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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Croton nepetaefoliusCroton nepetaefoliusCroton nepetaefoliusCroton nepetaefolius
Baill. sobreBaill. sobreBaill. sobreBaill. sobre os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as
propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio
celíacocelíacocelíacocelíaco
PPPPEDRO EDRO EDRO EDRO JJJJORGE ORGE ORGE ORGE CCCCALDAS ALDAS ALDAS ALDAS MMMMAGALHÃESAGALHÃESAGALHÃESAGALHÃES
Fortaleza-CE 2002
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Estudo farmacológico do óleo essencial do Croton nepetaefoliusCroton nepetaefoliusCroton nepetaefoliusCroton nepetaefolius Baill. Baill. Baill. Baill.
sobre os músculos lisos traqueal e vascular esobre os músculos lisos traqueal e vascular esobre os músculos lisos traqueal e vascular esobre os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as propriedades sobre as propriedades sobre as propriedades sobre as propriedades
eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio celíacoeletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio celíacoeletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio celíacoeletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio celíaco
Pedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas Magalhães
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Farmacologia como requisito parcial para a obtenção
do título de Doutor em Farmacologia
Fortaleza-CE, julho de 2002
3
Sessão pública de defesa em: 12 de julho de 2002
Estudo farmacológico do óleo essencial do Croton nepetaefolius Baill. sobre os
músculos lisos traqueal e vascular e sobre as propriedades eletrofisiológicas de
neurônios fásicos de gânglio celíaco
Pedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas MagalhãesPedro Jorge Caldas Magalhães
Prof. Orientador: José Henrique Leal-Cardoso
Banca examinadora:
Prof. Dr. José Henrique LealProf. Dr. José Henrique LealProf. Dr. José Henrique LealProf. Dr. José Henrique Leal----CardosoCardosoCardosoCardoso Prof. Titular de Fisiologia Humana da Universidade Estadual do Ceará - UECE
Prof. Dr. FranciscProf. Dr. FranciscProf. Dr. FranciscProf. Dr. Francisco Ruy Capazo Ruy Capazo Ruy Capazo Ruy Capaz Prof. Adjunto de Farmacologia da Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dr. Saad LahlouProf. Dr. Saad LahlouProf. Dr. Saad LahlouProf. Dr. Saad Lahlou Prof. Visitante da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Prof. Dr. Armênio Aguiar dos SantosProf. Dr. Armênio Aguiar dos SantosProf. Dr. Armênio Aguiar dos SantosProf. Dr. Armênio Aguiar dos Santos Prof. Adjunto de Fisiologia da Universidade Federal do Ceará - UFC
ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Andrelina Noronha Coelho de Souza. Andrelina Noronha Coelho de Souza. Andrelina Noronha Coelho de Souza. Andrelina Noronha Coelho de Souza Profa. Adjunta de Biofísica da Universidade Estadual do Ceará - UECE
4
AAAAgradecimentos
Prof. José Henrique Leal CardosoProf. José Henrique Leal CardosoProf. José Henrique Leal CardosoProf. José Henrique Leal Cardoso, meu mestre que, com sabedoria e
maturidade, tornou-me eternamente grato pelo despertar de minha vocação pela ciência e pelo ensino e pela minha formação acadêmica em todos esses anos
Márcia Andréa Vasconcelos dos SantosMárcia Andréa Vasconcelos dos SantosMárcia Andréa Vasconcelos dos SantosMárcia Andréa Vasconcelos dos Santos, Tatiana Leite Tatiana Leite Tatiana Leite Tatiana Leite PradinesPradinesPradinesPradines e Lívia Noronha Coelho de SouzaLívia Noronha Coelho de SouzaLívia Noronha Coelho de SouzaLívia Noronha Coelho de Souza pela dedicação e
entusiasmo com os quais me ajudaram a desenvolver este trabalho
Profs. Saad LahlouProfs. Saad LahlouProfs. Saad LahlouProfs. Saad Lahlou e Roberto Oscar BrasilRoberto Oscar BrasilRoberto Oscar BrasilRoberto Oscar Brasil pelo companheirismo e incentivo
PatríciaPatríciaPatríciaPatrícia, esposa e companheira, com quem dividi todos os momentos durante esse percurso
AlessandroAlessandroAlessandroAlessandro e BeatrizBeatrizBeatrizBeatriz, por quem mais vale o labor
Francisco Francisco Francisco Francisco Evanir LimaEvanir LimaEvanir LimaEvanir Lima, Sílvia LimaSílvia LimaSílvia LimaSílvia Lima, Aura Aura Aura Aura Rhanes YidaRhanes YidaRhanes YidaRhanes Yida, Joana Barbosa Joana Barbosa Joana Barbosa Joana Barbosa, Rejane Teixeira Rejane Teixeira Rejane Teixeira Rejane Teixeira, Marta Marta Marta Marta
FreitasFreitasFreitasFreitas, Rose Ferreira Rose Ferreira Rose Ferreira Rose Ferreira, Vilani Bastos Vilani Bastos Vilani Bastos Vilani Bastos, Artemísia Portela Artemísia Portela Artemísia Portela Artemísia Portela, Bento OliveiraBento OliveiraBento OliveiraBento Oliveira
Aos colegas do Departemento de Fisiologia e Farmacologia pela colaboração com as tarefas didáticas nesse período
FUNCAPFUNCAPFUNCAPFUNCAP
GerardoGerardoGerardoGerardo, pai e exemplo, a quem dedico este trabalho
5
SSSSUMÁRIO
PÁGINA
Lista de Figuras 8
Lista de Tabelas 11
Lista de abreviaturas 12
Resumo 14
Abstract 15
INTRODUÇÃO 16
OBJETIVOS 40
METODOLOGIA 42
Animais e tecidos 42
Vasos sangüíneos 42
Traquéia 43
Gânglio celíaco 45
Medidas eletrofisiológicas 49
Imunização dos cobaios com ovalbumina 50
Tratamento dos ratos com acetato de deoxicorticosterona (DOCA)-sal 50
Medida da pressão arterial 51
Estudo dos efeitos do OECN sobre a frequência cardíaca, respiratória e sobre os parâmetros gasométricos
52
Soluções e drogas 52
Protocolos experimentais 54
Análise estatística 55
RESULTADOS
Ações do OECN sobre o músculo liso traqueal de cobaio
• Efeito do OECN no tônus basal da traquéia isolada de cobaio 57
• Efeito do OECN na contraçao da traquéia isolada de cobaio induzida pela ovalbumina 57
• Efeito de uma segunda exposição da traquéia de cobaio a ovalbumina na ausência e na presença 57
6
de OECN e cromoglicato
• Efeito da pirilamina sobre as contrações induzidas pela ovalbumina e pela histamina em traquéia isolada de cobaio
58
• Efeito inibitório do OECN na contração mantida da histamina e prostaglandina F2α em traquéia isolada de cobaio
58
• Efeitos inibitórios do OECN nas contrações submaximais induzidas por histamina, KCl e carbacol na traquéia isolada de cobaio
59
• Comparação do potencial transmembrana da traquéia isolada de cobaio na presença e ausência do OECN
59
Ações do OECN na pressão arterial, frequências cardíaca e respiratória e gasometria de ratos anestesiados
• Pressão arterial média (PAM) 67
• Frequência cardíaca 67
• Frequência respiratória 67
• Gasometria 67
Ações do OECN sobre o músculo liso vascular isolado de cobaio
• Reversão da contratura K+ em aorta isolada e influência do endotélio e L-NAME no efeito do OECN
72
• Reversão da contratura induzida pelo éster do forbol em aorta isolada 72
• Inibição da curva concentração-efeito do dibutirato de forbol em aorta isolada 72
• Sobre a contração da aorta isolada induzida por solução de K+ hiperosmolar 73
• Sobre o potencial transmembrana da aorta isolada 73
• Sobre o potencial transmembrana de vasos mesentéricos isolados 74
Ações do OECN sobre o músculo liso vascular isolado de rato
• Reversão da contratura K+ e influência do endotélio e L-NAME no efeito do OECN 80
• Reversão da contratura K+ pelo 1,8 cineol, metil-eugenol e terpineol 80
• Influência do azul de metileno no relaxamento induzido pelo OECN na aorta de rato contraída com 0,3 µM de norepinefrina
80
• Sobre as contrações induzidas por fenilefrina em aorta de ratos uninefrectomizados e DOCA-sal 81
Efeitos na circulação mesentérica ex vivo de ratos
• Sobre o fluxo no leito vascular mesentérico 86
7
• Influência do L-NAME e D-NAME no efeito relaxante do OECN sobre o fluxo mesentérico 86
• Efeitos dos principais constituintes 1,8-cineol, metil-eugenol e terpineol sobre o fluxo no leito vascular mesentérico
88
Sobre a contração induzida por solução de K+ hiperosmolar em útero isolado de ratas estrogenizadas
88
Estudos eletrofisiológicos em neurônios fásicos do gânglio celíaco
• Propriedades elétricas passivas e ativas dos neurônios do gânglio celíaco 96
Ações da histamina sobre as propriedades passivas e ativas dos neurônios e efeitos do OECN sobre as respostas dos neurônios à histamina
• Sobre o potencial de repouso e a resistência de entrada da membrana 97
• Sobre o limiar de corrente para ativação neuronal 99
• Sobre o overshoot e a amplitude dos potenciais de ação 99
• Sobre a duração dos potenciais de ação 100
• Sobre o número de potenciais de ação 100
• Sobre a excitabilidade neuronal 101
DISCUSSÃO
• Efeitos no músculo liso traqueal 115
• Efeitos no músculo liso vascular 119
• Estudos eletrofisiológicos 123
• Considerações Finais 130
CONCLUSÕES 132
REFERÊNCIAS 134
TABELAS I a IV 157-160
Legendas das Figuras 161
8
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
1. Croton nepetaefolius Baill (ramos floridos) 19
2. Sistema de registro das contrações em músculo liso 44
3. Dissecção do gânglio celíaco de cobaio 46
4. Sistema para os experimentos de registro intracelular e de aquisição de dados eletrofisiológicos
48
5. Sistema de registro da pressão arterial 53
6. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o tônus basal da traquéia de cobaio
60
7. Reversão da contração mantida por solução despolarizante contendo 60mM de K+ pelo óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) e metil-eugenol em traquéia isolada de cobaio
61
8. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) e cromoglicato na contração induzida pela apresentação do antígeno sensibilizante em traquéia de cobaio
62
9. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração mantida da histamina na traquéia isolada de cobaio
63
10. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração mantida da prostaglandina F2α na traquéia isolada de cobaio
64
11. Efeito inibitório do óleo essncial do Croton nepetaefolius (OECN) nas contrações induzidas pela histamina, carbacol e KCl na traquéia de cobaio
65
12. Medida do potencial transmembrana do músculo liso traqueal de cobaio 66
13. Efeito hipotensor do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) OECN em ratos anestesiados nefrectomizados e DOCA-sal
69
14. Avaliação da frequência respiratória de ratos anestesiados nefrectomizados e DOCA-sal
70
15. Avaliação do efeito do tratamento agudo com óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) em parâmetros gasométricos sanguíneos de ratos anestesiados apenas nefrectomizados ou, após a nefrectomia, tratados com DOCA-sal
71
16. Efeito relaxante do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre a contração do músculo liso de anéis de aorta de cobaio, mantidos em 60 mM de K+
75
17. Reversão pelo óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) da contratura induzida pelo dibutirato de forbol em aorta de cobaio
76
18. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na curva concentração- 77
9
efeito do dibutirato de forbol na aorta isolada de cobaio
19. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração induzida pelo K+ hipertônico em aorta isolada de cobaio
78
20. Medida do potencial transmembrana do músculo liso vascular de cobaio 79
21. Efeito relaxante do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) no músculo liso de anéis de aorta de rato contraídos com solução despolarizante contendo 60 mM de K+
82
22. Efeito relaxante do 1,8-cineol, metil-eugenol e terpineol, constituintes do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) no músculo liso de anéis de aorta de rato
83
23. Efeito do azul de metileno na atividade relaxante do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) no músculo liso de anéis de aorta de rato contraídos com norepinefrina
84
24. Bloqueio, promovido pelo óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN), das contrações induzidas pela fenilefrina em aorta de ratos nefrectomizados e DOCA-sal
85
25. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato ex vivo
89
26. Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN), da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de L-NAME.
90
27. Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN), da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de D-NAME
91
28. Avaliação da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de cineol
92
29. Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes de metil-eugenol, da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+, na ausência e presença de L-NAME
93
30. Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes de terpineol, da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de L-NAME
94
31. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração induzida pelo K+ hipertônico em útero isolado de rata estrogenizada
95
32. Tipos de neurônios encontrados nos experimentos com gânglio celíaco de cobaio 103
33. Histogramas de distribuição de frequência das principais características elétricas das células utilizadas neste estudo, o potencial de repouso e a resistência de entrada
104
v
10
34. Efeito da histamina sobre o potencial transmembrana de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
105
35. Efeito da histamina sobre a resistência de entrada da membrana de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
106
36. Efeito da histamina sobre o limiar de corrente para ativação de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
107
37. Efeito da histamina sobre o overshoot dos potenciais de ação de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
108
38. Efeito da histamina sobre a amplitude dos potenciais de ação de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
109
39. Efeito da histamina sobre a duração dos potenciais de ação de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
110
40. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre as alterações produzidas pela histamina em neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
111
41. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre as alterações produzidas pela histamina no número de potenciais de ação em neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
112
42. Efeito da histamina sobre a excitabilidade de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
113
43. Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o efeito da histamina na excitabilidade de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
114
11
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
I. Valores (em mV) da diferença de potencial transmembrana registrado pela técnica do microeletrodo intracelular em vários tecidos de cobaio na presença e ausência de OECN
157
II. Concentração efetiva 50% (CE50) e concentração limiar de OECN (limiar) para a reversão da contratura induzida por 60 mM de K+ em aorta de cobaio e rato em diferentes condições
158
III. Comparação das propriedades elétricas dos neurônios apresentados neste estudo e em outros trabalhos encontrados na literatura, através de registros intracelulares de gânglios nervosos intactos de cobaio in vitro
159
IV. Efeito da pirilamina sobre as ações promovidas pela histamina em gânglio celíaco de cobaio
160
12
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh Acetilcolina
ADP Difosfato de adenosina
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA Análise de variância
ATP Trifosfato de adenosina
CI50 Concentração inibitória capaz de produzir 50 % do efeito máximo
DAG Diacilglicerol
DBF Dibutirato de forbol
DOCA Acetato de deoxicorticosterona
E.P.M. Erro padrão da média
EGTA Ácido etileno-bis(β-amino-etil-éter)-N,N,N´,N´-tetracético
Em Potencial transmembrana
GMPc Guanosina monofosfato cíclico
HA Histamina
IP3 Trifosfato de inositol
K60 Solução nutridora contendo 60 mM de K+
L-NAME l-nitro-arginina-metil-éster
LT Leucotrieno
MLC Cadeia leve de miosina
MLCK Quinase de cadeia leve de miosina
NO Óxido nítrico
OECN Óleo essencial do Croton nepetaefolius
PAM Pressão arterial média
PG Prostaglandina
Pi Fosfato inorgânico
PKC Proteína quinase C
Ri Resistência de entrada da membrana
TEA Tetraetilamônio
TTX Tetrodotoxina
Tx Tromboxano
13
ntão, a travessia das veredas sertanejas é mais exaustiva que a de uma estepe nua.
Nesta, ao menos, o viajante tem o desafogo de um horizonte largo e a perspectiva de planuras francas. Ao passo que a caatinga o afoga; abrevia-lhe o olhar; agride-o e estonteia-o; enlaça-o na trama epinescente e não o atrai; repulsa-o com as folhas urticantes, com o espinho, com os gravetos estalados em lanças; e desdobra-se-lhe na frente léguas e léguas, imutável no aspecto desolado: árvores sem folhas, de galhos estorcidos e secos, revoltos, entrecruzados, apontando rijamente no espaço ou estirando-se flexuosos pelo solo, lembrando um bracejar imenso, de tortura da flora agonizante...
Embora esta não tenha as espécies reduzidas dos desertos – mimosas tolhiças ou eufórbias ásperas sobre o tapete das gramíneas murchas – e se afigure farta de vegetais distintos, as suas árvores, vistas em conjunto, semelham uma só família de poucos gêneros, quase reduzida a uma espécie invariável, divergindo apenas no tamanho, tendo todas a mesma conformação, a mesma aparência de vegetais morrendo, quase sem troncos, em esgalhos logo ao irromper do chão. É que por um efeito explicável de adaptação às condições estreitas do meio ingrato, evolvendo penosamente em círculos estreitos, aquelas mesmo que tanto se diversificam nas matas ali se talham por um molde único. Transmudam-se, e em lenta metamorfose vão tendendo para limitadíssimo número de tipos caracterizados pelos atributos dos que possuem maior capacidade de resistência.
Esta impõe-se, tenaz e inflexível. ~
Trecho sobre a caatinga nordestina retirado do
livro “Os sertões”, escrito por Euclides da
Cunha entre 1898 e 1901, época em que
trabalhou como correspondente do jornal ‘O
Estado de São Paulo’, para cobrir os
acontecimentos em Canudos.
“E
”
14
RESUMO Estudo farmacológico do óleo essencial de Croton nepetaefolius Baill. sobre o músculo liso
traqueal e vascular e sobre as propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio
celíaco. Pedro Jorge Caldas Magalhães, Tese de Doutorado em Farmacologia, UFC, 2002.
Croton nepetaefolius Baill é um arbusto aromático do Nordeste brasileiro, conhecido como “marmeleiro
sabiá”, utilizado na medicina popular como antiespasmódico e carminativo. Os principais constituintes do
seu óleo essencial são 1,8-cineol, metil-eugenol, xantoxilina e terpineol. Recentemente, demonstraram-se
propriedades antiespasmódica intestinal, hipotensiva, antiinflamatória e analgésica para o óleo essencial
do Croton nepetaefolius (OECN). Neste trabalho, caracterizamos os efeitos farmacológicos do OECN
sobre o músculo liso respiratório e vascular de rato e cobaio e sobre o funcionamento elétrico de neurônios
de gânglio celíaco de cobaio. Usamos preparações in vitro de vasos sanguíneos de ratos e cobaios
machos (aorta e vasos mesentéricos) e anéis de traquéia, mantidos em solução nutridora, aerada, pH 7,4,
a 37 oC, para registro isométrico das contrações musculares. Usamos também gânglios celíacos intactos
de cobaios, mantidos em temperatura ambiente in vitro, para os registros eletrofisiológicos pela técnica do
microeletrodo intracelular. In vivo, avaliamos as ações do OECN sobre a pressão arterial média e alguns
parâmetros cardíacos, respiratórios e hematológicos em ratos. O OECN (0,1 - 1000 µg/ml) relaxou o
tônus basal (5 mM [K+]) e o tônus aumentado por K+ (60 mM) em traquéia de cobaio, de maneira
dependente de concentração (CE50 de 4 e 63 µg/ml, respectivamente). Em tecidos de cobaios
previamente sensibilizados, o OECN (300 e 600 µg/ml), reduziu a contração induzida pela apresentação
do antígeno sensibilizante (ovalbumina). Na faixa de concentração de 100 a 400 µg/ml, bloqueou as
contrações induzidas por histamina e PGF2α. O OECN inibiu as contrações induzidas por histamina,
carbacol e KCl com CI50 na faixa de 100 - 130 µg/ml. Em aorta de rato e cobaio, relaxou a contração
induzida por 60 mM de K+ (CI50 de 32 e 200 µg/ml, respectivamente). Em rato, mas não em cobaio, este
relaxamento foi parcialmente inibido pela retirada do endotélio vascular ou pela adição de 100 µM de L-
NAME. Em aorta de cobaio, o OECN inibiu as contrações independentes de Ca2+, induzidas por dibutirato
de forbol e por K+ hiperosmolar na solução nutridora. O OECN diminuiu preferencialmente a pressão
arterial em ratos DOCA-sal do que em ratos nefrectomizados e, bloqueou mais potentemente as
contrações induzidas pela fenilefrina em aorta de rato DOCA do que dos animais nefrectomizados. O
OECN, metil-eugenol e terpineol, aumentam o fluxo de líquido pela circulação mesentérica de rato, sendo
este efeito parcialmente inibido pela presença de L-NAME. Em nenhuma dessas preparações o OECN
produziu hiperpolarização do potencial transmembrana. Em neurônios fásicos de gânglio celíaco de
cobaio, o OECN diminuiu significativamente o aumento da excitabilidade produzido pela histamina sem
alterar as propriedades passivas e ativas dos neurônios. Em conclusão, o OECN relaxa o músculo liso
das vias aéreas, é um agente hipotensor e vasorelaxante e diminui a excitabilidade induzida por histamina
em neurônios autonômicos. Seus efeitos são, provavelmente, intracelulares ou mediados por proteína
quinase C.
15
ABSTRACT
Pharmacological study of the essential oil of Croton nepetaefolius Baill. on tracheal and vascular
smooth muscle and on electrophysiological properties of celiac ganglion phasic neurons. Pedro
Jorge Caldas Magalhães, Tese de Doutorado em Farmacologia, UFC, 2002.
Croton nepetaefolius is an aromatic bush found in brazilian Northeast region, called “marmeleiro sabiá”,
and it is used in folk medicine as an antispasmodic and carminative agent. Its essential oil is comprised of
1,8-cineole, methyl-eugenol, xanthoxylin, terpineol and others constituents. Recent studies showed some
pharmacological activities of the essential oil of Croton nepetaefolius (EOCN) as an intestinal
antispasmodic, hypotensive, anti-inflammatory and analgesic agent. Our aim in this work was to evaluate
the effects of EOCN on airway and vascular smooth muscle and also on autonomic neurons. We used in
vitro models of rat and guinea-pig isolated vessels and guinea-pig tracheal rings for isometric recording of
the smooth muscle contractions. Guinea-pig celiac ganglion, was used for intracellular microelectrode
recording of electricophysiological signals. Moreover, mean arterial pressure, cardiovascular, respiratory
and hematologic parameters were measured in vivo in rats. EOCN (0,1 – 1000 µg/ml) relaxed basal and
K+-increased guinea-pig tracheal tonus (EC50 = 4 and 63 µg/ml, respectively), in a concentratation-
dependent manner. In ovalbumin-sensitized guinea-pig tissues, EOCN inhibited the antigen-induced
contraction. EOCN (100 - 400 µg/ml) blocked the histamine- and PGF2α-induced contractions. The
contractions induced by histamine, carbacol and KCl were inhibited by EOCN with IC50s between 100-130
µg/ml. In rat and guinea-pig aortic rings, EOCN relaxed the 60 mM K+-induced contractions (IC50 = 32 and
200 µg/ml, respectively). Only in rat tissues, this EOCN-induced relaxation was partially inhibited by both
L-NAME (100µM) or endothelium lack. In guinea-pig aortic rings, EOCN inhibited the Ca2+-independent
phorbol esther- and hyperosmotic K+- induced contractions. EOCN, preferably, diminished the mean
arterial pressure and inhibited the aortic rings phenylephrine-induced contractions in DOCA-salt treated rats
rather than uninephrectomized rats. Both EOCN, methyl-eugenol and terpineol increased the flow through
rat mesenteric bed. This effect was partially blocked by L-NAME (50 µM). EOCN did not produce
hyperpolarization of the transmembrane potential. In celiac ganglion phasic neurons, EOCN signicantly
inhibited the histamine-induced increase of the neuronal excitability. In conclusion, EOCN is an airway
smooth muscle relaxant, hypotensor and vasorelaxant agent, and it is a blocker of the stimulant histamine
activity on autonomic neurons. Its effects are, probably, mediated by an intracellular action or protein C
kinase modulation.
16
[INTRODUÇÃO
Na cultura ocidental, todas as informações referentes a medicamentos e a seu uso foram
chamadas de materia medica desde que o conhecimento farmacêutico e médico foi sendo organizado.
No início do século XIX, a materia medica passou a ser dividida em disciplinas especializadas como a
farmacologia e a farmacognosia e, a partir do final do século XIX, a química farmacêutica, com o
advento das técnicas de sínteses de novos compostos (Robbers et al., 1997). Nas ciências médicas
diversas substâncias importantes são derivadas de produtos naturais como a nicotina, morfina,
atropina, hioscina, quinina, pilocarpina, glicosídios digitálicos entre outras que, na maior parte dos
casos são obtidas de diferentes espécies de plantas. Mesmo que muitas delas não sejam utilizadas
terapeuticamente, apresentam-se como valiosas ferramentas para exploração farmacológica de
mecanismos celulares como a rianodina, um alcalóide isolado das raízes de Ryania speciosa,
substância útil no estudo dos mecanismos de contração muscular e liberação de íons cálcio do retículo
sarcoplasmático (Meissner, 1986; Drummond e Hughes, 1987; Sutko et al., 1997), os ésteres do forbol
(como por exemplo, o dibutirato de forbol), extraídos de partes do Croton tiglium, agentes promotores
de tumor e ativadores de proteína quinase C (Drummond e Hughes, 1987), a tapsigargina, isolada de
Thapsia garganica, que mimetiza as ações dos segundos mensageiros intracelulares trifosfato de
inositol e diacilglicerol (Thastrup et al., 1987; Drummond e Hughes, 1987).
Estima-se que aproximadamente 25% de todos os medicamentos modernos sejam direta
ou indiretamente derivados de plantas. Em casos particulares como os de medicamentos utilizados
para o tratamento de câncer e os antimicrobianos, aproximadamente 60% dos medicamentos
atualmente disponíveis no mercado e aqueles nos últimos estágios de testes clínicos sejam derivados
de produtos naturais, principalmente de plantas (Calixto, 2000). Dentre estas substâncias, muitas não
são isoladas diretamente de plantas superiores, mas são produzidas a partir de precursores obtidos
desta fonte. Vários narcóticos utilizados como analgésicos são classificados como oriundos de
modificações químicas da molécula da morfina. O taxol pode ser sintetizado a partir da bacatina III,
que é relativamente abundante nas folhas de várias espécies de teixo, enquanto o próprio taxol é
17
encontrado apenas na casca do teixo raro do Pacífico. A hidrocortisona ou corticosteróides afins
podem ser obtidos pelo tratamento do estigmasterol que existe em abundância no óleo de soja
(Robers et al., 1997).
OS ÓLEOS ESSENCIAIS
Dentre os agentes terapêuticos provenientes de plantas, com uso medicinal popular e
científico, destacam-se os óleos essenciais. Esses óleos, também conhecidos como essências, são
princípios ativos oleosos e voláteis, responsáveis pelo aroma característico das chamadas plantas
aromáticas (produtoras de óleos essenciais), muitos deles inclusive possuindo propriedades ativas em
sistemas biológicos, o que os tornam, portanto, de interesse científico. Constituem-se em complexas
misturas de componentes classificados quimicamente em diversos grupos (terpenos, fenóis, etc) e,
geralmente, é possível atribuir a um ou mais constituintes as ações dos óleos essenciais sobre estes
sistemas. Apresentam uma grande importância econômica e são largamente utilizados na indústria
com os mais diversos fins como aromatizantes, repelentes de insetos, em perfumaria, na composição
de desinfetantes e cosméticos, na preparação de alimentos e licores (Freise, 1935; Jacobs, 1948;
Craveiro et al. 1977; Itokawa et al., 1980). Na medicina popular são utilizados, na forma de chás e
infusatos, como sedativos, estomáquicos, antiespasmódicos, antidiarréicos, antiparasitários,
antimicrobianos, analgésicos, diuréticos e hipotensores, antimaláricos, anti-hemorroidários, anti-
sifilíticos e no tratamento de rinite alérgica (Freise, 1935; Itokawa et al., 1981; Luz et al., 1984;
Klayman, 1985; Mendonça et al., 1991; Kiuchi et al., 1992).
O estudo dos efeitos dos óleos essenciais de plantas comumente encontradas em nossa
região sobre tecidos animais e, particularmente, sobre as células musculares tem se tornado rotineiro
nos últimos anos e têm demonstrado atividades farmacológicas coerentes com a sua utilização na
medicina popular (Leal-Cardoso e Fonteles, 1999). Por exemplo, o óleo essencial de Croton
zehntneri, espécie mais conhecida como “canela-de-cunhã”, mostrou-se possuidor de interessantes
propriedades farmacológicas sobre o músculo esquelético e sobre o músculo liso intestinal. No
primeiro, o óleo essencial de C. zehntneri e seus principais constituintes anetol e estragol inibiram
18
contrações induzidas pela estimulação elétrica direta no nervo e pela acetilcolina enquanto que
potencializaram as contrações produzidas pela cafeína (Albuquerque et al., 1995). No músculo liso
seus efeitos são predominantemente antiespasmódicos e são atribuídos, pelo menos parcialmente, ao
estragol (Coelho-de-Souza et al., 1997). Ao mesmo tempo, em concentrações maiores que 10 µg/ml,
também produz contrações rítmicas em íleo e aumenta a amplitude e a freqüência das contrações
espontâneas da bexiga de cobaio (Coelho-de-Souza et al., 1998), sugerindo que este óleo essencial
pode exercer efeitos moduladores diferenciais na contratilidade de vários músculos lisos.
Outro óleo essencial farmacologicamente ativo em células musculares lisas e
esqueléticas é o da Mentha x villosa, conhecida popularmente como “hortelã-rasteira”, cuja atividade
hipotensora foi descrita recentemente (Lahlou et al, 2001). Em músculo sartório de sapo este óleo
essencial também apresenta uma atividade inibitória sobre contrações induzidas por soluções
contendo 80 mM de K+ e potencializa as contrações induzidas pela cafeína. Por outro lado, em
concentrações maiores que 1 mg/ml produz contrações que são bloqueadas pela procaína (Fogaça et
al., 1997). O principal constituinte do hidrolato obtido na extração do óleo essencial da M. villosa, o
óxido de piperitenona, também se mostrou ativo sobre diversas preparações biológicas inclusive sobre
o músculo liso intestinal de cobaio com efeitos antiespasmódicos (Sousa et al., 1997). O óleo
essencial da Alpinia speciosa, planta conhecida popularmente como “colônia”, apresentou efeito
relaxante e antiespasmódico sobre preparações intestinais de íleo de rato (Bezerra et al., 2000, Lahlou
et al., 2002).
O ÓLEO ESSENCIAL DO Croton nepetaefolius
Croton nepetaefolius Baill é a denominação científica de um tipo de arbusto comum no
Nordeste brasileiro popularmente conhecido como “marmeleiro sabiá” (Fig. 1). É um exemplar da
família Euphorbiaceae e do gênero Croton, um dos mais bem representados na flora nordestina,
encontrado nos cerrados, matas litorâneas e principalmente nas caatingas (Ducke, 1959). De acordo
com citações populares, as plantas representantes deste gênero, nativas da região Nordeste do Brasil,
podem ser agrupadas em quatro categorias distintas, três delas com características bem definidas
19
Fig. 1 – Croton nepetaefolius Baill (ramo florido)
Folhas com limbo triangular, palmatinérvico, oval, agudo, de base cordato-subtruncado ou levemente cordado, provida de glândulas estipitadas e de margens duplamente serradas; na página superior são viloso-pubescente, tornando-se depois hirto-pubescente. As flores são pequenas, reunidas em inflorescência do tipo cacho. Os frutos, de poucos a numerosos, são cápsulas tricocas.
Fotografia da coleção do Prof. José Henrique Leal-Cardoso, de amostras de “marmeleiro sabiá”, obtidas no município de Viçosa do Ceará (CE), no momento de sua coleta em maio de 2002.
Atrofiam as raízes mestras batendo contra o subsolo impenetrável e substituem-nas pela expansão irradiante das radículas secundárias, ganglionando-as em tubérculos
túmidos de seiva. Amiúdam as folhas. Fitam-nas rijamente, duras como cisalhas, à ponta dos galhos para diminuírem o campo da insolação. Revestem de
um indumento protetor os frutos, rígidos, às vezes, como estróbilos. Dão-lhes na deiscência perfeita com que as vagens se abrem, estalando como se houvessem molas de
aço, admiráveis aparelhos para propagação das sementes, espalhando-as profusamente pelo chão. ~
Euclides da Cunha, em “Os sertões”
20
e que recebem a denominação de marmeleiros, canelas silvestres e velames. A quarta categoria, de
características mais difusas, é constituída pelas outras espécies do gênero Croton. O C.
nepetaefolius, como o nome popular indica é uma das espécies pertencente à categoria dos
marmeleiros que, assim como outras plantas deste gênero, é produtor de óleo essencial com aroma
agradável e característico. Um espécime desta planta encontra-se depositado no Herbário Prisco
Viana do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob o número 3.185,
tendo sido identificado pelo Dr. Afrânio Fernandes, professor daquele Departamento.
O Departamento de Química Orgânica e Inorgânica e o Laboratório de Produtos Naturais
da Universidade Federal do Ceará, bem como o Laboratório de Química da Universidade Estadual do
Ceará, têm estudado a composição química dos óleos essenciais de plantas do Nordeste do Brasil,
inclusive do C. nepetaefolius. Tem-se feito a identificação destes constituintes através de técnicas
como a cromatografia gasosa e a espectrometria de massa (GC/MS) em amostras de óleo extraídas
por arraste de vapor d´água. A constituição química do óleo essencial do C. nepetaefolius como
documentada pelo Departamento de Química Orgânica da UFC depende da região geográfica onde a
planta é colhida. Os principais contituintes são 1,8-cineol (conhecido também como eucaliptol), metil-
eugenol, α-terpineol, β-cariofileno e xantoxilina, entre outros de menor importância na sua contribuição
percentual.
Algumas ações farmacológicas do óleo essencial do Croton nepetaefolius (aqui
denominado simplesmente de OECN) têm sido demonstradas nos últimos anos. Recentemente,
Abdon (2001) descreveu algumas características farmacológicas deste óleo essencial. Administrado
por via oral, o OECN apresentou uma DL50 acima de 3 g/Kg de peso corporal, caracterizando sua
baixa toxicidade aguda. Além disso, por esta mesma via de administração, o OECN apresentou uma
atividade antiedematogênica nos modelos de edema de pata induzidos por dextrana, histamina e
carragenina, em doses relativamente baixas (10 – 300 mg/Kg), e uma atividade analgésica em
modelos de nocicepção induzida por ácido acético, formalina e estímulo térmico (30 – 300 mg/Kg).
21
Entretanto, na medicina popular, a planta é utilizada contra distúrbios gastrintestinais
como antiespasmódica e carminativa (Craveiro et al., 1980). O estudo de suas atividades em músculo
liso intestinal in vitro demonstrou as propriedades miorelaxantes do OECN (Magalhães, 1997 e
Magalhães et al., 1998). Em camundongos, a administração intragástrica de OECN (10-100 mg/Kg)
aumentou o trânsito intestinal do marcador de carvão depositado no estômago. Este mesmo efeito
também foi observado em animais que tiveram o trânsito intestinal aumentado com o tratamento prévio
com o óleo de rícino. Em preparações isoladas o OECN diminuiu o tônus basal e reduziu a amplitude
das contrações espontâneas de segmentos de íleo e dos esfíncteres gastro-esofágico, pilórico e íleo-
cecal de cobaios e cujas CE50 situaram-se em uma faixa de concentração de 0,9 a 16 e 8 a 150 µg/ml,
respectivamente. Em íleo, o OECN e seus constituintes cineol, metil-eugenol e terpineol produziram
uma diminuição do tônus basal com valores de CE50 correspondentes a 16, 322, 9 e 71 µg/ml,
respectivamente e bloquearam as contrações induzidas por soluções contendo 60 mM de K+ com CI50
de 18, 419, 12 e 95 µg/ml, respectivamente (Magalhães et al., 1998). Estes dados demonstram que o
OECN possui propriedades miorelaxantes e antiespasmódicas in vitro, que é consistente com o uso de
preparações da planta na medicina popular como um antiespasmódico intestinal (Dantas, 1979;
Craveiro et al., 1980).
No intestino de cobaio seu efeito não foi inibido por L-NAME (100 µM), um inibidor da NO-
sintase (Moncada et al., 1991), pela indometacina, inibidor da ciclooxigenase (Wennmalm, 1978), pelo
hexametônio, bloqueador nicotínico neuro-neuronal (Kosterlitz e Lees, 1964) e pela tetrodotoxina
(TTX), clássico bloqueador de canais rápidos de sódio (Narahashi et al., 1964), o que sugere que pelo
menos em intestino, o efeito relaxante deste óleo essencial não envolve a mediação colinérgica dos
plexos intramurais, nem a ação de derivados do ácido araquidônico e do óxido nítrico (Magalhães,
1997).
Alguns dos principais constituintes do OECN possuem atividades farmacológicas diversas
e não menos interessantes. O 1,8-cineol, também conhecido como eucaliptol, é um terpeno
encontrado no óleo essencial de muitas outras plantas como o eucalipto e o araçá. Tradicionalmente
22
é utilizado pela indústria farmacêutica por suas propriedades descongestionantes e antitussígenas
(Laude et al., 1994). Por administração oral, o cineol demonstrou possuir atividades gastroprotetoras
ao reduzir os danos gástricos induzidos por etanol e inibir o volume e a acidez do suco gástrico em
ratos (Santos e Rao, 2001). Também foram relatados efeitos inibitórios do cineol sobre edema de pata
induzido pela carragenina, sobre a nocicepção induzida pela formalina e ácido acético e apresentou
efeitos depressores do sistema nervoso central (Santos e Rao, 2000). O terpineol, por outro lado,
apresentou atividade anestésica local em nervo ciático (Moreira et al., 2001) e em preparações
frênico/diafragma de rato assim como no teste de reflexo da conjuntiva de coelho (Ghelardini et al.,
2001).
Frente a estes efeitos produzidos pelo OECN e seus constituintes e, considerada
promissora a sua utilização do ponto de vista terapêutico, tornou-se imperativo o estudo de suas
propriedades farmacológicas em outros tecidos. No presente trabalho, estudamos os efeitos do OECN
em músculo liso respiratório e vascular, bem como em neurônios do sistema nervoso autônomo, para
um melhor entendimento dos seus efeitos sistêmicos e seu mecanismo de ação. Antes, porém,
faremos algumas considerações sobre o funcionamento e as interações das células musculares lisas
vasculares e das vias aéreas e também dos gânglios pré-vertebrais do sistema nervoso autônomo.
A maquinaria muscular lisa e o seu funcionamento
As células musculares lisas das paredes de muitos órgãos são vitais para diversas
funções do organismo e seu funcionamento anormal contribui para muitas doenças (Somlyo e Somlyo,
1994 e 2000). A atividade uterina durante o parto, o sibilo e a dificuldade da respiração na asma e o
espasmo das artérias coronárias são produtos da contração de células musculares lisas que estão
presentes em diversos órgãos e sistemas como no útero, nas vias aéreas, nos vasos sanguíneos, no
estômago e intestinos, na bexiga, entre outros.
As células musculares lisas de vasos e das vias aéreas apresentam aspecto fusiforme e
dimensões que variam aproximadamente de 40 a 600 µm de comprimento e 2 a 10 µm de diâmetro,
em seu comprimento ótimo para geração de força (Berne e Levy, 1998). Na maior parte dos vasos, as
23
células musculares estão arranjadas circunferencialmente, de forma que sua contração reduz o
diâmetro do tubo. Nas vias aéreas, estão arranjadas em feixes (em média de 300 a 400 células)
separados por espaços interfasciculares de dimensões variadas que contém colágeno, elastina,
fibroblastos, axônios, vasos sanguíneos e mastócitos (Stephens, 1988). A contração tanto de vasos
quanto das vias aéreas produz aumento da resistência à passagem de sangue e do ar, mas tem pouco
efeito no comprimento do órgão (Berne e Levy, 1998). O sarcolema no músculo liso representa algo
em torno de 2 a 6% do volume celular e possui uma bicamada lipídica com elementos protéicos
inseridos. O retículo sarcoplasmático existe como uma estrutura tubular embora não apresente a
organização do retículo encontrado no músculo esquelético. Não há um sarcômero bem definido. Por
outro lado, encontramos os chamados “corpos densos”, considerados análogos dos discos Z dos
músculos estriados. São estruturas que servem para transmitir forças mecânicas e proporcionar
acoplamento entre miofilamentos e o estroma do tecido conectivo (Gabella, 1976, Somlyo et al., 1980).
A contração e o relaxamento no músculo liso acontecem, em última análise,
principalmente por um aumento e uma diminuição na concentração de Ca2+ livre no interior da célula,
respectivamente (Bolton et al., 1990; Somlyo e Somlyo, 1994 e 2000; Word e Kamm, 1997). Para
isso, o acoplamento excitação-contração acontece por mecanismos que envolvem a alteração do
potencial transmembrana (evento chamado de acoplamento eletromecânico), ou por mecanismos que
independem da diferença de potencial elétrico entre os lados interno e externo da membrana como,
por exemplo, pela ativação de receptores celulares por seus agonistas. A contração muscular pode
ocorrer também por uma combinação destes dois mecanismos (Rasmussen et al., 1987; Somlyo e
Somlyo, 1990). A despolarização da membrana da célula muscular, portanto, pode ocorrer tanto por
estimulação elétrica direta quanto por ligação de agonistas, como neurotransmissores, autacóides ou
hormônios a receptores residentes na superfície da membrana citoplasmática. Esta ativação dos
receptores, processo também chamado de acoplamento farmacomecânico, pode ter como
conseqüência a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático, a abertura de canais de Ca2+
dependentes e independentes de voltagem que aumentam o influxo de Ca2+ para o citoplasma além
24
do esperado para um certo grau de despolarização da membrana e o aumento da sensibilidade das
proteínas contráteis ao Ca2+ (Rembold, 1996). Portanto, as substâncias que produzem contração das
células musculares lisas o fazem por algum desses mecanismos ou por uma combinação deles. Por
outro lado, aquelas substâncias que produzem relaxamento muscular liso, podem fazê-lo também por
interferir nestes mesmos mecanismos ou em outros adicionais, como o aumento do efluxo de Ca2+ ou
seqüestro de Ca2+ em organelas intracelulares.
O potencial transmembrana (Em) das células do músculo liso varia entre –40 a –70 mV e
alteração desse potencial a valores menos negativos (despolarização) pode abrir canais de Ca2+
dependentes de voltagem, causando influxo de Ca2+ que produz aumento da [Ca2+] intracelular e início
da contração (Somlyo e Somlyo, 1994 e 2000). Em 1948, Bozler demonstrou que as contrações do
ureter, assim como no coração, foram propagadas e estão associadas com uma alteração elétrica, o
potencial de ação. Se os potenciais de ação forem iniciados pela estimulação elétrica ocorre
contração. Portanto, contrações espontâneas resultam de descargas espontâneas de potenciais de
ação (Bolton et al., 1990). As despolarizações provocadas, por exemplo, por potenciais de ação ou
alterações na [K+] extracelular produzem aumento da [Ca2+] citoplasmática primariamente por ativação
de canais de Ca2+ do tipo L (Bolton, 1979; Hermsmeyer et al., 1988). Na maior parte, mas não em
todos os músculos lisos, contrações induzidas por altas [K+] são completamente dependentes do Ca2+
extracelular e bloqueadores de canais lentos de Ca2+ (como a nifedipina e verapamil) inibem esta
contração (D´Ocon et al., 1991). Por outro lado, em alguns músculos lisos, soluções com alto K+
também podem liberar Ca2+ de seus estoques intracelulares direta e indiretamente (Munro e Wendt,
1994).
Existem muitos trabalhos demonstrando que substâncias como ATP e carbacol também
são capazes de produzir despolarização e abrir canais inespecíficos para cátions, promovendo influxo
de Na+ que ativam, por sua vez, canais L de Ca2+ e produzir contração (Sims, 1992). Outros agonistas
como angiotensina II, TEA e ACh inibem atividade de canais de K+ em células musculares lisas, o que
também leva a despolarização e influxo de Ca2+ (Bolton, 1979; Miyoshi e Nakaya, 1991). A liberação
25
de Ca2+ por alguns agonistas também pode levar a ativação de canais de Cl- o que pode despolarizar
a célula (Hogg et al., 1994).
Em várias células, a contração muscular é precedida por pequenas despolarizações do
potencial transmembrana e essas variações na atividade elétrica da membrana estão relacionadas às
funções dos tecidos. Por exemplo, as células musculares lisas da traquéia de cobaio apresentam
oscilações espontâneas do potencial transmembrana conhecidas como “ondas lentas” que podem ser
disparadas continuamente ou periodicamente em uma freqüência de aproximadamente 0,7 a 1,6 Hz.
O potencial transmembrana oscila espontaneamente devido a uma diminuição gradual na
permeabilidade da membrana aos íons K+ e quando é alcançado um limiar para ativar canais de Ca2+
um potencial de ação se inicia (Moss e Hofmann, 1992). Aumentos na freqüência das ondas lentas
estão associados com alterações no tônus muscular da traquéia, como espasmos evocados em
traquéia de cobaio pelo LTD4 (McCaig e Rodger, 1988) ou por baixas concentrações de acetilcolina ou
histamina (McCaig e Souhrada, 1980; Ahmed et al., 1984).
Algumas substâncias também podem produzir contração por mecanismos independentes
de alterações no potencial transmembrana através de alterações na [Ca2+] intracelular ou alterando as
respostas celulares ao Ca2+. No primeiro caso, as alterações da [Ca2+] no citoplasma mediadas por
receptores e, independentes das alterações do Em, podem ser alcançadas por mecanismos que
envolvem a ativação de receptores acoplados ao sistema de proteínas G e ativação da fosfolipase Cβ1
com produção de IP3 e liberação de Ca2+ dos seus estoques internos (por exemplos, receptor α1-
adrenérgico na ativação por norepinefrina e receptor H1 para histamina; Bárány e Bárány, 1996).
Outra forma pode ser através de alterações no influxo de Ca2+ mediado por receptor. Contrações
sustentadas do músculo liso são dependentes do Ca2+ extracelular (Deth e van Breemen, 1977) e sem
Ca2+ na solução extracelular as contrações induzidas por agonistas rapidamente relaxam à medida
que existe um esvaziamento dos estoques internos (Bozler, 1969). A elevação do Ca2+ intracelular em
uma contração mantida está relacionada a um maior influxo de Ca2+ para o interior da célula (Rembold
e Murphy, 1988b). Substâncias como ATP e carbacol podem ativar canais iônicos inespecíficos e
26
operados por receptor em alguns músculos lisos, aumentando diretamente o influxo de Ca2+ (Bolton,
1979; Benham e Tsien, 1987; Ganitkevich e Isenberg, 1990).
Pode-se obter força muscular por alteração da resposta celular ao Ca2+, como por
exemplo, na alteração da sensibilidade ao Ca2+ intracelular na modulação da fosforilação da cadeia
leve da miosina. Através de medidas da [Ca2+] intracelular simultâneas às medidas de força, muitos
pesquisadores demonstraram que a sensibilidade ao Ca2+ depende do estímulo (Morgan e Morgan,
1984; Bruschi et al., 1988; Karaki et al, 1988). A ativação da proteína quinase C (PKC) produz
contração sustentada e de desenvolvimento lento no músculo liso arterial, o que demonstra que esta
proteína pode estar envolvida na regulação da contratilidade do músculo liso ou em alguma outra
resposta celular como a modulação por feedback do metabolismo de fosfatidilinositídeos. Os
estímulos produzidos por angiotensina II, norepinefrina e endotelina causam aumento no conteúdo de
diacilglicerol (DAG), um ativador lipídico e endógeno da PKC (Lee e Severson, 1994). Contrações
sustentadas em músculo liso arterial e traqueal são caracterizadas por altos níveis de ativação de
pontes cruzadas com baixos níveis de Ca2+ intracelular, baixos níveis de fosforilação da cadeia leve de
miosina e baixas velocidades de encurtamento (Singer, 1996). Este exemplo serve para demonstrar
que a sensibilidade dos elementos contráteis ao Ca2+ é fator importante no processo contrátil.
Os ésteres de forbol, ativadores de proteína quinase C contraem o músculo liso e
aumentam a sensibilidade ao Ca2+ intracelular tanto em relação ao desenvolvimento de força como em
relação a fosforilação da miosina (Chatterjee e Tejada, 1986; Rembold e Murphy, 1988a; Nishimura et
al., 1990). Entretanto, a compreensão da real participação da PKC torna-se de maior complexidade
visto que já foram identificados mais de uma dezena de isoenzimas com diferentes genes relacionados
e classificadas de acordo com suas estruturas e seus domínios regulatórios e catalíticos. A maior
parte delas apresenta um domínio regulatório denominado C1 onde está localizado o sítio de ligação
para o DAG e também para os ésteres do forbol. Dentre estas, algumas são dependentes de Ca2+ e
outras não (Singer, 1996). Há relatos de que as contrações induzidas por K+ hiperosmolar em aorta
27
de rato e cobaio foram independentes de Ca2+ e mediadas parcialmente pela ativação de proteína
quinase C (Low et al., 1994).
A fosforilação da tirosina também pode ser importante na regulação da sensibilidade ao
Ca2+ intracelular, visto que algumas substâncias inibidoras de tirosina quinase (geldanomocina,
tirfostina e genisteina) diminuíram respostas contráteis induzidas por agonistas em músculo liso intacto
e em preparações desnudadas de músculo liso longitudinal de íleo de cobaio (Di Salvo et al., 1993). A
tirfostina, por outro lado não teve efeito em contrações induzidas por altas concentrações de K+ em
vasos intactos (Di Salvo et al., 1993). Ausina et al. (1996) descreveram que a adição hiperosmolar de
K+ em útero de rata produz contrações que são pouco influenciadas pela alteração de volume celular
devido ao estresse osmótico, são independentes de Ca2+ intra ou extracelular e de despolarização da
membrana, e que não parecem ser mediadas pela ativação de PKC, quinases dependentes de
Ca2+/calmodulina ou tirosina quinases. Entretanto, envolvem a participação de alguma quinase
sensível a estaurosporina.
Independentemente de os mecanismos iniciadores da contração serem relacionados às
alterações do Em, à ativação de canais operados por receptor, ao deslocamento de Ca2+ de estoques
intracelulares ou a uma combinação destes fatores, dentre outros, podemos considerar que as bases
bioquímicas e estruturais da contração muscular lisa apresentam uma grande similaridade com os
mecanismos conhecidos para a célula muscular estriada. Existem estruturas no músculo liso, os
corpos densos que são análogos das linhas Z nos músculos estriados e ambos são constituídos de α-
actinina e servem de pontos de ligação para os filamentos de actina (Somlyo e Somlyo, 1994). A
miosina nos dois tipos de células musculares é hexamérica formada por duas cadeias pesadas e
quatro cadeias leves (MLC20 e LC17, duas de cada). A atividade ATPasica é específica e
espacialmente localizada sendo desencadeada pela fosforilação da MLC20 no aminoácido Ser19 pela
MLCK dependente de Ca2+-calmodulina. É geralmente aceito que este é o mecanismo primário para
iniciar a contração no músculo liso (Sobieszek, 1977; de Lanerolle e Paul, 1991; Stull et al., 1991). O
Ca2+ é um segundo mensageiro chave envolvido em muitos processos de sinalização celular. No
28
músculo liso, a sua complexação com a calmodulina permite a sua interação com a MLC20 resultando
em sua isomerização a uma forma ativa (Stull et al., 1996).
A curva comprimento-tensão, a relação força-velocidade, a bioquímica e as alterações
mecânicas do músculo liso são consistentes com a teoria dos filamentos deslizantes da contração na
qual o ciclo das pontes cruzadas gera força e encurtamento (Arner et al., 1987; Fuglsang et al., 1993).
A ativação das pontes cruzadas se dá por ligação de alta afinidade da miosina à actina na ausência do
nucleotídeo, que se separam após a ligação do ATP e sua posterior hidrólise, seguida pela liberação
de Pi e transição para estados geradores de força terminados pela liberação de ADP, ligação de ATP e
repetição do ciclo (Somlyo e Somlyo, 1994).
Estabelecida uma contração, o relaxamento das células musculares lisas pode acontecer
por vários tipos de processos que, na maior parte dos casos, passa por redução da [Ca2+] no interior
da célula. Substâncias como o fator relaxante derivado do endotélio (FRDE, óxido nítrico) e fator
natriurético atrial aumentam GMPc e relaxam o músculo liso vascular por atenuação do aumento da
[Ca2+] intracelular em células isoladas e tecidos intactos (Rapoport et al., 1985; Karaki et al, 1988;
Word et al., 1991; Mc Daniel et al., 1992). A redução na [Ca2+] citoplasmática mediada pelo GMPc
pode ser produzida por alguns mecanismos como: abertura de canais de K+ que produzirá
hiperpolarização da célula e posterior diminuição do influxo de Ca2+ pelos canais L (Thornbury et al.,
1991,; Robertson et al., 1993); diminuição direta do influxo de Ca2+ através de canais do tipo L de
forma independente das alterações do Em como os efeitos do 8-bromo-GMPc em células musculares
vasculares como avaliado através da técnica de patch-clamp (Ishikawa et al., 1993); ativação da
bomba Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático e da membrana plasmática, dependentes de GMPc
com conseqüente diminuição do Ca2+ livre no citoplasma (Popescu et al., 1985; Twort e van Breemen,
1988); aumento da atividade trocadora Na+/Ca2+ como evidenciado em aorta de rato isolada (Itoh et
al., 1983).
Também pode ocorrer relaxamento muscular liso por hiperpolarização celular devida a
aumento da probabilidade de abertura de canais KCa e KATP mediada por aumento da [AMPc] (Anwer
29
et al., 1992; Quayle et al., 1994). A estimulação β-adrenérgica em miométrio de rata e o efeito do
peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (PRGC) em artérias mesentéricas de coelho demonstram
haver abertura de canais de K+ ativados por Ca2+ e por ATP, respectivamente. Entretanto, assim
como o GMPc, o AMPc também pode ser considerado capaz de diminuir a [Ca2+] intracelular por
diminuição do influxo de Ca2+ tanto por alteração do potencial transmembrana como por apresentar
efeitos diretos sobre os canais de Ca2+ do tipo L (Rembold, 1996). O mecanismo primário para a
diminuição da [Ca2+] intracelular provocada pela elevação do AMPc é a ativação da proteína quinase G
(GMPc-dependente) (Lincoln et al., 1990). Estímulos fisiológicos que aumentam AMPc incluem
agonistas que ativam receptores adrenégicos β2, purinérgicos P1 ou receptores PRGC. Outra ação do
AMPc pode ser a diminuição da sensibilidade ao Ca2+ intracelular. A ativação de proteínas quinases
dependentes de AMPc produz fosforilação da quinase de cadeia leve da miosina em determinados
sítios in vitro e isso pode diminuir sua sensibilidade ao Ca2+. O forskolin, um ativador específico da
adenililciclase, induziu relaxamento da carótida de suínos por diminuir a [Ca2+] intracelular sem alterar
a fosforilação da quinase de cadeia leve da miosina (McDaniel et al., 1991). Este mesmo efeito foi
visto no relaxamento da traquéia de bovino produzido pelo isoproterenol (Stull et al., 1990).
Especialmente em músculo liso vascular, o relaxamento produzido por algumas
substâncias como ADP/ATP, adenosina, histamina, trombina e acetilcolina são mediadas pelo
endotélio vascular através da liberação de NO ou do chamado fator hiperpolarizante derivado do
endotélio (FHDE, o qual pode ser um produto do citocromo P450) (Rapoport et al., 1984; Feletou e
Vanhoutte, 1988; Brayden, 1991; Arnal et al., 1999). Em 1980, Furchgott e Zawadzki foram os
primeiros a demonstrar que o relaxamento das células musculares lisas de vasos era dependente da
integridade anatômica do endotélio em resposta a acetilcolina. O endotélio também é o responsável
pela produção de outros vasodilatadores como a prostaciclina (PGI2) a qual relaxa o músculo liso
vascular pela ativação da adenilato ciclase e formação de AMPc (Arnal et al., 1999). Como um efeito
paradoxal e, em determinadas circunstâncias como anóxia e hipertensão, o endotélio também pode
ser o responsável pela liberação de substâncias vasoconstritoras como a PGH2, ânion superóxido (O2-)
30
e endotelina (Lüscher et al., 1993). Além de funções vasomotoras o endotélio também participa de
outros processos fisiológicos muito importantes pela liberação de NO e PGs como no controle da
agregação plaquetária (Radomski et al., 1991).
Como vimos anteriormente, a fosforilação da MLC20 pode ser considerada como iniciador
do processo contrátil. Existe uma aceitação geral também de que o relaxamento do músculo liso
contraído está associado com a desfosforilação da MLC20 (Stull et al., 1991; Somlyo e Somlyo, 1994 e
2000), onde a atividade da miosina fosfatase é necessária para reverter a ativação da miosina pela
fosforilação da sua cadeia leve regulatória. A medida que há diminuição na [Ca2+] intracelular, ocorre
inativação da MLCK dependente de Ca2+, desviando o balanço de atividade quinase para fosfatase, o
que resultará em desfosforilação da cadeia leve da miosina e relaxamento muscular (Word e Kamm,
1997). As fosfatases de serina e treonina são classificadas em quatro categorias gerais (tipos 1, 2A,
2B e 2C) de acordo com ativadores e inibidores específicos. A responsável pela desfosforilação da
miosina no músculo liso é a proteína fosfatase do tipo 1 (PP1), e a subunidade catalítica desta enzima
também está associada com o aparelho contrátil em músculo esquelético e cardíaco (Word e Kamm,
1997). Entretanto, em preparações de útero desnudado de rata contraído com solução fisiológica
saturada com Ca2+ e calmodulina, houve relaxamento relacionado a uma significativa, mas não
completa, desfosforilação da MLC20, pela adição à solução fisiológica da subunidade catalítica de uma
fosfatase do tipo 2 (Haeberly et al., 1985).
A dependência direta entre a força e a quantidade de miosina fosforilada não descreve
adequadamente todos os processos fisiológicos e celulares envolvidos na contração do músculo liso, e
este é um dos aspectos da fisiologia muscular que ainda encontra-se no início de sua compreensão.
Os baixos níveis de fosforilação da MLC20 estão associados com um forte aspecto do funcionamento
do músculo liso que é a sua capacidade de desenvolver força a um baixo consumo de energia (ATP)
(Siegman et al., 1980; Rembold e Murphy, 1993). Ainda não se conhece o mecanismo responsável
para este estado, num misto de alta força, baixa fosforilação e baixo consumo de energia, chamado de
“latch state”, mas acredita-se que envolva um aumento na proporção das pontes cruzadas
31
ativadas/desativadas, ou mesmo uma separação temporal entre a velocidade de desfosforilação e a
velocidade de desacoplamento entre actina e miosina ou mesmo uma lentificação da liberação de ADP
pelas pontes cruzadas, mantendo desta forma a força por mais tempo (Khromov et al., 1995). Pode
haver também um estado de cooperatividade onde pontes cruzadas fosforiladas promovem a ativação
de outras pontes não fosforiladas (Vyas et al., 1992). Relaxamento muscular liso sem desfoforilação
da MLC20 pode ser iniciado quando o músculo é contraído com agonistas e relaxado com agentes
ainda na presença de agonistas (por exemplo: histamina ou norepinefrina + papaverina em músculo
arterial de suíno).
Em resumo, o músculo liso envolve uma diversidade de mecanismos para a regulação de
sua contração ou seu relaxamento. Estes mecanismos incluem muitas formas da própria regulação do
Ca2+ intracelular bem como alguns aspectos das respostas celulares às alterações da [Ca2+]
citoplasmática. Como pontos principais dos processos celulares temos a ativação da quinase de
cadeia leve da miosina que leva a fosforilação da cadeia leve da miosina na posição da serina 19.
Esta fosforilação está associada com a atividade lítica de ATP da miosina ativada pela actina. Em
estímulos fisiológicos o desenvolvimento de força depende do aumento da quantidade de miosina
fosforilada, mas existem exemplos de eventos que não associam força e fosforilação da miosina. Isto
sugere que outros mecanismos regulatórios também podem modular a força contrátil em alguns
músculos. Teleologicamente, essa diversidade de mecanismos pode permitir ao músculo liso a
manutenção de suas funções normais como uma compensação de alguma deficiência genética, algum
estado patofisiológico ou terapia farmacológica.
O músculo liso das vias aéreas e sua interação com reações antigênicas
Já está bem estabelecido que a asma envolve uma fase inicialmente broncoconstritora e
uma fase tardia inflamatória (Barnes, 1989). Nesta, uma das características é a hipersensibilidade das
vias aéreas a vários estímulos físicos químicos e farmacológicos (Boushey et al., 1980; O’Byrne e
Manning, 1992). Vários componentes da árvore respiratória podem contribuir para a
hiperresponsividade das vias aéreas como a musculatura lisa, o epitélio brônquico, mecanismos
32
neuro-humorais e as ligações mecânicas entre o parênquima pulmonar e as vias aéreas (Ingram,
1991). A resposta anormal da musculatura lisa das vias aéreas tem sido sugerida para definir a
hiperrreatividade brônquica e tem sido objeto de várias investigações, embora também sejam
importantes as participações de eventos como a regulação da secreção de muco, a tosse e o tônus
vasomotor (Cockroft et al., 1977; Boushey et al., 1980).
A histamina tem um papel fisiológico importante. Esta substância é um dos mediadores
produzidos e estocados nos mastócitos e sua liberação se dá pela interação do antígeno com
anticorpos IgE na superfície dos mastócitos, desempenhando um papel fundamental nas reações de
hipersensibilidade imediata e nas respostas alérgicas. A liberação de histamina pode produzir efeitos
locais ou gerais principalmente na musculatura lisa através de sua ligação com receptores H1, cuja
ativação, por exemplo, provoca broncoconstrição (Ash e Schild, 1966). Apesar de os mastócitos
serem de provável importância em respostas broncoconstritoras agudas a alérgenos, seu papel na
asma crônica, particularmente nas respostas tardias a não está totalmente compreendido (Oates e
Wood, 1989). Isto tem importantes consequências terapêuticas visto que agonistas β e drogas que
estabilizam mastócitos (tipo oxatomida e loperamida), as quais previnem a liberação de mediadores
dos mastócitos são efetivas em prevenir a resposta broncoconstritora a alérgenos, como esperado,
mas não são efetivos em prevenir a hiperrreatividade brônquica subsequente. Por outro lado, os
corticosteróides os quais não são efetivos em prevenir a liberação de mediadores dos mastócitos,
inibem efetivamente a resposta tardia e previnem ou reduzem a hiperreatividade brônquica (Schleimer
et al., 1983; Cockroft e Murdock, 1987).
A liberação de histamina durante a reação anafilática já tem sido demonstrada em várias
espécies e tecidos mas, já há muito tempo, sabe-se que ela não é responsável sozinha por todos os
efeitos na musculatura lisa observados após a apresentação do estímulo desencadeador da reação de
hipersensibilidade (Brocklehurst, 1960). Em meados do século passado, foi sugerida a importância da
Substância Anafilática de Reação Lenta (SRS-A), nos eventos que ocorrem após estímulo imunológico
dos pulmões (Kellaway e Trethewil, 1940). A SRS-A foi caracterizada como um potente constritor da
33
musculatura lisa das vias aéreas com uma maior duração de ação que a histamina, sabendo-se
atualmente tratar-se este efeito da produção de leucotrienos, principalmente LTC4, LTD4 e LTE4 (Lewis
e Austen, 1984), liberados por algumas células presentes nas vias aéreas, incluindo mastócitos, que
estão envolvidas com a reação com o alérgeno (Dahlen et al., 1980 e 1983).
Produtos da ciclooxigenase também estão relacionados com os fenômenos da resposta
asmática imediata (Fish et al., 1981) e tardia (Fairfax, 1983). Os candidatos mais prováveis são as
prostaglandinas estimulatórias PGD2, PGF2α e o TxA2. A PGD2 contrai as vias aéreas produzindo
broncoconstrição diretamente por estimulação de receptores específicos e indiretamente por meio de
ação pré-sináptica com liberação de acetilcolina de nervos colinérgicos das vias aéreas (Tamaoki et
al., 1987). Assim como a PGD2 a PGF2α também é importante na indução da broncoconstrição e
hiperresponsividade das vias aéreas após inalação de alérgenos a organismos sensibilizados (O’Byrne
e Manning, 1992). O TxA2, um potente constritor da musculatura lisa, também tem sido implicado na
hipersensibilidade asmática em cães (Aizawa et al., 1985; Kleeberger et al., 1987) e em humanos
(Shephard et al., 1985).
Interações entre Sistema Imunológico e Sistema Nervoso Autônomo
Podemos exemplificar alguns eventos que ilustram a complexa relação entre sistema
imunológico e sistema nervoso autônomo. Nas vias aéreas, de uma maneira geral, há uma
concordância de que a inervação para a musculatura, vasos sanguíneos e glândulas é dupla: uma
excitatória e uma inibitória. A estimulação vagal contrai as vias aéreas, aumenta a secreção glandular
e dilata os vasos pulmonares (Hahn et al., 1978). Estes efeitos são bloqueados pela atropina
sugerindo que são mediados pela ativação dos receptores muscarínicos para a acetilcolina
(Widdicombe, 1963). Em animais, a estimulação simpática produz, ao contrário da parassimpática,
relaxamento da musculatura das vias aéreas, contrai os vasos sanguíneos e inibe as secreções
glandulares (Cabezas et al., 1971; Kadowitz et al., 1976).
34
Além dos eventos mecânicos e celulares que são importantes nas alterações do
funcionamento do músculo liso respiratório, também temos a participação de eventos mediados por
neurônios localizados na árvore respiratória ou distantes dela. Em camundongos, a exposição ao
alérgeno associada ao desenvolvimento de uma resposta mediada por IgE pode levar a uma alteração
do controle neural das vias aéreas com liberação aumentada de ACh de terminais neurais (Larsen et
al., 1994). Efeito semelhante foi registrado em cobaios, onde este aumento da neurotransmissão
colinérgica talvez seja mediado por uma down-regulation dos receptores muscarínicos pré-juncionais
inibitórios (Elbon et al., 1995). A liberação local de taquicininas por fibras C sensoriais também pode
ser importante na patofisiologia da inflamação brônquica e na hiperresponsividade relacionada com a
asma (Frossard e Advenier, 1991). Por outro lado, Greene et al (1988) demonstraram que a
estimulação imunológica in vitro dos mastócitos pulmonares produz secreção de fatores que excitam
neurônios sensoriais vagais. Entretanto, estes fenômenos não são exclusivos do músculo respiratório.
Nos dias atuais, portanto, é possível a compreensão das interações entre o sistema
imunológico e sistema nervoso e muitos estudos comprovaram que o sistema nervoso pode influenciar
o sistema imune, assim como o contrário também é provável acontecer (Livnat et al., 1987). O sistema
nervoso autônomo, em particular, deve exercer algum controle fisiológico sobre processos
imunológicos visto que fibras nervosas autonômicas contendo catecolaminas estão presentes em
áreas próximas a tecidos linfóides e linfócitos expressam receptores para neurotransmissores e
peptídeos neuromoduladores que são liberados por estes nervos (Williams et al., 1981; Livnat et al.,
1985).
Existem interações parácrinas entre mastócitos e o plexo submucoso que constituem
fatores das reações de hipersensibilidade do tipo 1 associadas com modelos de sensibilização a
antígenos específicos (Frieling et al., 1994a e 1994b). O comportamento do intestino imunizado
quando estimulado com o antígeno sensibilizante é influenciado pela maior atividade de neurônios
submucosos secretomotores do sistema nervoso entérico (Perdue e Gall, 1986; Wang et al., 1991). A
estimulação antigênica envolve secreção mucosa aumentada e incremento nos movimentos
35
propulsivos que são dependentes das funções integrativas do sistema nervoso entérico. Portanto, a
sinalização entre os mastócitos da mucosa intestinal e os neurônios entéricos está envolvida nas
respostas anafiláticas ao antígeno sensibilizante e a histamina é um dos prováveis sinais desta
comunicação (Frieling et al., 1994b). Entretanto, ainda são poucos os estudos a respeito do
funcionamento dos microcircuitos integrados em intestino sensibilizado durante a nova exposição ao
antígeno sensibilizante e é pequeno o nosso conhecimento sobre os efeitos neurofisiológicos da
ativação de mastócitos em diferentes tecidos.
Os gânglios autonômicos são de particular interesse pois apresentam uma população
considerável de mastócitos (Torp, 1961; Weinreich, 1985) e porque estão envolvidos na regulação do
tônus autonômico para a periferia (Weinreich, 1985). O gânglio nodoso, por exemplo, que apresenta
aproximadamente 95% de suas células classificadas como do tipo C e inerva regiões como o esôfago,
traquéia, brônquios e outras estruturas viscerais torácicas e abdominais, tem sua excitabilidade
alterada, em geral por despolarizações subliminares da membrana e por modulação da sua
intensidade de descargas, em resposta à presença de muitos autacóides como serotonina, histamina,
alguns prostanóides, leucotrienos e bradicinina (Undem et al., 1993; Undem e Weinreich, 1993; Leal-
Cardoso et al., 1993). A estimulação antigênica e a liberação de mediadores específicos durante a
reação de hipersensibilidade imediata nos pulmões estimulam a formação de impulsos em fibras
aferentes vagais em suas proximidades, enquanto que a destruição de fibras C pela capsaicina diminui
a resposta pulmonar induzida pelo antígeno (Coleridge et al., 1989; Matsuse et al., 1991). Está bem
documentado por Albuquerque et al. (1996) que o gânglio cervical superior, que também participa na
fase tardia da inflamação pulmonar subsequente à indução de uma reação anafilática, apresentou uma
potenciação sustentada, de longa duração (A-LTP, do inglês antigen-induced long term potentiation),
do potencial de ação composto e um aumento efetivo na liberação de histamina após a apresentação
do antígeno e, que as células imunes e os mediadores responsáveis pela A-LTP estão presentes no
próprio gânglio simpático.
36
Entretanto, relativamente pouca atenção tem sido dada a possíveis interações entre
mastócitos, antígenos e autacóides com outros gânglios autonômicos como os pré-vertebrais, embora
eles apresentem vantagens em seu estudo pela existência de arcos reflexos periféricos, riqueza de
tipos de potenciais sinápticos e dos tipos de neurônios (Leal-Cardoso, 1993). Os gânglios pré-
vertebrais abdominais como os gânglios celíaco direito e esquerdo, o mesentérico superior e o
mesentérico inferior são estruturas que desempenham importantes funções fisiológicas visto que é
através deles que o trato gastrintestinal recebe sua inervação simpática inibitória. O plexo celíaco
(gânglio celíaco direito e esquerdo e gânglio mesentérico superior) inerva grande parte do sistema
gastrintestinal e dá origem a um grande número de troncos nervosos que o ligam à maior parte dos
órgãos abdominais (Kreulen e Szurszewski, 1979a). Além da clássica descrição de vias aferentes e
eferentes que comunicam os neurônios centrais e periféricos, o plexo celíaco também está envolvido
com reflexos locais independentes da participação do sistema nervoso central. Em 1941, Kuntz e van
Buskirk demonstraram respostas inibitórias no sistema biliar e no segmento proximal do intestino que
envolviam indubitavelmente vias reflexas mediadas pelo plexo celíaco. A existência de reflexos
mediados por gânglios simpáticos pré-vertebrais foi confirmada por outros autores (Harris, 1943;
Semba, 1954), inclusive com a demonstração in vitro entre dois segmentos de cólon conectados
apenas por vias nervosas do gânglio celíaco e mesentérico inferior (Crowcroft et al., 1971; Kreulen e
Szurszewski, 1979b). Em 1993, o trabalho de Mazet et al nos mostra que a distensão gástrica inibe a
motilidade duodenal via reflexo nervoso, mediado pelo plexo celíaco, e que estes eventos não
dependem de mecanismos nicotínicos e ativação de canais de Na+ ou de Ca2+.
Leal-Cardoso (1993) descreveu que a apresentação do antígeno produziu desgranulação
de mastócitos, liberação significativa de histamina, maior formação de produtos da ciclooxigenase
(como PGD2 e TXB2) em gânglio celíaco e mesentérico inferior de cobaio ativa e previamente
sensibilizados ao antígeno. As propriedades elétricas dos neurônios também foram alteradas pela
apresentação ao antígeno, o que levou a uma despolarização, aumento da resistência de entrada da
membrana, aumento do número de potenciais de ação num pulso de corrente supraliminar, indução de
37
automatismo, bloqueio da pós-hiperpolarização lenta e uma corrente similar à corrente M de K+. As
respostas da apresentação do antígeno em relação ao potencial transmembrana e resistência de
entrada foram correlacionadas positivamente às ações da histamina adicionada exogenamente. Estes
dados demonstram a utilidade destas gânglios como modelo para o estudo das interações entre os
sistemas nervoso autônomo e imunológico.
Estudos relacionados às ações da histamina no sistema nervoso
O interesse pelo estudo das ações da histamina é proveniente das descobertas ocorridas
na primeira metade do século XX com os estudos sobre reações anafiláticas, a comprovação da
presença de histamina em muitos tecidos e a demonstração de que ela é uma das substâncias
liberadas pelos mastócitos em reações antígeno anticorpo. No sistema nervoso central de mamíferos
apresenta distribuição variada e existem fortes evidências de que ela possa ter um papel como um
neurotransmissor ou um neuromodulador (Adam e Hye, 1966; Hill, 1990). Os receptores para
histamina são divididos em três subtipos principais denominados H1, H2 e H3, baseados em estudos
quantitativos in vitro em tecidos periféricos e centrais. Em 1966, Ash e Schild introduziram o termo H1
para definir a classe de receptores histaminérgicos que foram sensíveis à inibição por baixas
concentrações de antihistamínicos clássicos como a prometazina e mepiramina. Estes receptores
estão classicamente relacionados com as contrações de muitos músculos lisos viscerais como a
traquéia, útero e íleo de cobaio. Os receptores H2, que participam da estimulação da secreção ácida
no estômago entre outros efeitos, foram identificados com o desenvolvimento da burimamida (Black et
al., 1972). A existência do receptor H3 foi sugerida em 1983 na tentativa de entender os efeitos da
histamina em regular sua própria liberação em fatias de cérebro de rato (Arrang et al., 1983).
No sistema nervoso autônomo, a histamina desempenha um papel muito relevante nas
alterações elétricas e funcionais promovidas por reações antígeno-anticorpo. Desde 1943, com o
trabalho de Kwiatkowsky sabemos da existência de histamina no sistema nervoso autônomo periférico
de mamíferos, sendo os mastócitos o seu principal local de armazenamento nos gânglios autonômicos
38
(Weinreich, 1985). Ela é o mediador inflamatório prototípico liberado de mastócitos nas proximidades
das terminações sensoriais periféricas, podendo inclusive estimular neurônios vagais do tipo C
(Coleridge e Coleridge, 1977; Wasserman, 1994). Nos gânglios simpáticos, alguns dos seus efeitos
parecem ser mediados por receptores H1 e H2 que, pelo menos em gânglio cervical superior de coelho,
são os responsáveis pela facilitação da transmissão sináptica e pela depressão ganglionar,
respectivamente (Brimble e Wallis, 1973). No rato, agonistas de receptor H1 foram ineficazes
enquanto que os de agonistas do receptor H2 produziram inibição da transmissão ganglionar, através
da diminuição dose-dependente da amplitude do potencial de ação composto pré- e pós-sináptico
(Lindl, 1983; Snow e Weinreich, 1987). Em 1989, Christian et al relataram que em gânglio cervical
superior de cobaio (assim como em gânglio celíaco e mesentérico inferior, vide acima), os efeitos da
aplicação exógena de histamina apresentaram correlação positiva com os da estimulação com o
antígeno e que ambos foram inibidos por antagonistas de receptor H1, não sendo alterados por
antagonistas de receptor H2 ou H3.
Os mecanismos de transdução do sinal através da ativação dos receptores
histaminérgicos em neurônios ainda são pouco compreendidos mas incluem alterações em correntes
iônicas como as correntes de K+. Em neurônios aferentes vagais do furão, pequeno mamífero
carnívoro da família dos mustelídeos, a despolarização e o conseqüente aumento da excitabilidade
produzido pela histamina foi provocado pela interferência nas correntes de K+ denominadas IK(rest),
ativa em condições de repouso, e a IAHP, corrente hiperpolarizante de K+ pós-potencial de ação,
podendo existir no mesmo neurônio e envolver a ativação do mesmo receptor H1 (Jafri et al., 1997).
Em neurônios entéricos tipo AHP (do inglês after hyperpolarization, assim classificado por apresentar
uma pós-hiperpolarização) de cobaio, a histamina produz efeitos estimulatórios que mimetizam
potenciais pós-sinápticos excitatórios lentos (Nemeth et al., 1984; Frieling et al., 1993). Diversos
autores relatam que a histamina produz despolarização, aumento da resistência de entrada da
membrana e diminuição da duração da pós-hiperpolarização lenta de neurônios AHP e que essas
alterações refletiriam as conseqüentes alterações da excitabilidade encontradas em muitos tecidos
39
(Nemeth et al., 1984; Christian et al., 1989; Weinreich et al., 1992; Hemming et al., 2000).
Aparentemente, a transdução de sinais sinápticos lentos envolve a ativação da adenilato ciclase e
produção de AMPc como segundo mensageiro (Palmer et al., 1986 e 1987). Recentemente, Starodub
e Wood (2000) descreveram a participação diferencial dos receptores H2 na produção de potenciais de
ação repetitivos que ocorre na estimulação induzida pela histamina em neurônios mioentéricos de
cobaio.
40
OBJETIVOS
Caracterizar os efeitos farmacológicos do OECN sobre o músculo liso respiratório e vascular
Muitas espécies de plantas produtoras de óleos essenciais, que são encontradas na
região Nordeste do Brasil são largamente utilizadas na medicina popular seja por tradição ou seja pelo
alto preço dos medicamentos cobrados pelas indústrias farmacêuticas. Atualmente, estas mesmas
indústrias têm demonstrado renovado interesse na investigação de plantas como fontes para novas
estruturas e para o desenvolvimento de agentes fitoterápicos de eficácia comprovada, segurança e
qualidade. Este interesse é justificado de certa forma pela existência de leis que regulamentam as
patentes para produtos de origem vegetal que já vêm sendo usado tradicionalmente. Muitas indústrias
farmacêuticas já assinaram acordos de cooperação com pessoas físicas ou órgãos públicos para a
investigação de plantas medicinais menos conhecidas em alguns países entre eles Brasil, Costa Rica,
China, México e até mesmo Samoa (Robbers et al., 1997). Além disso, segundo a OMS (Organização
Mundial da Saúde) aproximadamente 65 a 80% da população mundial depende essencialmente de
plantas como forma de tratamento primário de saúde (Calixto, 2000). E, para a grande maioria destas
plantas, ainda não existem dados farmacológicos que confirmem cientificamente a sua utilidade
terapêutica e muito menos a identificação dos seus possíveis efeitos tóxicos ou indesejáveis.
Como mencionamos anteriormente, em experimentos realizados no Laboratório de
Eletrofisiologia, o óleo essencial do Croton nepetaefolius apresentou efeitos farmacologicamente
interessantes. Ele se mostrou capaz de relaxar o músculo liso intestinal e vascular e também de
diminuir a pressão arterial sendo que foi mais potente em reduzir a pressão arterial dos ratos
hipertensos do que dos ratos normotensos. Sendo o músculo liso respiratório uma estrutura
importante na fisiopatologia das doenças respiratórias como a asma, torna-se de grande necessidade
a descoberta de novas substâncias ativas e mais seletivas neste músculo para uma possível utilização
como fármacos. Pelos nossos dados preliminares o OECN é capaz de produzir relaxamento do
músculo liso traqueal o que lhe dá uma potencialidade de exploração farmacológica significativa.
Esses fatos mostram a importância do estudo das ações do OECN sobre o músculo liso das vias
41
aéreas. Por outro lado, muitas revistas científicas importantes têm dedicado mais espaço para
publicações básicas e clínicas para estudos com medicamentos obtidos de plantas.
Avaliar a ação do óleo essencial do Croton nepetaefolius sobre o funcionamento de neurônios de
gânglios autonômicos
Na literatura é muito difícil encontrar estudos relacionados à ação de óleos essenciais
sobre o sistema nervoso, a não ser através de técnicas que visam avaliar parâmetros como
comportamento, analgesia e/ou inflamação que compreendam mecanismos neurais. Além do mais,
quase não existem relatos dos efeitos de óleos essenciais com experimentos que utilizam o registro
intracelular da atividade de neurônios. Para este propósito, este estudo também contribui para um
melhor entendimento do funcionamento do gânglio celíaco frente à histamina e uma possível
participação sua em eventos de cunho imunológico.
42
METODOLOGIA
Animais e tecidos
Neste estudo foram usados ratos (Ratus norvegicus) Wistar, adultos, machos,
(200–350 g), provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará. Utilizaram-se também cobaios (Cavia porcellus) adultos,
machos (400-600g), provenientes do Biotério do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Estado do
Ceará (HEMOCE). Os animais foram sacrificados por concussão cerebral ou deslocamento cervical.
Vasos sangüíneos
Segmentos de aorta foram retirados, após a abertura da caixa torácica, através de
uma incisão paralela ao esterno, rompendo-se as estruturas costais, permitindo a visualização de
todos os órgãos intratorácicos. Continuando-se a incisão a partir do apêndice xifóide até a região
inguinal, nos cobaios, foi possível a retirada de segmentos de vasos mesentéricos nas proximidades
das alças intestinais delgadas. No caso dos ratos, foi feita a identificação e a canulação da artéria
mesentérica, a partir da qual se fez a dissecação do leito vascular mesentérico.
A aorta e os vasos mesentéricos, após remoção, foram rapidamente colocados em
uma placa de Petri contendo solução nutridora de Tyrode modificada (nas [K+] e [Ca2+] – valores
originais 2,68 e 1,8 mM, respectivamente), para a retirada dos tecidos adjacentes e, no caso da aorta,
a remoção cuidadosa do sangue presente no interior de sua luz através da utilização de pinças para
cirurgia oftálmica. A solução fisiológica de Tyrode modificada tinha a seguinte composição expressa
em mM: NaCl 136,0, KCl 5,0, MgCl2 0,98, CaCl2 2,0, NaH2PO4 0,36, NaHCO3 11,9 e glicose 5,5.
A fixação da aorta foi feita após o corte transversal do tecido em pequenos anéis,
através de peças triangulares manufaturados com fios de aço inoxidável para cirurgia óssea. As
preparações foram colocadas em câmaras para órgão isolado contendo 10 ml de solução fisiológica
aquecida a 37ºC, pH 7,4 e oxigenadas por borbulhamento de ar. Os tecidos foram atados a um ponto
43
fixo, na câmara, e a uma unidade transdutora de força (Grass, modelo FT03, Quincy, Mass., EUA)
apropriada para registro isométrico das contrações, conectada a um polígrafo (Grass, modelo 5D). Os
sinais gerados pelo transdutor de força também foram condicionados e registrados em um sistema de
aquisição computadorizado (DATAQ, EUA, vide esquema simplificado na figura 2). A tensão de
repouso aplicada à preparação foi de 1 g e o tempo de equilíbrio com as condições artificiais do banho
foi de 1 h. A retirada do endotélio foi feita através de raspagem leve da superfície luminal dos
segmentos vasculares com pequenos pedaços de metal e foi confirmada pelo não relaxamento das
contrações de potássio ou norepinefrina na presença de acetilcolina, conforme descrito por Furchgott e
Zawadski (1980).
Para os registros elétricos intracelulares, a aorta e os vasos mesentéricos de
cobaio foram montados abertos (através de cortes longitudinais nos segmentos retirados), com a sua
face serosa voltada para cima, por onde foi feita a introdução do microeletrodo. A fixação do tecido foi
realizada com a utilização de microalfinetes inoxidáveis em câmaras horizontais de acrílico
preenchidas com polímero Silgard™. Todas as preparações usadas para os registros
eletrofisiológicos foram continuamente superperfundidas com solução fisiológica sob um fluxo de
aproximandamente 1 ml/min.
Os experimentos com o leito vascular mesentérico de ratos foram executados
através da perfusão de solução fisiológica (Tyrode modificado, pH 7,4 mantida a 37ºC) a partir da
artéria mesentérica. O tecido foi mantido a uma pressão hidrostática constante sob uma coluna líquida
de 53cm de H2O. As alterações da contratilidade vascular foram avaliadas de forma indireta pela
quantificação do fluxo de líquido através do leito vascular. Demais detalhes dos procedimentos
experimentais constam mais adiante na seção de resultados.
Traquéia
A montagem das preparações utilizando-se traquéia de cobaio ocorreu após a
abertura da face ventral do pescoço por uma incisão longitudinal da pele e afastamento das glândulas
parótidas e dos músculos hioideu e esterno-cleido-mastoideu. A traquéia foi retirada e transferida para
44
POSITIONFILTER
SENSITIVITYBALANCE
INPUT BRIDGE DC AMPGND
FULL SCALE
PM - 1000
ATTEN
PULLON
OUTPUT
0 X1
0
1mV
2
10
20100200
1V
2
10
1
10
50 100500
5K
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE VOLTAGE FILTERSENSITIVITY
D.C.
BAT TESTCAL
- +BRIDGE
INPUT
IN
GRASS POLIGRAPH DC DRIVER AMPLIFIER
POSITIONSENSIT
POLARITY
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE VOLTAGE FILTERSENSITIVITY
D.C.
BAT TESTCAL
- +BRIDGE
INPUT
IN
GRASS POLIGRAPH DC DRIVER AMPLIFIER
POSITIONSENSIT
POLARITY
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE V OLTAGE FILTERSENSITIVITY
D.C.
BAT TESTCAL
- +BRIDGE
INPUT
IN
GR ASS POL IGRAP H DC DRIV ER A MPLI FIE R
POSITIONSENSIT
POLARITY
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE VOLTAGEFILTERSENSITIVITY
D.C.
BAT TEST CAL- +
BRIDGE
INPUT
IN
GRASS POLIGRAPH DC DRIVER AMPLIFIER
POSITIONSENSIT
POLARITY
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE VOLTAGEFILTER
SENSITIVITY
D.C.
BAT TEST CAL- +
BRIDGE
INPUT
IN
GRASS POLIGRAPH DC DRIVER AMPLIFIER
POSITIONSENSIT
POLARITY
LOW LEVEL
PRE AMPLIFIER
BALANCE VOLTAGEFILTER
SENSITIVITY
D.C.
BAT TEST CAL- +
BRIDGE
INPUT
IN
GRASS POLIGRAPH DC DRIVER AMPLIFIER
POSITIONSENSIT
POLARITY
2
1
3
4
6 5
45
uma placa de Petri com solução fisiológica e manuseada nas mesmas condições que os tecidos
vasculares conforme descrito anteriormente. Os tecidos anexos foram eliminados e a traquéia foi
cortada transversalmente em pequenos anéis que foram atados com fios de algodão (conforme em
Castillo e De Beer, 1947) e montados em câmaras de 10 ml contendo solução de Tyrode modificada,
aerada continuamente, mantida a 37oC. A preparação foi conectada a um transdutor de força (Grass,
FT03) e a um fisiógrafo (vide seção anterior de vasos sanguíneos) para registro isométrico das
contrações. O tempo de equilíbrio da preparação com as condições do banho foi de 1 h e a tensão de
repouso foi de 1 g. Para os registros eletrofisiológicos, um ou dois anéis da traquéia foram abertos
pela sua porção cartilaginosa e fixados em câmaras com fundo de Silgard™ com a sua face luminal
voltada para cima, por onde foi feita a introdução do microeletrodo. Antes do registro dos potenciais
transmembrana foi feita uma sutil raspagem da região central do anel já fixado, com a utilização de
uma haste envolvida com algodão umedecido com solução fisiológica para a retirada do epitélio
respiratório.
Gânglio celíaco
Para a montagem das preparações de gânglio celíaco de cobaios, após o sacrifício
do animal, foi feita a abertura do abdômen através de uma incisão mediana (figura 3). O tubo
gastrintestinal foi seccionado em dois pontos para descarte: um, mais proximal, próximo ao esfíncter
gastro-esofagiano e outro, mais distal, próximo ao ceco. Com a exposição da região retroperitoneal,
constantemente umidificada com solução de Locke refrigerada (4-8°C; composição em mM: NaCl 140,
KCl 5,6, CaCl2 2,2, Trishidroximetilaminometano 10, glicose 10), os rins direito e esquerdo foram
retirados através de cortes adjacentes à sua face côncava no hilo renal. A aorta foi seccionada em um
ponto imediatamente acima do diafragma que também foi descartado e, em outro logo acima da artéria
mesentérica inferior. A região próxima à aorta entre estes dois pontos foi cuidadosamente
retirada incluindo aí parte da artéria celíaca, artéria mesentérica superior, gânglio celíaco,
gânglio mesentérico superior e glândulas supra-renais. No decorrer deste processo os nervos
46
NERVO ESPLÂNICO MAIOR
GÂNGLIO CELÍACO
ARTÉRIA MESENTÉRICASUPERIOR
ESÔFAGO
SUPRA-RENAL
RIM
TECIDO ADIPOSO
LINFONODO
RETO
BAÇO
ESTÔMAGO
PÂNCREAS
DUODENO
ÍLEO
AORTA
ARTÉRIACELÍACA
ARTÉRIAMESENTÉRICA
SUPERIOR
ARTÉRIAMESENTÉRICA
INFERIOR
GÂNGLIOMESENTÉRICOSUPERIOR
GÂNGLIOMESENTÉRICOINFERIOR
GÂNGLIOCELÍACOESQUERDO
GÂNGLIOCELÍACODIREITO
NERVOINTERMESENTÉRICO
NERVO ESPLÂNICOMAIOR ESQUERDO
NERVO ESPLÂNICOMENOR ESQUERDO
1
2
3
47
esplânicos direito e esquerdo foram identificados servindo de referencial para a dissecção do gânglio
celíaco durante a remoção da gordura e dos tecidos adjacentes. O gânglio foi utilizado em
experimentos no mesmo dia ou mantidos sob refrigeração (≈ 5ºC) por um período não superior a 24h.
A avaliação dos parâmetros elétricos demonstrou que a manutenção do tecido nestas condições não
alterou suas características elétricas ou farmacológicas.
Após o isolamento e limpeza do tecido, o gânglio foi medial e cuidadosamente
seccionado com lâmina de aço inoxidável separando-o em duas metades uma das quais utilizada para
experimento e a outra mantida refrigerada para utilização posterior. A primeira foi transferida para uma
câmara de acrílico com fundo Silgard™, especialmente desenhada para permitir a superperfusão do
tecido por meio de fluxo por gravidade, onde foi feita sua fixação no fundo da câmara com
microalfinetes inoxidáveis. A superperfusão do tecido foi realizada com solução de Locke mantida em
temperatura ambiente e oxigenada com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) em um fluxo de
aproximadamente 1 ml/min. O nível líquido acima da superfície do gânglio foi controlado na menor
altura possível para minimizar o aumento de capacitância do eletrodo originado da sua imersão no
banho. A câmara foi montada sobre um microscópio com objetiva de longa distância para visualizar
diretamente o gânglio e proceder os impalamentos. A movimentação do eletrodo para o impalamento
dos neurônios foi feita através de um micromanipulador hidráulico (Narishige, Japão). Todas as
soluções foram preparadas no dia do experimento a partir de alíquotas estoques de soluções mais
concentradas que foram conservadas em freezer. As soluções de superperfusão foram colocadas em
frascos Mariote conectados por meio de válvulas three-way que permitiam proceder-se a troca das
soluções com rapidez e sem descontinuidade de fluxo. Com este procedimento houve um retardo de
aproximadamente 15 a 20 segundos entre a abertura da válvula e o início da exposição do tecido a um
dado fármaco. Após cada troca de solução, os registros elétricos foram feitos somente após um
período mínimo de 1 minuto depois da abertura da válvula trocadora do reservatório de soluções.
48
0 1 2
3 4 5
10 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 15
0
1
ANALOG OUT
Digidata1200INTERFACE
ANALOG IN DIGITAL OUT TRIGGER IN
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
I
I
V
V
49
Medidas eletrofisiológicas
Para os registros eletrofisiológicos, foi utilizada a técnica do microeletrodo
intracelular (vide esquema simplificado na figura 4). Os potenciais transmembrana foram medidos
através de micropipetas (resistência de 70 - 120 MΩ, quando confeccionadas com vidro de
borossilicato com 1 e 0.5 mm de diâmetro externo e interno, respectivamente, ou resistência de 25 –
35 MΩ, quando confeccionadas em vidro de silicato de alumínio com 1 e 0.68 mm de diâmetro externo
e interno, respectivamente. Os microeletrodos foram preparados por um puxador de microeletrodos
resfriado com nitrogênio (Sutter Instruments, San Francisco, CA, USA). As micropipetas foram
preenchidas com uma solução de 95% de cloreto de K+ 3 M e 5% de citrato de K+ 1M, conectadas,
através de fio de prata, a um eletrômetro (Axoclamp 2B, Axon Instruments, Foster City, CA, USA). O
monitoramento do sinal foi realizado com um osciloscópio (Tektronix, modelo 5111A, Beaverton, OR,
USA). A aquisição dos registros eletrofisiológicos foi feita através de uma interface Digidata 1200
(Axon Instruments). A análise dos dados foi feita com os softwares Clampex (versão 6.0.1) e Clampfit
(versão 6.0.3, Axon Instruments, EUA). O potencial transmembrana foi considerado como a deflecção
de voltagem durante o impalamento (considerando-se a diferença do potencial zero (terra) do meio
extracelular como referencial). Do valor medido diretamente subtraiu-se o potencial de ponta do
eletrodo. Ao final de cada série de medidas foi feita a retirada proposital do eletrodo para confirmação
do valor obtido quando do impalamento. Com a estabilização da célula após o impalamento
(aproximadamente 5 minutos) o neurônio foi considerado nas estatísticas deste trabalho somente se o
potencial de repouso fosse mais negativo que –40 mV, a resistência de membrana > que 40 MΩ e o
overshoot dos potenciais de ação (acima do 0 mV) >10 mV. Caso as células não apresentassem
essas características, não foram consideradas nas estatísticas do presente trabalho. Para o
monitoramento das medidas de resistência de membrana, consideradas como a magnitude das
variações eletrotônicas de voltagem produzidas pela aplicação de pulsos de corrente hiperpolarizante
(duração de 1 segundo) de 100 pA, o sinal foi registrado ora pelo modo bridge (frequência de corte
3KHz) ora pelo modo descontínuo (discontinuos current clamping (DCC), velocidade de amostragem
50
de 1 a 1,5 KHz). A conversão dos valores de voltagem da resposta eletrotônica para unidade de
resistência (Ω) foi obtida através da lei de Ohm (V=IxR).
Imunização dos cobaios com ovalbumina
Para este estudo foram utilizados cobaios machos (400-500g) que foram
imunizados ativamente através de injeções intraperitoneais de ovalbumina (chicken egg albumin,
grade II, Sigma, EUA, 10 mg/Kg) em solução de NaCl 0,9% nos dias 1, 3 e 5. Os animais foram
sacrificados por concussão cerebral ou deslocamento cervical 21 a 50 dias após a última injeção.
Tratamento dos ratos com acetato de deoxicorticosterona (DOCA)-sal
Ratos Wistar, adultos, machos (200 – 350 g) foram mantidos em condições
constantes de temperatura (23 ± 2 ºC), com um ciclo dia/noite padrão (12 h claro / 12 h escuro), tendo
acesso à comida e água ad libitum. Os ratos foram anestesiados usando-se uma combinação de
ketamina / xylazina (na proporção de 90 / 10 mg/Kg de peso corporal, respectivamente, de acordo com
o trabalho de Flecknell, 1993), oportunidade em que foi realizado o procedimento de nefrectomia
esquerda, deixando-se intactos o rim direito e as duas supra-renais. O animal foi colocado em
decúbito dorsal e, através de uma incisão medial no abdômen, penetrando-se na cavidade peritoneal,
foi feito o deslocamento cuidadoso das alças intestinais, para a visualização do rim esquerdo. Expôs-
se o pedículo renal, isolando-se a artéria renal que foi obliterada com uma ligadura única feita com fio
resistente, envolvendo todas as estruturas do pedículo, por 3 ligações consecutivas, seccionando
distalmente à segunda ligadura. Desprezou-se o rim retirado e fechou-se a incisão por sutura
seguindo os planos anatômicos. Após um período de uma semana para recuperação da cirurgia, os
animais foram divididos em dois grupos: ratos do grupo 1 (grupo de ratos hipertensos DOCA-sal) que
foram tratados semanalmente com a aplicação subcutânea de uma suspensão de DOCA (25 mg/Kg
por 4 semanas, perfazendo um total de 100 mg/Kg durante todo o tratamento) dissolvida em óleo
comestível de girassol e com uma solução contendo 1 % de NaCl que substituiu a água ad libitum;
ratos do grupo 2 (grupo controle uninefrectomizado) aos quais foi permitido livre acesso à água e
51
também receberam injeções subcutâneas semanais de mesmo volume apenas do veículo. O
sacrifício do animal se deu 4 semanas após o início do tratamento com o hormônio ou com o veículo.
Medida da pressão arterial
Neste estudo foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos (200-350g). Os
animais foram anestesiados com uma associação ketamina / xylazina na proporção de 90 / 10 mg/Kg
de peso corporal, respectivamente, por via intraperitoneal. Após entrar em estado de anestesia
cirúrgica, o animal foi colocado em decúbito dorsal em uma prancha de madeira revestida com
camada de borracha, onde foi realizada a fixação da cabeça e das patas, através de fios de algodão e
pinos metálicos (conforme descrito por Carlini em 1973, vide figura 5). Para manter a temperatura
corporal em valores relativamente constantes entre 36 e 37oC, foi utilizada uma lâmpada
incandescente próxima ao corpo do animal. O procedimento cirúrgico consistiu em localizar e isolar a
veia ilíaca externa na região inguinal direita e introduzir um cateter (PE 60) com uma ponta de agulha
(30 x 8) preenchidos com solução salina heparinizada, via esta utilizada para administrar-se o OECN
(Fig. 5 – painéis 3 e 4). Após este procedimento foi feita uma incisão medial na região cervical por
onde foram localizados os músculos esterno-cleido-mastoideu e hioideu e as glândulas salivares
parótidas (Fig. 5 – painel 1). Afastando-se cuidadosamente estas estruturas foi possível a visualização
do conjunto nervo vago-artéria carótida, sendo esta última cuidadosamente isolada do nervo vago com
a utilização de pequenas hastes de vidro, mantendo-o intacto. A artéria foi, então, clampeada com
uma linha de algodão em uma extremidade mais cefálica e com uma pinça tipo bulldog na extremidade
mais caudal. No espaço entre os dois clampeamentos, o vaso foi cortado em V para introdução da
cânula com a abertura em bisel na direção contrária ao fluxo sanguíneo e conectado a um manômetro
de mercúrio, tipo Condon, regulado para uma pressão de aproximadamente 100 mmHg. Depois da
fixação da cânula que fora previamente heparinizada, procedeu-se a liberação da pinça hemostática
para que se pudesse registrar os níveis pressóricos do animal. Após um período de 10 minutos para
estabilização da pressão arterial média (PAM), o OECN foi injetado na forma de bolus, nas doses de 1,
52
5, 10, 20 e 50 mg/Kg. As injeções foram realizadas em intervalos de aproximadamente 1 minuto,
sendo que o volume total administrado nunca foi superior a 0,3 ml para se evitar alteração da PAM
provocada por hipervolemia. O registro das alterações da PAM foi feito em quimógrafo e expresso
como variação da pressão arterial em relação à pressão arterial controle.
Estudo dos efeitos do OECN sobre a frequência cardíaca, respiratória e sobre os parâmetros hematológicos e gasométricos
Nos animais usados para a medida da pressão arterial também foram analisados
os efeitos da aplicação endovenosa do OECN sobre a frequência cardíaca através da utilização de
eletrodos subcutâneos posicionados nas regiões axilar e inguinal direita e esquerda conectados a um
eletrocardiógrafo (modelo ECG-4, FUNBEC, São Paulo, Brasil). A frequência respiratória foi
monitorada visualmente após cada aplicação do OECN pelo número de incursões respiratórias durante
o período de 1 minuto. Após a injeção da última dose de OECN, foi retirada uma amostra de sangue
arterial através da cânula implantada na artéria carótida, a qual foi imediatamente analisada através de
um aparelho de gasometria (modelo COMPACT 1 Blood Gas Analyser AVL).
Soluções e drogas
O OECN empregado neste trabalho foi gentilmente cedido pelo Departamento de
Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará (UFC), e foi extraído de plantas
coletadas da região de Ipu, no interior do estado do Ceará, em maio de 1994. O óleo foi obtido das
folhas da planta pela técnica de arraste com vapor d’água e analisado por meio de cromatografia
gasosa e espectrometria de massa (Hewllet-Packard 6971 GC/MS), constatando-se a seguinte
composição química da amostra (em % do peso do óleo): 1,8-cineol (25.4%), metil-eugenol (14.9%),
xantoxilina (10.1%), β-cariofileno (9.66%), sabineno (5.2%), α-terpineol (4.96%) e outros constituintes
de menor importância em termos percentuais (vide Magalhães, 1997). A classificação botânica da
planta foi confirmada pelo Dr. Afrânio Fernandes, e uma amostra deste espécime consta do acervo do
Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da UFC, exsicata número 3.185.
53
PINÇABULLDOG
MÚSCULOESTERNO-CLEIDO-MASTOIDEU
MÚSCULOHIOIDEU
CARÓTIDACÂNULA
LINHA
EPIGÁSTRICA
FEMURAL
ILÍACAEXTERNA
CÂNULA
1 2
3
4
54
Nas soluções utilizadas neste estudo, em que concentrações de K+ foram aumentadas, diminuiu-se a
concentração de Na+ de maneira a manter-se a mesma osmolaridade, exceto nos experimentos com
soluções hipertônicas, nos quais o K+ foi adicionado à solução sem diminuir-se a concentração de
qualquer outro íon. O 12,13-dibutirato de forbol foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), levando-se
em consideração que a máxima concentração final de DMSO utilizada no banho foi <0,1%. Soluções
sem Ca2+ foram preparadas pela simples omissão de CaCl2 e pela adição de 2 mM de ácido etileno-bis
(β-amino-etil-éter-N,N,N’,N’-tetracético) (EGTA).
As soluções de histamina, cloreto de carbamilcolina (carbacol), pirilamina,
cromoglicato (Sigma, EUA) e outras substâncias foram preparadas pela adição da substância pura
diretamente na solução fisiológica e armazenadas em freezer em concentrações 100 a 1000 vezes
maiores que aquelas usadas na câmara durante os experimentos. As soluções de OECN utilizadas
foram preparadas frescas e sonicadas imediatamente antes do uso. Alguns experimentos foram
realizados usando Tween 0,5% como solvente.
Protocolos experimentais
Na maioria dos experimentos, após o período de equilíbrio (tempo necessário para
a adaptação da preparação às novas condições), foram evocadas contrações através da substituição
da solução fisiológica com baixa concentração de K+ (5 mM), por outra contendo 60 mM de K+, e
assim sucessivamente, até que se obtivesse pelo menos duas respostas contráteis iguais (este
período durou aproximadamente 30 a 60 minutos além do tempo necessário para o equilíbrio da
preparação). A maior parte dos dados aqui apresentados são normalizados como um percentual da
média dessas duas últimas contrações.
As curvas concentração-efeito para determinar os efeitos do OECN ou outras
substâncias foram obtidas pela exposição da preparação a concentrações crescentes, cumulativas ou
não, adicionadas ao banho pelo período aproximado de 5 minutos para cada concentração ou, quando
necessário, 10 minutos para observar a resposta platô. Para medir o relaxamento do tônus muscular
55
aumentado, dois segmentos adjacentes do tecido foram montados paralelamente e somente um foi
exposto ao óleo. Neste caso, o relaxamento foi considerado ser a diferença entre a linha de base da
preparação experimental e aquela da preparação controle. Para quantificar a inibição da contração
muscular, as preparações foram expostas ao OECN por 5 minutos e, então, foram estimuladas com o
agente indutor de contração adequado, ainda na presença do OECN.
Para verificar se o processo de imunização foi satisfatório, a ovalbumina (10 µg/ml)
foi adicionada ao banho em alguns anéis de traquéia. Se surgissem contrações imediatas após a
adição de ovalbumina o animal era considerado sensibilizado à ovalbumina. Como controle negativo,
anéis provenientes do mesmo animal foram expostos à ovalbumina à temperatura ambiente. Para
outros anéis, foram adicionados 10 µg/ml de soroalbumina bovina em uma temperatura de 37ºC.
Devido ao fato dos experimentos com respostas contráteis à ovalbumina terem sido realizados apenas
uma vez em cada tecido (exceto nos experimentos com cromoglicato de sódio, ver abaixo) os efeitos
do OECN e outras substâncias foram analisados de forma pareada.
Para os experimentos com aorta de ratos tratados com DOCA-sal e seu respectivo
grupo controle, utilizamos a fenilefrina como agonista, na concentração de 10 µM (resposta
submaximal, correspondente a ~80% da máxima).
Análise estatística
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M),
onde n representa o número de experimentos. São considerados estatisticamente significantes os
resultados que apresentaram probabilidade de ocorrência da hipótese nula menor que 5 % (p < 0,05).
Para comparação de dois grupos usamos o teste t pareado ou não pareado. Para comparação de
mais de dois grupos experimentais foram utilizados ANOVA e testes de múltipla comparação, citados
apropriadamente na seção de resultados e/ou nas legendas das figuras. As CE50s e CI50s foram
calculadas por interpolação semilogarítmica, sendo consideradas neste trabalho como a concentração
56
da substância capaz de produzir 50% do seu efeito máximo e, foram calculadas individualmente para
cada experimento. Para comparação de tratamentos foi utilizada ANOVA de duas variáveis.
57
RESULTADOS
AÇÕES DO OECN SOBRE O MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE COBAIO Efeito do OECN no tônus basal da traquéia isolada de cobaio
OECN (0,1-1000 µg/ml) produziu um relaxamento do tônus basal da traquéia
isolada de cobaio mantida em solução com 5 mM de K+, de maneira dependente de concentração (p <
0,001, ANOVA), com uma CE50 igual a 4,3 ± 0,8 µg/ml. A magnitude do relaxamento máximo induzido
pelo OECN não foi significativamente diferente do relaxamento produzido pela aminofilina e alcançou
um efeito máximo correspondente a 200,7 ± 25,6 % (n = 24) da contração induzida por 60 mM de K+
(Fig 6). Em tecidos contraídos com soluções com 60 mM de K+ o OECN relaxou as preparações com
CI50 de 63,3 ± 23,6 µg/ml (n = 10, Fig 7). Este valor foi estatisticamente diferente daquele obtido com
5 mM de K+ extracelular (p < 0,05, teste t não pareado). O efeito relaxante do OECN foi reversível
pela remoção do óleo através de lavagens sucessivas da preparação com solução fisiológica. O metil-
eugenol produziu um relaxamento semelhante ao OECN com CI50 de 57,1 ± 26,5 µg/ml (n = 4, Fig
7B).
Efeito do OECN na contração da traquéia isolada de cobaio induzida pela ovalbumina
A estimulação antigênica com a ovalbumina induziu contração que atingiu um pico
equivalente a 227,2 ± 21,7 % (n = 29) da contração induzida por 60 mM de K+. A prévia incubação do
tecido por 5 minutos com 300 e 600 µg/ml de OECN reduziu a contração para 82,5 ± 32,1 (n = 11) e
35,4 ± 9,6 % (n = 10) da contração induzida por 60 mM de K+ (Fig 8), respectivamente.
Efeito de uma segunda exposição da traquéia de cobaio a ovalbumina na ausência e na presença de OECN e cromoglicato
Na presença de 100 µM de cromoglicato de sódio (n = 20), adicionado previamente
por 5 minutos, a contração induzida pela apresentação do antígeno foi reduzida para 135,0 ± 26,5 %
da resposta controle induzida por 60 mM de K+ (Fig. 8B - 1a). Entretanto, em 9 dos 20 experimentos, a
adição subseqüente do antígeno à solução de banho, após a lavagem da preparação por 10 minutos
58
com solução fisiológica para a retirada tanto do OECN como do cromoglicato, induziu uma segunda
contração correspondente a 35,4 ± 15,2 % da contração induzida por 60 mM de K+ apenas para os
tecidos em contato com o cromoglicato (Fig. 8B – 2a). Por outro lado, uma segunda exposição à
ovalbumina não produziu contração nem nos tecidos dos animais controles (n = 6) nem nos tecidos
dos animais experimentais (300 ou 600 µg/ml EOCN) (n = 10), mas que não tiveram contato com o
cromoglicato (Fig. 8A e 8B).
Efeito da pirilamina sobre as contrações induzidas pela ovalbumina e pela histamina em traquéia isolada de cobaio
Em outro grupo de experimentos, a apresentação ao antígeno provocou uma
contração correspondente a 187,8 ± 28,2 % da contração induzida por 60 mM de K+ (n = 8, Fig. 8C).
Na presença de pirilamina (5 µM) a adição de ovalbumina à solução produziu contrações de
aproximadamente 74,6 ± 31,0 % da contração potássica. Quando comparado com o controle, este foi
estatisticamente diferente (p < 0,05, teste t pareado). A histamina (20 µM) produziu contrações
correspondentes a 177,4 ± 34,7 % (n = 10) da contração induzida por K60 e na presença de pirilamina
esta resposta foi significativamente reduzida para 7,5 ± 3,9 % da contração controle (p < 0,001, teste t
pareado, Fig 8C).
Efeito inibitório do OECN na contração mantida da histamina e prostaglandina F2αααα em traquéia isolada de cobaio
O OECN usado nas concentrações de 100 e 300 µg/ml, reduziu significativamente
a amplitude máxima da curva concentração-efeito induzida pela histamina para 72,6 ± 6,5 e 20,2 ± 2,2
% da resposta obtida na presença 30 µM de histamina, respectivamente (Fig 9B). Na presença de
OECN, o aumento da concentração de histamina a valores maiores que a concentração capaz de
saturar a resposta contrátil no controle não foi capaz de reverter o bloqueio e a tensão máxima foi
diminuída (Fig 9A). A CE50 para a histamina passou de 1,7 ± 0,4 µM (n = 10) no controle, para 4,3 ±
1,9 (n = 5) e 27,7 ± 2,3 µM, nas concentrações de 100 e 300 µg/ml, respectivamente, havendo
diferença significativa em relação ao controle apenas na concentração de 300 µg/ml (p < 0,05, teste
de Dunnett). Por outro lado, a força máxima induzida pela PGF2α foi alterada pelo OECN apenas na
59
concentração de 400 µg/ml (Fig. 10). A força produzida por 30 µM de PGF2α foi correspondente a
88,2 ± 4,8, 84,8 ± 18,9 e 22,4 ± 4,0 % da sua contração máxima, na ausência e presença de 200 e
400 µg/ml de OECN, respectivamente (Fig. 10B). A CE50 foi de 2,4 ± 0,4, 6,3 ± 0,7 e 14,9 ± 5,3 µM
na ausência e presença de 200 e 400 µg/ml de OECN, sendo diferente do controle apenas esta última
(p < 0,05, teste de Dunnett).
Efeitos inibitórios do OECN nas contrações submaximais induzidas por histamina, KCl e carbacol na traquéia isolada de cobaio
A exposição prévia da preparação a uma dada concentração de OECN por 5
minutos diminuiu as contrações subseqüentes induzidas por K+, histamina e carbacol (o primeiro
aplicado na concentração de 60 mM enquanto que os demais em concentrações que promovem
respostas submaximais em suas respectivas curvas concentração-efeito (dados não mostrados), Fig.
11), com valores de CI50 correspondentes a 123,9 ± 15,7 (n = 8), 102,5 ± 17,8 (n = 8) e 128,8 ± 32,5
µg/ml (n = 8), respectivamente. Foram realizados alguns experimentos utilizando um solubilizante
(Tween 0,5 %) no protocolo do bloqueio da contratura K+ pelo OECN (dados não mostrados). A
presença do solubilizante não alterou o efeito produzido pelo OECN.
Comparação do potencial transmembrana da traquéia isolada de cobaio na presença e ausência do OECN
O potencial transmembrana da traquéia isolada de cobaio foi medido em solução
normal contendo 5 mM de K+ e correspondeu a −46,7 ± 1,7 mV e em solução despolarizante cuja
concentração de K+ foi de 80 mM e foi de −17,9 ± 1,1 mV (Fig 12). O OECN (200 µg/ml) não alterou
significativamente estas medidas do potencial eletroquímico entre os lados externo e interno da
membrana que corresponderam respectivamente a −51,2 ± 1,6 mV e −19,3 ± 1,1 mV, nas
concentrações extracelulares de 5 e 80 mM de K+, respectivamente. O número de experimentos
encontra-se registrado na tabela I.
60
Concentração (µg/ml)
0 0 1 10 100 1000 10000
Rel
axam
ento
( % c
ontr
ação
K60
)
0
50
100
150
200
250
OECN Aminofilina
A
B
OECN ( g/ml)µ
20' 60'
0,1 1 10100
1000
300 mg
2 min
K60
61
Concentração (µg/ml)
0,1 1 10 100 1000
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
-60
0
60
120OECN
METIL-EUGENOL
A
B
1 10 30 100 300
600
K60
OECN ( g/ml)µ
3 min
500 mg
62
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
100
200
300
**
**
OVA23
oC
SAB37
oC
CONTROLEOECN 300OECN 600
****
OVA37
oC
1a
2a
CRG 100
♣
*
OVA10 g/mlµ
K60
K60
OVA10 g/mlµ
OECN 600 g/mlµ
OVA10 g/mlµ
OVA10 g/mlµ
300 mg
2 min
A
B
C
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
100
200
300OVAOVA+PIR
HAHA+PIR
*
***
63
K60 HAMµ
0,1 0,3 1 3 10 30
0,1 0,3 1 3 10 30 100
a
b
300mg
2 min
HA (µM)
1 10 100
Con
traç
ão(%
da
resp
osta
máx
ima)
0
40
80
120
* *
*
**
*
CONTROLEOECN 100OECN 300
64
K60
400mg
2min
PGF2M
α
(µ )1 3 10 30
1 3 10 30
1 3 10 30
a
b
c
PGF2α (µM)1 10 100
Con
traç
ão(%
da
resp
osta
máx
ima)
0
40
80
120
CONTROLEOECN 200OECN 400
**
**
*
B
A
65
OECN (µg/ml)
0,1 1 10 100 1000
Con
traç
ão(%
da
resp
osta
con
trol
e)
0
20
40
60
80
100
120
HA CChK+ (60mM)
B
HA3 Mµ
1 10 100 300
OECN ( g/ml)µ
HA3 Mµ
HA3 Mµ
HA3 Mµ
HA3 Mµ
HA3 Mµ
2 min
500 mg
66
Pot
enci
al tr
ansm
embr
ana
(mV
)
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
CONTROLEOECN 200
5 mM K+
80 mM K+
Traquéia
67
Ações do OECN na pressão arterial, frequências cardíaca e respiratória e na
gasometria de ratos anestesiados
Pressão Arterial Média (PAM): a PAM do grupo controle (nefrectomizado) foi de 74,9 ± 6,4 mmHg (n
= 7). Para os animais tratados com DOCA-sal a PAM foi significativamente diferente (p < 0,05, teste t
não pareado) e correspondeu a 105,0 ± 6,1 mmHg (n = 4). A injeção de veículo correspondente
àquele usado para injeção da maior dose de OECN não produziu alteração detectável na PAM. O
OECN reduziu a PAM de forma dose-dependente nos dois grupos de animais a partir da dose de 10
mg/Kg. Por outro lado, o OECN mostrou-se mais eficaz nos animais DOCA-sal do que nos animais
uninefrectomizados (p < 0,05, ANOVA de duas variáveis) (Fig. 13A).
Frequência cardíaca: a frequência cardíaca basal foi de 264,3 ± 10,7 b.p.m. (n = 7) e 233,3 ± 8,3
b.p.m. (n = 3) para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente; a aplicação endovenosa
do OECN produziu uma bradicardia significativa nas doses de 20 e 50 mg/Kg nos animais
uninefrectomizados e na dose de 50 mg/Kg nos animais DOCA (p < 0,05, teste de Dunnett) (Fig. 13B e
C). A recuperação da frequência cardíaca foi apenas parcial.
Frequência respiratória: a frequência respiratória basal foi de 52,0 ± 3,5 c.p.m. (n = 7) e 47,6 ± 5,7
c.p.m. (n = 5) para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente; o OECN não produziu
alterações significativas na frequência respiratória dos animais dos dois grupos estudados (Fig. 14A e
B).
Gasometria:
Em amostras de sangue colhidas após a administração da maior dose de OECN (50 mg/Kg),
determinaram-se:
pH: o pH foi de 7,3 ± 0,0 (n = 5) e 7,3 ± 0,0 (n = 4) para os grupos nefrectomizado e
DOCA-sal, respectivamente;
68
Hematócrito: o hematócrito foi de 40,0 ± 1,5 % (n = 5) e 40,4 ± 0,5 % (n = 4) para os
grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente;
HCO3-: a concentração plasmática de HCO3- foi 25,0 ± 1,6 mmol/l (n = 5) e 24,4 ± 3,1
mmol/l (n = 4) para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente;
O2 sat: a saturação de O2 plasmática foi de 94,8 ± 1,9 % (n = 5) e 97,8 ± 0,3 % (n = 4)
para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente;
Hemoglobina: a hemoglobina plasmática foi de 12,9 ± 0,5 g/dl (n = 5) e 13,0 ± 0,1 g/dl
(n = 4) para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente;
pO2: a pO2 plasmática foi de 97,4 ± 16,4 mmHg (n = 5) e 110,4 ± 3,3 mmHg (n = 4) para
os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente;
pCO2: a pCO2 plasmática foi de 48,8 ± 4,3 mmHg (n = 5) e 43,3 ± 8,6 mmHg (n = 4)
para os grupos nefrectomizado e DOCA-sal, respectivamente.
A comparação dos animais uninefrectomizados e DOCA-sal após a injeção da dose de 50 mg/Kg de
OECN demonstra não haver diferença significativa entre estes grupos em nenhum dos parâmetros
apresentados (p > 0,05, teste t não pareado, Fig 15).
69
A
B
C
OECN (mg/Kg)
0 10 20 30 40 50
∆P
A (
%)
-50
-40
-30
-20
-10
0
*
*
*
*
*
**
F
requ
ênci
a ca
rdía
ca(b
.p.m
.)
160
200
240
280
Fre
quên
cia
card
íaca
(b.p
.m.)
200
220
240
260
280
* *
*
CO
NT 1 5 10 20 50
OECN (mg/Kg) RE
C
Uninefrectomizados
DOCA-sal
CO
NT 1 5 10 20 50
OECN (mg/Kg) RE
C
70
Fre
quên
cia
resp
irató
ria(c
.p.m
.)
0
20
40
60
80
CO
NT 1 5 10 20 50
OECN (mg/Kg)
DOCA-sal
Fre
quên
cia
resp
irató
ria(c
.p.m
.)
0
20
40
60
80Uninefrectomizado
CO
NT 1 5 10 20 50
OECN (mg/Kg)
71
pH
7,2
7,4
7,6
mm
Hg
0
40
80
120
pO2 pCO2
O2
sat (
%)
0
40
80
120
HC
O3- (
mM
)
0
10
20
30
40
Hem
atóc
rito
(%)
0
20
40
60
Hem
oglo
bina
(g/
dl)
0
5
10
15
20
Uninefrectomizado DOCA-sal
A D
C F
E B
72
AÇÕES DO OECN SOBRE O MÚSCULO LISO VASCULAR ISOLADO DE COBAIO
Reversão da contratura K+ em aorta isolada e influência do endotélio e L-NAME no efeito do OECN
Ao ser adicionado no platô da contratura induzida por 60 mM de K+, o OECN (1 – 600 µg/ml)
produziu, na aorta de cobaio, um relaxamento dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), com
uma CI50 de 200,5 ± 40,3 µg/ml (n = 6, Fig. 16). O relaxamento foi significante a partir da
concentração de 100 µg/ml (teste de Dunnett, p < 0,05). Com a retirada do endotélio a CI50 foi 168,6 ±
16,1 µg/ml (n = 5). Em preparações com o endotélio intacto e na presença de L-NAME (100 µM),
adicionado cerca de 20 minutos antes da adição do OECN, a CI50 para a reversão da contração foi
252,8 ± 57,0 µg/ml (n = 5). Não houve diferença significativa entre as CI50 (p > 0,05, ANOVA). Os
valores das CI50 e das concentrações limiares encontram-se na tabela II.
Reversão da contratura induzida pelo éster do forbol em aorta isolada
Em preparações de aorta de cobaio mantidas em meio com baixa concentração de Ca2+
extracelular (solução fisiológica sem CaCl2 e adicionada de 2 mM de EGTA) o dibutirato de forbol (1
µM; DBF) produziu uma contração caracteristicamente tônica correspondendo a 58,2 ± 8,6 % da
contração induzida por 60 mM de K+ e que atingiu o seu pico em aproximadamente 30 minutos (Fig.
17A). A adição do OECN (10 – 1000 µg/ml) sobre o platô da contração produziu um efeito relaxante
da preparação que foi dependente de concentração e que diferiu significativamente do perfil da
contração de preparações controle que não receberam o OECN (Fig 17C). O relaxamento produzido
pelo óleo essencial foi significante a partir da concentração de 400 µg/ml (p < 0.05, teste de Dunnett) e
a CI50 do OECN correspondeu a 477,2 ± 81,9 µg/ml (n = 8, Fig. 17B).
Inibição da curva concentração-efeito do dibutirato de forbol em aorta isolada
A adição prévia de OECN por 5 minutos antes da adição de dibutirato de forbol em meio sem
Ca2+ e com EGTA também alterou significativamente o padrão da curva concentração-efeito do
73
dibutirato de forbol (Fig 18). Na ausência do OECN o dibutirato de forbol produziu uma contração que
foi dependente de concentração com uma CE50 igual a 0,4 ± 0,1 µM (n = 4) e efeito máximo
equivalente a 110,2 ± 4,2 % da contração induzida por 60 mM de K+ na concentração de 10 µM. Na
presença de 200 µg/ml de OECN, houve um aumento do valor numérico da CE50 para 3,2 ± 1,1 µM
que não atingiu significância (p = 0,073, teste t pareado), mas houve redução significativa do efeito
contrátil máximo induzido pelo DBF para 63,2 ± 4,5 % (p < 0,01, teste t pareado) do valor controle
(ausência de OECN).
Sobre a contração da aorta isolada induzida por solução de K+ hiperosmolar
A adição de KCl diretamente à solução nutridora com baixo teor de Ca2+ (solução sem adição
de Ca2+ e com 2 mM de EGTA) para uma concentração final de K+ de 300 mM produz uma contração
na aorta de cobaio cuja amplitude correspondeu a 66,9 ± 8,6 % (n = 6) da contração induzida por 60
mM de K+ na situação controle (Fig. 19). Na presença de OECN (400 µg/ml) a resposta à adição
hipertônica de K+ foi significativamente menor e correspondeu a 30,1 ± 8,3 % da contração K60 (p <
0,05, teste de Dunnett). Por outro lado, a adição de sucrose (600 mM) produziu uma contração de
77,1 ± 12,5 % (n = 4) da contração K+ e na presença do OECN esta contração foi de 75,9 ± 15,0 % da
contração K+.
Sobre o potencial transmembrana da aorta isolada
O potencial transmembrana da aorta isolada de cobaio foi medido na ausência e presença de
200 µg/ml de OECN em duas condições em relação à concentração extracelular de K+: uma com a
solução normal contendo 5 mM e outra com uma solução despolarizante contendo 80 mM (Fig. 20A).
Nestas duas situações, a presença do OECN não alterou significativamente a diferença de potencial
elétrico entre os dois lados da membrana que corresponderam respectivamente a −51,1 ± 1,6 mV sem
OECN e −48,2 ± 1,2 mV com OECN e −16,8 ± 0,8 mV e −14,3 ± 1,2 mV na ausência e presença de
OECN, respectivamente. O número de experimentos encontra-se registrado na tabela I.
74
Sobre o potencial transmembrana de vasos mesentéricos isolados
O potencial transmembrana de vasos mesentéricos isolados de cobaio também foi medido na
ausência e presença de 200 µg/ml de OECN em duas condições em relação à concentração
extracelular de K+: uma com a solução normal contendo 5 mM e outra com uma solução
despolarizante contendo 80 mM (Fig. 20B). Nestas duas situações, a presença do OECN não alterou
significativamente os potenciais transmembrana que corresponderam a −47,0 ± 1,6 mV (n = 29) e
−50,2 ± 1,8 mV (n = 29) na ausência e presença de OECN com 5 mM de K+ no meio extracelular,
respectivamente. Em presença de 80 mM de K+ o potencial transmembrana correspondeu a −13,4 ±
0,7 mV (n = 27) e −13,9 ± 1,0 mV (n = 27) na ausência e presença de OECN, respectivamente.
75
B
A
1 3 10 30 100 200 300500 600
1 3 10 30 100200
300
500
600
K60
K60
400 mg
5 min
600 mg
5 min
OECN ( g/ml)µ
OECN ( g/ml)µ
CONTROLE
COM L-NAME 100
OECN (µg/ml)
1 10 100 1000
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
20
40
60
80
100
120
L-NAME 100µMCONTROLE
SEM ENDOTÉLIO
76
OECN (µg/ml)
10 100 1000
Con
traç
ão(%
do
cont
role
)
0
40
80
120
*
100 200 300 400 600 800 1000
K60DBF1 Mµ
Ca0 (2 mM EGTA)
OECN ( g/ml)µ
5 min
500 mg
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
% d
a co
ntra
ção
K60
0
40
80
120sem OECNcom OECN
77
0,01
K60
Ca0 (2 mM EGTA) + OECN 200 g/mlµ 5 min
500 mg
K60
Ca0 (2 mM EGTA)
0,03 0,1 0,31
3 10
10310,30,10,030,01
DBF ( M)µ
DBF ( M)µ
DBF (µM)
0,01 0,10 1,00 10,00
% d
a K
60
0
40
80
120 DBFDBF + OECN 200
78
A
B
500mg
2min
K60
Ca 0 (2 mM EGTA)
OECN 400 g/mlµ
K300 K300 SUC600 SUC600
OECN 400 g/mlµ
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
20
40
60
80
100
K300 K 300OECN 400
SUC600
SUC 600OECN 400
*
79
Pot
enci
al tr
ansm
embr
ana
(mV
)
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
CONTROLEOECN 200
5 mM K+
80 mM K+
Aorta
Pot
enci
al tr
ansm
embr
ana
(mV
)
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
CONTROLEOECN 200
Vasos mesentéricos
80 mM K+
5 mM K+
80
AÇÕES DO OECN SOBRE O MÚSCULO LISO VASCULAR DE RATO
EFEITOS NA AORTA ISOLADA DE RATO
Reversão da contratura K+ e influência do endotélio e L-NAME no efeito do OECN
Assim como na aorta de cobaio, ao ser adicionado no platô da contratura induzida por 60 mM
de K+, o OECN (1 – 300 µg/ml) produziu um relaxamento dependente de concentração (p < 0,001,
ANOVA) da aorta de rato nas quais o endotélio foi mantido intacto (Fig. 21). A CI50 para o relaxamento
da contratura potássica foi de 32,2 ± 6,70 µg/ml (n = 8) e o relaxamento foi significativo a partir da
concentração de 3 µg/ml (teste de Dunnett, p < 0,05). Com a retirada do endotélio a CI50 foi
significativamente aumentada para 106,2 ± 5,7 µg/ml (n = 5; p < 0,05, teste de Dunnett). Em
preparações com o endotélio intacto e na presença de L-NAME (100 µM, Fig 21 B), adicionado cerca
de 20 minutos antes da adição do OECN, a CI50 para a reversão da contração foi significativamente
aumentada para 67,5 ± 5,6 µg/ml (n = 5, p < 0,05, teste de Dunnett). Os valores das CI50 e
concentrações limiares encontram-se na tabela II.
Reversão da contratura K+ pelo 1,8-cineol, metil-eugenol e terpineol A adição dos constituintes do OECN 1,8-cineol (1 – 400 µg/ml), metil-eugenol (1 – 300 µg/ml) e
terpineol (1 – 300 µg/ml), isoladamente, produziu um relaxamento da contratura K+ de forma
dependente de concentração (Fig. 22). A CI50 para cada constituinte foi 168,8 ± 18,1, 18,7 ± 6,4 e
41,0 ± 5,2 µg/ml, respectivamente. Quando comparadas em relação ao OECN, apenas o cineol
apresentou uma CE50 significativamente maior (p < 0,05, teste de Dunnett).
Influência do azul de metileno no relaxamento induzido pelo OECN na aorta de rato contraída com 0,3 µµµµM de norepinefrina
O relaxamento da aorta de rato (pré-contraída com 0,3 µM de norepinefrina e com o endotélio
intacto) produzido pelo OECN foi significativamente alterado pelo azul de metileno, um conhecido
81
inibidor da guanilato ciclase (Rapoport et al., 1985), adicionado na concentração de 10 µM cerca de 20
minutos antes da adição de norepinefrina (Fig. 23A). Nas concentrações de 10, 100 e 200 µg/ml o
OECN produziu um efeito relaxante correspondente a 33,8 ± 9,6, 71,4 ± 9,7 e 82,8 ± 7,1 % da
contração induzida por 0,3 µM de norepinefrina (Fig. 23B). O efeito relaxante do OECN na presença
de azul de metileno foi significativamente reduzido nas concentrações de 10 e 100 µg/ml mas não na
de 200 µg/ml (p < 0,05, teste t pareado) e correspondeu a 13,3 ± 4,7, 46,7 ± 4,1 e 67,4 ± 4,4 % da
contração controle de norepinefrina, respectivamente.
Sobre as contrações induzidas por fenilefrina em aorta de ratos uninefrectomizados e DOCA-sal
A exposição prévia da preparação a uma dada concentração de OECN (1 – 300 µg/ml) por 5
minutos diminuiu significativamente as contrações subseqüentes induzidas por fenilefrina utilizada em
concentrações que produziram efeitos contráteis submaximais (Fig. 24), com valores de CI50
correspondentes a 112,9 ± 23,4 (n = 5) para os animais uninefrectomizados e 16,4 ± 3,6 µg/ml (n = 7)
para os animais DOCA-sal. A comparação dos efeitos do OECN demonstrou haver diferença
significante entre os tecidos dos animais uninefrectomizados em relação aos dos animais DOCA-sal (p
< 0,001, two-way ANOVA).
82
A
B
400 mg
5 min
300 mg
5 min
1 3 10 30 100
200
300
13 10
30
100
200300
K60
K60
OECN ( g/ml)µ
OECN ( g/ml)µCOM ENDOTÉLIO
SEM ENDOTÉLIO
OECN (µg/ml)1 10 100 1000
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
40
80
120SEM ENDOTÉLIO
CONTROLEL-NAME 100
83
A
B
K60
1 3 10 30 100200
300
400
5 min
200 mg
CINEOL ( g/ml)µ
K60
1 310 30
100
200300
METIL-EUGENOL ( g/ml)µ
200 mg
5 min
Concentração (µg/ml)
1 10 100 1000
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
40
80
120
TERPINEOLCINEOL
MET EUG
84
B
A
K60 NE0,3
AM10
NE0,3
OECN ( g/ml)µ 10 100
200
10
100
200
OECN ( g/ml)µ
5 min
200 mg
.
Rel
axam
ento
indu
zido
pel
o O
EC
N(%
da
cont
raçã
o N
E 0
.3 µ
M)
0
20
40
60
80
100
*
*
10 100 200
OECN (µg/ml)
CONTROLE
AM 10
85
OECN (µg/ml)
1 10 100 1000
Con
traç
ão(%
do
cont
role
)
0
40
80
120DOCA-sal
Nefrectomizado
*
86
AÇÕES DO OECN SOBRE A CIRCULAÇÃO MESENTÉRICA ex vivo DE RATOS Sobre o fluxo no leito vascular mesentérico
Sob pressão constante, o fluxo de líquido fisiológico (com concentração extracelular de K+
correspondente a 5 mM) pelo leito vascular mesentérico foi de 2,9 ± 0,4 ml/min (n = 7). O aumento da
concentração de K+ para 60 mM no líquido de perfusão produziu uma diminuição significante (p < 0,01,
teste t pareado) do fluxo através dos vasos para 1,8 ± 0,3 ml/min. A partir daí, a diminuição do fluxo
permaneceu estável por todo o período em que a preparação esteve perfundida com a solução
despolarizante, etapa que durou aproximadamente 60 minutos. Após este período, com a reperfusão
do tecido com solução normal ([K+] 5 mM), o fluxo retornou a valores semelhantes aqueles observados
no período controle (Fig. 25A).
Após a estabilização do fluxo com solução despolarizante (~10 minutos após a troca de
solução), foi adicionado o OECN nas concentrações de 1, 10 100 e 300 µg/ml (Fig. 25B), mantendo-se
alta a concentração extracelular de K+. O tempo de perfusão para cada concentração foi de 5 minutos,
exceto para a concentração de 300 µg/ml, que foi de 10 minutos, durante os quais foram feitas duas
medidas, uma com cinco e outra com 10 minutos de perfusão. A presença do OECN aumentou o fluxo
mesentérico nas concentrações de 100 e 300 µg/ml, embora apenas na concentração de 300 µg/ml
este aumento tenha sido significativo (p < 0,05, teste de Dunnett). Ao final da segunda leitura do fluxo
com a solução de 300 µg/ml o OECN foi lavado pela perfusão da preparação com solução contendo
60 mM de K+, o que reduziu novamente o fluxo do líquido pelos vasos mesentéricos para os mesmos
níveis vistos antes da adição do óleo. Ao final, o tecido vascular foi novamente perfundido com
solução de Tyrode modificado e o fluxo retornou a valores próximos ao período controle.
Influência do L-NAME e D-NAME no efeito relaxante do OECN sobre o fluxo mesentérico
Na presença de L-NAME (50 µM) o fluxo basal no período controle (solução com 5 mM de K+)
foi de 2,8 ± 0,3 ml/min (n = 5), não diferindo dos experimentos sem a adição do L-NAME. Por outro
lado, com a troca pela solução despolarizante o fluxo vascular passou a ser a 0,9 ± 0,1 ml/min (p <
87
0,01, teste t pareado). Nesta situação, o OECN 1, 10 e 100 µg/ml foi ineficaz em reverter a diminuição
do fluxo mesentérico, enquanto que na concentração de 300 µg/ml este efeito mostrou uma tendência,
embora não significativa, ao final dos 10 minutos de contato (Fig. 26).
Na presença de 50 µM de D-NAME o fluxo basal no período controle (solução com 5 mM de
K+) foi de 3,2 ± 0,2 ml/min (n = 4), não diferindo dos experimentos sem a adição do D-NAME. A troca
da solução normal pela despolarizante reduziu o fluxo para 2,2 ± 0,2 ml/min também não diferindo dos
experimentos sem D-NAME. Nesta situação, o OECN nas concentrações de 1 e 10 µg/ml não
alteraram a diminuição do fluxo, enquanto que na concentração de 100 e 300 µg/ml foi observado um
aumento significante do fluxo mesentérico (p < 0,05, teste de Dunnett) (Fig. 27).
Efeitos dos principais constituintes 1,8-cineol, metil-eugenol e terpineol sobre o fluxo no leito vascular mesentérico
Após a estabilização do fluxo com solução despolarizante e mantendo-se alta a concentração
extracelular de K+, foram realizados experimentos adicionando-se isoladamente os principais
constituintes do OECN nas mesmas concentrações utilizadas para o óleo. O tempo de perfusão para
cada concentração também foi de 5 minutos e, para a concentração de 300 µg/ml, foram mantidas as
duas medidas, uma com cinco e outra com 10 minutos de perfusão. A presença do 1,8-cineol durante
a perfusão do leito com solução despolarizante produziu uma tendência a aumentar o fluxo
mesentérico apenas na concentração de 300 µg/ml, embora este aumento não tenha sido significativo.
A adição de L-NAME à solução aboliu essa tendência do 1,8-cineol a produzir aumento do fluxo (Fig.
28). Por outro lado, o metil-eugenol aumentou significativamente o fluxo nas concentrações de 100 e
300 µg/ml. Na presença de L-NAME (50 µM) apenas na concentração de 300 µg/ml foi significativo
(Fig. 29). O aumento do fluxo pelo terpineol foi significativo apenas na concentração de 300 µg/ml.
Na presença de L-NAME esta mesma concentração só produziu aumento significativo do fluxo com 10
minutos de perfusão (Fig. 30). Todas estas alterações produzidas pelos constituintes do OECN foram
reversíveis com a lavagem do tecido apenas com solução fisiológica.
88
Sobre a contração induzida por solução de K+ hiperosmolar em útero isolado de ratas estrogenizadas
A adição hipertônica de KCl diretamente à solução nutridora com baixa concentração de Ca2+
(solução contendo 2 mM de EGTA) para um teor final de K+ de 300 mM produz uma contração no
útero de ratas estrogenizadas com dietilestilbestrol. A amplitude da contração induzida por K300 foi
correspondente a 12,9 ± 1,4 % da contração induzida por 60 mM de K+ em meio com 2 mM de Ca2+
(Fig. 31A e B). Na presença de OECN (400 µg/ml) a resposta do K+ hipertônico não foi
significativamente alterada e correspondeu a 12,0 ± 1,0 % da contração K60. A adição de sucrose
(600 mM) nas mesmas condições produziu uma contração de 7,1 ± 2,2 % da contração K+ e o OECN
também não alterou esta resposta. Em preparações pré-contraídas com 60 mM de K+, o OECN
também produziu reversão da contração com CE50 de 52,6 ± 12,2 µg/ml (Fig. 31C)
89
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
40
60
80
100
120K60
OECN
110
100
300300´
Tempo (min)
0 20 40 60 80
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
40
60
80
100
120K60
A
B
90
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100K60
OECN 100OECN 300
OECN 300´
**
CONTROLE L-NAME (50µM)
Tempo (min)
0 40 80
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120K60
110
100
300
300´
OECN
OECN + L-NAME
A
B
91
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
40
60
80
100
120K60
OECN + D-NAME
1 10
100
300300´
OECN
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
K60OECN 100OECN 300
OECN 300´
**
CONTROLE D-NAME (50µM)
***
A
B
92
CONTROLE L-NAME (50µM)
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120
K60ME 100
ME 300 5´ME 10´
***
*
*
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120
140K60ME
ME + L-NAME
1 10
100
300
300´
A
B
93
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120
140K60
TERP
TERP + L-NAME (50µM)
1 10
100
300
300´
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120
* *
*
CONTROLE L-NAME (50µM)
K60TERP 100
TERP 300 5´TERP 300 10´
A
B
94
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
120
1
10 100
300´
300
K60
CIN + L-NAME
CIN
CONTROLE L-NAME (50µM)
Flu
xo (
% d
o co
ntro
le)
0
20
40
60
80
100
K60CIN 100
CIN 300 5´CIN 300 10´
A
B
95
K300 SUC 600
Con
traç
ão (
% d
o K
60)
0
4
8
12
16CONTROLEOECN 400
*
A
B
C
1g
2 minCa 0 (2 mM EGTA)
OECN 400 OECN 400
K60K300 K300 SUC600 SUC600
OECN (µg/ml)0,1 1 10 100 1000
Con
traç
ão (
% d
a K
60)
0
40
80
120
96
ESTUDOS ELETROFISIOLÓGICOS EM NEURÔNIOS FÁSICOS DO GÂNGLIO CELÍACO
Propriedades elétricas passivas e ativas dos neurônios do gânglio celíaco
Para os estudos eletrofisiológicos utilizamos a técnica do microeletrodo em preparações de
gânglio celíaco intacto. Algumas propriedades elétricas dos neurônios foram examinadas pelo registro
intracelular de suas respostas frente a pulsos quadrados constantes de corrente de 1 segundo de
duração a cada um ou dois segundos, ora hiperpolarizante para acompanhamento da resistência de
membrana, ora despolarizante para estudo dos potenciais de ação. As amplitudes dos pulsos
variaram de 0,02 a 0,5 nA e não houve injeção de corrente para a manutenção do potencial
transmembrana em nenhum experimento.
Com relação ao número de potenciais de ação evocados, a grande maioria dos neurônios
respondeu com um único potencial de ação no início do pulso limiar de corrente despolarizante. O
aumento da amplitude do pulso de corrente injetado acima de duas vezes o limiar de corrente para
geração do potencial de ação normalmente não produziu maior número de potenciais de ação.
Ocasionalmente, ocorria o surgimento de um ou dois potenciais de ação adicionais, mas sempre na
fase inicial, tornando-se o neurônio quiescente muito antes do final do pulso. Células com estas
características nós classificamos como fásicas (Fig. 32, traçado superior).
Obtivemos também, embora em menor número, registros de alguns neurônios que
responderam com apenas um (eventualmente dois ou mais) potencial de ação no limiar,
caracteristicamente com um retardo maior que os neurônios fásicos e que, com pequenos aumentos
na intensidade do pulso acima do limiar de corrente, iniciaram potenciais de ação adicionais. Um
aumento maior na intensidade do estímulo produziu o surgimento de um trem de potenciais de ação
que perdurou por todo o pulso despolarizante. A altura do pico do potencial de ação não foi alterada
ou teve pouca alteração durante o trem de potenciais de ação. Estas células nós classificamos como
neurônios tônicos (Fig. 32, traçado inferior). Neste estudo, por obtermos um maior número de
observações, consideramos apenas os dados obtidos em neurônios fásicos.
97
Após o período de estabilização da célula, o potencial de repouso para as células fásicas,
considerado como a deflecção de voltagem durante o impalamento foi de –54,5 ± 1,4 mV (n = 21) já
incluído neste valor a correção dos potenciais de ponta dos microeletrodos. Para alguns experimentos
acrescemos a esta medida o valor do potencial de ponta do eletrodo obtido com a retirada deste do
espaço intracelular ao final do registro. Os neurônios que apresentaram potencial de repouso mais
negativo que – 40 mV foram considerados como aceitáveis para este estudo (Fig. 33A).
A resistência de entrada da membrana foi quantificada pela amplitude das variações
eletrotônicas de voltagem produzidas pela aplicação de pulsos quadrados hiperpolarizantes (0,1 nA,
por 1 segundo) e correspondeu a 82,4 ± 6,1 MΩ (n = 21). A medida de resistência foi considerada
válida somente se as leituras fossem coincidentes tanto pelo modo bridge como pelo modo DCC (do
Inglês discontinuous current clamping). Quando as duas medidas eram desiguais, procedia-se o
balanceamento da ponte do circuito a fim de igualar as duas medidas, tomando este valor como o
correto para a resistência de entrada da membrana. Neste trabalho, as células somente foram
consideradas nas estatísticas se apresentassem resistência igual ou superior a 40 MΩ (Fig. 33B).
Os valores do limiar de corrente para ativação da célula situaram-se normalmente entre 0,04
e 0,18 nA (n = 21). A amplitude média dos potenciais de ação obtidos foi de 79,3 ± 0,1 mV (n = 89) e
o overshoot variou de 10,6 a 46,4 mV. Os valores médios destes e de outros parâmetros
eletrofisiológicos encontram-se distribuídos na tabela III.
Ações da histamina sobre as propriedades passivas e ativas dos neurônios e efeitos do OECN sobre as respostas dos neurônios à histamina
• Sobre o potencial de repouso e a resistência de entrada da membrana
A presença de histamina (10 µM) produziu alterações significativas em alguns parâmetros
elétricos enquanto que outros não foram afetados. Por exemplo, em relação ao potencial de repouso,
o efeito da histamina foi examinado em 12 neurônios, dos quais 91,7 % (11 dos 12 neurônios)
responderam com uma despolarização significativa e reversível em 5 preparações. Nestas, o
98
potencial transmembrana passou de –56,6 ± 1,8 mV no controle, para –52,9 ± 2,0 mV na presença de
histamina (10 µM, p < 0,01, teste t pareado). A histamina não produziu nenhum efeito no potencial
transmembrana em 1 dos 12 neurônios. A amplitude média da despolarização foi 3,5 ± 0,7 mV
(variação de 1 a 9 mV) (Fig. 34A).
A histamina produziu um aumento significativo da resistência de entrada da membrana em
58,3 % das células (7 de 12) de 88,6 ± 11,4 MΩ no controle, para 108,6 ± 11,0 MΩ na presença de
10 µM de histamina (p < 0,001, teste t pareado, Fig. 35A). Em 16,7 % (2 de 12 neurônios) não houve
alteração e nos 25 % restantes (3 de 12) a histamina produziu diminuição da resistência (não
significativo, p > 0,05, teste t pareado).
Em outra série de experimentos, o OECN (200 µg/ml) foi adicionado previamente à histamina.
O potencial de repouso no período controle foi de – 52,4 ± 2,2 mV (n = 8) e não foi significativamente
alterado pela presença de OECN (Em= – 52,7 ± 2,4 mV, p > 0,05, ANOVA). A adição de histamina (10
µM) produziu uma despolarização significativa em 8 dos 9 neurônios considerados neste estudo (p <
0,05, ANOVA). A despolarização média foi de 4,5 ± 1,0 mV (1 a 9 mV) e o potencial de repouso ficou
em torno de – 48,2 ± 1,8 mV (Fig. 34B). Apenas em uma célula a histamina não produziu alteração no
potencial transmembrana.
Na resistência de entrada da membrana, o OECN não produziu alteração significativa (72,9 ±
10,2 MΩ e 78,6 ± 11,0 MΩ, no controle e na presença de 200 µg/ml de OECN, respectivamente). Na
presença de histamina (10 µM) e OECN, das 9 células estudadas, 7 apresentaram uma resistência de
membrana maior que no período controle (72,9 ± 10,2 MΩ vs 101,4 ± 16,2 MΩ, p < 0,05, teste de
Dunnett), 1 não sofreu alteração e em 1 a histamina produziu diminuição da resistência (Fig. 35B).
As propriedades elétricas dos neurônios do gânglio celíaco que foram alteradas pela histamina
quais sejam: despolarização do potencial transmembrana, aumento da resistência de entrada,
diminuição do limiar de corrente para excitação celular e o aumento do número de potenciais de ação
em pulsos de corrente correspondentes ao dobro do limiar, foram significativamente alteradas pela
99
prévia exposição da preparação a 1 µM de pirilamina, um antagonista dos receptores H1 para a
histamina, bloqueando as alterações induzidas por esse autacóide (Tabela IV).
• Sobre o limiar de corrente para ativação neuronal
A histamina produziu uma diminuição no limiar de corrente em 91,7 % (11 de 12) nos
neurônios estudados, sendo ineficaz em apenas 1 neurônio. O limiar de corrente no período controle
foi de 105,4 ± 11,1 pA e na presença de 10 µM de histamina foi significativamente diminuído para 67,3
± 8,2 pA (n = 11, p < 0,001, teste t pareado). A redução média foi da ordem de 38,2 ± 6,3 pA (Fig.
36A).
No grupo de células em que o OECN fora adicionado antes da histamina, o limiar de corrente
despolarizante para a ativação neuronal foi, no período controle, de 120,0 ± 13,3 pA (n = 9) e este não
foi alterado nem pela solução de 200 µg/ml de OECN, nem pela solução de OECN + histamina (10
µM). Na primeira, o limiar de corrente correspondeu a 128,9 ± 14,6 pA (n = 9), enquanto que na
segunda, foi de 106,7 ± 17,9 pA (n = 9), não diferindo significativamente do período controle em
nenhuma das duas situações (p > 0,05, ANOVA, Fig. 36B).
• Sobre o overshoot e a amplitude dos potenciais de ação
No período em que a histamina esteve presente em solução, o overshoot dos potenciais de
ação foi 23,7 ± 1,1 mV (variação de 13,4 a 44,9, n = 53), não sendo estatisticamente diferente (p >
0,05, teste t pareado) do período controle (23,7 ± 1,2 mV, variação de 10,6 a 46,4) (Fig. 37A).
Naqueles experimentos com a adição prévia de OECN o overshoot foi de 24,9 ± 1,7 mV (n = 22) no
período controle. Nem com OECN 200 µg/ml nem com OECN + histamina houve alteração
significativa dos valores do overshoot que corresponderam a 22,6 ± 1,3 e 22,4 ± 1,2 mV,
respectivamente (p > 0, 05, ANOVA) (Fig. 37B).
Com relação à amplitude dos potenciais de ação, no período controle, o valor médio
correspondeu a 79,3 ± 1,1 mV (n = 60). A adição de histamina ao meio produziu uma redução
100
significativa da amplitude para 75,9 ± 1,0 mV (p < 0,001, teste t pareado) (Fig. 38A). Nos
experimentos com OECN as amplitudes médias foram 76,7 ± 1,9, 74,1 ± 1,9 e 68,4 ± 1,8 mV (n =
30), para as situações controle, com OECN 200 µg/ml e OECN 200 + histamina (10 µM) (Fig. 38B).
Comparando estes valores, somente o último foi estatisticamente diferente do controle (p < 0,01, teste
de Dunnett).
• Sobre a duração dos potenciais de ação
A duração média dos potenciais de ação dos neurônios que foram testados apenas com
histamina foi 3,8 ± 0,1 ms no período controle e 3,9 ± 0,1 ms na presença de 10 µM de histamina (n =
60). Não houve diferença estatística entre estas duas situações (p > 0,05, teste t pareado) (Fig. 39A).
Para os experimentos com OECN, no período controle a duração média dos potenciais de ação foi 4,0
± 0,2 ms (n = 28), na presença de OECN foi 4,2 ± 0,2 ms e na presença de OECN + histamina 10 µM
foi 4,9 ± 0,4 ms, não havendo diferença significativa entre nenhum deles (p > 0,05, ANOVA) (Fig 39B).
• Sobre o número de potenciais de ação
O número de potenciais de ação foi apreciado de duas formas distintas. Em uma delas não
levamos em consideração o valor nominal do pulso de corrente, considerando apenas o número de
potenciais ocorridos nos pulsos correspondentes a 1 vez, 1,5 vezes e 2 vezes o valor do limiar de
corrente (Figs. 40 e 41). Neste caso, a presença da histamina provocou um aumento significativo do
número de potenciais de ação nos pulsos de 1,5 e 2 vezes acima do limiar para ativação do neurônio
(Fig 40A). Com pulsos correspondentes a 1,5 vezes o limiar, a célula respondeu com uma média de
1,4 ± 0,1 potenciais no controle e, na presença de histamina, este valor aumentou para 4,6 ± 1,2
potenciais (p < 0,05, teste t pareado) (Fig. 41A). No dobro do limiar, a célula passou de 2,6 ± 0,4
potenciais no controle, para 6,2 ± 1,2 potenciais (p < 0,01, teste t pareado). Na presença do OECN a
histamina não produziu os efeitos vistos no controle em relação ao número de potenciais de ação (Fig.
41B).
101
Na outra situação nós consideramos o número de potenciais de ação de acordo com o pulso
de corrente aplicado (variação em etapas de 20; faixa de variação: 20 a 200 pA), independente do
valor correspondente ao limiar ou seus múltiplos. Na comparação de todos os tratamentos entre si, o
perfil de alterações produzidos pela histamina diferiu dos demais, incluindo o período controle (p <
0,05, teste de Bonferroni). Por outro lado, o número de potenciais de ação ocorrido no controle não
diferiu estatisticamente dos períodos em que as células estavam em contato com o OECN 200 µg/ml
ou com OECN + histamina 10 µM (p > 0,05, teste de Bonferroni) (Fig 41C).
• Sobre a excitabilidade neuronal
Avaliamos a excitabilidade neuronal através das alterações sobre o limiar de corrente e da
latência para o surgimento do potencial de ação em função do estímulo despolarizante aplicado. Esta
última medida foi feita através da distância temporal (latência) entre o início do estímulo (tempo zero) e
o pico positivo do potencial de ação. Sob estes aspectos, aplicamos uma série de estímulos de
corrente desde sub- até supraliminares na ausência e presença de histamina, ou OECN, ou dos dois.
O número de pulsos despolarizantes crescentes necessários para alcançar o limiar de ativação celular
foi maior no controle do que na presença de 10 µM de histamina (Fig. 42B). Como vimos
anteriormente (Fig 36), no período controle, o estímulo mínimo para que fosse iniciado um potencial de
ação foi em média 112,4 ± 8,1 pA (n = 21, considerando todas as células usadas para avaliar o limiar
de corrente). Na presença de histamina 10 µM o estímulo inicial médio foi 73,3 ± 9,6 pA (n = 12). Na
presença do OECN e em meio com OECN + histamina (10 µM) foi de 134,0 ± 14,0 e 110,0 ± 16,4 pA
(n = 10). Quando comparados em relação ao controle, a única diferença significante foi a do período
em que a preparação ficou exposta apenas à histamina (p < 0,05, teste de Dunnett).
O tempo para se atingir o pico do potencial de ação para cada célula nos diferentes
tratamentos também foi avaliado. Por exemplo, para pulsos despolarizantes de 100 pA o pico do
potencial de ação foi atingido após 115,5 ± 6,5 ms (n = 10) a partir do início do estímulo no período
controle (Fig. 42A). Na presença de histamina, OECN (200 µg/ml) e OECN + histamina (10 µM), para
102
este mesmo pulso, os tempos para se atingir o pico foram de 96,2 ± 10,18, 119,6 ± 4,44 e 122,5 ±
7,28 ms, respectivamente. Com pulsos de 180 pA, o pico do potencial de ação aconteceu com 97,7 ±
6,7, 71,3 ± 2,4, 112,6 ± 7,1 e 96,8 ± 1,4 ms, para o período controle, na presença de histamina,
OECN e OECN + histamina, respectivamente (Fig. 43).
103
Fásica
Tônica
1x 2x1,5x
20 mV
400 ms
104
Número de observações
0 2 4 6 8 10
-40 -44
-45 -49
-50 -54
-55 -59
-60 -64
-65 -69
Potencial de m
embrana (m
V)
Número de observações
0 2 4 6 8
40-59
60-79
80-99
100-119
120-139
140-159
Resistência de m
embrana (M
Ω)
A
B
105
Pot
enci
al tr
ansm
embr
ana
(mV
)
-80
-60
-40
-20
0
Pot
enci
al tr
ansm
embr
ana
(mV
)
-80
-60
-40
-20
0
**
CONTROLE HA 10µM
*
CONTROLEOECN200
+HA 10µM
OECN200
N.S.
A
B
106
Res
istê
ncia
(M
Ω)
0
20
40
60
80
100
120
140
Res
istê
ncia
(M
Ω)
0
20
40
60
80
100
120
140
CONTROLE HA 10µM
CONTROLEOECN 200
+HA 10µM
OECN200
***
N.S.
*
A
B
107
A
B
Est
ímul
o (p
A)
0
40
80
120
160
CONTROLE HA 10µM
***
Est
ímul
o (p
A)
0
40
80
120
160
CONTROLE OECN200
OECN+
HA 10µM
108
Ove
rsho
ot (
mV
)
0
5
10
15
20
25
30
OECN200
OECN200+
HA10µMCONTROLE
Ove
rsho
ot (
mV
)
0
5
10
15
20
25
30
CONTROLE HA 10µM
A
B
109
Am
plitu
de (
mV
)
0
20
40
60
80
100
Am
plitu
de (
mV
)
0
20
40
60
80
100
CONTROLE HA 10µM
OECN200
CONTROLEOECN200
+HA 10µM
***
**N.S.
A
B
110
Dur
ação
(m
s)
0
1
2
3
4
5
6D
uraç
ão (
ms)
0
1
2
3
4
5
6
CONTROLE HA 10µM
OECN200
CONTROLEOECN200
+HA 10µM
A
B
111
20 mV
400 ms
-60 mV
CONTROLE
HA 10µM
1x 1,5x 2x
1x 1,5x 2x
20 mV
400 ms
-57 mV
CONTROLE
OECN 200
OECN 200 + HA 10 µM
A
B
112
Núm
ero
méd
io d
e P
A
0
2
4
6
8
1,5x 2x1x
CONTROLEOECN 200OECN200 + HA 10µM
Limiar de corrente
Estímulo (pA)
0 40 80 120 160 200
Núm
ero
méd
io d
e P
A
0
2
4
6CONTROLEHA 10 µM
HA 10 µM + OECN 200OECN 200
♣
A
B
C
Núm
ero
méd
io d
e P
A0
2
4
6
8
Limiar de corrente1,5x 2x1x
*
**HA 10 µMCONTROLE
113
Tempo (ms)
60 80 100 120
20
406080
100120140160180200
20
406080
100120140160180200
Est
ímul
o (p
A)
CONTROLE
HA 10 µM
Estímulo (pA)
80 120 160 200
Latê
ncia
(m
s)
60
80
100
120
140CONTROLE
HA 10 µM
*
A
B
114
CONTROLE
OECN 200
Tempo (ms)
60 80 100 120 140 160
Est
ímul
o (p
A)
OECN 200+
HA 10 µM
20406080
100120140160180200
20406080
100120140160180200
20406080
100120140160180200
Estímulo (pA)
80 120 160 200
Latê
ncia
(m
s)
60
80
100
120
140
160CONTROLE
OECN 200 + HA 10OECN 200
A
B
115
DISCUSSÃO
Efeitos no músculo liso traqueal
Este estudo demonstra que o OECN (0,1-1000µg/ml) induz efeitos relaxantes no
músculo liso da traquéia de cobaio in vitro, com uma CE50 de 4,3µg/ml e uma amplitude máxima de
relaxamento semelhante à produzida pela aminofilina, uma metilxantina inibidora de fosfodiesterase
largamente usada como relaxante do músculo liso respiratório (Brackett et al., 1990). Esses
resultados demonstram coerência entre os efeitos induzidos pelo OECN em músculo respiratório com
aqueles previamente descritos em intestino (Magalhães et al., 1998) e artérias (vide abaixo e em
Lahlou et al., 2000).
O efeito miorelaxante intestinal foi, em certas doses, associado com aumento do
trânsito intestinal (Magalhães et al., 1998). O OECN também demonstrou ter efeito hipotensor (Lahlou
et al., 2000). Portanto, o OECN tem demonstrado possuir múltiplos efeitos no intestino, sistemas
circulatório e respiratório que podem conceitualmente ser vantajosos em algumas circunstâncias,
como em patologias compostas nas quais são requeridos agentes broncodilatadores, procinéticos
intestinais ou antihipertensivos. A atividade miorelaxante foi mais potente no músculo liso respiratório
e intestinal (Magalhães et al., 1998) do que no músculo liso circulatório (Lahlou et al., 2000). Serão
necessários estudos adicionais para determinar se essas diferentes potências in vitro também irão
ocorrer in vivo e se o OECN será eficaz em baixas doses como visto em órgão isolados. O óleo
essencial do Croton zehntneri tem demonstrado potências in vitro semelhantes para relaxamento de
músculos lisos.
O modelo do cobaio sensibilzado à ovalbumina aproxima-se da broncoconstrição
induzida por alérgenos em humanos (Wills-Karp e Gilmour, 1993). Os resultados apresentados no
presente trabalho demonstram sensibilização ativa e específica via injeções intraperitoneais de
ovalbumina, visto que nem a ovalbumina em temperatura ambiente nem soroalbumina bovina a 37ºC
produziram respostas contráteis no músculo liso traqueal dos animais tratados. Além disso, sob
desafio antigênico específico, o antígeno liga-se à IgE ligada aos mastócitos, promovendo a liberação
116
de mediadores como histamina, leucotrienos e prostaglandinas que promovem contração do músculo
liso respiratório (Iwagoe et al., 1996). Neste estudo, nós presumimos que tenha havido uma
degranulação de mastócitos apreciável visto que uma exposição subseqüente ao antígeno não foi
capaz de produzir contrações adicionais.
A contração induzida pelo estímulo antigênico foi reduzida pelo cromoglicato de
sódio, um inibidor da degranulação de mastócitos (Horan et al., 1990) para 135 % da resposta
controle. Entretanto, uma segunda exposição do tecido à ovalbumina na ausência do cromoglicato
produziu uma segunda contração induzida por antígeno em aproximadamente 45% dos experimentos.
Esse resultado serve para ilustrar a eficácia do cromoglicato em prevenir a degranulação de
mastócitos e a conseqüente liberação de autacóides. OECN (300 e 600µg/ml) inibiu parcial, mas
significativamente, a contração da traquéia induzida pelo antígeno. Após a lavagem da preparação
com solução fisiológica para remover tanto o óleo como a ovalbumina, um segundo estímulo
antigênico não foi capaz de induzir contração do músculo liso traqueal. Portanto, parece improvável
que o efeito do OECN seja indireto, devido a uma inibição da liberação de mediadores pelos
mastócitos. Além disso, na presença de OECN, foram necessárias maiores concentrações de
histamina para se alcançar uma dada intensidade de contração e a tensão máxima foi diminuída. Isso
indica que a inibição da contração induzida pela ovalbumina ocorreu após a liberação dos mediadores.
Vale ressaltar que os efeitos do OECN em músculo liso traqueal isolado diferiram
daqueles vistos em músculo liso intestinal. Neste tecido, o OECN também teve um efeito relaxante e
uma ação inibitória sobre as contrações induzidas por K+. Entretanto, existiu uma proximidade entre
as CE50s para relaxamento do tônus basal e para o bloqueio da contratura potássica em íleo, as quais
foram semelhantes em magnitude (15,7 ± 4,3 e 18,2 ± 2,3 µg/ml, respectivamente). Neste estudo,
estes valores diferiram significativamente (4,3 ± 0,78 e 123,9 ± 15,7 µg/ml, respectivamente), o que
sugere que, pelo menos no músculo liso traqueal, diferentes mecanismos modulam o relaxamento do
tônus basal e tônus aumentado por alto K+. Além disso, em comparação com a resposta controle
induzida por 60 mM de K+, a amplitude do relaxamento traqueal foi maior que aquele observado no
117
músculo liso intestinal (200,7 ± 25,62 versus 34,3 ± 5,5 % da contração induzida por 60 mM de K+,
respectivamente (Magalhães et al., 1998)).
O presente trabalho confirma que a histamina é uma das grandes responsáveis
pela contração do músculo liso traqueal induzida pela ovalbumina, visto que a pirilamina, um
antagonista de receptores H1 para histamina (Chen et al., 1998), reduziu um pouco mais de 50% da
resposta contrátil pelo estímulo antigênico. Este também é um indício de que a contração induzida
pelo antígeno é mediada pela liberação de outras substâncias (e.g. leucotrienos e prostaglandinas)
(Mitchell et al., 1993; Iwagoe et al., 1996). Esta conclusão é possível porque: 1) a concentração de
pirilamina utilizada (5 µM) é suficiente para bloquear totalmente a contração do músculo liso traqueal
induzida pela histamina em concentração maximal aplicada exogenamente e, 2) OECN nas
concentrações de 300 e 600 µg/ml diminuiu a resposta contrátil induzida pela histamina para valores
correspondentes a aproximadamente 10 e 2 % da contração controle, enquanto que a contração
induzida pela ovalbumina foi reduzida apenas para valores próximos a 82 e 35 % da contração
induzida por 60mM de K+, respectivamente. Tornam-se razoáveis também as hipóteses de que ou a
contração induzida pela apresentação do antígeno é resultante de uma potencialização de seus
mediadores, o que torna a resposta contrátil maior ou mais potente que a de seus componentes
isolados ou, por outro lado, que deva existir dentre estes mediadores, alguns cuja resposta do músculo
liso traqueal não seja tão potentemente inibida pela presença do OECN como a contração induzida
pela histamina.
A PGF2α é uma das substâncias que podem ser liberadas após a estimulação
antigênica (Leal-Cardoso, 1993; Albuquerque, 1996 e 1997). Em comparação com a histamina, o
OECN apresentou um efeito distinto em relação àquele produzido sobre as ações da PGF2α. Na
concentração de 200 µg/ml, que na maior parte dos tecidos inibe praticamente todas as contrações, o
OECN reduziu a contração induzida apenas por pequenas concentrações de PGF2α não interferindo
com a resposta máxima do tecido ao prostanóide. Com 100 µg/ml, já havia reduzido a resposta
118
máxima da histamina. Isto demonstra que o OECN possui uma certa especificidade de efeito que
requer maiores estudos.
É improvável também uma inibição competitiva direta do receptor da histamina no
músculo liso traqueal pela presença do OECN visto que um grande aumento na concentração
exógena de histamina não foi capaz de reverter o bloqueio promovido pelo óleo. Além disso, para
agonistas diferentes como histamina, carbacol e K+, não ocorreu diferença significante entre os valores
de CI50 para inibição das contrações induzidas por agonistas, indicando uma ação inespecífica em
relação a receptores de neurotransmissores ou autacóides. Do mesmo modo, OECN relaxou
preparações pré-contraídas pela manutenção de alta concentração de K+. Isto elimina um mecanismo
de ação indireto (via liberação de mediadores dos terminais nervosos, visto que os nervos estão
despolarizados e, nesta situação, inativados (Quast, 1993)). Estes dados também estão de acordo
com aqueles previamente encontrados para o íleo de cobaio onde o efeito relaxante do OECN não foi
alterado pela presença da tetrodotoxina, um conhecido bloqueador de canais de sódio (Magalhães,
1997). Por outro lado, o relaxamento de preparações contraídas com 60mM de K+, também elimina a
possibilidade de o OECN atuar por promover uma hiperpolarização da diferença de potencial elétrico
entre os lados intra e extracelular, por ativação de canais de K+ e conseqüente efluxo deste íon, visto
que, conceitualmente, o potencial transmembrana, nesta situação, aproxima-se bastante do potencial
de equilíbrio para o K+ (Quast, 1993), previsto pela equação de Nernst. Através das medidas do
potencial transmembrana, pode-se comprovar que a presença do OECN não é capaz de produzir
despolarização ou hiperpolarização, tanto no íleo (dados não mostrados) como na traquéia ou na aorta
de cobaio (vide adiante), mantidos em solução normal e despolarizante, o que comprova a nossa
hipótese.
Em conclusão, OECN é caracterizado como um relaxante de músculo liso,
corroborando estudos anteriores e o uso do Croton nepetaefolius como um antiespasmódico na
medicina popular. Provavelmente o OECN atue como um antiespasmódico através do antagonismo de
Ca2+, ou seja, inibição de mobilização de Ca2+ operada por receptor, bloqueio da liberação de Ca2+ de
119
organelas citoplasmáticas e/ou diminuição da sensibilidade das proteínas contráteis à concentração de
Ca2+ intracelular.
Efeitos no músculo liso vascular
Os resultados do OECN sobre o sistema circulatório e sobre preparações isoladas
de vasos demonstram que este óleo essencial causa uma diminuição da PAM em ratos anestesiados
(sem alterações agudas significativas em alguns parâmetros sangüíneos relacionados com o equilíbrio
ácido-básico e transporte de gases respiratórios), provavelmente como uma conseqüência dos efeitos
relaxantes sobre o músculo liso vascular, pois, em aorta pré-contraída e na circulação mesentérica de
rato perfundida com solução de K+ 60 mM, o OECN produziu um efeito relaxante de maneira
dependente de concentração.
A diminuição da PAM foi significativa a partir da dose de 10 mg/Kg, enquanto que a
bradicardia produzida pelo OECN foi estatisticamente significante apenas nas doses de 20 e 50 mg/Kg
para os animais uninefrectomizados e apenas na dose de 50 mg/Kg nos animais DOCA-sal. Portanto,
a diminuição da PAM deve ser mediada primariamente por um efeito vasodilatador que se segue por
um cronotropismo e talvez por um inotropismo negativo. A eficácia do OECN parece estar relacionada
com o nível pressórico do animal tanto in vivo como in vitro, visto que o óleo produziu maior
hipotensão em animais DOCA-sal do que nos animais uninefrectomizados. Esta mesma diferença
também foi visualizada para o bloqueio das contrações induzidas pela fenilefrina na aorta isolada
destes animais. Estes dados confirmam observações obtidas em estudos anteriores nos quais o
OECN apresentou efeitos relaxantes e antiespasmódicos em músculo liso, bem como uma atividade
anti-hipertensiva em ratos, com um componente de sua ação mediada por um efeito vasodilatador
(Magalhães et al, 1998; Lahlou et al, 1999 e 2000) e requerem maiores estudos para elucidar estas
diferenças em sua eficácia.
Em comum com estes trabalhos, aqui os efeitos inibitórios e relaxantes do OECN
foram dependentes de concentração e totalmente reversíveis com a lavagem da preparação e,
120
portanto, não indicam uma depressão inespecífica da função contrátil do músculo liso, mas sugerem
ações mais específicas. Neste aspecto em particular, chamam a nossa atenção os diferentes efeitos
encontrados para o OECN em aorta isolada de ratos e cobaios. Em aorta de rato a CE50 para o
relaxamento da contratura K+ foi significativamente menor do que a encontrada para a aorta de cobaio
(32 vs. 200 µg/ml, p < 0,001, teste t não pareado), assim como o efeito relaxante do OECN foi
parcialmente reduzido pela presença do L-NAME, um inibidor da liberação de NO pelas células
endoteliais (Rees et al., 1990; Arnal et al., 1999) e pela retirada do endotélio vascular. Na aorta de
cobaio, a adição de L-NAME e a retirada do endotélio não produziram efeitos significativos na resposta
do OECN em relação aos experimentos controle. Estas dados são um forte indício de que existe uma
certa especificidade no mecanismo de ação do OECN e que, pelo menos na aorta de rato, a liberação
de NO pelo endotélio vascular é fator importante para o efeito relaxante do óleo.
Esta observação foi confirmada nos experimentos realizados com a perfusão da
circulação mesentérica de ratos onde o OECN aumentou significativamente o fluxo de líquido pelo leito
mesentérico perfundido ex vivo com solução despolarizante contendo 60 mM de K+. Da mesma forma
que na aorta isolada, a presença de L-NAME produziu uma inibição parcial do efeito relaxante do
OECN sobre a circulação mesentérica. A presença do D-NAME, um isômero inativo do L-NAME
(Ward et al., 1993), não alterou a resposta vasodilatadora do OECN. Estes efeitos foram apenas
parciais porque a ação relaxante do OECN não foi totalmente abolida. Em concentrações mais altas
(>100 µg/ml), tanto em aorta como na circulação mesentérica, houve reversão da contração e da
diminuição do fluxo mesentérico, respectivamente, pelo OECN, independente da ausência ou
presença do L-NAME e da retirada do endotélio nos tecidos in vitro. Já nas concentrações mais
baixas (1 a 100 µg/ml) a retirada do endotélio ou a adição inibidor da NO sintase diminuiu ou, pelo
menos retardou, o aparecimento do efeito relaxante promovido pelo OECN. Isto sugere que, em ratos,
o OECN apresenta um mecanismo para o relaxamento do músculo liso vascular que é parcialmente
dependente da liberação de NO endotelial.
121
Fica evidenciado também que o efeito vasodilatador do OECN pode ser explicado
pela ação conjunta de seus constituintes visto que a utilização isolada de alguns deles (1,8-cineol,
metil-eugenol e terpineol), tanto em aorta como em leito mesentérico, produziu os mesmos efeitos do
óleo essencial, embora com diferentes características, sendo o metil-eugenol o mais potente deles,
seguido de perto pelo terpineol (suas CE50s não diferiram entre si, p > 0,05, teste student-Neuman-
Keuls) e o 1,8-cineol como o menos potente. Estas observações são possíveis porque seguiram o
mesmo padrão observado para estas substâncias em íleo de cobaio (Magalhães et al., 1998). Nesta
preparação o metil-eugenol, terpineol e 1,8-cineol apresentaram CI50s para inibição da contratura K+
correspondentes a 12, 95 e 418 µg/ml, respectivamente. No presente trabalho estas substâncias
apresentaram valores de 18, 41 e 168 µg/ml.
A inibição do efeito relaxante do OECN também ficou evidenciada pelo uso do azul
de metileno, um inibidor da ativação da enzima guanilato ciclase (Katsuki et al., 1977; Rapoport e
Murad, 1983). De modo semelhante ao ocorrido com a utilização do L-NAME, a redução do efeito foi
mais evidente em baixas concentrações (10 e 100 µg/ml) do que em concentrações mais altas (200
µg/ml) sugerindo mais uma vez que o OECN pode atuar em diferentes locais ou etapas da cascata de
eventos que levam à contração muscular. A seguir explicitaremos outras evidências que nos levam a
esta conclusão.
Primeiramente, da mesma forma como visto no músculo liso traqueal e,
adicionalmente também observado em células nervosas do gânglio celíaco, o efeito relaxante do
OECN não parece ser proveniente de hiperpolarização por abertura de canais iônicos da membrana
com conseqüentes alterações do potencial eletroquímico, visto que não houve alteração do potencial
transmembrana nem na aorta e em vasos mesentéricos, bem como em traquéia ou neurônios
simpáticos. Outro fato que nos leva a descartar este mecanismo, como já foi discutido anteriormente
(vide seção de músculo liso traqueal), é a capacidade que tem o OECN em relaxar preparações pré-
contraídas com solução despolarizante.
122
De modo interessante, o OECN reduziu a força máxima induzida pelo éster do
forbol e relaxou a contração do dibutirato de forbol (1 µM) em aorta de cobaio mantida em solução
com baixo teor de Ca2+. Existe uma série de evidências disponíveis na literatura que sugerem que o
alvo celular para os ésteres de forbol é a proteína quinase C, o que produz aumento da sensibilidade
dos elementos contráteis ao Ca2+ (Drummond e Hughes, 1987; Somlyo e Somlyo, 1994 e 2000). Além
disso, a contração induzida pelo dibutirato de forbol é independente da liberação de Ca2+ dos estoques
internos (Orton et al., 1990; Savineau et al., 1991) e em nosso estudo ocorreu em uma condição onde
a concentração extracelular de Ca2+ foi mantida muito baixa (~10-9 M) pela utilização de uma solução
contendo 2 mM de EGTA, um conhecido quelante de Ca2+, o que sugere também ser uma contração
independente do influxo de Ca2+ do meio externo. A possibilidade de que o relaxamento da contração
mantida pelo éster do forbol seja devido a um declínio natural da preparação é improvável visto que a
comparação do curso temporal da resposta contrátil ao dibutirato de forbol na ausência e presença do
OECN mostrou-se estatisticamente significante na comparação em todos os tempos arrolados.
Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado que a adição hiperosmolar de
KCl causa contração independente de Ca2+ na aorta de cobaio e de ratos, a qual é mediada, pelo
menos parcialmente, pela ativação de proteína quinase C (Low et al., 1994). Por outro lado, Ausina et
al. (1996) demonstraram que as respostas contráteis evocadas por KCl hiperosmótico no útero de
ratas não é mediada pela ativação da proteína quinase C, mas envolve a ativação de uma proteína
quinase sensível a estaurosporina. Os resultados aqui apresentados demonstram que, em solução
sem Ca2+ (com 2mM de EGTA), o K+ hiperosmolar promove uma pequena contração quando
comparada à contração controle produzida por solução isosmótica de 60mM de K+ (com 2 mM de
Ca2+). Em útero de ratas, uma diminuição do volume celular como conseqüência de um estresse
hiperosmótico não explicaria o desenvolvimento desta contração visto que soluções hiperosmóticas de
glicose produziram contrações significativamente menores.
Em nosso estudo, o OECN produziu uma inibição da contração induzida por
300mM de K+ em aorta de cobaio e relaxou as contrações induzidas pelo dibutirato de forbol em
123
concentração extracelular de Ca2+ mantida baixa. Isto sugere que o OECN é capaz de diminuir uma
contração iniciada intracelularmente, visto que existe uma hipótese bem estabelecida de que os
ésteres de forbol penetram facilmente as células musculares lisas, ligam-se e ativam a proteína
quinase C (Kikkawa et al., 1983). Portanto, de acordo com a literatura, essas duas condições iniciais
representam uma presumível resposta da ativação da proteína quinase C. Por outro lado, na
contração não influenciada pela proteína quinase C (por exemplo, contração induzida pelo K+
hiperosmótico em útero de ratas) o OECN não produziu efeito.
A proteína quinase C tem assumido uma posição de importância nos modelos
atuais de sinalização intracelular e, por isso, tem sido objeto de muitas pesquisas (Singer, 1996). Há
um consenso atualmente que a proteína quinase C é, na realidade, uma grande família de proteínas
quinases relacionadas. Algumas proteínas quinases (incluindo a PKC) fosforilam diferentes resíduos
de serina localizados no domínio regulatório da NO sintase constitutiva (Murthy et al., 1994). Significa
dizer que agentes que estimulam a hidrólise de fosfoinositídeos podem exercer efeitos opostos na
atividade da NO sintase. Por outro lado, contrações de artéria pulmonar de rato mediadas pela
proteína quinase C podem ser inibidas por outros compostos que aumentam o conteúdo intracelular de
nucleotídeos cíclicos (Savineau, et al., 1993). Não é difícil encontrar na literatura relatos de
substâncias extraídas de plantas como flavonóides e antraquinonas que apresentam a propriedade de
inibir proteína quinase C (Larkin et al., 1993). Estas relações demonstram que é possível que o OECN
atue por um mecanismo comum e específico sobre as contrações nas quais a cascata inclui a ativação
de atividade enzimática de nucleotídeos cíclicos e alguma isoforma de proteína quinase que pode ser
a proteína quinase C.
Estudos eletrofisiológicos
A dissecção dos tecidos abdominais para obtenção do gânglio celíaco, utilizando
os métodos descritos anteriormente, consistiu em uma das tarefas mais exigentes desta tese, pelas
características peculiares da região que apresenta bastante tecido adiposo, inúmeras estruturas de
124
dimensões reduzidas e consistência muito semelhante à dos tecidos nervosos. Entretanto, tanto
morfológica quanto funcionalmente, as características das estruturas encontradas e das células
registradas neste estudo corroboram a descrição feita por vários autores encontrados na literatura
especializada.
A forma, disposição, localização e as conexões dos gânglios pré-vertebrais
utilizados neste estudo estão de acordo com os relatos feitos por Kreulen e Szurszewski (1979a),
sendo o gânglio celíaco encontrado em uma posição ventral à aorta abdominal logo abaixo da artéria
celíaca. Na maior parte das vezes, o gânglio encontrava-se dividido em dois grandes lobos (um direito
e um esquerdo) unidos por uma comissura central de espessura variável em cada animal, chegando
em alguns casos a ter uma espessura semelhante à dos lobos principais, aparentando ser uma massa
única de tecido, enquanto que em outros, a conexão entre ambos tornava-se mais tênue.
Quanto às características funcionais, os neurônios arrolados neste estudo foram
classificados em células fásicas e tônicas, de acordo com suas características de disparo de
potenciais de ação durante uma despolarização mantida conforme classificação anterior (Weems e
Szurszewski 1978; Kreulen e Szurszewski 1979a; Cassel et al. 1986;). As primeiras responderam com
a geração de potenciais de ação apenas no início do pulso despolarizante e permaneceram
quiescentes no decorrer do estímulo. As segundas responderam com a geração de potenciais de
ação durante todo o pulso de corrente. A ocorrência de células consideradas como fásicas neste
estudo foi de 91% enquanto que as células tônicas corresponderam a somente 9%. A frequência de
registros eletrofisiológicos entre células fásicas e tônicas apresenta grande variabilidade na literatura.
Por exemplo, Ma e Wu (1988) descreveram 75 % dos neurônios registrados em suas preparações
como tônicos e os 25% restantes como fásicos. Os resultados encontrados por Kreulen e Szurszewski
(1979a) sugerem que há uma proporção de 52 % para as fásicas e 48 % para as tônicas em gânglio
celíaco de cobaio. Em ratos, 58% dos neurônios do gânglio celíaco foram tônicos e 42 % foram
classificados como fásicos (Wang e McKinnon, 1995). Por outro lado, Cassel e McLachlan
encontraram uma distribuição de mais de 75 % de neurônios impalados nos lobos proximal e mediano
125
disparando fasicamente. Dector e Weems (1983) descreveram em gânglio celíaco de gatos uma
proporção de 63 % de neurônios fásicos e 32 % de neurônios tônicos. Recentemente, além destas
duas classes de neurônios, foram classificadas as células do tipo pós-hiperpolrização lenta (PHPL).
São células que após poucos potenciais de ação iniciais apresentam uma hiperpolarização que dura
vários segundos e inibe a geração de outros potenciais de ação (Christian e Weinreich, 1988; Cassel
e McLachlan, 1987). Entretanto, não consideramos em nossos registros este terceiro tipo de célula
visto que, em resposta a um estímulo supra-liminar de corrente constante de longa duração (e. g.,
1000 ms), as células PHPL respondem de maneira semelhante aos neurônios fásicos.
As propriedades elétricas das células deste estudo como as medidas de potencial
de repouso e resistência de membrana, estão situadas em uma faixa próxima aos valores descritos
por diversos autores em outras preparações de gânglio celíaco e de neurônios de outros gânglios pré-
vertebrais de cobaios ou outros mamíferos, conforme demonstrado na tabela III. A comparação com
valores controle já publicados anteriormente nos serve de confirmação das condições experimentais e
integridade fisiológica dos neurônios relacionados no presente trabalho, limitando possíveis
interferências danosas nas características do potencial de ação quando as células encontram-se com
diferenças de potencial situadas em uma faixa mais distante entre –50 e –80 mV.
As ações farmacológicas de óleos essenciais sobre determinadas funções
nervosas vem sendo estudadas com maior frequência nas últimas quatro décadas. A condução do
potencial de ação em nervo frênico, por exemplo, é bloqueada pelo eugenol, substância encontrada
comumente em óleos essenciais de diversas plantas. Também foram descritas ações depressoras do
sistema nervoso central para o eugenol e seus análogos químicos (Ozeki, 1975; Dallmeier e Carlini,
1981; Brodin e Roed, 1984). Substâncias semelhantes também encontradas em essências naturais
como o estragol e anetol têm descritas atividades depressoras do sistema nervoso central (Le Bourhis,
1968; Le Bourhis e Soenen, 1973). Recentemente foram descritas atividades de óleos essenciais
sobre a participação autonômica no controle do fluxo sanguíneo na pele (Saeki, 2000). Apesar disso,
pouco se sabe ainda sobre as ações farmacológicas desses óleos essenciais no funcionamento de
126
neurônios. Este estudo focalizou as ações do OECN sobre os efeitos da histamina em neurônios
fásicos encontrados no gânglio celíaco de cobaio.
Há muito se sabe que a histamina é encontrada no sistema nervoso autônomo de
mamíferos (Kwiatkowski, 1943). Em ratos, há a demonstração de que a histamina está presente em
fibras nervosas e neurônios motores, sensoriais e autonômicos ainda na fase embrionária (Häppölä et
al., 1991). O papel fisiológico e as quantidades liberadas nas proximidades dos receptores
histaminérgicos têm sido objeto de estudos nos últimos anos (Lindl, 1983; Nemeth et al., 1984; Snow e
Weinreich, 1987; Weinreich e Undem, 1987; Christian et al., 1989; Leal-Cardoso, 1993; Albuquerque et
al, 1997). Nos gânglios autonômicos, o principal local de armazenamento de histamina são os
mastócitos (Weinreich, 1985), transparecendo desta forma uma das mais importantes vias de
sinalização entre o sistema nervoso e sistema imunológico. Em determinadas circunstâncias, a
ativação dos mastócitos por mecanismos específicos pode levar à liberação de muitos mediadores,
entre eles a histamina, e consequentemente às alterações na excitabilidade neuronal e eficácia
sináptica através da ativação de subtipos de receptores histaminérgicos (Christian et al., 1989;
Weinreich et al, 1992; Leal-Cardoso, 1993; Frieling et al., 1994a e b).
Os efeitos da aplicação da histamina sobre as propriedades elétricas analisadas
estão de acordo com o que tradicionalmente se conhece. Em mais de 90 % das células consideradas
neste estudo, a histamina produziu despolarização do potencial transmembrana, aproximando-o do
limiar de ativação neuronal. A despolarização média de aproximadamente 4mV produzida por
histamina (10 µM) pode ser considerada semelhante àquela encontrada por Christian et al. (1989) e
Haas (1984) em gânglio cervical superior e neurônios hipocampais, respectivamente, embora tenha
sido menor que a despolarização de aproximadamente 10 mV descrita por Jafri et al. (1997) em
neurônios aferentes vagais de furão.
Em mais de 54 % destas células a despolarização provocada pela histamina, foi
acompanhada por um aumento na resistência de entrada, provavelmente como um reflexo da
diminuição da condutância de membrana. Existem evidências de que a despolarização induzida pela
127
histamina pode ser produzida por bloqueio de várias correntes iônicas, incluindo a de uma
subpopulação de canais de K+ que estão normalmente abertos quando a célula encontra-se em
valores próximos ao seu potencial de repouso. Esta corrente seria designada como IK(rest) (Jafri et al.,
1997) e tem sido demonstrada em diversas preparações de neurônios periféricos (Higashi et al., 1982
Christian et al., 1989; Leal-Cardoso et al., 1993) e centrais (McCormick e Williamson, 1991; Munakata
e Akaike, 1994). Sabe-se também que a histamina pode produzir inibição de condutância ao K+
dependentes de Ca2+ (Haas, 1984). Por outro lado, algumas células não apresentaram qualquer
alteração ou tiveram diminuição da resistência de entrada da membrana. Nestes casos, há a
possibilidade de a histamina produzir interferência em dois ou mais mecanismos iônicos distintos,
alterando a condutância destas correntes, que se somariam para determinar o efeito final da histamina
nesta célula. Há ainda a possibilidade da histamina atuar em canais iônicos cuja faixa de atuação não
inclui o potencial de repouso e valores mais negativos, como o canal M de K+ (Adams e Brown, 1982).
Não é surpresa, portanto, que uma única substância neuroativa afete condutâncias iônicas múltiplas
em neurônios ganglionares conforme descrito em preparações simpáticas de anfíbios (Tsuji et al.,
1987) e de mamíferos (Minota et al., 1981).
A presença do OECN não produziu alterações per si sobre as propriedades
elétricas da membrana neuronal. Não houve alteração do potencial de repouso (–52,4 ± 2,18
versus –52,7 ± 2,38 mV no controle e na presença do OECN, respectivamente) e da resistência de
entrada da membrana (72,9 ± 10,17 versus 78,6 ± 11,00 MΩ, no controle e na presença de OECN,
respectivamente). Do mesmo modo, o OECN não impediu a despolarização e o aumento da
resistência da membrana provocado pela adição de histamina ao meio. A despolarização média
produzida pela histamina foi algo em torno de 4 mV tanto nos experimentos sem OECN como
naqueles em que houve a adição do óleo. Se as alterações produzidas pela histamina sobre estes
parâmetros são devidas a sua interferência na condutância da membrana principalmente aos íons K+,
é aceitável supor que o OECN não interfere em correntes de K+ nesses neurônios, exceto para a
corrente M de K+, cuja faixa de ativação se situa entre –55 e –30 mV. Estes dados estão de acordo
128
com outras evidências que demonstram ser as ações do OECN independentes da abertura de canais
de K+ da membrana.
Como visto anteriormente nos experimentos com preparações de músculo liso
respiratório e vascular, o OECN é capaz de relaxar uma contração induzida por alta concentração de
K+. É improvável ocorrer uma hiperpolarização do potencial da membrana (e isso foi demonstrado
pelos experimentos eletrofisiológicos em músculo liso), pois um aumento da [K+] para valores acima de
40 mM aumenta a condutância ao K+ e, nesta situação, o potencial transmembrana tem valores
próximos do potencial de equilíbrio para o K+ de acordo com a equação de Nernst (Quast, 1993).
Além disso, as medidas do potencial transmembrana em 60 e 80 mM de [K+], assumem valores muito
próximos ao previsto pela equação de Nernst e muito positivos (–20 a –15 mV) quando as
preparações de músculo liso ou neurônios entraram em contato ou não com o OECN, o que reforça
esta hipótese.
Outra observação interessante é a de que as alterações produzidas tanto pela
histamina como pelo OECN parecem ser restritas a mudanças na excitabilidade neuronal sem alterar
as características básicas do potencial de ação. Para demonstrar isto, faremos algumas
considerações: primeiro, no presente estudo, as características básicas dos potenciais de ação como
a duração, a amplitude e o overshoot estão dentro da faixa normalmente demonstrada por outros
autores conforme demonstrado na tabela III. Segundo, a histamina produziu despolarização do
potencial transmembrana e não alterou a duração e o overshoot, embora tenha provocado uma
diminuição significativa da amplitude do potencial de ação. A presença do OECN também não
produziu alterações significativas em nenhum destes parâmetros, nem impediu a diminuição da
amplitude quando as células foram expostas à histamina. Terceiro, apesar de ter sido observada uma
diminuição significativa da amplitude (de 79,3 mV no controle para 75,9 mV na presença de
histamina), esta não parece refletir qualquer alteração nos mecanismos intrínsecos de geração do
potencial de ação, visto que corresponde a uma combinação entre a despolarização do potencial
transmembrana que foi de aproximadamente 3,5 mV e a não alteração do overshoot. Quarto, apesar
129
de não termos caracterizado de maneira irrefutável (apoiando-se em uma significância estatística), o
OECN apresentou, em alguns experimentos, uma tendência a aumentar o limiar de corrente para
excitação celular (v. traçado original na Fig. 40B – OECN 200), enquanto que a histamina claramente o
diminui (v. Figs. 36A e 40A – HA 10 µM). Esta hipótese é reforçada pelo número de potenciais de
ação ocorridos em pulsos 1x, 1,5x e 2x o limiar de corrente, na presença de histamina e OECN
isoladamente e em combinação (v. Fig. 41A e B). Nesses dados podemos observar que a histamina
isoladamente, aumentou conspicuamente a excitabilidade neuronal e o OECN bloqueou este aumento
da excitabilidade induzido pela histamina. Cabe ainda notar a tendência do OECN aplicado
isoladamente em reduzir a excitabilidade neuronal (Fig. 41B – 1x).
Além de diminuir o limiar de corrente, outro fator que sugere alteração da
excitabilidade neuronal são as variações da latência para o surgimento do potencial de ação. Na
presença de histamina, a despolarização e a diminuição na condutância poderiam estar relacionadas
com o aumento da excitabilidade neuronal por aproximar o potencial de repouso do limiar de ativação
da célula, aumentando a responsividade do neurônio a um pulso quadrado despolarizante. De acordo
com os nossos resultados, a intensidade de corrente despolarizante aplicada ao neurônio para a
geração de um potencial de ação é menor quando esta célula está na presença de histamina do que
na situação controle. Para um dado pulso de corrente, o tempo para se atingir o pico do potencial de
ação também é menor na presença de histamina do que na sua ausência. Entretanto, na presença do
OECN, o tempo de pico do potencial de ação quando foi adicionada a histamina não foi diminuído em
relação ao controle como aconteceu quando somente o autacóide estava presente, embora a
despolarização provocada pela histamina não tenha sido impedida pelo óleo. Com isso podemos
supor que é improvável que seja uma aproximação do potencial transmembrana do limiar de ativação
um fator determinante do aumento da excitabilidade neuronal. Adicionalmente, é razoável supor –se
que existam mecanismos distintos que determinam, de maneira independente, as alterações
produzidas pela histamina como a despolarização e o aumento na responsividade do neurônio, sendo
que o OECN atua em apenas um deles.
130
Tanto a apresentação de antígenos, a tecidos de animais previamente
sensibilizados, quanto a adição de histamina tendem a produzir alterações no padrão de disparos de
potenciais de ação de neurônios simpáticos de fásicos para tônicos (Frieling et al., 1994; Leal-
Cardoso, 1993). No presente trabalho, fica claro este efeito da histamina que tende a transformar uma
célula de padrão caracteristicamente fásico para um padrão tônico, aumentando o número de
potenciais de ação evocados desde o seu limiar de ativação até em relação a valores mais altos de
estímulos. Tudo leva a crer que, fisiologicamente, esta alteração de comportamento da célula seja de
extrema importância visto que pode refletir em um aumento do volume de informações transferidas
pelos neurônios ganglionares sem alterar as características funcionais do potencial de ação que se
relacionam ao seu disparo e a sua propagação.
O efeito da histamina acima descrito talvez tenha sido aquele sobre o qual foi mais
evidente a ação do OECN. Sob este aspecto, a presença de OECN tende a produzir uma diminuição
da excitabilidade celular quando o neurônio entra em contato com a histamina. Neste estudo realizado
em gânglio celíaco assim como em outros tecidos, os efeitos da histamina foram mediados pela
ativação de receptores H1 pois um de seus antagonistas clássicos, a pirilamina, inibiu praticamente
todas as suas alterações mensuradas neste trabalho. Por outro lado, a cimetidina, um antagonista de
receptores H2, teve pouca influência sobre estes mesmos parâmetros. Entretanto, pela diversidade de
substâncias encontradas na constituição química do OECN e por outras evidências descritas em
seções anteriores como as CI50s próximas em relação a vários agentes contraturantes não
acreditamos que este efeito do OECN se deva a uma competição com algum receptor histaminérgico e
sim que a ação do OECN aconteça em algum ponto da cadeia de eventos que ocorrem após a
ativação do receptor para histamina, talvez envolvendo receptores intracelulares desta cadeia.
Considerações finais
Este trabalho confirma que os óleos essenciais, obtidos de plantas do Nordeste
brasileiro, são produtos farmacologicamente ativos com uma variedade de efeitos com potencial
131
exploração na busca de norvos fármacos. Especificamente sobre o óleo essencial do Croton
nepetaefolius, contribui desde a possibilidade de oferecer um maior conhecimento dos efeitos desta
planta sobre o funcionamento básico do músculo liso traqueal e vascular e sobre a atividade elétrica
de neurônios constituintes do sistema nervoso simpático. Neste último caso, passa a ser um ponto de
partida para estudos futuros dos efeitos de óleos essenciais utilizando técnicas eletrofisiológicas,
principalmente sobre estruturas autonômicas (e provavelmente centrais também), um campo ainda
totalmente aberto e com muitas perspectivas.
A mistura de conceitos e sistemas fisiológicos neste estudo, indo de contratilidade
do músculo liso de diversos órgãos, passando por eventos puramente mediados pelo sistema
imunológico e chegando até o funcionamento de neurônios, poderia sugerir um grau de complexidade
do efeito do OECN maior do que realmente o é. Observe-se, contudo, que os dados aqui obtidos
apresentam um certo grau de homogeneidade em relação ao mecanismo apresentado nestas diversas
preparações. Em todas elas, o OECN teve um efeito depressor que, em músculo, diminuiu a
contratilidade e, em neurônios, a excitabilidade. Os efeitos em músculo liso sugerem uma ação
intracelular, provavelmente envolvendo a redução da sensibilidade da maquinaria contrátil à [Ca2+]
intracelular e/ou alteração da compartimentalização do Ca2+ intracelular, levando à diminuição da
[Ca2+] citoplasmática. Em alguns tecidos, esta ação pode ser influenciada pela produção de óxido
nítrico ou ativação da guanilato ciclase. Como a [Ca2+] intracelular é um fator importante na
modulação da ativação de canais de K+, inclusive do canal M (Adams e Brown, 1982), é possível
sugerir-se que o mecanismo de ação esteja relacionado ao controle desse parâmetro intracelular.
132
CONCLUSÕES
O OECN relaxa a musculatura lisa da traquéia de cobaio e inibe a resposta anafilática inicial de
uma exposição de um tecido frente a um antígeno, muito provavelmente por interferir no processo
contrátil do que na liberação de mediadores pelas células envolvidas com o processo imunológico;
O efeito inibitório do OECN nas contrações induzidas pela apresentação do antígeno se dá, em
grande parte, pela inibição dos efeitos da histamina liberada pelos mastócitos teciduais;
Existe uma certa especificidade para os efeitos miorelaxantes do OECN no músclo liso traqueal
visto que, em determinadas concentrações, inibe preferencialmente a histamina à PGF2α, embora
ele tenha se mostrado um agente inibidor inespecífico para determinados agonistas como a
histamina e o carbacol;
O OECN apresenta efeito miorelaxante em vasos, sendo mais potente em relaxar a contração
induzida por K+ em aorta de rato do que em aorta de cobaio;
O efeito hipotensor do OECN pode ser explicado, pelo menos parcialmente, pela propriedade
vasodilatadora do OECN;
Em rato, mas não em cobaio, o efeito inibitório do OECN é parcialmente dependente da via de
produção/liberação de NO, e requer a integridade do endotélio vascular;
Pelo menos em relação aos componentes estudados isoladamente, os efeitos miorelaxantes do
OECN podem ser atribuídos parcialmente à influência conjunta de seus constituintes pela ordem
de importância: metil-eugenol e terpineol e o 1,8-cineol;
O efeito relaxante do OECN não se deve à abertura de canais de K+ e hiperpolarização do
potencial transmembrana em nenhum dos tecidos musculares estudados;
O OECN possui um efeito inibitório da excitabilidade em neurônios do sistema nervoso autônomo
quando estes estão em contato com agonistas como a histamina;
133
A especificidade dos efeitos do OECN verifica-se também em relação aos parâmetros
eletrofisiológicos neuronais pelo seu efeito seletivo em diminuir determinados efeitos da histamina
em neurônios simpáticos, como o aumento do número de potenciais de ação, enquanto que não
interfere em outros efeitos como a despolarização produzida por esse autacóide;
Os dados sugerem que as ações do OECN são provavelmente derivadas de sua atuação em
mecanismos intracelulares que envolvam a ativação de proteínas quinases.
h
134
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157
TABELA I – Valores (em mV) da diferença de potencial transmembrana registrado pela técnica do
microeletrodo intracelular em vários tecidos de cobaio na presença e ausência de OECN
[K+] extracelular
5 mM K+ 80 mM K+
Tecido Controle OECN
200 µµµµg/ml Controle
OECN
200 µµµµg/ml
Traquéia -46,7±1,67
n=24
-51,2±1,56
n=20
-17,9±1,09
n=24
-19,3±1,13
n=24
Aorta -51,1±1,65
n=34
-48,2±1,18
n=25
-16,8±0,85
n=22
-14,3±1,20
n=21
Vasos mesentéricos
-47,0±1,60
n=29
-50,2±1,78
n=29
-13,4±0,74
n=27
-13,9±1,04
n=27
158
TABELA II – Concentração efetiva 50% (CE50) e concentração limiar de OECN (limiar) para a
reversão da contratura induzida por 60 mM de K+ em aorta de cobaio e rato em diferentes
condições. Valores em µµµµg/ml
COBAIO RATO
CE50 Limiar CE50 Limiar
Endotélio intacto 200,5±40,28 100 32,2±6,69a 3
Sem endotélio 168,6±16,10ns 100 106,2±5,66b 30b
Endotélio intacto + L-NAME (100µµµµM)
252,8±57,02ns 100 67,5±5,59b 3ns
a, significativamente diferente quando comparado com o mesmo tratamento nas duas espécies (teste t
não pareado)
b, significativamente diferente do controle (com endotélio intacto na mesma espécie, teste de Dunett)
ns, não significativo nas comparação para a mesma espécie
159
TABELA III – Comparação das propriedades elétricas dos neurônios apresentados neste estudo
e em outros trabalhos encontrados na literatura, através de registros intracelulares de gânglios
nervosos intactos de cobaio in vitro
Em (mV)
Ri (MΩΩΩΩ)
Amplitude (mV)
Overshoot (mV)
Duração (ms)
Presente trabalho –54,5±1,39 82,4±6,09 79,3±0,99 21,5±0,95 3,9±0,10
Ma e Wu, 1988 -59,3±5,6 53,7±19,8 68±15,3 11,7±4,6 2,7±0,6
Leal-Cardoso, 1993 -57,4±1,6 80±5,3 - 24±3,4 1,2±0,03
Kreulen e Szurszewski, 1979
-54±0,9 26±2,5 - - -
Cassel e McLachlan, 1987 -61±1 101,9±9,3 - - -
McLachlan e Meckler, 1989
-59,8±1,2 156,9±19,5 - - -
Stebbing e Bornstein, 1993 -57±1,2 90±10 - - -
* Coggan et al., 1991 -53±0,8 47±8,6 - - -
**Leal-Cardoso et al., 1993 -59±0,6 80±5,3 79±1,2 21±1,0 5,2±0,1
*** Undem et al., 1993 -60±1 48,4±4 - - -
**** King e Szurszewski, 1984
-54 a -47 10,9 a 41,7 81 a 82 - -
*, experimentos realizados com neurônios dissociados de gânglio celíaco de cobaio e mantidos em cultura primária (Coggan, JS, Gruener, R e Kreulen, DL. Electrophysiological properties and cholinergic responses in guinea-pig celiac ganglion neurons in primary culture. J Auton Nerv System 34:147-156, 1991)
**, experimentos realizados em gânglio nodoso de coelho (vide lista de referências, p. 131) ***, experimentos realizados em gânglio nodoso de cobaio (vide lista de referências, p. 140) ****, experimentos realizados em gânglios pré-vertebrais (King, BF e Szurszewski, JH. Mechanoreceptor pathways from
the distal colon to the autonomic nervous system in the guinea-pig. J Physiol (Lond) 350:93-107, 1984)
160
Tabela IV – Efeito da pirilamina sobre as ações promovidas pela histamina em gânglio celíaco
de cobaio
Controle Histamina Pirilamina
Histamina +
Pirilamina
Em (mV) -59,7±1,40a -55,6±2,18a,* -51,0±3,12 -51,5±3,64
Ri (MΩΩΩΩ) 87,1±11,28b 107,1±10,17b,*** 103,3±7,60 106,6±13,58
Limiar I (pA) 115,0±13,06 81,7±14,45* 103,3±22,1 88,3±13,27
Amplitude (mV) 68,7±3,49 70,2±2,60 70,4±5,06 69,4±4,13
Overshoot (mV) 24,9±2,30 27,7±2,81 30,0±4,64 27,9±3,81
Nº de PA no dobro do limiar I
3,1±0,46 6,9±1,14* 3,3±0,61 3,7±0,56
A histamina foi usada na concentração de 10 µM e a pirilamina na concentração de 1 µM;
As comparações foram feitas entre o grupo controle vs. histamina (n=12) e entre o grupo pirilamina vs. pirilamina+histamina (n=6);
a, n=10 de 12 células (1 sem alteração e 1 com hiperpolarização)
b, n=7 de 12 células (3 sem alteração e 2 com diminuição da resistência)
*, significativamente diferente (p<0,05, teste t pareado)
***, significativamente diferente (p<0,0001, teste t pareado)
Em, potencial transmembrana; Ri, resistência de entrada da membrana; Limiar I, limiar de corrente; PA, potenciais de ação
161
Fig. 2 – Sitema de registro das contrações em músculo liso
Esquema simplificado do sistema de montagem das preparações de músculo liso e registro isométrico
das contrações. Após a preparação, os tecidos musculares eram montados em câmaras de vidro (2)
de capacidade para 10mL de solução fisiológica, aerada e com temperatura de 37ºC mantida
constante pela cirulação de água proveniente de banho-maria com propulsão (3). Uma das
extremidades dos tecidos era fixada a um transdutor de força (1), conectado a um pré-amplificador.
Parte dos experimentos deste estudo foram realizados através de polígrafo Grass (6) e parte através
de um sistema de aquisição de dados computadorizado da DATAQ (4 e 5).
Fig. 3 – Dissecção do gânglio celíaco de cobaio
A dissecção e retirada do gânglio celíaco de cobaio foi realizada através de incisão abdominal
mediana para visualização dos órgãos internos, que removidos para uma posição mais lateralizada
para mostrar a região de tecido adiposo onde se encontra o gânglio celíaco, aparecem como no painel
superior (1). Na primeira etapa, foi descartada grande extensão das visceras intestinais desde o
esfíncter gastro-esofágico até o ceco para melhor visualização (2). Realizamos também a retirada dos
dois rins através de cortes pelo hilo renal com preservação das supra-renais. Toda a massa tecidual
próxima à aorta, que foi seccionada acima da artéria celíaca e abaixo da artéria mesentérica, foi
retirada e mantida em solução fisiológica refrigerada (~4-5ºC), a partir da qual, em câmara apropriada
com fundo de Silgard™, foi possível a completa limpeza e identificação do gânglio celíaco, cujas
conexões nervosas e relações anatômicas importantes com artérias são mostradas no painel inferior
(3).
162
Fig. 4 – Sistema para os experimentos de registro intracelular e de aquisição de dados
eletrofisiológicos
Esquema simplificado do sistema de registro e aquisição de dados eletrofisiológicos utilizados para a
musculatura lisa e para os neurônios do gânglio celíaco de cobaio. Após a limpeza adequada, os
tecidos foram fixados a uma câmara de superperfusão preparada sobre a mesa de um microscópio
ótico (4), por onde fluia constantemente (~ 1ml/min) solução fisiológica (1). O posicionamento do
microeletrodo intracelular, preparado na hora dos experimentos em borossilicato ou silicato de
alumínio e preenchidos com 95% de solução cloreto de K+ 3M e 5% de citrato de K+ 1M, foi alcançado
através da utilização de micromanipulador hidráulico (2). O microeletrodo foi fixado em um holder
apropriado que consistia no primeiro estágio de amplificação (headstage, 3) e conectado ao
eletrômetro Axoclamp 2A (7). Os pulsos de corrente foram aplicados através da utilização de um
trigger (5) e um estimulador (6) capaz de controlar a voltagem, a duração e a frequência do pulso
aplicado. As respostas de corrente (I) e voltagem (V) foram transferidos a um computador contendo o
software pClamp6 (8) através de um interface Digidata (9). O acompanhamento dos experimentos e
da frequência de amostragem do sinal foi realizado através da utilização de dois osciloscópios (10 e
11).
Fig. 5 – Sistema de registro da pressão arterial
Esquema simplificado do sistema de registro da pressão arterial de ratos. O animal foi anestesiado
com ketamina/xylazina (90 / 10 mg/Kg, respectivamente) e colocado em decúbito dorsal em uma
prancha de madeira recoberta com camada de borracha, com fixação da cabeça e das patas
(adaptado de Carlini, EA, Farmacologia prática sem aparelhagem, São Paulo, Sarvier, 1973). Foi
localizada e isolada a veia ilíaca externa na região inguinal direita e introduzido um tubo de polietileno
(PE, no 60) com uma ponta de agulha (30 x 8) preenchidos com solução salina heparinizada, via esta
163
utilizada para introduzir-se o OECN (4). Por uma incisão medial na região cervical foi possível a
visualização do conjunto nervo vago-artéria carótida, sendo esta última isolada do nervo vago,
mantendo-o intacto. A artéria foi, então, clampeada com uma linha de algodão em uma extremidade
mais cefálica e com uma pinça tipo bulldog na extremidade mais caudal (1), cortada para introdução
da cânula e, conectado a um manômetro de mercúrio, tipo Condon, regulado para uma pressão de
aproximadamente 100 mmHg (2). O OECN foi injetado por seringa (3) em bolus (para detalhes de
protocolo, vide texto). O registro das alterações da PAM foi feito em quimógrafo e expresso como
variação % da pressão arterial média (PAM) em relação à pressão arterial controle.
Fig. 6 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o tônus basal da
traquéia de cobaio
A, traçado poligráfico original da contração isométrica induzida por 60 mM de K+ (K60) seguida pela
adição de concentrações crescentes de OECN conforme indicado em µg/ml por pontos acima do
traçado. As preparações controle que não receberam a adição de OECN (não mostradas) mantiveram
seu tônus por igual período das preparações experimentais. ∆, lavagem. Observe a boa recuperação
do tônus basal após a lavagem da preparação.
B, gráfico das alterações médias induzidas pelo OECN e pela aminofilina sobre o tônus do músculo
liso traqueal.
Pontos e barras verticais representam a média e erro padrão da média (E.P.M.), respectivamente.
164
Fig. 7 – Reversão da contração mantida por solução despolarizante contendo 60 mM de K+ pelo
óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) e metil-eugenol em traquéia isolada de cobaio
A, traçado de um experimento típico mostrando o efeito relaxante do OECN sobre uma contração
mantida do músculo liso traqueal induzida por solução contendo 60 mM de K+ (K60). A adição do
OECN foi feita após a estabilização da contração em seu platô e as concentrações usadas estão
representadas por pontos acima do traçado, mantendo-se alta a concentração do K+ por todo o
experimento. B, gráfico das alterações médias produzidas pelo OECN e metil-eugenol, usados
separadamente, sobre o tônus aumentado do músculo traqueal pelo K+.
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 8 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) e do cromoglicato na
contração induzida pela apresentação do antígeno sensibilizante em traquéia de cobaio
A, registros em polígrafo das respostas contráteis de segmentos adjacentes de músculo liso traqueal à
apresentação do antígeno sensibilizante (Ovalbumina (OVA); 10 µg/ml, adicionada à solução
fisiológica), na ausência (traçado superior) e presença (traçado inferior) de 600 µg/ml de OECN. Após
a lavagem a preparação foi novamente exposta à OVA sem desenvolvimento de resposta contrátil.
B, gráfico das alterações médias produzidas pela primeira exposição (1ª) à OVA na ausência (controle)
e presença de 300 e 600 µg/ml de OECN (OECN 300 e OECN 600, respectivamente) e 100 µM de
cromoglicato (CRG 100). A segunda exposição (2ª), desta vez somente à OVA e sem OECN, em
todos os tecidos produziu contrações apenas naqueles que foram anteriormente expostos ao
cromoglicato (♣, p < 0,02 teste de Fisher). Em outro grupo de experimentos, a primeira exposição do
tecido traqueal de animais sensibilizados, mantido em solução à temperatura ambiente, à OVA (OVA
165
23 ºC) e à tecidos mantidos em solução à 37 ºC e expostos à soroalbumina bovina (SAB 37 ºC) não
apresentou resposta contrátil. **, p < 0,01, teste de Dunn.
C, respostas contráteis dos experimentos em que as preparações foram expostos à OVA na ausência
(OVA) e presença de 5 µM de pirilamina (OVA + PIR). Também foram comparadas as respostas da
preparação apenas à histamina (HA, 20 µM) ou à HA na presença de 5 µM de pirilamina (HA + PIR).
*, p < 0,05 e ***, p < 0,001, teste t pareado.
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o e.p.m., respectivamente.
Fig. 9 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração mantida da
histamina na traquéia isolada de cobaio
A, cópia de traçado original de um mesmo experimento onde a preparação foi inicialmente exposta à
concentrações crescentes de histamina (HA) na ausência (traçado a) e na presença de 300 µg/ml de
OECN (traçado b). As concentrações de HA utilizadas e o momento da aplicação são ilustrados por
pontos abaixo de cada traçado. Note que mesmo a adição de 100 µM de HA não houve
desenvolvimento de força na mesma intensidade vista no controle. B, comparação das respostas
contráteis da traquéia de cobaio à HA na ausência (controle) e presença de 100 e 300 µg/ml de OECN
(OECN 100 e OECN 300, respectivamente). As contrações foram normalizadas em função da
resposta máxima da HA obtida na ausência de OECN.
Pontos e barras verticais representam a média e o E.P.M., respectivamente.
166
Fig. 10 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração mantida da
prostaglandina F2αααα na traquéia isolada de cobaio
A, cópia de traçado original de um mesmo experimento onde a preparação foi inicialmente exposta à
concentrações crescentes de prostaglendina F2α (PGF2α) na ausência (traçado a) e na presença de
200 (traçado b) e 400 (traçado c) µg/ml de OECN. As concentrações de PGF2α utilizadas e o
momento da aplicação são demonstradas por pontos abaixo de cada traçado. B, comparação das
respostas contráteis da traquéia de cobaio à PGF2α na ausência (controle) e presença de 200 e 400
µg/ml de OECN (OECN 200 e OECN 400, respectivamente). As contrações foram normalizadas em
função da resposta máxima da PGF2α obtida na ausência de OECN.
Pontos e barras verticais representam a média e o E.P.M., respectivamente.
Fig. 11 – Efeito inibitório do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) nas contrações
induzidas pela histamina, carbacol e KCl na traquéia de cobaio
A, traçado típico mostrando a inibição da resposta contrátil à histamina pela exposição prévia da
preparação ao OECN por um período de 5 min à adição do agonista. Após cada contração a
preparação foi lavada para nova exposição ao OECN em concentrações crescentes (0,1 a 600 µg/ml).
A histamina foi utilizada em concentrações (3 – 10 µM) que produziram respostas submaximais (~
70% da resposta máxima); esta concentração foi determinada em cada experimento e mantida fixa em
um dado experimento. Ao final, com a retirada do OECN após lavagens sucessivas da preparação, a
resposta contrátil à histamina foi restaurada.
B, curvas concentração-efeito do OECN sobre as respostas contráteis da traquéia de cobaio a
concentrações submaximais de histamina (HA), carbacol (10-100 nM, CCh) e K+ (60 mM). As
167
contrações foram expressas como % da resposta obtida pelo agente contraturante ainda na ausência
do OECN.
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 12 – Medida do potencial transmembrana do músculo liso traqueal de cobaio
Medidas do potencial transmembrana do tecido traqueal isolado mantido em solução de Tyrode
modificado (5 mM K+) e em solução despolarizante contendo 80 mM de K+ (80 mM K+) na ausência
(controle) e presença de 200 µg/ml de OECN (OECN 200).
Gráficos de caixa representando valores estatísticos: mediana (traço interno), percentil 25% (limite
inferior da caixa), o percentil 75% (limite superior da caixa), intervalo de confiança 90 % (barras
verticais), intervalo de confiança 95 % (pontos).
Fig. 13 – Efeito hipotensor do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) em ratos
anestesiados uninefrectomizados e DOCA-sal
A, diminuição máxima na pressão arterial média (PAM) induzida pela injeção em bolus (1 - 50 mg/Kg,
iv) do OECN em ratos anestesiados uninefrectomizados (, n = 7) e DOCA-sal (, n = 4). Os valores
representam a média das alterações como um percentual da linha de base. As barras verticais
representam o E.P.M.. A hipotensão foi significante a partir de 10 mg/Kg em ambos os grupos. O
tratamento com DOCA-sal aumentou significativamente a hipotensão (p < 0,05, two way ANOVA, *).
B e C, variação da frequência cardíaca induzida pelo OECN em animais uninefrectomizados (B) e
DOCA-sal (C). REC, medida da frequência cardíaca do animal 10 minutos após a última dose
aplicada do OECN.
168
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B e C) representam a média e o
E.P.M., respectivamente.
Fig. 14 – Avaliação da frequência respiratória de ratos anestesiados nefrectomizados e DOCA-
sal tratados com OECN
Frequência respiratória de ratos anestesiados em função da dose de OECN administrada por via
intravenosa em ratos uninefrectomizados (A) e tratados com DOCA-sal (B). A administração não
produziu alterações significativas neste parâmetro em nenhum dos grupos.
c.p.m., ciclos respiratórios por minuto.
Barras com linhas verticais no topo representam a média dos ciclos respiratórios e o E.P.M.,
respectivamente.
Fig. 15 – Avaliação do tratamento agudo com óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN)
em parâmetros gasométricos sanguíneos de ratos anestesiados apenas uninefrectomizados ou,
após a nefrectomia, tratados com DOCA-sal
A administração endovenosa de OECN não produziu efeito significativo em nenhum dos parâmetros
avaliados em animais uninefrectomizados e nem em animais DOCA-sal. A amostra de sangue foi
retirada ao final do experimento, após o período de recuperação do animal. Todas as amostras foram
de sangue arterial, retirado pela canulação da carótida usada para registro da pressão arterial.
Gráficos de caixa (A) representando valores estatísticos: mediana (traço interno), percentil 25% (limite
inferior da caixa), o percentil 75% (limite superior da caixa), intervalo de confiança 90 % (barras
verticais).
169
Barras e linhas verticais no topo (B a F) representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 16 – Efeito relaxante do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre a contração
do músculo liso de anéis de aorta de cobaio, mantidos em 60 mM de K+
A, traçado original mostrando o efeito relaxante da adição cumulativa de concentrações crescentes
(indicadas pelos pontos acima dos traçados) do OECN em anés de aorta na ausência (controle) e
presença (com L-NAME 100) de 100 µM de L-NAME.
B, gráfico mostrando a curva concentração-efeito para o efeito relaxante do OECN em aorta de cobaio
com endotélio intacto e ausência de L-NAME (controle), na presença de 100µM de L-NAME (L-NAME
100µM) e na ausência de L-NAME e sem endotélio (sem endotélio).
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 17 – Reversão pelo óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) da contratura induzida
pelo dibutirato de forbol em aorta de cobaio
A, traçado original representando o efeito da adição cumulativa de OECN sobre uma contração
induzida pelo dibutirato de forbol (DBF) em aorta de cobaio mantida em solução sem Ca2+ e com a
adição de EGTA (Ca0 2 mM EGTA).
B, gráfico mostrando a curva concentração-efeito para o efeito relaxante do OECN em aorta de cobaio
contraída pelo DBF. *, concentração a partir da qual o efeito foi significativo (p < 0,05, teste de
Dunnett).
C, comparação da força desenvolvida pelo tecido em função do tempo de decaimento da preparação
na ausência (•) e na presença do OECN (ο). A adição do OECN aconteceu no tempo 20 minutos.
170
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 18 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na curva concentração-efeito
do dibutirato de forbol na aorta isolada de cobaio
A, traçado original de um mesmo experimento onde dois segmentos vizinhos de uma aorta de cobaio,
mantidos em solução sem Ca2+ e acrescida de 2 mM de EGTA, foram expostos a concentrações
crescentes de dibutirato de forbol (DBF) na ausência (traçado superior) e na presença de 200 µg/ml de
OECN (traçado inferior). As concentrações de DBF utilizadas e o momento da aplicação são
demonstrados por pontos acima de cada traçado.
B, comparação das respostas contráteis da aorta de cobaio ao DBF na ausência e presença de 200
µg/ml de OECN (DBF + OECN 200). As contrações foram normalizadas em função da resposta à
solução com 60 mM de K+.
Pontos e barras verticais representam a média e e.p.m., respectivamente.
Fig. 19 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração induzida pelo
K+ hipertônico em aorta isolada de cobaio
A, cópia de traçado original de um experimento com aorta de cobaio, mantida em solução sem Ca2+ e
com 2 mM de EGTA, estimulada pela adição hipertônica de 300 mM de K+ (K300) à solução nutriente
na ausência e na presença de 400 µg/ml de OECN. Para verificar a influência do choque osmótico na
preparação, foi adicionada solução de sucrose 600 mM (SUC600) também na ausência e presença do
OECN.
171
B, gráfico das médias das respostas contráteis da aorta de cobaio em função da solução hipertônica
de K+. *, significativamente diferente de K300 (p < 0,05, teste t pareado).
Barras verticais no topo das colunas, E.P.M..
Fig. 20 – Medida do potencial transmembrana do músculo liso vascular de cobaio
Medidas do potencial transmembrana da aorta (A) e de vasos mesentéricos (B) isolados de cobaio e
mantidos em solução de Tyrode modificado (5 mM K+) e em solução despolarizante (solução nutridora
contendo 80 mM de K+ (80 mM K+)), na ausência (controle) e presença de 200 µg/ml de OECN
(OECN 200).
Gráficos de caixa representando valores estatísticos: mediana (traço interno), percentil 25% (limite
inferior da caixa), o percentil 75% (limite superior da caixa), intervalo de confiança 90 % (barras
verticais), intervalo de confiança 95 % (pontos).
Fig. 21 - Efeito relaxante do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) no músculo liso de
anéis de aorta de rato contraídos com solução despolarizante contendo 60 mM de K+
A, traçado original mostrando o efeito relaxante da adição cumulativa de concentrações crescentes
(representadas por pontos e números acima dos traçados) do OECN em anés de aorta na ausência
(controle) e presença (com L-NAME) de 100 µM de L-NAME.
B, gráfico mostrando a curva concentração-efeito para a atividade relaxante do OECN em aorta de
rato com endotélio intacto e ausência de L-NAME (controle), na presença de 100 µM de L-NAME (L-
NAME 100 µM) e na ausência de L-NAME e sem endotélio (sem endotélio).
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
172
Fig. 22 – Efeito relaxante do 1,8-cineol, metil-eugenol e αααα-terpineol, constituintes do óleo
essencial do Croton nepetaefolius (OECN) no músculo liso de anéis de aorta de rato
A, traçado original mostrando o efeito relaxante da adição cumulativa de concentrações crescentes
(mostradas por pontos e números acima dos traçados de cineol (traçado superior) e metil-eugenol
(traçado inferior) em anéis de aorta de rato contraídos com 60 mM de K+.
B, gráfico mostrando a curva concentração-efeito para o efeito relaxante dos constituintes do OECN
em aorta de rato com endotélio.
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 23 – Efeito do azul de metileno na atividade relaxante do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN) no músculo liso de anéis de aorta de rato contraídos com norepinefrina
A, traçado original mostrando o efeito relaxante do OECN (10, 100 e 200 µg/ml) sobre contrações
induzidas por 0,3 µM de norepinefrina (NE 0,3) em anés de aorta de rato. O azul de metileno (AM) foi
utilizado na concentração de 10 µM e adicionado cerca de 20 minutos antes da adição da NE.
B, gráfico mostrando as alterações médias do relaxamento induzido pelo OECN na ausência e na
presença do azul de metileno em aorta de rato com endotélio intacto. *, significativo em relação à
mesma concentração na ausência do AM (p < 0,05, teste t pareado).
Barras e linhas verticais no topo representam a média e E.P.M., respectivamente.
173
Fig. 24 – Bloqueio, promovido pelo óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN), das
contrações induzidas pela fenilefrina em aorta de ratos uninefrectomizados e DOCA-sal
Gráfico mostrando o efeito inibitório da adição de concentrações crescentes de OECN sobre a
contração da aorta de ratos uninefrectomizados e tratados com DOCA-sal, induzida por concentrações
submaximais de fenilefrina. *, tratamento significativamente diferente (p < 0,05, two way ANOVA).
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
Fig. 25 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o fluxo de líquido na
circulação mesentérica de rato ex vivo
A, Gráfico mostrando a redução do fluxo mesentérico produzido pela solução despolarizante contendo
60 mM de K+ por um período de aproximadamente 1 hora.
B, reversão da diminuição do fluxo produzida pela solução despolarizante pela adição de
concentrações crescentes de OECN (10, 100 e 300 µg/ml). O tempo de exposição a cada
concentração de OECN foi de 5 minutos, exceto na concentração de 300 µg/ml, na qual o fluxo foi
medido após 5 (300) e 10 minutos (300’) de exposição a esta concentração. O valor de uma dada
concentração de OECN e o início da exposição a ela são mostrados pelos números ao lado dos
pontos do gráfico.
Pontos e barras verticais representam a média e E.P.M., respectivamente.
174
Fig. 26 – Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes do óleo essencial do
Croton nepetaefolius (OECN), da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de
rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de
L-NAME
A, gráfico mostrando que, após a estabilização da diminuição do fluxo induzida por 60 mM de K+
(K60), o OECN reverteu o fluxo, para valores próximos aos obtidos no controle (período pré K60) na
ausência mas não na presença de 50 µM de L-NAME. O valor de uma dada concentração de OECN e
o início da exposição a ela são mostrados pelos números entre os pontos do gráfico.
B, histograma mostrando a reversão máxima da diminuição do fluxo induzida pela exposição da
preparação durante 5 minutos a 100 e 300 µg/ml de OECN (OECN 100 e OECN 300,
respectivamente), e 10 min a 300 µg/ml (OECN 300´) na ausência e presença de L-NAME. Média ±
E.P.M., n = 6. *, significativamente diferente de K60 (p < 0,05, teste de Dunnett).
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B) representam a média e E.P.M.,
respectivamente.
Fig. 27 – Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes do óleo essencial do
Croton nepetaefolius (OECN), da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de
rato, produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de
D-NAME
A, gráfico mostrando que, após a estabilização da diminuição do fluxo induzida por 60 mM de K+ (K60),
o OECN reverteu o fluxo, para valores próximos aos obtidos no controle (período pré K60) tanto na
ausência como na presença de 50 µM de D-NAME. O valor de uma dada concentração de OECN e o
início da exposição a ela são mostrados pelos números entre os pontos do gráfico.
175
B, histograma mostrando a reversão máxima da diminuição do fluxo induzida pela exposição da
preparação durante 5 minutos a 100 e 300 µg/ml de OECN (OECN 100 e OECN 300,
respectivamente), e 10 min a 300 µg/ml (OECN 300´) na ausência e presença de D-NAME. Média ±
E.P.M., n = 6. *, significativamente diferente de K60 (p < 0,05, teste de Dunnett).
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B) representam a média e E.P.M.,
respectivamente.
Fig. 28 – Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes de metil-eugenol, da
diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução
despolarizante contendo 60 mM de K+, na ausência e presença de L-NAME
A, gráfico mostrando que, após a estabilização da diminuição do fluxo induzida por 60mM de K+(K60),
o metil-eugenol reverteu o fluxo, de maneira dependente de concentração, para os mesmos valores
obtidos no controle (período pré K60) na ausência e na presença de 50 µM de L-NAME. O valor de
uma dada concentração de cineol e o início da exposição a ela são mostrados pelos números entre os
pontos do gráfico.
B, histograma mostrando a reversão máxima da diminuição do fluxo induzida pela exposição da
preparação durante 5 minutos a 100 e 300 µg/ml de metil-eugenol (ME 100 e ME 300,
respectivamente), e 10 min a 300 µg/ml (ME 300´) na ausência e presença de L-NAME. *,
significativamente diferente de K60 (p < 0,05, teste de Dunnett).
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B) representam a média e E.P.M.,
respectivamente.
176
Fig. 29 – Reversão, induzida pela adição de concentrações crescentes de terpineol, da
diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato, produzida pela solução
despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de L-NAME
A, gráfico mostrando que, após a estabilização da diminuição do fluxo induzida por 60 mM de K+ (K60),
o terpineol reverteu o fluxo, de maneira dependente de concentração, para os mesmos valores obtidos
no controle (período pré K60) na ausência mas não na presença de 50 µM de L-NAME. O valor de
uma dada concentração de cineol e o início da exposição a ela são mostrados pelos números entre os
pontos do gráfico.
B, histograma mostrando a reversão máxima da diminuição do fluxo induzida pela exposição da
preparação durante 5 minutos a 100 e 300 µg/ml de terpineol (TERP 100 e TERP 300,
respectivamente), e 10 min a 300 µg/ml (TERP 300´) na ausência e presença de L-NAME. *,
significativamente diferente de K60 (p < 0,05, teste de Dunnett).
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B) representam a média e E.P.M.,
respectivamente.
Fig. 30 – Avaliação da diminuição do fluxo de líquido na circulação mesentérica de rato,
produzida pela solução despolarizante contendo 60 mM de K+ na ausência e presença de cineol
A, gráfico mostrando que, após a estabilização da diminuição do fluxo induzida por 60mM de K+ (K60),
o cineol apresentou uma tendência de reversão (não significativa, p > 0,05, ANOVA) da redução do
fluxo para o valor controle. Na presença de 50 µM de L-NAME, esta tendência foi abolida. O valor de
uma dada concentração de cineol e o início da exposição a ela são mostrados pelos números entre os
pontos do gráfico.
177
B, histograma mostrando a reversão máxima da diminuição do fluxo induzida pela exposição da
preparação durante 5 minutos a 100 e 300 µg/ml de cineol (CIN 100 e CIN 300, respectivamente), e
10 min a 300 µg/ml (CIN 300´) na ausência e presença de L-NAME. *, significativamente diferente de
K60 (p < 0,05, teste de Dunnett).
Pontos e barras verticais (A) e barras com linhas verticais no topo (B) representam a média e E.P.M.,
respectivamente.
Fig. 31 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) na contração induzida pelo
K+ hipertônico em útero isolado de rata estrogenizada
A, traçado original de um experimento com útero isolada de rata estrogenizada com dietilestilbestrol,
mantida em solução sem Ca2+ e com 2 mM de EGTA, estimulada pela adição hipertônica de 300 mM
de K+ (K300) à solução nutriente na ausência e na presença de 400 µg/ml de OECN. Para verificar a
influência do choque osmótico na preparação, essa foi também exposta a uma solução de 600 mM de
sucrose (SUC600) também na ausência e presença do OECN.
B, histograma das variações médias das respostas contráteis do útero de rata em função da solução
hipertônica de K+. *, significativamente diferente de K300 controle (p < 0,05, teste t pareado)
C, gráfico mostrando a quantificação da reversão da contração induzida por 60 mM de K+ em útero de
rata pelo OECN.
Barras com linhas verticais no topo (B) e pontos e barras verticais (C) representam a média e o E.P.M.,
respectivamente.
178
Fig. 32 – Tipos de neurônios encontrados nos experimentos com gânglio celíaco de cobaio
Traçados de potenciais de ação registrados intracelularmente de gânglio celíaco intacto de cobaio e
classicamente conhecidos como oriundos de célula fásica e tônica. O tecido foi mantido a temperatura
ambiente e, estimulado com pulsos quadrados de corrente despolarizante de 1000ms de duração,
correspondentes ao limiar de excitabilidade (1x), 50% mais de corrente do que no limiar (1,5x) e no
dobro da corrente necessária para a ativação neuronal (2x).
Fig. 33 – Histogramas de distribuição de freqüência das principais características elétricas das
células utilizadas neste estudo, o potencial de repouso e a resistência de entrada
A, ocorrência de células de acordo com o valor do potencial transmembrana em condições controle,
recebendo apenas pulsos de corrente hiperpolarizante para monitoramento da resistência de entrada
da membrana.
B, ocorrência de células com diferentes valores de resistência de entrada de membrana. Para este
estudo, só foram aceitas células com potencial transmembrana mais negativo que –40 mV e com
resistência de entrada maior que 40 MΩ.
Fig. 34 – Efeito da histamina sobre o potencial transmembrana de neurônios fásicos do gânglio
celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton nepetaefolius
(OECN)
A, gráfico mostrando os valores de potencial transmembrana dos neurônios do gânglio celíaco de
cobaio na ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina (HA 10 µM).
179
B, gráfico mostrando as variações do Em em função da adição de 200 µg/ml de OECN e de 10 µM de
histamina.
**, p < 0,01, teste t pareado
*, p < 0,05, teste de Dunnett
N.S., não significativo, p > 0,05, ANOVA
Gráficos de caixa representando valores estatísticos: mediana (traço interno), percentil 25% (limite
inferior da caixa), o percentil 75% (limite superior da caixa), intervalo de confiança 90 % (barras
verticais), intervalo de confiança 95 % (pontos).
Fig. 35 – Efeito da histamina sobre a resistência de entrada da membrana de neurônios fásicos
do gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN)
A, gráfico mostrando os valores da resistência de entrada dos neurônios do gânglio celíaco de cobaio
na ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina (HA 10 µM).
B, gráfico mostrando as variações de Ri em função da adição de 200 µg/ml de OECN e de 10 µM de
histamina.
***, p < 0,001, teste t pareado
*, p < 0,05, teste de Dunnett
N.S., não significativo, p > 0,05, ANOVA
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o E.P.M., respectivamente.
180
Fig. 36 – Efeito da histamina sobre o limiar de corrente para ativação de neurônios fásicos do
gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN)
A, gráfico mostrando os valores médios dos pulsos de corrente despolarizante de amplitude mínima
necessária para a ativação de potenciais de ação nos neurônios do gânglio celíaco de cobaio na
ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina (HA 10 µM).
B, gráfico mostrando as variações do limiar de corrente em função da adição de 200 µg/ml de OECN e
de 10 µM de histamina.
***, p < 0,001, teste t pareado
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o E.P.M., respectivamente.
Fig. 37 – Efeito da histamina sobre o overshoot dos potenciais de ação de neurônios fásicos do
gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN)
A, gráfico mostrando os valores médios da amplitude do overshoot dos potenciais de ação nos
neurônios do gânglio celíaco de cobaio na ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina
(HA 10 µM).
B, gráfico mostrando as medidas médias do overshoot em função da adição de 200 µg/ml de OECN e
de 10 µM de histamina.
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o E.P.M., respectivamente.
181
Fig. 38 – Efeito da histamina sobre a amplitude dos potenciais de ação de neurônios fásicos do
gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN)
A, gráfico mostrando os valores médios da amplitude dos potenciais de ação nos neurônios do gânglio
celíaco de cobaio na ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina (HA 10 µM).
B, gráfico mostrando as variações da amplitude dos potenciais de ação em função da adição de 200
µg/ml de OECN e de 10 µM de histamina.
***, p < 0,001, teste t pareado
*, p < 0,05, teste de Dunnett
N.S., não significativo, p > 0,05, ANOVA
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o E.P.M., respectivamente.
Fig. 39 – Efeito da histamina sobre a duração dos potenciais de ação de neurônios fásicos do
gânglio celíaco de cobaio mantidos na ausência e presença do óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN)
A, gráfico mostrando os valores médios da duração dos potenciais de ação nos neurônios do gânglio
celíaco de cobaio na ausência (controle) e na presença de 10 µM de histamina (HA 10 µM).
B, gráfico mostrando as variações da duração dos potenciais de ação em função da adição de 200
µg/ml de OECN e de 10 µM de histamina.
Barras com linhas verticais no topo representam a média e o E.P.M., respectivamente.
182
Fig. 40 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre as alterações
produzidas pela histamina em neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
A, registro intracelular de potenciais de ação em neurônios do gânglio celíaco de cobaio estimulados
com pulsos de corrente despolarizante correspondentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limiar de ativação
neuronal, na ausência (controle, traçado superior) e presença (HA 10 µM, traçado inferior) de
histamina.
B, registro intracelular de potenciais de ação em neurônios do gânglio celíaco de cobaio estimulados
com pulsos de corrente despolarizante correspondentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limiar de ativação
neuronal, na ausência (controle, traçado superior) e presença de 200 µg/ml de OECN (OECN 200,
traçado intermediário) e OECN + histamina (OECN 200 + HA 10 µM, traçado inferior).
Fig. 41 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre as alterações
produzidas pela histamina no número de potenciais de ação em neurônios fásicos do gânglio
celíaco de cobaio
A, gráfico mostrando o número médio de potenciais de ação em neurônios do gânglio celíaco de
cobaio estimulados com pulsos de corrente despolarizante correspondentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limiar
de ativação neuronal, na ausência (controle) e presença (HA 10 µM) de histamina. * e **, p < 0,05 e p
< 0,01, respectivamente, teste t pareado.
B, gráfico do número médio de potenciais de ação em neurônios do gânglio celíaco de cobaio
estimulados com pulsos de corrente despolarizante correspondentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limiar de
ativação neuronal, na ausência (controle) e presença de 200 µg/ml de OECN (OECN 200) e OECN +
histamina (OECN 200 + HA 10 µM).
183
C, gráfico mostrando a curva de regressão linear de 2ª ordem do número médio de potenciais de ação
em função do pulso de corrente despolarizante aplicado na ausência (controle) e na presença de
histamina (HA 10 µM), 200 µg/ml de OECN (OECN 200) e histamina + OECN (HA 10 µM + OECN
200). ♣, significativamente diferente do controle, p < 0,05, teste de Bonferroni).
Barras com linhas verticais no topo (A e B) representam a média e o E.P.M., respectivamente.
Fig. 42 – Efeito da histamina sobre a excitabilidade de neurônios fásicos do gânglio celíaco de
cobaio
A, traçado original mostrando o tempo de latência para ocorrência dos picos dos potenciais de ação
em função do pulso de corrente despolarizante aplicado na ausência (controle) e na presença de 10
µM de histamina (HA 10 µM), na geração de potenciais de ação em neurônio fásico do gânglio celíaco
de cobaio.
B, gráfico do tempo médio do pico dos potenciais de ação em neurônios fásicos do gânglio celíaco de
cobaio estimulados com pulsos de corrente despolarizante na ausência (controle) e presença de 10
µM de histamina (HA 10 µM). *, significativamente diferente do controle, p < 0,05, two way ANOVA de
duas variáveis.
Pontos com linhas verticais representam a média e o E.P.M., respectivamente.
Fig. 43 – Efeito do óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) sobre o efeito da histamina
na excitabilidade de neurônios fásicos do gânglio celíaco de cobaio
A, traçado original mostrando o tempo de latência para ocorrência dos picos dos potenciais de ação
em função do pulso de corrente despolarizante aplicado na ausência (controle), na presença de 200
184
µg/ml de OECN (OECN 200) e na presença de 10 µM de histamina + 200 µg/ml de OECN (OECN 200
+ HA 10 µM), na geração de potenciais de ação em neurônio fásico do gânglio celíaco de cobaio.
B, gráfico do tempo médio do pico dos potenciais de ação em neurônios fásicos do gânglio celíaco de
cobaio estimulados com pulsos de corrente despolarizante na ausência (controle) na presença de 200
µg/ml de OECN (OECN 200) e na presença de 10 µM de histamina + 200 µg/ml de OECN (OECN 200
+ HA 10 µM).
Pontos com linhas verticais representam a média e o E.P.M., respectivamente.
185
M168e Magalhães, Pedro Jorge Caldas Estudo farmacológico do óleo essencial do Croton
nepetaefolius Baill. Sobre os músculos lisos traqueal e vascular e sobre as propriedades eletrofisiológicas de neurônios fásicos de gânglio celíaco / Pedro Jorge Caldas Magalhães. – Fortaleza, 2002.
145f. : il. Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso. Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Departamento de Fisiologia e Farmacologia. 1. Óleos voláteis – Farmacologia. 2. Plantas
medicinais – Croton nepetaefolius. 3. Músculo liso. 4. Liberação de histamina. 5. Neurônios fásicos. I.Título
CDD : 615.32
