-peptidase da catepsina B por ancorar a carboxila C-teminal dos

substratos peptídicos (MUSIL et al., 1991). O par iônico Cys29-His199 também é determinante

para a estabilidade da α-hélice central da enzima, bem como outras pontes salinas tais como:

Asp22-His110 e Arg116-Asp224, localizadas na alça de oclusão. Ainda, ligações interdomínios,

Asp40-Arg202 e Arg41-Glu163, são responsáveis pela estabilização desta hélice. A ruptura do

par iônico Cys29-His199, pela desprotonação do imidazol em meio alcalino, catalisa a

desnaturação da enzima por desorganizar a estrutura de sua α hélice central (TURK et al.,

1994). A pré-pro-catepsina B é sintetizada por apenas um gene, com localização no 8p22,

que pode transcrever mais de um tipo de RNA mensageiro, que variam em tamanho

dependendo da extensão da região não traduzida. O RNA mensageiro é traduzido ligado à

membrana dos ribossomos. A pró-enzima recém sintetizada no retíulo endoplasmático rugoso

passa para o aparelho de Golgi, onde recebera, na sua estrutura primária, oligossacarídeos do

tipo alta-manose, que contém manose-6-fosfato. A glicoproteína fosforilada se liga aos

receptores de manose-6-fosfato na membrana do Golgi e é direcionada ao lisossomo. Durante

este processo, as vesículas de transporte são acidificadas, fato este que permite a dissociação

do receptor, e também desencadeia o autoprocessamento da pró-enzima, pela liberação

proteolítica do seu pró-peptídeo. O processamento intermolecular, feito pela catepsina B ou

outras peptidases, pode ser um mecanismo alternativo de ativação destas enzimas (ROWAN

et al., 1991).

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FIGURA 1. Representação Esquemática da Estrutura Tridimensional da Catepsina B. A figura mostra o diagrama da estrutura cristalina da enzima catepsina B lisossomal humana. A molécula, que possui aproximadamente 28 kDa, é orientada por dois domínios globulares, direito e esquerdo (por convenção), e o sítio ativo se encontra inserido entre estes dois domínios. Os resíduos de aminoácidos que formam o sítio ativo estão representados na figura (Cys29 199/His ). As estruturas de α hélice estão representadas em vermelho e as estruturas β pregueadas estão representadas em azul. A estrutura representada em verde recobrindo o sítio ativo é a alça de oclusão, que através dos resíduos de histidina (His110 e His111), determina a atividade de carboxidipeptidil-peptidase da catepsina B.

Além da função de inibir a enzima proteolítica durante a sua biossíntese, o pró-peptídeo

da catepsina B também é responsável por estabilizar a enzima em pH neutro. Em condições

normais de ativação, o pró-peptídeo é degradado após ser clivado da pró-enzima. Entretanto,

em algumas circunstâncias, a catepsina B pode ser secretada da célula como um complexo

não covalente formado pelo pró-peptídeo e a enzima madura. Esta forma pode representar um

potencial reservatório extracelular de enzimas proteolíticas (MORT; BUTTLE, 1997).

Devido ao ambiente pouco favorável dos lisossomos, a meia-vida da maioria das

proteínas lisossomais fica restrita em torno de 24 h. A prolina localizada na porção N-

terminal é uma característica marcante das cisteíno-peptidases lisossomais. A presença de

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prolina protege a enzima de possíveis ataques de amino-peptidases (MORT; BUTTLE,

1997).

1.1.2 Participação de Catepsina B na Metástase Tumoral

O estudo da catepsina B e dos componentes da matriz extracelular tem sido de

relevante interesse nos processos fisiopatológicos que envolvem a degradação de

componentes da matriz. Entre esses processos incluem-se a angiogênese (MIGNATTI;

RIFKIN, 1996), o “turnover” da matriz extracelular, bem como processos invasivos em geral

(MIGNATTI; RIFKIN, 1993). As enzimas lisossomais, entre elas, a catepsina B, tem sido

alvo constante de estudos que visam um melhor entendimento dos processos de remodelação

tecidual, evolução tumoral e metástases (MIGNATTI; RIFKIN, 1993).

O alto potencial destrutivo das cisteíno-peptidases lisossomais é regulado por

inibidores protéicos endógenos, tais como: cistatinas, cininogênio e tireoglobulinas do tipo I

(TURK et al., 1997). As cisteíno-peptidases lisossomais também são controladas pelo pH do

meio, estas enzimas sofrem desnaturação em pH 7,4 e alcalino (TURK et al., 1994). Desta

forma, inibidores protéicos, juntamente com o pH fisiológico, são responsáveis por manter o

“balanço” proteolítico desta classe de enzima no tecido. Alterações do conteúdo enzimático

ou dos inibidores podem resultar em diversas patologias que envolvem estados de

remodelação tecidual.

A elevação da atividade da catepsina B está particularmente bem documentada em

carcinomas de cólon, pâncreas e cérebro (SLOANE et al., 1986). Além do lisossomo, a

catepsina B tem sido localizada na membrana plasmática de células tumorais (GUINEC et al.,

1992; MOIN et al., 1998). Esta distribuição permite a enzima degradar os componentes da

matriz extracelular e da membrana basal (SHEAHAN et al., 1989; BUCK et al., 1992).

Estudos sobre a progressão do câncer correlacionados aos níveis de catepsina B, têm

mostrado que essa enzima freqüentemente aparece elevada na maioria dos tumores em

estádios invasivos (Tabela 1). A elevação dos níveis de catepsina B, em carcinoma de cólon

humano, tem sido notada nos estadios precoces em relação aos estadiamentos avançados.

Ainda, neste tumor não foi notado um decréscimo da quantidade de inibidores endógenos

presentes, quando comparados aos níveis da mucosa normal (IACOBUZIO-DONAHUE et

al., 1997).

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TABELA 1: Catepsina B em Tumores Humanos Tumor Observação Referência

Carcinoma Gástrico Atividade de catepsina B aumenta no tecido malígnoquando comparada ao tecido não malígno.O aumento da atividade foi positivo quandocorrelacionado com a progressão tumoral

1

2

Carcinoma de Pulmão Atividade da catepsina B aumenta em tumores quandocomparada ao parenquima pulmonar.Existe significante correlação entre o aumento daatividade de catepsina B no tumor e baixos índices desobrevida no pós-operatório

3,4

5

Carcinoma Coloretal Aumento na expressão da catepsina B no tumorquando comparada ao tecido normal. A expressão daenzima possui correlação positiva com o aumento doestágio e redução dos índices de sobrevida.Adenomas e tecido normal do colom possuem níveiscomparáveis de atividade de catepsina B.Estágios iniciais (Dukes’ A e B) possuem atividadeselevadas quando comparadas aos estágios avançados(Dukes’ C e D) e tecidos normais.Aumento dos níveis de RNAm em tumoresespecíficos. Estes aumentos também possuemcorrelação inversa com os estágios de Dukes’

6

78

9

Osteoclastomas Três formas de RNAm são detectadas por northernblot. A catepsina B foi localizada nos osteoclastos dotumor

10

Carcinoma de Mama Aumento da atividade de catepsina B no tumorprimário e citosarcomas quando comparada àdisplasia mamária.Aumento da atividade de catepsina B na neoplasiaquando comparada ao tecido normal e correlaçãopositiva com a malignidade tumoral.A catepsina B é secretada em quantidadessignificantemente superiores no tumor malígno quandocomparada ao tecido normal.

11

12

13

Glioma Aumento da expressão do RNAm da catepsina B eaumento da atividade correlacionada com aprogressão tumoral.

14,15

Melanoma Pr-catepsina B e complexos de inibidores de catepsinaB madura são secretados por células de melanomaem cultura.Ensaios de imunoistoquímica com catepsina Bmarcada, indica que a peptidase é quase exclusiva emcélulas tumorais. A intensidade da marcação possuicorrelação positiva com o tamanho do tumor, mas nãocom o tipo de melanoma.

16

17

Próstata Apresenta correlação positiva entre ensaios deimunoistoquimica para catepsina B e índiceshistológicos de Gleason 5-8

18

*Referências: (1) WATANABE et al.,1987; (2) WATANABE et al.,1989; (3) KREPELA et al.,1990. (4) WERLE et al.,1995; (5) EBERT et al.,1994; (6) SHUJA et al.,1991; (7) SHEAHAN et al.,1989; (8) MURNANE et al.,1991; (9) PAGE etal.,1991; (10) KREPELA et al.,1989; (11) LAH et al.,1995; (12) LAH et al.,1992; (13) RECKLIES et al.,1982; (14) REMPEL et al.,1994; (15) SIVAPARVATHI et al.,1995; (16 ) TSUSHIMA et al.,1991; (17) FROHLICH et al.,1995; (18) SINHA et al.,1995.

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O tráfego celular e o direcionamento de enzimas lisossomais são controlados,

classicamente, por vias que envolvem o reconhecimento de receptores de manose-6-fosfato

(BROWN et al.,1986). No entanto, vários trabalhos mostram que esta classe de receptores não

é suficiente para o direcionamento de várias enzimas lisossomais, seja por uma mudança na

expressão destes receptores (KASPER et al., 1996), seja por alterações no padrão de

glicosilação de enzimas lisossomais, tal como observado para a catepsina B em células

tumorais (IACOBUZIO-DONAHUE et al., 1997). De fato, o direcionamento lisossomal de

catepsina B, em células normais, independente do receptor de manose-6-fosfato tem sido

proposto (HANEWINKEL et al., 1987), bem como para a catepsina B de células de

carcinoma de cólon humano HT-29 (DE STEFANIS et al., 1997). Altos níveis de catepsina B,

além de modificações qualitativas na sua expressão protéica, o que inclui alteração do padrão

normal de glicosilação da enzima, são determinantes na manutenção do fenótipo de

malignidade de células tumorais (IACOBUZIO-DONAHUE et al., 1997). Alterações na

expressão, no processamento e na localização celular de catepsina B têm sido observados em

vários tecidos tumorais; investigações clínicas têm mostrado que a catepsina B é um indicador

altamente confiável para o diagnóstico e prognóstico de câncer (KOS; LAH, 1998).

Proteínas da matriz extracelular (HUMPHRIES et al., 1983; BUCK et al., 1992) e de

membrana basal (BARICOS et al., 1988; BRIOZZO et al., 1988) podem ser hidrolisadas pela

catepsina B. Estudos de imunoistoquímica realizados em vários tipos de carcinomas humanos:

carcinomas de bexiga (VISSHER et al., 1994), cólon (KHAN et al., 1998a), de estômago

(KHAN et al., 1998b) e pulmão (SUKOH et al. 1994), mostraram que a intensidade de

marcação para catepsina B e colágeno tipo IV ou laminina foram inversamente proporcionais

entre si, ou seja, quanto maior a quantidade de catepsina B detectada, menor foi a quantidade

de colágeno e lamina detectada nestes tumores.

