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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS- EQA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA TECNOLÓGICA E AMBIENTAL
– PPGQTA
LABORATÓRIO DE ANÁLISE DE COMPOSTOS ORGÂNICOS E METAIS - LACOM
Maicon Renato Ferreira Sampaio
Orientador: Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel
Rio Grande, setembro de 2008
“ESTUDO DE METÓDOS EMPREGANDO DLLME, DSPE HPLC-DAD E LC-
MS NA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM DERIVADOS DA CANA-
DE-AÇÚCAR”
2
INTRODUÇÃO
Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L): gramínea, origem asiática,
colmos espessos;
Principais constituintes: Açúcares, Sais orgânicos e inorgânicos, água,
proteínas, amido, gomas, ceras, graxas, corantes.....
O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, Na média,
55% da cana brasileira transforma-se em álcool e 45%, açúcar.2
Estado de São Paulo: 59,3% da produção brasileira.3 O Rio Grande do
Sul abrange apenas 0,2% da produção atual;
Santo Antônio da Patrulha: 39.302 hab; Derivados da cana: cachaça, a
rapadura, o melado, o açúcar mascavo e o caldo da cana,4
Brasil x consumo de agrotóxicos: soja, cana-de-açúcar, milho e o café.6
3
Derivados da cana-de-açúcar
Caldo de cana Bagaço: rico em fibras
(celulose, hemicelulose,
lignina): geração de
energia/ alimento para gado
Melado ou mel de engenho, rapadura,
açúcar mascavo, acúcar refinado,
aguardente...
Justificativas
• Uso indiscriminado de pesticidas, principalmente herbicidas da classe das
triazinas, presença de pesticidas não autorizados,
• Queima de extensas áreas de cana para facilitar a colheita manual, produzindo,
além, de gases, material particulado contendo altos níveis de hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs)
• Práticas incorretas de aplicação, não higienização de equipamentos para
processamento da cana, assim como locais de estocagem da cana.
• Problemas de saúde pública como, por exemplo a contaminação ocorrida no
Brasil, no estado de Santa Catarina pelo transmissor da doença de chagas;
5
-A produção de cana-de-açúcar: geração de empregos, situação
financeira favorável;
-Santo Antônio da Patrulha-RS: culturas locais orizicultura, feijão, milho,
fumo, cana-de-açúcar e mandioca, 41,1% zona rural;
- Rapadura, o açúcar mascavo, melado e o caldo da cana in natura X
Álcool, aguardente e açúcar;
- ANVISA: LMR para cana-de-açúcar, e para os derivados consumidos
pelo homem
- Contribuirá para uma legislação específica;
-contribuirá para a consolidação da linha de pesquisa;
SELEÇÃO DOS ANALITOS
Seleção dos
agrotóxicos
Agrotóxicos usados
na culturaTécnica de extração
e AnálisePadrões
EMATER e
recomendações ANVISA
Figura 1: Esquema de seleção dos compostos
7
Quadro 1: Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32
Classe Grupo químico Classificação
toxicológica
LMR
mg/kg
Codex
LMR
mg/kg
Anvisa
Intervalo de
segurança
em dias
2,4-D Herbicida Ácido
ariloxialcanóico
I 0,05 0,1 3
Fipronil Formicida e
cupinicida
Pirazol II - 0,03 30 dias
(foliar)
1 dia (solo)
Diurom Herbicida Uréico III - 0,1 150 dias
AGROTÓXICOS SELECIONADOS
8
Caldo de cana-de-açúcar
- O caldo conserva todos os nutrientes da cana-de-açúcar, entre
eles minerais como ferro, cálcio, potássio, sódio e magnésio, além
de vitaminas de complexo B e C.12
-O pH do caldo varia de 5,2 a 6,8 e a sua proporção produzido pela
moagem é, em litros, de 50 a 100% .11
-Em média, a composição química da cana-de-açúcar é de 65 a
75% de água, principal componente é a sacarose (70% a 91%)
-
MELADO OU MEL DE ENGENHO
O melado é um xarope obtido do caldo de cana-de-açúcar, que é
decantado, filtrado, concentrado até atingir um teor de sólidos (°Brix)
entre 65 e 75%. A temperatura necessária para atingir o teor de sólidos é
de 105 a 110°C, o “ponto” do melado
-Usa-se ácido cítrico na razão de 0,5 a 1,0g por litro de caldo, este
processo é necessário para que ocorra a inversão da sacarose, e não
ocorra a cristalização.
