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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
KRISTIANA CERQUEIRA MOUSINHO
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE
CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E
IN VIVO
FORTALEZA
2010
Universidade Federal do Ceará
Faculdade de Medicina
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE
CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN
VIVO
Kristiana Cerqueira Mousinho
Tese submetida à Coordenação do programa de
Pós-Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Orientador:
Profo.Dro. Manoel Odorico de Moraes Filho
Co-Orientadora:
Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza
Fortaleza - CE
2010
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde
M892e Mousinho, Kristiana Cerqueira.
Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, in vitro e in vivo / Kristiana Cerqueira Mousinho. – 2010.
167 f. : il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2010.
Área de concentração: Oncologia Experimental. Orientação: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho.
1. Chalcona. 2. Toxicidade. 3. Antineoplásicos. I. Título. CDD 615.1
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE CHALCONA, 1-(4-
Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN VIVO
KRISTIANA CERQUEIRA MOUSINHO
Tese submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia
como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará. A citação de qualquer
trecho deste trabalho é permitida, desde que seja feita em conformidade com as
normas da ética científica.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Orientador)
Universidade Federal do Ceará – UFC
__________________________________________________ Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza (Co-Orientadora)
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
________________________________________________________ Profa. Dra. Caridad Noda Pérez
Universidade Estadual de Goiás – UEG
__________________________________________________ Profa. Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos Universidade Federal do Amazonas - UFAM
__________________________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves
Universidade Federal do Ceará - UFC
À minha Vovó Nadege (in memorian),
Que não conseguiu esperar o término
Desta etapa da minha vida,
Mas sei que está feliz por isso em
Algum lugar da esfera espiritual,
Dedico este trabalho.
“Tudo é do Pai, toda honra e toda glória, é Dele a vitória alcançada em minha vida,
tudo é do Pai se sou fraco e pecador, bem mais forte é o meu Senhor, que me cura
por Amor”.
Padre Fábio de Melo
“Honra o teu médico por causa da necessidade,
Pois foi o Altíssimo quem o criou,
Porque toda a medicina provém de Deus,
A ciência do médico o eleva em honra;
Ele é admirado na presença dos grandes,
O Senhor fez a terra produzir os medicamentos,
O homem sensato não os despreza,
Uma espécie de madeira não adoçou o amargor da água?
Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens;
O Altíssimo deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas;
E dela se serve para acalmar as dores e curá-las;
O Farmacêutico faz misturas agradáveis;
Compõe ungüentos úteis a saúde;
E seu trabalho não terminará,
Até que a paz divina se estenda sobre a face da terra”.
Eclesiástico (38; 1-8)
Agradecimentos
O câncer é uma doença grave e assustadora. Receber um diagnóstico de câncer é
algo que ninguém consegue imaginar. Mas o que é ruim pode ser o início de uma mudança
boa. E quando o exemplo dado não combina com a natureza, surge o momento da definição. O
momento pede calma (quase que impossível) para olhar o que é preciso fazer adiante;
prudência, para perceber as mudanças e coragem para enfrentar os desafios. Para os
pacientes só resta recolher os cacos, organizar as idéias e simplesmente aceitar talvez a tarefa
mais intensa de uma existência.
Quando trabalhamos com pessoas que sofrem desse mal, passamos a tentar
compreender o que se tem por dentro de cada um. Agora eu vejo o imenso valor dos “Doutores
da Alegria”, fazer alguém sorrir onde se tem muitos motivos para chorar é DIVINO. Quando se
acredita, o belo surge e o verdadeiro permanece. O maior significado está nas pessoas e não
nas palavras.
Foi por isso que resolvi sair um pouco de cena (da área clínica) e estudar muito para
entender melhor o tratamento desses pacientes baseado nas substâncias antineoplásicas.
Tratamento esse que compromete a qualidade de vida das pessoas. E como todo pesquisador
dessa área passei a sonhar em testar substâncias que destruam o tumor e não o paciente, eis-
me aqui concluindo o meu doutorado.
Agradecer, neste momento, faz-se tão necessário quanto defender esta tese. As
pessoas passam pela nossa vida nos dando sempre alguma lição, até o que não se fazer com
os outros. Tudo é aprendizado.
Em primeiro lugar, como sempre em minha vida, agradeço a Deus, onipresente,
onisciente e indefinível. Agradeço pela vida, pelos ensinamentos constantes e principalmente
por ter desenhado a minha caminhada com perfeição, com o objetivo de me mostrar o real
valor do AMOR, da CARIDADE e da FÉ.
A minha Virgem Santíssima, por me colocar no colo sempre que preciso. Por
interceder junto a Jesus Cristo, por mim. E como mãe me consolar nos momentos de aflição.
Também por me fazer sentir que eu nunca estou só.
Aos meus pais Gabriel e Nádja, aos meus anjos da guarda terrenos, por terem
aceitado a missão de serem meus pais, e brilhantemente com ela, me ensinado valores
essenciais a vida: AMOR, CARINHO, RESPONSABILIDADE e CARÁTER. Por terem
acreditado na minha capacidade e sonhado comigo para que este dia chegasse. Agradeço a
Deus por vocês serem à base da minha sustentação. Amo vocês.
A minha Titia Nazaré, minha segunda mãe e outro anjo que Deus pôs em minha vida,
o meu sincero agradecimento. Por cuidar sempre de mim, sorrir e chorar comigo.
Aos meus irmãos Karinne e Diogo, amigos também, simplesmente uma parte de mim.
Obrigada por existirem e fazerem a minha vida mais feliz. Agradeço também aos meus
cunhados: Luciano e Julliany, pelos momentos de alegria vividos. As minhas sobrinhas Lívian
e Líris (Liloca e Preguinho), por despertarem em mim um sentimento inesplicável e deixarem
meu coração transbordando de amor cada vez que as encontro, sem vocês o meu mundo seria
em preto e branco.
Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, pelo exemplo de competência e inteligência; por
ter me aceitado como orientanda e me recebido no LOE sem se quer saber quem eu era, com
uma importante acolhida que conforta, retira o medo e a ansiedade perante tudo o que é novo.
Por ser a pessoa mais prática que eu conheço, tornado tudo mais simples. Agradeço por
acreditar na minha capacidade intelectual, passando suas aulas para que eu pudesse ministrá-
las.
A Dra. Ivone Antônia de Souza, um exemplo de Mestre. Agradeço por tudo,
principalmente pelo apoio emocional que sempre tive na calmaria de sua voz e quando me
dizes: “Kristiana, no final tudo dá certo”. Sem você eu não estaria aqui. Faltam palavras para
dizer o que você representa na minha vida acadêmica.
A Dra. Letícia Lotufo, pelo carinho constante, apoio emocional e científico. Pelo
exemplo de profissional, equilíbrio e atenção mesmo a quem não eram seus orientandos,
mostrando sempre como se trabalhar em equipe.
A Dra. Claúdia Pessoa, pelo apoio, amizade e disponibilidades diárias. Pela
organização dos seminários do LOE, enriquecedores de conhecimentos.
A Dra. Raquel Montenegro, pela amizade, disponibilidade e ajuda neste trabalho, com
sugestões e orientações. Agradeço pela atenção nos momentos de desespero.
A Dra. Ana Paula Negreiros, pela ajuda nas análises das lâminas, disponibilidade e
carinho com que sempre me tratou.
Em especial aos amigos: Arinice, Gabriela, Hemerson, Igor (Boy do LOE) e
Washington Araújo, pela contribuição, paciência, aprendizado, disponibilidade e
companheirismo, que me compreenderam nos momentos de aflição e os quais têm méritos
junto a mim na realização desta tese.
Aos demais amigos do LOE: Adriana Carvalho (companheira das brincadeiras, dos
experimentos e até das baixarias), Aline, Aline Sbardeloto, Ana Jérsia, Assuero, Bruno
Cavalcante (pelos ensinamentos e contribuição nos experimentos), Bruninho (IC), Daisy (IC),
Danilão, Delano Marinho, Diego, Daniel, Elthon Goés (pelos experimentos do BrdU nos
finais de semana e feriados serem a maior descontração), Evelyne, Felipe, Gardênia,
Hidemburgo (comedor de pipocas, porque a culpa é da Coca-cola), Kézia, Miller, Patrícia
Marçal, Paula Abreu, Paula Jimenez, Paulo Michel, Rafael, Vanessa, Venúncia, pela
companhia, risadas e colaboração nessa tese.
Agradeço ainda a Silvana (Sil), Erivanda, D. Rogéria e D. Fátima por todo apoio no
que era necessário para a realização dos experimentos, pelas conversas “in off” altamente
reveladoras. A Flávia pelo imenso esforço em providenciar o material necessário para a
conclusão desta tese e pelas conversas diárias.
As minhas grandes amigas Adelânia, Sheyla e Gracinha, por todo o carinho, atenção
e amizade em todos os momentos que compartilhamos. Amizade daquelas que agente guarda
no coração.
Existem pessoas que foram imprescindíveis para a minha saúde física e psíquica nesta
tese, pessoas que sempre deram desde o apoio logístico ao emocional. Pessoas que
transpassam o limite da amizade e se tornam família, estrelas e não cometas, pérolas que
Deus coloca no nosso caminho para rir, chorar, aprender coisas que jamais aprenderíamos
sozinhos, fazer com que as batalhas sejam mais leves e curtas, são companheiros de toda
uma vida. Deus me deu esta bênção de norte ao sul deste país. São eles: Cecília (minha irmã
morena), José Roberto (caça e pesca Papicu, via Praia do Futuro, iieeiii), Vanesca, Cínthya e
Cia, Silvéria e Alexandre, Deisy e Roberto César (Letícia), Roberta e Otacílio (Limoeiro,
iiieeiii), Ana Carla e Júlio, Fabíola e Marne. Obrigada por vocês existirem.
Ao meu médico, Dr. Carlos Windson, por me atender sempre que precisei
principalmente nas mazelas pré-tese. Valeu pelas amostras grátis!
A toda a minha família e amigos que sempre torceram por mim.
As secretárias do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Aura Rhanes e
Márcia, pela dedicação com o que fazem e por me ajudar em tudo o que precisei.
Aos servidores Alana, Ana Paula, Íris, Chiquinho, agradeço as conversas,
cumplicidade e disponibilidade em sempre ajudar.
E por fim, a todos aqueles que padecem de algum tipo de câncer, onde a luta para se
obter a cura ou o alívio é uma constante, torna-se incansável e infinitamente dolorosa no corpo
e na alma. A Icla da Silva (in memorian), que me fez despertar a vontade de trabalhar nessa
área. A Iara da Silva e Ianara que me fizeram acreditar que a cura do câncer é possível. Ao
Ayrton Plácido (in memorian), Tia Yelda (in memorian), Tio Dilson Simões (in memorian),
Marcelinho (in memorian) e a todos os outros pacientes e amigos que padeceram dessa
doença e nos quais aprendi o valor da VIDA e do AMOR.
Enfim:
“O câncer pode roubar-lhe aquela alegre ignorância que um dia levou a acreditar que o
amanhã se estenderia para sempre. Cada dia é para ser vivido sabiamente”.
Heloísa Chiattone.
Este trabalho foi realizado com o auxílio das seguintes instituições:
Banco do Nordeste do Brasil - BNB
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP
Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa - FUNCAP
Instituto Claude Bernard - InCb
Índice
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Símbolos e Abreviaturas
Resumo
Abstract
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 29
1.1 O Câncer e sua formação................................................................................... 29
1 1.2 Incidência do Câncer.................................................................................... 31
1.3 O ciclo celular e o Câncer............................................................................. 33
2 1.4 Morte celular: Apoptose e Necrose................................................................ 36
1.5 Princípios da Quimioterapia Antineoplásica.................................................... 41
1.6 Chalconas.................................................................................................... 46
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA............................................................................... 52
3 OBJETIVOS................................................................................................................. 54
3.1 Geral................................................................................................................... 54
3.2 Específicos................................................................................................. 54
4 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................... 57
4.1 Materiais utilizados.....................................................................................
57
4.1.1 Equipamentos........................................................................................ 57
4.1.2 Reagentes, Soluções e Fármacos........................................................... 58
4.2 Células................................................................................................................ 64
4.2.1 Manutenção das células em cultura.......................................................... 65
4.2.2 Obtenção de células PBMC.................................................................... 66
4.3 Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos................................ 66
4.4 Animais.............................................................................................................. 67
4.5 Procedimento experimental........................................................................... 67
4.5.1 Obtenção da Chalcona............................................................................ 67
4.5.2 Estudo da atividade citotóxica...............................................................
4.5.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais...................................
68 79
4.5.2.1.1 Princípio do teste.......................................................................... 69
4.5.2.1.2 Procedimento experimental................................................................ 69
4.5.2.1.3 Análise dos dados........................................................................ 70
4.5.2.2 Ensaio de citotoxicidade em células normais.................................... 70
4.5.2.2.1 Princípio do teste................................................................................ 70
4.5.2.2.2 Procedimento experimental................................................................ 70
4.5.2.2.3 Análise dos dados.............................................................................. 71
4.5.2.3 Determinação da Atividade Hemolítica............................................... 71
4.5.2.3.1 Princípio do Teste.............................................................................. 71
4.5.2.3.2 Procedimento experimental................................................................ 71
4.5.2.3.3 Análise dos dados.............................................................................. 72
4.5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60 (leucemia
promielocítica)...............................................................................................................
72
4.5.3.1 Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan (Curva)............................................................................................................................
72
4.5.3.1.1 Princípio do Teste......................................................................... 72
4.5.3.1.2 Procedimento Experimental........................................................... 72
4.5.3.1.3 Análise dos dados........................................................................ 73
4.5.3.2 Teste da Acridina- Coloração diferencial por BE/LA.......................... 73
4.5.3.2.1 Princípio do Teste......................................................................... 73
4.5.3.2.2 Procedimento Experimental........................................................... 74
4.5.3.2.3 Análise dos dados........................................................................ 74
4.5.3.3 Teste do BrdU- Inibição da síntese de DNA – Ensaio do BrdU........... 74
4.5.3.3.1 Princípio do Teste.......................................................................... 74
4.5.3.3.2 Procedimento Experimental............................................................ 75
4.5.3.3.3 Análise dos dados......................................................................... 75
4.5.3.4 Teste da Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-
Giemsa............................................................................................................................
4.5.3.4.1 Princípio do teste....................................................................................
4.5.3.4.2 Procedimento experimental....................................................................
75 75 76
4.5.3.4.3 Análise dos dados.................................................................................. 76
4.5.3.5 Determinação da Integridade de membrana- viabilidade celular......... 76
4.5.3.5.1 Princípio do teste.................................................................................... 76
4.5.3.5.2 Procedimento experimental.................................................................... 76
4.5.3.5.3 Análise dos dados.................................................................................. 77
4.5.3.6 Análise do ciclo celular............................................................................ 77
4.5.3.6.1 Princípio do Teste.................................................................................. 77
4.5.3.6.2 Procedimento experimental.................................................................... 78
4.5.3.6.3 Análise dos dados.................................................................................. 78
4.5.3.7 Ensaio da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V.................... 78
4.5.3.7.1 Princípio do teste.................................................................................... 78
4.5.3.7. 2 Procedimento experimental.............................................................. 79
4.5.3.7.3 Análise dos dados................................................................................. 79
4.5.3.8 Determinação da ativação das caspases- 3 e 7...................................... 79
4.5.3.8.1 Princípio do teste.............................................................................. 79
4.5.3.8.2 Procedimento Experimental............................................................... 80
4.5.3.8.3 Análise dos dados............................................................................ 80
4.5.3.9 Determinação da ativação da caspase-8............................................... 80
4.5.3.9.1 Princípio do teste.............................................................................. 80
4.5.3.9.2 Procedimento Experimental.............................................................. 81
4.5.3.9.3 Análise dos dados........................................................................... 81
4.5.3.10 Determinação da ativação da caspase-9.............................................. 81
4.5.3.10.1 Princípio do teste........................................................................... 81
4.5.3.10.2 Procedimento Experimental............................................................ 82
4.5.3.10.3 Análise dos dados......................................................................... 82
4.5.3.11 Ensaio do Western blot (Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -
9).....................................................................................................................................
82
4.5.3.11.1 Princípio do teste........................................................................
82
4.5.3.11.2 Procedimento Experimental......................................................... 83
4.5.3.11.2.1 Extração de Proteínas................................................................ 83
4.5.3.11.2.2 Quantificação de Proteínas........................................................ 83
4.5.3.11.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida......................................... 84
4.5.3.11.2.4 Eletrotransferência..................................................................... 84
4.5.3.11.2.5 Imunodetecção.......................................................................... 84
4.5.3.11.2.6 Análise dos dados..................................................................... 85
4.5.4 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica ........................................ 85
4.5.4.1 Ensaio de genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do
cometa............................................................................................................................
85
4.5.4.1.1 Princípio do teste........................................................................... 85
4.5.4.1.2 Procedimento experimental............................................................ 86
4.5.4.1.3 Análise dos dados......................................................................... 86
4.5.4.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em linfócitos
humanos – Teste do micronúcleo in vitro.................................................................
87
4.5.4.2.1 Princípio do teste........................................................................... 87
4.5.4.2.2 Procedimento experimental............................................................. 88
4.5.4.2.3 Análise dos dados......................................................................... 88
4.5.5 Avaliação da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados
com tumor Sarcoma 180...............................................................................................
89
4.5.5.1 Princípio do teste.............................................................................. 89
4.5.5.2 Procedimento experimental................................................................... 90
4.5.5.3 Análise dos dados............................................................................. 91
4.5.5.4 Parâmetros toxicológicos avaliados.................................................. 91
4.5.5.4.1 Avaliação dos parâmetros bioquímicos....................................... 91
4.5.5.4.2 Princípio do teste.........................................................................
4.5.5.4.3 Procedimento experimental...............................................................
91 92
4.5.5.4.4 Análise dos dados.................................................................................. 92
4.5.5.4.2 Avaliação dos parâmetros hematológicos....................................... 93
4.5.5.4.2.1 Princípio do teste.......................................................................... 93
4.5.5.4.2.2 Procedimento experimental............................................................ 93
4.5.5.4.2.3 Análise dos dados........................................................................ 93
4.5.5.5 Análise histopatológica....................................................................... 93
4.5.5.5.1 Princípio do teste.............................................................................. 93
4.5.5.5.2 Procedimento experimental................................................................ 94
4.5.5.5.3 Análise dos dados............................................................................ 94
5 RESULTADOS............................................................................................................ 96
5.1 Estudo da atividade citotóxica..................................................................... 96
5.1.1 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células tumorais humanas....... 96
5.1.2 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células normais humanas
(PBMC)............................................................................................................................
97
5.2 Atividade hemolítica.................................................................................... 98
5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxica em células HL-60....................... 99
5.3.1 Determinação da viabilidade celular por exclusão do azul de Tripan.......... 99
5.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio............. 100
5.3.3 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU.............. 101
5.3.4 Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa...................................... 103
5.3.5 Análises da citometria de fluxo............................................................... 104
5.3.5.1 Integridade de membrana celular e concentração de células.................. 104
5.3.5.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA............................... 105
5.3.5.3 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V..............
5.3.5.4 Detecção da ativação de Caspases Efetoras – 3 e 7...............................
108 110
5.3.5.5 Detecção da ativação de Caspases Iniciadoras -8/-9............................... 111
5.3.5.6 Detecção do Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -9 pelo método do
Western blot....................................................................................................................
115
5.3.6 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica........................................ 116
5.3.6.1 Avaliação da genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do
cometa............................................................................................................................
116
5.3.6.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade – Teste do
micronúcleo in vitro......................................................................................................
117
5.3.7 Estudo in vivo............................................................................................. 118
5.3.7.1 Estudo da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados
com Sarcoma 180...........................................................................................................
118
5.3.7.2 Avaliação dos aspectos toxicológicos nos órgãos dos
camundongos transplantados com Sarcoma 180......................................................
120
5.3.7.2 Análise bioquímica e hematológica dos camundongos saudáveis
ou transplantados com Sarcoma 180..........................................................................
127
6 DISCUSSÃO............................................................................................................... 134
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................ 151
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………..…………………..………….…... 153
ANEXO 1- Aprovação do Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos
(COMEPE).......................................................................................................................
168
ANEXO 2- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA)....................... 169
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fluxograma mostrando um esquema simplificado da base molecular do câncer......................................................................................................................................
31
Figura 2: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira........................................................................................
32
Figura 3: Esquema das fases do ciclo celular........................................................................ 34
Figura 4: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular............................................... 36
Figura 5: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia........................................................................................................................
37
Figura 6: Esquema demonstrando as principais vias de ativação da apoptose, suas interconexões e as alterações morfológicas mais características..........................................
40
Figura 7: Distribuição da origem dos medicamentos antineoplásicos que estão no mercado nos últimos 25 anos.................................................................................................
43
Figura 8: Estrutura química da vimblastina, da vincristina, da vindesina e da vinorelbina...............................................................................................................................
44
Figura 9: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel....................................................... 45
Figura 10: Núcleo fundamental das chalconas...................................................................... 46
Figura 11: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do derivado de chalcona, (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona..................................................................................................................................
49
Figura 12: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt* entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo......................................................................................................................................
68
Figura 13: Representação dos tipos de cometas corados com prata e visualizados em microscópio óptico, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de acordo com o dano. a) tipos 0 (verde) e 1 (amarelo); b) tipos 2 (vermelho) e 3 (azul); c) tipo 4...............................................................................................................................................
87
Figura 14: Representação da formação de micronúcleos a partir de um fragmento cromossômico acêntrico e cromossomo inteiro em uma célula binucleada pelo uso de Citocalasina B..........................................................................................................................
89
Figura 15: Curva de crescimento em células leucêmicas humanas (HL-60), tratadas com o composto CG nas concentrações 0,04 µM; 0,2 µM; 0,4 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A viabilidade das células leucêmicas foi determinada por exclusão de azul de tripan em 3, 6, 12 e 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), * p< 0,05; ** p<0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls........................................................................................................................................
100
Figura 16: Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose) avaliado em células leucêmicas humanas (HL-60), tratada com o composto CG nas concentrações 1,0 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A análise foi realizada após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a
diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (DOX). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), **p< 0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls........................................................................................................................
101
Figura 17: Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 horas de incubação. As células foram tratadas com o composto CG nas concentrações 1,0 µM e 2,0 µM. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2), *p< 0,05 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.......................................................................................................................................
102
Figura 18: Fotomicrografias das lâminas das células de HL-60, tratadas e não tratadas, após 24 horas de incubação com a doxorrubicina e CG. A- Controle negativo (DMSO), B- tratadas com Doxorrubicina (0,5 µM), C- 1,0 µM e D- 2,0 µM. A contagem foi realizada através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), células com núcleos de coloração marrom. O aumento foi de 400X.............................................................................................
102
Figura 19: Fotomicrografias das células de HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com a CG e coradas com May-Grunwald-Giemsa. O aumento foi de 400X. A- Controle negativo, B- doxorrubicina a 0,5 µM, C- 1,0 µM (CG), D- 2,0 µM (CG) e E- 4,0 µM (CG). As setas pretas indicam redução de volume celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos “blebs”.....................................................................................................................................
103
Figura 20: A- Avaliação da integridade de membrana plasmática e B- Avaliação do número de células viáveis, analisados por citometria de fluxo. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM e com o controle doxorrubicina a 0,5 µM. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................
105
Figura 21: Efeito da CG no ciclo celular após 24 h de incubação. Os histogramas do ciclo celular foram analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células de HL-60, determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A- Controle negativo; B- Doxorrubicina (0,5 µM); C, D e E- CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM............................................................................................
108
Figura 22: A- Determinação da fragmentação do DNA; B- Análise do efeito sobre o ciclo celular. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, após 24 h de incubação e analisados por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. (C-) representa o controle negativo; (DOX) controle positivo com Doxorrubicina (0,5 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................
107
Figura 23: Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-60. No histograma (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Gráfico (B): % de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão
5.0........................................................................................................................................... 109
Figura 24: Análise da detecção das Caspases Efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................
110
Figura 25: Histograma referente ao teste das Caspases Efetoras 3 e 7. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................
111
Figura 26: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 8, por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................
112
Figura 27: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 8. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................
113
Figura 28: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 9, por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................
114
Figura 29: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 9. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................
114
Figura 30: Expressão das procaspase e caspase-9, citocromo c em células de HL-60, controle e tratadas com 1,0 e 2,0 µM, durante 12 e 24h, avaliada por Western
blot......................................................................................................................... 115
Figura 31: Freqüência de dano ao DNA. O derivado de chalcona (CG) nas concentrações
de 1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de
incubação. C-: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois
experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA
seguido pelo teste Student Newman-Keuls..............................................................
116
Figura 32: Índice de dano ao DNA. A substância CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM
sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle
negativo. Os valores foram obtidos pela multiplicação do número de células de classe de
dano, variando de 0 (sem dano) a 400 (dano máximo). Os dados correspondem à média ±
EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle
negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-
Keuls.......................................................................................................................................
117
Figura 33: Micronúcleo por 2000 células binucleadas. A substância CG nas
concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do micronúcleo após
24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de
dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por
ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls..............................................................
118
Figura 34: Fotomicrografia do tumor Sarcoma 180 transplantados em camundongos e
percentual de inibição tumoral dos animais submetidos ao protocolo de avaliação da
atividade antitumoral. A substância CG foi testada nas concentrações 25 mg/Kg e 50
mg/Kg; 5-FU, 25 mg/Kg, controle positivo . Controle negativo (DMSO 10%). Os dados
correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001),
comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-
Keuls.......................................................................................................................................
119
Figura 35: Fotomicrografia do tumor Sarcoma 180 transplantados em camundongos. O
controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os
animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG
(50 mg/Kg). Aumento de 400X...............................................................
120
Figura 36: Diferença de peso corpóreo dos camundongos com Sarcoma 180, em gramas.
Os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais, **p<0,00, quando
comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise
da variância) seguido por Student Newman-Keuls...................................................
121
Figura 37: Fotomicrografia dos fígados de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X........................................................................................................................................
123
Figura 38: Fotomicrografia dos baços de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a
droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X e 400X........................................................................................................................................
124
Figura 39: Fotomicrografia dos rins de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg,B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X...............................................................
125
Figura 40: Fotomicrografia dos estômagos de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a
droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com CG (25 mg/Kg, C e D) e (E e F) CG
(50 mg/Kg). Aumento de 100X.....................................................................................
126
Figura 41: Resumo dos resultados dos estudos de avaliação da atividade citotóxica e antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG)........................................................................................................................................
131
Figura 42: Resumo dos resultados dos estudos genotóxico/mutagênico, antitumoral e toxicológica da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG)........................................................................................................................................
132
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Exemplos de alguns flavonóides e suas fontes........................................ 47
Tabela 2 - Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e antitumoral..................................................................................................................
65
Tabela 3: Atividade citotóxica da CG frente às linhagens tumorais. Células
humanas de leucemias (HL-60, K562), carcinoma de cólon (HCT-8), glioblastoma
(SF-295) e carcinoma de mama (MDA-MB-435). A Doxorrubicina foi usada como
controle positivo.........................................................................................................
