EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT

José Eduardo LeviDepto. De Biologia Molecular

Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo

07/06/2013

17,25

17,62

12.96

20.3 19.63

18.12

14.9415.77

11.89.93

9.799.19

6,35

5.45

4.47

3.27 2,482,61 2,36

2.75

2.72

2.390

5

10

15

20

25

1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

% d

e D

esc

art

e -M

éd

iaPorcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP

1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL;2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV

Porcentagem de Descarte - HIV

Teste em uso e critério:

ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%)

CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%)

Obs.: 2004 ELISA Ag + Ac2011 NAT

Porcentagem de Descarte - HCV

Teste em uso e critério:

ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%)

Obs.: 2008 ELISA Ag + Ac2011 NAT

FPS 2010ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%

Jan/11 Feb/11 Mar/11 Apr/11 May/11 Jun/11 Jul/11 Aug/11 Sep/11 Oct/11 Nov/11 Dec/11 Jan/12 Feb/12 Mar/12 Apr/12 May/12 Jun/12 Jul/12 Aug/12 Sep/12 Oct/120.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

HIV descarte teste

Teste 1 + Teste 2 Teste 1 Teste 2

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1

RNA plasmáticoAnticorpos anti-HIV

11

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Antígeno p2416 22

Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

DT = 21.5 hrs

“blip” viremia

2nd gen1nd gen

3rd gen

11.3/MILHÃO = 1:88.500

“Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue”

“Eu doo sangue para ter meus resultados”

Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1

RNA plasmáticoAnticorpos anti-HIV

11

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Antígeno p2416 22

Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

DT = 21.5 hrs

“blip” viremia

2nd gen1nd gen

3rd gen

Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil

Port. 262 M.S. 02/2002 - introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado “pool” de 8 amostras

Port. 1407 M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios

Port. 79 01/2003 - adiada por 1 ano

Port. 112 01/2004 - Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV.

Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.

– Plataforma multiplex para HCV e HIV;– Pool de 6 amostras;– 2008 - estudos-piloto - SC – 2010 - Estudos multicêntricos (outros hemocentros

brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística.

– Registro em 12/2010– 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE,

RJ e SP

– 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA).

Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos

blood units/day(based on the # of serology tests)

30 ¬ 100

100 ¬ 200

200 ¬ 400

400 ¬ 800

800 ¬ 1000

1000 ¬ 1500

1500 ¬ 2000

BUT …São Paulo State – due to size and complexity …will be addressed further !

How to?Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on:

Easiness for primary tube logistics and report return within platelet saving time (<24h) Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already

established for serology tests.

Manaus, 376

Belém, 349

Campo Grande, 629

Brasília, 773

Salvador, 438

Curitiba, 769

Fortaleza, 646

Recife, 942

Florianópolis, 1115

B.Horizonte, 1192

Rio de Janeiro, 1083

São Paulo1923

Manual Operacional NAT

• Sítio Testador (SIT)– 24 horas para resultado após o recebimento– Encaminhar tubo para coleta– Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos

• Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia – Relatório para o SIT– Distribuição dos tubos para UCA– Coleta e centrifuga amostra– Conservar em geladeira

• Unidade Coletora de Amostra (UCA)– Relatório para a URA– Coleta e centrifuga amostra– Conservar em geladeira

Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos

Pooling – 2h Extração – 2h e 30min

PCR Setup –30min

Amplificação–3h

Tempo total 9h

30 min - 20ºC30 min + 22ºC

NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste

Tubo primário - PPT

Pool – 6 amostras

Plataforma automática Janus Perkin Elmer

Protocolo de rotina

TOTAL POOL SINGLE

1 552 552 0

2 522 516 6

3 492 480 12

4 462 444 18

5 432 408 24

6 402 372 30

7 372 336 36

8 342 300 42

9 312 264 48

10 0 0 92

NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste

Adição da partícula calibradora

Extração – Biorobô MDx(T. lise e protease, temp 65ºC)

Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) – PCR tempo real Applied Biosystems 7300

NAT FPS Total 532.700 doaçõesMês FPS H Santos COLSAN Stella M. UNIFESP Sta C. SP Sta Marcelina Ribeirão Total

Oct-10 4707 4707Nov-10 5434 5434Dec-10 11495 11495Jan-11 11659 240 11899Feb-11 10572 531 11103Mar-11 11401 426 11827Apr-11 11304 386 11690May-11 10147 421 10568Jun-11 11035 1253 12288Jul-11 12615 1674 14289Aug-11 11452 1355 12807Sep-11 10258 1692 11950Oct-11 9533 2071 11604Nov-11 11015 2411 13426Dec-11 11296 1971 13267Jan-12 8948 2231 11179Feb-12 12189 2544 14733Mar-12 11018 2480 13498Apr-12 9660 1904 11564May-12 12571 2634 15205Jun-12 11538 2115 13653Jul-12 12084 2464 14548Aug-12 12094 2634 14728Sep-12 9650 2151 8538 284 820 21443Oct-12 10944 2268 12736 396 1898 2221 30463Nov-12 10652 2350 11224 359 1853 1664 1664 29766Dec-12 10923 1805 12499 367 1572 2874 2652 32692Jan-13 11006 2718 12644 364 2170 4134 2703 35739Feb-13 9440 1886 11185 374 1906 3680 2599 31070Mar-13 10516 2386 14103 362 1890 4714 2849 36820Apr-13 10640 2625 14121 448 1873 4169 2859 510 37245

Total 327796 51626 97050 2954 13982 23456 15326 510 532700

Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca)

• Amostra em SINGLE

• Ct: 32,54

- Processada dia 17 de março de 2011

HCV Maio de 2011 a Abril de 2013

Total de doações = 379.422 (FPS+HS)Total de resultados reagentes: 1052

Prevalência = 0.05%

EIA Ac/Ag

Reagente Não Reagente

NAT Detectável 192 7 (falso positivos NAT)

NAT Não Detectável 853 378.370 Negativo

HIVMaio de 2011 a Abril de 2013

Total de doações = 379.422 (FPS+HS)Total de resultados reagentes 1065

Prevalência = 0.04%

Ac/Ag 2 testes EIA + CMIA

Reagente Não Reagente

NAT Detectável 163 28 (falso positivo NAT)1 janela em abril de 2013

NAT Não Detectável 1065 378.357

PF coleta amostra bolsa CT retorno EIA WB NAT3804045 03/12/2010 04800001938-8 104109940 54 11/01/2011 N NR N

          11/02/2011 N NR N194828 09/12/2010 0210265394-3 104164080 56        

2903482 11/12/2010 02102651648-0 104164325 44 31/12/2010 N NR N          05/02/2011 N NR N

2986278 13/12/2010 0502215483-8 104115054 58 24/02/2011 N NR N2774240 15/12/2010 0502215520-6 104169001 45 22/12/2010 N NR N3779751 15/12/2010 0502219335-3 104166036 16 01/03/2011 N NR N495641 15/12/2010 0502223922-1 104166736 48 13/12/2011 N NR N

3808786 21/12/2010 0502225709-2 104144193 56        3811196 31/12/2010 0502218389-7 104175431 56        3703095 02/01/2011 0502218572-5 104175181 45 04/02/2012 N NR N2570093 13/01/2011 0502230082-6 104177712 57 15/02/2011 N NR N3674534 14/01/2011 0502229960-7 104177611 15        3816361 19/01/2011 0502229400-1 104182658 35        1508395 24/01/2011 0502228984-9 104177257 54 15/03/2011 N NR N3817893 24/01/2011 4800002559-0 104147730 46 02/03/2012 N NR N2978849 26/01/2011 0502232590-0 104179994 51 02/03/2011 N NR N3573837 28/01/2011 0700365782-1 104185355 44 23/02/2011 N NR N

          18/04/2011 N NR N3395295 21/02/2011 0502240019-7 104203382 59 24/03/2011 N NR N

          15/04/201 N NR N3759227 20/03/2011 0502247606-1 104221526 59        2736457 20/03/2011 0502242568-8 104221370 49 13/04/2011 N NR N

          06/05/2011 N NR N3764909 09/04/2011 0502247152-3 104229396 24/41/ND 09/05/2011 N NR N2147942 22/06/20114800005590-2 104236830 17/53/ND 27/07/2011 N NR N

1754169 04/07/2011 0502275726-5 104248542 59 16/11/2011 N NR N3628109 07/07/20110502276968-9 104229877 50/52/ND 10/08/2011 N NR N1909304 11/07/20110700367705-9 104269449 51/54/ND        2100337 20/07/20114800006494-4 104237406 47/55/ND 31/08/2011 N NR N3886339 17/09/20110502297325-1 104334478 59/50/ND 19/10/2011 N NR N2026869 29/09/20110210295405-6 104333646 57/47/ND 21/10/2011 N NR N118057 30/09/20110502308004-8 104327583 53/59/ND 08/02/2012 N NR N

HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT

Testes :Abbott: HIV Ag/Ac COMBO QuimioluminescenciaBioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”

Teste de Western Blot:MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2

SOROCONVERSÃO - HIV

gp120 gp160p17 p24Banda controle

16/04/13 03/05/13 14/05/13

Quimio (S/CO)

NR 571,990 8,470

ELISA (DO) NR 3,000 2,784

NAT (CT) 32,0 17,856 22,848

W. BLOT - IND POS

matriz

capsídeo

gp41

gp120envelope

CD4

CCR5

CXCR4

transcriptase reversa

RNA viral Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP

Última Doação Negativa: 02/08/2011

Sexo: masculino Idade: 36 anos

Teste NAT - 17/04/2013Pool de 6 amostras - CT: 34,6374

Teste NAT - 18/04/2013Amostra única - CT: 32,8703

Teste NAT - 03/05/2013Amostra única – CT: 17,856

Teste NAT - 17/05/2013Amostra única – CT: 22,848

RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WPNAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1:238.000OBSERVADO = 1: 328.000

RENDIMENTO NAT NO BRASIL

N AMOSTRAS CASOS WP TAXA

HCV 1.085.548 4 1:271.387

HIV 1.024.755 5 1:204.951

LEVI ET AL., HEMO 2011

RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500

RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:156.000

HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo

Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press

Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIVEm Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e NovembroRecebeu 47 transfusões com unidades da FPS.

Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas.

Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentousoroconversão para HIV e NAT+.

HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo

Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press

Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS

DATA ANTI-HIV NAT CARGA VIRAL28/09/201

2NEG NEG INDETECTÁVEL

17/12/2012

POS POS 39,658 cps/mL

HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo

Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press

Número de réplicas

Cobas MPXN+

ProcleixN+

Bio-ManguinhosN+

Pura 20 3 13 0Diluida 1:6 5 0 1 0PlasmaNegativo

1 0 0 0

CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1

RNA plasmáticoAnticorpos anti-HIV

11

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Antígeno p2416 22

Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

DT = 21.5 hrs

“blip” viremia

2nd gen1nd gen

3rd gen

Infecção

jelevi@prosangue.sp.gov.br