Também foi demonstrado que as células de estroma, vizinhas ao tumor de mama, além

das células tumorais, também apresentam aumento na expressão de catepsina B

(CASTIGLIONI et al., 1994). Joensuu et al. (1995) obtiveram resultados similares para

catepsina D em carcinomas de mama.

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1.1.3 Controle da Expressão Gênica e da Secreção de Catepsina B

A capacidade de componentes da matriz extracelular de mediar o controle da

expressão de cisteíno e aspartil-peptidases ainda não está totalmente elucidada. A hipótese

que os elementos da matriz extracelular das células de estroma possam modular a expressão

de catepsina B e D tumoral se torna muito importante quando analisada pelo ponto de vista

que estas enzimas possam estar contribuindo para a atividade degradativa tumoral

(KOBLINSKI et al., 2002). Foi observado que os fibroblastos adjacentes ao tecido tumoral

maligno apresentam elevada produção de serino-peptidases, metalo-peptidases e de catepsinas

B e D, em relação aos fibroblastos encontrados em estroma de neoplasia benigna (BASSET et

al., 1990). Interessantemente, foi demonstrado, que o colágeno tipo I é capaz de promover a

expressão e secreção da catepsina B em fibroblastos, via sua interação com as integrinas ·1·1 e

·2·2. Por outro lado, esta interação não foi capaz de estimular a síntese e secreção da catepsina

D. Este diferencial na indução de síntese e secreção de enzimas lisossomais distintas, mediado

por uma proteína da matriz, pode indicar diferentes papeis destas enzimas na fisiopatologia

dos processos tumorais (KOBLINSKI et al., 2002).

As interações entre integrinas com colágeno do tipo I, não são só responsáveis pelo

aumento da expressão de catepsina B, como também são responsáveis pelo aumento da

secreção de pró-catepsina B, sugerindo que a enzima secretada por esta via ainda não tenha

alcançado o endossomo ou o compartimento lisossomal. A quantidade de catepsina B ativa

que é secretada em resposta ao colágeno tipo I (KOBLINSKI et al., 2002), pode estar

refletindo o processamento da pró-catepsina B extracelularmente ou a exocitose da catepsina

B ativa dos lisossomos/endossomos, como já foi mostrado em uma grande variedade de

células (ANDREWS et al., 2000).

A secreção de catepsina B é regulada pela via do ras (SLOANE et al., 1994). Uma

grande variedade de agentes e tratamentos podem desencadear a exocitose dos lisossomos

dependendo do tipo celular (GUO et al., 2002). Exposição às partículas de zimosan em

macrófagos alveolares, agentes que inibem a H+-ATPase do vacúolo ou agentes que elevam o

pH do lisossomo, são situações que provocam a exocitose lisossomal (TAPPER et al., 1990;

SUNDLER et al., 1997). O metabólito de ácido araquidônico, o ácido12-S-hidroxi-

eicosatetraeonico (12-S-HETE) induz a exocitose de lisossomos em uma grande variedade de

células em cultura (HONN et al., 1994; ULBRICHT et al., 1996). Finalmente, condições que

rapidamente elevam as concentrações citosólicas de Ca2+ também induzem a exocitose dos

lisossomos em várias linhagens celulares. Recentes estudos têm identificado agentes

potencializadores, mas não iniciadores do processo de exocitose lisossomal, tais como o

- 21 -

AMPc e agentes que aumentam os níveis de AMPc, potencializam a ação do Ca2+,

desencadeando a exocitose do lisossomo (RODRIGUEZ et al., 1999). Igualmente, o TPA e

outros ésteres de forbol são agentes potencializadores, mas não desencadeadores da exocitose

lisossomal (TAPPER et al., 1995).

Ainda não se sabe o motivo porque são encontradas populações distintas de

lisossomos exocitados, ora apresentando teor de catepsina L, ora apresentando catepsina L

com catepsina B e vice-versa. As condições capazes de desencadear a exocitose lisossomal

seletiva de catepsina L, enzima da mesma família da catepsina B, ainda não foram

identificadas. Estudos recentes mostram que a catepsina L é exocitada por populações

lisossomais que são sensíveis à elevação de concentração do Ca2+ citosólico (MARTINEZ et

al., 2000). A literatura tem mostrado que o TPA induz a exocitose de lisossomos contendo

apenas catepsina B, mas não promove a secreção de catepsina L e D. As similaridades das

ações do TPA e 12-S-HETE são mais que apenas coincidências, a ênfase na natureza

heterogênea dos lisossomos/endossomos e a demonstração que estas organelas diferem em

suas susceptibilidades no processo de sinalização e no processo de desencadeamento da sua

exocitose, é um ponto crítico no estudo da secreção celular da catepsina B. Os recentes

estudos sugerem a existência de vários sinalizadores e mecanismos envolvidos na exocitose

lisossomal (GUO et al., 2002). Dados da literatura mostram que fisiologicamente as células

epiteliais de tireóide secretam catepsina B ativa por exocitose lisossomal estimulada pelo

hormônio TSH. A secreção da catepsina B ativa promove a liberação de tiroxina (T4) pela

degradação extracelular da tireoglobulina (LINKE, et al., 2002).

As secreções das formas ativas e da pró-catepsina B têm sido descritas em vários

tecidos neoplásicos (Tabela 2). A saturação da via da manose-6-fosfato pode provocar o

redirecionamento das enzimas lisossomais, fazendo com que estas enzimas sejam secretadas

na suas formas inativas (pró-catepsina B). A secreção da enzima madura é muito mais

complexa. Aparentemente, a secreção da enzima madura pode indicar que ela esteja sendo

processada intracelularmente em excesso, passando diretamente pelo tráfego lisossomal ou

também pode estar sendo ativada extracelularmente (FROSCH et al., 1999). Tooze at al.

(1991) mostrou que a catepsina B madura é secretada pelo pâncreas exócrino de rato pela

fusão de lisossomos com grânulos de reserva citoplasmático. Estes grânulos podem se

apresentar de dois modos: corpos crinofágicos, os quais degradam intracelularmente material

secretório, ou como grânulos secretórios, responsáveis por exocitar produtos de degradação

catabólica (HASHIZUME et al., 1993).

- 22 -

Os múltiplos caminhos relacionados no processo de secreção celular da catepsina B,

tanto da forma ativa como da pró-enzima, sugerem que a secreção de catepsina B pode ter

conseqüências funcionais determinantes para a degradação dos componentes da matriz

extracelular (KOBLINSKI et al., 2002).

TABELA 2: Localização Celular Alterada da Catepsina B em Tumores

*Referências. (1) FROHLICH et al.,1995; (2) TERADA et al., 1995; (3) SINHA et al.,1995; (4) RECKLIES et al.,1982; (5) POOLE et al.,1978; (6) VISSCHER et al.,1994; (7 ) SLOANE et al.,1986.

Tecido Tumoral Observação Referência*Melanoma Catepsina B foi encontrada em estruturas vesiculáres e

espaços extracelulares. 1

Colângio- e hepatocelular carcinomas

Catepsina B foi encontrada em todos os tipos celulares tumorais. Em tecidos normais, apenas em hapatócitos e raramente em fibroblastos, em ducto intra-hepático bilial as células epiteliais apresentaram marcação.

2

Próstata Catepsina B foi localizada nos compartimentos citoplasmático e nuclear das células tumorais.

3

Câncer de mama Tumores de mama humanos secretam pró-catepsina B. Quando comparado ao fibrossarcoma benigno, câncer de mama secreta maior quantidade da enzima.

4,5

Câncer de bexiga Catepsina B foi encontrada em tumores em estágios iniciais colocalizada aos lisossomos. Tumores em estágios avançados de evolução apresentaram marcação difusa por todo citoplasma.

6

Melanoma murino Fracionamento subcelular e ensaios de atividade indicam a ocorrência de uma mudança da atividade enzimática para a membrana plasmática. Este dado possui correlação positiva com o aumento do potencial metastático.

7

Nosso grupo demonstrou que a atividade da catepsina B é regulada pela presença de

glicosaminoglicanos “heparin-like” (ALMEIDA et al., 2001). Foi observado que a heparina e

o heparam sulfato são capazes de interagir com a His111 da alça de oclusão da catepsina B e

promover a estabilização da α-hélice central do sítio ativo da enzima em pH 7,4, a

estabilização conformacional favorece a atividade endopeptidásica da enzima por aumentar

em cinco vezes a meia-vida desta enzima em pH 7,4. A catepsina B tem sido envolvida nos

processos de invasão tumoral pela degradação de componentes da matriz extracelular (BUCK

et al., 1992). A degradação dos componentes da matriz pode ocorrer intracelularmente, pela

intensa atividade proteolítica da célula tumoral, ou extracelularmente, pela catepsina B

presente na superfície celular associada à membrana plasmática (SLOANE et al. , 1996). A

presença de catepsina B na membrana plasmática resulta em dissolução focal de proteínas da

matriz extracelular e permite a invasão de células tumorais (KOBLINSKI; SLOANE, 1997).

Nossos resultados sugerem que o heparam sulfato pode ancorar a catepsina B na superfície

celular, e esta interação favorece a atividade endopeptidásica da enzima por aumentar em

cinco vezes sua meia-vida em pH fisiológico (ALMEIDA et al., 2001), o que está de acordo

- 23 -

com a observação de que formas de catepsina B ligadas à membrana são muito resistentes à

inativação em pH neutro (SLOANE et al., 1988).

Os proteoglicanos de heparam sulfato da superfície celular estão em constante

renovação como resultado de sua secreção e endocitose contínua. Foi demonstrado que

algumas proteínas ligadas à cadeias de heparam sulfato são endocitadas juntamente com

proteoglicanos, como por exemplo: o fator de crescimento de fibroblastos (REILAND;

RAPRAEGER, 1993) e lipases lipoprotéicas (JACKSON et al., 1991). É interessante observar

que em vesículas lisossomais existe uma alta concentração de catepsina B (KOS; LAH, 1998)

e que heparam sulfato também está presente neste compartimento durante seu tráfego

intracelular (BIENKOWISKI; CONRAD, 1984). Estas observações sugerem que o

mecanismo de inserção da catepsina B na membrana plasmática, bem como seu tráfego

celular, possa ser dependente de proteoglicanos de heparam sulfato.