97
Tabela 4: Atividade citotóxica da CG frente à linhagem normal obtida de cultura primária (PBMC) após 24, 48 e 72 horas de incubação............................................
98
Tabela 5: Avaliação do potencial hemolítico da CG frente a eritrócitos de
camundongos Swiss (Mus musculus)........................................................................
98
Tabela 6: Efeito da CG sobre a massa corpórea e a massa úmida dos órgãos (fígado, baço, rins e estômago) de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180..............................................................................................................
121
Tabela 7: Efeito da CG sobre os parâmetros bioquímicos (aspartato
aminotransferase - AST, alanina aminotransferase – ALT, uréia e creatinina) de
sangue periférico de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180..............................................................................................................
128
Tabela 8: Efeito da CG e 5-fluorouracil (5-FU) sobre os parâmetros hematológicos
(hemoglobina, plaquetas e leucócitos) de sangue periférico de camundongos
saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.........................................
130
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
5-FU
Dox
CG
5-Fluorouracil
Doxorrubicina
1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ANOVA Analisys of Variance (Análise de variância)
CI50 Concentração inibitória mínima
CO2
PBMC
Dióxido de carbono
Células mononucleares do sangue periférico
BrdU Bromodeoxiuridina
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
E.P.M. Erro padrão da média
IC Intervalo de confiança
IM Índice de mutagenicidade
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)
TBS Tris buffer solution (Tampão tris)
US-NCI United States National Cancer Institute (Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos)
UI
COMEPE
CEPA
Unidades internacionais
Comitê de Ética em Pesquisas Humanas
Comitê de Ética em Pesquisa Animal
Resumo
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN VIVO. Kristiana Cerqueira Mousinho. Orientador: Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho. Co-orientadora: Dra. Ivone Antônia de Souza. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2010.
A substância 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona (CG) é um derivado de chalcona, sintetizado a partir da reação química entre a acetofenona e para-nitro benzaldeído. Para avaliar o seu potencial anticâncer foi realizado um estudo farmacológico de suas propriedades antitumorais em vários modelos biológicos in vitro e in vivo. A CG apresentou potente atividade citotóxica nas 5 linhagens tumorais testadas, inibindo a proliferação das células tumorais pelo ensaio do MTT e em células mononucleares do sangue periférico (PMCB) humano através do ensaio do Alamar blue. Todas as linhagens mostraram sensibilidade ao tratamento com a CG, e a CI50 variou de 1,18µM em HCT-8 a 3,32µM em SF-295. O composto apresentou fraca citotoxicidade (CI50 igual a 7,07µM) nas células PBMC, com exposição a CG em 72h, em relação às células de HL-60, utilizada como modelo nos demais testes biológicos. O tempo de encubação com o composto foi de 24h na maioria dos experimentos. Adicionalmente, a CG não induziu efeitos hemolíticos. O ensaio de exclusão por azul de Tripan revelou diminuição da viabilidade celular principalmente após 24h na maior concentração testada (4µM) com 58,4%. Para os testes de atividade antiproliferativa, LA/BE mostrou em sua morfologia células em apoptose nas duas maiores concentrações, enquanto que o BrdU, apresentou incorporação do mesmo nas concentrações testadas. A morfologia analisada por May-Grunwald-Giemsa mostrou redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear. Adicionalmente, a CG induziu apoptose em células leucêmicas HL-60, com participação das vias intrínseca e maior estímulo da via extrínseca, de maneira concentração-dependente, como observado na integridade da membrana citoplasmática, aumento da fragmentação do DNA e externalização da fosfatidilserina. Na análise do ciclo celular, foi observado parada na fase G2/M, sendo ativada as caspases 3, 7, 8 e 9 (a última na maior concentração e confirmada pelo teste do Western blot). Não houve ativação do Citocromo c. A CG não foi capaz de induzir processos genotóxicos/ mutagênicos (testes do cometa e micronúcleo in vitro). No ensaio de atividade antitumoral in vivo, observou-se inibição tumoral nas doses testadas (25 e 50mg/Kg/dia, via oral) de 54,85 e 69,11% respectivamente. As doses de CG causaram tumefação celular e o surgimento de focos inflamatórios no parênquima ou estroma hepático/renal, necrose nefrotóxica focal, esteatose microvesicular, pigmentos de hemossiderina, hiperplasia das células de Kupffer, congestão da polpa vermelha e desorganização dos folículos linfóides esplênicos. Além disso, os índices bioquímicos mostraram aumento do AST e diminuição da uréia (CG 25mg/Kg/dia), diminuição do ALT (5-FU e CG 25mg/Kg/dia); as alterações hematológicas mostraram leucopenia e plaquetopenia (5-FU), aumento dos leucócitos totais (CG 50mg/Kg/dia), aumento de neutrófilos e linfócitos em todos os grupos tratados. Todos os resultados nos levam a enfatizar que a CG possui grande potencialidade como molécula promissora por suas propriedades anticâncer. Palavras chave: Chalcona, citotoxicidade, mecanismo de ação, toxicidade, antitumoral.
Abstract
IN VITRO AND IN VIVO STUDY OF THE ANTICANCER POTENTIAL OF A CHALCONA DERIVED SUBSTANCE, 1- (4-Nitrofenil)-3- fenilprop-2- en-1-ona. Kristiana Cerqueira Mousinho. Advisor: Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho. Co-advisor: Dra. Ivone Antônia de Souza. Doctorate Thesis. Graduate Program on Pharmacology. Departamento f Phisyology and Pharmacology, UFC, 2010.
The substance 1- (4-Nitrofenil)-3- fenilprop-2- en-1-ona (CG) is a chalcone derivative, synthesized from a chemical reaction between acetophenone and p-nitro benzaldehyde. To evaluate its anticancer potential a pharmacological study of its antitumor properties in selected biological models in vitro e in vivo. CG presented a powerful cytotoxic activity in the 5 tested tumor lines evaluated, inhibiting cell proliferation of the tumor lines in the MTT assay and human peripheral mononuclear blood cells (PMBC) through the Alamar Blue assay. All cell lines showed sensitivity to the treatment with the CG, and the IC50 varied from 1,18 µM in HCT-8 to 3,32 µM in SF-295. The sample presented weak cytotoxic effect (IC50 of 7,07 µM) in cells PMBC, with 72h exposure to CG, compared to HL-60 cells (leukemic cell line), used in the next biological tests. The sample was incubated with the cells during 24h for the majority of the experiments. Additionally, CG did not induce hemolytic effects. The Tripan Blue assay showed a decrease of the cellular viability especially after 24h of incubation of the higher tested concentration (4 µM) with 58,4%. In assays for antiproliferative activity, OA/BE showed in its morphology cells going under apoptosis in the two higher concentrations, whereas the BrdU assay, presented incorporation of the same in the tested concentrations. The morphology analyzed with the May-Grunwald-Giemsa stain showed a decrease of the cellular volume, chromatin condensation and nuclear fragmentation.CG induced apoptosis in HL-60 cells, with participation of the intrinsic pathway and major stimulation of the extrinsic pathway, in a concentration-dependent manner, as observed in the cytoplasmatic membrane integrity, increase of DNA fragmentation and outsourcing of phosphatidylserine. In the cellular cycle analysis, it was observed a stop in the G2/M phase, activating caspases 3, 7, 8 and 9 (the last one in the highest concentration and confirmed by the Western blot assay). It was not observed activation of Cytochrome c. CG was not capable to induce mutagenic/genotoxic processes (comet assay and micronucleus in vitro). In the in vivo antitumor activity assay, tumor inhibition was observed in the tested doses (25 and 50mg/Kg/day, oral intake) of 54,85 and 69,11%, respectively . The doses of CG caused cellular swelling and the arise of inflammatory focus in the parenchyma or hepatic/renal stroma, focal nephrotoxic necrosis, microvesicular steatosis, hemosiderin pigments, hyperplasia of Kupffer cells, congestion of the red pulp and disorganization of the splenic lymphoid follicles. Furthermore, the biochemical indices had shown increase of AST and reduction of urea (25mg/Kg/day of CG), reduction of ALT (25mg/Kg/day of 5-FU and CG); hematologic alterations showed leukopenia and thrombocytopenia (5-FU), increase of total leukocytes (50mg/Kg/day of CG), increase of neutrophils and lymphocytes in all treated groups. All results led us to emphasize that CG possesses great potential as a promising molecule for its anticancer properties.
Keywords: Chalcones, cytotoxicity, mechanism of action, toxicity, antitumor.
Introdução
30
1 INTRODUÇÃO
1.1 O Câncer e sua formação
O termo câncer vem do latim “cancer”, que significa “carangueijo”, no qual deve
ter sido empregado em analogia entre a morfologia do crustáceo e ao modo de
crescimento infiltrante do tumor (DE ALMEIDA, 2005). Representa um conjunto de
mais de 100 doenças e é definido como enfermidades complexas de caráter
mutacional, proliferativo, de crescimento celular aberrante e descontrolado, em que
células em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e órgãos adjacentes,
podendo migrar para regiões distantes do organismo, evento este conhecido como
metástase (KUMAR et al., 2004; INCA, 2010).
As células do câncer possuem defeitos nos mecanismos que governam a
proliferação normal. Entre as características do tumor maligno estão à auto-suficiência
da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do crescimento,
inibição da morte celular não seguida de autólise (apoptose), potencial replicativo
ilimitado, angiogênese, poder de invasão e capacidade de metastatizar-se (HANAHAN
& WEINGER, 2000).
A célula neoplásica passa a ser considerada nesta condição quando ela
adquire vantagens metabólicas e capacidades biológicas quando comparadas às
células não transformadas: a) perda do controle da proliferação e divisão celular; b)
imortalização celular devido à ativação da enzima telomerase; c) alterações
cromossômicas (de forma e número); d) perda das propriedades adesivas da
membrana plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por
contato do movimento e crescimento celular; e) perda de função e da capacidade de
diferenciação ou especialização; f) capacidade para invadir tecidos vizinhos ou
distantes e formar metástases; g) capacidade de induzir a formação de novos vasos
sangüíneos (angiogênese). Observa-se, no entanto, que todos os casos de câncer
estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos, no controle positivo
e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA & KOHN, 2001;
RIBEIRO et al., 2003).
A formação do câncer dá-se pelo processo denominado carcinogênese,
geralmente ocorre lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula
cancerosa origine um tumor detectável (Figura 1). Esse processo passa por vários
estágios até de chegar à formação tumoral: são os de iniciação, promoção e de
31
progressão (SPANDIDOS, 1985; CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &
JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; SPANDIDOS, 2007).
O primeiro estágio da carcinogênese é o da iniciação. As células sofrem o
efeito de um agente carcinogênico, também chamado de agente oncoiniciador, que
provoca modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células encontram-se
geneticamente alteradas, mas ainda não é possível se detectar um tumor
clinicamente. Como exemplo de substâncias químicas carcinógenas tem sido descrito
o sulfato de dimetila, metilnitrossuréia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosamina
e benzopireno, entre outros agentes não químicos, como: exposição por vírus, hepatite
B, HTLV, HPV, radiação ionizante (CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &
JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006).
Na fase seguinte, denominada de promoção, as células geneticamente
alteradas (iniciadas) sofrem um efeito prolongado dos agentes oncopromotores,
induzindo a expressão de proto-oncogenes. A célula iniciada é transformada em célula
maligna, de forma lenta e gradual. A suspensão do contato com o agente muitas vezes
interrompe o processo nesse estágio. Sendo assim, a promoção pode compreender
pelo menos dois mecanismos independentes: a ativação gênica e a atividade mitótica
(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; KLAUNING & KAMENDULIS,
2008).
O terceiro e último estágio é o da progressão e caracteriza-se pela
multiplicação descontrolada, sendo um processo irreversível. O tumor maligno já está
em fase de desenvolvimento no microambiente favorável, evoluindo até o surgimento
das primeiras manifestações clínicas da doença. Os fatores que promovem a iniciação
ou progressão da carcinogênese são chamados de carcinógenos. Existe um grande
número de agentes que causam lesão e induzem a transformação neoplásica das
células, são eles: os carcinógenos químicos, energia radioativa, vírus oncogênicos e
alguns agentes microbianos. O fumo, por exemplo, é um agente carcinógeno
completo, pois possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese.
(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006;
SPANDIDOS, 2007).
A classificação do câncer é feita de acordo com o tipo de célula que o originou,
baseada no componente parenquimatoso, e não de acordo com os tecidos para os
quais se espalhou. Pode-se chamar de classificação primária (KATZUNG, 2003;
KUMMAR et al., 2004).
32
A série de anormalidades metabólicas decorrentes do câncer, bem como os
processos invasivos e metastáticos, provoca doença e morte eventual do paciente, a
não ser que a neoplasia maligna possa ser erradicada com o tratamento (KATZUNG,
2003; BEZERRA, 2008b).
Agentes adquiridos
(ambientais) que lesão o DNA:
Químicos, radiação, vírus
Incapacidade de recuperação DNA
Mutações hereditárias em:
Genes que afetam a
recuperação do DNA;
Genes que afetam o
crescimento celular ou
apoptose.
Célula Normal
Reparo do DNA
Bem -sucedido
Lesão do DNA
Mutações no genoma das células
somáticas
Ativação dos oncogenes
promotores do crescimento
Inativação do gene supressor
de tumor
Alterações nos genes que
regulam a apoptose
Proliferação celular desreguladaDiminuição da apoptose
Expansão clonal
Angiogênese
Escapa da imunidade Mutações adicionais
Progressão do tumor
Neoplasia malignaInvasão e Metástase
Figura 1: Fluxograma mostrando um esquema simplificado da base molecular do câncer (Adaptado de KUMMAR et al., 2004).
1.2 Incidência do Câncer
As principais observações relativas à causa do câncer podem ser observadas
pelos estudos epidemiológicos existentes, que relacionam a um ambiente particular, a
hereditariedade e influências culturais com a ocorrência de tumores malignos.
Algumas doenças que se mostrem associadas com um risco maior de desenvolver o
33
câncer, podem fornecer dados sobre a patogênese da malignidade (KUMAR et al.,
2004).
Desde 2003 o câncer tem sido a segunda causa de morte por doença, atrás
apenas de mortes relacionadas a doenças cardiovasculares, com uma incidência
anual estimada em 6 milhões de casos (SRIVASTAVA et al., 2005). O câncer
atemoriza a sociedade atual por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor,
sendo responsável por 25 % das mortes. Acredita-se que até 2020 mais 20 milhões de
novos casos irão surgir (ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2010).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 apontam que ocorrerá um total de
489.270 novos casos de câncer, sendo 236.240 casos para o sexo masculino e
253.030 para o sexo feminino e serão válidas para o ano de 2011. Estima-se que o
câncer de pele do tipo não melanoma (114.000 novos casos) será o mais incidente na
população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (52.000), mama feminina
(49.000), cólon e reto (28.000), pulmão (28.000), estômago (21.000) e colo do útero
(18.000) (Figura 2) (INCA, 2010).
Alguns fatores estão associados ao desenvolvimento de alguns tipos de
câncer, entre eles os geográficos e ambientais, idade, sexo, hábitos de vida,
predisposição genética ao câncer, condições predisponentes não hereditárias, como
inflamação crônica e condições pré-cancerosas (KUMAR et al., 2004).
Figura 2: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira (Fonte: INCA, 2010).
34
1.3 O Ciclo celular e o Câncer A célula surge quando ocorre a fusão ou divisão de duas células. Esse
processo dinâmico celular, que ocorre de forma ordenada, pode ser mais bem
avaliado através do curso de vida desta célula. Esses eventos se iniciam por ocasião
de um processo de replicação, que envolve um período de crescimento seguido pela
divisão, sendo denominado de ciclo celular (ALMEIDA et al., 2005).
O ciclo celular é utilizado para controlar o crescimento e a divisão celular,
portanto trata-se de um processo evolutivo e ao mesmo tempo conservativo da célula.
A estimulação para o crescimento inicia-se com a liberação de fatores, que se ligam
aos receptores de membrana da célula e desencadeiam uma cascata de proteínas
transdutoras de sinal. Em G0 o DNA apresenta-se enovelado, com atividade nuclear
baixa. Existem duas fases de intervalo chamadas de G1 e G2, em que ocorre a síntese
de RNA e de proteínas; uma fase S, onde acontece à formação e replicação do DNA,
e uma fase denominada M, onde a célula executa o processo de divisão em duas
células filhas, conhecida como mitose (CRECZYNSKI-PASA; PEDROSA, 2001;
FOSTER, 2008).
A regulação do ciclo celular é feita por sinais extracelulares como fatores de
crescimento e disponibilidade de nutrientes. Na fase G0 ou que está em quiescência, a
célula nessa fase não está se replicando. Quando as células passam para a fase G1,
ocorre a preparação da célula para a multiplicação, com a produção de fatores de
crescimento celulares que são essenciais para a formação da nova célula. Na fase S
ocorre a preparação para a síntese de DNA. Em seguida a célula entra na fase G2,
onde há a síntese de componentes para a mitose (divisão celular com manutenção do
número de cromossomos específico da espécie), como a produção do fuso mitótico
que é feita na fase M. Após o evento da divisão do material nuclear, há um outro
evento chamado citocinese (que é a separação da célula mãe, formando duas células
filhas com suas organelas e constituintes celulares), finalizando o ciclo de replicação
celular (Figura 3) (FOSTER, 2008).
35
Figura 3: Esquema das fases do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et al., 2003.
Todo esse processo requer um intenso controle por retroalimentação com o
objetivo de assegurar que todas as etapas moleculares sejam seqüenciais e
orientadas corretamente. Essa progressão ordenada através das diversas fases do
ciclo é orquestrada pelas ciclinas, quinases ciclina-dependentes (CDK’s) e por seus
inibidores (FISCHER et al., 2004; KUMAR et al., 2004).
Cada fase do ciclo possui os chamados checkpoints, que podem levar a parada
da progressão do ciclo celular e a ativação de mecanismos de reparo (Figura
4)(MALUMBRES et al., 2007). As células vão para a fase seguinte do ciclo celular, de
forma irreversível, se passar pelos checkpoints. O dano ao DNA e/ou mal
funcionamento de organelas e estruturas (falha no fuso mitótico) pode ativar a parada
do ciclo e a célula pode entrar em morte celular, caso o dano não seja reparado
(FOSTER, 2008). Os pontos de checagem da integridade do DNA operam através do
ciclo, especialmente na transição G1 –S, durante e depois da fase de síntese do DNA,
e antes das células entrarem em mitose (G2 - M) (FISCHER et al., 2004).
Nas células tumorais, os checkpoints são freqüentemente ignorados,
resultando em instabilidade genética e conseqüente vantagem proliferativa de células
cancerosas, quando comparadas com as células normais (FISCHER et al., 2004).
As ciclinas são proteínas chaves do ciclo celular, que em conjunto com as
quinases dependentes de ciclina (CDKs), formam o complexo ciclina-CDK que
coordena a progressão do ciclo (MALUMBRES et al., 2007). Este complexo é
composto por uma subunidade reguladora (ciclina) e uma catalítica (CDK)
(BETTENCOURT-DIAS et al., 2004). A atividade das ciclinas é modulada por
36
modificações nos seus níveis de expressão de RNAm, quanto nos níveis de proteínas.
Assim as ciclinas são produzidas em cada uma das fases do ciclo (FOSTER, 2008).
A proteína do retinoblastoma, pRb, controla a expressão de genes que
comprometem as ciclinas que estão no checkpoint na interseção G1-S. No início de G1,
ela está hipofosforilada, o que reprime o avanço do ciclo celular, porque impede a
atividade do fator de transcrição E2F. Próximo ao ponto de restrição, os pontos de
restrição, os complexos ciclina D – CDK4 e 6 e o complexo ciclina E – CDK2,
hiperfosforila pRb, liberando E2F, promovendo desta forma a entrada em S (ALMEIDA
et al., 2005). Quando ocorre mutação no gene pRB, o ciclo celular fica desregulado, e
mesmo que a célula não esteja preparada para entrar em S ou tenha ocorrido erros, o
ciclo progride (MADDIKA et al., 2007). Isto porque o gene pRb é reconhecido como
supressor tumoral, pois é capaz de parar o ciclo celular, caso erros sejam detectados.
Por isso, mutações no pRB são freqüentemente encontradas em tumores (ALMEIDA
et al., 2005).
As células tumorais mostram uma perda no controle da proliferação celular
(ponto de restrição) e, muitas vezes, tornam-se independentes de sinais mitogênicos
para a sua progressão através das diferentes fases do ciclo celular (HANAHAN &
WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002). A perda do controle da proliferação celular
envolve mutações em genes reguladores do ciclo celular, os proto-oncogenes e genes
supressores tumorais, o que caracteriza o câncer como uma doença genética (LOURO
et al., 2002; FOSTER, 2008). Dessa forma, as alterações nos mecanismos de
regulação do ciclo celular tornam a célula apta a passar pelo ciclo celular sem a devida
checagem e, portanto fazendo com que esta acumule uma série de mutações que
contribuem para o surgimento das características malignas do tumor, como auto-
suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos inibidores de
crescimento, evasão da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo
ilimitado, angiogênese e invasão tecidual e metástase (HANAHAN & WEINBERG,
2000; LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Portanto, as células cancerosas diferem
das células normais, pelo fato de continuarem a crescer e se dividir, não obedecendo
ao controle biológico natural do organismo (HANAHAN & WEINBERG, 2000).
37
Figura 4: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et
al., 2003.
1.4 Morte celular: Apoptose e Necrose
O equilíbrio entre a proliferação e a morte celular regula e controla o número de
células no organismo. A cascata de eventos, bioquímicos e fisiológicos, que leva a
mudanças na síntese de macromoléculas, na homeostase celular, na regulação do
volume celular, e finalmente na perda da viabilidade celular está intimamente
relacionada às mudanças morfológicas características de cada tipo de morte celular
(BRASILEIRO-FILHO, 2006; TINARI et al., 2008).
Com o propósito de pesquisar e compreender as patologias, diversos tipos de
morte celular vêm sendo descritos, tais como a apoptose, autofagia, necrose,
catástrofe mitótica, excitotoxicidade e senescência. No entanto, a apoptose e a
necrose são os tipos mais intensamente estudados (KRYSKO et al., 2008).
38
A morte celular pode ser classificada de acordo com sua aparência morfológica
(apoptose, necrose, autofagia ou catástrofe mitótica – Figura 5), critérios com base
em enzimas (com ou sem o envolvimento de nucleases ou de classes distintas de
proteases, tais como caspases, catepsinas e glutaminases), aspectos funcionais
(programada ou acidental, fisiológica ou patológica) ou características imunológicas
(imunogênicas ou não imunogênicas) (MELINO, 2001; OKADA & MAK, 2004;
GALLUZZI et al., 2007).
Figura 5: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia. Fonte: Bruin & Medema, 2008.
A autofagia é uma resposta ativa a falta de nutrientes, diferenciação e
desenvolvimento, sendo então um processo adaptativo de resposta ao estresse
metabólico, que resulta na degradação de proteínas e organelas. A autofagia é
definida como um processo em que proteínas e organelas são degradadas por
proteases lisossomais (RICCI & ZONG, 2006).
A catástrofe mitótica não é considerada uma forma de morte, mas sim um sinal
irreversível para a morte (RICCI & ZONG, 2006), sendo principalmente associada nos
pontos de checagem do ciclo celular. É um processo resultante de mitose aberrante,
durante a separação das cromátides irmãs (BREDESEN, 2007). Morfologicamente
39
apresentam-se como células aumentadas e multinucleadas, e com defeitos mitóticos,
como condensação nuclear incompleta, defeito no alinhamento dos cromossomos e
dano DNA (BRUIN & MEDEMA, 2008).
O dano que leva a catástrofe mitótica pode ser induzido por fármacos
quimioterápicos como agentes da hiperpolimerização dos microtúbulos (paclitaxel),
agentes despolimeralizantes de microtubulos (vinblastina e vincristina) e inibidores de
checkpoint quinase 1 (Chk1) (7-hidroxiestaurosporina) (RICCI & ZONG, 2006).
As principais características da necrose incluem: depleção energética, danos a
membrana lipídica e perda da função homeostática de canais e bombas de íons. É
bem caracterizada pela vacuolização do citoplasma, perda de integridade de
membrana e aumento do volume celular (KRYSKO et al., 2008). A necrose é induzida
por inibidores da produção de energia celular, desbalanço no fluxo de cálcio, geração
de ROS e ativação de proteases não apoptóticas, cada um destes eventos
potencializa o outro. A β-lapachona e o honokiol são exemplos de compostos que
induzem necrose em células tumorais (BRASILEIRO-FILHO, 2006; RICCI & ZONG,
2006).
A apoptose é um importante fenômeno, bem caracterizado, na citotoxicidade
induzida por fármacos anticâncer (KIM et al., 2002; MADDIKA et al., 2007;), sendo
também um processo seletivo de deleção celular fisiológica (HENGARTNER, 2000),
visto que ocorre para o controle da população celular e do tecido (VERMES et al.,
2000), desenvolvimento embrionário ( ZIEGLER & GROSCURTH, 2004), dentre outros
processos fisiológicos e patológicos. Foi primeiramente descrita por Kerr e
colaboradores em 1972.
Do grego apo= de e ptose= cair, a apoptose é conhecida como morte celular
programada, fenômeno esse em que a célula é estimulada a acionar mecanismos que
culminam com sua morte. A célula em apoptose não sofre autólise, ela é fragmentada
e seus fragmentos são endocitados por células vizinhas, sem desencadear
quimiotatismo nem ativação de células fagocitárias, diferentemente da necrose
(BRASILEIRO-FILHO, 2006). A apoptose pode ser reconhecida por algumas
características marcantes e coordenadas, pode ser observado retração celular e
conseqüente perda de aderência com a matrix extracelular e células vizinhas. As
organelas mantêm a morfologia, porém em alguns casos, as mitocôndrias podem
apresentar ruptura na membrana externa. A cromatina sofre condensação, além disso,
na membrana plasmática, formam-se prolongamentos, os chamados blebs, que
aumentam de tamanho e se rompem, originados os corpos apoptóticos, onde são
rapidamente fagocitados por macrófagos e removidos sem causar processo
inflamatório (ZIEGLER; GROSCURTH, 2004).
40
A ativação da apoptose ocorre por duas vias gerais: via extrínseca e
intrínseca (Figura 6).
Quando a via intrínseca é ativada (Figura 6), o primeiro passo é o aumento da
permeabilidade da membrana mitocondrial seguida da liberação de proteínas que
normalmente estavam localizadas no espaço intermembranar [citocromo c, fator de
indução da apoptose, Smac/DIABLO (Second Mitochondria-derived Activator of
Caspases/Direct IAP Binding Protein with Low Propidium iodideI), entre outros]. O
citocromo c se liga a Apaf-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) e forma um
complexo multicatalítico chamado apoptossomo. Este complexo ativa a caspase-9 a
partir de sua forma zimogênica pró-caspase-9. Então, a caspase-9 cliva as caspases
efetoras -3, -6 e -7, ativando-as para realizar a fragmentação do DNA (KUMAR et al.,
2004; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004; BRASILEIRO-FILHO, 2006).
