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   UNIVERSI F DEP  EXTRACÇÃO DESO Estágio Laboratorial Discente: Docentes  ADE EDUARDO MO CULDADE DE CIÊNCIAS ARTAMENTO DE QUIMICA E QUANTIFICAÇÃO IRIBONUCLÉICO (  CONDOEIRA, Silva Benedito : Prof. Doutor Victor Skripet dr. Jaime Cumbe DLANE  DE CIDO NA) Maputo, Abril de 2011

EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO DESOXIRIBONUCLÉICO _DNA_CONDOEIRA,Silva

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CONDOEIRA,Silva

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CONDOEIRA

UNIVERSI

FDEP

EXTRACÇÃO

DESO

Estágio Laboratorial

Discente:

Docentes

 

ADE EDUARDO MO

CULDADE DE CIÊNCIASARTAMENTO DE QUIMICA

E QUANTIFICAÇÃO

IRIBONUCLÉICO (

CONDOEIRA, Silva Benedito

: Prof. Doutor Victor Skripet

dr. Jaime Cumbe

1

DLANE

DE ÁCIDO

NA)

Maputo, Abril de 2011

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I.  RESUMO TEÓRIC

 

Os tripanossomas fazem pa

mamíferos, incluindo o hom

transmitido pela mosca tsé-ts

podem acarretar alterações he

A técnica de PCR (polymera

processo de replicação de D

termoestável isolada da bacté

Com a PCR, quantidades mín

em poucas horas, permitindo

infecciosas, cancro ou doença

Durante o PCR são usadas el

duas cadeias simples, permi

também em cadeia simples e

química. Para amplificar

complementares das sequênc

terminais 3', de modo a perm

complementar, usando como

amplificar (figura 1).

Para realizar PCR são nece

contendo a polimerase, prime

 Figura 1: Processo de replicação

rte do grupo dos protozoários e podem inf 

em. Trypanosoma vivax  (género Trypan

é para ruminantes, ocasionando infecções

matológicas severas e mortalidade dos anima

se chain reaction - reacção de polimerase e

A. A chave para a PCR é a DNA Taq po

ia Thermus Aquaticus. 

imas de material genético podem ser amplifi

a detecção rápida e fiável dos marcadores

s genéticas.

evadas temperaturas de forma a separar as

tindo então a ligação de oligonucleótidos

eralmente constituídos por 15 a 30 nucleóti

uma determinada região são necessár

ias que flanqueiam o fragmento de DNA

itir a actuação da DNA Taq polimerase dura

molde cada uma das duas cadeias simples c

ssárias pequenas quantidades do DNA al

rs, os quatro desoxinucleótidos constituinte

de DNA através da reacção de polimerase em cadeia

2

ctar insectos e vários

soma)  é um parasita

gudas e crónicas, que

is.

cadeia) baseia-se no

limerase, uma enzima

adas milhões de vezes

genéticos de doenças

oléculas de DNA em

iniciadores ( primers),

os, obtidos por síntese

ios dois iniciadores

amplificar, nos seus

nte a síntese da cadeia

onstituintes do DNA a

o, um tampão salino

do DNA e o cofactor

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Mg2+. Esta mistura é submeti

que se repete um número esp

1)  Desnaturação: (94-96

2)  Hibridização ou  An

hidrogénio ao DNA al

3)  Extensão: (72ºC) amp

de cada cadeia molde,

Demonstração esquemática d

desnaturação, de annealing e

Normalmente são realizados

exponencial (2ciclos). 

O resultado é analisado atrav

acordo com sua massa e sua cDurante a eletroforese, as pa

elétrica aplicada nele. Depen

migrar para o cátodo (+) ou

rapidamente que moléculas d

fará o DNA ou RNA "brilhar"

 Figura 2: Demonstração esquem( (ºC) e tempo de desnat

da a vários ciclos de amplificação que cons

cífico de vezes:

ºC) de modo a separar as duas cadeias.

ealing:  (50-65ºC) Associação dos inicia

vo em cadeia simples.

lificação dos iniciadores através da síntese d

catalisada pela DNA Taq polimerase.

programação no termociclador, indicando a

e extensão.

de 25 a 40 ciclos para cada reacção na qual

és de uma eletroforese em gel, que é a mig

arga, ela pode ser de agarose ou de poliacrilatículas se movem entre os poros do gel de

endo da carga das partículas que estão send

para o ânodo (-). Moléculas de menor m

e maior massa. Após a corrida, coloca-se

quando exposto ao UV.

tica da programação dos ciclos da PCR com temperatração, de anelamento e de extensão.

3

istem em três passos e

ores por ligações de

cadeia complementar

s temperaturas de

a taxa de replicação é

ração de partículas de

midaacordo com a corrente

o separadas, estas irão

assa irão migrar mais

rometo de etídio, que

ura

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1.  Objectivos 

Geral 

  Aplicar as técnicas básicas de biologia molecular na extracção e quantificação de

ácido desoxiribonucléico (DNA).

  Aplicar as técnicas de diagnóstico da tripanossomose bovina baseada na reacção dePCR.

 Específicos

  A partir de uma amostra de sangue bovino existente fazer a extracção de DNA de

trypanossona vivax e quantificar por espectofotometria em um Nanodrop,

  Aplicar a reacção de PCR na amplificação do DNA de trypanossona vivax colhida

da amostra de sangue bovino e diagnosticar esse DNA com base na electroforese

em gel de agarose.

2.  PARTE EXPERIMENTAL

Nas tabelas abaixo estão representados os materiais, equipamentos e reagentes usados durante a

experiência

Tabela 1: Materiais e equipamentos

Materiais e Equipamentos

Centrifugadores Lamparina Microondas Geleira

Tubos Eppendorf Nanodrop Fluxo laminar Luvas

Balança Analítica Transiluminador UV Micropipetas e Pontas Tesoura

Termociclador iCycler BIORAD® Equipamentos de Electroforense

Tabela 2: reagentes usados

Reagentes 

PBS Primers Chelex dNTPmix

PBS-Saponina PCR buffer TBE Dream Taq

Brometo de Etídio Agua destilada Agarose MgCl2 

Tampão de carregamento (azul de bromofenol)

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II.  EXTRACÇÃO DE D

1.  Esterilizou-se uma

lamparina, e com el

pedaços (equivalente

papel de filtro conte

(Sangue Bovino co

Mangaze no dia

depositou-se num tub

2.  Preparou-se e adiciocontendo a amostra e i

3.  Após a incubação cent

papel de filtro, pois ne

Levou-se novamente a

4.  Após a incubação cen

Após isto, adicionou-

maria por 10min a 95°

5.  Centrifugou-se nova

mistura em três fases,

e a fase orgânica (fo

transferida para um no

Observações:

Durante o processo de extra

plasmáticas e nucleares de mpara remover o resto da sapon

do papel de filtro e o banho-

As soluções, assim obtidas, f 

determinar se da amostra foi

ng/µL) o DNA extraído da a

NA NAS MANCHAS DE SANGUE EM P

tesoura, numa

a corta-se em

s a 1mm2) o

ndo a amostra

hido por M.

16.11.10) e

de centrífugo.

ou-se 1mL de PBS – Saponina a 0,5%ncubou-se a mistura durante 4h a 4°C

rifugou-se e descartou-se do tubo a parte liq

le estava contido o DNA, tendo-se adicionad

incubadora, por 1h.

rifugou-se durante 5min e descartou-se nov

e ao tubo 100µL de Chelex a 10% e levou-

C e sob agitação constante.

ente a mistura durante 5min a 1400rpm.

uma aquosa (contém o DNA a extrair), interf 

rmada basicamente de lipideos). A fase aq

vo tubo.

ção, o complexo PBS – Saponina adiciona

do a expor o DNA do tripanossoma. O seguina não descartada. A adicção de Chelex ma

aria desnatura as proteínas.

oram levadas para o nanodrop (um espectr

-nos possível extrair o DNA, ou seja de m

ostra preparada.

Figura 2: Amostra de Sang

5

APEL DE FILTRO

o tubo de centrífugo

ida deixando apenas o

o depois 1mL de PBS.

mente a parte líquida.

e a mistura ao banho-

Houve separação da

ase (contém proteinas)

uosa foi descartada e

do quebra membranas

ndo PBS é adicionadoscara o DNA e o retira

fotometro) de modo a

odo a quantificar (em

ue Bovino

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III. ANALISE QUALIT

Quantificação de DNA n

1.  Com o computador

programa ND-1000

opção Nucleic Acid. 

2.  Levantou-se o pe

sensores (superior e i

macio e depositou-

1,5µL de água desti

baixou-se o pedestaloperação.

3.  Novamente levant

limpamo-los com pa

1,5µL de Blank, b

seleccionou-se a opç

diálogo. Após esta

pedestai e limpou-se

4.  Depositou-se 1,5µL

se o pedestal, preenc

opção MESURE. Ter

amostras e duas veze

5.  Terminada as analise

de DNA na amostra,

Tabela 3: Registo de concentraç

Amostras ng/µ

1M"- Preto 33,9

2M"- Preto 39,9

3M"- Preto -1,33

1M"- Azul 46,3

2M"- Azul 62,5

H2O -0,05H2O 0,46

Depois da quantificação, cons

TIVA E QUANTITATIVA DOS ÁCIDO

o Nanodrop

activado, activou-se o

3.7 e seleccionou-se a

estal, limpou-se os

nferior) com um papel

e, no sensor inferior,

lada até formar bolha;

e esperou-se o fim da

u-se o pedestal e

el macio. Depositou-se

ixou-se o pedestal e

ão Blank na janela de

peração levantou-se o

s dois sensores (superior e inferior).

a amostra preparada na secção anterior no s

eu-se o SAMPLE ID com códigos da amos

minada a operação, procedeu-se do mesmo

com a água.

s limpou-se os pedestais e registou-se os va

bsorvância e Ratio, conforme mostra a tabe

es e Absorvância de ADN extraído da amostra 

l A260 A280 A

0,68 0,958

0,799 1,14

-0,027 -0,132

0,927 1,316

1,252 1,696

-0,001 -0,0020,009 0,013

ervou-se a amostra de DNA extraído a 4°C.

 Figura 3: Nanod

6

NUCLÉICOS

nsor inferior, baixou-

tra e seleccionou-se a

odo para as restantes

lores da concentração

la a seguir:

260 /A280 

0,71

0,7

0,2

0,7

0,74

0,660,72

rop (ND) 

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IV. REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Para a realização da reacção de polimerase em cadeia (PCR), preparou-se num fluxo laminar amistura de reacção (master mix) com os componentes da tabela abaixo em um tubo de eppendorf 

de volume equivalente a 0,5mL:

Tabela 4: Componentes usados para a mistura de reacção

Componente (Conc, stock) Conc. Final µL/reacção Vtotal (µL)x10

PCR buffer (10x) 1x 2 20

MgCl2 (25mM) 2,5mM 2 20

dNTP-mix (10mM) 0,5mM 1 10

Primer PGP-Fw (10µM) 0,25 µM 0,5 5

Primer PGP-Rv (10µM) 0,25 µM 0,5 5

Dream Taq (5U/µL) 0,5 µ/µl 0,25 2,5

H2O detilada # 12,75 127,5

DNA # 1 µL 10 µL

Volume Total 20 µL 200 µL

Da solução master mix preparada foi retirado sucessivamente 20µL para 10 tubos de eppendorf.

Esses tubos, foram posteriormente levados a um termociclador, onde ocorre a reacção de PCR

propriamente dita. As condições de reacção de PCR estão representadas na tabela abaixo:

Tabela 5: Condições de Reacção

Etapa Objectivo Temperatura Temo N° de ciclos

1 Desnaturação inicial 94°C 5min

2 Desnaturação 94°C 40s3 Pareamento ou anneling 65°C 40s 38

4 Extensão 72°C 90s

5 Extensão final 72°C 10min

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V.  ELECTROFORESE

1. 

Preparou-se a cubpara se depositar o

2.  Preparou-se o gel

arrefecer até 50%.

3.  Adicionou-se bro

deixou-se até poli

4.  Após a polimeriz

certo volume de ta

5.  Misturou-se 2µL

permitir o  acomp

master mix e o D

6.  Retirou-se pequen

diferentes poros d

7.  Conectou-se os el

durante 20min.

8.  Terminada a corri

ultravioleta confor

 Figura 4: Visualização

EM GEL DE AGAROSE

a de alectroforese e colocou-se os pentes ds componentes a analisar,

de agarose (a preparação está na pagina e

eto de etídio, verteu-se a mistura na cu

erizar.

ção retirou-se o pente e mergulhou-se a cu

mpão de corrida.

e tampão de carregamento, de modo a adici

nhamento da  corrida, para cada um dos 10

A extraído.

as quantidades, em cada tubo, da mistura e

gel.

ctrodos a fonte e submeteu-se as amostras

a, retirou-se a tina contendo gel e observou

me mostra a figura a seguir:

de bandas de DNA em electroforese de gel de a

8

e modo a fazer poros

m anexo) e deixou-se

ba de electroforese e

ba numa tina com um

onar cor as amostras e 

tubos que continha o

5 e depositou-se nos

a uma corrida a 100V

-se no transiluminador

arose 

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VI. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

A tabela 3 apresenta as concentrações de DNA e as relações de absorbância em 260 e 280 nmobtida das amostras de coágulo sanguíneo extraidos em bovinos, após análise

espectrofotométrica no Nanodrop. Como se observa, as amostras de DNA obtidas apresentam

um garu de pureza relativamente proximo do ideal, com excepção da amostra 3M"- preto que

apresenta um valor muito equidistante.

Estes valores indicam que o DNA extraidos estão, de certa forma, contaminadas por proteinas

visto que a razão A260 /A280 está, de certo modo, abaixo de 1,44 a 1,90 que indicam amostras com

alto grau de pureza.

Nota: Todos os cálculos relativos a preparação das soluções estão na folha em anexo. 

A avaliação do DNA extraído em electrforese em gel de agarose não mostrou existências de

DNA do tripanossoma vivax no DNA genômico extraido das amostras de coágulos sanguíneos

bovinos, entretanto, este resultado leva-nos a duas possiveis análise:

1) 

Durante o processo de extracção de DNA pode ter ocorrido uma inibição promovidapelo Chelex que conjuntamente com o DNA teria sido tranferido para o novo tubo

durante o processo descrito em 5 na extração de DNA ou pelas proteinas que não

foram desnaturadas nem pelo processo de desnaturação em banho-maria. Estes

provavelmente se teriam acoplado/reagido com master mix inibindo o processo de

amplificação na reacção de PCR.

2)  Durante a reacção de PCR não ocorreu a amplificação do DNA do tripanossoma

vivax pelo facto de a amostra analisada não o conter, ou seja, o coágulo de sanguebovino analisado não apresenta nenhum grau de contaminação pela tripanossomose.

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VII.  CONCLUSÃO

As análises colocadas na discussão dos resultados não indicam que a experiência não tenha de

melhor forma, nem ainda, que não se tenha atingido os objectivos preconizados, porém suscinta

que as experiências deste género sejam repetidas por duas ou mais vezes para que não se tenha

resultados ambíguos e ainda para que cada resultado das experiências se sustentem entre si dando

mais credibilidade aos resultados. Não obstante, nesta experiencia foi-nos possível aplicar as

técnicas básicas de biologia molecular na extracção e quantificação de ácido desoxiribonucléico

(DNA), aplicar a reacção de polimerase em cadeia (PCR) na amplicação de uma quantidade

mínima de um material genético e com base na electroforese em gel de agarose fazer o seu

diagnóstico.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1) 

McMurry, John, Organic Chemistry, Thomson –Brooks/Cole, 7 Edition, 2008, USA,p.p. 1117 – 1118.

2)  Anónimo 2, Tripanossoma, http://pt.wikipedia.org/wiki/Tripanossoma, consultado no dia

17.03.2011

3)  Anónimo 1, PCR - Amplificação de DNA in vitro,  http://www.e-

escola.pt/topico.asp?hid=339, consultado no dia 17.03.2011

4)  Anónimo 3,   Eletroforese em Gel, http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel,

consultado no dia 21.03.2011

5)  Anónimo 4, Electroforese,

http://www.sabedoria.ebrasil.net/db/biologia/estudos/biologia/biologiag/eletroforese.php.

htm, consultado no dia 24.03.2011

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ANEXO

1.  Preparação da solução de PBS 1x

Foi-nos dado uma solução tampão de PBS 10x e tínhamos que prepara-la a 1x num copo

de 50mL

PBS (10x) PBS (1x) em 50mL

Usando a lei de diluição tem-se: . = .  

=

= 5 

  Foram tomados 5mL da solução tampão de PBS (pH = 6,89) a 10x para se

preparar uma solução 1x. O volume foi completado com água destilada.

2.  Preparação de PBS – Saponina a 0,5%

Quantidade de saponina a pesar para preparar a solução de PBS – Saponina a 0,5%   a

partir da solução anterior.

1 100 1% 

0,25 25 1% 

0,5% 

= 0,125  

  Pesado 0,125g de saponina, dissolveu-se na solução de PBS 1x preparado

anteriormente, obtendo-se assim PBS – Saponina a 0,5% 

3.  Preparação da solução de Chelex a 10% 

Massa de Chelex a pesar para prepara-lo a 10% num volume de 5mL

Tem-se que: % ℎ = 10  % =

çã100 

çã = 5 logo

=?  = 0,5 

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  Em uma balanca analítica, pesou-se 0,5g de Chelex e com ajuda de micro pipeta

adicionou-se 5ml de agua destilda.

4.  Preparação de Gel de Agarose (1%) 

Massa de agarose a pesar para preparar o gel a 1% num volume de 5mL

Tem-se que: % = 1  % =

çã100 

çã = 50 logo

=?  = 0,5 

Pesou-se 0,5g de agarose e dissolveu-se em 50mL de TBE (1x), colocou-se a solução no

microondas de modo que a solução se solubilizasse completamente.

Deixou-se a mistura arrefecer por uns minutos de modo que o gel se polimerizasse e

adicionou-se depois 2,5µL de brometo de etídio (0,5µL por cada 10mL de solução).

5.  Preparação de Tampão de Carregamento

Foi-nos dado o azul de bromofenol, um tampão de carregamento, a 6x e tinha que sepreparar uma solução a 1x num volume de 20µL.

Usando a lei de diluição tem-se: . = .  

=

= 3,5 µ 

  Foram tomados 3,5µL da solução tampão de carregamento a 6x para se preparar

uma solução de 1x.