1.1.4 Papel da Catepsina B e dos Lisossomos na Apoptose de Células Tumorais

Além de sua função de degradar proteínas da matriz extracelular e de garantir

capacidade de invasão de células tumorais, a catepsina B tem sido implicada no controle de

apoptose. A catepsina B possui atividade de protease ativadora de morte celular dependente e

independente de caspases, disparando os mecanismos de apoptose em células tumorais.(FU et

al, 1998). Foi demonstrado que a ativação de apoptose em células infectadas por HPV,

induzidas pelo complexo inibitório da oncoproteína E7 de HPV e p21, está associada à

ativação da catepsina B, e este poderia ser um mecanismo alternativo para garantir a morte

celular das células infectadas. Também foi observado que a ativação da catepsina B ocorre em

células tumorais com mutações de caspases, bem como superexpressão de proteínas Bcl-2 e

p21 (KAZNELSON et al, 2004). Drogas antitumorais que induzem a permeabilização da

membrana lisossomal liberam catepsinas B e D para o citoplasma que, por sua vez, podem

induzir apoptose dependente de Bax (ERDAL et al.,2005). Interessantemente, compostos que

promovem a translocação de enzimas lisossomais para o citoplasma induzem morte celular

independentemente de p53 (ERDAL et al.,2005). Tem sido observado que TNF, via receptor-

1 (TNF-R1), além de ativar caspases, também promove apoptose mediada pela mobilização

de enzimas lisossomais para o citoplasma. Antagonicamente, NF-kappaB é capaz de bloquear

o efeito pró-apoptótico do TNF pela indução de uma proteína inibidora da atividade de

catepsina B, denominada Spi2A (LIU et al., 2003). Dados na literatura têm mostrado que a

catepsina B é capaz de ativar a proteína Bid na sua forma pró-apoptótica tBid (CIRMAN et

al., 2004) e degradar a enzima SK-1 que é inibidora de apoptose (TAHA et al.,2005). Desta

- 24 -

forma, as enzimas lisossomais, em especial a catepsina B, tem sido diretamente implicadas no

controle da apoptose.

As células tumorais possuem vários defeitos na suas vias de morte celular, tais como:

exacerbação da expressão gênica de proteínas antiapoptóticas, Bcl-2, Bcl-xL, Akt/PKB e

inibidores, bem como, apresentam mutações em proteínas pró-apoptóticas, com: Bax, Apaf-1

e p53. Essas alterações favorecem o desenvolvimento tumoral por bloquear a interferir

negativamente na ativação das caspases e, dessa forma, bloquear a apoptose pelas vias

clássicas. Por outro lado, durante os estágios iniciais da tumorigênese, muitas células

transformadas podem ser sensibilizadas por vários estímulos de morte e, freqüentemente,

muitas delas podem entrar em apoptose espontânea (JAATTELA, 2004).

Alterações marcantes observadas no compartimento lisossomal das células tumorais e o

direto envolvimento das enzimas lisossomais no controle da apoptose tumoral, sugerem que a

via lisossomal de disparo da morte celular pode contribuir, significantemente, para a

sensibilização do programa de morte em células tumorais. Dentre essas alterações lisossomais

promovida pela imortalização celular podemos destacar: 1) a elevação da sensibilidade da

membrana lisossomal a agentes lisossomotrópicos; 2) o aumento do volume dos lisossomos e

3) a elevação da sensibilidade da morte celular pela via lisossomal. Também, podem-se notar

as alterações lisossomais promovidas pela transformação celular: 1) elevação na expressão

gênica das catepsinas lisossomais; 2) alteração do tráfego celular dos lisossomos; 3) elevação

na taxa de secreção das catepsinas e 4) aparecimento da “heat shock protein” Hsp70 na

membrana lisossomal induzindo maior estabilidade da membrana lisossomal para as células

tumorais (FEHRENBACHER & JAATTELA, 2005).

Tem sido mostrado que a imortalização e a transformação, em fibroblastos embrionários

murinos, sensibilizam essas células para a indução de morte celular pela via lisossomal

disparada por TNF. Por si mesmo, a espontânea imortalização observada nessas células,

gerada pela inativação do seu sistema de p53, foi suficiente para sensibilizar em mais de 1000

vezes os fibroblastos embrionários murinos à ação apoptótica induzida pelo TNF. Essa

sensibilização foi altamente dependente da atividade da enzima lisossomal catepsina B.

Interessantemente, foi mostrado que o nocaute do gene da catepsina B nessas células de

fibroblasto embrionárias imortalizadas geram células resistentes à indução de apoptose pelo

TNF, de modo semelhante à ação do TNF nas células selvagens não imortalizadas. A

reintrodução da catepsina B nessas células mutantes defectivas de catepsina B foi suficiente

para promover a ressensibilização ao TNF, enquanto que a inibição farmacológica da

catepsina B ou a depressão da expressão gênica dessa enzima por RNA de interferência

- 25 -

significativamente protegeram as células imortalizadas contra a apoptose induzida por TNF.

Ainda, a transformação dos fibroblastos embrionários murinos imortalizados induzida por v-

Ha-ras ou c-Src promoveu uma grande elevação na taxa de expressão gênica das catepsinas B

e L (FEHRENBACHER et al., 2004). Dessa forma, os autores especularam que a

sensibilização destas células para o estímulo apoptótico disparado pelo TNF se deve à

exacerbação da via lisossomal presentes em células transformadas (FEHRENBACHER &

JAATTELA, 2005).

1.2 Heparanase em Células Tumorais e Metástases.

Em 1975, Hook descreveu a atividade de uma endoglicosidase de degradação do

heparam sulfato, primeiro relato da heparanase. Somente em 1983 relacionaram com a

invasibilidade e metastatização tumoral. A purificação da heparanase foi dificultada por sua

limitada disponibilidade e sua instabilidade (SIMIZU et al., 2004).

Os glicosaminoglicanos “heparin-like” estão amplamente distribuídos em organismos

multicelulares (Nader & Dietrich, 1989). Particularmente, a heparina e heparam sulfato,

dentre os demais glicosaminoglicanos, apresentam elevada capacidade de interação com

variado número de proteínas. Os glicosaminoglicanos “heparin-like” exercem um complexo

papel na regulação da matriz extracelular, controlando uma grande variedade de processos

biológicos, tais como: hemostase, inflamação, angiogênese, ação de fatores de crescimento,

adesão celular, entre outros (Conrad et al., 1998). Heparina e heparam sulfato são reguladores

da atividade proteolítica de algumas proteinases, bem como de seus inibidores (TERSARIOL

et al., 2002).

A heparanase é uma endo-β-glucuronidase que quebra ligações glicosídicas

intrassacarídicas do heparam sulfato. O gene da heparanase determina um polipeptídio de 543

aminoácidos com peso molecular de 61,2 kDa, entretanto a heparanase purificada apresenta

uma diferença de 156 aminoácidos a menos, esses resultados sugerem a existência de

proteólise pós-traducional para a enzima madura encontrada nos tecidos ( SIMIZU et

al.,2004). Essa enzima foi recentemente clonada, sendo que o gene da heparanase humana

apresenta um cDNA de 3.7 kb e encontra-se distribuído em cerca de 50 kb, contendo 14 éxons

e 13 íntrons, este gene está localizado no cromossomo humano 4q22 (DONG et al., 2000).

A heparanase promove a degradação de cadeias de heparam sulfato dos proteoglicanos

que são componentes da matriz extracelular, de membrana basal e da superfície celular. Em

tumores, a heparanase pode facilitar a invasão de células tumorais e metástases pela

- 26 -

degradação da membrana basal vascular e matriz extracelular (Nurcombe et al., 2000;

Vlodavski et al., 1999).

Pacientes que apresentavam altos níveis de expressão de heparanase em carcinoma

espinocelular de esôfago apresentaram pior prognóstico. Células endoteliais de novos vasos e

de vasos formados na periferia do tumor apresentavam uma intensa expressão de heparanase.

A heparanase facilita a angiogênese por liberar para o meio extracelular os fatores de

crescimentos angiogênicos ligados aos proteoglicanos de heparam sulfato. A elevação da

densidade de microvasos está correlacionada com a expressão de heparanase. (Takaomi,2004)

Há uma correlação entre pior prognóstico e a expressão aumentada da heparanase e o

carcinoma ductal de mama in situ. Sendo que em tecidos normais não foi encontrada dosagem

de heparanase ( Maxhimer et al., 2005). Também se identificou uma marcação intensa de

heparanase em áreas de invasão tumoral em cânceres ductais mamários ( ZCHARIA et

al.,2001).

Nos adenocarcinomas colorretais foi descrito a presença da heparanase na superfície

celular e no citoplasma (FRIEDMAN et al.,2000).

O conjunto destas observações sugere que o mecanismo de inserção da catepsina B na

membrana plasmática, bem como seu tráfego celular, possam ser dependente de

proteoglicanos de heparam sulfato e a liberação de catepsina B da superfície celular pode

estar relacionada com a atividade da heparanase. Assim, as enzimas catepsina B e a

heparanase são moléculas alvo para o desenvolvimento de agentes antitumorais e também

podem servir como marcadores moleculares para o diagnóstico e prognóstico de tumores.

1.3 Câncer de Cabeça e Pescoço

Os cânceres de cabeça e pescoço são os tumores malignos que acometem as estruturas

anatômicas do lábio, cavidade oral (mucosa bucal, gengiva, palato duro, língua oral, assoalho

da boca), orofaringe (amídalas, base da língua, palato mole), nasofaringe, fossa nasal e seios

paranasais, laringe, hipofaringe, glândulas salivares e tireóide. Excluímos no presente trabalho

os cânceres de tiróide e de glândulas salivares, pois são histologicamente diferentes.

A incidência de casos novos diagnosticados nos EUA, excluindo os cânceres de pele, é

estimada em 70.000 casos anualmente. Representa 5% de todos os cânceres diagnosticados.

Predominantemente são espinocelulares (90%). E são responsáveis por cerca de 8100

óbitos/ano (cânceres de cavidade oral e faringe) e 4200 óbitos/ano em câncer de laringe

(American Cancer Society,1997). Nas Estimativas de Incidência e Mortalidade por Câncer no

Brasil em 2003, as neoplasias são responsáveis por cerca de 12,7% dos óbitos no Brasil sendo

- 27 -

destes 2,84% cânceres de cavidade oral e 2,09% cânceres de laringe. As estimativas de casos

novos de câncer de cavidade oral para 2003 eram de 10.600 caso com 3200 óbitos

(INCA/MS/2003)

Há uma forte associação entre os cânceres do trato aerodigestivo alto e o uso do

tabaco. Estudos epidemiológicos mostram um aumento do risco em 20 a 40 vezes para os

fumantes. O consumo de álcool também é um dos maiores fatores de risco, acrescentando um

risco de 5 a 11 vezes de ter a doença em relação ao só fumante ou ao não fumante

(TALAMINI et al., 2002).

O paciente que apresenta um tumor de cavidade oral, em geral, se queixa de uma

úlcera na boca que não cicatriza, perda de dentes, prótese dentária que não se adapta mais,

trismo ou perda de peso. Também, podem reclamar de disfagia, odinofagia, sangramento ou

otalgia. É importante para o médico ter um alto nível de suspeita principalmente em fumantes

e etilistas. Cerca 30 % dos pacientes com neoplasia de cabeça e pescoço tem como primeira

queixa uma metástase em linfonodo cervical (SHAH et al, 1990)

A localização do linfonodo metastático ajuda na procura do primário, pois apresenta

uma correlação positiva do primário e seu primeiro sítio de metastatização.

Os estudos de imagens são fundamentais no estadiamento, principalmente a

Tomografia Computadorizada, ajudando na avaliação da extensão do tumor, sua infiltração de

estruturas anexas, e aumenta de 70 a 93 % a efetividade na detecção de metástase cervical (

STEVENS et al, 1985 ).