A via de receptor de morte ou via extrínseca (Figura 6) envolve a ativação de
receptores de membrana. Eles são membros da superfamília de receptores de fatores
de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor receptor - rTNF). Estão inclusos nessa
família os receptores de membrana rTNF-1, FAS (CD95), TRAIL (TNF-related
apoptosis inducing ligand), entre outros. Esses receptores possuem um domínio
distinto dentro do citoplasma denominado de domínio de morte (Death Domain - DD)
que contém uma seqüência de 65 aminoácidos. Após a associação dos receptores de
membrana ao seu correspondente DD, ocorre uma mudança conformacional nos
receptores, o que promove o recrutamento de uma molécula adaptadora FAS que irá
associar-se com o domínio de morte (DD) formando o FADD. Este complexo formado
é o responsável por iniciar a cascata de caspases, pois o FADD se liga a procaspase-
8 e forma caspase-8, ativando as caspases efetoras -3, -6 e -7 (STRASSER et al.,
2000; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004).
41
Figura 6: Esquema demonstrando as principais vias de ativação da apoptose, suas interconexões e as alterações morfológicas mais características. Adaptado de MACFARLANE & WILLIAMS (2004) com algumas alterações.
42
1.5 Princípios de Quimioterapia Antineoplásica
A utilização de agentes químicos, isolados ou em combinação com o objetivo
de tratar os tumores malignos, denomina-se de quimioterapia antineoplásica. Difere da
radioterapia e da terapia cirúrgica por ser um tratamento sistêmico e cada vez mais
tem se tornado uma das mais importantes e promissoras ferramentas de combate ao
câncer no mundo (BONASSA & SANTANA, 2005). Existem as terapias com
fotorradiação (KUSUZAKI et al., 2007) e a imunoterapia (HERR & MORALES, 2008).
A proposta do tratamento com os agentes antineoplásicos é de impedir a
multiplicação de células cancerosas, a metastização e de proporcionar a destruição do
tumor existente (SKEEL, 2007).
No entanto, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o
tratamento do câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado por
causa de falhas nos esquemas terapêuticos, altos índices de recidivas, redução da
sobrevida dos pacientes e dos efeitos adversos, o que leva a uma contínua busca por
novos fármacos (SALGALLER & LODGER, 1998). O fármaco ideal deve aumentar a
especificidade, protegendo tecidos normais, minimizar o desconforto dos pacientes e
aumentar a eficácia, resultando na erradicação da massa heterogênea do tumor
(BRANNON-PEPPAS & BLANCHETTE, 2004).
Diante do exposto anteriormente, é importante que novas estratégias como o
restabelecimento do controle do ciclo celular com drogas que agem nos pontos de
checagem, possam ser disponibilizadas como uma estratégia viável na terapia
anticâncer (FISCHER et al., 2004).
Dentre as substâncias isoladas de produtos naturais encontramos os
chamados metabólitos secundários, uma classe química que se destaca pelo grande
potencial farmacológico. Estes são produtos de vias condicionais que são ativadas em
contextos ou situações particulares. Eles podem ser divididos em diversas classes
estruturais: terpenos, lignanas, taninos, lactonas, esteróides, chalconas, flavonas,
flavanonas, alcalóides e quinonas, dentre outros (CLARDY & WALSH, 2004).
Além disso, inúmeros análogos foram sintetizados em laboratórios por
diferentes grupos de pesquisa, com o objetivo de se identificar os grupos
farmacofóricos, estabelecendo, assim, a relação estrutura-atividade na tentativa de se
obter fármacos mais potentes (KINGSTON, 2000). A partir deste momento, grandes
mudanças ocorreram nos centros de pesquisas, incluindo a identificação de novos
alvos moleculares exploráveis, estabelecimento de programas de triagem de produtos
naturais em larga escala (HTS – High Throughput Screening), avanços no projeto
43
racional de drogas e química combinatória (YUNES et al., 2001; MANN, 2002;
ROTHENBERG et al., 2003; BUTLER, 2004; GANESAN, 2004; WESTWELL &
STEVENS, 2004; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG et al., 2006; NEWMAN &
CRAGG, 2007).
Diversos fármacos, nas fases do ciclo celular, irão atuar inibindo a multiplicação
celular. Esses fármacos que exercem a sua ação interferindo no ciclo celular são
chamados de ciclo-celular específicos. Entretanto, os antineoplásicos que tem a
capacidade de agir sobre as células tumorais independentes de estarem atravessando
o ciclo ou de estarem em repouso (Fase G0), são denominados de ciclo-celular não-
específicos (VASCONCELLOS apud ALMEIDA et al, 2005).
Muitas dessas substâncias constituem-se, sobretudo, em modelos para o
desenvolvimento de medicamentos sintéticos modernos, tais como os fármacos
anticâncer utilizados atualmente: a vimblastina (Velban®) e a vincristina (Oncovin®) e
os análogos vindesina (Eldisine®) e vinorelbina (Navelbine®); o paclitaxel (Taxol®) e o
análogo docetaxel (Taxotere®); a podofilotoxina e os análogos, etoposídeo
(Etopophos®) e teniposídeo (Vumon®); e a camptotecina e os análogos, topotecano
(Hycamtin®) e irinotecano (Camptosar®). Esses medicamentos apresentam uma
participação no mercado que movimenta cerca de 50 bilhões de dólares anualmente
(CRAGG & NEWMAN, 2000; CRAGG & NEWMAN, 2005; PINTO et al., 2002).
A importância da síntese química das moléculas que possuem atividade
antitumoral torna-se um atrativo e um processo viável para a indústria farmacêutica
(Figura 7), visto que com relação à produção de substâncias extraídas de fontes
naturais, que requer muito material para a extração e obtenção da dose necessária
para o paciente, torna-se também um caminho longo até o isolamento do princípio
ativo com menos toxicidade ao paciente.
Como exemplo ao que foi abordado acima, a vimblastina e a vincristina são
alcalóides naturais encontrados nas partes aéreas da planta Catharanthus roseus var.
albus G. Don. ou Vinca rósea L., (Apocynaceae) daí serem chamados de alcalóides da
vinca (Figura 8). Já a vindesina e a vinorelbina são derivados semi-sintéticos
(GUERITTE-FAHY, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2005; NEWMAN & CRAGG, 2006).
44
Categorias usadas para definir a origem dos medicamentos anticâncer:
V-Vacina, B- Uso biológico (Peptídeos ou proteínas isolados de algum organismo ou linhagem celular), N- Produto Natural, ND- Derivado de produto natural por modificações semi-sintética, S- Totalmente sintético, S/NM- São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais, S*- Totalmente sintético, mas na farmacopéia diz ser de origem natural, S*/NM- São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais, V- vacina.
Figura 7: Distribuição da origem dos medicamentos antineoplásicos que estão no mercado nos últimos 25 anos. Adaptado de: Newmann & Cragg, 2007.
O mecanismo de ação dos alcalóides da vinca é o aparelho mitótico, em
particular, os microtúbulos. Envolve o bloqueio da polimerização dos microtúbulos, que
constituem uma importante parte do citoesqueleto e do fuso mitótico. O fármaco liga-
se especificamente à proteina microtubular, a tubulina, na forma dimérica. O complexo
fármaco-tubulina liga-se a extremidade em formação dos microtubulos, interompendo
a sua organização, com consequente despolimerização destes microtubulos. O
processo determina a parada da mitose na fase metáfase, com dissolução do fuso
mitótico e interferencia na segregação dos cromossomos (KATZUNG, 2003).
45
NH
N
R4 CH3
O
OCH3
N
N
R1
R2
OH
R3
CH3
O
CH3
R1 R2 R3 R4
Vimblastina CH3 CO2CH3 OCH2CH3 OH
Vincristina COH CO2CH3 OCH2CH3 OH
Vindesina CH3 CONH2 OH OH
Vinorelbina CH3 CO2CH3 OCH2CH3 H
Figura 8 Estrutura química da vimblastina, da vincristina, da vindesina e da vinorelbina.
O paclitaxel (Figura 9) é um alcalóide encontrado nas cascas da planta Taxus
brevifolia Nutt (Taxaceae). O seu análogo, o docetaxel (Figura 9), foi obtido através do
estudo da relação estrutura-atividade (KINGSTON, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2005).
Um dos fatores que desde logo despertou a atenção no estudo dos taxanos
(paclitaxel e docetaxel) foi o seu mecanismo de ação ser diferente do que, até então,
era conhecido. As estruturas intracelulares afetadas pelos taxanos também são os
microtúbulos. Entretanto, diferentemente das outras drogas antimitóticas conhecidas,
como os alcalóides da vinca ou a colchicina, que induzem a disjunção dos
microtúbulos, os taxanos promove a polimerização da tubulina em microtúbulos das
células (KINGSTON, 1991; KATZUNG, 2003). Os microtúbulos formados por indução
dos taxanos são extremamente estáveis e disfuncionais. Havendo assim um
deslocamento no equilíbrio dinâmico entre a formação dos microtúbulos e a sua
dissociação em tubulina, o que compromete a mitose, bloqueando a divisão celular e
comprometendo funções celulares vitais, o que provoca a morte da célula.
Devido à dificuldade de isolamento e baixo rendimento, somente após 20 anos
de sua descoberta, o Paclitaxel foi utilizado para testes clínicos. No entanto, para
46
produzir 360g do composto, cerca de 4000 árvores foram sacrificadas, tornando
inviável seu uso (MANN, 2002). Este problema somente foi solucionado quando Potier
e seus colaboradores descobriram que das folhagens de Taxus baccata poderia se
extrair uma quantidade maior de um precursor, 10-deacetilcaccatin III, que facilmente
poderia ser convertido em Paclitaxel e em análogos mais potentes como o Docetaxel
(Taxotere) (GUERITTE-VOEGELIN et al., 1991). Este último é um taxóide, semi-
sintético, duas vezes mais potente que o composto natural (Figura 9) (BARREIRO &
FRAGA, 2002). O Docetaxel é um exemplo importante que demonstra a importância
da síntese ou semi-síntese química na descoberta de novos agentes antineoplásicos.
Nos últimos 50 anos, as pesquisas de novas moléculas levaram a descoberta
de mais de 100 novos fármacos que adentraram ao arsenal para o tratamento de
neoplasias malignas, sendo, na sua maioria, derivados ou protótipos de produtos
naturais (WAGNER-DÕBLER et al., 2002).
R1 R2
Paclitaxel
COCH3
Docetaxel
OC(CH3)
H
Figura 9: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel.
CH3
CH3
OH
CH3
OR2O
O
CH3
OH
AcOO
O
O
O
OH
NH
O
R1
CH3
47
1.6 Chalconas
As chalconas são compostos precursores da via de biossíntese dos
flavonóides. O termo chalcona é utilizado para caracterizar uma família de compostos
que possuem como núcleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presença
de uma ligação olefínica, de um grupamento cetona e/ou de um grupamento hidroxila,
com dois anéis aromáticos, unido a α,β insaturados (Figura 10). Uma característica
importante neste grupo é a pigmentação amarela apresentada pelos mesmos, que
passa a vermelha em meio alcalino. Essas substâncias têm um papel importante em
sistemas ecológicos em função das cores que produzem nos vegetais e são
encontradas em diferentes órgãos, sobretudo nas flores. As cores estão implicadas
especialmente na polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros. Apresentam
uma grande variedade de atividades biológicas, sendo as mais comuns edulcorantes
ou protetores contra a luz e calor (BRAVO, 1998; LAWRENCE et al., 2006).
Figura 10: Núcleo fundamental das chalconas.
Na Tabela 1 podemos observar alguns exemplos de flavonóides pertencentes
a essas classes, suas fontes e estruturas (HODEK; TREFIL; STIBOROVA, 2002;
MOON; WANG & MORRIS, 2006). Os flavonóides ainda podem ser encontrados de
duas formas, sem os grupamentos açúcar (agliconas) ou com resíduos de açúcares
ligados (glicosídicas) (PETERSON & DWYNER, 1998).
48
Tabela 1: Exemplos de alguns flavonóides e suas fontes.
Fonte: MOON, WANG & MORRIS, 2006.
As chalconas, uma das maiores classes de produtos naturais com vasta
distribuição em frutas, vegetais, temperos, chás, soja e outros gêneros alimentícios
são destaques na pesquisa devido à disponibilidade destes compostos na dieta da
população e tem sua importância na medicina popular (VINCENZO et al., 2000;
NOWAKOWSKA, 2007).
49
Além do papel sobre sistemas ecológicos e das atividades biológicas, as
chalconas têm despertado grande interesse farmacológico. Nos últimos anos, têm sido
estudadas as atividades: antiinflamatória, antinociceptiva (VIANA et al., 2003),
antitumoral, antimicrobiana (RAFI et al., 2000), antimalárica (CHEN, 1994), inclusive
com atividade anti-HIV (CHEENPRACHA, 2006) e antioxidante para várias chalconas
e seus derivados sintéticos (LEBEAU et al., 2000). A posição em que se encontram os
grupos substituintes nos dois anéis aromáticos determina essa variedade de
propriedades farmacológicas e biológicas (KO, 2003).
Um número de derivados de chalconas tem sido encontrado inibindo
importantes enzimas no sistema celular, incluindo xantina oxidase, aldose redutase,
epoxido hidrolase, proteína tirosina quinase e quinona redutase (NOWAKOWSKA,
2007).
Dentre os flavonóides, as chalconas têm sido relatadas como compostos
atraentes com propriedades quimioprotetoras e antitumorais. As chalconas 4,2’,6’-
trihidroxi-4’-metoxidihidrochalcona,2’,6’-dihidroxi-4’-etoxidihidrochalcona, e 2’,4’-
diacetoxichalcona, isoladas das partes aéreas de Ononis natrix ssp. ramosissima
(Leguminosae), apresentam moderada atividade citotóxica contra P-388 (leucemia
murina), A-549 (carcinoma de pulmão de não-pequenas células humano) e HT-29
(câncer de colon humano). Entretanto, o composto mais potente, a 2’,6’-diacetoxi-4,4’-
dimetoxidihidrochalcona, mostrou atividade seletiva pela linhagem de células P-388
(FOREJTNIKOVA et al., 2005; KIMURA, 2005).
A chalcona 3,4,3’,4’,5’-pentametoxichalcona é um potente agente citotóxico,
que atua ligando-se à tubulina, impedindo a montagem dos microtúbulos (LAWRENCE
et al., 2000). A chalcona pedicina (2’,5’-dihidroxi-3’,4’,6’-trimetoxichalcona) isolada das
folhas de Fissistigma languinosum (Annonaceae), também agem a nível de tubulina,
interrompendo a montagem destas subunidades em microtúbulos. Nesta mesma
planta foram descobertas duas novas chalconas condensadas, fissistina e isofissistina,
citotóxicas contra células KB, que contém sequências do papiloma vírus (ALIAS et al.,
1995).
Com base em sua descoberta de que a licochalcona A isolada de Xin-jiang
licorice possui atividade antiinflamatória e antitumorigênica, SHIBATA (1994) sintetizou
e estudou a atividade antimutoral in vitro e in vivo de 40 chalconas derivadas da
licochalcona A. Os resultados obtidos demonstraram que muitos destes compostos
possuem uma grande potência em inibir a tumorigênese. Dentre estes estão a 3’-metil-
3-hidroxichalcona e a 4’-metil-3-6 hidroxichalcona, que além de inibir a fosforilação de
fosfolipídeos promovida pelo acetato de tetradecanoilforbol (TPA) em células HeLa in
vitro, o crescimento de tumores em pele de camundongos iniciados com
50
dimetilbenz[a]-antraceno e promovido por TPA também apresentam uma marcante
atividade inibitória sobre a proliferação de células HGC-27 (câncer gástrico humano).
Muitos trabalhos descrevem a importância das chalconas para os estudos
antitumorais, considerando-as candidatas promissoras ao desenvolvimento de novas
drogas com atividade antineoplásica (SHAH et al., 2008). Alguns derivados de
chalconas estão sendo investigados: a atividade anticâncer em linhagens tumorais que
conferem a resistência a multidrogas (MDR) ou seu potencial para modular a atividade
da glicoproteína P, proteína encontrada na membrana celular responsável pela
resistência aos antineoplásicos (VINCENZO et al., 2000).
A chalcona utilizada para a realização deste estudo foi a (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-
fenilprop-2-en-1-ona, como apresentado na Figura 11.
Figura 11: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do derivado de chalcona, (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.
51
Existem dois fatores que podem explicar o crescente interesse da indústria
farmacêutica por produtos sintéticos oncológicos. O primeiro é o desejo de encontrar
moléculas para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos, que tenha uma
eficácia terapêutica grande e que sejam mais toleráveis aos efeitos colaterais por eles
desencadeados. O segundo e o mais importante é o respaldo cada vez mais sólido
que a ciência está oferecendo aos estudos das drogas sintéticas e derivados de
produtos naturais. A partir da constatação de que muitas vezes diversos
pesquisadores mostram interesse em descobrir atividade antitumoral em moléculas já
existentes com comprovada atividade biológica em outras moléculas do mesmo grupo,
é possível que esses estudos mostrem atividades promissoras anticâncer.
A substância ((E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona) para a investigação da
atividade antitumoral in vitro e in vivo deste estudo foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr.
Antônio Carlos Severo Menezes e Profa. Dra. Caridad Noda Pérez, do Departamento
de Química Orgânica da Universidade Estadual de Goiás (UEG).
Relevância e
Justificativa
53
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de drogas antineoplásicas é dependente do conhecimento dos
fatores etiológicos e patogenéticos que contribuem para a o desenvolvimento dos
tumores malignos. Várias anormalidades são encontradas nos pacientes oncológicos,
tanto com relação às características dos tumores (inibição do processo apoptótico,
aquisição de auto-suficiência, sinalização dos fatores de crescimento, formação de
novos vasos sanguíneos e a ocorrência da metástase à distância), como as alterações
identificadas nos pacientes após o tratamento convencional, o que diminui muitas
vezes a qualidade de vida do indivíduo.
O câncer é a segunda causa de morte por doença no mundo, ficando atrás
apenas das doenças cardiovasculares, o número de novos casos de câncer vem
aumentando a cada ano e o crescente número de óbitos, que somente em 2008
vitimou cerca de 40 mil pessoas, custaram em demandas hospitalares superiores a
400 milhões de reais (BRASIL, 2009).
A descoberta de novas substâncias naturais ou sintéticas capazes de interferir em
eventos celulares específicos das células tumorais malignas tem proporcionado a
busca por moléculas com atividade cada vez mais definida.
Deste modo, a busca por compostos com ação antineoplásica específica e com
menor toxicidade para o portador de câncer levou-nos a investigar um possível efeito
do derivado de chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, designado no
presente estudo por CG, substância de fácil obtenção, no intuito de que futuramente
essa molécula possa ser usada no tratamento de doenças neoplásicas, o que
justificaria a importância deste estudo.
Objetivos
55
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar as propriedades anticâncer de um derivado de chalcona, (E)-1-(4-
Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG) em modelos experimentais in vitro e in vivo.
3.2 Específicos
Determinar a atividade citotóxica e hemolítica da CG em diferentes linhagens
tumorais e a atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos,
respectivamente;
Avaliar a citotoxicidade deste composto em relação a células mononucleares
do sangue periférico (PBMC) de voluntários saudáveis;
Sobre o mecanismo de ação citotóxico da CG, utilizando como modelo a
linhagem HL-60 (Leucemia promielocítica), após 24 horas de exposição:
Avaliar a viabilidade celular;
Avaliar o efeito da CG sobre a indução de morte celular;
Averiguar a ação antiproliferativa da CG por meio de inibição da síntese
de DNA;
Investigar alterações morfológicas desencadeadas pelo composto CG;
Estudar por meio da citometria de fluxo, o efeito da CG sobre a
viabilidade celular, integridade de membrana, fragmentação de DNA,
análise do ciclo celular, externalização da fosfatidilserina (Anexina V),
caspases- 3, 7, 8 e 9;
Investigar a participação do Citocromo c, Pro-caspase 9 e Caspase-9 clivada;
Estudar o potencial genotóxico da CG sobre as células mononucleares do
sangue periférico (PBMC) de voluntários saudáveis;
56
Investigar o potencial mutagênico da CG através do teste do micronúcleo sobre
as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de voluntários
saudáveis;
Determinar o efeito antitumoral in vivo da CG em camundongos Swiss,
portadores de Sarcoma 180 e seu grau de toxicidade através de analises do
hemograma, bioquímica e hispatológico dos órgãos-alvo dos animais.
Materiais e Métodos
58
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais utilizados
4.1.1 Equipamentos
Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2®
Agitador de tubo, Donner AD 8850®
Balança pra pesar animais, Filizola®
Balança Analítica, Gehaka Modelo AG200®
Balão Volumétrico
Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di®
Câmara de Newbauer, Boeco Germany®
Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212®
Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206®
Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403®
Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin®
Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte mini®
Contador manual, Division of Bexton, Dickinson and Company®
Deonizador de água Milli-Q, Milipore®
Destilador de água
Espectrofotômetro de placa DTX-880, Beckman Coulter®
Fluxo laminar, VECO®
Incubadora de células, (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow®
High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek
3000, BeckmanCoulter®
Microondas, Panasonic®
Microscópio óptico, Metrimpex Hungary/PZO-Labimex Modelo Studar lab®
59
Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot®
Microscópio de fluorescência, Olympus®
pHmetro, Micronal B474®
Pipetas automáticas, Gilson®
Sistema Vertical (Western blot), Amershan Biosciences®, Modelo miniVE
completo.
4.1.2 Reagentes, Soluções e Fármacos
Ácido Acético - Vetec®
Ácido Clorídrico - Vetec®
Agarose baixo ponto
de fusão
- Gibco®
Agarose ponto de fusão
normal
- Gibco®
Álcool Etílico - Vetec®
Alamar Blue (Resazurina) 0,312 mg/mL Sigma®
Anticorpo anti-BrdU 1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma®
BSA 5 % q.s.p. 500 µL de
solução
Dako®
Anticorpo biotinilado anti-
imunoglobulina de
camundongo
Azul de tripan 0,4%
1 µL de anticorpo anti-
imunoglobulina
BSA 5 % q.s.p. 100 µL de
solução
Sigma®
10 mg de azul de tripan Sigma®
PBS q.s.p. 100 mL de solução -
BrdU 10mM - Sigma®
Brometo de Etídio 100
μg/mL 1mg de brometo de etídeo Sigma®
Citocalasina B
Citocromo c
PBS q.s.p 10 mL de solução
-
-
Sigma®
- Biotechnology®
Citrato de Sódio - Grupo Química®
60
Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®
Diaminobenzidina (DAB) 5 µL de DAB Immunotech®
1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05M)
pH= 7,6 Proquímios®
2 µL de H2O2 Proquímios®
Dimetilsulfóxido (DMSO) - Vetec®
Doxorrubicina –
fornecida pelo Instituto do
Câncer do Ceará – ICC
-
Zodiac®
Estreptavidina –
peroxidase
1 µL de Estreptavidina –
peroxidase Sigma®
BSA 5 % q.s.p. 100 µL de
solução Dako®
Eosina-Azul de Metileno
(May- Grunwald)
Giemsa
Ficoll
Fitohemaglutinina
0,2 g
Metanol q.s.p. 100 mL de
solução
-
Reagen®
Bioclin®
- Sigma®
- Sigma®
5-Fluorouracil - Sigma®
Formaldeído -
Dinâmica®
Gentamicina -
Novafarma®
Hematoxilina - Doles®
Iodeto de propídeo 50
µg/mL 1 mg de iodeto de propídeo Boehringer®
PBS q.s.p. 50 mL
Laranja de Acridina 1 g de laranja de acridina (100
µg/mL) Fluka®
H2O q.s.p. 10 mL de solução -
Meio de cultura de células
RPMI 1640
Diluído em água deionizada e
esterelizada, filtrado em filtro
millipore (0,22 µm) e
complementado com SBF 10 %,
1 % de glutamina, 1 % de
Cultilab®
61
antibióticos, 1 % de bicarbonato
de sódio (0,75 %) e 25 mM de
HEPES
Metanol - Vetec®
MTT 20 mg de MTT Sigma®
PBS q.s.p. 100 mL de solução -
Penicilina –
estreptomicina Penicilina 10.000 U.I./mL Cultilab®
Solução desnaturante
(para análise de
incorporação de BrdU)
Soro fetal bovino
Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab®
Formamida 70 %
2x SSC (pH entre 6,5 e 7,5 a 70
°C)
Vetec®
- Cultilab®
Solução salina (para
hemólise)
8,5 g de Cloreto de sódio (0,85
%) Labsynth®
1,11 g de Cloreto de cálcio (10
mM) Reagen®
H2O q.s.p 1 L de solução -
SSC 10X
Cloreto de sódio 1,5 M
Citrato de sódio 0,15 M
H2O
-
Tampão fosfato (PBS) 8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®
2,14 g de NaHPO4.7H2O Labsynth®
0,276 g de NaHPO4.H20 Labsynth®
H20 q.s.p. 1 L de solução (pH =
7,2) -
Tampão Tris (TBS) 10X
Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®
Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios®
H2O destilada -
Tripsina 0,25% 50 mL de Tripsina 2,5 % Cultilab®
0,125 g de EDTA Proquímios®
450 mL de PBS -
Triton X -100 - Isofar®
62
Outras Soluções:
Tampão fosfato pH = 7,4 (PBS)
NaCl................................................................... 8,77g
NaH2PO4 (Monobásico)..................................... 3,18g
Na2HPO4 (dibásico)........................................... 10,94g
H2O destilada..................................................... q.s.p. 1L
Tampão tris pH = 7,6 (TBS)
NaCl.................................................................. 8,77g
Tris-base........................................................... 6,08g
H2O destilada.................................................... q.s.p. 1L
Ajustar o pH para 7,6 com HCl.
Ensaio do Cometa
Tampão para corrida eletroforética pH~13 (alcalino)
EDTA.................................................................. 0,292g
NaOH.................................................................. 12,0g
H2O destilada....................................................... q.s.p. 1L
Tampão de lise pH= 10
NaCl................................................................. 145g
EDTA............................................................... 29,23g
Tris-base.......................................................... 1,21g
63
Triton X-100.................................................... 10mL
DMSO............................................................. 100mL
H2O destilada.................................................. q.s.p. 1L
Solução de neutralização pH= 7,5
Tris-base......................................................... 78,46g
H2O destilada.................................................. q.s.p. 1L
Ajustar o pH para 7,5 com HCl.
Ensaio do Micronúcleo
Solução de Carnoy
Metanol............................................................ 3 mL
Ácido acético................................................... 1 mL
Western Blot
Solução de acrilamida/bisacrilamida 30.8%
Acrilamida (PlusOne®) ................................ 30% em dH2O
Bisacrilamida (PlusOne®) ........................... 0,8% em dH2O
Tampão de corrida (pH 8,3)
Tris (PlusOne®)........................................... 25 mM
Glicina (PlusOne®)...................................... 0,192M
SDS (Fisher Scientific®)………………...……. 0,1%
Tampão de transferência
Tris (PlusOne®)........................................... 25 mM
64
Glicina (PlusOne®)...................................... 0,192M
MeOH……………………………………….….. 20%
Tampão de revelação (pH 9,5)
Tris (PlusOne®)........................................... 50 mM
MgCl2…………………………………..………. 5mM
NaCl........................................................... 0,15M
Composição do tampão de lise (Cell Signaling Technology®)
Tris-HCl (pH 7.5)…....................................... 20 mM
NaCl............................................................ 150 mM
Na2EDTA..................................................... 1 mM
EGTA........................................................... 1 mM
Triton........................................................... 1%
Fosfato de Sódio........................................ 2.5 mM
β- Glycerofosfato........................................ 1 mM
Na3VO4........................................................ 1µg/mL
Composição do tampão de amostra Blue Juice (10X; Invitrogen®)
Tris-HCl (pH 7,5)…....................................... 10 mM
EDTA........................................................... 10 mM
Sacarose...................................................... 65%
Azul de bromofenol ...................................... 0,3%
Componentes do kit para dosagem de proteínas DC Protein Assay (Bio-Rad
Laboratories®)
Reagent A….................................................... Solução alcalina de tartarato
de Cu
Reagent B...................................................... Reagente de Folin
65
Reagent S............................................................ Detergente
Substâncias:
(E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona (CG)
Doxorrubicina (controle positivo in vitro) (Zodiac®)
5-Fluorouracil (controle negativo in vivo) (Sigma®)
4.2 Células
As células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e
antitumoral estão listadas quanto ao tipo histológico, origem e fonte na tabela 2.
66
Tabela 2 - Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e
antitumoral.
Linhagem* Tipo Histológico Origem Fonte
HL-60 Leucemia
promielocítica Humana
Children’s Mercy Hospital –
EUA
HCT-8 Carcinoma de cólon Humana Children’s Mercy Hospital –
EUA
SF-295 Glioblastoma Humana Instituto Nacional do Câncer
- EUA
MDA-MB-435 Melanoma Humana Instituto Nacional do Câncer
- EUA
PBMC Linfócitos e monócitos Humana Cultura primária
K562 Leucemia Mielóide
Crônica Humana
Instituto Nacional do Câncer
- EUA
Sarcoma 180 Sarcoma Murina –
camundongos
Laboratório de Oncologia
experimental - UFC
*Linhagens pertencentes ao Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.
4.2.1 Manutenção das células em cultura
As linhagens celulares foram cultivadas em garrafas para cultura de células (75
cm3, volume de 250 mL), os meios utilizados foram RPMI 1640, suplementados com
10% de soro bovino fetal e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células
foram mantidas em incubadoras com atmosfera de 5 % de CO2 a 37 ºC. Diariamente
acompanhava-se o crescimento celular com a utilização de microscópio de inversão. O
meio foi trocado sempre que o crescimento celular atingia confluência necessária para
renovação de nutrientes. Para a manutenção de células aderidas utilizou-se tripsina
(0,25%) para que as células despregassem-se das paredes das garrafas (PESSOA,
2000).
67
4.2.2 Obtenção de células PBMC
As células de PBMC (peripheral blood mononuclear cells – linfócitos e
monócitos) foram obtidas a partir de sangue periférico de voluntários saldáveis. A
coleta do sangue foi realizada em frasco heparinizados por profissionais capacitados,
nas dependências da UNIFAC-UFC (Unidade de Farmacologia Clínica da
Universidade Federal do Ceará), utilizando seringas esterilizadas e descartáveis com
volume de 5 mL. O material assim obtido foi imediatamente transportado para o
Laboratório de Oncologia experimental (LOE) do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, também da Universidade Federal do Ceará.
As células PBMC foram isoladas a partir de uma amostra de cerca de 3 mL de
sangue, acrescida de 5 mL de PBS. As etapas até o isolamento incluíram a adição de
3 mL de Ficoll, seguida por 30 minutos de centrifugação a 1.000 rpm, e feita a
aspiração dos PBMC, presentes na região intermediária entre as hemácias e o
plasma. A suspensão de células PBMC foi transferida para um outro tubo o qual foi
acrescido com PBS até o volume de 11 mL, sendo centrifugado por 20 minutos a
1.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células PBMC foi
ressuspendido em Meio completo (RPMI 1640 acrescido de 20% de soro fetal bovino,
1 % de antibiótico (penicilina-estreptominica) e 4% de fitohemaglutinina) e contado em
câmera de Newbauer para posterior diluição e plaqueamento.
Os experimentos realizados com células PBMC foram previamente aprovados
pelo Comitê de Ética em Pesquisas Humanas- COMEPE, no 106/10, UFC (Anexo 1).
4.3 Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos
O animal de manutenção ou doador foi anestesiado com quetamina e
sacrificado por meio de deslocamento cervical. Fez-se o procedimento asséptico com
álcool iodado e, em seguida, coletou-se o líquido ascítico da cavidade abdominal,
tendo sido preparada uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL
de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem das
células. Os animais receptores foram inoculados com 2 x 106 células/0,5 mL na região
intraperitoneal. O procedimento é realizado a cada 10 dias. Os experimentos
realizados com animais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal-CEPA, UFC (Anexo 2).
68
4.4 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss albino (Mus musculus) oriundos do
Biotério Central da Universidade Federal do Ceará. Estes foram alojados dentro de
gaiolas de polipropileno e grades metálicas apropriadas em pequenos grupos do
mesmo sexo (não excedendo 5 animais por gaiola para ratos ou 10 animais por gaiola
para camundongos). A temperatura do local foi de 22 °C ± 5 °C. A iluminação foi
artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Os animais
tiveram livre acesso a alimentação (ração especifica) e água.
Foram utilizados animais (fêmeas ou machos) adultos, jovens, saudáveis e que não
tenham sido anteriormente submetidos a processos experimentais. O número de
animais utilizados foi reduzido ao mínimo cientificamente aceitável. No início do
estudo, a variação de massa dos animais foi à mínima possível, não excedendo ± 20
% da massa média de cada grupo.
Os animais foram identificados de forma inequívoca, e foram aclimatados às
condições do biotério durante pelo menos cinco dias. A nocicepção e o sofrimento dos
animais no decurso dos ensaios foram minimizados de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal da COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos de
experimentação animal preconizados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal do Ceará, tendo sido aprovado de acordo com o protocolo no
08/10 (Anexo 2).
4.5 Procedimento Experimental
4.5.1 Obtenção da Chalcona
Para obtenção da chalcona, foi pesado 0,120 g de KOH e dissolvido em 50 mL
de metanol. Para o preparo da reação, foi pipetado 0,233 mL de acetofenona e
adicionado os 5 mL da solução do catalizador (KOH 5%) preparado anteriormente. Foi
mantida a solução em agitação em um balão volumétrico, por 1 minuto. Foi pesado
0,3022 g de para-nitro benzaldeído e adicionado ao balão, em seguida foi colocado 10
mL de metanol completando assim o volume da solução para 15 mL. O esquema de
refluxo foi montado utilizando o condensador com a solução da reação sob agitação
magnética e permaneceu sob agitação durante 4 horas. Após esse processo, foi
69
formado um precipitado amarelo no balão, que foi filtrado com auxílio do funil e papel
de filtro e deixado secar por 4 horas, em temperatura ambiente, pesando em seguida a
massa obtida. A Figura 12 mostra a reação da obtenção da (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-
fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.
O estudo químico foi realizado no Departamento de Química Orgânica da
Universidade Estadual de Goiás (UEG), sob a orientação do Prof. Dr. Antônio Carlos
Severo Menezes e Profa. Dra. Caridad Noda Pérez.
Figura 12: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt* entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.
4.5.2 Estudo da atividade citotóxica
O estudo da atividade citotóxica da CG foi realizado em células humanas
tumorais. Adicionalmente, a atividade citotóxica da CG foi avaliada em células humana
normais.
*A reação de Claisen-Schmidt é uma reação orgânica que pode ser usada na obtenção de chalconas.
70
4.5.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais
4.5.2.1.1 Princípio do teste
A avaliação do potencial citotóxico da substância teste foi realizada em células
tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de cólon, SF-
295 – glioblastoma e MDA-MB-435 – melanoma) através do método do MTT após 72
horas de incubação. Este é um ensaio quantitativo in vitro que foi desenvolvido por
Mossman em 1983 para estimar a proliferação e sobrevivência celular. É definido na
literatura como apropriado para estimava de citotoxicidade (PESSOA et al., 2000;
COSTA-LOTUFO et al., 2004; BEZERRA et al., 2005; BEZERRA et al., 2008) e basea-
se na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do Ciclo de Krebs que é
ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazolium (brometo
de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, ou MTT), que é hidrossolúvel e de cor
amarelada, em cristais de formazan, que são de cor azul escura. Essa técnica tem a
capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula, sendo assim,
bastante útil para avaliar a citotoxicidade.
4.5.2.1.2 Procedimento experimental
As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em multiplacas
de 96 cavidades numa densidade de 0,3 x 106 células/mL, para células em suspensão
(HL-60) e 0,7 x 105 células/mL para as células aderidas (MDA-MB-435, SF-295 e HCT-
8). Após 24 horas de incubação, a substância teste (0,09 a 5 µg/mL ou 0,35 a 19, 76
µM) dissolvida em DMSO foi adicionada em cada poço, utilizando o HTS (high-
throughput screening), e encubada por 72 horas. A doxorrubicina foi utilizada como
controle positivo com concentrações variando de 0,09 a 5 µg/mL. O controle negativo
recebeu a mesma quantidade de DMSO. Após o período de incubação, as placas
foram centrifugadas (15 G/15 min), e o sobrenadante foi descartado. Cada cavidade
recebeu 200 µL da solução de MTT (0,5 mg/mL em meio RPMI 1640) e foi reincubada
durante 3 horas, em estufa a 37 ºC e a 5% CO2. Após esse período, as placas foram
novamente centrifugadas (30 G/10 min), o sobrenadante foi desprezado, e o
precipitado foi ressuspendido em 150 µL de DMSO. Para a quantificação do sal
reduzido nas células vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do
espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 595 nm (MOSSMAN et al.,
1983).
71
4.5.2.1.3 Análise dos dados
A substância foi testada em diluições seriadas, em duplicata ou triplicata. Os
experimentos foram analisados segundos suas médias e respectivos EPMs e
determinado suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito
máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de
regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).
4.5.2.2 Ensaio de citotoxicidade em células normais
4.5.2.2.1 Princípio do teste
Para avaliar a citotoxicidade do composto teste sobre a proliferação de células
normais, o ensaio do alamar blue foi realizado utilizando células PBMC (Peripheral
blood mononuclear cells - células mononucleadas de sangue periférico humano, que
inclui linfócitos e monócitos) após 24, 48 e 72 horas de exposição com o composto
teste. O alamar blue, recentemente identificado como resazurina (O'BRIEN et al.,
2000), é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades redox. Como com
os sais de tetrazólio, o alamar blue reduz-se em células em proliferação. A forma
oxidada é azul (não fluorecente/célula não viável) e a forma reduzida é rósea
(fluorescente/célula viável). A redução do alamar blue reflete a proliferação celular.
Este foi inicialmente utilizado para indicar crescimento e/ou viabilidade celular no
monitoramento de proliferação de linfócitos (AHMED et al., 1994) e atualmente
apresenta várias aplicações. Este teste é amplamente empregado em estudos de
prospecção de fármacos.
4.5.2.2.2 Procedimento experimental
Inicialmente, as células PBMC foram plaqueadas em placas de 96 cavidades (3
x 105 células/poço em 100 µL de meio). Após 24 horas de incubação, a substância CG
(0,09 a 5 µg/mL ou 0,35 a 19, 76 µM) dissolvidos em DMSO foram adicionados em
cada poço, utilizando o HTS, e incubadas por 24, 48 e 72 horas. A doxorrubicina (0,09
a 5 µg/mL) foi utilizada como controle positivo. O controle negativo recebeu a mesma
quantidade de DMSO. Vinte e quatro horas antes do final de cada período de
incubação, 10 µL da solução estoque (0,312 mg/mL) de alamar blue
(resazurina) foram adicionados a cada poço. A leitura foi realizada por fluorescência
72
em comprimento de onda de 570 nm (reduzido) e 595 nm (oxidado), utilizando uma
leitora de placa (AHMED et al., 1994).
4.5.2.2.3 Análise dos dados
A substância foi testada em diluições seriadas, em duplicata ou triplicata. Os
experimentos foram analisados segundos suas médias e respectivos EPMs e
determinado suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito
máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de
regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).
4.5.2.3 Determinação da Atividade Hemolítica
4.5.2.3.1 Princípio do Teste
Esta metodologia, segundo Costa-Lotufo et at. (2002), permite avaliar o
potencial das substâncias em causar lesões na membrana plasmática da célula, seja
pela formação de poros ou pela ruptura total.
4.5.2.3.2 Procedimento experimental
O sangue foi coletado de três camundongos Swiss (Mus musculus) por via
orbital, sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85 % + CaCl2 10 mM).
Os eritrócitos foram lavados 3 vezes em solução salina por centrifugação (1500 rpm/3
min) para redução da contaminação plasmática e ressuspendidos em salina para
obtenção de uma suspensão de eritrócitos a 2 %. Os ensaios foram realizados em
placas de 96 poços. Cada poço da 1ª fileira recebeu 100 L da solução salina. Na 2ª,
os poços receberam 50 L da solução salina e 50 L do veículo de diluição da
substância teste, neste caso, DMSO 10 %. Aos poços da 3ª fileira, foram adicionados
100 L de solução salina e 100 L da substância teste (CG). Da 4ª fileira em diante os
poços receberam 100 L da solução salina, excetuando-se os da última fileira, que
receberam 80 L de solução salina e 20 L de Triton X-100 1 % (controle positivo). As
diluições foram feitas da 3ª à 11ª cavidade, retirando-se 100 L da solução da
cavidade anterior e transferindo para a seguinte de modo que as concentrações foram
sempre diluídas pela metade, variando de 1,56 a 200 g/mL. Em seguida, 100 L da
suspensão de eritrócitos foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 1
73
h, sob agitação constante à temperatura ambiente (26 2 ºC), as amostras foram
centrifugadas (5000 rpm/3 min) e o sobrenadante transferido para uma outra placa
para a leitura da absorbância no espectrofotômetro de placas a 540 nm.
4.5.2.3.3 Análise dos dados
A análise dos dados foi realizada pela leitura da placa no espectrofotômetro de
placas a 540 nm.
4.5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60 (leucemia
promielocítica)
O estudo do mecanismo de ação citotóxico da CG foi realizado utilizando a
linhagem leucêmica HL-60 como modelo. Foram avaliados a viabilidade por exclusão
por azul de tripan, coloração diferencial por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina;
inibição da síntese de DNA (BrdU); análise morfológica das células pela Coloração por
May-Grunwald-Giemsa. A viabilidade celular e integridade de membrana; a
externalização da fosfatidilserina e o conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete
as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo. O efeito da CG sobre a ativação da
caspase – 3, 7, 8 e 9 também foi avaliado. Analisou-se a expressão do Citocromo c
pelo método do Western blot.
4.5.3.1 Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan (Curva)
4.5.3.1.1 Princípio do Teste
O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar separadamente as
células viáveis das células mortas pela substância testada. O corante penetra em
todas as células, porém somente as células viáveis conseguem bombear o tripan para
fora, sendo possível observar uma coloração azulada nas células mortas.
4.5.3.1.2 Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 céls/mL, foram
incubadas por 3, 6, 12 e 24h com a amostra CG, nas concentrações de 0,04; 0,2; 0,4;
2 e 4 µM estimadas a partir do valor da CI50 encontrada no método do MTT para esta
74
mesma linhagem celular. Foram retirados 90 μL da suspensão de células e adicionado
a 10 μL do azul de tripan. As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas e
contadas em câmara de Newbauer. No controle foi utilizado o DMSO, que é utilizado
como veículo da substância teste.
4.5.3.1.3 Análise dos dados
Os dados foram expressos como da média ± erro padrão da média (E.P.M.) de
experimentos independentes (n = 3). Para verificação da ocorrência de diferenças
significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls, usando o programa GraphPad
(Intuitive Software for Science, San Diego, CA) com nível de significância de 5 % (p <
0,05).
4.5.3.2 Teste da Acridina
Coloração diferencial por BE/LA
4.5.3.2.1 Princípio do Teste
O método de coloração por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)
permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou
necrose através da revelação por fluorescência com base em alterações morfológicas
nucleares e citoplasmáticas (McGAHON et al., 1995).
A laranja de acridina intercala-se ao DNA, conferindo aparência verde ao
núcleo celular, sendo capaz de atravessar membranas intactas. O brometo de etídio é
incorporado majoritariamente por células não viáveis (com instabilidade de
membrana), intercalando-se ao DNA. As células viáveis com membrana intacta
apresentam núcleo uniformemente corado de verde pela LA. O BE marca muito
fracamente ou muitas vezes não marca, pois não atravessa membranas não lisadas.
As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam manchas verdes
brilhantes no núcleo (condensação da cromatina) e não são marcadas por BE.
Morfologicamente, observam-se alterações da membrana em decorrência da formação
de corpúsculos apoptóticos. As células que estão em apoptose tardia têm aparência
alaranjada devido a algum dano de membrana que permite a entrada de pequena
75
quantidade de BE. Já as células necróticas, por apresentarem intenso dano à
membrana plasmática, coram-se de vermelho intenso.
4.5.3.2.2 Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 0,3 x 106 céls/mL,
foram incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4 µM. A suspensão
de células foi transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5 min em baixa
rotação (10 x g/5 min. correspondente a 1000 rpm/5 min.). O sobrenadante foi
descartado e as células foram ressuspendidas em 20 μL de solução de PBS. Em
seguida, 1 μL da solução de BE/LA foi adicionado a cada tubo e uma alíquota dessas
células transferido para uma lâmina e montado com lamínula e em seguida levadas ao
microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares. A Doxorrubicina
(0,5 μM) foi usada como controle positivo (GENG et al., 2003).
4.5.3.2.3 Análise dos dados
Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis,
necróticas e apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra e montadas
em lâminas que foram fotografadas para o registro visual de possíveis alterações. Os
dados foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n =
3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de
Student Newman Keuls (p < 0,05), usando o programa GraphPad (Intuitive Software
for Science, San Diego, CA).
4.5.3.3 Teste do BrdU
Inibição da síntese de DNA – Ensaio do BrdU
4.5.3.3.1 Princípio do Teste
A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a timina. Assim,
quando as células estão sintetizando seu DNA, o BrdU é incorporado no lugar da
timina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por técnicas
imunohistoquímicas (PERA et al., 1977).
76
4.5.3.3.2 Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 céls/mL, foram
incubadas por 24 h com as concentrações de CG (1, 2 e 4 µM) e o controle positivo foi
a doxorrubicina (0,5 µM). Três horas após a adição do BrdU na cultura de células,
lâminas para cada amostra foram preparadas e postas para secar por 2 h. Após o
período de secagem foram fixadas em metanol: ácido acético (7:1,5) por 5 min. As
células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução desnaturante
por 90 min a 70 oC e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, as células foram
circuladas com caneta hidrofóbica e incubada com anticorpo primário e deixada na
geladeira durante a noite em câmara úmida. As células foram incubadas com
anticorpo secundário biotinado por 20 min e, em seguida, com a solução de
estreptavidina-fluoresceína por mais 20 min. Foi adicionado o cromógeno DAB por 1-5
min e, em seguida, removido com água destilada. Em seguida, são adicionados os
anticorpos e um cromógeno específico, a diaminobenzidina (DAB). Para corar as
células não marcadas pelo cromógeno, utiliza-se hematoxilina (0,1 %). Consideram-se
positivas para proliferação, as células de núcleo corado pelo DAB (cor marrom) e,
negativas, as células de núcleo corado com hematoxilina (cor azul).
4.5.3.3.3 Análise dos dados
Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo
marrom (incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados
foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 2). A
proporção de células marcadas em marrom e não-marcadas entre os diferentes
grupos foi comparada pelo teste 2 com nível de significância de 5 % (p < 0,05)
usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).
4.5.3.4 Teste da Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-Giemsa
4.5.3.4.1 Princípio do teste
A coloração utilizada nesse experimento se baseia em interações eletrostáticas
entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul de metileno (corante
básico), eosina (corante ácido), entre outros componentes básicos que permite
distinguir o citoplasma e o núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua
77
integridade nuclear, bem como alterações no citoplasma. Essa técnica é bastante
indicada para estudo do padrão de morte celular (apoptose/necrose) (McGAHON et
al., 1995).
4.5.3.4.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 0,3 x 106
células/mL foram incubadas por 24 horas com a CG (1, 2 e 4 µM), o controle positivo
foi a doxorrubicina (0,5 µM) e examinadas ao microscópio de inversão. Para observar
a morfologia, 50μL da suspensão de células foram adicionadas à centrífuga de lâmina
(Cytospin®). Após a adesão das células na lâmina, a fixação foi feita com metanol por
1 minuto e a coloração por May-Grunwald, por 10 segundos, seguida pelo Giemsa por
mais 10 segundos.
4.5.3.4.3 Análise dos dados
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio para
avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle (não-
tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia em microscopia
óptica.
4.5.3.5 Determinação da Integridade de membrana- viabilidade celular
4.5.3.5.1 Princípio do teste
A análise da integridade da membrana plasmática é uma importante ferramenta
para estudar o tipo de morte celular, visto que apenas na necrose ela apresenta-se
precocemente alterada. O teste se baseia na capacidade do iodeto de propídeo (PI),
hidrofílico, penetrar em célula cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao DNA
emitir alta fluorescência quando é excitado pelo laser de argônio (488 nm). A célula
com membrana integra emite baixa fluorescência. Deste modo, este método permite
avaliar a viabilidade celular através da verificação da integridade da membrana
plasmática (MACKLIS & MADISON, 1990).
4.5.3.5.2 Procedimento experimental
78
A determinação da integridade da membrana celular foi avaliada por citometria
de fluxo utilizando o PI como agente fluorogênico. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada
como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado com
o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 0,3 x 106 células/mL com
diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 µM). Uma alíquota de 50 μL foi recolhida 24
h após a incubação com a substância. As células foram diluídas com a solução de PI
(2 μg/mL em PBS), na ausência de luz e a 37 ºC, e, após 5 minutos, analisadas por
citometria de fluxo (MILITÃO et al., 2006). Os ensaios foram realizados em três
experimentos independentes realizados em triplicatas. Cinco mil eventos foram
analisados em cada amostra.
4.5.3.5.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
4.5.3.6 Análise do ciclo celular
4.5.3.6.1 Princípio do Teste
O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G1, S, G2 e M. Durante o
período de crescimento celular (fase G1) uma célula diplóide apresenta um conteúdo
2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA nuclear, i.e.,
possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma
nuclear (2-4n) e na fase seguinte (fase G2) ocorre o segundo período de crescimento
celular, durante o qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida
ocorre a mitose (fase M, 4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas
células filhas, cada uma com um conteúdo 2n em DNA. As células que não se
encontram em divisão celular (G0) apresentam um conteúdo 2n em DNA. Assim, as
diferentes fases do ciclo celular podem ser determinadas a partir do conteúdo de DNA
que elas apresentam. Deste modo, o resultado da distribuição do conteúdo em DNA
nuclear de uma população de células pode dar-se em G0/G1, S e G2/M (SHAPIRO,
1985; CIBAS, 1995).
79
Para determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula foi utilizado o Iodeto
de Propídeo (PI) como agente fluorogênico. Esse teste baseia-se na capacidade do PI
se ligar ao DNA. Inicialmente a membrana plasmática das células é lisada por um
detergente para que o PI possa se ligar ao núcleo. Assim, as fases do ciclo celular
foram determinadas através do conteúdo do DNA que elas apresentavam (SHAPIRO,
1985; CIBAS, 1995).
4.5.3.6.2 Procedimento experimental
Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração
de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4
μM. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo. Após o período de
incubação uma alíquota de 50 µL da suspensão de células foi transferida para um tubo
eppendorff e incubada por mais 30 minutos com 100µL de uma solução de lise
contendo PI (50µg/mL), Triton X-100 (0,1%) e citrato de sódio (0,1%). Em seguida as
amostras foram analisadas através do programa Guava Express Plus (Guava
Tecnologies), onde foram obtidas histogramas representando a quantidade de células
em cada fase do ciclo celular (G1, S e G2/M) e a quantidade de células com DNA
fragmentado.
4.5.3.6.3 Análise dos dados
Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos
como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes (n
= 3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por
Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).
4.5.3.7 Ensaio da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V
4.5.3.7.1 Princípio do teste
É baseado na observação de que durante a indução de apoptose, a
fosfatidilserina, um fosfolipídeo de membrana interna, é externalizado, servindo como
marcação de que a célula deverá ser fagocitada. A anexina V pode ligar-se a
80
fosfatidilserina com grande afinidade e seletividade. As células não marcadas são
ditas viáveis, já as células marcadas apenas com anexina V estão em apoptose inicial.
4.5.3.7.2 Procedimento experimental
Células em necrose, de alguma maneira até agora desconhecida, podem
expressar um pouco de fosfatidilserinna, para compensar é adicionado um corante que
se ligue ao DNA, mas não permeável a membrana íntegra como o brometo de etídio.
Haverá perda da integridade de membrana nas células em apoptose tardia, onde
serão anexina V positivas e também brometo de etídio, enquanto aquelas células
marcadas apenas com o brometo serão as células em necrose. As células não
marcadas, são ditas viáveis, já as células marcadas apenas com anexina V estão em
apoptose inicial.
Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração
de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4
μM. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo.
4.5.3.7.3 Análise dos dados
Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram
expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos
independentes (n = 3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre
os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)
seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).
4.5.3.8 Determinação da ativação das caspases- 3 e 7
4.5.3.8.1 Princípio do teste
As caspases pertencem à família de proteases cisteínas, podendo ser divididas
em caspases inflamatórias e caspases apoptóticas, os quais podem ser incluídas nos
grupos de caspases iniciadoras (como no caso da apoptose as caspases- 8 e 9) e
efetoras (como no caso da apoptose as caspases- 3 e 7). A ativação das caspases- 3
e 7 possui papel central no mecanismo de apoptose. As caspases-3 e 7 são
responsáveis pela clivagem de vários componentes celulares relacionados ao reparo e
81
controle do DNA. Assim, a dosagem das caspases- 3 e 7 permite o estudo de
mecanismos apoptóticos (MEHMET, 2002).
4.5.3.8.2 Procedimento Experimental
A atividade das caspases- 3 e 7 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico
de protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na
detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos
substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por
caspases especificas: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para as caspases-3 e 7.
Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24 horas com
diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e atmosfera
contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo. Às
células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes foram
acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a 37ºC,
5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da incubação,
80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram
centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução
de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de
fluxo.
A densidade óptica da amostra foi medida em comprimento de onda de 405
nm (MILITÃO et al., 2006). A atividade das caspases nas amostras foi determinada em
relação ao controle não tratado e expresso como atividade das caspases-3 e 7
especifica (UI/mg de proteína).
4.5.3.8.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.
4.5.3.9 Determinação da ativação da caspase-8
4.5.3.9.1 Princípio do teste
82
A atividade da caspase- 8 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de
protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na
detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos
substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por
caspases especificas: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-8.
4.5.3.9.2 Procedimento Experimental
Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24
horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e
atmosfera contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle
positivo. Às células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes
foram acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a
37ºC, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da
incubação, 80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram
centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução
de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de
fluxo.
4.5.3.9.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos.
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.
4.5.3.10 Determinação da ativação da caspase-9
4.5.3.10.1 Princípio do teste
A atividade da caspase- 9 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de
protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na
detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos
substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por
caspases especificas: Ac-Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-9.
83
4.5.3.10.2 Procedimento Experimental
Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24
horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e
atmosfera contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle
positivo. Às células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes
foram acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a
37ºC, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da
incubação, 80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram
centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução
de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de
fluxo.
4.5.3.10.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos.
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.
4.5.3.11 Ensaio do Western blot (Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -9)
4.5.3.11.1 Princípio do teste
Western blot ou, alternativamente, imunoblot, é uma técnica amplamente
empregada para detectar uma determinada proteína numa dada amostra, por
exemplo, de homogenato celular total. Neste estudo, esta metodologia foi utilizada
para verificar a expressão aumentada ou diminuída de proteína-chave associada as
vias de sinalização celular relacionadas ao dano do DNA e apoptose.
O protocolo de Western blot é realizado em diversas etapas onde constam: a
extração e posterior quantificação de proteínas totais das células submetidas a cada
tratamento, a separação de proteínas desnaturadas de acordo com o peso molecular
em eletroforese vertical de poliacrilamida, a eletrotransferência das proteínas na
disposição em que separam no gel para uma membrana com capacidade de ligar
proteínas e a detecção de proteína específica através de sondas do anticorpo
respectivo, que será posteriormente revelado, nesse caso de modo colorimétrico,
84
baseado na reação da enzima fosfatase alcalina sobre o substrato NBT/BCIP
produzindo um precipitado de cor púrpura que marca a membrana (JIMENEZ, 2009).
O experimento de Western blot deste estudo empregou o seguinte anticorpo
primário: Citocromo c (Santa Cruz Biotechnology®), Procaspase- 9 (Cell Signalling®) e
Caspase- 9 clivada (Cell Signalling®). Os anticorpos secundários anti-mouse IGg (Cell
Signalling) e anti-rabbit IGg (Cell Signalling) ligados a enzima fosfatase alcalina foram
utilizados na etapa de detecção.
4.5.3.11.2 Procedimento Experimental
4.5.3.11.2.1 Extração de Proteínas
Células de HL-60 tratadas com CG 1 e 2 µM foram encubadas por 12 e 24
horas antes da extração de proteínas totais. Inicialmente, as células foram
centrifugadas e o pellet foi lavado 2 vezes com PBS. O sobrenadante foi descartado e,
às células, foi adicionado o tampão para lise celular (Cell Signaling Technology®)
acrescido de um coquetel de inibidores de proteases (1:100 v/v), ortovanadato de
sódio (1:100 v/v) e PMSF (1:100 v/v), e deixadas em gelo por 1h30, sonicando as
amostras a cada 30 minutos. Foi utilizada a proporção aproximada de 1mL de tampão
RIPA completo para cada 107 células. Ao final da incubação, as amostras foram
centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos a 40C. O sobrenadante foi coletado,
aliquotado e armazenado a -200C.
4.5.3.11.2.2 Quantificação de Proteínas
A quantificação de proteínas da CG foi realizada por método
colorimétrico similar à dosagem proposto por Lowry et al., 1951, valendo-se do kit DC
Protein Assay (BioRad Laboratories) e executado como descrito pelo fabricante em
microplacas de 96 cavidades. Uma curva padrão com BSA (1-10µg) diluído em
tampão RIPA completo foi preparada para calibração do método. O tampão RIPA
completo foi utilizado para marcar o branco experimental. Em seguida, 5 µL da
amostra testada (CG) foi plaqueada em duplicatas e adicionado 25 µL do reagente A
(preparado a partir da adição de 20µL do reagente S a cada 1 mL do reagente A)
seguido por 200 µL do reagente B. As amostras foram incubadas por 10 minutos, sob
agitação leve e lidas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 620 nm.
85
A concentração de proteínas em cada amostra foi determinada frente à curva
gerada pelo BSA, tendo sido plotado o gráfico absorbância vs. quantidade de
proteínas. A curva foi gerada a partir de regressão linear no programa GraphPad
Prism 5.0 e os valores de absorbância obtidos para a amostra foram substituídas na
equação da curva para determinar as respectivas concentrações de proteína.
4.5.3.11.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para a separação das proteínas das células tratadas com CG foi baseada no
peso molecular, as amostras foram submetidas à eletroforese vertical em gel de
poliacrilamida descontínuo. Após a montagem do sistema vertical (Amershan
Biosciences, modelo miniVE completo) o gel de resolução foi confeccionado para uma
concentração final de 12,5% ou 7,5% de poliacrilamida em tampão Tris-HCl 1,5M, pH
8,8. O gel de concentração foi montado sobre este, com 5% de poliacrilamida em
tampão Tris-HCl 0,5M, pH 6,8.
Da amostra (CG), 15 µg da proteína total carregada com o tampão Blue Juice
5X (5:1 v/v) foi aplicado nos poços do gel de concentração. O marcador de peso
molecular Full-Range Rainbow Marker (12 -125 kDa; GE Healthcare) foi usado sempre
no primeiro poço à esquerda para monitorar a separação das proteínas. A corrida
eletroforética foi realizada a uma voltagem constante de 100 V e 30 mA à temperatura
ambiente, utilizando o tampão de corrida para eletroforese. O tempo de corrida variou
entre 2h e 2h30.
4.5.3.11.2.4 Eletrotransferência
As proteínas separadas foram transferidas para a membrana de PVDF
Hybond-P. Para tanto, o gel foi colocado em contato coma membrana previamente
lavada em MeOH entre esponjas e papéis de filtro banhados na solução de
transferência. A eletrotransferência foi realizada pelo modo de inversão (Amershan
Bioscience, bolt module para miniVE) à voltagem constantes de 100 V e 300 mA por
1h20 à 40C.
4.5.3.11.2.5 Imunodetecção
Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 1h em solução de
BSA 3% em TBS. Em seguida, foram lavadas (3 vezes, 10 minutos cada lavagem)
86
com TBS-Tween 0,05% (TBS-T) e incubadas sob agitação overnight à 40C com o
anticorpo primário diluído em solução de BSA 5% em TBS-T. Após lavagem com TBS-
T (3 vezes, 10 minutos cada lavagem), as membranas foram incubadas com o
anticorpo secundário acoplado à enzima fosfatase alcalina diluído em solução de BSA
5% em TBS-T por 2h, sob agitação. Após lavagem com TBS-T (3 vezes, 10 minutos
cada lavagem) seguida de lavagem no tampão de revelação, as membranas foram
reveladas com NBT (0,33 mg/mL) e BCIP (0,168 mg/mL), diluídos em 15 mL de
solução de revelação até a indicação colorimétrica desejada.
4.5.3.11.2.6 Análise dos dados
A documentação das membranas reveladas foi realizada em captador de
imagens (Modelo ImageQuant® 300) utilizando, para aquisição e edição, o programa
ImageQuant® 300.
4.5.4 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica
No estudo da atividade genotóxica in vitro, o ensaio do cometa, em células
mononucleares periféricas humanas, foi realizado para avaliar danos à fita simples e à
fita dupla do DNA induzidos pela CG. Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico
in vitro da CG, o ensaio do micronúcleo foi realizado em células mononucleares
periféricas humanas (PBMC).
4.5.4.1 Ensaio de genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa
4.5.4.1.1 Princípio do teste
O ensaio cometa ou SCGE (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) foi
desenvolvido por Singh e colaboradores (1988) para detectar quebra de fitas simples e
duplas na molécula de DNA induzidas por substâncias com potencial genotóxico, tais
como agentes alquilantes, intercalantes e oxidantes. Sendo muito utilizado em estudo
de genética toxicológica, a fim de um biomonitoramento ambiental ou no
monitoramento populacional em humanos. Entretanto, este teste é utilizado como um
indicativo e não como um teste mutagênico. Este pode ser utilizado tanto em células
de animais quanto vegetais in vitro e in vivo (ANDERSON et al., 1994; FAIRBAIRN et
al., 1995; SILVA et al., 2003).
87
4.5.4.1.2 Procedimento experimental
A avaliação do potencial genotóxico da CG, avaliado através do ensaio do
cometa, foi realizado em linfócitos humanos (células mononucleares periféricas
humanas). O ensaio do cometa foi realizado em condições alcalinas (HARTMANN &
SPEIT, 1997; SINGH & SINGH, 2002; WOJEWODZKA et al. 2002). A doxorrubicina
(0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle
negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
Para o estudo da atividade genotóxica, linfócitos humanos (células
mononucleares periféricas humanas) (3 X 106 células em 5 mL) foram incubadas por
24 horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 µM). Após o período de
incubação, as células foram lavadas com PBS gelado, removidas com 100 μL de
tripsina 0,15% e ressuspensas em meio completo. Em seguida, 20 μL da suspensão
de células (~106 células/mL) foi dissolvido em 0,5% em agarose com baixo ponto de
fusão e imediatamente espalhada sobre uma lâmina pré-tratada com 1% de agarose
com baixo ponto de fusão. As células foram, então, colocadas em solução de lise por
pelo menos 1 hora a 4 ºC. Em seguida foram dispostas horizontalmente na cuba de
eletroforese e preenchida com tampão de corrida, em pH ~ 13, para o ensaio do
cometa em condições alcalinas (HARTMANN & SPEIT, 1997; SINGH & SINGH, 2002),
por 60 min para permitir o equilíbrio com o tampão de corrida. A eletroforese foi
conduzida em baixa luminosidade por 20 min, usando 14 V e uma corrente de 12 mA
(0,5 V/cm). Após a corrida eletroforética, as lâminas foram retiradas e mergulhadas na
solução de neutralização durante 5 minutos. A análise foi realizada por coloração com
nitrato de prata (NADIN et al. 2001) e as células foram contadas em microscópio
óptico com aumento de 400x. Os ensaios foram realizados em três experimentos
independentes realizados em triplicatas.
4.5.4.1.3 Análise dos dados
A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente
determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (HARTMANN & SPEIT,
1997; TICE et al., 2000; BURLINSON et al., 2007). Foram, contados 50
cometas/lâmina e classificados, de acordo com a percentagem de DNA na cauda do
cometa, indicando o grau de quebra do DNA, de acordo com a figura 10. Onde 0 =
sem danos (<5%), 1 = baixo nível de danos (5-20%), 2 = médio nível de danos (20-
40%), 3 = alto nível de danos (40-95%) e 4 = dano total (95%). Foram calculados o
índice (ID) e a freqüência (FD) de danos. O ID foi obtido pela seguinte fórmula: ID =
88
400 - ∑ Escores. A FD representa a porcentagem de células que sofrem danos no
DNA. Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey com a utilização do programa GraphPad Prisma
versão 5.0.
Figura 13: Representação dos tipos de cometas corados com prata e visualizados em microscópio óptico, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de acordo com o dano. a) tipos 0 (verde) e 1 (amarelo); b) tipos 2 (vermelho) e 3 (azul); c) tipo 4. Fonte: Collins (2004).
4.5.4.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em linfócitos humanos –
Teste do micronúcleo in vitro
4.5.4.2.1 Princípio do teste
Micronúcleos (MN) são pequenos corpúsculos compostos de material
cromossômico. Após a separação das cromátides no processo mitótico, dois núcleos
são reconstituídos, um em cada pólo. A membrana nuclear é refeita ao redor destes
dois conjuntos cromossômicos. Mas se um cromossomo inteiro ou um fragmento
cromossômico acêntrico não se integra ao novo núcleo (por não ser unido ao fuso),
este também pode ser considerado um micronúcleo. Os micronúcleos, então, são,
estruturalmente, pequenos núcleos representados por material genético que foi
perdido pelo núcleo principal como conseqüência de um dano genético. Este dano
pode ser causado por agentes químicos, físicos ou biológicos, capazes de interferir no
processo de ligação do cromossomo às fibras do fuso, ou que possam introduzir a
perda de material genético (cromossomos inteiros ou fragmentos). O teste de
89
micronúcleo, portanto, detecta genotoxicidade cromossômica em eucariotos do tipo
clastogênese e danos ao fuso mitótico (SILVA et al., 2003).
O teste de MN em organismo sob exposição aguda, menos de quatro
semanas, é realizado em eritrócitos jovens, denominados policromatófitos (EPC) que
por conterem RNA ribossomal se cora de forma diferenciada. A análise por ser muito
simples apresenta vantagem em relação à análise dos cromossomos. Os
micronúcleos podem ser identificados em qualquer tipo de célula. Pode-se avaliar
micronúcleos para diagnóstico de doenças hematológicas em células epiteliais da
mucosa bucal, do trato urinário, e também monitorar ambientes através de teste em
roedores, plantas e peixes (SILVA et al., 2003).
4.5.4.2.2 Procedimento experimental
O efeito genotóxico ex vivo da CG foi avaliado em linfócitos humanos.
Amostras de sangue periférico (5 mL) foram retiradas de voluntários saudáveis. A
doxorrubicina foi utilizado com controle positivo na dose de 0,5 µM. O controle
negativo foi tratado com o veiculo (DMSO 10%) utilizado para diluir a substância. O
experimento foi realizado de acordo com os princípios éticos preconizados pela
Comissão de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Federal do
Ceará, n0 106/10.
Os linfócitos humanos (células mononucleares periféricas humanas) (3 X 106
células em 5 mL) foram incubados por 24 horas com diferentes concentrações da CG
(1, 2 e 4 µM), após esse período foi acrescido a Citocalasina B (Sigma®), para realizar
o bloqueio da citocinese, e encubadas por mais 24 horas em estufa a 37ºC. No final
das 72 horas, os tubos foram centrifugados e descartado o sobrenadante, adicionou-
se vagarosamente 5mL a solução de Carnoy gelada por 3 vezes consecutivas. Em
seguida os tubos foram centrifugados, retirado o sobrenadante, deixando 1mL, agitou-
se e realizadas s preparações das lâminas, que foram coradas, adequadamente com
giemsa, e analisadas para a presença de micronúcleos. (SCHMID, 1975; OECD,
1997).
4.5.4.2.3 Análise dos dados
Todas as lâminas, incluindo aqueles do controle positivo e negativo, foram
codificadas antes da análise. A proporção de células micronucleadas no total de
90
células binucleadas analisadas e número de micronúcleos nas células analisadas
(freqüência de micronúcleos/ 2000 células analisadas), foram observadas por lâmina.
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo
teste Student Newman-Keuls.com a utilização do programa GraphPad Prisma versão
5.0. Qualquer substância é considerada genotóxica quando apresenta um aumento,
estatisticamente significante, da ocorrência de micronúcleos em células binucleadas,
de maneira dose resposta em pelo menos um dos tempos analisados, quando
comparado ao grupo controle negativo (LI et al., 2007).
Figura 14: Representação da formação de micronúcleos a partir de um fragmento cromossômico acêntrico e cromossomo inteiro em uma célula binucleada pelo uso de Citocalasina B. Fonte: Fenech (2000).
4.5.5 Avaliação da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados com
tumor Sarcoma 180
4.5.5.1 Princípio do teste
O sarcoma 180, ou tumor de Crocker, é um tumor indiferenciado que foi
descrito pela primeira vez em camundongos em 1914. Este tumor foi encontrado na
região axilar direita e diagnosticado na época como carcinoma, mas o tecido de
origem não foi especificado, de forma que não se sabe se era uma neoplasia cutânea
ou mamária. Estudos posteriores demonstraram que suas células não produzem
laminina, o que não permite sua caracterização como de origem epitelial. O tumor
invade músculo esquelético, tecido adiposo, nervos e vasos sangüíneos (STEWART et
al., 1959). O Sarcoma 180 pode ser transplantado por inoculação subcutânea,
91
intramuscular ou intraperitoneal e cresce rapidamente em 90 a 100% dos animais
inoculados, havendo uma taxa de regressão natural de 8 a 10% (ZUCKERBERG,
1973). Apesar de seu comportamento agressivo local, esse tumor não produz
metástases (KURASHIGE & MITSUHASHI, 1982).
O Sarcoma 180 tem sido utilizado no estudo da ação de componentes
químicos, físicos e biológicos sobre o crescimento, patogênese, imunologia,
citogenética e terapêutica de células tumorais. A vantagem da utilização de neoplasias
transplantáveis, em comparação às demais, recai sobre o conhecimento prévio da
quantidade e das características iniciais das células tumorais a serem inoculadas e
sobre o desenvolvimento rápido da neoplasia, que restringe o tempo de estudo
(STEWART et al., 1959).
4.5.5.2 Procedimento experimental
Para o teste de atividade antitumoral, foi utilizado o tumor sólido do tipo
Sarcoma 180, com 8 dias de implantação na região axilar direita. O animal doador, ou
da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizada assepsia
com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal,
tendo sido preparado uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL
de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem de
células (BEZERRA et al., 2006).
Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 106 céls/0,5 mL na região axilar
esquerda dos camundongos (Mus musculus Swiss). Nesse experimento, foram
utilizados 8 animais por grupos, sendo todas fêmeas, apresentando massa corpórea
variando entre 25-30 g. Em seguida, 24 h após a inoculação do tumor foi iniciado o
tratamento durante 7 dias consecutivos de acordo com os grupos abaixo:
Grupo I –– Tratados com o veículo (DMSO 10%) utilizado para diluir as
substâncias (grupo controle negativo) com H2O destilada;
Grupo II – Tratados com 5-fluorouracil 25 mg/kg/dia (grupo controle positivo);
Grupo III – Tratados com CG 25 mg/kg/dia;
Grupo IV – Tratados com CG 50 mg/kg/dia.
Os grupos foram tratados por via oral, sendo o grupo controle positivo (5-
fluorouracil) por via intraperitoneal. Vinte quatro horas após o termino do tratamento,
os animais foram anestesiados e seu sangue periférico foi coletado através do plexo
orbital, em tubos heparinizados, para análises bioquímicas e hematológicas. Em
92
seguida, os animais foram sacrificados, sendo retirados os tumores, rins, fígados e
baços para pesagem, análise histopatológica. Todos os animais foram pesados no
inicio e no final do tratamento. O experimento foi realizado de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal preconizados pela Comissão de Ética em Pesquisa
Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará, n0 08/10.
4.5.5.3 Análise dos dados
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:
IT (%) = [(A-B)/A] x 100
Onde: A = média dos pesos dos tumores no grupo controle e B = média dos pesos
dos tumores nos animais tratados.
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
4.5.5.4 Parâmetros toxicológicos avaliados
4.5.5.4.1 Avaliação dos parâmetros bioquímicos
4.5.5.4.2 Princípio do teste
Dentre os parâmetros bioquímicos, foram avaliados testes de dano hepático e
testes de função renal.
A alanina transaminase (ALT), também chamada transaminase glutâmica
pirúvica sérica (SGPT ou TGP) ou alanina aminotransferase (ALAT), é uma enzima
presente nos hepatócitos (células do fígado). Quando uma célula é danificada, ela
libera esta enzima no sangue, onde é medida. A ALT aumenta drasticamente em
lesões hepáticas agudas. A aspartato transaminase (AST), também chamada de
transaminase glutâmica oxalacética sérica (SGOT ou TGO) ou aspartato
aminotransferase (ASAT), é similar à ALT de modo que é outra enzima associada às
células parenquimais do fígado. Está aumentada na lesão hepática aguda, mas
93
também está presente nas hemácias e músculos esqueléticos e cardíacos, não sendo
então uma enzima específica do fígado (GAW et al., 2004).
Como parâmetro da função renal, foi avaliado a concentração de úreia
plasmatica. A uréia é uma substância que provém dos alimentos que contém proteínas
como, por exemplo, os alimentos de origem animal (carne, ovos), e que devem ser
quase totalmente eliminada do organismo através da urina. Quando os rins estão com
a sua função de filtração prejudicada, a uréia fica acumulada no sangue, provocando
alterações em vários órgãos, estabelecendo a uremia. Entretanto, a concentração
sérica de uréia não é tão precisa como medida da função glomerular. A ingestão de
proteínas na dieta afeta a concentração de uréia plasmática. O sangramento
gastrintestinal fará com que a uréia do plasma esteja elevada. E ainda, a uréia é
reabsorvida pelos túbulos (GAW et al., 2004).
A creatinina é utilizada como índice de função renal devido à constância da
formação e excreção da creatinina. A avaliação inicial da função renal na prática
clínica diária costuma ser realizada através da dosagem de creatinina plasmática
(CrP). A concentração sérica e excreção de creatinina urinária estão aumentadas
significantemente pela necrose muscular esquelética, miastenia grave e fome. Como
também, em hipertiroidismo e acidose diabética. Por ocasião de ter independência a
fatores como dieta (ingestão de proteína), grau de hidratação e do metabolismo de
proteínas, a creatinina plasmática é um teste de triagem mais confiável ou índice de
função renal do que a uréia. Ela tende a aumentar mais lentamente que a uréia na
doença renal (LOPES, 1998; BURMEISTER et al.; 2007).
4.5.5.4.3 Procedimento experimental
Para avaliar os parâmetros bioquímicos, sangue periférico foi coletado através
do plexo orbital, em tubos heparinizados, onde o plasma foi utilizado para avaliar a
função renal e danos hepáticos. Para investigação de dano hepático foram
determinados os níveis séricos das transaminases: aspartato aminotransferase (AST)
e alanina aminotransferase (ALT). Para tanto, utilizaram-se kits da LABTEST®
sistemas para diagnostico, seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante. A função
renal foi avaliada pelos parâmetros séricos clássicos da integridade renal: a uréia e a
creatinina. Para tanto, também se utilizou o kit da LABTEST® sistemas para
diagnostico, seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante. Também foi coletado o
sangue do plexo orbital de 5 animais saudáveis, além dos grupos tratados para estas
análises.
94
4.5.5.4.4 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 8 animais por grupo.
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
4.5.5.4.2 Avaliação dos parâmetros hematológicos
4.5.5.4.2.1 Princípio do teste
A análise dos parâmetros hematológicos consta de uma série de provas que
possibilitam detectar anormalidades que se apresentam em certos fenômenos
fisiopatológicos importantes nos animais e nos homens e que se refletem no sangue
(LORENZI, 2006).
4.5.5.4.2.2 Procedimento experimental
Foram realizadas as seguintes provas hematológicas: dosagem de
hemoglobina, contagem de plaquetas e leucócitos realizada em hematocitômetro. A
contagem diferencial leucocitária foi realizada por meio de esfregaços sanguíneos e
foram determinados valores relativos e absolutos de linfócitos, neutrófilos, eosinófilos,
monócitos e basófilos. Também foi coletado o sangue do plexo orbital de 5 animais
saudáveis, além dos grupos tratados para estas análises.
4.5.5.4.2.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 8 animais por grupo .
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
4.5.5.5 Análise histopatológica
95
4.5.5.5.1 Princípio do teste
A técnica de coloração hematoxilina e eosina (H/E) permite diferenciar o
citoplasma do núcleo, possibilitando, assim, a análise de algumas estruturas celulares.
A análise morfológica e histopatológica de tecidos dos animais tratadas permitem
identificar alterações que possam ocorrer e fornecer subsídios para sugerir os efeitos
tóxicos causados pela droga.
4.5.5.5.2 Procedimento experimental
Após a eutanásia dos animais, foram retirados todos os tumores e órgãos
(estômago, fígado, baço, rins), pesados e armazenados em solução de formol a 10%.
As peças foram retiradas do formol e seccionadas em pequenas partes para posterior
preparação das lâminas. O material foi fixado em formol a 10% por 24 horas,
desparafinizado em xilol por 15 minutos, e desidratado em concentrações crescentes
de álcool até 70% (mergulhando-se rapidamente as lâminas), sendo posteriormente
lavado em água destilada até a total remoção do álcool. Posteriormente as lâminas
foram coradas com hematoxilina e eosina.
4.5.5.5.3 Análise dos dados
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio óptico e
analizadas por patologista experiente, para avaliação das características morfológicas
e realizada a comparação dos controles negativo (não tratadas) e positivo.
Resultados
97
5 RESULTADOS
5.1 Estudo da atividade citotóxica
O estudo da atividade citotóxica da CG foi realizado em células humanas
tumorais e em células humana normais.
5.1.1 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células tumorais humanas
A avaliação do potencial citotóxico da CG foi realizada em 5 linhagens de
células tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de
cólon, SF-295 – glioblastoma, MDA-MB-435 – melanoma e K562 – leucemia mielóide
crônica), através do método do MTT após 72 horas de incubação. A doxorrubicina foi
usada como controle positivo em todos os experimentos.
Os resultados encontrados no ensaio de citotóxico da CG, em células tumorais
humanas estão apresentados na Tabela 3. CG apresentou elevado potencial de
citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de CI50 que
variaram de 0,48 µg/mL (1,89 µM) em Hl-60; 0,30 µg/mL (1,18 µM) em HCT-8; 0,84
µg/mL (3,32 µM) em SF-295; 0,45 µg/mL (1,77 µM) em MDA-MB-435 e 0,43 µg/mL
(1,69 µM) em K562. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também
apresentou citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de
CI50 que variaram de 0,01 µg/mL (0,02 µM) a 0,48 µg/mL (0,88 µM) para as linhagens
de HCT-8 e MDA-MB-435, respectivamente. Para este ensaio, foram consideradas
citotóxicas aquelas substâncias que apresentaram CI50 < 1 µg/mL (3,95 µM).
98
Tabela 3: Atividade citotóxica da CG frente às linhagens tumorais. Células humanas
de leucemias (HL-60, K562), carcinoma de cólon (HCT-8), glioblastoma (SF-295) e
carcinoma de mama (MDA-MB-435). A Doxorrubicina foi usada como controle positivo.
*Valores de IC50 em µg/mL (µM) originados de experimentos independentes (n=3) da CG obtidos pelo ensaio do MTT em painel de linhagens celulares após 72h de incubação. Os dados foram obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
5.1.2 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células normais humanas
(PBMC)
Para a avaliação da seletividade em células normais humanas, a atividade
citotóxica da CG foi avaliada em PBMC (peripheral blood mononuclear cell – linfócitos
e monócitos) pelo método alamar blue com 24, 48 e 72 horas de incubação.
Os resultados encontrados estão descritos na Tabela 4, que apresenta o
potencial citotóxico da CG, em células normais humana. Quando a atividade citotóxica
da CG foi avaliada em células humanas normais (PBMC), o valor de CI50 encontrado
foi de 10,51 µg/mL (41,54 µM) em 24 horas; 2,29 µg/mL (9,05 µM) em 48 horas e 1,79
µg/mL (7,07 µM) em 72 horas. Assim, a CG apresenta um índice de citotoxicidade em
PBMC que aumenta com o tempo de exposição à substância.
Entretanto, comparando a CI50 da CG em HL-60 (Tabela 3), utilizada como
modelo nos demais testes biológicos, com a CI50 em PBMC após 72 h de incubação
(Tabela 4), observou-se que a citotoxicidade foi maior em células HL-60 do que em
PBMC.
Substâncias Linhagem Celular- CI50 [µg/mL] (µM)
HL-60
HCT-8
SF-295
MDA-MB-
435 K562
CG
0,48 (1,89) 0,26-0,82*
0,30 (1,18) 0,20-0,47*
0,84 (3,32) 0,6-1,19*
0,45 (1,77) 0,34-0,60*
0,43 (1,69) 0,23-1,35*
Doxorrubicina 0,02 (0,04) 0,01-0,03*
0,01 (0,02) 0,01-0,02*
0,23 (0,40) 0,19-0,25*
0,48 (0,83) 0,34-0,66*
0,14 (0,24) 0,09-0,23*
99
Tabela 4: Atividade citotóxica da CG frente à linhagem normal obtida de cultura
primária (PBMC) após 24, 48 e 72 horas de incubação.
Substância Linhagem Celular- CI50 [µg/mL] (µM)
PBMC
24 horas 48 horas 72 horas
CG 10,51 (41,54) 2,29 (9,05) 1,79 (7,07) 6,07-18,19* 1,67-3,14* 1,16-2,77*
*A tabela apresenta os valores de CI50 em µg/mL (µM) originados de experimentos independentes (n=3) obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
5.2 Atividade hemolítica
Este ensaio permite avaliar o potencial das substâncias em causar lesões na
membrana plasmática da célula, seja pela formação de poros ou pela ruptura total, por
meio da utilização de eritrócitos de camundongos (Costa-Lotufo et at., 2002).
A substância CG nas concentrações testadas não foi capaz de causar hemólise
(Tabela 5) em eritrócitos de camundongos, desta forma, pode-se inferir que a
atividade citotóxica não é dependente de lise imediata da membrana plasmática,
podendo estar relacionado com um mecanismo de morte celular mais específico.
Tabela 5: Avaliação do potencial hemolítico da CG frente a eritrócitos de
camundongos Swiss (Mus musculus).
Substância-Teste EC50 µg/mL (µM)
CG
>200 µg/mL (790,5 µM)
*EC50: Concentração efetiva em que a substância-teste causa hemólise em 50% dos eritrócitos.
Resultados expressos em g/mL (M).
100
5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxica em células HL-60
A fim de investigar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade da
CG, células de HL-60, linhagem leucêmica, (0,3 x 106 células/mL) foram utilizadas
como modelo, após 24 horas de incubação com o composto teste nas concentrações
de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, na maioria dos experimentos, baseadas nos valores de CI50. A
doxorrubicina (Dox) na concentração de 0,5 µM foi utilizada como controle positivo.
Foram avaliados a viabilidade celular por exclusão do azul de tripan, o padrão
de morte celular por coloração diferencial com Brometo de Etídio e Laranja de
Acridina, a síntese de DNA pelo ensaio do BrdU e a morfologia celular pela Coloração
diferencial com May-Grunwald-Giemsa. Em seguida, a viabilidade celular, a
integridade de membrana e o conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete as fases
do ciclo celular, foram analisados por citometria de fluxo. O efeito da CG sobre a
ativação das caspases- 3, 7, 8 e 9 também foi avaliado por citometria de fluxo. Por fim,
a expressão do Citocromo C foi detectada pelo método do Western blot.
5.3.1 Determinação da viabilidade celular por exclusão do azul de Tripan
Este ensaio é um método direto de avaliação da viabilidade celular após o
tratamento com o composto teste. A análise dos resultados permite verificar que o
composto CG na concentração de 0,04 µM não foi capaz de reduzir a viabilidade de
células HL-60 em nenhum tempo de incubação investigado. Adicionalmente, CG nas
concentrações de 0,2; 0,4 e 2,0 µM reduziram significativamente (p<0,05) o número de
células viáveis apenas após 24 h de incubação. Já na maior concentração testada (4,0
µM), CG promoveu redução significativa (p<0,001) e similar após 6 e 12 h de
incubação (68,59 ± 6,70%), sendo este efeito maior após 24 h de incubação, com uma
redução de (41,65 ± 3,13%) em relação ao controle, o que resulta numa diferença de
58,4 % no número de células viáveis (Figura 15).
101
0 3 6 9 12 15 18 21 240
25
50
75
100
125controle
0,04 M
0,2M
0,4M
2,0 M
4,0 M
** *
**
**
*
Tempo de incubação (h)
Célu
las v
iáveis
(%
)
Figura 15: Curva de crescimento em células leucêmicas humanas (HL-60), tratadas com o composto CG nas concentrações 0,04 µM; 0,2 µM; 0,4 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A viabilidade das células leucêmicas foi determinada por exclusão de azul de tripan em 3, 6, 12 e 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), * p< 0,05; ** p<0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
5.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio
Para investigar o padrão de morte celular (apoptose ou necrose) envolvido na
atividade citotóxica da CG realizou-se a coloração diferencial com laranja de acridina e
brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células
viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado.
Para confirmar que a atividade antiproliferativa do composto testado está
relacionada com a indução de apoptose e necrose, a análise morfológica das células
tratadas foi investigada utilizando a coloração diferencial de laranja de acridina e
brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células
viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado. Os resultados demonstraram que
as células não-tratadas com CG (grupo controle) apresentaram um percentual de
97,67 ± 0,69 % de células viáveis (coloração verde uniforme e morfologia normal)
(Figura 16). O tratamento das células com o composto CG, na menor concentração
testada (1,0 µM), causou poucas alterações significativas no padrão morfológico de
células HL-60 quando comparadas ao controle negativo. No entanto, a partir da
concentração intermediária (2,0 µM) foi observado um aumento de 60,44 ± 0,80% na
percentagem de células em processo de apoptose. Já na maior concentração (4,0
µM), a CG causou uma redução da percentagem de células viáveis. Essa redução foi
102
acompanhada por um aumento de 94 ± 0,19% de células com características de
apoptose e apenas um discreto aumento de 3,11 ± 0,11% de células em necrose
estatisticamente significativo (p<0,001). Já a doxorrubicina causou 91,22 ± 0,48%
(p<0,001) de apoptose, diminuindo visivelmente o percentual de células viáveis
(Figura 16).
C Dox 1,0 2,0 4,00
25
50
75
100Viável
Apoptose
Necrose
CG
(M)
**
**
**
**
**
**
**
** **
Célu
las (
%)
Figura 16: Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose) avaliado em células leucêmicas humanas (HL-60), tratada com o composto CG nas concentrações 1,0 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A análise foi realizada após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (DOX). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), **p< 0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
5.3.3 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU
Para relacionar a atividade antiproliferativa dos compostos testados à inibição
da síntese de DNA foi realizado o ensaio de incorporação do BrdU. Neste ensaio foi
observado que células HL-60 tratadas com o derivado de chalcona (CG), onde nas
concentrações testadas (1,0 e 2,0 µM) mostram que as células viáveis existentes
marcadas no núcleo com coloração marrom destacam a incorporação com o BrdU,
com diferença significativa em relação ao controle negativo (70,13 ± 1,18%), com
66,63 ± 3,35% e 72,63 ± 4,0%; respectivamente (Figura 17 e 18). A doxorrubicina,
utilizada como controle positivo, causou 54,38% (15,75 ± 0,86) de inibição da
proliferação celular em relação ao controle negativo (Figura 17). A maior concentração
103
da CG (4,0 µM) causou destruição celular tão intensa ao ponto de impossibilitar a
contagem de células. Por esse motivo, decidiu-se avaliar a inibição da síntese de DNA
apenas na concentração corresponde à CI50 e metade dela.
C Dox 1.0 2.00
50
100
CG
(M)
70,13 ± 1,18
15,75 ± 0,86
66,63 ± 3,35 72,63 ± 4,0
**
*
Cél
ula
s (%
)
Figura 17: Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 horas de incubação. As células foram tratadas com o composto CG nas concentrações 1,0 µM e 2,0 µM. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2), *p< 0,05 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
Figura 18: Fotomicrografias das lâminas das células de HL-60, tratadas e não tratadas, após 24 horas de incubação com a doxorrubicina e CG. A- Controle negativo (DMSO), B- tratadas com Doxorrubicina (0,5 µM), C- 1,0 µM e D- 2,0 µM. A contagem foi realizada através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), células com núcleos de coloração marrom. O aumento foi de 400X.
104
5.3.4 Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa
A análise por microscopia das células HL-60, coradas com May-Grunwald-
Giemsa, revelou diversas mudanças morfológicas induzidas pela CG e Doxorrubicina.
Após 24 horas em cultura, células HL-60 do grupo do controle (não-tratadas) exibiram
uma morfologia típica de células não aderidas, tais como membrana íntegra, células
pleomórficas, nítida visualização tanto da membrana plasmática quanto nuclear
(Figura 19A). As células tratadas com a Dox (0,5 µM), utilizada como controle positivo,
induziu redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear
em células de HL-60, todas as características condizentes com apoptose (Figura
19B). Já as células tratadas com a menor concentração da CG (1,0 µM), observou-se
pouca diferença estrutural das células em relação ao controle negativo (Figura 19C).
Nas duas maiores concentrações testadas de CG (2,0 e 4,0 µM), apresentaram
mudanças morfológicas consistentes com processo de apoptose incluindo redução do
volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear, sendo que na
maior concentração (4,0 µM), observa-se um padrão semelhante, produzindo
características e redução de células viáveis muito próximas ao controle positivo tratado
com doxorrubicina (Figura 19D e E).
Figura 19: Fotomicrografias das células de HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com a CG e coradas com May-Grunwald-Giemsa. O aumento foi de 400X. A- Controle negativo, B- doxorrubicina a 0,5 µM, C- 1,0 µM (CG), D- 2,0 µM (CG) e E- 4,0 µM (CG). As setas pretas indicam redução de volume celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos “blebs”.
105
5.3.5 Análises da citometria de fluxo
5.3.5.1 Integridade de membrana celular e concentração de células
A determinação da viabilidade celular serviu como parâmetro para avaliar a
integridade de membrana plasmática de células com morfologia normal, esse teste foi
realizado por citometria de fluxo utilizando o Iodeto de Propídeo (PI) como agente
fluorogênico. A doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle positivo em todos os
experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir
a substância. Foram utilizadas, neste estudo, as concentrações (1, 2 e 4 μM) da CG.
As células foram analisadas 24 h após a incubação com a substância teste.
Na avaliação da viabilidade celular, onde foi utilizado iodeto de propídeo como
corante hidrofílico permeável somente em células com membrana rompida, foi
observado perda da integridade da membrana citoplasmática, com 53,5% a partir de
24 horas de incubação com a maior concentração de CG testada, 4,0 µM (Figura 20A)
em relação ao controle negativo. A integridade de membrana foi afetada tanto na
concentração de 2,0 µM (75,18 ± 3,25%) como na concentração de 4,0 µM (43,29 ±
2,68%) em relação ao controle negativo. A doxorrubicina, por sua vez, reduziu a
proliferação celular com pouca alteração da integridade da membrana citoplasmática
96,79 ± 0,22% (Figuras 20A e B). Como observado na Figura 20B, a CG causou uma
redução significativa na proliferação celular, de maneira dose-dependente, com 24
horas após a incubação, onde nos tratados com doxorrubicina (0,5 µM), CG (2,0 µM e
4,0 µM) foram significativos (p<0,001) .
Esses dados confirmam os resultados observados através dos testes de MTT,
viabilidade por exclusão do azul de tripan e coloração por May-Grunwald-Giemsa e
LA/BE.
106
Figura 20: A- Avaliação da integridade de membrana plasmática e B- Avaliação do número de células viáveis, analisados por citometria de fluxo. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM e com o controle doxorrubicina a 0,5 µM. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
5.3.5.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA
A progressão do ciclo celular e a fragmentação internucleossomal do DNA das
células HL-60, tratadas com CG, foram realizadas por citometria de fluxo e analisadas
através do programa ModFit LT 3.1. Os resultados mostraram que tanto o controle
positivo (doxorrubicina) quanto às duas maiores concentrações de CG, 2,0 e 4,0 µM
causaram aumento significante na fragmentação de DNA (p < 0,05). Após 24 horas de
exposição, células não tratadas apresentaram 4,36 ± 0,37% de fragmentação de DNA,
enquanto as células tratadas com CG nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM causaram
22,54 ± 2,50% e 48,49 ± 2,60%, respectivamente. A menor concentração da CG 1,0
µM não causou fragmentação significativa do DNA. Já a doxorrubicina (Dox), utilizada
como controle positivo, mostrou 90,41 ± 2,06% das células com DNA fragmentado
(Figura 22A).
Quanto à progressão das fases do ciclo celular, as células tratadas com CG
tiveram diferenças significativas nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM, com 40,77% e
40,51% em relação ao controle negativo 50,88%, mostrando que não houve parada na
fase G0/G1. Já a doxorrubicina, promoveu uma parada na fase G0/G1 de 90% em
107
relação ao controle negativo e intensa fragmentação do DNA. Já na fase S, A CG não
demonstrou diferença significativa em ralação ao controle, bem como as células
tratadas com doxorrubicina. Na fase G2/M, a maior concentração testada (4,0 µM),
apresentou parada nesta fase de 20,87 ± 1,20% com diferença significativa (p<0,05)
(Figura 21 e 22B).
Figura 21: Efeito da CG no ciclo celular após 24 h de incubação. Os histogramas do ciclo celular foram analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células de HL-60, determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A- Controle negativo; B- Doxorrubicina (0,5 µM); C, D e E- CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM.
108
Figura 22: A- Determinação da fragmentação do DNA; B- Análise do efeito sobre o ciclo celular. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, após 24 h de incubação e analisados por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. (C-) representa o controle negativo; (DOX) controle positivo com Doxorrubicina (0,5 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
109
5.3.5.3 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V
A fim de confirmar o tipo de morte celular induzida pela CG, a externalização
da fosfatidilserina foi avaliada por citometria de fluxo. A Anexina V liga-se a
fosfatidilserina, reconhecendo desta forma as células em apoptose. A exposição da
fosfatidilserina é para sinalizar a fagocitose das células apoptóticas. O Figura 23B
mostra que há uma diminuição das células viáveis concentração-dependente nas
concentrações de CG de 2,0 e 4,0 µM, com 79,36 ± 1,71% e 50,57 ± 2,28%,
respectivamente, estatísticamente significativo, *p<0,05. Como observado na Figura
23A e B, houve uma indução da externalização da fosfatidilserina de forma
concentração dependente, quando analisamos a indução de apoptose inicial mais a
tardia, com 8,53% e 15,27%; 10,25% e 33,63%, respectivamente, sendo significativo
nas maiores concentrações (2,0 e 4,0 µM), com *p<0,05.
A CG aumentou o percentual de células em processo tardio a necrose, nas
concentrações de 2,0 e 4,0 µM da CG, com 4,4% e 6,0% em relação ao controle
negativo, *p<0,05 (Figura 23A e B). Já a doxorrubicina (0,5 µM) apresentou aumento
significativo na porcentagem de células em apoptose inicial e tardia, com 32,44% e
65,15%, respectivamente (Figura 23A e B).
110
Figura 23: Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-
60. No histograma (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Gráfico (B): % de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
111
5.3.5.4 Detecção da ativação de Caspases Efetoras – 3 e 7
A ativação da caspase-3 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A doxorrubicina
(0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle
negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. As
concentrações (1,0; 2,0 e 4,0 µM) utilizadas da CG neste estudo foram previamente
determinadas. As células foram analisadas 24 horas após a incubação com o derivado
de chalcona (CG).
Como demonstrado na Figura 24A, houve uma diminuição estatiticamente
significativa (p<0,001) no número de células viáveis, nas células tratadas com CG nas
concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, 84,88 ± 2,65%, 43,74 ± 0,99% e 20,98 ± 1,34%,
respectivamente. O controle positivo, doxorrubicina 0,5 µM, mostrou um percentual de
20,09 ± 1,43%, resultado este muito próximo a dose maior da CG (4,0 µM). Com
relação aos valores de apoptose inicial e tardia, observamos que nas maiores
concentrações da CG (2,0 e 4,0 µM) houve um aumento significante (**p<0,001) em
relação ao controle negativo, 15,34 ± 1,6% e 14,77 ± 0,36% apoptose inicial; 18,36 ±
4,21% e 43,61 ± 3,13% apoptose tardia (Figuras 24 e 25).
Na avaliação da necrose as maiores concentrações da CG aumentaram o
percentual da mesma em 15,69 ± 3,08% e 17,87 ± 2,09%, respectivamente (Figura
24D e 25- 4 e 5). A Caspase 3 e 7 foi ativada pela doxorrubicina 0,5 µM e CG 2,0 e 4,0
µM.
Figura 24: Análise da detecção das Caspases Efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células
HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de
Viáveis Apoptose Inicial
Apoptose tardia Necrose
112
variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
Figura 25: Histograma referente ao teste das Caspases Efetoras 3 e 7. (A): 1- Controle
negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
5.3.5.5 Detecção da ativação de Caspases Iniciadoras -8/-9
Como mostrado nas Figuras 26 e 27, a Caspase- 8 demonstrou
comportamento semelhante ao encontrado nas Caspase- 3/-7. Houve diminuição de
células viáveis em todas as concentrações testadas de forma significante (p<0,05),
doxorrubicina 0,5 µM (28,47 ± 2,65%), CG 1,0; 2,0 e 4,0 µM (27,19 ± 5,15%; 18,43 ±
0,24% e 21,26 ± 4,00%). Aumentou o número de células apoptóticas iniciais e tardias
(*p<0,05 e **p<0,001), embora esse aumento tenha somente ocorrido com
significância na apoptose inicial nas células tratadas com doxorrubicina (26,02 ±
2,10%) (Figura 26B). Já na apoptose tardia tanto a doxorrubicina quanto as
concentrações de CG testadas aumentaram o percentual em 26,43 ± 3,82% (DOX- 0,5
µM); 40,41 ± 4,88%, 30,60 ± 7,96% e 44,55 ± 4,94% (CG- 1,0; 2,0 e 4,0 µM) em
relação ao controle negativo (Figuras 26 e 27- 2, 3, 4 e 5).
Na necrose, o aumento do percentual ocorreu de forma significativa na
doxorrubicina, similarmente na dose de 4,0 µM da CG. Porém, na dose correlacionada
a CI50 (2,0 µM) também houve aumento de 7,19 ± 0,47% (Figuras 26D e 27-4).
113
Na avaliação da Caspase- 9, a redução das células viáveis foi significativa na
dose maior de 4,0 µM, com 28, 89 ± 52%. A doxorrubicina houve diminuição de 45,00
± 5,26% (Figura 28A). Na apoptose inicial e tardia, observou-se que apenas na maior
dose da CG houve aumento significativo da apoptose, 24,07 ± 8,58% e 11,85 ± 4,62%
respectivamente. Na necrose, pode-se observar aumento nas células tratadas com
doxorrubicina de 25,10 ± 4,94% (Figuras 28 e 29).
Figura 26: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 8, por citometria de fluxo em células
HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
Viáveis Apoptose Inicial
Apoptose tardia Necrose
114
Figura 27: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 8. (A): 1- Controle negativo; 2-
tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
115
Figura 28: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 9, por citometria de fluxo em células
HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
Figura 29: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 9. (A): 1- Controle negativo; 2-
tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.
Viáveis Apoptose Inicial
Apoptose tardia Necrose
116
5.3.5.6 Detecção do Citocromo C, Procaspase-9 e Caspase -9 pelo método do
Western blot
Inicialmente, a análise pelo método do Western blot avaliou a expressão do
citocromo C, no qual esta análise está relacionada com a via intrínseca da apoptose.
O citocromo C reside no espaço entre as membranas interna e externa da mitocôndria,
que uma vez liberada no citosol das células e associado a outras proteínas,
desencadeiam a cascata de eventos que resulta na morte apoptótica.
O tratamento das células de HL-60 foi feito com CG nas concentrações de 1,0
e 2,0 µM, e incubadas por 12 e 24 horas, para todos os experimentos do Western blot.
De um modo geral, a CG apresentou um padrão de expressão semelhante quando
comparado com a expressão da proteína do controle nos mesmos tempos de
incubação, não sendo observado nenhuma diferença entre eles (Figura 30).
As caspases são expressas na forma de proenzimas, que devem ser clivadas
para ocorrer a sua ativação. As caspases iniciadoras (2,8, 9, 10 e 12) são
autocatalíticas, de modo que conseguem auto-ativar em respostas a estímulos
apoptóticos e desencadear o processo. As efetoras (3, 6 e 7) são clivadas e, portanto
ativadas pelas caspases iniciadoras.
A indução da procaspase 9, assim como a sua ativação, não pôde ser
observada em nenhum tempo de incubação com a CG, nas duas concentrações
testadas, quando comparados com o controle (Figura 30). Já a caspase-9 clivada,
mostrou-se fracamente expressa somente na concentração de 2,0 µM, no tempo de 24
horas de incubação (Figura 30), corroborando com o resultado apresentado
anteriormente da detecção da caspase-9 pelo citômetro de fluxo (Figura 28).
Figura 30: Expressão das procaspase e caspase-9, citocromo c em células de HL-60, controle
e tratadas com 1,0 e 2,0 µM, durante 12 e 24h, avaliada por Western blot.
117
5.3.6 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica
5.3.6.1 Avaliação da genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa
A avaliação do potencial genotóxico induzido pela substância CG foi realizada
através do teste do cometa em PBMCs, após 24 horas de incubação. As
concentrações de CG utilizadas neste ensaio foram 1,0; 2,0 e 4,0 µM. A doxorrubicina
foi utilizada como controle positivo, na concentração de 0,5 µM e o controle negativo
foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
O potencial genotóxico da CG foi avaliado no ensaio do cometa em condições
alcalinas (detecção de quebra da fita simples e da fita dupla do DNA). O ensaio
mostrou na análise da freqüência de dano (%), que em nenhuma concentração
testada da CG houve danos de grau 2,3 e 4, de forma significativa. Em relação ao
controle, as três concentrações de CG testadas mostraram um pequeno aumento da
migração do DNA, representado pelo dano grau 1. A doxorrubicina, controle positivo,
na concentração de 0,5 µM, induziu de forma significativa danos de graus 3 e 4,
considerado alto nível de dano (Figura 31).
Com relação ao índice de dano, a CG não mostrou características genotóxicas
significativas quando comparados com o controle negativo. A doxorrubicina, controle
positivo, mostrou um índice de 237,5 ± 3,27 e freqüência de dano (88,50 ± 1,48%) ao
DNA (Figura 31 e 32).
C-
Dox
1,0
2,0
4,0
0
25
50
75
100
0
1
2
3
4
Grau de Dano
(µM)
CG
**
**
** ** **Fre
qu
ên
cia
de d
an
o (
%)
Figura 31: Freqüência de dano ao DNA. O derivado de chalcona (CG) nas concentrações de
1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
118
C-Dox
1,0 2,0 4,0
0
50
100
150
200
250 **
CG
(µM)
Índ
ice
de
dan
o
(0-4
00)
Figura 32: Índice de dano ao DNA. A substância CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM
sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle negativo. Os valores foram obtidos pela multiplicação do número de células de classe de dano, variando de 0 (sem dano) a 400 (dano máximo). Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
5.3.6.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade – Teste do micronúcleo in
vitro
Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico in vitro da CG, o ensaio do
micronúcleo em PBMC, foi realizado após 24 horas após a administração do fármaco.
As concentrações da CG usadas neste ensaio foram às mesmas dos testes anteriores,
1,0; 2,0 e 4,0 µM. A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo, na dose de 0,5
µM e o controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a
substância.
Observa-se na Figura 33, que a CG nas doses testadas, 1,0 (4,33 ± 1,11); 2,0
(3,00 ± 0,93) e 4,0 µM (6,50 ± 0,95), não induziu significantemente a quantidade de
micronúcleo analisados na contagem de 2000 células binucleadas, ao contrário da
doxorrubicina (47,00 ± 5,00), usada como controle positivo, que aumentou de forma
significante (**p<0,001) em relação ao controle negativo (3,66 ± 0,88).
De acordo com os resultados, a CG apresentou resultado negativo neste
ensaio, ou seja, a substância não apresenta potencial genotóxica/mutagênica in vitro,
119
sendo satisfatório, visto que a substância testada possui característica citotóxica e não
genotóxica e mutagênica.
C DOX 1,0 2,0 4,00
10
20
30
40
50
60C
DOX
1,0
2,0
4,0
(M)
CG
**
MN
po
r 2000 C
BN
Figura 33: Micronúcleo por 2000 células Binucleadas. A substância CG nas concentrações
1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do micronúcleo após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
5.3.7 Estudo in vivo
5.3.7.1 Estudo da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados com
Sarcoma 180
A atividade antitumoral da CG foi analisada em camundongos
transplantados com o tumor experimental Sarcoma 180. Foi avaliado através da
pesagem dos tumores, bem como da análise histopatológica destes. O tratamento
consistiu na administração da CG nas doses de 25 e 50mg/Kg, por via oral. O controle
negativo foi tratado com o veículo usado para diluir os compostos (DMSO 10%), por
via oral e o controle positivo, 5-Fluorouracil, na dose de 25mg/Kg, pela via
intraperitoneal, durante 7 dias consecutivos. No 8o dia, os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical e dissecados para a retirada do tumor, fígado, baço, rins e
estômago. Dentre as doses estudadas, a CG 25 e 50mg/kg/dia oral foram capazes de
reduzir o crescimento tumoral de forma significativa (**p < 0.001) quando comparadas
ao controle negativo, DMSO 10%.
120
O efeito antitumoral da CG está apresentado na Figura 34, onde o peso
relativo dos tumores é: controle negativo (2,32 ± 0,28), controle positivo (0,30 ± 0,05),
CG 25 mg/Kg (1,05 ± 0,11) e CG 50 mg/Kg (0,71 ± 0,07), o que equivale a uma
inibição tumoral de 87,07% do 5-FU, 54,85% da CG na menor dose (25 mg/Kg) e
69,11% da CG na maior dose (50 mg/Kg).
As análises histopatológicas dos tumores (Figura 35) retirados de
camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180 dos grupos controles e
tratados mostraram características de neoplasia maligna constituída por células
redondas e poligonais, com núcleos hipercromáticos e graus variados de pleomorfismo
celular e nuclear, com alguns núcleos vesiculosos e macronúcleos acidofílicos. Foram
visualizadas mitoses, invasão muscular e áreas de necrose. Não houve mudança nos
padrões morfológicos das células tumorais em todos os grupos.
Figura 34: Peso tumoral e percentual de inibição tumoral dos animais submetidos ao protocolo
de avaliação da atividade antitumoral. A substância CG foi testada nas concentrações 25 mg/Kg e 50 mg/Kg; 5-FU, 25 mg/Kg, controle positivo . Controle negativo (DMSO 10%). Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
121
Figura 35: Fotomicrografia dos tumores de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
5.3.7.2 Avaliação dos aspectos toxicológicos nos órgãos dos camundongos
transplantados com Sarcoma 180
A Tabela 6 apresenta os resultados sobre as alterações de peso nos órgãos,
como fígado, baço, rins e estômago; já a Figura 36, mostra alterações no peso dos
animais. Nenhuma diferença foi encontrada na massa corpórea dos animais tratados
com CG quando comparados com o grupo controle (p> 0,05), exceto o 5-FU que
reduziu significantemente (p<0,001) a massa corporal (-3,14 ± 0,59). Em relação à
massa úmida dos órgãos (fígado, baço, rins e estômago) dos animais tratados com
CG ou 5-FU em camundongos com Sarcoma 180, foram observadas alterações
(p<0,001 e p<0,05), no baço e rins (0,05 ± 0,01 e 0,28 ± 0,01, respectivamente) do
grupo tratado com 5-FU, quando comparado com o grupo controle.
122
Tabela 6: Efeito da CG sobre a massa corpórea e a massa úmida dos órgãos (fígado,
baço, rins e estômago) de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180.
* A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais. *p < 0,05 e **p< 0,001, quando comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
C- 5-FU 25 mg/Kg 50mg/Kg
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
**
Pes
o (
g)
Figura 36: Diferença de peso corpóreo dos camundongos com Sarcoma 180, em gramas. Os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais, **p<0,00, quando comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Foram realizadas análises histopatológicas nos fígados, baços, rins e
estômagos de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados com
5-FU (sem estômago) e com a CG.
Na análise histológicas dos órgãos para o grupo controle negativo (DMSO
10%), os fígados estudados mostraram-se com coloração pardo-rosada e sem
alterações macroscópicas, enquanto que a análise microscópica indicou presença de
congestão portal e da veia centrolobular, discreta tumefação celular de hepatócitos e
123
hiperplasia das células de Kupffer (Figura 37 A e B). No fígado dos animais tratados
com 5-FU, foram encontrados além das mesmas alterações do grupo que recebeu
DMSO 10%, também dilatação dos sinusóides e focos inflamatórios diversos,
esteatose, microvesicular e citoplasma vacuolizado (Figura 37 C e D). Nos grupos
tratados com 25mg/Kg de CG, foi visualizado intensa tumefação celular dos
hepatócitos, hiperplasia das células de Kupffer e esteatose microvesicular em diversos
trechos. Na dose de 50mg/Kg, as mesmas alterações da menor dose da CG também
foram encontradas com adição de dilatação dos sinusóides (Figura 37 E; F; G e H).
Na avaliação macroscópica dos baços do grupo controle negativo (DMSO
10%), o tamanho do órgão foi homogêneo e de coloração vinhosa, enquanto que a
análise microscópica mostrou delimitação da polpa branca e da polpa vermelha, com
presença de megacariócitos de permeio (Figura 38 A e B). No grupo do controle
positivo (5-FU), os baços estavam muito pequenos e de coloração vinhosa, e a análise
microscópica indicou desorganização das polpas branca e vermelha com mudança na
arquitetura celular, além de pigmentos de hemossiderina (Figura 38 C e D). Os baços
do grupo tratado com CG 25mg/Kg, mostraram-se vinhosos e com tamanho maior que
o controle e na microscopia observaram presença dos folículos linfóides ligeiramente
amplos e desorganizados e numerosos megacariócitos. No grupo tratado com
50mg/Kg, as polpas branca e vermelha encontravam-se desorganizadas com a
presença de megacariócitos (Figura 38 E; F; G e H).
Ao analisar os tecidos relacionados com a excreção, os rins nos animais
tratados com o controle negativo (DMSO 10%) e positivo (5-FU), se mostraram
pardacentos e de pequena dimensão (controle negativo), na observação
macroscópica. Ao exame microscópico observou-se que, nestes grupos a arquitetura
glomerular estava mantida. Foram visualizadas hemorragias glomerular e tubular,
além de moderada tumefação do epitélio tubular (proximais e distais) (Figura 39 A e
B). Nos tratados com CG, com dose de 25mg/Kg, os órgãos dos animais
apresentaram coloração pardacenta, e a microscopia indicou a manutanção da
arquitetura glomerular com presença de hemorragia glomerular, intensa tumefação do
epitélio tubular (proximais e distais), necrose nefrotóxica focal do epitélio tubular. No
grupo de maior dose da CG (50mg/Kg), os rins estavam com coloração pardo-escuros,
enquanto que a microscopia indicou que a arquitetura glomerular estava preservada,
porém foram observadas hemorragias glomerular e tubular, intensa tumefação do
epitélio tubular (proximais e distais), vacuolização do epitélio tubular, necrose
nefrotóxica focal do epitélio (Figura 39 C e D).
124
No estômago, foi analisado apenas o controle negativo (DMSO 10%) e os
tratados com CG (25 e 50mg/Kg), onde foi utilizada a via oral para administração do
composto teste. Na macroscopia, todos os tecidos mostraram coloração brancacenta e
pregueado mucoso preservado. Na microscopia de todos os grupos, a região cárdia e
fúndica não apresentaram alterações histológicas com visualizações das células
principais e parietais. Na mucosa e submucosa não foram encontrados nenhuma
alteração indicativa de processo inflamatório (Figura 40 A; B; C; D; E e F).
Figura 37: Fotomicrografia mostrando os fígados de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
125
Figura 38: Fotomicrografia mostrando os baços de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X e 400X.
126
Figura 39: Fotomicrografia mostrando os rins de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg,B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
127
Figura 40: Fotomicrografia mostrando os estômagos de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com CG (25 mg/Kg, C e D) e (E e F) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X.
128
5.3.7.2 Análise bioquímica e hematológica dos camundongos saudáveis ou
transplantados com Sarcoma 180
Dentre os parâmetros bioquímicos analisados, foram realizados testes de dano
hepático (níveis plasmáticos das transaminases: aspartato aminotransferase - AST e
alanina aminotransferase - ALT) e teste da função gromerular renal (níveis plasmáticos
de uréia e creatinina).
A Tabela 7 apresenta os resultados encontrados. Não foram encontradas
alterações significantes (p > 0,05) nos níveis plasmáticos dos parâmetros bioquímicos
analisados em nenhum dos grupos seja de camundongos saudáveis ou transplantados
com o tumor Sarcoma 180. Entretanto, foi observado um aumento nos níveis
plasmáticos da AST em camundongos tratados com CG 25mg/kg/dia (112,4 ± 7,02)
em relação ao grupo de animais saudáveis (79,43 ± 7,82), sugerindo uma leve
hepatoxicidade.
Em relação aos níveis de ALT, houve uma discreta diminuição dos grupos
tratados com CG 50mg/Kg/dia (25,25 ± 1,03) em relação ao grupo dos animais
saudáveis (31,43 ± 2,32) e o grupo do 5-FU (21,57 ± 1,52) em ambos os grupos
controles, DMSO 10% + H2O destilada (26,88 ± 1,38) e o grupo dos animais saudáveis
(31,43 ± 2,32).
Nas provas de funções renais, houve uma diminuição da uréia do grupo CG
25mg/Kg/dia (29,38 ± 3,53) em relação aos animais saudáveis (46,00 ± 4,10). Na
análise da creatinina não foi encontrada nenhuma alteração nos grupos tratados com
5-FU, CG 25 e 50mg/Kg/dia em relação aos controles, DMSO 10% + H2O destilada ou
dos animais saudáveis.
A análise microscópica das funções hepáticas e renais deste experimento
complementa o estudo histopatológico dos órgãos dos animais tratados com os grupos
testes 5-FU, CG 25 e 50mg/Kg/dia, mostrando que há alteração microscópica no
fígado e rins dos animais tratados.
129
Tabela 7: Efeito da CG sobre os parâmetros bioquímicos (aspartato aminotransferase
- AST, alanina aminotransferase – ALT, uréia e creatinina) de sangue periférico de
camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
*A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco animais. a, p< 0,001) quando comparado com o grupo DMSO 10% e H2O destilada de camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180 por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls. b, p< 0,05 quando comparado com o grupo que recebeu H2O, camundongos saudáveis por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Dentre os parâmetros hematológicos analisados foram realizadas dosagem de
hemoglobina, contagem de plaquetas e contagem global e diferencial de leucócitos.
A Tabela 8 apresenta os resultados encontrados. Em todos os camundongos
transplantados com tumor Sarcoma 180, incluindo os grupos controle tratados apenas
com H2O ou DMSO 10% + H2O destilada, não houve alteração significante (p<0,05) na
contagem de hemoglobina. Na contagem das plaquetas a única alteração significativa
(p< 0,05 e p<0,001) ocorrida foi com o 5-FU (314,00 ± 24,71), havendo uma
diminuição das plaquetas em relação aos controles dos animais tratados com H2O ou
DMSO 10% + H2O destilada (1108 ± 78,83 e 1181 ± 71,31 respectivamente).
No número leucócitos totais circulantes houve uma diminuição significativa
(p< 0,05 e p<0,001) no grupo do 5-FU (1,22 ± 0,13) com os grupos controles dos
animais tratados com H2O ou DMSO 10% + H2O destilada (2,64 ± 0,26 e 2,43 ± 0,26
respectivamente), induzindo assim a leucopenia. Já o grupo tratado com CG na maior
dose 50mg/Kg/dia (3,52 ± 0,33), aumentou significantemente (p< 0,001) em
comparação ao controle tratado com DMSO 10% + H2O destilada (2,43 ± 0,26),
sugerindo que a CG na maior dose pode está estimulando o mecanismo imunológico
130
do organismo. Além disso, houve uma diferença significante (p< 0,001) na relação do
percentual de linfócitos e neutrófilos circulantes no grupo do 5-FU (89% e 9,57%
respectivamente), aumentando nos linfócitos e diminuindo os neutrófilos em relação ao
controle tratado com DMSO 10% + H2O destilada (74% e 23,6%) transplantado com
Sarcoma 180, sugerindo uma leucopenia. Nos grupos tratados com CG, nas duas
doses testadas (25 e 50 mg/Kg), observou-se um aumento no percentual dos
neutrófilos (25,25% e 27, 75%) e diminuição do percentual dos linfócitos (73,5% e
71%) quando comparado com o controle dos animais saudáveis, tratado com H2O
(89% e 9,30% respectivamente) de forma significativa (p< 0,05).
As demais análises, eosinófilos e monócitos, não tiveram diferença
significativa em relação aos controles.
131
Tabela 8: Efeito da CG e 5-fluorouracil (5-FU) sobre os parâmetros hematológicos (hemoglobina, plaquetas e leucócitos) de sangue periférico
de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
*A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco animais. a, (p< 0,001) quando comparado com o grupo DMSO 10% e H2O destilada de camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180 por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls. b, p< 0,05 quando comparado com o grupo que recebeu H2O, camundongos saudáveis por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
132
Figura 41: Resumo dos resultados dos estudos de avaliação da atividade citotóxica e antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG).
133
Figura 42: Resumo dos resultados dos estudos genotóxico/mutagênico, antitumoral e toxicológica da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG).
Discussão
135
6 DISCUSSÃO
No século passado, houve uma grande revolução no desenvolvimento de
agentes citotóxicos para a terapia do câncer. Foi possível alcançar o controle de certas
neoplasias, como as neoplasias da infância, leucemia aguda, doença de Hodgkin,
linfomas não-Hodgkin, neoplasia trofoblástica gestacional e tumores de células
germinativas (ISMAEL et al., 2008).
O desenvolvimento da terapia antineoplásica frente a mudanças severas, como
a limitação da indicação de algumas drogas e o fato das substâncias citotóxicas
causarem danos não só unicamente no tumor como no tecido normal e saudável,
tornou-se cada vez mais freqüente a busca por agentes mais seletivos (ISMAEL et al.,
2008).
A quimioterapia clássica, porém, traz ao paciente uma série de limitações
quanto a sua freqüência de uso e a tolerância orgânica frente às reações adversas.
Normalmente, dependendo do tipo de reação provocada pelo medicamento, o
paciente precisa de um intervalo entre os ciclos, maior ou menor, visto que as doses
utilizadas nos pacientes é individual e são calculadas baseando-se na superfície
corporal de cada indivíduo.
Os novos agentes estudados podem ser utilizados como protótipos para a
síntese de análogos mais promissores. A obtenção de análogos é um processo
comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica,
e isso pode ser feito através de estudos da relação entre a estrutura e atividade
biológica servindo de base para a otimização molecular (GARRETT & WORKMAN,
1999; WILSON & DANISHEFSKY, 2007).
Têm-se por objetivo, neste processo, o desenho racional e o desenvolvimento
de uma segunda geração de agentes com características melhoradas, tais como o
aumento da eficácia e da estabilidade, a melhora das propriedades farmacocinéticas e
a diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND & GANESAN, 2004).
Adicionalmente, a descoberta de novas drogas através da extração de
produtos naturais tem tido limitações quando comparados com as substâncias
sintéticas pesquisadas. Alguns achados mostram que dentro da indústria farmacêutica
a descoberta de produtos naturais promissores para o tratamento de muitas doenças
são caros e desafiam o tempo e custo dessas pesquisas (LAM, 2007).
136
Inúmeras vantagens das novas técnicas de estudo da relação estrutura-
atividade, obtidos por técnicas recentes de modelagem molecular, as técnicas
tradicionais de modificação molecular e relação estrutura-atividade, apesar de serem
dispendiosas e requer extenso período de investigação, são, ainda, de suma
importância na descoberta e na caracterização de novos fármacos, onde novos
agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela análise inicial de dados teóricos
(WERMUTH et al., 1998; THOMAS, 2000).
Sabendo da importância farmacológica das chalconas, neste trabalho, nos
propusemos a estudar a atividade antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-
fenilprop-2-en-1-ona, substância sintética, obtida através de uma reação química entre
a acetofenona e para-nitro benzaldeído. O grupo das chalconas é considerado uma
das maiores classes de substâncias com potencial e muitos interesses farmacológicos
(NOWAKOWSKA, 2007). Desse modo, pesquisas vêm sendo realizadas no
desenvolvimento de novos análogos. Vale ressaltar que a obtenção desta chalcona
(CG) envolve procedimentos relativamente simples, possibilitando sua obtenção em
larga escala.
De acordo com a literatura, compostos puros podem ser considerados
promissores para justificar novos estudos, quando apresentarem CI50 menor que 1
µg/mL (PESSOA et al., 2000). Considerando esse valor, a CG mostrou-se bastante
citotóxica contra as 5 linhagens tumorais humanas estudadas (HL-60; HCT-8; SF-295;
MDA-MB-435; K562). A CI50 variou de 0,30 µg/mL em células de HCT-8 a 0,84 µg/mL
em células de SF-295, a primeira é a linhagem de colón e a segunda do sistema
nervoso. Outro ponto a ser observado é a citotoxicidade da CG nas células de K562
(0,43 µg/mL), pois essas células de leucemia mielóide crônica possuem a presença do
cromossomo Philadelphia, que resulta em um mau prognóstico para os pacientes e
confere maior resistência aos tratamentos antitumorais convencionais devido a uma
alteração citogenética específica, resultante da translocação recíproca entre os braços
longos dos cromossomos 9 e 22 (MELO et al., 2003; SKEEL, 2007). O potencial
citotóxico da CG assemelha-se com os dados encontrados na literatura para outras
chalconas estudadas, segundo o trabalho de Srinivasan et al., 2009, mostrou atividade
antitumoral in vitro em três derivados de chalconas (11a, 11f, 11h) para as linhagens
de câncer de pulmão, H2009 e A549, com CI50 (5.1 ± 1.9; 2.3 ± 0.3; 1.9 ± 0.1 µM).
De acordo com VINCENZO et al., (2000), as chalconas inibem a proliferação
de células de câncer de ovário primário. A atividade anti-invasiva (in vitro) pode ser
encontrada e demonstrada entre chalconas contendo o grupo fenil. Outras atividades
foram descritas com elevado potencial citotóxico em células humanas de colón.
137
Apesar de não termos estudado outros análogos de chalconas, é certo que a
atividade anticâncer deste composto (CG) está relacionada com a sua estrutura
química, na adição do NO2
(eletronegativo) ao anel B da molécula. Essa modificação
estrutural interfere na relação estrutura-atividade, proporcionando mecanismos de
ação diferentes.
A manutenção da homeostase nos organismos multicelulares é obtida através
do balanço entre a proliferação e morte das células. Alguns tipos de morte celular têm
sido descritos: apoptose (tipo I), morte celular associado com autofagia (tipo II),
necrose ou oncoses (tipo III), catástrofe mitótica, entre outros (KRYSKO, 2008).
Na avaliação do potencial antitumoral de uma substância, é muito importante
que se investigue a utilização de células normais a fim de se obter informações sobre
a seletividade para a célula normal e tumoral (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI et al.,
2003). A CG testada em linfócitos periféricos humanos estimulados com
fitoemaglutinina, apresentou CI50 de 1,79 µg/mL em 72hs. Este valor sugere que houve
maior citotoxicidade em células HL-60 do que em PBMC quando incubada igualmente
por 72h. Os dados também mostraram que a citotoxicidade da CG foi tempo-
dependente, onde viu-se em 24h de exposição, 10,51 µg/mL; em 48h, 2,29 µg/mL e
72h, 1,79 µg/mL. Compostos com ação anticâncer, em sua maior parte, têm como
alvo moléculas e/ou processos celulares compartilhados por células normais e
tumorais, então é de se esperar algum nível de toxicidade.
Ainda participando do “screening” na molécula, foi realizada a investigação da
atividade hemolítica com eritrócitos de camundongos buscando caracterizar o
mecanismo citotóxico direto sobre a membrana plasmática das células, já que os
mesmos possuem grande semelhança com os eritrócitos humanos, principalmente
quanto à sensibilidade (COSTA-LOTUFO et al., 2002; DRESCH et al., 2005). Este
método é um ótimo indicador para averiguar agressão in vitro, por causa da
estabilidade mecânica característica da membrana eritrocitária (SHARMA; SHARMA,
2001).
A ausência da atividade hemolítica foi observada para CG, onde a EC50
mostrou ser acima de 200 µg/mL (790,5 µM), sugerindo possivelmente que o
mecanismo de atividade citotóxica desempenhado por essa substância, não esteja
relacionado à indução de dano em nível de membrana plasmática, mas por uma
possível interferência com os mecanismos intracelulares.
Os resultados do teste antiproliferativo de exclusão por azul de tripan serve
para observar também os efeitos citotóxicos (Figura 15), onde verificou-se a
138
confirmação com o ensaio do MTT (Tabela 3). O ensaio permitiu distinguir as células
capazes de drenar o corante ácido azul de tripan para fora da célula em contraposição
àquelas que não possuem capacidade. A absorção desse corante é um forte indicativo
de dano na membrana plasmática que culmina na morte celular (HYNES et al., 2003;
MINERVINI et al., 2004). A CG apresentou maior atividade antiproliferativa que o
controle negativo nas concentrações testadas após as 24h de incubação e agiu de
maneira concentração-tempo-dependente, sendo que na maior concentrção (4,0 µM),
houve uma redução da proliferação celular após as doze horas de incubação, com um
provável efeito citostático, seguido de efeito citotóxico após as 24h. Apesar de ser
utilizado para estudos de citotoxicidade este teste não distingue qual via de morte está
participando dela. Visto que sistemas de transporte ativo estão em pleno
funcionamento em células viáveis, contudo, nos estágios iniciais da apoptose estes
sistemas ainda estão em funcionamento, enquanto que na necrose não.
As avaliações morfológicas realizadas pelo ensaio da LA/BE mostraram que
após o tratamento com CG, nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM houve um aumento da
população de células apoptóticas com 60,44% e 94%, onde as células apresentavam
cromatina condensada, fragmentada e de um verde brilhante intenso quando
excitadas pela luz azul (BRIGGS; JONES, 2005). VINCENZO et al., (2000), em seu
estudo comprovaram-se que ao testar derivados de chalconas pelo método de
Brometo de etídeo, verificaram-se que em 1 e 4 h de encubação não houve mudanças
significantes no padrão celular, enquanto que em 24h, houve uma diminuição
significante de células viáveis, o que corrobora com os nossos resultados expostos.
Investigando o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade em que a CG
está relacionada, a inibição da proliferação celular foi mensurada pela inibição da
síntese de DNA, através da atividade antiproliferativa pela incorporação do BrdU
(análogo da timidina), que tem o intuito de avaliar a taxa de proliferação por meio do
percentual de células que incorporam o BrdU (DOLBEARE et al., 1983). Porém, o
resultado encontrado mostrou que não houve diminuição da incorporação do BrdU ao
DNA das células de HL-60 testadas (Figura 17), mas observou-se a diminuição da
população celular, como mostrado na Figura 18. Esses resultados refletem que
provavelmente a ação da CG não está relacionada à inibição da síntese de DNA.
As substâncias utilizadas na terapia do câncer apresentam características
diversas em seus mecanismos de ação, o grupo dos taxanes e dos alcalóides da
vinca, por exemplo, atuam em nível microtubular, já as antraciclinas atuam impedindo
a síntese de DNA, RNA e proteínas (BONASSA, 2005).
139
Subseqüentemente ao estudo de inibição de síntese de DNA, alterações
morfológicas foram investigadas usando a coloração por May-Grünwald-Giemsa com o
intuito de determinar que tipo de morte celular estivesse relacionado com a
citoxicidade das substâncias (MARINHO-FILHO et al., 2010). Apoptose é uma das
formas de morte celular de grande importância nos sistemas biológicos, pois
desempenha um papel essencial no desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na
regulação da resposta imune, na eliminação de células senescentes e na morte celular
induzida pelas drogas antineoplásicas (HU & KAVANAGH, 2003; VERMEULEN et al.,
2005).
A morte celular via apoptose pode ser identificada por uma série de alterações
morfológicas na célula como diminuição do volume celular, condensação da
cromatina, fragmentação nuclear, formação de corpos apoptóticos e de
prolongamentos da membrana plasmática (“blebs”). Já a necrose ocorre por uma ação
rápida da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e
perda da integridade da membrana plasmática (KERR et al., 1972; DARZYNKIEWICZ
et al., 1992; STRASSER et al, 2000). Na análise da exposição das células de HL-60
com as concentrações testadas de CG em 24 horas de exposição, foram facilmente
visualizadas, por microscopia óptica, a diminuição do volume celular, condensação da
cromatina, fragmentação nuclear, presença dos blebs e formação de corpos
apoptóticos, condizendo com as características já mostradas nos ensaios de LA/BE.
A indução de apoptose em células tumorais é um benefício para o tratamento
do câncer (LOS et al., 2003). A apoptose é a morte celular programada da célula que
envolve o controle genético de eventos bioquímicos e morfológicos das células,
incluindo a externalização da fosfatidilserina, liberação do citocromo c da mitocôndria e
ativação de caspases (SCHULTZ & HARRINGTON, 2003). A citometria de fluxo é
uma ferramenta bastante valiosa para estudo estrutural e funcional das células, sendo
considerado um método rápido e preciso, tendo boa aplicação para investigação de
compostos com atividade antitumoral. As características inerentes à morfologia das
células apoptóticas como condensação de cromatina e a redução do volume celular
são detectadas por meio do desvio da luz incidida sobre a célula para frente e para o
lado (DARZYNKIEWICZ et al., 1992; RAMANATHAN,1997; LIMA, 2005).
A citometria de fluxo utiliza um sistema para observar células individuais
obtidas a partir de uma suspensão celular. Assim, uma população de células passa ao
longo de tubos capilares, onde um sistema óptico registra o parâmetro que se deseja
medir e alimenta um computador com os dados obtidos. Corantes fluorescentes
140
específicos são utilizados para os componentes celulares que se deseja observar,
permitindo o uso do citômetro de fluxo no diagnóstico das neoplasias e como uma
poderosa ferramenta para a compreensão das alterações celulares causadas por
compostos biologicamente ativos (SHAPIRO et al., 1995; MARINHO-FILHO et al.,
2010).
Os estudos realizados com citometria de fluxo mostraram diminuição
significativa do número de células a partir da concentração de 2,0 µM (equivalente a
CI50) e pouca perda da integridade de membrana, na mesma concentração, diferindo
apenas da maior dose (4,0 µM), que apresentou perda importante dessa integridade
de membrana. Em relação à análise da fragmentação do DNA, a CG apresentou nas
maiores concentrações testadas (2,0 e 4,0 µM), 22,54 e 48,49% respectivamente.
Enquanto que no ciclo celular, observou-se que na fase G2/M, a maior concentração
testada (4,0 µM), apresentou parada nesta fase de 20,87%. VICENZO e colaboradores
(2000) mostraram em seu trabalho que os compostos derivados de chalcona, tiveram
um aumento da fragmentação do DNA e mostraram parada em G2/M do ciclo celular,
se equiparando aos dados encontrados neste estudo.
A progressão apropriada ao longo do ciclo celular é monitorada por pontos de
checagem (checkpoints) que correspondem às etapas de transição G1/S e G2/M para
detectar defeitos durante a síntese de DNA e a segregação cromossômica,
respectivamente (MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, o dano celular pode
causar a parada do ciclo na fase G1 para permitir que o sistema de reparo atue antes
da passagem para a próxima fase. Essa passagem (G1 S) é regulada pela
fosforilação da proteína Retinoblastoma (Rb) por quinases dependentes de ciclinas
(Cyclin-Dependent Kinases, CDKs), principalmente, após a formação dos complexos
ciclina D-CDK4 e ciclina D-CDK6. Em seu estado hipofosforilado, a Rb liga-se e inibe a
transcrição do fator de transcrição E2F. O complexo de ciclina D-CDK fosforila a Rb, a
qual libera o E2F, permitindo ao mesmo atuar na ativação de genes e expressão de
proteínas (ciclina E) necessários para entrar na fase S (HARBOUR et al., 1999;
MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, é provável que a parada do ciclo celular
causada pela CG possa estar relacionada à presença de possíveis alterações
percebidas na síntese de proteínas e RNA (Fase G2), pela alteração na maquinaria de
reparo ou em alguma fase do processo mitótico (Fase M). Certamente, a atuação do
maquinário enzimático de reparo não conseguiu corrigir o dano celular, levando às
células leucêmicas à morte por apoptose.
Outras avaliações relacionadas ao tipo de morte celular foram prosseguidos
141
com o objetivo de melhor caracterizar a via apoptótica da envolvida. A anexina V é um
representante de uma família de proteínas ligadas a fosfolipídeos dependentes de
cálcio, e possuem alta afinidade por bicamadas fosfolipídicas de membrana, ricas em
fosfatidilserina. Os fluocromos conjulgados podem ser uma ferramenta fundamental
para monitorar as mudanças de assimetria de membranas celulares fosfolipídicas,
sendo, portanto um excelente método para determinar a presença de células
apoptóticas (THIAGARAJAN & TAIT, 1990; KOOPMAN et al., 1994). O ensaio da
anexina V foi realizado para detectar a externalização da fosfatidilserina (evento
ocorrido na fase inicial da apoptose), o qual é um fosfolipídeo interno da estrutura da
membrana, e que ao ser externalizado, sinaliza para os macrófagos induzindo a
fagocitose da célula, evitando a liberação do conteúdo celular para o meio extracelular
(VERMES et al, 1995; ZIMMERMANN et al, 2001; FREIKMAN et al, 2008).
Após 24h de exposição a CG, observou-se um aumento, de modo
concentração-depedente, no número de células anexina positiva, representada pela
apoptose inicial e tardia. Células apoptóticas mostram perda da assimetria
aumentando a externalização de PS principalmente na dose de 4,0 µM. Houve um
aumento discreto de células em necrose, nas doses de 2,0 e 4,0 µM (Figura 23). É
importante destacar que o evento de externalização da fosfatidilserina ocorre por
causa da liberação de citocromo c devido à perda de integridade da membrana
mitocondrial (GOLDSTEIN et al., 2000; FREIKMAN et al, 2008).
Bioquimicamente, a apoptose é tida como a morte celular programada,
executada por uma família de proteases- as caspases- que, à ativação, regulam o
desmonte da célula de maneira precisa e orquestrada, e este é o processo
inconfundível da apoptose (JIMENEZ, 2009). As caspases estão agrupadas em dois
tipos: iniciadoras (2, 8, 9 e 10) e efetoras (3, 6 e 7) (WANG et al., 2005). A CG foi
capaz de ativar as caspases 3 e 7 nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM. Também ativou
a caspase 8, nas três doses testadas (1,0; 2,0 e 4,0 µM) e a caspase 9, na maior
concentração (4,0 µM). As duas maiores sinalizações da apoptose no organismo
humano, são a via “extrínseca” iniciada pela ativação de receptores de morte
presentes na membrana que conduz a uma clivagem das caspases e a via “intrínseca”
caracterizada pela despolarização mitocondrial, liberação de citocromo c e ativação de
caspases (MONTENEGRO et al., 2010). Diante do exposto sugere-se que a CG age
somente pela via extrínseca nas concentrações de 1,0, 2,0 e 4,0 µM.
142
A mitocôndria desempenha um importante papel no programa apoptótico. O
Citocromo c, normalmente reside no espaço entre as membranas interna e externa da
mitocôndria, onde ele atua na transferência de elétrons como parte da fosforilação
oxidativa. Após a sinalização do processo de morte (apoptose), a membrana
mitocondrial externa torna-se despolarizada e o citocromo c é secretado da
mitocôndria para o citosol circundante. Este associa-se a outras proteínas para
desencadear a cascata de eventos que culminam na apoptose. Uma vez no
citoplasma, o citocromo c associa-se à proteína Apaf-1, formando o apoptossomo, que
culmina em ativar a procaspase-9, convertendo-se em caspase-9, chamado de
processo da via intrínseca (FANG et al., 2008; WEINBERG, 2008; JIMENEZ, 2009).
Para a investigação de eventos apoptóticos através do envolvimento
mitocondrial, pelo método do Western blot, a CG não mostrou diferença na expressão
do citocromo c e procaspase-9 nas concentrações e tempos testados em relação ao
controle. Em adição, o tratamento das células de HL-60 com a CG não está
unicamente associada com a liberação do citocromo c, mas com o aumento da
expressão da caspase-9 clivada quando encubada por 24 h exposta a maior
concentração (2,0 µM), Entretanto, baseado nos resultados encontrados, é adequado
conjeturam que na maior concentração 4,0 µM, as duas vias da apoptose são
ativadas. Estes resultados se equiparam a outros estudos com derivados de
chalconas, como o realizado por FANG et al.(2008), que mostrou o envolvimento da
expressão de vários marcadores de morte celular, entre eles as caspases 8, 9 e 3,
como também o citocromo c, quando testados com o isolespeol, mostrando a
utilização também das duas vias envolvidas no mecanismo de morte celular.
NISHIMURA et al. (2007), estudram a ação antitumoral da isobavachalcona, onde foi
observado aumento da expressão da caspase-3 e 9, como também do Bcl-2 e Bax.
De acordo com a literatura, a atividade citotóxica de algumas chalconas já foi
relacionada a diferentes mecanismos de ação, entre eles: (a) inibição da incorporação
celular da timina, uridina e leucina, inibindo desta forma a síntese de RNA, DNA e
proteínas; (b) inibição não-competitiva da interação entre 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno e
a glutationa S-transferase (GST) (DIMMOCK et al., 1999); (c) desestabilização dos
microtúbulos, através da competição com a colchicina pelo sítio ativo da tubulina,
provocando um decréscimo no crescimento tumoral, alquilação do processo mitótico
(LAWRENCE; McGOWN; DUCKI, 2000; LAWRENCE et al., 2006); (d) inibição da
interação entre a oncoproteína MDM2 e a proteína de supressão tumoral p53, levando
a um aumento da atividade transcripcional da p53, reativando a integridade genômica
143
(STOLL et al., 2001); (e) inibição da liberação de histamina, possivelmente através da
inibição da proteína C quinase (PKC), já que esta enzima constitui um importante
receptor para certos tipos de tumores, exercendo uma atividade antitumoral
(MIDDLETON et al., 1987).
Além disso, de acordo com Dimmock e colaboradores (1999), a introdução de
grupos hidroxila favorece o aumento da citotoxicidade. Estudos realizados por Gordon
e colaboradores (1993), com dihidroxichalconas indicaram um aumento na atividade
antitumoral. Há também uma inibição da produção de lactato nas células tumorais tipo
ascíticas de Erlich (SUOLINNA, 1975).
Na oncologia muitos agentes antineoplásicos de uso clínico são considerados
genotóxicos e mutagênicos, como por exemplo, o etoposídeo, teniposídeo,
doxorrubicina, entre outros. Vários agentes alquilantes são considerados
leucemogênicos. A relação entre a atividade citotóxica, genotóxica e mutagência ainda
não está bem elucidada (ANDERSON & BERGER, 1994; DE MESA et al., 2002).
Esse tipo de exposição ao indivíduo provoca algumas vezes o desenvolvimento
de segunda malignidade. Apesar desse risco, o benefício provocado por muitas
substâncias antineoplásicas, que resulta na remissão parcial ou completa do tumor é
considerado. O objetivo da avaliação sistemática da carcinogenicidade dos agentes
citotóxicos em diversas espécies animais e também em células humanas permite a
identificação e o desenvolvimento de agentes menos tóxicos, sendo benéfico aos
pacientes (AYDEMIR & BILALOGLU, 2003).
Vários ensaios para identificação de agentes mutagênicos e/ou genotóxicos
vem sendo desenvolvidos (MACGREGOR et al., 2000). A ocorrência de mutações, no
entanto, depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA.
(SILVA et al., 2003).
O teste do cometa é considerado um método com sensibilidade adequada
relacionado à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO &
TICE, 2003). É essencial para a avaliação da segurança de novos fármacos
(HARTMANN et al., 2003). Os testes citogenéticos in vitro têm fornecido informações
fundamentais para o estabelecimento do potencial mutagênico de agentes químicos e
físicos. O estudo de danos no DNA em nível cromossômico é essencial uma vez que a
mutação cromossômica é um evento importante no processo de carcinogênese
(SALVADORI et al., 2003).
O uso das células de PBMC, obtidas do sangue periférico como células-modelo
para avaliar a genotoxicidade deve-se ao fato dessas células serem sensíveis aos
144
agentes genotóxicos, pois há uma correlação entre os danos induzidos nas células
periféricas do sistema hematopoiético e outras células somáticas (ALBERTINI et al.,
2000).
As mutações podem ocorrer em três níveis: gênica, cromossômica e mutações
genômicas, como a mudança no número de cromossomos originando as aneuploidias
e poliploidias. Um único método de genotoxicidade não pode fornecer informações
sobre todos os indicadores de toxicidade genética. Conseqüentemente, é necessário
que cada agente químico seja avaliado em diferentes ensaios para que se possa
colher informações adequadas a respeito de seu potencial genotóxico (CARERE et al.,
2002; DEARFIELD et al., 2002; MULLER et al., 2003).
O ensaio do cometa mostrou que a CG foi capaz de causar dano ao DNA, grau
1, em pequenas proporções nas três concentrações testadas, quando analisado o
percentual da freqüência de dano. Com relação ao índice de dano (ID) só o controle
positivo (doxorrubicina) teve ocorrência significativa de dano. Os dados obtidos sobre
a indução de apoptose através da coloração por BE/LA corroboram com os achados
do ensaio do cometa, no qual o aumento das concentrações de CG em 24h de
exposição resulta no aumento do número de células apoptóticas, porém os valores de
ID para a linhagem celular testada não foi significante. Sendo assim podemos supor
que a CG não participa da indução de genotóxicidade e que os danos de grau 1
provocados por ela podem ser reparados pela própria maquinaria celular.
Já se sabe que a doxorrubicina (controle positivo) produz efeitos
gentóxicos/mutagênicos importantes, pois atua na quebra das duas fitas de DNA, seu
mecanismo de ação basea-se intercalando com o DNA e produzindo efeitos na
Topoisomerase II (SKEEL, 2007). Portanto, a ação da doxorrubicina justifica o dano
causado ao DNA observado no ensaio do cometa. Entretanto, a CG não causou danos
ao DNA, visto que atua na fase G2/M e não na síntese do DNA, onde ocorre o
processo de genotoxicidade/mutagenicidade produzidos pelas substâncias em
exposição, corroborando com achados na literatura, como o paclitaxel que atua em
nível de microtúbulos (Fase M) e também não induz a genotoxicidade
(MOZZAQUATRO, 2007).
O micronúcleo representa perda de cromatina em conseqüências de danos
cromossômicos ou dano no aparelho mitótico. Durante a mitose esses micronúcleos
são formados, independentemente do tipo de dano ocorrido durante o ciclo celular. Por
isso, os danos no DNA causados pela exposição a agentes mutagênicos, por exemplo,
somente serão expressos em micronúcleo após um ciclo de divisão celular, sendo
145
dependentes da proporção de células que estão se dividindo (FENECH & MORLEY,
1997; CLARE et al., 2006).
As quebras de fita dupla representam uma das mais severas lesões ao DNA,
devido à perda da continuidade cromossômica. Levando a geração de fragmentos
cromossômicos acêntricos (sem centrômero) comprometendo a segregação
cromossômica durante a mitose (KAYE et al., 2004). Adicionalmente, lesões de fita
dupla tendem a ser reparadas erroneamente devido à falta de segmentos
complementares de DNA (molde) que possam ser utilizados pelas enzimas envolvidas
no processo (PFEIFFER et al., 2000). Os resultados observados na exposição das
células de PBMC com a CG mostram que a CG não induz a formação de
micronúcleos, em nenhuma das concentrações testadas (1,0; 2,0 e 4,0µM) quando
comparados com o controle negativo, já a doxorrubicina (controle positivo) promove de
forma significativa aos achados de micronúcleos nas células. Esses dados sugerem
que a CG não é citotóxica no momento em que eles são estimulados
mitogênicamente, sem interferir na quebra das fitas simples ou dupla do DNA. Estes
resultados corroboram com os dados encontrados in vitro no ensaio do cometa.
Substâncias genotóxicas/mutagênicas podem causar o desenvolvimento de
malignidades secundárias. Uma vez que, nem todo agente genotóxico é,
necessariamente, mutagênico, pelo fato das lesões geradas no DNA poderem ser
reparadas ou evoluírem para mutações. Então podemos sugerir que a CG por não
apresentar essas características, mostra-se ser uma molécula segura, com ação
citotóxica e não genotóxica/mutagênica.
As pesquisas envolvendo animais de laboratório são necessárias para a
compreensão dos processos antitumorais em organismos vivos. Muitos modelos
experimentais utilizando camundongos são aceitos para os testes antitumorais
embasados em aspectos semelhantes aos humanos e importantes, como: semelhança
fisiológica de genes, células, tecidos e sistemas (CHABNER et al., 2001; KAMB,
2005).
Buscando afirmar a ação antineoplásica dos resultados obtidos in vitro, a CG
foi avaliada através do teste antitumoral in vivo, utilizando camundongos Mus
musculus Swiss transplantados com Sarcoma 180. Dentre as doses estudadas, foi
visto que os animais tratados com CG (25 e 50mg/Kg/dia) por via oral, durante 7 dias,
apresentaram redução na massa tumoral em 54,85 e 69,11%, respectivamente,
quando comparados ao controle negativo (DMSO 10%). Estudos anteriores mostraram
que as chalconas em geral, possuem ação antitumoral in vivo, prevenindo a
146
proliferação de células tumorais em ratos, como a isoliquiritigenina, que é um potente
agente antitumoral (SABZEVARI et al., 2004).
A aplicação das chalconas no tratamento quimioterápico do câncer ganhou
destaque, devido a seu potencial de restaurar a sensibilidade celular, através da
inibição da glicoproteína-P (uma proteína de membrana responsável pela exportação
de fármacos para o meio extracelular), a qual após longa exposição ao tratamento
quimioterápico encontra-se ativa em um mecanismo de super expressão que acaba
inibindo a ação quimioterápica (BOIS et al., 1998).
Os achados histopatológicos dos tumores, no tratamento com a CG, mostram
áreas de necrose de coagulação, invasão muscular, perda da arquitetura celular, com
presença de células aberrantes, núcleos hipercromáticos e graus variados de
pleomorfismo celular e nuclear, características normalmente encontradas em tecidos
tumorais malignos.
Os tumores de Sarcoma 180, em sua grande maioria, podem desenvolver
necrose a partir da 3ª semana de implante (PEREIRA & CHAVES, 1983), porém o
crescimento tumoral em apenas 1 semana foi suficiente para o surgimento de
necroses em todos os grupos, inclusive no grupo controle negativo (DMSO 10%). Isso
é explicado pelo fato de que o Sarcoma 180 em sua forma sólida, caracteriza-se por
um rápido crescimento em 7 dias (SCHABEL, 1977), modificando a sua capacidade de
oxigenação dos vasos sanguíneos locais e daqueles em formação (angiogênese)
ultrapassada pelo aumento da massa neoplásica (PADERA et al., 2004). A necrose de
coagulação é determinada pela desnaturação da maioria das proteínas celulares
(inclusive as lisossômicas) devido à queda acentuada no pH celular durante o
processo de lesão por hipóxia ou isquemia.
A análise da diferença do peso corpóreo dos animais antes e após o
tratamento indica possíveis achados de toxicidades, como por exemplo, a anorexia
produzida por muitas substâncias antineoplásicas. O 5-FU é uma delas, além de
provocar diarréias também pode induzir o indivíduo à anorexia, induzindo a perda de
peso (BONASSA & SANTANA, 2005). Nos resultados obtidos neste estudo, a única
alteração de peso observada foi dos animais que receberam o 5-FU, numa média de -
3,14g. Portanto, a CG não alterou o peso dos animais no período do tratamento (7
dias) em nenhuma dose testada (25 e 50mg/Kg/dia).
Evidências que também apontam a toxicidade in vivo de substâncias
relacionam-se a aumento ou diminuição no peso relativo dos órgãos-chave pós-
tratamento (BARDOCZ et al.,1996). O balanço entre os efeitos terapêuticos e
147
toxicológicos de um composto químico é um parâmetro importante quando se quer
verificar a aplicabilidade farmacológica do composto (ANAZETTI et al., 2003). A
toxicidade induzida pelos fármacos ou as reações adversas são as principais causas
da retirada de medicamentos do mercado. Entre 1975 e 1999, 16 das 45 drogas
aprovadas foram retiradas do mercado por razões de segurança e 22 % (10 das 45)
foram hepatotóxicas (LASSER et al., 2002). Olson e colaboradores (2000) mostraram
que 72% dos sintomas e/ou sinais de toxicidade de drogas em humanos podem ser
delineados e visualizados em animais de laboratório.
A toxicidade nos pacientes em uso de quimioterapia é medida através da
análise do hemograma completo, provas de função hepática e renal antes do início de
cada ciclo de terapia. Dependendo do grau de toxicidade encontrada, o paciente pode
adiar o ciclo e fazer uso de terapia de auxilio a essa reações limitantes.
O fígado e rins são órgãos responsáveis pela detoxicação do organismo, e em
casos de intoxicação podem ter seu volume e/ou peso aumentado. Em relação às
alterações no peso dos órgãos analisados, a CG não mostrou nenhuma diferença
significativa entre eles. Porém, o controle positivo (5-FU), mostrou uma redução
significativa do baço, indicando a reação de imunossupressão causada por ele e
diminuição do tamanho dos rins (*p< 0,05 e **p<0,01).
Os achados histopatológicos referentes à análise do fígado dos animais, os
grupos que receberam CG 25 e 50mg/Kg/dia apresentaram alterações indicativas de
toxicidade representadas pela presença de esteatose microvesicular em praticamente
toda a extensão da amostra, focos inflamatórios, tumefação celular, hiperplasia das
células de Kupffer. Um dado positivo é que não há fibrose intersticial, nem ocorrência
de necrose ou comprometimento do parênquima. Como visto, sem a ocorrência de
danos mais graves, o fígado é capaz de promover regeneração hepatocelular com a
ausência da exposição à substância teste. Muitos achados em biópsias sugerem que
os fármacos devem ser considerados como possíveis causadores de qualquer lesão
hepática in vivo (SCHEUER, LEFKOWITCH, 2000).
As aminotransferases ou transaminases constituem um grupo de enzimas que
catalisa a interconversão de aminoácidos em cetoácidos, por transferência de grupos
aminos. As aminotransferases de importância clínica são: AST ou TGO e ALT ou TGP,
principalmente para detectar a hepatite viral aguda e a hepatite fulminante (GARCIA &
KANAAN, 2008). De acordo com BONASSA & SANTANA (2007), a toxicidade
hepática envolvendo os antineoplásicos, relaciona-se com a elevação transitória das
148
enzimas hepáticas (AST, ALT, DHL e fosfatase alcalina), alterando o metabolismo das
gorduras, necrose hepatocelular, colestase, hepatite e doença veno-oclusiva.
Na avaliação das transaminases hepáticas, sensíveis indicadores da injuria
celular hepática, o AST ou TGO, dos animais que receberam 25 mg/Kg/dia (CG)
mostrou um aumento significativo (p<0,05) em relação aos animais saudáveis,
enquanto que o ALT ou TGP foi reduzido nos grupos que recebeu o 5-FU
(comparando os dois grupos controles- H2O + DMSO 10% e animais saudáveis) e
diminuição no grupo tratado com 50mg/Kg/dia (CG) (Tabela 7), assim pode-se
correlacionar com as alterações observadas no histopatológico do fígado dos animais
e que por essas enzimas não estarem muito aumentadas, há um indicativo de
toxicidade no tecido hepático, porém podem ser reversíveis assim como as alterações
observadas na histologia dos órgãos.
Em adição a avaliação de danos causados aos lipídios, DNA e proteínas, a
enzima AST é comumente usada como indicador de integridade hepática. Elevações
de transaminases no soro ocorrem após uma injúria ao tecido hepático devido à
toxicidade. REBELLO (2005), mostrou em seu estudo que nenhuma das chalconas
avaliadas causou elevação significativa na atividade desta enzima, sugerindo que os
compostos não são hepatotóxicos nas concentrações testadas.
SABZEVARI e colaboradores (2004), tentando determinar um possível
mecanismo de ação que justifique esta atividade antitumoral realizaram estudos com
chalconas hidroxiladas em hepatócitos de ratos e sugeriram que a citotoxicidade de
chalconas para hepatócitos e possivelmente para células tumorais estava relacionado
à sua habilidade de formar radicais fenoxil pró-oxidantes e causar um desacoplamento
da mitocôndria. Portanto estes autores postularam que a atividade antitumoral de
chalconas hidroxiladas estaria associada ao seu potencial pró-oxidante.
No baço foi evidente a desorganização dos folículos nos dois grupos tratados
com a CG (25 e 50mg/Kg/dia), porém na maior dose o efeito foi mais evidente (Figura
38). No grupo de 25mg/Kg/dia, a polpa branca ficou ampliada e comprimindo a polpa
vermelha. Enquanto que no grupo de 50mg/Kg/dia, a polpa branca ficou totalmente
misturada com a polpa vermelha, porém não passa a idéia de hiperplasia da mesma.
No controle positivo, a atrofia da polpa branca e mudança da arquitetura celular é uma
característica do 5-FU. Presença de megacariócitos foi encontrada em todos os
grupos analisados, que indica um aumento da atividade da hematopoiese podendo
estar relacionado a um possível efeito imunoestimulante, porém mais testes terão que
ser realizados para a comprovação deste efeito.
149
Na análise histológica dos rins, observou-se que nos 2 grupos testados (CG 25
e 50mg/Kg/dia), foram encontrados alterações funcionais com resposta adaptativa
representada por hemorragias e tumefação do epitélio tubular, reações equiparáveis
com o controle positivo tratado com 5-FU (25mg/Kg/dia). No entanto, no grupo CG
50mg/Kg/dia também visualizou-se vacuolização isomérica do epitélio tubular.
Entretanto, apesar das alterações morfológicas encontradas, houve manutenção da
arquitetura glomerular nos rins, ausência de infiltrado inflamatório por entre os túbulos
e fibrose, o que torna a toxicidade inicial com caráter reversível provavelmente após a
suspensão da exposição a CG.
A uréia é formada pelo fígado como produto final do metabolismo e da digestão
de proteínas, sendo posteriormente liberada no sangue e excretada pelos rins, sendo
assim a uréia relaciona-se com a função hepática e renal. Encontra-se diminuída em
pacientes com disfunção hepática grave e aumentada na disfunção renal (GARCIA &
KANAAN, 2008). A depuração da creatinina é o método utilizado para mensurar a taxa
de filtração glomerular (TFG), sendo que o aumento dos seus níveis tem uma forte
correlação com a falência renal (GARCIA & KANAAN, 2008).
Na avaliação bioquímica, foram analisadas as funções renais, através da uréia
e creatinina. Desses dois parâmetros, a única alteração observada foi a diminuição da
taxa de uréia no grupo tratado com CG (25 mg/Kg/dia) quando comparados com os
dois controles- DMSO 10% + H2O destilada e animais saudáveis. Como descrito no
parágrafo anterior, a diminuição da uréia pode estar relacionada com alguma
disfunção hepática, assim como observado nas análises histológica do fígado. Sendo
assim, os dados apresentados para análise das funções renais, uréia e creatinina, não
apresentaram indícios de toxicidade nos rins, mesmo que na análise histológica os rins
tenham apresentado alterações importantes. Entretanto, esse resultado vem subsidiar
a hipótese de reversibilidade dos danos encontrados na histologia dos rins.
Em relação à histopatologia do estômago dos animais que receberam a CG
pela via oral, não foram encontradas alterações nem macroscópica e nem
microscópica (Figura 40). Esses dados mostram que a CG nas duas concentrações
(25 e 50 mg/Kg/dia) não alterou a mucosa gástrica e participou do processo inicial
digestório sem apresentar ocorrência de dano, porém esse tratamento foi de apenas 7
dias, não podendo afirmar que em tempo de maior exposição a CG, não possa causar
nenhum dano importante no órgão em questão.
150
As células da medula óssea são bastante sensíveis à agressão causada pelos
agentes quimioterápicos. Como conseqüência, os glóbulos brancos (leucócitos) e
vermelhos (hemácias), assim como as plaquetas podem ter sua produção
comprometida, determinando queda em suas contagens no sangue (KATZUNG,
2003).
Os leucócitos têm papel essencial nos mecanismos imunológicos do organismo
e são desenvolvidos no baço e linfonodos (DUKES, 1996). Adicionalmente, o
tratamento com a CG (50mg/Kg/dia) aumenta a proporção dos polimorfonucleares em
sangue periférico, onde o efeito do 5-FU proporciona leucopenia. Este resultado vem a
corroborar com os achados na histologia dos animais tratados e fortalecer a idéia de
uma possível atuação também do sistema imunológico na atividade antitumoral in vivo.
Os glóbulos vermelhos permanecem na circulação por períodos muito maiores
que os leucócitos. Assim, a anemia (queda na contagem dos glóbulos vermelhos no
sangue) torna-se evidente somente após alguns ciclos de quimioterapia. Por isso, não
foi evidenciada anemia, induzida pelo 5-FU, no modelo experimental adotado. Já nas
contagens do número de plaquetas, houve alteração apenas nos tratados com 5-FU,
resultando em plaquetopenia severa.
As substituições de grupamentos químicos na estrutura principal da chalcona
podem ativar ou destivar certas propriedades dessa molécula. Com a variedade de
radicais e de posições substituíveis pode-se sintetizar muitas moléculas derivadas e,
dependendo das substituições, pode-se obter compostos com atividades biológicas
semelhantes. Com isso, várias moléculas podem exercer a mesma função, com
potencial diferenciado, sendo mais ou menos ativa para determinados fins. A CG,
avaliada neste estudo demonstrou grande potencial citotóxico frente às linhagens de
células tumorais, envolvimento na parada do ciclo celular em G2/M e fragmentação do
DNA. A presença de caspases ativas, bem como exposição da fosfatidilserina e as
alterações morfológicas encontradas, confirmam a indução de apoptose pela via
extrínseca. Não foram encontradas características genotóxicas/mutagênicas em
linfócitos humanos. Seu potencial antitumoral foi confirmado in vivo em modelo
experimental, onde a CG foi ativa nas duas doses testadas (25 e 50mg/Kg/dia) pela
via oral, com toxicidade branda e alterações reversíveis nos órgãos, visto nos estudos
histopatológicos, bioquímicos e hematológicos.
Considerações
Finais
152
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dentre todos os resultados obtidos neste estudo, podemos afirmar que
a CG, um produto sintético, obtido a partir da reação química entre a acetofenona e
para-nitro benzaldeído, apresenta atividade anticâncer. As suas propriedades físico-
químicas, como muitas chalconas estudadas, estão relacionadas com as atividades
antitumorais descritas e seu mecanismo de ação abrangente, podendo atuar nas vias
extrínseca e intríseca da apoptose, como também na atividade antitumoral e a
provável ativação do sistema imunológico apresentados nos resultados in vivo. Outros
dados de extrema importância referentes a essa molécula são a capacidade de
produzir baixa toxicidade e reversíveis, bem como a ausência de danos
genotóxicos/mutagênicos, o que indica segurança nas concentrações testadas da
chalcona. De qualquer modo, estudos complementares que contemplem análises de
alvo molecular, eficácia em modelos xenográficos, estudos toxicológicos e
farmacocinéticos adicionais são necessários para a validação deste fármaco para uso
humano. Por fim, a CG mostrou ser uma molécula com grande potencial citotóxico e
antitumoral, e por isso torna-se uma molécula promissora para a terapia do câncer.
Referências Bibliográficas
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Anexos
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ANEXO 1 Aprovação do Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos (COMEPE)
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ANEXO 2 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA)