Estudo de precursores eosinofilicos derivados de sangue de ... · Estudo de precursores eosinofilicos ... doutorado algo construído e dirigido com competência ... do desenvolvimento

Fundação Oswaldo Cruz Instituto Fernandes Figueira Pós Graduação em Saúde da Criança e da Mulher

Estudo de precursores eosinofilicos derivados de sangue de cordão umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação

alérgica

Daniella Campelo Batalha Cox Moore

Rio de Janeiro Fevereiro 2008

Fundação Oswaldo Cruz Instituto Fernandes Figueira Pós Graduação em Saúde da Criança e da Mulher

Estudo de precursores eosinofilicos derivados de sangue de cordão

umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação alérgica


Orientadora: Dra Maria Ignez Capella Gaspar Elsas Co-orientador: Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas

Tese de doutorado apresentado aPós graduação em Saúde da Criançae da Mulher do Instituto FernandesFigueira para obtenção de titulo dedoutor.

Rio de Janeiro Fevereiro 2008

Dedico esta tese à meus filhos,

João Felipe e Gustavo.

AGRADECIMENTOS

Agradeço de todo o coração, à minha família: meus pais, Maria Lúcia e Frank,

minhas irmãs, Vanessa e Paula (as melhores amigas que alguém pode ter), meu esposo

Alberto pelo apoio, amor e compreensão dedicados a mim, em especial durante o período

da tese de doutorado.

Durante a realização deste doutorado muitas pessoas importantes passaram a fazer

parte da construção desta tese de doutorado e deste período da minha vida.

Agradeço à Drª Maria Ignez Gaspar Elsas, , pela oportunidade e orientação e pelo

acolhemimento como profissional. Agradeço a oportunidade de desenvolver com ela este

trabalho de pesquisa e incorporar à minha vida a experiência de trabalhar em um

laboratório sério e comprometido com a verdade e com os princípios éticos e técnicos da

pesquisa científica.

Ao Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas, um agradecimento especial e o meu

reconhecimento sincero de sua integridade profissional. Agradeço a orientação impecável

e sobretudo a paciência e a argüição rigorosa, mas sempre generosa, que tornaram possível

a realização desta tese de doutorado e que lapidou de forma marcante a minha postura

profissional.

Agradeço a Pós graduação do Instituto Fernandes Figueira por fazerem deste

doutorado algo construído e dirigido com competência e amor ao ensino.

Aos colegas de laboratório, atualmente amigos queridos que me apoiaram de todas

as formas possíveis ao longo de todo o período de construção desta tese. Agradeço a Anisia

Praxedes, Bianca De Lucca, Carla Jones, Daniela Masid, Maria Carolina Souza, Marcelo A.

Gardel, Mônica Barradas, Ricardo Alves Luz, Roseli da Cunha Rodrigues,Túlio Queto,

Vanessa Ecard e Zilton Vasconcelos.

Agradeço especialmente a Túlio Queto que foi meu anjo da guarda, estando sempre

disponível e solícito durante todo este doutorado, tendo sido sua colaboração fundamental

para a boa formatação de todas as figuras contidas na tese.

Agradeço especialmente a Zilton Vasconcelos pela ajuda e nos procedimentos de

separação magnética de CD34+ e citometria de fluxo.

Agradeço especialmente a Ricardo Luz por toda ajuda com o protocolo de cultura

de sangue humano.

Agradeço a colegas de laboratório, Elisabeth Maximiano Santos e Simone Salles ,

que por motivos pessoais nos deixaram ao longo do caminho, mas que marcaram sua

presença de forma inesquecível.

Ao Departamento de Pediatria e Obstetrícia da Maternidade Oswaldo Nazareth pela

recepção cordial e prestativa e sobretudo minha admiração ao serviço pelo reconhecimento

da importância do incentivo à pesquisa. Em especial, meus agradecimentos ao Dr.

Arnaldo Costa Bueno. Agradeço a colaboração de todas as equipes médicas e de

enfermagem de obstetrícia que me recepcionaram sempre de forma prestativa e forneceram

suporte para que o sangue de cordão umbilical fosse colhido da maneira adequada.

Ao Departamento de Obstetrícia do Instituto Fernandes Figueira pela colaboração

valorosa para a construção desta tese de doutorado. À Drª Augusta Maria Batista de

Assumpção, chefe do Departamento de Obstetrícia pelo reconhecimento da importância da

pesquisa científica e a todas as equipes médicas e de enfermagem, que forneceram uma

ajuda de suma importância na coleta de sangue de cordão umbilical. À Dra Valéria Seidl

pela ajuda inestimável.

Agradeço a CAPES pela bolsa de doutorado recebida para a realização do

doutorado.

Agradeço aos membros da minha banca de doutorado: Dr. José Roberto de Moraes

Ramos, Dr. Marcelo Pelajo Machado, Dr. Zilton Farias Meira de Vasconcelos, Dr Neio

Lucio Fernandes Boechat Boechat e Dra Maria Ignez Capella Gaspar Elsas, pelas valiosas

sugestões e orientações

“Determinação, coragem e auto confiança são fatores decisivos para o sucesso. Se

estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los.

Independente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de

orgulho.”

Dalai Lama

RESUMO

Os corticoesteróides são as principais drogas utilizadas no controle da inflamação alérgica, na qual o eosinófilo tem um papel importante. Contudo, os corticoesteróides também têm um papel essencial na resposta de estresse, que está associada à piora clínica nas alergias. O uso de culturas de células hematopoiéticas oferece uma oportunidade para estudarmos o efeito dos glicocorticóides sobre a linhagem eosinofílica num período crítico do desenvolvimento do sistema imune. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos glicocorticóides sobre a diferenciação eosinofílica em cultura de sangue de cordão umbilical humano. Foram realizadas culturas líquidas por 14 a 28 dias, na presença de IL-3, IL-5 e GM-CSF, a partir de células mononucleares ou de células enriquecidas em progenitores CD34+, obtidas a partir de sangue de cordão umbilical. Adicionamos, onde indicado, dexametasona, hidrocortisona ou budesonide no início da cultura. Onde indicado, o mifepristone (RU486) foi acrescentado às culturas para avaliar o envolvimento do receptor de glicocorticóide nos efeitos observados. Observamos, na presença de dexametasona 10-7 M, um aumento do número de células totais, do percentual de eosinófilos e do número absoluto de eosinófilos, que foi estatisticamente significativo, em relação ao grupo controle. Com a presença de 10-7 M de budesonide e hidrocortisona, observamos auo mento estatisticamente significativo do percentual de eosinófilos e número total de eosinófilos. Os eosinófilos após coloração com Wright-Giemsa apresentavam grau de maturidade variável, com uma significativa proporção de células com o núcleo bilobado característico da forma madura. Em culturas enriquecidas na população CD34+, a dexametasona também aumentou o número de eosinófilos recuperados no 14o dia. Estudos cinéticos mostraram que a dexametasona, para ter efeito, precisava ser adicionada no início da cultura, sendo ineficaz quando acrescentada a partir do 14o e do 21o dia de cultura. No 28º. dia de cultura, não havia mais diferença significativa entre culturas experimentais e controles, sugerindo que os eosinófilos formados na presença de dexametasona sofreram envelhecimento e morte celular programada. Os efeitos da dexametasona foram bloqueados pela adição de RU486 à cultura, mostrando a importância do receptor de glicocorticóide para o efeito observado. A análise do efeito da dexametasona em experimentos realizados a partir de sangue de cordão umbilical de mães atópicas não mostrou diferença estatisticamente significativa quando comparado com experimentos realizados a partir de sangue de cordão umbilical de mães não atópicas. Desta forma, este estudo mostrou que a dexametasona, budesonide e hidrocortisona apresentam efeito potencializador sobre a linhagem eosinofílica em células hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical humano e que estes efeitos são mediados pelo receptor de glicocorticóide.

Abstract

Corticosteroids are the major therapeutic resources for the control of allergic inflammation, for which eosinophils are essential contributors. However, corticosteroids also have an essential role in stress responses, which are associated with the precipitatiohn of allergic episodes. The use of hemopoietic cell cultures allows us to study the effects of corticosteroids on the eosinophil lineage, in a critical period of development of the immune system. In the present study, we aimed at evaluating the effects of corticosteroids on eosinophil differentiation in human cord blood cultures. We established liquid culutres for 14 to 28 days, in the presence of IL-3, IL-5 and GM-CSF, with mononuclear cells, or with cells further enriched in CD34+ progenitors. Where indicated, dexamethasone, hydrocortisone or budesonide were added at the beginning of the cultures. Where needed, mifepristone (RU486) was added to the cultures to probe for the involvement of glucocorticoid receptors in effects of exogenous glucocorticoids. We observed, in the presence of dexamethasone 10-7 M, an increase in total cell numbers, in the percent of eosinophils, and the total eosinophil numbers, that was highly significant, relative to the control group. In the presence of 10-7 M budesonide or hydrocortisone, we observed a significant increase in the percent eoosinophils and total eosinophil numbers, over control cultures. Eosinophils stained with Wright-Giemsa displayed a variable degree of cytological maturity, with a sizable fraction presenting the typical bilobed nucleus of the mature form, and abundant cytoplasmic granules stained in red. In cultures enriched for CD34+ cells, dexamethasone also increased eosinophil numbers recovered by day 14. Kinetic analyses showed that dexamethasone had to be added at the beginning of the culture, and became ineffective if added at day 14 or 21. At the 28th. day of culture, there was no longer a significant difference between experimental and control cultures, suggesting that the eosinophils maturing in the presence of dexamethasone underwent subsequently senescence and programmed cell death. The effects of dexamethasone were blocked by adding RU486 to the culture, showing the requirement for glucocorticoid receptor signaling for the effects observed. The analysis of the effects of dexamethasone in experiments carried out with cord blood from atopic mothers did no show a significant difference relative to controls with samples from mothers who denyed previous atopic disease. Overall, our findings indicated that dexamethasone, budesonide and hydrocortisone present an enhancing effect on the differentiation of eosinophils from hemopoietic cells isolated from human cord blood, which is mediated by the glucocorticoid receptor.

LISTA DE ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensageiro CCR3 Receptor de quimiocinas CD102 ICAM-2 CD34 Molécula de superfície que marca células hematopoiéticas CD40L Ligante de CD40 CD54 ICAM-1 CD62L Molécula de superfície que caracteriza L-selectina CFU Unidade formadora de colônia CXCR2 Receptor de quimiocinas CXCR4 Receptor de quimiocinas ECP Proteína catiônica eosinofílica EDN Neurotoxina derivada do endotélio Eo/B Eosinófilos/ Basófilos FcεRI Receptor Fc do tipo I para imunoglobulina E FcεRII Receptor Fc do tipo II para imunoglobulina E GM-CSF Fator estimulador do crescimento de colônias de granulócitos e monócitos GR Receptor de glicocorticóide HPA Hipotálamo hipofisário adrenal ICAM-1 Molécula de adesão intercelular do tipo 1 ICAM-2 Molécula de adesão intercelular do tipo 2 ICAM-3 Molécula de adesão intercelular do tipo 3 IFNγ Interferon gama IgE Imunoglobulina E IL-1β Interleucina 1 beta IL-10 Interleucina 10 IL-11 Interleucina 11 IL-13 Interleucina 13 IL-2 Interleucina 2 IL-3 Interleucina 3 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-5Rα Subunidade alfa do receptor de interleucina 5 IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 LFA-1 Antígeno da função leucocitária do tipo 1 M2 Receptor muscarínico tipo 2 MBP Proteína básica principal MCP-1 Proteína quimiotática de monócito 1 MCP-2 Proteína quimiotática de monócito 2 MCP-3 Proteína quimiotática de monócito 3 MCP-4 Proteína quimiotática de monócito 4

PAF Fator de ativação de plaquetas RANTES Quimiocina para eosinófilos SAM Simpático adrenal medular STAT 5 Transdutor de sinal e ativador de transcripção 5 Th0 Linfócito T auxiliar Th1 Linfócito T auxiliar tipo 1 Th2 Linfócito T auxiliar tipo 2 TNFα Fator de necrose tumoral alfa VCAM-1 Molécula de adesão da célula vascular tipo 1 VLA-4 Antígeno muito tardio tipo 4

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Tabela de potências relativas e doses equivalentes dos corticoesteróides

25

FIGURA 2 – Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de células totais obtidas.

54

FIGURA 3 –Gráfico do efeito da dexametasona sobre o percentual de eosinófilos obtidos.

56

FIGURA 4- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número total de eosinófilos obtidos.

57

FIGURA 5a e 5b- Fotos das lâminas (controle e com dexametasona) de experimentos realizados a partir de células mononucleares coradas com panótico e wright giemsa.

58; 59

FIGURA 6- Gráficos de citometria de fluxo – análise da pureza de separação das células CD34+.

61

FIGURA 7- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de células totais obtidas em cultura realizada a partir de células CD34+.

62

FIGURA 8- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o percentual de eosinófilo obtido em cultura realizada a partir de células CD34+.

63

FIGURA 9- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de eosinófilos obtidos em cultura realizada a partir de células CD34+.

63

FIGURA 10ª e 10b – Fotos das lâminas ( controle e com dexametasona) de experimentos realizados a partir de células CD34+ coradas com panótico e wright-giemsa..

64 e 65

FIGURA 11- Gráfico do efeito do RU486 sobre o percentual de eosinófilos 67 FIGURA 12 – Gráfico do efeito do RU486 sobre o número de eosinófilos 68 FIGURA 13- Gráfico da cinética de ação da dexametasona – células totais. 69 FIGURA 14 – Gráfico da cinética de ação da dexametasona – percentual de eosinófilos

71

FIGURA 15- Gráfico da cinética de ação da dexametasona – número de eosinófilos.

72

FIGURA 16 – Gráfico do efeito do Budesonide – células totais 74

FIGURA 17- Gráfico do efeito do Budesonide – percentual de eosinófilos 75 FIGURA 18- Gráfico do efeito do Budesonide – número de eosinófilos 76 FIGURA 19- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – células totais 78 FIGURA 20- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – percentual de eosinófilos

79

FIGURA 21- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – número de eosinófilos 80

FIGURA 22 –Fotos de lâminas (controle e com hidrocortisona) coradas com Wright-Giemsa.

81

FIGURA 23- Gráfico de efeito da dexametasona sobre o número de eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados com sangue de cordão umbilical humano coletado de mães atópicas e não atópicas.

82

FIGURA 24 a e b- Gráfico de efeito da dexametasona sobre o número de eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados com sangue de cordão umbilical humano coletado de mães atópicas e não atópicas

83

FIGURA 25- Gráfico de enhancement entre experimentos realizados a partir de mães atópicas e não atópicas.

84

Figura 26. Tabela do Perfil de gestantes 85

ÍNDICE I – Introdução 1 1. Apresentação e justificativa do estudo 1 2. Revisão da literatura 3 2.1. Impacto das doenças atópicas na saúde da criança 3 A.Hipótese da Higiene 6

• Efeito irmão 7 • Freqüência a creche 9 • Colonização do intestino 10 • Exposição ao ambiente de fazenda 12 • Exposição a animais domésticos 13 • Exposição a endotoxina 14

B. Hipótese da Programação fetal 15 • Tipo de Parto 15 • Probióticos 16 • PUFA 17 • Antioxidantes 18

2.2 Estresse e alergia 21 A. Histórico 21 B. Estresse e corticoesteróides 22 C. Corticoesteróides e alergia 24 D. Mecanismo de ação dos corticoesteróides 25 E. Estudos experimentais 30 F. Relaçao entre os efeitos do estresse e a propensão a reações alérgicas 32 G. Importância dos corticoesteróides no amadurecimento pulmonar fetal. 37 2.3. Eosinopoiese 38 2.4. Citocinas eosinopoiéticas 40

• GM-CSF 40 • IL-3 41 • IL-5 41

3. Relevância do estudo 42

II- Objetivos 45 • Gerais 45 • Específicos 45

III- Metodologia 1. População de pacientes estudados e critérios de inclusão 46 2. Critérios de exclusão 46 3. Estudos com células hematopoiéticas 47

3.1.Materiais 47

3.2 Cultura de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical 48

3.3. Colorações hematológicas 52 3.4. Microfotografia 52 3.5. Métodos estatísticos 52 IV-Resultados 53

1. Efeito da dexametasona sobre a cultura realizada a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão

53

2. Efeito da dexametasona sobre a cultura realizada a partir de células CD34+ enriquecidas derivadas de sangue de cordão

60

3. Bloqueio dos efeitos da dexametasona pelo mifepristone 66 4. Cinética de ação da dexametasona 69

5. Efeito do budesonide sobre a formação de eosinófilos 73 6. Efeito da hidrocortisona sobre a formação de eosinófilos 77 7. Efeito da atopia materna sobre o efeito potencializador de eosinófilos pela dexametasona.

82

8. Pefil das gestantes e recém nascidos dos quais foram coletados o sangue de cordão umbilical humano.

84

V- Discussão 84

VI-Referências Bibliográficas 96 VII- Anexo 110 Anamnese 110 Termo de consentimento live e informado da Maternidade Oswaldo Nazareth

111

Termo de consentimento livre e informado da Maternidade IFF. 112 Autorização do Comitê de Ética da Secretaria Municipal de Saúde 113 Autorização do Comitê de Ética do Instituto Fernandes Figueira 114

1 INTRODUÇÃO


I- INTRODUCÃO

1. Apresentação e Justificativa do estudo.

No presente estudo, procuramos utilizar a cultura de células hematopoiéticas

isoladas a partir de sangue de cordão umbilical como um sistema experimental, visando

a analisar alguns dos efeitos da exposição aos corticosteróides e a outros agentes

moduladores da hematopoiese.

Em especial, procuramos definir se os glicocorticóides, da mesma forma que já foi

descrito em outros estudos que utilizaram medula óssea humana ou de animais

experimentais, potencializam em cultura de sangue de cordão a produção de eosinófilos,

na presença da combinação apropriada de citocinas (GM-CSF, IL-3 e IL-5).

Procuramos igualmente caracterizar o possível envolvimento do receptor de

glicocorticóide nos efeitos desta classe de agentes sobre a diferenciação hematopoiética

ex vivo.

A iniciativa deste estudo está ligada à necessidade de abordar a um problema

extremamente complexo, a saber, quais os fatores ambientais que podem influenciar o

desenvolvimento das doenças alérgicas, através da sua atuação no eixo Hipotálamo-

Pituitária-Adrenal (HPA), que é central para a homeostasia e para a imuno-regulação.

Uma grande quantidade de estudos da literatura indica que a evolução das

doenças alérgicas, ainda que delimitada por fatores hereditários, é decisivamente

influenciada pelo meio ambiente, através de uma ampla variedade de mecanismos –

como a atuação de subpopulações de linfócitos imuno-regulatórios, a exposição a

2 INTRODUÇÃO


produtos microbianos, com ativação dos receptores de tipo Toll, e os perfis de produção

de citocinas que resultam dessa exposição.

Como é próprio de estudos envolvendo seres humanos, no entanto, tais

mecanismos básicos se manifestam clinicamente num nível de organização biológico

muito superior, transparecendo sobretudo como efeitos epidemiológicos (“efeito irmão”,

“freqüência à creche”, “exposição a ambiente de fazenda”, entre tantos outros).

Dentre os muitos problemas científicos interessantes e importantes que se

apresentam nesta área, hoje, procuramos nos concentrar na associação entre estresse e

alergia, ou, mais precisamente, em alguns mecanismos fundamentais que poderiam

contribuir para essa inegável associação.

No caso, o foco da nossa pesquisa foi a possível contribuição dos

glicocorticóides para a produção de eosinófilos, um dos subtipos de leucócitos mais

característicos das doenças alérgicas.

Achados da literatura sugerem que os glicocorticóides, em concentrações

compatíveis com a atuação do eixo hipotálamo-hipofisário, estimulam a produção de

eosinófilos a partir de células hematopoiéticas, o que forneceria um possível racional

para a influência do estresse na progressão da doença alérgica.

Tal mecanismo, se for confirmado com o uso de células de sangue de cordão

umbilical, que são representativas do sistema hematopoiético fetal, e suscetíveis a uma

variedade de influências de origem materna, poderia ter o interesse adicional de sugerir

um racional para a conhecida associação entre estresse nas mães e alergia nos filhos.

3 INTRODUÇÃO


2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1- Impacto das doenças atópicas na saúde da criança

As doenças atópicas, tais como asma brônquica, rinite alérgica, dermatite

atópica e conjuntivite alérgica apresentam um curso de evolução crônico com períodos

de exacerbação. Estima-se que os custos econômicos mundiais de apenas a asma

brônquica, exceda a combinação de custos da infecção pelo HIV/SIDA e tuberculose

(Gleich, 2000), que são consideradas problemas epidemiológicos de importância

mundial.

A morbidade relacionada a estas doenças, e o custo elevado com medicações ( e,

por vezes, internações) tornam as doenças alérgicas e sua fisiopatologia alvos constantes

de investigação. A prevalência da asma e outras doenças alérgicas tem aumentado nas

últimas décadas (Warner et al, 2000). Tem ocorrido um aumento no número de

admissões hospitalares, particularmente em lactentes com asma, que não é devido nem a

um aumento na taxa de readmissão nem a uma redução na gravidade requerida para a

admissão. Isto gera um problema econômico. No Reino Unido em 1993, 11% do custo

total com prescrições foi gasto com drogas para o tratamento de asma. No mesmo ano,

ocorreram 103.000 admissões hospitalares por asma, sendo que 1 em 4 eram pacientes

na faixa pediátrica. Os custos indiretos não podem ser quantificados, mas um recente

estudo com 8000 crianças com asma mostrou que 56% eram sintomáticos a cada

semana, e 20% acordavam toda a noite com os sintomas. Além disso, 74% revelaram ter

ao menos restrições moderadas no seu estilo de vida (Warner, 1990). Anualmente,

4 INTRODUÇÃO


segundo o Consenso Brasileiro de Manejo de Asma, ocorrem cerca de 350.000

internações por asma no Brasil, constituindo-se na quarta causa de hospitalização pelo

SUS (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianças e adultos jovens. Há

registro de aumento desse número de internações entre 1993 e 1999, e indícios de que a

prevalência da asma esteja aumentando em todo o mundo, inclusive no Brasil (III

Consenso Brasileiro de Asma). Em 1996, os custos do SUS com internação por asma

foram de 76 milhões de reais, 2,8% do gasto total anual e o terceiro maior valor gasto

com uma doença. Foi realizado um estudo multicêntrico (International Study for

Asthma and Allergies in Chilhood - ISAAC) em 56 países, que mostrou uma

variabilidade da asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando o Brasil em 8o. lugar, com uma

prevalência média de 20%. A mortalidade de asma ainda é baixa, mas apresenta uma

magnitude crescente em diversos países e regiões. Nos países em desenvolvimento, a

mortalidade por asma vem aumentando nos últimos 10 anos, correspondendo a 5-10%

das mortes por causa respiratória,com elevada proporção de óbitos domiciliares

(Chatkin et al, 1999).

Os estudos de comparações de prevalência regionais e internacionais são

imprescindíveis para o estudo etiológico da asma. Entretanto, estes estudos são difíceis

de realizar, uma vez que um estudo de prevalência de asma requer um mínimo de 1000

pessoas (idealmente 3000 pessoas), com uma taxa de resposta maior que 90%, para que

se possam estimar a prevalência e a gravidade com precisão razoável (Beasley et al,

2000). Apesar destas dificuldades, o estudo de comparações internacionais já nos trouxe

algumas informações valiosas. Foi observado que a prevalência de asma está

aumentando no mundo todo. A prevalência da asma é maior nos países desenvolvidos e

5 INTRODUÇÃO


naqueles que falam a língua inglesa. Tem sido observado um aumento da prevalência da

asma nos países em desenvolvimento, à medida em que estes se tornam mais

desenvolvidos, mais urbanizados. A prevalência de outros distúrbios alérgicos tais como

rinite, dermatite atópica, e urticária também está aumentando no mundo todo (Beasley

et al, 2000). Estas características dos padrões internacionais de prevalência da asma

suscitam questões importantes. É evidente, com base neste conhecimento, que nenhum

fator etiológico já identificado possa ser responsabilizado sozinho pelo aumento da

prevalência da asma no mundo todo. Por exemplo, temos evidências, através das

comparações globais de que a poluição do ar não é o fator de risco principal para o

desenvolvimento da asma. Regiões como a China e o Leste Europeu, que são os locais

que possuem os mais altos níveis de poluição do ar, em geral, apresentam taxas de

prevalência de asma menores do que aquelas encontradas em países como Austrália,

Nova Zelândia e Estados Unidos, que apresentam níveis menores de poluição do ar. De

forma semelhante, as diferenças nos hábitos de fumo também não conseguem explicar

os padrões de prevalência global. Isto é ilustrado por um estudo realizado nas

comunidades chinesas que vivem no sudeste asiático, no qual a prevalência de asma

mais baixa foi observada na comunidade que vive no continente, apesar dos altos níveis

de consumo de cigarros (Leung, 1994). A sensibilização a alérgenos da poeira

domiciliar é um importante fator de risco para o desenvolvimento da asma (Sporik et al,

1992); entretanto, recentes estudos na China e África mostraram que podem ocorrer

diferenças significativas de prevalência de asma apesar da similaridade da taxa de

sensibilização atópica (Leung et al, 1997;,Yemaneberhan, 1997). Com base nisto,

6 INTRODUÇÃO


podemos conjeturar que existam outros fatores que possam afetar a suscetibilidade à

sensibilização alérgica (independente dos níveis de alérgeno).

Várias hipóteses tem surgido na tentativa de explicar este fenômeno, que

recentemente, parece ter atingido um platô tais como a hipótese da higiene e a hipótese

da programação fetal.

A- HIPÓTESE DA HIGIENE

Em 1989, a observação epidemiológica de Strachan, de que o risco de febre do

feno e a sensibilização alérgica diminuem à medida que aumenta o número de irmãos

numa prole, deu origem à chamada hipótese da higiene. Strachan propôs que a

diminuição no tamanho da família, a melhoria da moradia, e os altos padrões de limpeza

pessoal haviam reduzido as oportunidades de infecções cruzadas entre as crianças e que

as infecções poderiam ter um papel em prevenir as doenças atópicas (Strachan, 1989).

Esta teoria ganhou respaldo com as descobertas de Mosmann em 1986. Este autor

mostrou que quando células T CD4+ naive eram estimuladas, elas poderiam se

desenvolver em duas populações distintas com base no perfil de citocinas produzidas. A

população de células chamada Th1 produz interleucina 2 (IL-2), interferon γ (IFN-γ) e

fator de necrose tumoral alfa (TNFα). A população Th2 produz IL-4 (importante para a

mudança de isotipo de classe para IgE), IL-5 (importante para prolongar a sobrevida de

eosinofilos), IL-6 e IL-13 (estimula a produção de IgE) (Mosmann et al, 1986). A

descoberta destas subpopulaçoes ofereceu um arcabouço conceitual para a hipótese da

higiene. Dentro desta visão, uma baixa exposição a patógenos virais e bacterianos

durante a primeira infância resultaria em estimulação insuficiente das células Th1, que

7 INTRODUÇÃO


em condições normais, contrabalança a expansão de células Th2, e este desequilíbrio

resultaria em predisposição para doenças alérgicas (Braun-Fahrländer et al, 2002).

É conhecido que todos os RN nascem com um viés para uma resposta Th2. Isto

possivelmente ocorre porque o modo Th2 pode contribuir para a manutenção da

gravidez (Wegman et al, 1993). Repetidas infecções induzindo as atividades de

citocinas Th1, principalmente nos primeiros meses de vida, poderiam ajudar a resposta

T a amadurecer para um fenótipo mais balanceado. Os atópicos produzem menos IFN-γ

e o desvio para Th2 persiste (Prescott et al, 1999). Desta forma, eventos e exposiçoes

durante os primeiros anos de vida podem modular o desenvolvimento do sistema imune,

contribuindo para o recente aumento das alergias (Prescott, 2003).

Com base na hipótese da higiene, vários agentes infecciosos e condições que

predispõem a infecções em uma fase precoce da vida foram estudados tais como a

aglomeração, número maior de irmãos, freqüência a creche, imunizações, infecções

como sarampo e hepatite A e outros.

• EFEITO IRMÃO

Vários estudos sugerem que o fato de ter mais irmãos mais velhos protegeria o

filho mais novo das doenças atópicas , uma associação epidemiológica conhecida como

“efeito irmão”.

Segundo Strachan (Strachan, 1989), a possibilidade de infecções cruzadas entre o

irmão mais velho e o mais novo, protegeria o último do desenvolvimento de atopia por

induzir um perfil de citocinas Th1.

8 INTRODUÇÃO


Este efeito foi primeiramente descrito na literatura por Golding e Peters (Golding

e Peters, 1986) em um estudo que buscou avaliar a saúde e o comportamento das

crianças na Grã Bretanha, incluindo associações epidemiológicas com fatores de risco

como condições de moradia, classe social e fumo. Neste estudo foi detectado que para

asma e sibilancia não havia associação com o número de outras crianças na família,

mas para eczema e febre do feno, observou-se uma diminuição do quando havia um

número maior de irmãos.

Recentemente foi feita uma revisão por Karmaus (Karmaus e Botezan, 2002)

levando em conta a relação entre o número de irmãos e a presença de doenças alérgicas.

Para eczema, 10 dos 11 estudos analisados mostraram associação inversa com o número

de irmãos. 22 dos 31 estudos mostraram associação inversa para asma. Todos os 17

estudos de febre do feno mostraram associação inversa com o número de irmãos; 14 de

16 estudos mostraram associação inversa com a sensibilização alérgica. A proporção de

casos atribuíveis ao efeito irmão é considerada como sendo de 34% para o eczema, 28%

para asma, 56% para febre do feno, 38% para o desenvolvimento de IgE especifica.

Karmaus sugere que, se compreendermos melhor os fatores que compõem o efeito

irmão, poderemos previnir cerca de 30% dos casos de asma, eczema e febre do feno.

Foi demonstrado que os níveis de IgE encontrados diminuem à medida que se

avança na ordem de nascimento das crianças estudadas (Karmaus et al, 2001). Um

estudo de Van Gool (Van Gool et al, 2004) mostrou que a mais alta paridade é

associada com níveis mais baixos de IgE sérica neonatal. Outros determinantes de IgE

sérica neonatal achados foram : IgE sérica materna elevada, idade materna avançada e

9 INTRODUÇÃO


nascimento nos primeiros 3 meses do ano. Estes estudos levantam a possibilidade de

que o “efeito irmão”possa ter suas origens ainda no útero.

• FREQÜÊNCIA À CRECHE

A creche deve ser vista como um indicador de exposição precoce a numerosos

agentes infecciosos. Um estudo norueguês mostrou que a freqüência à creche

aumenta significativamente o risco de infecções do trato respiratório superior e de

otite recorrente, em crianças de 3-5 anos (Nafstad et al, 1999). Estes achados foram

confirmados por um estudo prospectivo, que mostrou que lactentes que freqüentam

creches no primeiro ano de vida estão em maior risco para o desenvolvimento de

infecções de ouvido, resfriados, ou doenças do trato respiratório inferior como

bronquite, bronquiolite e pneumonia (Celedon et al, 1999).

A frequência à creche na primeira infância é uma característica do estilo de

vida da Alemanha Ocidental. Em um estudo alemão , Kramer (Kramer et al, 1999)

mostrou que crianças que entravam na creche no primeiro ano de vida apresentavam

risco menor para o desenvolvimento de febre do feno e de positividade ao teste

cutâneo para alergenos. Um estudo nos Estados Unidos corroborou este achado

mostrando que lactentes que freqüentavam a creche nos primeiros 6 meses de vida

estavam associados com um risco diminuído para atopia após um período de 13

anos de acompanhamento clínico, embora apresentassem mais sintomas de

broncoespasmo aos 2 anos (Ball et al, 2000).

10 INTRODUÇÃO


• COLONIZAÇÃO DO INTESTINO

O estímulo microbiano, tanto pela flora comensal como por patógenos

no intestino, pode ter um papel protetor contra o desenvolvimento de atopias.

Matricardi e colaboradores (Matricardi et al, 2000) mostraram em um estudo caso-

controle, realizado com cadetes italianos, que a atopia era inversamente relacionada

com marcadores de infecções transmitidas através da rota orofecal ou transmitida

através de mãos contaminadas ou alimentos (Toxoplasma gondii, Helicobacter pylori

e vírus da hepatite A). Os autores sugeriram, neste estudo, que características da vida

ocidental que poderiam estar ligadas a este aumento das alergias incluiria a dieta

ocidentalizada, com uso de aditivos anti microbianos, e com baixo conteúdo

microbiano aliada à diminuição da transmissão de doenças pela via orofecal. Sepp e

colaboradores mostraram que a flora intestinal de lactentes da Estônia (onde a

prevalência de alergia é relativamente baixa) difere da flora intestinal de lactentes

suecos de 1 ano de idade. Nos lactentes da Estônia eram achados mais

freqüentemente lactobacilos. Em contraste, as contagens de Clostridium ( em

particular Clostridium difficile ) eram mais altas nos lactentes suecos (Sepp et al,

2005). Foi feito outro estudo que comparou estas duas populações, mas dividindo

cada um em indivíduos alérgicos e não alérgicos. Este estudo mostrou que as

crianças alérgicas dos dois paises mostravam intestino menos colonizado com

lactobacilos do que as não alérgicas achado (Bjöksten et al, 1999).

11 INTRODUÇÃO


Tem sido observada uma baixa prevalência de sensibilização alergênica

em crianças de escolas antroposóficas quando comparadas a outras crianças da

mesma idade da vizinhança. O estilo de vida da Antroposofia, que inclui o uso

restrito de antibióticos e o uso em grande quantidade de alimentos fermentados, que

contêm abundantemente lactobacilos, tem sido associado com um risco diminuído de

alergia (Alm et al, 1999). Um estudo mostrou que o uso prévio de antibióticos

causava desvio para uma resposta imune tipo Th2, provavelmente por causar um

distúrbio na flora intestinal, sendo este efeito prevenido pela suplementação oral com

bactérias intestinais probioticas (Sudo et al, 2002).

Um estudo randomizado controlado, com 159 crianças de alto risco, mostrou

que a administraçao perinatal de bactérias intestinais probióticas (Lactobacilus GG)

diminuiu o desenvolvimento de eczema atópico durante os primeiros 2 anos de vida

(Kalliomaki et al, 2001). Em apoio a este estudo, temos alguns outros estudos bem

sucedidos, que usaram cepas especificas de probióticos para o tratamento de crianças

com eczema atópico e alergia ao leite de vaca (Majama et al, 1997; Isolauri et al,

2000)

Um estudo de Nover testou uma dos aspectos da hipótese da higene, ao

investigar se a antibioticoterapia e alterações na microbiota, incluindo o crescimento

de Candida albicans poderia desregular a resposta imune, gerando uma resposta do

tipo Th2 em resposta a um alergeno inalavel (Noverr et al, 2004 ) .Neste estudo, os

autores demonstraram que, em modelo animal, a resposta alérgica pode ocorrer se

houver perturbação da microbiota intestinal.

12 INTRODUÇÃO


• EXPOSIÇÃO A AMBIENTE DE FAZENDA

Vários estudos têm mostrado que existe uma menor prevalência de febre do

feno e de sensibilização alergênica em crianças de fazenda, quando comparadas com

crianças que não são de fazenda (Braun-Fahrländer et al, 1999 ). Um estudo de Ernst

& Cornier (Ernst & Cormier, 2000) mostrou uma prevalência significativamente

mais baixa de asma (definida como sibilância e hiperreatividade da via aérea a

metacolina) e atopia (aferida atraves de teste de puntura para 24 alergenos inalados

comuns), em crianças criadas em fazenda, quando comparadas a crianças que

estudam na mesma escola, na mesma zona rural mas que não tem contato regular

com o ambiente de fazenda. Um estudo de Leynaert e col. foi conduzido para avaliar

se o fato de ter vivido em uma fazenda quando criança poderia exercer um efeito

protetor para atopia que persistisse pela vida adulta. Este estudo mostrou que o risco

de sensibilização atópica e de febre do feno foi mais baixo para aqueles indivíduos

que viveram em fazenda quando eram crianças do que entre os que não viveram

(Leynaert et al, 2001). Não foi achada associação entre o ambiente de fazenda na

infância e o risco de ter asma ou sibilância na vida adulta , sendo isto atribuído ao

fato de que a asma pode ter outros desencadeantes que não a atopia. Os autores

sugerem que este trabalho fornece evidências de que fatores ambientais encontrados

na infância podem ter um efeito protetor por um longo período contra o

desenvolvimento de atopia.

As condições de vida das famílias que vivem em fazenda diferem, em muitos

detalhes do estilo de vida de outras famílias. As diferenças incluem: um tamanho de

13 INTRODUÇÃO


família maior, mais animais domésticos, freqüente aquecimento da casa com lenha,

menos uso de fumo entre as mães, e hábitos de alimentação característicos (Von

Mutius, 2001) . Ainda não é conhecido o que, dentre estes fatores, determina o

“efeito fazenda”. Um estudo realizado na Áustria mostrou que o contato com granjas

ou pequenas criações de animais explicava a relação negativa entre o ambiente de

fazenda e atopia (Von Ehrenstein et al, 2000).

• EXPOSIÇÃO A ANIMAIS DOMÉSTICOS

Existe uma vasta literatura sugerindo que a sensibilização a animais

domésticos constitui um importante fator de risco para asma (Plaschke et al, 1999). A

sensibilização a animais domésticos pode ocorrer tanto em casas que tenham animais

como nas que não têm, e alguns estudos mostraram que o fato de ter um cachorro em

casa estava associado a um risco menor de sensibilização ao cachorro por volta dos

6-7anos (Ownby et al, 2002). Um outro estudo mostrou que ter um gato em casa na

infância estava associado a um risco menor de sensibilização aos gatos quando

adulto naqueles que tinham historia familiar de atopia (Roost et al, 1999).

Um estudo esclarece que os animais domésticos são muito mais do que os seus

alérgenos, e que o fato de ser dono de um animal domestico pode resultar em

diversas formas de exposições como mordidas de animais e arranhões , além da

exposição a altos níveis de endotoxina (Heinrich et al, 2001). Desta forma, como a

exposição passiva é importante, o fato de não ser dono do animal poderia deixar um

14 INTRODUÇÃO


individuo apenas com a exposição passiva ao alergeno . Os estudos ainda são

inconclusivos como indicado por revisão de Simpson e Custovic (Simpson &

Custovic, 2003): alguns estudos indicam que ser dono do cão ou gato aumentam e

outros que diminuem a sensibilização a estes. Entretanto, em função da exposição

passiva, o fato de não ter o animal em casa não necessariamente vai impedir que o

indivíduo seja sensibilizado. Desta forma aqueles indivíduos que apresentarem

sintomas relacionados com a sensibilização devem ser afastados da exposição para os

demais, a literatura ainda tem que trazer mais algumas respostas .

• EXPOSIÇÃO A ENDOTOXINA

As endotoxinas bacterianas são potentes imunomoduladores que podem inibir

a resposta Th2, pela indução de um perfil Th1 atraves da produção de IL-12 e IFN-γ

pelas células apresentadoras de antígenos(Douwes et al, 2004). Alguns estudos têm

mostrado que a atopia está associada com polimorfismo do CD14, que é o co-

receptor para endotoxina nos monócitos e outras células inflamatórias (Woo et al,

2003).

As concentrações de endotoxina têm se mostrado altas em casas de crianças

morando em fazendas, quando comparadas às casas de crianças que não moram em

fazendas (Von Mutius et al, 2000). Os níveis de endotoxina tem se mostrado altos em

paises desenvolvidos, quando granjas e pequenas criações são mantidas perto da

casa.

15 INTRODUÇÃO


O momento da exposição à endotoxina parece ser importante. É possível que

haja uma janela de oportunidade nos primeiros anos de vida, durante a qual o

fenótipo Th2 típico do nascimento pode ser desviado para o fenótipo Th1 (Martinez

& Holt, 1999). Em modelo animal foi mostrado que a exposiçao à endotoxina antes

do processo de sensibilização alergenica prevenia o desenvolvimento de atopia;

entretanto, a exposiçao de endotoxina após o estimulo alergênico aumentava o

infiltrado celular nas vias aéreas que é visto na fase tardia da reação alérgica (Tulik et

al, 2000).

B. HIPÓTESE DA PROGRAMAÇÃO FETAL

Uma outra hipótese para explicar a tendência mundial ao aumento das alergias é a

de programação fetal. Tem sido crescente o interesse na possibilidade de que a mãe

possa desempenhar, no curso da gestação, um papel determinante no desenvolvimento

da resposta imune fetal a alérgenos. Atualmente , as interações entre mãe, placenta e o

feto estão formando uma nova fronteira da pesquisa e oferecem um alvo potencial para

a intervenção no sentido de prevenir a asma alérgica (Warner et al, 1998).

• TIPO DE PARTO

Um estudo de Brown e colaboradores mostrou que o tipo de parto pode alterar a

produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue de cordão umbilical. Estes

autores mostraram que, quando o parto é normal, ocorre uma maior produção de IFN-γ

enquanto no parto cesariano ocorre diminuição. Os autores ressaltam a necessidade de

16 INTRODUÇÃO


outros estudos para avaliar por quanto tempo este efeito pode persistir, mas é possível

que o parto normal seja o primeiro estímulo para fazer com que o desvio Th2 protetor

da gravidez venha para um novo ponto de equilíbrio, uma vez que o interferon gama

estimula o perfil Th1 e inibe o Th2 (Brown et al, 2003)

• PROBIÓTICOS

Um estudo de Kaliomaki e colaboradores ressaltou a importância dos probióticos

na modulação das doenças alérgicas. Estes pesquisadores conduziram um estudo

randomizado controlado, no qual era introduzido o Lactobacilus GG no período pré

natal na dieta de gestantes que apresentassem risco para a transmissão de atopia (ou

seja, tenham ao menos um parente de primeiro grau com eczema ou parceiro com

eczema atópico, rinite ou asma) e de lactentes nos primeiros 6 meses de vida. O estudo

mostrou que a freqüência de eczema atópico aos 2 anos de idade foi reduzido à metade

no grupo que consumiu probiótico, quando comparado com o grupo placebo, o que

mostrou que o Lactobacilus GG é efetivo na prevenção do eczema atópico (Kaliomaki

et al, 2001). Os probióticos , especialmente as cepas Lactobacillus e Bifidobacterium,

são capazes de modificar in vitro o perfil de citocinas produzidas por monócitos e

linfócitos, levando à uma produção aumentada de interleucina 12 e interferon gama,

típica do fenótipo Th1 (Vaarala, 2003). Os probióticos podem portanto representar um

importante estímulo, capaz de conduzir o sistema imune fetal que encontra-se desviado

para o eixo Th2 rumo a um novo equilíbrio, sem com isso representar um dano ao

organismo, como o que seria causado por um vírus ou bactéria patogênica.

17 INTRODUÇÃO


Um estudo de Pohjavuori e colaboradores (Pohjavuori et al, 2004) mostrou que as

bactérias probióticas são potencialmente benéficas para o amadurecimento do sistema

imune do lactente. Estes pesquisadores conduziram um estudo randomizado duplo cego,

no qual pacientes com suspeita de alergia a leite de vaca receberam, por 4 semanas,

Lactobacillus rhamnosus GG. Foi mostrado que as células mononucleares periféricas de

lactentes com alergia a leite de vaca apresentam uma produção diminuída de IFN-γ e

que esta produção aumenta no grupo que recebeu o probiótico. A alergia a leite de vaca

é considerada uma manifestação de uma falha no estabelecimento da tolerância oral, e

em geral se resolve por volta dos 2 anos, quando o intestino completa seu

amadurecimento. A exposição apropriada a micróbios orofecais pode diminuir a

polarização para Th2, que é predominante no período neonatal e assim contribui para

um desenvolvimento de um perfil de citocinas e resposta a antígenos alimentares mais

equilibrado.

Apesar destes efeitos benéficos do uso dos probióticos em uma fase precoce da

vida, estudos em adultos não mostraram melhora de alergia a pólen após consumo de

lactobacillus (Helin et al, 2002).

• ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS (PUFA)

Em 1997, Black e Sharpe assinalaram que alterações recentes no consumo de

gorduras pela população poderiam ter algum papel no aumento das alergias. Nos países

industrializados, como conseqüência de medidas de saúde pública tomadas para

diminuir o risco de doença coronariana, o consumo de gordura saturada (manteiga e

18 INTRODUÇÃO


banha) foi diminuído e o consumo de n-6 PUFAs (presentes nas margarinas e óleos

vegetais) foi aumentado. Estes autores também sugeriram que o consumo diminuído de

óleo de peixe (atum fresco, arenque, cavala, truta e salmão) ou de produtos derivados do

óleo de peixe (óleo de fígado de bacalhau), rico em n-3 PUFAs, ácido

eicosapentaenoico (EPA) e acido docosahexaenoico (DHA) pode ter contribuído para o

aumento das alergias (Black & Sharp, 1997).

Os acidos graxos poliinsaturados (PUFA) mais comuns são o ácido linoléico (n-6)

e o ácido α-linoléico (n-3). O ácido linoléico é convertido em ácido araquidônico, que

pode ser subseqüentemente metabolizado pelas vias da ciclooxigenase e da

lipooxigenase para produzir prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos. O aumento da

produção de ácido araquidônico e de prostaglandina E2 aumenta a sensibilização

atópica. O ácido α-linoleico inibe o metabolismo do ácido linoléico uma vez que

compete pela mesma cascata enzimática (Devereaux & Seaton, 2005).

Outros nutrientes envolvidos nas alergias são os ácidos graxos. As dietas

ocidentais sofreram nas últimas décadas, um declínio no consumo de ácidos graxos

poliinsaturados anti inflamatórios (n-3 PUFAs), com um correspondente aumento do

consumo dos n-6 PUFAs. Alguns estudos utilizando suplementação de n-3 PUFA em

adultos com asma estabelecida tem sido desapontadores (Woods et al, 2000). No

entanto, isso pode significar apenas que, uma vez que a resposta imune esteja

estabelecida, pode já ser tarde demais. Com este entendimento, Dunstan e colaboradores

conduziram um estudo randomizado, controlado com 98 gestantes atópicas que

receberam n-3 PUFAs ou placebo desde a 20a. semana de gestação até o parto. Foi

encontrado uma produção diminuida de todas as citocinas neonatais (IL-5, IL-13, IL-10

19 INTRODUÇÃO


e IFN-γ), o que sugere que a suplementação com óleo de peixe pode ter um papel

imunoregulador (Dunstan et al, 2003) e não um papel na polarização Th1 ou Th2.

Ainda existem poucos estudos de intervenção com PUFAs, e desta forma, as evidencias

ainda são insuficientes para recomendar ou não o uso de suplementação dietética com

PUFA.

Um estudo de Kankaanpää e colaboradores mostrou que o baixo consumo materno

de alimentos ricos em n-3 PUFA estava associada com uma razão aumentada de n-6/n-3

PUFA no leite materno tanto em mães atópicas como saudáveis (Kankaanpää et al,

2001).

• ANTIOXIDANTES

Um dos mecanismos propostos para os danos sabidamente causados pela falta de

substâncias antioxidantes na dieta seria um aumento na suscetibilidade da via aérea ao

dano oxidativo, resultando em inflamação e asma (Devereaux & Seaton, 2005). São

incluídos como tendo atividade antioxidante: a vitamina E, vitamina C, vitamina A,

selênio , flavonóides (obtidos de frutas frescas, como maçãs).

O consumo diminuído de vitamina E, selênio, flavonóides e frutas pelas mães

durante a gestação e pelas crianças pequenas pode ter o potencial de predispor a asma.

Isto poderia ocorrer não apenas por afetar o desenvolvimento da via aérea através do seu

efeito antioxidante mas também através de efeitos estimulantes da produção de citocinas

Th1, não relacionado com ação anti-oxidante (Devereaux & Seaton, 2005) .

20 INTRODUÇÃO


Alguns estudos têm se preocupado em avaliar o papel da vitamina C. Soutar e

colaboradores conduziram um estudo populacional, comparando indivíduos que

apresentavam hiperreatividade de vias aéreas com controles. Os resultados indicaram

que o menor percentil de consumo de vitamina C estava associado com um risco sete

vezes maior de ter hiperreatividade (Soutar et al, 1997). Em outro estudo, Bodner e

colaboradores fizeram um estudo de seguimento e compararam quem desenvolveu

sibilância na vida adulta com aqueles que não evoluíram para este quadro. Os riscos de

apresentar sibilância se mostraram aumentados 2 vezes mais para o percentil mais baixo

de consumo de vitamina C, e 5 vezes mais para o percentil mais baixo de consumo de

vitamina E (Bodner et al, 1999).

O selênio é um importante componente da glutationa-peroxidase, uma importante

enzima do metabolismo oxidativo. Recentes estudos no Reino Unido mostraram que o

consumo de selênio pela população diminuiu muito e, que existe uma deficiência

subclínica de selênio (Brown et al, 1997).

Vários estudos tem mostrado uma relação inversa, no qual o percentil mais alto de

consumo de vitamina E apresentaria uma menor chance de sensibilização atópica

(Fogarty et a;. 2000). Um estudo (Devereux et al, 2002) mostrou que a resposta

proliferativa a alérgenos, em células mononucleares de sangue de cordão umbilical,

estava significativamente aumentada quando havia história familiar de doença atópica

ou hábito de fumo pela mãe, e diminuída significativamente por uma dieta materna rica

em vitamina E.

21 INTRODUÇÃO


Segundo Devereaux & Seaton, o papel dos antioxidantes e dos ácidos graxos

poliinsaturados (PUFA) na asma são provavelmente complementares (Rubin et al,

2004).

A vitamina A é uma classe que inclui o retinol e mais de 600 carotenóides

estruturalmente relacionados, muitos dos quais tem forte atividade antioxidante (Rubin

et al, 2004). Dois estudos em crianças mostraram associações negativas entre asma e os

níveis séricos de alfa caroteno e beta caroteno (Harik-Khan et al, 2004, Seaton &

Devereux, 2000).

2.2. Estresse e Alergia

A. Histórico

A importância clínica das glândulas supra renais foi avaliada pela primeira

vez por Addison, que descreveu o curso fatal da insuficiência destas glândulas em

pacientes com destruição adrenal em 1849. Tais estudos, posteriormente publicados

(1855), foram logo expandidos por Brown-Séquard, que demonstrou que a

adrenalectomia bilateral era fatal em animais de laboratório. Logo a seguir, foi

evidenciado que a córtex da supra-renal, ao invés da medula, era a parte essencial para a

sobrevida nestas experiências; muitos estudos adicionais demonstraram que a córtex da

supra-renal regulava o metabolismo dos carboidratos e o equilíbrio hidroeletrolítico. Por

fim, os esforços empreendidos por vários pesquisadores levaram ao isolamento e

caracterização de uma ampla diversidade de adrenocorticoesteróides. O estudo dos

fatores reguladores do metabolismo dos carboidratos (denominados glicocorticóides)

22 INTRODUÇÃO


culminou com a síntese da cortisona – o primeiro glicocorticóide biologicamente ativo a

ficar disponível em grande quantidade. Logo depois da cortisona sintética ter se

tornado disponível, Hench e colaboradores demonstraram a dramática melhora trazida

pelos glicocorticóides e do ACTH no tratamento da artrite reumatóide. Estes estudos

abriram caminho para o uso clínico dos corticoesteróides em uma ampla variedade de

estados patológicos (Goodman & Gilman, 1996).

Os corticoesteróides de ocorrência natural incluem três famílias de hormônios:

os glicocorticóides, os mineralocorticóides e os esteróides sexuais. Historicamente, as

ações dos glicocorticóides foram ligadas à regulação do metabolismo dos carboidratos,

mas como classe essas substâncias agem em todos os sistemas do organismo. Desde

1948, a hidrocortisona (cortisol), o principal hormônio produzido pela córtex adrenal na

espécie humana, é reconhecida como tendo potentes efeitos antiinflamatórios e

imunossupressivos quando administrado farmacologicamente (Asadullah et al, 2002).

B. Estresse e os corticoesteróides

Através de mecanismos ainda não totalmente compreendidos, os

corticoesteróides dotam o organismo com a capacidade de resistir a circunstâncias

estressantes, como os estímulos nocivos e as alterações ambientais. As ações anti-

inflamatória e imunossupressora dos corticoesteróides, que fundamentam um dos

principais usos terapêuticos desta classe de substâncias, também propiciam um

mecanismo protetor no contexto fisiológico, pois muitos dos imunomediadores

associados à resposta inflamatória diminuem o tono vascular e poderiam levar ao

colapso cardiovascular, quando não contrapostos pelos corticoesteróides adrenais. A

23 INTRODUÇÃO


taxa de produção diária de cortisol pode aumentar muito (pelo menos 10 vezes) no

quadro do estresse grave (Goodman & Gilman, 1996).

As modalidades de ação dos glicocorticóides (Sapolsky et al, 2000) durante o

estresse incluem: as ações permissivas (exercidas pelos glicocorticóides antes da

presença do estressor), supressivas (atribuídas ao aumento das concentrações de

glicocorticóides mediada pelo estresse), estimuladoras (associadas com o aumento da

concentração do glicocorticóide, iniciando-se 1 hora ou mais depois do aparecimento do

estressor) e preparativas (ações que não afetam a resposta imediata ao estressor, mas

modulam a resposta do organismo a um estressor subseqüente). As ações permissivas e

supressivas foram reconhecidas desde a década de 50. As ações estimuladoras foram

tidas como responsáveis pela proteção contra o estresse propiciado pelo aumento dos

níveis de glicocorticóides. Até onde sabemos, a designação de algumas ações dos

glicocorticóides como preparativas é nova. É raro, que os efeitos dos glicocorticóides

sobre algum sistema fisiológico consistam de apenas um destes tipos de ações. Em

princípio, todas as ações podem ser observadas dentro da ampla faixa de concentrações

de glicocorticóides. As ações permissivas são tipicamente associadas com níveis basais

de glicocorticóides (Sapolsky et al, 2000). Para ilustrar estas ações podemos recorrer a

uma analogia para melhor compreensão. Uma resposta imediata a um estressor, por

exemplo, um invasor armado, pode consistir em atirar no inimigo, o que corresponderia

à primeira onda de resposta hormonal ao estresse (catecolaminas, etc). Entre as ações

que poderiam modular esta resposta, as ações permissivas seriam aquelas que já

estivessem presentes no momento do ataque, como as armas de defesa. As ações

estimulatórias aumentam a resposta e são iniciadas após o ataque, e como exemplo,

24 INTRODUÇÃO


poderíamos citar o recrutamento de combatentes ativos da reserva. As ações

supressivas, que contraem a resposta defensiva, poderiam corresponder ao

cancelamento de um ataque para evitar a autodestruição por “fogo amigo”. As ações

preparativas poderiam ser o desenvolvimento de ações designadas não para repelir o

invasor, mas para estabelecer medidas de sobrevivência a longo prazo, para o caso do

conflito durar muito tempo, ou se reapresentar como uma próxima invasão (como

desenvolver melhores sistemas de detecção).

Citando um outro exemplo, temos que as ações dos glicocorticóides estão

relacionadas de modo complexo àquelas de outros hormônios. Por exemplo, na ausência

de hormônios lipolíticos, o cortisol quase não tem efeito sobre a taxa de lipólise nos

adipócitos. Da mesma forma, na ausência de glicocorticóides, a adrenalina e a

noradrenalina apresentam efeitos apenas discretos sobre a lipólise. A administração de

uma pequena dose de um glicocorticóide, no entanto, potencializa acentuadamente a

ação lipolítica dessas aminas. Estes efeitos dos glicocorticóides, envolvendo as ações

conjugadas a outros reguladores hormonais, permissivos, e, mais provavelmente ,

refletem as alterações na síntese protéica induzidas pelos esteróides, as quais, por sua

vez, modificam a responsividade do tecido (Goodman & Gilman, 1996).

C. Corticoesteróides e alergia

Os corticoesteróides são de longe o tratamento mais eficaz disponível até o

momento para o controle das doenças alérgicas, incluindo asma brônquica, rinite

alérgica e dermatite atópica (Barnes, 2001). Entretanto, quando administrados por

25 INTRODUÇÃO


tempo prolongado, seus efeitos benéficos podem ser sobrepujados pelos seus efeitos

colaterais, o que justifica os esforços em separar os efeitos benéficos dos

corticoesteróides dos seus efeitos colaterais indesejáveis. Do ponto de vista clínico,

uma boa maneira de reduzir o risco de efeitos colaterais é evitar estender o tratamento

além do tempo acima necessário. A terapêutica com glicocorticóides deve ser ajustada

a cada paciente individualmente (Asadullah et al, 2002). Outra possibilidade consiste no

uso de glicocorticóides mais seletivos com efeitos colaterais reduzidos. Isto reforça a

necessidade de um melhor entendimento das ações dos glicocorticóides para sua melhor

utilização.

Tendo em vista principalmente as ações antiinflamatórias do cortisol, foram

desenvolvidos vários glicocorticóides sintéticos. Na tabela 1 a seguir listamos as

potências relativas e doses equivalentes de alguns corticoesteróides naturais (como o

cortisol e a cortisona) e sintéticos (como a prednisona, prednisolona, triancinolona,

betametasona e dexametasona).

Drogas Potência antiinflamatória

Duração de ação

Dose equivalente

Cortisol 1 Curta 20 Cortisona 0.8 Curta 25

Prednisona 4 Intermediária 5 Prednisolona 4 Intermediária 5 Betametasona 25 Longa 0.75 Dexametasona 25 Longa 0.75

Tabela 1. Potências relativas e doses equivalentes dos corticoesteróides representativos (Goodman e Gilman, 1996). * curta: meia-vida biológica de 8-12 horas. Intermediária: meia-vida biológica de 12-36 horas. Longa: meia-vida biológica de 36-72 horas.

D. Mecanismo de ação dos corticoesteróides

26 INTRODUÇÃO


Os glicocorticóides ( Goodman & Gilman, 1996) interagem com proteínas

receptoras específicas nos tecidos alvo, regulando a expressão dos genes responsivos

aos corticoesteróides. O receptor de glicocorticóide (GR, do inglês glucocorticoid

receptor) situa-se predominantemente no citoplasma em uma forma inativa, até sua

associação ao ligante (glicocorticóide ou análogo inativo como o mifepristone). A

ligação do glicocorticóide ao receptor resulta em ativação do mesmo e subsequente

translocação para o núcleo. O GR inativo é encontrado como um complexo com outras

proteínas, inclusive (HSP)90 – membro da família de proteínas do choque térmico

induzidas pelo estresse; HSP70; e uma imunofilina de 56kDa – do grupo de proteínas

intracelulares que se ligam aos agentes imunossupressores ciclosporina e tacrolimus. A

HSP90, através de interações com o domínio de ligação de esteróides, pode manter a

conformação do GR de forma que favoreça a associação com estas proteínas que

servem de âncoras e que ajudam a reter o receptor no citoplasma na ausência de ligante.

Após fixação do ligante, a HSP90 e várias outras proteínas associadas sofrem

dissociação do GR, e o GR dirige-se para dentro do núcleo, onde pode interagir com

seqüências específicas de DNA dentro de regiões reguladoras dos genes-alvo.

Estas seqüências curtas de DNA presentes na região promotora, que são

identificadas pelo receptor de glicocorticóide ativado, são denominados elementos

responsivos ao glicocorticóide (GRE) e proporcionam a especificidade de alvo na

indução da transcrição gênica pelos glicocorticóides.

Esta ação sobre a transcrição pode ser inibitória ou estimulatória. Inicialmente

(Sapolsky et al 2000) a ligação do complexo hormônio-receptor ao GRE (os receptores

de mineralocorticóides, receptores de progesterona e de androgênios também se ligam

27 INTRODUÇÃO


ao GRE) era tida como necessária, tanto para a ativação como a repressão. Esta visão

ainda é aceita para a ativação, entretanto a repressão é mediada através da ligação a

GRE negativos (nGREs); Neste caso, o receptor desloca ou interfere com fatores

positivamente ativos em sítios adjacentes.

Existem muitos casos nos quais o receptor de glicocorticóide ativado não

necessita ligar-se ao GRE ou ao nGRE, ou até mesmo ao ADN, para controlar a

transcrição. O receptor de glicocorticóide ativado, pode, por exemplo, se ligar

diretamente a um outro fator de transcrição que ative a transcrição através do seus

próprios sítios de ligação com o ADN. Pode haver tanto interferência como

cooperação, sendo a interferência o resultado mais freqüente. Dentre os fatores-alvo

mais conhecidos, destaca-se a proteína ativadora –1 (AP-1).

A interação do glicocorticóide com o receptor de glicocorticóide (GR) pode

inibir a síntese de certas proteínas, através da redução na estabilidade do ARNm

correspondente, ao induzir a transcrição de genes que codificam ribonucleases

específicas. Este é o mecanismo pelo qual o glicocorticóide inibe a síntese de GM-

CSF, que tem um papel importante na sobrevida das células inflamatórias nos sítios de

inflamação (Barnes, 1998).

Os glicocorticóides podem atenuar ou suprimir a inflamação através do aumento

da síntese de várias proteínas antiinflamatórias. Eles aumentam a síntese de

lipocortina-1, uma proteína de 37 kDa que inibe a fosfolipase A2 e, conseqüentemente,

inibe a liberação do ácido araquidônico e a sua subseqüente metabolização a produtos

das vias da lipoxigenase e cicloxigenase, como os leucotrienos, tromboxanos e

prostaglandinas, além das lipoxinas. O bloqueio da fosfolipase A2 impede igualmente

28 INTRODUÇÃO


a produção de fator ativador de plaquetas (Barnes et al, 1998). Nas células epiteliais,

os glicocorticóides também aumentam a expressão da enzima endopeptidase neutra, que

degrada peptídeos inflamatórios, como a Substância P, a bradicinina e a endotelina-1.

Pacientes com asma, tratados com glicocorticóides inalados apresentam níveis mais

altos de expressão de endopeptidase neutra do que controles não tratados (Sont et al,

1997).

Os glicocorticóides aumentam a expressão de receptores β2 adrenérgicos

através do aumento da taxa de transcrição gênica. Isto pode ser relevante na asma,

impedindo a perda de receptores β2 adrenérgicos que ocorre após o tratamento

prolongado com agonistas β2 (Barnes et al, 1998).

Os glicocorticóides inibem a transcrição de várias citocinas que são relevantes

nas doenças alérgicas, incluindo IL-1β, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, TNF-α, GM-CSF e

quimiocinas que atraem células inflamatórias para os sítios de inflamação, incluindo IL-

8, RANTES, MCP-1, MCP-3, MCP-4, MIP-1α e eotaxina (Barmes et a;l 1998). Na

inflamação alérgica, a expressão das citocinas IL-4 (importante para síntese de IgE) e

IL-5 (importante para inflamação eosinofílica) também está inibida pelos

glicocorticóides (Barnes et al, 1998).

As moléculas de adesão têm um papel fundamental no tráfego de células

inflamatórias para os sítios de inflamação. A expressão de muitas moléculas de adesão

nas células endoteliais é induzida por citocinas como a IL-1β e o TNF-α, e como já

vimos, os corticoesteróides inibem a produção destas citocinas. Os glicocorticóides

podem também ter um efeito inibitório direto sobre a expressão de moléculas de adesão,

como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a E- selectina, através da inibição

29 INTRODUÇÃO


da transcrição gênica (Barnes et al, 1998). Um estudo de Juan e colaboradores (Juan et

al, 1999) avaliou o efeito da dexametasona em cultura de eosinófilos purificados

derivados do sangue periférico, no que se refere às moléculas de adesão. Este estudo

demonstrou que ICAM-3 encontra-se altamente expresso em eosinófilos em repouso.

Neste estudo não houve alteração de : LFA-1, Mac-1 ou CD18 em presença de

dexametasona na concentração de 10-6 M. Neste estudo, não foi mostrado efeito em

ICAM-1 e ICAM-2; houve contudo uma inibição significativa da expressão de ICAM-3

e um aumento na expressão de L-selectina .

Os glicocorticóides diminuem a sobrevida de algumas células inflamatórias como

os linfócitos T e os eosinófilos. A sobrevivência do eosinófilo é dependente da

presença de citocinas como IL-5 e GM-CSF. A exposição ao glicocorticóide em

determinadas condições inibe a produção destas citocinas e também leva a morte celular

programada ou apoptose. Contudo, quantidades mínimas destes fatores de sobrevida

são suficientes para antagonizar a indução de apoptose pelos glicocorticóides.

O mecanismo molecular pelo qual o glicocorticóide induz a apoptose em

eosinófilos e linfócitos T ainda não é bem compreendido. Em contraste, os

glicocorticóides diminuem a apoptose o que tem importantes implicações na resolução

da inflamação aguda de neutrófilos (Meagher et al, 1996).

Uma das isoformas de sintase de óxido nítrico (Nos-2, iNOS) é induzida por

citocinas inflamatórias, resultando em grande aumento da produção de óxido nítrico. O

óxido nítrico pode aumentar o fluxo sanguíneo regional e a exsudação de plasma e

pode amplificar a resposta inflamatória. Segundo algumas hipóteses pode contribuir

para a inflamação eosinofílica na asma, mudando o equilíbrio rumo ao perfil Th2,

30 INTRODUÇÃO


através da sua ação quimiotática para eosinófilos, paralelamente ao aumento da

sobrevida de eosinófilos (Yates et al, 1995). A indução de iNOS é inibida pelos

glicocorticóides, que podem bloqueá-la indiretamente através da inibição da transcrição

de NF-κB.

E. Estudos experimentais

Os glicocorticóides apresentam uma série de efeitos tanto in vivo como in vitro,

que parecem favorecer os mecanismos responsáveis pelas reações alérgicas

Examinaremos a seguir algumas evidências recentes de efeitos que favorecem nesta

ordem: a) a produção de eosinófilos; b) a produção de anticorpos anafiláticos; e c) a

produção de citocinas Th2.

Em 2000, um estudo realizado em camundongos normais e alérgicos (Gaspar

Elsas et al, 2000a) demonstrou que a dexametasona, um representante sintético do grupo

dos glicocorticóides, apresentava efeitos paradoxais quando adicionado às culturas de

medula óssea. Neste estudo, a dexametasona aumentou, de forma dose-dependente, o

número total de colônias mielóides formadas, assim como o tamanho das colônias

eosinofílicas e a fração de colônias mielóides que foram comprometidas com a

produção de eosinófilos. A dexametasona, em concentrações ainda mais baixas,

estimulava fortemente a diferenciação terminal de eosinófilos de camundongo a partir

da medula óssea cultivada na presença de IL-5. Este foi o mais recente e detalhado de

uma série de relatos de vários grupos (revisto em Gaspar Elsas et al, 2000b) mostrando,

em diferentes condições, estimulação da eosinopoiese por glicocorticóides.

31 INTRODUÇÃO


Um estudo mais recente (Debierre-Grockieco et al 2003) mostrou que a

dexametasona no curso da produção de eosinófilos em cultura, aumenta a proliferação e

diferenciação de células imaturas, enquanto aumenta a morte celular de células

maduras. Neste estudo, os autores sugerem que este efeito seja devido a uma ação sobre

STAT 5 ( transdutor de sinal e ativador de transcrição 5), que é um fator de transcrição

envolvido na proliferação, diferenciação e sobrevida das células hematopoiéticas que

interage com o receptor de glicocorticóide.

Um outro estudo (Miranda Buitenhuis et al, 2003) mostrou que STAT5 tem um

papel muito importante na diferenciação eosinofilica a partir de celulas CD34+

derivadas de sangue de cordão umbilical humano No sistema ex vivo, a expressão e a

ativação de STAT5 se mostrou bastante alta nas fases iniciais de diferenciação e

encontra-se diminuida nas fases finais de diferenciação o que poderia explicar o efeito

estimulador da dexametasona sobre as células imaturas e pró apoptótico sobre as células

maduras.

Um estudo avaliou o efeito do corticoesteróide in vivo na produção de IgE.

Neste estudo 10 pacientes que tiveram crise de asma receberam 20mg de prednisona e

todos apresentaram um aumento da IgE serica após o curso de prednisona. Além disso o

estudo mostrou que as células mononucleares do sangue periférico destes pacientes

produzizam níveis maiores de IgE in vitro quando a IL-4 exógena era adicionada (Zieg

et al, 1994). As bases moleculares para estes efeitos paradoxais dos corticoesteróides na

atopia foram pelo menos em parte elucidadas por Jabara et al., 2001, que demonstraram

que a síntese de IgE induzida pelo corticoesteróide, na presença de IL-4, depende de um

aumento da molécula coestimulatória ligante de CD40 (CD40L), uma glicoproteína

32 INTRODUÇÃO


transmembrana pertencente à superfamília do TNF. O CD40L é normalmente expresso

em linfócitos T ativados, que interagem com uma glicoproteína de superfície

denominada CD40 que é constitutivamente expressa em linfócitos B. A interação CD40

– CD40L é essencial para a indução da síntese de IgE pela IL4 e IL-13. Foi estabelecido

que o aumento da expressão de CD40L pela hidrocortisona envolve interação com GR e

translocação para o núcleo, onde o receptor vai agir, aumentando a transcrição de

RNAm para CD40L (Jabara et al, 2001). Os efeitos supressivos sobre a IL-4 e CD40

ocorrem em menores concentrações do que aqueles efeitos que envolvem aumento da

transcrição de CD40L (Barnes, 2001). A concentração de hidrocortisona que resulta

em ótima expressão de CD40L (10-6 M) está na faixa dos níveis de cortisol sérico

encontrados em humanos sob condições de stress (Jabara et al, 2001).

Um estudo de Ramirez e colaboradores (Ramirez et al, 1996), mostrou que

células T de rato, ativadas in vitro na presença de dexametasona, sintetizavam uma

quantidade maior de RNAm para IL-4, IL-10 e IL-13, enquanto a síntese de interferon

gama e fator de necrose tumoral alfa encontra-se diminuída globalmente, estes efeitos

da dexametasona favorecem um perfil TH2 .

F. Relação entre os efeitos do estresse e a propensão às reações alérgicas

Uma das mais comuns definições psicológicas de estresse têm sido de que o

estresse ocorre quando a demanda do ambiente ultrapassa a capacidade adaptativa

do indivíduo ou capacidade de lidar com a demanda (Cohen et al, 1991). Devido ao

fato de que a mesma demanda ambiental poder produzir respostas variáveis tanto

33 INTRODUÇÃO


do ponto de vista emocional, comportamental e psicológico, tem sido sugerido que

é essencial considerar a perspectiva subjetiva daquele evento supostamente

estressante. Desta forma, para que o evento adverso seja estressante ele tem que ser

considerado pelo indivíduo como algo ameaçador ou impossível de manejar.

Um estudo prospectivo de 18 meses envolvendo crianças com asma que

foram submetidas a uma experiência negativa de vida (ex; morte de um membro

próximo da família) mostrou um risco aumentado de crise de asma de cerca de 2 x

quando comparado com o grupo controle. É importante ressaltar que o impacto de

um evento negativo mostrou-se aumentado quando no contexto de estresse crônico

(Sandberg et al, 2000).

Um estudo prospectivo realizado com uma coorte de 150 crianças em risco

de ter asma (pelo fato de a mãe ter asma) mostrou que duas variáveis estavam

altamente associadas com a presença de asma aos 6 e 8 anos: a IgE sérica

aumentada aos 6 meses de vida e a taxa de dificuldades parentais avaliada quando o

RN tem 3 semanas de vida (Klinnert et al, 2001). Este estudo sugere que a história

natural da asma, uma das mais importantes doenças alérgicas, pode ter seu início

em uma fase bem precoce da vida, em um momento onde o sistema imune está se

desenvolvendo e ao mesmo tempo interagindo com fatores ambientais. O fato da

avaliação de eventos estressantes vivenciados pelos pais correlacionar-se

fortemente com a presença de asma aos 6 anos, nos remete a pensar novamente no

corticoesteróide, um dos principais hormônios do estresse como possível

modulador desta correlação.

34 INTRODUÇÃO


Um outro estudo realizado com 20 universitários alérgicos (teste cutâneo

positivo para inalantes e história de broncoespasmo) avaliou o estresse psicológico

associado com os exames finais e a resposta alérgica a alergenos inalados (Liu et

al, 2002). Este estudo mostrou que o período de exames finais e provavelmente o

estresse associado com este evento estava associado com um aumento da eosinofilia

no escarro e nos níveis de EDN ( neurotoxina derivada do endotélio) às 6 e 24horas

após a provocação com alergeno, refletindo o aumento dos eosinofilos na via aérea

Já é conhecido que sob a exposição a muitas formas de estresse agudo ocorre

a ativação do eixo HPA e do eixo SAM ( simpatico-adrenal-medular) levando a um

aumento da secreção de hormônios como cortisol, adrenalina e noradrenalina. Altos

níveis de cortisol diminuem a inflamação nas vias aéreas. De forma similar os

agonistas beta adrenergicos, como a epinefrina são potentes broncodilatadores

(Chen and Miller 2007). Também é conhecido que certos estressores, em especial

aqueles graves e crônicos, podem suprimir a função do sistema imune celular em

humanos Em conjunto, estas observações poderiam apoiar a idéia de que

experiências estressantes devem atenuar, em vez de exacerbar, as crises alérgicas.

Entretanto, os achados nos estudos de asma sugerem ao contrário que, o

estresse em geral piora as crises alérgicas. Várias hipóteses foram levantadas para

explicar esta associação.

Um estudo (Millet et al, 2007) mostrou que quando o estresse crônico

começa, ocorre uma ativação inicial do eixo HPA resultando em uma elevada

concentração circulante de cortisol e ACTH; entretanto, à medida que o tempo

passa, esta atividade diminui e a secreção de cortisol fica a níveis abaixo do

35 INTRODUÇÃO


normal, o que sugere que estressores crônicos podem levar o eixo HPA a ficar

menos responsivo.

Um outro estudo (Miller and Chen, 2006) mostrou que em crianças asmáticas

que vivenciaram simultaneamente condições de estresse agudo e crônico

apresentaram uma diminuição de 5,5 vezes no RNAm para receptor de

glicocorticoide (GR) na população de leucócitos.

Este estudo encontra apoio em um outro estudo envolvendo pacientes com

dermatite atopica, publicado por Buske-Kirschbaum e colaboradores em 2002. . A

dermatite atópica é uma doença inflamatória da pele de curso crônico, evoluindo

com períodos de exacerbação, cujos principais sintomas são a pele seca, eczematosa

e o prurido intenso (Leung et al, 2000). A importância do estresse na manutenção e

nas exacerbações da dermatite atópica é evidenciada por um estudo (King and

Wilson, 1991) que encontrou uma correlação significativamente positiva entre

níveis elevados de estresse interpessoal e exacerbações de dermatite atópica 24h

depois. Neste estudo, foi documentada a eficácia das intervenções psicoterapicas

na redução dos sintomas associados à dermatite atópica. Um outro estudo (Buske-

Kirschbaum et al, 2002) procurou estudar o eixo hipotálamo-hipofisario- adrenal,

em virtude deste ser uma das principais vias pela qual o sistema nervoso central

exerce seu controle sobre o sistema imune em condições estressantes. Neste estudo,

os autores mostraram que os pacientes que sofrem de dermatite atópica, apresentam

um eixo hipotálamo-hipofisário-adrenal com baixa responsividade, ou seja,

apresentam uma resposta atenuada de cortisol desencadeada pelo estresse e

ressaltam que a disfunção do eixo ocorre a nível suprapituitario, uma vez que, a

36 INTRODUÇÃO


resposta de ACTH ao estresse também encontra-se diminuida . Os autores discutem

a possibilidade de que o uso prolongado de corticoide inalado ou oral, assim como

o tratamento com esteróides tópicos em altas doses (Matsuda et al,2000), possa

resultar em um eixo HPA com baixa responsividade, como apontado por alguns

autores (Clark & Lipworth 1997).

Um estudo de Ball (2006) ressalta que, embora a relação entre alterações

funcionais do eixo hipotálamo-hipofise-adrenal e as doenças alérgicas ter sido

primariamente explicada como resultado do estresse associado à doença crônica,

trabalhos recentes mostraram que as alterações do ciclo circadiano do cortisol

podem preceder a doença alérgica. Desta forma, respostas aumentadas de liberação

de cortisol endógeno a estímulos estressores podem predispor indivíduos

suscetíveis à atopia e à doenças alérgicas, através do desvio do sistema imune para

uma resposta predominantemente TH2, aumentando a produção de IgE total e

alergeno especifica e/ou inibindo a tolerância imune periférica (Ball, 2006).

Finalmente, vários estudos sugerem que a exposição a altas doses de cortisona

pode desviar o sistema imune em direção a uma resposta predominantemente Th2

(Marshall and Agarwal, 2000). Em um estudo com estudantes universitários

asmáticos, Liu e col mostraram que no período de exames finais , a razão IFN-γ/IL-

5 (ou seja, desvio para resposta Th2) estava bastante aumentada e se correlacionava

com o número absoluto de eosinófilos no escarro após 24 horas de provocação

alergenica (Liu et al, 2002) .Tendo em vista o valor preditivo dos níveis de IgE aos

6 meses de vida para asma na infância (Klinnert et al, 2001), este mecanismo deve

ser importante .

37 INTRODUÇÃO


Com base nestes estudos é possível que o estresse crônico propicie as reações

alérgicas através de uma diminuição na quantidade receptores de glicocorticoides

em leucócitos, através da diminuição da resposta do eixo HPA ao estresse, e do

desvio do sistema imune para uma resposta Th2.

G. .Importância dos corticoesteróides no amadurecimento pulmonar fetal

O uso de corticoesteróide pré natal consagrou-se em 1995 com a

publicação do consenso do National Institutes of Health, a respeito dos efeitos dos

corticoesteróides na maturação pulmonar (Crowley, 2003). A administração de

corticoesteróides para mulheres antes de um parto prematuro está associada a uma

redução significativa na mortalidade e na incidência de síndrome de insuficiência

respiratória assim como de hemorragia intracraniana nos recém nascidos (Gibson,

2002). Foi realizada uma revisão dos benefícios e riscos do uso de corticoesteróide

antenatal para maturação fetal o que gerou algumas recomendações dos seus

revisores, o Comitê de Medicina Materno-fetal da Sociedade de Obstetras e

Ginecologistas do Canadá (SOGC). Estas recomendações (Crane et al, 2003) da

SOGC são: toda gestante entre 24-34 semanas de gestação que estiver em risco de

parto prematuro deve ser considerada candidata para o tratamento antenatal com

curso único de corticoesteróide; O tratamento deverá consistir de duas doses de

12mg de betametasona IM com intervalo de 24horas, ou 4 doses de 6mg de

dexametasona IM com intervalo de 12horas. Como não existem dados que garantam

a eficácia e segurança de cursos repetidos de corticoesteróides, isto não deve ser

38 INTRODUÇÃO


feito, devendo ficar reservado para gestantes participantes de ensaios controlados

randomizados. Visto que vários experimentos e estudos clínicos (Lee et al, 2006)

sugeriram um risco aumentado para dano neurológico com o uso da dexametasona

quando comparado com a betametasona, a betametasona perinatal deve ser a

primeira escolha.

2.3 Eosinopoiese

A inflamação eosinofílica é um dos principais fatores na patogênese das doenças

alérgicas, incluindo a asma brônquica. Um papel importante é atribuído ao eosinófilo

pelo seu potencial de causar dano aos tecidos (Popken-Harris et al, 1998). A ativação

dos eosinófilos envolve a liberação de ânions superóxido, mediadores lipídicos e de

componentes granulares tóxicos, como por exemplo, a proteína básica principal, a

peroxidase eosinofílica, a neurotoxina derivada do endotélio, a proteína catiônica

eosinofílica e a proteína do cristal de Charcot-Leyden (Mahmudi-Azer et al, 2000).

Os eosinófilos maduros se desenvolvem a partir de células hematopoiéticas

pluripotenciais (progenitores hematopoiéticos) que apresentam a glicoproteína CD34 na

sua superfície. Tem sido demonstrado um aumento do número de células CD34+ tanto

no sangue como na medula óssea de indivíduos asmáticos atópicos, quando comparado

com indivíduos normais (Kuo et al, 2001).

Recentemente, vários achados tem demonstrado uma contribuição das células

progenitoras inflamatórias para inflamação das vias aéreas na asma. Um destes é a

presença aumentada de unidades formadoras de colônias (CFU) para

eosinófilos/basófilos no sangue de indivíduos alérgicos (Cyr & Denburg, 2001). Estes

números flutuam de acordo com a exacerbação e resolução da asma clínica e estão

39 INTRODUÇÃO


aumentados após a inalação alergênica em associação com o desenvolvimento de

hiperresponsividade das vias aéreas (Kim et al, 1999). O aumento de células

progenitoras no sangue periférico e na medula óssea em resposta à inalação alergênica

provavelmente contribui para o acúmulo de células inflamatórias maduras nas vias

aéreas de indivíduos asmáticos, através do aumento da produção e liberação destes

progenitores pela medula óssea (Kim et al, 1999).

Até recentemente, era difícil e dispendioso estudar a linhagem eosinofílica no

homem. Eosinófilos maduros podiam ser isolados no sangue periférico em gradiente

de densidade, mas o rendimento era baixo, a pureza variável e o custo elevado. Estes

fatores eram influenciados de forma decisiva pelos números circulantes de eosinófilos

no sangue coletado. Por esta razão, a maior parte dos estudos era realizada com

eosinófilos purificados a partir do sangue de doadores com diversas formas de

eosinofilia, que não correspondem necessariamente ao encontrado no sangue de

indivíduos sadios. A eosinopoiese, por outro lado, só podia ser estudada em cultura de

medula óssea, o que necessitava de procedimentos invasivos, devido ao difícil acesso ao

compartimento medular.

Um estudo recente, contudo, demonstrou que as células mononucleares de

sangue de cordão umbilical humano, quando cultivadas na presença das citocinas IL-3 e

IL-5 por um tempo relativamente longo, dão origem a células que se coram como

eosinófilos, apresentando características similares aos eosinófilos humanos do sangue

periférico após ativação com fMLP (Zardini et al, 1997) . Portanto, este sistema pode

ser considerado um modelo de maturação eosinofílica in vitro, potencialmente útil para

a investigação das atividades biológicas dos eosinófilos. A maior vantagem da

40 INTRODUÇÃO


utilização de células mononucleares do sangue de cordão umbilical consiste na obtenção

de uma quantidade maior de eosinófilos que a disponível na circulação sanguínea de

indivíduos sadios. Os eosinófilos cultivados a partir de células mononucleares de

sangue de cordão umbilical tem capacidades funcionais similares em testes de

desgranulação e quimiotaxia, às dos eosinófilos maduros, mas não formam os grânulos

cristalóides maduros (Ohashi et al, 1999; Popken-Harris et al, 1998).

2.4. CITOCINAS EOSINOPOIÉTICAS

GM-CSF

GM-CSF foi primeiramente isolado de pulmoes murinos e mais tarde de uma

linhagem leucemica de celulas T. O GM-CSF recombinante ou purificado age na via de

diferenciação de granulócitos (que incluem neutrofilos e eosinofilos) e macrófagos,

estimula a formação de colônias de megacariocitos e provavelmente aumenta a

formação de colônias eritroides na presença de eritropoietina. Possui também muitas

atividades sobre as células maduras da via de diferenciação GM. Estimula a síntese de

membrana e proteínas nucléicas em granulocitos murinos, aumenta a adesão de

neutrofilos e expressão de glicoproteinas de adesão de superfície, inibe a migração de

neutrofilos, estimula a atividade citotoxica e fagocitica contra bactérias, parasitas e

células tumorais recobertas de anticorpos, e aumenta a sobrevida de neutrofilos e

eosinofilos humanos in vitro. Também tem efeitos indiretos, aumentando a produção

de superoxido em resposta a componentes quimiotaticos bacterianos, e aumenta a

liberação de acido araquidônico e a síntese de leucotrieno B4 em resposta a ionóforo de

cálcio (Barnes et al, 1998, Abbas et al, 1997) .

41 INTRODUÇÃO


Interleucina 3

A interleucina 3 (IL-3) também conhecida como fator estimulador de colônia

multilinhagem (Multi-CSF), é um produto de peso molecular 20-26 kDa das células T

CD4+, tanto do subtipo Th1 como Th2, que age sobre a maioria dos progenitores

imaturos da medula óssea e promove a expansão de várias linhagens mielóides.(Abbas

et al, 1997). A IL-3 recombinante parece ser um fator ativador para eosinofilos mas não

para neutrofilos. A administração de IL-3 no camundongo induz ao aumento de 10

vezes da eosinofilia sanguinea e de 2-3 vezes nos números de granulocitos e monócitos

(Barnes et al, 1998).

Interleucina 5

A IL-5 foi originalmente identificada de forma independente como um fator

envolvido em fenômenos inteiramente distintos: a) como um fator estimulante de célula

B que mediava a proliferação e diferenciação de linfócitos B e induzia secreção de

IgM (B cell Differentiation Factor II, ou abreviadamente, BCDF-II); b) como um fator

liberado em grande quantidade por linfócitos T de camundongos infectados com o

helminto Mesocestoides corti, que induz intensa eosinofilia no sangue e nos tecidos, e

que estimulava a medula óssea a produzir grande quantidade de eosinófilos em cultura

(Eosinophil Differentiation Factor, Eosinophil CSF). Além dos linfócitos Th, uma das

mais importantes fontes de IL-5 na inflamação alergia advém de mastócitos e

eosinófilos. A IL-5 interage com um receptor especifico que consiste em um

heterodimero formado pelas cadeias IL-5rα e IL-5rβ. A subunidade β é compartilhada

com os receptores de GM-CSF e IL-3 (Takatsu, 1992). Hoje, a IL-5 está firmemente

42 INTRODUÇÃO


estabelecida como o principal fator eosinopoiético em condições fisiológicas, e o sua

interação sinérgica com GM-CSF e IL-3, promovendo a eosinofilopoiese, está bem

documentada.

Após sua clonagem e geração de proteína purificada, a IL-5 humana mostrou ter

mínima atividade sobre os linfócitos B; em camundongos, a IL-5 parece desempenhar

um papel significativo na produção de anticorpos, consistente com a atividade de

BCDF-II originalmente descrita. Entretanto, a IL-5 induz o amadurecimento de uma

população homogênea de eosinófilos quando acrescida a cultura de precursores de

medula óssea (Clutterbuck et al 1989), e os camundongos transgênicos para a expressão

constitutiva de IL-5 desenvolvem intensa eosinofilia (Tominaga et al, 1991). Além de

sua capacidade de estimular a produção de eosinófilos, a IL-5 é quimiotática para

eosinófilos e capaz de ativar eosinófilos maduros. A importância da IL-5 nos distúrbios

alérgicos encontra suporte pela demonstração de níveis séricos aumentados de IL-5 na

síndrome hipereosinofílica, síndrome eosinofilia-mialgia e após desafio alergênico

endobrônquico (Borish and Rosenwasser, 1996).

Também pode atuar promovendo o crescimento e diferenciação de linfócitos B,

desempenhando um papel importante na síntese de imunoglobulina, especialmente IgA

(Barnes et al, 1998) .

3- Relevância

Asma e alergia são problemas de saúde pública em escala mundial . Sua

incidência está aumentando em todo o mundo, de forma explosiva nas últimas duas

43 INTRODUÇÃO


décadas (Warner et al, 1990) . Através do estudo de comparações globais não se

encontra um fator de risco já conhecido para o desenvolvimento da asma, que, sozinho

possa ser responsabilizado por este aumento de prevalência (Beasley et al, 2000). Desta

forma, tornam-se necessários estudos que avaliem a contribuição de outros fatores para

o aumento das doenças alérgicas. O presente estudo visa ajudar a elucidar o impacto dos

corticoesteróides, que constituem as drogas atualmente mais utilizadas para o

tratamento das doenças alérgicas, e que são igualmente mediadores centrais das reações

de estresse, sobre as células hematopoiéticas, em particular as precursoras da linhagem

eosinofílica.

O estudo de células hematopoiéticas em através do sangue de cordão umbilical

representa uma conquista para a pesquisa em saúde da criança e da mulher. O tecido-

alvo representa uma interface crítica onde os efeitos de diferentes fatores que

influenciam a mãe, a criança ou ambos podem ser criteriosamente avaliados (Thorton &

Vance, 2002). A literatura internacional é rica em estudos sobre hematopoiese

utilizando sangue de cordão umbilical (Zardini et al, 1997; Velásquez et al, 2000,

Scepek et al, 1997). Por outro lado, este sistema experimental se harmoniza

especialmente com a temática multidisciplinar da interação mãe-filho, que é

indissociável da missão institucional do Instituto Fernandes Figueira. Valorizando-se

este modelo, poderemos estabelecer uma ferramenta preciosa para futuros estudos que

envolvam efeitos de medicamentos na mãe e na criança. Principalmente se entendermos

esse momento do nascimento e os primeiros meses de vida como um período de janela

imunológica onde possíveis intervenções possam ter um impacto significativo.

44 INTRODUÇÃO


Durante a elaboração da dissertação de Mestrado defendida em 2003, obtivemos

resultados preliminares que apontaram para uma maior sensibilidade das células

hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical humano à ação estimulatória

da dexametasona, diferentemente do que ocorre em medula óssea murina. Para nossa

surpresa, o efeito no aumento da porcentagem de colônias eosinofílicas, com alto

significado estatístico foi encontrado na concentração de dexametasona mais baixa em

nosso estudo (10-11 M), o que não era esperado pois os efeitos dos glicocorticóides

raramente são observados em concentrações tão baixas. A eficácia de concentração tão

baixa em um teste de formação de colônias torna importante a construção de uma curva

dose-resposta detalhada que consiste um dos objetivos do presente estudo.

Os resultados apresentados aqui documentam somente o efeito dos

corticoesteróides (dexametasona e hidrocortisona) in vitro . O estudo dos efeitos dos

corticoesteróides in vivo poderia ser feito utilizando-se sangue de cordão umbilical de

gestantes que receberam corticoesteróide no período perinatal. Ao iniciar o estudo, era

nosso objetivo incluir pacientes nesta situação. O uso de corticoesteróide perinatal, cuja

indicação visa acelerar a maturação pulmonar do concepto cuja gestação deva ser

interrompida antes do termo, ocorre com freqüência mais elevada na Maternidade do

Instituto Fernandes Figueira pelo fato desta se constituir em maternidade de risco.

Contudo, o número de amostras obtidas no período de desenvolvimento do projeto, que

correspondessem a esta descrição foi muito menor do que o de amostras de parto normal

obtidas. Por esta razão, atendendo a prioridades práticas, nos concentramos inicialmente

no estudo dos efeitos in vitro, deixando para estudos futuros o estabelecimento de uma

comparação entre os efeitos obtidos in vitro e possíveis efeitos in vivo.

45 OBJETIVOS


II- OBJETIVOS

OBJETIVOS GERAIS

Estudar o efeito de glucocorticóides (dexametasona, budesonide e hidrocortisona)

sobre a produção de eosinófilos em cultura de células hematopoiéticas derivadas do

sangue de cordão umbilical humano na presença de IL-5, IL-3, e GM-CSF.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Avaliar o efeito dos glucocorticóides sobre a eosinopoiese em cultura de

sangue de cordão umbilical, caracterizando a relação dose-resposta e a

cinética dos efeitos observados.

• Analisar o envolvimento do receptor de glucocorticóide nas ações sobre

produção de eosinófilos.

• Avaliar os possíveis efeitos da atopia materna sobre a resposta à

dexametasona no sistema.

46 METODOLOGIA


III- METODOLOGIA

1. População de Pacientes Estudados e Critérios de Inclusão

Foi utilizado sangue de cordão umbilical (cerca 15-20ml de sangue por paciente)

obtido na hora do parto, após a obtenção do consentimento livre e informado da

gestante. Além da assinatura do termo consentimento livre e informado, as gestantes

foram submetidas a uma anamnese (roteiro em anexo). As coletas foram realizadas em:

Maternidade Oswaldo Nazareth (Praça XV) e Maternidade do Instituto Fernandes

Figueira, com aprovação de seus respectivos comitês de ética (em anexo) .

2. Critérios de Exclusão

As amostras de sangue de cordão umbilical não foram colhidas em pacientes

portadores de doenças neoplásicas, distúrbios linfoproliferativos, imunodeficiências,

infecções e pacientes que estavam em uso de droga imunossupressora. Era de grande

interesse, na fase inicial do estudo, obter um grupo de pacientes que haviam utilizado

corticoesteróide perinatal visando acelerar a maturidade pulmonar do recém nato.

Entretanto, a maior parte dos partos prematuros assistidos, nos quais a mãe havia

utilizado corticoesteróide perinatal, apresentavam infecção e por esta razão foram

excluídos deste estudo. No presente estudo, não foram incluídos resultados de pacientes

em uso de corticoesteróide perinatal sem infecção, os quais constituirão, futuramente, o

objeto de uma análise separada.

47 METODOLOGIA


3. Estudos com células hematopoiéticas

3.1 Materiais

3.1.1. Drogas

Foram utilizadas, nas culturas de células, as seguintes drogas: dexametasona (ref.

D8893, Sigma chemical co), hidrocortisona (ref. 4001, Sigma chemical co), budesonide

(Foraseq®), mifepristone (Ref. M8046, Sigma chemical co). A dexametasona foi

diluída em RPMI . A solução de estoque mantida em congelador foi de 10-4 M. As

concentrações de uso foram mantidas em geladeira a 4o C. O conteúdo de 1 cápsula de

budesonide contendo 400 μg (Foraseq®, Novartis) foi dissolvido em RPMI até uma

concentração 10-4 M, sendo a solução esterilizada por filtração e mantida em

congelador, sendo as diluições de uso preparadas no momento da cultura e guardadas a

4o C. A hidrocortisona foi diluída em etanol PA e filtrada em milipore. A solução de

estoque mantida em congelador foi de 10-3 M. As concentrações 10-5 M, 10-7 M , 10-9 M

foram diluídas em RPMI e mantidas em geladeira a 4o C. Onde indicado, foi utilizado

mifepristone (RU 486, ref. M 8046, Sigma chemical co), a partir de uma solução

estoque 10-2M em álcool PA, mantida em congelador. A concentração de uso de 10-5M

foi mantida em geladeira a 4o C.

3.1.2 Anticorpos

Foram utilizados, para separação (“sorting”) de células CD34+ e para citometria de

fluxo, os seguintes anticorpos contidos no MACS CD34 Progenitor Cell Isolation Kit,

48 METODOLOGIA


Miltenyi Biotec : reagente A1 (Ig humana para o bloqueio da ligação a FcR), reagente

A2 (anticorpo monoclonal anti CD34 conjugado ao hapteno) e reagente B (esferas

magnéticas conjugadas com um anticorpo anti hapteno)

3.1.3 Citocinas

Foram utilizadas as citocinas: rhIL-3 (Pharmingen 19631 T), rhIL-5 ( ref.205- IL-005

R&D) e GM-CSF (ref. 19741, pharmingen).

3.2 Cultura de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical

3.2.1 Cultura de células mononucleares de sangue de cordão umbilical

Foram coletados 15-20 ml de sangue de cordão umbilical heparinizado (heparina

livre de conservantes) logo após o parto. O sangue foi diluído com meio RPMI

suplementado com 2mM de L-glutamina, 100U/ml de estreptomicina e 100U/ml de

penicilina, na razão de 1:1, e em seguida centrifugado a 450xg por 40 minutos sobre um

gradiente de Lymphoprep™ (Nycomed), carregado na proporção de 2:1 entre sangue e

meio de separação. Ao final da centrifugação, o anel de células mononucleares foi

coletado e transferido para outro tubo, sendo lavado 2 vezes com meio RPMI a 500xg

por 10 minutos. O depósito celular final foi ressuspendido em 3ml de RPMI. As células

foram contadas em Câmara de Neubauer, após uma diluição 1:10 em solução de Turk

para contagem de células nucleadas totais. As culturas de células mononucleares

derivadas de sangue de cordão umbilical foram inoculadas na densidade de

106células/ml e mantidas em placa de 24 poços com meio RPMI e 10% FCS, a 37oC,

49 METODOLOGIA


numa atmosfera humidificada de 5% CO2/ 95% ar, por 14 dias.. Foram adicionados às

culturas, as citocinas rhGM-CSF (2ng/ml, concentração final), rhIL-3 (2ng/ml, idem) e

rhIL-5 (0,2ng/ml, idem). Onde indicado, as culturas foram estabelecidas na presença de

dexametasona, hidrocortisona e budesonide (concentrações finais 10-7 M a 10-9 M).

Após 14 dias de cultura, foi realizada a contagem do número de células nucleadas totais.

Em seguida foi realizada citocentrifugação das amostras e os citocentrifugados foram

corados com Panótico ou Wright-Giemsa, seguindo-se a contagem diferencial em

microscópio Olympus BX-50 sob objetiva de 100x com imersão em óleo.

3.2.2 Cultura de células CD34+ purificadas

Para a purificação de células CD34+, foram coletados 150-200ml de sangue de

cordão umbilical, através de punção da placenta e drenagem sob a ação da gravidade (a

placenta foi suspensa e o cordão foi puncionado diretamente para uma bolsa de coleta

de sangue que já contem anticoagulante). O sangue, sem diluição prévia, foi carregado

num gradiente de Lymphoprep™ na proporção de 2:1, sendo em seguida centrifugado a

400xg por 35 minutos. O anel de células mononucleares foi coletado e transferido para

outro tubo, onde foi diluido com RPMI e lavado por 10 minutos a 500xg por 2 vezes. O

depósito celular final foi ressuspendido em 5ml de RPMI e as células obtidas contadas

em câmara de Neubauer. As células foram analisadas por citometria de fluxo no

Laboratório de Citocinas, Depatamento de Imunologia da UFRJ, Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Preparamos 3 tubos para citometria de fluxo com 30

μl de suspensão celular:

50 METODOLOGIA


1o. tubo= contendo o anticorpo controle de isotipo, conjugado a FITC (controle para

anti-CD45) e o anticorpo controle de isotipo, conjugado a a PE (controle para anti-

CD34), 1μl de cada.

2o. tubo= contendo anti-CD45-FITC (clone 2D1) e anticorpo controle de isotipo,

conjugado a PE, 1μl de cada

3o. tubo= contendo anti-CD45-FITC (clone 2D1) e anti-CD34-PE (clone 8G12), 1μl de

cada.

Deixamos estes 3 tubos no escuro por 15 minutos, e depois adicionamos 1000μl de

tampão de lise, seguindo-se uma incubação no escuro por 10 minutos, centrifugação

por 5 minutos a 500xg e descarte do sobrenadante. O depósito foi ressuspendido em

1000μl de PBS e centrifugado por 5 minutos a 500xg. Ressuspendemos o depósito final

em 1000μl de PBS e levamos ao citômetro para analisarmos o percentual de celulas

CD34+ contidas nesta amostra.

Para a separação (“sorting”), utilizamos um kit para separação magnética de

células CD34+ (MACS CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec). Com este

kit, as células progenitoras hematopoiéticas, que constituem cerca de 0,1-0,5% das

células do sangue de cordão umbilical humano, podem ser eficientemente enriquecidas

até uma pureza de 85-98%. Já conhecendo o percentual de células CD34+ que temos na

nossa suspensão celular, voltamos a trabalhar com a amostra guardada, que tinha sido

ressuspendida em 5ml de RPMI, e centrifugada por 5 minutos a 500g , sendo o

depósito lavado em 5ml de tampão MiniMACS e ressuspendido em 800μl do mesmo

tampão. Seguiu-se a adição de 100μl do reagente A1 (Ig humana para o bloqueio da

51 METODOLOGIA


ligação a FcR) e do reagente A2 (anticorpo monoclonal anti CD34 conjugado ao

hapteno). Deixamos em repouso por 15 minutos no gelo a suspensão, após

homogeneizar, e em seguida, adicionamos 10 ml de tampão, seguindo-se uma

centrifugação por 5 minutos a 500xg. Após o descarte do sobrenadante, o depósito foi

ressuspendido em 400μl de tampão. Adicionamos 100μl do reagente B (esferas

magnéticas conjugadas com um anticorpo anti hapteno), e incubamos por 15 minutos no

gelo, seguindo-se nova diluição com 10 ml de tampão, centrifugação (5 minutos a

500xg), descarte de sobrenadante e resuspensão em 500μl de tampão. A suspensão

celular foi então passada pela coluna de separação magnetica miniMACS, previamente

equilibrada em tampão. O efluente desta coluna contém o produto da seleção negativa.

Em seguida, a coluna foi removida do suporte magnetico e lavada com tampão,

obtendo-se o eluato que foi coletado no tubo de seleção positiva, contendo as celulas

CD34+. Foi feita contagem em câmara de Neubauer com solução de Turk e realizada

cultura liquida com 2,5 x 105 células CD34+/ml com 1ng/ml de rhIL-3, 1ng/ml de rhIL-

5 e rh10 ng/ml de GM-CSF (Lundahl et al, 2002). Adicionamos onde indicado a

dexametasona na concentração de 10-7 M e a cultura foi mantida em estufa por 14 dias.

3.3 Colorações hematológicas

As lâminas foram coradas rotineiramente com Panótico Rápido LB (Laborclin,

cód.620529). As lâminas eram submersas por 5 segundos na solução 1 (solução de

triarilmetano a 0,1%) para fixação, depois na solução 2 (solução de xantenos a 0,1%)

por mais 5 segundos e, finalmente na solução 3 ( solução de tiazinas a 0,1%) por mais 5

segundos. As lâminas eram em seguida secadas em ar ambiente.

52 METODOLOGIA


Para melhor visualização dos grânulos dos eosinófilos, utilizamos a coloração de

Wright-Giemsa (ACCUSTAIN® Wright-Giemsa stain, modified, Sigma Aldrich®),

com fixação em metanol (1 minuto de imersão por lâmina) e secadas. Após isto eram

colocadas verticalmente imersas na solução de Wright-Giemsa modificado por 5

minutos e depois imersas em água deionizada por mais 5 minutos. O excesso era lavado

gentilmente em água corrente. As lâminas eram secadas e analisadas ao microscópio

sob imersão.

3.4 Microfotografia

Algumas das lâminas preparadas foram fotografadas com auxílio de microscópio

Leica DMLS e programa Leica IM50 image manager .

3.5 Métodos estatísticos

Para análise estatística foi utilizado o teste T de student para comparação entre dois

grupos. E realizado Anova com correção de Tukey com auxílio do programa Systat

for Windows quando foram feitas comparações múltiplas entre diferentes grupos.

53 RESULTADOS


IV RESULTADOS

1. Efeito da Dexametasona sobre a cultura de precursores eosinopoiéticos derivados de sangue de cordão umbilical humano.

Resultados anteriores do nosso laboratório mostraram que a dexametasona aumentava

de forma dose-dependente, o numero total de colônias mielóides formadas, assim como o

tamanho das colônias eosinofilicas e a fração de colônias mieloides comprometidas com a

produção de eosinofilos em culturas de medula óssea de camundongos normais e alérgicos.

Com o objetivo de verificar se estes resultados poderiam ser reproduzidos a partir de células

precursoras eosinofílicas humanas, realizamos uma cultura liquida, establecendo uma curva

dose-resposta para dexametasona .

A figura 2 mostra que a dexametasona quando acrescida à cultura líquida realizada a

partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical humano, aumenta

de forma altamente significativa o número de células totais obtidos, após 14 dias de cultura,

na concentração de 10-7M (p=0,000957) quando comparado com o grupo controle que

apresenta apenas as citocinas eosinopoiéticas IL-5, GM-CSF e IL-3. Ainda observamos um

efeito estatisticamente significativo na concentração de dexametasona 10-8M quando

comparado com o grupo controle (p=0,013). O efeito desapareceu na concentração de 10-

9M onde não vemos diferença estatisticamente significativa quando comparada com o grupo

controle (p=0.787).

54 RESULTADOS


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

GM-CSF+ IL-3+IL-5 +D 10-7M + D 10-8M

+ D 10-9M

No.

cél

ulas

tota

is x

10

6 célu

las/

ml

*

*

Fig.2- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de dexametasona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

Analisando o percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura observamos

como ilustrado na figura 3, que a dexametasona (D7) aumenta significativamente o

55 RESULTADOS


percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura liquida na concentração de 10-7M

(p=5,56E-06) e este efeito diminui na concentração de 10-8M (p= 0,03316) mas ainda

permanece estatisticamente significativo. Já na concentração de 10-9M (p=0.4718) não

observamos mais diferença estatistica significativa em relação ao grupo controle.

Como mostrado na figura 4, observamos que a dexametasona quando acrescida à

cultura líquida a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical

humano, aumenta significativamente o numero de eosinófilos na concentração de 10-7M

(p=8.7412E-05) e a medida que a concentração diminui 10-8M o efeito diminui (p=0,046),

desaparecendo na concentração de 10-9M .

Após 14 dias de cultura à partir de células mononucleares derivadas de sangue de

cordão umbilical humano, observamos células em vários estágios de amadurecimento. Os

eosinófilos são identificados como células contendo grânulos abundantes no seu citoplasma,

cuja cor avermelhada é mais evidente nas preparações coradas com Wright-Giemsa, como

ilustra a figura 5.

56 RESULTADOS


0

5

10

15

20

25

30

35

GM-CSF+IL-3+ IL-5 + D 10-7M

+D 10-8M

+ D 10-9M

Perc

entu

al d

e eo

sinó

filos

*

*

Fig.3- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de dexametasona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

57 RESULTADOS


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

GM-CSF+IL3+IL5 +D 10-7M

+ D 10-8M

+ D 10-9M

No.

de

eosi

nófil

os x

106 c

élul

as/m

l

*

*

Fig.4- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de dexametasona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

58 RESULTADOS


Fig.5a- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com panótico.

59 RESULTADOS


Fig.5b- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com Wright-Giemsa..

2. Efeito da dexametasona em cultura liquida realizada a partir de células CD34+ enriquecidas

60 RESULTADOS


Procuramos verificar se este efeito potencializador, observado com a dexametasona na

concentração de 10-7M, quando realizamos a cultura diretamente a partir de células

mononucleares de sangue de cordão umbilical humano, poderia ser reproduzido se

fizessemos a cultura a partir de células CD34+ purificadas. Na figura 6 podemos

observar gráficos de citometria de fluxo que mostram a pureza da separação obtida. Os três

primeiros gráficos (dotplots) são referentes ao sangue de cordão umbilical humano após a

separação por gradiente de densidade e anterior a coluna imunomagnetica. Encontramos,

como pode ser visto no gráfico c, 5% de células CD34+CD45+low, fenótipo característico

de células tronco hematopoiéticas humanas. O último gráfico (letra d), representa a células

após a coluna imunomagnética, com enriquecimento de 8 vezes das células CD34+45low.

As outras células presentes no gráfico apresentam tamanho e complexidade compatíveis

com monócitos e devem ser eliminadas com um protocolo de aderência prévio à coluna

imunomagnética.

61 RESULTADOS


Fig. 6- Gráfico de análise do enriquecimento por citometria de fluxo das populações

celulares obtidas após separação magnética das células CD34+.

Como observado na figura 7, a dexametasona na concentração de 10-7M não foi

capaz de alterar o número de células totais obtidos após 14 dias de cultura quando

comparado com o grupo controle, entretanto, como ilustra respectivamente a figura 8 e 9

foi capaz de potencializar o número de precursores eosinofílicos e o número de

eosinófilos totais. Podemos observar na figura 10 que o controle obtido apresenta uma

5,0 % 40,0 % 0,02 %

Isotipo controle FITC

CD45 FITC

Isotipo controle PE CD34 PE

b c d a

62 RESULTADOS


população bem mais homogênea de células com aspecto mononuclear e no grupo onde

foi acrescida a dexametasona, observamos um aumento do número de eosinófilos e de

células com núcleo segmentado.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

GM-CSF + IL-3+ IL-5 + D 10-7M

No

célu

las

tota

is x

106 c

élul

as/m

l

Fig.7- O gráfico mostra o número de células totais obtidas após 14 dias de cultura realizada a partir de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle e o grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-5 foi acrescida dexametasona na concentração de 10-7M.

63 RESULTADOS


0,002,004,006,008,00

10,00

12,0014,0016,0018,0020,00

GM-CSF+ IL-3 + IL-5 D7

Perc

entu

al d

e eo

sinó

filos

Fig.8- O gráfico mostra o percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle e o grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-5 foi acrescida dexametasona na concentração de 10-7M..

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

GM-CSF + IL-3 + IL-5 + D 10-7M

No . d

e eo

sinó

filos

x 1

06 célu

las/

ml

Fig.9- O gráfico mostra o número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle e o grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-5 foi acrescida dexametasona na concentração de 10-7M.

64 RESULTADOS


Fig.10a- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com panótico.

65 RESULTADOS


Fig.10b- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com Wright-Giemsa.

3. Bloqueio dos efeitos da dexametasona pelo mifepristone (RU486)

66 RESULTADOS


Após verificar o efeito potencializador da dexametasona sobre a diferenciação dos

eosinófilos, decidimos avaliar se este efeito ocorria via receptor de glicocorticóide.

Desta forma utilizamos o mifepristone (RU486) que é um bloqueador do receptor de

glicocorticóide.

Como mostrado na figura 11, observamos que, quando a cultura era desenvolvida

na presença de dexametasona, o efeito potencializador sobre os eosinófilos (p=0.026,

n=4, comparação entre o grupo controle e as culturas com dexametasona) era totalmente

bloqueado pelo RU486 (p=0,04, comparação entre culturas com dexametasona e culturas

com RU486 + dexametasona). O RU486, por si só, não teve efeito estatístico

significativo (p=0.204).

O efeito inibitório do mifepristone sobre a diferenciação de eosinófilos é ainda

detectável quando analisamos o número total de eosinófilos recuperados das culturas.

Como mostrado na figura 12, observamos que o RU486 quando adicionado à cultura,

bloqueia totalmente o efeito potencializador sobre o número de eosinófilos observado

com a dexametasona (p=0,036). Em contraste, o RU486 não teve efeito por si só

(p=0,290).

Nestes 4 experimentos realizados com mifepristone, a dexametasona não foi capaz

de potencializar o número de células totais e desta forma, não pudemos avaliar o efeito

do RU486 com relação ao número de células totais.

67 RESULTADOS


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

GM-CSF+ IL-3 +IL-5

+ D 10-7M

+RU486 +RU486+D7

Perc

entu

al d

e eo

sinó

filos

*

Fig.11- Efeito do mifepristone (RU486) sobre o percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical humano. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle. O grupo D7 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas a dexametasona na concentração de 10-7M. O grupo RU486 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas o RU486 na concentração de 10-7M. No grupo RU486 +D7 foram acrescido RU486 e dexametasona, ambos na concentração de 10-7M.

68 RESULTADOS


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

GM-CSF+ IL-3+ IL-5

+ D 10-7M

+RU486 +RU486+D7

núm

ero

de e

osin

ófilo

s x

106 c

élul

as/m

l *

Fig.12- Efeito do mifepristone (RU486) sobre o número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical humano. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle. O grupo D7 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas a dexametasona na concentração de 10-7M. O grupo RU486 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas o RU486 na concentração de 10-7M. No grupo RU486 +D7 foram acrescido RU486 e dexametasona, ambos na concentração de 10-7M.

4. Cinética de ação da dexametasona

69 RESULTADOS


Para observar o efeito da dexametasona ao longo do desenvolvimento em cultura dos

eosinófilos, realizamos uma cultura líquida com até 28 dias de duração, com interrupção em

14 dias, 21 dias e 28 dias de cultura, onde indicado.

Como observamos na figura 13, a dexametasona aumenta o número de células totais

quando comparada com o controle no 14º. dia de cultura(p=0,0009) , o que já não ocorre no

21º dia (p=0.144) e no 28º dia (p=0.615).

0

1

2

3

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 14

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 21

No

de células totais (x106

/ml) D7

D7

D7 no dia14D7

D7 no dia21

* 14 dias

21 dias

21 dias

28 dias

28 dias

Fig.13- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células nucleadas totais obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, sendo que, no grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10-7M .

70 RESULTADOS


Como mostrado na figura 14, quando analisamos o percentual de eosinófilos

obtidos após 28 dias de cultura, observamos que a dexametasona foi capaz de aumentar

significativamente o percentual de eosinófilos no 14º.dia de cultura (p= 4,40699E-07) e

no 21º dia de cultura (p=0.027), o que já não ocorre no 28º dia de cultura (p=0.48).

Também notamos que nem a introdução da dexametasona apenas no 14º.dia seguindo-se

da interrupção com 21 dias , nem a sua introdução com 21 dias seguida de interrupção

com 28 dias aumentou significativamente o percentual de eosinófilos observado (p=0,20

e p=0,49 respectivamente).

Como observado na figura 15, a dexametasona aumentou de forma altamente

significativa o número de eosinófilos recuperados no 14º dia (p=1,22378E-05) como no

21º dia (p=0.0009) em relação aos respectivos controles. No 28º dia de cultura, contudo,

seu efeito não foi mais significativo (p= 0,81) quando comparada com o grupo controle.

A dexametasona acrescentada tardiamente (no 14º.dia e no 21º.dia ) também não teve

efeito potencializador sobre o número de eosinófilos recuperados

71 RESULTADOS


0

20

40

60

80

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 14

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 21

% E

osi

nó

filo

s

D7

D7

D7 no dia 14

D7

D7 no dia 21

*

* 14 dias

21 dias

21 dias

28 dias

28 dias

Fig.14- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, sendo que, no grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10-7M .

72 RESULTADOS


0

0,5

1

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 14

GM-CSF+IL-3+IL-5

D7 D7 nodia 21

No d

e eo

sinó

filos

(x10

6 )

D7

D7

D7 no dia 14

D7

D7 no dia 21

* * 14 dias

21 dias

21 dias

28 dias

28 dias

Fig.15- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, sendo que, no grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10-7M .

5. Efeito da Budesonide sobre a formação de eosinófilos

Buscamos analisar se o efeito potencializador sobre os precursores eosinofilicos

observado com a dexametasona poderia também ser observado com outros

73 RESULTADOS


corticoesteróides, especialmente aqueles correntemente utilizados no tratamento das

alergias. Desta forma realizamos experimentos com budesonide, um corticoesteróide muito

utilizado por via inalatória para prevenção tanto da asma brônquica como da rinite alérgica

.Observamos, como ilustrado na figura 16, que o budesonide na concentração de 10-7M, 10-

8M e 10-9M , numa série limitada de experimentos (n=5) quando acrescido a cultura, não

apresentou efeito estatisticamente significativo sobre o número de células totais ao final de

14 dias de cultura quando comparado com o grupo controle (p= 0,07; p=0,20; p=0,11,

respectivamente).

Como mostrado na figura 17, quando verificamos o efeito do budesonide sobre o

percentual de eosinófilos obtidos, observamos que com budesonide na concentração de 10-

7M ocorreu um aumento significativo (p= 0,02) em relação ao grupo controle. Este efeito

diminui na concentração de 10-9M (p=0,05) e desparece na concentração de 10-11M (p=0.28)

em relação ao grupo controle.

Como mostrado na figura 18, o efeito potencializador do budesonide ainda é detectável quando

analisamos o número de eosinófilos recuperados. O budesonide na concentração de 10-7M foi capaz

de aumentar significativamente o número de eosinófilos totais quando comparado com o

grupo controle (p=0.047), contudo este efeito não foi observado na concentração de 10-9M. e

10-11M (p=0,12; p=0,43, respectivamente)

74 RESULTADOS


0

0,5

1

1,5

2

2,5

GM + IL-3+IL-5 + B 10-7M

+ B 10-9M

+ B 10-11M

num

ero

de c

elul

as to

tais

x 1

06 /ml

Fig. 16 - Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de budesonide (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +B7, +B8 e +B9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

75 RESULTADOS


0

5

10

15

20

25

30

GM-CSF + IL-3+ IL-5

+ B 10-7M

+ B 10-9M

+ B 10-11M

Perc

entu

al d

e eo

sinó

filos

*

*

Fig. 17- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de budesonide (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +B7, +B8 e +B9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

76 RESULTADOS


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

GM-CSF + IL- 3+IL-5

+ B 10-7M

+ B 10-9M

+ B 10-11M

No e

osin

ófilo

s x

106 c

élul

as/m

l

*

Fig. 18- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de budesonide (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +B7, +B8 e +B9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

6. Efeito da hidrocortisona sobre a formação de eosinófilos

77 RESULTADOS


A hidrocortisona, foi um dos corticoesteróides testados pelo nosso grupo em função de

sua relação com o hormônio produzido pelo corpo humano nas reações de estresse.

Como mostrado na figura 19, a análise do efeito da hidrocortisona sobre o número de

células totais mostrou que a hidrocortisona não apresentou efeito estatisticamente

significativo nas concentrações de 10-7M, 10-9M e10-11M (p=0,14, p=0,12, p=0,10,

respectivamente)

Como mostrado na figura 20, quando analisamos o percentual de eosinófilos obtidos,

vemos que a hidrocortisona na concentração de 10-7M aumenta de forma altamente

significativa o percentual de eosinófilos obtidos (p=0.003) em relação ao grupo controle.

Este efeito já desaparece na concentração 10-9 M (p=0.11) e também na concentração de 10-

11M (p=0.43) quando comparado com o grupo controle.

Como observado na figura 21, o efeito potencializador da hidrocortisona ainda é

detectável quando analisamos o número absoluto de eosinófilos obtidos. A hidrocortisona

aumentou significativamente o número de eosinófilos na concentração de 10-7M (p=0.03).

Este efeito já não é mais significativo nas concentrações de 10-9M e 10-11M (p=0.31,p=0.82,

respectivamente) quando comparados com o grupo controle.

78 RESULTADOS


0

0,20,4

0,60,8

11,2

1,41,6

1,8

GM-CSF+IL-3+IL-5

+ H 10-7M

+ H 10-9M

+ H 10-11M

No . c

élul

as to

tais

x 1

05 cél

ulas

/ml

Fig. 19 - Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de hidrocortisona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

.

79 RESULTADOS


0

5

10

15

20

25

30

GM-CSF+IL-3+IL-5

+ H 10-7M

+ H 10-9M

+ H 10-11M

perc

entu

al d

e eo

sino

filos

obt

idos

*

Fig. 20- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de hidrocortisona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

80 RESULTADOS


0

0,5

1

1,5

2

2,5

GM-CSF+IL-3+IL-5

+ H 10-7M

+ H 10-9M

+ H 10-11M

No . e

osin

ófilo

s x

105 c

élul

as/m

l *

Fig. 21- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de hidrocortisona (10-7M , 10-8M, e 10-9M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.

Na figura 22 podemos observar a fotografia de uma lâmina vista ao microscópio sob aumento

de 100x com imersão em óleo, mostrando o aumento de número de eosinófilos, com seus grânulos

bem evidenciados pela coloração de Wright-Giemsa, observados na concentração de 10-7M.

81 RESULTADOS


Fig.22- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com Wright-Giemsa.

7. Efeito da atopia materna sobre ao efeito potencializador de eosinófilos da dexametasona

82 RESULTADOS


Foi avaliado o impacto da atopia sobre o efeito potencializador sobre a linhagem

eosinofílica exercido pela dexametasona. Atopia foi definida como a presença de história

pessoal ou familiar de doença atópica (asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite

atópica) Como mostra a figura 23, a maioria dos experimentos realizados mostra aumento do

número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura na presença de dexametasona.

0

1

2

Controle D7

No Eos

inóf

ilos

(x10

6 )

Fig.23- Efeito da dexametasona sobre o no. de eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados através da coleta de sangue de cordão umbilical de mães não atópicas e atópicas. Na figura 24 podemos observar o aumento do numero de eosinófilos nos

experimentos realizados a partir de coleta de sangue de cordão umbilical humano de

mães atópicas (painel a) e não atópicas (painel b) respectivamente. Não observamos

83 RESULTADOS


diferença estatisticamente significativa entre o percentual de aumento de eosinófilos em

relação ao grupo controle entre o grupo de mães atópicas e não atópicas como ilustra a

figura 25, apesar do enhancement observado ter sido maior no grupo de mães atópicas.

0

1

2

1 2

No Eos

inóf

ilos

(x10

6 )

0

1

2

1 2

No Eos

inóf

ilos

(x10

6 )

Fig.24 – Efeito da dexametasona sobre o no. de eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados através da coleta de sangue de cordão umbilical de mães atópicas (painel a) e mães não atópicas.

Painel a Painel b

84 RESULTADOS


0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Mães atópicas Mães não atópicas

perc

entu

al d

e au

men

to e

ntre

o g

rupo

ex

perim

enta

l e o

con

trol

e

Fig.25 – Enhancement obtido com a dexametasona em experimentos realizados a partir

do sangue de cordão umbilical humano de mães atópicas e não atópicas.

8. Pefil das gestantes e recém nascidos dos quais foram coletados o sangue de cordão

umbilical humano. Na figura 26 podemos verificar o perfil das gestantes que participaram do estudo e

dos seus recém natos . Para garantir a confidencialidade da informação disponibilizada

pelas gestantes, seus nomes não ficarão expostos na tabela abaixo nem tampouco de seus

recém nascidos. O sangue de cordão umbilical representa o sangue do recém nascido,

mas tendo em vista a íntima interface com o sangue/organismo materno torna-se

importante a presença dos dados maternos.

85 RESULTADOS


Fig.26. Tabela do perfil de gestantes.

idade Tipo

sanguineo paridade tipo de parto IG atopia sexo do

bebê peso nasc estatura apgar

O + GII PI A0 cesariana 39s nao masculino 3260 51 9 e 10 23 O - GII PI A0 cesariana 41s nao masculino 3210 51 8 e 10 29 O + GI P0 A0 normal 40s nao masculino 4175 54 9 e 9 25 O+ GIII PI AI cesariana 38s sim masculino 3835 51 8 e 8 36 GI P0 A0 cesariana 41s nao masculino 3765 53 9 e 10 27 O + GII P0 AI normal 40s nao masculino 3400 52 9 e 10 19 A + GII PI A0 cesariana 40s nao masculino 3830 51 8 e 9

A + GII PI cesariana 38s nao masculino 3385 50 8 e 8 18 O + GI P0 A0 normal 35s sim feminino 2745 47,5 9 e9

GIV PIII A0 normal 39 nao feminino 2595 46 9 e 9

17 GI P0 A0 normal 41s nao feminino 3135 51 9 e 9 24 O + GIII PI AI cesariana 39s nao feminino 3540 50 8 e 9

31 A - GII PI A0 normal com

forceps 40s sim feminino 3705 53 9 e 10 34 GI P0 A0 normal 40s nao masculino 3460 51 9 e 10 18 O - GI P0 A0 normal 38s não masculino 2966 52 9 e 9 22 O + GI P0 A0 normal 38s nao feminino 3490 51 9 e 9 15 B + GI P0 A0 normal 41s sim feminino 3740 50 8 e 6 18 O+ GI P0 A0 normal 40s nao masculino 3910 52 9 e 10 33 O+ GIII PI AI normal 39s não feminino 3295 49 9 e 9 27 A+ GIV PII AI normal 37s feminino 2510 51 9 e 9 19 O - GI P=0 normal 37s masculino 2400 48 9 e 10 19 O+ GIII PII normal 39s não masculino 3470 50 9 e 9 27 A + GI P0 A0 normal 36s sim feminino 2495 48 7 e 9 37 O+ GII P0 AI cesariana 41s não feminino 3630 9 e 9 24 O+ GIII PI cesariana 40s sim feminino 4015 54 9 e 10 22 O+ GI P0 normal 40s não masculino 3030 49

38 O+ GVI PIV A1 cesariana 36s nao masculino 3130 9 e 9

24 B+ GIII PI AI cesariana 40s sim feminino 3415 49 9 e 10

34 O+ GVI PII AIII cesariana 38s não masculino 4205 53 9 e 10

86


V- DISCUSSÃO

Os glicocorticóides são as drogas mais utilizadas atualmente para o tratamento das

doenças alérgicas, entretanto , alguns estudos tem demonstrado efeitos paradoxais dos

glicocorticóides (Ramirez et al, 1996; Buitenhuis et al2003; Debierre-Grokierko, 2003) que

poderiam contribuir para a manutenção da doença alérgica. Um estudo de Gaspar Elsas e

colaboradores demonstrou que em células obtidas de medula óssea de murinos, a

dexametasona aumentava o número total de colônias mielóides formadas, assim como

tamanho das colônias eosinofílicas e a fração de colônias mielóides que foram

comprometidas com a produção de eosinófilos. (Gaspar Elsas et al, 2000a). O nosso estudo

buscou avaliar se efeitos semelhantes poderiam ser observados com células de origem

humana. Para isto, escolhemos utilizar células derivadas de sangue de cordão umbilical

humano que constitui um sistema bastante vantajoso para o estudo da maturação

eosinofílica in vitro uma vez que possibilita o cultivo de eosinófilos com características

morfológicas similares aos encontrados na medula óssea além de ser menos invasivo do

que o componente medular.

O nosso estudo mostrou que existe correspondência com os resultados obtidos

por Gaspar Elsas e colaboradores em camundongos, em precursores eosinofilicos humanos.

Nossos experimentos a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão

87


umbilical humano mostraram que a dexametasona na concentração de 10-7M é capaz de

aumentar de forma estatisticamente significativa o número total de células obtidas, o

percentual de eosinófilos e por conseguinte o número total de eosinófilos. À medida que a

concentração diminui, o efeito observado vai sendo diminuído, mas ainda apresenta

diferença estatisticamente significativa na concentração de 10-8M; já na concentração de

10-9M não observamos mais este efeito. Este efeito potencializador da dexametasona

mostrou-se linhagem especifico, potencializando seletivamente a linhagem eosinofílica.

Estes resultados encontram apoio em alguns outros estudos. Um estudo de Barr et al

(1987), demonstrou aumento do número de colônias eosinofílicas formadas a partir de

células derivadas da medula óssea humana por concentrações fisiológicas e farmacológicas

de hidrocortisona. Um estudo de Debierre Grokierko também encontrou aumento do

número de eosinófilos na presença de dexametasona em cultura realizada a partir de células

CD34+.

Estes estudos, assim como o nosso, trazem um alerta para uma sensibilidade diferente

das células precursoras hematopoiéticas ao glicocorticóide . É importante ressaltar que estes

achados não contradizem a literatura existente na qual os corticoesteróides atuem

aumentando a apoptose do eosinófilo maduro e assim contribuindo para a resolução do

quadro alérgico, e sim tenta esclarecer que existem células que tem importância para os

quadros alérgicos, que são as células precursoras hematopoiéticas que não estão sendo

88


mortas e sim potencializadas. Isto pode ajudar a explicar alguns estudos que tem mostrado

que o glicocorticóide pode predispor a reações alérgicas (Agarwal and Marshall., 2000,

Ramirez et al, 1996) e principalmente fornecer mais uma base para explicar a ampla

literatura existente ligando o estresse à exacerbação das crises alérgicas (Sandberg et al,

2000; Klinnert et al, 2001).

Quando nos nossos experimentos observamos o aumento no percentual de

eosinófilos, dirigimos nossa atenção para verificar se a dexametasona seria capaz de atuar

sobre populações enriquecidas em progenitores CD34+. Esta questão é igualmente

relevante para o problema de se algum outro tipo celular, presente na cultura de células

mononucleares, exerce efeitos inibitórios sobre a diferenciação de eosinófilos. Esta

possibilidade deve ser levada em conta, pois os dados de outros laboratórios insistem em

que a diferenciação eosinofílica a partir de sangue de cordão umbilical só se faz

eficientemente a partir de células CD34+ purificadas (Lundahl et al, 2002) levando, além

disso, o dobro do tempo do requerido em nosso sistema na presença de dexametasona. Tais

discrepâncias poderiam ser resolvidas, se alguma célula acessória, presente na cultura de

mononucleares, secretasse alguma substancia inibitória para a eosinopoiese, na ausência

mas não na presença da dexametasona. Uma destas possibilidades, tendo em vista que a

nossa cultura apresenta uma grande quantidade de monócitos, seria de que a dexametasona

pudesse estar inibindo a geração de alguma substância produzida por estes monócitos,

89


como por exemplo a prostaglandina E2 (PGE2). A PGE2 tem efeitos supressivos

conhecidos sobre a eosinopoiese e a adição de dexametasona à cultura poderia estar

inibindo a via da ciclooxigenase e com isso diminuindo a síntese de PGE2 pelos monócitos.

Com a perda da inibição exercida pela PGE2, os eosinófilos poderiam proliferar.

Em virtude das dificuldades técnicas e do alto custo envolvido no experimento,

realizamos apenas um experimento utilizando a separação magnética de células CD34+. O

percentual de células CD34+ encontrado normalmente no sangue de cordão umbilical

humano varia de 0,1 a 0,5%. Após a inicial separação das células mononucleares por

gradiente de densidade utilizando Lymphoprep, obtivemos um percentual de 5% das células

como sendo CD34+ como mostrado nos dados obtidos através de citometria de fluxo. Após

a separação magnética, o enriquecimento de células CD34+ foi de 40%, ou seja, 8 vezes

maior do que antes deste procedimento. Ainda ficamos com uma contaminação de duas

populações celulares que pelas características observadas em citometria de fluxo

corresponderiam a hemácias e monócitos (foram tentados alguns experimentos com lise de

hemácias por cloreto de amônio ou NaCl hipotônico; entretanto, o tratamento afetou

significativamente a função das células hematopoiéticas, inviabilizando esta estratégia).

Com este experimento realizado a partir de células CD34+ enriquecidas, sem lise de

hemácias, obtivemos resultados semelhantes aos obtidos quando realizamos a partir de

células mononucleares sem purificação adicional. Isto confirma que a dexametasona pode

90


atuar em populações enriquecidas em progenitores. A dexametasona nessa cultura realizada

a partir de células CD34+ foi capaz de potencializar o número eosinófilos recuperado. No

entanto, o aumento foi menor do que o encontrado sem separação. Não consideramos

provável que isto se deva a algum sofrimento das células resultante do processo de

purificação, tendo em vista a grande abundância de figuras blásticas nas culturas

estabelecidas com células CD34+ purificadas.

Estas observações não apóiam a idéia de que células acessórias, presentes na

cultura, produzam substâncias inibitórias para a eosinopoiese, como seria o caso da PGE2.

Se realmente a potencialização dos eosinófilos ocorresse por inibição da PGE2 produzida

pelos monócitos, esperaríamos que com o enriquecimento de células CD34+ que o

percentual de eosinófilos obtidos fosse muito maior, o que não ocorreu.

Contudo, surge a possibilidade alternativa de que uma célula acessória esteja

secretando alguma substância estimulatória para a eosinopoiese, a qual contribuiria para os

efeitos da dexametasona em nossas condições de cultura. Se alguma célula acessória estiver

produzindo um fator eosinopoiético, é possível que quando retiramos parte destas células,

durante a separação magnética de CD34+, a capacidade da cultura produzir eosinófilos seja

reduzida, mesmo na presença de dexametasona.

De fato, uma das substâncias que poderia ser responsável por estimular os

eosinófilos seria a IL-13. Um estudo mostrou (Kyurkchiev et al, 2007) que a progesterona

91


modifica algumas propriedades regulatórias de células dendríticas derivadas de monócitos e

estimula a produção por estas de IL-10 e IL-13. A IL-13 (Taube et al, 2002) é uma citocina

pleiotrópica que é secretada por células Th2 ativadas e monócitos. Apresenta atividade

imunológica redundante com a IL-4. A IL-13 é capaz de regular a mudança de classe para

IgE nas células B e a expressão de MHC II e receptores de baixa afinidade para IgE (CD23)

nas células B e em monócitos. É capaz de ativar mastócitos e eosinófilos, além da função

neutrofilica. IL-13 também aumenta a expressão de VCAM-1 nas células endoteliais,

facilitando o recrutamento preferencial de eosinófilos e também células T para o tecido da

via aérea. Apesar de não ser necessária para a a indução do desenvolvimento de uma

resposta Th2, ela é capaz de estimular a ativação da resposta Th2 uma vez que inibe a

produção de IL-12 nos monócitos. Mais importante, em cultura de medula óssea murina, a

IL-13 potencializa significativamente a produção de eosinófilos em presença de IL-5

(Queto et al., manuscrito em preparação).

Realizamos experimentos para avaliar a cinética do efeito da dexametasona ao longo

de uma cultura de 28 dias com o objetivo de analisar o efeito da dexametasona ao longo do

amadurecimento eosinofílico. Nestes experimentos, a dexametasona foi capaz de aumentar

de forma altamente significativa os precursores eosinofilicos no 14º. e no 21º dia de

cultura, mas não observamos mais este efeito no 28º. dia de cultura. Nossas células no 28º.

dia de cultura apresentavam já aumento da apoptose principalmente no grupo com

92


dexametasona. Isto pode significar que à medida que os precursores eosinofílicos vão se

desenvolvendo rumo ao eosinófilo maduro, progressivamente, vai perdendo a sensibilidade

ao efeito potencializador de eosinófilos e ganhando sensibilidade ao efeito pró apoptótico

da droga, efeito este já consagrado e que valida o uso terapêutico da droga. Adcionamos a

dexametasona tardiamente no 14º. e 21º. dia de cultura, e não observamos o efeito

potencializador da dexametasona, o que sugere que para que esta exerça este efeito

potencializador torna-se necessário que ela esteja presente na cultura quando os

progenitores estão começando a se comprometer com a linhagem.

Adicionalmente, houve grande interesse em avaliar se o efeito exercido pela

dexametasona ocorria via receptor de glicocorticóide. Utilizamos então, o mifepristone

(RU486) que é um derivado da noretindrona que se liga ao receptor da progesterona com

afinidade maior que a progesterona, mas não ativa esse receptor, agindo portanto como uma

antiprogestina. O mifepristone também se liga ao GR humano (receptor de glicocorticóide

humano) com uma afinidade de 3 a 4 vezes maior do que a dexametadona e cerca de 18

vezes maior do que o cortisol. A ligação do mifepristone ao receptor, impede o receptor de

se dissociar da proteína do choque térmico e desta forma evita a translocação do complexo

RU486/receptor para o núcleo (Johanssen & Allolio, 2007). Desta forma, os efeitos anti-

glicocorticoide do mifepristone são dose dependentes. Com a adição do mifepristone a

cultura , observamos que o efeito potencializador exercido pela dexametasona pode ser

93


completamente bloqueado por este, caracterizando o efeito observado via receptor de

glicocorticóide. É importante ressaltar que quando o RU486 é adicionado isoladamente a

cultura não ocorre nenhuma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo

controle onde só temos citocinas eosinopoiéticas (IL-3, GM-CSF e IL-5), o que sugere que

a progesterona não é, sozinha, responsável por nenhum efeito sobre a eosinopoiese, embora

experimentos adcionais devam ser realizados para confirmar o efeito da progesterona. Fica,

no entanto, por estabelecer se ela não tem um efeito aditivo ou sinérgico com os

glicocorticóides. Foi importante avaliar um possível efeito da progesterona, uma vez que

esta é sintetizada em grande quantidade e liberada pela placenta durante a gravidez. No

terceiro trimestre da gravidez, a taxa de secreção de progesterona aumenta de 10-20mg/dia

e pode chegar a centenas de miligramas durante a parte final da gravidez (Lu et al, 2006).

Embora as lavagens a que são submetidas as células do sangue de cordão umbilical durante

o seu isolamento possam reduzir consideravelmente o transporte de progesterona para

dentro da cultura, com níveis iniciais tão elevados, e com a alta afinidade do receptor de

progesterona, uma quantidade residual deve atingir a cultura, em condições suficientes para

interagir com este receptor, e, se for o caso, interagir com os glicocorticóides também.

Para avaliar se o efeito potencializador para precursores eosinofílicos

observado pela dexametasona poderia ser reproduzido por outros corticoesteróides,

realizamos experimentos utilizando a hidrocortisona e a budesonide. A hidrocortisona

94


(cortisol), o principal hormônio glicocorticóide produzido pelo córtex adrenal e envolvido

com o estresse fisiológico, mostrou que também é capaz de potencializar os precursores

eosinofilicos no nosso estudo. Ao avaliar a hidrocortisona, estávamos em parte tentando

avaliar um possível efeito das concentrações de estresse deste hormônio sobre os

precursores eosinofilicos que pode ser encontrado na concentração de 10-6 M (Jabara et al,

2001). No nosso estudo, a hidrocortisona mostrou efeito estatístico somente na

concentração de 10-7M, já perdendo este efeito em concentrações baixas. Estes resultados

estão de acordo com o fato de que a hidrocortisona apresenta uma afinidade oito vezes mais

baixa para o receptor de glicocorticóide do que a dexametasona (Vissser et al,1998), e uma

potência anti-inflamatória vinte e cinco vezes menor in vivo (Goodman & Gilman, 1996).

O estilo de vida ocidental tem sido freqüentemente associado ao aumento de

prevalência de doenças alérgicas e, desta forma , o estresse do estilo de vida ocidental pode

ajudar a fornecer um racional adequado, uma vez que existe a possibilidade de que doses

mantidas de cortisol possam hipoteticamente potencializar o número de precursores

eosinofílicos in vivo como já observamos in vitro em nosso estudo.

O budesonide foi outro corticoesteróide escolhido, tendo em vista que tem sido

amplamente utilizado por via inalatória tanto para prevenção da asma brônquica como da

rinite alérgica. A budesonide também mostrou-se capaz de potencializar os precursores

eosinofilicos.

95


A absorção sistêmica do corticoesteróide pode ocorrer após inalação ou por

deglutição da droga. Imediatamente após a inalação do corticoesteroide com aerossol ,

cerca de 10-20% da dose normal é depositada nos pulmões, enquanto que a maior parte fica

na orofaringe e é deglutida. Após absorção no trato gastrointestinal, a droga passa pelo

fígado antes de chegar a circulação sistêmica. Alguns corticoesteróides, especialmente a

budesonide e o fluticasone são metabolizados (89% e 99% respectivamente) na primeira

passagem pelo fígado dando origem a metabólitos inativos. Somente uma pequena

proporção pode ainda se manter ativa após a primeira passagem. A droga que se deposita

no pulmão é absorvida rapidamente se a droga não é bem metabolizada localmente podem

ocorrer efeitos colaterais extra pulmonares, especialmente em altas doses (Rizzo e Sole,

2006). Tendo conhecimento que a absorção sistêmica pode ocorrer, é pertinente a

preocupação com a influência desta droga sobre os precursores eosinofílicos.

Com base nos dados obtidos através da anamnese realizada com a gestante separamos

os experimentos realizados em 2 grupos: sangue de cordão umbilical humano de mães

atópicas e sangue de cordão umbilical humano de mães não atópicas. Comparando os dois

grupos observamos não observamos diferença estatisticamente significativa, embora a

magnitude do efeito tenha sido maior nos experimentos de mães atópicas. A nossa

incapacidade de demonstrar um efeito significativo da atopia, neste caso, pode ser devido

ao fato de termos ignorado uma variável importante, ou seja, a atopia paterna, que não foi

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contemplada na nossa anamnese. A avaliação da atopia materna é muito importante para

atopia fetal, uma vez que a mãe contribui tanto com a parte genética como provendo um

microambiente uterino atópico. No estudo de Liu e colaboradores (Liu,. 2003), os bebês

nascidos de mães alérgicas apresentaram maior risco de serem alérgicos do que aqueles nos

quais apenas os pais eram alérgicos. Embora a contribuição materna para atopia da prole

pareça ser maior do que a do pai, certamente, a transmissão genética da atopia paterna

ocorre e não deve ser ignorada. Um desenho de estudo ideal deveria conter dados sobre a

atopia e possivelmente dosagem de IgE sérica do bebê aos 6 meses de vida.

Alternativamente, poderíamos desenhar o experimento de forma a excluir atopia no

grupo de interesse e fazer a pergunta de se a ausência de atopia (materna ou paterna), afeta

a magnitude da resposta observada aos glicocorticóides.

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ANAMNESE Prontuario:________________

Nome:__________________________________________________________________ Endereço:_______________________________________________________________ Telefone:______________________Data de nascimento:_________________________ Escolaridade:____________Estadocivil:__________ Raça:______________________ Paridade:______________ Grupo Sanguíneo:___________________________________ Hospital:________________________________________________________________ Tipo de Parto:_____________________ Indicação: ______________________________ Idade Gestacional:__________________ Tipo de anestesia:________________________ Intercorrencias gestacionais:_________________________________________________ ________________________________________________________________________ Número de consultas de pré natal:____________________________________________ História Pessoal de atopia: __________________________________________________ Uso de Imunoterapia:______________________________________________________ Historia Familiar de atopia:__________________________________________________ Uso de corticoesteróide na gestação:______________________ motivo:______________ Uso de outras drogas na gestação:____________________________________________ Hábitos: Fumo__________________________ Bebida alcoólica___________________ Animais domésticos:_______________________________________________________ Condições de domicilio: saneamento básico________ água encanada________________ Água filtrada _______________ rua asfaltada ___________ pessoas morando no domicílio________________________________________________________________ Hábitos alimentares: _______________________________________________________ (leite, frutas, yougurtes, leite fermentado, carne de vaca, peixe, gordura trans). Eventos estressantes durante a gravidez:_______________________________________ _______________________________________________________________________ (perda de emprego, perda de parceiro, morte ou doença na família, falta de dinheiro, mudança de domicilio) Sorologias da gestação: VDRL:_________________________ Anti HIV:________________________ data:____________________ Anti hepatite B:___________________ data:____________________ Anti Toxoplasmose:________________ data:____________________ Anti Rubéola:_____________________ data:____________________ Doenças Prévias a gestação:_________________________________________________ Doenças da gestação:______________________________________________________ Nome do RN_______________ Sexo =________ Pnasc=___________ Est=_____________ Apgar=___________ Data do parto=___________________

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Projeto Estudo das Células Progenitores hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação alérgica e impacto da exposição perinatal aos corticoesteróides Instituição: Instituto Fernandes Figueira/ Fundação Oswaldo Cruz/MS-RJ. Pesquisador responsável: Daniella Campelo Batalha Cox Moore. Orientadores: Dra. Maria Ignez Capella Gaspar Elsas e Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas. Paciente:____________________________________ Prontuário: ______________________ Após estar inteiramente esclarecida sobre a natureza da pesquisa, eu,________________________________, estou sendo solicitada a contribuir numa investigação científica no período destinado à pesquisa.

Informações sobre o estudo:

O estudo tem a finalidade de estudar o eosinófilo que é uma célula presente no sangue que tem importância em várias doenças alérgicas como a asma brônquica, a rinite alérgica, a dermatite atópica, dentre outras. Buscando entender melhor esta célula, seu comportamento, como reage a remédios tradicionalmente utilizados para tratar as doenças alérgicas, pretendemos com isso aumentar o conhecimento nesta área para que o médico tenha um melhor entendimento das doenças alérgicas e com isto melhorar a forma como trata seus pacientes.

Assim, estou sendo informada: 1. Recebi informações sobre o procedimento, riscos, benefícios e inconvenientes do exame. 2. Que a pesquisadora manterá sigilo sobre a identidade da paciente e que todas as informações

contidas no prontuário da paciente são consideradas confidenciais. 3. Que o exame a ser realizado será colhido do sangue vindo do cordão umbilical após o parto;

Desta forma, não existe qualquer risco ou desconforto para a paciente ou para o recém nascido.

4. Que a coleta de 15ml de sangue do cordão umbilical destina-se a realização de estudos do projeto de pesquisa registrado no Instituto Fernandes Figueira.

5. Que este procedimento não interfere com o parto, recuperação da gestante e com o recém nascido.

6. Que se assim desejar, terei acesso livre aos resultados dos exames realizados no sangue obtido do cordão umbilical.

7. Que a recusa em participar da pesquisa jamais terá qualquer penalidade ou constrangimento por parte da Instituição, a qual manterá o acompanhamento e o tratamento pelos mesmos médicos que prestam atendimentos pela saúde da puérpera e do Recém nascido.

Nesta pesquisa médica não será testada qualquer medicação. não há fins lucrativos, apenas de aumento de conhecimento na área médica.

Declaro estar ciente deste termo de consentimento autorizando a coleta de sangue do cordão umbilical após o parto, sendo de minha responsabilidade participar deste projeto. Paciente:_____________________________________________________________________. Rio de Janeiro, ____ de ________ de ________.

OBS.: A paciente poderá pedir informações sobre a pesquisa sempre que achar necessário. A médica a ser contactada neste caso será: Nome: Dra. Daniella Campelo Batalha Cox Moore. Endereço: Av. Rui Barbosa , 176 - Flamengo. Tel: 25541731 (Laboratório de Fisiopatologia Humana) Comitê de Ética em Pesquisa. Endereço: Rua Afonso Cavalcanti, 455, sala 701 Cidade Nova. Tel: 2503-2024/ 2503-2026.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Projeto Estudo das Células Progenitores hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação alérgica e impacto da exposição perinatal aos corticoesteróides Instituição: Instituto Fernandes Figueira/ Fundação Oswaldo Cruz/MS-RJ. Pesquisador responsável: Daniella Campelo Batalha Cox Moore. Orientadores: Dra. Maria Ignez Capella Gaspar Elsas e Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas. Paciente:____________________________________ Prontuário: ______________________ Após estar inteiramente esclarecida sobre a natureza da pesquisa, eu,________________________________, estou sendo solicitada a contribuir numa investigação científica no período destinado à pesquisa.

Informações sobre o estudo:

O estudo tem a finalidade de estudar o eosinófilo que é uma célula presente no sangue que tem importância em várias doenças alérgicas como a asma brônquica, a rinite alérgica, a dermatite atópica, dentre outras. Buscando entender melhor esta célula, seu comportamento, como reage a remédios tradicionalmente utilizados para tratar as doenças alérgicas, pretendemos com isso aumentar o conhecimento nesta área para que o médico tenha um melhor entendimento das doenças alérgicas e com isto melhorar a forma como trata seus pacientes.

Assim, estou sendo informada: 8. Recebi informações sobre o procedimento, riscos, benefícios e inconvenientes do exame. 9. Que a pesquisadora manterá sigilo sobre a identidade da paciente e que todas as informações

contidas no prontuário da paciente são consideradas confidenciais. 10. Que o exame a ser realizado será colhido do sangue vindo do cordão umbilical após o parto;

Desta forma, não existe qualquer risco ou desconforto para a paciente ou para o recém nascido.

11. Que a coleta de 15ml de sangue do cordão umbilical destina-se a realização de estudos do projeto de pesquisa registrado no Instituto Fernandes Figueira.

12. Que este procedimento não interfere com o parto, recuperação da gestante e com o recém nascido.

13. Que se assim desejar, terei acesso livre aos resultados dos exames realizados no sangue obtido do cordão umbilical.

14. Que a recusa em participar da pesquisa jamais terá qualquer penalidade ou constrangimento por parte da Instituição, a qual manterá o acompanhamento e o tratamento pelos mesmos médicos que prestam atendimentos pela saúde da puérpera e do Recém nascido.

Nesta pesquisa médica não será testada qualquer medicação. não há fins lucrativos, apenas de

aumento de conhecimento na área médica. Declaro estar ciente deste termo de consentimento autorizando a coleta de sangue do cordão

umbilical após o parto, sendo de minha responsabilidade participar deste projeto.

Paciente:_____________________________________________________________________. Rio de Janeiro, ____ de ________ de ________.

OBS.: A paciente poderá pedir informações sobre a pesquisa sempre que achar necessário. A médica a ser contactada neste caso será: Nome: Dra. Daniella Campelo Batalha Cox Moore. Endereço: Av. Rui Barbosa , 176 - Flamengo. Tel: 25541731 (Laboratório de Fisiopatologia Humana)

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