O sistema TNM para o estadiamento dos cânceres de cabeça e pescoço permite ao

médico comparar resultados, discutir prognóstico, e decidir o tratamento adequado. A

classificação T se refere ao tamanho e invasão de estruturas anexas da lesão primária, N para

a situação dos linfonodos cervicais e o M para a presença ou não de metástase à distância, nas

figuras 2, 3 e 4 temos modelos de classificação linfonodal, laríngea e de cavidade oral,

respectivamente (AMERICAN JOINT COMMITTEE ON CANCER E UICC, 2002 ).

A cirurgia se mantém como padrão de tratamento para os carcinomas espinocelulares

de cabeça e pescoço. Tendo como objetivo englobar o tratamento da lesão primária e o

pescoço envolvido. Principalmente nos estadios avançados (estadio III e IV). A radioterapia

pode ser usada como tratamento adjuvante pré- ou pós-cirúrgico. Usualmente é administrada

pós-operatoriamente. Está particularmente indicada nos casos com linfonodos positivos.

- 28 -

Primariamente está indicada nos casos precoces de câncer de laringe (estadio I e II) e nos

carcinomas de nasofaringe.

A quimioterapia tem sido intensamente estudada, estando presente em vários

protocolos de tratamento neoadjuvante. Muito interesse vem apresentado os modelos de

preservação de órgãos nos casos de câncer de laringe (WOLF,et al, 1993)

Como nova terapêutica, mostrando ser promissora, está a terapia genética onde a

introdução, nas células somáticas do paciente, de genes para fabricarem proteínas com efeito

terapêutico (LIU , et al, 1994).

- 29 -

Figura 2. Estadiamento Linfonodal. N1, linfonodo ipsilateral da lesão com até 3 cm. N2a, linfonodo ipsilateral da lesão de 3 a 6 cm. N2b, mais de um linfonodo ipsilateral da lesão menores de 6 cm. N2c, presença de linfonodo contralateral da lesão menor de 6 cm. N3, linfonodo de tamanho igual ou maior de 6 cm (American Joint Committee on Cancer Staging Manual, 6th ed., 2002)

- 30 -

Figura 3. Estadiamento de tumores de laringe. T1, limitado a uma subregião da supraglote, ou limitado a prega vocal com motilidade preservada (T1a, uma prega e T1b, ambas as pregas), ou limitado a subglote. T2, mucosa de mais que uma sub-região da supraglote ou glote ou região adjacente, sem fixação da prega vocal; ou nos tumores glóticos extensão para supra ou subglote, ou diminuição da mobilidade de prega vocal; ou nos de subglote extensão para prega vocal com mobilidade normal ou diminuída. T3, fixação de prega vocal ou invasão da área pós-cricóide, pré-epiglótica, espaço paraglótico ou erosão da cartilagem tireóidea. T4a, extravasamento da laringe e T4b, invasão do espaço pré-vertebral, mediastino ou artéria carótida (American Joint Committee on Cancer Staging Manual, 6th ed., 2002).

- 31 -

Figura 4. Estadiamento dos tumores de cavidade oral. T1, lesão menor de 2 cm. T2, lesão entre 2 a 4 cm. T3, lesão maior de 4 cm. T4a, lábio: invasão cortical óssea, nervo alveolar, assoalho da boca ou pele. Cavidade oral: invasão da cortical óssea, músculos extrínsecos profundos da língua, seio maxilar ou pele. T4b, invasão do espaço mastigatório, lâminas pterigóides, base do crânio, artéria carótida (American Joint Committee on Cancer Staging Manual, 6th ed., 2002)

- 32 -

2 MATERIAIS

2.1 Obtenção do tecido tumoral

Foram separados fragmentos de tecidos provenientes de biópsias, previamente indicados

para exame anátomo-patológico, de pacientes encaminhados ao Departamento de Cirurgia de

Cabeça e Pescoço do Hospital Estadual Mário Covas – Santo André (HEMC), SP. Nos casos

de câncer, no ato do exame clínico do paciente foi feito o estadiamento clínico da lesão, pelo

do sistema TNM (T, extensão do tumor primário; N, linfonodos regionais; M, metástase à

distância), proposto pela American Joint Comittee of Cancer de 1988 e União Internacional

de Combate ao Câncer, revisada de 2002 (Tabela 3). Os procedimentos semiológicos,

cirúrgicos e triagem dos pacientes são da responsabilidade do cirurgião Emílio López Couto

da equipe de cirurgia de cabeça e pescoço do HEMC. Partes dos fragmentos de tecidos

removidos de forma rotineira por biópsias para análise histopatológica foram imediatamente

congelados e enviados ao laboratório do CIIB-UMC, para o devido processamento, num total

de 9 lesões benignas.

Conforme o anexo A obtivemos aprovação da comissão de ética em pesquisa da

faculdade de medicina ABC utilizando o modelo de autorização do anexo B.

Foram divididos pela localização anatômica em Cavidade Oral, Orofaringe, Laringe e

Hipofaringe. As lesões de lábio da Cavidade Oral foram excluídas por terem outro fator

desencadeante (exposição solar). Foram analisados 20 pacientes no período de julho de 2004

a fevereiro de 2006. Sendo 18 do sexo masculino e 2 femininos. Divididos por região

anatômica, obtivemos: 3 de cavidade oral, 6 de orofaringe, 9 de laringe e 2 de hipofaringe.

- 33 -

Tabela 3: Estadiamento conforme AJCC e UICC, 1988, revisada 2002

Estadio Grupos 0 Tin situ N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 III T3 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0 IVA T4a N0 M0 T4a N1 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N2 M0 T4a N2 M0 IVB T4b qq N M0 qq T N3 M0 IVC qq T qq N M1 From American Joint Committee on Cancer: American Joint Committee on Cancer Staging Manual, 6th ed., 2002, p 65.

Sinal qq: qualquer T in situ :Carcinoma in situ T1: Cavidade Oral e Orofaringe, tumor de até 2 cm; Hipofaringe, limitado a uma sub-região; Laringe, limitado a uma sub-região da supraglote, ou limitado a corda(s) vocal(is)com mobilidade normal, ou limitado a subglote. T2: Cavidade Oral e Orofaringe, tumor de 2 a 4 cm;, Hipofaringe, tumor invade mais de uma região da hipofaringe ou região adjacente; Laringe, mais de uma região da supraglote ou glote, ou tumor glótico invadindo supraglote ou subglótico com diminuição da mobilidade da corda vocal, ou tumor subglótico invadindo glote com mobilidade normal ou diminuída das pregas vocais T3: Cavidade Oral e Orofaringe, tumor maior de 4 cm; Hipofaringe, mais de uma sub-região comprometida ou adjacente com fixação de hemilaringe; Laringe, fixação de corda vocal e/ou invasão da área pós-cricóide, parede medial do seio piriforme ou tecidos pré-epiglóticos T4: Cavidade Oral e Orofaringe, tumor invade estruturas adjcentes; Hipofaringe, invade estrutura adjacente; Laringe, invade cartilagem tireóide ou estruturas adjacentes T4b: São tumores que apresentam invasão de estruturas que o impedem de ressecção cirúgica ( pex. fáscia pré- vertebral) N1: Metástase em um único linfonodo ipsilateral de até 3 cm em seu maior eixo N2: Metástase em um único linfonodo ipsilateral de 3 a 6 cm, ou mais de um linfonodo sendo nenhum maior de 6 cm; ou linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum maior de 6 cm. N3: Metástase em um linfonodo maior de 6 cm M0: Ausência de metástase a distância M1: Presença de metástase a distância

- 34 -

2.2 Detecção das Enzimas em Cortes Histológicos

As biópsias de mucosa orofaríngea foram fixadas em formol tamponado e incluídas em

parafina. Para as reações de imunoistoquímica os cortes histológicos de 4 μm foram

colocados em lâminas previamente silanizadas com organosilano 4 % em acetona (3-

aminopropril trietoxisilano – SIGMA). As lâminas foram submetidas a banhos consecutivos

em baterias de xilol e álcool para a completa desparafinização. A atividade da peroxidase

endógena foi bloqueada tratando as lâminas com 2 banhos consecutivos de peróxido de

hidrogênio 3% em metanol (v/v), por 15 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, para a

recuperação antigênica, os cortes foram submetidos a fervura em panela à vapor do tipo

steam-cuisine, imersos em tampão citrato de sódio 10mM, pH 6,0 durante 70 minutos, a

95°C. Após o resfriamento, as lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS, por 5 minutos cada

lavagem. A seguir, para o bloqueio de reações inespecíficas, as lâminas foram incubadas com

leite desnatado 1% em PBS por 40 minutos. A seguir, as lâminas foram, novamente, lavadas

em PBS e adicionado sobre os cortes histológicos o anticorpo primário monoclonal

anticatepsina B e anti-heparanase (Sigma), as lâminas foram incubadas à temperatura

ambiente, overnight em câmara úmida. Decorrido o período de incubação, as lâminas foram

submetidas à lavagem com PBS e incubadas com o anticorpo secundário marcado com biotina

(LSAB, DAKO) em câmara úmida por 30 minutos à 37ºC. A seguir, as lâminas foram

novamente lavadas, 3 vezes em PBS, por 5 minutos cada lavagem, e incubadas com

complexo Streptavidina-Biotina-Peroxidase (LSAB, DAKO), em câmara úmida por 30

minutos, à 37ºC. Em seguida, os cortes foram lavados em PBS, e a reação revelada com

incubação dos cortes em solução de diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio à 37ºC, por

cinco minutos. Após a incubação, as lâminas foram lavadas em água corrente, e finalmente

coradas com hematoxilina de Carrazi por 60 segundos, lavados novamente em água corrente,

desidratadas em baterias de álcool e xilol e montadas em Permount (Fisher Scientific).

2.3 Obtenção do Extrato Bruto Tecidual

Fragmentos de tecidos humanos, provenientes das biopsias da mucosa orofaríngea,

foram homogeneizados em Polter, utilizando pestilo revestido de teflon, no tampão acetato de

sódio 0,05M, pH 5,0 a 4°C. Para remover fragmentos de tecidos insolúveis da preparação, o

homogenato foi centrifugado por 5 mim 10.000 x g a 4°C, o sobrenadante foi recuperado

obtendo-se, desta forma,l o extrato bruto tecidual. O extrato bruto foi estocado a -20°C e

dosado quanto a quantidade de proteína presente, pelo método de Comassie Blue (Spector) e

quanto ao teor da enzima catepsina B.