Amostra de 100
gramas
Açúcar refinado Rapadura
Sacarose (em g) 99,6 72,0 a 78,0
Frutose/ glucose - 1,5 a 7,0
Potássio (em mg) 0,5 a 1,0 10,0 a 13,0
Cálcio 0,5 a 5,0 40,0 a 100,0
Magnésio - 70,0 a 90,0
Sódio 0,6 a 0,9 19,0 a 30,0
Ferro 0,5 a 1,0 10,0 a 13,0
Vitaminas A - 130,0
Proteína - 280
Água em g - 1,5 a 7,0
Calorias (Kcal) 384 312
Quadro 2: Quadro comparativo da rapadura e
açúcar refinado13
11
Revisão
-ZUIN et al comparou SBSE e MASE para a determinação de 18 resíduos de contaminantes
orgânicos em amostras de caldo de cana provenientes de São Carlos, estado de São Paulo,
sudoeste do Brasil.
Do total dos compostos estudados resíduos de HCB, triazinas e benzopirenos foram encontrados
nas amostras na faixa de 0,004- 0,112 μg L-1 com RSD ≤ 8.2% e por SBSE e entre 0.01–0.15 μg
L− 1 (RSD ≤ 12.9%) por MASE.
- TFOUNI et al amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e cana colhida queimada e
produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana. Foram analisados 5
HPAs carcinogênicos (benzoantraceno, benzofluoranteno, benzofluoranteno, benzopireno e
dibenzoantraceno. Para a análise dos compostos foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) com detector de fluorescência.
12
- TFOUNI et al desenvolveram um método envolvendo extração líquido–líquido
com cicloexano e dimetilformamida–água (9:1, v/v), clean up em coluna de sílica
gel e determinação por HPLC com detecção por fluorescência. Picos dos HPAs
foram identificados pela confirmação por CG–MS. Níveis dos HPAs detectados
nas amostras analisadas variaram de não detectados a 1,94 μg/L. Os resultados
confirmam a presença destes compostos em cachaça e indicam que a
contaminação da cana pode ser a fonte de HPAs em aguardente de cana.
13
Preparo de amostra
Matriz complexa rica em carboidratos, além de ceras, graxas, vitaminas,
minerais o que demanda métodos eficientes de preparo de amostra tais
como extração e ou pré-concentração para que estes compostos sejam
determinados e que o método seja sensível para atender as exigências
das legislações da área.
14
DLLME
-Desenvolvida por Rezaee e colaboradores.17
-Sistema ternário de extração;
-Miniaturização da extração líquido-líquido;
Figura 3: Etapas envolvidas na DLLME16
(Microextração líquido-líquido dispersiva)
Analitos/
Matriz
Volu
me
da
amos
tra
Volume
do
disperso
r
Volume do
solvente
extrator
Tempo de
centrifug
ação
Volume
da fase
sedimen
tada
R (%) RSD
%
LODm Análise Referê
ncia
Antibiótico
(MEL)
5 mL 1 mL de
ACN
30μL de
tetracloro
etano
2 min/
4000
rpm
30 μL 89,5 e
93,6
4,3 e
6,2
0,6 e 0,1
μg Kg-1
HPLC-
VWD
Chen et
al. 2009
Fungicida
maçãs
5mL 1mL de
acetona
9 μL de
clorobenz
eno
5 min/ 5
rpm
1 μL 93 a
107,7
%
3,8 a
4,9%
Entre 3,0
e 8,0
μg.Kg-1
GC-ECD Zang et
al
2008
Agrotóxico
(melancia e
pepino)
5 mL 1 mL de
ACN
27 μL de
clorobenz
eno
3min/
4000 rpm
1 μL 67 e
111
2 e 9 0,010 e
0,190 μg
Kg-1
GC-FPD Zhao et
al 2007
Agrotóxico
SUCO DE
FRUTAS
5 mL 1mL de
ACN
15μL de
tetracloro
etano
3 min/
3500 rpm
5 μL 80,4 e
117
1,38
e
2,74
12.3 to
16.0 pg
mL−1
HPLC-
FLD
Wang
et al
2008
Quadro : Revisão DLLME para extração de compostos em alimentos:19-26
16
Otimização da separação de M3 10 mg L-1 por HPLC-DAD
Determinação dos LOQ e LOD para os agrotóxicos analisados;
Construção da curva analítica em 6 níveis de concentração
Figura : HPLC-DAD
Resultados HPLC-DAD
17
OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO DE M3 (10 mg L-1) POR
HPLC-DAD
Coluna
analítica
Waters Spherisorb; 5m x 4,6 x 150mm
Thermo hypersil; 5m x 4,6 x 250mm
Fase móvel: MeOH:H2O ultrapura pH 3Variando a composição
em modos de eluição
isocrático e gradiente
vazão 0,8 mL/min e 1 mL/min
18
Proporção da fase móvel Vazão (mL min-1) Tempo de retenção dos
agrotóxicos (min)
Observações
MeOH Água
ultrapura pH
= 3,0
2,4-D Diurom Fipronil
50% 50% 0,8 10,0 19,8 Não eluiu Tempo de corrida
muito longo
60% 40% 0,8 5,3 8,6 Não eluiu Em 9,464 há um
coeluindo com
diuron
65% 35% 0,8 4,1 6,2 18,4 O 2,4-D coelui com
o pico do solvente
68% 32% 1,0 6,7 7,5 16,3 O 2,4-D fica muito
próximo ao diurom
21
Fase móvel:
MeOH e água
ultrapura
pH= 3,0
Modo de
eluição:
gradiente
OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO DE M3 (10 mg L-1) POR HPLC-DAD
Figura 5 : Cromatograma de separação de M3
por HPLC-DAD
Fase
estacionária:
Coluna
analítica
Thermo
hypersil
Detector por arranjo de diodos
22
Baseada na absorção da luz, onde o sinal é proporcional à concentração do analito. Faz
uma varredura em toda a faixa de absorção do UV e do Vis (190 a 800 nm)
Permite selecionar o comprimento de onda de máxima absorbância de cada um dos
elementos, melhorando a detectabilidade e a sensibilidade.
É possível a construção de espectros tridimensionais:
Figura: Espectro em três dimensões de uma solução analítica 10 mg L-1 dos três compostos
Pureza do pico
23
-Comparação dos espectros em diversos pontos do pico cromatográfico,
como por exemplo, no início, no ápice e no fim. Se eles se sobrepõem o pico
é puro.
-Isso fornece um dado extra para o analista que assim saberá se há ou não
interferentes eluindo no mesmo tempo de retenção do analito.
Otimização da DLLME
24
Seleção do Solvente extrator
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tetracloroetileno Tetracloreto de carbono
Diclorobenzeno
Diurom
Fipronil
Seleção do solvente dispersor
26
Escolha do pH da amostra
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
0 0,25 0,5 0,75 1
2,4-D
Diurom
Fipronil
Teste de adição de NaCl
27
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Diuron Fipronil
Rec
up
era
çã
o
Agrotóxicos estudados
Recuperação dos compostos, usando 1mL de amostra
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Diuron Fipronil
Rec
up
era
çã
o (
%)
Recuperação dos compostos usando 0,5mL de amostra
Série1
Cachaça: é a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no
Brasil, com graduação alcoólica de trinta e oito a quarenta e oito por cento em volume,
a vinte graus Celsius, obtida pela destilação do mosto fermentado de cana-de-açúcar
com características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até
seis gramas por litro, expressos em sacarose.
Teste realizado para amostra de cachaça com as condições
otimizadas para o melado (nível de fortificação 0,02mg L-1)
DSPE (dispersive solid phase extraction)
30
Desenvolvida por Anastassíades et al;
Baseia-se na extração dos analitos da matriz da amostra com um solvente
orgânico (comumente acetonitrila) seguido da remoção de interferentes usando
um sorvente para cleanup.
O termo “dispersive” refere-se ao processo de limpeza, uma vez que o
adsorvente é adicionado na forma sólida e dispersado na solução orgânica
(usando um vortex), facilitando o contato estreito com as interferências.
