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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo
ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL
RENATA HAGE AMARAL
Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Materiais Orientador: Dr. Ademar Benvolo Lugo
SO PAULO 2009
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo
ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL
RENATA HAGE AMARAL
Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Materiais Orientador: Dr. Ademar Benvolo Lugo
SO PAULO 2009
Este trabalho dedicado a todas as pessoas que
participaram de sua realizao.
Aos meus pais, David e Wilma, pelo apoio e pacincia.
Aos meus queridos amigos, pela fora e incentivo
que me deram durante este perodo.
Agradecimentos
Ao Dr. Lugo, obrigada pela oportunidade e apoio durante a realizao
deste projeto.
Sizue Ota Rogero, muito obrigada por todo apoio, incentivo e disposio
em me ajudar e ensinar nos momentos em que precisei de seus conhecimentos.
Ao Dr. Jos Roberto Rogero, obrigada pelo importante suporte dado
durante a realizao desta pesquisa.
Dra. urea S. Cruz e Rezolina Pereira dos Santos, do Instituto Adolfo
Lutz, muito obrigada pelo esforo em nos fornecer as micoplacas.
Ao Dr. Patrick Spencer, obrigada pela colaborao e apoio na parte
experimental deste trabalho.
Ao Dr. Jorge Sarkis e Helena Miho Shihomatsu pelo suporte e apoio dado
na parte experimental deste projeto.
Aos meus amigos Souza, Mara, Roberta, Carolina e Sirlene, do Laboratrio
de Biomateriais IPEN, muito obrigada pelo carinho, apoio e comprrenso.
ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL
Renata Hage Amaral
RESUMO
Os hidrogis esto dentre as matrizes polimricas mais utilizadas em tecnologia farmacutica em razo de sua vasta aplicao e funcionalidade, especialmente em sistema de liberao de frmacos. Tendo em vista o grande avano nas inovaes dos produtos cosmticos, tanto por meio da introduo de novos princpios ativos quanto pelas matrizes utilizadas para liberao controlada dos mesmos, o objetivo deste trabalho foi incorporar e avaliar a liberao de um princpio ativo natural, o ArctAlg, em membranas de hidrogel, de modo a obter um dispositivo de liberao para fins cosmticos. O ArctAlg um extrato aquoso que possui uma excelente ao anti-oxidante, lipoltica, anti-inflamatria e citoestimulante. Foi realizado o estudo das propriedades mecnicas, fsico-qumicas e a biocompatibilidade in vitro das membranas de hidrogis de poli(vinil-2- pirrolidona) (PVP) e poli(vinil lcool) (PVA) obtidas pela reticulao por radiao ionizante. A caracterizao fsico-qumica das matrizes polimricas foi obtida pelos ensaios de frao gel e intumescimento e o de biocompatibilidade in vitro pelo ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro. No ensaio de frao gel tanto o hidrogel de PVP quanto o de PVA apresentaram um alto grau de reticulao. O hidrogel de PVP apresentou uma maior porcentagem de intumescimento em relao ao de PVA e no ensaio de citotoxicidade os hidrogis mostraram-se atxicos. A propriedade citoestimulante do ArctAlg foi verificada no ensaio de citoestimulao com clulas fibroblsticas de pele de coelho, em que foi evidenciado um aumento de cerca de 50% das clulas quando em contato com 0,5% do princpio ativo. As membranas de hidrogel preparadas com 3% de ArctAlg foram submetidas ao ensaio de liberao em incubadora a 37C e as alquotas coletadas durante o ensaio foram quantificadas por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Os resultados obtidos na cintica de liberao mostraram que as membranas de hidrogel de PVP liberaram cerca de 50% do ArctAlg incorporado e as de PVA em cerca de 30%. No ensaio de citoestimulao do ArctAlg liberado, o dispositivo de PVP apresentou um aumento em cerca de 80% da populao celular em relao ao controle do ensaio, mostrando ser o dispositivo mais indicado para ser utilizado em processos de reparao cutnea.
IMMOBILIZATION AND RELEASE STUDY OF A RED ALGA EXTRACT IN HYDROGEL MEMBRANES
Renata Hage Amaral
ABSTRACT
In pharmaceutical technology hydrogel is the most used among the polymeric matrices due to its wide application and functionality, primarily in drug delivery system. In view of the large advance innovations in cosmetic products, both through the introduction of new active agents as the matrices used for its controlled release, the objective of this study was to evaluate the release and immobilization of a natural active agent, the Arct'Alg in hydrogel membranes to obtain a release device for cosmetics. Arct'Alg is an aqueous extract which has excellent anti-oxidant, lipolytic, anti-inflammatory and cytostimulant action. Study on mechanical and physical-chemical properties and biocompatibility in vitro of hydrogel membranes of poly(vinyl-2- pyrrolidone) (PVP) and poly(vinyl alcohol) (PVA) obtained by ionizing radiation crosslinking have been performed. The physical-chemical characterization of polymeric matrices was carried out by gel fraction and swelling tests and biocompatibility by in vitro test of cytotoxicity by using the technique of neutral red incorporation. In the gel fraction test, both the PVP and PVA hydrogel showed a high crosslinking degree. The PVP hydrogel showed a greater percentage of swelling in relation to PVA and the cytotoxicity test of the hydrogels showed non-toxicity effect. The cytostimulation property of Arct'Alg was verified by the cytostimulation test with rabbit skin cells, it was showed an increase at about 50% of the cells when in contact with 0,5% of active agent. The hydrogel membranes prepared with 3% of Arct'Alg were subjected to the release test in an incubator at 37C and aliquots collected during the test were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results obtained in the kinetics of release showed that the PVP hydrogel membranes released about 50% of Arct'Alg incorporated and the PVA hydrogel membranes at about 30%. In the cytostimulation test of released Arct'Alg, the PVP device showed an increase at about 80% of cell population in relation of test control, showing to be the greater device to be used in processes of skin repair.
SUMRIO
Pgina 1 INTRODUO 10 2 OBJETIVOS 12 3 REVISO DA LITERATURA 13 3.1 Pele humana 13
3.1.1 Epiderme 14
3.1.2 Derme 16
3.1.3 Vascularizao da pele 17
3.2 Cicatrizao 18
3.3 Polmeros 20
3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros 20
3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros 22
3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros 25
3.3.4 Hidrogis 27
3.3.5 Poli(vinil lcool) 29
3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona) 30
3.3.7 gar 32
3.3.8 Poli(etilenoglicol) 32
3.4 Arctalg 33
3.5 Sistema de liberao de frmacos 34
3.6 Citotoxicidade 39
3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno 40
4 MATERIAIS E MTODOS 42 4.1 Materiais 42
4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes de hidrogel 42
4.1.2 Princpio ativo 42
4.2 Mtodos 42
4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel 42
4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel 43
4.2.2.1 Frao Gel 43
4.2.2.2 Intumescimento 44
4.2.2.3 Propriedades mecnicas 45
4.2.2.4 Citotoxicidade 46
4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel 47
4.2.3.1 Citoestimulao 47
4.2.3.2 Estudo do comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado 51
4.2.3.3 Incorporao do ArctAlg na matriz de hidrogel 52
4.2.4 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg 53
4.2.5 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado 53
5 RESULTADOS E DISCUSSO 55 5.1 Obteno das matrizes de hidrogel 55
5.2 Caracterizao da matriz de hidrogel 56
5.2.1 Frao Gel 56
5.2.2 Intumescimento 57
5.2.3 Citotoxicidade 59
5.2.4 Propriedades Mecnicas 61
5.3 Citotoxicidade do ActAlg 64
5.4 Citoestimulao 65
5.6 Estudo do comportamento do dipeptdeo irradiado 67
5.7 Obteno do dispositivo de hidrogel 69
5.8 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg 70
5.9 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado 79
6 CONCLUSO 81 7 APNDICE 82 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 91
LISTA DE FIGURAS Pgina
FIGURA 1. Camadas da pele 13 FIGURA 2. Camadas da epiderme 14
FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares 17
horizontais: superficial e profundo
FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao 23
FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal 24
FIGURA 6. Poli(vinil lcool) 29
FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona) 30
FIGURA 8. Formao do radical polimrico 31
FIGURA 9. Poli(etilenoglicol) 33
FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina 34
FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo 35
FIGURA 12. Extrator de Soxhlet 44
FIGURA 13. Texturmetro da Micro System 45
FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle 47
na microplaca.
FIGURA 15. Esquema da distribuio das diferentes concentraes de 50
ArctAlg na microplaca 3.
FIGURA 16. Sistema de HPLC da Shimadzu 52
FIGURA 17. Matriz de hidrogel de PVP 55
FIGURA 18. Matriz de hidrogel de PVA 56
FIGURA 19. Perfil de intumescimento dos hidrogis de PVP e PVA 59
FIGURA 20. Curvas de viabilidade celular dos hidrogis de PVP e PVA 60
no ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro
FIGURA 21. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVP 62
FIGURA 22. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVA 62
FIGURA 23. Curvas de viabilidade celular do ArctAlg 65
FIGURA 24. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg 66
FIGURA 25. Cromatograma do citrulil-arginina irradiado 68
FIGURA 26. Cromatograma do citrulil-arginina no-irradiado 68
FIGURA 27. Dispositivo de hidrogel de PVA 70
FIGURA 28. Dispositivo de hidrogel de PVP 70
FIGURA 29. Cromatograma da soluo padro de citrulil-arginina 71
FIGURA 30. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo 72
de PVP contendo ArctAlg aps 1h de liberao.
FIGURA 31. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVP 72
FIGURA 32. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo 73
de PVA contendo ArctAlg aps 1h de liberao
FIGURA 33. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVA 73
FIGURA 34. Cromatograma da anlise em HPLC do dispositivo de 74
PVA contendo citrulil-arginina
FIGURA 35. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg do 76
dispositivo de PVP
FIGURA 36. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no 77
ArctAlg do dispositivo de PVA
FIGURA 37. Viabilidade celular do ArctAlg liberado na primeira 79
hora dos dispositivos de hidrogis de PVP e PVA
FIGURA 38. Viabilidade celular em funo da concentrao de 82
ArctAlg em microplaca contendo 200.000 cls/mL
FIGURA 39. Viabilidade celular em funo da concentrao de 83
ArctAlg em microplaca contendo 180.000 cls/mL
FIGURA 40. Viabilidade celular em funo da concentrao de 84
ArctAlg em microplaca contendo 150.000 cls/mL
FIGURA 41. Viabilidade celular em funo da concentrao de 85
ArctAlg em microplaca contendo 100.000 cls/mL
FIGURA 42. Viabilidade celular em funo do uso de MEM com 86
diferenetes concentraes de SFB
FIGURA 43. Viabilidade celular em funo da concentrao de
SFB no MEM + L-15 87
FIGURA 44. Viabilidade celular em funo da concentrao de
ArctAlg com incubao da microplaca por 24h 88
FIGURA 45. Viabilidade celular em funo da concentrao de
ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 1 89
FIGURA 46. Viabilidade celular em funo da concentrao de
ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 2 90
10
1 INTRODUO
Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela
hidrofilicidade e insolubilidade em gua (Kudela, 1990).
Os hidrgeis tm despertado grande interesse devido apresentarem
caractersticas interessantes como, por exemplo, a biocompatibilidade. A utilidade
dos hidrogis como biomateriais encontra-se na similaridade de suas
propriedades fsicas com aquelas dos tecidos vivos, fazendo-os teis para uma
grande variedade de aplicaes biomdicas, como curativos, implantes, lentes de
contato, matriz para imobilizao de enzimas e sistemas de liberao controlada
e/ou sustentada de princpios ativos (Peppas, 1996).
Bandagem de hidrogel base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e
poli(etilenoglicol) (PEG) foi originalmente inventada como curativo para o
tratamento de queimadura por Rosiak e colaboradores (1989). No entanto,
atualmente, este sistema polimrico amplamente aplicado como sistema de
liberao de frmacos entre outros. O sucesso desses sistemas est relacionado
com as propriedades da matriz e a tecnologia de fabricao das mesmas.
Inicialmente os sistemas de liberao de frmacos foram desenvolvidos
para rotas tradicionais de administrao, como oral e intravenoso, porm,
recentemente ocorreu um aumento nas pesquisas que visam utilizao de rotas
consideradas no tradicionais como nasal, ocular, pulmonar, vaginal, retal e
transdrmica (ZHANG et al., 2004).
Durante dcadas a pele tem sido utilizada como via de administrao
de substncias dermatologicamente ativas, ou seja, com ao farmacolgica nos
tecidos da pele. Nessas terapias considera-se que as molculas do frmaco
difundem-se para o tecido no local da aplicao para produzir seus efeitos
teraputicos (Chien, 1987).
Uma das principais aplicaes das membranas de hidrogel sobre o
tecido cutneo lesionado, por serem flexveis, no txicas e possibilitarem a
aplicao tpica de frmacos por meio da membrana (Rosiak, 1991).
11
Tendo em foco o desenvolvimento de um novo produto para a
regenerao cutnea, na rea cosmtica, este trabalho teve por objetivo o estudo
da incorporao e liberao de um princpio ativo natural, o ArctAlg, em
membranas de hidrogel. Este princpio ativo foi escolhido por possuir em sua
composio o dipeptdeo citrulil-arginina que apresenta propriedades biolgicas
como ao anti-oxidante, citoestimulante, lipoltica e anti-inflamatria. A escolha
de hidrogis de PVP e PVA como matrizes para incorporar e liberar este princpio
ativo foi motivada pela comprovada biocompatibilidade e alto grau de
intumescimento dos mesmos. Partindo do pressuposto de que o princpio ativo
no se liga ao polmero, realizou-se o ensaio de liberao do ArctAlg a partir dos
hidrogis para verificar o seu perfil de liberao e uma possvel viabilidade
comercial deste dispositivo.
12
2 OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi o estudo da incorporao do
ArctAlg em membranas de hidrogel de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e poli(vinil
lcool) (PVA) obtidas pela radiao ionizante e cintica de liberao do mesmo.
Para alcanar este objetivo foram realizadas as seguintes etapas:
Caracterizar o hidrogel de PVP e PVA;
Estudar a incorporao do ArctAlg na matriz polimrica;
Analisar a liberao in vitro do ArctAlg;
Verificar in vitro a propriedade de citoestimulao do ArctAlg em cultura
de clulas fibroblsticas.
13
3 REVISO DA LITERATURA
3.1 Pele humana
A pele o maior rgo do corpo humano, ocupando rea mdia de 2
m2, o que corresponde a cerca de 10 a 15% do peso total corporal (Leonardi &
Matheus, 2008). Ela formada por tecidos de origem ectodrmica e mesodrmica
que se arranjam em trs camadas distintas: a epiderme, a derme e a hipoderme.
Esta ltima no considerada por muitos autores como parte integrante da pele,
embora seja estudada dentro do sistema tegumentar (Sousa & Vargas, 2004).
As camadas da pele humana esto ilustradas na FIG. 1
FIGURA 1. Camadas da pele.
O tegumento, mesmo sem restringir a maleabilidade do corpo humano,
constitui uma barreira eficiente contra agresses exgenas, de natureza qumica
ou biolgica e impede a perda de gua e de protenas para o exterior. A pele
tambm age como rgo sensorial, participa do sistema imunolgico e exerce
outras funes, como a regulao da temperatura corprea, a produo de
vitamina D3, a excreo de eletrlitos e outras substncias e confere uma
proteo relativa para os rgos internos (Sousa & Vargas, 2004).
14
A espessura da pele varia dependendo da rea do corpo, sendo a pele
mais espessa encontrada nas regies sujeitas a presses e atritos constantes
(Ribeiro, 2006).
3.1.1 Epiderme
A epiderme, de origem ectodrmica, um epitlio de revestimento
estratificado e pavimentoso por possuir vrias camadas de clulas que vo se
achatando medida que se tornam mais superficiais. Como todo epitlio, as
clulas da epiderme se renovam indefinidamente devido a uma atividade mittica
contnua. A principal funo da epiderme produzir queratina, uma protena
fibrosa malevel, responsvel pela impermeabilidade cutnea, e as clulas que
esto envolvidas nesta funo so denominadas queratincitos (Sousa & Vargas,
2004).
As camadas que formam a epiderme so conhecidas como basal,
espinhosa, granulosa e crnea (FIG. 2). Uma quinta camada, a lcida,
encontrada entre as camadas crnea e granulosa na palma das mos e sola dos
ps, conferindo maior espessamento da pele nestas regies (pele espessa), ao
contrrio das demais regies do corpo onde a pele mais fina (pele delgada)
(Ribeiro, 2006).
FIGURA 2. Camadas da epiderme
15
As clulas da epiderme constituem um sistema dinmico, ou seja,
esto em constante renovao, desde sua juno com a derme at a sua
superfcie cutnea, onde se efetua uma descamao permanente (Leonardi &
Matheus, 2008).
O estrato basal chamado tambm de estrato germinativo, por conter
clulas em diviso. As clulas recm produzidas migram em direo s camadas
superiores da epiderme, com a finalidade de substituir as que descamaram. Logo,
na camada germinativa originam-se as clulas epidrmicas, que vo pouco a
pouco ganhando a superfcie, sofrendo modificaes graduais na forma e na
composio qumica, at se tornarem anucleadas (na camada crnea) e se
esfoliarem. H, assim, um deslocamento permanente e repetido de clulas, que
da camada basal atingem gradualmente a superfcie da epiderme para se
desprenderem j mortas (Leonardi & Matheus, 2008).
O ciclo de queratinizao, ou corneificao, consiste nesta
transformao das clulas epiteliais em clulas crneas. A pele elimina
diariamente cerca de 6 a 14g de clulas mortas, que so substitudas por outras
clulas epidrmicas, as quais gradualmente se queratinizam (Leonardi &
Matheus, 2008).
O tempo que um queratincito basal leva para se tornar um
queratincito crneo duas semanas, e o mesmo perodo de tempo gasto para
que o queratincito crneo venha a descamar. Portanto, a epiderme tem a sua
populao queratinoctica renovada a cada quatro semanas, em condies
habituais (Sousa & Vargas, 2004).
Acima da camada basal encontra-se a espinhosa, formada por vrias
fileiras de clulas, sendo as mais profundas polidricas e as superficiais mais
achatadas (Ribeiro, 2006). Apresentam prolongamentos citoplasmticos na forma
de espinhos que formam pontes entre as clulas adjacentes chamadas
desmossomos, os quais so responsveis pela manuteno da integridade da
epiderme. Entre esses prolongamentos h um espao preenchido com tecido
fluido que separa as clulas vizinhas e permite que nutrientes e oxignio
difundam-se em direo s demais camadas da epiderme (Barry, 1983).
Os corpos lamelares, reconhecidos como o primeiro sinal de
queratinizao, surgem no estrato espinhoso. Esses grnulos contm lipdeos
16
como ceramidas, cidos graxos e colesterol, alm de proteases, fosfatases
cidas, lpases e glicosidases (Baumann &Weisberg, 2002).
A camada granulosa, com a espessura de duas ou trs camadas de
clulas carregadas em grnulos de querato-hialina, situa-se entre a camada
crnea e a camada espinhosa (Ribeiro, 2006).
Esta regio da epiderme a responsvel pela formao da bicamada
de lipdeos presente entre as fileiras de clulas corneificadas que formam a
camada crnea. Esta estrutura lamelar tem como funo prevenir a desidratao
das camadas subjacentes da epiderme, formar barreira e oferecer resistncia
absoro percutnea, alm de atuar como cimento, fixando as clulas
queratinizadas umas s outras, impedindo o seu desprendimento (Ribeiro, 2006).
A ltima camada da epiderme, a crnea, o resultado final do
processo de diferenciao celular pelo qual passam os queratincitos e que
comea na camada germinativa ou basal (Ribeiro, 2006).
A poro menos permevel da epiderme o estrato crneo, onde as
clulas so mais queratinizadas e o teor de lipdeos mais elevado. Depois que
uma molcula atravessa este estrato no h outra barreira difuso para outras
camadas da pele (Leonardi & Matheus, 2008).
As clulas do estrato crneo so muito ricas em queratina e no
possuem ncleo e nenhuma organela. Embora seja uma membrana muito fina, o
estrato comporta-se como uma eficiente barreira, protegendo nosso corpo da
desidratao. Os lipdeos disponveis neste estrato formam membranas lamelares
intercelulares que retm gua, conservando a superfcie da nossa pele saudvel e
macia (Leonardi & Matheus, 2008).
3.1.2 Derme
A derme consiste em um tecido resistente e elstico que proporciona
resistncia fsica ao corpo frente a agresses mecnicas, fornece nutrientes
epiderme e abriga os apndices cutneos, vasos sanguneos e linfticos, clulas
de natureza conjuntiva e de origem sangunea (Ribeiro, 2006).
dividida em duas regies, a poro superior conhecida como derme
papilar, sendo a camada inferior epiderme e que apresenta maior densidade de
elementos vasculares, e a outra logo abaixo, a derme reticular que possui maiores
feixes de fibras colgenas (Baumann &Weisberg, 2002).
17
O colgeno sintetizado no retculo endoplasmtico do fibroblasto,
iniciado pelo pr-colgeno que por ao de peptidases se transforma em
tropocolgeno, rico em aminocidos lisina e prolina, que sofrem hidroxilao para
transformar o tropocolgeno em colgeno, este rico em hidroxilisina e
hidroxiprolina. Fazem parte desta reao bioqumica os cofatores silcio orgnico,
cido ascrbico, magnsio e clcio (Leonardi & Matheus, 2008).
As fibras elsticas permitem extensa deformao da pele, que retorna
passivamente ao estado original quando suspensa a fora aplicada (Ribeiro,
2006). Essas fibras esto reunidas em feixes de microfibrilas compostas de
fibrilina. A fibrilina forma um molde, sobre o qual a elastina depositada. As fibras
elsticas esto localizadas na periferia dos feixes de fibras colgenas e formam
uma rede estrutural na derme e, juntamente com o colgeno, respondem pelas
propriedades mecnicas dos tecidos conectivos (Baumann &Weisberg, 2002).
3.1.3 Vascularizao da pele
A derme possui dois plexos vasculares horizontais, um superficial e
outro profundo (FIG. 3). Esta rede vascular de fundamental importncia para a
nutrio da epiderme, que no vascularizada (Ribeiro, 2006).
FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares horizontais:
superficial e profundo.
O plexo superficial situa-se na poro superficial da derme reticular,
com arterolas pequenas, de camada muscular descontnua, e delas partem alas
18
capilares com sangue arterial que ascendem at o topo de cada papila drmica e
retornam como papilares venosos (Sousa & Vargas, 2004).
O plexo profundo situa-se na base da derme reticular e composto por
arterolas e vnulas de parede muscular contnua. H ntima ligao dos dois
plexos, pois das arterolas do plexo profundo, sobem vasos que se ligam no plexo
superficial (Sousa & Vargas, 2004).
3.2 Cicatrizao
O processo de cicatrizao se d fundamentalmente no tecido
conjuntivo, no qual diversos fatores de ordem geral ou local intervm em sua
constituio e funo. A cicatriz consiste na substituio do tecido lesado por
tecido conjuntivo neoformado, indicado como cicatricial (Guirro, 2002).
A reparao cutnea constituda por uma sucesso de fenmenos
complexos e estreitamente ligados, que podem ser classificados em diferentes
etapas ou fases (Guirro, 2002):
Fase inflamatria: Fase inicial e fundamental do processo de reparo que dura
em mdia 72 horas desencadeada pela leso, independentemente de seu
agente etiolgico. Numa primeira etapa, observa-se uma vasoconstrio, que
fugaz, seguida pela liberao de substncias vasoativas (histamina,
serotonina, 5-hidroxi-triptamina, cininas, plasmina, calicrena e prostaglandinas
PgE1 e PgE2), capazes de promover aumento da permeabilidade vascular. O
fluido originado do exudato principalmente o plasma, que coagula,
delimitando o processo.
Fase de latncia: Essa fase assim denominada em virtude de se acreditar
inicialmente que havia uma interrupo na cicatrizao, porm atualmente
sabe-se que uma fase bastante ativa. Substncias denominadas fatores de
crescimento (cininas) esto aumentadas em nvel srico em torno do sexto
dia, e atuam em diversas fases da proliferao celular.
Fase de fibroplasia (biossntese do colgeno): a ao de macrfagos inicia a
transio para essa segunda fase do reparo da leso em que se desenvolve a
formao do tecido de granulao. O tecido de granulao consiste de uma
19
densa populao de macrfagos, fibroblastos e novos vasos, embebidos em
uma matriz frouxa de colgeno, fibronectina e cido hialurnico.
Fase de contrao: Fase dinmica que objetiva a reduo da superfcie
cruenta, produzindo a aproximao das bordas da leso, contribuindo para o
fechamento da mesma. Esta fase tem incio entre o stimo e o dcimo quarto
dias de leso.
A cicatrizao processa-se na maioria das vezes de forma rpida e
satisfatria. No entanto, fatores como estado nutricional, doena preexistente, uso
de vestimenta, exposio terapia com radiao, lcool e fumo podem influenciar
neste processo de regenerao da pele (Sousa & Vargas, 2004).
O processo de cicatrizao pode ser classificado segundo o tipo e a
quantidade de tecido em cicatrizao por primeira inteno e cicatrizao por
segunda inteno. A primeira ocorre em casos de incises cirrgicas limpas no-
infectadas, cujas bordas so aproximadas por suturas. A leso provoca a morte
de um nmero limitado de clulas epiteliais e do tecido conjuntivo, alm da
ruptura da continuidade da membrana basal epitelial. A reao inflamatria mais
branda e ao final do processo observa-se uma cicatriz formada por tecido
conjuntivo destitudo de infiltrado inflamatrio recoberto por uma epiderme intacta.
Cicatrizao por segunda inteno ocorre quando h uma perda extensa de
clulas e tecido que deve ser preenchida, como na ulcerao inflamatria,
formao de abscesso e em feridas superficiais que geram grandes defeitos.
Observa-se uma reao inflamatria mais intensa e so necessrias a
regenerao das clulas parenquimatosas e a formao de um tecido de
granulao abundante para completar o reparo tecidual. Grandes feridas de
superfcie podem sofrer contrao, um efeito possivelmente causado pela
presena de miofibroblastos, que resulta na reduo do tamanho da leso ao final
do processo cicatricial (Cotran et al., 2000).
As cicatrizes podem ser classificadas em (Sousa & Vargas, 2004):
Atrficas: leses lisas, planas, retrteis, sem sulcos, poros e plos,
acompanhadas de discromia.
20
Hipertrficas: leses discrmicas, fibrticas, lisas, salientes, sem sulcos,
poros e plos. So limitadas rea do processo cicatricial inicial, seu
tamanho tende a diminuir ao longo dos anos.
Queloidianas: salientes, duras, com superfcie lisa e brilhante, de colorao
rsea ou castanha e que apresenta dor e/ou prurido.
3.3 Polmeros 3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros
A qumica das radiaes consiste no estudo dos efeitos qumicos
produzidos quando a matria exposta radiao de energia alta, ou tambm
denominada, radiao ionizante. Geralmente, os tipos de radiao mais
conhecidos so aqueles produzidos pela decomposio de ncleos radioativos
(radiao , e ), partculas reativas de alta energia (eltrons, prtons, etc.) e
radiao eletromagntica de onda curta (raios X) (Spinks & Woods, 1990).
Quando a radiao eletromagntica interage com a matria ocorrem
vrios processos de atenuao, sendo os trs principais: efeito fotoeltrico, efeito
Compton e produo de pares (Spinks & Woods, 1990).
Efeito fotoeltrico: ocorre principalmente com ftons de baixa energia
(menor que 1 MeV), que interagem predominantemente pelo efeito
fotoeltrico. Neste tipo de interao, toda a energia do fton transferida
para um nico eltron atmico, que ejetado com uma energia igual
diferena entre a energia do fton e a energia de ligao do eltron ao
tomo. A ocorrncia de interaes fotoeltricas mais provvel em
materiais com nmero atmico elevado e para ftons de baixa energia.
Efeito Compton: ocorre quando um fton interage com um eltron que pode
estar fracamente ligado ou livre, sendo que o eltron acelerado e o fton
defletido com energia reduzida. A energia do fton incidente dividida
entre o fton espalhado e o eltron. A interao Compton ocorre
21
predominantemente para ftons com energia entre 1 e 5 MeV em materiais
com elevado nmero atmico .
Produo de pares: a produo de pares envolve a completa absoro de
um fton nos arredores de um ncleo atmico ou, menos freqentemente,
um eltron com formao de duas partculas, um eltron e um psitron. A
produo de pares no ocorre com ftons de energia menor que 1,02 MeV
(Spinks & Woods, 1990).
A interao da radiao ionizante com a matria promove eventos
fsico-qumicos, em nvel atmico, os quais so complexos e podem ser divididos
em trs etapas consecutivas e distintas: etapa fsica, etapa fsico-qumica e etapa
qumica (Farhataziz & Rodgers, 1987).
Na etapa fsica (10-18 a 10-15s), devido ao da radiao sobre a
matria, ocorre transferncia de energia. Esta energia transferida provoca
excitaes eletrnicas e ionizao. As espcies primrias formadas com alta
energia so muito instveis, sofrendo reaes secundrias (Farhataziz &
Rodgers, 1987).
Na etapa fsico-qumica (10-15 a 10-11s) ocorre a formao de espcies
secundrias reativas (H+, radicais livres, etc.) que podem se originar de uma nica
reao ou podem resultar de uma sucesso complexa de reaes (Farhataziz &
Rodgers, 1987).
A etapa qumica (10-11s em diante) se inicia quando o sistema
restabelece o equilbrio trmico que havia sido alterado pela transferncia de
energia da radiao. As espcies reativas continuam a reagir entre si e com
outras espcies vizinhas. O tempo de durao desta etapa depende do meio
(slido, lquido, etc.) em que a radiao vai interagir (Farhataziz & Rodgers,
1987).
As mudanas qumicas produzidas em um polmero quando exposto
radiao no so muito diferentes das observadas em compostos de massa molar
baixo (Charlesby, 1960). Nem todas as molculas polimricas possuem o mesmo
tamanho, e muitas de suas propriedades no esto relacionadas somente com a
massa molar, mas com sua distribuio (Farhataziz & Rodgers, 1987).
Basicamente, na irradiao de polmeros, os objetivos so a
modificao das propriedades fsicas como o comportamento mecnico,
condutividade, ponto de fuso, entre outros (Farhataziz & Rodgers, 1987).
22
Os principais efeitos da radiao sobre os polmeros so: ciso da
cadeia principal, com conseqente reduo da massa molar; reticulao, com
conseqente aumento da massa molar (podendo formar uma rede tridimensional
insolvel) e formao de insaturaes. Como conseqncia da modificao
estrutural do polmero irradiado pode ser verificada alteraes de suas
caractersticas morfolgicas como, por exemplo, perda da cristalinidade e
alterao de cor (Reichmanis & ODonnell, 1989).
A reticulao de materiais polimricos pode ser iniciada por uma
dissociao do hidrognio ou por um radical que abstrai um hidrognio de uma
cadeia polimrica prxima formando um stio reativo adicional. Para cada
excitao-ionizao, um radical polimrico e um tomo de hidrognio so
formados. Estes tomos de hidrognio podem retirar outro hidrognio e formar um
radical polimrico adicional, ou tambm percorrer uma longa distncia e sofrer
vrias colises antes de abstrair um segundo hidrognio, produzindo radicais
polimricos em outros locais (Bradley, 1984).
Alguns polmeros, aps exposio radiao de alta energia, mostram
um aumento na massa molar, levando a formao de uma rede tridimensional
(reticulao), j outros mostram uma reduo na sua massa molar, ocorrendo
mudanas na viscosidade e propriedades mecnicas. Estas mudanas podem ser
devido a uma ciso na cadeia principal, induzida pela radiao, ocorrendo um
rearranjo dos tomos perto do ponto de ruptura para estabilizar os grupos finais
(degradao) (Charlesby, 1960).
As modificaes causadas pela radiao ionizante em polmeros
dependem das condies de processo, ou seja, tipo de radiao, presena de
oxignio ou diferentes atmosferas, aditivos, solventes, grau de cristalinidade e
homogeneidade do material polimrico que ir absorver a energia, etc (Clegg &
Collyer, 1964).
3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros
A radiao ionizante pode produzir a ciso ou reticulao de molculas
polimricas, levando a diminuio ou o aumento do peso molecular (Clough &
Shalaby, 1991).
23
Na reticulao ocorre uma ligao entre as cadeias polimricas (FIG.4)
formando uma rede tridimensional (Charlesby, 1960). Dentre os mecanismos
propostos para a reticulao pode-se citar os seguintes (Schnabel, 1981):
Quebra da ligao C-H de uma cadeia polimrica com a formao de um
tomo de hidrognio seguido da retirada de um segundo tomo de uma
molcula prxima formando hidrognio molecular (H2). Sendo assim, os
dois radicais polimricos combinam-se formando uma reticulao;
Migrao de radicais produzidos pela quebra das ligaes C-H ao longo
das cadeias polimricas at que duas delas tornem-se adjacentes e se
unam formando a reticulao;
Estes processos podem ocorrer de forma individual ou
concomitantemente. Apesar de nenhuma destas explicaes ser completamente
aceita, admite-se que para cada excitao ou ionizao, um radical polimrico e
um tomo de hidrognio, devido a sua energia cintica, produzem radicais
polimricos secundrios. Pares de radicais adjacentes, formados pela radiao ou
por tomos de hidrognio, podem unir-se (Schnabel, 1981).
FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao.
O fator mais importante que influencia na capacidade de
intumescimento do hidrogel a reticulao. Os hidrogis altamente reticulados
possuem uma estrutura mais apertada diminuindo o intumescimento em
comparao com hidrogis menos reticulados. A reticulao diminui a mobilidade
24
da cadeia polimrica, por isso diminui a capacidade de intumescimento do
hidrogel (Peppas, et al., 2000).
O uso da radiao de alta energia para promover a reticulao entre
molculas adjacentes do polmero uma das principais aplicaes industriais das
radiaes (Farhataziz & Rodgers, 1987).
O termo degradao polimrica usado para denotar as mudanas
nas propriedades fsicas causadas por reaes qumicas envolvendo ciso de
cadeia na macromolcula (Schnabel, 1981). A degradao polimrica consiste na
reduo da massa molar do polmero e de mudanas em sua estrutura qumica
(ODonnell, 1991).
A ciso de cadeia (FIG. 5) um efeito importante da radiao sobre os
polmeros. As reaes de competio entre a ciso de cadeia e a reticulao
ocorrem simultaneamente em muitos sistemas polimricos, a predominncia de
uma dessas reaes ir depender das condies de irradiao e da estrutura
qumica do polmero. Apesar das reaes de ciso ser geralmente consideradas
uma deteriorao, alguns produtos industriais usam esta reao de degradao
para produzir produtos comerciais (Bradley, 1984).
FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal
Em materiais como a celulose, o poliisobutileno e o polipropileno a
ciso da cadeia, ou reduo da massa molar predominante. J em poliamidas,
poliacrilatos e polivinil lcool, a reao de reticulao a predominante (Bradley,
1984).
O polmero pode sofrer degradao por outros processos, como a
degradao qumica, enzimtica, mecnica, biodegradao, etc., alm da
degradao por meio da radiao (Schnabel, 1981).
25
3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros
Atualmente, o maior grupo de materiais usados para fins biomdicos
so os polmeros, que podem ser utilizados separadamente ou em combinaes
com outros materiais (Rosiak et al.,1995).
A aplicao de polmeros sintticos na rea mdica tem crescido
substancialmente nos ltimos 30 anos. Na TAB. 1 so mostradas algumas das
aplicaes dos polmeros sintticos na medicina (Peppas et al., 2000).
TABELA 1: Aplicaes biomdicas dos polmeros.
Instrumentos Sistemas com funo
mdicos Sistemas substituintes ou melhoradores de partes do corpo teraputica
cirrgicos Externamente Internamente
Lentes de contato Prteses ortopdicas
Seringas Sistema de liberao de
Coraes artificiais Implantes cardiovasculares frmacos
Bombas de insulina "Stents"
Catteres Biosensores Rins artificiais Mamoplastia Fgados artificiais Reconstruo maxilofacial
Curativos Bombas de insulina Peles artificiais Reconstruo das cordas Vocais Reconstruo de rgos Sexuais
Suturas Tendes artificiais Cartilagem articular
O polmero para ser considerado um biomaterial deve preencher
alguns requisitos como (Rosiak et al.,1995):
no-toxicidade: os materiais no devem ser pirognicos ou carcinognicos e
no devem provocar inflamaes crnicas;
26
funcionalidade: os biomateriais devem substituir temporariamente ou para a
vida toda os rgos e tecidos que esto com suas funes comprometidas;
estril: devem ser facilmente esterilizveis em autoclave ou radiao ionizante;
biocompatibilidade: o biomaterial deve causar o mnimo de stress ao
organismo receptor, ou seja, no causar nenhum dano as clulas e tecidos.
Polmeros so molculas de cadeia longa que consiste de um nmero
de pequenas unidades repetidas, as quais se denominam monmeros. Vrios
tipos de polmeros so utilizados em aplicaes biomdicas como os
homopolmeros e os copolmeros (Visser et al.,1996).
A radiao ionizante produz ons e radicais livres que podem iniciar a
polimerizao ou a copolimerizao em monmeros e degradao e reticulao
em polmeros (Schnabel, 1981). O uso da radiao ionizante para a formao de
biomateriais polimricos possui algumas vantagens como (Rosiak, 1991):
reticulao e esterilizao simultnea do produto;
O processo de reticulao pode ocorrer em uma ampla faixa de temperatura
sem necessitar de um aquecimento para ocorrer reao no sistema;
Propriedades fsicas e/ou qumicas do produto final podem ser obtidas pelo
ajuste da intensidade e tipo de radiao, tempo de irradiao (dose), etc.
O curativo de hidrogel a base de PVP utilizado em queimaduras e
ulceraes da pele utiliza a radiao ionizante para obter a reticulao do
polmero e simultnea esterilizao do produto (Rosiak, 1991).
H tambm outros tipos de hidrogis utilizados como curativos
reportados na literatura, hidrogis de PVP e PVA (Razzak et al., 2001) e de poli
xido de etileno (PEO) e PVA (Yoshii et al., 1999) obtidos por radiao gama, e
de PVA intumescidos com quitosana (Rodas et al., 2005) so alguns exemplos.
Desde a dcada de 1980, folhas de silicone na forma de gel tm sido
testadas no tratamento de escaras hipertrficas e quelides apresentando bons
27
resultados. Estudos demonstraram que as bandagens de silicone em gel so
seguras e efetivas para essa aplicao, podendo ser especialmente teis para
crianas e outros pacientes intolerantes dor e a outros procedimentos (Valenta
& Auner, 2004).
Outro produto muito utilizado no tratamento de feridas que requeiram
enxerto o Integra. Ele constitudo por membrana de colgeno que quando
colocado sobre a ferida sofre invaso dos vasos sanguneos promovendo sua
vascularizao. Aps algum tempo esta membrana degradada pelo organismo e
substituda por tecido do prprio paciente (Jones et al., 2002).
3.3.4 Hidrogel
Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela
hidrofilicidade e insolubilidade em gua. Na gua, eles intumescem at atingir o
equilbrio preservando a sua forma (Kudela, 1990).
A hidrofilicidade do hidrogel devido a presena de grupos hidroflicos
em gua como OH, -COOH, -CONH, etc. A insolubilidade e estabilidade de sua
forma em gua so devido a presena da rede tridimensional (Kudela, 1990).
Os hidrogis podem ser classificados em vrios tipos, dependendo do
seu mtodo de preparo, carga inica, ou caractersticas fsicas estruturais
(Peppas, 1996).
A sntese do hidrogel pode ser a partir de qualquer polmero hidroflico
que possa ser reticulado formando uma rede tridimensional. A reticulao pode
ser feita por reao qumica, radiao ionizante ou interaes fsicas (Gehrke &
Lee, 1990).
A reticulao por reao qumica necessita de um agente iniciador.
Este agente normalmente liga as cadeias de massa molar maior atravs de seus
grupos multifuncionais. Um segundo mtodo utilizado a reao de
copolimerizao entre um ou mais monmeros e um monmero multifuncional,
que presente em menor quantidade. Outro mtodo utilizado envolve o uso da
combinao de um monmero e uma cadeia polimrica linear que so reticulados
por um agente qumico (Peppas, 1996).
A formao de hidrogis via radiao ionizante pode ser definida como
resultado de combinao mtua de macrorradicais. Estes macrorradicais so
produtos obtidos pela interao da radiao com a matria prima, formando
28
produtos reativos como ons e estados excitados, que perdem sua energia
formando radicais livres. Se estes radicais estiverem localizados em cadeias
polimricas diferentes e posicionados favoravelmente, podem sofrer
recombinaes havendo a formao de ligao covalente entre as cadeias
(Rosiak & Olejniczak, 1993).
Na reticulao por radiao ionizante ocorre a interconeco das
cadeias polimricas longas por meio de ligaes covalentes. Nos hidrogis fsicos
(gis reversveis, pseudogis) tambm formada uma rede tridimensional, mas
as cadeias polimricas individuais so conectadas por pontes de hidrognio ou
interaes eletrostticas. Neste caso normalmente possvel converter este tipo
de hidrogel em uma soluo homogenia. Os exemplos clssicos de alguns so
gelatina e gar (Rosiak, 1991).
O processo de formao de hidrogis por radiao ionizante possui
algumas vantagens, como por exemplo, obter a reticulao e esterilizao
simultnea do produto, possibilidade de reticulao em temperaturas baixas e
ausncia de iniciadores qumicos (Rosiak et al.,1995).
A habilidade de absorver gua e ons, sem perder sua forma e suas
propriedades mecnicas uma das principais caractersticas do hidrogel. Outra
propriedade importante de alguns hidrogis a biocompatibilidade em contato
com o sangue, fluidos corpreos e tecidos vivos (Rosiak, 1991).
As propriedades fsicas dos hidrogis fazem com que eles tenham uma
ampla aplicao no campo biomdico e farmacutico, sendo utilizados como
curativos, lentes de contato, matrizes para imobilizao de enzimas e sistemas de
liberao de frmacos (Peppas, 1996).
Um dos hidrogis mais utilizados o PHEMA. Este foi apresentado
como um material biolgico por Wichterle e Lim em 1960. A estrutura do PHEMA
permite um contedo de gua similar ao do tecido vivo. Este hidrogel inerte ao
organismo, resistente a degradao e no absorvido pelo corpo (Peppas, 1996).
Rosiak e colaboradores (1989) desenvolveram um sistema polimrico
base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG) e gar, reticulado
por feixe de eltrons de alta energia, com excelentes caractersticas para ser
utilizado como curativo. O hidrogel de PVP, produzido pela irradiao de sua
soluo aquosa, tem sido aplicado no tratamento de queimaduras, ulceraes da
pele, curativo ps-operatrio, etc.
29
A tecnologia de produo dos curativos de hidrogel via radiao
ionizante possui algumas vantagens em relao ao por processo qumico, pois
alm de ser uma tecnologia mais simples, fcil e limpa (sem resduos) o produto
final completamente esterilizado (Rosiak, 1991).
Alm do hidrogel produzido por Rosiak e colaboradores (1991), existem
outros tipos de curativo de hidrogel comercializados como o Vigilon e Kik gel.
Estes tambm so esterilizados utilizando a tcnica de irradiao (Razzak et al.,
2001).
Os hidrogis tambm tm sido utilizados amplamente no
desenvolvimento de sistema de liberao controlada de frmacos, podendo liber-
lo de acordo com os estmulos do ambiente, devido a uma mudana de pH ou de
temperatura, por exemplo. Esta classe de hidrogis sensveis a estmulos,
tambm chamada de hidrogis inteligentes. Hidrogis de poliacrilameda e
quitosana sensveis a variao de pH (Bonina et al., 2004) e hidrogis de gelatina
e dextrano sensveis a estmulos duplos (Kurissawa & Yui, 1998) so alguns
exemplos.
3.3.5 Poli(vinil lcool)
O poli(vinil lcool) (PVA) produzido pela hidrlise controlada do
poli(vinil acetato). So produzidos PVA de massa molar varivel e com diferentes
graus de hidrlise, sendo que este ir determinar a solubilidade em gua do
polmero resultante (Ulrich, 1982).
A descoberta do PVA (FIG. 6) foi em 1924 quando Herrman e Haehnel
adicionaram lcali em uma soluo de poli(vinil acetato) e obtiveram o poli(vinil
lcool), mas foi em 1927 que foi realizado a sua primeira publicao cientfica
(Marten, 1989).
FIGURA 6. Poli(vinil lcool)
30
Os filmes de PVA possuem uma excelente resistncia a ruptura e
abraso. As propriedades mecnicas deste polmero dependem do grau de
hidrlise, massa molar e umidade relativa (Marten, 1989).
O PVA solvel em solventes hidroflicos e altamente polares, como a
gua. A viscosidade das solues de PVA dependente principalmente da massa
molar, concentrao, grau de hidrlise e temperatura. Materiais com alto grau de
hidrlise tm uma maior viscosidade e podem at formar gel (Marten, 1989).
A excelente resistncia qumica e propriedades fsicas do PVA fazem
com que ele tenha um amplo uso industrial. Ele muito utilizado na produo de
poli(vinil butiral), em fibras, adesivos, papel, etc. (Marten, 1989).
3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona)
Polivinilamidas so polmeros anfotricos, altamente polares, que esto
sendo estudados desde 1930. Os polmeros derivados de estruturas cclicas so
os mais importantes, como o poli(N-vinil-2-pirrolidona), tambm chamado de
polivinilpirrolidona, povidone ou PVP (Barabas, 1989).
O PVP (FIG. 7) produzido pela polimerizao do N-vinil-pirrolidona
iniciada por um radical livre. Ele utilizado em formulaes cosmticas, na
indstria txtil, em adesivos, etc (Ulrich, 1982).
Este polmero apresenta uma combinao de propriedades, incluindo
solubilidade em gua e em solventes orgnicos, baixa toxicidade, boas
caractersticas para formar filmes e habilidade de aderir inmeros substratos
(Barabas, 1989).
FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona)
31
Devido sua propriedade adesiva e formadora de filmes utilizado em
sprays de cabelo e adesivos. J na indstria farmacutica utilizado em sistema
de liberao de frmacos e na indstria de alimentos para clarificao da cerveja
e do vinho. Na Segunda Guerra Mundial o PVP foi usado como espessante de
plasma sanguneo (Barabas, 1989).
O PVP um p higroscpico branco ou levemente amarelado. Este
polmero consiste de um grupo metileno hidrofbico e um grupo amina hidroflico.
Como conseqncia deste balano hidrofbico-hidroflico, ele solvel em
diversos solventes orgnicos e tambm em gua (Barabas, 1989).
Devido s caractersticas do vinilpirrolidona, o PVP quimicamente
inerte. O polmero seco pode ser estocado em condies normais sem ocorrer
sua decomposio, degradao, ou mudanas estruturais. Em solues aquosas
tambm podem ser estocadas por um longo perodo se estocadas
adequadamente (Barabas, 1989).
A irradiao da soluo aquosa de PVP resulta na formao de
macroradicais (na cadeia polimrica) e radicais Hidroxilas (OH) formados durante
a radilise do solvente. A reticulao resultante da recombinao mtua de
macroradicais formados, e como resultado deste processo h formao de
ligaes covalentes entre estas molculas. Se a quantidade destas novas
ligaes for suficientemente grande, aparece no sistema uma frao de gel
insolvel (FIG. 8) (Rosiak &Ulanski, 1999).
Direto
(formao do radical)
(reticulao)
32
Indireto
(formao do radical)
(abstrao do H do polmero)
(reticulao)
FIGURA 8. Formao do radical polimrico.
3.3.7 gar
O gar uma mistura complexa de polissacardeos extrados de
espcies de algas vermelhas, conhecidas como agarofitas (espcies de Gelidium,
Gracilaria, Pterocladia, Acanthopeltis e Ahnfeltia) (Bridson, 2006). insolvel em
gua e solvel em gua fervente. Quando fervido (no funde abaixo de 85C)
torna-se um lquido lmpido e na temperatura entre 32C e 38C ele torna-se
slido para resultar em um gel firme (Farmacopia Brasileira, 1977).
Agarose o componente responsvel pelas propriedades de
geleificao forte do gar, enquanto a agaropectina responsvel pelas
propriedades de viscosidade. A proporo entre agarose e agaropectina em gar
varia de acordo com a alga de origem (Bridson, 2006).
3.3.8 Poli(etilenoglicol)
O poli(etilenoglicol) (PEG) (FIG. 9) um homopolmero
termoplstico, obtido pela polimerizao cataltica do xido de etileno (Carey &
Sundberg, 1983).
33
FIGURA 9. Poli(etilenoglicol)
O PEG miscvel em gua, possui baixa toxicidade e consegue ser
compatvel com uma grande variedade de formulaes. Possui uma boa
estabilidade e pode ser misturado com gua (ou outros solventes) para obter uma
ampla faixa de viscosidade (Clinton & Matlock, 1990).
Este polmero utilizado como surfactante, lubrificante, plastificante
(Ulrich, 1982), em formulaes cosmticas, solues de lentes de contato, etc.
(Clinton & Matlock, 1990).
3.4 Arctalg
Observando a vida selvagem na regio subrtica do Atlntico,
pesquisadores verificaram que as algas vermelhas resistiam s baixas
temperaturas do inverno extremo, assim como a pouca luminosidade devido os
dias serem mais curtos. Estas algas, como a Chondrus crispus, quando
submetidas em situao de stress, como no inverno intenso, sintetizam em
grande quantidade o dipeptdeo citrulil-arginina, que utilizado como uma reserva
energtica (fonte de nitrognio) para este perodo do ano (Christophe, 2006).
Baseado nesses fatos foi estudado e desenvolvido um extrato natural
padronizado desta alga vermelha do mar rtico, o qual foi registrado como
ArctAlg. Este extrato derivado da biomassa da Chondrus crispus que
selecionada sob condies controladas de frio intenso, pouca luminosidade e
processo de extrao especfico que permite a padronizao dos principais
constituintes (dipeptdeo citrulil-arginina, aminocido taurina e agentes
osmoreguladores) (Exsymol, 2005).
34
FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina
ArctAlg um extrato aquoso com cerca de 7,5% de resduo seco. Um
de seus principais componentes o dipeptdeo citrulil-arginina (FIG. 10), rico em
nitrognio, representando cerca de 7% do extrato seco. Outros componentes
importantes so: o aminocido taurina (importante fonte de energia celular), o
agente osmoregulador floridosdeo e seus ismeros representando cerca de 13%
do resduo seco, alm de sais minerais como Ca, Mg, K, Cl. Este extrato possui
uma excelente ao antioxidante, lipoltica, antiinflamatria e citoestimulante.
Devido essas propriedades, o ArctAlg pode ser utilizado em produtos
cosmticos com ao anti-envelhecimento, anti-celulite e tambm na no auxlio da
cicatrizao (Exsymol, 2005).
3.5 Sistema de liberao de frmacos
O maior avano no desenvolvimento de sistemas de liberao de
frmacos est na possibilidade de manter a concentrao do princpio ativo em
um nvel teraputico plasmtico por um longo perodo de tempo, abaixo do nvel
txico e acima do nvel mnimo efetivo, como ilustrado na FIG.11 (Heller, 1996).
35
FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo.
(____) dose segura (- - -) dose no segura (__ . __ .__) liberao controlada
Um dos materiais mais utilizados como matriz para compor um
dispositivo de liberao controlada de medicamentos so os polmeros,
principalmente devido biocompatibilidade, biodegradabilidade, e a possibilidade
de se projetar mecanismos ou sistemas diferentes de liberao de drogas (Uhrick
et.al., 1999).
Os sistemas polimricos para a liberao controlada podem ser
classificados de acordo com o mecanismo que controla a liberao do agente
teraputico: por difuso, pela penetrao de gua e quimicamente, como pode ser
visto na TAB. 2 (Heller, 1996).
Nos sistemas controlados por difuso existem dois tipos de
dispositivos, os monolticos e os controlados por membrana (dispositivos
reservatrios). Em um dispositivo monoltico o frmaco disperso uniformemente
na matriz polimrica e a liberao controlada por difuso atravs da matriz. A
difuso vai depender da solubilidade do frmaco no polmero, em que ou o
princpio ativo vai estar abaixo do limite de solubilidade e dissolvido no polmero
ou ele vai estar bem acima do seu limite de solubilidade disperso na matriz
(Heller, 1996). Outro fator que interfere na difuso em dispositivos monolticos o
tamanho do poro. Em hidrogis, a difuso ocorre atravs dos poros, em que o
frmaco se move por meio das regies que esto preenchidas com gua (Gehrke
& Leee, 1990).
36
Nos dispositivos reservatrios o frmaco est contido em um
compartimento envolto por uma membrana polimrica que pode ou no ser
porosa e que controla a difuso da droga para o meio externo. Um exemplo deste
tipo de dispositivo so os contraceptivos transdrmicos (Heller, 1996).
No mecanismo controlado pela penetrao de gua, a taxa de
liberao do frmaco controlada pela taxa de penetrao de gua no
dispositivo, sendo dois tipos de sistema: o osmtico e o por intumescimento. Nos
dispositivos do tipo bomba osmtica o agente osmtico est contido dentro de
uma cmara rgida e separado do frmaco por uma partio mvel, sendo que um
dos lados do compartimento rgido uma membrana semipermevel. Quando o
dispositivo imerso em meio aquoso, a gua penetra no dispositivo atravs da
membrana aumentando o volume do compartimento osmtico que por
conseqncia exerce uma presso sobre a parte mvel fazendo com que o
frmaco saia por meio de um orifcio. Nos dispositivos controlados por
intumescimento o princpio ativo disperso uniformemente em uma matriz
hidroflica reticulada, no estado slido seco. Esta matriz, quando em contato com
um meio aquoso, se expande e o frmaco se difunde para fora do polmero
(Heller, 1996).
No mecanismo de liberao controlado quimicamente o frmaco
liberado devido degradao do polmero. Essa degradao pode ocorrer por
enzimas, por reaes qumicas ou pela gua. Neste mecanismo existem dois
tipos de sistema: monolticos e de cadeias pendentes. No sistema monoltico o
frmaco disperso uniformemente em um polmero biodegradvel, em que sua
liberao pode ser controlada pela difuso ou pela degradao ou ainda pela
combinao dos dois (Heller, 1996). Nos sistemas de cadeias pendentes o
princpio ativo ligado covalentemente cadeia de um polmero biodegradvel,
sendo que sua liberao ocorre com o rompimento das ligaes entre o polmero
e o frmaco (Heller, 1996).
37
TABELA 2. Classificao dos Sistemas de Liberao Controlada.
TIPOS DE SISTEMA
MECANISMO DE LIBERAO
Controlado pela Difuso
Dispositivos reservatrios
Dispositivos monolticos
Difuso atravs da membrana.
Difuso atravs do corpo do polmero.
Controlado pela Penetrao de gua
Sistema osmtico
Sistema por intumescimento
Transporte osmtico da gua por meio de
uma membrana semipermevel.
Penetrao de gua em um polmero
seco.
Controlado Quimicamente
Sistemas monolticos
Sistemas de cadeias laterais (enxertos)
Por eroso ou pela combinao de
eroso com difuso.
Combinao entre a hidrlise do grupo
pendente e a difuso do corpo do
polmero.
Em sistemas de liberao de frmacos, o termo hidrogel reservado
para materiais polimricos que conseguem absorver quantidades significantes de
gua (mais que 20% do seu peso seco) enquanto mantm sua estrutura
tridimensional (Gehrke &Lee, 1990).
Os dispositivos de hidrogel possuem uma relevante importncia em
sistemas de liberao, pois alm de possibilitar o controle da liberao do
frmaco, eles aumentam a estabilidade de princpios ativos instveis por proteg-
los do meio externo (Gehrke &Lee, 1990).
Em relao incorporao de princpios ativos em hidrogis,
destacam-se dois mtodos gerais. O primeiro mtodo consiste na mistura do
38
frmaco com o hidrogel e sua posterior reticulao, fazendo com que o princpio
ativo fique preso dentro da matriz. No segundo mtodo, primeiramente, o hidrogel
seco e assim obtido o dispositivo. Este mergulhado em uma soluo
contendo o princpio ativo que incorporado atravs da capacidade de
intumescimento do hidrogel. Este ltimo mtodo possui algumas vantagens em
relao ao primeiro, pois durante o processo de reticulao pode haver uma
alterao nas propriedades teraputicas do princpio ativo (Kim et.al., 1992).
Os hidrogis devem possuir propriedades fundamentais para que
possam ser utilizados como matrizes para compor dispositivos de liberao
controlada, sendo elas a biocompatibilidade, permeabilidade e capacidade de
intumescimento. Embora esta ltima propriedade seja a mais importante, a
permeabilidade que faz com que ele possa ser utilizado como um sistema de
liberao de frmacos (Gehrke &Lee, 1990).
Os hidrogis podem ser impermeveis, semipermeveis e totalmente
permeveis em relao a um soluto. Sua permeabilidade pode ser alterada em
relao ao tempo ou devido resposta a um estmulo externo (Gehrke & Lee,
1990).
A capacidade de intumescimento de um hidrogel tambm pode ser
interferida por um estmulo externo. Assim, nos ltimos 30 anos houve um grande
interesse no desenvolvimento dos hidrogis que respondem a estmulos do
ambiente. O uso de hidrogis inteligentes tem sido proposto, principalmente pelo
fato desses gis absorverem uma grande quantidade de gua, de possurem uma
natureza elstica similar a de tecidos naturais, por apresentarem
biocompatibilidade e, principalmente, por terem a capacidade de controlar a taxa
de liberao do frmaco em funo de estmulos externos e das condies do
meio em que se encontra. Como algumas manifestaes de doenas alteram
parmetros do organismo tais como pH, temperatura, concentrao de
substncias e etc., esses hidrogis tm a capacidade de alterar a cintica de
liberao do frmaco de acordo com essas mudanas (Langer & Peppas, 2003).
39
3.6 Citotoxicidade
A biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade de um
material funcionar com uma resposta apropriada do hospedeiro em uma aplicao
especfica (Williams, 1986). Esta resposta apropriada, na maioria dos casos,
significa que um sistema vivo na presena de tal material no apresenta resposta
adversa. O material no pode ser afetado pelo meio fisiolgico, e os tecidos locais
e remotos no podem sofrer danos pela presena deste material (Ratner, 1996).
A seleo e avaliao de qualquer material ou dispositivo com inteno
de uso em humanos requer um programa estruturado de avaliao. Num
processo descrito, deve ser feita uma descrio informada que pesa as vantagens
e desvantagens dos vrios materiais e escolhas de procedimentos de testes. Para
se ter segurana de que o produto final ir realizar/efetuar como desejado e ser
seguro para uso humano, o programa dever incluir uma avaliao biolgica (ISO
10993-1, 2003).
A caracterizao de materiais biocompatveis implica na
obrigatoriedade do teste de citotoxicidade. A toxicidade de um material pode ser
avaliada por testes in vitro, em animais de experimentao, incluindo testes de
uso, e por estudos clnicos em seres humanos (ISO 10993-5, 1992).
Os testes in vitro minimizam o uso de animais em pesquisa. Eles so
normalmente efetuados como um teste de triagem inicial na primeira fase de
avaliao da biocompatibilidade. Eles avaliam os danos causados pelo material
s clulas, fornecendo dados rpidos e de baixo custo. Dentre os vrios testes de
toxicidade para biomateriais, o teste de citotoxicidade o mais sensvel e sua
sensibilidade depende da linhagem celular, do tipo de aplicao dos materiais no
teste e da interpretao da resposta celular (ISO 10993-5, 1992).
O teste de citotoxicidade uma tcnica que utiliza cultura celular e
determina a lise das clulas (morte celular), inibio do crescimento celular e
outros efeitos, causados pelos dispositivos, materiais e/ou seus extratos (ISO,
1992). Este teste consiste em colocar o material direta ou indiretamente em
contato com uma cultura de clulas de mamferos, verificando-se as alteraes
celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporao de corantes
vitais ou a inibio da formao de colnias celulares (ISO 10993-5, 1992).
Uma das tcnicas mais utilizadas para verificar a toxicidade de um
material a de Incorporao do Vermelho Neutro (Ciapetti et. al., 1996). Esta
40
tcnica foi descrita inicialmente por Finter (1969) e consiste em avaliar a
toxicidade por meio da viabilidade celular pela medida da quantidade do corante
vermelho neutro incorporado nas clulas vivas.
3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno
A principal clula envolvida no processo de regenerao cutnea o
fibroblasto. Com estmulos adequados, durante a reparao tecidual, os fibrcitos
(forma inativa da clula) revertem para o estado de fibroblastos (forma ativa da
clula) reativando a capacidade de sntese de colgeno e elastina (Junqueira &
Carneiro, 2008).
A sntese de colgeno um processo bioqumico complexo que ainda
no totalmente conhecido. Os fibroblastos que se encontram no tecido
lesionado, durante o processo de regenerao tecidual, so caracterizados por
possurem uma alta produo de colgeno e sintetizar espontaneamente xido
ntrico (NO), o que no ocorre com os fibroblastos que no esto em locais com
leso (Witte et al., 2002).
O NO produzido em condies inflamatrias e constitui um
importante mediador em diversos processos biolgicos. Ele produzido a partir
da L-arginina por uma reao mediada pela enzima NO-sintetase (Dusse, et. al.,
2003). Esta enzima possui trs isoformas, sendo uma delas a NO-sintetase
induzvel (iNOS) em que sua expresso est diretamente relacionada a processos
inflamatrios na pele. A expresso da iNOS no est restrita somente em clulas
do sistema imune como os macrfagos, ela tambm expressa em fibroblastos.
(Frank et. al., 2002).
A L-arginina produzida em situaes de stress como traumas,
ferimento, queimadura, etc. Este aminocido pode ser metabolizado via NO-
sintetase produzindo NO ou via arginase produzindo ornitina e uria (Witte et al.,
2002).
A ornitina precursora das poliaminas e prolinas (Lehninger, 1995). As
poliaminas so bases orgnicas alifticas, pertencentes ao grupo das aminas
bioativas, so encontradas em quase todas as clulas e desempenham diversas
atividades biolgicas (Lima & Glria, 1999). J a prolina essencial para a
formao da fibra colgena devido ser a precursora do colgeno tipo III (Gimnez
et. al., 2005).
41
As poliaminas so essenciais para a citoestimulao celular, ou seja, a
proliferao das clulas fibroblsticas (Witte et al., 2002), devido estarem
envolvidas em quase todas as etapas de sntese do DNA, RNA e protenas.
Sendo assim, as poliaminas so indispensveis as clulas vivas por estarem
diretamente envolvidas com o crescimento e renovao celular (Bardcz, 1995) e
principalmente em tecidos com alta demanda celular como na cicatrizao de
feridas (Kalac & Krausov, 2005), para que haja um maior nmero de clulas
fibroblsticas e uma maior produo de colgeno.
42
4 MATERIAIS E MTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes polimricas
Poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) K 90, Kollidon 90F, massa molar mdia
1000000 1500000 proveniente da BASF, poli(etileno glicol) (PEG 300) da
Oxiteno, gar tipo tcnico n 3 da Oxoid e poli(vinil lcool) (PVA), Celvol E47/88,
grau de hidrlise 87-89%, ponto de fuso de 180oC, temperatura de transio
vtrea de 58C, proveniente da Dermet Agekem.
4.1.2 Princpio ativo
ArctAlg um extrato de algas de colorao amarela fornecido pela
Exymol. Possui cerca de 7,5% de resduo seco, sendo cerca de 7% de dipeptdeo
citrulil-arginina, 0,15% de aminocido taurina, 0,9% de floridosdeo, 0,14% de
metil parabeno sdico e sais minerais.
4.2 MTODOS
4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel
Foram utilizadas duas formulaes para a obteno das matrizes de
hidrogel. Os componentes e suas concentraes esto descritos na TAB. 3.
43
TABELA 3. Descrio da formulao das membranas de PVP e PVA.
Para sntese do hidrogel de PVP foram misturados primeiramente o
PVP K90, o PEG 300 e a gua destilada, deixando durante 24h em temperatura
ambiente. Aps este perodo a mistura foi aquecida e adicionou-se o gar,
mantendo-se em aquecimento at a completa dissoluo dos componentes. O
hidrogel de PVA foi sintetizado a partir da mistura de PVA e gua destilada com
aquecimento at a dissoluo do PVA. Posteriormente foi adicionado o gar e
manteve-se o aquecimento at dissoluo total dos componentes.
As membranas de hidrogel foram preparadas vertendo-se 5 mL da
soluo resfriada a aproximadamente 40C em moldes circulares de 5 cm de
dimetro e 0,2 cm de espessura, as quais, aps resfriamento, foram seladas,
embaladas adequadamente e enviadas para irradiao em uma fonte de raios
gama de Co-60. As membranas de PVP foram irradiadas na dose de 25 kGy e as
membranas de PVA na dose de 20 kGy.
4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel
As matrizes de hidrogel de PVP e PVA foram submetidas aos
seguintes ensaios:
4.2.2.1 Frao Gel
As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na
temperatura de 60C at peso constante. Aps a secagem, cada amostra com
cerca de 0,15 g cada, em triplicata, foi acondicionada em saquinho de tecido non
MATRIZ COMPOSIO CONCENTRAO (%)
PVP K90 6,0
PVP PEG 300 1,5
GAR 0,5
GUA DESTILADA 92,0
PVA PVA 8
GAR 1
GUA DESTILADA 91
44
woven e colocadas para remoo da frao solvel, por 36h, no extrator Soxhlet
(FIG. 12), utilizando como solvente a gua. Decorrido este tempo as amostras
foram novamente secas em estufa na temperatura de 60 C at atingirem peso
constante.
FIGURA 12. Extrator Soxhlet
O clculo da frao gel foi realizado pelas Equaes 1 e 2 de acordo
com a norma ASTM D 2765 (ASTM, 2001).
Fs = ( mi mf) / mi x 100 (1)
FG = 100% - Fs (2)
Onde: mi = massa inicial da amostra
mf = massa de gel seco
Fs = frao solvel
FG = frao gel
4.2.2.2 Intumescimento
As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na
temperatura de 60C at peso constante. Cada amostra seca, em triplicata, com
45
cerca de 0,15g foi colocada em frasco contendo 20mL de tampo fosfato salina
(PBS) 0,1M pH = 5,0 e durante um perodo de 24 horas, foi verificada a massa a
cada hora durante as primeiras 6 horas do ensaio e aps 24 horas.
O grau de intumescimento foi calculado utilizando a Equao 3 de
acordo com a norma ASTM D 570 (ASTM, 1998).
I% = (mf mi) / mi x 100 (3)
Onde: I% = grau de intumescimento em porcentagem
mf = massa final em gramas
mi = massa inicial em gramas
4.2.2.3 Propriedades Mecnicas
As propriedades mecnicas das matrizes de hidrogel foram avaliadas
pelo ensaio de trao utilizando-se o texturmetro, modelo TA-TX2i com clula de
carga 25 Kg, da marca Stable Micro System (FIG 13).
FIGURA 13. Texturmetro, modelo TA-TX2i da Stable Micro System
Foram utilizados corpos de prova retangulares (2,4 x 10 cm) fixados em
probes roller grips (modelo A/TGT). No ensaio as amostras foram tracionadas a
uma velocidade de 0,8 mm/s, partindo-se de uma distncia inicial (lo) de 60mm,
at a ruptura. Este ensaio seguiu a norma ASTM D882-95 (ASTM,1995) e
46
metodologia encontrada na literatura (Carvalho e Grosso, 2006) com algumas
alteraes.
4.2.2.4 Citotoxicidade
O ensaio in vitro de citotoxicidade das matrizes de hidrogel foi realizado
utilizando-se a tcnica de Incorporao do Vermelho Neutro seguindo normas
internacionais (ISO 10993-1, 10993-5 1992) e metodologia publicada
anteriormente (Rogero, et. al., 2003). Os extratos das amostras das membranas
de hidrogel e do controle negativo foram preparados pela imerso dos mesmos
em meio mnimo de Eagle (MEM) e incubados em estufa durante 24h a 37C. Foi
utilizado 1/8 de cada membrana de hidrogel, equivalente a 4,5cm2 em 9mL de
MEM, ou seja, 0,5cm2/mL. Como controle negativo foi utilizado pellets de PVC
(policloreto de vinila) atxico (1cm2/mL) e como controle positivo soluo de fenol
0,02%. Aps este perodo, foram feitas diluies seriadas (100, 50, 25, 12,5 e
6,25%) dos extratos obtidos das amostras e do controle negativo assim como da
soluo de fenol. Em seguida, 200 L de cada diluio dos extratos e dos
controles, em triplicata, foram colocados em contato com uma cultura de clulas
de tecido conectivo de camundongo, a linhagem NCTC clone 929 do ATCC
(American Type Culture Collection), cultivadas em microplaca de 96 poos (FIG.
14). A microplaca preparada foi colocada a 37C por 24h em estufa incubadora de
CO2, modelo CB150, marca Binder, com atmosfera mida e 5% de CO2. O cultivo
das clulas e a distribuio da suspenso celular na microplaca foram realizados
na Seo de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz.
Esta primeira etapa do ensaio foi realizada em capela de fluxo laminar
utilizando tcnicas asspticas e todo material estril.
Aps 24h, a microplaca foi retirada da estufa e os extratos foram
substitudos por 200 L de soluo do corante vermelho neutro e incubada
novamente a 37C por 3h para incorporao do corante nas clulas. Decorrido
este perodo o corante foi desprezado e a microplaca lavada com soluo tampo
fosfato pH 7,4 e posteriormente com soluo de lavagem (1% de CaCl2 10% em
soluo de formaldedo 0,5%). Aps a lavagem os poos da microplaca foram
preenchidos com 200 L de soluo de extrao (50% de cido actico 2% e
etanol 50%) para a lise das clulas vivas e liberao do corante.
47
FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle na
microplaca. Legenda:
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4
Controle de clulas Controle negativo Controle positivo
A leitura da microplaca foi realizada em espectrofotmetro, leitora
ELISA modelo Sunrise da Tecan, em 540 nm. Com as densidades ticas (DO)
obtidas foram feitos clculos da porcentagem de viabilidade celular tomando-se
como referncia a DO do controle de clulas no ensaio.
O potencial txico foi determinado quantitativamente pelo ndice de
citotoxicidade (IC50%) encontrado no grfico obtido. O IC50% a concentrao de
extrato que provoca a morte de metade da populao celular do ensaio.
4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel
Primeiramente foi feito um estudo do princpio ativo para avaliar sua
atividade citoestimulante e verificar a sua integridade frente radiao ionizante.
4.2.3.1 Citoestimulao
A atividade citoestimulante do ArctAlg foi verificada no ensaio in vitro
de citoestimulao utilizando o mtodo de incorporao do corante vermelho
neutro de acordo com a metodologia encontrada na literatura (Christophe, 2006).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
B 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50%
C 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25%
D
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
E 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25%
F MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%
G MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%
H MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%
48
Essa metodologia requereu como primeira etapa a verificao da faixa
de concentrao do princpio ativo ArctAlg a ser utilizada, em que foi
estabelecida no ensaio de citotoxicidade.
Posteriormente, foram realizados vrios ensaios de citoestimulao
(cerca de 18) para padronizao da quantidade ideal de clulas, tipo de meio de
cultura com a quantidade adequada de Soro Fetal Bovino (SFB), tempo de
incubao e concentrao do princpio ativo.
As concentraes de princpio ativo utilizadas nestes ensaios foram de
2, 1, 0,5 e 0,25%. Estas concentraes foram determinadas de acordo com o
ensaio de citotoxicidade do ArctAlg realizado previamente, em que o resultado
obtido mostrou que as concentraes abaixo de 2,5% do princpio ativo eram
atxicas.
Em seguida, foram realizados alguns ensaios com clulas fibroblsticas
de pele de coelho, linhagem celular FPC IAL para padronizar o nmero de
clulas/mL que iria conter na suspenso celular que seria utilizada para preparar
a microplaca. No primeiro ensaio foi utilizada uma microplaca que foi preparada
com uma suspenso de 200.000 clulas/mL, sendo que duas fileiras da
microplaca foram cultivadas com MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB como controle
do ensaio; outras duas fileiras com MEM e L-15 (v/v) mais 10% SFB, meio que
proporciona condio nutricional total e nas outras fileiras foi colocado as
diferentes concentraes do ArctAlg com o MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB.
Neste ensaio a microplaca foi incubada durante 24h e depois feito a leitura da DO.
O resultado obtido foi que a viabilidade celular deste ensaio, em todas as
condies nutricionais das clulas, foi semelhante e elevada, no havendo
diferena significativa entre as clulas que se encontravam em condio restrita
de nutrio com as que estavam com o princpio ativo ou em condio de nutrio
total (Apndice A). Portanto decidiu-se diminuir a quantidade do nmero de
clulas/mL para o prximo ensaio.
Outros 4 ensaios foram realizados, iguais ao descrito anteriormente,
onde foi alterado somente o nmero de clulas/mL. Foram testadas suspenses
de 180.000 clulas/mL, 150.000 clulas/mL e 100.000 clulas/mL, sendo este
ltimo realizado em duplicata. O melhor resultado encontrado foi com a
suspenso celular de 100.000 clulas/mL, mas mesmo assim no foi muito
49
satisfatrio devido a viabilidade celular do controle do ensaio ainda estar elevada
(Apndice B).
Aps a padronizao do nmero de clulas/mL foram realizados os
ensaios para padronizar a concentrao adequada de SFB e tambm verificar se
o L-15 interferia no crescimento celular. Para tanto, foi realizado um ensaio
utilizando uma microplaca preparada com uma suspenso de 100.000 clulas/mL
cultivadas com MEM e as concentraes de 15, 10, 5 e 2% de SFB. A microplaca
foi incubada durante 24h e aps trmino do ensaio feito a leitura da DO (Apndice
C). Neste ensaio pode-se observar que houve um aumento da viabilidade celular
nas concentraes de 10 e 15% de SFB, mas no houve uma diferena
significativa do crescimento celular entre essas concentraes. J as clulas que
estavam em contato com 5% de SFB apresentaram um pequeno crescimento e
as que estavam com 2% mantiveram-se sem crescimento. Este mesmo ensaio foi
repetido utilizando MEM e L-15 (v/v) junto com o SFB para verificar se no havia
alterao no crescimento das clulas (Apndice D). O resultado obtido neste
ensaio foi semelhante ao obtido quando se utilizou somente o soro fetal bovino.
Sendo assim, foi determinado utilizar o meio de cultura MEM e L-15 (v/v) com 2%
SFB para o controle do ensaio de citoestimulao e o MEM e L-15 (v/v) com 10%
SFB como o meio de cultura com condio total de nutrio.
Tendo a padronizao da suspenso celular de 100.000 cls/mL e das
concentraes de SFB (2 e 10%), foram realizados os ensaios com o ArctAlg.
No primeiro ensaio foi utilizada apenas uma microplaca, contendo o meio de
condio total de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 10% SFB), o meio com dficit
de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 2% SFB), ou seja, o controle do ensaio, e o
princpio ativo em diferentes concentraes (2; 1; 0,5 e 0,25%) sendo esta
diluio seriada feita em meio MEM e L-15 (v/v) mais 2% SFB. A microplaca foi
incubada durante 24h e aps finalizar o ensaio feito a leitura da DO (Apndice E).
Neste ensaio, ainda no foi possvel observar um crescimento significativo das
clulas em contato com o princpio ativo. Tentou-se, portanto aumentar a
incubao da microplaca para 48h.
No ensaio realizado com 48h de incubao o resultado mostrou que
houve aumento no nmero das clulas que estavam em contato com o ArctAlg.
Este ensaio foi repetido, mas o resultado no foi reprodutvel (Apndice F).
Portanto, decidiu-se trabalhar com micro