- 35 -

2.4 Dosagem da Atividade Enzimática da Catepsina B nos Tecidos

A atividade de catepsina B presente no extrato bruto foi monitorada pela hidrólise de

substrato fluorogênico Z-F-R-MCA a 37 ºC, utilizando espectrofluorímetro Hitachi F-2500. O

comprimento de onda do fluorímetro foi ajustado para, λ = 380 nm e λexcitação emissão= 460nm,

respectivamente, fenda 10/10 nm. Foram utilizadas cubetas de caminho óptico de 10 mm,

volume final de 2 ml. As soluções para reação foram mantidas no compartimento

termostatizado durante 5 minutos antes da adição da enzima. Antes do ensaio, as cisteíno-

proteases presentes no extrato bruto foram ativadas com DTT 2 mM, 5 min. a 37 ºC em

tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6.0, NaCl 200 mM e EDTA 1 mM. A seguir, foi

adicionada à preparação enzimática 5 μM do substrato fluorogênico Z-F-R-MCA e a

fluorescência liberada decorrente da hidrólise do substrato foi monitorada em tempo real. A

atividade endopeptidásica da catepsina B presente no extrato bruto tecidual foi certificada

pela adição de 5 μM de seu inibidor irreversível específico CA-074 à preparação. O resultado

da quantidade enzimática foi expresso em unidades de enzima por miligramas de proteína do

tecido.

2.5 Quantificação e Interpretação de Heparanase nas Reações de Imunoistoquímica.

Cerca de 8 a 10 campos com células marcadas foram selecionados de cada lâmina para a

análise quantitativa da heparanase. As células positivas para heparanase foram quantificadas

em 100 células/biópsia. Assim, a porcentagem de expressão imunoistoquímica foi

determinada para a heparanase no presente estudo. A expressão quantitativa de heparanase foi

classificada em índices de positividade (IP): negativo IP0 (0 a 5%); IP1 (> 5% a 30% de

positividade), IP2 (> 30% a 60%) e IP3 (>60% a 83%), de acordo com MILLON et al. (2001).

Ainda, a expressão de todas as proteínas foi avaliada segundo a intensidade e distribuição

tecidual da coloração. Para análise estatística das lâminas de imunoistoquímica, a

significância foi determinada pelo teste de Chi-quadrado (χ2). Foi utilizado o software de

análise de imagem: Sistema de Processamento e Análise de Imagem Imagelab ® (Softium

Informática).

As lâminas foram analisadas em microscópio óptico Nikon Eclipse® TS100, sendo a

área mais representativa determinada em aumento 40 e 100x, e para análise da

imunoexpressão 400x, foram realizadas captações de imagens com a câmera digital Nikon

Coolpix® 4300, com zoom óptico máximo, abertura F13.4. As imagens foram transferidas

para um computador Pentium 4 ®

- 36 -

2.6 Análise Estatística da Atividade Enzimática.

Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste t de student, com o auxílio do Programa

computacional Excell da Microsoft. Os dados foram considerados estatisticamente

significantes com p < 0,05, ou seja, 95% de confiabilidade Exceto a idade, o tamanho dos

tumores (T),e a presença de metástase em tumores da laringe em função do teor de catepsina

B, todos os outros dados foram estatisticamente significantes.

- 37 -

3 Resultados

3.1 Atividade da Catepsina B

Avaliamos a atividade da Catepsina B em 20 amostras de carcinomas espinocelulares

de cabeça e pescoço, excluindo lesões de pele e de lábio. Realizando a análise sob diversos

parâmetros procurando padrões e diferenças entre os grupos.

No período de Julho de 2004 a Fevereiro de 2006 coletamos amostras de 20 pacientes

que foram submetidos à ressecções cirúrgicas de carcinomas espinocelulares de cavidade oral,

orofaringe, laringe e hipofaringe. Dos 20 pacientes, 18 eram do sexo masculino e 2 do

feminino. Com idade variando de 42 anos a 71 anos. Em 3 pacientes tivemos lesões de

cavidade oral, 6 pacientes com acometimento da orofaringe, 9 pacientes encontramos tumores

de laringe e 2 com lesões de hipofaringe. O estadiamento variou entre Estadio II a IV, não

sendo obtidas amostras de pacientes Estadio I. No Estadio II foi somente 1 paciente, Estadio

III foram 4 pacientes e Estadio IV foram 15 pacientes. Conforme a revisão de 2002 da UICC

nos Estadio IV encontramos 1 Estadio IVc, 1 Estadio IVb e 13 Estadio IVa (Tabela IV).

Dividimos em dois grupos por idade, sendo o primeiro grupo de 12 pacientes com 40 a

55 anos de idade e um segundo grupo de 8 pacientes com idade de 56 a 75 anos. Ao

analisarmos a atividade média e o erro padrão da atividade da Catepsina B por grupo, não

observamos diferença significativa. No primeiro grupo (40 – 55 anos, N=12) os valores foram

de 24 ± 5 UAF/min.μg e no segundo grupo (56 – 75 anos, N=8) os valores foram de 23 ± 6

UAF/min.μg (Figura 5).

Na Tabela 5 foram colocados os valores individualizados da atividade da Catepsina B

encontradas nos pacientes portadores de carcinoma espinocelular, com suas diferentes

apresentações patológicas e o estadiamento conforme a American Joint Comittee of Cancer de

2002. Como todos os pacientes foram passíveis de ressecção cirúrgica não temos representado

T4b, que são tumores avançados com impossibilidade de ressecção cirúrgica. Apresenta um

paciente estadio IVc, pois apresentava metástase à distância. A atividade específica da enzima

em carcinoma espinocelulares variou de 3,4 – 62,1 UAF/min.μg de proteína e para as lesões

benignas variou de 1,8 – 6,2 UAF/min.μg de proteína.

Os resultados da atividade da Catepsina B também foram distribuídos pelo

estadiamento comparativamente com os resultados das amostras de hiperplasia benignas de

mucosa oral. Não obtivemos amostra estadio I. Nos estadios II tivemos um paciente com

atividade enzimática de 14,1 UAF/min/µg de proteína. Obtivemos quatro pacientes estadio III

- 38 -

com variação da atividade enzimática de 3,4 a 26,6 UAF/min/µg. O maior grupo foi o do

estadio IV com 15 pacientes com valores de catepsina B variando de 9,0 a 62,1 UAF/min/µg.

As lesões benignas em número de nove tiveram a atividade da catepsina B variando de 1,8 a

6,2 UAF/min/µg (Tabela 6).

Realizamos um gráfico de dispersão com os resultados da atividade da Catepsina B

nos Estadiamentos conforme AJCC 2002 e com as lesões benignas, observando o padrão de

dispersão dos resultados. Onde nas lesões benignas a atividade se concentrava na base do

gráfico e no estadio IV se dispersava em valores mais elevados (Figura 6).

O valor médio da atividade da Catepsina B e o erro padrão determinado nas lesões

cancerosas foi de 23,5 ± 3,6 UAF/min.μg de proteína e nas lesões benignas o valor médio e

erro padrão foi de 3,4 ± 0,5 UAF/min.μg de proteína. Os dados apresentados mostram que as

lesões cancerosas apresentam cerca de 8 vezes mais atividade enzimática do que as lesões

benignas (Figura 7). O gráfico representa o elevado teor de atividade da Catepsina B nas

lesões malignas comparativamente com as lesões benignas.

A Figura 7 mostra a distribuição de Catepsina B em amostras teciduais provenientes

de lesões benignas (Figs. 8A e 8C) e lesões malignas (Figs. 8B e 8D). A Figura 8 apresenta

cortes teciduais provenientes da mucosa orofaríngea revelados por reações de

imunoistoquímica para Catepsina B em marrom e núcleo celular em azul. As Figs. 8A e 8C,

representativas das lesões benignas, mostram bordas bem delimitadas e em intensa

proliferação epitelial, bem como áreas de tecido conjuntivo íntegro adjacente à hiperplasia. Foi

verificada que a Catepsina B, nas lesões benignas, aparece fracamente marcada em marrom de

localização exclusivamente intracelular em grânulos ao redor do núcleo, sugerindo uma

localização lisossomal perinuclear. As Figs 8B e 8D são representativas de carcinomas

espinocelulares, claramente pode-se observar a presença de tecido epitelial invadindo a matriz

extracelular adjacente ao epitélio tumoral. Ao contrário do padrão de quantidade e localização

celular de catepsina B observada para as lesões benignas, foi verificado que a Catepsina B em

carcinoma espinocelular aparece fortemente marcada em marrom e com localização celular

anômala, pois foi detectada a presença dessa enzima na matriz extracelular. Também as Figs.

8B e 8D mostram que a Catepsina B aparece particularmente concentrada na porção infiltrante

tumoral, região de intensa remodelação do tecido conjuntivo adjacente.

- 39 -

0

5

10

15

20

25

30

1

Cate

psin

aB(

UAF

/min

*ug)

40 - 55 56 - 75

Figura 5. Atividade da Catepsina B em Função da Idade dos Pacientes. Grupo de paciente de 45 a 55 anos apresentou atividade específica de catepsina B igual a 24 ± 5 UAF/min/μg (média ± erro padrão, N=12) e o grupo de 56 aos 75 anos apresentou 23 ± 6 UAF/min/μg (média ± erro padrão, N=08).

- 40 -

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

0 1 2 3 4 5 E I E II E III E IV Benig

Cat

epsi

na B

(UA

F/m

in*u

g)

Figura 6. Atividade Enzimática da Catepsina B em Carcinomas Espinocelulares e Hiperplasias Benignas. A atividade enzimática da catepsina B nos tecidos provenientes da mucosa orofaríngea humana sendo:E I= Estadio I ( Coluna 1, N=0 ), E II= Estadio II (Coluna 2, N = 1), E III= Estadio III ( Coluna 3 , N = 4 ), E IV= Estádio IV ( Coluna 4, N = 15 ) e hiperplasias benignas (Coluna 5, N = 09) foi determinada espectrofluorimetricamente utilizando o substrato fluorigênico Z-FR-MCA. Cerca de 10 μl do homogenato tecidual foram incubados a 37ºC com 5 μM do substrato Z-FR-MCA no tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,3 contendo 200 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2 mM DTT, na presença ou na ausência de 2μM do inibidor irreversível específico da catepsina B, CA-074.

- 41 -

Atividade Média da Catepsina

0

5

10

15

20

25

30

1

UAF

/min

*mcg

de

prot

benignas malignas

Figura 7. Representação gráfica dos valores médios da atividade da Catepsina B Os carcinomas espinocelulares apresentaram atividade específica de catepsina B igual a 23,5 ± 3,6 UAF/min/μg (média ± erro padrão, N=20) e as lesões benignas apresentaram 3,4 ± 0,5 UAF/min/μg (média ± erro padrão, N=09). p <0,05

- 42 -

A B

C D

AA BB

CC DD

Figura 8. Detecção de Catepsina B por Reações de Imunoistoquímica em Carcinomas Espinocelulares e Hiperplasias Benignas. Cortes histológicos de 4 μm de tecidos embebidos em parafina provenientes da mucosa orofaríngea humana foram pré-tratados para recuperação antigênica, conforme descrito em Métodos, e incubados com anticorpo anticatepsina B humano na diluição 1:80. A ligação do anticorpo primário anticatepsina B ao tecido foi monitorada pela adição de anticorpo secundário conjugado com peroxidase. Após reação de peroxidase, as lâminas foram contra-coradas por hematoxilina. As Figs. 8A e 8C representam amostras de hiperplasias benignas, as Figs. 8B e 8D representam amostras de carcinoma espinocelular. Símbolos: a seta indica o epitélio espinocelular, a cruz indica o tecido conjuntivo adjacente e a barra representa a escala de 50 μm. (fonte do Autor)

- 43 -

3.2 Classificação TNM e Região Anatômica

Observando os valores elevados da atividade da Catepsina B nos tumores,

desdobramos os resultados por classificação do Tumor, por presença de Linfonodos

comprometidos, presença de Metástase e localização Anatômica do tumor. Tentamos observar

um padrão de maior ou menor expressão enzimática, o que foi prejudicado pelo N pequeno.

