170
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA KRISTIANA CERQUEIRA MOUSINHO ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN VIVO FORTALEZA 2010

ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

KRISTIANA CERQUEIRA MOUSINHO

ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE

CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E

IN VIVO

FORTALEZA

2010

Page 2: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Universidade Federal do Ceará

Faculdade de Medicina

Departamento de Fisiologia e Farmacologia

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia

ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE

CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN

VIVO

Kristiana Cerqueira Mousinho

Tese submetida à Coordenação do programa de

Pós-Graduação em Farmacologia do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará como requisito

parcial para a obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia.

Orientador:

Profo.Dro. Manoel Odorico de Moraes Filho

Co-Orientadora:

Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza

Fortaleza - CE

2010

Page 3: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

M892e Mousinho, Kristiana Cerqueira.

Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, in vitro e in vivo / Kristiana Cerqueira Mousinho. – 2010.

167 f. : il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2010.

Área de concentração: Oncologia Experimental. Orientação: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho.

1. Chalcona. 2. Toxicidade. 3. Antineoplásicos. I. Título. CDD 615.1

Page 4: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE CHALCONA, 1-(4-

Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN VIVO

KRISTIANA CERQUEIRA MOUSINHO

Tese submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia

como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará. A citação de qualquer

trecho deste trabalho é permitida, desde que seja feita em conformidade com as

normas da ética científica.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Orientador)

Universidade Federal do Ceará – UFC

__________________________________________________ Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza (Co-Orientadora)

Universidade Federal de Pernambuco – UFPE

________________________________________________________ Profa. Dra. Caridad Noda Pérez

Universidade Estadual de Goiás – UEG

__________________________________________________ Profa. Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos Universidade Federal do Amazonas - UFAM

__________________________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves

Universidade Federal do Ceará - UFC

Page 5: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

À minha Vovó Nadege (in memorian),

Que não conseguiu esperar o término

Desta etapa da minha vida,

Mas sei que está feliz por isso em

Algum lugar da esfera espiritual,

Dedico este trabalho.

Page 6: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

“Tudo é do Pai, toda honra e toda glória, é Dele a vitória alcançada em minha vida,

tudo é do Pai se sou fraco e pecador, bem mais forte é o meu Senhor, que me cura

por Amor”.

Padre Fábio de Melo

Page 7: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

“Honra o teu médico por causa da necessidade,

Pois foi o Altíssimo quem o criou,

Porque toda a medicina provém de Deus,

A ciência do médico o eleva em honra;

Ele é admirado na presença dos grandes,

O Senhor fez a terra produzir os medicamentos,

O homem sensato não os despreza,

Uma espécie de madeira não adoçou o amargor da água?

Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens;

O Altíssimo deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas;

E dela se serve para acalmar as dores e curá-las;

O Farmacêutico faz misturas agradáveis;

Compõe ungüentos úteis a saúde;

E seu trabalho não terminará,

Até que a paz divina se estenda sobre a face da terra”.

Eclesiástico (38; 1-8)

Page 8: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Agradecimentos

O câncer é uma doença grave e assustadora. Receber um diagnóstico de câncer é

algo que ninguém consegue imaginar. Mas o que é ruim pode ser o início de uma mudança

boa. E quando o exemplo dado não combina com a natureza, surge o momento da definição. O

momento pede calma (quase que impossível) para olhar o que é preciso fazer adiante;

prudência, para perceber as mudanças e coragem para enfrentar os desafios. Para os

pacientes só resta recolher os cacos, organizar as idéias e simplesmente aceitar talvez a tarefa

mais intensa de uma existência.

Quando trabalhamos com pessoas que sofrem desse mal, passamos a tentar

compreender o que se tem por dentro de cada um. Agora eu vejo o imenso valor dos “Doutores

da Alegria”, fazer alguém sorrir onde se tem muitos motivos para chorar é DIVINO. Quando se

acredita, o belo surge e o verdadeiro permanece. O maior significado está nas pessoas e não

nas palavras.

Foi por isso que resolvi sair um pouco de cena (da área clínica) e estudar muito para

entender melhor o tratamento desses pacientes baseado nas substâncias antineoplásicas.

Tratamento esse que compromete a qualidade de vida das pessoas. E como todo pesquisador

dessa área passei a sonhar em testar substâncias que destruam o tumor e não o paciente, eis-

me aqui concluindo o meu doutorado.

Agradecer, neste momento, faz-se tão necessário quanto defender esta tese. As

pessoas passam pela nossa vida nos dando sempre alguma lição, até o que não se fazer com

os outros. Tudo é aprendizado.

Em primeiro lugar, como sempre em minha vida, agradeço a Deus, onipresente,

onisciente e indefinível. Agradeço pela vida, pelos ensinamentos constantes e principalmente

por ter desenhado a minha caminhada com perfeição, com o objetivo de me mostrar o real

valor do AMOR, da CARIDADE e da FÉ.

A minha Virgem Santíssima, por me colocar no colo sempre que preciso. Por

interceder junto a Jesus Cristo, por mim. E como mãe me consolar nos momentos de aflição.

Também por me fazer sentir que eu nunca estou só.

Aos meus pais Gabriel e Nádja, aos meus anjos da guarda terrenos, por terem

aceitado a missão de serem meus pais, e brilhantemente com ela, me ensinado valores

essenciais a vida: AMOR, CARINHO, RESPONSABILIDADE e CARÁTER. Por terem

acreditado na minha capacidade e sonhado comigo para que este dia chegasse. Agradeço a

Deus por vocês serem à base da minha sustentação. Amo vocês.

A minha Titia Nazaré, minha segunda mãe e outro anjo que Deus pôs em minha vida,

o meu sincero agradecimento. Por cuidar sempre de mim, sorrir e chorar comigo.

Aos meus irmãos Karinne e Diogo, amigos também, simplesmente uma parte de mim.

Obrigada por existirem e fazerem a minha vida mais feliz. Agradeço também aos meus

cunhados: Luciano e Julliany, pelos momentos de alegria vividos. As minhas sobrinhas Lívian

e Líris (Liloca e Preguinho), por despertarem em mim um sentimento inesplicável e deixarem

Page 9: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

meu coração transbordando de amor cada vez que as encontro, sem vocês o meu mundo seria

em preto e branco.

Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, pelo exemplo de competência e inteligência; por

ter me aceitado como orientanda e me recebido no LOE sem se quer saber quem eu era, com

uma importante acolhida que conforta, retira o medo e a ansiedade perante tudo o que é novo.

Por ser a pessoa mais prática que eu conheço, tornado tudo mais simples. Agradeço por

acreditar na minha capacidade intelectual, passando suas aulas para que eu pudesse ministrá-

las.

A Dra. Ivone Antônia de Souza, um exemplo de Mestre. Agradeço por tudo,

principalmente pelo apoio emocional que sempre tive na calmaria de sua voz e quando me

dizes: “Kristiana, no final tudo dá certo”. Sem você eu não estaria aqui. Faltam palavras para

dizer o que você representa na minha vida acadêmica.

A Dra. Letícia Lotufo, pelo carinho constante, apoio emocional e científico. Pelo

exemplo de profissional, equilíbrio e atenção mesmo a quem não eram seus orientandos,

mostrando sempre como se trabalhar em equipe.

A Dra. Claúdia Pessoa, pelo apoio, amizade e disponibilidades diárias. Pela

organização dos seminários do LOE, enriquecedores de conhecimentos.

A Dra. Raquel Montenegro, pela amizade, disponibilidade e ajuda neste trabalho, com

sugestões e orientações. Agradeço pela atenção nos momentos de desespero.

A Dra. Ana Paula Negreiros, pela ajuda nas análises das lâminas, disponibilidade e

carinho com que sempre me tratou.

Em especial aos amigos: Arinice, Gabriela, Hemerson, Igor (Boy do LOE) e

Washington Araújo, pela contribuição, paciência, aprendizado, disponibilidade e

companheirismo, que me compreenderam nos momentos de aflição e os quais têm méritos

junto a mim na realização desta tese.

Aos demais amigos do LOE: Adriana Carvalho (companheira das brincadeiras, dos

experimentos e até das baixarias), Aline, Aline Sbardeloto, Ana Jérsia, Assuero, Bruno

Cavalcante (pelos ensinamentos e contribuição nos experimentos), Bruninho (IC), Daisy (IC),

Danilão, Delano Marinho, Diego, Daniel, Elthon Goés (pelos experimentos do BrdU nos

finais de semana e feriados serem a maior descontração), Evelyne, Felipe, Gardênia,

Hidemburgo (comedor de pipocas, porque a culpa é da Coca-cola), Kézia, Miller, Patrícia

Marçal, Paula Abreu, Paula Jimenez, Paulo Michel, Rafael, Vanessa, Venúncia, pela

companhia, risadas e colaboração nessa tese.

Agradeço ainda a Silvana (Sil), Erivanda, D. Rogéria e D. Fátima por todo apoio no

que era necessário para a realização dos experimentos, pelas conversas “in off” altamente

reveladoras. A Flávia pelo imenso esforço em providenciar o material necessário para a

conclusão desta tese e pelas conversas diárias.

As minhas grandes amigas Adelânia, Sheyla e Gracinha, por todo o carinho, atenção

e amizade em todos os momentos que compartilhamos. Amizade daquelas que agente guarda

no coração.

Page 10: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Existem pessoas que foram imprescindíveis para a minha saúde física e psíquica nesta

tese, pessoas que sempre deram desde o apoio logístico ao emocional. Pessoas que

transpassam o limite da amizade e se tornam família, estrelas e não cometas, pérolas que

Deus coloca no nosso caminho para rir, chorar, aprender coisas que jamais aprenderíamos

sozinhos, fazer com que as batalhas sejam mais leves e curtas, são companheiros de toda

uma vida. Deus me deu esta bênção de norte ao sul deste país. São eles: Cecília (minha irmã

morena), José Roberto (caça e pesca Papicu, via Praia do Futuro, iieeiii), Vanesca, Cínthya e

Cia, Silvéria e Alexandre, Deisy e Roberto César (Letícia), Roberta e Otacílio (Limoeiro,

iiieeiii), Ana Carla e Júlio, Fabíola e Marne. Obrigada por vocês existirem.

Ao meu médico, Dr. Carlos Windson, por me atender sempre que precisei

principalmente nas mazelas pré-tese. Valeu pelas amostras grátis!

A toda a minha família e amigos que sempre torceram por mim.

As secretárias do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Aura Rhanes e

Márcia, pela dedicação com o que fazem e por me ajudar em tudo o que precisei.

Aos servidores Alana, Ana Paula, Íris, Chiquinho, agradeço as conversas,

cumplicidade e disponibilidade em sempre ajudar.

E por fim, a todos aqueles que padecem de algum tipo de câncer, onde a luta para se

obter a cura ou o alívio é uma constante, torna-se incansável e infinitamente dolorosa no corpo

e na alma. A Icla da Silva (in memorian), que me fez despertar a vontade de trabalhar nessa

área. A Iara da Silva e Ianara que me fizeram acreditar que a cura do câncer é possível. Ao

Ayrton Plácido (in memorian), Tia Yelda (in memorian), Tio Dilson Simões (in memorian),

Marcelinho (in memorian) e a todos os outros pacientes e amigos que padeceram dessa

doença e nos quais aprendi o valor da VIDA e do AMOR.

Enfim:

“O câncer pode roubar-lhe aquela alegre ignorância que um dia levou a acreditar que o

amanhã se estenderia para sempre. Cada dia é para ser vivido sabiamente”.

Heloísa Chiattone.

Page 11: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Este trabalho foi realizado com o auxílio das seguintes instituições:

Banco do Nordeste do Brasil - BNB

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP

Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa - FUNCAP

Instituto Claude Bernard - InCb

Page 12: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Índice

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Símbolos e Abreviaturas

Resumo

Abstract

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 29

1.1 O Câncer e sua formação................................................................................... 29

1 1.2 Incidência do Câncer.................................................................................... 31

1.3 O ciclo celular e o Câncer............................................................................. 33

2 1.4 Morte celular: Apoptose e Necrose................................................................ 36

1.5 Princípios da Quimioterapia Antineoplásica.................................................... 41

1.6 Chalconas.................................................................................................... 46

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA............................................................................... 52

3 OBJETIVOS................................................................................................................. 54

3.1 Geral................................................................................................................... 54

3.2 Específicos................................................................................................. 54

4 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................... 57

4.1 Materiais utilizados.....................................................................................

57

4.1.1 Equipamentos........................................................................................ 57

4.1.2 Reagentes, Soluções e Fármacos........................................................... 58

4.2 Células................................................................................................................ 64

4.2.1 Manutenção das células em cultura.......................................................... 65

4.2.2 Obtenção de células PBMC.................................................................... 66

4.3 Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos................................ 66

4.4 Animais.............................................................................................................. 67

4.5 Procedimento experimental........................................................................... 67

Page 13: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

4.5.1 Obtenção da Chalcona............................................................................ 67

4.5.2 Estudo da atividade citotóxica...............................................................

4.5.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais...................................

68 79

4.5.2.1.1 Princípio do teste.......................................................................... 69

4.5.2.1.2 Procedimento experimental................................................................ 69

4.5.2.1.3 Análise dos dados........................................................................ 70

4.5.2.2 Ensaio de citotoxicidade em células normais.................................... 70

4.5.2.2.1 Princípio do teste................................................................................ 70

4.5.2.2.2 Procedimento experimental................................................................ 70

4.5.2.2.3 Análise dos dados.............................................................................. 71

4.5.2.3 Determinação da Atividade Hemolítica............................................... 71

4.5.2.3.1 Princípio do Teste.............................................................................. 71

4.5.2.3.2 Procedimento experimental................................................................ 71

4.5.2.3.3 Análise dos dados.............................................................................. 72

4.5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60 (leucemia

promielocítica)...............................................................................................................

72

4.5.3.1 Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan (Curva)............................................................................................................................

72

4.5.3.1.1 Princípio do Teste......................................................................... 72

4.5.3.1.2 Procedimento Experimental........................................................... 72

4.5.3.1.3 Análise dos dados........................................................................ 73

4.5.3.2 Teste da Acridina- Coloração diferencial por BE/LA.......................... 73

4.5.3.2.1 Princípio do Teste......................................................................... 73

4.5.3.2.2 Procedimento Experimental........................................................... 74

4.5.3.2.3 Análise dos dados........................................................................ 74

4.5.3.3 Teste do BrdU- Inibição da síntese de DNA – Ensaio do BrdU........... 74

4.5.3.3.1 Princípio do Teste.......................................................................... 74

4.5.3.3.2 Procedimento Experimental............................................................ 75

4.5.3.3.3 Análise dos dados......................................................................... 75

4.5.3.4 Teste da Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-

Page 14: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Giemsa............................................................................................................................

4.5.3.4.1 Princípio do teste....................................................................................

4.5.3.4.2 Procedimento experimental....................................................................

75 75 76

4.5.3.4.3 Análise dos dados.................................................................................. 76

4.5.3.5 Determinação da Integridade de membrana- viabilidade celular......... 76

4.5.3.5.1 Princípio do teste.................................................................................... 76

4.5.3.5.2 Procedimento experimental.................................................................... 76

4.5.3.5.3 Análise dos dados.................................................................................. 77

4.5.3.6 Análise do ciclo celular............................................................................ 77

4.5.3.6.1 Princípio do Teste.................................................................................. 77

4.5.3.6.2 Procedimento experimental.................................................................... 78

4.5.3.6.3 Análise dos dados.................................................................................. 78

4.5.3.7 Ensaio da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V.................... 78

4.5.3.7.1 Princípio do teste.................................................................................... 78

4.5.3.7. 2 Procedimento experimental.............................................................. 79

4.5.3.7.3 Análise dos dados................................................................................. 79

4.5.3.8 Determinação da ativação das caspases- 3 e 7...................................... 79

4.5.3.8.1 Princípio do teste.............................................................................. 79

4.5.3.8.2 Procedimento Experimental............................................................... 80

4.5.3.8.3 Análise dos dados............................................................................ 80

4.5.3.9 Determinação da ativação da caspase-8............................................... 80

4.5.3.9.1 Princípio do teste.............................................................................. 80

4.5.3.9.2 Procedimento Experimental.............................................................. 81

4.5.3.9.3 Análise dos dados........................................................................... 81

4.5.3.10 Determinação da ativação da caspase-9.............................................. 81

4.5.3.10.1 Princípio do teste........................................................................... 81

4.5.3.10.2 Procedimento Experimental............................................................ 82

4.5.3.10.3 Análise dos dados......................................................................... 82

4.5.3.11 Ensaio do Western blot (Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -

9).....................................................................................................................................

82

Page 15: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

4.5.3.11.1 Princípio do teste........................................................................

82

4.5.3.11.2 Procedimento Experimental......................................................... 83

4.5.3.11.2.1 Extração de Proteínas................................................................ 83

4.5.3.11.2.2 Quantificação de Proteínas........................................................ 83

4.5.3.11.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida......................................... 84

4.5.3.11.2.4 Eletrotransferência..................................................................... 84

4.5.3.11.2.5 Imunodetecção.......................................................................... 84

4.5.3.11.2.6 Análise dos dados..................................................................... 85

4.5.4 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica ........................................ 85

4.5.4.1 Ensaio de genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do

cometa............................................................................................................................

85

4.5.4.1.1 Princípio do teste........................................................................... 85

4.5.4.1.2 Procedimento experimental............................................................ 86

4.5.4.1.3 Análise dos dados......................................................................... 86

4.5.4.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em linfócitos

humanos – Teste do micronúcleo in vitro.................................................................

87

4.5.4.2.1 Princípio do teste........................................................................... 87

4.5.4.2.2 Procedimento experimental............................................................. 88

4.5.4.2.3 Análise dos dados......................................................................... 88

4.5.5 Avaliação da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados

com tumor Sarcoma 180...............................................................................................

89

4.5.5.1 Princípio do teste.............................................................................. 89

4.5.5.2 Procedimento experimental................................................................... 90

4.5.5.3 Análise dos dados............................................................................. 91

4.5.5.4 Parâmetros toxicológicos avaliados.................................................. 91

4.5.5.4.1 Avaliação dos parâmetros bioquímicos....................................... 91

4.5.5.4.2 Princípio do teste.........................................................................

4.5.5.4.3 Procedimento experimental...............................................................

91 92

Page 16: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

4.5.5.4.4 Análise dos dados.................................................................................. 92

4.5.5.4.2 Avaliação dos parâmetros hematológicos....................................... 93

4.5.5.4.2.1 Princípio do teste.......................................................................... 93

4.5.5.4.2.2 Procedimento experimental............................................................ 93

4.5.5.4.2.3 Análise dos dados........................................................................ 93

4.5.5.5 Análise histopatológica....................................................................... 93

4.5.5.5.1 Princípio do teste.............................................................................. 93

4.5.5.5.2 Procedimento experimental................................................................ 94

4.5.5.5.3 Análise dos dados............................................................................ 94

5 RESULTADOS............................................................................................................ 96

5.1 Estudo da atividade citotóxica..................................................................... 96

5.1.1 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células tumorais humanas....... 96

5.1.2 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células normais humanas

(PBMC)............................................................................................................................

97

5.2 Atividade hemolítica.................................................................................... 98

5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxica em células HL-60....................... 99

5.3.1 Determinação da viabilidade celular por exclusão do azul de Tripan.......... 99

5.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio............. 100

5.3.3 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU.............. 101

5.3.4 Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa...................................... 103

5.3.5 Análises da citometria de fluxo............................................................... 104

5.3.5.1 Integridade de membrana celular e concentração de células.................. 104

5.3.5.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA............................... 105

5.3.5.3 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V..............

5.3.5.4 Detecção da ativação de Caspases Efetoras – 3 e 7...............................

108 110

5.3.5.5 Detecção da ativação de Caspases Iniciadoras -8/-9............................... 111

5.3.5.6 Detecção do Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -9 pelo método do

Western blot....................................................................................................................

115

5.3.6 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica........................................ 116

Page 17: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

5.3.6.1 Avaliação da genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do

cometa............................................................................................................................

116

5.3.6.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade – Teste do

micronúcleo in vitro......................................................................................................

117

5.3.7 Estudo in vivo............................................................................................. 118

5.3.7.1 Estudo da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados

com Sarcoma 180...........................................................................................................

118

5.3.7.2 Avaliação dos aspectos toxicológicos nos órgãos dos

camundongos transplantados com Sarcoma 180......................................................

120

5.3.7.2 Análise bioquímica e hematológica dos camundongos saudáveis

ou transplantados com Sarcoma 180..........................................................................

127

6 DISCUSSÃO............................................................................................................... 134

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................ 151

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………..…………………..………….…... 153

ANEXO 1- Aprovação do Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos

(COMEPE).......................................................................................................................

168

ANEXO 2- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA)....................... 169

Page 18: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fluxograma mostrando um esquema simplificado da base molecular do câncer......................................................................................................................................

31

Figura 2: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira........................................................................................

32

Figura 3: Esquema das fases do ciclo celular........................................................................ 34

Figura 4: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular............................................... 36

Figura 5: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia........................................................................................................................

37

Figura 6: Esquema demonstrando as principais vias de ativação da apoptose, suas interconexões e as alterações morfológicas mais características..........................................

40

Figura 7: Distribuição da origem dos medicamentos antineoplásicos que estão no mercado nos últimos 25 anos.................................................................................................

43

Figura 8: Estrutura química da vimblastina, da vincristina, da vindesina e da vinorelbina...............................................................................................................................

44

Figura 9: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel....................................................... 45

Figura 10: Núcleo fundamental das chalconas...................................................................... 46

Figura 11: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do derivado de chalcona, (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona..................................................................................................................................

49

Figura 12: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt* entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo......................................................................................................................................

68

Figura 13: Representação dos tipos de cometas corados com prata e visualizados em microscópio óptico, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de acordo com o dano. a) tipos 0 (verde) e 1 (amarelo); b) tipos 2 (vermelho) e 3 (azul); c) tipo 4...............................................................................................................................................

87

Figura 14: Representação da formação de micronúcleos a partir de um fragmento cromossômico acêntrico e cromossomo inteiro em uma célula binucleada pelo uso de Citocalasina B..........................................................................................................................

89

Figura 15: Curva de crescimento em células leucêmicas humanas (HL-60), tratadas com o composto CG nas concentrações 0,04 µM; 0,2 µM; 0,4 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A viabilidade das células leucêmicas foi determinada por exclusão de azul de tripan em 3, 6, 12 e 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), * p< 0,05; ** p<0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls........................................................................................................................................

100

Figura 16: Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose) avaliado em células leucêmicas humanas (HL-60), tratada com o composto CG nas concentrações 1,0 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A análise foi realizada após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a

Page 19: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (DOX). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), **p< 0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls........................................................................................................................

101

Figura 17: Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 horas de incubação. As células foram tratadas com o composto CG nas concentrações 1,0 µM e 2,0 µM. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2), *p< 0,05 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.......................................................................................................................................

102

Figura 18: Fotomicrografias das lâminas das células de HL-60, tratadas e não tratadas, após 24 horas de incubação com a doxorrubicina e CG. A- Controle negativo (DMSO), B- tratadas com Doxorrubicina (0,5 µM), C- 1,0 µM e D- 2,0 µM. A contagem foi realizada através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), células com núcleos de coloração marrom. O aumento foi de 400X.............................................................................................

102

Figura 19: Fotomicrografias das células de HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com a CG e coradas com May-Grunwald-Giemsa. O aumento foi de 400X. A- Controle negativo, B- doxorrubicina a 0,5 µM, C- 1,0 µM (CG), D- 2,0 µM (CG) e E- 4,0 µM (CG). As setas pretas indicam redução de volume celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos “blebs”.....................................................................................................................................

103

Figura 20: A- Avaliação da integridade de membrana plasmática e B- Avaliação do número de células viáveis, analisados por citometria de fluxo. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM e com o controle doxorrubicina a 0,5 µM. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................

105

Figura 21: Efeito da CG no ciclo celular após 24 h de incubação. Os histogramas do ciclo celular foram analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células de HL-60, determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A- Controle negativo; B- Doxorrubicina (0,5 µM); C, D e E- CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM............................................................................................

108

Figura 22: A- Determinação da fragmentação do DNA; B- Análise do efeito sobre o ciclo celular. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, após 24 h de incubação e analisados por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. (C-) representa o controle negativo; (DOX) controle positivo com Doxorrubicina (0,5 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................

107

Figura 23: Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-60. No histograma (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Gráfico (B): % de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão

Page 20: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

5.0........................................................................................................................................... 109

Figura 24: Análise da detecção das Caspases Efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................

110

Figura 25: Histograma referente ao teste das Caspases Efetoras 3 e 7. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................

111

Figura 26: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 8, por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................

112

Figura 27: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 8. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................

113

Figura 28: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 9, por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...............................................................................................................................

114

Figura 29: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 9. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0...........................................................................................................................................

114

Figura 30: Expressão das procaspase e caspase-9, citocromo c em células de HL-60, controle e tratadas com 1,0 e 2,0 µM, durante 12 e 24h, avaliada por Western

Page 21: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

blot......................................................................................................................... 115

Figura 31: Freqüência de dano ao DNA. O derivado de chalcona (CG) nas concentrações

de 1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de

incubação. C-: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois

experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA

seguido pelo teste Student Newman-Keuls..............................................................

116

Figura 32: Índice de dano ao DNA. A substância CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM

sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle

negativo. Os valores foram obtidos pela multiplicação do número de células de classe de

dano, variando de 0 (sem dano) a 400 (dano máximo). Os dados correspondem à média ±

EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle

negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-

Keuls.......................................................................................................................................

117

Figura 33: Micronúcleo por 2000 células binucleadas. A substância CG nas

concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do micronúcleo após

24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de

dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por

ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls..............................................................

118

Figura 34: Fotomicrografia do tumor Sarcoma 180 transplantados em camundongos e

percentual de inibição tumoral dos animais submetidos ao protocolo de avaliação da

atividade antitumoral. A substância CG foi testada nas concentrações 25 mg/Kg e 50

mg/Kg; 5-FU, 25 mg/Kg, controle positivo . Controle negativo (DMSO 10%). Os dados

correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001),

comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-

Keuls.......................................................................................................................................

119

Figura 35: Fotomicrografia do tumor Sarcoma 180 transplantados em camundongos. O

controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os

animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG

(50 mg/Kg). Aumento de 400X...............................................................

120

Figura 36: Diferença de peso corpóreo dos camundongos com Sarcoma 180, em gramas.

Os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais, **p<0,00, quando

comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise

da variância) seguido por Student Newman-Keuls...................................................

121

Figura 37: Fotomicrografia dos fígados de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X........................................................................................................................................

123

Figura 38: Fotomicrografia dos baços de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a

Page 22: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X e 400X........................................................................................................................................

124

Figura 39: Fotomicrografia dos rins de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg,B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X...............................................................

125

Figura 40: Fotomicrografia dos estômagos de camundongos transplantados com o tumor

Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a

droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com CG (25 mg/Kg, C e D) e (E e F) CG

(50 mg/Kg). Aumento de 100X.....................................................................................

126

Figura 41: Resumo dos resultados dos estudos de avaliação da atividade citotóxica e antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG)........................................................................................................................................

131

Figura 42: Resumo dos resultados dos estudos genotóxico/mutagênico, antitumoral e toxicológica da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG)........................................................................................................................................

132

Page 23: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Exemplos de alguns flavonóides e suas fontes........................................ 47

Tabela 2 - Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e antitumoral..................................................................................................................

65

Tabela 3: Atividade citotóxica da CG frente às linhagens tumorais. Células

humanas de leucemias (HL-60, K562), carcinoma de cólon (HCT-8), glioblastoma

(SF-295) e carcinoma de mama (MDA-MB-435). A Doxorrubicina foi usada como

controle positivo.........................................................................................................

97

Tabela 4: Atividade citotóxica da CG frente à linhagem normal obtida de cultura primária (PBMC) após 24, 48 e 72 horas de incubação............................................

98

Tabela 5: Avaliação do potencial hemolítico da CG frente a eritrócitos de

camundongos Swiss (Mus musculus)........................................................................

98

Tabela 6: Efeito da CG sobre a massa corpórea e a massa úmida dos órgãos (fígado, baço, rins e estômago) de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180..............................................................................................................

121

Tabela 7: Efeito da CG sobre os parâmetros bioquímicos (aspartato

aminotransferase - AST, alanina aminotransferase – ALT, uréia e creatinina) de

sangue periférico de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor

Sarcoma 180..............................................................................................................

128

Tabela 8: Efeito da CG e 5-fluorouracil (5-FU) sobre os parâmetros hematológicos

(hemoglobina, plaquetas e leucócitos) de sangue periférico de camundongos

saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.........................................

130

Page 24: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

5-FU

Dox

CG

5-Fluorouracil

Doxorrubicina

1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona

ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase

ANOVA Analisys of Variance (Análise de variância)

CI50 Concentração inibitória mínima

CO2

PBMC

Dióxido de carbono

Células mononucleares do sangue periférico

BrdU Bromodeoxiuridina

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

E.P.M. Erro padrão da média

IC Intervalo de confiança

IM Índice de mutagenicidade

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)

TBS Tris buffer solution (Tampão tris)

US-NCI United States National Cancer Institute (Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos)

UI

COMEPE

CEPA

Unidades internacionais

Comitê de Ética em Pesquisas Humanas

Comitê de Ética em Pesquisa Animal

Page 25: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Resumo

Page 26: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO DE CHALCONA, 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, IN VITRO E IN VIVO. Kristiana Cerqueira Mousinho. Orientador: Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho. Co-orientadora: Dra. Ivone Antônia de Souza. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2010.

A substância 1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona (CG) é um derivado de chalcona, sintetizado a partir da reação química entre a acetofenona e para-nitro benzaldeído. Para avaliar o seu potencial anticâncer foi realizado um estudo farmacológico de suas propriedades antitumorais em vários modelos biológicos in vitro e in vivo. A CG apresentou potente atividade citotóxica nas 5 linhagens tumorais testadas, inibindo a proliferação das células tumorais pelo ensaio do MTT e em células mononucleares do sangue periférico (PMCB) humano através do ensaio do Alamar blue. Todas as linhagens mostraram sensibilidade ao tratamento com a CG, e a CI50 variou de 1,18µM em HCT-8 a 3,32µM em SF-295. O composto apresentou fraca citotoxicidade (CI50 igual a 7,07µM) nas células PBMC, com exposição a CG em 72h, em relação às células de HL-60, utilizada como modelo nos demais testes biológicos. O tempo de encubação com o composto foi de 24h na maioria dos experimentos. Adicionalmente, a CG não induziu efeitos hemolíticos. O ensaio de exclusão por azul de Tripan revelou diminuição da viabilidade celular principalmente após 24h na maior concentração testada (4µM) com 58,4%. Para os testes de atividade antiproliferativa, LA/BE mostrou em sua morfologia células em apoptose nas duas maiores concentrações, enquanto que o BrdU, apresentou incorporação do mesmo nas concentrações testadas. A morfologia analisada por May-Grunwald-Giemsa mostrou redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear. Adicionalmente, a CG induziu apoptose em células leucêmicas HL-60, com participação das vias intrínseca e maior estímulo da via extrínseca, de maneira concentração-dependente, como observado na integridade da membrana citoplasmática, aumento da fragmentação do DNA e externalização da fosfatidilserina. Na análise do ciclo celular, foi observado parada na fase G2/M, sendo ativada as caspases 3, 7, 8 e 9 (a última na maior concentração e confirmada pelo teste do Western blot). Não houve ativação do Citocromo c. A CG não foi capaz de induzir processos genotóxicos/ mutagênicos (testes do cometa e micronúcleo in vitro). No ensaio de atividade antitumoral in vivo, observou-se inibição tumoral nas doses testadas (25 e 50mg/Kg/dia, via oral) de 54,85 e 69,11% respectivamente. As doses de CG causaram tumefação celular e o surgimento de focos inflamatórios no parênquima ou estroma hepático/renal, necrose nefrotóxica focal, esteatose microvesicular, pigmentos de hemossiderina, hiperplasia das células de Kupffer, congestão da polpa vermelha e desorganização dos folículos linfóides esplênicos. Além disso, os índices bioquímicos mostraram aumento do AST e diminuição da uréia (CG 25mg/Kg/dia), diminuição do ALT (5-FU e CG 25mg/Kg/dia); as alterações hematológicas mostraram leucopenia e plaquetopenia (5-FU), aumento dos leucócitos totais (CG 50mg/Kg/dia), aumento de neutrófilos e linfócitos em todos os grupos tratados. Todos os resultados nos levam a enfatizar que a CG possui grande potencialidade como molécula promissora por suas propriedades anticâncer. Palavras chave: Chalcona, citotoxicidade, mecanismo de ação, toxicidade, antitumoral.

Page 27: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Abstract

Page 28: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

IN VITRO AND IN VIVO STUDY OF THE ANTICANCER POTENTIAL OF A CHALCONA DERIVED SUBSTANCE, 1- (4-Nitrofenil)-3- fenilprop-2- en-1-ona. Kristiana Cerqueira Mousinho. Advisor: Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho. Co-advisor: Dra. Ivone Antônia de Souza. Doctorate Thesis. Graduate Program on Pharmacology. Departamento f Phisyology and Pharmacology, UFC, 2010.

The substance 1- (4-Nitrofenil)-3- fenilprop-2- en-1-ona (CG) is a chalcone derivative, synthesized from a chemical reaction between acetophenone and p-nitro benzaldehyde. To evaluate its anticancer potential a pharmacological study of its antitumor properties in selected biological models in vitro e in vivo. CG presented a powerful cytotoxic activity in the 5 tested tumor lines evaluated, inhibiting cell proliferation of the tumor lines in the MTT assay and human peripheral mononuclear blood cells (PMBC) through the Alamar Blue assay. All cell lines showed sensitivity to the treatment with the CG, and the IC50 varied from 1,18 µM in HCT-8 to 3,32 µM in SF-295. The sample presented weak cytotoxic effect (IC50 of 7,07 µM) in cells PMBC, with 72h exposure to CG, compared to HL-60 cells (leukemic cell line), used in the next biological tests. The sample was incubated with the cells during 24h for the majority of the experiments. Additionally, CG did not induce hemolytic effects. The Tripan Blue assay showed a decrease of the cellular viability especially after 24h of incubation of the higher tested concentration (4 µM) with 58,4%. In assays for antiproliferative activity, OA/BE showed in its morphology cells going under apoptosis in the two higher concentrations, whereas the BrdU assay, presented incorporation of the same in the tested concentrations. The morphology analyzed with the May-Grunwald-Giemsa stain showed a decrease of the cellular volume, chromatin condensation and nuclear fragmentation.CG induced apoptosis in HL-60 cells, with participation of the intrinsic pathway and major stimulation of the extrinsic pathway, in a concentration-dependent manner, as observed in the cytoplasmatic membrane integrity, increase of DNA fragmentation and outsourcing of phosphatidylserine. In the cellular cycle analysis, it was observed a stop in the G2/M phase, activating caspases 3, 7, 8 and 9 (the last one in the highest concentration and confirmed by the Western blot assay). It was not observed activation of Cytochrome c. CG was not capable to induce mutagenic/genotoxic processes (comet assay and micronucleus in vitro). In the in vivo antitumor activity assay, tumor inhibition was observed in the tested doses (25 and 50mg/Kg/day, oral intake) of 54,85 and 69,11%, respectively . The doses of CG caused cellular swelling and the arise of inflammatory focus in the parenchyma or hepatic/renal stroma, focal nephrotoxic necrosis, microvesicular steatosis, hemosiderin pigments, hyperplasia of Kupffer cells, congestion of the red pulp and disorganization of the splenic lymphoid follicles. Furthermore, the biochemical indices had shown increase of AST and reduction of urea (25mg/Kg/day of CG), reduction of ALT (25mg/Kg/day of 5-FU and CG); hematologic alterations showed leukopenia and thrombocytopenia (5-FU), increase of total leukocytes (50mg/Kg/day of CG), increase of neutrophils and lymphocytes in all treated groups. All results led us to emphasize that CG possesses great potential as a promising molecule for its anticancer properties.

Keywords: Chalcones, cytotoxicity, mechanism of action, toxicity, antitumor.

Page 29: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Introdução

Page 30: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

30

1 INTRODUÇÃO

1.1 O Câncer e sua formação

O termo câncer vem do latim “cancer”, que significa “carangueijo”, no qual deve

ter sido empregado em analogia entre a morfologia do crustáceo e ao modo de

crescimento infiltrante do tumor (DE ALMEIDA, 2005). Representa um conjunto de

mais de 100 doenças e é definido como enfermidades complexas de caráter

mutacional, proliferativo, de crescimento celular aberrante e descontrolado, em que

células em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e órgãos adjacentes,

podendo migrar para regiões distantes do organismo, evento este conhecido como

metástase (KUMAR et al., 2004; INCA, 2010).

As células do câncer possuem defeitos nos mecanismos que governam a

proliferação normal. Entre as características do tumor maligno estão à auto-suficiência

da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do crescimento,

inibição da morte celular não seguida de autólise (apoptose), potencial replicativo

ilimitado, angiogênese, poder de invasão e capacidade de metastatizar-se (HANAHAN

& WEINGER, 2000).

A célula neoplásica passa a ser considerada nesta condição quando ela

adquire vantagens metabólicas e capacidades biológicas quando comparadas às

células não transformadas: a) perda do controle da proliferação e divisão celular; b)

imortalização celular devido à ativação da enzima telomerase; c) alterações

cromossômicas (de forma e número); d) perda das propriedades adesivas da

membrana plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por

contato do movimento e crescimento celular; e) perda de função e da capacidade de

diferenciação ou especialização; f) capacidade para invadir tecidos vizinhos ou

distantes e formar metástases; g) capacidade de induzir a formação de novos vasos

sangüíneos (angiogênese). Observa-se, no entanto, que todos os casos de câncer

estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos, no controle positivo

e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA & KOHN, 2001;

RIBEIRO et al., 2003).

A formação do câncer dá-se pelo processo denominado carcinogênese,

geralmente ocorre lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula

cancerosa origine um tumor detectável (Figura 1). Esse processo passa por vários

estágios até de chegar à formação tumoral: são os de iniciação, promoção e de

Page 31: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

31

progressão (SPANDIDOS, 1985; CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &

JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; SPANDIDOS, 2007).

O primeiro estágio da carcinogênese é o da iniciação. As células sofrem o

efeito de um agente carcinogênico, também chamado de agente oncoiniciador, que

provoca modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células encontram-se

geneticamente alteradas, mas ainda não é possível se detectar um tumor

clinicamente. Como exemplo de substâncias químicas carcinógenas tem sido descrito

o sulfato de dimetila, metilnitrossuréia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosamina

e benzopireno, entre outros agentes não químicos, como: exposição por vírus, hepatite

B, HTLV, HPV, radiação ionizante (CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &

JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006).

Na fase seguinte, denominada de promoção, as células geneticamente

alteradas (iniciadas) sofrem um efeito prolongado dos agentes oncopromotores,

induzindo a expressão de proto-oncogenes. A célula iniciada é transformada em célula

maligna, de forma lenta e gradual. A suspensão do contato com o agente muitas vezes

interrompe o processo nesse estágio. Sendo assim, a promoção pode compreender

pelo menos dois mecanismos independentes: a ativação gênica e a atividade mitótica

(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; KLAUNING & KAMENDULIS,

2008).

O terceiro e último estágio é o da progressão e caracteriza-se pela

multiplicação descontrolada, sendo um processo irreversível. O tumor maligno já está

em fase de desenvolvimento no microambiente favorável, evoluindo até o surgimento

das primeiras manifestações clínicas da doença. Os fatores que promovem a iniciação

ou progressão da carcinogênese são chamados de carcinógenos. Existe um grande

número de agentes que causam lesão e induzem a transformação neoplásica das

células, são eles: os carcinógenos químicos, energia radioativa, vírus oncogênicos e

alguns agentes microbianos. O fumo, por exemplo, é um agente carcinógeno

completo, pois possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese.

(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006;

SPANDIDOS, 2007).

A classificação do câncer é feita de acordo com o tipo de célula que o originou,

baseada no componente parenquimatoso, e não de acordo com os tecidos para os

quais se espalhou. Pode-se chamar de classificação primária (KATZUNG, 2003;

KUMMAR et al., 2004).

Page 32: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

32

A série de anormalidades metabólicas decorrentes do câncer, bem como os

processos invasivos e metastáticos, provoca doença e morte eventual do paciente, a

não ser que a neoplasia maligna possa ser erradicada com o tratamento (KATZUNG,

2003; BEZERRA, 2008b).

Agentes adquiridos

(ambientais) que lesão o DNA:

Químicos, radiação, vírus

Incapacidade de recuperação DNA

Mutações hereditárias em:

Genes que afetam a

recuperação do DNA;

Genes que afetam o

crescimento celular ou

apoptose.

Célula Normal

Reparo do DNA

Bem -sucedido

Lesão do DNA

Mutações no genoma das células

somáticas

Ativação dos oncogenes

promotores do crescimento

Inativação do gene supressor

de tumor

Alterações nos genes que

regulam a apoptose

Proliferação celular desreguladaDiminuição da apoptose

Expansão clonal

Angiogênese

Escapa da imunidade Mutações adicionais

Progressão do tumor

Neoplasia malignaInvasão e Metástase

Figura 1: Fluxograma mostrando um esquema simplificado da base molecular do câncer (Adaptado de KUMMAR et al., 2004).

1.2 Incidência do Câncer

As principais observações relativas à causa do câncer podem ser observadas

pelos estudos epidemiológicos existentes, que relacionam a um ambiente particular, a

hereditariedade e influências culturais com a ocorrência de tumores malignos.

Algumas doenças que se mostrem associadas com um risco maior de desenvolver o

Page 33: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

33

câncer, podem fornecer dados sobre a patogênese da malignidade (KUMAR et al.,

2004).

Desde 2003 o câncer tem sido a segunda causa de morte por doença, atrás

apenas de mortes relacionadas a doenças cardiovasculares, com uma incidência

anual estimada em 6 milhões de casos (SRIVASTAVA et al., 2005). O câncer

atemoriza a sociedade atual por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor,

sendo responsável por 25 % das mortes. Acredita-se que até 2020 mais 20 milhões de

novos casos irão surgir (ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2010).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 apontam que ocorrerá um total de

489.270 novos casos de câncer, sendo 236.240 casos para o sexo masculino e

253.030 para o sexo feminino e serão válidas para o ano de 2011. Estima-se que o

câncer de pele do tipo não melanoma (114.000 novos casos) será o mais incidente na

população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (52.000), mama feminina

(49.000), cólon e reto (28.000), pulmão (28.000), estômago (21.000) e colo do útero

(18.000) (Figura 2) (INCA, 2010).

Alguns fatores estão associados ao desenvolvimento de alguns tipos de

câncer, entre eles os geográficos e ambientais, idade, sexo, hábitos de vida,

predisposição genética ao câncer, condições predisponentes não hereditárias, como

inflamação crônica e condições pré-cancerosas (KUMAR et al., 2004).

Figura 2: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira (Fonte: INCA, 2010).

Page 34: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

34

1.3 O Ciclo celular e o Câncer A célula surge quando ocorre a fusão ou divisão de duas células. Esse

processo dinâmico celular, que ocorre de forma ordenada, pode ser mais bem

avaliado através do curso de vida desta célula. Esses eventos se iniciam por ocasião

de um processo de replicação, que envolve um período de crescimento seguido pela

divisão, sendo denominado de ciclo celular (ALMEIDA et al., 2005).

O ciclo celular é utilizado para controlar o crescimento e a divisão celular,

portanto trata-se de um processo evolutivo e ao mesmo tempo conservativo da célula.

A estimulação para o crescimento inicia-se com a liberação de fatores, que se ligam

aos receptores de membrana da célula e desencadeiam uma cascata de proteínas

transdutoras de sinal. Em G0 o DNA apresenta-se enovelado, com atividade nuclear

baixa. Existem duas fases de intervalo chamadas de G1 e G2, em que ocorre a síntese

de RNA e de proteínas; uma fase S, onde acontece à formação e replicação do DNA,

e uma fase denominada M, onde a célula executa o processo de divisão em duas

células filhas, conhecida como mitose (CRECZYNSKI-PASA; PEDROSA, 2001;

FOSTER, 2008).

A regulação do ciclo celular é feita por sinais extracelulares como fatores de

crescimento e disponibilidade de nutrientes. Na fase G0 ou que está em quiescência, a

célula nessa fase não está se replicando. Quando as células passam para a fase G1,

ocorre a preparação da célula para a multiplicação, com a produção de fatores de

crescimento celulares que são essenciais para a formação da nova célula. Na fase S

ocorre a preparação para a síntese de DNA. Em seguida a célula entra na fase G2,

onde há a síntese de componentes para a mitose (divisão celular com manutenção do

número de cromossomos específico da espécie), como a produção do fuso mitótico

que é feita na fase M. Após o evento da divisão do material nuclear, há um outro

evento chamado citocinese (que é a separação da célula mãe, formando duas células

filhas com suas organelas e constituintes celulares), finalizando o ciclo de replicação

celular (Figura 3) (FOSTER, 2008).

Page 35: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

35

Figura 3: Esquema das fases do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et al., 2003.

Todo esse processo requer um intenso controle por retroalimentação com o

objetivo de assegurar que todas as etapas moleculares sejam seqüenciais e

orientadas corretamente. Essa progressão ordenada através das diversas fases do

ciclo é orquestrada pelas ciclinas, quinases ciclina-dependentes (CDK’s) e por seus

inibidores (FISCHER et al., 2004; KUMAR et al., 2004).

Cada fase do ciclo possui os chamados checkpoints, que podem levar a parada

da progressão do ciclo celular e a ativação de mecanismos de reparo (Figura

4)(MALUMBRES et al., 2007). As células vão para a fase seguinte do ciclo celular, de

forma irreversível, se passar pelos checkpoints. O dano ao DNA e/ou mal

funcionamento de organelas e estruturas (falha no fuso mitótico) pode ativar a parada

do ciclo e a célula pode entrar em morte celular, caso o dano não seja reparado

(FOSTER, 2008). Os pontos de checagem da integridade do DNA operam através do

ciclo, especialmente na transição G1 –S, durante e depois da fase de síntese do DNA,

e antes das células entrarem em mitose (G2 - M) (FISCHER et al., 2004).

Nas células tumorais, os checkpoints são freqüentemente ignorados,

resultando em instabilidade genética e conseqüente vantagem proliferativa de células

cancerosas, quando comparadas com as células normais (FISCHER et al., 2004).

As ciclinas são proteínas chaves do ciclo celular, que em conjunto com as

quinases dependentes de ciclina (CDKs), formam o complexo ciclina-CDK que

coordena a progressão do ciclo (MALUMBRES et al., 2007). Este complexo é

composto por uma subunidade reguladora (ciclina) e uma catalítica (CDK)

(BETTENCOURT-DIAS et al., 2004). A atividade das ciclinas é modulada por

Page 36: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

36

modificações nos seus níveis de expressão de RNAm, quanto nos níveis de proteínas.

Assim as ciclinas são produzidas em cada uma das fases do ciclo (FOSTER, 2008).

A proteína do retinoblastoma, pRb, controla a expressão de genes que

comprometem as ciclinas que estão no checkpoint na interseção G1-S. No início de G1,

ela está hipofosforilada, o que reprime o avanço do ciclo celular, porque impede a

atividade do fator de transcrição E2F. Próximo ao ponto de restrição, os pontos de

restrição, os complexos ciclina D – CDK4 e 6 e o complexo ciclina E – CDK2,

hiperfosforila pRb, liberando E2F, promovendo desta forma a entrada em S (ALMEIDA

et al., 2005). Quando ocorre mutação no gene pRB, o ciclo celular fica desregulado, e

mesmo que a célula não esteja preparada para entrar em S ou tenha ocorrido erros, o

ciclo progride (MADDIKA et al., 2007). Isto porque o gene pRb é reconhecido como

supressor tumoral, pois é capaz de parar o ciclo celular, caso erros sejam detectados.

Por isso, mutações no pRB são freqüentemente encontradas em tumores (ALMEIDA

et al., 2005).

As células tumorais mostram uma perda no controle da proliferação celular

(ponto de restrição) e, muitas vezes, tornam-se independentes de sinais mitogênicos

para a sua progressão através das diferentes fases do ciclo celular (HANAHAN &

WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002). A perda do controle da proliferação celular

envolve mutações em genes reguladores do ciclo celular, os proto-oncogenes e genes

supressores tumorais, o que caracteriza o câncer como uma doença genética (LOURO

et al., 2002; FOSTER, 2008). Dessa forma, as alterações nos mecanismos de

regulação do ciclo celular tornam a célula apta a passar pelo ciclo celular sem a devida

checagem e, portanto fazendo com que esta acumule uma série de mutações que

contribuem para o surgimento das características malignas do tumor, como auto-

suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos inibidores de

crescimento, evasão da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo

ilimitado, angiogênese e invasão tecidual e metástase (HANAHAN & WEINBERG,

2000; LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Portanto, as células cancerosas diferem

das células normais, pelo fato de continuarem a crescer e se dividir, não obedecendo

ao controle biológico natural do organismo (HANAHAN & WEINBERG, 2000).

Page 37: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

37

Figura 4: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et

al., 2003.

1.4 Morte celular: Apoptose e Necrose

O equilíbrio entre a proliferação e a morte celular regula e controla o número de

células no organismo. A cascata de eventos, bioquímicos e fisiológicos, que leva a

mudanças na síntese de macromoléculas, na homeostase celular, na regulação do

volume celular, e finalmente na perda da viabilidade celular está intimamente

relacionada às mudanças morfológicas características de cada tipo de morte celular

(BRASILEIRO-FILHO, 2006; TINARI et al., 2008).

Com o propósito de pesquisar e compreender as patologias, diversos tipos de

morte celular vêm sendo descritos, tais como a apoptose, autofagia, necrose,

catástrofe mitótica, excitotoxicidade e senescência. No entanto, a apoptose e a

necrose são os tipos mais intensamente estudados (KRYSKO et al., 2008).

Page 38: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

38

A morte celular pode ser classificada de acordo com sua aparência morfológica

(apoptose, necrose, autofagia ou catástrofe mitótica – Figura 5), critérios com base

em enzimas (com ou sem o envolvimento de nucleases ou de classes distintas de

proteases, tais como caspases, catepsinas e glutaminases), aspectos funcionais

(programada ou acidental, fisiológica ou patológica) ou características imunológicas

(imunogênicas ou não imunogênicas) (MELINO, 2001; OKADA & MAK, 2004;

GALLUZZI et al., 2007).

Figura 5: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia. Fonte: Bruin & Medema, 2008.

A autofagia é uma resposta ativa a falta de nutrientes, diferenciação e

desenvolvimento, sendo então um processo adaptativo de resposta ao estresse

metabólico, que resulta na degradação de proteínas e organelas. A autofagia é

definida como um processo em que proteínas e organelas são degradadas por

proteases lisossomais (RICCI & ZONG, 2006).

A catástrofe mitótica não é considerada uma forma de morte, mas sim um sinal

irreversível para a morte (RICCI & ZONG, 2006), sendo principalmente associada nos

pontos de checagem do ciclo celular. É um processo resultante de mitose aberrante,

durante a separação das cromátides irmãs (BREDESEN, 2007). Morfologicamente

Page 39: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

39

apresentam-se como células aumentadas e multinucleadas, e com defeitos mitóticos,

como condensação nuclear incompleta, defeito no alinhamento dos cromossomos e

dano DNA (BRUIN & MEDEMA, 2008).

O dano que leva a catástrofe mitótica pode ser induzido por fármacos

quimioterápicos como agentes da hiperpolimerização dos microtúbulos (paclitaxel),

agentes despolimeralizantes de microtubulos (vinblastina e vincristina) e inibidores de

checkpoint quinase 1 (Chk1) (7-hidroxiestaurosporina) (RICCI & ZONG, 2006).

As principais características da necrose incluem: depleção energética, danos a

membrana lipídica e perda da função homeostática de canais e bombas de íons. É

bem caracterizada pela vacuolização do citoplasma, perda de integridade de

membrana e aumento do volume celular (KRYSKO et al., 2008). A necrose é induzida

por inibidores da produção de energia celular, desbalanço no fluxo de cálcio, geração

de ROS e ativação de proteases não apoptóticas, cada um destes eventos

potencializa o outro. A β-lapachona e o honokiol são exemplos de compostos que

induzem necrose em células tumorais (BRASILEIRO-FILHO, 2006; RICCI & ZONG,

2006).

A apoptose é um importante fenômeno, bem caracterizado, na citotoxicidade

induzida por fármacos anticâncer (KIM et al., 2002; MADDIKA et al., 2007;), sendo

também um processo seletivo de deleção celular fisiológica (HENGARTNER, 2000),

visto que ocorre para o controle da população celular e do tecido (VERMES et al.,

2000), desenvolvimento embrionário ( ZIEGLER & GROSCURTH, 2004), dentre outros

processos fisiológicos e patológicos. Foi primeiramente descrita por Kerr e

colaboradores em 1972.

Do grego apo= de e ptose= cair, a apoptose é conhecida como morte celular

programada, fenômeno esse em que a célula é estimulada a acionar mecanismos que

culminam com sua morte. A célula em apoptose não sofre autólise, ela é fragmentada

e seus fragmentos são endocitados por células vizinhas, sem desencadear

quimiotatismo nem ativação de células fagocitárias, diferentemente da necrose

(BRASILEIRO-FILHO, 2006). A apoptose pode ser reconhecida por algumas

características marcantes e coordenadas, pode ser observado retração celular e

conseqüente perda de aderência com a matrix extracelular e células vizinhas. As

organelas mantêm a morfologia, porém em alguns casos, as mitocôndrias podem

apresentar ruptura na membrana externa. A cromatina sofre condensação, além disso,

na membrana plasmática, formam-se prolongamentos, os chamados blebs, que

aumentam de tamanho e se rompem, originados os corpos apoptóticos, onde são

rapidamente fagocitados por macrófagos e removidos sem causar processo

inflamatório (ZIEGLER; GROSCURTH, 2004).

Page 40: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

40

A ativação da apoptose ocorre por duas vias gerais: via extrínseca e

intrínseca (Figura 6).

Quando a via intrínseca é ativada (Figura 6), o primeiro passo é o aumento da

permeabilidade da membrana mitocondrial seguida da liberação de proteínas que

normalmente estavam localizadas no espaço intermembranar [citocromo c, fator de

indução da apoptose, Smac/DIABLO (Second Mitochondria-derived Activator of

Caspases/Direct IAP Binding Protein with Low Propidium iodideI), entre outros]. O

citocromo c se liga a Apaf-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) e forma um

complexo multicatalítico chamado apoptossomo. Este complexo ativa a caspase-9 a

partir de sua forma zimogênica pró-caspase-9. Então, a caspase-9 cliva as caspases

efetoras -3, -6 e -7, ativando-as para realizar a fragmentação do DNA (KUMAR et al.,

2004; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004; BRASILEIRO-FILHO, 2006).

A via de receptor de morte ou via extrínseca (Figura 6) envolve a ativação de

receptores de membrana. Eles são membros da superfamília de receptores de fatores

de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor receptor - rTNF). Estão inclusos nessa

família os receptores de membrana rTNF-1, FAS (CD95), TRAIL (TNF-related

apoptosis inducing ligand), entre outros. Esses receptores possuem um domínio

distinto dentro do citoplasma denominado de domínio de morte (Death Domain - DD)

que contém uma seqüência de 65 aminoácidos. Após a associação dos receptores de

membrana ao seu correspondente DD, ocorre uma mudança conformacional nos

receptores, o que promove o recrutamento de uma molécula adaptadora FAS que irá

associar-se com o domínio de morte (DD) formando o FADD. Este complexo formado

é o responsável por iniciar a cascata de caspases, pois o FADD se liga a procaspase-

8 e forma caspase-8, ativando as caspases efetoras -3, -6 e -7 (STRASSER et al.,

2000; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004).

Page 41: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

41

Figura 6: Esquema demonstrando as principais vias de ativação da apoptose, suas interconexões e as alterações morfológicas mais características. Adaptado de MACFARLANE & WILLIAMS (2004) com algumas alterações.

Page 42: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

42

1.5 Princípios de Quimioterapia Antineoplásica

A utilização de agentes químicos, isolados ou em combinação com o objetivo

de tratar os tumores malignos, denomina-se de quimioterapia antineoplásica. Difere da

radioterapia e da terapia cirúrgica por ser um tratamento sistêmico e cada vez mais

tem se tornado uma das mais importantes e promissoras ferramentas de combate ao

câncer no mundo (BONASSA & SANTANA, 2005). Existem as terapias com

fotorradiação (KUSUZAKI et al., 2007) e a imunoterapia (HERR & MORALES, 2008).

A proposta do tratamento com os agentes antineoplásicos é de impedir a

multiplicação de células cancerosas, a metastização e de proporcionar a destruição do

tumor existente (SKEEL, 2007).

No entanto, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o

tratamento do câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado por

causa de falhas nos esquemas terapêuticos, altos índices de recidivas, redução da

sobrevida dos pacientes e dos efeitos adversos, o que leva a uma contínua busca por

novos fármacos (SALGALLER & LODGER, 1998). O fármaco ideal deve aumentar a

especificidade, protegendo tecidos normais, minimizar o desconforto dos pacientes e

aumentar a eficácia, resultando na erradicação da massa heterogênea do tumor

(BRANNON-PEPPAS & BLANCHETTE, 2004).

Diante do exposto anteriormente, é importante que novas estratégias como o

restabelecimento do controle do ciclo celular com drogas que agem nos pontos de

checagem, possam ser disponibilizadas como uma estratégia viável na terapia

anticâncer (FISCHER et al., 2004).

Dentre as substâncias isoladas de produtos naturais encontramos os

chamados metabólitos secundários, uma classe química que se destaca pelo grande

potencial farmacológico. Estes são produtos de vias condicionais que são ativadas em

contextos ou situações particulares. Eles podem ser divididos em diversas classes

estruturais: terpenos, lignanas, taninos, lactonas, esteróides, chalconas, flavonas,

flavanonas, alcalóides e quinonas, dentre outros (CLARDY & WALSH, 2004).

Além disso, inúmeros análogos foram sintetizados em laboratórios por

diferentes grupos de pesquisa, com o objetivo de se identificar os grupos

farmacofóricos, estabelecendo, assim, a relação estrutura-atividade na tentativa de se

obter fármacos mais potentes (KINGSTON, 2000). A partir deste momento, grandes

mudanças ocorreram nos centros de pesquisas, incluindo a identificação de novos

alvos moleculares exploráveis, estabelecimento de programas de triagem de produtos

naturais em larga escala (HTS – High Throughput Screening), avanços no projeto

Page 43: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

43

racional de drogas e química combinatória (YUNES et al., 2001; MANN, 2002;

ROTHENBERG et al., 2003; BUTLER, 2004; GANESAN, 2004; WESTWELL &

STEVENS, 2004; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG et al., 2006; NEWMAN &

CRAGG, 2007).

Diversos fármacos, nas fases do ciclo celular, irão atuar inibindo a multiplicação

celular. Esses fármacos que exercem a sua ação interferindo no ciclo celular são

chamados de ciclo-celular específicos. Entretanto, os antineoplásicos que tem a

capacidade de agir sobre as células tumorais independentes de estarem atravessando

o ciclo ou de estarem em repouso (Fase G0), são denominados de ciclo-celular não-

específicos (VASCONCELLOS apud ALMEIDA et al, 2005).

Muitas dessas substâncias constituem-se, sobretudo, em modelos para o

desenvolvimento de medicamentos sintéticos modernos, tais como os fármacos

anticâncer utilizados atualmente: a vimblastina (Velban®) e a vincristina (Oncovin®) e

os análogos vindesina (Eldisine®) e vinorelbina (Navelbine®); o paclitaxel (Taxol®) e o

análogo docetaxel (Taxotere®); a podofilotoxina e os análogos, etoposídeo

(Etopophos®) e teniposídeo (Vumon®); e a camptotecina e os análogos, topotecano

(Hycamtin®) e irinotecano (Camptosar®). Esses medicamentos apresentam uma

participação no mercado que movimenta cerca de 50 bilhões de dólares anualmente

(CRAGG & NEWMAN, 2000; CRAGG & NEWMAN, 2005; PINTO et al., 2002).

A importância da síntese química das moléculas que possuem atividade

antitumoral torna-se um atrativo e um processo viável para a indústria farmacêutica

(Figura 7), visto que com relação à produção de substâncias extraídas de fontes

naturais, que requer muito material para a extração e obtenção da dose necessária

para o paciente, torna-se também um caminho longo até o isolamento do princípio

ativo com menos toxicidade ao paciente.

Como exemplo ao que foi abordado acima, a vimblastina e a vincristina são

alcalóides naturais encontrados nas partes aéreas da planta Catharanthus roseus var.

albus G. Don. ou Vinca rósea L., (Apocynaceae) daí serem chamados de alcalóides da

vinca (Figura 8). Já a vindesina e a vinorelbina são derivados semi-sintéticos

(GUERITTE-FAHY, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2005; NEWMAN & CRAGG, 2006).

Page 44: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

44

Categorias usadas para definir a origem dos medicamentos anticâncer:

V-Vacina, B- Uso biológico (Peptídeos ou proteínas isolados de algum organismo ou linhagem celular), N- Produto Natural, ND- Derivado de produto natural por modificações semi-sintética, S- Totalmente sintético, S/NM- São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais, S*- Totalmente sintético, mas na farmacopéia diz ser de origem natural, S*/NM- São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais, V- vacina.

Figura 7: Distribuição da origem dos medicamentos antineoplásicos que estão no mercado nos últimos 25 anos. Adaptado de: Newmann & Cragg, 2007.

O mecanismo de ação dos alcalóides da vinca é o aparelho mitótico, em

particular, os microtúbulos. Envolve o bloqueio da polimerização dos microtúbulos, que

constituem uma importante parte do citoesqueleto e do fuso mitótico. O fármaco liga-

se especificamente à proteina microtubular, a tubulina, na forma dimérica. O complexo

fármaco-tubulina liga-se a extremidade em formação dos microtubulos, interompendo

a sua organização, com consequente despolimerização destes microtubulos. O

processo determina a parada da mitose na fase metáfase, com dissolução do fuso

mitótico e interferencia na segregação dos cromossomos (KATZUNG, 2003).

Page 45: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

45

NH

N

R4 CH3

O

OCH3

N

N

R1

R2

OH

R3

CH3

O

CH3

R1 R2 R3 R4

Vimblastina CH3 CO2CH3 OCH2CH3 OH

Vincristina COH CO2CH3 OCH2CH3 OH

Vindesina CH3 CONH2 OH OH

Vinorelbina CH3 CO2CH3 OCH2CH3 H

Figura 8 Estrutura química da vimblastina, da vincristina, da vindesina e da vinorelbina.

O paclitaxel (Figura 9) é um alcalóide encontrado nas cascas da planta Taxus

brevifolia Nutt (Taxaceae). O seu análogo, o docetaxel (Figura 9), foi obtido através do

estudo da relação estrutura-atividade (KINGSTON, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2005).

Um dos fatores que desde logo despertou a atenção no estudo dos taxanos

(paclitaxel e docetaxel) foi o seu mecanismo de ação ser diferente do que, até então,

era conhecido. As estruturas intracelulares afetadas pelos taxanos também são os

microtúbulos. Entretanto, diferentemente das outras drogas antimitóticas conhecidas,

como os alcalóides da vinca ou a colchicina, que induzem a disjunção dos

microtúbulos, os taxanos promove a polimerização da tubulina em microtúbulos das

células (KINGSTON, 1991; KATZUNG, 2003). Os microtúbulos formados por indução

dos taxanos são extremamente estáveis e disfuncionais. Havendo assim um

deslocamento no equilíbrio dinâmico entre a formação dos microtúbulos e a sua

dissociação em tubulina, o que compromete a mitose, bloqueando a divisão celular e

comprometendo funções celulares vitais, o que provoca a morte da célula.

Devido à dificuldade de isolamento e baixo rendimento, somente após 20 anos

de sua descoberta, o Paclitaxel foi utilizado para testes clínicos. No entanto, para

Page 46: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

46

produzir 360g do composto, cerca de 4000 árvores foram sacrificadas, tornando

inviável seu uso (MANN, 2002). Este problema somente foi solucionado quando Potier

e seus colaboradores descobriram que das folhagens de Taxus baccata poderia se

extrair uma quantidade maior de um precursor, 10-deacetilcaccatin III, que facilmente

poderia ser convertido em Paclitaxel e em análogos mais potentes como o Docetaxel

(Taxotere) (GUERITTE-VOEGELIN et al., 1991). Este último é um taxóide, semi-

sintético, duas vezes mais potente que o composto natural (Figura 9) (BARREIRO &

FRAGA, 2002). O Docetaxel é um exemplo importante que demonstra a importância

da síntese ou semi-síntese química na descoberta de novos agentes antineoplásicos.

Nos últimos 50 anos, as pesquisas de novas moléculas levaram a descoberta

de mais de 100 novos fármacos que adentraram ao arsenal para o tratamento de

neoplasias malignas, sendo, na sua maioria, derivados ou protótipos de produtos

naturais (WAGNER-DÕBLER et al., 2002).

R1 R2

Paclitaxel

COCH3

Docetaxel

OC(CH3)

H

Figura 9: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel.

CH3

CH3

OH

CH3

OR2O

O

CH3

OH

AcOO

O

O

O

OH

NH

O

R1

CH3

Page 47: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

47

1.6 Chalconas

As chalconas são compostos precursores da via de biossíntese dos

flavonóides. O termo chalcona é utilizado para caracterizar uma família de compostos

que possuem como núcleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presença

de uma ligação olefínica, de um grupamento cetona e/ou de um grupamento hidroxila,

com dois anéis aromáticos, unido a α,β insaturados (Figura 10). Uma característica

importante neste grupo é a pigmentação amarela apresentada pelos mesmos, que

passa a vermelha em meio alcalino. Essas substâncias têm um papel importante em

sistemas ecológicos em função das cores que produzem nos vegetais e são

encontradas em diferentes órgãos, sobretudo nas flores. As cores estão implicadas

especialmente na polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros. Apresentam

uma grande variedade de atividades biológicas, sendo as mais comuns edulcorantes

ou protetores contra a luz e calor (BRAVO, 1998; LAWRENCE et al., 2006).

Figura 10: Núcleo fundamental das chalconas.

Na Tabela 1 podemos observar alguns exemplos de flavonóides pertencentes

a essas classes, suas fontes e estruturas (HODEK; TREFIL; STIBOROVA, 2002;

MOON; WANG & MORRIS, 2006). Os flavonóides ainda podem ser encontrados de

duas formas, sem os grupamentos açúcar (agliconas) ou com resíduos de açúcares

ligados (glicosídicas) (PETERSON & DWYNER, 1998).

Page 48: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

48

Tabela 1: Exemplos de alguns flavonóides e suas fontes.

Fonte: MOON, WANG & MORRIS, 2006.

As chalconas, uma das maiores classes de produtos naturais com vasta

distribuição em frutas, vegetais, temperos, chás, soja e outros gêneros alimentícios

são destaques na pesquisa devido à disponibilidade destes compostos na dieta da

população e tem sua importância na medicina popular (VINCENZO et al., 2000;

NOWAKOWSKA, 2007).

Page 49: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

49

Além do papel sobre sistemas ecológicos e das atividades biológicas, as

chalconas têm despertado grande interesse farmacológico. Nos últimos anos, têm sido

estudadas as atividades: antiinflamatória, antinociceptiva (VIANA et al., 2003),

antitumoral, antimicrobiana (RAFI et al., 2000), antimalárica (CHEN, 1994), inclusive

com atividade anti-HIV (CHEENPRACHA, 2006) e antioxidante para várias chalconas

e seus derivados sintéticos (LEBEAU et al., 2000). A posição em que se encontram os

grupos substituintes nos dois anéis aromáticos determina essa variedade de

propriedades farmacológicas e biológicas (KO, 2003).

Um número de derivados de chalconas tem sido encontrado inibindo

importantes enzimas no sistema celular, incluindo xantina oxidase, aldose redutase,

epoxido hidrolase, proteína tirosina quinase e quinona redutase (NOWAKOWSKA,

2007).

Dentre os flavonóides, as chalconas têm sido relatadas como compostos

atraentes com propriedades quimioprotetoras e antitumorais. As chalconas 4,2’,6’-

trihidroxi-4’-metoxidihidrochalcona,2’,6’-dihidroxi-4’-etoxidihidrochalcona, e 2’,4’-

diacetoxichalcona, isoladas das partes aéreas de Ononis natrix ssp. ramosissima

(Leguminosae), apresentam moderada atividade citotóxica contra P-388 (leucemia

murina), A-549 (carcinoma de pulmão de não-pequenas células humano) e HT-29

(câncer de colon humano). Entretanto, o composto mais potente, a 2’,6’-diacetoxi-4,4’-

dimetoxidihidrochalcona, mostrou atividade seletiva pela linhagem de células P-388

(FOREJTNIKOVA et al., 2005; KIMURA, 2005).

A chalcona 3,4,3’,4’,5’-pentametoxichalcona é um potente agente citotóxico,

que atua ligando-se à tubulina, impedindo a montagem dos microtúbulos (LAWRENCE

et al., 2000). A chalcona pedicina (2’,5’-dihidroxi-3’,4’,6’-trimetoxichalcona) isolada das

folhas de Fissistigma languinosum (Annonaceae), também agem a nível de tubulina,

interrompendo a montagem destas subunidades em microtúbulos. Nesta mesma

planta foram descobertas duas novas chalconas condensadas, fissistina e isofissistina,

citotóxicas contra células KB, que contém sequências do papiloma vírus (ALIAS et al.,

1995).

Com base em sua descoberta de que a licochalcona A isolada de Xin-jiang

licorice possui atividade antiinflamatória e antitumorigênica, SHIBATA (1994) sintetizou

e estudou a atividade antimutoral in vitro e in vivo de 40 chalconas derivadas da

licochalcona A. Os resultados obtidos demonstraram que muitos destes compostos

possuem uma grande potência em inibir a tumorigênese. Dentre estes estão a 3’-metil-

3-hidroxichalcona e a 4’-metil-3-6 hidroxichalcona, que além de inibir a fosforilação de

fosfolipídeos promovida pelo acetato de tetradecanoilforbol (TPA) em células HeLa in

vitro, o crescimento de tumores em pele de camundongos iniciados com

Page 50: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

50

dimetilbenz[a]-antraceno e promovido por TPA também apresentam uma marcante

atividade inibitória sobre a proliferação de células HGC-27 (câncer gástrico humano).

Muitos trabalhos descrevem a importância das chalconas para os estudos

antitumorais, considerando-as candidatas promissoras ao desenvolvimento de novas

drogas com atividade antineoplásica (SHAH et al., 2008). Alguns derivados de

chalconas estão sendo investigados: a atividade anticâncer em linhagens tumorais que

conferem a resistência a multidrogas (MDR) ou seu potencial para modular a atividade

da glicoproteína P, proteína encontrada na membrana celular responsável pela

resistência aos antineoplásicos (VINCENZO et al., 2000).

A chalcona utilizada para a realização deste estudo foi a (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-

fenilprop-2-en-1-ona, como apresentado na Figura 11.

Figura 11: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do derivado de chalcona, (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.

Page 51: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

51

Existem dois fatores que podem explicar o crescente interesse da indústria

farmacêutica por produtos sintéticos oncológicos. O primeiro é o desejo de encontrar

moléculas para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos, que tenha uma

eficácia terapêutica grande e que sejam mais toleráveis aos efeitos colaterais por eles

desencadeados. O segundo e o mais importante é o respaldo cada vez mais sólido

que a ciência está oferecendo aos estudos das drogas sintéticas e derivados de

produtos naturais. A partir da constatação de que muitas vezes diversos

pesquisadores mostram interesse em descobrir atividade antitumoral em moléculas já

existentes com comprovada atividade biológica em outras moléculas do mesmo grupo,

é possível que esses estudos mostrem atividades promissoras anticâncer.

A substância ((E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona) para a investigação da

atividade antitumoral in vitro e in vivo deste estudo foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr.

Antônio Carlos Severo Menezes e Profa. Dra. Caridad Noda Pérez, do Departamento

de Química Orgânica da Universidade Estadual de Goiás (UEG).

Page 52: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Relevância e

Justificativa

Page 53: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

53

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

O desenvolvimento de drogas antineoplásicas é dependente do conhecimento dos

fatores etiológicos e patogenéticos que contribuem para a o desenvolvimento dos

tumores malignos. Várias anormalidades são encontradas nos pacientes oncológicos,

tanto com relação às características dos tumores (inibição do processo apoptótico,

aquisição de auto-suficiência, sinalização dos fatores de crescimento, formação de

novos vasos sanguíneos e a ocorrência da metástase à distância), como as alterações

identificadas nos pacientes após o tratamento convencional, o que diminui muitas

vezes a qualidade de vida do indivíduo.

O câncer é a segunda causa de morte por doença no mundo, ficando atrás

apenas das doenças cardiovasculares, o número de novos casos de câncer vem

aumentando a cada ano e o crescente número de óbitos, que somente em 2008

vitimou cerca de 40 mil pessoas, custaram em demandas hospitalares superiores a

400 milhões de reais (BRASIL, 2009).

A descoberta de novas substâncias naturais ou sintéticas capazes de interferir em

eventos celulares específicos das células tumorais malignas tem proporcionado a

busca por moléculas com atividade cada vez mais definida.

Deste modo, a busca por compostos com ação antineoplásica específica e com

menor toxicidade para o portador de câncer levou-nos a investigar um possível efeito

do derivado de chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, designado no

presente estudo por CG, substância de fácil obtenção, no intuito de que futuramente

essa molécula possa ser usada no tratamento de doenças neoplásicas, o que

justificaria a importância deste estudo.

Page 54: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Objetivos

Page 55: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

55

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar as propriedades anticâncer de um derivado de chalcona, (E)-1-(4-

Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG) em modelos experimentais in vitro e in vivo.

3.2 Específicos

Determinar a atividade citotóxica e hemolítica da CG em diferentes linhagens

tumorais e a atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos,

respectivamente;

Avaliar a citotoxicidade deste composto em relação a células mononucleares

do sangue periférico (PBMC) de voluntários saudáveis;

Sobre o mecanismo de ação citotóxico da CG, utilizando como modelo a

linhagem HL-60 (Leucemia promielocítica), após 24 horas de exposição:

Avaliar a viabilidade celular;

Avaliar o efeito da CG sobre a indução de morte celular;

Averiguar a ação antiproliferativa da CG por meio de inibição da síntese

de DNA;

Investigar alterações morfológicas desencadeadas pelo composto CG;

Estudar por meio da citometria de fluxo, o efeito da CG sobre a

viabilidade celular, integridade de membrana, fragmentação de DNA,

análise do ciclo celular, externalização da fosfatidilserina (Anexina V),

caspases- 3, 7, 8 e 9;

Investigar a participação do Citocromo c, Pro-caspase 9 e Caspase-9 clivada;

Estudar o potencial genotóxico da CG sobre as células mononucleares do

sangue periférico (PBMC) de voluntários saudáveis;

Page 56: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

56

Investigar o potencial mutagênico da CG através do teste do micronúcleo sobre

as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de voluntários

saudáveis;

Determinar o efeito antitumoral in vivo da CG em camundongos Swiss,

portadores de Sarcoma 180 e seu grau de toxicidade através de analises do

hemograma, bioquímica e hispatológico dos órgãos-alvo dos animais.

Page 57: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Materiais e Métodos

Page 58: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

58

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais utilizados

4.1.1 Equipamentos

Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2®

Agitador de tubo, Donner AD 8850®

Balança pra pesar animais, Filizola®

Balança Analítica, Gehaka Modelo AG200®

Balão Volumétrico

Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di®

Câmara de Newbauer, Boeco Germany®

Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212®

Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206®

Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403®

Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin®

Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte mini®

Contador manual, Division of Bexton, Dickinson and Company®

Deonizador de água Milli-Q, Milipore®

Destilador de água

Espectrofotômetro de placa DTX-880, Beckman Coulter®

Fluxo laminar, VECO®

Incubadora de células, (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow®

High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek

3000, BeckmanCoulter®

Microondas, Panasonic®

Microscópio óptico, Metrimpex Hungary/PZO-Labimex Modelo Studar lab®

Page 59: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

59

Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot®

Microscópio de fluorescência, Olympus®

pHmetro, Micronal B474®

Pipetas automáticas, Gilson®

Sistema Vertical (Western blot), Amershan Biosciences®, Modelo miniVE

completo.

4.1.2 Reagentes, Soluções e Fármacos

Ácido Acético - Vetec®

Ácido Clorídrico - Vetec®

Agarose baixo ponto

de fusão

- Gibco®

Agarose ponto de fusão

normal

- Gibco®

Álcool Etílico - Vetec®

Alamar Blue (Resazurina) 0,312 mg/mL Sigma®

Anticorpo anti-BrdU 1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma®

BSA 5 % q.s.p. 500 µL de

solução

Dako®

Anticorpo biotinilado anti-

imunoglobulina de

camundongo

Azul de tripan 0,4%

1 µL de anticorpo anti-

imunoglobulina

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de

solução

Sigma®

10 mg de azul de tripan Sigma®

PBS q.s.p. 100 mL de solução -

BrdU 10mM - Sigma®

Brometo de Etídio 100

μg/mL 1mg de brometo de etídeo Sigma®

Citocalasina B

Citocromo c

PBS q.s.p 10 mL de solução

-

-

Sigma®

- Biotechnology®

Citrato de Sódio - Grupo Química®

Page 60: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

60

Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®

Diaminobenzidina (DAB) 5 µL de DAB Immunotech®

1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05M)

pH= 7,6 Proquímios®

2 µL de H2O2 Proquímios®

Dimetilsulfóxido (DMSO) - Vetec®

Doxorrubicina –

fornecida pelo Instituto do

Câncer do Ceará – ICC

-

Zodiac®

Estreptavidina –

peroxidase

1 µL de Estreptavidina –

peroxidase Sigma®

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de

solução Dako®

Eosina-Azul de Metileno

(May- Grunwald)

Giemsa

Ficoll

Fitohemaglutinina

0,2 g

Metanol q.s.p. 100 mL de

solução

-

Reagen®

Bioclin®

- Sigma®

- Sigma®

5-Fluorouracil - Sigma®

Formaldeído -

Dinâmica®

Gentamicina -

Novafarma®

Hematoxilina - Doles®

Iodeto de propídeo 50

µg/mL 1 mg de iodeto de propídeo Boehringer®

PBS q.s.p. 50 mL

Laranja de Acridina 1 g de laranja de acridina (100

µg/mL) Fluka®

H2O q.s.p. 10 mL de solução -

Meio de cultura de células

RPMI 1640

Diluído em água deionizada e

esterelizada, filtrado em filtro

millipore (0,22 µm) e

complementado com SBF 10 %,

1 % de glutamina, 1 % de

Cultilab®

Page 61: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

61

antibióticos, 1 % de bicarbonato

de sódio (0,75 %) e 25 mM de

HEPES

Metanol - Vetec®

MTT 20 mg de MTT Sigma®

PBS q.s.p. 100 mL de solução -

Penicilina –

estreptomicina Penicilina 10.000 U.I./mL Cultilab®

Solução desnaturante

(para análise de

incorporação de BrdU)

Soro fetal bovino

Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab®

Formamida 70 %

2x SSC (pH entre 6,5 e 7,5 a 70

°C)

Vetec®

- Cultilab®

Solução salina (para

hemólise)

8,5 g de Cloreto de sódio (0,85

%) Labsynth®

1,11 g de Cloreto de cálcio (10

mM) Reagen®

H2O q.s.p 1 L de solução -

SSC 10X

Cloreto de sódio 1,5 M

Citrato de sódio 0,15 M

H2O

-

Tampão fosfato (PBS) 8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®

2,14 g de NaHPO4.7H2O Labsynth®

0,276 g de NaHPO4.H20 Labsynth®

H20 q.s.p. 1 L de solução (pH =

7,2) -

Tampão Tris (TBS) 10X

Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®

Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios®

H2O destilada -

Tripsina 0,25% 50 mL de Tripsina 2,5 % Cultilab®

0,125 g de EDTA Proquímios®

450 mL de PBS -

Triton X -100 - Isofar®

Page 62: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

62

Outras Soluções:

Tampão fosfato pH = 7,4 (PBS)

NaCl................................................................... 8,77g

NaH2PO4 (Monobásico)..................................... 3,18g

Na2HPO4 (dibásico)........................................... 10,94g

H2O destilada..................................................... q.s.p. 1L

Tampão tris pH = 7,6 (TBS)

NaCl.................................................................. 8,77g

Tris-base........................................................... 6,08g

H2O destilada.................................................... q.s.p. 1L

Ajustar o pH para 7,6 com HCl.

Ensaio do Cometa

Tampão para corrida eletroforética pH~13 (alcalino)

EDTA.................................................................. 0,292g

NaOH.................................................................. 12,0g

H2O destilada....................................................... q.s.p. 1L

Tampão de lise pH= 10

NaCl................................................................. 145g

EDTA............................................................... 29,23g

Tris-base.......................................................... 1,21g

Page 63: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

63

Triton X-100.................................................... 10mL

DMSO............................................................. 100mL

H2O destilada.................................................. q.s.p. 1L

Solução de neutralização pH= 7,5

Tris-base......................................................... 78,46g

H2O destilada.................................................. q.s.p. 1L

Ajustar o pH para 7,5 com HCl.

Ensaio do Micronúcleo

Solução de Carnoy

Metanol............................................................ 3 mL

Ácido acético................................................... 1 mL

Western Blot

Solução de acrilamida/bisacrilamida 30.8%

Acrilamida (PlusOne®) ................................ 30% em dH2O

Bisacrilamida (PlusOne®) ........................... 0,8% em dH2O

Tampão de corrida (pH 8,3)

Tris (PlusOne®)........................................... 25 mM

Glicina (PlusOne®)...................................... 0,192M

SDS (Fisher Scientific®)………………...……. 0,1%

Tampão de transferência

Tris (PlusOne®)........................................... 25 mM

Page 64: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

64

Glicina (PlusOne®)...................................... 0,192M

MeOH……………………………………….….. 20%

Tampão de revelação (pH 9,5)

Tris (PlusOne®)........................................... 50 mM

MgCl2…………………………………..………. 5mM

NaCl........................................................... 0,15M

Composição do tampão de lise (Cell Signaling Technology®)

Tris-HCl (pH 7.5)…....................................... 20 mM

NaCl............................................................ 150 mM

Na2EDTA..................................................... 1 mM

EGTA........................................................... 1 mM

Triton........................................................... 1%

Fosfato de Sódio........................................ 2.5 mM

β- Glycerofosfato........................................ 1 mM

Na3VO4........................................................ 1µg/mL

Composição do tampão de amostra Blue Juice (10X; Invitrogen®)

Tris-HCl (pH 7,5)…....................................... 10 mM

EDTA........................................................... 10 mM

Sacarose...................................................... 65%

Azul de bromofenol ...................................... 0,3%

Componentes do kit para dosagem de proteínas DC Protein Assay (Bio-Rad

Laboratories®)

Reagent A….................................................... Solução alcalina de tartarato

de Cu

Reagent B...................................................... Reagente de Folin

Page 65: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

65

Reagent S............................................................ Detergente

Substâncias:

(E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona (CG)

Doxorrubicina (controle positivo in vitro) (Zodiac®)

5-Fluorouracil (controle negativo in vivo) (Sigma®)

4.2 Células

As células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e

antitumoral estão listadas quanto ao tipo histológico, origem e fonte na tabela 2.

Page 66: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

66

Tabela 2 - Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e

antitumoral.

Linhagem* Tipo Histológico Origem Fonte

HL-60 Leucemia

promielocítica Humana

Children’s Mercy Hospital –

EUA

HCT-8 Carcinoma de cólon Humana Children’s Mercy Hospital –

EUA

SF-295 Glioblastoma Humana Instituto Nacional do Câncer

- EUA

MDA-MB-435 Melanoma Humana Instituto Nacional do Câncer

- EUA

PBMC Linfócitos e monócitos Humana Cultura primária

K562 Leucemia Mielóide

Crônica Humana

Instituto Nacional do Câncer

- EUA

Sarcoma 180 Sarcoma Murina –

camundongos

Laboratório de Oncologia

experimental - UFC

*Linhagens pertencentes ao Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.

4.2.1 Manutenção das células em cultura

As linhagens celulares foram cultivadas em garrafas para cultura de células (75

cm3, volume de 250 mL), os meios utilizados foram RPMI 1640, suplementados com

10% de soro bovino fetal e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células

foram mantidas em incubadoras com atmosfera de 5 % de CO2 a 37 ºC. Diariamente

acompanhava-se o crescimento celular com a utilização de microscópio de inversão. O

meio foi trocado sempre que o crescimento celular atingia confluência necessária para

renovação de nutrientes. Para a manutenção de células aderidas utilizou-se tripsina

(0,25%) para que as células despregassem-se das paredes das garrafas (PESSOA,

2000).

Page 67: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

67

4.2.2 Obtenção de células PBMC

As células de PBMC (peripheral blood mononuclear cells – linfócitos e

monócitos) foram obtidas a partir de sangue periférico de voluntários saldáveis. A

coleta do sangue foi realizada em frasco heparinizados por profissionais capacitados,

nas dependências da UNIFAC-UFC (Unidade de Farmacologia Clínica da

Universidade Federal do Ceará), utilizando seringas esterilizadas e descartáveis com

volume de 5 mL. O material assim obtido foi imediatamente transportado para o

Laboratório de Oncologia experimental (LOE) do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, também da Universidade Federal do Ceará.

As células PBMC foram isoladas a partir de uma amostra de cerca de 3 mL de

sangue, acrescida de 5 mL de PBS. As etapas até o isolamento incluíram a adição de

3 mL de Ficoll, seguida por 30 minutos de centrifugação a 1.000 rpm, e feita a

aspiração dos PBMC, presentes na região intermediária entre as hemácias e o

plasma. A suspensão de células PBMC foi transferida para um outro tubo o qual foi

acrescido com PBS até o volume de 11 mL, sendo centrifugado por 20 minutos a

1.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células PBMC foi

ressuspendido em Meio completo (RPMI 1640 acrescido de 20% de soro fetal bovino,

1 % de antibiótico (penicilina-estreptominica) e 4% de fitohemaglutinina) e contado em

câmera de Newbauer para posterior diluição e plaqueamento.

Os experimentos realizados com células PBMC foram previamente aprovados

pelo Comitê de Ética em Pesquisas Humanas- COMEPE, no 106/10, UFC (Anexo 1).

4.3 Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos

O animal de manutenção ou doador foi anestesiado com quetamina e

sacrificado por meio de deslocamento cervical. Fez-se o procedimento asséptico com

álcool iodado e, em seguida, coletou-se o líquido ascítico da cavidade abdominal,

tendo sido preparada uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL

de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem das

células. Os animais receptores foram inoculados com 2 x 106 células/0,5 mL na região

intraperitoneal. O procedimento é realizado a cada 10 dias. Os experimentos

realizados com animais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em

Pesquisa Animal-CEPA, UFC (Anexo 2).

Page 68: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

68

4.4 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss albino (Mus musculus) oriundos do

Biotério Central da Universidade Federal do Ceará. Estes foram alojados dentro de

gaiolas de polipropileno e grades metálicas apropriadas em pequenos grupos do

mesmo sexo (não excedendo 5 animais por gaiola para ratos ou 10 animais por gaiola

para camundongos). A temperatura do local foi de 22 °C ± 5 °C. A iluminação foi

artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Os animais

tiveram livre acesso a alimentação (ração especifica) e água.

Foram utilizados animais (fêmeas ou machos) adultos, jovens, saudáveis e que não

tenham sido anteriormente submetidos a processos experimentais. O número de

animais utilizados foi reduzido ao mínimo cientificamente aceitável. No início do

estudo, a variação de massa dos animais foi à mínima possível, não excedendo ± 20

% da massa média de cada grupo.

Os animais foram identificados de forma inequívoca, e foram aclimatados às

condições do biotério durante pelo menos cinco dias. A nocicepção e o sofrimento dos

animais no decurso dos ensaios foram minimizados de acordo com os princípios éticos

de experimentação animal da COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos de

experimentação animal preconizados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

Universidade Federal do Ceará, tendo sido aprovado de acordo com o protocolo no

08/10 (Anexo 2).

4.5 Procedimento Experimental

4.5.1 Obtenção da Chalcona

Para obtenção da chalcona, foi pesado 0,120 g de KOH e dissolvido em 50 mL

de metanol. Para o preparo da reação, foi pipetado 0,233 mL de acetofenona e

adicionado os 5 mL da solução do catalizador (KOH 5%) preparado anteriormente. Foi

mantida a solução em agitação em um balão volumétrico, por 1 minuto. Foi pesado

0,3022 g de para-nitro benzaldeído e adicionado ao balão, em seguida foi colocado 10

mL de metanol completando assim o volume da solução para 15 mL. O esquema de

refluxo foi montado utilizando o condensador com a solução da reação sob agitação

magnética e permaneceu sob agitação durante 4 horas. Após esse processo, foi

Page 69: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

69

formado um precipitado amarelo no balão, que foi filtrado com auxílio do funil e papel

de filtro e deixado secar por 4 horas, em temperatura ambiente, pesando em seguida a

massa obtida. A Figura 12 mostra a reação da obtenção da (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-

fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.

O estudo químico foi realizado no Departamento de Química Orgânica da

Universidade Estadual de Goiás (UEG), sob a orientação do Prof. Dr. Antônio Carlos

Severo Menezes e Profa. Dra. Caridad Noda Pérez.

Figura 12: Esquema da reação de condensação de Claisen-Schmidt* entre acetofenona e p-nitrobenzaldeído. Estrutura do (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, molécula do estudo.

4.5.2 Estudo da atividade citotóxica

O estudo da atividade citotóxica da CG foi realizado em células humanas

tumorais. Adicionalmente, a atividade citotóxica da CG foi avaliada em células humana

normais.

*A reação de Claisen-Schmidt é uma reação orgânica que pode ser usada na obtenção de chalconas.

Page 70: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

70

4.5.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais

4.5.2.1.1 Princípio do teste

A avaliação do potencial citotóxico da substância teste foi realizada em células

tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de cólon, SF-

295 – glioblastoma e MDA-MB-435 – melanoma) através do método do MTT após 72

horas de incubação. Este é um ensaio quantitativo in vitro que foi desenvolvido por

Mossman em 1983 para estimar a proliferação e sobrevivência celular. É definido na

literatura como apropriado para estimava de citotoxicidade (PESSOA et al., 2000;

COSTA-LOTUFO et al., 2004; BEZERRA et al., 2005; BEZERRA et al., 2008) e basea-

se na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do Ciclo de Krebs que é

ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazolium (brometo

de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, ou MTT), que é hidrossolúvel e de cor

amarelada, em cristais de formazan, que são de cor azul escura. Essa técnica tem a

capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula, sendo assim,

bastante útil para avaliar a citotoxicidade.

4.5.2.1.2 Procedimento experimental

As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em multiplacas

de 96 cavidades numa densidade de 0,3 x 106 células/mL, para células em suspensão

(HL-60) e 0,7 x 105 células/mL para as células aderidas (MDA-MB-435, SF-295 e HCT-

8). Após 24 horas de incubação, a substância teste (0,09 a 5 µg/mL ou 0,35 a 19, 76

µM) dissolvida em DMSO foi adicionada em cada poço, utilizando o HTS (high-

throughput screening), e encubada por 72 horas. A doxorrubicina foi utilizada como

controle positivo com concentrações variando de 0,09 a 5 µg/mL. O controle negativo

recebeu a mesma quantidade de DMSO. Após o período de incubação, as placas

foram centrifugadas (15 G/15 min), e o sobrenadante foi descartado. Cada cavidade

recebeu 200 µL da solução de MTT (0,5 mg/mL em meio RPMI 1640) e foi reincubada

durante 3 horas, em estufa a 37 ºC e a 5% CO2. Após esse período, as placas foram

novamente centrifugadas (30 G/10 min), o sobrenadante foi desprezado, e o

precipitado foi ressuspendido em 150 µL de DMSO. Para a quantificação do sal

reduzido nas células vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do

espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 595 nm (MOSSMAN et al.,

1983).

Page 71: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

71

4.5.2.1.3 Análise dos dados

A substância foi testada em diluições seriadas, em duplicata ou triplicata. Os

experimentos foram analisados segundos suas médias e respectivos EPMs e

determinado suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito

máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de

regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).

4.5.2.2 Ensaio de citotoxicidade em células normais

4.5.2.2.1 Princípio do teste

Para avaliar a citotoxicidade do composto teste sobre a proliferação de células

normais, o ensaio do alamar blue foi realizado utilizando células PBMC (Peripheral

blood mononuclear cells - células mononucleadas de sangue periférico humano, que

inclui linfócitos e monócitos) após 24, 48 e 72 horas de exposição com o composto

teste. O alamar blue, recentemente identificado como resazurina (O'BRIEN et al.,

2000), é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades redox. Como com

os sais de tetrazólio, o alamar blue reduz-se em células em proliferação. A forma

oxidada é azul (não fluorecente/célula não viável) e a forma reduzida é rósea

(fluorescente/célula viável). A redução do alamar blue reflete a proliferação celular.

Este foi inicialmente utilizado para indicar crescimento e/ou viabilidade celular no

monitoramento de proliferação de linfócitos (AHMED et al., 1994) e atualmente

apresenta várias aplicações. Este teste é amplamente empregado em estudos de

prospecção de fármacos.

4.5.2.2.2 Procedimento experimental

Inicialmente, as células PBMC foram plaqueadas em placas de 96 cavidades (3

x 105 células/poço em 100 µL de meio). Após 24 horas de incubação, a substância CG

(0,09 a 5 µg/mL ou 0,35 a 19, 76 µM) dissolvidos em DMSO foram adicionados em

cada poço, utilizando o HTS, e incubadas por 24, 48 e 72 horas. A doxorrubicina (0,09

a 5 µg/mL) foi utilizada como controle positivo. O controle negativo recebeu a mesma

quantidade de DMSO. Vinte e quatro horas antes do final de cada período de

incubação, 10 µL da solução estoque (0,312 mg/mL) de alamar blue

(resazurina) foram adicionados a cada poço. A leitura foi realizada por fluorescência

Page 72: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

72

em comprimento de onda de 570 nm (reduzido) e 595 nm (oxidado), utilizando uma

leitora de placa (AHMED et al., 1994).

4.5.2.2.3 Análise dos dados

A substância foi testada em diluições seriadas, em duplicata ou triplicata. Os

experimentos foram analisados segundos suas médias e respectivos EPMs e

determinado suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito

máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de

regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).

4.5.2.3 Determinação da Atividade Hemolítica

4.5.2.3.1 Princípio do Teste

Esta metodologia, segundo Costa-Lotufo et at. (2002), permite avaliar o

potencial das substâncias em causar lesões na membrana plasmática da célula, seja

pela formação de poros ou pela ruptura total.

4.5.2.3.2 Procedimento experimental

O sangue foi coletado de três camundongos Swiss (Mus musculus) por via

orbital, sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85 % + CaCl2 10 mM).

Os eritrócitos foram lavados 3 vezes em solução salina por centrifugação (1500 rpm/3

min) para redução da contaminação plasmática e ressuspendidos em salina para

obtenção de uma suspensão de eritrócitos a 2 %. Os ensaios foram realizados em

placas de 96 poços. Cada poço da 1ª fileira recebeu 100 L da solução salina. Na 2ª,

os poços receberam 50 L da solução salina e 50 L do veículo de diluição da

substância teste, neste caso, DMSO 10 %. Aos poços da 3ª fileira, foram adicionados

100 L de solução salina e 100 L da substância teste (CG). Da 4ª fileira em diante os

poços receberam 100 L da solução salina, excetuando-se os da última fileira, que

receberam 80 L de solução salina e 20 L de Triton X-100 1 % (controle positivo). As

diluições foram feitas da 3ª à 11ª cavidade, retirando-se 100 L da solução da

cavidade anterior e transferindo para a seguinte de modo que as concentrações foram

sempre diluídas pela metade, variando de 1,56 a 200 g/mL. Em seguida, 100 L da

suspensão de eritrócitos foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 1

Page 73: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

73

h, sob agitação constante à temperatura ambiente (26 2 ºC), as amostras foram

centrifugadas (5000 rpm/3 min) e o sobrenadante transferido para uma outra placa

para a leitura da absorbância no espectrofotômetro de placas a 540 nm.

4.5.2.3.3 Análise dos dados

A análise dos dados foi realizada pela leitura da placa no espectrofotômetro de

placas a 540 nm.

4.5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60 (leucemia

promielocítica)

O estudo do mecanismo de ação citotóxico da CG foi realizado utilizando a

linhagem leucêmica HL-60 como modelo. Foram avaliados a viabilidade por exclusão

por azul de tripan, coloração diferencial por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina;

inibição da síntese de DNA (BrdU); análise morfológica das células pela Coloração por

May-Grunwald-Giemsa. A viabilidade celular e integridade de membrana; a

externalização da fosfatidilserina e o conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete

as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo. O efeito da CG sobre a ativação da

caspase – 3, 7, 8 e 9 também foi avaliado. Analisou-se a expressão do Citocromo c

pelo método do Western blot.

4.5.3.1 Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan (Curva)

4.5.3.1.1 Princípio do Teste

O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar separadamente as

células viáveis das células mortas pela substância testada. O corante penetra em

todas as células, porém somente as células viáveis conseguem bombear o tripan para

fora, sendo possível observar uma coloração azulada nas células mortas.

4.5.3.1.2 Procedimento Experimental

Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 céls/mL, foram

incubadas por 3, 6, 12 e 24h com a amostra CG, nas concentrações de 0,04; 0,2; 0,4;

2 e 4 µM estimadas a partir do valor da CI50 encontrada no método do MTT para esta

Page 74: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

74

mesma linhagem celular. Foram retirados 90 μL da suspensão de células e adicionado

a 10 μL do azul de tripan. As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas e

contadas em câmara de Newbauer. No controle foi utilizado o DMSO, que é utilizado

como veículo da substância teste.

4.5.3.1.3 Análise dos dados

Os dados foram expressos como da média ± erro padrão da média (E.P.M.) de

experimentos independentes (n = 3). Para verificação da ocorrência de diferenças

significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls, usando o programa GraphPad

(Intuitive Software for Science, San Diego, CA) com nível de significância de 5 % (p <

0,05).

4.5.3.2 Teste da Acridina

Coloração diferencial por BE/LA

4.5.3.2.1 Princípio do Teste

O método de coloração por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)

permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou

necrose através da revelação por fluorescência com base em alterações morfológicas

nucleares e citoplasmáticas (McGAHON et al., 1995).

A laranja de acridina intercala-se ao DNA, conferindo aparência verde ao

núcleo celular, sendo capaz de atravessar membranas intactas. O brometo de etídio é

incorporado majoritariamente por células não viáveis (com instabilidade de

membrana), intercalando-se ao DNA. As células viáveis com membrana intacta

apresentam núcleo uniformemente corado de verde pela LA. O BE marca muito

fracamente ou muitas vezes não marca, pois não atravessa membranas não lisadas.

As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam manchas verdes

brilhantes no núcleo (condensação da cromatina) e não são marcadas por BE.

Morfologicamente, observam-se alterações da membrana em decorrência da formação

de corpúsculos apoptóticos. As células que estão em apoptose tardia têm aparência

alaranjada devido a algum dano de membrana que permite a entrada de pequena

Page 75: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

75

quantidade de BE. Já as células necróticas, por apresentarem intenso dano à

membrana plasmática, coram-se de vermelho intenso.

4.5.3.2.2 Procedimento Experimental

Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 0,3 x 106 céls/mL,

foram incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4 µM. A suspensão

de células foi transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5 min em baixa

rotação (10 x g/5 min. correspondente a 1000 rpm/5 min.). O sobrenadante foi

descartado e as células foram ressuspendidas em 20 μL de solução de PBS. Em

seguida, 1 μL da solução de BE/LA foi adicionado a cada tubo e uma alíquota dessas

células transferido para uma lâmina e montado com lamínula e em seguida levadas ao

microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares. A Doxorrubicina

(0,5 μM) foi usada como controle positivo (GENG et al., 2003).

4.5.3.2.3 Análise dos dados

Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis,

necróticas e apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra e montadas

em lâminas que foram fotografadas para o registro visual de possíveis alterações. Os

dados foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n =

3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de

Student Newman Keuls (p < 0,05), usando o programa GraphPad (Intuitive Software

for Science, San Diego, CA).

4.5.3.3 Teste do BrdU

Inibição da síntese de DNA – Ensaio do BrdU

4.5.3.3.1 Princípio do Teste

A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a timina. Assim,

quando as células estão sintetizando seu DNA, o BrdU é incorporado no lugar da

timina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por técnicas

imunohistoquímicas (PERA et al., 1977).

Page 76: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

76

4.5.3.3.2 Procedimento Experimental

Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 céls/mL, foram

incubadas por 24 h com as concentrações de CG (1, 2 e 4 µM) e o controle positivo foi

a doxorrubicina (0,5 µM). Três horas após a adição do BrdU na cultura de células,

lâminas para cada amostra foram preparadas e postas para secar por 2 h. Após o

período de secagem foram fixadas em metanol: ácido acético (7:1,5) por 5 min. As

células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução desnaturante

por 90 min a 70 oC e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, as células foram

circuladas com caneta hidrofóbica e incubada com anticorpo primário e deixada na

geladeira durante a noite em câmara úmida. As células foram incubadas com

anticorpo secundário biotinado por 20 min e, em seguida, com a solução de

estreptavidina-fluoresceína por mais 20 min. Foi adicionado o cromógeno DAB por 1-5

min e, em seguida, removido com água destilada. Em seguida, são adicionados os

anticorpos e um cromógeno específico, a diaminobenzidina (DAB). Para corar as

células não marcadas pelo cromógeno, utiliza-se hematoxilina (0,1 %). Consideram-se

positivas para proliferação, as células de núcleo corado pelo DAB (cor marrom) e,

negativas, as células de núcleo corado com hematoxilina (cor azul).

4.5.3.3.3 Análise dos dados

Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo

marrom (incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados

foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 2). A

proporção de células marcadas em marrom e não-marcadas entre os diferentes

grupos foi comparada pelo teste 2 com nível de significância de 5 % (p < 0,05)

usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

4.5.3.4 Teste da Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-Giemsa

4.5.3.4.1 Princípio do teste

A coloração utilizada nesse experimento se baseia em interações eletrostáticas

entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul de metileno (corante

básico), eosina (corante ácido), entre outros componentes básicos que permite

distinguir o citoplasma e o núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua

Page 77: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

77

integridade nuclear, bem como alterações no citoplasma. Essa técnica é bastante

indicada para estudo do padrão de morte celular (apoptose/necrose) (McGAHON et

al., 1995).

4.5.3.4.2 Procedimento experimental

Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 0,3 x 106

células/mL foram incubadas por 24 horas com a CG (1, 2 e 4 µM), o controle positivo

foi a doxorrubicina (0,5 µM) e examinadas ao microscópio de inversão. Para observar

a morfologia, 50μL da suspensão de células foram adicionadas à centrífuga de lâmina

(Cytospin®). Após a adesão das células na lâmina, a fixação foi feita com metanol por

1 minuto e a coloração por May-Grunwald, por 10 segundos, seguida pelo Giemsa por

mais 10 segundos.

4.5.3.4.3 Análise dos dados

As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio para

avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle (não-

tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia em microscopia

óptica.

4.5.3.5 Determinação da Integridade de membrana- viabilidade celular

4.5.3.5.1 Princípio do teste

A análise da integridade da membrana plasmática é uma importante ferramenta

para estudar o tipo de morte celular, visto que apenas na necrose ela apresenta-se

precocemente alterada. O teste se baseia na capacidade do iodeto de propídeo (PI),

hidrofílico, penetrar em célula cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao DNA

emitir alta fluorescência quando é excitado pelo laser de argônio (488 nm). A célula

com membrana integra emite baixa fluorescência. Deste modo, este método permite

avaliar a viabilidade celular através da verificação da integridade da membrana

plasmática (MACKLIS & MADISON, 1990).

4.5.3.5.2 Procedimento experimental

Page 78: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

78

A determinação da integridade da membrana celular foi avaliada por citometria

de fluxo utilizando o PI como agente fluorogênico. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada

como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado com

o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.

As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 0,3 x 106 células/mL com

diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 µM). Uma alíquota de 50 μL foi recolhida 24

h após a incubação com a substância. As células foram diluídas com a solução de PI

(2 μg/mL em PBS), na ausência de luz e a 37 ºC, e, após 5 minutos, analisadas por

citometria de fluxo (MILITÃO et al., 2006). Os ensaios foram realizados em três

experimentos independentes realizados em triplicatas. Cinco mil eventos foram

analisados em cada amostra.

4.5.3.5.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.

4.5.3.6 Análise do ciclo celular

4.5.3.6.1 Princípio do Teste

O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G1, S, G2 e M. Durante o

período de crescimento celular (fase G1) uma célula diplóide apresenta um conteúdo

2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA nuclear, i.e.,

possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma

nuclear (2-4n) e na fase seguinte (fase G2) ocorre o segundo período de crescimento

celular, durante o qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida

ocorre a mitose (fase M, 4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas

células filhas, cada uma com um conteúdo 2n em DNA. As células que não se

encontram em divisão celular (G0) apresentam um conteúdo 2n em DNA. Assim, as

diferentes fases do ciclo celular podem ser determinadas a partir do conteúdo de DNA

que elas apresentam. Deste modo, o resultado da distribuição do conteúdo em DNA

nuclear de uma população de células pode dar-se em G0/G1, S e G2/M (SHAPIRO,

1985; CIBAS, 1995).

Page 79: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

79

Para determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula foi utilizado o Iodeto

de Propídeo (PI) como agente fluorogênico. Esse teste baseia-se na capacidade do PI

se ligar ao DNA. Inicialmente a membrana plasmática das células é lisada por um

detergente para que o PI possa se ligar ao núcleo. Assim, as fases do ciclo celular

foram determinadas através do conteúdo do DNA que elas apresentavam (SHAPIRO,

1985; CIBAS, 1995).

4.5.3.6.2 Procedimento experimental

Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração

de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4

μM. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo. Após o período de

incubação uma alíquota de 50 µL da suspensão de células foi transferida para um tubo

eppendorff e incubada por mais 30 minutos com 100µL de uma solução de lise

contendo PI (50µg/mL), Triton X-100 (0,1%) e citrato de sódio (0,1%). Em seguida as

amostras foram analisadas através do programa Guava Express Plus (Guava

Tecnologies), onde foram obtidas histogramas representando a quantidade de células

em cada fase do ciclo celular (G1, S e G2/M) e a quantidade de células com DNA

fragmentado.

4.5.3.6.3 Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos

como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes (n

= 3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por

Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).

4.5.3.7 Ensaio da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V

4.5.3.7.1 Princípio do teste

É baseado na observação de que durante a indução de apoptose, a

fosfatidilserina, um fosfolipídeo de membrana interna, é externalizado, servindo como

marcação de que a célula deverá ser fagocitada. A anexina V pode ligar-se a

Page 80: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

80

fosfatidilserina com grande afinidade e seletividade. As células não marcadas são

ditas viáveis, já as células marcadas apenas com anexina V estão em apoptose inicial.

4.5.3.7.2 Procedimento experimental

Células em necrose, de alguma maneira até agora desconhecida, podem

expressar um pouco de fosfatidilserinna, para compensar é adicionado um corante que

se ligue ao DNA, mas não permeável a membrana íntegra como o brometo de etídio.

Haverá perda da integridade de membrana nas células em apoptose tardia, onde

serão anexina V positivas e também brometo de etídio, enquanto aquelas células

marcadas apenas com o brometo serão as células em necrose. As células não

marcadas, são ditas viáveis, já as células marcadas apenas com anexina V estão em

apoptose inicial.

Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração

de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com a CG nas concentrações de 1, 2 e 4

μM. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo.

4.5.3.7.3 Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram

expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos

independentes (n = 3). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre

os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).

4.5.3.8 Determinação da ativação das caspases- 3 e 7

4.5.3.8.1 Princípio do teste

As caspases pertencem à família de proteases cisteínas, podendo ser divididas

em caspases inflamatórias e caspases apoptóticas, os quais podem ser incluídas nos

grupos de caspases iniciadoras (como no caso da apoptose as caspases- 8 e 9) e

efetoras (como no caso da apoptose as caspases- 3 e 7). A ativação das caspases- 3

e 7 possui papel central no mecanismo de apoptose. As caspases-3 e 7 são

responsáveis pela clivagem de vários componentes celulares relacionados ao reparo e

Page 81: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

81

controle do DNA. Assim, a dosagem das caspases- 3 e 7 permite o estudo de

mecanismos apoptóticos (MEHMET, 2002).

4.5.3.8.2 Procedimento Experimental

A atividade das caspases- 3 e 7 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico

de protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na

detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos

substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por

caspases especificas: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para as caspases-3 e 7.

Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24 horas com

diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e atmosfera

contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle positivo. Às

células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes foram

acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a 37ºC,

5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da incubação,

80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram

centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução

de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de

fluxo.

A densidade óptica da amostra foi medida em comprimento de onda de 405

nm (MILITÃO et al., 2006). A atividade das caspases nas amostras foi determinada em

relação ao controle não tratado e expresso como atividade das caspases-3 e 7

especifica (UI/mg de proteína).

4.5.3.8.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.

4.5.3.9 Determinação da ativação da caspase-8

4.5.3.9.1 Princípio do teste

Page 82: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

82

A atividade da caspase- 8 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de

protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na

detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos

substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por

caspases especificas: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-8.

4.5.3.9.2 Procedimento Experimental

Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24

horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e

atmosfera contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle

positivo. Às células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes

foram acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a

37ºC, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da

incubação, 80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram

centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução

de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de

fluxo.

4.5.3.9.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos.

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,

os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.

4.5.3.10 Determinação da ativação da caspase-9

4.5.3.10.1 Princípio do teste

A atividade da caspase- 9 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de

protease, de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na

detecção espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos

substratos X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por

caspases especificas: Ac-Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-9.

Page 83: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

83

4.5.3.10.2 Procedimento Experimental

Inicialmente, células HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram incubadas por 24

horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 μM) em estufa úmida a 37 ºC e

atmosfera contendo 5% de CO2. A doxorrubicina (0,5 M) foi usada como controle

positivo. Às células tratadas ou não tratadas durante 24 h com as substâncias testes

foram acrescentados 10µL de FLICA 10X. Em seguida, elas foram incubadas por 1 h a

37ºC, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Depois da

incubação, 80 µL de tampão de lavagem foram adicionados às células, as quais foram

centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O precipitado foi ressuspendido em uma solução

de trabalho (PI 1:200 em tampão de lavagem 1x) antes da análise em citômetro de

fluxo.

4.5.3.10.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos.

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,

os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.

4.5.3.11 Ensaio do Western blot (Citocromo c, Procaspase-9 e Caspase -9)

4.5.3.11.1 Princípio do teste

Western blot ou, alternativamente, imunoblot, é uma técnica amplamente

empregada para detectar uma determinada proteína numa dada amostra, por

exemplo, de homogenato celular total. Neste estudo, esta metodologia foi utilizada

para verificar a expressão aumentada ou diminuída de proteína-chave associada as

vias de sinalização celular relacionadas ao dano do DNA e apoptose.

O protocolo de Western blot é realizado em diversas etapas onde constam: a

extração e posterior quantificação de proteínas totais das células submetidas a cada

tratamento, a separação de proteínas desnaturadas de acordo com o peso molecular

em eletroforese vertical de poliacrilamida, a eletrotransferência das proteínas na

disposição em que separam no gel para uma membrana com capacidade de ligar

proteínas e a detecção de proteína específica através de sondas do anticorpo

respectivo, que será posteriormente revelado, nesse caso de modo colorimétrico,

Page 84: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

84

baseado na reação da enzima fosfatase alcalina sobre o substrato NBT/BCIP

produzindo um precipitado de cor púrpura que marca a membrana (JIMENEZ, 2009).

O experimento de Western blot deste estudo empregou o seguinte anticorpo

primário: Citocromo c (Santa Cruz Biotechnology®), Procaspase- 9 (Cell Signalling®) e

Caspase- 9 clivada (Cell Signalling®). Os anticorpos secundários anti-mouse IGg (Cell

Signalling) e anti-rabbit IGg (Cell Signalling) ligados a enzima fosfatase alcalina foram

utilizados na etapa de detecção.

4.5.3.11.2 Procedimento Experimental

4.5.3.11.2.1 Extração de Proteínas

Células de HL-60 tratadas com CG 1 e 2 µM foram encubadas por 12 e 24

horas antes da extração de proteínas totais. Inicialmente, as células foram

centrifugadas e o pellet foi lavado 2 vezes com PBS. O sobrenadante foi descartado e,

às células, foi adicionado o tampão para lise celular (Cell Signaling Technology®)

acrescido de um coquetel de inibidores de proteases (1:100 v/v), ortovanadato de

sódio (1:100 v/v) e PMSF (1:100 v/v), e deixadas em gelo por 1h30, sonicando as

amostras a cada 30 minutos. Foi utilizada a proporção aproximada de 1mL de tampão

RIPA completo para cada 107 células. Ao final da incubação, as amostras foram

centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos a 40C. O sobrenadante foi coletado,

aliquotado e armazenado a -200C.

4.5.3.11.2.2 Quantificação de Proteínas

A quantificação de proteínas da CG foi realizada por método

colorimétrico similar à dosagem proposto por Lowry et al., 1951, valendo-se do kit DC

Protein Assay (BioRad Laboratories) e executado como descrito pelo fabricante em

microplacas de 96 cavidades. Uma curva padrão com BSA (1-10µg) diluído em

tampão RIPA completo foi preparada para calibração do método. O tampão RIPA

completo foi utilizado para marcar o branco experimental. Em seguida, 5 µL da

amostra testada (CG) foi plaqueada em duplicatas e adicionado 25 µL do reagente A

(preparado a partir da adição de 20µL do reagente S a cada 1 mL do reagente A)

seguido por 200 µL do reagente B. As amostras foram incubadas por 10 minutos, sob

agitação leve e lidas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 620 nm.

Page 85: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

85

A concentração de proteínas em cada amostra foi determinada frente à curva

gerada pelo BSA, tendo sido plotado o gráfico absorbância vs. quantidade de

proteínas. A curva foi gerada a partir de regressão linear no programa GraphPad

Prism 5.0 e os valores de absorbância obtidos para a amostra foram substituídas na

equação da curva para determinar as respectivas concentrações de proteína.

4.5.3.11.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida

Para a separação das proteínas das células tratadas com CG foi baseada no

peso molecular, as amostras foram submetidas à eletroforese vertical em gel de

poliacrilamida descontínuo. Após a montagem do sistema vertical (Amershan

Biosciences, modelo miniVE completo) o gel de resolução foi confeccionado para uma

concentração final de 12,5% ou 7,5% de poliacrilamida em tampão Tris-HCl 1,5M, pH

8,8. O gel de concentração foi montado sobre este, com 5% de poliacrilamida em

tampão Tris-HCl 0,5M, pH 6,8.

Da amostra (CG), 15 µg da proteína total carregada com o tampão Blue Juice

5X (5:1 v/v) foi aplicado nos poços do gel de concentração. O marcador de peso

molecular Full-Range Rainbow Marker (12 -125 kDa; GE Healthcare) foi usado sempre

no primeiro poço à esquerda para monitorar a separação das proteínas. A corrida

eletroforética foi realizada a uma voltagem constante de 100 V e 30 mA à temperatura

ambiente, utilizando o tampão de corrida para eletroforese. O tempo de corrida variou

entre 2h e 2h30.

4.5.3.11.2.4 Eletrotransferência

As proteínas separadas foram transferidas para a membrana de PVDF

Hybond-P. Para tanto, o gel foi colocado em contato coma membrana previamente

lavada em MeOH entre esponjas e papéis de filtro banhados na solução de

transferência. A eletrotransferência foi realizada pelo modo de inversão (Amershan

Bioscience, bolt module para miniVE) à voltagem constantes de 100 V e 300 mA por

1h20 à 40C.

4.5.3.11.2.5 Imunodetecção

Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 1h em solução de

BSA 3% em TBS. Em seguida, foram lavadas (3 vezes, 10 minutos cada lavagem)

Page 86: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

86

com TBS-Tween 0,05% (TBS-T) e incubadas sob agitação overnight à 40C com o

anticorpo primário diluído em solução de BSA 5% em TBS-T. Após lavagem com TBS-

T (3 vezes, 10 minutos cada lavagem), as membranas foram incubadas com o

anticorpo secundário acoplado à enzima fosfatase alcalina diluído em solução de BSA

5% em TBS-T por 2h, sob agitação. Após lavagem com TBS-T (3 vezes, 10 minutos

cada lavagem) seguida de lavagem no tampão de revelação, as membranas foram

reveladas com NBT (0,33 mg/mL) e BCIP (0,168 mg/mL), diluídos em 15 mL de

solução de revelação até a indicação colorimétrica desejada.

4.5.3.11.2.6 Análise dos dados

A documentação das membranas reveladas foi realizada em captador de

imagens (Modelo ImageQuant® 300) utilizando, para aquisição e edição, o programa

ImageQuant® 300.

4.5.4 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica

No estudo da atividade genotóxica in vitro, o ensaio do cometa, em células

mononucleares periféricas humanas, foi realizado para avaliar danos à fita simples e à

fita dupla do DNA induzidos pela CG. Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico

in vitro da CG, o ensaio do micronúcleo foi realizado em células mononucleares

periféricas humanas (PBMC).

4.5.4.1 Ensaio de genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa

4.5.4.1.1 Princípio do teste

O ensaio cometa ou SCGE (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) foi

desenvolvido por Singh e colaboradores (1988) para detectar quebra de fitas simples e

duplas na molécula de DNA induzidas por substâncias com potencial genotóxico, tais

como agentes alquilantes, intercalantes e oxidantes. Sendo muito utilizado em estudo

de genética toxicológica, a fim de um biomonitoramento ambiental ou no

monitoramento populacional em humanos. Entretanto, este teste é utilizado como um

indicativo e não como um teste mutagênico. Este pode ser utilizado tanto em células

de animais quanto vegetais in vitro e in vivo (ANDERSON et al., 1994; FAIRBAIRN et

al., 1995; SILVA et al., 2003).

Page 87: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

87

4.5.4.1.2 Procedimento experimental

A avaliação do potencial genotóxico da CG, avaliado através do ensaio do

cometa, foi realizado em linfócitos humanos (células mononucleares periféricas

humanas). O ensaio do cometa foi realizado em condições alcalinas (HARTMANN &

SPEIT, 1997; SINGH & SINGH, 2002; WOJEWODZKA et al. 2002). A doxorrubicina

(0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle

negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.

Para o estudo da atividade genotóxica, linfócitos humanos (células

mononucleares periféricas humanas) (3 X 106 células em 5 mL) foram incubadas por

24 horas com diferentes concentrações da CG (1, 2 e 4 µM). Após o período de

incubação, as células foram lavadas com PBS gelado, removidas com 100 μL de

tripsina 0,15% e ressuspensas em meio completo. Em seguida, 20 μL da suspensão

de células (~106 células/mL) foi dissolvido em 0,5% em agarose com baixo ponto de

fusão e imediatamente espalhada sobre uma lâmina pré-tratada com 1% de agarose

com baixo ponto de fusão. As células foram, então, colocadas em solução de lise por

pelo menos 1 hora a 4 ºC. Em seguida foram dispostas horizontalmente na cuba de

eletroforese e preenchida com tampão de corrida, em pH ~ 13, para o ensaio do

cometa em condições alcalinas (HARTMANN & SPEIT, 1997; SINGH & SINGH, 2002),

por 60 min para permitir o equilíbrio com o tampão de corrida. A eletroforese foi

conduzida em baixa luminosidade por 20 min, usando 14 V e uma corrente de 12 mA

(0,5 V/cm). Após a corrida eletroforética, as lâminas foram retiradas e mergulhadas na

solução de neutralização durante 5 minutos. A análise foi realizada por coloração com

nitrato de prata (NADIN et al. 2001) e as células foram contadas em microscópio

óptico com aumento de 400x. Os ensaios foram realizados em três experimentos

independentes realizados em triplicatas.

4.5.4.1.3 Análise dos dados

A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente

determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (HARTMANN & SPEIT,

1997; TICE et al., 2000; BURLINSON et al., 2007). Foram, contados 50

cometas/lâmina e classificados, de acordo com a percentagem de DNA na cauda do

cometa, indicando o grau de quebra do DNA, de acordo com a figura 10. Onde 0 =

sem danos (<5%), 1 = baixo nível de danos (5-20%), 2 = médio nível de danos (20-

40%), 3 = alto nível de danos (40-95%) e 4 = dano total (95%). Foram calculados o

índice (ID) e a freqüência (FD) de danos. O ID foi obtido pela seguinte fórmula: ID =

Page 88: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

88

400 - ∑ Escores. A FD representa a porcentagem de células que sofrem danos no

DNA. Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

comparações múltiplas de Tukey com a utilização do programa GraphPad Prisma

versão 5.0.

Figura 13: Representação dos tipos de cometas corados com prata e visualizados em microscópio óptico, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de acordo com o dano. a) tipos 0 (verde) e 1 (amarelo); b) tipos 2 (vermelho) e 3 (azul); c) tipo 4. Fonte: Collins (2004).

4.5.4.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em linfócitos humanos –

Teste do micronúcleo in vitro

4.5.4.2.1 Princípio do teste

Micronúcleos (MN) são pequenos corpúsculos compostos de material

cromossômico. Após a separação das cromátides no processo mitótico, dois núcleos

são reconstituídos, um em cada pólo. A membrana nuclear é refeita ao redor destes

dois conjuntos cromossômicos. Mas se um cromossomo inteiro ou um fragmento

cromossômico acêntrico não se integra ao novo núcleo (por não ser unido ao fuso),

este também pode ser considerado um micronúcleo. Os micronúcleos, então, são,

estruturalmente, pequenos núcleos representados por material genético que foi

perdido pelo núcleo principal como conseqüência de um dano genético. Este dano

pode ser causado por agentes químicos, físicos ou biológicos, capazes de interferir no

processo de ligação do cromossomo às fibras do fuso, ou que possam introduzir a

perda de material genético (cromossomos inteiros ou fragmentos). O teste de

Page 89: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

89

micronúcleo, portanto, detecta genotoxicidade cromossômica em eucariotos do tipo

clastogênese e danos ao fuso mitótico (SILVA et al., 2003).

O teste de MN em organismo sob exposição aguda, menos de quatro

semanas, é realizado em eritrócitos jovens, denominados policromatófitos (EPC) que

por conterem RNA ribossomal se cora de forma diferenciada. A análise por ser muito

simples apresenta vantagem em relação à análise dos cromossomos. Os

micronúcleos podem ser identificados em qualquer tipo de célula. Pode-se avaliar

micronúcleos para diagnóstico de doenças hematológicas em células epiteliais da

mucosa bucal, do trato urinário, e também monitorar ambientes através de teste em

roedores, plantas e peixes (SILVA et al., 2003).

4.5.4.2.2 Procedimento experimental

O efeito genotóxico ex vivo da CG foi avaliado em linfócitos humanos.

Amostras de sangue periférico (5 mL) foram retiradas de voluntários saudáveis. A

doxorrubicina foi utilizado com controle positivo na dose de 0,5 µM. O controle

negativo foi tratado com o veiculo (DMSO 10%) utilizado para diluir a substância. O

experimento foi realizado de acordo com os princípios éticos preconizados pela

Comissão de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Federal do

Ceará, n0 106/10.

Os linfócitos humanos (células mononucleares periféricas humanas) (3 X 106

células em 5 mL) foram incubados por 24 horas com diferentes concentrações da CG

(1, 2 e 4 µM), após esse período foi acrescido a Citocalasina B (Sigma®), para realizar

o bloqueio da citocinese, e encubadas por mais 24 horas em estufa a 37ºC. No final

das 72 horas, os tubos foram centrifugados e descartado o sobrenadante, adicionou-

se vagarosamente 5mL a solução de Carnoy gelada por 3 vezes consecutivas. Em

seguida os tubos foram centrifugados, retirado o sobrenadante, deixando 1mL, agitou-

se e realizadas s preparações das lâminas, que foram coradas, adequadamente com

giemsa, e analisadas para a presença de micronúcleos. (SCHMID, 1975; OECD,

1997).

4.5.4.2.3 Análise dos dados

Todas as lâminas, incluindo aqueles do controle positivo e negativo, foram

codificadas antes da análise. A proporção de células micronucleadas no total de

Page 90: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

90

células binucleadas analisadas e número de micronúcleos nas células analisadas

(freqüência de micronúcleos/ 2000 células analisadas), foram observadas por lâmina.

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo

teste Student Newman-Keuls.com a utilização do programa GraphPad Prisma versão

5.0. Qualquer substância é considerada genotóxica quando apresenta um aumento,

estatisticamente significante, da ocorrência de micronúcleos em células binucleadas,

de maneira dose resposta em pelo menos um dos tempos analisados, quando

comparado ao grupo controle negativo (LI et al., 2007).

Figura 14: Representação da formação de micronúcleos a partir de um fragmento cromossômico acêntrico e cromossomo inteiro em uma célula binucleada pelo uso de Citocalasina B. Fonte: Fenech (2000).

4.5.5 Avaliação da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados com

tumor Sarcoma 180

4.5.5.1 Princípio do teste

O sarcoma 180, ou tumor de Crocker, é um tumor indiferenciado que foi

descrito pela primeira vez em camundongos em 1914. Este tumor foi encontrado na

região axilar direita e diagnosticado na época como carcinoma, mas o tecido de

origem não foi especificado, de forma que não se sabe se era uma neoplasia cutânea

ou mamária. Estudos posteriores demonstraram que suas células não produzem

laminina, o que não permite sua caracterização como de origem epitelial. O tumor

invade músculo esquelético, tecido adiposo, nervos e vasos sangüíneos (STEWART et

al., 1959). O Sarcoma 180 pode ser transplantado por inoculação subcutânea,

Page 91: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

91

intramuscular ou intraperitoneal e cresce rapidamente em 90 a 100% dos animais

inoculados, havendo uma taxa de regressão natural de 8 a 10% (ZUCKERBERG,

1973). Apesar de seu comportamento agressivo local, esse tumor não produz

metástases (KURASHIGE & MITSUHASHI, 1982).

O Sarcoma 180 tem sido utilizado no estudo da ação de componentes

químicos, físicos e biológicos sobre o crescimento, patogênese, imunologia,

citogenética e terapêutica de células tumorais. A vantagem da utilização de neoplasias

transplantáveis, em comparação às demais, recai sobre o conhecimento prévio da

quantidade e das características iniciais das células tumorais a serem inoculadas e

sobre o desenvolvimento rápido da neoplasia, que restringe o tempo de estudo

(STEWART et al., 1959).

4.5.5.2 Procedimento experimental

Para o teste de atividade antitumoral, foi utilizado o tumor sólido do tipo

Sarcoma 180, com 8 dias de implantação na região axilar direita. O animal doador, ou

da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizada assepsia

com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal,

tendo sido preparado uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL

de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem de

células (BEZERRA et al., 2006).

Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 106 céls/0,5 mL na região axilar

esquerda dos camundongos (Mus musculus Swiss). Nesse experimento, foram

utilizados 8 animais por grupos, sendo todas fêmeas, apresentando massa corpórea

variando entre 25-30 g. Em seguida, 24 h após a inoculação do tumor foi iniciado o

tratamento durante 7 dias consecutivos de acordo com os grupos abaixo:

Grupo I –– Tratados com o veículo (DMSO 10%) utilizado para diluir as

substâncias (grupo controle negativo) com H2O destilada;

Grupo II – Tratados com 5-fluorouracil 25 mg/kg/dia (grupo controle positivo);

Grupo III – Tratados com CG 25 mg/kg/dia;

Grupo IV – Tratados com CG 50 mg/kg/dia.

Os grupos foram tratados por via oral, sendo o grupo controle positivo (5-

fluorouracil) por via intraperitoneal. Vinte quatro horas após o termino do tratamento,

os animais foram anestesiados e seu sangue periférico foi coletado através do plexo

orbital, em tubos heparinizados, para análises bioquímicas e hematológicas. Em

Page 92: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

92

seguida, os animais foram sacrificados, sendo retirados os tumores, rins, fígados e

baços para pesagem, análise histopatológica. Todos os animais foram pesados no

inicio e no final do tratamento. O experimento foi realizado de acordo com os princípios

éticos de experimentação animal preconizados pela Comissão de Ética em Pesquisa

Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará, n0 08/10.

4.5.5.3 Análise dos dados

O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:

IT (%) = [(A-B)/A] x 100

Onde: A = média dos pesos dos tumores no grupo controle e B = média dos pesos

dos tumores nos animais tratados.

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 3 experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.

4.5.5.4 Parâmetros toxicológicos avaliados

4.5.5.4.1 Avaliação dos parâmetros bioquímicos

4.5.5.4.2 Princípio do teste

Dentre os parâmetros bioquímicos, foram avaliados testes de dano hepático e

testes de função renal.

A alanina transaminase (ALT), também chamada transaminase glutâmica

pirúvica sérica (SGPT ou TGP) ou alanina aminotransferase (ALAT), é uma enzima

presente nos hepatócitos (células do fígado). Quando uma célula é danificada, ela

libera esta enzima no sangue, onde é medida. A ALT aumenta drasticamente em

lesões hepáticas agudas. A aspartato transaminase (AST), também chamada de

transaminase glutâmica oxalacética sérica (SGOT ou TGO) ou aspartato

aminotransferase (ASAT), é similar à ALT de modo que é outra enzima associada às

células parenquimais do fígado. Está aumentada na lesão hepática aguda, mas

Page 93: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

93

também está presente nas hemácias e músculos esqueléticos e cardíacos, não sendo

então uma enzima específica do fígado (GAW et al., 2004).

Como parâmetro da função renal, foi avaliado a concentração de úreia

plasmatica. A uréia é uma substância que provém dos alimentos que contém proteínas

como, por exemplo, os alimentos de origem animal (carne, ovos), e que devem ser

quase totalmente eliminada do organismo através da urina. Quando os rins estão com

a sua função de filtração prejudicada, a uréia fica acumulada no sangue, provocando

alterações em vários órgãos, estabelecendo a uremia. Entretanto, a concentração

sérica de uréia não é tão precisa como medida da função glomerular. A ingestão de

proteínas na dieta afeta a concentração de uréia plasmática. O sangramento

gastrintestinal fará com que a uréia do plasma esteja elevada. E ainda, a uréia é

reabsorvida pelos túbulos (GAW et al., 2004).

A creatinina é utilizada como índice de função renal devido à constância da

formação e excreção da creatinina. A avaliação inicial da função renal na prática

clínica diária costuma ser realizada através da dosagem de creatinina plasmática

(CrP). A concentração sérica e excreção de creatinina urinária estão aumentadas

significantemente pela necrose muscular esquelética, miastenia grave e fome. Como

também, em hipertiroidismo e acidose diabética. Por ocasião de ter independência a

fatores como dieta (ingestão de proteína), grau de hidratação e do metabolismo de

proteínas, a creatinina plasmática é um teste de triagem mais confiável ou índice de

função renal do que a uréia. Ela tende a aumentar mais lentamente que a uréia na

doença renal (LOPES, 1998; BURMEISTER et al.; 2007).

4.5.5.4.3 Procedimento experimental

Para avaliar os parâmetros bioquímicos, sangue periférico foi coletado através

do plexo orbital, em tubos heparinizados, onde o plasma foi utilizado para avaliar a

função renal e danos hepáticos. Para investigação de dano hepático foram

determinados os níveis séricos das transaminases: aspartato aminotransferase (AST)

e alanina aminotransferase (ALT). Para tanto, utilizaram-se kits da LABTEST®

sistemas para diagnostico, seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante. A função

renal foi avaliada pelos parâmetros séricos clássicos da integridade renal: a uréia e a

creatinina. Para tanto, também se utilizou o kit da LABTEST® sistemas para

diagnostico, seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante. Também foi coletado o

sangue do plexo orbital de 5 animais saudáveis, além dos grupos tratados para estas

análises.

Page 94: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

94

4.5.5.4.4 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 8 animais por grupo.

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,

os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.

4.5.5.4.2 Avaliação dos parâmetros hematológicos

4.5.5.4.2.1 Princípio do teste

A análise dos parâmetros hematológicos consta de uma série de provas que

possibilitam detectar anormalidades que se apresentam em certos fenômenos

fisiopatológicos importantes nos animais e nos homens e que se refletem no sangue

(LORENZI, 2006).

4.5.5.4.2.2 Procedimento experimental

Foram realizadas as seguintes provas hematológicas: dosagem de

hemoglobina, contagem de plaquetas e leucócitos realizada em hematocitômetro. A

contagem diferencial leucocitária foi realizada por meio de esfregaços sanguíneos e

foram determinados valores relativos e absolutos de linfócitos, neutrófilos, eosinófilos,

monócitos e basófilos. Também foi coletado o sangue do plexo orbital de 5 animais

saudáveis, além dos grupos tratados para estas análises.

4.5.5.4.2.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de 8 animais por grupo .

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,

os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.

4.5.5.5 Análise histopatológica

Page 95: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

95

4.5.5.5.1 Princípio do teste

A técnica de coloração hematoxilina e eosina (H/E) permite diferenciar o

citoplasma do núcleo, possibilitando, assim, a análise de algumas estruturas celulares.

A análise morfológica e histopatológica de tecidos dos animais tratadas permitem

identificar alterações que possam ocorrer e fornecer subsídios para sugerir os efeitos

tóxicos causados pela droga.

4.5.5.5.2 Procedimento experimental

Após a eutanásia dos animais, foram retirados todos os tumores e órgãos

(estômago, fígado, baço, rins), pesados e armazenados em solução de formol a 10%.

As peças foram retiradas do formol e seccionadas em pequenas partes para posterior

preparação das lâminas. O material foi fixado em formol a 10% por 24 horas,

desparafinizado em xilol por 15 minutos, e desidratado em concentrações crescentes

de álcool até 70% (mergulhando-se rapidamente as lâminas), sendo posteriormente

lavado em água destilada até a total remoção do álcool. Posteriormente as lâminas

foram coradas com hematoxilina e eosina.

4.5.5.5.3 Análise dos dados

As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio óptico e

analizadas por patologista experiente, para avaliação das características morfológicas

e realizada a comparação dos controles negativo (não tratadas) e positivo.

Page 96: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Resultados

Page 97: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

97

5 RESULTADOS

5.1 Estudo da atividade citotóxica

O estudo da atividade citotóxica da CG foi realizado em células humanas

tumorais e em células humana normais.

5.1.1 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células tumorais humanas

A avaliação do potencial citotóxico da CG foi realizada em 5 linhagens de

células tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de

cólon, SF-295 – glioblastoma, MDA-MB-435 – melanoma e K562 – leucemia mielóide

crônica), através do método do MTT após 72 horas de incubação. A doxorrubicina foi

usada como controle positivo em todos os experimentos.

Os resultados encontrados no ensaio de citotóxico da CG, em células tumorais

humanas estão apresentados na Tabela 3. CG apresentou elevado potencial de

citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de CI50 que

variaram de 0,48 µg/mL (1,89 µM) em Hl-60; 0,30 µg/mL (1,18 µM) em HCT-8; 0,84

µg/mL (3,32 µM) em SF-295; 0,45 µg/mL (1,77 µM) em MDA-MB-435 e 0,43 µg/mL

(1,69 µM) em K562. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também

apresentou citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de

CI50 que variaram de 0,01 µg/mL (0,02 µM) a 0,48 µg/mL (0,88 µM) para as linhagens

de HCT-8 e MDA-MB-435, respectivamente. Para este ensaio, foram consideradas

citotóxicas aquelas substâncias que apresentaram CI50 < 1 µg/mL (3,95 µM).

Page 98: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

98

Tabela 3: Atividade citotóxica da CG frente às linhagens tumorais. Células humanas

de leucemias (HL-60, K562), carcinoma de cólon (HCT-8), glioblastoma (SF-295) e

carcinoma de mama (MDA-MB-435). A Doxorrubicina foi usada como controle positivo.

*Valores de IC50 em µg/mL (µM) originados de experimentos independentes (n=3) da CG obtidos pelo ensaio do MTT em painel de linhagens celulares após 72h de incubação. Os dados foram obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

5.1.2 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células normais humanas

(PBMC)

Para a avaliação da seletividade em células normais humanas, a atividade

citotóxica da CG foi avaliada em PBMC (peripheral blood mononuclear cell – linfócitos

e monócitos) pelo método alamar blue com 24, 48 e 72 horas de incubação.

Os resultados encontrados estão descritos na Tabela 4, que apresenta o

potencial citotóxico da CG, em células normais humana. Quando a atividade citotóxica

da CG foi avaliada em células humanas normais (PBMC), o valor de CI50 encontrado

foi de 10,51 µg/mL (41,54 µM) em 24 horas; 2,29 µg/mL (9,05 µM) em 48 horas e 1,79

µg/mL (7,07 µM) em 72 horas. Assim, a CG apresenta um índice de citotoxicidade em

PBMC que aumenta com o tempo de exposição à substância.

Entretanto, comparando a CI50 da CG em HL-60 (Tabela 3), utilizada como

modelo nos demais testes biológicos, com a CI50 em PBMC após 72 h de incubação

(Tabela 4), observou-se que a citotoxicidade foi maior em células HL-60 do que em

PBMC.

Substâncias Linhagem Celular- CI50 [µg/mL] (µM)

HL-60

HCT-8

SF-295

MDA-MB-

435 K562

CG

0,48 (1,89) 0,26-0,82*

0,30 (1,18) 0,20-0,47*

0,84 (3,32) 0,6-1,19*

0,45 (1,77) 0,34-0,60*

0,43 (1,69) 0,23-1,35*

Doxorrubicina 0,02 (0,04) 0,01-0,03*

0,01 (0,02) 0,01-0,02*

0,23 (0,40) 0,19-0,25*

0,48 (0,83) 0,34-0,66*

0,14 (0,24) 0,09-0,23*

Page 99: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

99

Tabela 4: Atividade citotóxica da CG frente à linhagem normal obtida de cultura

primária (PBMC) após 24, 48 e 72 horas de incubação.

Substância Linhagem Celular- CI50 [µg/mL] (µM)

PBMC

24 horas 48 horas 72 horas

CG 10,51 (41,54) 2,29 (9,05) 1,79 (7,07) 6,07-18,19* 1,67-3,14* 1,16-2,77*

*A tabela apresenta os valores de CI50 em µg/mL (µM) originados de experimentos independentes (n=3) obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

5.2 Atividade hemolítica

Este ensaio permite avaliar o potencial das substâncias em causar lesões na

membrana plasmática da célula, seja pela formação de poros ou pela ruptura total, por

meio da utilização de eritrócitos de camundongos (Costa-Lotufo et at., 2002).

A substância CG nas concentrações testadas não foi capaz de causar hemólise

(Tabela 5) em eritrócitos de camundongos, desta forma, pode-se inferir que a

atividade citotóxica não é dependente de lise imediata da membrana plasmática,

podendo estar relacionado com um mecanismo de morte celular mais específico.

Tabela 5: Avaliação do potencial hemolítico da CG frente a eritrócitos de

camundongos Swiss (Mus musculus).

Substância-Teste EC50 µg/mL (µM)

CG

>200 µg/mL (790,5 µM)

*EC50: Concentração efetiva em que a substância-teste causa hemólise em 50% dos eritrócitos.

Resultados expressos em g/mL (M).

Page 100: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

100

5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxica em células HL-60

A fim de investigar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade da

CG, células de HL-60, linhagem leucêmica, (0,3 x 106 células/mL) foram utilizadas

como modelo, após 24 horas de incubação com o composto teste nas concentrações

de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, na maioria dos experimentos, baseadas nos valores de CI50. A

doxorrubicina (Dox) na concentração de 0,5 µM foi utilizada como controle positivo.

Foram avaliados a viabilidade celular por exclusão do azul de tripan, o padrão

de morte celular por coloração diferencial com Brometo de Etídio e Laranja de

Acridina, a síntese de DNA pelo ensaio do BrdU e a morfologia celular pela Coloração

diferencial com May-Grunwald-Giemsa. Em seguida, a viabilidade celular, a

integridade de membrana e o conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete as fases

do ciclo celular, foram analisados por citometria de fluxo. O efeito da CG sobre a

ativação das caspases- 3, 7, 8 e 9 também foi avaliado por citometria de fluxo. Por fim,

a expressão do Citocromo C foi detectada pelo método do Western blot.

5.3.1 Determinação da viabilidade celular por exclusão do azul de Tripan

Este ensaio é um método direto de avaliação da viabilidade celular após o

tratamento com o composto teste. A análise dos resultados permite verificar que o

composto CG na concentração de 0,04 µM não foi capaz de reduzir a viabilidade de

células HL-60 em nenhum tempo de incubação investigado. Adicionalmente, CG nas

concentrações de 0,2; 0,4 e 2,0 µM reduziram significativamente (p<0,05) o número de

células viáveis apenas após 24 h de incubação. Já na maior concentração testada (4,0

µM), CG promoveu redução significativa (p<0,001) e similar após 6 e 12 h de

incubação (68,59 ± 6,70%), sendo este efeito maior após 24 h de incubação, com uma

redução de (41,65 ± 3,13%) em relação ao controle, o que resulta numa diferença de

58,4 % no número de células viáveis (Figura 15).

Page 101: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

101

0 3 6 9 12 15 18 21 240

25

50

75

100

125controle

0,04 M

0,2M

0,4M

2,0 M

4,0 M

** *

**

**

*

Tempo de incubação (h)

Célu

las v

iáveis

(%

)

Figura 15: Curva de crescimento em células leucêmicas humanas (HL-60), tratadas com o composto CG nas concentrações 0,04 µM; 0,2 µM; 0,4 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A viabilidade das células leucêmicas foi determinada por exclusão de azul de tripan em 3, 6, 12 e 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), * p< 0,05; ** p<0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio

Para investigar o padrão de morte celular (apoptose ou necrose) envolvido na

atividade citotóxica da CG realizou-se a coloração diferencial com laranja de acridina e

brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células

viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado.

Para confirmar que a atividade antiproliferativa do composto testado está

relacionada com a indução de apoptose e necrose, a análise morfológica das células

tratadas foi investigada utilizando a coloração diferencial de laranja de acridina e

brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células

viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado. Os resultados demonstraram que

as células não-tratadas com CG (grupo controle) apresentaram um percentual de

97,67 ± 0,69 % de células viáveis (coloração verde uniforme e morfologia normal)

(Figura 16). O tratamento das células com o composto CG, na menor concentração

testada (1,0 µM), causou poucas alterações significativas no padrão morfológico de

células HL-60 quando comparadas ao controle negativo. No entanto, a partir da

concentração intermediária (2,0 µM) foi observado um aumento de 60,44 ± 0,80% na

percentagem de células em processo de apoptose. Já na maior concentração (4,0

µM), a CG causou uma redução da percentagem de células viáveis. Essa redução foi

Page 102: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

102

acompanhada por um aumento de 94 ± 0,19% de células com características de

apoptose e apenas um discreto aumento de 3,11 ± 0,11% de células em necrose

estatisticamente significativo (p<0,001). Já a doxorrubicina causou 91,22 ± 0,48%

(p<0,001) de apoptose, diminuindo visivelmente o percentual de células viáveis

(Figura 16).

C Dox 1,0 2,0 4,00

25

50

75

100Viável

Apoptose

Necrose

CG

(M)

**

**

**

**

**

**

**

** **

Célu

las (

%)

Figura 16: Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose) avaliado em células leucêmicas humanas (HL-60), tratada com o composto CG nas concentrações 1,0 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A análise foi realizada após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (DOX). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), **p< 0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.3 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU

Para relacionar a atividade antiproliferativa dos compostos testados à inibição

da síntese de DNA foi realizado o ensaio de incorporação do BrdU. Neste ensaio foi

observado que células HL-60 tratadas com o derivado de chalcona (CG), onde nas

concentrações testadas (1,0 e 2,0 µM) mostram que as células viáveis existentes

marcadas no núcleo com coloração marrom destacam a incorporação com o BrdU,

com diferença significativa em relação ao controle negativo (70,13 ± 1,18%), com

66,63 ± 3,35% e 72,63 ± 4,0%; respectivamente (Figura 17 e 18). A doxorrubicina,

utilizada como controle positivo, causou 54,38% (15,75 ± 0,86) de inibição da

proliferação celular em relação ao controle negativo (Figura 17). A maior concentração

Page 103: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

103

da CG (4,0 µM) causou destruição celular tão intensa ao ponto de impossibilitar a

contagem de células. Por esse motivo, decidiu-se avaliar a inibição da síntese de DNA

apenas na concentração corresponde à CI50 e metade dela.

C Dox 1.0 2.00

50

100

CG

(M)

70,13 ± 1,18

15,75 ± 0,86

66,63 ± 3,35 72,63 ± 4,0

**

*

Cél

ula

s (%

)

Figura 17: Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 horas de incubação. As células foram tratadas com o composto CG nas concentrações 1,0 µM e 2,0 µM. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2), *p< 0,05 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

Figura 18: Fotomicrografias das lâminas das células de HL-60, tratadas e não tratadas, após 24 horas de incubação com a doxorrubicina e CG. A- Controle negativo (DMSO), B- tratadas com Doxorrubicina (0,5 µM), C- 1,0 µM e D- 2,0 µM. A contagem foi realizada através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), células com núcleos de coloração marrom. O aumento foi de 400X.

Page 104: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

104

5.3.4 Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa

A análise por microscopia das células HL-60, coradas com May-Grunwald-

Giemsa, revelou diversas mudanças morfológicas induzidas pela CG e Doxorrubicina.

Após 24 horas em cultura, células HL-60 do grupo do controle (não-tratadas) exibiram

uma morfologia típica de células não aderidas, tais como membrana íntegra, células

pleomórficas, nítida visualização tanto da membrana plasmática quanto nuclear

(Figura 19A). As células tratadas com a Dox (0,5 µM), utilizada como controle positivo,

induziu redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear

em células de HL-60, todas as características condizentes com apoptose (Figura

19B). Já as células tratadas com a menor concentração da CG (1,0 µM), observou-se

pouca diferença estrutural das células em relação ao controle negativo (Figura 19C).

Nas duas maiores concentrações testadas de CG (2,0 e 4,0 µM), apresentaram

mudanças morfológicas consistentes com processo de apoptose incluindo redução do

volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear, sendo que na

maior concentração (4,0 µM), observa-se um padrão semelhante, produzindo

características e redução de células viáveis muito próximas ao controle positivo tratado

com doxorrubicina (Figura 19D e E).

Figura 19: Fotomicrografias das células de HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com a CG e coradas com May-Grunwald-Giemsa. O aumento foi de 400X. A- Controle negativo, B- doxorrubicina a 0,5 µM, C- 1,0 µM (CG), D- 2,0 µM (CG) e E- 4,0 µM (CG). As setas pretas indicam redução de volume celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos “blebs”.

Page 105: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

105

5.3.5 Análises da citometria de fluxo

5.3.5.1 Integridade de membrana celular e concentração de células

A determinação da viabilidade celular serviu como parâmetro para avaliar a

integridade de membrana plasmática de células com morfologia normal, esse teste foi

realizado por citometria de fluxo utilizando o Iodeto de Propídeo (PI) como agente

fluorogênico. A doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle positivo em todos os

experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir

a substância. Foram utilizadas, neste estudo, as concentrações (1, 2 e 4 μM) da CG.

As células foram analisadas 24 h após a incubação com a substância teste.

Na avaliação da viabilidade celular, onde foi utilizado iodeto de propídeo como

corante hidrofílico permeável somente em células com membrana rompida, foi

observado perda da integridade da membrana citoplasmática, com 53,5% a partir de

24 horas de incubação com a maior concentração de CG testada, 4,0 µM (Figura 20A)

em relação ao controle negativo. A integridade de membrana foi afetada tanto na

concentração de 2,0 µM (75,18 ± 3,25%) como na concentração de 4,0 µM (43,29 ±

2,68%) em relação ao controle negativo. A doxorrubicina, por sua vez, reduziu a

proliferação celular com pouca alteração da integridade da membrana citoplasmática

96,79 ± 0,22% (Figuras 20A e B). Como observado na Figura 20B, a CG causou uma

redução significativa na proliferação celular, de maneira dose-dependente, com 24

horas após a incubação, onde nos tratados com doxorrubicina (0,5 µM), CG (2,0 µM e

4,0 µM) foram significativos (p<0,001) .

Esses dados confirmam os resultados observados através dos testes de MTT,

viabilidade por exclusão do azul de tripan e coloração por May-Grunwald-Giemsa e

LA/BE.

Page 106: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

106

Figura 20: A- Avaliação da integridade de membrana plasmática e B- Avaliação do número de células viáveis, analisados por citometria de fluxo. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM e com o controle doxorrubicina a 0,5 µM. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.3.5.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA

A progressão do ciclo celular e a fragmentação internucleossomal do DNA das

células HL-60, tratadas com CG, foram realizadas por citometria de fluxo e analisadas

através do programa ModFit LT 3.1. Os resultados mostraram que tanto o controle

positivo (doxorrubicina) quanto às duas maiores concentrações de CG, 2,0 e 4,0 µM

causaram aumento significante na fragmentação de DNA (p < 0,05). Após 24 horas de

exposição, células não tratadas apresentaram 4,36 ± 0,37% de fragmentação de DNA,

enquanto as células tratadas com CG nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM causaram

22,54 ± 2,50% e 48,49 ± 2,60%, respectivamente. A menor concentração da CG 1,0

µM não causou fragmentação significativa do DNA. Já a doxorrubicina (Dox), utilizada

como controle positivo, mostrou 90,41 ± 2,06% das células com DNA fragmentado

(Figura 22A).

Quanto à progressão das fases do ciclo celular, as células tratadas com CG

tiveram diferenças significativas nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM, com 40,77% e

40,51% em relação ao controle negativo 50,88%, mostrando que não houve parada na

fase G0/G1. Já a doxorrubicina, promoveu uma parada na fase G0/G1 de 90% em

Page 107: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

107

relação ao controle negativo e intensa fragmentação do DNA. Já na fase S, A CG não

demonstrou diferença significativa em ralação ao controle, bem como as células

tratadas com doxorrubicina. Na fase G2/M, a maior concentração testada (4,0 µM),

apresentou parada nesta fase de 20,87 ± 1,20% com diferença significativa (p<0,05)

(Figura 21 e 22B).

Figura 21: Efeito da CG no ciclo celular após 24 h de incubação. Os histogramas do ciclo celular foram analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células de HL-60, determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A- Controle negativo; B- Doxorrubicina (0,5 µM); C, D e E- CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM.

Page 108: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

108

Figura 22: A- Determinação da fragmentação do DNA; B- Análise do efeito sobre o ciclo celular. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, após 24 h de incubação e analisados por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. (C-) representa o controle negativo; (DOX) controle positivo com Doxorrubicina (0,5 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Page 109: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

109

5.3.5.3 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V

A fim de confirmar o tipo de morte celular induzida pela CG, a externalização

da fosfatidilserina foi avaliada por citometria de fluxo. A Anexina V liga-se a

fosfatidilserina, reconhecendo desta forma as células em apoptose. A exposição da

fosfatidilserina é para sinalizar a fagocitose das células apoptóticas. O Figura 23B

mostra que há uma diminuição das células viáveis concentração-dependente nas

concentrações de CG de 2,0 e 4,0 µM, com 79,36 ± 1,71% e 50,57 ± 2,28%,

respectivamente, estatísticamente significativo, *p<0,05. Como observado na Figura

23A e B, houve uma indução da externalização da fosfatidilserina de forma

concentração dependente, quando analisamos a indução de apoptose inicial mais a

tardia, com 8,53% e 15,27%; 10,25% e 33,63%, respectivamente, sendo significativo

nas maiores concentrações (2,0 e 4,0 µM), com *p<0,05.

A CG aumentou o percentual de células em processo tardio a necrose, nas

concentrações de 2,0 e 4,0 µM da CG, com 4,4% e 6,0% em relação ao controle

negativo, *p<0,05 (Figura 23A e B). Já a doxorrubicina (0,5 µM) apresentou aumento

significativo na porcentagem de células em apoptose inicial e tardia, com 32,44% e

65,15%, respectivamente (Figura 23A e B).

Page 110: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

110

Figura 23: Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-

60. No histograma (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Gráfico (B): % de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Page 111: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

111

5.3.5.4 Detecção da ativação de Caspases Efetoras – 3 e 7

A ativação da caspase-3 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A doxorrubicina

(0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle

negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. As

concentrações (1,0; 2,0 e 4,0 µM) utilizadas da CG neste estudo foram previamente

determinadas. As células foram analisadas 24 horas após a incubação com o derivado

de chalcona (CG).

Como demonstrado na Figura 24A, houve uma diminuição estatiticamente

significativa (p<0,001) no número de células viáveis, nas células tratadas com CG nas

concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, 84,88 ± 2,65%, 43,74 ± 0,99% e 20,98 ± 1,34%,

respectivamente. O controle positivo, doxorrubicina 0,5 µM, mostrou um percentual de

20,09 ± 1,43%, resultado este muito próximo a dose maior da CG (4,0 µM). Com

relação aos valores de apoptose inicial e tardia, observamos que nas maiores

concentrações da CG (2,0 e 4,0 µM) houve um aumento significante (**p<0,001) em

relação ao controle negativo, 15,34 ± 1,6% e 14,77 ± 0,36% apoptose inicial; 18,36 ±

4,21% e 43,61 ± 3,13% apoptose tardia (Figuras 24 e 25).

Na avaliação da necrose as maiores concentrações da CG aumentaram o

percentual da mesma em 15,69 ± 3,08% e 17,87 ± 2,09%, respectivamente (Figura

24D e 25- 4 e 5). A Caspase 3 e 7 foi ativada pela doxorrubicina 0,5 µM e CG 2,0 e 4,0

µM.

Figura 24: Análise da detecção das Caspases Efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células

HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de

Viáveis Apoptose Inicial

Apoptose tardia Necrose

Page 112: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

112

variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Figura 25: Histograma referente ao teste das Caspases Efetoras 3 e 7. (A): 1- Controle

negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.3.5.5 Detecção da ativação de Caspases Iniciadoras -8/-9

Como mostrado nas Figuras 26 e 27, a Caspase- 8 demonstrou

comportamento semelhante ao encontrado nas Caspase- 3/-7. Houve diminuição de

células viáveis em todas as concentrações testadas de forma significante (p<0,05),

doxorrubicina 0,5 µM (28,47 ± 2,65%), CG 1,0; 2,0 e 4,0 µM (27,19 ± 5,15%; 18,43 ±

0,24% e 21,26 ± 4,00%). Aumentou o número de células apoptóticas iniciais e tardias

(*p<0,05 e **p<0,001), embora esse aumento tenha somente ocorrido com

significância na apoptose inicial nas células tratadas com doxorrubicina (26,02 ±

2,10%) (Figura 26B). Já na apoptose tardia tanto a doxorrubicina quanto as

concentrações de CG testadas aumentaram o percentual em 26,43 ± 3,82% (DOX- 0,5

µM); 40,41 ± 4,88%, 30,60 ± 7,96% e 44,55 ± 4,94% (CG- 1,0; 2,0 e 4,0 µM) em

relação ao controle negativo (Figuras 26 e 27- 2, 3, 4 e 5).

Na necrose, o aumento do percentual ocorreu de forma significativa na

doxorrubicina, similarmente na dose de 4,0 µM da CG. Porém, na dose correlacionada

a CI50 (2,0 µM) também houve aumento de 7,19 ± 0,47% (Figuras 26D e 27-4).

Page 113: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

113

Na avaliação da Caspase- 9, a redução das células viáveis foi significativa na

dose maior de 4,0 µM, com 28, 89 ± 52%. A doxorrubicina houve diminuição de 45,00

± 5,26% (Figura 28A). Na apoptose inicial e tardia, observou-se que apenas na maior

dose da CG houve aumento significativo da apoptose, 24,07 ± 8,58% e 11,85 ± 4,62%

respectivamente. Na necrose, pode-se observar aumento nas células tratadas com

doxorrubicina de 25,10 ± 4,94% (Figuras 28 e 29).

Figura 26: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 8, por citometria de fluxo em células

HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Viáveis Apoptose Inicial

Apoptose tardia Necrose

Page 114: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

114

Figura 27: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 8. (A): 1- Controle negativo; 2-

tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Page 115: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

115

Figura 28: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 9, por citometria de fluxo em células

HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Figura 29: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 9. (A): 1- Controle negativo; 2-

tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Viáveis Apoptose Inicial

Apoptose tardia Necrose

Page 116: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

116

5.3.5.6 Detecção do Citocromo C, Procaspase-9 e Caspase -9 pelo método do

Western blot

Inicialmente, a análise pelo método do Western blot avaliou a expressão do

citocromo C, no qual esta análise está relacionada com a via intrínseca da apoptose.

O citocromo C reside no espaço entre as membranas interna e externa da mitocôndria,

que uma vez liberada no citosol das células e associado a outras proteínas,

desencadeiam a cascata de eventos que resulta na morte apoptótica.

O tratamento das células de HL-60 foi feito com CG nas concentrações de 1,0

e 2,0 µM, e incubadas por 12 e 24 horas, para todos os experimentos do Western blot.

De um modo geral, a CG apresentou um padrão de expressão semelhante quando

comparado com a expressão da proteína do controle nos mesmos tempos de

incubação, não sendo observado nenhuma diferença entre eles (Figura 30).

As caspases são expressas na forma de proenzimas, que devem ser clivadas

para ocorrer a sua ativação. As caspases iniciadoras (2,8, 9, 10 e 12) são

autocatalíticas, de modo que conseguem auto-ativar em respostas a estímulos

apoptóticos e desencadear o processo. As efetoras (3, 6 e 7) são clivadas e, portanto

ativadas pelas caspases iniciadoras.

A indução da procaspase 9, assim como a sua ativação, não pôde ser

observada em nenhum tempo de incubação com a CG, nas duas concentrações

testadas, quando comparados com o controle (Figura 30). Já a caspase-9 clivada,

mostrou-se fracamente expressa somente na concentração de 2,0 µM, no tempo de 24

horas de incubação (Figura 30), corroborando com o resultado apresentado

anteriormente da detecção da caspase-9 pelo citômetro de fluxo (Figura 28).

Figura 30: Expressão das procaspase e caspase-9, citocromo c em células de HL-60, controle

e tratadas com 1,0 e 2,0 µM, durante 12 e 24h, avaliada por Western blot.

Page 117: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

117

5.3.6 Estudo da atividade genotóxica e mutagênica

5.3.6.1 Avaliação da genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa

A avaliação do potencial genotóxico induzido pela substância CG foi realizada

através do teste do cometa em PBMCs, após 24 horas de incubação. As

concentrações de CG utilizadas neste ensaio foram 1,0; 2,0 e 4,0 µM. A doxorrubicina

foi utilizada como controle positivo, na concentração de 0,5 µM e o controle negativo

foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.

O potencial genotóxico da CG foi avaliado no ensaio do cometa em condições

alcalinas (detecção de quebra da fita simples e da fita dupla do DNA). O ensaio

mostrou na análise da freqüência de dano (%), que em nenhuma concentração

testada da CG houve danos de grau 2,3 e 4, de forma significativa. Em relação ao

controle, as três concentrações de CG testadas mostraram um pequeno aumento da

migração do DNA, representado pelo dano grau 1. A doxorrubicina, controle positivo,

na concentração de 0,5 µM, induziu de forma significativa danos de graus 3 e 4,

considerado alto nível de dano (Figura 31).

Com relação ao índice de dano, a CG não mostrou características genotóxicas

significativas quando comparados com o controle negativo. A doxorrubicina, controle

positivo, mostrou um índice de 237,5 ± 3,27 e freqüência de dano (88,50 ± 1,48%) ao

DNA (Figura 31 e 32).

C-

Dox

1,0

2,0

4,0

0

25

50

75

100

0

1

2

3

4

Grau de Dano

(µM)

CG

**

**

** ** **Fre

qu

ên

cia

de d

an

o (

%)

Figura 31: Freqüência de dano ao DNA. O derivado de chalcona (CG) nas concentrações de

1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

Page 118: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

118

C-Dox

1,0 2,0 4,0

0

50

100

150

200

250 **

CG

(µM)

Índ

ice

de

dan

o

(0-4

00)

Figura 32: Índice de dano ao DNA. A substância CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM

sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C-: controle negativo. Os valores foram obtidos pela multiplicação do número de células de classe de dano, variando de 0 (sem dano) a 400 (dano máximo). Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.6.2 Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade – Teste do micronúcleo in

vitro

Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico in vitro da CG, o ensaio do

micronúcleo em PBMC, foi realizado após 24 horas após a administração do fármaco.

As concentrações da CG usadas neste ensaio foram às mesmas dos testes anteriores,

1,0; 2,0 e 4,0 µM. A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo, na dose de 0,5

µM e o controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a

substância.

Observa-se na Figura 33, que a CG nas doses testadas, 1,0 (4,33 ± 1,11); 2,0

(3,00 ± 0,93) e 4,0 µM (6,50 ± 0,95), não induziu significantemente a quantidade de

micronúcleo analisados na contagem de 2000 células binucleadas, ao contrário da

doxorrubicina (47,00 ± 5,00), usada como controle positivo, que aumentou de forma

significante (**p<0,001) em relação ao controle negativo (3,66 ± 0,88).

De acordo com os resultados, a CG apresentou resultado negativo neste

ensaio, ou seja, a substância não apresenta potencial genotóxica/mutagênica in vitro,

Page 119: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

119

sendo satisfatório, visto que a substância testada possui característica citotóxica e não

genotóxica e mutagênica.

C DOX 1,0 2,0 4,00

10

20

30

40

50

60C

DOX

1,0

2,0

4,0

(M)

CG

**

MN

po

r 2000 C

BN

Figura 33: Micronúcleo por 2000 células Binucleadas. A substância CG nas concentrações

1,0; 2,0 e 4,0 µM sobre PBMC, analisado pelo teste do micronúcleo após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.7 Estudo in vivo

5.3.7.1 Estudo da Atividade Antitumoral em camundongos transplantados com

Sarcoma 180

A atividade antitumoral da CG foi analisada em camundongos

transplantados com o tumor experimental Sarcoma 180. Foi avaliado através da

pesagem dos tumores, bem como da análise histopatológica destes. O tratamento

consistiu na administração da CG nas doses de 25 e 50mg/Kg, por via oral. O controle

negativo foi tratado com o veículo usado para diluir os compostos (DMSO 10%), por

via oral e o controle positivo, 5-Fluorouracil, na dose de 25mg/Kg, pela via

intraperitoneal, durante 7 dias consecutivos. No 8o dia, os animais foram sacrificados

por deslocamento cervical e dissecados para a retirada do tumor, fígado, baço, rins e

estômago. Dentre as doses estudadas, a CG 25 e 50mg/kg/dia oral foram capazes de

reduzir o crescimento tumoral de forma significativa (**p < 0.001) quando comparadas

ao controle negativo, DMSO 10%.

Page 120: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

120

O efeito antitumoral da CG está apresentado na Figura 34, onde o peso

relativo dos tumores é: controle negativo (2,32 ± 0,28), controle positivo (0,30 ± 0,05),

CG 25 mg/Kg (1,05 ± 0,11) e CG 50 mg/Kg (0,71 ± 0,07), o que equivale a uma

inibição tumoral de 87,07% do 5-FU, 54,85% da CG na menor dose (25 mg/Kg) e

69,11% da CG na maior dose (50 mg/Kg).

As análises histopatológicas dos tumores (Figura 35) retirados de

camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180 dos grupos controles e

tratados mostraram características de neoplasia maligna constituída por células

redondas e poligonais, com núcleos hipercromáticos e graus variados de pleomorfismo

celular e nuclear, com alguns núcleos vesiculosos e macronúcleos acidofílicos. Foram

visualizadas mitoses, invasão muscular e áreas de necrose. Não houve mudança nos

padrões morfológicos das células tumorais em todos os grupos.

Figura 34: Peso tumoral e percentual de inibição tumoral dos animais submetidos ao protocolo

de avaliação da atividade antitumoral. A substância CG foi testada nas concentrações 25 mg/Kg e 50 mg/Kg; 5-FU, 25 mg/Kg, controle positivo . Controle negativo (DMSO 10%). Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (**p<0,001), comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

Page 121: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

121

Figura 35: Fotomicrografia dos tumores de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.

5.3.7.2 Avaliação dos aspectos toxicológicos nos órgãos dos camundongos

transplantados com Sarcoma 180

A Tabela 6 apresenta os resultados sobre as alterações de peso nos órgãos,

como fígado, baço, rins e estômago; já a Figura 36, mostra alterações no peso dos

animais. Nenhuma diferença foi encontrada na massa corpórea dos animais tratados

com CG quando comparados com o grupo controle (p> 0,05), exceto o 5-FU que

reduziu significantemente (p<0,001) a massa corporal (-3,14 ± 0,59). Em relação à

massa úmida dos órgãos (fígado, baço, rins e estômago) dos animais tratados com

CG ou 5-FU em camundongos com Sarcoma 180, foram observadas alterações

(p<0,001 e p<0,05), no baço e rins (0,05 ± 0,01 e 0,28 ± 0,01, respectivamente) do

grupo tratado com 5-FU, quando comparado com o grupo controle.

Page 122: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

122

Tabela 6: Efeito da CG sobre a massa corpórea e a massa úmida dos órgãos (fígado,

baço, rins e estômago) de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180.

* A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais. *p < 0,05 e **p< 0,001, quando comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.

C- 5-FU 25 mg/Kg 50mg/Kg

-5.0

-2.5

0.0

2.5

5.0

**

Pes

o (

g)

Figura 36: Diferença de peso corpóreo dos camundongos com Sarcoma 180, em gramas. Os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais, **p<0,00, quando comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%) experimental por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.

Foram realizadas análises histopatológicas nos fígados, baços, rins e

estômagos de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados com

5-FU (sem estômago) e com a CG.

Na análise histológicas dos órgãos para o grupo controle negativo (DMSO

10%), os fígados estudados mostraram-se com coloração pardo-rosada e sem

alterações macroscópicas, enquanto que a análise microscópica indicou presença de

congestão portal e da veia centrolobular, discreta tumefação celular de hepatócitos e

Page 123: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

123

hiperplasia das células de Kupffer (Figura 37 A e B). No fígado dos animais tratados

com 5-FU, foram encontrados além das mesmas alterações do grupo que recebeu

DMSO 10%, também dilatação dos sinusóides e focos inflamatórios diversos,

esteatose, microvesicular e citoplasma vacuolizado (Figura 37 C e D). Nos grupos

tratados com 25mg/Kg de CG, foi visualizado intensa tumefação celular dos

hepatócitos, hiperplasia das células de Kupffer e esteatose microvesicular em diversos

trechos. Na dose de 50mg/Kg, as mesmas alterações da menor dose da CG também

foram encontradas com adição de dilatação dos sinusóides (Figura 37 E; F; G e H).

Na avaliação macroscópica dos baços do grupo controle negativo (DMSO

10%), o tamanho do órgão foi homogêneo e de coloração vinhosa, enquanto que a

análise microscópica mostrou delimitação da polpa branca e da polpa vermelha, com

presença de megacariócitos de permeio (Figura 38 A e B). No grupo do controle

positivo (5-FU), os baços estavam muito pequenos e de coloração vinhosa, e a análise

microscópica indicou desorganização das polpas branca e vermelha com mudança na

arquitetura celular, além de pigmentos de hemossiderina (Figura 38 C e D). Os baços

do grupo tratado com CG 25mg/Kg, mostraram-se vinhosos e com tamanho maior que

o controle e na microscopia observaram presença dos folículos linfóides ligeiramente

amplos e desorganizados e numerosos megacariócitos. No grupo tratado com

50mg/Kg, as polpas branca e vermelha encontravam-se desorganizadas com a

presença de megacariócitos (Figura 38 E; F; G e H).

Ao analisar os tecidos relacionados com a excreção, os rins nos animais

tratados com o controle negativo (DMSO 10%) e positivo (5-FU), se mostraram

pardacentos e de pequena dimensão (controle negativo), na observação

macroscópica. Ao exame microscópico observou-se que, nestes grupos a arquitetura

glomerular estava mantida. Foram visualizadas hemorragias glomerular e tubular,

além de moderada tumefação do epitélio tubular (proximais e distais) (Figura 39 A e

B). Nos tratados com CG, com dose de 25mg/Kg, os órgãos dos animais

apresentaram coloração pardacenta, e a microscopia indicou a manutanção da

arquitetura glomerular com presença de hemorragia glomerular, intensa tumefação do

epitélio tubular (proximais e distais), necrose nefrotóxica focal do epitélio tubular. No

grupo de maior dose da CG (50mg/Kg), os rins estavam com coloração pardo-escuros,

enquanto que a microscopia indicou que a arquitetura glomerular estava preservada,

porém foram observadas hemorragias glomerular e tubular, intensa tumefação do

epitélio tubular (proximais e distais), vacuolização do epitélio tubular, necrose

nefrotóxica focal do epitélio (Figura 39 C e D).

Page 124: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

124

No estômago, foi analisado apenas o controle negativo (DMSO 10%) e os

tratados com CG (25 e 50mg/Kg), onde foi utilizada a via oral para administração do

composto teste. Na macroscopia, todos os tecidos mostraram coloração brancacenta e

pregueado mucoso preservado. Na microscopia de todos os grupos, a região cárdia e

fúndica não apresentaram alterações histológicas com visualizações das células

principais e parietais. Na mucosa e submucosa não foram encontrados nenhuma

alteração indicativa de processo inflamatório (Figura 40 A; B; C; D; E e F).

Figura 37: Fotomicrografia mostrando os fígados de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.

Page 125: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

125

Figura 38: Fotomicrografia mostrando os baços de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg, C e D), CG (25 mg/Kg, E e F) e (G e H) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X e 400X.

Page 126: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

126

Figura 39: Fotomicrografia mostrando os rins de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (25 mg/Kg,B), CG (25 mg/Kg, C) e (D) CG (50 mg/Kg). Aumento de 400X.

Page 127: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

127

Figura 40: Fotomicrografia mostrando os estômagos de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A e B) foi tratado com o veiculo usado para diluir a droga (DMSO 10%). Os animais foram tratados com CG (25 mg/Kg, C e D) e (E e F) CG (50 mg/Kg). Aumento de 100X.

Page 128: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

128

5.3.7.2 Análise bioquímica e hematológica dos camundongos saudáveis ou

transplantados com Sarcoma 180

Dentre os parâmetros bioquímicos analisados, foram realizados testes de dano

hepático (níveis plasmáticos das transaminases: aspartato aminotransferase - AST e

alanina aminotransferase - ALT) e teste da função gromerular renal (níveis plasmáticos

de uréia e creatinina).

A Tabela 7 apresenta os resultados encontrados. Não foram encontradas

alterações significantes (p > 0,05) nos níveis plasmáticos dos parâmetros bioquímicos

analisados em nenhum dos grupos seja de camundongos saudáveis ou transplantados

com o tumor Sarcoma 180. Entretanto, foi observado um aumento nos níveis

plasmáticos da AST em camundongos tratados com CG 25mg/kg/dia (112,4 ± 7,02)

em relação ao grupo de animais saudáveis (79,43 ± 7,82), sugerindo uma leve

hepatoxicidade.

Em relação aos níveis de ALT, houve uma discreta diminuição dos grupos

tratados com CG 50mg/Kg/dia (25,25 ± 1,03) em relação ao grupo dos animais

saudáveis (31,43 ± 2,32) e o grupo do 5-FU (21,57 ± 1,52) em ambos os grupos

controles, DMSO 10% + H2O destilada (26,88 ± 1,38) e o grupo dos animais saudáveis

(31,43 ± 2,32).

Nas provas de funções renais, houve uma diminuição da uréia do grupo CG

25mg/Kg/dia (29,38 ± 3,53) em relação aos animais saudáveis (46,00 ± 4,10). Na

análise da creatinina não foi encontrada nenhuma alteração nos grupos tratados com

5-FU, CG 25 e 50mg/Kg/dia em relação aos controles, DMSO 10% + H2O destilada ou

dos animais saudáveis.

A análise microscópica das funções hepáticas e renais deste experimento

complementa o estudo histopatológico dos órgãos dos animais tratados com os grupos

testes 5-FU, CG 25 e 50mg/Kg/dia, mostrando que há alteração microscópica no

fígado e rins dos animais tratados.

Page 129: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

129

Tabela 7: Efeito da CG sobre os parâmetros bioquímicos (aspartato aminotransferase

- AST, alanina aminotransferase – ALT, uréia e creatinina) de sangue periférico de

camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.

*A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco animais. a, p< 0,001) quando comparado com o grupo DMSO 10% e H2O destilada de camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180 por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls. b, p< 0,05 quando comparado com o grupo que recebeu H2O, camundongos saudáveis por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.

Dentre os parâmetros hematológicos analisados foram realizadas dosagem de

hemoglobina, contagem de plaquetas e contagem global e diferencial de leucócitos.

A Tabela 8 apresenta os resultados encontrados. Em todos os camundongos

transplantados com tumor Sarcoma 180, incluindo os grupos controle tratados apenas

com H2O ou DMSO 10% + H2O destilada, não houve alteração significante (p<0,05) na

contagem de hemoglobina. Na contagem das plaquetas a única alteração significativa

(p< 0,05 e p<0,001) ocorrida foi com o 5-FU (314,00 ± 24,71), havendo uma

diminuição das plaquetas em relação aos controles dos animais tratados com H2O ou

DMSO 10% + H2O destilada (1108 ± 78,83 e 1181 ± 71,31 respectivamente).

No número leucócitos totais circulantes houve uma diminuição significativa

(p< 0,05 e p<0,001) no grupo do 5-FU (1,22 ± 0,13) com os grupos controles dos

animais tratados com H2O ou DMSO 10% + H2O destilada (2,64 ± 0,26 e 2,43 ± 0,26

respectivamente), induzindo assim a leucopenia. Já o grupo tratado com CG na maior

dose 50mg/Kg/dia (3,52 ± 0,33), aumentou significantemente (p< 0,001) em

comparação ao controle tratado com DMSO 10% + H2O destilada (2,43 ± 0,26),

sugerindo que a CG na maior dose pode está estimulando o mecanismo imunológico

Page 130: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

130

do organismo. Além disso, houve uma diferença significante (p< 0,001) na relação do

percentual de linfócitos e neutrófilos circulantes no grupo do 5-FU (89% e 9,57%

respectivamente), aumentando nos linfócitos e diminuindo os neutrófilos em relação ao

controle tratado com DMSO 10% + H2O destilada (74% e 23,6%) transplantado com

Sarcoma 180, sugerindo uma leucopenia. Nos grupos tratados com CG, nas duas

doses testadas (25 e 50 mg/Kg), observou-se um aumento no percentual dos

neutrófilos (25,25% e 27, 75%) e diminuição do percentual dos linfócitos (73,5% e

71%) quando comparado com o controle dos animais saudáveis, tratado com H2O

(89% e 9,30% respectivamente) de forma significativa (p< 0,05).

As demais análises, eosinófilos e monócitos, não tiveram diferença

significativa em relação aos controles.

Page 131: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

131

Tabela 8: Efeito da CG e 5-fluorouracil (5-FU) sobre os parâmetros hematológicos (hemoglobina, plaquetas e leucócitos) de sangue periférico

de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.

*A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco animais. a, (p< 0,001) quando comparado com o grupo DMSO 10% e H2O destilada de camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180 por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls. b, p< 0,05 quando comparado com o grupo que recebeu H2O, camundongos saudáveis por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.

Page 132: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

132

Figura 41: Resumo dos resultados dos estudos de avaliação da atividade citotóxica e antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG).

Page 133: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

133

Figura 42: Resumo dos resultados dos estudos genotóxico/mutagênico, antitumoral e toxicológica da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona, (CG).

Page 134: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Discussão

Page 135: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

135

6 DISCUSSÃO

No século passado, houve uma grande revolução no desenvolvimento de

agentes citotóxicos para a terapia do câncer. Foi possível alcançar o controle de certas

neoplasias, como as neoplasias da infância, leucemia aguda, doença de Hodgkin,

linfomas não-Hodgkin, neoplasia trofoblástica gestacional e tumores de células

germinativas (ISMAEL et al., 2008).

O desenvolvimento da terapia antineoplásica frente a mudanças severas, como

a limitação da indicação de algumas drogas e o fato das substâncias citotóxicas

causarem danos não só unicamente no tumor como no tecido normal e saudável,

tornou-se cada vez mais freqüente a busca por agentes mais seletivos (ISMAEL et al.,

2008).

A quimioterapia clássica, porém, traz ao paciente uma série de limitações

quanto a sua freqüência de uso e a tolerância orgânica frente às reações adversas.

Normalmente, dependendo do tipo de reação provocada pelo medicamento, o

paciente precisa de um intervalo entre os ciclos, maior ou menor, visto que as doses

utilizadas nos pacientes é individual e são calculadas baseando-se na superfície

corporal de cada indivíduo.

Os novos agentes estudados podem ser utilizados como protótipos para a

síntese de análogos mais promissores. A obtenção de análogos é um processo

comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica,

e isso pode ser feito através de estudos da relação entre a estrutura e atividade

biológica servindo de base para a otimização molecular (GARRETT & WORKMAN,

1999; WILSON & DANISHEFSKY, 2007).

Têm-se por objetivo, neste processo, o desenho racional e o desenvolvimento

de uma segunda geração de agentes com características melhoradas, tais como o

aumento da eficácia e da estabilidade, a melhora das propriedades farmacocinéticas e

a diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND & GANESAN, 2004).

Adicionalmente, a descoberta de novas drogas através da extração de

produtos naturais tem tido limitações quando comparados com as substâncias

sintéticas pesquisadas. Alguns achados mostram que dentro da indústria farmacêutica

a descoberta de produtos naturais promissores para o tratamento de muitas doenças

são caros e desafiam o tempo e custo dessas pesquisas (LAM, 2007).

Page 136: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

136

Inúmeras vantagens das novas técnicas de estudo da relação estrutura-

atividade, obtidos por técnicas recentes de modelagem molecular, as técnicas

tradicionais de modificação molecular e relação estrutura-atividade, apesar de serem

dispendiosas e requer extenso período de investigação, são, ainda, de suma

importância na descoberta e na caracterização de novos fármacos, onde novos

agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela análise inicial de dados teóricos

(WERMUTH et al., 1998; THOMAS, 2000).

Sabendo da importância farmacológica das chalconas, neste trabalho, nos

propusemos a estudar a atividade antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3-

fenilprop-2-en-1-ona, substância sintética, obtida através de uma reação química entre

a acetofenona e para-nitro benzaldeído. O grupo das chalconas é considerado uma

das maiores classes de substâncias com potencial e muitos interesses farmacológicos

(NOWAKOWSKA, 2007). Desse modo, pesquisas vêm sendo realizadas no

desenvolvimento de novos análogos. Vale ressaltar que a obtenção desta chalcona

(CG) envolve procedimentos relativamente simples, possibilitando sua obtenção em

larga escala.

De acordo com a literatura, compostos puros podem ser considerados

promissores para justificar novos estudos, quando apresentarem CI50 menor que 1

µg/mL (PESSOA et al., 2000). Considerando esse valor, a CG mostrou-se bastante

citotóxica contra as 5 linhagens tumorais humanas estudadas (HL-60; HCT-8; SF-295;

MDA-MB-435; K562). A CI50 variou de 0,30 µg/mL em células de HCT-8 a 0,84 µg/mL

em células de SF-295, a primeira é a linhagem de colón e a segunda do sistema

nervoso. Outro ponto a ser observado é a citotoxicidade da CG nas células de K562

(0,43 µg/mL), pois essas células de leucemia mielóide crônica possuem a presença do

cromossomo Philadelphia, que resulta em um mau prognóstico para os pacientes e

confere maior resistência aos tratamentos antitumorais convencionais devido a uma

alteração citogenética específica, resultante da translocação recíproca entre os braços

longos dos cromossomos 9 e 22 (MELO et al., 2003; SKEEL, 2007). O potencial

citotóxico da CG assemelha-se com os dados encontrados na literatura para outras

chalconas estudadas, segundo o trabalho de Srinivasan et al., 2009, mostrou atividade

antitumoral in vitro em três derivados de chalconas (11a, 11f, 11h) para as linhagens

de câncer de pulmão, H2009 e A549, com CI50 (5.1 ± 1.9; 2.3 ± 0.3; 1.9 ± 0.1 µM).

De acordo com VINCENZO et al., (2000), as chalconas inibem a proliferação

de células de câncer de ovário primário. A atividade anti-invasiva (in vitro) pode ser

encontrada e demonstrada entre chalconas contendo o grupo fenil. Outras atividades

foram descritas com elevado potencial citotóxico em células humanas de colón.

Page 137: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

137

Apesar de não termos estudado outros análogos de chalconas, é certo que a

atividade anticâncer deste composto (CG) está relacionada com a sua estrutura

química, na adição do NO2

(eletronegativo) ao anel B da molécula. Essa modificação

estrutural interfere na relação estrutura-atividade, proporcionando mecanismos de

ação diferentes.

A manutenção da homeostase nos organismos multicelulares é obtida através

do balanço entre a proliferação e morte das células. Alguns tipos de morte celular têm

sido descritos: apoptose (tipo I), morte celular associado com autofagia (tipo II),

necrose ou oncoses (tipo III), catástrofe mitótica, entre outros (KRYSKO, 2008).

Na avaliação do potencial antitumoral de uma substância, é muito importante

que se investigue a utilização de células normais a fim de se obter informações sobre

a seletividade para a célula normal e tumoral (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI et al.,

2003). A CG testada em linfócitos periféricos humanos estimulados com

fitoemaglutinina, apresentou CI50 de 1,79 µg/mL em 72hs. Este valor sugere que houve

maior citotoxicidade em células HL-60 do que em PBMC quando incubada igualmente

por 72h. Os dados também mostraram que a citotoxicidade da CG foi tempo-

dependente, onde viu-se em 24h de exposição, 10,51 µg/mL; em 48h, 2,29 µg/mL e

72h, 1,79 µg/mL. Compostos com ação anticâncer, em sua maior parte, têm como

alvo moléculas e/ou processos celulares compartilhados por células normais e

tumorais, então é de se esperar algum nível de toxicidade.

Ainda participando do “screening” na molécula, foi realizada a investigação da

atividade hemolítica com eritrócitos de camundongos buscando caracterizar o

mecanismo citotóxico direto sobre a membrana plasmática das células, já que os

mesmos possuem grande semelhança com os eritrócitos humanos, principalmente

quanto à sensibilidade (COSTA-LOTUFO et al., 2002; DRESCH et al., 2005). Este

método é um ótimo indicador para averiguar agressão in vitro, por causa da

estabilidade mecânica característica da membrana eritrocitária (SHARMA; SHARMA,

2001).

A ausência da atividade hemolítica foi observada para CG, onde a EC50

mostrou ser acima de 200 µg/mL (790,5 µM), sugerindo possivelmente que o

mecanismo de atividade citotóxica desempenhado por essa substância, não esteja

relacionado à indução de dano em nível de membrana plasmática, mas por uma

possível interferência com os mecanismos intracelulares.

Os resultados do teste antiproliferativo de exclusão por azul de tripan serve

para observar também os efeitos citotóxicos (Figura 15), onde verificou-se a

Page 138: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

138

confirmação com o ensaio do MTT (Tabela 3). O ensaio permitiu distinguir as células

capazes de drenar o corante ácido azul de tripan para fora da célula em contraposição

àquelas que não possuem capacidade. A absorção desse corante é um forte indicativo

de dano na membrana plasmática que culmina na morte celular (HYNES et al., 2003;

MINERVINI et al., 2004). A CG apresentou maior atividade antiproliferativa que o

controle negativo nas concentrações testadas após as 24h de incubação e agiu de

maneira concentração-tempo-dependente, sendo que na maior concentrção (4,0 µM),

houve uma redução da proliferação celular após as doze horas de incubação, com um

provável efeito citostático, seguido de efeito citotóxico após as 24h. Apesar de ser

utilizado para estudos de citotoxicidade este teste não distingue qual via de morte está

participando dela. Visto que sistemas de transporte ativo estão em pleno

funcionamento em células viáveis, contudo, nos estágios iniciais da apoptose estes

sistemas ainda estão em funcionamento, enquanto que na necrose não.

As avaliações morfológicas realizadas pelo ensaio da LA/BE mostraram que

após o tratamento com CG, nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM houve um aumento da

população de células apoptóticas com 60,44% e 94%, onde as células apresentavam

cromatina condensada, fragmentada e de um verde brilhante intenso quando

excitadas pela luz azul (BRIGGS; JONES, 2005). VINCENZO et al., (2000), em seu

estudo comprovaram-se que ao testar derivados de chalconas pelo método de

Brometo de etídeo, verificaram-se que em 1 e 4 h de encubação não houve mudanças

significantes no padrão celular, enquanto que em 24h, houve uma diminuição

significante de células viáveis, o que corrobora com os nossos resultados expostos.

Investigando o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade em que a CG

está relacionada, a inibição da proliferação celular foi mensurada pela inibição da

síntese de DNA, através da atividade antiproliferativa pela incorporação do BrdU

(análogo da timidina), que tem o intuito de avaliar a taxa de proliferação por meio do

percentual de células que incorporam o BrdU (DOLBEARE et al., 1983). Porém, o

resultado encontrado mostrou que não houve diminuição da incorporação do BrdU ao

DNA das células de HL-60 testadas (Figura 17), mas observou-se a diminuição da

população celular, como mostrado na Figura 18. Esses resultados refletem que

provavelmente a ação da CG não está relacionada à inibição da síntese de DNA.

As substâncias utilizadas na terapia do câncer apresentam características

diversas em seus mecanismos de ação, o grupo dos taxanes e dos alcalóides da

vinca, por exemplo, atuam em nível microtubular, já as antraciclinas atuam impedindo

a síntese de DNA, RNA e proteínas (BONASSA, 2005).

Page 139: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

139

Subseqüentemente ao estudo de inibição de síntese de DNA, alterações

morfológicas foram investigadas usando a coloração por May-Grünwald-Giemsa com o

intuito de determinar que tipo de morte celular estivesse relacionado com a

citoxicidade das substâncias (MARINHO-FILHO et al., 2010). Apoptose é uma das

formas de morte celular de grande importância nos sistemas biológicos, pois

desempenha um papel essencial no desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na

regulação da resposta imune, na eliminação de células senescentes e na morte celular

induzida pelas drogas antineoplásicas (HU & KAVANAGH, 2003; VERMEULEN et al.,

2005).

A morte celular via apoptose pode ser identificada por uma série de alterações

morfológicas na célula como diminuição do volume celular, condensação da

cromatina, fragmentação nuclear, formação de corpos apoptóticos e de

prolongamentos da membrana plasmática (“blebs”). Já a necrose ocorre por uma ação

rápida da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e

perda da integridade da membrana plasmática (KERR et al., 1972; DARZYNKIEWICZ

et al., 1992; STRASSER et al, 2000). Na análise da exposição das células de HL-60

com as concentrações testadas de CG em 24 horas de exposição, foram facilmente

visualizadas, por microscopia óptica, a diminuição do volume celular, condensação da

cromatina, fragmentação nuclear, presença dos blebs e formação de corpos

apoptóticos, condizendo com as características já mostradas nos ensaios de LA/BE.

A indução de apoptose em células tumorais é um benefício para o tratamento

do câncer (LOS et al., 2003). A apoptose é a morte celular programada da célula que

envolve o controle genético de eventos bioquímicos e morfológicos das células,

incluindo a externalização da fosfatidilserina, liberação do citocromo c da mitocôndria e

ativação de caspases (SCHULTZ & HARRINGTON, 2003). A citometria de fluxo é

uma ferramenta bastante valiosa para estudo estrutural e funcional das células, sendo

considerado um método rápido e preciso, tendo boa aplicação para investigação de

compostos com atividade antitumoral. As características inerentes à morfologia das

células apoptóticas como condensação de cromatina e a redução do volume celular

são detectadas por meio do desvio da luz incidida sobre a célula para frente e para o

lado (DARZYNKIEWICZ et al., 1992; RAMANATHAN,1997; LIMA, 2005).

A citometria de fluxo utiliza um sistema para observar células individuais

obtidas a partir de uma suspensão celular. Assim, uma população de células passa ao

longo de tubos capilares, onde um sistema óptico registra o parâmetro que se deseja

medir e alimenta um computador com os dados obtidos. Corantes fluorescentes

Page 140: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

140

específicos são utilizados para os componentes celulares que se deseja observar,

permitindo o uso do citômetro de fluxo no diagnóstico das neoplasias e como uma

poderosa ferramenta para a compreensão das alterações celulares causadas por

compostos biologicamente ativos (SHAPIRO et al., 1995; MARINHO-FILHO et al.,

2010).

Os estudos realizados com citometria de fluxo mostraram diminuição

significativa do número de células a partir da concentração de 2,0 µM (equivalente a

CI50) e pouca perda da integridade de membrana, na mesma concentração, diferindo

apenas da maior dose (4,0 µM), que apresentou perda importante dessa integridade

de membrana. Em relação à análise da fragmentação do DNA, a CG apresentou nas

maiores concentrações testadas (2,0 e 4,0 µM), 22,54 e 48,49% respectivamente.

Enquanto que no ciclo celular, observou-se que na fase G2/M, a maior concentração

testada (4,0 µM), apresentou parada nesta fase de 20,87%. VICENZO e colaboradores

(2000) mostraram em seu trabalho que os compostos derivados de chalcona, tiveram

um aumento da fragmentação do DNA e mostraram parada em G2/M do ciclo celular,

se equiparando aos dados encontrados neste estudo.

A progressão apropriada ao longo do ciclo celular é monitorada por pontos de

checagem (checkpoints) que correspondem às etapas de transição G1/S e G2/M para

detectar defeitos durante a síntese de DNA e a segregação cromossômica,

respectivamente (MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, o dano celular pode

causar a parada do ciclo na fase G1 para permitir que o sistema de reparo atue antes

da passagem para a próxima fase. Essa passagem (G1 S) é regulada pela

fosforilação da proteína Retinoblastoma (Rb) por quinases dependentes de ciclinas

(Cyclin-Dependent Kinases, CDKs), principalmente, após a formação dos complexos

ciclina D-CDK4 e ciclina D-CDK6. Em seu estado hipofosforilado, a Rb liga-se e inibe a

transcrição do fator de transcrição E2F. O complexo de ciclina D-CDK fosforila a Rb, a

qual libera o E2F, permitindo ao mesmo atuar na ativação de genes e expressão de

proteínas (ciclina E) necessários para entrar na fase S (HARBOUR et al., 1999;

MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, é provável que a parada do ciclo celular

causada pela CG possa estar relacionada à presença de possíveis alterações

percebidas na síntese de proteínas e RNA (Fase G2), pela alteração na maquinaria de

reparo ou em alguma fase do processo mitótico (Fase M). Certamente, a atuação do

maquinário enzimático de reparo não conseguiu corrigir o dano celular, levando às

células leucêmicas à morte por apoptose.

Outras avaliações relacionadas ao tipo de morte celular foram prosseguidos

Page 141: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

141

com o objetivo de melhor caracterizar a via apoptótica da envolvida. A anexina V é um

representante de uma família de proteínas ligadas a fosfolipídeos dependentes de

cálcio, e possuem alta afinidade por bicamadas fosfolipídicas de membrana, ricas em

fosfatidilserina. Os fluocromos conjulgados podem ser uma ferramenta fundamental

para monitorar as mudanças de assimetria de membranas celulares fosfolipídicas,

sendo, portanto um excelente método para determinar a presença de células

apoptóticas (THIAGARAJAN & TAIT, 1990; KOOPMAN et al., 1994). O ensaio da

anexina V foi realizado para detectar a externalização da fosfatidilserina (evento

ocorrido na fase inicial da apoptose), o qual é um fosfolipídeo interno da estrutura da

membrana, e que ao ser externalizado, sinaliza para os macrófagos induzindo a

fagocitose da célula, evitando a liberação do conteúdo celular para o meio extracelular

(VERMES et al, 1995; ZIMMERMANN et al, 2001; FREIKMAN et al, 2008).

Após 24h de exposição a CG, observou-se um aumento, de modo

concentração-depedente, no número de células anexina positiva, representada pela

apoptose inicial e tardia. Células apoptóticas mostram perda da assimetria

aumentando a externalização de PS principalmente na dose de 4,0 µM. Houve um

aumento discreto de células em necrose, nas doses de 2,0 e 4,0 µM (Figura 23). É

importante destacar que o evento de externalização da fosfatidilserina ocorre por

causa da liberação de citocromo c devido à perda de integridade da membrana

mitocondrial (GOLDSTEIN et al., 2000; FREIKMAN et al, 2008).

Bioquimicamente, a apoptose é tida como a morte celular programada,

executada por uma família de proteases- as caspases- que, à ativação, regulam o

desmonte da célula de maneira precisa e orquestrada, e este é o processo

inconfundível da apoptose (JIMENEZ, 2009). As caspases estão agrupadas em dois

tipos: iniciadoras (2, 8, 9 e 10) e efetoras (3, 6 e 7) (WANG et al., 2005). A CG foi

capaz de ativar as caspases 3 e 7 nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM. Também ativou

a caspase 8, nas três doses testadas (1,0; 2,0 e 4,0 µM) e a caspase 9, na maior

concentração (4,0 µM). As duas maiores sinalizações da apoptose no organismo

humano, são a via “extrínseca” iniciada pela ativação de receptores de morte

presentes na membrana que conduz a uma clivagem das caspases e a via “intrínseca”

caracterizada pela despolarização mitocondrial, liberação de citocromo c e ativação de

caspases (MONTENEGRO et al., 2010). Diante do exposto sugere-se que a CG age

somente pela via extrínseca nas concentrações de 1,0, 2,0 e 4,0 µM.

Page 142: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

142

A mitocôndria desempenha um importante papel no programa apoptótico. O

Citocromo c, normalmente reside no espaço entre as membranas interna e externa da

mitocôndria, onde ele atua na transferência de elétrons como parte da fosforilação

oxidativa. Após a sinalização do processo de morte (apoptose), a membrana

mitocondrial externa torna-se despolarizada e o citocromo c é secretado da

mitocôndria para o citosol circundante. Este associa-se a outras proteínas para

desencadear a cascata de eventos que culminam na apoptose. Uma vez no

citoplasma, o citocromo c associa-se à proteína Apaf-1, formando o apoptossomo, que

culmina em ativar a procaspase-9, convertendo-se em caspase-9, chamado de

processo da via intrínseca (FANG et al., 2008; WEINBERG, 2008; JIMENEZ, 2009).

Para a investigação de eventos apoptóticos através do envolvimento

mitocondrial, pelo método do Western blot, a CG não mostrou diferença na expressão

do citocromo c e procaspase-9 nas concentrações e tempos testados em relação ao

controle. Em adição, o tratamento das células de HL-60 com a CG não está

unicamente associada com a liberação do citocromo c, mas com o aumento da

expressão da caspase-9 clivada quando encubada por 24 h exposta a maior

concentração (2,0 µM), Entretanto, baseado nos resultados encontrados, é adequado

conjeturam que na maior concentração 4,0 µM, as duas vias da apoptose são

ativadas. Estes resultados se equiparam a outros estudos com derivados de

chalconas, como o realizado por FANG et al.(2008), que mostrou o envolvimento da

expressão de vários marcadores de morte celular, entre eles as caspases 8, 9 e 3,

como também o citocromo c, quando testados com o isolespeol, mostrando a

utilização também das duas vias envolvidas no mecanismo de morte celular.

NISHIMURA et al. (2007), estudram a ação antitumoral da isobavachalcona, onde foi

observado aumento da expressão da caspase-3 e 9, como também do Bcl-2 e Bax.

De acordo com a literatura, a atividade citotóxica de algumas chalconas já foi

relacionada a diferentes mecanismos de ação, entre eles: (a) inibição da incorporação

celular da timina, uridina e leucina, inibindo desta forma a síntese de RNA, DNA e

proteínas; (b) inibição não-competitiva da interação entre 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno e

a glutationa S-transferase (GST) (DIMMOCK et al., 1999); (c) desestabilização dos

microtúbulos, através da competição com a colchicina pelo sítio ativo da tubulina,

provocando um decréscimo no crescimento tumoral, alquilação do processo mitótico

(LAWRENCE; McGOWN; DUCKI, 2000; LAWRENCE et al., 2006); (d) inibição da

interação entre a oncoproteína MDM2 e a proteína de supressão tumoral p53, levando

a um aumento da atividade transcripcional da p53, reativando a integridade genômica

Page 143: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

143

(STOLL et al., 2001); (e) inibição da liberação de histamina, possivelmente através da

inibição da proteína C quinase (PKC), já que esta enzima constitui um importante

receptor para certos tipos de tumores, exercendo uma atividade antitumoral

(MIDDLETON et al., 1987).

Além disso, de acordo com Dimmock e colaboradores (1999), a introdução de

grupos hidroxila favorece o aumento da citotoxicidade. Estudos realizados por Gordon

e colaboradores (1993), com dihidroxichalconas indicaram um aumento na atividade

antitumoral. Há também uma inibição da produção de lactato nas células tumorais tipo

ascíticas de Erlich (SUOLINNA, 1975).

Na oncologia muitos agentes antineoplásicos de uso clínico são considerados

genotóxicos e mutagênicos, como por exemplo, o etoposídeo, teniposídeo,

doxorrubicina, entre outros. Vários agentes alquilantes são considerados

leucemogênicos. A relação entre a atividade citotóxica, genotóxica e mutagência ainda

não está bem elucidada (ANDERSON & BERGER, 1994; DE MESA et al., 2002).

Esse tipo de exposição ao indivíduo provoca algumas vezes o desenvolvimento

de segunda malignidade. Apesar desse risco, o benefício provocado por muitas

substâncias antineoplásicas, que resulta na remissão parcial ou completa do tumor é

considerado. O objetivo da avaliação sistemática da carcinogenicidade dos agentes

citotóxicos em diversas espécies animais e também em células humanas permite a

identificação e o desenvolvimento de agentes menos tóxicos, sendo benéfico aos

pacientes (AYDEMIR & BILALOGLU, 2003).

Vários ensaios para identificação de agentes mutagênicos e/ou genotóxicos

vem sendo desenvolvidos (MACGREGOR et al., 2000). A ocorrência de mutações, no

entanto, depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA.

(SILVA et al., 2003).

O teste do cometa é considerado um método com sensibilidade adequada

relacionado à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO &

TICE, 2003). É essencial para a avaliação da segurança de novos fármacos

(HARTMANN et al., 2003). Os testes citogenéticos in vitro têm fornecido informações

fundamentais para o estabelecimento do potencial mutagênico de agentes químicos e

físicos. O estudo de danos no DNA em nível cromossômico é essencial uma vez que a

mutação cromossômica é um evento importante no processo de carcinogênese

(SALVADORI et al., 2003).

O uso das células de PBMC, obtidas do sangue periférico como células-modelo

para avaliar a genotoxicidade deve-se ao fato dessas células serem sensíveis aos

Page 144: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

144

agentes genotóxicos, pois há uma correlação entre os danos induzidos nas células

periféricas do sistema hematopoiético e outras células somáticas (ALBERTINI et al.,

2000).

As mutações podem ocorrer em três níveis: gênica, cromossômica e mutações

genômicas, como a mudança no número de cromossomos originando as aneuploidias

e poliploidias. Um único método de genotoxicidade não pode fornecer informações

sobre todos os indicadores de toxicidade genética. Conseqüentemente, é necessário

que cada agente químico seja avaliado em diferentes ensaios para que se possa

colher informações adequadas a respeito de seu potencial genotóxico (CARERE et al.,

2002; DEARFIELD et al., 2002; MULLER et al., 2003).

O ensaio do cometa mostrou que a CG foi capaz de causar dano ao DNA, grau

1, em pequenas proporções nas três concentrações testadas, quando analisado o

percentual da freqüência de dano. Com relação ao índice de dano (ID) só o controle

positivo (doxorrubicina) teve ocorrência significativa de dano. Os dados obtidos sobre

a indução de apoptose através da coloração por BE/LA corroboram com os achados

do ensaio do cometa, no qual o aumento das concentrações de CG em 24h de

exposição resulta no aumento do número de células apoptóticas, porém os valores de

ID para a linhagem celular testada não foi significante. Sendo assim podemos supor

que a CG não participa da indução de genotóxicidade e que os danos de grau 1

provocados por ela podem ser reparados pela própria maquinaria celular.

Já se sabe que a doxorrubicina (controle positivo) produz efeitos

gentóxicos/mutagênicos importantes, pois atua na quebra das duas fitas de DNA, seu

mecanismo de ação basea-se intercalando com o DNA e produzindo efeitos na

Topoisomerase II (SKEEL, 2007). Portanto, a ação da doxorrubicina justifica o dano

causado ao DNA observado no ensaio do cometa. Entretanto, a CG não causou danos

ao DNA, visto que atua na fase G2/M e não na síntese do DNA, onde ocorre o

processo de genotoxicidade/mutagenicidade produzidos pelas substâncias em

exposição, corroborando com achados na literatura, como o paclitaxel que atua em

nível de microtúbulos (Fase M) e também não induz a genotoxicidade

(MOZZAQUATRO, 2007).

O micronúcleo representa perda de cromatina em conseqüências de danos

cromossômicos ou dano no aparelho mitótico. Durante a mitose esses micronúcleos

são formados, independentemente do tipo de dano ocorrido durante o ciclo celular. Por

isso, os danos no DNA causados pela exposição a agentes mutagênicos, por exemplo,

somente serão expressos em micronúcleo após um ciclo de divisão celular, sendo

Page 145: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

145

dependentes da proporção de células que estão se dividindo (FENECH & MORLEY,

1997; CLARE et al., 2006).

As quebras de fita dupla representam uma das mais severas lesões ao DNA,

devido à perda da continuidade cromossômica. Levando a geração de fragmentos

cromossômicos acêntricos (sem centrômero) comprometendo a segregação

cromossômica durante a mitose (KAYE et al., 2004). Adicionalmente, lesões de fita

dupla tendem a ser reparadas erroneamente devido à falta de segmentos

complementares de DNA (molde) que possam ser utilizados pelas enzimas envolvidas

no processo (PFEIFFER et al., 2000). Os resultados observados na exposição das

células de PBMC com a CG mostram que a CG não induz a formação de

micronúcleos, em nenhuma das concentrações testadas (1,0; 2,0 e 4,0µM) quando

comparados com o controle negativo, já a doxorrubicina (controle positivo) promove de

forma significativa aos achados de micronúcleos nas células. Esses dados sugerem

que a CG não é citotóxica no momento em que eles são estimulados

mitogênicamente, sem interferir na quebra das fitas simples ou dupla do DNA. Estes

resultados corroboram com os dados encontrados in vitro no ensaio do cometa.

Substâncias genotóxicas/mutagênicas podem causar o desenvolvimento de

malignidades secundárias. Uma vez que, nem todo agente genotóxico é,

necessariamente, mutagênico, pelo fato das lesões geradas no DNA poderem ser

reparadas ou evoluírem para mutações. Então podemos sugerir que a CG por não

apresentar essas características, mostra-se ser uma molécula segura, com ação

citotóxica e não genotóxica/mutagênica.

As pesquisas envolvendo animais de laboratório são necessárias para a

compreensão dos processos antitumorais em organismos vivos. Muitos modelos

experimentais utilizando camundongos são aceitos para os testes antitumorais

embasados em aspectos semelhantes aos humanos e importantes, como: semelhança

fisiológica de genes, células, tecidos e sistemas (CHABNER et al., 2001; KAMB,

2005).

Buscando afirmar a ação antineoplásica dos resultados obtidos in vitro, a CG

foi avaliada através do teste antitumoral in vivo, utilizando camundongos Mus

musculus Swiss transplantados com Sarcoma 180. Dentre as doses estudadas, foi

visto que os animais tratados com CG (25 e 50mg/Kg/dia) por via oral, durante 7 dias,

apresentaram redução na massa tumoral em 54,85 e 69,11%, respectivamente,

quando comparados ao controle negativo (DMSO 10%). Estudos anteriores mostraram

que as chalconas em geral, possuem ação antitumoral in vivo, prevenindo a

Page 146: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

146

proliferação de células tumorais em ratos, como a isoliquiritigenina, que é um potente

agente antitumoral (SABZEVARI et al., 2004).

A aplicação das chalconas no tratamento quimioterápico do câncer ganhou

destaque, devido a seu potencial de restaurar a sensibilidade celular, através da

inibição da glicoproteína-P (uma proteína de membrana responsável pela exportação

de fármacos para o meio extracelular), a qual após longa exposição ao tratamento

quimioterápico encontra-se ativa em um mecanismo de super expressão que acaba

inibindo a ação quimioterápica (BOIS et al., 1998).

Os achados histopatológicos dos tumores, no tratamento com a CG, mostram

áreas de necrose de coagulação, invasão muscular, perda da arquitetura celular, com

presença de células aberrantes, núcleos hipercromáticos e graus variados de

pleomorfismo celular e nuclear, características normalmente encontradas em tecidos

tumorais malignos.

Os tumores de Sarcoma 180, em sua grande maioria, podem desenvolver

necrose a partir da 3ª semana de implante (PEREIRA & CHAVES, 1983), porém o

crescimento tumoral em apenas 1 semana foi suficiente para o surgimento de

necroses em todos os grupos, inclusive no grupo controle negativo (DMSO 10%). Isso

é explicado pelo fato de que o Sarcoma 180 em sua forma sólida, caracteriza-se por

um rápido crescimento em 7 dias (SCHABEL, 1977), modificando a sua capacidade de

oxigenação dos vasos sanguíneos locais e daqueles em formação (angiogênese)

ultrapassada pelo aumento da massa neoplásica (PADERA et al., 2004). A necrose de

coagulação é determinada pela desnaturação da maioria das proteínas celulares

(inclusive as lisossômicas) devido à queda acentuada no pH celular durante o

processo de lesão por hipóxia ou isquemia.

A análise da diferença do peso corpóreo dos animais antes e após o

tratamento indica possíveis achados de toxicidades, como por exemplo, a anorexia

produzida por muitas substâncias antineoplásicas. O 5-FU é uma delas, além de

provocar diarréias também pode induzir o indivíduo à anorexia, induzindo a perda de

peso (BONASSA & SANTANA, 2005). Nos resultados obtidos neste estudo, a única

alteração de peso observada foi dos animais que receberam o 5-FU, numa média de -

3,14g. Portanto, a CG não alterou o peso dos animais no período do tratamento (7

dias) em nenhuma dose testada (25 e 50mg/Kg/dia).

Evidências que também apontam a toxicidade in vivo de substâncias

relacionam-se a aumento ou diminuição no peso relativo dos órgãos-chave pós-

tratamento (BARDOCZ et al.,1996). O balanço entre os efeitos terapêuticos e

Page 147: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

147

toxicológicos de um composto químico é um parâmetro importante quando se quer

verificar a aplicabilidade farmacológica do composto (ANAZETTI et al., 2003). A

toxicidade induzida pelos fármacos ou as reações adversas são as principais causas

da retirada de medicamentos do mercado. Entre 1975 e 1999, 16 das 45 drogas

aprovadas foram retiradas do mercado por razões de segurança e 22 % (10 das 45)

foram hepatotóxicas (LASSER et al., 2002). Olson e colaboradores (2000) mostraram

que 72% dos sintomas e/ou sinais de toxicidade de drogas em humanos podem ser

delineados e visualizados em animais de laboratório.

A toxicidade nos pacientes em uso de quimioterapia é medida através da

análise do hemograma completo, provas de função hepática e renal antes do início de

cada ciclo de terapia. Dependendo do grau de toxicidade encontrada, o paciente pode

adiar o ciclo e fazer uso de terapia de auxilio a essa reações limitantes.

O fígado e rins são órgãos responsáveis pela detoxicação do organismo, e em

casos de intoxicação podem ter seu volume e/ou peso aumentado. Em relação às

alterações no peso dos órgãos analisados, a CG não mostrou nenhuma diferença

significativa entre eles. Porém, o controle positivo (5-FU), mostrou uma redução

significativa do baço, indicando a reação de imunossupressão causada por ele e

diminuição do tamanho dos rins (*p< 0,05 e **p<0,01).

Os achados histopatológicos referentes à análise do fígado dos animais, os

grupos que receberam CG 25 e 50mg/Kg/dia apresentaram alterações indicativas de

toxicidade representadas pela presença de esteatose microvesicular em praticamente

toda a extensão da amostra, focos inflamatórios, tumefação celular, hiperplasia das

células de Kupffer. Um dado positivo é que não há fibrose intersticial, nem ocorrência

de necrose ou comprometimento do parênquima. Como visto, sem a ocorrência de

danos mais graves, o fígado é capaz de promover regeneração hepatocelular com a

ausência da exposição à substância teste. Muitos achados em biópsias sugerem que

os fármacos devem ser considerados como possíveis causadores de qualquer lesão

hepática in vivo (SCHEUER, LEFKOWITCH, 2000).

As aminotransferases ou transaminases constituem um grupo de enzimas que

catalisa a interconversão de aminoácidos em cetoácidos, por transferência de grupos

aminos. As aminotransferases de importância clínica são: AST ou TGO e ALT ou TGP,

principalmente para detectar a hepatite viral aguda e a hepatite fulminante (GARCIA &

KANAAN, 2008). De acordo com BONASSA & SANTANA (2007), a toxicidade

hepática envolvendo os antineoplásicos, relaciona-se com a elevação transitória das

Page 148: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

148

enzimas hepáticas (AST, ALT, DHL e fosfatase alcalina), alterando o metabolismo das

gorduras, necrose hepatocelular, colestase, hepatite e doença veno-oclusiva.

Na avaliação das transaminases hepáticas, sensíveis indicadores da injuria

celular hepática, o AST ou TGO, dos animais que receberam 25 mg/Kg/dia (CG)

mostrou um aumento significativo (p<0,05) em relação aos animais saudáveis,

enquanto que o ALT ou TGP foi reduzido nos grupos que recebeu o 5-FU

(comparando os dois grupos controles- H2O + DMSO 10% e animais saudáveis) e

diminuição no grupo tratado com 50mg/Kg/dia (CG) (Tabela 7), assim pode-se

correlacionar com as alterações observadas no histopatológico do fígado dos animais

e que por essas enzimas não estarem muito aumentadas, há um indicativo de

toxicidade no tecido hepático, porém podem ser reversíveis assim como as alterações

observadas na histologia dos órgãos.

Em adição a avaliação de danos causados aos lipídios, DNA e proteínas, a

enzima AST é comumente usada como indicador de integridade hepática. Elevações

de transaminases no soro ocorrem após uma injúria ao tecido hepático devido à

toxicidade. REBELLO (2005), mostrou em seu estudo que nenhuma das chalconas

avaliadas causou elevação significativa na atividade desta enzima, sugerindo que os

compostos não são hepatotóxicos nas concentrações testadas.

SABZEVARI e colaboradores (2004), tentando determinar um possível

mecanismo de ação que justifique esta atividade antitumoral realizaram estudos com

chalconas hidroxiladas em hepatócitos de ratos e sugeriram que a citotoxicidade de

chalconas para hepatócitos e possivelmente para células tumorais estava relacionado

à sua habilidade de formar radicais fenoxil pró-oxidantes e causar um desacoplamento

da mitocôndria. Portanto estes autores postularam que a atividade antitumoral de

chalconas hidroxiladas estaria associada ao seu potencial pró-oxidante.

No baço foi evidente a desorganização dos folículos nos dois grupos tratados

com a CG (25 e 50mg/Kg/dia), porém na maior dose o efeito foi mais evidente (Figura

38). No grupo de 25mg/Kg/dia, a polpa branca ficou ampliada e comprimindo a polpa

vermelha. Enquanto que no grupo de 50mg/Kg/dia, a polpa branca ficou totalmente

misturada com a polpa vermelha, porém não passa a idéia de hiperplasia da mesma.

No controle positivo, a atrofia da polpa branca e mudança da arquitetura celular é uma

característica do 5-FU. Presença de megacariócitos foi encontrada em todos os

grupos analisados, que indica um aumento da atividade da hematopoiese podendo

estar relacionado a um possível efeito imunoestimulante, porém mais testes terão que

ser realizados para a comprovação deste efeito.

Page 149: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

149

Na análise histológica dos rins, observou-se que nos 2 grupos testados (CG 25

e 50mg/Kg/dia), foram encontrados alterações funcionais com resposta adaptativa

representada por hemorragias e tumefação do epitélio tubular, reações equiparáveis

com o controle positivo tratado com 5-FU (25mg/Kg/dia). No entanto, no grupo CG

50mg/Kg/dia também visualizou-se vacuolização isomérica do epitélio tubular.

Entretanto, apesar das alterações morfológicas encontradas, houve manutenção da

arquitetura glomerular nos rins, ausência de infiltrado inflamatório por entre os túbulos

e fibrose, o que torna a toxicidade inicial com caráter reversível provavelmente após a

suspensão da exposição a CG.

A uréia é formada pelo fígado como produto final do metabolismo e da digestão

de proteínas, sendo posteriormente liberada no sangue e excretada pelos rins, sendo

assim a uréia relaciona-se com a função hepática e renal. Encontra-se diminuída em

pacientes com disfunção hepática grave e aumentada na disfunção renal (GARCIA &

KANAAN, 2008). A depuração da creatinina é o método utilizado para mensurar a taxa

de filtração glomerular (TFG), sendo que o aumento dos seus níveis tem uma forte

correlação com a falência renal (GARCIA & KANAAN, 2008).

Na avaliação bioquímica, foram analisadas as funções renais, através da uréia

e creatinina. Desses dois parâmetros, a única alteração observada foi a diminuição da

taxa de uréia no grupo tratado com CG (25 mg/Kg/dia) quando comparados com os

dois controles- DMSO 10% + H2O destilada e animais saudáveis. Como descrito no

parágrafo anterior, a diminuição da uréia pode estar relacionada com alguma

disfunção hepática, assim como observado nas análises histológica do fígado. Sendo

assim, os dados apresentados para análise das funções renais, uréia e creatinina, não

apresentaram indícios de toxicidade nos rins, mesmo que na análise histológica os rins

tenham apresentado alterações importantes. Entretanto, esse resultado vem subsidiar

a hipótese de reversibilidade dos danos encontrados na histologia dos rins.

Em relação à histopatologia do estômago dos animais que receberam a CG

pela via oral, não foram encontradas alterações nem macroscópica e nem

microscópica (Figura 40). Esses dados mostram que a CG nas duas concentrações

(25 e 50 mg/Kg/dia) não alterou a mucosa gástrica e participou do processo inicial

digestório sem apresentar ocorrência de dano, porém esse tratamento foi de apenas 7

dias, não podendo afirmar que em tempo de maior exposição a CG, não possa causar

nenhum dano importante no órgão em questão.

Page 150: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

150

As células da medula óssea são bastante sensíveis à agressão causada pelos

agentes quimioterápicos. Como conseqüência, os glóbulos brancos (leucócitos) e

vermelhos (hemácias), assim como as plaquetas podem ter sua produção

comprometida, determinando queda em suas contagens no sangue (KATZUNG,

2003).

Os leucócitos têm papel essencial nos mecanismos imunológicos do organismo

e são desenvolvidos no baço e linfonodos (DUKES, 1996). Adicionalmente, o

tratamento com a CG (50mg/Kg/dia) aumenta a proporção dos polimorfonucleares em

sangue periférico, onde o efeito do 5-FU proporciona leucopenia. Este resultado vem a

corroborar com os achados na histologia dos animais tratados e fortalecer a idéia de

uma possível atuação também do sistema imunológico na atividade antitumoral in vivo.

Os glóbulos vermelhos permanecem na circulação por períodos muito maiores

que os leucócitos. Assim, a anemia (queda na contagem dos glóbulos vermelhos no

sangue) torna-se evidente somente após alguns ciclos de quimioterapia. Por isso, não

foi evidenciada anemia, induzida pelo 5-FU, no modelo experimental adotado. Já nas

contagens do número de plaquetas, houve alteração apenas nos tratados com 5-FU,

resultando em plaquetopenia severa.

As substituições de grupamentos químicos na estrutura principal da chalcona

podem ativar ou destivar certas propriedades dessa molécula. Com a variedade de

radicais e de posições substituíveis pode-se sintetizar muitas moléculas derivadas e,

dependendo das substituições, pode-se obter compostos com atividades biológicas

semelhantes. Com isso, várias moléculas podem exercer a mesma função, com

potencial diferenciado, sendo mais ou menos ativa para determinados fins. A CG,

avaliada neste estudo demonstrou grande potencial citotóxico frente às linhagens de

células tumorais, envolvimento na parada do ciclo celular em G2/M e fragmentação do

DNA. A presença de caspases ativas, bem como exposição da fosfatidilserina e as

alterações morfológicas encontradas, confirmam a indução de apoptose pela via

extrínseca. Não foram encontradas características genotóxicas/mutagênicas em

linfócitos humanos. Seu potencial antitumoral foi confirmado in vivo em modelo

experimental, onde a CG foi ativa nas duas doses testadas (25 e 50mg/Kg/dia) pela

via oral, com toxicidade branda e alterações reversíveis nos órgãos, visto nos estudos

histopatológicos, bioquímicos e hematológicos.

Page 151: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Considerações

Finais

Page 152: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

152

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Dentre todos os resultados obtidos neste estudo, podemos afirmar que

a CG, um produto sintético, obtido a partir da reação química entre a acetofenona e

para-nitro benzaldeído, apresenta atividade anticâncer. As suas propriedades físico-

químicas, como muitas chalconas estudadas, estão relacionadas com as atividades

antitumorais descritas e seu mecanismo de ação abrangente, podendo atuar nas vias

extrínseca e intríseca da apoptose, como também na atividade antitumoral e a

provável ativação do sistema imunológico apresentados nos resultados in vivo. Outros

dados de extrema importância referentes a essa molécula são a capacidade de

produzir baixa toxicidade e reversíveis, bem como a ausência de danos

genotóxicos/mutagênicos, o que indica segurança nas concentrações testadas da

chalcona. De qualquer modo, estudos complementares que contemplem análises de

alvo molecular, eficácia em modelos xenográficos, estudos toxicológicos e

farmacocinéticos adicionais são necessários para a validação deste fármaco para uso

humano. Por fim, a CG mostrou ser uma molécula com grande potencial citotóxico e

antitumoral, e por isso torna-se uma molécula promissora para a terapia do câncer.

Page 153: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

Referências Bibliográficas

Page 154: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

154

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AHMED, S.A.; GOGAL, R.M.; WALSH, J.E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes an alternative to [3H] thymidine incorporation assay. Journal of immunological methods, v.170, 211 – 224p., 1994. ALBERTINE, R.J.; ANDERSON, D.; DOUGLAS, G.R.; HAGMAR, L.; HEMMINKI, K.; MERLO, F.; NATARAJAN, A.T.; NORPPA, H.; SHUKER, D.E.; TICE, R.; WATERS, M.D.; AITIO, A. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. Mutat. Res., v.463, n.2, 111-172p., 2000. ALIAS, Y.; AWANG, K.; HADI, H.A.; THOISON, O.; SÉVENET, T.; PAIS, M. An antimitotic and cytotoxic chalcone from Fissistigma lanuginosum. J.Nat. Prod., v.58, 1160-1166p., 1995. ALMEIDA, V. L., LEITÃO, A., REINA, L, C, B., MONTANARI, C. A., DONNICI, C. L., LOPES, M. T. P. Câncer e Agentes Antineoplásicos Ciclo-Celular Específicos e Ciclo-Celular Não Específicos que interagem com o DNA: Uma Introdução. Química Nova, v.28, 118-129p., 2005. ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURAN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and human peripheral blood mononuclear cells. Toxicology, v.188, 261-274p., 2003. ANDERSON, D.; YU,T.W.; PHILLIPS, B.J.; SCHMEZER, P. The effect of various antioxidants and other modifying agents on oxygen-radical-generated DNA damage in human lymphocytes in the Comet assay. Mutation Research, v.307, 261 – 271p., 1994. ANDERSON, R.D.; BERGER, N.A. International commission for protection against environmental mutagens and carcinogens. mutagenicity and carcinogenicity of topoisomerase-interactive agents. Mutation Research, v.309, 109 – 142p., 1994. AYDEMIR, N.; BILALOGLU, R. Genotoxicity of two anticancer drugs, gemcitabine and topotecan, in mouse bone marrow in vivo. Mutation Research, v.537, 43–51p., 2003. BARDOCZ, S.; GRANT, G.; PUSZTAI, A. The effect of phytohaemagglutinin on the growth, body composition, and plasma insulin of the rat at different dietary concentrations. Br. J. Nutr., v.76, n.4, 613-626p., 1996. BARREIRO, E.J., & FRAGA, C.A.M. Química Medicinal: As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos. São Paulo- ARTMED Editora Ltda, 2002. BETTENCOURT-DIAS, M.; GIET, R.; SINKA, R.; MAZUMDAR, A.; LOCK, W.G.; BALLOUX, F.; ZAFIROPOULOS, P.J.; YAMAGUCHI, S.; WINTER, S.; CARTHEW, R.W.; COOPER, M.; JONES, D.; FRENZ, L.; GLOVER, D.M. Genome-wide survey of protein kinases required for cell cycle progression. Nature, v.432, 980-987p., 2004. BEZERRA, D.P.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. Antiproliferative Effects of Two Amides, Piperine and Piplartine, from Piper Species. Zeitschrift fur Naturforschung C, v.60, 539–543p., 2005.

Page 155: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

155

BEZERRA, D.P.; CASTRO, F.O.; ALVES, A.P.N.N.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. In vivo growth-inhibition of sarcoma 180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from Piper. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.39, 801–807p., 2006. BEZERRA, D.P.; MILITÃO, G.C.G.; CASTRO, F.O.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. Piplartine induces inhibition of leukemia cell proliferation triggering both apoptosis and necrosis pathways. Toxicology in Vitro, v.21, 1–8p., 2007. BEZERRA, D.P.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; ALENCAR, N.M.; MESQUITA, R.O.; LIMA, M.W.; ALVES, A.P.; PESSOA, O.D.; CHAVES, J.H.; SILVEIRA, E.R.; COSTA-LOTUFO, L.V. In vivo growth inhibition of sarcoma 180 by piperlonguminine, an alkaloid amide from the Piper species. Journal of Applied Toxicology, v.28, n.5, 599-607p., 2008a. BEZERRA, D.P. Estudo Farmacológico das Propriedades Anticâncer da Piplartina. Tese de Doutorado, Fortaleza, 255p., 2008b. BOIS, F. et al. Halogenated chacones with high-affinity binding to P-glycoprotein: potential modulators of multidrug resistance. J. Med. Chem., v.41, n.21, 4161-4164p., 1998. BONASSA, E.M.A. & SANTANA, T.R. Enfermagem em Terapêutica Oncológica. Atheneu, 3a Ed., 3-15p., 2005. BRANNON-PEPPAS, L. & BLANCHETTE, J.O. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. Adv. Drug Deliv. Ver., v.56, 1649-1659p., 2004. BRASIL. Ministério da Saúde. DATASUS. Disponível em: http://tabnet.datasus.gov.br. Acesso em: 08 de agosto de 2010. BRASILEIRO-FILHO, G. Bogliolo Patologia. Guanabara Koogan, 7a Ed., Rio de Janeiro, 43-236p., 2006. BRAVO, L. Polyphenols: chemistry, dietry sources, metabolism and nutritional significance.Nutr. Ver.: v.56, 317-333p., 1998. BREDESEN, D.E. Toward a mechanistic taxonomy for cell death programs. Stroke, v.38, 652-660p., 2007. BRIGGS, C.; JONES, M.S. Green I-induced fluorescence in cultured immune cells: A comparison with Acridine Orange. Acta Histochem., v.107, n.4, 301-312p., 2005. BRUIN, E. C. & MEDEMA, J. P. Apoptosis and non-apoptotic deaths in cancer development and treatment response. Cancer Treat. Rev., v.34, 737- 749p., 2008. BURLINSON, B.; TICE, R.R.; SPEIT, G.; AGURELL, E.; BRENDLER-SCHWAAB, S.Y.; COLLINS, A.R.; ESCOBAR, P.; HONMA, M.; KUMARAVEL, T.S.; NAKAJIMA, M.; SASAKI, Y.F.; THYBAUD, V.; UNO, Y.; VASQUEZ, M.; HARTMANN, A. Fourth international workgroup on genotoxicity testing: results of the in vivo comet assay workgroup. Mutation Research, v.627, 31–35p., 2007.

Page 156: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

156

BURMEISTER, J.E.; AGNOLIN, R.; DA COSTA, M.G.; MILTERSTEINER, D.R.; CAMPOS, B.M. Creatinina plasmática normal significa função renal normal? Revista da AMRIGS, Porto Alegre, v.51, n.2, 114-120p., 2007. BUTLER, M.S. The role of natural products in drug discovery. Journal of Natural Products, v.67, 2141–2153p., 2004. CARERE, A.; STAMMATI, A.; ZUCCO, F. In vitro toxicology methods: impact on regulation from technical and scientific advancements. Toxicol. Lett., v.127, 153-160p., 2002. CHABNER, B.A.; LONGO, D.L. Cancer chemotherapy and biotherapy; 2th edn., Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996. CHABNER, B.A.; RYAN, D.P.; PAZ-ARES, L.; GARCIA-CHABONERO, R.; CALABRESI, P. Anitneoplastic agents. In: HARDMAN, J.G.; LIMBIRD, L.E. (Ed.). Goodman & Gilman`s: The Pharmacological Basis of Therapeutics. New York: McGraw-Hill, 1389-1459p., 2001. CHEENPRACHA, S. Anti-HIV-1 protease activity of compounds from Boesenbergia pandurata. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.14, 1710-1714p., 2006. CHEN, M.; THEANDER, T.G.; CHRISTENSEN, S.B.; HVIID, L.; ZHAI, L.; KHARAZMI, A. Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits in vitro growth of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and protects mice from P. yoelii infection. Antimicrob Agents Chemother, v.38, n.7, 1470-1475p., 1994. CIBAS, E.S. Applications of flow cytometric DNA analysis to diagnostic cytology. Diagnostic cytopathology, v.13, 166–171p., 1995. CLARDY, J.; WALSH, C. Lessons from natural molecules. Nature, v.432, 829–837p., 2004. CLARE, M.G.; LORENZON, G.; AKHURST, L.C.; MARZIN, D.; DELFT, J.; MONTERO, R.; BOTTA, A.; BERTENS, A.; CINELLI, S.; THYBAUD, V.; LORGE, E. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test II. Using human lymphocytes. Mutat. Res., v.607, 37-60p., 2006. COSTA-LOTUFO, L.V.; CUNHA, G.M.A.; FARIAS, P.A.M.; VIANA, G.S.B.; CUNHA, K.M.A.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; GRAMOSA, N.V.; RAO, V.S. The Cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated from Copaifera langsdorffi oleo-resin. Toxicon, v.40, n.8, 1231-1234p., 2002. COSTA-LOTUFO, L.V.; SILVEIRA, E.R.; BARROS, M.C.; LIMA, M.A.; MORAES, M.E.; MORAES, M.O.; PESSOA, C. Antiproliferative effects of abietane diterpenes from Aegiphila lhotzkyana. Planta Medica, v.70, 180–182p., 2004. CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J. Antineoplastic agents from natural sources: achievements and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs, v.9, 2783–2797p., 2000. CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of Ethnopharmacology, v.100,72–79p., 2005.

Page 157: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

157

CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J.; YANG, S.S. Natural product extracts of plant and marine origin having antileukemia potential. The NCI experience. Journal of Natural Products, v.69, 488–498p., 2006. CRECZYNSKI-PASA, T.B.; PEDROSA, R.C. Alvos moleculares na pesquisa de fitofármacos e fitoterápicos. In: YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. (Ed.). Plantas medicinais sob a ética da química medicinal moderna. Chapecó, SC: Argos Editora Universitária, p.195-229, 2001. DARZYNKIEWICZ, Z., BRUNO, S., DEL BINO, G., GORCZYCA, M., HOTZ, M. A., LASSOTA, P., TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13: 795-808, 1992. DEARFIELD, K.L.; CIMINO, M.C.; MCCARROLL, N.E.; MAUER, I.; VALCOVIC, L.R. Genotoxic risk assessment: a proposed classification strategy. Mutat. Res., v.521, 121-135p., 2002. DE ALMEIDA, V.L.; LEITÃO, A.; REINA, L.C.B.; MONTANARI, C.A.; DONNICI, C.L.; LOPES, M.T.P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não específicos que interagem com o DNA: uma introdução. Química Nova, v.28, 118-129 p., 2005. DE MESA, R.L.; DE CERAIN; SALSAMENDI, A.L.; ARIZNABARRETA, L.S.; AGABEYNZANO, M.J.C.; PATINO-GARCIA, A. Measurement and analysis of the chemotherapy-induced genetic instability in pediatric cancer patients. Mutagenesis, v.17, 171–175p., 2002. DIMMOCK, J.R.; KANDEPU, N.M.; HETHERINGTON, M.; QUAIL, J.W.; PUGAZHENTI, U.; SUDOM, A.M. Bioactivities of chalcones. Curr. Med. Chem., v.6, 1125-1149p.,1999. DOLBEARE, F.; GRATZNER, H.; PALLAVICINI, M.G.; GRAY, J.W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.80, n.18, 5573-5577p., 1983. DRESCH, R.R.; HAESER, A.S.; LERNER, C.; MOTHES, B.; VOZÁRI-HAMPE, M.M.; HENRIQUES, A.T. Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em extratos de esponjas (Porífera) nativas da costa atlântica do Brasil. Ver. Bras. Farmacognosia, v.15, 16-22p., 2005. DUKES, H.H. Fisiologia dos Animais Domésticos. Editora Guanabara, 11a Ed., Rio de Janeiro, 19-43p., 1996. FAIRBAIRN, D.W.; OLIVE, P.L.; O’NEILL, K.L. The Comet Assay: a comprehensive review. Mutation Research, v.339, 37-59p., 1995. FANG, S.C.; HSU, C.L.; YU, Y.S.; YEN, G.C. Cytotoxic effects of new geranyl chalcone derivatives isolated from the leaves of Artocarpus communis in SW 872 human liposarcoma cells. J. Agric. Food Chem., v.56, 8859-8868p., 2008. FENECH, M.; MORLEY, A. Solutions to the kinetic problem in the micronucleus test. Cytobios, v.43, 223-243p.,1997. FISCHER , P. M., GLOVER, D. M., LANE, D. P. Targeting the cell cycle. Drug Disc. Today, v.1, n.4, 417-423p., 2004.

Page 158: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

158

FOREJTNIKOVA, H.; LUNEROVA, K.; KUBINOVA, R.; JANKOVSKA, D.; MAREK, R.; KARES, R.; SUCHY, V.; VONDRACEK, J.; MACHALA, M. Chemoprotective and toxic potentials of synthetic and natural chalcones and dihydrochalcones in vitro. Toxicology, v.208, 81-93p., 2005. FOSTER, I. Cancer: a cell cycle defect. Radiography. v.14, n.2, 144-149 p., 2008. FREIKMAN, I.; AMER, J.; COHEN, S.J.; RINGEL, I.; FILBACH, E. Oxidative stress causes membrane phoospholipid rearrangement and shedding from RBC membranes: an NMR study. Biochim Biophys Acta, v.1778, 2388-2394p., 2008. GALLUZZI L, MAIURI MC, VITALE I, ZISCHKA H, CASTEDO M, ZITVOGEL L, KROEMER G. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death Diff, v.14,1237-1266p., 2007. GANESAN, A. Natural products as a hunting ground for combinatorial chemistry. Current Opinion in Biotechnology, v.15, 584–590p., 2004. GARCIA, M.A.T.; KANAAN, S. Bioquímica clínica. Editora Atheneu, Rio de Janeiro, 2008. GARRETT, M.D. & WORKMAN, P. Discovering Novel Chemotherapeutic Drugs for the Third Millennium. Eur. J. Cancer, v.35, 2010-2030p., 1999. GAW, A.; MURPHY, M.J.; COWAN, R.A.; O’REILLY, D.S.T.J.; STEWART, M.J.; SHEPHERD, J. Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour. Churchill Livingstone, 3ª ed., 2004. GENG, C.X., ZENG, Z.C., WANG, J.Y. Docetaxel inhibits SMMC-7721 human hepatocellular carcinoma cells growth and induces apoptosis. World J. Gastroenterol, v.9, 696-700p., 2003. GOLDSTEIN, J.C.; WATERHOUSE, N.J.; JUIN, P.; EVAN, G.I.; GREEN, D.R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat. Cell Biol., v.2, n.3, 156-162p., 2000. GONTIJO, A.M.M.C.; TICE, R. Teste do cometa para a detecção de dano no DNA e reparo em células individualizadas. In: RIBEIRO, L.R.; SALVADORI, D.M.F.; MARQUES, E.K. (Ed.). Mutagênese ambiental. Ulbra, Canoas-RS, 247-275p., 2003. GORDON, L.T.; WEITZMAN, S.A. Inflammation and cancer. Cancer Journal, v.6, 257p., 1993. GUERITTE-VOEGELEIN, F., GUÉNARD, D., LAVELLE, F., LE GOFF, M.T., MANGATAL, L., POTIER, P. Relationships between the structure of Taxol analogues and their antimitotic activity. J. Med. Chem., v.34, 992-998p., 1991. GUERITTE, F.; FAHY, J. The vinca alkaloids. In: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-Routledge Psychology Press. Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, 123 – 136p., 2005. HANAHAN, D., WEINGERG, R.A. The hallmarks of cancer. Cell, v.100, 57–70p., 2000.

Page 159: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

159

HARBOUR, J. W., LUO, R. X., DEI SANTI, A., POSTIGO, A. A., DEAN, D. C. Cdk phosphorylation triggers sequential intramolecular interactions that progressively block Rb functions as cells move through G1. Cell, v.98, 859-869p.,1999. HARTMANN, A.; SPEIT, G. The contribution of cytotoxicity to DNA-effects in the single cell gel test (Comet assay). Toxicology Letters, v.90,183-188p., 1997. HARTMANN, A.; AGURELL, E.; BEEVERS, C.; BRENDLER-SCHWAAB, S.; BURLINSON, B.; CLAY, P.; COLLINS, A.; SMITH, A.; SPEIT, G.; THYBAUD, V.; TICE, R.R. Recommendations for conducting the in vivo alkaline comet assay. Mutagenesis, v.18, n.1, 45-51p., 2003. HENGARTNER, M.O. The biochemistry of apoptosis. Nature, v.407, 770-776p., 2000. HERR, H.W.; MORALES, A. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer: an immunotherapy success story. Journal of Urology, v.179, 53–56p., 2008. HODEK, P.; TREFIL, P.; STIBOROVA, M. Flavonoids potent and versatile biologically active compounds interecting with cytochromes P450. Chemico-Biological Interactions, Shannon, v.139, 1-21p., 2002. HU W. & KAVANAGH J.J. Anticancer therapy targeting the apoptotic pathway. Lancet Oncology, v.4, 721-729p., 2003. HYNES, J.; FLOYD, S.; SOINI, A.E.; O`CONNOR, R.; PAPKOVSKY, D.B. Fluorescence-based cell viability screening assays using water-soluble oxygen probes. J. Biomolec. Screen., v.8, n.3, 264-272p., 2003. INCA. Incidência de Câncer no Brasil <www.inca.gov.br/estimativa/2010>. Acessado em 26 de Julho de 2010, 100p. ISMAEL, G.F.V.; ROSA, D.D.; MANO, M.S.; AWADA, A. Novel citotoxic drugs: Old challenges, new solutions. Cancer Treatment Reviews, v.34, 81-91 p, 2008. JIMENEZ, P.C. Estaurosporinas de Eudistema vannamel: química e bioatividade. Tese de Doutorado. Fortaleza-Ceará, 128 p., 2009. JUNG, A.; BRABLETZ, T.; KIRCHNER, T. The migrating cancer stem cells model--a conceptual explanation of malignant tumour progression. Ernst Schering Foundation Symposium Proceedings, v.5, 109–124p., 2006. KAMB, A. What`s wrong with our cancer models? Nat. Rev. Drug Discov., v.4, n.2, 161-165p., 2005. KATZUNG, G.B. Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill Medical, 9th edn., United States of America, 1088p., 2003. KAYE, J.A.; MELO, J.A.; CHEUNG, S.K.; VAZE, M.B.; HABER, J.E.; TOCZYSKI, D.P. DNA breaks promote genomic instability by impeding proper chromosome segregation. Curr. Biol., v.14, 2096-2106p., 2004. KERR, JF, WYLLIE, AH, CURRIE, AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., v.26, 239-257p., 1972.

Page 160: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

160

KIM, R.; TANABE, K.; UCHIDA, Y.; EMI, M.; INOUE, H.; TOGE, T.. Current status of the molecular mechanisms of anticancer drug-induced apoptosis. Cancer Chemotherapy Pharmacology, v.50, 343-35p., 2002. KIMURA, Y. New anticancer agents: in vitro and in vivo of the antitumor and antimetastatic actions of various compounds isolated from medicinal plants. In Vivo, v.19, 37-60p., 2005. KINGSTON, D.G.I. The Chemistry of Taxol. Pharmacology & Therapeutics, v.52, 1-34p., 1991. KINGSTON, D.G.I. Recent advances in the chemistry of taxol. Journal of Natural Products, v.63, 726-734p., 2000. KINGSTON, D.G.I. Taxol and its analogs. In: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, 89–122p., 2005. KLAUNING, J.E.; KAMENDULIS, L.M. Chemical carcinogenesis. In: KLAASSEN, C.D. (Ed.). Casarett and Doull`s Toxicology: The basic science of poisons. 7th ed. [S.I.]: McGraw-Hill, 329-380p., 2008. KO, H.; TGAO, L.; YU, R.; LIU, C.; WANG, J.; LIN, C. Structure-activity relationship studies on chalcone derivates: The potent inhibition of chemical mediators release. Bioorg Med. Chem. Lett, v.11, 105-111p., 2003. KOOPMAN, G.; REUTELINGSPERGER, C.P.; KUIJTEN, G..; KEEHNEN, R.M.; PALS, S.T.; VAN OERS, M.H. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, v.84, n.5, 1415-1420p., 1994. KRYSKO, D.V., BERGHE, T. V., D’HERDE, K., VANDENABEEL, P. Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis. Methods, v.44, 205-221p., 2008. KURASHIGE, S.; MITSUHASHI, S. Macrophage activities in sarcoma 180-bearing mice and EL4-bearing mice. Gann, v.73, 85–90p., 1982. KUMAR, V., ABBAS, A. K, FAUSTO, N., ROBBINS, S. L., COTRAN, R. S. Pathology Basis of Disease. China: WB Saunders, 1552p., 2004. KUSUZAKI, K.; MURATA, H.; MATSUBARA, T.; SATONAKA, H.; WAKABAYASHI, T.; MATSUMINE, A.; UCHIDA, A. Review. Acridine orange could be an innovative anticancer agent under photon energy. In Vivo. v.21, 205–214p., 2007. LAM, K.S. New aspects of natural products in drug discovery. Trends in Microbiology, v.15, n.6, 279-289p., 2007. LASSER, K. E., ALLEN, P. D., WOOLHANDLER, S. J., HIMMELSTEIN, D. U., WOLFE, S. M., BOR D. H. Timing of new black box warnings and withdrawals for prescription medications. JAMA, v.287, 2215-2220p., 2002. LAWRENCE, N. J.; MCGROWN, A.T.; DUCKI, S.; HADFIELD, J.A. The interactions of chalcones with tubulin. Anticancer Drug Des., v.15, 135-141p., 2000.

Page 161: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

161

LAWRENCE, N.J.; PATTERSON, R.P.; OoI, L.L.; DARREN, C.; DUCKI, S. Effects of α–substitutions on structure and biological activity of anticancer chalcones. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v.16, 5844-5848p., 2006. LEBEAU, J.; FURMAN, C.; BERNIER, J.; DURIEZ, P.; TEISSIER, E.; COTELLE, N. Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated flavonoids. Free Radic. Biol. Med., v.29, 900-912p., 2000. LI, N.; SONG, Y.; ZHANG, W.; WANG, W.; CHEN, J.; WONG, A.W.; ROBERTS, A. Evaluation of the in vitro and in vivo genotoxicity of magnolia bark extract. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.49, 154–159p., 2007. LIMA, T.M. Citometria de fluxo. In: PERES, C.M.; CURI, R. Como cultivar células. RJ: Guanabara Koogan, 1a ed. Rio de Janeiro, 227-253p., 2005. LIOTTA, L. A., KOHN, E. C. The microenvironment of the tumourhost interface. Nature, v.411, 375-379p., 2001. LOPES, H.J.J. Enzimas no Laboratório Clínico- Aplicações Diagnósticas. Belo Horizonte-MG, 29 p.,1998. LORENZI, T.F. Manual de Hematologia: Propedêutica e Clínica. Medsi, 4º ed., 722p, 2006. LOS, M.; BUREK, C.J.; STROH, C.; BENEDYK, K.; HUG, H.; MACKIEWICZ, A. Anticancer drugs of tomorrow: apoptotic pathways as target for drug design. Drug Discovery Today, v.8, 67-77p., 2003. LOURO, I.D., LLERENA JR, J.C., VIEIRA DE MELO, M.S., ASHTON-PROLLA, P., CONFORTI-FRÓES, N. Genética Molecular do Câncer. MSG Produção Editorial, 1ª. ed., São Paulo, 2002. LOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., v.193, 265-27p., 1951. MACFARLANE, M., WILLIAMS, A. C. Apoptosis and disease: a life or death decision. EMBO reports, v.5, 674-678p., 2004. MCGAHON, A.J.; MARTIN, S.J.; BISSONNETTE, R.P.; MAHBOUBI, A.; SHI, Y.; MOGIL, R.J. NISHIOKA, W.K.; GREEN, D.R. The end of the (cell) line: methods for the study of apoptosis in vitro. Meth. Cell Biol., v.46, 153–185p., 1995. MACGREGOR, J.T.; CASCIANO, D.; MULLER, L. Strategies and testing methods for identifying mutagenic risks. Mutation Research, v.455, 3-20p., 2000. MACKLIS, J.D.; MADISON R.D. Progressive incorporation of propidium iodide in cultured mouse neurons correlates with declining electrophysiological status: a fluorescence scale of membrane integrity. Journal of Neuroscience Methods, v.31, 43–46p., 1990. MADDIKA, S.; ANDE, S.R.; PANIGRAHI, S. PARANJOTHY, T.; WEGLARCZK, K.; ZUSE, A.; ESHRAGHI, M.; MANDA, K.D.; WIECHEC, E.; LOS, MAREK. Cell survival, cell death and cell cycle pathways are interconnected: implications for cancer therapy. Drug resistance updates, v.10, 13-29p., 2007.

Page 162: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

162

MALUMBRES, M.; PEVARELLO, P.; BARBACID, M.; BISCHOFF, J.R. CDK inhibitors in cancer therapy: what is next? TRENDS in Pharmacological Sciences, v.29, 16-21p., 2007. MALUMBRES, M., BARBACID, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Rev. Cancer, v.9,153-166p., 2009. MANN, J. Natural products in cancer chemotherapy: past, present and future. Nature Reviews Câncer, v.2, 143–148p., 2002. MARINHO-FILHO, J. D. B., BEZERRA, D. P., ARAÚJO, A. J., MONTENEGRO, R. C., PESSOA, C., DINIZ, J. C., VIANA, F. A., PESSOA, O. D. L., SILVEIRA, E. R., MORAES, M. O., COSTA-LOTUFO, L. V. Oxidative stress induction by (+)-cordiaquinone J triggers both mitochondria-dependent apoptosis and necrosis in leukemia cells. Chemico-Biological Interactions, v.183, 369-379p., 2010. MEHMET, H. Apoptosis: caspase Wnds a new place to hide. Nature, v.403, 29–30p., 2002. MELINO G. The Sirens’song. Nature. v.412, 23p., 2001. MELO, J. V., HUGHES, T. P., APPERLEY, J. F. Chronic Myeloid Leukemia. Hematol., 132-52p., 2003. MIDDLETON, E.J.; FERRIOLA, P.; DRZEWIECKI. Effect of flavonoids on tumor promoter-induced basophil histamine release and protein kinase C. Biochem. Pharmacol., v.15, n.36, 2048-2052p., 1987. MILITAO, G.C.G.; DANTAS, I.N.F.; PESSOA, C.; FALCÃO, M.J.C.; SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; CURI, R.; LIMA, T.; MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V. Induction of apoptosis by pterocarpans from Platymiscium floribundum in HL-60 human leukemia cells. Life Sciences, v.78, 2409-2417p., 2006. MINERVINI, F.; FORNELLI, F.; FLYNN, K.M. Toxicity and apoptosis induced by the mycotoxins nivalenol, depxynivalenol, and fumonisin B1 in a human erythroleukemia cell line. Toxicology in vitro, v.18, n.1, 21-28p., 2004. MONTENEGRO, R.C.; ARAÚJO, A.J.; MOLINA, M.T.; MARINHO-FILHO, J.D.B.; ROCHA, D.D.; LÓPEZ-MONTERO, E.; GOULAT, M.O.F.; BENTO, E.S.; ALVES, A.P.N.N.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V. Cytotoxic activity of naphthoquinones with special emphasis on juglone and its 5-0-methyl derivative. Chemico-Biological Interactions, v.184, 439-448p., 2010. MOON, Y.J.; WANG, X.; MORRIS, M.E. Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicology in vitro, v.20, 187-210p., 2006. MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, v.16, 55–63p., 1983. MOZZAQUATRO, L. Avaliação tóxico-genética das combinações paclitaxel/carboplatina e gemcitabina/cisplatina in vivo em camundongos. Disssertação de Mestrado. ULBRA, 2007. MULLER, L.; BLAKEY, D.; DEARFIELD, K.L.; GALLAOWAY, S.; GUZZIE, P.;

Page 163: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

163

HAYASHI, M.; KASPER, P.; KIRKLAND, D.; NACGREGOR, J.T.; PARRY, J.M.;SCHECHTMAN, L; SMITH, A.; TANAKA, N; TWEATS, D.; YAMASAKI, H. Strategy for genotoxicity testing and stratification of genotoxicity test results-report on initial activities of the IWGT Expert Group. Mutat. Res., v. 540, 177-181p., 2003. NADIN, S.B.; VARGAS-ROIG, L.M.; CIOCCA, D.R. A silver staining method for single-cell gel assay. Journal of histochemistry and cytochemistry, v.49, 1183–1186p., 2001. NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. Journal of Natural Products, v.70, 461–477p., 2007. NISHIMURA, R.; TABATA, K.; ARAKAWA, M.; ITO, Y.; KIMURA, Y.; AKIHISA, T.; NAGAI, H.; SAKUMA, A.; KOHNO, H.; SUZUKI, T. Isobavachalcone, a Chalcone constituent of Angelica keiskei, induces apoptosis in neuroblastoma. Biol. Pharm. Bull., v.30, n.10, 1878-1883p., 2007. NOWAKOWSKA, Z. A review of anti-infective and anti-inflammatory chalcones. European Journal of Medicinal Chemistry, v.42, 125-137p., 2007. O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry, v.267, 5421-5426p., 2000. OECD (ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT). Guideline for testing of chemicals nº 474. Genetic Toxicology: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, 1997. OKADA H. & MAK, TW. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumor cells. Nat Rev Cancer, v.4, 592-603p., 2004. OLSON, H., BETTON, G., ROBINSON, D., THOMAS, K., MONRO, A., KOLAJA, G., LILLY, P., SANDERS, J., SIPES, G., BRACKEN, W., DORATO, M., VAN DEUN, K., SMITH, P., BERGER, B., HELLER, A. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol., v.32, 56-67p., 2000. ORTHOLAND, J.Y. & GANESAN, A. Natural products and combinatorial chemistry: back to the future. Curr. Opin. Chem. Biol., 271-280p., 2004. PADERA, T. P., STOLL, B. R., TOOREDMAN, J. B., CAPEN, D., DI TOMASO, E., JAIN, R. K. Pathology: cancer cells compress intratumour vessels. Nature, v.427, 695p., 2004. PERA, F., MATTIAS, P., DETZER. Methods for determining the proliferation kinetics of cells by means of 5-bromodeoxyuridine. Cell Tissue Kinetics. v.10 255-264p., 1977. PEREIRA, F. B. C., CHAVES, F. B. Evolution of Sarcoma 180 in mice treated with hyperchlotinated water. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v.78, 209-214p., 1983. PESSOA, C. Determinação do mecanismo de ação citotóxica de alguns compostos extraídos de plantas do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado. Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, UFC, 2000.

Page 164: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

164

PESSOA, C.; SILVEIRA, E.R.; LEMOS, T.L.; WETMORE, L.A.; MORAES, M.O.; LEYVA, A. Antiproliferative effects of compounds derived from plants of Northeast Brazil. Phytotherapy research, v.14, 187–191p., 2000. PETERSON, J.; DWYER, J.Flavonóides: Dietary occurrence and biochemical activity. Nutrition Research, v.18, n.2, 1995-2018p., 1998. PFEIFFER, P.; GOEDECKE, W.; OBE, G. Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potencial to induce chromosomal aberrations. Mutagenesis, v.5, 289-302p., 2000. PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S.; LOPES, N.P.; EPIFANIO, R.A. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v.25, 45 -61p., 2002. RAFI, M. M.; ROSEN, R.T.; VASSIL, A.; HO, C.T.; ZHANG, H.; GHAI, G.; LAMBERT, G.; DiPAOLA, R. S. Modulation of bcl-2 and cytotoxicity by licochalcone-A, a novel estrogenic flavonoid. Anticancer Res., v.20, 2653-2658p., 2000. RAMANATHAN, M. Flow cytometry application in pharmacodynamics and drug delivery. Pharm. Res., v.14, n.9, 1106-1114p.,1997. REBELLO, J.M. Avaliação da atividade antioxidante e antifúngica de análogos sintéticos da acetofenona e pró-oxidante e antitumoral de chalconas sintéticas. Dissertação de Mestrado. Florianópolis, 130p., 2005. RIBEIRO, L. R., SALVADORI, D. M. F. MARQUES, E. K. Mutagênese Ambiental. Canoas: Editora da ULBRA, 356p., 2003. RICCI, M.S.; ZONG, W.X. Chemotherapic approaches for targeting cell death pathways. The oncologist, v.11, 342-357p., 2006. ROTHENBERG, M.L.; CARBONE, D.P.; JOHNSON, D.H. Improving the evaluation of new cancer treatments: challenges and opportunities. Nature Reviews, v.3, 303-309p., 2003. SALGALLER, M.L. & LODGER, P.A. Use of cellular and cytokine adjuvants in the immunotherapy of cancer. J Surg Oncol. N., v.68, 122-138p., 1998. SALVADORI, D.M.F.; RIBEIRO, L.R.; FENECH, M. Teste do micronúcleo em células humanas in vitro. In: RIBEIRO, L.R.; SALVADORI, D.M.F.; MARQUES, E.K. (Ed.). Mutagênese ambiental. Ulbra, Canoas-RS, 201-219p., 2003. SABZEVARI, O; GALATI, G.; MORIDANI, M.Y., SIRAKI, A.; O`BRIEN, P.I.. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer hydroxychalcones. Chemico-Biological Interations. v.148, 57-67p., 2004. SCHABEL, F. Quantitative evaluation of anticancer agent activity in experimental animals. Pharmacol. Ther., v.1, 411-435p., 1977. SCHECHTMAN, L.; SMITH, A.; TANAKA, N.; TWEATS, D.; YAMASAKI, H. Strategy for genotoxicity testing and stratification of genotoxicity test results – report on initial activities of the IWGT Expert Group. Mutat. Res., v.540, 177-181p., 2003.

Page 165: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

165

SCHEUER, P.J.; LEFKOWITCH, J.H. Drugs and toxins. In: Liver Biopsy Interpretation, Scheuer PJ, Lefkowitch JH (eds). WB Saunders, 6th edição, London, 134–150p., 2000. SCHMID, W. The micronucleus test. Mutation Research, v.31, 9–15p., 1975. SCHULTZ, D.R. and HARRINGTON, W.J.JJr. Apoptosis: programmed cell death at a molecular level. Semin. Arthritis Rheum, v.32, 345-369p., 2003. SHAH, A.; KHAN, A.M.; QURESHI, R.; FARZANA, L.A.; NAZAR, M.F.; SHAH, S.S. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA. Int. J. Mol. Sci., v.9, 1424-1434p., 2008. SHAPIRO, H. M. Overture. In: SHAPIRO, H. M. (Org.). Practical Flow Cytometry. New York: Wiley-Liss, 3a ed., 1-32 p., 1995. SHARMA, P.; SHARMA, J.D. In vitro hemolysis of human erythrocytes by plant extracts with antiplasmodial activity. J. Ethnopharmacol., v.74, n.3, 160-170p., 2009. SHIBATA, S. Anti-tumorigenic chalcones. Stem Cells, v.12, 44-52p., 1994. SILVA, J.; ERDTMANN, B.; HENRIQUES, J.A.P.; Genética Toxicologia. Porto Alegre, Alcance, 422p., 2003. SINGH, Y.N.; SINGH, N.N. Therapeutic potential of kava in the treatment of anxiety disorders. Central Nervous System Drugs, v.16, 731–743p., 2002. SKEEL, R.T. Handbook of Cancer Chemotherapy. 7 Ed., Lippincott Williams Wilkins,1-50 p., 2007. SPANDIDOS, D.A. Mechanism of carcinogenesis: The role of oncogenes, transcriptional enhancers and growth factors. Anticancer Research, v.5, 485−498p., 1985. SPANDIDOS, D.A. Oncogenes and tumor suppressor genes as paradigms in oncogenesis. Journal of Buon, 12 Suppl 1, 9–12p., 2007. SPENCE, R.A.J.; JONHSTON, P.G. Oncology, Oxford University Press, Oxford, 536p., 2001. SRINIVASAN, B.; JOHNSON, T.E.; LAD, R.; XING, C. Structure-Activity Relationship Studies of Chalcone Leading to 3-Hydroxy-4,3`,4`, 5`-tetramethoxychalcone and Its Analogues as Potent Nuclear Factor κB Inhibitors and Their Anticancer Activities. J. Med. Chem., v.52, 7228-7235p., 2009. SRIVASTAVA, V., NEGI, A. S., KUMAR, J. K., GUPTA, M., KHANUJA, S. P. S. Plant-based anticâncer molecules: A chemical and biological profile of some important leads. Bioorg. Med. Chem., v.13, 5892-5908p., 2005. STEWART, H.L.; SNEU, K.C.; DUNHAM, L.J.; SCHLYEN, S.M. Transplantable and Transmissible Tumors of Animals. Armed Forces Institute of Pathology, WashIngton, 324–329p., 1959. STOLL, R.; RENNER, C.; HANSEN, S. Chalcone derivatives antagonize between the human oncoprotein MDM2 and p53. Biochem., v.40, n.2, 336-344p., 2001.

Page 166: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

166

STRASSER, A., O’CONNOR, L., DIXIT, V. M. Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem., v.69, 217-245p., 2000. SUOLINNA, E.M.; BUCHSBAUM, N.R.; RECKER, E. The effect of flavonoids on aerobic glycolysis and growth of tumor cells. Cancer Res., v.35, 1865p., 1975. THOMAS, G. Medicinal Chemistry: An Introduction. John Wiley & Sons, Chichester, 2000. TICE, R.R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMANN, A.; KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J.C.; SASAKI, Y.F. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and Molecular Mutagenesis, v.35, 206–221p., 2000. TINARI, A; GIAMMARIOLI, AM; MANGANELLI, V CIARLO, L; MALORNI, W. Analyzing Morphological and Ultrastructural Features in Cell Death. Em: Methods in Enzymology. Elsevier Inc., 442p., 2008. THIAGARAJAN, P.; TAIT, J.F. Binding of Annexin V/placental anticoagulant protein I to platelets. Evidence for phosphatidylserine exposure in the procoagulant response of activated platelets. J. Biol. Chem., v.265, n.29, 17420-17423p., 1990. VASCONCELLOS, M.C. Estudo do Potencial Antineoplásico da Biflorina, o- Naftoquinona isolada das Raízes de Capraria biflora L.Tese de Doutorado. Fortaleza-Ceará, p.193, 2007. VERMES, I.; HAANEN, C.; STEFFENS-NAKKEN, H.; REUTELINGSPERGER, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods, v.184, n.1, 39-51p., 1995. VERMES, I.; HAANEN, C.; REUTELINGSPERGER, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods, v.243, 167-190p., 2000. VERMEULEN, K. VAN BOCKSTAELE, D.R. BERNEMAN, Z.N. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer. Ann. Hematol., v.84, 627–639p., 2005. VIANA, G.S.; BANDEIRA, M.A.; MATOS, F.J. Analgesic and anti-inflammatory effects of chalcones isolated from Myracrodrun urundeuva Allemao. Phytomedicine, v.10, 189-195p., 2003. VINCENZO, R.; FERLINI, C.; DISTEFANO, M.; GAGGINI, C.; RIVA, A.; BOMBARDELLI, E.; MORAZZONI, P.; VALENTI, P.; BELLUTI, F.; RANELLETTI, F.O.; MANCUSO, S.; SCAMBIA, G. In vitro evaluation of newly developed chalcone analogues in human cancer cells. Cancer Chemother Pharmacol, v.46, 305-31p., 2000. WAGNER- DÖBLER, L, BEIL, W., LANG, S., MEINERS, M., LAATSCH, H. Integrated approach to explore the potential of marine microorganisms for the production of bioactive metabolites. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, v.74, 207-238p., 2002. WANG, L.; SHI, G.G.; YAO, J.C.; GONG, W.; WEI, D.; WU, T.T.; AJANI, J.A.; HUANG, S.; XIE, K. Expression of endothelial nitric oxide synthase correlates with the

Page 167: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

167

angiogenic phenotype of and predicts poor prognosis in human gastric cancer. Gastric Cancer, v.8, n.1, 18-28p., 2005. WEINBERG, R.A. A biologia do câncer. Artmed Editora S.A.. Porto Alegre, 864p., 2008. WERMUTH, G.; GANELLIN, C.R.; LINDBERG, P.; MITSCHER, L.A.; Glossary of terms used in medicinal chemistry. Pure and Applied Chemistry, v.70, 1129–1143p., 1998. WESTWELL, A.D.; STEVENS, M.F.G. Hitting the chemotherapy jackpot: strategy, productivity and chemistry. Drug Discovery Today, v.9, 625–627p., 2004. WILSON, R.M. & DANISHEFSKY, S.J. Applications of total synthesis toward the discovery of clinically useful anticancer agents. Chem. Soc. Rev., v.36, 1207-1226p., 2007. YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL-FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova, v.24,147-152p., 2001. ZIEGLER, U.; GROSCURTH. Morphological features as cell death. News physiology sciences, v.19, 124-128p., 2004. ZIMMERMANN, K.C.; BONZON, C.; GREEN, D.R. The machinery of programmed cell death. Pharmacol. Ther., v.92, n.1, 57-70p., 2001. ZUCKERBERG, C. Ultrastructure of Sarcoma 180. Cancer Research, v.33, 2278-2282p., 1973. ZUCCO, V.; SUPINO, R.; RICHETTI, S.C.; CLERIS, L.; MARCHESI, E.; GAMBACORTI-PASSERINI, C.; FORMELLI, F. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Letters, v.175, 17-25p., 2002.

Page 168: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

168

Anexos

Page 169: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

169

ANEXO 1 Aprovação do Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos (COMEPE)

Page 170: ESTUDO DO POTENCIAL ANTICÂNCER DE UM DERIVADO … · Estudo do potencial anticâncer de um derivado de chalcona, 1-(4-Nitrofenil)-3- ... Porque toda a medicina provém de Deus, A

170

ANEXO 2 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA)