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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

DOUTORANDA: Marta Rabello Piva

ORIENTADORA: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza

Natal/RN

2009

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Patologia Oral.

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CD8, FOXP3, - B EM DISPLASIAS EPITELIAIS E

CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS.

2

DEDICATÓRIAS

3

DEDICATÓRIAS

Dedico este trabalho em especial a meu pai, , meu ídolo, meu

guia, que apesar de não poder compartilhar com essa vitória, foi o seu desejo e o seu

reconhecimento que me incentivaram a chegar até aqui.

A Chiquinho, meu companheiro e incentivador. Sua compreensão, dedicação,

carinho e confiança, me fizeram buscar forças para alcançar esta conquista. Sou sua fã

nº1.

À minha mãe Bernadeth, que sempre foi meu anjo da guarda, e me confortou

com todo seu carinho e preocupação dedicados aos meus filhos durante a minha

ausência.

Aos nossos filhos, Francisco Roberto, Diogo, Breno, Luís Henrique, Moema

Tereza, João Victor e Paulo Henrique, por serem as pessoas maravilhosas que são.

Pela compreensão e apoio que tanto me gratificou e encorajou. Para estes dedico a

esperança em um mundo melhor.

Às minhas amigas inseparáveis, Tânia, Lívia, Aída e Rosa, que suportaram o

meu abandono nas quartas e sextas. Os caranguejos agradecem.

Ao Deus pela minha família, e por ter colocado no meu caminho pessoas

maravilhosas como Cris, Karuza (Pan), Líbia e a tal de Daniele, minhas amigas,

companheiras e filhas de coração, espero que a distância não nos separe; assim como

meus filhos patológicos que nunca me abandonaram, Thiago, Luana, Luciana e o trio

Paulo, Dani e Giovanna. Foi um projeto e tanto! Obrigada por vocês existirem. Não

podendo deixar de fora o meu amigo e colaborador, Cassiano, que nunca me deixou na

mão, quando precisei, agora papai, desejo o melhor desse mundo para você, Simone e o

mais novo mascote da patologia. Dra. Lélia! Vamos pensar em ampliar esse negócio e

colocar a nossa creche, assim a senhora em vez de reclamar da superpopulação, vai

curtir junto com agente.

4

AGRADECIMENTOS

5

AGRADECIMENTOS

Aos professores Lélia Batista de Souza e Leão Pereira Pinto, por viabilizarem

a realização de um sonho.

Ao CNPq e à CAPES, na pessoa do Prfº José Fernandes Lima, pelo apoio

financeiro indispensável para a execução deste curso.

Aos meus irmãos e sobrinhos, Nestor, Isabela, Augusto César, Isabelle e

Nestorzinho pelo apoio e dedicação sem os quais não teria conseguido realizar esta

tarefa. Gugu, meu amor por você é incondicional.

À minha orientadora, professora Lélia Batista de Souza por sempre estar ao

meu lado nos erros e nos acertos. Acho que decifrei o enigma!

Aos professores Antônio Costa, Hébel, Lélia Maria, Márcia Miguel e

Roseana, por tudo que nos ensinaram, pela compreensão e pela solidariedade durante

todo o curso.

À Dr.Ângelo, Líbia, Cris e Cassiano pela orientação, possibilitando um

conhecimento mais profundo sobre a aplicabilidade dos testes utilizados na análise

estatística deste trabalho.

Aos funcionários Gracinha, Idelzuite, Canindé, Sandra, Hévio e Lourdinha

sempre amigos dedicados e atenciosos, dispostos a colaborar com nossos trabalhos.

Aos colegas do mestrado e doutorado Manuel, Márcio, Rosilene, Simone,

Roberta, Érika, Andréa, Janaína, Claudine, Polliana, Cristina, Karuza, George,

Cassiano, Bruna Rafaela, Bruna Amaral, Alexandre, Valéria*, Pedro Paulo*,

Daniele*(meus irmãozinhos*), João Goulart, Marcelo, Deborah, Ruth, Betânia e

Domingos, o pessoal do Maranhão, Antônio Luiz, Fernanda e Carmem e os caçulas,

Felipe, Joabe, Cyntia, Taís, Maiara, Marianne e Emeline, pelo companheirismo e

6

solidariedade não só no nosso aprendizado como também nas comemorações e

despedidas, sempre um motivo para festejarmos e estarmos juntos.

A Cassiano, Cris, Éricka, Líbia, Márcia e Pedro Paulo, pela mãozinha nas

horas dos apertos. Não existem palavras que expressem, o quanto vocês foram e serão

importantes na minha vida.

Ao amigo indispensável nas farras. O que seriam dos congressos sem você,

Gustavo?

A todos aqueles que por ventura tenham escapado injustamente do meu

pensamento neste momento, meu perdão, mas para fazer justiça sem medo de errar, eu

teria que agradecer à Sociedade Médica Sergipana em nome de todos aqueles que me

socorreram nos momentos de dificuldade, em especial a Dr. Eduardo Góis e Dr.

Caetano Macieira.

MUITO OBRIGADA!

7

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

8

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

APC Célula apresentadora de antígeno

CE Carcinoma epidermóide

Célula NK

CEO Carcinoma epidermóide oral

DEO Displasia Epitelial Oral

Fas Membro da família do TNF expresso na superfície celular (CD95)

Foxp3 Proteína de transcrição reponsávem pela função e diferenciação da

célula Treg

GITR -

IFN- Interferon-

LB Linfócito B

LPS Lipopolissacarídio (Endotoxina)

LT Linfócito T

LTC Linfócito T citotóxico

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

NFk-B Fator de transcrição nuclear kappa B

TCR

TGF-

transformante

TNF- e necrose tumoral-

Treg Linfócito T regulador

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

10

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Ilustrações pg

Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasias. 46

Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais. 47

Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO. 47

Quadro 04-Estadiamento do CEO. 48

Quadro 05- Gradação de Bryne.(1998). 48

Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários. 50

Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos. 51

Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos carcinomas epidermóides

de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo. Natal/RN

2009.

55

Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides

de acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.

57

Tabela 01- Gradação histológica das displasias baseada na OMS (2005) de

acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.

54

Tabela 02- Correlação entre Gradação histológica de malignidade dos CEO e a

intensidade do infiltrado inflamatório, nas lesões estudadas. Natal/RN 2009.

56

Tabela 03- Expressão imuno-

- B nas DEO e CEO. Natal/RN 2009.

58

Tabela 04- Expressão imuno-

- B) de acordo com o grau das DEO. Natal/RN 2009.

59

Tabela 05- Expressão imuno-

- B) de acordo com o estágio dos CEO. Natal/RN 2009.

60

Tabela 06- Expressão imuno-

- B) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nas

DEO. Natal/RN 2009.

61

Tabela 07- Expressão imuno-histoquímic

- B) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nos

CEO. Natal/RN 2009.

62

Tabela 08- Distribuição dos casos de CEO de baixo e alto graus segundo os

parâmetros utilizados na gradação histológica de malignidade. Natal/RN 2009.

63

11

Tabela 09- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,

estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas

NF- B em relação ao tipo de lesão. Natal/RN

2009.

64

Tabela 10- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,

estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas

NF- B em relação à gradação histológica das

DEO. Natal/RN 2009.

64

Tabela 11- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,

estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas

NF- B em relação à gradação histológica de

malignidade dos CEO. Natal/RN 2009.

65

Tabela 12- Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância

estatística entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células

NF- B, segundo o tipo de

lesão. Natal/RN 2009.

66

Ggáfico 01- Comparação das GHM. 56

Figura 01- CEO, Invasão em massas (HE/200x). 67

Figura 02- CEO, Invasão em cordões (HE/100x). 67

Figura 03- CEO, Células maduras (HE/200x). 67

Figura 04- CEO, Células imaturas (HE/200x). 67

Figura 05- CEO, Presença de massas (HE/100x). 68

Figura 06- CEO, Ausência de massas (HE/100x). 68

Figura 07- CEO, Dismorfismo escasso (HE/200x). 68

Figura 08- CEO, Dismorfismo acentuado (HE/200x). 68

Figura 09-DEO, CD8 > 50% (SABC/200x). 69

Figura 10- DEO, CD8 > 50% (SABC/200x). 69

Figura 11- CEO, CD8 > 50% (SABC/200x). 69

Figura 12- CEO, CD8 < 5% (SABC/200x). 69

Figura 13- DEO, FOXP3 > 50% (SABC/200x). 70

Figura 14- DEO, FOXP3 > 50% (SABC/200x). 70

Figura 15- CEO, FOXP3 > 50% (SABC/100x). 70

Figura 16- CEO, FOXP3 5-50% (SABC/200x). 70

12

Figura 17- (SABC/200x). 71

Figura 18- -50% (SABC/200x). 71

Figura 19- 00x). 71

Figura 20- -50% (SABC/400x). 71

Figura 21- 00x). 72

Figura 22- -50% (SABC/200x). 72

Figura 23- 00x). 72

Figura 24- -50% (SABC/200x). 72

Figura 25- 00x). 73

Figura 26- -50% (SABC/200x). 73

Figura 27- 00x). 73

Figura 28- -50% (SABC/200x). 73

Figura 29- 00x). 74

Figura 30- -50% (SABC/200x). 74

Figura 31- 00x). 74

Figura 32- 00x). 74

Figura 33- DEO, NF- B > 50% (SABC/200x). 75

Figura 34- DEO, NF- B < 5% (SABC/200x). 75

Figura 35- CEO, NF- B > 50% (SABC/100x). 75

Figura 36- CEO, NF- B 5-50% (SABC/400x). 75

13

RESUMO

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RESUMO

A Displasia Epitelial Oral (DEO) é a lesão que precede ou co-existe com o Carcinoma

Epidermóide Oral (CEO), apresentando alterações moleculares e/ou histológicas

semelhantes. As divergências sobre o potencial de malignização das DEO e o papel da

inflamação nestes processos têm dificultado o diagnóstico precoce e a avaliação da

agressividade dos CEO. Sendo assim, tornou-se objetivo deste estudo avaliar o papel da

inflamação na carcinogênese oral e agressividade tumoral. Para isso foi realizado estudo

morfológico em 20 casos de DEO e 40 casos de CEO para detectar o potencial de

malignização das DEO e o Grau Histológico de Malignidade (GHM) dos CEO,

analisando as massas superficiais para avaliação do dismorfismo e o front invasivo para

avaliação do crescimento tumoral; e imuno-histoquímico, utilizando os anticorpos anti-

CD8, anti-FOXP3, anti- -TNF- -NF- B, para comparar a expressão

dos mesmos com o tipo de lesão, grau histológico e intensidade do infiltrado

inflamatório. Os resultados foram estatisticamente significantes para os parâmetros,

maturidade celular (p=0,0001), presença de massas (p=0,038) e dismorfismo (p=0,037),

quando associados aos GHM. Ao comparar a expressão dos marcadores com o tipo de

lesão, encontrou-se uma expressão significativamente maior do CD8 (p=0,001) e do

NF- B (p=0,002) nas DEO, assim como uma menor expressão nas

DEO severas (p=0,011), não tendo expressão significativa entre os graus dos CEO. Ao

relacionar a expressão dos marcadores estudados com a intensidade do infiltrado

inflamatório, observou-se uma rela inflamatório (p=0,003), o

NF- B epiteliais (p=0,051 e p=0,004), nas DEO; com o CD8 (p=0,021) e o

(p=0,015) no conjuntivo dos CEO; e uma relação negativa

(p=0,034) epitelial dos CEO. Não foi encontrada relação significativa da FOXP3 com

nenhuma das variáveis estudadas. Esses achados levaram a concluir que, o estudo do

front invasivo é tão importante quanto o estudo das massas superficiais para avaliação

da agressividade tumoral; a intensidade do infiltrado inflamatório não pode ser utilizado

como parâmetro para avaliação prognóstica do CEO no exame de rotina; mas os eventos

moleculares detectados neste estudo podem ser necessários para embasar a

determinação do potencial de malignidade nas DEO e da agressividade nos CEO.

PALAVRAS-CHAVE: Carcinoma epidermóide oral, Displasia epitelial oral, Gradação

histológica de malignidade, Infiltrado inflamatório, Imuno-histoquímica.

15

ABSTRACT

16

ABSTRACT

The Oral Epithelial Dysplasia (OED) is the lesion that precedes or co-exists with the

Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC), presenting molecular and/or histological

similar alterations. The divergences about the malignization potential of OEDs and the

role of inflammation in this process make hard the early diagnosis and evaluation of

OSCCs aggressiveness. Thus, it became the goal of this study to evaluate the role of

inflammation in oral carcinogenesis and tumoral aggressiveness. For this purpose a

morphological study was performed in 20 OED cases and 40 OSCC cases to detect the

malignization potential of OEDs and the histologic malignancy grading (HMG) of

OSCCs, analyzing superficial masses for dismorphism evaluation and the invasive front

for evaluation of tumoral growing; and immunohistochemical, using anti-CD8, anti-

FOXP3, anti-TGF , anti-TNF and anti-NF- B antibodies, comparing their with the

types lesion, histological degree and intensity of the inflammatory infiltrate. The results

were statistically significant for the parameters: cell maturity (p=0,0001), masses

presence (p=0,038) and dismorphism (p=0,037), when associated to HMG. To compare

the expression of the markers with the types lesion, a significantly higher expression of

CD8 (p=0,001) and NF- B (p=0,002) in the OED, and also a smaller expression of the

epithelial TGF in the severe OEDs (p=0,011), without significant expression between

OSCC degrees. By relating the expression of the studied markers with the inflammatory

infiltrate intensity, a positive relation was observed with: inflammatory TNF (p=0,003),

epithelial TNF and NF- B (p=0,051 and p=0,004), in OEDs; and with CD8 (p=0,021)

and TNF (p=0,015) in conjunctive OSCCs; and a negative relation with epithelial

TNF (p=0,034) in OSCCs. No significant relation was found between FOXP3 with any

of the studied variables. These findings lead to the conclusion that, the study of the

invasive front is as important as the study of superficial masses for the evaluation of

tumoral aggressiveness; the intensity of the inflammatory infiltrate has no use as a

parameter for prognostic evaluation of OSCC in routine exams, but, the molecular

events detected in this study may be necessary to give basis for determining the

malignant potential in OEDs and aggressiveness in OSCCs.

KEYWORDS: Oral Squamous Cell Carcinoma, Oral Epithelial Dysplasias, Histologic

Malignancy Grading, inflammatory infiltrate, immunohistochemical.

17

SUMÁRIO

18

SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO 19

2 REVISÃO DE LITERATURA 21

2.1 Carcinoma Epidermóide (considerações gerais) 22

2.2 Parâmetros para Gradação Histológica de Malignidade 27

2.3 Papel da Inflamação na Carcinogênese 29

2.4 Evasão da Resposta Imunológica no CEO 35

- 37

3 PROPOSIÇÃO 44

4 MATERIAL E MÉTODOS 46

4-1 Caracterização do Estudo 47

4.2 População e Amostra 47

4.3 Implicações Éticas 47

4.4 Estudo Morfológico 48

4.5 Estudo Imuno-Histoquímico 51

4.6 Análise dos Resultados 53

5 RESULTADOS 55

5.1 Resultados Morfológicos 56

5.2 Resultados Imuno-Histoquímicos 60

5.3 Resultados Estatísticos 65

6 DISCUSSÃO 78 7 CONCLUSÃO 94 REFERÊNCIAS ANEXOS

19

INTRODUÇÃO

20

1- INTRODUÇÃO

Os Carcinomas são as neoplasias malignas de maior incidência no ser humano

sendo que, o Carcinoma Epidermóide (CE) corresponde a cerca de 95% das neoplasias

malignas orais (ALBERTS, 2004; CHOI et al., 2006). A Displasia Epitelial, é o evento

histológico que antecede ou co-existente em muitos CE, o que assegura seu potencial

pré-maligno, estando ambos associados à fatores de risco como a radiação ultra-violeta

(uv), o fumo, o álcool, e infecção por alguns tipos virais, entre eles o HPV, e quando

associados à predisposição genética de cada indivíduo, podem aumentar o potencial

cancerígeno ou, quem sabe, dar início a um processo que está freqüentemente associado

à reação inflamatória.

Estudos têm demonstrado que a ação intermitente ou descontrolada de citocinas

que participam do processo inflamatório são capazes não só de transformar como de

induzir à progressão, invasão e metástase das células neoplásicas (AGGARWAL, 2006)

e de alguns tipos celulares que participam do controle da inflamação e defesa anti-

tumoral (ABBAS e LICHTMAN, 2005).

Embora para alguns pesquisadores o infiltrado inflamatório funcione como

defesa do hospedeiro no Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) (BRYNE et al.,1989),

outros acreditam que ele possa atuar na transformação e progressão tumoral

(BALKWILL e MANTOVANI, 2001). Porém, novos estudos são necessários para que

se possa esclarecer seu verdadeiro papel no câncer.

Sabendo-se que as células inflamatórias, em maior ou menor quantidade, estão

presentes nas Displasias Epiteliais Orais (DEO) e nos Carcinomas Epidermóides Orais

(CEO), pretende-se estudar o papel das mesmas, na transformação e progressão tumoral,

através dos eventos moleculares que ocorrem na carcinogênese, utilizando a expressão

imuno-histoquímica de marcadores relacionados à ativação ou inibição do CD8,

principal responsável pela defesa anti-tumoral e do fator de transcrição NF- B,

responsável pela produção de grande parte das citocinas pró-inflamatórias. Esses

eventos podem ajudar a esclarecer o potencial de malignização das DEO e a

agressividade dos CEO, bem como a utilização da intensidade do infiltrado inflamatório

como parâmetro de malignidade para a gradação histológica, ajudando na prevenção e

tratamento precoce do câncer.

21

REVISÃO DE LITERATURA

22

2- REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS:

Displasia epitelial e carcinoma epidermóide oral

O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) é caracterizado por alterações

morfológicas e funcionais das células, associadas à diferenciação e crescimento, que

definem o processo de progressão tumoral. Várias lesões, histologicamente distintas,

precedem o aparecimento do CEO, as quais apresentam eventos similares àqueles

observados na progressão, justificando seu potencial de malignidade (MITHANI, 2007).

A Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1978, classificou como lesão pré-

cancerosa aquela que apresente alterações morfológicas nas quais o desenvolvimento do

CEO seja mais provável que o tecido normal (Leucoplasia, Eritroplasia e Lesão do

Palato por Fumo Invertido) e, como condição pré-cancerosa, uma situação associada a

um aumento significativo do risco de câncer (Fibrose Submucosa, Ceratose Actínica,

Líquen Plano e Lupus Eritematoso Discóide). Esse mesmo grupo definiu a

ue não pode ser classificada clinicamente ou

patologicamente como qualquer outra doença, permanecendo por quase 25 anos, quando

em 2005, a OMS redefiniu-a como uma placa branca de risco questionável, depois de

excluído o diagnóstico de doenças conhecidas ou desordens sem risco aumentado de

transformação maligna. Portanto, não devendo ser usado como descritor clínico de uma

lesão branca (WARNAKULASURIYA, JOHNSON e VAN DER WAAL, 2007). Para

Mithani (2007), a leucoplasia é uma lesão pré-maligna que pode apresentar similaridade

molecular e/ou histológica com o CEO, quando apresenta displasia epitelial.

É importante ressaltar que a Displasia Epitelial Oral (DEO) não dispõe de uma

aparência clínica específica, sendo encontrada com freqüência precedendo o

desenvolvimento ou co-existindo com o Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) (WHO,

1978; LUMERMAN, FREEDMAN e KERPEL, 1995; PINDBORG et al., 1997;

REIBEL, 2003).

23

As dificuldades quanto ao diagnóstico e gradação das displasias epiteliais são

grandes entre os patologistas. Por isso, a OMS em 2005, resolveu propor um método

binário, diminuindo de três para duas, as possibilidades diagnósticas e

conseqüentemente as chances de desacordo entre os profissionais. Foi sugerido estudo

longitudinal para testar a significância do baixo e alto risco de displasia. O termo

desordens potencialmente malignas foi sugerido, sendo a biópsia, prática necessária

para confirmar a presença de displasia, embora outros autores como Kuffer e Lombardi

(2002), tenham sugerido o termo, neoplasia intra-epitelial escamosa (SIN), ou mesmo

como neoplasia intra-epitelial oral (OIN). Na boca, o epitélio das lesões precursoras é

geralmente atrófico, sem evidência de invasão, e a quantidade de queratina é irrelevante,

porém, para o diagnóstico de displasia, deve-se considerar em primeiro lugar, as

alterações arquiteturais e em seguida, as citológicas (WARNAKULASURIYA et al.,

2008).

A Displasia Epitelial Oral (DEO) é o evento que assegura, histologicamente, o

potencial pré-maligno, já que apenas 15% das lesões sem displasia evoluem para CEO

(SILVERMAN, GORSKY e LOZADA, 1984). Sendo assim, através da biologia

molecular, várias proteínas relacionadas à progressão tumoral têm se mostrado

significativamente alteradas em estudos comparativos entre lesões pré-malignas com

Displasias Epiteliais Orais e o CEO, mas não entre os graus histológicos de malignidade

(ABBAS et al., 2007).

Apesar da grande maioria das leucoplasias estarem associadas ao fumo, apenas

2,1% das lesões, em pacientes fumantes, tornaram-se malignas em comparação com

11,1% dos pacientes não-fumantes. As porções lateral e ventral da língua são as mais

afetadas, geralmente de forma não-homogênea, envolvendo mulheres idosas e não-

fumantes (NAPIER e SPEIGHT, 2008).

Embora a cirurgia tenha efeito benéfico, não reduz o risco de recorrência e

posterior transformação. Já a cessação de atividade de risco reduz, teoricamente, o risco

de transformação maligna ou desenvolvimento de novas lesões (LODI e PORTER,

2008). Warnakulasuriya et al. (2008) não acreditam que as mutações ocorridas nas

displasias sejam as mesmas responsáveis pela transformação maligna, mas o acúmulo

dessas mutações pode levar à transformação.

24

Além disso, a interação entre as células tumorais e o estroma peritumoral pode

ser um passo importante na progressão, visto que o compartimento estromal de um

tumor abriga uma grande variedade de células entre elas: fibroblastos, células

endoteliais e inflamatórias que passam a trabalhar a favor da progressão, ao produzirem

fatores que estimulam angiogênese, crescimento e metástase (BISWAS et al., 1995;

HANAHAN e WEINBERG, 2000 ).

Esse papel coube, em grande parte, ao indutor extracelular de metaloproteinases

da matriz, EMMPRIN, designado CD147 no Sexto Seminário Internacional e

Conferência sobre antígenos de diferenciação de leucócitos humanos (KOCH et al.,

1999). Para Yan, Zucker e Toole (2005) experimentos comprovam que o EMMPRIN

induz várias propriedades associadas à malignidade incluindo, invasividade,

angiogênese e ancoragem independente de crescimento. Processo esse que pode ter

início na remodelação da Membrana Basal ou Matriz extracelular ao redor das lesões

pré-malignas.

O Câncer Oral é o 8º câncer mais comum do mundo e o 4º do Brasil (INCA,

2008). Entre 90-95% de todas as neoplasias malignas da boca são carcinomas

epidermóides, sendo também denominados, carcinomas espinocelulares ou carcinomas

de células escamosas. Isso talvez se deva ao fato da maior parte da proliferação celular

de um organismo humano ocorrer nos epitélios, e/ou então porque os tecidos epiteliais

são expostos com maior freqüência às mais variadas formas de agressões físicas e

químicas, o que susceptibilizar o desenvolvimento do câncer, caracterizado por

proliferação desordenada das células escamosas do epitélio, expressando variáveis graus

de similaridade com suas células de origem (MOORE et al., 2000; DANTAS et al.,

2003; ALBERTS et al., 2004; CHOI et al., 2006).

Para Choi et al. (2006) o CEO é uma das neoplasias mais difíceis de ser

controlada, tendo uma sobrevida de 5 anos em apenas 35-50% dos casos, atribuindo este

fato ao reconhecimento tardio das lesões bem como à falhas no tratamento. Segundo

Kademani et al. (2005), a metástase em linfonodos é um dos principais indicadores

25

prognósticos, podendo ser responsável por uma queda de 50% da chance de

sobrevivência.

Já está bem estabelecido que, o câncer oral tem etiologia multifatorial, na qual

estão envolvidos tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos, sendo provavelmente

necessária a ação de mais de um desses carcinógenos para produção da malignidade.

Esta requer desestabilização de vários sistemas de controle que coordenam o

comportamento celular (PANDE et al., 2002; RAMALHO et al., 2002; NAGPAL,

DAS, 2003; SCHLIEPHAKE, 2003).

De acordo com Boshoff e Weiss (2001) ocorre, na maioria dos casos, um

acúmulo seqüencial de mutações somáticas por muitos anos, antes da expansão clonal

de células transformadas e, as lesões que se tornam clinicamente evidentes são

aparentemente resistentes aos mecanismos de defesa da imunidade celular (KERREBIN

et al., 1999).

O tabagismo e o etilismo crônicos são os principais fatores de risco para o

câncer de boca (MOORE et al., 2000; REGEZI, SCIUBBA, 2000; CANTO, DEVESA,

2002; BETTENDORF, PIFFKÒ, BANKFALVI, 2004; TROMP et al., 2005; GHOSHAL

et al., 2006), pois, apenas 15 a 20% dos pacientes portadores de lesões malignas orais

não têm história pregressa destes hábitos (VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004).

Conforme citam Venturi, Pamplona e Cardoso (2004), o risco de

desenvolvimento de CEO na população geral aumenta em cerca de sete vezes com o

tabagismo, e em até quinze vezes quando este hábito está associado ao consumo crônico

de álcool. Todavia, Schmidt et al (2004) verificaram que 1/3 dos pacientes de sua

amostra acometida por CEO, nunca fumaram.

Para zur Hausen (2000), 15 a 20% da incidência de câncer na população mundial

pode ser ligada etiologicamente à infecções específicas, sendo que, nos últimos anos, as

atenções têm sido voltadas particularmente ao HPV (BOUDA et al., 2000), que segundo

Schiffman e Castle (2003), é necessária mas não suficiente para causar câncer cervical.

Alguns fatores de risco que promovem a progressão tumoral nesses casos têm sido

amplamente estudados, como o tabagismo e o uso de contraceptivos.

26

Liang et al. (2008), estudando o carcinoma de língua, encontrou a presença de

HPV em apenas um caso dos 51 avaliados, contrastando com estudo anterior onde havia

encontrado a presença viral em 51,5% dos casos, concluindo portanto, ser a localização,

o fator divergente, responsável pelo resultado encontrado, visto que no primeiro estudo,

a amostra era da base da língua e no mais recente, da região anterior da língua.

Outros fatores como a exposição crônica à radiação solar (NEVILLE et al.,

2004) e deficiência nutricional ; INCA, 2008), podem favorecer

o desenvolvimento do CEO, em pessoas de pele clara e dietas inadequadas que

funcionam como fonte de radicais livres, respectivamente.

A localização anatômica dos CEO depende fundamentalmente dos fatores de

risco. Em fumantes de cachimbo é mais comum o carcinoma de palato, em mascadores

de fumo, o da mucosa jugal, e em alcóolatras e fumantes de cigarro, os da língua,

assoalho da boca e gengiva inferior (KOWALSKI, 1991). Ghoshal et al. (2006),

encontraram uma maior incidência de CE na mucosa jugal de indianos com hábito de

mascar fumo e Magrini et al. (2000); Kerdpon, Sriplung (2001) e Costa et al. (2002)

relataram uma maior incidência em língua e lábio inferior, embora o CEO de lábio

inferior esteja relacionado àqueles pacientes de pele clara que se expõem

freqüentemente à radiação solar, ou utilizam o lábio como apoio para o cigarro, charuto

ou cachimbo, cabendo a este a fração de 25 a 30% dos casos de câncer bucal (REGEZI,

SCIUBBA, 2000; NEVILLE et al., 2004).

Segundo Costa et al. (2002) e Miranda (2002), a localização anatômica também

encontra-se relacionada ao comportamento biológico do CEO, visto que os tumores

localizados no lábio inferior apresentavam grau de malignidade mais baixo que os

localizados na língua, o que pode ser atribuído à maior probabilidade destes

desenvolverem metástases ocultas e conseqüentemente baixa taxa de sobrevivência em

função da infiltração muscular observada mesmo quando detectados nos estágios

iniciais (AMARAL et al., 2004).

27

Os homens, principalmente aqueles que se encontram entre a quinta e a oitava

década de vida, têm uma probabilidade duas vezes maior de desenvolver CEO, embora

essa diferença tenha diminuído nos últimos anos, aumentando entre as mulheres

(REGEZI, SCIUBBA, 2000) e pessoas mais jovens, com menos de 40 anos

(O`REAGAN et al., 2006).

Schantz e Yu (2002) relataram que o CEO tem uma incidência de 0.4 a 3.9% em

pacientes jovens, havendo nestes casos uma maior agressividade da neoplasia e um pior

prognóstico; Sasaki et al. (2005) afirmaram que o prognóstico em pacientes mais jovens

não difere daqueles que acometem pacientes mais velhos.

Estados de imunodeficiência, especialmente os relacionados à deficiência de

imunidade do tipo celular, como a AIDS, aumentam a suscetibilidade às infecções em

geral, sendo alta a prevalência de lesões provocadas por HPV nestes grupos, tanto por

reativação de uma infecção latente como por aquisição de uma nova infecção (VILLA,

AN et al., 2006).

Doenças inflamatórias crônicas, como as doenças auto-imunes, de etiologia

desconhecida, caracterizadas por infiltrado linfocitário sub-epitelial e destruição da

membrana basal e/ou ceratinócitos, onde os linfócitos T citolíticos (LTC),

possivelmente induzidos por Th1, levam os ceratinócitos à apoptose (SUGERMAN et

al., 2002), vêm sendo consideradas fatores de risco para transformação maligna ou

mesmo, lesões pré-malignas (PINDBORG et al., 1997; MIGNONA et al., 2004; ACAY

et al., 2006).

2.2 PARÂMETROS PARA GRADAÇÃO HISTOLÓGICA DE MALIGNIDADE

A grande variação no aspecto histológico do CEO, o qual teve Broders (1920)

como pioneiro na sua classificação, baseando-se no grau de diferenciação das células

tumorais e em seguida, com o prognóstico da mesma (BRODERS, 1941), levou ao

desenvolvimento de vários sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHM) a

fim de viabilizar a interpretação da agressividade do tumor (MARTINS NETO, 1999).

Para Kurokawa et al. (2005) o aspecto histológico pode refletir a relação

tumor/hospedeiro.

28

Vários parâmetros como: ceratinização de células individuais, formação de

pérolas córneas, presença de pontes intercelulares, número e aspecto das figuras de

mitose, grau de pleomorfismo celular e nuclear, e presença de células gigantes

multinucleadas (WAHI, 1971); estrutura neoplásica, ceratinização, pleomorfismo

nuclear, número de mitoses, modo e estágio de invasão, invasão vascular e infiltrado

inflamatório linfoplasmocitário (JACKOBSSON et al., 1973); grau de ceratinização,

pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão, infiltrado inflamatório e

invasão vascular (CRISSMAN et al., 1984) e grau de ceratinização, pleomorfismo

celular, número de mitoses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado

inflamatório linfoplasmocitário (ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1987) foram

utilizados e, em 1999, Martins Neto em uma revisão sobre SGHM do CEO considerou o

grau de ceratinização, a atividade mitótica e as atipias celulares e nucleares, os

parâmetros de maior relevância, por serem comuns à maioria dos sistemas propostos.

No sistema proposto por Bryne (1989) a autora sugeriu que as células presentes

na área do front de invasão tumoral exibem diferentes características moleculares

quando comparadas com as áreas superficiais do tumor, e que interações entre o tumor e

uma importante região para determinação do prognóstico.

Para Bryne (1998) e Kurokawa et al. (2005) a população celular das áreas mais

invasivas (mais profundas) exibem um perfil mais agressivo (população mais

heterogênea) do que a situada nas áreas centrais e superficiais do tumor, além de ser

nessa área que as células tumorais se encontram com maior índice de proliferação e

conseqüentemente menor grau de diferenciação. Portanto, Bryne (1998) propôs um

novo SGHM com avaliação apenas do front de invasão tumoral, baseando-se em quatro

parâmetros: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado

inflamatório, já que em 1992, Bryne et al. verificaram que a exclusão do parâmetro

aumentasse a reprodutibilidade.

29

Kurokawa et al. (2005) avaliaram 124 pacientes com CE de língua onde 66,7%

tiveram sobrevida acima de 5 anos e concluíram que os casos com escore < 8 e aqueles

com escore > ou igual a 11, avaliados pela Gradação do Front Invasivo, tinham melhor

e pior prognóstico, respectivamente.

Segundo Costa, Araújo-Júnior e Ramos (2005), a gradação histológica das partes

mais profundas do tumor influencia diretamente na sobrevida do paciente, pelo fato das

células neoplásicas nesse local mostrarem-se indiferenciadas. Estes autores acharam um

infiltrado inflamatório predominantemente discreto, nos casos de CEO agressivos,

quando correlacionados com o desenvolvimento de metástase nos linfonodos cervicais

(TNM II/IV).

Silveira (2007) verificou que as células inflamatórias CD8 e CD25 positivas

tinham maior participação nas lesões menos agressivas (lábio inferior), assim como o

anti- foi mais marcante nos casos sem metástase, independente da localização

anatômica. A autora afirmou ainda que o infiltrado inflamatório exerceu certa influência

na agressividade dos CE de língua e lábio inferior estudados e de certa forma pode estar

contribuindo para as controvérsias no tocante a utilização deste como critério

morfológico indicador de agressividade, visto que, a grande maioria (80%) da amostra,

apresentou infiltrado inflamatório variando de moderado a intenso.

2.3 PAPEL DA INFLAMAÇÃO NA CARCINOGÊNESE

A inflamação, freqüentemente presente no CEO (HOFFMANN, BIER e

WHITESIDE, 2004), é uma resposta protetora do organismo cujo objetivo é livrá-lo da

causa inicial da lesão. Essa resposta ocorre no tecido conjuntivo vascularizado, cuja

reação vascular leva ao acúmulo extra-vascular de líquido e leucócitos estando

estreitamente ligada ao processo de reparo, caracterizado pela capacidade do organismo

substituir células lesadas ou mortas após a inflamação. Logo, a proliferação celular pode

ser estimulada, sendo a mesma controlada por fatores químicos do micro-ambiente. A

população celular, no tecido adulto, é determinada pela velocidade de proliferação,

diferenciação e morte por apoptose. Porém, um excesso de fatores estimulantes, ou uma

30

deficiência de inibidores pode resultar em um crescimento descontrolado, ou seja, o

câncer (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).

Uma variedade de agentes lesivos, ao mesmo tempo em que provoca danos

celulares dispara uma série de eventos que servem para conter a lesão. As respostas

vasculares e celulares são desencadeadas por estímulos inflamatórios, e a inflamação só

termina quando o estímulo lesivo é removido e os mediadores dissipados ou inibidos

(COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).

Na grande maioria das vezes, a remoção do estímulo inflamatório fica sob

responsabilidade do sistema imunológico, que tem como função defender contra

microorganismos infecciosos, embora, atue também contra substâncias estranhas não

infecciosas. A imunidade natural ou inata fornece a primeira linha de defesa contra os

microorganismos, mas não reconhece diferenças discretas entre substâncias estranhas.

Uma outra forma de imunidade mais específica e com memória é desenvolvida em

resposta a infecções, conhecida como imunidade adaptativa ou adquirida (ABBAS e

LICHTMAN, 2005).

Muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de ativar o sistema

imunológico de forma específica (JANEWAY et al., 2007), já que ele não é efetivo

frente a muitos tipos de tumores (KACANI et al., 2003; ABBAS e LICHTMAN, 2005).

Para isso, é necessário a identificação dos antígenos associados às células tumorais,

pois, tumores sediados na cavidade oral são freqüentemente circundados por infiltrado

inflamatório com células imunes (HOFFMANN, BIER e WHITESIDE, 2004).

Os mecanismos efetores da resposta imunológica têm início com a ligação de

um agente sinalizador a um receptor específico, na superfície celular que envia sinais ao

núcleo através de vias de transdução de sinais, onde fatores reguladores conhecidos

como fatores de transcrição promovem alterações específicas na regulação da expressão

gênica (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).

O NF- B é um fator de transcrição ativado em resposta aos sinais do receptor de

célula T (TCR) sendo essencial para a síntese de citocinas. Na célula T em repouso,

essa proteína encontra-se no citoplasma associada a proteínas inibidoras (I Bs). Os

31

sinais do TCR induzem à fosforilação pelas I B cinases (IKK), que é seguida pela

inserção de múltiplas cópias de uma pequena proteína chamada ubiquitina, liberando

assim o NF- B que entra no núcleo, onde contribui para a ativação transcricional de

vários genes de citocinas e receptores de citocinas. O NF- B está envolvido na ativação

da célula T, contribuindo para a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e na resposta de

muitos tipos celulares às citocinas pró-inflamatórias tais como o fator de necrose

tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1) e lipoproteínas bacterianas (LPS) (HAYDEN e

GHOSH, 2004; ABBAS e LICHTMAN, 2005).

A manutenção do NF- B ativado durante a inflamação, predispõe à

transformação maligna, podendo ser utilizado para inibir a transformação tumoral, mas

para isso, é preciso interferir no seu papel fisiológico, tanto na imunidade e/ou

inflamação, como na homeostase (PACIFICO e LEONARDI, 2006).

Os tumores humanos podem ativar linfócitos CD4 ou CD8, dependendo da via

do processamento para desencadear a resposta imunológica, e o controle do tumor

depende tanto da magnitude da resposta imunológica inicial, como da capacidade de

sustentar essa resposta por um período prolongado (SABEL et al., 2005).

O principal mecanismo de defesa anti-tumoral é a morte das células neoplásicas

pelos linfócitos T CD8, também conhecidos como linfócitos T citotóxicos (LTC), as

quais podem reconhecer e matar células potencialmente malignas que expressem

peptídeos derivados de proteínas celulares mutantes ou proteínas virais oncogênicas

associadas ao MHC classe I (ABBAS e LICHTMAN, 2005).

A função dos linfócitos T CD4 parece estar relacionada com a produção de TNF

pelos macrófagos e INF pela população Th1, podendo ser responsável pelo aumento na

expressão do MHC-I pelas células neoplásicas, resultando na sensibilisação dos

linfócitos T CD8 e conseqüente lise das células neoplásicas pelo sistema

perforina/granzima (CHANG et al., 2005), ou através da ligação do Fas presente nas

células tumorais com o Fas-L (CD95) dos Linfócitos (ABBAS e LICHTMAN, 2005).

Ainda segundo Chang et al. (2005), a supressão dos linfócitos CD4 Th1 resulta em

progressão tumoral.

32

Segundo Janeway et al. (2007), a resposta imune do tipo celular, se dá através do

receptor de célula T (TCR) associado a moléculas transmembranas designadas CD3 e

(zeta), as quais traduzem a ligação extracelular com o antígeno em sinais ativadores

para o interior da célula, e a completa ativação requer um segundo sinal co-

estimulatório fornecido pela ligação do CD28, presente nos linfócitos, ao B7-1 ou B7-2

nas APC.

Quando os linfócitos se tornam células ativadas, passam a expressar receptores

para IL-2, podendo ser identificados pelo método da imuno-histoquímica, utilizando-se

o anticorpo anti-CD25 (WEISS, 1993). Porém, Sato et al (2005) lembram que o CD25

também se encontra expresso na superfície das células T regulatórias, as quais exibem

propriedades imunossupressoras. Segundo Hoffmann, Bier e Whiteside (2004) a IL-2 é

capaz de inibir o crescimento de CE de cabeça e pescoço.

A célula Treg, é um subtipo de linfócito T que tem o papel de induzir e manter a

tolerância imunológica, bem como a finalização da resposta imune. A deficiência ou

diminuição dessa célula pode conduzir a uma doença auto-imune (HORI, NAMURA e

SAKAGUSHI, 2003; MAGGI et al., 2005).

Bluestone e Abbas (2003) propuseram dois grupos de células Treg profissionais:

a célula Treg Natural, que se desenvolve no timo, tem elevada expressão constitutiva de

CD25 (CD4+CD25+) e destrói outras células T por contato, independente de citocinas,

tendo papel importante na tolerância contra antígenos próprios; A Treg Adaptável (Th3)

torna-se madura nos tecidos periféricos, sob estimulação antigênica e/ou co-

estimulação, exercendo função supressiva através de secreção de IL-10 e TGF- .

Forkhead Fox P3 (Foxp3), uma proteína responsável pela regulação das funções

e desenvolvimento das células Treg, tem sido utilizada na detecção das mesmas

(SAKAGUCHIS, 2004; SATO et al., 2005; BOER et al., 2007), sendo considerada por

Hori, Namura e Sakagushi (2003), o melhor marcador para essas células. Boer et al.

(2007) afirmaram ainda que Foxp3 é quase que exclusiva das células que expressam

CD4 e CD25, que devem expressar também GITR (Glucocorticoid-Induced TNF

Receptor) e CTLA-4.

33

Boer et al. (2007) relataram que Foxp3 pode ser um fator de transcrição que

induz GITR, talvez por isso encontraram um grupo de células Foxp3 (+) e GITR (-), não

considerando este último, um bom marcador.

Wan e Flavell (2007) demonstraram que a diminuição da expressão de Foxp3

causa doença auto-imune dose dependente através da transformação das células Treg

em células efetoras, as quais instruiriam uma diferenciação Th2 nas células T

convencionais.

Vários estudos têm ressaltado o envolvimento da célula Treg no

desenvolvimento e progressão do câncer (PETERSEN et al., 2006; FU et al., 2007;

KOBAYASHI et al., 2007), e como a expressão de CD4+CD25+ não quer dizer que

essas células sejam Treg, pelo fato de outras células T, recentemente ativadas, poderem

expressar CD25, a proteína Foxp3 pode ajudar a entender o papel de Treg na

carcinogênese (BOER et al., 2007).

A propriedade imuno-supressiva das células T CD4 foram associadas à baixa

sobrevivência de pacientes com câncer de ovário (CURIEL, 2004), embora Sato et al.

(2005) não acreditassem que apenas o infiltrado de células T CD4 fosse responsável

pela baixa sobrevivência e sim, que a influência da modulação de CD4 sobre os

benefícios de CD8 dependesse do número de células Treg na população CD4.

A inflamação crônica como fator de risco para o câncer já havia sido cogitada

por Virchow no início do século XIX e constatada por Weitzman e Gordon (1990) ao

associar várias doenças inflamatórias crônicas como doença de Bowel, gastrite atrófica,

colecistite crônica e esofagite de refluxo com o desenvolvimento do câncer. Contudo,

com a biologia molecular vieram os vários estudos que envolviam a relação do tumor

com o estroma peri-tumoral (BALKWILL e MANTOVANI, 2001; COUSSENS e

H, 2001; YAN, ZUCKER E TOOLE, 2005),

ficando evidente a contribuição deste com o crescimento tumoral, invasão e metástase

(MIGNOGNA et al., 2004; AGGARWAL et al., 2006; VIGNESWARAN et al., 2006).

34

Para Balkwill e Mantovani (2001), ficou mais fácil sugerir a participação das

citocinas e células inflamatórias no desenvolvimento e progressão tumoral do que uma

resposta anti-tumoral do hospedeiro (NAKANO et al., 2001), como proposto em vários

outros estudos onde serviu de parâmetro para gradação histológica de malignidade

(JACKOBSSON et al., 1973; ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1986; BRYNE et

al., 1989).

Aumento na concentração de linfócitos CD4 e CD8 foram relacionados tanto

com a transformação como com a progressão do câncer oral e este, exercia influência

tanto na reação imune local quanto na sistêmica (GANNOT et al., 2002 e GANNOT,

BOCHNER e KEISARI, 2004).

A quantidade de linfócitos T CD8 esteve relacionada com o grau de

diferenciação no câncer de pulmão, sendo maior quando as células encontravam-se

indiferenciadas (MORI et al., 2000), e segundo Sheu et al. (1999), os CD4 estiveram

diminuídos em relação ao CD8 em tumores cervicais de crescimento rápido e produção

de metástase.

Na revisão de Chang et al. (2005), os autores citaram um estudo onde a relação

CD4/CD8 era menor nas displasias moderadas e severas do que nas displasias leves,

sendo a maioria dos CD8 considerados supressores, sugerindo um desequilíbrio

imunológico local, e um outro que considerou essa relação menor que 1 preditiva de

metástase em linfonodo. Sendo assim, esses autores sugeriram a possibilidade dessa

deficiência de linfócitos CD8 no CEO, ser devido a fatores inibitórios liberados pelas

células tumorais.

Daniel et al. (2003) encontraram concentrações elevadas de linfócitos CD4 na

transformação de lesões pré-cancerosas para o câncer de pele, sugerindo a possibilidade

destas estarem relacionadas com a progressão tumoral.

Sato et al. (2005) encontraram um prognóstico favorável nos tumores que

apresentavam uma alta taxa na relação CD8/Treg, ao estudar 117 canceres de ovário,

ressaltando a importância da localização intra-epitelial dos linfócitos e a detecção das

células Treg sendo feita através de dupla marcação CD25/FOXP3.

35

2.4 EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA NO CEO

O escape à ação do sistema imunológico resulta em progressão rápida do câncer,

sendo necessário o uso da imunoterapia para potencializar a resposta anti-tumoral do

hospedeiro e evitar a disseminação (SHEU et al., 1999).

Os cânceres surgem a partir da proliferação e disseminação descontrolada de

clones de células transformadas, os quais deveriam ser reconhecidos pelo sistema

imune, antes de se transformar em tumor. Embora já tenha sido comprovado que o

sistema imune reage contra muitos tumores, ou pelo menos atrasa a progressão, não se

sabe ainda, o aproveitamento dessas reações imunológicas para destruir tumores de

forma específica. Além disso, tem-se que contar com a capacidade das células tumorais

de evadir ou superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (COUSSENS e WERB,

2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005). A remodelação da matriz extracelular (MEC) e

membrana basal (MB) confinada ao microambiente pericelular das lesões Pré-Malignas,

podem ser o primeiro passo para a invasão (YAN, ZUCKER e TOOLE, 2005).

O fenômeno da angiogênese, caracterizado pelo desenvolvimento de novos

vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura existente, é observado

em uma série de eventos fisiológicos e patológicos sediados na cavidade oral, incluindo

a inflamação, reparo tecidual e metástase tumoral (RAVI et al., 1998; SEDIVY et al.,

2003).

-2 é capaz de estimular células

mesenquimais indeferenciadas a liberar o P1GF (Fator de Crescimento Placentário), que

é importante no recrutamento de células hematopoiéticas e endoteliais indiferenciadas

em condições patológicas, como isquemia, inflamação, cicatrização e câncer (RAIDA et

al., 2005).

Segundo Abbas e Lichtman (2005), a evasão da resposta imunológica pode

ocorrer: pela sub-regulação do MHC da classe I ou qualquer componente da maquinaria

de processamento de antígeno, o que leva à perda da expressão deste e,

conseqüentemente, ausência de reconhecimento pela célula T; pela falta de co-

36

estimuladores ou MHC de classe II para induzirem a diferenciação dos LTC; pela

imunossupressão provocada por citocinas tumorais (TGF- ), que inibe a proliferação e

funções efetoras de linfócitos e macrófagos, ou através do ligante de Fas (FasL) que

reconhece o receptor de morte celular nos leucócitos que tentam atacar o tumor, levando

à apoptose; pela capacidade de alguns antígenos tumorais induzirem a tolerância

imunológica pois, os antígenos tumorais são antígenos próprios encontrados pelo

sistema imune em desenvolvimento ou em forma tolerogênica por linfócitos maduros,

permitindo livremente o seu crescimento.

La Gruta et al. (2004) acrescentaram que alteração ou ausência na expressão de

proteínas formadoras do complexo TCR estão relacionadas ao escape da neoplasia às

defesas do hospedeiro, como sugerem Gruiji et al. (1999) no caso dos componentes das

proteínas CD3 e (zeta) responsáveis por deficiências no sistema imune de pacientes

portadores de vários tipos de câncer.

Segundo Kiessling et al. (1996) e Reichert et al. (2002), isso pode estar

relacionado à liberação de citocinas imunossupressoras pelas células neoplásicas que

induziriam a degradação de constituintes do TCR, já que o referido domínio pode ser

clivado pela atividade proteolítica das caspases induzida por Fas (GASTMAN et al.,

1999). Reichert et al. (2002) encontraram ainda, que o aumento na proporção das

células apoptóticas estava relacionada com a redução na expressão do domínio . Como

sugeriram La Gruta et al. (2004), a redução ou ausência da expressão de proteínas

formadoras do complexo TCR, como a proteína está diretamente relacionada à

irresponsividade dos LT frente a estimulação antigênica.

O Fas é um receptor da família do TNF, membro dos receptores com domínio de

morte que pode estar envolvido na apoptose de linfócitos em tumores humanos

(ALDERSON et al., 1995).

Outra proteína chamada CTLA-4 (CD152), homóloga à CD28, liga-se ao B7-1 e

B7-2, e é expressa nas células T ativadas, mas não nas células T naive. CTLA-4 inibe a

ativação da célula T, possivelmente bloqueando a fosforilação das cadeias associadas

ao receptor de célula T (TCR) ao recrutar a fosfatase para sinapse. APCs normais em

37

repouso, que podem apresentar antígeno próprio, mas expressam pouco B7, ligam-se ao

CTLA-4 e induzem tolerância nas células T auto-reativas (ABBAS e LICHTMAN,

2005).

A MMP-9 também está envolvida no mecanismo de escape (evasão) à vigilância

imunológica ao clivar o receptor de IL-2, suprimindo a proliferação de células T

(COUSSENS e WERB, 2001) ou, quando ativa TGF- , um importante inibidor da

resposta por célula T contra tumor (YU e STAMENKOVIC, 2000; GORELIK e

FLAVELL, 2001).

Os mecanismos utilizados para escape às reações de defesa nas neoplasias

humanas são variados, o que pode ser complicado pela supressão da imunidade local e

sistêmica exercida por elas. Isso pode explicar a discrepância entre falhas e sucessos nas

imunoterapias (WHITESIDE, 2005) .

2.5 PAPEL DO TGF E TNF F- NO DESENVOLVIMENTO DO CEO

O TGF- é uma proteína cuja principal função no sistema imune é inibir a

proliferação e ativação de linfócitos e outros leucócitos, comumente designados

e codificados por genes diferentes, entre os quais, o 1 é o mais

freqüentemente superregulado nas células tumorais, podendo ser expresso por linfócitos

reguladores e/ou células neoplásicas para inibir a resposta de LTC, promovendo a

progressão e invasão tumoral (DERYNCK e FENG, 1997; GASTMAN et al., 1999;

GORELIK e FLAVELL, 2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005).

No tecido epitelial normal, TGF- regula o crescimento e a diferenciação

celular, porém, freqüentemente, funciona como supressor tumoral no início da

carcinogênese, depois, passa a funcionar como um promotor na progressão e metástase

(MASSAGUÉ, BLAIN e LO, 2000; MOUSTAKAS et al., 2002).

O papel supressor do TGF- é melhor ilustrado através da mutação de genes que

codificam seus receptores. Sendo assim, regulação negativa ou dano na disposição dos

receptores na superfície dos linfócitos T citolíticos, permitem que as células tumorais

38

escapem aos efeitos inibitórios de TGF- DERYNCK, AKHURST e BALMAIN,

2001).

Gorelik e Flavell (2001) desenvolveram ratos transgênicos sem receptor de

TGF- tipo II (dnTGF-RII) nas células T CD4 e CD8 e testaram seu efeito anti-tumoral

em modelos de timoma e melanoma, os quais estão associados com a produção de TGF-

, resultando em ratos resistentes ao crescimento tumoral, por uma potente resposta

tumor-específica por parte dos LTC. Porém, isso funciona quando o bloqueio de TGF-

ocorre antes das células tumorais inibirem as células T, sugerindo a inibição da

diferenciação de LTC e/ou expansão clonal, ou ainda destruição dos LTC pelo grande

número de células tumorais. Contudo, ficou claro que o bloqueio de TGF- favorece a

resposta imune anti-tumoral.

Glinka, Chang e Prud`homme (2006) observaram o papel inibitório de TGF- ,

ao utilizar uma proteína B7-1 mutante (B7-1wa) que se liga seletivamente ao CTLA-4,

associando-a à pré-proinsulina (PPins) e ao ácido glutâmico (GAD65) como vacina,

ambos utilizados contra diabetes auto-imune, com resultados favoráveis restritos,

induzindo assim o aumento de células T regulatórias (Treg) que

expressavam CTLA Foxp e GF- , tendo um efeito protetor contra a doença. A

deleção de TGF- abolia o efeito supressor exercido pela célula Treg.

Glick et al. (1994) demonstraram que a diminuição autócrina de TGF- em

ceratinócitos levou lesões papilomatosas a se transformarem em carcinomas, assim

como no câncer cervical, porém, as células cancerígenas desenvolvem uma resistência

parcial ou total a essa inibição nas células transformadas (DONALISIO et al., 2008).

Trombospondina, proteína da matriz extracelular e a integrina v 6 podem

mediar ativação do TGF- em diferentes contextos, e as células tumorais estão bem

equipadas para isso (SCHULTZ-CHERRY e MURPHY-ULLRICH, 1993;

freqüentemente em células malignas, principalmente em áreas de invasão, também

podem ativar TGF- e sugerem que essas proteínas podem resultar de um processo

39

fisiológico de remodelação que são aproveitadas e adaptadas pelas células tumorais para

promover crescimento e invasão tumoral.

Logullo et al. (2003) estudaram a expressão do TGF- 1 em 140 casos de

Carcinoma Epidermóide de cabeça e Pescoço, observando positividade em apenas 52

(37,1%) casos sendo que, 16 (11,4%) destes apresentaram reatividade em >60% das

células e 9/16 ocorreram na cavidade oral. Nas adjacências, aparentemente normais, foi

observado positividade em todos os casos estudados, sendo que em apenas 16 destes, tal

expressão estendeu-se até as camadas superficiais, estando os mesmos associados com

positividade tumoral. Os receptores de TGF- I e II foram avaliados em 20 casos da

cavidade oral (17 positivos para TGF- e 3 negativos). Forte e difusa positividade foi

observada para RII nos 17 casos positivo e 2/3 foram negativos enquanto, apenas 9/17

casos positivos para RI, sugerindo uma interrupção na trajetória do TGF- .

Iamaroon, Pattamapun e Piboonniyom (2006) também sugeriram alteração no

caminho do TGF- indicada pela redução ou ausência na expressão da molécula

sinalizadora de TGF- (Smad4), observando expressão desta em apenas 60% dos 15

casos de CEO comparados aos 82% dos 11 tecidos normais utilizados como controle.

Vagenas et al. (2007) ao estudarem 110 casos de carcinoma gástricos,

encontraram 71% de positividade para o TGF- , a qual não foi observada no tecido

normal, sendo considerada como um fator prognóstico independente.

-4 em linhagens de células de

câncer cervical CasKi e SiHa, HPV-16 positivas, Donalisio et al. (2008) concluíram que

estas células são resisten

eficiente que a IL-4 no controle da infecção por HPV-16, funcionando como supressor

tumoral.

Para Yeh et al. (2008), TGF- tem papel essencial na progressão tumoral e

metástase, através da ativação - B resultando na ativação da integrina

v e migração de células (JJ012) de condrossarcoma humano.

40

funções que influenciam na diferenciação de muitos tipos celulares, sendo seu efeito

limitado ao tempo de exposição e à concentração no desenvolvimento embrionário e na

vida adulta, em eventos da tomorigênese como apoptose, esteve relacionado ao tempo

de exposição, já no processo de migração não foi encontrada essa relação, em linhagens

de células do câncer de mama (MCF-7) (STEINERT et al., 2008).

Via de sinalização das BMPs tem mostrado inibir a tumorigênese de vários tipos

tumorais, incluindo cérebro, estômago e carcinoma de células basais da pele, mas

Katsuno et al. (2008) es -2 em uma linhagem celular

(MDA-231-D) de câncer de mama, observaram que o crescimento dessas células não

foram afetados, porém verificou uma indução da motilidade e invasividade dessas

células através da degradação do colágeno tipo I.

O TNF é considerado um dos maiores mediadores da inflamação, que induz

outros mediadores e proteases na orquestra da resposta inflamatória (BALKWILL,

2002), estando envolvido em diversos passos da tumorigênese, incluindo transformação,

promoção, sobrevivência, proliferação, angiogênese e metástase (AGGARWAL et al.,

2006).

Para Aggarwal (2003), o TNF quando expresso localmente por células do

sistema imune, tem um papel terapêutico, todavia quando desregulado e secretado na

circulação, pode mediar uma variedade de doenças, inclusive o câncer. Inicialmente

pensou-se que só os macrófagos produziam TNF , mas segundo Digel et al. (1990) o

TNF é produzido por uma grande variedade de células tumorais.

As células cancerígenas expressam uma forma ativada de NF- B, induzida por

vários estímulos inflamatórios, que regula os produtos gênicos (AGGARWAL, 2004;

PACIFICO e LEONARDI, 2006; LUEDDE et al., 2007), sendo um importante elo entre

câncer e inflamação, o qual pode ser disparado pela superregulação de TNF

(PIKARSKY et al., 2004).

41

NF- B tem um importante papel anti-apoptótico, crítico para a sobrevivência

das células cancerosas, sendo cotado como um importante alvo para a terapia do câncer.

A ativação de NF- B induzida por TNF, protege as células contra apoptose através da

supressão da ativação de JNK e indução de fatores de sobrevivência tais como XIAP e

survivin (WANG, CHEN e LIN, 2007; LUEDDE et al., 2007). Porém, a morte

persistente das células do fígado, induzida por TNF, provavelmente se deve à atividade

persistente de JNK mediada por TNFR2 (SCHWABE e BRENNER, 2006).

As citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1 dependem do complexo da kinase que

degrada I B para ativação do fator de transcrição NF- B. Esse complexo (IKK) é

constituído por duas kinases, IKK e IKK e uma subunidade regulatória denominada

NEMO, associadas com ambas IKKs, o qual regula a atividade dessas subunidades IKK

por vias de sinalização distintas, onde a associação de NEMO com IKK ou NEMO

com IKK podem formar complexos funcionais para ativação de NF- B em resposta à

IL-1, mas não ao TNF, que depende unicamente do complexo NEMO:IKK para

transcrição (SOLT et al., 2007).

Wang, Chen e Lin (2007) demonstraram que a supressão simultânea da ativação

de IKK e Akt, resulta no eficiente bloqueio do fator anti-apoptótico XIAP, obstruindo

a via de sobrevivência mediada por NF- B, a qual pode deixar as células cancerosas

mais vulneráveis a citotoxidade induzida por TNF, melhorando dramaticamente a ação

anti-câncer do TNF.

Segundo Greten et al. (2004), a deleção de IKK não diminui a inflamação, mas

reduz a incidência de câncer no intestino, assim como a supressão de TNF ou indução

de I B resulta na falha da progressão tumoral no fígado (PIKARSKY et al., 2004). Já

Luedde et al. (2007) concluiram que NEMO é essencial para ativação do NF- B que

regula a resposta celular à inflamação, funcionando como um supressor tumoral no

fígado de ratos, fornecendo um paradigma para o seu papel no câncer.

Deleção de NEMO bloqueia completamente a ativação de NF-kB deixando o

fígado mais sensível à toxidade do TNF induzida por lipoproteínas (LPS), causando

esteatohepatite e carcinoma hepatocelular espontâneos. Assim como Maeda et al. (2005)

42

não encontraram o

o estresse oxidativo pode induzir a apoptose e proliferação compensatória levando à

diminuição da capacidade regenerativa e aumento de células ovais progenitoras

(LUEDDE et al., 2007).

A sina

ativação do domínio de morte (FADD) em ceratinócitos e hepatócitos, é requerida para

o desenvolvimento da inflamação e câncer de pele e fígado em ratos com inibição de

NF- B. Invasão massiva de polimorfonucleares está frenqüentemente presente (LIND et

al., 2004; SCHWABE e BRENNER, 2006). Segundo Lind et al. (2004), a super-

Os macrófagos próximos ao tumor são os maiores produtores de TNF, tendo

papel na promoção, crescimento e invasão tumoral (MOORE et al, 1999; BALKWILL e

MANTOVANI, 2001), embora seu fator inibitório tenha efeito anti-apoptótico,

impedindo a transcrição de p53 (HUDSON et al., 1999).

Um dos membros da família TNF, conhecido como Fas (CD95), é expresso na

superfície de muitos tipos celulares, inclusive do câncer, e inicia uma cascata de

sinalização à morte apoptótica da célula no momento em que este se liga ao ligante Fas,

expresso nas células T ativadas (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Segundo Iwase et al.

(2003), embora as células do câncer expressem Fas na sua superfície, são relativamente

resistentes à apoptose mediada por Fas. Para Fujieda et al. (2000), não existe correlação

entre a expressão de Fas ou FasL e qualquer fator clinicopatológico. A expressão de Fas

não afetou a apoptose espontânea das células neoplásicas.

Muitas são as moléculas que sinalizam apoptose mediada por Fas, podendo este

ser modulado por fatores anti-apoptóticos, como c-FLIP, o qual forma um complexo

estável com Fas, FADD e Caspase 8 (ASHKENAZI e DIXIT, 1998; KRUEGER et al.,

2001), sendo o mesmo mais elevado em células cancerosas que em células normais

(RIPPO et al., 2004).

No estudo realizado por Stang et al. (2007) eles demonstraram que a apoptose

pode ser induzida pelo fator regulador de interferon-1 (IRF-1), independente da ligação

43

de Fas com o domínio de morte (FADD). Porém envolve clivagem das caspases-3, -7 e

-8, visto que o inibidor específico da caspase-8 (IETH) leva à expressão de c-FLIP em

células cancerosas com déficit de caspase-8 e segundo Scaffidi et al. (1999) ocorre o

bloqueio da clivagem da caspase-8 quando esta associa-se a c-FLIP.

Kondo et al. (2006) estudaram o papel da associação da Kinase (PI3-K) com Akt

no controle da sobrevivência da célula do CEO, utilizando o inibidor de PI3-K, o qual

suprimiu a fosforilação de Akt e acelerou apoptose mediada por Fas no CEO. Embora o

inibidor de PI3-K não tenha afetado a expressão de Fas nas célula do CEO, regulou

negativamente c-FLIP, proteína inibidora de morte programada por Fas, favorecendo a

suscetibilidade da apoptose mediada por Fas.

O glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR) é um membro da superfamília

de receptores TNF o qual é biologicamente multifuncional, participando da proliferação,

ativação, diferenciação e sobrevivência dos linfócitos T. Atua como potente co-

estimulador na ativação inicial dos linfócitos CD4, através da sinalização do NF-kB que

resulta na produção de IL-2. Porém, a co-estimulação do GITR mostra grande

habilidade na produção de IL-10 que contra-regula a resposta proliferativa à IL-2

(KANAMARU et al., 2004).

44

PROPOSIÇÃO

45

3- PROPOSIÇÃO

A proposta deste estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquímica do

NF -B, TNF TGF- FOXP3 e CD8, em Displasias Epiteliais e Carcinomas

Epidermóides Orais, visando um maior conhecimento da participação da inflamação na

transformação e progressão tumoral, para auxiliar na avaliação dos parâmetros de

agressividade já conhecidos, bem como no estabelecimento de outros parâmetros que

possam elucidar o comportamento biológico da lesão.

46

MATERIAL E MÉTODOS

47

4- MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

O presente trabalho consta de um estudo observacional, transversal da expressão

imuno-histoquímica dos anticorpos estudados, nos casos de Displasias Epiteliais e

Carcinomas Epidermóides Orais selecionados.

4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA

4.2.1 População

Casos de Displasias Epiteliais Orais (DEO) e Carcinomas Epidermóides Orais

(CEO) pertencentes aos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Universidade

Federal de Sergipe em Aracaju-SE e do Laboratório de Anatomia Patológica da

Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, em Natal-RN, diagnosticados no período de 1996-2007.

4.2.2 Amostra

4.2.2.1 Critério de inclusão

Foram incluídos no estudo 20 casos de DEO e 40 casos de CEO de biópsias

excisionais, dos referidos serviços, cujos blocos de parafina continham material

suficiente para elaboração do estudo.

4.2.2.2 Critério de Exclusão

Foram excluídos aqueles casos cujos blocos de parafina continham material

insuficiente para a análise proposta, bem como os espécimes provenientes de pacientes

que haviam se submetido a tratamento prévio com quimio ou radioterapia.

4.3 IMPLICAÇÕES ÉTICAS

A realização da pesquisa teve início após aprovação do projeto pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), sob

parecer de no 233/2007.

48

4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO

Do material emblocado em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5 de

espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina, os quais foram observados

em microscopia de luz, para confirmação diagnóstica e análise dos critérios para

classificação das DEO e gradação histológica dos casos de CEO.

4.4.1 DISPLASIAS EPITELIAIS

As displasias foram classificadas em Leve (L), Moderada (M) e Severa (S), a

depender do grau de envolvimento das camadas epiteliais, baseando-se nos critérios

sugeridos pela OMS em 2005, conforme descritos no quadro 01

(WARNAKULASURIYA et al., 2008).

Quando as alterações celulares e arquiteturais se restringiam ao terço inferior do

epitélio as displasias foram classificadas como Leves; quando se estendiam até o terço

médio, como Moderadas; e nos casos em que tais alterações ultrapassavam o terço

médio e/ou as atipias citológicas estavam presentes em maior quantidade, como

Severas.

Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasia.

ARQUITETURA CITOLOGIA Perda de Estratificação Anisocariose (tamanho)

Perda de polaridade da camada basal Pleomorfismo nuclear (forma) Hiperplasia da camada basal Anisocitose Projeção em forma de gota Pleomorfismo celular Aumento do nº de mitoses Variação na relação núcleo/citoplasma

Mitoses acima da basal Aumento do nº de núcleos Disceratose (ceratinização prematura) Mitoses atípicas

Pérolas córneas Aumento do número de nucléolos - Hipercromatismo

4.4.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE

Para análise da gradação histológica dos casos de CEO foi utilizado um método

desenvolvido para este estudo, baseado em parâmetros bem embasados na literatura,

como: pleomorfismo celular, número de mitoses e presença de ceratinização, analisados

dentro do dismorfismo celular, além de dissociação das células e organização das

49

massas (Quadro 02), além de maturidade celular e tipo de invasão, conforme Martins

Neto (1999).

Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais.

CRITÉRIOS Favoráveis Contrários Ceratina Muitas pérolas córneas Poucas pérolas córneas e/ou

ceratinizações isoladas Anisocitose/Anisocariose Leve Acentuada

Hipercromatismo Pouco Muito Mitoses Poucas, na periferia Muitas, espalhadas

Dissociação das células Unidas Soltas Arquitetura Organizada (lembrando

as camadas do epitélio) Desorganizada

Obs: Se 03 ou mais critérios representarem um prognóstico favorável, utiliza-

para cada um dos parâmetros avaliados

(Quadro 03), a fim de testar todas as combinações possíveis e ordená-las. Após análise

de cada caso, estes foram agrupados e classificados como Estágio I (baixo grau) e

Estágio II (alto grau), de acordo com o quadro 04, para viabilizar uma análise

comparativa dos mesmos com a expressão dos anticorpos estudados e com a intensidade

do infiltrado inflamatório.

Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO

CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL

ESCORE

MASSAS FRONT INVASIVO Presença Dismorfism

o Maturidade Tipo

0 Ausente Baixo

Maduras (Predominant

e)

Massas Trabéculas

1 Presente Alto Imaturas (Predominant

e)

Ninhos Cordões

Para o presente estudo considerou-se os seguintes aspectos:

Presença de massas entre o epitélio de revestimento ou superfície tecidual

ulcerada e o Front Invasivo, dá uma conotação de antiguidade à lesão. O Dismorfismo

das células epiteliais, sendo aqui caracterizado por um conjunto de alterações que

50

aproximam ou distanciam do normal, as massas e/ou células, da estrutura original do

epitélio de revestimento, como a formação anormal de ceratina,

anisocitose/anisocariose, hipercromatismo e nº de mitoses aumentado, associado à

dissociação das células e desarranjo arquitetural, denunciando a incapacidade de

diferenciação normal dessas células (Quadro 02). A maturidade, quando predominante

no front invasivo dá a impressão de freio no processo de invasão, justificando a

avaliação do tipo de invasão que revela uma menor ou maior rapidez no crescimento

e/ou invasão, a exemplo dos casos de invasão em trabéculas ou massas, com

predominância de células maduras, em relação àqueles que invadem como pequenos

ninhos ou cordões de células imaturas, como utilizado na própria classificação de Bryne

agravantes dos primeiros, respectivamente.

Quadro 04- Estadiamento do CEO

SITUAÇÕES Tipo de Invasão

Maturidade Presença de Massas

Dismorfismo ESTÁGIOS

1 0 0 0 0 I 2 0 0 0 1 I 3 0 0 1 0 I 4 0 0 1 1 I 5 0 1 0 0 I 6 0 1 0 1 I 7 0 1 1 0 II 8 0 1 1 1 II 9 1 0 0 0 II

10 1 0 0 1 II 11 1 0 1 0 II 12 1 0 1 1 II 13 1 1 0 0 II 14 1 1 0 1 II 15 1 1 1 0 II 16 1 1 1 1 II

Todos os casos foram submetidos à classificação desenvolvida por Bryne (1998)

para o Front

avaliado e os resultados foram graduados, conforme escores obtidos após análise:

Estágio I (escores 4-8) e (escores 3-6), respectivamente e Estágio II (escores 9-16) e

(escores 7-12), respectivamente, adaptados para este estudo, conforme Miranda (2002).

51

A intensidade do infiltrado inflamatório foi avaliada tanto nas DEO como nos CEO, em

Leve (L), Moderado (M) e Intenso (I), adaptado de Bryne (1998).

Quadro 05- Gradação histológica de malignidade proposta por Bryne.(1998)

PARÂMETROS (Bryne) ESCORE Grau de

ceratinização Pleomorfismo

nuclear (maturidade)

Tipo de invasão Resposta inflamatória

1 altamente ceratinizado

(mais de 50% das células)

pouco pleomorfismo nuclear (mais de 75% de células

maduras)

massas com bordas bem delimitadas

Intenso

2 moderadamente ceratinizado (20 a 50% das

células)

moderado pleomorfismo

nuclear (50 a 75% de células maduras)

cordões ou trabéculas sólidas

e massas infiltrativas

Moderado

3 mínima ceratinização (5 a 20% das

células)

abundante pleomorfismo (25 a 50 % de

células maduras)

pequenos grupos ou cordões de

células infiltrativas

(N>15)

Escasso

4 nenhuma ceratinização (O a 5 % das

células)

pleomorfismo nuclear extremo (0 a

25% de células maduras)

dissociação celular difusa /ou

células individuais

(N<15)

Ausente

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

Os espécimes de

espessura e estes, montados em lâminas histológicas previamente limpas e

desengorduradas, preparadas com adesivo à base de organosilano (3-

aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Aos cortes

histológicos foram aplicados anticorpos dirigidos contra as proteínas estudadas, cujas

especificações estão contidas no quadro 06. Como controles negativos foram omitidos

os anticorpos primários e para os positivos foram utilizadas secções de câncer de mama

e granuloma periapical previamente testados.

4.5.1 Método da Imuno-histoquímica

Xilol 1 (30 minutos), estufa 59º - desparafinização

Xilol 2 (20 minutos), temperatura ambiente - desparafinização

Etanol absoluto I, II, III 5 minutos cada;

52

Etanol 95º/ 5minutos;

Etanol 80º/ 5 minutos;

Etanol 95% + Hidróxido de amônio a 10%/ 10 minutos (retirada do pigmento

formólico);

Lavagem das lâminas em água corrente, 10 minutos;

Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada.

Recuperação antigênica;

Água corrente, 10 minutos;

Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 VOL;

Água corrente, 10 minutos;

Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada;

TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada;

Incubação do anticorpo primário + BSA;

Lavagem e imersão das lâminas em TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada;

Tween 20, 2 trocas, 5 minutos cada;

Incubação do anticorpo secundário + SABC ou Envision;

Incubação do complexo avidina/biotina, diluído em TRIS gelado (A+B);

Lavagem com TRIS;

Incubação da diaminobenzidina;

Revelação;

Lavagem em água corrente, 10 minutos;

Passagem em água destilada;

Contracoloração com Hemtoxilina de Mayer, 10 minutos;

Lavagem em água corrente, 10 minutos;

Água destilada, duas trocas, 5 minutos;

Desidratação, diafanização e montagem.

53

Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários.

ANTICORPO CLONE DILUIÇÃO/ TEMPO DE

INCUBAÇÃO

RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA

MÉTODO

NF -B* NF -B p65

(A)

1:100 3 horas

Citrato Envision-HRP**

TNF * TNF (2C8) 1:100 Overnigth

Pepsina Envision-HRP**

TGF * TGF 1 (V) 1:500 Overnigth

Pepsina Envision-HRP**

FOXP3* FOXP3(H190) 1:100 Overnigth

Tris-EDTA PH-9,0

Envision-HRP**

CD8** C8/144B 1:200

Tris-EDTA PH-9,0

SABC**

* Santa Cruz Biotechnology, Inc. e ** DAKO

4.6 ANÁLISE DOS RESULTADOS

4.6.1 Análise Morfológica

Após a classificação dos casos de DEO e CEO, quanto ao grau histológico,

conforme a metodologia descrita foi realizada análise de associação entre: os graus

histológicos dos mesmos e a intensidade do infiltrado inflamatório; entre os estágios

resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo

e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998); e entre os estágios

resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo

e os parâmetros utilizados pela mesma.

4.6.2 Análise Imuno-histoquímica

Foram realizadas análises semi-quantitativas dos anticorpos anti-CD8, anti-

FOXP3, anti- -

anticorpos anti- - -NF- B em células epiteliais que tiveram

marcação expressiva. Todos os casos foram classificados como de baixa expressão,

quando apresentavam < de 5% das células marcadas, de expressão moderada quando a

marcação envolvia entre 5% e 50% das células e de alta expressividade quando >50%

das células se encontravam marcadas (Quadro 07), segundo critérios propostos por

Abbas (2007).

54

Os resultados foram analisados em relação ao tipo de lesão, grau histológico e

intensidade do infiltrado inflamatório. Foram consideradas positivas as reações que

apresentaram coloração marrom. As análises morfológicas e imuno-histoquímicas

foram feitas por um único observador, por três vezes consecutivas.

Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos.

EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS CD8/FOXP3/ NF -B

SEMI-QUANTITATIVA Baixa < 5%

Moderada 5-50% Alta > 50%

Abbas (2007)

4.6.3 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico com o objetivo

de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 13.0 para

Windows.

Foi empregado o teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher (para valores

menores que 5%) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados entre

o grau histológico de malignidade dos CEO e os parâmetros utilizados nessa avaliação.

Para a verificação das hipóteses de igualdade de expressão dos anticorpos

B) com relação aos tipos de lesão e grau

histológico das displasias (DEO) e carcinomas (CEO), utilizou-se o teste não

paramétrico de Mann-Whitney, uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do

estabelecimento de escores.

A existência de correlação entre a expressão dos marcadores imuno-

- B) e a intensidade do infiltrado

inflamatório, segundo o tipo de lesão, foi investigada utilizando-se o coeficiente de

correlação de Spearman.

O nível de significância utilizado para todos os testes foi de 5%.

55

RESULTADOS

56

5- RESULTADOS 5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS

a) DISPLASIAS EPITELIAIS

Dos 20 casos de DEO estudados, 9 (45%) foram classificados como displasias

leves (L), 3 (15%) moderadas e 8 (40%) severas. Quanto à intensidade do infiltrado

inflamatório, 5 (25%) eram leves (L), 10 (50%) moderados (M) e 5 (25%) intensos (I)

(Tabela 01).

Tabela 01- Gradação histológica das displasias epiteliais baseada na OMS (2005) e sua relação com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

b) CARCINOMA EPIDERMÓIDE

No exame microscópico, os carcinomas exibiram uma gama muito grande de

variações no que diz respeito à sua invasão, maturidade e organização, independente da

localização anatômica e idade dos pacientes. Os CEO foram estadiados conforme a

metodologia proposta (Quadro 08).

(Figuras 01-08).

Dos 40 casos analisados, 17 (42,5%) se encontravam no Estágio I e 23 (57,5%)

no Estágio II. Quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, 11 (27,5%) foram leves

(L), 10 (25%) foram moderados (M) e 19 (47,5%) intensos (Tabela 02).

DEO

Infiltrado Inflamatório L M I

GRAU N % n % n % n % L 9 45 2 22,2 4 44,4 3 33,3 M 3 15 1 33,3 2 66,6 - - S 8 40 2 25 4 50 2 25

TOTAL 20 100 5 25 10 50 5 25

57

Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos casos de Carcinomas Epidermóides de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo. Natal/RN 2009.

ESCORES CASOS Tipo de

invasão Maturidade Presença de

massas Dismorfismo ESTÁGIO

01 0 0 1 0 I 02 1 0 1 1 II 03 1 0 1 0 II 04 1 1 0 0 II 05 1 1 0 0 II 06 1 0 1 1 II 07 0 1 1 1 II 08 1 1 1 1 II 09 0 0 0 0 I 10 1 0 1 0 II 11 1 0 1 1 II 12 1 0 1 1 II 13 0 0 1 0 I 14 1 1 1 1 II 15 1 1 1 1 II 16 0 0 0 0 I 17 1 1 0 1 II 18 0 0 0 0 I 19 1 1 0 0 II 20 1 0 1 0 II 21 0 0 1 1 I 22 0 0 1 1 I 23 0 1 1 1 II 24 0 0 0 0 I 25 0 1 0 1 I 26 0 0 1 1 I 27 0 0 0 0 I 28 0 0 0 1 I 29 0 0 0 0 I 30 0 1 1 1 II 31 0 1 1 1 II 32 0 0 1 0 I 33 1 1 1 1 II 34 1 1 1 1 II 35 0 1 1 1 II 36 0 1 1 1 II 37 0 0 0 0 I 38 0 0 1 1 I 39 0 1 1 1 II 40 0 0 1 1 I

Tabela 02- Correlação entre a gradação histológica de malignidade dos CEO e a intensidade do infiltrado inflamatório, nas lesões estudadas. Natal/RN 2009.

58

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

Do ponto de vista do infiltrado inflamatório, dos 11 casos com infiltrado

inflamatório leve 2 (18,2%) pertenciam às lesões de grau I e 9 (81,8%) às de grau II;

dos 10 casos com infiltrado inflamatório moderado 4 (40%) pertenciam às lesões de

grau I e 6 (60%) às de grau II; e dos 19 casos com infiltrado inflamatório intenso 11

(57,9%) pertenciam às lesões de grau I e 8 (42,1%) às de grau II.

Os 40 casos de CEO também foram avaliados pelo método de Bryne para o front

invasivo (1998) e em seguida classificados como Estágio I (para escores entre 3-6 e 4-

8) e Estágio II (para escores entre 7-12 e 9-16), conforme metodologia proposta. Foi

observada uma divergência de 13,3% e 20% para os casos sem e com o parâmetro em

questão, respectivamente (Quadro 09) em relação aos resultados obtidos pelo método

desenvolvido para este estudo (Quadro 08), embora o número total de casos de alto e

baixo graus, tenham sido coincidentemente iguais (Gráfico 01).

Gráfico 01- Comparação das GHM

0 5 10 15 20 25

Alto

Baixo

Grau Histológico de Malignidade

Pesquisa

Bryne

CEO

Infiltrado Inflamatório L M I

Estágios N % N % n % n %I 17 42,5 2 11,8 4 23,5 11 64,7 II 23 57,5 9 39,1 6 26,1 8 34,8

TOTAL 40 100 11 27,5 10 25 19 47,5

59

Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides de acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.

ESCORES CASOS GC M TI RI TOTAL

s/RI c/RI 01 3 1 1 1 5 I 6 I 02 4 2 4 2 10 II 12 II 03 3 3 4 2 10 II 12 II 04 2 4 2 1 8 II 9 II 05 3 3 2 1 8 II 9 II 06 2 2 4 1 8 II 9 II 07 4 4 1 1 9 II 10 II 08 4 4 4 2 12 II 14 II 09 3 1 1 3 5 I 8 I 10 3 2 2 1 7 II 8 I 11 3 1 1 2 5 I 7 I 12 3 1 3 1 7 II 8 I 13 4 1 2 1 7 II 8 I 14 4 4 3 4 11 II 15 II 15 3 4 3 2 10 II 12 II 16 1 1 1 1 3 I 4 I 17 4 4 4 4 12 II 16 II 18 3 1 1 1 5 I 6 I 19 4 4 4 3 12 II 15 II 20 2 1 2 3 5 I 8 I 21 4 1 1 3 6 I 9 II 22 3 2 2 4 7 II 11 II 23 2 3 2 2 7 II 9 II 24 1 1 1 1 3 I 4 I 25 3 2 2 1 7 II 8 I 26 3 1 1 2 5 I 7 I 27 3 1 1 2 5 I 7 I 28 4 1 1 4 6 I 10 II 29 4 1 1 1 6 I 7 I 30 3 3 1 4 7 II 11 II 31 4 3 2 1 9 II 10 II 32 3 1 1 2 5 I 7 I 33 4 4 4 3 12 II 15 II 34 4 4 4 4 12 II 16 II 35 4 3 1 2 8 II 10 II 36 3 3 2 1 8 II 9 II 37 3 1 1 3 5 I 8 I 38 3 3 2 1 8 II 9 II 39 3 3 2 4 8 II 12 II 40 2 1 2 1 5 I 6 I

Grau de ceratinização (GC); Maturidade (M); Tipo de invasão (TI);Resposta

inflamatória (RI); sem Resposta inflamatória (s/RI) e com Resposta inflamatória (c/RI).

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

60

As células imunomarcadas foram evidenciadas ao microscópio de luz como uma

pigmentação que variava de castanho claro a marrom. A positividade foi observada

tanto nas células epiteliais (CE) como no infiltrado inflamatório (II) presente nas lesões

de DEO e CEO estudadas.

Tabela 03- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGF , TNF e NF- B nas DEO e CEO. Natal/RN 2009. ANTICORPOS

ESCORES*

DEO (n=20)

CEO (n=40)

n

%

N

%

<5% 4 20 28 70 CD8 5-50% 4 20 3 7,5

>50% 12 60 9 22,5 <5% 11 55 24 60

FOXP3 5-50% 5 25 11 27,5 >50% 4 20 5 12,5 <5% 4 20 7 17,5

TGF (II) 5-50% 5 25 16 40 >50% 11 55 17 42,5 <5% 4 20 16 40

TGF (CE) 5-50% 8 40 14 35 >50% 8 40 10 25 <5% 3 15 15 37,5

TNF (II) 5-50% 10 50 14 35 >50% 7 35 11 27,5 <5% 6 30 16 40

TNF (CE) 5-50% 7 35 17 42,5 >50% 7 35 7 17,5 <5% 6 30 20 50

NF- B 5-50% - - 15 37,5 >50% 14 70 5 12,5

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

*De acordo com Abbas (2007)

Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.

A marcação do anti-CD8 e anti-FOXP3 foi observada nas células inflamatórias;

o anti-NF- B, no núcleo tanto das células epiteliais como das células inflamatórias,

embora apenas as epiteliais tenham sido avaliadas, conforme metodologia; já o TGF e

o TNF foram evidenciados tanto no núcleo como no citoplasma das células epiteliais e

inflamatórias.

61

A positividade epitelial para TGF e TNF era difusa tanto nas DEO como nos

CEO (figuras 17-32).

Todos os casos de DEO e CEO investigados expressaram positividade para

todos os anticorpos. Com exceção do TGF presente nas células inflamatórias, que

apresentou expressão <5% em 20% dos casos de DEO, superando os 15% dos CEO, os

demais marcadores apresentaram maior expressividade, embora discreta, nas DEO do

que nos CEO, embora uma grande diferença fosse notada, na expressão do CD8 e NF -

B, que foram bem mais expressas nas DEO (Tabela 03).

Tabela 04- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGF , TNF e NF- B) de acordo com o grau das DEO. Natal/RN 2009. ANTICORPOS

ESCORES*

DEO (n=20) L M S

N % N % N % <5% 2 22,2 - - 2 25

CD8 5-50% 1 11,1 1 33,3 2 25 >50% 6 66,6 2 66,6 4 50 <5% 3 33,3 3 100 5 62,5

FOXP3 5-50% 3 33,3 - - 2 25 >50% 3 33,3 - - 1 12,5 <5% 2 22,2 - - 2 25

TGF (II) 5-50% 4 44,4 1 33,3 - - >50% 3 33,3 2 66,6 6 75 <5% - - - - 4 50

TGF (CE) 5-50% 5 55,5 1 33,3 2 25 >50% 4 44,4 2 66,6 2 25 <5% 1 11,1 2 66,6 - -

TNF (II) 5-50% 5 55,5 1 33,3 4 50 >50% 3 33,3 - - 4 50 <5% 2 22,2 1 33,3 3 37,5

TNF (CE) 5-50% 5 55,5 1 33,3 1 12,5 >50% 2 22,2 1 33,3 4 50 <5% 2 22,2 1 33,3 3 37,5

NF- B 5-50% - - - - - - >50% 7 77,7 2 66,6 5 62,5

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

*De acordo com Abbas (2007)

Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.

62

As expressões imuno-histoquímicas das DEO e CEO foram agrupadas de acordo

com o estágio em que as lesões se encontravam, seguindo a metodologia utilizada

(Tabelas 04 e 05).

Foi observado que a expressão do CD8 >50% ocorreu em 100% dos casos de

DEO moderadas onde a FOXP3 teve expressividade <5%, elevando ao máximo a

inflamatório dessas mesmas lesões, esteve expresso >5% em 100% dos casos ( 5-50%

em 33,3% e >50% em 66,6%) e em 75% das células inflamatórias dos casos de DEO

severas, embora tenha caído bastante nas células epiteliais (Tabela 04).

Tabela 05- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGF , TNF e NF- B de acordo com o estágio dos CEO. Natal/RN 2009. ANTICORPOS

ESCORES*

CEO (n=40)

I (n=17) II (n=23) N % N %

<5% 11 64,7 17 73,9 CD8 5-50% 1 5,9 2 8,7

>50% 5 29,4 4 17,4 <5% 11 64,7 13 56,5

FOXP3 5-50% 4 23,5 7 30,4 >50% 2 11,7 3 13 <5% 5 29,4 2 8,7

TGF (II) 5-50% 7 41,2 9 39,1 >50% 5 29,4 12 52,2 <5% 9 52,9 8 34,8

TGF (CE) 5-50% 4 23,5 10 43,5 >50% 4 23,5 5 21,7 <5% 6 35,3 9 39,1

TNF (II) 5-50% 4 23,5 10 43,5 >50% 7 41,2 4 17,4 <5% 8 47 8 34,8

TNF (CE) 5-50% 7 41,2 10 43,5 >50% 2 11,7 5 21,7 <5% 9 52,9 11 47,8

NF- B 5-50% 7 41,2 8 34,8 >50% 1 5,9 4 17,4

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

*De acordo com Abbas (2007)

Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.

63

O NF- B encontrava-se altamente expresso em todos os graus das DEO, embora

marcando >50% das células em 50% dos casos das mesmas (Tabela 04).

Entre os estágios dos CEO, a variação mais significativa foi a da expressão do

TGF no infiltrado inflamatório dos casos de alto grau, com 56,5% de positividade

>50%, em relação aos de baixo grau, com 29,4% de positividade >50% (Tabela 05).

Tabela 06- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGF , TNF e NF- B de acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório nas DEO. Natal/RN 2009. ANTICORPOS

ESCORES*

Infiltrado Inflamatório nos DEO (n=20)

L M I N % N % N %

<5% 2 40 1 10 1 20 CD8 5-50% 2 40 2 20 - -

>50% 1 20 7 70 4 80 <5% 3 60 6 60 2 40

FOXP3 5-50% 1 20 2 20 2 40 >50% 1 20 2 20 1 20 <5% - - 4 40 - -

TGF (II) 5-50% 2 40 1 10 2 40 >50% 3 60 5 50 3 60 <5% 1 20 3 30 - -

TGF (CE) 5-50% 1 20 4 40 3 60 >50% 3 60 3 30 2 40 <5% 2 40 1 10 - -

TNF (II) 5-50% 3 60 6 60 1 20 >50% - - 3 30 4 80 <5% 3 60 2 20 1 20

TNF (CE) 5-50% 2 40 4 40 1 20 >50% - - 4 40 3 60 <5% 4 80 2 20 - -

NF- B 5-50% - - - - - - >50% 1 20 8 80 5 100

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

*De acordo com Abbas (2007)

Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.

Relacionando a expressão do CD8 e FOXP3 com a intensidade do infiltrado

inflamatório nas DEO e CEO, verificou-se que o CD8 tinha uma marcação bem mais

expressiva nas DEO com infiltrado inflamatório moderado (70%) e intenso (80%),

64

caindo abruptamente nos CEO para moderado (20%) e intenso (36,8%), e a FOXP3 que

tinha uma expressão baixa, porém constante (20%) entre os graus de DEO, teve uma

redução de aproximadamente 50% nos CEO, principalmente nos casos que

apresentavam infiltrado inflamatório moderado (10%) e intenso (10,5%) (Tabelas 06 e

07).

iveram expressão

<50% nas DEO com infiltrado inflamatório leve, aumentando consideravelmente,

>50%, quando o infiltrado inflamatório era moderado (40%) ou intenso (60%) no

epitélio, e moderado (30%) ou intenso (80%) no conjuntivo (Tabela 06).

Tabela 07- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGF , TNF e NF- B de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nos CEO. Natal/RN 2009. ANTICORPOS

ESCORES*

Infiltrado Inflamatório nos CEO (n=40)

L M I N % N % n %

<5% 11 100 6 60 11 57,9 CD8 5-50% - - 2 20 1 5,8

>50% - - 2 20 7 36,8 <5% 7 63,6 6 60 11 57,9

FOXP3 5-50% 2 18,2 3 30 6 31,6 >50% 2 18,2 1 10 2 10,5 <5% 3 27,2 2 20 2 10,5

TGF (II) 5-50% 4 36,4 3 30 8 42,1 >50% 4 36,4 5 50 9 47,4 <5% 4 36,4 3 30 9 47,4

TGF (CE) 5-50% 3 27,2 5 50 6 31,6 >50% 4 36,4 2 20 4 21 <5% 9 81,8 3 30 9 47,4

TNF (II) 5-50% 1 9,1 5 50 6 31,6 >50% 1 9,1 2 20 4 21 <5% 3 27,2 1 10 10 52,6

TNF (CE) 5-50% 6 54,4 6 60 6 31,6 >50% 2 18,2 3 30 3 15,8 <5% 6 54,4 6 60 8 42,1

NF- B 5-50% 3 27,2 2 20 10 52,6 >50% 2 18,2 2 20 1 5,8

Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.

*De acordo com Abbas (2007)

Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.

65

representativo nos casos com infiltrado

inflamatório leve, marcando 18,2% das células epiteliais e 9,1% das inflamatórias,

elevando discretamente para 30% das células epiteliais e 20% das inflamatórias, nos

casos com moderado infiltrado inflamatório e 16% das células epiteliais e 21% das

inflamatórias, nos casos com intenso infiltrado inflamatório (Tabela 07).

epiteliais, quanto o NF -B, tiveram baixa expressividade, apresentando positividade

>50%, em 15,8% e 5,8% dos casos, respectivamente (Tabela 07).

5.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS

Os resultados obtidos foram submetidos a tratamento estatístico com o objetivo

de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 13.0 para

Windows.

Foi empregado o teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher (para valores

menores que 5) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados entre o

estágio em que os CEO se encontravam e os parâmetros utilizados na Gradação

Histológica de Malignidade (GHM), constatando-se que o estágio em que os CEO se

encontrava esteve significativamente associado à maturidade celular, à presença de

massas entre o front invasivo e a superfície da lesão, como também ao dismorfismo das

células e arranjo das massas (Tabela 08).

Tabela 08- Distribuição dos casos de CEO de baixo e alto graus segundo os parâmetros utilizados na gradação histológica de malignidade. Natal/RN 2009.

GRAU HISTOLÓGICO DE MALIGNIDADE

Parâmetros Estágio I Estágio II Total n % N % N % P

Maturidade Celular Maduras Imaturas

15 2

68,2 11,1

7

16

31,8 88,9

22 18

100 100

0,0001

Presença de Massas Ausente Presente

9 8

69,2 29,6

4

19

30,8 70,4

13 27

100 100

0,038

Dismorfismo Pouca Muita

10 7

62,5 29,2

6

17

37,5 70,8

16 24

100 100

0,037

* teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher

66

B

com relação aos tipos de lesão, utilizou-se o teste não paramétrico de Mann-Whitney,

uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do estabelecimento de escores.

Tabela 09- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8,

B em relação ao tipo de lesão. Natal/RN 2009. Marcador Grau N Mediana Q25-Q75 Média

dos postos

Soma dos

postos

U

P

CD8 DEO CEO

20 40

3 1

2-3 1-2

40,50 25,50

818,00 1020,00

200,00 0,001

FOXP3 DEO CEO

20 40

1 1

1-2 1-2

31,98 29,76

639,50 1190,50

370,50 0,600

DEO CEO

20 40

3 2

2-3 2-3

32,28 29,61

645,50 1184,50

364,50 0,546

) DEO CEO

20 40

2 2

2-3 1-2,75

35,30 28,10

706,00 1124,00

304,00 0,110

DEO CEO

20 40

2 2

2-3 1-3

34,70 28,40

694,00 1136,00

316,00 0,161

) DEO CEO

20 40

2 2

1-3 1-2

34,25 28,62

685,00 1145,00

325,00 0,208

NF- B DEO CEO

20 40

3 1,5

1-3 1-2

39,75 25,88

795,00 1035,00

215,00 0,002

* teste não paramétrico de Mann-Whitney

Tabela 10-Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8, FOXP3,

B em relação à gradação histológica das DEO. Natal/RN 2009. Marcador Grau N Mediana Q25-Q75 Média

dos postos

Soma dos

postos

U

P

CD8 L-M S

12 8

3 2

2-3 1-3

11,42 8,79

148,50 61,50

33,50 0,278

FOXP3 L-M S

12 8

2 1

1-3 1-2

11,69 8,29

152,00 58,00

30,00 0,173

L-M S

12 8

2 3

2-3 1-3

10,00 11,43

130,00 80,00

39,00 0,568

) L-M S

12 8

3 1

2-3 1-2

12,81 6,21

166,50 43,50

15,50 0,011

L-M S

12 8

2 2

1,5-3 2-3

9,62 12,14

125,00 85,00

34,00 0,317

) L-M S

12 8

2 3

1,5-2,5 1-3

10,12 11,21

131,50 78,50

40,50 0,674

NF- B L-M S

12 8

3 3

2-3 1-3

11,19 9,21

145,50 64,50

36,50 0,370

* teste não paramétrico de Mann-Whitney

67

Com a amostra agrupada de acordo com o tipo de lesão, observou-se de forma

geral uma expressão maior nas DEO, embora a diferença entre elas só tenha sido

significativa para a quantidade de células TCD8 e a quantidade de células positivas para

o NF- B (Tabela 09).

A amostra foi então agrupada de acordo com a gradação histológica das DEO e

dos CEO observando- B,

células epiteliais das DEO (Tabela 10).

NF B nos CEO, não apresentou diferença estatisticamente significante (Tabela 11).

Tabela 11-Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8, FOXP3,

B em relação à gradação histológica de malignidade dos CEO. Natal/RN 2009. Marcador Grau N Mediana Q25-Q75 Média

dos postos

Soma dos

postos

U

P

CD8 I II

17 23

1 1

1-3 1-2

21,74 19,59

369,50 450,50

174,50 0,475

FOXP3 I II

17 23

1 1

1-2 1-2

19,62 21,15

333,50 486,50

180,50 0,638

I II

17 23

2 3

1-3 2-3

16,97 23,11

288,50 531,50

135,50 0,076

) I II

17 23

1 2

1-2,5 1-3

18,38 22,07

312,50507,50

159,50 0,293

I II

17 23

2 2

1-3 1-2

22,53 19,00

383,00 437,00

161,00 0,315

) I II

17 23

2 2

1-2 1-2

18,65 21,87

317,00 503,00

164,00 0,351

NF- B I II

17 23

1 2

1-2 1-2

19,32 21,37

328,50 491,50

175,50 0,546

* teste não paramétrico de Mann-Whitney

A existência de correlação entre a imunomarcação

B e a intensidade do infiltrado inflamatório segundo o tipo de lesão foi

investigada utilizando-se o coeficiente de correlação de Spearman.

68

Nas DEO, foi observada correlação positiva e estatisticamente significativa entre

a quantidade de células imunopositivas para o TNF-

como nas células epiteliais, e a intensidade do infiltrado inflamatório. Além disso,

também constatou-se correlação positiva entre a intensidade do infiltrado inflamatório e

a quantidade de células imunopositivas para o NF- B.

Nos CEO, a intensidade do infiltrado inflamatório mostrou correlação positiva

com a quantidade de linfócitos TCD8 e com a quantidade de células imunopositivas

-se correlação negativa

entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células neoplásicas

imunopositivas para o TNF-

Tabela 12-Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células imunopositivas

B, segundo o tipo de lesão. Natal/RN 2009.

TIPO DE LESÃO

MARCADORES

INFILTRADO

INFLAMATÓRIO

R P

DEO CD8

FOXP3

(CE)

NF- B

0,391

0,109

0,000

-0,026

0,632

0,442

0,617

0,088

0,648

1,000

0,912

0,003

0,051

0,004

CEO CD8

FOXP3

TGF (II)

TGF (CE)

TNF (II)

TNF (CE)

NF- B

0,365

0,018

0,189

-0,142

0,383

-0,337

0,046

0,021

0,911

0,243

0,383

0,015

0,034

0,776

* coeficiente de correlação de Spearman.

69

Figu

ra 0

1 C

EO, I

nvas

ão e

m m

assa

s (H

E 20

0x)

Figu

ra 0

2 C

EO, I

nvas

ão e

m c

ordõ

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E 10

0x)

Figu

ra 0

3 C

EO, C

élul

as m

adur

as (H

E 40

0x)

Figu

ra 0

4 C

EO, C

élul

as Im

atur

as (H

E 20

0x)

01

03 01

02

04

70

Fi

gura

07-

CEO

, Dis

mor

fism

o es

cass

o (H

E 20

0x)

Figu

ra 0

8- C

EO, D

ism

orfis

mo

acen

tuad

o (H

E 20

0x)

Figu

ra 0

5- C

EO, P

rese

nça

de m

assa

s (H

E 10

0x)

Figu

ra 0

6- C

EO, A

usên

cia

de m

assa

s (H

E 10

0x)

05

06

07

08

71

Fi

gura

09-

DEO

, CD

8 >

50%

(SA

BC

200

x)

Figu

ra 1

0- D

EO, C

D8

> 50

% (S

AB

C 2

00x)

Figu

ra 1

1- C

EO, C

D8

> 50

% (S

AB

C 2

00x)

Fi

gura

12-

CEO

, CD

8 <

5% (S

AB

C 2

00x)

09

10

11 10

12

72

Figu

ra 1

5- C

EO, F

OX

P3 >

50%

(Env

isio

n-H

RP

200x

) Fi

gura

16-

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nvis

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HR

P 40

0x)

Figu

ra 1

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OX

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RP

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, FO

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HR

P 20

0x)

13

14

15

16

73

Figu

ra 1

7- D

EO, T

GF

(CE)

> 5

0% (E

nvis

ion-

HR

P 20

0x)

Figu

ra 1

8- D

EO, T

GF

(CE)

5-5

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Envi

sion

-HR

P 20

0x)

Figu

ra 1

9- D

EO, T

GF

(CE)

< 5

% (E

nvis

ion-

HR

P 10

0x)

Figu

ra 2

0- D

EO, T

GF

(II)

>50

% (E

nvis

ion-

HR

P 40

0x)

17

18

19

20

74

Figu

ra 2

1- C

EO, T

GF

(CE)

> 5

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HR

P 20

0x)

Figu

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2- C

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GF

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HR

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Figu

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3- C

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HR

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Figu

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4- C

EO, T

GF

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nvis

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HR

P 20

0x)

21

22

23

24

75

Figu

ra 2

5- D

EO, T

NF

(CE)

> 5

0% (E

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HR

P 40

0x)

Figu

ra 2

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HR

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Figu

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Figu

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HR

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25

26

27

28

76

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, TN

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31

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77

Figu

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Figu

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5- C

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Figu

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EO, N

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nvis

ion-

HR

P 40

0x)

33

34

35

36

78

DISCUSSÃO

79

6- DISCUSSÃO

Sendo a etiologia do CEO multifatorial, para que haja uma expansão clonal de

células transformadas e resistentes aos mecanismos de defesa do hospedeiro, é

necessária a atuação conjunta de fatores extrínsecos e intrínsecos, de forma variada,

porém seqüencial, por muitos anos (KERREBIN et al., 1999; BOSHOFF e WEISS,

2001; RAMALHO et al., 2002; NAGPAL e DAS, 2003). Sendo assim, para impedir a

atuação de fatores intervenientes (sexo, idade, localização anatômica, fatores de risco,

etc.), considerou-se a possibilidade de avaliar a agressividade tumoral através das

alterações morfológicas e de sua relação com o hospedeiro, via inflamação. Isso já havia

sido proposto anteriormente por Jackobsson et al. (1973), Crissman et al.( 1984),

Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e Bryne et al. (1989) sendo que, para isso é

necessário entender o papel da inflamação na carcinogênese, objetivo principal deste

estudo, não esquecendo no entanto das lesões que precedem o aparecimento do câncer.

Segundo Warnakulasuriya et al. (2007), durante um longo período (1978-2005)

a OMS classificou as lesões com potencial de transformação maligna em dois grupos, o

-

Actínica, Líquen Plano e Lupus Eritematoso Discóide -

do qual faziam parte a Leucoplasia, a Eritroplasia e a Lesão do Palato por Fumo

Invertido. O primeiro grupo consistia em situações associadas a um aumento

significativo do risco de câncer, enquanto o segundo grupo incluía lesões com

alterações morfológicas onde o desenvolvimento de CEO era mais provável. Nesse

segundo caso, o potencial de malignidade era demonstrado através da presença de DEO

nos cortes histológicos.

Entretanto, sabe-se que mesmo condições consideradas anteriormente como

-

histológicos, o que exigiria uma reformulação na classificação destas lesões. Assim, a

OMS (2005) acabou agrupando todas as lesões anteriormente citadas em um único

g

et al.,2008).

80

Dessa forma, uma classificação mais adequada para estas lesões deveria ser

feita, apenas, após análise histológica dos tecidos submetidos à biópsia, uma vez que a

prese

-

considerada pela OMS uma lesão de risco questionável, apresenta similaridade

histológica e molecular com o CEO quando há presença de displasia epitelial. De

acordo com Reibel (2003), as alterações displásicas encontradas em alguns casos de

leucoplasia podem ainda pré-existir e/ou coexistir com o CEO, confirmando ainda mais

As alterações moleculares presentes nos quadros de displasia epitelial podem

preceder as alterações morfológicas, devendo fazer parte da análise de classificação

estudo morfológico, com a detecção de DEO, seria suficiente para sugerir um potencial

pré-maligno às desordens orais. Isso também pode ser raciocinado quando se percebe

que nem todas as lesões com displasia epitelial se transformam em CEO, devendo

existir alterações moleculares responsáveis pelo processo de transformação celular.

Vários estudos têm relacionado tanto as DEO quanto os CEO a alguns fatores de

risco como o fumo, o álcool, a radiação ultravioleta, o HPV e outros, considerados

fatores extrínsecos. Porém, é necessária a presença de fatores intrínsecos, inerentes a

cada paciente, para justificar a transformação de uma pequena parcela dos casos. Esta

situação requer, portanto, desestabilização de vários sistemas de controle que

coordenam o comportamento celular (NAGPAL, DAS, 2003; SCHLIEPHAKE, 2003).

Napier e Speight (2008) citaram um estudo realizado na Dinamarca em que

apenas 2,1% das leucoplasias em pacientes fumantes evoluíram para um câncer, em

contraste com 11,1% das leucoplasias em não fumantes. Considerando ser a DEO o

evento que garante o potencial maligno da lesão, estes resultados reforçam a

necessidade de avaliar a presença desta e/ou os eventos moleculares que participam do

processo de transformação celular, para sugerir, assim, o potencial de transformação

maligna das lesões.

81

Assim, quando ocorre uma desestabilização de algum ou alguns sistemas de

controle do comportamento celular, agravada pela manutenção de um fator de risco,

poderá se expressar histologicamente como uma DEO ou um câncer propriamente dito.

Caso contrário, fará parte dos casos omissos, em que só maiores estudos ou o tempo,

poderiam confirmar o desfecho destas lesões.

Para Silverman, Gorsky e Lozada (1984), apenas 15% das lesões sem displasia

evoluem para CEO. Por isso, a maioria das lesões leucoplásicas nunca sofrerá

transformação maligna, como também, a presença da displasia não implica

necessariamente em transformação maligna, mas, pode ocorrer sem constatação prévia

-

a, terá um desfecho final, caso não haja intervenção.

Embora existam muitas pessoas sem doença expostas a fatores de risco, é

impossível negar a relação destes com o CEO. No entanto, é necessário considerar a

importância de fatores inerentes ao hospedeiro no processo de transformação celular.

Dentro desta linha de raciocínio, pode-se lembrar a afirmativa de Schiffman e Castle

(2003) ao estudar a relação do HPV com o câncer cervical, de que a presença do vírus é

necessária, mas não suficiente para causar o câncer. Da mesma forma que o HPV, a

maioria dos fatores de risco para funcionar como irritante crônico deve estar ativado ou

atuante por um período prolongado.

Teoricamente, a eliminação de fatores de risco reduz a possibilidade de

surgimento de novas lesões ou de transformação maligna das já existentes (LODI,

PORTER, 2008), sendo, portanto, a maneira mais viável de prevenir o câncer de boca.

A manutenção dos fatores de risco e, por conseqüência, do estado de inflamação crônica

dos tecidos afetados resulta, dependendo do tempo e periodicidade do estímulo, em

descontrole do comportamento celular (NAPIER, SPEIGHT, 2008). Assim, o processo

inflamatório pode funcionar como um estímulo à proliferação e invasão tumorais.

Dentro deste mesmo raciocínio, a reagudização da inflamação durante uma biópsia

incisional, seguida de cicatrização, pode acelerar o processo.

82

A duração da interação entre o epitélio exposto a fatores de risco e o conjuntivo

justo-epitelial pode ser um passo importante na transformação e invasão tumorais, visto

que as células presentes no mesênquima, quando estimuladas, passam a produzir fatores

que estimulam a angiogênese, o crescimento e, conseqüentemente, metástase, como já

citava Biswas et al. (1995) e Hanahan e Weinberg, (2000).

Segundo Yan, Zucker e Toole (2005), experimentos comprovam que o

EMMPRIN induz várias propriedades associadas à malignidade incluindo invasividade,

angiogênese e ancoragem independente de crescimento. Esse processo pode ter início na

remodelação da membrana basal ou matriz extracelular nas proximidades das desordens

potencialmente malignas, favorecendo a tese de que, o processo de reparo, gerado pela

biópsia incisional, pode estimular a invasão de uma lesão pré-cancerosa ou o

crescimento de um CEO já instalado, visto que está intimamente relacionado à

angiogênese e produção de citocinas inflamatórias.

Nessas condições patológicas, o recrutamento de células hematopoiéticas e

endoteliais indiferenciadas pode ser efetuado pelo P1GF (Fator de Crescimento

Placentário), liberado por membros da família TGF-

2005). Isso mostra a importância da precisão e rapidez no diagnóstico das mesmas,

alicerçando a necessidade de maiores conhecimentos sobre os eventos moleculares

envolvidos.

No presente estudo os casos de DEO e CEO foram avaliados morfologicamente

e classificados quanto ao grau histológico e intensidade do infiltrado inflamatório,

considerando o grau histológico nas DEO, como potencial de malignização, visto que

esta assegura, pelo menos em parte, o potencial pré-maligno das lesões e, nos CEO,

como determinante da agressividade tumoral, semelhante ao que foi proposto por

Broders em 1920.

Na gradação histológica de malignidade desenvolvida neste estudo para análise

dos casos de CEO, foram utilizados quatro parâmetros: tipo de invasão, maturidade

invasivo e o dismorfismo, todos

estes já consagrados na literatura, embora sob ponto de vista diferente. Os resultados

83

desta nova forma de avaliação foram, então, comparados com a gradação histológica de

Bryne (1998).

Ao comparar o tipo de invasão das duas gradações, verificou-se uma

concordância quanto à apresentação dos casos, constatando que quando essa invasão se

dava em forma de massas ou trabéculas, o tumor era de baixa agressividade enquanto

que quando esta apresentação se dava em forma de cordões ou células isoladas, as

lesões eram altamente agressivas.

Outro aspecto analisado pela gradação histológica desenvolvida para este estudo

invasivo em 15 casos (68,2%) de baixa agressividade (Estágio I) e 7 casos (31,8%) de

invasivo

em 2 casos (11,1%) de baixa agressividade (Estágio I) e 16 casos (88,9%) de alta

agressividade (Estágio II), mostrando-se estatisticamente significante (p=0,0001).

Contudo, a imaturidade não pode ser utilizada para avaliação do pleomorfismo, como

sugerido pelo estudo de Bryne (1998), entre outros citados na revisão, visto que este se

manifesta no decorrer do processo de diferenciação, por onde muitas dessas células

ainda não passaram. No estudo de Bryne (1998) essa utilização fica ainda mais

incoere front

células é imatura.

invasivo

o

invasivo denota a existência

através do dismorfismo, se essa diferenciação foi bem sucedida ou não contando com o

seu produto final, a ceratina, para esta avaliação. Portanto, as massas superficiais podem

não ser o local onde estão ocorrendo, as principais reações, mas onde se pode observar o

resultado destas, ou seja, o efeito das citocinas inflamatórias no processo de

transformação celular, analisada através do dismorfismo celular e arquitetural. A

presença de massas e o dismorfismo acentuado das mesmas estiveram presentes na

maioria dos casos de CEO de alto grau, mostrando resultado estatisticamente

significante (p=0,038 e 0,037, respectivamente).

84

Ao comparar os resultados da gradação de Bryne com a gradação desenvolvida

para este estudo, observou-se diferença nos resultados

em 20% e 13,3% dos casos, respectivamente. A diferença ocasionada com

a inclusão do infiltrado inflamatório, avaliado por Bryne (1998) como resposta do

hospedeiro, ou seja, diminuindo a agressividade, atribuindo maiores escores àquelas

lesões com menos infiltrado inflamatório e vice-versa, foi irrelevante, embora mostre

que interfere na avaliação individual, assim como a ausência de avaliação do

pleomorfismo celular, visto que no lugar deste, foi avaliada a maturidade das células no

front de invasão.

Na essência, são avaliações diferentes, podendo ocasionar as distorções mais

variadas possíveis, a depender da amostra e por ser um resultado numérico pode ter

havido uma compensação, diminuindo a diferença entre os resultados, chegando a

igualar o resultado final entre os casos de alto e baixo grau de malignidade (Gráfico 01).

O método binário diminui as possíveis distorções causadas por divergências nas

avaliações.

Embora estudos como o de Costa, Araújo-Junior e Ramos (2005) também

tenham encontrado relação entre o infiltrado inflamatório leve e a agressividade tumoral

dada pela presença de metástase em linfonodos, esta pode não estar relacionada à

intensidade do infiltrado inflamatório e sim ao tempo de permanência da lesão na

cavidade oral. Além do mais, a maioria (72,5%) dos casos avaliados em nosso estudo

apresentou infiltrado inflamatório variando entre moderado e intenso, concordando com

Silveira (2007) ao comprovar que o infiltrado inflamatório exerceu grande influência na

classificação da agressividade tumoral proposta por Bryne (1998), embora não garanta

que a inflamação seja favorável ao hospedeiro.

Ainda comentando a possibilidade de relação entre o leve infiltrado inflamatório

e metástase nos linfonodos. Não seria um contra senso, tendo em vista que os CEO de

uma maneira geral apresentam infiltrado inflamatório entre moderado e alto e são

descobertos tardiamente, ou seja, na maioria das vezes muito grande e/ou com

metástase!

85

A detecção de metástases em linfonodos ou à distância, feita através do sistema

TNM, é utilizada na clínica para descrever a situação do tumor naquele momento. No

entanto, isto nem sempre reflete a agressividade das células tumorais, a qual está

relacionada à capacidade dessas células burlarem o sistema imunológico do hospedeiro,

num curto espaço de tempo, fazendo com que o mesmo trabalhe em parceria com as

células tumorais, proporcionando proliferação acelerada e migração destas.

A biologia molecular, através da imuno-histoquímica, apesar de não determinar

o tempo de desenvolvimento tumoral, contribui para presumi-lo, ao detectar o momento

que as mudanças funcionais acontecem. Mesmo porque, estas devem ocorrer antes das

alterações morfológicas observadas na microscopia utilizando o método de rotina,

corado pela hematoxilina e eosina, justificando a falta de correlação muitas vezes

encontrada entre os estudos morfológicos e imuno-histoquímicos.

Mesmo comprovando a importância da imuno-histoquímica como subsídio do

estudo morfológico para determinar a agressividade tumoral, isto não diminui a

importância da classificação TNM na conduta do tratamento, uma vez que o

conhecimento da agressividade em condições avançadas do tumor tem pouca

importância para a sobrevida do paciente, mas seria de grande valia nas fases iniciais da

doença, onde a análise morfológica pode não detectar a sua presença.

Portanto, é impossível não concordar com Bryne (1998) quanto à importância da

interação entre o infiltrado inflamatório, independente do seu papel, e as células

invasivo, embora as marcações observadas permitam discordar que

as de invasão tumoral tenham características

moleculares diferentes, quando comparadas com as áreas superficiais do tumor. Não

necessariamente, já que essa diferença vai depender da velocidade de crescimento. Nos

casos em que a lesão se encontra em fase de franca proliferação, a maioria das células

do invasivo são células imaturas; já quando o crescimento é lento, são

semelhantes às massas superficiais, constituídas em sua maioria de células maduras,

onde algumas já produziram ceratina, e não tendo como descamar, como acontece

normalmente no epitélio de revestimento, vão se acumulando e dando volume às massas

superficiais, e muitas vezes, quando o crescimento é intenso e duradouro, sofrem

86

necrose. Logo, essa diferença pode estar relacionada à maturidade celular, só ocorrendo

nos casos mais agressivos.

Desta forma, as características moleculares, observadas através das marcações

imuno-histoquímicas, podem ser diferentes nas áreas proliferativas, o que seria esperado

até mesmo num epitélio normal, Nas lesões em que o crescimento é lento (sem cordões

f invasivo), fica difícil visualizar essa diferença no padrão de marcação entre

invasivo, mesmo quando são bem atípicas, com massas altamente

dismórficas e contêm muitas células imaturas. Por isso, a análise do invasivo é

tão importante na avaliação desse potencial de crescimento, quanto a avaliação das

massas em relação à sua capacidade de diferenciação, ambas importantes na avaliação

comportamental do CEO.

Os resultados deste estudo mostram que o infiltrado inflamatório esteve presente

em todos os casos de DEO e CEO, sendo mais intenso nos casos de CEO (47,5%) que

nos de DEO (25%). Na maioria dos casos de CEO, ocorreu variação entre moderado e

intenso, mas foi dentre os casos com infiltrado inflamatório leve que se observou que

81,8% (9 casos) estavam no grupo de alto risco, mostrando que a ausência de reação

pode estar relacionada à agressividade tumoral, visto que o hospedeiro não tem reação

contra o tumor, embora o aumento desse infiltrado não demonstre essa proteção,

sugerindo um papel diferente para o infiltrado inflamatório nos CEO. Esses resultados

vêm corroborar com os achados de Silveira (2007), alertando quanto à possibilidade

desse infiltrado exercer outro papel ou mesmo de não exercer seu papel de defesa

citado por diversos autores (ABBAS e LICHTMAN, 2005; JANEWAY et al., 2007 ;

HOFFMANN, BIER e WHITESIDE ,2004) que afirmavam ser comum a presença de

infiltrado inflamatório em tumores da cavidade oral, diferentemente dos conceitos de

Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e Bryne (1989), os quais atribuiram ao infiltrado

inflamatório o papel de defesa anti-tumoral.

É notório que a falta de resposta do hospedeiro, seja pela ausência de reação

inflamatória e/ou por incompetência desta, pode estar relacionada com a agressividade,

mas, a intensidade da inflamação pura e simples não é parâmetro para avaliação

prognóstica, visto que o infiltrado inflamatório pode assumir funções variadas nos

87

estágios da carcinogênese, sendo necessário entender o que representa a sua presença e

como ele atua na transformação, progressão e invasão tumoral.

Segundo Abbas (2007), alterações moleculares significativas que ocorrem entre

as DEO e os CEO não ocorrem entre os graus histológicos dos CEO, concordando com

inflamatório, detectou uma tendência à maior expressão dos marcadores estudados, nas

DEO do que nos CEO, visto que diferenças estatisticamente significantes só foram

detectadas na expressão do CD8 (p=0,001) e do NF- B (p=0,002). Entre os estágios dos

CEO nenhuma alteração significativa foi encontrada.

Estes resultados sugerem que a maior expressão do CD8 no infiltrado

inflamatório das DEO indica uma função inicialmente protetora na carcinogênese,

estando presente também nos CEO, corroborando os achados de Sabel et al. (2005), os

quais sugerem que o controle do tumor depende tanto da magnitude da resposta

imunológica inicial, como da capacidade de sustentar essa resposta por um período

prolongado. Outros tipos celulares presentes em grande quantidade em algumas lesões,

como os polimorfonucleares, podem favorecer a transformação (LIND et al., 2004;

SCHWABE, BRENNER, 2006), como também a progressão e invasão tumoral,

observadas com freqüência após biópsias incisionais.

A queda repentina da resposta imune pode levar a uma progressão rápida da

doença. Porém, aquele papel protetor do CD8 que se esperava encontrar nos estágios

iniciais dos CEO não foi observado, sendo evidenciado nas DEO, significando que,

após a transformação, o infiltrado inflamatório pode tentar deter o crescimento e atrasar

a progressão tumoral, a depender da variação na expressão dos fatores que promovem

ou detêm a lesão, mas dificilmente conseguirá destruí-la. Isso pôde ser observado neste

estudo ao relacionar a intensidade do infiltrado inflamatório com a expressão do CD8, o

qual se mostrou estatisticamente significativo. Daí a importância de se estudar a

imunoterapia como forma de fortalecer a defesa do hospedeiro

inclusive por um subtipo de célula T reguladora ou célula Treg, com atividade

imunossupressora, a qual é ativada sob estimulação antigênica nos tecidos periféricos,

88

HORI, NAMURA e SAKAGUSHI, 2003; MAGGI et al., 2005). Desta forma, essa

citocina pode ter grande participação na agressividade tumoral, visto a forte tendência a

aumentar sua expressão no infiltrado inflamatório dos casos de CEO de alto grau. Como

uma das principais funções desta citocina, é a de inibir a ativação do linfócito T

citolítico (CD8), responsável pela defesa anti-tumoral do hospedeiro, há uma

concordância com os achados de Gorelik e Flavell (2001), os quais concluíram que o

-tumoral.

Apesar de não ter sido detectada no infiltrado inflamatório uma expressão

detecção de células Treg (BOER et al., 2007), tanto entre os casos de DEO e de CEO,

como entre os graus histológic

aumentar nas células inflamatórias das DEO severas, junto com uma forte tendência à

diminuição da FOXP3 e mostrando uma forte tendência a aumentar nos casos de CEO

de alto grau, sugerindo maior atividade das células Treg com diminuição do tempo de

vida da mesma ou ineficácia do marcador, visto que a defesa anti-tumoral exercida

pelos linfócitos T CD8 tende a diminuir tanto entre DEO e CEO como entre os graus

histológicos destas, sendo estatisticamente significante apenas no primeiro caso, quando

intensidade do infiltrado inflamatório nos casos de CEO.

A FOXP3 só mostrou tendência significativa para diminuir entre os graus de

DEO, q

uma queda estatisticamente significativa em relação às DEO, a FOXP3 parece estável e

amatório tende a diminuir, concordando com Chang et al.(2005) que

sugeriram a possibilidade dessa deficiência ser devida a fatores inibitórios liberados

pelas células tumorais.

inflamatório dos casos de CEO de alto grau e a leve tendência ao aumento do NF- B

nos mesmos, é possível concordar com Yeh et al. (2008) que sugeriram um importante

89

nto e a diferenciação celular,

funcionando como supressor tumoral no início da carcinogênese, regulando

negativamente a expressão de oncogenes como o do HPV-16 (DONALISIO et al.,

2008). O presente estudo apresentou uma diminuição significativa deste nas DEO

severas (p=0,011), concordando com os relatos de Glick et al. (1994), os quais

demonstraram ocorrer transformação carcinomatosa em ceratinócitos após diminuição

autócrina do TGF-

Para Donalisio et al. (2008), em câncer cervical, as células transformadas têm

resistência parcial ou total aos efeitos inibitórios do TGF-

resultado esteja relacionado com o grau de diferenciação celular, onde a quantidade de

agressivo, respectivamente. Neste estudo, não houve diferença significativa na

Contudo, é importante lembrar que, segundo Gorelik e Flavell (2001), para

favorecer a respos

células epiteliais. A diminuição do CD8 ocorreu entre os graus das DEO, mostrando a

mesma tendência entre as DEO e CEO, mas não entre os graus dos CEO.

com a intensidade do infiltrado inflamatório pôde-se observar que existe um aumento do

mesmo nas células inflamatórias e uma diminuição nas células epiteliais, tanto nas DEO

como nos CEO, concordando com os estudos citados anteriormente. Isso sugere que a

crescimento, podendo funcionar como uma marca biológica de transformação nos casos

de DEO.

A manutenção do estímulo inflamatório levando à super-expressão do NF- B

nas DEO, sugere que a transcrição acelerada do NF- B nesses casos favorece o

processo de transformação, caindo logo após a transformação, nos casos de CEO. Essa

90

conclusão é fortalecida pela tendência significativa para maior expressão da proteína

ABBAS e

LICHTMAN, 2005), tanto nas células epiteliais, como nas células inflamatórias das

DEO em relação aos CEO, embora não tenha sido observada essa tendência entre os

graus das DEO e dos CEO. Talvez a falta de relação entre a imunomarcação e os graus

histológicos seja pela dificuldade na gradação pelo exame de rotina, mostrando a

importância desses marcadores na evidenciação das alterações moleculares,

contribuindo assim para uma melhor avaliação do potencial de malignidade nas DEO e

da agressividade nos CEO.

Os achados deste estudo vêm a discordar da possibilidade de existir uma forma

ativada de NF- B induzida por vários estímulos inflamatórios que regula os produtos

gênicos nos CEO, protegendo as células tumorais contra apoptose, conforme relatos de

Aggarwal (2004); Pacifico e Leonardi (2006), visto que este diminui significativamente

nos CEO em relação às DEO.

Quando a expressão destes marcadores foi associada à intensidade do infiltrado

inflamatório, evidenciou-se aumento significativo tanto do NF-

confirmando a importância da inflamação no processo de transformação celular. Nos

CEO, o NF- o qual aumentou

epiteliais diminuiu. Estes resultados indicam que talvez as células transformadas

independam dessa via de transcrição e/ou que apresentem alguma falha no receptor de

(LIND et al., 2004), pode estar ocorrendo uma diminuição compensatória devido à

aumentado, passa a ter outras funções nos CEO, as quais podem estar relacionadas à

progressão e invasão tumoral.

pel de

induzir a transformação independente da ativação do NF- B, assim como os de Luedde

91

et al. (2007), que sugeriram a inibição do NF- B como causa do câncer, o atual estudo

acredita que o aumento do NF- B nas DEO e subseqüente diminuição nos CEO seja

mais comumente uma conseqüência da transformação e não a causa, embora a

o aumento tanto do NF -

infiltrado inflamatório, opinião esta em concordância com Lind et al. (2004)

em transformação pode estar relacionada à

infiltrado inflamatório nas DEO, tanto nas células epiteliais, mostrando a aceleração

transcricional das mesmas através da correlação positiva do NF- B, quanto nas células

inflamatórias, indicando grande atividade na produção de citocinas, o que vem a

concordar com Aggarval et al. (2006), que sugere

mediadores químicos da inflamação, estando envolvido em diversos passos da

tumorigênese, inclusive no processo de transformação. A manutenção do NF- B

ativado, durante a inflamação, disparado pela super-regulação de TNF é um

importante elo entre o câncer e a inflamação, concordando com a opinião de Pikarsky et

al. (2004).

Nos casos de CEO, onde era esperada uma correlação positiva da expressão do

ectada

uma correlação negativa, estatisticamente significativa, sugerindo que as células

transformadas perdem esse elo com a inflamação. Isso leva a discordar mais uma vez da

possibilidade de existência de uma forma ativada do NF- B nos CEO, sugerida por

Pacifico e Leonardi (2006), mesmo porque, embora o NF- B continue diretamente

proporcional à intensidade do infiltrado, o aumento é insignificante.

inflamatórias com a intensidade deste infiltrado, mantendo o NF- B ativado, predispõe

à transformação maligna nas DEO, estando este envolvido na ativação da célula T,

contribuindo para a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e na resposta de muitos tipos

celulares às citocinas pró-inflamatór

concordando com a opinião de Pacifico e Leonardi (2006).

92

Embora neste estudo a avaliação do NF- B tenha sido feita só nas células

epiteliais, a super-expressão deste esteve visivelmente presente nas células inflamatórias

células inflamatórias associado à intensidade deste infiltrado, observado no teste de

correlação de Spearman (Tabela 12).

A avaliação das alterações moleculares nas DEO é o maior trunfo para a

prevenção e tratamento precoce do CEO, tendo em vista que não existe nenhum

parâmetro que determine o momento que um tecido displásico, independente do grau

histológico, invade o tecido conjuntivo ou um CEO metastatiza. No entanto, a falta de

- B sugerem

inflamatório dos CEO, a progressão tumoral. Tais eventos podem ser valiosos na

determinação de uma marca biológica que sirva de parâmetro para avaliação do

potencial de malignidade das DEO e agressividade dos CEO em estudos futuros.

O contexto desse estudo em geral vem a concordar não só com Weitzman e

Gordon (1990) ao associarem vários processos inflamatórios crônicos com o

desenvolvimento do câncer, mas também com Balkwill e Mantovani (2001) ao

sugerirem a participação das citocinas e células inflamatórias no desenvolvimento e

progressão tumoral, com Abbas e Lichtman (2005), ao afirmarem que as células

transformadas têm a capacidade de evadirem ou superarem os mecanismos de defesa do

hospedeiro e com Silveira (2007), ao sugerir um papel diferente, daquele

exclusivamente anti-tumoral, sugerido em outros estudos.

No entanto, a inflamação tanto inibe como promove a carcinogênese, sendo que

o aumento dos promotores leva à transformação e durante a transformação, as células

perdem o controle do crescimento e se tornam independentes dos estímulos de uma

célula normal, criando seus próprios mecanismos de sobrevivência e fazendo com que o

infiltrado inflamatório participe junto com elas da progressão e invasão tumoral, embora

as células de defesa sejam importantes, nesta fase, para atrasar o processo. Isso mostra

que a imunoterapia ainda pode ser de grande valia no combate ao câncer.

93

A exploração de outras proteínas, principalmente aquelas relacionadas com

remodelação tecidual, como o EMPRIM (YAN, ZUCKER E TOOLE, 2005) e/ou as

relacionadas com a migração das células tumorais através da indução da motilidade e

conseqüentemente a invasividade, como as BMP (KATSUNO et al., 2008 e STEINER

et al., 2008), é necessária para demonstrar o papel das mesmas durante a invasão e

progressão do CEO.

94

CONCLUSÕES

95

7- CONCLUSÕES

1- Os parâmetros utilizados na Gradação Histológica de Malignidade deste estudo

são condizentes com a agressividade tumoral.

2- O estudo do front invasivo para avaliação do crescimento tumoral é importante

assim como o estudo das massas superficiais para avaliação da diferenciação

celular.

3- A intensidade do infiltrado inflamatório não serve como parâmetro histológico

de malignidade devido à variação do seu papel nas fases da carcinogênese.

4- A permanência da inflamação por tempo prolongado pode favorecer a

transformação maligna, após a qual passa a atuar na progressão tumoral

favorecendo a metástase.

5- A reação anti-tumoral exercida pelos linfócitos T CD8 pode impedir a

transformação ou atrasar a progressão da lesão.

6- O NF-

funcionando como elo de união entre a inflamação e o câncer.

7-

Logo, os ceratinócitos transformados perdem, parcialmente ou totalmente, o

controle do crescimento exercido por ele.

8- A diminuição do nas células transformadas pode significar a autonomia

das mesmas.

9- Os eventos moleculares detectados neste estudo podem ser valiosos na

determinação de marcas biológicas que sirvam de parâmetro para avaliação do

potencial de malignidade das DEO e agressividade dos CEO em estudos futuros.

96

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