Na Tabela 7 comparamos a classificação T do estadiamento TNM com as lesões

benignas. Nos casos benignos N=9 tivemos uma variação da atividade da Catepsina B de 1,8

a 6,2 UAF/min/μg , obtivemos um paciente T1 com atividade de 15,57 UAF/min/μg , na

classificação T2 tivemos 4 pacientes com atividade enzimática de 3,39 a 48,83 UAF/min/μg

, pacientes T3 em número de 3 com Catepsina B de 5,39 a 26,62 e no grupo classificado com

T4 com N=12 e atividade enzimática de 9,03 a 62,12 UAF/min/μg .

Dividimos em três grupos, grupo A com lesões benignas em número de 9 e atividade

da Catepsina B e erro padrão de 3,4 ± 0,5 UAF/min/μg com Grupo B pacientes com tumores

mais precoces T1, T2 e T3, obtivemos valores de atividade enzimática e erro padrão de 19,8 ±

5,6 UAF/min/μg, N=8 e no Grupo C os tumores avançados T4 com atividade de 25,4 ± 4,9

UAF/min/μg , N=12 (Figura 9).

Há uma forte correlação entre a progressão da doença para uma atividade

metastatizante e o aumento dos valores da atividade da catepsina B. Em lesões benignas a

atividade foi de 3,4 ± 0,5 UAF/min/µg, N = 9. Nos tumores malignos sem metástase os

valores foram de 15 ± 2 UAF/min/µg, N = 8 e nos Tumores com metástase a atividade

enzimática foi de 26 ± 5 UAF/min/µg, N = 9 (Figura 10).

Em relação à metástase à distância, somente tivemos um paciente submetido à

ressecção cirúrgica com presença de metástase à distância. O paciente com a metástase

apresentava um valor alto de atividade da Catepsina B de 48,8 UAF/min/µg.

Na avaliação dos tumores laríngeos dividimos em dois grupos, o primeiro com

pacientes estadio II e III com atidade da Catepsina e erro padrão de 11 ± 4 UAF/min/ug, N=4,

nas lesões mais invasivas estadio IV obtivemos uma atividade de 31 ± 10 UAF/min/ug, N=5

(Figura 11).

Continuando na avaliação das lesões laríngeas dividimos em dois grupos o primeiro

sem metástase e o segundo com, obtivemos resultados sem diferença significativa da

atividade da Catepsina B nos dois grupos. No grupo sem metástase a atividade foi de 16 ± 4

UAF/min/ug, e no grupo com metástase 16 ± 3 UAF/min/ug (Figura 12).

- 44 -

A presença de metástase nas lesões de orofaringe está positivamente correlacionada

com a atividade enzimática da Catepsina B conforme a avaliação dos dois grupos (Figura

13). No grupo sem metástase a atividade foi de 15 ± 3 UAF/min/ug e no grupo com metástase

31 ± 6 UAF/min/ug. Apresentando uma atividade duas vezes maior nas lesões com metástase.

Na Tabela 8 dividimos por regiões anatômicas, onde encontramos uma tendência de

termos valores mais elevados da atividade enzimática nas lesões da Cavidade Oral, sendo na

laringe encontrado o menor valor, porém pertence a um paciente com doença localmente

precoce, e o maior valor em um paciente com doença localmente

invasiva.

0

5

10

15

20

25

30

35

1

Cate

psin

aB(

UAF

/min

*ug)

A B C

Figura 9. Atividade da Catepsina B e Classificação do Tumor. Grupo A, atividade específica de catepsina B nas lesões benignas 3,4 ± 0,5 UAF/min/μg ( N=9). Grupo B, teor de catepsina B nos pacientes com tumores mais precoces T1, T2 e T3 igual a 19,8 ± 5,6 UAF/min/μg ( N=8) e no Grupo C os tumores avançados T4 apresentam 25,4 ± 4,9 UAF/min/μg ( N=12). p <0,05

- 45 -

0

5

10

15

20

25

30

35

A B C

Cate

psin

a B

(UAF

/min

*ug)

Figura 10. Atividade de Catepsina B em Tumores Espinocelulares. Os valores representam a média e o erro padrão da atividade específica de catepsina B presente em tumores do epitélio espinocelular.(A) tumores benignos, hiperqueratose (3,4 ± 0,5 UAF/min.ug, N = 9); (B) tumores sem metástase (15 ± 2 UAF/min/ug, N = 8) e (C) tumores com metástase (26 ± 5 UAF/min/ug, N = 9). p <0,05

- 46 -

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

A B

Cate

psin

a B

(UAF

/min

*ug)

Figura 11. Quantidade de Catepsina B em Relação ao Estadiamento dos Tumores de Laringe. Os valores representam a média e o erro padrão da atividade específica de catepsina B presente em tumores de laringe.(A) tumores em estadios II e III (11 ± 4 UAF/min/ug, N = 4) e (C) tumores em estadio IV (31 ± 10 UAF/min/ug, N = 5). p <0,05

- 47 -

0

5

10

15

20

25

A B

Cate

psin

a B

(UAF

/min

*ug)

Figura 12. Atividade de Catepsina B em Tumores de Laringe. Os valores representam a média e o erro padrão da atividade específica de catepsina B presente nas lesões cancerosas de laringe.(A) tumores sem metástase (16 ± 4 UAF/min/ug, N=4) e (B) tumores com metástase (16 ± 3 UAF/min/ug, N=5).

- 48 -

0

5

10

15

20

25

30

35

40

A B

Cate

psin

a B

(UAF

/min

*ug)

Figura 13. Atividade de Catepsina B em Tumores da Cavidade Orofaríngea. Os valores representam a média e o erro padrão da atividade específica de catepsina B presente nas lesões cancerosas da cavidade orofaríngea.(A) tumores sem metástase (15 ± 3 UAF/min/ug, N=5) e (B) tumores com metástase (31 ± 6 UAF/min/ug, N=6). p <0,05

- 49 -

3.3 Atividade da Heparanase

A expressão quantitativa de heparanase determinada percentualmente nas lâminas de

imuno–histoquímica está apresentada na Tabela IX. A heparanase, em nossos ensaios se

mostrou com uma marcação frágil. Na maioria dos ensaios não houve coloração.

No gráfico de positividade a expressão quantitativa de heparanase foi classificada em

índices de positividade (IP): negativo IP0 (0 a 5%); IP1 ((> 5% a 30% de positividade), IP2 (>

30% a 60%) e IP3 (>60% a 83%), de acordo com MILLON et al. (2001). Não apresentou uma

significativa diferença da imunoexpressão entre as lesões (Tabela 10).

Em oito casos conseguimos uma marcação intensa da heparanase nos tecidos

cancerosos, principalmente na superfície celular e na porção infiltrante tumoral em relação às

lesões benignas. (Figura 14). Nas demais não apresentou nenhuma marcação da

heparanase.

Figura 14 Reações de Imunoistoquímica de Heparanase em Carcinomas Espinocelulares. A imagem da esquerda a lesão teve alta marcação com a heparanase em um carcinoma espinocelular, porém com maior preservação citológica e histológica, menos anaplásico. Na imagem da direita, observamos marcação completamente negativa do epitélio canceroso para a heparanase, e o aspecto dismórfico, anaplásico de desdiferenciação mesenquimal. A ligação do anticorpo primário anti-heparanase ao tecido foi monitorada pela adição de anticorpo secundário conjugado com peroxidase. Após reação de peroxidase, as lâminas foram contra-coradas por hematoxilina. (fonte do Autor)

- 50 -

4 Discussão

O carcinoma espinocelular se origina nas camadas mais profunda do epitélio, e

dependendo de seu grau de diferenciação histológica, cresce rapidamente, invade e destrói os

tecidos adjacentes, segundo os planos de menor resistência, podendo emitir metástase para os

linfonodos da região, ou mais raramente, acometer outros órgãos utilizando-se da via

hematogênica. Conforme mencionados anteriormente, estudos sobre a progressão do câncer

correlacionados aos níveis de catepsina B, têm mostrado que essa enzima freqüentemente

aparece elevada em tumores em estadios invasivos.

Câncer de cabeça e pescoço é uma doença séria, na maioria das vezes sequelante e

incapacitante do indivíduo, que para o ano de 2003 o Instituto Nacional do Câncer estimou

em 10.600 casos novos, somente de Cavidade Oral, com 3200 óbitos. Nos Estados Unidos a

estimativa total de Cânceres de Cabeça e Pescoço para 2003 são de 36500 com 11000 óbitos

(JORNAL A., et al 2003). No nosso grupo observamos uma predominância do sexo

masculino de nove vezes o número de mulheres, acima da média que é de cerca de duas a três

vezes o número de homens a mais do que o de mulheres (SEER,1999). A idade média em

torno dos 55 anos está dentro do esperado, apesar de que vem aumentando a incidência em

pacientes mais novos. Obtivemos 45 % de cânceres de laringe sendo a média em torno de 40

% (Tabela 4). Porém, dentro do estadiamento geral, os lábios entram como lesões de

cavidade oral. Nós não incluímos estes pacientes, pois o mecanismo de cancerização do lábio,

em geral, decorre da exposição solar, diferentemente das lesões de língua e assoalho de boca,

onde o tabagismo e etilismo são os principais causadores. A maior parte dos pacientes foram

operados no estadio IV (Tabela 5), pois normalmente chegam ao serviço público de

referência com tumores avançados, por erros diagnósticos e atraso nas condutas (COLLINS,

et al, 1995).

O Estadiamento pela Classificação TNM (AJCC,2002) apresenta uma grande

vantagem na sua simplicidade, sua universalidade (em qualquer serviço é capaz de realizá-lo)

e garante uma padronização da informação. Porém em suas vantagens encontramos suas

limitações, pois não se levam em conta aspectos histológicos, biológicos do tumor e do

paciente. Podendo ter dois pacientes do mesmo estadiamento com evoluções distintas. Outros

modelos de estadiamentos têm sido propostos, dentre eles os que agregam aspectos biológicos

do tumor. Os pacientes analisados todos foram passíveis de ressecção cirúrgica, não sendo

- 51 -

representados pacientes estadio IVb, que são tumores com critérios locais de inoperabilidade

(pex. invasão de fáscia pré-vertebral).

Em relação à metástase à distância, somente tivemos um paciente submetido à

ressecção cirúrgica com presença de metástase à distância (Classificação IVc). Pacientes com

metástase à distância, são classificados como doença sistêmica, sem controle regional com

cirurgia e radioterapia, não sendo indicada cirurgia pelo grupo, com exceções (por exemplo:

metástase única no pulmão, onde a equipe de tórax irá realizar a ressecção da lesão). Neste

caso em particular, a metástase foi em região inguinal e encontrada no dia da cirurgia, sendo

inicialmente classificada como tumor a se esclarecer.

Quando avaliada a presença de linfonodos comprometidos, observamos uma

apresentação inversa no número de pacientes em relação aos tumores avançados, sendo

encontrados mais pacientes N 0 (N=11) e menos N 3 (N=1), e nos tumores encontramos mais

pacientes T 4 (N=12) do que T 1 (N=1). Isto é decorrente que pacientes com linfonodos N3

(lesões maiores de 6 cm), são menos passíveis de ressecção cirúrgica, porém, normalmente os

pacientes chegam até os serviços públicos de referência com tumores localmente avançados

(COLLINS, et al, 1995).

Encontramos uma larga literatura relacionando a atividade das Cisteíno

proteases e seu envolvimento na metastatização e evolução tumoral, em diversos sítios

conforme mostrado na Tabela 1. Porém foi pouco estudada em Cânceres de Cabeça e

Pescoço (SIEWISKI, et al 1992: RUSSO, et al 1995). Contudo, apesar de poucos, estes

trabalhos observam uma correlação positiva entre a gravidade das lesões com estadiamentos

avançados e a atividade aumentada da catepsina. Os resultados obtidos por nós confirmam

uma correlação positiva entre o estadiamento avançado com maior positividade da atividade

da Catepsina B em comparação com as lesões benignas (Figura 7).

Dividimos em dois grupos em relação à idade dos pacientes, pois há uma impressão

entre os cirurgiões que em pacientes mais jovens os tumores são mais agressivos (não tendo

base estatística), não encontramos diferenças entre os dois grupos (Figura 5).

Observamos que na presença de metástases há um aumento significativo da catepsina.

Como o mecanismo de metastatização ocorre com invasão das estruturas adjacentes, e a

catepsina é uma enzima proteolítica relacionada a invasibilidade tumoral, o seu aumento é um

fator de marcação da capacidade metastatizante do tumor. O mesmo foi observado por

Watanabe em carcinoma de cólon. Poderíamos argumentar que ela só se eleva quando já

ocorreu a metástase, porem o material foi colhido da lesão tumoral primária, sendo uma

característica do tumor e não da metástase(Figura 10).

- 52 -

Sabendo-se que o principal fator prognóstico do tumor é sua metastatizaçao, drogas

inibidoras da catepsina poderiam diminuir esta capacidade facilitando o controle local do

tumor.

Dividimos em dois grupos os tumores laríngeos, um grupo estadio II e estadio III, e

outro estadio IV. Observa-se que as lesões avançadas apresentam atividade aumentada em

relação a lesões menos invasivas de cerca de três vezes (Figura 11). A catepsina é

participante dos processos invasivos, e os resultados confirmam o esperado mostrando seu

significativo aumento neste tipo de tumores, participando do processo remodelação e invasão

tecidual que foi confirmada pela imunoistoquímica onde observamos a Catepsina B em

carcinoma espinocelular fortemente marcada em marrom e com localização celular anômala,

pois foi detectada a presença dessa enzima na matriz extracelular (Figura 8).

Em contraste com as avaliações gerais de atividade de catepsina B, quando analisamos

especificamente a presença de metástase ou não em tumores de laringe não observamos uma

diferença na atividade enzimática (Figura 12). Tumores de laringe apresentam uma

característica menos metastatizante que das outras localizações, porém apresentam uma

agressividade local grande. Isto decorre da anatomia laríngea, que na região glótica apresenta

uma menor rede linfática, e o cone elástico que funciona com uma barreira para a invasão

tumoral. Em contrapartida há um espaço muito pequeno separando a mucosa da cartilagem.

Tumores glóticos de comissura anterior podem evoluir rapidamente de um T2 para T4 com

invasão cartilaginosa (WELSH LW., et al, 1984). Conforme já avaliamos há uma correlação

positiva da atividade enzimática e as progressões locais do tumor, que nos nossos dados

sugerem ser mais importante na secreção enzimática na laringe do que a capacidade de

metastatização.

Diferentemente das lesões laríngeas, nas lesões de orofaringe e cavidade oral há um

significativo aumento da atividade da Catepsina B nas lesões metastáticas em relação às sem

metástase linfonodal (Figura 13). Conforme o descrito acima acredito no aspecto anatômico

possa estar influenciando, contudo não posso descartar que aspectos biomoleculares do tumor

laríngeo levem a uma produção semelhante de Catepsina B nos tumores com e sem

metástase. E nas demais regiões aumento nas lesões metastatizadas (CLOSE LG ,1987).

Pode-se especular que a secreção aumentada da catepsina é uma conseqüência da

progressiva desdiferenciação tumoral e sua capacidade de invasão.

Como informado anteriormente a heparanase promove a degradação de cadeias de

heparam sulfato dos proteoglicanos que são componentes da matriz extracelular e da

membrana basal. Em tumores, a heparanase pode facilitar a invasão de células tumorais e

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metástases pela degradação da membrana basal vascular e matriz extracelular (NURCOMBE

., 2000; VLODAVSKI., 1999). O mecanismo de inserção da catepsina B na membrana

plasmática, bem como seu tráfego celular, devem ser dependente de proteoglicanos de

heparam sulfato e a liberação de catepsina B da superfície celular pode estar relacionada com

a atividade da heparanase

As imagens de imunoistoquímica apresentam uma grande marcação para

Catepsina B, não só intralisossomal perinuclear, mas principalmente aparece concentrada na

porção infiltrante tumoral, região de intensa remodelação do tecido conjuntivo adjacente.

Esses dados sugerem que a Catepsina B pode estar participando do processo de degradação da

matriz extracelular e facilitando a infiltração do tumor epitelial no mesênquima (Figura 8).

Em relação a Heparanase não encontramos uma marcação intensa, sendo em apenas

oito casos positivos. Em todos demais casos a marcação no tecido tumoral foi totalmente

negativa (Figura 14).

O índice de positividade foi baixo, não apresentando diferença significativa entre as

lesões benignas e malignas (Tabela 10). Mesmo após repetições dos ensaios os resultados não

se alteraram. O número de casos pequeno poderia ser o fator determinante, se não fosse a

grande maioria dos casos negativa. Encontramos em alguns casos tecidos glandulares

positivos, podendo ser a heparanase um marcador melhor para tumores de origem glandular

do que de linhagem epitelial. Porém, a literatura já apresenta trabalhos correlacionando

evolução tumoral de carcinoma espinocelulares e níveis de heparanase.

A Heparanase, em nosso estudo, não se mostrou um marcador das lesões cancerosas

ou da desdiferenciação celular. Na verdade a heparanase foi detectada nas células tumorais

que ainda preservavam as características das células epiteliais e não nas células tumorais mais

desdiferenciadas. Recentemente (DOVINER et al., 2006), foi demonstrando que durante o

processo de malignização das células epiteliais de cólon, ocorre uma grande alteração do

padrão de expressão da heparanase ativa (50 kDa), de modo geral foi verificado que as células

menos displásicas dos tumores, bem como as células normais apresentavam elevados teores

da forma ativa da enzima, enquanto que as células tumorais mais displásicas e mais

desdiferenciadas do tumor apresentavam baixíssimas quantidade da enzima ativa e elevada

quantidade da enzima inativa, a pró-heparanase (65 kDa). Esses resultados sugerem que a

transformação epitélio-mesenquimal (DECLERCK et al, 2004), observada no processo de

malignização das células espinocelulares leva ao decréscimo da quantidade de heparanase

ativa nos tecidos tumorais. Esses dados indicam que a heparanase pode ser um marcador da

diferenciação celular nas células epiteliais. As células embrionárias apresentam elevados

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teores dos glicosaminoglicanos condroitim-sulfato e ácido hialurônico durante o período

embrionário, e baixos teores desses glicosaminoglicanos durante a fase de diferenciação

celular. A presença do proteoglicano de heparam sulfato só ocorre na fase embrionária

durante a diferenciação celular (SAMPAIO et al, 1981). Interessantemente, os tumores

perdem os proteoglicanos de heparam sulfato (INKI et JALKANEN, 1996; SAMPAIO et al,

1977) e ganham os de condroitim sulfato, bem como, o ácido hialurônico (DIETRICH et al,

1993). Esse fato parece ser característico da transformação epitélio-mesenquimal observado

durante o processo de malignização. Assim sendo, parece que o decréscimo da quantidade de

heparanase observada na transformação epitélio-mesenquimal correlaciona com a diminuição

da quantidade do proteoglicano de heparam sulfato observado nos tecidos tumorias. Esses

resultados sugerem que os proteoglicanos de heparam sulfato controlam positivamente a

biossíntese da heparanase. A perda de heparam sulfato observada nos tecidos tumorais

aparentemente não está ligada ao aumento da enzima heparanase, mais sim a alterações de

enzimas envolvidas na biossíntese desses glicosaminoglicanos durante o processo de

desdiferenciação celular observado nos tumores. Outro fato importante da perda de heparam

sulfato da superfície celular é a disseminação de catepsina B para a matriz extracelular,

conforme mencionado previamente o heparam sulfato pode ancorar a catepsina B na

superfície celular e promover sua endocitose. Assim sendo, a deficiência de proteoglicanos da

superfície celular das células tumorais facilita a difusão de catepsina B para a matriz

extracelular e sua subseqüente degradação. Também, é conhecido que a enzima catepsina B

quando secretada para o meio extracelular é capaz de degradar várias proteínas da matriz

extracelular, inclusive o proteoglicano de heparam sulfato. Assim a presença dessa proteinase

na matriz pode modular a biossíntese da enzima heparanase, pela degradação do

proteoglicano de heparam sulfato. Como já observado anteriormente, o processo de

desenvolvimento tumoral, a desdiferenciação epitélio-mesenquimal, possui características

similares ao processo da embriogênese.

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5 Conclusões e Sugestões

A Catepsina B é um bom marcador da malignidade e da evolução dos carcinomas

espinocelulares de cabeça e pescoço. Apresenta uma correlação positiva entre os estadios

avançados e os níveis de atividade enzimática.

Especificamente nas lesões laríngeas, a atividade da Catepsina B é mais acentuada e

determinada no processo de invasibilidade local do que nos processos de metastatização.

Nas lesões de orofaringe a característica metastatizante parece ser mais determinante

do que a invasibilidade local nas elevações mais acentuadas da atividade enzimática.

A Catepsina B está correlacionada com a degradação da matriz celular, com os dados

obtidos concluímos que ela está participando do processo de invasibilidade local do câncer e

de sua metastatização. E, sua produção e atividade são progressivamente maiores com a

desdiferenciação celular, ou seja, na transformação epitélio-mesenquimal observadas nas

células tumorais durante o processo de malignização (DECLERCK et al, 2004). O

desenvolvimento de inibidores específicos da Catepsina B pode ser importante para a

diminuição da invasibilidade e da metastatização do câncer. Sendo esta, em geral, o principal

fator prognóstico da doença, o seu controle seria um fator determinante na sobrevida dos

pacientes.

No nosso estudo, diferentemente da literatura ou do esperado na elaboração do

projeto, a heparanase não foi um marcador significativo das lesões malignas, ou da progressão

tumoral. A desdiferenciação tumoral com sua transformação epitélio – mesenquimal, com

perda de proteoglicanos de heparam sulfato, promovem uma diminuição da biossíntese da

heparanase. Desta forma a heparanase se mostrou um marcador de células diferenciadas.

Estudos subseqüentes e a continuação das análises da heparanase em carcinomas

espinocelulares de cabeça e pescoço poderiam confirmar ou alterar nosso trabalho.

Os dados obtidos em conjunto mostraram que a desdiferenciação tumoral aumenta a

atividade e expressão da Catepsina B e diminui a expressão da Heparanase.

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Anexo – Comitê de Ética

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Apêndice A - TERMO DE LIVRE CONSENTIMENTO ESCLARECIDO

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Prezado Paciente O projeto de pesquisa intitulado: “Estudo da Catepsina B e da Heparanase em Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço” dos autores Emílio López Couto, Profª Drª Maria A. da Silva Pinhal e Prof. Dr . Ivarne L. S. Tersariol tem por objetivo auxiliar o diagnóstico de tumores de cabeça e pescoço, bem como avaliar o grau de gravidade da doença. Se obtivermos resultados favoráveis, poderemos contribuir para detecção precoce do câncer e conhecer melhor como estas doenças evoluem no nosso organismo. Baseado nestas informações poderemos melhorar o modo de tratamento destes tumores. Desta forma, necessitamos obter acesso às amostras de sangue e de tecidos tumorais provenientes de Cirurgias de Cabeça e Pescoço, que serão realizadas no Hospital Estadual Mário Covas – santo André, SP. Bem como, precisamos também obter informações contidas no seu prontuário médico. Informamos que a coleta de amostras de tecidos tumorais não acarretará em danos maiores do que aqueles promovidos pelo procedimento cirúrgico de remoção do tumor. O paciente submetido à cirurgia será acompanhado pela equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Estadual Mário Covas – Santo André. Todas as informações sobre a doença e possíveis seqüelas cirúrgicas serão fornecidas pela equipe cirúrgica. Comprometemos manter o sigilo das informações coletadas e o anonimato das pessoas cujos materiais biológicos e documentos médicos forem consultados, também garantimos que as informações colhidas serão utilizadas exclusivamente para o cumprimento do propósito deste projeto de pesquisa. O paciente em qualquer momento da pesquisa poderá retirar o livre consentimento e automaticamente seus dados serão retirados do trabalho em questão, sem que isto lhe acarrete ônus de qualquer espécie. Eu,_____________________________________________ Identidade________________ R:_________________________, nº__________, CEP_____________________________ Cidade_______________________________________Tel__________________________ fui claramente informado sobre os propósitos deste projeto de pesquisa e voluntariamente aceito a participar desta pesquisa. _________________________________________________________________________

Emílio López Couto, Cirurgião de Cabeça e Pescoço – Hospital Estadual Mário Covas – Fundação ABC, Santo André, SP

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Apêndice B - Tabelas

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Tabela 4: Patologia, Estadio, Sexo e Idade dos Pacientes

Amostra Patologia Estadio Sexo Idade 1 T4aN2BM0 Cavidade Oral IVa masc 42

2 T4aN0M0 Larringe IVa masc

60 3 T3N1M0 Laringe III masc

60

4 T4aN2bM0 Hipofaringe IVa masc

54 5 T4aN0M0 Laringe IVa masc 54 6 T2N0M1 de Cavidade Oral IVc masc 49 7 T3N1M0 Orofaringe III masc 50

8 T4aN0M0 Cavidade Oral IVa masc

66 9 T4aN0M0 Laringe IVa masc 71

10 T4aN0M0 Orofaringe IVa masc

55 11 T4aN0M0 Orofaringe IVa masc 51 12 T4aN2cM0 Hipofaringe IVa masc 70 13 T1N3M0 Laringe IVb masc 62

14 T4aN2bM0 Laringe IVa masc

60 15 T2N2M0 Orofaringe IVa masc

47

16 T4aN0M0 Laringe IVa fem

51 17 T2N1M0 Laringe III masc 64 18 T2N0M0 Orofaringe II masc 55 19 T4aN0M0 Laringe IVa masc 45

20 T3N0M0 Orofaringe III fem

52

As amostras foram coletadas no período Julho de 2004 a Fevereiro de 2006. Estadiamento conforme a padronização da American Joint Comittee of Cancer de 1988 e União Internacional de Combate ao Câncer, revisada de 2002

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Tabela 5: Atividade da Catepsina B, Estadiamento e Patologia

Resultados da atividade enzimática correlacionando com a patologia e o estadiamento dos pacientes portadores de carcinoma espinocelular. Os valores estão expressos em atividade específica de catepsina B (UAF/min/µg de proteína )

Amostra Patologia Estadio Atividade Catepsina

UAF/min*µg

1 T4aN2BM0 Cavidade Oral IVa 46,51

2 T4aN0M0 Laringe IVa 48,57 3 T3N1M0 Laringe III 20,69 4 T4aN2bM0 Hipofaringe IVa 19,72 5 T4aN0M0 Laringe IVa 16,71 6 T2N0M1 de Cavidade Oral IVc 48,83 7 T3N1M0 Orofaringe III 26,62 8 T4aN0M0 Cavidade Oral IVa 17,14 9 T4aN0M0 Laringe IVa 62,12

10 T4aN0M0 Orofaringe IVa 23,32 11 T4aN0M0 Orofaringe IVa 14,84 12 T4aN2cM0 Hipofaringe IVa 12,13 13 T1N3M0 Laringe IVb 15,57 14 T4aN2bM0 Laringe IVa 11,83 15 T2N2M0 Orofaringe IVa 30,63 16 T4aN0M0 Laringe IVa 23

17 T2N1M0 Laringe III 3,39 18 T2N0M0 Orofaringe II 14,1 19 T4aN0M0 Laringe IVa 9,03

20 T3N0M0 Orofaringe III 5,39

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Tabela 6: Atividade da Catepsina B nas Lesões Benignas e nos Diferentes Estadiamentos dos Cânceres

Estadio II Estadio III Estadio IV Estadio I

Benignas (UAF/min*µg de prot)

(UAF/min*µg de prot)

(UAF/min*µg de prot)

(UAF/min*µg de prot) (UAF/min*µg de prot)

14,1 3,39 9,03 1,8

5,39 11,83 2,1

20,69 12,13 2,32

26,62 14,84 2,45

15,57 3,37

16,71 3,52

17,14 4,42

19,72 5,62

23 6,2

23,32

30,63

46,51

48,57

48,83

62,12

Resultados da Atividade Enzimática da Catepsina B em relação ao estadiamento dos pacientes com cânceres de cabeça e pescoço e das lesões benignas da cavidade oral. Os valores estão expressos em atividade específica de catepsina B (UAF/min/µg de proteína).

- 73 -

Tabela 7: Expressão Enzimática da Catepsina B e a Classificação do Tumor.

Benignas T1 T2 T3 T4 (UAF/min*µg de

prot) (UAF/min*µg de

prot) (UAF/min*µg de

prot) (UAF/min*µg de

prot) (UAF/min*µg de

prot)

1,8 15,57 3,39 5,39 9,03

2,1 14,1 20,69 11,83

2,32 30,63 26,62 12,13

2,45 48,83 14,84

3,37 16,71

2,52 17,14

4,42 19,72

5,62 23

6,2 23,32

46,51

48,57

62,12

Utilizou – se o Estadiamento conforme a padronização da American Joint Comittee of Cancer de 1988 e União Internacional de Contra o Câncer, revisada de 2002 . Os valores estão expressos em atividade específica de catepsina B (UAF/min/µg de proteína).

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Tabela 8: Expressão Enzimática da Catepsina B nas Diferentes Regiões

Anatômicas

Cavidade Oral Laringe Hipofaringe Orofaringe (UAF/min*µg de prot) (UAF/min*µg de prot) (UAF/min*µg de prot) (UAF/min*µg de prot)

17,14 5,39 3,39 12,13

46,51 14,1 9,03 19,72

48,83 14,84 11,83

23,32 15,57

26,62 16,71

30,63 20,69

23

48,57

62,12

Os valores estão expressos em atividade específica de catepsina B (UAF/min/µg de proteína).

- 75 -

Tabela9: Expressão Quantitativa de Heparanase, Estadiamento e Patologia

Estadiamento conforme a padronização da American Joint Comittee of Cancer de 1988 e União Internacional de Combate ao Câncer, revisada de 2002 e porcentagem de expressão imunoistoquímica.

Amostra Patologia Estadio Heparanase 1 T4aN2BM0 Cavidade Oral IVa 29,78 2 T4aN0M0 Laringe IVa 43,95 3 T3N1M0 Laringe III 70,81 4 T4aN2bM0 Hipofaringe IVa 29,88 5 T4aN0M0 Laringe IVa 42,76 6 T2N0M1 de Cavidade Oral IVc 48,72 7 T3N1M0 Orofaringe III 34,96

25,31 8 T4aN0M0 Cavidade Oral IVa 9 T4aN0M0 Laringe IVa -------

10 T4aN0M0 Orofaringe IVa ------- 11 T4aN0M0 Orofaringe IVa ------- 12 T4aN2cM0 Hipofaringe IVa ------- 13 T1N3M0 Laringe IVb ------- 14 T4aN2bM0 Laringe IVa ------- 15 T2N2M0 Orofaringe IVa ------- 16 T4aN0M0 Laringe IVa ------- 17 T2N1M0 Laringe III ------- 18 T2N0M0 Orofaringe II ------- 19 T4aN0M0 Laringe IVa ------- 20 T3N0M0 Orofaringe III -------

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Tabela 10: Classificação quantitativa da Heparanase por Índice de Positividade

Heparanase Total IP0 IP1 IP2 IP3

Lesões Benignas

6 3 0 0 9

Carcinoma Espinocelular

12 3 4 1 20

IP0 (0 a 5%); IP1 ((> 5% a 30% de positividade), IP2 (> 30% a 60%) e IP3 (>60% a 83%)

A expressão quantitativa de heparanase foi classificada em índices de positividade (IP): negativo IP0 (0 a 5%); IP1 ((> 5% a 30% de positividade), IP2 (> 30% a 60%) e IP3 (>60% a 83%), de acordo com MILLON et al. (2001) Oral Oncol.. 37, 620-631. Para análise estatísticas, a significância foi verificada pelo teste de Chi-quadrado (χ2).

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