32
DAGNAC et al desenvolveram um método usando DSPE e LC-MS/MS para a
determinação simultânea de 44 pesticidas em leite bovino. Como as amostras de leite
bovino não percolam através de cartuchos de SPE, usualmente aplicados para extração de
pesticidas de amostras homogêneas de leites pasteurizados. Então, usou-se a técnica
DSPE onde 5 ml de leite cru foram diluídos com 5 ml de um solvente orgânico (metanol ou
acetonitrila) contendo 1% de ácido fórmico e a mistura era agitada por 2 min. Após a
centrifugação, o sobrenadante orgânico era recuperado e seco com sulfato de sódio
anidro. Após, o extrato era colocado em contato com uma mistura dispersiva contendo
sulfato de magnésio/ sílica modificada (C18) / PSA na proporção 6/1/1 in g. Após a mistura
e centrifugação o extrato final era evaporado e com nitrogênio e reconstituído em 1 mL de
metanol.
33
BARAKAT et al desenvolveram um método para determinação de resíduos de
pesticidas em mel, usando dispersive solid phase extraction (DSPE) e determinação
por GC-ECD e GC-NPD. 5g de amostra são dissolvidos em 10ml de água
deionizada. 10 mL de acetonitrila acidificada com ácido acetico, 1.0 g de acetato de
sódio e 4.0 g de sulfato de magnésio anidro são misturados por 1min. Após o
sistema é centrifugado a 4000 rcf for 2 min. 6 ml do sobrenadante é adicionado a um
tubo de polietileno de 15mL contendo 0.4 g de PSA e 0.6 g de sulfato de magnésio
anidro e adiciona-se 50 µL de tetradecano, evapora-se em um rotaevaporador e
reconstitui o extrato em 2mL de solução padrão interna, 1 µL da amostra é injetado
no GC-NPD e GC-ECD.
36
Tabela - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos,
empregando DSPE, no sistema HPLC-DAD
Condições: 5g de amostra e 10mL de ACN
AgrotóxicosFaixa Linear (mg L-1)
LOQ
(mg L-1)Curva
analíticar
2,4-D 0,625 – 5,0 0,625Y =3,27.104
-6,36.103 0,99954
Diurom 0,1 – 5,0 0,1Y =9,17.104
- 3,38.102 0,99927
Fipronil 0,25 – 5,0 0,25Y =5,44.104
+7,71.103 0,99870
37
AgrotóxicosFaixa Linear (mg L-1)
LOQi
(mg L-1)Curva analítica r
2,4-D 0,1 – 5,0 0,1Y =4,28.104 -
1,77.103 0,9991
Diurom 0,05 – 5,0 0,05Y =1,02.105 +
5,41.103 0,9990
Fipronil 0,1 – 5,0 0,1Y =6,19.104
+6,91.103 0,9992
Tabela - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos no sistema
HPLC-DAD
38
CURVA ANALÍTICA
As curvas analíticas para o 2,4-D e fipronil apresentaram linearidade na faixa
de 0,1 a 5 mg L-1 e para o Diurom apresentaram linearidade na faixa de 0,05 a 5
mg L-1. O coeficiente de correlação linear com valores de R2>0,9980
Curva analítica dos padrões
39
Testes de exatidão e precisão em 3 níveis de concentração
10g de amostra e 5ml de
acetonitrila
Relação: massa de
amostra: volume de
solvente 2: 1
Tabela - Limites de detecção e quantificação do método (mg Kg-1)
40
AgrotóxicoLODm LOQm
DSPE
Diurom 0,016 0,05
2,4-D 0,104 0,3125
Fipronil 0,041 0,125
41
Desenvolvimento e validação de um método multiresíduo para determinação
de agrotóxicos por LC-MS/MS
Ministério da Agricultura e da ANVISA: ingredientes ativos autorizados.
Disponibilidade de padrões
Compostos Massa molar
(g.mol-1)
Transição
(m/z)
Íon Precursor
> Íon Produto
Energia de
Colisão
(eV)
Voltagem
do Cone
(V)
Imazapique 275 276>231
276>185
20
30
40
40
Simazina 201 202>132
202>124
18
18
35
35
Carbofurano 221 222>165
222>123
20
20
25
25
Atrazina 215 216>174
216>146
20
22
33
35
Diurom 233 233>72
233>160
20
25
28
28
Clomazone 240 240>125
240>100
20
15
25
30
42
Tiametoxan 291 292>181
292>122
30
31
23
23
Imidacloprido 255 256>209
256>175
256>210
14
14
30
30
Modo de ionização negativo ESI-, para o modo de aquisição MRM
Compostos Massa molar
(g.mol-1)
Transição
(m/z)
Íon Precursor
> Íon Produto
Energia de
Colisão
(eV)
Voltagem
do Cone
(V)
2,4-D 221 219>161
219>89
20
30
15
15
Fipronil 437 435>330
435>250
15
26
30
25
43
Compostos
selecionados
MeOH:água 0,1%
ácido fórmico
50:50
Tempo de corrida:
20 min
MeOH:água
0,1% ácido
fórmico
65:35
MeOH:água
0,1%ácido
fórmico
60:40
MeOH:água 0,1%
ácido acético
65:35
Imazapique 2,15 1,81 1,81 2,76
Simazina 3,72 2,33 2,68 2,42
Carbofurano 3,46 2,15 2,50 2,15
Atrazina 5,90 2,94 3,63 3,02
Diurom 7,55 3,20 4,07 3,29
Clomazona 8,77 3,46 4,50 3,55
Tiametoxam 1,54 1,46 1,46 1,46
Imidacloprido 1,72 1,54 1,54 1,54
2,4-D 8,62 3,83 4,79 11,58
Fipronil Não eluiu em 20
min
7,66 13,15 8,36
44
Quadro : Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32
Classe Grupo químico Classificação
toxicológica
LMR
mg/kg
Anvisa
Carbofurano Acaricida,
nematicida
Metilcarbamato de
benzofuranilaido
Classe I 0,1
Atrazina Herbicida triazina II 0,25
Simazina Herbicida triazina III 0,02
AGROTÓXICOS SELECIONADOS
45
Quadro 1: Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32
Classe Grupo químico Classificação
toxicológica
LMR
mg/kg
Anvisa
Clomazona Herbicida Isoxazolidinona III 0,1
Imazapique Herbicida Imidazolinona II 0,1
Tiametoxam Inseticida Neonicotinóide III 0,02
AGROTÓXICOS SELECIONADOS
Imidacloprido Inseticida Neonicotinóide III 0,05
46
Compostos LQ instrumental [mg L-1] LD instrumental
[mg L-1]
Imazapique 0,05 0,016
Simazina 0,01 0,0033
Imidacloprido 0,001 0,00033
Tiametoxam 0,05 0,016
Atrazina 0,005 0,0016
2,4-D 0,01 0,0033
Fipronil 0,05 0,016
Clomazone 0,0005 0,00016
Carbofurano 0,001 0,00033
Diurom 0,005 0,0016
47
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
200,00
5mL
10mL
Variação do volume de acetonitrila
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
Sem cleanup
Com cleanup
Avaliação da etapa de clean-up
Testes de otimização DSPE
48
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
MgSO4
MgSO4 + NaCl
Influência do uso de NaCl
49
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
Temperatura 105˚C
Temperatura ambiente
Influência da temperatura no melado
50
Agrotóxico
Ponto
de
fusão
(ºC)
log Kow
Solubilidade em
água (g L-1) Pressão de vapor (mPa)
(25 ºC)
Diurom**158-
159°C2.85 (25 ºC)
0,0364 ()1.1 X10-3
2,4-D 140,52.58-2.83 (pH
1)
0,311 (pH 1), 20,
031 (pH 5), 23,180
(pH 7), 34,196 (pH
9)
1.86 X 10-2
Fipronil * 200-201 4,00,0019 (pH 5),
0,0024 (pH 9)3.7 X10-4
Fonte: The e-Pesticide Manual (thirteenth edition) version 3.0
*slowly hydrolysed at pH 9 (DT50 c. 28 d). Stable to heat. Slowly degrades in sunlight
**Stable in neutral media at normal temperatures, but hydrolysed at elevated temperatures.
Hydrolysed by acids and alkalis. Decomposes at 180-190 ºC.
Efeito de matriz
51
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
46,65 61,7491,68
135,16
16,5856,48 74,01
26,54
83,90
209,83
%EM
100 metanol padrão área
matriz padrão área% xEM
KRUVE et al., 2008
52
PRÓXIMOS TESTES
-Curva na matriz para os compostos no HPLC-DAD;
-- Testar etapas de pré-concentração;
-Ensaios de fortificação em níveis menores de concentração;
-Para os compostos no LC-MS
-Ensaios de fortificação nas matrizes de melado, caldo de cana, cachaça
--Curva na matriz para o caldo de cana,
-Avaliação do efeito de matriz em ambas matrizes;
-Testes com líquidos iônicos para a matriz caldo de cana....
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REFERÊNCIAS
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