FATORES FÍSICOS E QUÍMICOS MEDIADORES DA OVIPOSIÇÃO DE

FLÁVIA AUGUSTA CLOCLET DA SILVA

FATORES FÍSICOS E QUÍMICOS MEDIADORES DA OVIPOSIÇÃO DE

PENTATOMÍDEOS FITÓFAGOS EM SUBSTRATOS ARTIFICIAIS

Tese apresentada como requisito parcial para obtenção

do grau de “Doutor em Ciências” no Programa de Pós-

graduação em Ciências Biológicas, Área de

Concentração Entomologia, da Universidade Federal do

Paraná.

Orientador: Dr. Antônio Ricardo Panizzi

Curitiba – PR

2009

ii

Aos meus pais, Neno e Lica.

DEDICO.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelos desafios diários que justificam plenamente a vida.

Ao Dr. Antônio Ricardo Panizzi, meu orientador e amigo, a quem tenho grande admiração pelo

exemplo de dedicação à Entomologia.

Ao programa de Pós-graduação em Entomologia da Universidade Federal do Paraná, a todo seu

corpo docente, em especial às professoras Sonia Noemberg Lazzari e Lúcia Massutti de Almeida,

pelo incentivo e sugestões valiosas.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte

financeiro.

À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa Soja), especialmente a equipe de

Entomologia pela amizade e colaboração.

Aos pesquisadores da Embrapa Cenargen: Dr. Miguel Borges, Dra. Maria Carolina de Moraes e Dr.

Raúl Laumann, pela colaboração direta na elaboração deste trabalho e pela hospitalidade em

Brasília.

Aos pesquisadores do Laboratório de Melhoramento Genético da Embrapa Soja, Dra. Mercedes

Carrão-Panizzi e José Marcos Mandarino e ao laboratorista Rodrigo S. Leite, pela colaboração nas

análises químicas.

Aos funcionários do Laboratório de Microanálise da Universidade Estadual de Londrina, em

especial à professora Célia Guadalupe Andrade.

Às amigas de sempre: Ana Paula Vidotto, Andressa Murata, Janaína Rigonato e Karina Morelli, que

apesar da distância sempre se fizeram presentes em minha vida.

iv

Aos amigos de laboratório: Fábio Siqueira, Rogério Depieri, Fabiane Cunha e Talita M. Alexandre

pelos bons momentos que passamos juntos.

Ao laboratorista e amigo Jovenil J. da Silva, pelo apoio e grande exemplo de generosidade.

Aos meus pais Neno e Lica, à minha irmã Ana Rosa e meu sobrinho João Fernando, por

representarem em minha vida, a verdadeira essência do amor.

À minha segunda família: Lúcia, Wagner, Luciana e Helô pela presença fraternal e pelo apoio em

todos os momentos da minha vida “londrinense”.

Agradeço especialmente ao Fábio Coltro (Fá), pela amizade, paciência, amor incondicional e

principalmente, por acreditar que este trabalho era possível.

Ao meu “filho peludo”, Teodoro, pelos momentos de descontração em meio às preocupações com a

elaboração da tese.

v

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ...................................................................................................................... iii

RESUMO......................................................................................................................................... viii

ABSTRACT ....................................................................................................................................... x

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................................... xii

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... xiv

CAPÍTULO 1

Introdução geral

1.1. Introdução ........................................................................................................................ 1

1.2. Objetivos .......................................................................................................................... 5

1.3. Literatura Citada .............................................................................................................. 7

CAPÍTULO 2

Avaliação de substratos artificiais de oviposição para pentatomídeos fitófagos

2.1. Introdução ...................................................................................................................... 11

2.2. Material e métodos ........................................................................................................ 13

2.3. Resultados e discussão .................................................................................................. 17

2.4. Literatura citada ............................................................................................................. 30

vi

CAPÍTULO 3

Oviposição de Euschistus heros (F.) (Heteroptera: Pentatomidae) em substratos artificial e

natural

3.1. Introdução ...................................................................................................................... 34


3.3. Resultados e discussão ................................................................................................... 38


CAPÍTULO 4

Análise do perfil químico de vagens verdes de soja da cultivar BRS 267

4.1. Introdução ...................................................................................................................... 48




4.5. Anexos ........................................................................................................................... 79

CAPÍTULO 5

Resposta olfativa e oviposição de Euschistus heros em substrato artificial tratado com

compostos químicos extraídos de vagens de soja da cultivar BRS 267

5.1. Introdução ...................................................................................................................... 81



5.4. Literatura citada ........................................................................................................... 104

vii

CAPÍTULO 6

Comparação do perfil químico e análise de preferência alimentar e de oviposição de

Euschistus heros em vagens verdes de soja de diferentes cultivares

6.1. Introdução .................................................................................................................... 112

6.2. Material e métodos ...................................................................................................... 114

6.3. Resultados e discussão ................................................................................................. 117

6.4. Literatura citada ........................................................................................................... 131

CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................................................... 138

viii

RESUMO

Visando aprimorar a técnica de criação de pentatomídeos fitófagos em laboratório foram avaliados

diferentes substratos artificiais para oviposição, identificando as características físicas e químicas

envolvidas neste comportamento. Primeiramente, avaliou-se o algodão hidrófilo como substrato

artificial de oviposição para os pentatomídeos: Chinavia impicticornis (Stål.), Dichelops

melacanthus (Dallas), Edessa meditabunda (F.), Euschistus heros (F.), Nezara viridula (L.),

Piezodorus guildinii (West.) e Thyanta perditor (F.). Cinco espécies mostraram preferência em

ovipositar no algodão, apenas E. meditabunda e N. viridula apresentaram preferência pela caixa de

plástico. Ao se comparar a oviposição de E. heros no algodão, no tule e no voil, observou-se

preferência pelo algodão (85,2% de posturas) seguido pelo tule (13,7%) e o voil (1,1%). Ao se

comparar o algodão com substratos naturais, E. heros ovipositou mais no algodão (74,3% posturas)

do que em folhas (23,6 %) ou em vagens de soja (0,1%). Pedaços de algodão fixos em planta de

soja receberam mais posturas (60%) do que a planta isoladamente (40%) e, em análise de

microscopia eletrônica de varredura observou-se que fibras do algodão recobrem os ovos, porém a

eclosão não é afetada. Para P. guildinii comparou-se o algodão com fio de lã sintética e com

barbante de algodão. Obtiveram-se mais posturas no fio de lã (92,3%), indicando que esta espécie

prefere superfícies alongadas e com fibras soltas para depositar os ovos. Ao se avaliar o perfil

químico de vagens de soja `BRS 267´ buscando identificar compostos químicos condicionantes de

oviposição e, que possam ser utilizados em associação com os substratos artificiais selecionados,

identificou-se vários compostos voláteis [(E)-2-hexenal, (Z)-3-hexen-1-ol, 1-octen-3-ol, tridecano,

pentadecano e hexadecano]. Também, açúcares como galactitol, glucopiranose, D-galactose, D-

galactofuranose e isômeros de inositol foram identificados. A concentração total de açúcares no

ix

extrato de vagens foi de 9,9% e de isoflavonas de 128,1 mg/100 g. Em olfatômetro, as fêmeas de E.

heros responderam positivamente ao extrato de vagens de soja `BRS 267´, bem como às misturas de

voláteis extraídos das vagens. Fêmeas aeradas com os voláteis extraídos das vagens de soja e com

misturas de voláteis (aldeídos e alcanos) tiveram a oviposição estimulada 24 h após, observando-se

redução acentuada após 48 h. Algodão tratado com extrato de vagens recebeu mais posturas (60%)

do que a testemunha, ou seja, com metanol puro (40%). Soluções de açúcares e isoflavonas

(daidzina, genistina e glicitina) causaram deterrência de oviposição para E. heros. Comparou-se o

perfil químico de vagens de soja das cultivares BRS 267, BRS 213, BR 16 e IAC-100 e a

preferência alimentar e de oviposição de E. heros pelas vagens desss cultivares. As cultivares BRS

267 e BRS 213 liberaram mais voláteis em comparação às demais. A concentração de açúcares foi

semelhante entre as cultivares. Níveis maiores de isoflavonas foram observados em ÌAC-100´ e

`BR 16´. Fêmeas de E. heros apresentaram preferência alimentar e de oviposição pela cultivar BRS

267.

PALAVRAS-CHAVE: Heteroptera, Glycine max, comportamento, substrato artificial, oviposição,

fitoquímicos.

x

ABSTRACT

To improve the rearing technique of stink bugs in the laboratory, we evaluated different ovipositing

substrates. In addtion, we identified physical and chemical traits involved in this behavior. Firstly,

we tested commercial cotton balls as oviposition site of the pentatomid species Chinavia

impicticornis (Stål.), Dichelops melacanthus (Dallas), Edessa meditabunda (F.), Euschistus heros

(F.), Nezara viridula (L.), Piezodorus guildinii (West.) and Thyanta perditor (F.). Chinavia

impicticornis, D. melacanthus, E. heros, P. guildinii and T. perditor showed preference to oviposite

on cotton balls. E. meditabunda and N. viridula preferred to lay eggs on plastic boxes. Additionaly,

we showed that E. heros prefer to lay eggs on the cotton balls (85.2%) rather than polyester veil

(13.7%) or cheesecloth (1.1%). When we compared cotton balls with natural substrates, E. heros

showed preference to oviposite on balls (74.3%) compared to leaves (23.6%) or pods of soybean

(0.1%). Cotton balls tied to soybean plants received more egg masses (60%) than the entire plants

(40%). Although scanning electron microscopy showed cotton fibers surrounding the egg masses,

the nymph’s eclosion was not affected. Piezodorus guildinii preferred to lay eggs on syntetic wool

string (92.3%) rather than cotton string, indicating its preference to lay eggs on elongated structures

with loose fibers. Finaly, we identified chemicals of soybean pods (cv. BRS 267) involved in the

oviposition process and used those chemicals in association with the artificial substrates selected.

We identified several volatile compounds, such as (E)-2-hexenal, (Z)-3-hexen-1-ol, 1-octen-3-ol,

tridecane, pentadecane and hexadecane. Additionaly, we identified sugars as galactitol,

glucopiranose, D-galactose, D-galactofuranose and isomers of inositol. Total sugar concentration on

pod extracts was 9.9%, and of isoflavones on pods was 128.1 mg/100g. In olfactometer tests,

females of E. heros showed positive response to soybean pod extract and to the mixtures of

xi

volatiles. Females exposed for 10 min. to volatiles (aldehydes and alkanes) showed stimulated

ovipostion after 24 h, which decreased after 48 h. Cotton balls treated with pod extract received

more egg masses (60%) than when treated with methanol (40%). Sugar and isoflavone (daidzin,

genistin and glycitin) solution caused oviposition deterrency of E. heros. Chemical profile of

soybean pods of cvs. BRS 267, BRS 213, BR 16 and IAC-100 were compared regarding E. heros

feeding preference and ovipostion. BRS 267 and BRS 213 released more volatiles, sugar

concentration among varieties was similar, and isoflavone contents were greater for cvs. IAC-100

and BR 16. E. heros females showed feeding and oviposition preferences for cv. BRS 267.

KEY WORDS: Heteroptera, Glycine max, behavior, artificial substrates, oviposition,

phytochemicals.

xii

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2

Tabela 2.1. Número médio (± EP) e porcentagem média (± EP) de posturas e ovos depositados por

Euschistus heros em substratos artificiais. ................................................................................. 21


Piezodorus guildinii em substratos artificiais em laboratório. ................................................... 23


Piezodorus guildinii em substratos artificiais em laboratório. ................................................... 24

CAPÍTULO 3


Euschistus heros em substratos artificial e natural em teste de dupla escolha em laboratório. .. 39


Euschistus heros em substratos artificial e natural em teste de múltipla escolha em laboratório.

......................................................................................................................................................40

CAPÍTULO 4

Tabela 4.1. Concentração média dos compostos voláteis obtidos por aeração forçada de vagens de

soja (cultivar BRS 267) em estágio R6. ..................................................................................... 59

Tabela 4.2. Concentração de isoflavonas presentes em sementes de soja in natura, da cultivar BRS

267 (M.C. Carrão-Panizzi não-publicado). ................................................................................ 68

xiii

CAPÍTULO 5

Tabela 5.1. Extratos químicos avaliados nos ensaios de olfatometria e o número de fêmeas de

Euschistus heros avaliadas em cada tratamento. ........................................................................ 85

Tabela 5.2. Extratos químicos avaliados nos ensaios de preferência de oviposição e o número de

casais de Euschistus heros utilizados em cada tratamento. ........................................................ 87

Tabela 5.3. Comparação das porcentagens de primeira escolha e de residência de fêmeas de

Euschistus heros em olfatômetro em “Y”, em resposta aos diferentes voláteis testados. .......... 90


Euschistus heros em substrato artificial tratado com diferentes soluções de açúcares

(concentração de 0,1 mg/mL). .................................................................................................... 97


Euschistus heros em substrato artificial tratado com diferentes soluções de isoflavonas

(concentração de 0,01 mg/mL). ................................................................................................ 100

CAPÍTULO 6

Tabela 6.1. Concentração média (μg/24 h) (± EP) de compostos voláteis extraídos por aeração

forçada de vagens das cultivares de soja BRS 213, BRS 267, BR 16 e IAC-100, em estágio R6.

....................................................................................................................................................119

Tabela 6.2. Porcentagem média (mg/100 g) (± EP) de açúcares redutores totais presentes em vagens

verdes desengorduradas, sementes verdes integrais e desengorduradas de soja, de quatro

cultivares. .................................................................................................................................. 121

Tabela 6.3. Concentração média (mg/100 g) (± EP) de isoflavonas presentes em vagens de soja das

cultivares BRS 213, BR 16 e IAC-100, em estágio R6. ........................................................... 125

xiv

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 2

Figura 2.1. Oviposição em laboratório entre algodão hidrófilo, papel filtro, gerbox e alimento para

sete espécies de percevejos fitófagos. Médias seguidas pela mesma letra dentro dos tratamentos,

não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05). Dados em porcentagem

foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação. ............................... 19

Figura 2.2. Fêmeas de Piezodorus guildinii em posição de pré-oviposição sobre fio de lã sintética de

tricô (A); posturas depositadas e detalhe (setas) para as fibras desfiadas do fio de lã (B). ........ 25

Figura 2.3. Número médio (± EP) de posturas de Piezodorus guildinii em substratos artificiais em

laboratório, distribuídas em diferentes classes de tamanho (ovos/postura). A) Comparação entre

fio de lã, barbante e voil e B) comparação entre fio de lã e algodão. Médias seguidas pela

mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P <

0,05) (A). Médias comparadas usando o teste t de Student (P < 0,05) (B). ............................... 26

Figura 2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) da genitália feminina de Euschistus heros.

A) Vista ventral das placas da genitália revelando grande quantidade de sensilas (160X); B)

Detalhe mostrando sensilas do tipo tricóidea, com base em soquete (setas) (600X). ................ 28

Figura 2.5. Microscopia eletrônica de varredura de ovos de Euschistus heros depositados em

algodão e observação de ninfas recém-eclodidas. A) Posturas depositadas justapostas sobre as

fibras de algodão e com muitas fibras de algodão ao redor e sobre os ovos (40X); B) Detalhe de

fibra de algodão sobre ovo (150X); C) Fibras de algodão fixadas na base do ovo (seta) (150X);

D) Ninfas recém eclodidas sobre os ovos (microscópio estereoscópico 10X). .......................... 29

xv

CAPÍTULO 3

Figura 3.1. Porcentagem média (± EP) de posturas e porcentagem de eclosão de ninfas de

Euschistus heros originadas de ovos depositados sobre algodão e planta de soja. Médias

seguidas pela mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste

de Tukey (P < 0,05). Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para

análise de comparação. ............................................................................................................... 41

Figura 3.2. A) Posturas de Euschistus heros depositadas sobre algodão hidrófilo e coletadas durante

manutenção das colônias em laboratório. B) Posturas retiradas do algodão (com auxílio de

pinça) e colocadas em caixa gerbox forrada com papel filtro umedecido. ................................. 43

CAPÍTULO 4

Figura 4.1. Perfil químico das amostras de extrato de vagens verdes de soja `BRS 267´

derivatizadas com MSFTA, obtido por análise em cromatografia gasosa: A) extrato bruto; B)

fração de metanol (100%) e C) fração de hexano (100%). ........................................................ 57

Figura 4.2. Fórmula estrutural de três isômeros de inositol identificados em amostras de extrato de

vagens de soja derivatizadas com MSFTA: A) mio-inositol; B) muco-inositol e C) scillo-

inositol. ....................................................................................................................................... 63

Figura 4.3. Concentração média (± EP) de açúcares identificados em extrato de vagens de soja

(cultivar BRS 267) derivatizado com MSFTA. .......................................................................... 63

Figura 4.4. Porcentagem média (± EP) de açúcares redutores presentes em diferentes amostras de

soja R6 (cultivar BRS 267). Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente

diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05). .................................................................................. 64

xvi

Figura 4.5. Concentração de isoflavonas presentes em extrato bruto de vagens de soja (cultivar BRS

267). G-DAÍ= daidzina; G-GLY= glicitina; G-GEN= genistina; M-DAÍ= malonil-daidzina; M-

GLY= malonil-glicitina, A-DAÍ= acetil-daidzina; M-GEN= malonil genistina; A-GEN= acetil-

genistina, DAÍ= daidzeína; GLY= gliciteína e GEN= genisteína, (dados de 1 amostra, sem erro

padrão). ....................................................................................................................................... 66

CAPÍTULO 5

Figura 5.1. Imagens capturadas por câmera de vídeo durante estudo com Euschistus heros em

olfatômetro tipo “Y”. A) Linhas demarcando as áreas contendo os tratamentos e B) Trilha do

inseto formada pelo programa Sacan durante o monitoramento (10 minutos). ......................... 84

Figura 5.2. Porcentagem média (± EP) de posturas e ovos depositados por Euschistus heros em

substrato artificial tratado com extrato bruto de soja ou metanol puro (controle). Médias

seguidas pela mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste

t de Student (P < 0,05). ............................................................................................................... 93


substrato artificial tratado com frações metanólica ou hexânica do extrato bruto de soja ou com

hexano e metanol (controles). Médias seguidas pela mesma letra entre os tratamentos, não são

significativamente diferentes pelo teste t de Student (P < 0,05). ............................................... 94

Figura 5.4. Número total de ovos depositados por Euschistus heros 24 e 48 horas após o contato

com diferentes compostos voláteis, hexano e água, em olfatômetro. ....................................... 103

xvii

CAPÍTULO 6

Figura 6.1. Concentração média (± EP) de voláteis liberados por vagens de cultivares de soja.

Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P

< 0,05). ...................................................................................................................................... 118

Figura 6.2. Concentração média (± EP) de isoflavonas presentes em vagens de soja de diferentes

cultivares. Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste de

Tukey (P < 0,05). * Nd = não detectado. .................................................................................. 122

Figura 6.3. Tempo médio (± EP) de alimentação de fêmeas de Euschistus heros em vagens de

diferentes cultivares de soja, em testes com e sem chance de escolha. Médias seguidas pela

mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P <

0,05). ......................................................................................................................................... 127

Figura 6.4. Porcentagem média (± EP) de posturas de Euschistus heros depositadas em vagens de

diferentes cultivares de soja. Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente

diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05). ................................................................................ 130

CAPÍTULO 1

Introdução geral

1.1. Introdução

Os percevejos pentatomídeos (Heteroptera: Pentatomidae) caracterizam-se por serem pragas

importantes de diversas culturas, entre as quais a soja, Glycine max (L.) Merrill (Fabaceae). Várias

espécies têm sido reportadas atacando essa leguminosa, os mais importantes sendo o percevejo

verde, Nezara viridula (L.), o percevejo-verde-pequeno, Piezodorus guildinii (Westwood) e o

percevejo marrom, Euschistus heros (F.) (Panizzi & Slansky 1985).

Atualmente, a principal forma de controle desses percevejos é através do uso de inseticidas

químicos tradicionais, como monocrotophos e endosulfan (Panizzi et al. 2000a). Entretanto, tem se

observado que esses inseticidas não apresentam a mesma eficiência, devido ao aparecimento de

populações de percevejos resistentes (Sosa-Gomez et al. 2001). Dessa forma, medidas alternativas

de controle têm sido investigadas e utilizadas com sucesso, entre as quais, o controle biológico

através do uso de parasitóides de ovos, tendo como principal agente de controle o

microhimenóptero Trissolcus basalis (Woll.) (Hymenoptera: Scelionidae), capaz de parasitar ovos

de diferentes espécies de percevejos da soja (Corrêa-Ferreira 2002). Portanto, para atender aos

programas de controle biológico é fundamental a manutenção de colônias de percevejos como fonte

contínua de fornecimento de ovos para a multiplicação dos parasitóides em laboratório. Além disso,

essas colônias viabilizam o desenvolvimento de pesquisas em entomologia básica e aplicada de

2

forma contínua, disponibilizando insetos sadios para bioensaios sem depender da ocorrência natural

dos percevejos no campo.

Atualmente, a criação massal de percevejos em laboratório é realizada principalmente com

dieta natural [vagem verde de feijão, Phaseolus vulgaris L. (Fabaceae), sementes de amendoim,

Arachis hypogaea, L. (Fabaceae) e soja] e plantas de soja como substrato para oviposição, porém tal

metodologia demanda mão de obra, tempo em excesso e tem custo elevado. Portanto, tem-se

buscado utilizar substratos artificiais de oviposição para facilitar o processo de manutenção das

colônias de percevejos.

Em criações em laboratório, tem sido observado que os percevejos ovipositam

freqüentemente nas paredes teladas das gaiolas, em especial, quando a planta não apresenta boas

condições (p.ex., planta senescente). Da mesma forma, ao se criar o percevejo N. viridula em

laboratório, pedaços de papel toalha suspensos no interior da gaiola servem como substrato de

oviposição (Shearer & Jones 1996). Esta mesma espécie pode ovipositar em substratos artificiais

que mimetizam folhas de soja, comportando-se exatamente como se estivessem ovipositando em

plantas na natureza, isto é, no lado inferior dos folíolos (Panizzi et al. 2000b). Observou-se também

que tiras de voil podem ser utilizadas como substrato para acomodar as posturas de diferentes

espécies de pentatomídeos (Bundy & McPherson 2000).

Silva & Panizzi (2007) demonstraram que algodão comercial seco pode ser usado como

substrato de oviposição para várias espécies de pentatomídeos e, recentemente, observou-se que o

percevejo-verde-pequeno, P. guildinii oviposita em fio de lã sintética colocado no interior de

gaiolas de criação (Silva & Panizzi 2008).

Em estudo sobre seleção de planta hospedeira, observou-se que o percevejo

Neomegalotomus parvus (Westwood) (Heteroptera: Alydidae) oviposita em folhas de soja junto à

3

nervura central, o que facilitaria a fixação dos ovos (Panizzi et al. 1996). Em outra planta

hospedeira, o guandu (Cajanus cajan L.) (Fabaceae) os percevejos ovipositam em fendas presentes

nas vagens. Esses locais específicos de oviposição, possivelmente são selecionados por sensilas

mecanorreceptoras presentes no abdome (Ventura 2000), indicando que para N. parvus, as

características físicas do substrato são determinantes na seleção do local de oviposição.

Na natureza, os pentatomídeos depositam seus ovos em massas que variam em tamanho e

forma. Em muitos casos, como N. viridula, os ovos são depositados em massas com formato

hexagonal, e o número de ovos varia, sendo em média 80 ovos/postura (Kiritani & Hokyo 1965,

Javahery 1994). Em geral, os ovos são depositados na face inferior das folhas (face abaxial) das

suas plantas hospedeiras, como no caso da soja.

Em laboratório, estudo associando substratos artificiais e extratos químicos mostrou que

fêmeas de N. viridula ovipositam preferencialmente em tecido tratado com extrato metanólico de

vagens de soja do que em tecido tratado com água (Panizzi et al. 2004), reforçando pesquisas que

demonstram que em insetos herbívoros a seleção do hospedeiro para alimentação, cópula e

oviposição é mediada basicamente por substâncias químicas da planta (Bernays & Chapman 1994).

Nos últimos anos, uma grande variedade de compostos químicos de plantas foi identificada,

e sua atividade sobre os comportamentos alimentar e reprodutivo, comprovada para herbívoros de

diferentes ordens, como Lepidoptera (Du et al. 1995, Ibrahim et al. 2005) e Diptera (Morris et al.

2000, Gouinguené & Städler 2005), incluindo espécies de importância econômica. Estes estudos

permitiram uma melhor compreensão das relações ecológicas entre plantas hospedeiras, insetos-

praga e seus inimigos naturais, auxiliando no desenvolvimento de novos métodos de controle e no

aprimoramento de métodos já existentes.

4

Entretanto, em estudos sobre as preferências de oviposição em heterópteros pouca atenção

tem sido dedicada em examinar o papel de compostos químicos no processo. Apesar de existirem

muitos estudos publicados com percevejos, há pouca informação sobre o papel das substâncias

químicas originárias de plantas na preferência de oviposição de Heteroptera (Dwumfour 1992,

Constant et al. 1996). Por outro lado, existem inúmeras referências a outros grupos de insetos como

Lepidoptera e Diptera, entre outras ordens mencionadas (Honda 1995, Hilker & Meiners 2002,

Städler 2002).

Por isso, conhecer os mecanismos envolvidos no comportamento de oviposição de

heterópteros fornecerá informações sobre a interação desses insetos com suas plantas hospedeiras,

auxiliando no desenvolvimento de táticas de controle mais eficientes. Além disso, essas

informações poderão auxiliar no aprimoramento de técnicas de criação desses percevejos em

laboratório.

Portanto, o presente estudo buscou elucidar os mecanismos envolvidos no comportamento

de oviposição de diferentes espécies de pentatomídeos fitófagos, considerando as seguintes

hipóteses:

1) A textura e a forma do substrato de oviposição influenciam no comportamento de

oviposição dos pentatomídeos fitófagos;

2) A oviposição dos pentatomídeos é influenciada pelos compostos químicos extraídos de

vagens de soja;

3) É possível utilizar substratos artificiais de oviposição para manter colônias de

pentatomídeos fitófagos em laboratório.

5

1.2. Objetivos

O estudo teve os seguintes objetivos específicos:

Selecionar substratos artificiais para receber as posturas de diferentes espécies de

pentatomídeos fitófagos.

Verificar a influência das características físicas (textura e forma) dos substratos

artificiais sobre o comportamento de oviposição dos percevejos.

Avaliar a porcentagem de eclosão de ninfas de E. heros provenientes de posturas

depositadas em substratos artificiais e plantas de soja.

Comparar a preferência de oviposição de Euschistus heros em substratos artificiais e

plantas de soja.

Avaliar a ação de extratos químicos de vagens de soja que possam ser utilizados para

condicionar a oviposição de pentatomídeos em substratos artificiais.

Extrair, identificar e quantificar compostos voláteis presentes em vagens de soja de

diferentes cultivares.

6

Extrair, identificar e quantificar isoflavonas e açúcares presentes em vagens de soja de


Avaliar a resposta olfativa de E. heros aos principais compostos voláteis identificados

em diferentes cultivares de soja.

Avaliar a oviposição de E. heros em substratos tratados com isoflavonas e açúcares

presentes em vagens de soja de diferentes cultivares.

Comparar a preferência alimentar e de oviposição de E. heros em vagens de soja de


Analisar e comparar o perfil químico de diferentes cultivares de soja visando selecionar

genótipos que apresentem características químicas que condicionem a oviposição de

percevejos pentatomídeos fitófagos.

7

1.3. Literatura Citada

Bernays, E.A. & R.F. Chapman. 1994. Host-plant selection by phytophagous insects. Chapman &

Hall, London, UK, 312 p.

Bundy, C.S. & R.M. McPherson. 2000. Morphological examination of stink bug (Heteroptera:

Pentatomidae) eggs on cotton and soybeans, with a key to genera. Ann. Entomol. Soc. Am. 93:

616-624.

Constant, B., S. Grenier & G. Bonnot. 1996. Artificial substrate for egg laying and embryonic

development by the predatory bug Macrolophus caliginosus (Heteroptera: Miridae). Biol.

Control. 7: 140-147.

Corrêa-Ferreira, B.S. 2002. Trissolcus basalis para o controle de percevejos da soja. In Parra,

J.R.P.; P.S.M. Botelho; B.S. Corrêa-Ferreira & J.M.S. Bento. (eds.). Controle biológico no

Brasil: parasitóides e predadores. Manole, São Paulo, Brasil, 609 p.

Du, Y., J.A.A. Renwick & J.J.A. Van Loon. 1995. Sensory responses of tarsal chemoreceptors of

Pieris napi napi and Pieris napi oleracea to oviposition-stimulating glucosinolates. Physiol.

Entomol. 20: 164-174.

Dwunfour, E.F. 1992. Volatile substances evoking orientation in the predatory flowerbug

Anthocoris nemorum (Heteroptera: Anthocoridae). Bull. Entomol. Res. 1: 157-161.

8

Gouinguené, S.P.D. & E. Städler. 2005. Comparison of the sensitivity of four Delia species to

host and non-host plants compounds. Physiol. Entomol. 30: 62-74.

Hilker, M. & T. Meiners. 2002. Chemoecology of insect eggs and egg deposition. Blackwell

Publishers, Berlin, Germany, 390 p.

Honda, K. 1995. Chemical basis of differential oviposition by lepidopterous insects. Arch. Insect

Biochem. Physiol. 30: 1-23.

Ibrahim, M.A., A. Nissinen & J.K. Holopainen. 2005. Response of Plutella xylostella and its

parasitoid Cotesia plutellae to volatile compounds. J. Chem. Ecol. 31: 1969-1984.

Javahery, M. 1994. Development of eggs in some true bugs (Hemiptera: Heteroptera). Part I.

Pentatomoidea. Can. Entomol. 126: 401-433.

Kiritani, K. & N. Hokyo. 1965. Variation of egg mass size in relation to the oviposition pattern in

Pentatomidae. Kontyû 33: 427-433.

Morris, B.D., S.P. Foster & M.O. Harris. 2000. Identification of 1-octacosanal and 6-methoxy-2-

benzoxazolinone from wheat as ovipositional stimulants for Hessian fly, Mayetiola destructor.

J. Chem. Ecol. 26: 859-873.

9

Panizzi, A.R. & F. Slansky, Jr.. 1985. Review of phytophagous pentatomids (Hemiptera:

Pentatomidae) associated with soybean in the Americas. Fla. Entomol. 68: 184-214.

Panizzi, A.R., E. Hirose & E.D.M. Oliveira. 1996. Egg allocation by Megalotomus parvus

(Heteroptera: Alydidae) on soybean. An. Soc. Entomol. Brasil 25: 537-543.

Panizzi, A.R., J.E. McPherson, D.G. James, M. Javahery & R.M. McPherson. 2000a. Stink

bugs (Pentatomidae). In Schaefer, C.W. & A.R. Panizzi. (eds.). Heteroptera of economic

importance. CRC Press, Boca Raton, Flórida, USA. 474 p.

Panizzi, A.R., J.R.P. Parra, C.H. Santos & D.R. Carvalho. 2000b. Rearing the southern green

stink bug using an artificial dry diet and an artificial plant. Pesq. Agropec. Bras. 35: 1709-1715.

Panizzi, A.R., M. Berhow & R.J. Bartelt. 2004. Artificial substrate bioassay for testing

oviposition of southern green stink bug conditioned by soybean plant chemical extracts.

Environ. Entomol. 33: 1217-1222.

Shearer, P.W. & V.P. Jones. 1996. Suitability of macadamia nut as a host plant of Nezara viridula

(Hemiptera: Pentatomidae). J. Econ. Entomol. 89: 996-1003.

Silva, F.A.C. & A.R. Panizzi. 2007. Cotton balls as an oviposition substrate for laboratory rearing

of phytophagous stink bugs (Heteroptera: Pentatomidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 100: 745–

748.

10

Silva, F.A.C. & A.R. Panizzi. 2008. The adequacy of artificial oviposition substrates for laboratory

rearing of Piezodorus guildinii (Westwood) (Heteroptera, Pentatomidae). Rev. Brasil. Entomol.

52: 131-134.

Sosa-Gomez, D.R., I.C. Corso & L. Morales. 2001. Insecticide resistance to endosulfan,

monocrotophos and metamidophos in the Neotropical brown stink bug, Euschistus heros (F.).

Neotrop. Entomol. 30: 317-320.

Städler, E. 2002. Plant chemicals cues important for egg deposition by herbivorous insects. In

Hilker, M. & T. Meiners (eds.). Chemoecology of insect eggs and egg deposition. Blackwell


Ventura, M.U. 2000. Seleção hospedeira em Neomegalotomus parvus West. (Hemiptera:

Alydidae). Tese de Doutorado. Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 106 p.

11

CAPÍTULO 2

Avaliação de substratos artificiais de oviposição para pentatomídeos fitófagos

2.1. Introdução

Várias espécies de insetos têm sido reportadas atacando a soja, Glycine max (L.) Merrill

(Fabaceae), as mais importantes são o percevejo verde, Nezara viridula (L.), o percevejo-verde-

pequeno, Piezodorus guildinii (Westwood) e o percevejo marrom, Euschistus heros (F.)

(Heteroptera: Pentatomidae). A maioria desses insetos causa danos à soja com a introdução do

aparelho bucal nas vagens e, ao atingirem as sementes, danificam diretamente os tecidos, tornando-

as chochas e enrugadas, afetando, conseqüentemente, a produção e a qualidade dos grãos (Panizzi

& Slansky 1985).

Vários estudos têm sido realizados buscando conhecer aspectos ecológicos,

comportamentais e evolutivos dessas espécies de pentatomídeos, visando principalmente,

estabelecer táticas eficazes de controle. Dentro deste âmbito, a criação de percevejos fitófagos em

laboratório é hoje uma atividade de extrema importância, disponibilizando insetos para uso em

testes de biologia, testes de linhagens resistentes, testes de eficiência de inseticidas, uso em

programas de controle biológico com parasitóides e identificação de feromônios, entre outros.

Atualmente, a criação de pentatomídeos em laboratório depende do uso contínuo de plantas

de soja, oferecidas como substratos para oviposição, porém essa metodologia demanda mão-de-obra

e tempo excessivos e tem custo elevado; fazendo-se necessário o seu aprimoramento, através do uso

de materiais mais baratos e da utilzação de espaços físicos menores, sem afetar a qualidade dos

12

insetos. Um dos principais problemas encontrados ao criar pentatomídeos fitófagos em laboratório é

fornecer substratos artificiais de oviposição adequados. Muitos materiais como papel toalha, voil e

telas de nylon têm sido relatados como possíveis substratos artificiais de oviposição para

pentatomídeos fitófagos (Shearer & Jones 1996, Bundy & McPherson 2000, Panizzi et al. 2004,

Silva et al. 2008). Estruturas de plástico que imitam plantas de soja, também foram utilizadas como

substrato de oviposição para N. viridula (Panizzi et al. 2000), sendo que nesse substrato artificial as

fêmeas apresentaram comportamento semelhante ao observado em plantas de soja, ovipositando no

lado inferior (abaxial) dos folíolos.

Em estudos em laboratório, Bianco (1998) utilizou algodão hidrófilo para agrupar as

posturas do percevejo barriga verde Dichelops furcatus (Dallas) e, recomendou o uso deste

substrato artificial embora, não tenha comparado o algodão com outros substratos para oviposição.

Ao criar o percevejo marrom, E. heros em laboratório, observou-se também que as fêmeas

preferiam ovipositar no algodão utilizado para fornecer água (F.A.C. Silva, observação pessoal). A

partir desta observação casual e do estudo de Bianco (1998) decidiu-se testar o algodão hidrófilo

como substrato de oviposição para diferentes espécies de pentatomídeos fitófagos.

Em testes com o percevejo marrom comparou-se o algodão hidrófilo com pedaços de tule e

de voil, pois esses tecidos geralmente, são utilizados para recobrir gaiolas de criação em laboratório

e, ocasionalmente, são encontradas posturas de E. heros sobre esses materiais (Villas Bôas &

Panizzi 1980).

Para P. guildinii foram testados substratos artificiais de forma longilínea (fio de lã e

barbante de algodão), pois na natureza estes pentatomídeos ovipositam preferencialmente em

superfícies alongadas, como vagens de soja (Panizzi & Smith 1977) ou em vagens das plantas

hospedeiras alternativas pertencentes ao gênero Indigofera (Fabaceae) (Panizzi 1992). Além disso,

13

estudos com Piezodorus hybneri Gmelin demonstraram que as fêmeas ovipositam

preferencialmente em fios de juta (Higuchi 1994a), indicando que para este gênero de percevejo

possivelmente, a forma alongada do substrato é importante.

Portanto, visando aprimorar a técnica de criação de pentatomídeos fitófagos em laboratório,

foram avaliados substratos artificiais de oviposição para diferentes espécies de percevejos,

verificando principalmente, a influência das características físicas (textura e forma) dos substratos

sobre o comportamento de oviposição.

2.2. Material e métodos

Adultos dos pentatomídeos E. heros, N. viridula, P. guildinii, Chinavia impicticornis (Stål),

Dichelops melacanthus (Dallas), Edessa meditabunda (F.) e Thyanta perditor (F.) foram coletados

em campos de soja e milho [Zea mays (L.) (Poaceae)] e em plantas não cultivadas [picão-preto,

Bidens pilosa L. (Asteraceae) e rubim, Leonurus sibiricus L. (Lamiaceae)] na fazenda da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária, em Londrina, PR (latitude 23° 18´S), de dezembro de 2005 a

janeiro de 2006.

Os insetos (30 casais) foram colocados em caixas de plástico (20 x 20 x 25 cm), forradas

com papel filtro e alimentados com vagem verde de feijão, Phaseolus vulgaris L., sementes de soja

e amendoim, Arachis hypogaea L. (Fabaceae) e frutos maduros de ligustro, Ligustrum lucidum Ait.

(Oleaceae). Tanto na criação estoque como nos experimentos a seguir, os insetos foram mantidos

em ambiente climatizado a 25 ± 1 °C, 65 ± 5% UR e fotoperíodo 14h L: 10h E.

14

2.2.1. Avaliação de algodão hidrófilo como substrato artificial de oviposição para diferentes

espécies de pentatomídeos fitófagos

Dez casais de cada espécie dos pentatomídeos em estudo foram selecionados da criação

estoque e colocados individualmente em caixa gerbox (11,0 x 11,0 x 3,5 cm), forrada com papel

filtro, contendo alimento (mesmo utilizado para criação em laboratório) e um pedaço (2,0 cm de

diâmetro) de algodão hidrófilo seco (Cremer S.A., Blumenau, SC), distribuídos aleatoriamente nas

caixas. Diariamente, as caixas foram observadas, os alimentos e o pedaço de algodão foram

trocados e o número de posturas e ovos depositados no algodão, no papel filtro, no alimento e nas

laterais e/ou tampa da gerbox foi avaliado. Cada casal de inseto foi considerado uma unidade

experimental em delineamento estatístico inteiramente casualizado.

2.2.2. Comparação de algodão hidrófilo, tule e voil como substrato de oviposição para

Euschistus heros

Quinze casais de E. heros foram selecionados da criação de laboratório e colocados

individualmente, em caixa gerbox (11,0 x 11,0 x 3,5 cm) forrada com papel filtro. Em cada caixa

foi colocado um pedaço (2,0 cm de diâmetro) de algodão hidrófilo seco (Cremer S.A., Blumenau,

SC), um pedaço (3,0 cm de comp. x 3,0 cm de larg.) de tule branco (malha de 1,0 mm) (Bankike -

Com. e Ind. de Rendas Ltda, Nova Friburgo, RJ) e um pedaço (3,0 cm de comp. x 3,0 cm de larg.)

de voil extra-fino (Têxtil São João Ltda., São João da Boa Vista, RS). Os insetos foram alimentados

com vagem verde de feijão e sementes de amendoim e soja.

15

As caixas foram observadas diariamente durante seis dias. Os alimentos foram trocados a

cada dois dias. Diariamente, os substratos de oviposição foram trocados e o número de posturas e

ovos depositados nos diferentes substratos foi avaliado. Cada casal de inseto foi considerado uma

unidade experimental em delineamento estatístico inteiramente casualizado.

2.2.3. Comparação de algodão hidrófilo, barbante de algodão, fio de lã sintética e voil como

substrato de oviposição para Piezodorus guildinii

Dez casais de P. guildinii provenientes de criação em laboratório foram colocados em

gaiolas teladas (50 x 50 x 70 cm) forradas com papel filtro. Na tampa de cada gaiola foram

pendurados: um fio (30 cm de comp. x 0,2 cm de diâmetro) de barbante de algodão (Têxtil São João

Ltda., São João da Boa Vista, RS), um fio (30 cm de comp. x 0,3 cm de diâmetro) de lã sintética

branca de tricô (Família, São Paulo, SP) e uma fita (30 cm de comp. x 2,0 cm de larg.) de voil

(Têxtil São João Ltda., São João da Boa Vista, RS), fixados com auxílio de fita adesiva transparente

e distanciados 15 cm entre si.

Em experimento semelhante, dez casais de P. guildinii foram colocados em gaiolas contendo

uma linha de tricô (30 cm de comp. x 0,3 cm de diâmetro) e um pedaço (2,0 cm de diâmetro) de

algodão hidrófilo seco (Cremer S.A., Blumenau, SC). Os insetos foram alimentados com vagem

verde de feijão, sementes de amendoim e soja e frutos maduros de ligustro.

Para cada experimento foram utilizadas quatro gaiolas observadas diariamente, durante seis

dias. Os alimentos foram trocados a cada dois dias. Diariamente, os substratos de oviposição foram

trocados e o número de posturas e ovos depositados nos diferentes substratos foi avaliado. Cada

16

gaiola foi considerada uma unidade experimental em delineamento estatístico inteiramente

casualizado.

2.2.4. Microscopia eletrônica de varredura das placas genitais femininas e de ovos de

Euschistus heros depositados em algodão hidrófilo

As análises de microscopia eletrônica de varredura foram realizadas no Laboratório de

Microanálise e Microscopia Eletrônica da Universidade Estadual de Londrina, PR.

Fêmeas de E. heros com 10 dias de idade foram mortas por congelamento e tiveram a região

genital dissecada com auxílio de lâmina de bisturi. O material foi fixado durante 3 horas em

glutaraldeído 2,5%, solução tampão fosfato 0,1M e água; em seguida foram dados três banhos de 15

minutos em tampão fosfato 0,1M. Uma fixação secundária foi realizada durante 1 hora em solução

de ósmio 1% e solução tampão fosfato 0,1M. O material recebeu três banhos de 15 minutos em

tampão fosfato 0,1M e foi desidratado em álcool 70% “overnight” e em três banhos de 10 minutos

em álcool 80%, 90% e 100%. Para desidratação total, o material foi colocado em ponto crítico

durante 30 minutos com álcool absoluto. O material foi colado com fita adesiva de carbono em

suportes para microscopia eletrônica (“stubs”) e metalizado com ouro. O mesmo procedimento foi

realizado para a análise dos ovos de E. heros depositados sobre o algodão hidrófilo.

Os materiais foram observados em microscópio eletrônico de varredura (MEV) modelo Fei

Quanta 200 (Fei Company, Hillsboro, Oregon, EUA).

17

2.2.5. Análise dos dados

O número médio de posturas, de ovos e ovos/postura foi calculado e submetido à análise de

variância (ANOVA). As porcentagens de posturas e ovos foram transformadas em arcoseno (x +

1) para comparação pelo teste de Tukey, utilizando-se o programa estatístico SAS 8.2. (SAS

Institute 1981, Zar 1984).

2.3. Resultados e discussão

2.3.1. Avaliação de algodão hidrófilo como substrato artificial de oviposição para diferentes

espécies de pentatomídeos fitófagos

Das sete espécies de percevejos estudadas, cinco espécies (C. impicticornis, D. melacanthus,

E. heros, P. guildinii e T. perditor) mostraram preferência significativa em ovipositar no algodão

hidrófilo (Fig. 2.1), porém também ovipositaram no papel filtro, mas não no alimento, sendo que

apenas C. impicticornis o fez na caixa gerbox. Aparentemente, o tamanho e a forma das posturas

podem ter influenciado nesses resultados, pois em geral, a maioria dessas espécies de

pentatomídeos apresenta posturas de no máximo 25 ovos, agrupados em poucas linhas. Um

exemplo são as posturas de E. heros que possuem de 3 a 14 ovos dispostos em duas ou três linhas

paralelas (Villas Bôas & Panizzi 1980); D. melacanthus apresenta posturas com 5 a 14 ovos em três

linhas (A.R.P. comunicação pessoal); C. impicticornis de 12 a 14 ovos em três ou quatro linhas

18

(Grazia et al. 1982); T. perditor de 11 a 25 ovos em duas linhas (Panizzi & Herzog 1984) e P.

guildinii de 11 a 15 ovos em duas linhas (Panizzi & Smith 1977).

Apenas E. meditabunda e N. viridula não ovipositaram no algodão. E. meditabunda

ovipositou preferencialmente na lateral da caixa gerbox (75%), seguida pelo alimento (vagem de

feijão - 25%), não ovipositando no algodão e no papel (Fig. 2.1). Sanchez et al. (1999) também

observaram oviposição de E. meditabunda sobre vagem verde de feijão (45%) e na lateral de caixas

de criação (25%).

O fato de E. meditabunda não ter ovipositado no algodão, embora apresente posturas

pequenas (12 a 14 ovos dispostos em duas linhas; Rizzo 1976), pode estar relacionado ao tamanho

dos ovos, que são maiores do que os das outras espécies testadas e, isso pode ter prejudicado a

fixação dos ovos devido à disposição irregular das fibras do algodão. Uma característica

interessante desta espécie refere-se ao comportamento apresentado pelas ninfas recém-eclodidas,

que permanecem imóveis e com a cabeça encostada no córion até atingirem o 2º instar (Rizzo

1971). Embora não haja estudos conclusivos sobre a importância biológica, fisiológica e/ou

evolutiva desse comportamento, é possível que o tipo de substrato de oviposição interfira nesse

comportamento.

N. viridula não ovipositou no algodão, possivelmente devido ao tamanho e forma de suas

posturas (usualmente >100 ovos depositados em cinco a sete linhas; Rizzo 1976), o que sugere a

necessidade de uma superfície mais plana para acomodar os ovos, como o caso de folíolos de soja,

um substrato natural (Todd 1989) ou ainda voil esticado, um substrato artificial (Panizzi et al.

2004).

19

Os resultados demonstram que o algodão hidrófilo pode ser usado como substrato para

receber as posturas de várias espécies de pentatomídeos fitófagos associados com a soja e

provavelmente, para outras espécies que depositam posturas com poucos ovos.

0

20

40

60

80

100

120

E. her

os

D. melac

anth

us

C. impic

ticor

nis

T. per

ditor

P. guil

dinii

E. med

itabu

nda

N. virid

ula

Nú

mer

o m

éd

io d

e p

os

tura

s (

%)

Algodão Papel Caixa Alimento

Figura 2.1. Oviposição em laboratório entre algodão hidrófilo, papel filtro, gerbox e alimento

para sete espécies de percevejos fitófagos. Médias seguidas pela mesma letra dentro dos

tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05). Dados em

porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.

a

b

a

a

a aa

a

b

b

b bb b

c

20

2.3.2. Comparação de algodão hidrófilo, tule e voil extra fino como substrato de oviposição

para Euschistus heros

O número médio de posturas e ovos depositados por E. heros foi significativamente maior

no algodão comparado com o tule e o voil extra fino (Tabela 2.1). Aproximadamente 80% das

posturas foram depositadas no algodão, comparado com 14% no tule e 1% no voil. A porcentagem

de ovos foi significativamente maior no algodão (87,3%), seguido pelo tule (11,9%), e pelo voil

(0,8%). Embora o número médio de ovos/postura tenha variado entre os diferentes substratos, não

foi observada diferença significativa entre eles (Tabela 2.1).

Esses resultados reforçam estudos anteriores que demonstram que o algodão hidrófilo é um

substrato de oviposição preferido por E. heros (Silva & Panizzi 2007). Além disso, esses resultados

confrontam que o voil, substrato de oviposição preferido por outras espécies de pentatomídeos

como N. viridula (Panizzi et al. 2004), poderia ser adequado para receber as posturas de E. heros.

21


Euschistus heros em substratos artificiais.

Número médio (± EP) 1

Substrato Posturas Posturas (%)2 Ovos Ovos (%)2

Média (± EP) de

ovos/postura

Algodão 10,9 ± 0,8 a 85,2 ± 3,4 a 73,3 ± 6,6 a 87,3 ± 3,1 a 6,9 ± 0,6 a

[163]3

Voil 0,13 ± 0,1 c 1,1 ± 1,1 c 0,4 ± 0,4 c 0,8 ± 0,8 c 3,0 ± 0,1 a

[2]

Tule 1,7 ± 0,3 b 13,7 ± 2,9 b 9,5 ± 2,5 b 11,9 ± 2,7 b 5,4 ± 0,5 a

[25]1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste de

Tukey (P<0,05).2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.

3 Número de posturas em cada substrato, entre colchetes.

Observou-se que as posturas depositadas sobre o tule apresentaram uma distribuição

irregular, com muitos ovos sobrepostos. Possivelmente, isso ocorreu devido ao tamanho da malha

do tecido, que por apresentar abertura maior, impediu o arranjo característico observado nas

posturas de E. heros [3 a 14 ovos dispostos em duas a três linhas paralelas (Villas Bôas & Panizzi

1980). Bundy & McPherson (2000) mencionam que posturas de diferentes espécies de

pentatomídeos também apresentaram padrão irregular de distribuição dos ovos quando os autores

usaram tiras de voil como substrato para oviposição. No presente estudo, por ter sido utilizado um

voil extra fino, observou-se arranjo normal das posturas, sugerindo que o tamanho da malha é um

fator importante para o arranjo correto dos ovos nas posturas de pentatomídeos.

22

2.3.3. Comparação de algodão hidrófilo, barbante de algodão, fio de lã sintética e voil como

substrato de oviposição para Piezodorus guildinii

O número total de posturas depositadas nas estruturas de forma longilínea (lã de tricô e no

barbante) foi maior do que no voil (Tabela 2.2). Considerando a porcentagem de ovos, observou-se

preferência pela lã de tricô (54,4%) em relação aos outros dois substratos (barbante 31,7% e voil

13,9%). O número médio de ovos/postura foi maior na lã de tricô do que no voil, com valores

intermediários para o barbante (Tabela 2.2).

Na natureza, P. guildinii deposita preferencialmente os ovos em estruturas alongadas, como

vagens de soja comparada com os folíolos (Panizzi & Smith 1977, Higuchi 1994b). Em laboratório

observou-se que a espécie asiática, P. hybneri oviposita em fios de juta pendurados no interior de

gaiolas de criação (Higuchi 1994a). Ambas as espécies apresentam posturas pequenas e arranjadas

em duas linhas paralelas.

Portanto, o padrão de postura (linhas paralelas) apresentado por P. guildinii pode ter

determinado a preferência pela lã de tricô, seguida pelo barbante. Outro fator importante pode estar

relacionado ao fato de a lã de tricô apresentar grande quantidade de fibras (Figs. 2.2 A e B) que

possivelmente, estimulem sensilas mecanoreceptoras presentes nas placas genitais das fêmeas. Esta

hipótese é reforçada com base em outros estudos de comportamento de oviposição de heterópteros,

que demonstram que a escolha do local de oviposição é dada por mecanoreceptores, que são

estimulados após a fêmea esfregar o ovipositor na superfície de oviposição (Ventura & Panizzi

2000). Outro estudo verificou que fêmeas de N. viridula tocam o substrato de oviposição com o

abdome antes de depositar os ovos, provavelmente para estimular mecanoreceptores (Panizzi 2006).

Para todas as categorias de tamanho de posturas (amplitude), o número médio (Fig. 2.3 A)

23

indicou que a maioria das posturas foi depositada no fio de lã de tricô, seguida pelo barbante e a tira

de voil. A diferença foi particularmente marcada pelas posturas localizadas na categoria de 11 a 20

ovos/postura. Esta classificação inclui o tamanho das posturas usualmente depositadas pelas fêmeas

de P. guildinii na natureza, em média 14 ovos (Panizzi & Smith 1977).


Piezodorus guildinii em substratos artificiais em laboratório.


Substrato Posturas Posturas

(%)2

Ovos Ovos

(%)2

Média (± EP)

de ovos/postura

Lã de tricô 3,8 ± 0,6 a 53,8 ± 0,3 a 71,4 ± 10,0 a 54,4 ± 0,3 a 17,9 ± 1,6 a

[38]3

Barbante 2,2 ± 0,4 ab 31,0 ± 0,3 b 41,6 ± 9,1 ab 31,7 ± 0,3 b 15,5 ± 2,3 ab

[22]

Voil 1,1 ± 0,3 b 15,2 ± 0,2 b 18,3 ± 5,0 b 13,9 ± 0,2 b 9,7 ± 2,1 b

[11]1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste de

Tukey (P < 0,05).2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.3 Número de posturas em cada substrato, entre colchetes.

No teste onde foram comparados a lã de tricô e o algodão hidrófilo, observou-se que foram

colocadas 10x mais posturas na lã de tricô do que no algodão (Tabela 2.3). Mais de 90% das

posturas e mais de 80% dos ovos foram depositados na lã. O número de ovos/postura foi

significativamente maior para as posturas depositadas na lã de tricô. Como observado no primeiro

24

teste, o número médio de posturas de todos os tamanhos foi significativamente maior na lã de tricô

do que no algodão, exceto para as posturas maiores (21-30 ovos) (Fig. 2.3 B). Esses resultados

indicam que fêmeas de P. guildinii preferem substratos longilíneos (fio de lã) do que substratos com

áreas maiores no sentido da largura (por ex., bolas de algodão).

Portanto, os testes demonstram a viabilidade do fio de lã sintética de tricô como um

substrato artificial de oviposição para P. guildinii. Embora outros fios sejam rotineiramente usados

para receber posturas de P. guildinii (A.R. Panizzi não-publicado) e P. hybneri (Higuchi 1994a),

fios que apresentam grande quantidade de fibras soltas apresentam melhores resultados e devem ser

preferencialmente utilizados em criações em laboratório.


Piezodorus guildinii em substratos artificiais em laboratório.

Número médio (±EP) 1

Substrato Posturas Posturas (%)2 Ovos Ovos (%)2

Média (±EP)

de

ovos/postura

Lã de tricô 5,5 ± 2,6 a 92,3 ± 1,9 a 33,2 ± 4,6 a 82,9 ± 0,5 a 18,0 ± 2,1 a

[55]3

Algodão 0,5 ± 0,2 b 7,7 ± 0,1 b 6,8 ± 2,4 b 17,1 ± 0,3 b 6,0 ± 1,9 b

[5]1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05).2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.3 Número de posturas em cada substrato, entre colchetes.

25

Figura 2.2. Fêmeas de Piezodorus guildinii em posição de pré-oviposição sobre fio de lã sintética

de tricô (A); posturas depositadas e detalhe (setas) para as fibras desfiadas do fio de lã (B).

A

B

26

0

2

4

6

8

10

12

1-10 11-20 21-30 >30

Classes de tamanho (ovos/postura)

Nú

me

ro m

édio

de

po

stu

ras

Fio de lã

Barbante

Voil

0

2

4

6

8

10

12

1-10 11-20 21-30

Classes de tamanho (ovos/postura)

Nú

me

ro m

édio

de

po

stu

ras

Fio de lã

Algodão

Figura 2.3. Número médio (± EP) de posturas de Piezodorus guildinii em substratos artificiais em

laboratório, distribuídas em diferentes classes de tamanho (ovos/postura). A) Comparação entre fio

de lã, barbante e voil e B) comparação entre fio de lã e algodão. Médias seguidas pela mesma letra

entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05) (A).

Médias comparadas usando o teste t de Student (P < 0,05) (B).

A

B

a

a

a

a

ab b b

b

ab

bab

b

a

a

b

ba

a

27

2.3.4. Microscopia eletrônica de varredura da genitália feminina e de ovos de Euschistus heros

depositados em algodão hidrófilo

Imagens da genitália feminina de E. heros obtidas através de microscopia eletrônica de

varredura (MEV) revelaram a presença de sensilas longas, em forma de cerdas, com soquetes

flexíveis com provável função mecanorreceptora (Fig. 2.4 A, B) (Altner & Prillinger 1980; Frazier

1985).

Em MEV foi revelado que muitas fibras de algodão ficam localizadas ao redor e sobre os

ovos (Figs. 2.5 A e B) e, bem fixadas na base dos ovos (Fig. 2.5 C). Em microscópio estereoscópico

(aumento 10X) observou-se que as ninfas recém-eclodidas puderam se movimentar facilmente até a

parte superior dos ovos (Fig. 2.5 D), demonstrando que as fibras não interferem negativamente, no

comportamento de agregação das ninfas de E. heros recém-eclodidas. Testes indicam que a

porcentagem de eclosão não é afetada pelas fibras de algodão que recobrem os ovos (ver Capítulo 3,

item 3.3.3).

28

Figura 2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) da genitália feminina de Euschistus heros.

A) Vista ventral das placas da genitália revelando grande quantidade de sensilas (160X); B) Detalhe

mostrando sensilas do tipo tricóidea, com base em soquete (setas) (600X).

A B

29

Figura 2.5. Microscopia eletrônica de varredura de ovos de Euschistus heros depositados em

algodão e observação de ninfas recém-eclodidas. A) Posturas depositadas justapostas sobre as fibras

de algodão e com muitas fibras de algodão ao redor e sobre os ovos (40X); B) Detalhe de fibra de

algodão sobre ovo (150X); C) Fibras de algodão fixadas na base do ovo (seta) (150X); D) Ninfas

recém eclodidas sobre os ovos (microscópio estereoscópico 10X).

A B

C

D

30

2.4. Literatura citada

Altner, H. & L. Prillinger. 1980. Ultrastructure of invertebrate chemo, thermo, and hygroreceptor

and its functional significance. Intern. Rev. Cytol. 67: 69-139.

Bianco, R. 1998. Técnica de criação do percevejo barriga verde, Dichelops furcatus. In XVII

Congresso Brasileiro de Entomologia, Rio de Janeiro, RJ, p. 202.


Pentatomidae) eggs on cotton and soybeans, with a key to the genera. Ann. Entomol. Soc. Am.

93: 616-624.

Frazier, J.L. 1985. Nervous system: sensory system. In Blum, M.S. (ed). Fundamentals of insect

physiology. John Wiley & Sons, New York, USA, 598 p.

Grazia, J., M.C. Del Vecchio & R. Hildebrand. 1982. Estudo das ninfas de pentatomídeos

(Heteroptera) que vivem sobre soja (Glycine max (L.) Merrill): IV- Acrosternum impicticorne

(Stal, 1872). An. Soc. Entomol. Brasil. 11: 261-268.

Higuchi, H. 1994a. Photoperiodic induction of diapause, hibernation and voltinism in Piezodorus

hybneri (Heteroptera: Pentatomidae). Appl. Entomol. Zool. 29: 585-592.

31

Higuchi, H. 1994b. Seasonal prevalence and mortality factors of eggs of Piezodorus hybneri

Gmelin (Heteroptera: Pentatomidae) in a soybean field. Japan. J. Appl. Entomol. Zool. 38: 17-

21.

Panizzi, A.R. & J.G. Smith. 1977. Biology of Piezodorus guildinii: Oviposition, development

time, adult sex ratio and longevity. Ann. Entomol. Soc. Am. 70: 35-39.

Panizzi, A.R. & F. Slansky, Jr.. 1985. Review of phytophagous pentatomids (Hemiptera:

Pentatomidae) associated with soybean in the Americas. Fla. Entomol. 68: 184-214.

Panizzi, A.R. 1992. Performance of Piezodorus guildinii on four species of Indigofera. Ent. Exp.

Appl. 63: 221-228.

Panizzi, A.R. 2004. Neotropical brown stink bug, Euschistus heros (F.) (Hemiptera: Heteroptera:

Pentatomidae). In Capinera, J.L. (ed.). Encyclopedia of Entomology, Kluwer Academic

Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1545 p.

Panizzi, A.R. 2006. Possible egg positioning and gluing behavior by ovipositing southern green

stink bug, Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae). Neotrop. Entomol. 35: 149-151.

Panizzi, A.R. & D.C. Herzog. 1984. Biology of Thyanta perditor (Hemiptera: Pentatomidae). Ann.

Entomol. Soc. Am. 77: 646- 650.

32





stink bug using an artificial dry diet and an artificial plant. Pesq. Agropec. Brasil. 35: 709-1715.

Rizzo, H.F. 1971. Aspectos morfológicos y biológicos de Edessa meditabunda (F.) (Hemiptera,

Pentatomidae). Rev. Per. Entomol. 14: 272-281.

Rizzo, H.F. 1976. Hemípteros de interés agrícola. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires,

Argentina. 69 p.

Sánchez, M.C., D. Díaz & M. Maselli. 1999. El comportamiento y tiempo de desarollo de la

chinche Edessa meditabunda (F.) (Hemiptera: Pentatomidae). Rev. Fac. Agron. Maracay. 25:

149-158.

SAS Institute. 1981. SAS for linear models. A guide to the ANOVA and GLM procedures. SAS

Institute, Cary, N.C.



33


of phytophagous stink bugs (Heteroptera: Pentatomidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 100: 745-

748.

Silva, C.C., R.A. Laumann, M.C. Blassioli, M. Pareja & M. Borges. 2008. Euschistus heros

mass rearing technique for the multiplication of Telenomus podisi. Pesq. Agropec. Bras. 43:

575-580.

Todd, J.W. 1989. Ecology and behavior of Nezara viridula. Annu. Rev. Entomol. 34: 273-292.

Ventura, M.U. & A.R. Panizzi. 2000. Oviposition behavior of Neomegalotomus parvus (West.)

(Hemiptera: Alydidae): Daily rhythm and site choice. An. Soc. Entomol. Brasil 29: 391-400.

Villas Bôas, G. L. & A.R. Panizzi. 1980. Biologia de Euschistus heros (Fabricius, 1789) em soja

(Glycine max L. Merrill). An. Soc. Entomol. Brasil 9: 105-113.

Zar, J.H. 1984. Biostatistical analysis, 2nd ed., Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J.

34

CAPÍTULO 3

Oviposição de Euschistus heros (F.) (Heteroptera: Pentatomidae) em substratos artificial e

natural

3.1. Introdução

Alguns estudos têm mostrado que o percevejo marrom, Euschistus heros (F.) (Heteroptera:

Pentatomidae) pode ser facilmente criado em condições de laboratório, obtendo-se altas taxas de

sobrevivência e fecundidade (Peres & Corrêa-Ferreira 2001, Silva et al. 2008). Entretanto, um dos

principais desafios ao criar em laboratório esta e outras espécies de pentatomídeos é oferecer

substratos de oviposição adequados para concentrar as posturas e reduzir o tempo de manuseio na

manutenção das colônias.

Os pentatomídeos são conhecidos por ovipositar em papel toalha pendurados no interior de

gaiolas (Shearer & Jones 1996), sobre voil (Bundy & McPherson 2000), em estruturas de plástico

que imitam folhas de soja (Panizzi et al. 2000b) ou em voil esticado tratado com extrato químico de

vagens de soja (Panizzi et al. 2004). Para espécies de pentatomídeos que depositam os ovos em

linhas duplas, como Piezodorus guildinii (Westwood), substratos com forma longilínea, como fios

de lã, têm se mostrado adequados (Silva & Panizzi 2008).

Demonstrou-se que algodão hidrófilo adquirido comercialmente é considerado um substrato

adequado para receber as posturas de diferentes espécies de pentatomídeos fitófagos, incluindo E.

heros (Silva & Panizzi 2007). Entretanto, os estudos anteriores com E. heros não compararam o

algodão com hospedeiros naturais. Portanto, este estudo foi conduzido para comparar a oviposição e

35

a taxa de eclosão das ninfas de E. heros nos substratos artificial (algodão hidrófilo comercial) e

natural (planta de soja).


De dezembro de 2007 a março de 2008, adultos de E. heros foram coletados em campos de

soja, na fazenda da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, em Londrina, PR (latitude 23º

18`S).

Trinta casais foram colocados em caixas de plástico (20 x 20 x 25 cm), forradas com papel

filtro e alimentados com vagem verde de feijão, Phaseolus vulgaris L., sementes de soja e

amendoim, Arachis hypogaea L. (Fabaceae) e frutos maduros de ligustro, Ligustrum lucidum Ait.

(Oleaceae). As caixas foram mantidas em sala climatizada (25 ± 1 °C, 65 ± 5% UR, fotoperíodo

14h L: 10h E). Os alimentos foram trocados a cada dois dias.

3.2.1. Oviposição em substratos artificial vs. natural utilizando partes de plantas de soja

Para o teste de dupla escolha, cinco casais de E. heros foram selecionados da colônia

estabelecida em laboratório e colocados individualmente, em caixas gerbox (11,0 x 11,0 x 3,5 cm)

forradas com papel filtro umedecido. Em cada caixa colocou-se um folíolo de soja da cultivar BRS

267 (com o pecíolo embebido em água em um Eppendorf de 2 mL), um pedaço de algodão

hidrófilo comercial (2,0 cm diâmetro) e o alimento (uma semente de amendoim). Em outro

36

tratamento usou-se uma vagem de soja da mesma cultivar em estágio R6, um pedaço de algodão e o

alimento (uma semente de amendoim).

As caixas foram observadas diariamente durante doze dias, as posturas foram removidas de

cada substrato e o número de posturas, ovos e ovos/postura foi avaliado. O número médio e a

porcentagem média de posturas e ovos/postura foram calculados para cada substrato.

Para o teste de múltipla escolha, oito casais de E. heros foram avaliados utilizando-se a

mesma metodologia descrita anteriormente, exceto que neste bioensaio os substratos (folíolo e

vagem de soja e algodão hidrófilo) foram oferecidos aos insetos simultaneamente. Os casais foram

mantidos em BOD (25 1 oC, 65 5% UR, fotofase 14h) e observados diariamente durante três

dias. O número médio e a porcentagem média de posturas, ovos e ovos/postura foram calculados.

3.2.2. Oviposição em substratos artificial vs. natural utilizando plantas inteiras de soja

Para complementar o estudo anterior, no qual foram testados folíolos e vagens de soja

destacados da planta, um teste adicional foi conduzido com plantas inteiras de soja, buscando-se

eliminar algum possível efeito negativo causado pela remoção dos folíolos e vagens da planta;

Moraes et al. (2005) observaram que danos mecânicos em soja induzem a emissão de voláteis

específicos que influenciam na interação inseto-planta.

Dez casais de E. heros foram colocados em gaiolas teladas (50 x 50 x 30 cm) contendo um

vaso com duas plantas de soja (cultivar BRS 267) na fase reprodutiva de desenvolvimento (R6).

Dois pedaços de algodão hidrófilo (2,0 cm diâmetro) foram amarrados com fio de nylon, em cada

planta, sendo um fixado na parte basal e outro na parte apical da planta. As gaiolas foram mantidas

37

em sala climatizada (25 1 oC, 65 5% UR, fotofase 14h) e observadas diariamente durante quatro

dias. O número médio e a porcentagem média de posturas, ovos e ovos/postura foram calculados.

3.2.3. Avaliação da viabilidade de ovos Euschistus heros depositados em diferentes substratos

Posturas de E. heros depositadas no algodão hidrófilo (n = 640 ovos), folíolos de soja (n =

321 ovos) e vagens de soja (n = 312 ovos), foram coletadas no dia da oviposição e colocadas

individualmente, em placas de Petri (9,0 x 1,5 cm) forradas com papel filtro umedecido, para evitar

a dessecação. As placas foram mantidas em condições controladas (25 1 oC, 70 5% UR,

fotofase 14 h) e o número de ninfas eclodidas foi avaliado diariamente. A porcentagem de eclosão

foi calculada para cada substrato testado.


O número médio de posturas, de ovos e ovos/postura foi calculado e submetido à análise de

variância (ANOVA). As porcentagens de posturas e ovos foram transformadas em arcoseno (x +

1) para comparação pelo teste de Tukey para comparações múltiplas e pelo teste t de Student para

comparar duas médias, utilizando-se o programa estatístico SAS 8.2. (SAS Institute 1981, Zar

1984).

38


3.3.1. Oviposição em substrato artificial vs. natural utilizando partes de plantas de soja

Fêmeas de E. heros apresentaram preferência em ovipositar no algodão hidrófilo quando

este substrato foi comparado com o substrato natural (vagens e folíolos de soja).

O número médio de posturas foi 40 vezes maior no substrato artificial do que no folíolo de

soja e, a porcentagem média de posturas foi significativamente maior no algodão (98,6%) do que no

folíolo (1,4%) (Tabela 3.1). Além disso, o número médio de ovos/postura foi numericamente maior

no algodão (4,2) do que no folíolo de soja (2,0), mas como ocorreu apenas uma postura no folíolo,

não foi possível realizar a comparação estatística dos dados.

Observou-se preferência de oviposição de E. heros pelo substrato artificial, semelhante ao

observado no tratamento anterior quando se comparou o algodão com vagem de soja. O número de

posturas e de ovos foi cinco vezes maior no algodão do que nas vagens. A porcentagem de posturas

foi de 80% no algodão contra 20% na vagem e apenas o número médio de ovos/postura não foi

significativamente diferente entre os dois substratos (Tabela 3.1).

No teste de múltipla escolha onde, algodão, folíolo e vagem de soja foram oferecidos

simultaneamente, observaram-se três vezes mais posturas depositadas no algodão do que no folíolo

e 30 vezes mais no algodão comparado com a vagem. O número médio de ovos foi

aproximadamente 5 e 26 vezes maior no algodão do que no folíolo e na vagem, respectivamente. A

porcentagem de posturas foi significativamente (P < 0,05) maior no algodão (74,3%), seguida pelo

folíolo (23,6%) e pela vagem de soja (2,1%). Além disso, o número médio de ovos/postura foi

39

significativamente maior no algodão do que no folíolo de soja sendo que, na vagem de soja apenas

uma postura foi depositada, impedindo a inclusão dos dados na análise estatística (Tabela 3.2).

De modo geral, o número de ovos/postura foi baixo em todos os substratos testados,

considerando que E. heros geralmente, oviposita de 3 a 14 ovos/postura (Villas Bôas & Panizzi

1980); isso que pode estar relacionado às características genéticas e/ou fisiológicas da população de

insetos utilizada em ambos os experimentos.


Euschistus heros em substratos artificial e natural em teste de dupla escolha em laboratório.



(%)2

Ovos Ovos

(%)2

Média (± EP)

de

ovos/postura

Algodão

vs.

8,2 ± 1,9 a 98,6 ± 3,2 a 39,2 ± 10,8 a 99,4 ± 0,6 a 4,2 ± 0,6

[41]3,4

Folha de soja 0,2 ± 0,2 b 1,4 ± 1,43 b 0,4 ± 0,4 b 0,6 ± 0,6 b 2,0

[1] 4

Algodão

vs.

2,2 ± 2,0 a 80,0 ± 11,8 a 10,2 ± 6,4 a 75,2 ± 18,1 a 5,0 ± 0,6a

[11]

Vagem de soja 0,4 ± 0,4 b 20,0 ± 11,8 b 2,2 ± 1,9 b 24,8 ± 18,1 b 5,5 ± 2,8a

[2]1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste t de

Student (P < 0,05). 2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.3 Número de posturas colocado em cada substrato, entre colchetes.4 A comparação estatística não foi realizado porque apenas um valor foi obtido para folha de soja.

40


Euschistus heros em substratos artificial e natural em teste de múltipla escolha em laboratório.



(%)2

Ovos Ovos

(%)2

Média (± EP)

de

ovos/postura

Algodão 3,2 ± 0,6 a 74,3 ± 8,3 a 30,9 ± 3,9 a 83,2 ± 7,8 a 11,0 ± 1,1 a

[26]3,4

Folha de Soja 1,0 ± 0,3 b 23,6 ± 6,9 b 6,4 ± 3,3 b 14,6 ± 6,0 b 6,5 ± 0,9 b

[8]

Vagem de soja 0,1 ± 0,1 b 2,1 ± 2,1 c 1,2 ± 1,2 c 2,2 ± 2,1 b 10,0

[1]5

1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste de

Tukey (P<0,05).2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.3 Número de posturas colocado em cada substrato, entre colchetes.4 Médias comparadas usando o teste t de Student (P < 0,05). 5 Dados não incluídos na análise estatística porque apenas um valor foi obtido para vagem de soja.

3.3.2. Oviposição em substrato artificial vs. natural utilizando plantas inteiras de soja

Euschistus heros depositou 58% das posturas sobre os pedaços de algodão amarrados nas

plantas de soja. Embora a área natural (planta) disponível para que as fêmeas depositassem seus

ovos fosse maior, apenas 36% das posturas foram depositadas nos folíolos e apenas cerca de 6% nas

vagens (Fig. 3.1). E. heros é conhecido por apresentar preferência em ovipositar em folhas de soja

41

comparadas com as vagens (Villas Bôas & Panizzi 1980), diferente do que se observa para outros

pentatomídeos como P. guildinii (Panizzi & Smith 1977).

Esses resultados demonstram de maneira conclusiva, que para o percevejo marrom o

algodão hidrófilo foi o substrato de oviposição preferido.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Algodão Folha de Soja Vagem de Soja

Substrato de Oviposição

Nú

me

ro m

édio

(%

)

Posturas Eclosão

Figura 3.1. Porcentagem média (± EP) de posturas e porcentagem de eclosão de ninfas de

Euschistus heros originadas de ovos depositados sobre algodão e planta de soja. Médias seguidas

pela mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P

< 0,05). Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de

comparação.

a

a

a a a

b

42

3.3.3. Viabilidade de ovos de E. heros depositados sobre algodão hidrófilo e plantas de soja

Posturas depositadas em substrato artificial e natural (58,3% no algodão; 36,1% nos folíolos

de soja e 5,7% nas vagens de soja) mostraram porcentagem de eclosão semelhante. Observou-se

porcentagem média de eclosão de 90,5% no algodão, 84,5% nos folíolos e 91% nas vagens de soja

(Fig. 3.1). Esses resultados reforçam dados preliminares (Silva & Panizzi 2007) que demonstraram

que as ninfas de E. heros recém-eclodidas não são afetadas pelas fibras de algodão que

eventualmente recobrem as posturas.

Portanto, esse estudo confirma a viabilidade de uso do algodão hidrófilo comercial como

substrato para concentrar as posturas de E. heros, em condições de laboratório, além de permitir que

os ovos sejam arranjados na postura de forma semelhante àquela encontrada na natureza e sem

prejudicar a eclosão das ninfas. Rotineiramente, o uso do algodão como substrato de oviposição tem

facilitado a manutenção das colônias de percevejos, pois as posturas concentradas sobre ele são

facilmente removidas com auxílio de pinça e transferidas para as caixas de criação de ninfas (Fig.

3.2 B) (Silva & Panizzi 2007).

Adicionalmente, o potencial de uso deste substrato artificial pode ser intensificado com

estudos que investiguem a possibilidade de oferecer diretamente, as “bolinhas” de algodão contendo

as posturas de E. heros ao parasitóide de ovos, Telenomus podisi (Ashmead) (Hymenoptera:

Scelionidae), espécie comumente criada em laboratório para liberação massal no campo e que

preferencialmente, parasita ovos de E. heros (Corrêa-Ferreira & Moscardi 1995, Sujii et al. 2002).

Portanto, se a capacidade de parasitismo e a emergência dos parasitóides não forem afetadas, será

possível utilizar o algodão contendo as massas de ovos parasitados diretamente no campo. Isso irá

43

tornar o processo atual, em que os ovos são reunidos em cartelas e então oferecidos aos

parasitóides, muito mais prático e eficiente, com economia de tempo e recursos.

Figura 3.2. A) Posturas de Euschistus heros depositadas sobre algodão hidrófilo e coletadas

durante manutenção das colônias em laboratório. B) Posturas retiradas do algodão (com auxílio de

pinça) e colocadas em caixa gerbox forrada com papel filtro umedecido.

A

B

44




616-624.

Borges, M., M.L.M. Costa, E.R. Sujii, M.A.G. Medeiros, G.F. Redígolo, I.S. Resck & E.F.

Vilela. 1999. Semiochemical and physical stimuli involved in host recognition by Telenomus

podisi (Hymenoptera: Scelionidae) towards Euschistus heros (Heteroptera: Pentatomidae).

Physiol. Entomol. 24: 227-233.

Borges, M., S. Colazza, L.P. Ramirez-Lucas, K.R. Chauhan, M.C.B. Moraes & J.R Aldrich.

2003. Kairomonal effect of walking traces from Euschistus heros (Heteroptera: Pentatomidae)

on two strains of Telenomus podisi (Hymenoptera: Scelionidae). Physiol. Entomol., 28: 349-

355.

Corrêa-Ferreira, B.S. & F. Moscardi. 1995. Seasonal occurrence and host spectrum of egg

parasitoids associated with soybean stink bugs. Biol. Control.5: 196-202.


J.R.P., P.S.M. Botelho, B.S. Corrêa-Ferreira & J.M.S. Bento. (eds.) Controle Biológico no


45

Moraes, M.C.B., R. Laumann, E.R. Sujii, C. Pires & M. Borges. 2005. Induced volatiles in

soybean and pigeon pea plants artificially infested with the neotropical brown stink bug,

Euschistus heros, and their effect on the egg parasitoid, Telenomus podisi. Entomol. Exp.

Appl. 155: 227-237.

Panizzi, A.R. & J.G. Smith. 1977. Biology of Piezodorus guildinii: Oviposition, development

time, adult sex ratio and longevity. Ann. Entomol. Soc. Am. 70: 35-39.

Panizzi, A.R. 2004. Neotropical brown stink bug, Euschistus heros (F.) (Hemiptera: Heteroptera:

Pentatomidae). In Capinera, J.L. (ed.). Encyclopedia of Entomology, Kluwer Academic

Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1545 p.


bugs (Pentatomidae). In Schaefer, C.W. & A.R. Panizzi. (eds.). Heteroptera of economic

importance. CRC Press, Boca Raton, FLórida, USA. 474 p.


stink bug using an artificial dry diet and an artificial plant. Pesq. Agropec. Brasil. 35: 709-

1715.




46

Panizzi, A.R. & C.H. Santos. 2001. Unusual oviposition on the body of conspecifics by

phytophagous heteropterans. Neotrop. Entomol. 30: 471-472.

Peres, W.A.A. & B.S. Corrêa-Ferreira. 2001. Nymphal and adult performance of Euschistus

heros (Fabr.) (Hemiptera: Pentatomidae), as a potential alternative host for egg parasitoids

multiplication. Neotrop. Entomol. 30: 535-540.

Rizzo, H.F. 1976. Hemípteros de interés agrícola. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires,

Argentina. 69 p.







748.


rearing of Piezodorus guildinii (Westwood) (Heteroptera, Pentatomidae). Rev. Bras. Entomol.

52: 131-134.

47

Silva, C.C., R.A. Laumann, M.C. Blassioli, M. Pareja & M. Borges. 2008. Euschistus heros

mass rearing technique for the multiplication of Telenomus podisi. Pesq. Agropec. Bras. 43:

575-580.




Sujii, E.R., M.L.M. Costa, C.S.S. Pires, S. Colazza & M. Borges. 2002. Inter and intra-guild

interactions in egg parasitoid species of the soybean stink bug complex. Pesq. Agropec. Brasil.

37: 1541-1549.




48

CAPÍTULO 4

Análise do perfil químico de vagens verdes de soja da cultivar BRS 267

4.1. Introdução

Parâmetros morfológicos e bioquímicos estão envolvidos no processo de escolha dos insetos

pelas plantas hospedeiras (Norris & Kogan 1980) sendo que, muitos compostos fitoquímicos podem

influenciar no comportamento de busca por locais para oviposição (Bernays & Chapman 1994).

Deste modo, a identificação de compostos químicos, que atuam como estimulantes de oviposição

para diferentes espécies de insetos, vem ganhando importância nas últimas décadas, devido ao

potencial de uso na manipulação do comportamento de pragas no campo (Städler 1992), além de

servir como ferramentas para estudos em laboratório.

Várias pesquisas com diferentes espécies de plantas demonstram que substâncias presentes

na superfície das folhas (Jackson et al. 1986, Derridj et al. 1996, Lin et al. 1998, Morris et al. 2000,

Coyle et al. 2003) e frutos (Lombarkia & Derridj 2002) atuam como estimulantes de oviposição

para insetos de diferentes ordens. Entretanto, há poucos estudos sobre o papel das substâncias

químicas originárias de plantas na preferência de oviposição de Heteroptera (Dwumfour 1992,

Constant et al. 1996), embora haja inúmeras referências a outros grupos como Lepidoptera e

Diptera, entre outras ordens mencionadas (Renwick 1989, Städler & Schöni 1990, Foster & Harris

1992, Honda 1995, Udayagiri & Mason 1995, Hilker & Meiners 2002, Städler 2002).

Em estudo com o percevejo-verde, Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae),

Panizzi et al. (2004) observaram que extratos de soja podem atuar como condicionantes de

49

oviposição. Com base neste estudo, tem-se buscado identificar compostos químicos presentes em

vagens de soja que possam ser utilizados para condicionar a oviposição dos percevejos em

substratos artificiais, auxiliando na manutenção de colônias em laboratório.

Para identificação dos diferentes compostos químicos selecionou-se a cultivar de soja BRS

267, por tratar-se de um genótipo suscetível ao ataque de percevejos. Esta soja apresenta sabor mais

adocicado, podendo inclusive ser consumida ainda verde, sendo considerada ideal para alimentação

humana (Silva & Carrão-Panizzi 2004). Por esta razão, acredita-se que esta cultivar possui

compostos químicos mais atrativos aos percevejos.

Portanto, este trabalho teve como objetivo estudar o perfil químico de vagens de soja da

cultivar BRS 267, identificando alguns compostos para posterior utilização em bioensaios de

atratividade com pentatomídeos fitófagos.


Os estudos foram conduzidos no Laboratório de Bioecologia de Percevejos, no

Laboratório de Melhoramento Genético da Embrapa Soja, Londrina, PR e no Laboratório de

Ecologia e Semioquímicos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, de

outubro de 2006 a setembro de 2007.

50

4.2.1. Cultivo das plantas de soja

Sementes de soja (cultivar BRS 267) foram semeadas em vasos de plástico (5,0 L) contendo

solo esterilizado. Os vasos foram colocados em casa de vegetação em condições controladas de

temperatura (28 ºC), umidade relativa (70 ± 10%), luminosidade (25000 Lux) e fotoperíodo (14hL:

10hE). Para todos os ensaios foram utilizadas plantas no estágio reprodutivo (R6) (Fehr et al. 1971).

4.2.2. Extração, identificação e quantificação de compostos totais em vagens de soja

Para obtenção do extrato bruto, 136 g de vagens de soja (estágio R6) foram liofilizadas,

moídas em liquidificador e adicionadas a um balão volumétrico equipado com extrator Soxhlet

contendo 800 mL de éter de petróleo. O material foi refluxado por 24 horas e em seguida a solução

foi separada e o resíduo sólido foi refluxado em 800 mL de metanol por 48 horas. A solução

metanólica obtida foi concentrada sob vácuo a 40 oC, resultando em um material viscoso (24,8 g)

que foi submetido às análises cromatográficas e aos testes biológicos. O resíduo sólido foi

descartado.

4.2.3. Fracionamento e derivatização do extrato bruto

Para o fracionamento dos extratos utilizou-se uma coluna de vidro de 20 cm de

comprimento e 0,5 cm de diâmetro, preenchida com 2,0 g de sílica gel (Sigma, malha de 70-230,

63-200 , diâmetro médio do poro 60 Å). A coluna foi eluída com 5,0 mL de metanol e 5,0 mL de

hexano. Diluiu-se 50 mg do extrato bruto de vagens soja em 5,0 mL de hexano e adicionou-se 1,0

51

mL da solução na parte superior da coluna. Em seguida a coluna foi eluída com um gradiente de

solventes diluídos em água, primeiramente o hexano (de 20 a 100%) e em seguida o metanol (de 20

a 100%). Para cada concentração de solvente foram realizadas três eluições e as amostras foram

coletadas separadamente, para análise e uso em bioensaios.

Para extração de alguns compostos não voláteis foi conduzida uma extração na fase líquida

(EFL) com a derivatização do extrato. Para tanto, vagens de soja foram moídas em nitrogênio

líquido e 100 mg do material ainda congelado foi transferido para um frasco de 10 mL onde

adicionou-se 3 mL de HCl (0,001 M) e a solução foi sonicada durante 10 minutos. A amostra foi

extraída com 10 mL de éter etílico e o sobrenadante foi transferido para um frasco de 30 mL. O

solvente foi evaporado sobre fluxo de nitrogênio filtrado. Adicionou-se a cada amostra 0,1 mL de

padrão interno (-tetracosano 5,0 µg/mL), a solução foi evaporada novamente e adicionou-se 0,1

mL de N-metil-N-trimethilsililtrifluoroacetamina (MSFTA). A solução foi aquecida a 60 ºC por 1

hora. Foram preparadas três amostras. As amostras foram analisadas diretamente por cromatografia

gasosa (CG).

4.2.4. Extração, identificação e quantificação de compostos voláteis

Para extração dos compostos voláteis de vagens de soja adaptou-se a metodologia de Moraes

et al. (2005). Para tanto, as vagens (25 g) foram colocadas em câmaras de vidro (5 L) adaptadas

para coleta de compostos voláteis. Na tampa de cada câmara foram feitos dois furos para conectar

tubos de vidro (8,0 cm comp. x 0,7 cm diâmetro) contendo 60 mg de adsorvente químico Super Q

(co-polímero de p-devinilbenzeno-vinilbenzeno) (Alltech, malha de 80/100; Alltech Associates Inc.,

Deerfield, Illinois, EUA). As câmaras foram aeradas durante 24 horas, com ar filtrado através de

52

carvão ativado em fluxo contínuo de 1.200 mL min-1. Após a aeração os adsorventes químicos

foram retirados e eluídos com aproximadamente 1,0 mL de hexano. A solução obtida foi

concentrada a 200 μL, com auxílio de N2 puro.

Os extratos foram analisados por cromatografia gasosa (Perkin-Elmer, Überlingen,

Alemanha, usando uma coluna DB-5 (30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 μm de

espessura; J&W Scientific, Folsom, Califórnia, EUA). A coluna foi mantida a 50 ºC por dois

minutos e em seguida programada a 5 ºC min-1 até 180 ºC/0,1 s e 10 ºC /min até 250 oC/20 minutos.

Foi injetado 1,0 μL de amostra. Os dados foram coletados com o Software Autosystem e foram

analisados usando o programa Origin 5.0 (Microcal Software). Para a quantificação dos compostos

foi comparada a área da base dos picos de cada composto com a área total do padrão interno

utilizado (-tetracosano 5 g/mL). Foram analisadas três amostras.

Para comparar os voláteis emitidos os extratos selecionados foram analisados por

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) usando um equipamento

Shimadzu QP-2010, detector seletivo de massa (Schimadzu Corp., Kyoto, Japão), com ionização de

impacto de elétrons (70 eV). Utilizou-se uma coluna TRB-5 (30 m x 0,25 mm de diâmetro interno,

filme de 0,25 μm de espessura; Teknokroma, Barcelona, Espanha) usando o mesmo programa de

temperatura da análise por cromatografia gasosa, o injetor foi mantido a 250 °C e a injeção foi no

modo splitless, a linha de transferência foi mantida a 250 °C. Os compostos foram identificados

através da comparação do tempo de retenção e do espectro de massa com padrões autênticos.

53

4.2.5. Extração, identificação e quantificação de açúcares totais

Para identificação dos açúcares foi realizada a diluição de 10,0 mg do extrato bruto de soja

em 1,0 mL de metanol. A solução foi derivatizada com MSFTA e 1,0 μL foi injetado e analisado

em cromatografia gasosa (CG) e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-

EM). Foram analisadas três amostras.

Para a determinação do teor de açúcares redutores totais presentes em soja (cultivar BRS

267) foi realizada a análise de Somogy (1945) e Nelson (1944). Foram comparadas amostras de

sementes integrais (SI), sementes desengorduradas (SD) e vagens cheias desengorduradas (VD).

Para desengordurar as amostras, inicialmente foi realizada a desidratação das vagens e

sementes de soja (R6) em estufa 30 ºC durante 24 horas. O material desidratado foi triturado em

liquidificador, obtendo-se uma farinha integral. Porções de 5,0 g da farinha integral foram

colocadas separadamente em extrator Soxhlet com 100 mL de hexano P.A., durante 6,0 horas. Após

a extração, o hexano foi retirado por evaporação e condensação no próprio extrator. A amostra de

farinha restante no cartucho foi colocada em estufa para evaporação total do solvente e foi utilizada

nas análises.

Em frascos Erlenmeyer de 250 mL foram colocados individualmente, 1,0 g de cada amostra

(SI; SD e VD), 100 mL de água destilada e 5,0 mL de ácido sulfúrico concentrado, em seguida a

solução foi deixada em banho-maria a 65 ºC, por 30 minutos. A solução foi resfriada até 15 ºC e

teve o pH neutralizado (NaOH 5N). Transferiu-se a solução para um balão volumétrico de 200 mL

que teve o volume completado com água destilada. A solução foi filtrada em papel filtro.

Colocou-se 1 mL do material filtrado em tubos de ensaio e acrescentou-se 1,0 mL de

Reativo de Somogy (Anexo 4.5.1). A mistura foi levada ao banho-maria fervente por 10 minutos,

54

tampando os tubos com bolinhas de gude. Os tubos foram resfriados em água corrente e em seguida

adicionou-se 1,0 mL de Reativo de Nelson (Anexo 4.5.2) e 7,0 mL de água destilada, agitando a

solução em agitador magnético por 3 minutos. Foram realizadas três repetições para cada tipo de

amostra (SI; SD e VD) e as amostras foram analisadas em espectrofotômetro (Cecil mod. 3000)

com absorbância em 535 nm.

Para o cálculo do teor de açúcares redutores totais foi utilizada a fórmula:

% Somogy Nelson = A. D. K. 100 = ou A. K. 100 onde:

1.000.000 g

A = absorbância da amostra

K = constante da curva padrão de glicose (Anexo 4.5.3)

D = volume da diluição do material inicial

g = massa da amostra presente na alíquota da reação, em microgramas

4.2.6. Extração, identificação e quantificação de isoflavonas

Realizou-se a identificação e quantificação de isoflavonas presentes no extrato bruto de

vagens de soja e nas vagens in natura, adaptando-se a metodologia proposta por Kudou et al.

(1991). Para tanto, amostras de 100 mg de vagens de soja (estágio R6) foram moídas e colocadas

em tubos de ensaio com 4,0 mL de etanol aquoso a 70%, contendo 0,1% de ácido acético, à

temperatura ambiente por uma hora e agitados a cada 15 minutos.

Nas análises de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), 1,5 mL de amostra foi

centrifugado por 15 minutos a 14.000 rpm, a 4 °C (centrífuga Eppendorf mod. 5417R). Em seguida,

55

o sobrenadante foi filtrado com membrana 0,45 µm e transferido para os frascos de vidro

depositados nas bandejas do auto-aplicador de amostras do cromatógrafo. Para cada amostra

(extrato bruto e vagem in natura) foram injetados 20 μL, em triplicata.

As análises de isoflavonas foram realizadas em cromatógrafo líquido (Waters, mod. 2690),

com injetor automático de amostras. Foi utilizada coluna de fase reversa do tipo ODS C18 (YMC

Pack ODS-AM Columm) com 250 mm de comprimento x 0,4 mm de diâmetro interno e partículas

de 5 µm.

Para a separação das isoflavonas, adotou-se o sistema de gradiente linear binário, tendo-se

como fases móveis: 1) metanol contendo 0,025% de ácido trifluoroacético (TFA) (solvente A) e 2)

água destilada deionizada ultrapura contendo 0,025% de TFA (solvente B). A condição inicial do

gradiente foi de 20% para o solvente A, que aos 40 minutos atingiu a concentração de 100% para,

em seguida, retornar a 20% aos 41 minutos e permanecer nestas condições até os 60 minutos.

Portanto, o tempo total de corrida para cada amostra foi de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi

de 1,0 mL/min e a temperatura durante a corrida foi de 24 ºC. Para a detecção das isoflavonas, foi

utilizado um detector de arranjo de foto diodo (Waters, mod. 996), ajustado para o comprimento de

onda igual a 260 nm.

Para a identificação dos picos correspondentes a cada uma das isoflavonas foram utilizados

padrões de glicitina, daidzina, daidzeína, genistina e genisteína (Sigma), solubilizados em metanol

(grau HPLC), nas seguintes concentrações: 0,00625 mg/mL; 0,0125 mg/mL; 0,0250 mg/mL; 0,0500

mg/mL e 0,1000 mg/mL, respectivamente.

Para a quantificação das 12 formas de isoflavonas, por padronização externa (área dos

picos), foram utilizados os padrões como referência, bem como o coeficiente de extinção molar de

cada uma delas para o cálculo das outras formas (malonil e acetil).

56


4.3.1. Perfil químico do extrato e das frações derivatizadas do extrato de vagens de soja

Quando o extrato de vagens de soja foi fracionado com diferentes concentrações de hexano

(fração apolar) e metanol (fração polar), observou-se pela análise de cromatografia gasosa que a

maior parte dos compostos presentes no extrato bruto foi separada na fração polar e apenas uma

pequena parte dos compostos foi separada na fração apolar (Figs. 4.1 A, B e C). A maioria dos

compostos detectados nas amostras do extrato bruto e na fração de metanol apresenta baixa

volatilidade, indicada pelo maior tempo de retenção (acima de 25 min) na coluna cromatográfica.

Panizzi et al. (2004) demonstraram que a fração metanólica (polar) obtida de extrato de

vagens de soja apresenta efeito condicionante de oviposição para N. viridula. Em estudo

semelhante, Gouinguené et al. (2005) compararam a atividade biológica de diferentes frações de

extrato de bulbo de cebola para a mosca Delia antiqua (Meigen) (Diptera: Anthomyiidae) e

observaram que compostos voláteis presentes nas frações polares também atuam como estimulantes

de oviposição. Devido às diferenças observadas entre os perfis químicos do extrato de vagens de

soja ´BRS 267è das frações do extrato, a ação biológica sobre os percevejos foi avaliada, no

capítulo 5.

57

Figura 4.1. Perfil químico das amostras de extrato de vagens verdes de soja `BRS 267´

derivatizadas com MSFTA, obtido por análise em cromatografia gasosa: A) extrato bruto; B) fração

de metanol (100%) e C) fração de hexano (100%).

15 20 25 30 350

20

40

60

80

Tempo de retenção (min)

15 20 25 30 350

20

40

60

80

Inte

nsid

ad

e (

mV

/1000

)

15 20 25 30 350

20

40

60

80

15 20 25 30 350

20

40

60

80

15 20 25 30 350

20

40

60

80

Tempo de retenção (min)

15 20 25 30 350

20

40

60

80

Inte

nsid

ad

e (

mV

/1000

)

15 20 25 30 350

20

40

60

80

Inte

nsid

ad

e (

mV

/1000

)

15 20 25 30 350

20

40

60

80

A

B

C

58

4.3.2. Identificação e quantificação de compostos voláteis em vagens de soja

Os principais compostos voláteis identificados em vagens de soja BRS 267 foram: (E)-2-

hexenal, (Z)-3-hexen-1-ol, 1-octen-3-ol, 3-octanona, tridecano, pentadecano e hexadecano. Os

compostos e suas respectivas concentrações estão agrupados por grupos químicos na Tabela 4.1.

Boué et al. (2003) compararam os voláteis presentes em sementes de soja em diferentes

estágios de desenvolvimento, e observaram que no estágio inicial (R6) as sementes apresentam

maiores concentrações de 3-hexanona, (E)-2-hexenal, 1-hexanol e 3-octatona. A concentração

desses compostos reduz nos estágios mais avançados (R7 e R8), observando-se aumento na

concentração de hexanal, (E)-2-heptenal, (E)-2-octenal, etanol, 1-hexanol e 1-octen-3-ol. Para os

autores, esses voláteis podem servir como indicadores do estágio de maturidade da planta e como

marcadores bioquímicos para avaliar a qualidade das sementes.

Os voláteis de soja presentes em sementes cruas e torradas foram analisados por Rosario et

al. (1984), que observaram concentrações maiores de ácido acético, 2-metil e 3 metil-1-butanol, 1-

pentanol, 1-hexanol, α-pineno e limoneno em soja crua. Nas sementes torradas observaram-se

concentrações maiores de 1-octen-3-ol, pentanal, hexanal e acetona.

59

Tabela 4.1. Concentração média dos compostos voláteis obtidos por aeração forçada de vagens de

soja (cultivar BRS 267) em estágio R6.

Compostos voláteis presentes vagens de soja Concentração média (µg/24 h) (± EP)

Álcoois

(Z)-3-hexen-1-ol 1,5399 ± 1,798

Hexanol 0,3525 ± 0,303Nonanol 0,39972 ± 0,227

1-Octen-3-ol 5,1912 ± 29,752(E)-2-None-1-ol 0,2007 ± 0,161

2,6 nonadiol 0,4077 ± 0,182Aldeídos

(E)-2-Hexenal 1,2744 ± 0,386

Nonanal 1,7516 ± 1,070

Decanal 2,2024 ± 1,064

Cetonas

3-Octanona 3,6147 ± 2,062

Alcanos

Geranil acetona 0,6068 ± 0,319

(Z)-3-Hexenil acetato 1,8824 ± 2,532

α-pineno 0,5113 ± 0,085

Canfeno 1,2547 ± 0,468

Mirceno 3,0285 ± 1,703

Undecano 0,8719 ± 0,303

Dodecano 0,6294 ± 0,140Tridecano 3,4102 ± 0,749

Pentadecano 3,0876 ± 0,483

Hexadecano 3,1349 ± 1,137

60

Nas amostras de soja BRS 267 não foi detectado o hexanal, embora muitos estudos

demonstrem que este composto volátil está presente em quase todos os produtos de soja (Fujimaki

et al. 1965), que passam por procesamentos industriais que geralmente, ativam as enzimas

lipoxigenases que participam da formação do hexanal, composto responsável pelo sabor ruim nos

derivados de soja. As enzimas lipoxigenases têm como seu principal substrato o ácido linoléico e

linolênico, que foram detectados em baixas concentrações nas amostras derivatizadas. Traços dos

ácidos ferrúlico e vanílico também foram detectados nas amostras de vagens de soja BRS 267, em

estágio R6.

A maioria dos estudos tem avaliado os compostos voláteis presentes em sementes e em

alimentos à base de soja, por atuarem como indicadores de atividades bioquímicas que podem

produzir diferentes sabores em produtos vegetais (Fujimaki et al. 1965, Honig & Rackis 1975,

Hsieh et al. 1981). Entretanto, ainda são escassas as informações sobre a composição dos voláteis

presentes em vagens de soja in natura, e seu papel na interação com os insetos.

Liu et al. (1989) compararam os voláteis presentes em folhas de cultivares de soja resistente

(PI 227687) e suscetível (Davis) ao ataque por Trichoplusia ni (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae).

Os autores observaram a presença de compostos como o 2-hexenal, 4-hexen-1-ol-acetato e 2,2-

dimethilhexanal nas duas cultivares, porém em concentrações muito diferentes. Por exemplo, o

composto 4-hexen-1-ol-acetato, considerado atrativo aos insetos, foi observado em concentração

maior na cultivar suscetível (68%) do que na cultivar resistente (29%). Compostos como o 3-

tetradecano e 1-dodecano estão presentes apenas na cultivar resistente, bem como traços de alguns

hidrocarbonetos insaturados e terpenóides, indicando que estes compostos possivelmente estão

associados com o efeito repelente que esta cultivar apresenta.

61

Alguns compostos voláteis identificados nas vagens de soja (BRS 267) como o α-pineno e

mirceno têm sido relatados como mediadores da atividade alimentar de coleópteros (Fan & Sun

2006). Além disso, o α-pineno é considerado um dos principais compostos envolvidos na escolha de

locais para oviposição por cerambicídeos (Ikeda et al. 1980). Em muitos casos, esses voláteis

podem ser produzidos pelas plantas após o ataque por insetos, como demonstrado por Rodríguez et

al. (2002), que observaram que a atividade alimentar e de oviposição de fêmeas de Lygus hesperus

Knight (Heteroptera: Miridae) causa a liberação de α-pineno, mirceno e β-cariofileno. Muitos

desses voláteis constitutivos da planta têm sido relatados como importantes na interação entre os

insetos herbívoros e seus inimigos naturais (Colazza et al. 2004, Moraes et al. 2005).

Portanto, a identificação precisa dos compostos voláteis de soja pode servir como ferramenta

para muitos estudos, ajudando a esclarecer aspectos envolvidos nos mecanismos de resistência de

plantas e na interação tritrófica.

4.3.3. Identificação e quantificação de açúcares totais

Nas amostras derivatizadas com MSFTA foram identificados vários açúcares como

galactitol, glucopiranose, D-galactose, D-galactofuranose e três isômeros de inositol (Fig. 4.2. A, B,

C).

A concentração desses açúcares variou de 25,62 μg/mL (D-galactofuranose) a 2472,08

μg/mL (scillo-inositol) (Fig. 4.3). O mio-inositol é comumente encontrado em sementes de várias

plantas (Cosgrove 1980), entretanto, nas amostras de extrato de vagens de soja analisadas,

observou-se concentração maior do scillo-inositol. Este composto na forma livre tem sido

freqüentemente detectado em animais e algumas plantas (Posternak 1965). Hou et al. (2008)

62

detectaram a presença de mio-inositol em sementes de soja de diferentes cultivares. Os autores

também observaram outros açúcares como sacarose, estaquiose, glicose, frutose e rafinose, sendo os

dois primeiros açúcares os que ocorreram em concentrações maiores nos diferentes genótipos

estudados.

Dreyer et al. (1979) observaram, em soja, a presença de outro isômero do inositol, o 3-O-

metil-quiroinositol e discutem que este composto pode atuar como um fator de resistência,

conferindo à planta efeito antibiótico. Entretanto, em estudo realizado por Schoonhoven & Derksen-

Koppers (1973), observou-se que o percevejo Dysdercus fulvoniger (De Geer) (Pyrrhocoridae) não

teve o comportamento alimentar afetado quando ingeriu solução de inositol 0,01 M.

Muitos açúcares desempenham papel importante no comportamento dos insetos, atuando

como fagoestimulantes (Bernays & Chapman 1994) e estimulantes de oviposição (Eisemann & Rice

1985, Derridj et al.1996). Portanto, a identificação e quantificação desses açúcares em soja, bem

como a avaliação de sua atividade biológica, podem elucidar mecanismos envolvidos na interação

dos insetos com as plantas de soja. Além disso, estudos que demonstrem se há associação entre os

comportamentos de busca por alimento e de local de oviposição para pentatomídeos fitófagos,

também poderão ser conduzidos utilizando-se açúcares específicos da planta hospedeira desses

insetos.

63

A B C

Figura 4.2. Fórmula estrutural de três isômeros de inositol identificados em amostras de extrato de

vagens de soja derivatizadas com MSFTA: A) mio-inositol; B) muco-inositol e C) scillo-inositol.

0

1000

2000

3000

4000

Galacti

tol

Ceto- d

- ácid

o glu

cônic

o

Scyllo

- ino

sitol

Gluco

pira

nose

Muc

o-ino

sitol

D-Gala

ctofu

rano

se

D-Gala

ctose

Mio-

inos

itol

Açúcares identificados

Co

nce

ntr

ação

(µ

g/m

L)

Figura 4.3. Concentração média (± EP) de açúcares identificados em extrato de vagens de soja

(cultivar BRS 267) derivatizado com MSFTA.

OH

OH OH

OH OH

OHOH

OH OH

OH OH

OH HO

HO

HOOH

OH

OH

HO

HO

HOOH

OH

OH

HO OH

OH

OH

OH

HO OH

OH

OH

OH

OH

64

Através da análise de Somogy & Nelson verificou-se que a concentração de açúcares

redutores totais foi de 8,3% nas amostras de sementes integrais, 10,9% nas sementes

desengorduradas e 9,9% nas vagens cheias desengorduradas (Fig. 4.4). A cultivar BRS 267

apresenta concentração alta de sacarose (Carrão-Panizzi et al. 2006), o que lhe confere sabor

adocicado característico. É possível que esta característica também atue sobre os comportamentos

alimentar e de oviposição dos insetos, pois alguns estudos demonstram que certos açúcares atuam

como fagoestimulantes e estimulantes de oviposição (Simmonds et al. 1991, Eisemann & Rice

1985). Portanto, a atividade biológica dos diferentes açúcares combinados entre si foi avaliada no

Capítulo 5.

0

2

4

6

8

10

12

14

Semente Integral SementeDesengordurada

Vagem Desengordurada

Amostras de soja (BRS 267)

Açú

care

s re

du

tore

s (%

)

Figura 4.4. Porcentagem média (± EP) de açúcares redutores presentes em diferentes amostras de

soja R6 (cultivar BRS 267). Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes

pelo teste de Tukey (P < 0,05).

a

a

a

65

4.3.4. Identificação e quantificação de isoflavonas

A análise de isoflavonas presentes no extrato bruto de vagens de soja indicou concentrações

maiores das formas glicosídicas daidzina, genistina e glicitina, respectivamente. Observaram-se

baixas concentrações das formas malonil-glicitina e malonil-genistina. (Fig. 4.5).

Genistina, daidzina e suas formas agliconas, genisteína e daidzeína são as principais

isoflavonas encontradas em soja (Murphy 1982). As formas acetil e malonil são termicamente

instáveis e são convertidas nas suas formas glicosídicas correspondentes quando aquecidas (Kudou

et al. 1991, Carrão-Panizzi et al. 2004). Avaliando diferentes cultivares de soja, Park et al. (2001)

observaram aumento no teor de isoflavonas glicosídicas com extração após aquecimento. Portanto,

isso pode explicar as concentrações mais elevadas das formas de isoflavonas glicosídicas do que

malonil, observadas no extrato bruto de vagens de soja, pois este foi obtido por aquecimento (ver

item 4.2.2).

A concentração total de isoflavonas observadas no extrato bruto de soja foi de 128,1 mg/100

g, corroborando com outros estudos que observaram que a concentração de isoflavonas pode variar

de 126,1 a 409,2 mg/100 g (Tsukamoto et al. 1995, Araújo et al. 1997, Carrão-Panizzi et al. 1999).

66

0

10

20

30

40

50

60

70

G-DAÍ

G-GLY

G-GEN

M-D

AÍ

M-G

LY

M-G

ENA-D

AÍ

A-GLY

A-GEN

DAÍGLY

GEN

Glicosídica Malonil Acetil Aglicona

Co

nc

entr

aç

ão

(m

g/1

00

g)

Figura 4.5. Concentração de isoflavonas presentes em extrato bruto de vagens de soja (cultivar

BRS 267). G-DAÍ= daidzina; G-GLY= glicitina; G-GEN= genistina; M-DAÍ= malonil-daidzina;

M-GLY= malonil-glicitina, A-DAÍ= acetil-daidzina; M-GEN= malonil genistina; A-GEN= acetil-

genistina, DAÍ= daidzeína; GLY= gliciteína e GEN= genisteína, (dados de 1 amostra, sem erro

padrão).

Não foi possível detectar a porcentagem de isoflavonas nas vagens de soja in natura,

possivelmente devido às baixas concentrações presentes nas amostras avaliadas. É possível que o

tratamento térmico que as sementes receberam para desidratação e preparo da farinha de soja, tenha

alterado a concentração de isoflavonas. Em estudo recentemente realizado por Carrão-Panizzi (não-

publicado) foram quantificadas isoflavonas nas formas glicosídicas e malonil em sementes verdes

de soja BRS 267 (Tabela 4.2), as formas acetil e agliconas não foram observadas. De acordo com

vários estudos, a concentração das diferentes formas de isoflavonas nas sementes de soja pode

variar significativamente de acordo com o genótipo, com as variações de temperatura durante o

67

cultivo, o tipo de solo, a localização geográfica, partes da semente e metodologia de extração

(Coward et al. 1993, Carrão-Panizzi & Kitamura 1995, Carrão-Panizzi et al. 1999, Park et al. 2001,

Carrão-Panizzi et al. 2004, Ribeiro et al. 2006, 2007).

As isoflavonas têm sido amplamente estudadas, pois apresentam propriedades biológicas

importantes, exercendo atividades antioxidantes (Shahidi et al. 1992, Esaki et al. 1999),

antifúngicas (Naim et al. 1974), anticancerígenas (Coward et al. 1993, Denis et al. 1999) e

propriedades estrogênicas. Além disso, alguns estudos demonstram que as isoflavonas têm papel

fundamental na resistência de plantas contra insetos (Sutherland et al. 1980, Rao et al. 1990,

Piubelli et al. 2005).

As isoflavonas estão associadas com o sabor amargo e adstringente que algumas cultivares

de soja apresentam e é possível, que esta característica influencie no comportamento de escolha

pelos insetos. Por esta razão, a atividade biológica das isoflavonas sobre os insetos deve ser melhor

investigada.

68

Tabela 4.2. Concentração de isoflavonas presentes em sementes de soja in natura, da cultivar BRS

267 (M.C. Carrão-Panizzi não-publicado).

A análise do perfil químico de vagens de soja da cultivar BRS 267 demonstrou haver

quantidades acentuadas de açúcares (principalmente inositol), baixos teores de isoflavonas e uma

ampla variedade de voláteis. Portanto, esses compostos se apresentam como possíveis mediadores

do comportamento de oviposição de percevejos e, assim, tiveram sua atividade biológica testada, no

capítulo 5.

Vagens de soja in natura Concentração (mg/100 g)

Daidzina 6,62

Glicitina 4,39

Genistina 10,94

6”-O-Malonil-Daidzina 54,85

6”-O-Malonil-Glicitina 34,23

6” -O-Malonil-Genistina 74,63

6”-O-Acetil-Daidzina 0,00

6”-O-Acetil-Glicitina 0,00

6”-O-Acetil-Genistina 0,00

Daidzeína 0,00

Gliciteína 0,00

Genisteína 0,00

69


Araújo, J.M.A., J.C.S. Carlos & C.S. Sedyama. 1997. Isoflavonas em grãos de soja: importância

da atividade de beta-glucosidase na formação do sabor amargo e adstringente. Ciênc. Tec.

Alim. 17: 137–141.



Boué, S.M., B.Y. Shih, C.H. Carter-Wientjes & T.E. Cleveland. 2003. Identification of volatile

compounds in soybean at various developmental stages using solid phase microextraction. J.

Agr. Food Chem. 51: 4873-4876.

Carrão-Panizzi, M.C. & K. Kitamura. 1995. Isoflavone content in Brazilian soybean cultivars.

Breeding Sci. 45: 295-300.

Carrão-Panizzi, M.C., A.D.P. Beléia, K. Kitamura & M.C.N. Oliveira. 1999. Effects of genetics

and environment of isoflavone content of soybean from different regions of Brazil. Pesq.

Agrop. Brasil. 34: 1787–1795.

Carrão-Panizzi, M.C., S.P.G. Favoni & A. Kikuchi. 2002. Extraction time for isoflavone

determination. Braz. Arch. Biol. Technol. 45: 515-518.

70

Carrão-Panizzi, M.C., S.P.G. Favoni & A. Kikuchi. 2004. Hydrothermal treatments in the

development of isoflavone glycones in soybean (Glycine max (L.) Merrill) grains. Braz. Arch.

Biol. Technol. 47: 225-232.

Carrão-Panizzi, M.C., A.E. Pípolo, L.A. Almeida, J.M.G. Mandarino, M. Kaster, C.A.A.

Arias, G.E.S. Carneiro, J.F.F.Toledo, L.C. Miranda, J.T. Yorinori, W.P. Dias, A.M.R.

Almeida, L.A. Domit, V.T. Benassi, N.E. Arantes, A.C.B. Oliveira, R.L. Brogin, E.S.

Lambert, P.F. Bertagnolli, M.A.S. Rangel & P.I.M. Souza. 2006. BRS 267: cultivar de soja

para alimentação humana. In Reunião de pesquisa de soja da região central do Brasil, 28,

Uberaba. MG., p. 315-317.

Colazza S., A. Fucarino, E. Peri, G. Salerno, E. Conti & F. Bin. 2004. Insect oviposition induces

volatile emission in herbaceous plants that attracts egg parasitoids. J. Exp. Biol. 207: 47-53.

Constant, B., S. Grenier & G. Bonnot. 1996. Artificial substrate for egg laying and embryonic

development by the predatory bug Macrolophus caliginosus (Heteroptera: Miridae). Biol.

Control. 7: 140-147.

Cosgrove, D.J. & C.G.J. Irving. 1980. Inositol phosphates: their chemistry, biochemistry and

physiology. Elsevier Scientific, Amsterdam, The Netherlands, 214 p.

71

Coward, L., N.C. Barnes, K.D.R. Setchell & S. Barnes. 1993. Genistein, daidzein, and their β-

glicoside conjugates: antitumor isoflavones in soybean foods American and Asian diets. J. Agr.

Food Chem. 41: 1961-1967.

Coyle, D.R., J.D. McMillin, R.B. Hall & E.R. Hart. 2003. Effects of cotton wood leaf beetle

(Coleoptera: Chrysomelidae) larval defoliation, clone, and season on Populus foliar

phagostimulants. Environ. Entomol. 32: 452-462.

Denis, L., M.S. Morton & K. Griffiths. 1999. Diet and its preventive role in prostatic disease. Eur.

Urol. 35: 377-387.

Derridj, S., B.R. Wu, L. Stammitti, J.P. Garrec & A. Derrien. 1996. Chemicals on the leaf

surface, information about the plant available to insects. Entomol. Exp. Appl. 80: 197-201,

1996.

Dreyer, D.L., R.G. Binder, B.G. Chan, A.C. Waiss Jr., E.E. Hartwig & G.L. Beland. 1979.

Pinitol, a larval growth inhibitor for Heliothis zea in soybeans. Experientia 35: 1182-1183.

Dwunfour, E.F. 1992. Volatile substances evoking orientation in the predatory flowerbug

Anthocoris nemorum (Heteroptera: Anthocoridae). Bull. Entomol. Res. 1: 157-161.

Eisemann, C.H. & M.J. Rice. 1985. Oviposition behaviour of Dacus tryoni: effects of some sugars

and salts. Entomol. Exp. Appl. 39: 61-71.

72

Esaki, H., S. Kawakishi, Y. Morimitsu & T. Osawa. 1999. New potent antioxidative o-

dihydroxyisoflavones in fermented Japanese soybean products. Biosci. Biotech. Bioch. 63:

1637-1639.

Fan, J.T. & J.h. Sun. 2006. Influences of host volatiles on feeding behaviour of the Japanese pine

sawyer, Monochamus alternatus. J. Appl. Entomol. 130: 238-244.

Fehr, W.R., C.E. Caviness, D.T. Burmood & J.S. Pennington. 1971. Stage of development

descriptions for soybeans, Glycine max (L.) Merrill. Crop Sci. 11: 929-31.

Foster, S.P. & M.O. Harris. 1992. Foliar chemicals of wheat and related grasses influencing

oviposition by Hessian fly, Mayetiola destructor (Say) (Diptera: Cecidomyiidae). J. Chem.

Ecol. 18: 1965-1980.

Fujimaki, M., S. Arai, N. Kirigaya & Y. Sakurai. 1965. Studies on flavor components in

soybean. Part 1. Aliphatic carbonyl compounds. Agr. Biol. Chem. 29: 855.

Gouinguené, S.P., H.R. Buser & E. Städler. 2005. Host-plant leaf surface compounds influencing

oviposition in Delia antiqua. Chemoecology 15: 243-249.



73

Honda, K. 1995. Chemical basis of differential oviposition by lepidopterous insects. Arch. Insect

Biochem. Physiol. 30: 1-23.

Honig, D.H. & J.J. Rackis. 1975. Volatile components of maturing soybeans. Cereal Chem. 52:

396-401.

Hou, A., P. Chen, A. Shi, B. Zhang & Y.J. Wang. 2008. Sugar variation in soybean seed assessed

with a rapid extraction and quantification method. Inter. J. Agron. 2009: 1-8.

Ikeda T., N. Enda, A. Yamane, K. Oda & T. Toyoda. 1980. Attractants for the Japanese pine

sawyer, Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae). Appl. Entomol. Zool. 15:

358-361.

Jackson, D.M., R.F. Severson, A.W. Johnson & G.A. Herzog. 1986. Effects of cuticular duvane

diterpenes from green tobacco leaves on tobacco budworm (Lepidoptera: Noctuidae)

oviposition. J. Chem. Ecol.12: 1349-1359.

Kudou, S., Y. Fleury, D. Welti, D. Magnolato, T. Uchida, K. Kitamura & K. Okubo. 1991.

Malonyl isoflavone glycosides in soybean seeds (Glycine max (L.) Merrill). Agr. Biol. Chem.

55: 2227-2233.

Lin, S., B.F. Binder & E.R. Hart. 1998. Chemical ecology of cotton wood leaf beetle adult

feeding preferences on Populus. J. Chem. Ecol.24: 1791-1802.

74

Liu, S.H., D.M. Norris & P. Lyne. 1989. Volatiles from the foliage of soybean, Glycine max, and

lima bean, Phaseolus lunatus: their behavioral effects on the insects Trichoplusia ni and

Epilachna varivestis. J. Agr. Food Chem. 37: 496-501.

Lombarkia, N. & S. Derridj. 2002. Incidence of apple fruit and leaf surface metabolites on Cydia

pomonella oviposition. Entomol. Exp. Appl.. 104: 79-87.

Moraes, M.C. B., R. Laumann, E.R. Sujii, C. Pires & M. Borges. 2005. Induced volatiles in

soybean and pigeon pea plants artificially infested with the Neotropical brown stink bug,

Euschistus heros, and their effect on the egg parasitoid, Telenomus podisi. Entomol. Exp. Appl.

155: 227-237.

Morris, B.D., S.P. Foster & M.O. Harris. 2000. Identification of 1-octacosanal and 6-methoxy-2-

benzoxazolinone from wheat as ovipositional stimulants for Hessian fly, Mayetiola destructor.

J. Chem. Ecol. 26: 859-873.

Murphy, P.A. 1982. Phytoestrogen content of processed soybean products. Food Technol. 36: 60-

64.

Naim, M., B. Gestetner, S. Zilkah, Y. Birk & A. Bondi. 1974. Soybean isoflavones:

characterization, determination, and antifungal activity. J. Agr. Food Chem. 22: 806-810.

75

Nelson, N.A. 1944. Photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose.

J. Biol. Chem. 153: 375-380.

Norris, D.M. & M. Kogan. 1990. Biochemical and morphological bases of resistance. In

Maxuwell, F.G & P.R. Jenning (eds.). Breeding plants resistant to insects. John Wiley and Sons,

New York, USA, 683 p.




Park, Y.K., C.L. Aguiar, S.M. Alencar, H.A.A. Mascarenhas & A.R.P. Scamparini. 2001.

Avaliação do teor de isoflavonas em soja brasileira. Ciên. Tec. Alim. 3: 156-160.

Piubelli, G.C., C.B. Hoffmann-Campo, F. Moscardi, S.H. Miakubo & M.C.N. Oliveira. 2005.

Are chemical compounds important for soybean resistance to Anticarsia gemmatalis? J. Chem.

Ecol. 31: 1509-1525.

Posternak, T. 1965. The cyclitols, chemistry, biochemistry, biology. Hermann, Paris, France, 286

p.

Rao, K.V., S.K. Chattopadhyay & G.C. Reddy. 1990. Flavonoids with mosquito larval toxicity.

J. Agr. Food Chem. 38: 1427-1430.

76

Renwick, J.A.A. & F.S. Chew. 1994. Oviposition behavior in Lepidoptera. Annu. Rev. Entomol.

39: 377-400.

Renwick, J.A.A. 1989. Chemical ecology of oviposition in phytophagous insects. Experientia 45:

223-228.

Ribeiro, M.L.L., J.M.G. Mandarino, M.C. Carrão-Panizzi, M.C.N. Oliveira, C.B.H. Campo,

A.L. Nepomuceno & E.I. Ida. 2006. β-glucosidase activity and isoflavone content in

germinated soybean radicles and cotyledons. J. Food Biochem. 30: 453-465.


A.L. Nepomuceno & E.I. Ida. 2007. Isoflavone content and β-glucosidase activity in soybean

cultivars of different maturity groups. J. Food. Compos. Anal. 20: 19-24.

Rodriguez-Saona, C., S.J. Crafts-Brandner, L. Williams III & P.W. Paré. 2002. Lygus

hesperus feeding and salivary gland extracts induce volatile emissions in plants. J. Chem. Ecol.

28: 1733-1747.

Rosario, R.D., B.O.D. Lumen, H. Tsutomu, R.A. Flath, R. Mon & R. Teranishi. 1984.

Comparison of headspace of volatiles from winged beans and soybeans. J. Agr. Food Chem. 32:

1011-1015.

77

Shahidi, F. & P.K.J.P.D. Wanasundara. 1992. Phenolic antioxidant. CRC Critical Review Food

Sci. Nutr. 32: 67-103.

Schoonhoven, L.M. & I. Derksen-Koppers. 1973. Effects of secondary plant substances on

drinking behaviour in some Heteroptera. Ento. Exp. Appl. 16: 141-145.

Silva, J.B. & M.C. Carrão-Panizzi. 2004. Evaluation of soybean genotypes for consumption in

natura as edamame. P. 66. In Resumos VII World Soybean Research Conference, IV

International Soybean Processing and Utilization Conference, III Brazilian Soybean Congress,

Foz do Iguaçú, Paraná.

Simmonds, M.S.J., L.M. Schoonhoven & W.M. Blaney. 1991. Changes in the responsiveness of

the maxillary styloconic sensilla of Spodoptera littoralis to inositol and sinigrin correlate with

feeding behaviour during the final larval stadium. J. Insect Physiol. 37: 261-268.

Somogy, M. 1945. Determination of blood sugar. J. Biol. Chem. 160: 69-73.

Städler, E. & R. Schöni. 1990. Oviposition behavior of the cabbage root fly, Delia radicum (L.)

influenced by host plant extracts. J. Insect Behav. 3:195-209.

Städler, E. 1992. Behavioral responses of insect to plant secondary compounds. In: Rosenthal,

G.A. & M.R. Berenbaum (eds.). Herbivores: their interactions with secondary plant metabolites,

vol. II. Academy Press, San Diego, USA, 256 p.

78

Städler, E. 2002. Plant chemicals cues important for egg deposition by herbivorous insects. In

Hilker, M. & T. Meiners (eds.). Chemoecology of insect eggs and egg deposition. Blackwell


Sutherland, O.R.W., G.B. Russell, D.R. Biggs & G.A. Lane. 1980. Insect feeding deterrent

activity of phytoalexin isoflavonoids. Biochem. Syst. Ecol. 8: 73-75.

Tsukamoto, C. S., S. Shimada, K. Igita, S. Kudou, M. Kokubun, K. Okubo & K. Kitamura.

1995. Factors affecting isoflavone content in soybean seeds: changes in isoflavonas, saponins,

and composition on fatty acids at different temperatures during seed development. J. Agr. Food

Chem. 43: 1184-1192.

Udayagiri, S. & C.E. Mason. 1995. Host plant constituents as oviposition stimulants for a

generalist herbivore: European corn borer. Entomol. Exp. Appl. 76: 59-65.

79

4.5. Anexos

4.5.1. Reativo de Somogy

Pesar 28 g de Na2HPO4 e adicionar 40 g de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 mL

de água destilada;

Adicionar 100 mL de NaOH 1N;

Gotejar 80 mL de uma solução de CuSO45H2O a 10% sob agitação constante;

Juntar 180 mL de Na2SO4 e completar o volume com água destilada a 1000 mL;

Deixar em repouso por 2 dias e filtrar em papel filtro;

Guardar o Reativo em frasco de vidro escuro e temperatura ambiente.

4.5.2. Reativo de Nelson

Pesar 50 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O (molibdato de amônio) e dissolver em 800 mL de água;

Adicionar 52 mL de H2SO4 concentrado;

Juntar 6 g de Na2HASO4 (hidrogênio arseniato de sódio) dissolvidos em 50 mL de água e

completar o volume com água destilada a 1000 mL;

Deixar o Reativo em frasco escuro de vidro por 2 dias e conservar em temperatura ambiente.

80

4.5.3. Determinação da curva padrão de glicose

Pesar 1 g de glicose P.A. anidro e completar com água a 100 mL;

Retirar do balão: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mL e transferir para balão volumétrico de 100 mL,

obtendo-se 2; 4; 6; 8; 10 mg/100 mL;

Retirar de cada balão 1 mL da solução de glicose e transferir para tubos de ensaio;

Acrescentar 1mL de Reativo de Somogy e levar ao banho-maria fervente durante 10

minutos, tampando os tubos com bolinhas de gude;

Retirar do banho-maria e resfriar em água corrente;

Acrescentar 1 mL de Reativo de Nelson e 7mL de água destilada, agitar em agitador

magnético e fazer leitura em absorbância a 535 nm;

Calcular a constante K da curva

K = Somatório das concentrações (20 + 40 + 60 +80 + 100 mg/L).

81

CAPÍTULO 5

Resposta olfativa e oviposição de Euschistus heros em substrato artificial tratado com

compostos químicos extraídos de vagens de soja da cultivar BRS 267

5.1. Introdução

Na década de 1970 o percevejo marrom Euschistus heros (F.) (Heteroptera: Pentatomidae)

era classificado como praga secundária da soja [Glycine max (L.) Merrill (Fabaceae)] na América

do Sul, mas recentemente, tem aumentado em número e causado danos severos a esta cultura nas

principais áreas produtoras (Panizzi et al. 2000a).

Adultos de E. heros podem ser manejados eficientemente através da liberação massal de

parasitóides de ovos (Corrêa-Ferreira 2002) ou pelo uso de armadilhas com feromônios sexuais

(Borges et al. 1998, 1999, Laumann et al. 2007). Essas técnicas de manejo dependem da

manutenção de colônias de percevejos em laboratório, para o fornecimento contínuo de ovos para a

multiplicação dos parasitóides em laboratório e de adultos com idade conhecida para a

identificação, isolamento e determinação da atividade biológica de feromônios. Além disso, essas

colônias viabilizam o desenvolvimento de outras pesquisas em entomologia básica e aplicada de

forma contínua, disponibilizando insetos sadios para bioensaios sem depender da ocorrência natural

dos percevejos no campo.

Durante muitos anos, tem se buscado aprimorar as técnicas de criação de percevejos

fitófagos. O uso de substratos artificiais para concentrar as posturas tem facilitado a manutenção das

colônias em laboratório e, vários substratos artificiais foram testados para diferentes espécies de

82

percevejos (Panizzi et al. 2000b, Bundy & McPherson 2000). Panizzi et al. (2004) avaliaram

extratos químicos de vagens de soja como possíveis condicionantes de oviposição para o percevejo-

verde, Nezara viridula (L.), buscando aumentar a atratividade das fêmeas pelos substratos

artificiais. Os autores observaram que as fêmeas depositam significativamente mais ovos em

substrato artificial (tule) tratado com extrato metanólico de vagens de soja do que em áreas não

tratadas. Porém, não identificaram a natureza química dos compostos presentes no extrato e

tampouco avaliaram a ação dos compostos isolados sobre o comportamento dos percevejos.

Recentemente, Silva & Panizzi (2007, 2008) desenvolveram metodologia para criação de

pentatomídeos em laboratório, utilizando substratos artificiais para oviposição, porém não

associaram aos substratos características químicas atrativas aos percevejos.

Portanto, buscando identificar compostos condicionantes de oviposição que possam ser

associados aos substratos artificiais em criações de percevejos em laboratório, conduziu-se o

presente estudo, que teve como objetivo principal avaliar a ação de extratos químicos de vagens de

soja da cultivar BRS 267, sobre o comportamento de oviposição de E. heros.


Os estudos foram conduzidos no Laboratório de Bioecologia de Percevejos, no Laboratório

de Melhoramento Genético da Embrapa Soja, Londrina, PR e no Laboratório de Ecologia e

Semioquímicos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, de junho a

dezembro de 2006.

83

5.2.1. Resposta olfativa de fêmeas de Euschistus heros aos compostos químicos extraídos de

vagens de soja

Para avaliar a resposta olfativa das fêmeas de E. heros aos voláteis extraídos de vagens de

soja da cultivar BRS 267, utilizou-se um olfatômetro em forma de “Y” (corpo 9,0 cm; braços 8,0

cm cada, com ângulo de 130º, diâmetro interno de 1,5 cm) confeccionado em placa de acrílico, que

foi colocada sobre uma placa de vidro translúcido e coberto com uma placa de vidro transparente.

As três placas foram fixadas com auxílio de grampos de metal (clips) e na parte de baixo receberam

iluminação com lâmpadas de infravermelho (emissão homogênea de comprimento de onda de 950

nm fornecida por 108 LEDs). O olfatômetro foi acoplado a uma fonte contínua de ar filtrado, com

fluxo de 800 mL/min. regulado com fluxômetro. Para registro e processamento das imagens, o

olfatômetro foi monitorado usando um monitor de vídeo (Sony SSM-14 N5E) conectado a uma

câmera monocromática (Sony SPT M324CE) ajustada com lentes de 12,5 a 75,0 mm. As imagens

foram capturadas e digitalizadas utilizando uma placa de vídeo (PC-Studio PCTV Pinnacle System)

e os dados foram processados pelo programa Sacan (Jorge et al. 2005) (Fig. 5.1).

Fêmeas de E. heros com 15 dias de idade foram selecionadas da criação de laboratório e

utilizadas nos bioensaios. As fêmeas foram introduzidas no olfatômetro individualmente pela

extremidade de saída de ar e foram monitoradas durante 10 minutos. As posições dos braços do

olfatômetro foram invertidas entre tratamento e controle a cada quatro avaliações, para evitar

qualquer influência. Os extratos químicos avaliados (Tabela 5.1) foram aplicados (10 μL) em tiras

de papel filtro (1,5 x 0,5 cm) e colocados na extremidade dos braços do olfatômetro. Os extratos

foram reaplicados a cada três avaliações. As análises foram conduzidas em sala com temperatura

controlada (25 ± 1 ºC). Foram calculadas as porcentagens de primeira escolha (o lado do

84

olfatômetro em que o inseto entrou pela primeira vez, entre tratamento e controle) e de residência,

ou seja, o tempo de permanência em cada local do olfatômetro, entre tratamento e controle.

Figura 5.1. Imagens capturadas por câmera de vídeo durante estudo com Euschistus heros em

olfatômetro tipo “Y”. A) Linhas demarcando as áreas contendo os tratamentos e B) Trilha do inseto

formada pelo programa Sacan durante o monitoramento (10 minutos).

A B

85

Tabela 5.1. Extratos químicos avaliados nos ensaios de olfatometria e o número de fêmeas de

Euschistus heros avaliadas em cada tratamento.

Tratamento Controle Repetições

Extrato metanólico de vagens de soja (10

mg/mL)

Metanol puro 43

Fração de extrato bruto de vagens de soja obtida

com hexano 100% (1 mg/mL)

Hexano puro 20


com metanol 100% (1 mg/mL)

Metanol puro 20


com metanol 100% (1 mg/mL)

Fração de extrato bruto de vagens

de soja obtida com hexano 100%

20

Voláteis extraídos de vagens de soja (200 μL)

(0,01 mg/mL)

Diclorometano 20

Misturas de padrões de voláteis alcanos (0,1

mg/mL)

Hexano puro 20

Mistura de padrões de voláteis aldeídos (0,1

mg/mL)

Diclorometano 20

86

5.2.2. Preferência de oviposição de Euschistus heros em substrato artificial tratado com

compostos químicos extraídos de vagens de soja

Casais de E. heros com 10 dias de idade foram selecionados da criação de laboratório e

colocados individualmente, em caixa gerbox (11,0 x 11,0 x 3,5 cm) forrada com papel filtro. Em

cada caixa foram colocadas duas tampinhas de plástico (1,5 cm de diâmetro), preenchidas com

algodão hidrófilo seco (Cremer S.A., Blumenau, SC). Em uma das tampinhas foi aplicado sobre o

algodão 0,5 mL do tratamento e na outra, a mesma quantidade do controle (Tabela 5.2). Os insetos

foram alimentados com vagem verde de feijão e sementes de amendoim e soja.

As caixas foram mantidas em câmara BOD (25 ± 1 °C, 65 ± 5% UR, fotoperíodo 14h L: 10h

E) e observadas diariamente durante oito dias. Os alimentos e as tampinhas com os tratamentos e

controles foram trocados a cada dois dias. Diariamente, avaliou-se o número de posturas e ovos

depositados em cada tratamento, durante seis dias. Cada casal de inseto foi considerado uma

unidade experimental em delineamento estatístico inteiramente casualizado.

87

Tabela 5.2. Extratos químicos avaliados nos ensaios de preferência de oviposição e o número de

casais de Euschistus heros utilizados em cada tratamento.

Tratamento Controle Repetições

Extrato metanólico de vagens de soja (10 mg/mL) Metanol puro 20

Fração de extrato bruto de vagens de soja obtida com

hexano 100%

Hexano puro 20

Fração de extrato bruto de vagens de soja obtida com

metanol 100%

Metanol puro 20

Solução de isoflavonas a 0,01 mg/mL (daidzina, genistina

e glicitina)

Água 10

Solução de açúcares a 0,1 mg/mL (Solução 1)* Água 10

Solução de açúcares a 0,1 mg/mL (Solução 2)** Água 10

Solução de açúcares a 0,1 mg/mL (Solução 3)*** Água 15

* Solução 1: sacarose, frutose, glicose, maltose, galactose e sorbitol.

** Solução 2: sacarose, frutose, glicose, maltose, galactose, sorbitol, sillo-inositol, mio-inositol,

glucopiranose e galactitol.

*** Solução 3: sillo-inositol, mio-inositol, glucopiranose e galactitol (açúcares identificados em

soja `BRS 267´).

88

5.2.3. Efeito dos voláteis extraídos de vagens de soja sobre a oviposição de Euschistus heros

Dez fêmeas férteis de E. heros selecionadas da criação de laboratório foram colocadas

individualmente, durante dez minutos, em olfatômetro contendo voláteis extraídos de vagens de

soja (200 μL), mistura de voláteis alcanos (0,1 mg/mL) e mistura de voláteis aldeídos (0,1 mg/mL).

Como controle foram utilizadas fêmeas aeradas com hexano ou água destilada. Após o contato com

os compostos voláteis as fêmeas foram colocadas individualmente, em caixas gerbox (11,0 x 11,0 x

3,5 cm) forradas com papel filtro e em cada caixa foi colocado um macho de E. heros com

aproximadamente oito dias de idade. Os insetos foram alimentados com vagem verde de feijão e

sementes de amendoim e soja. Como substrato para oviposição foi colocado um pedaço (2,0 cm de

diâmetro) de algodão hidrófilo seco em cada caixa.

As caixas foram mantidas em câmara BOD (25 ± 1 °C, 65 ± 5% UR, fotoperíodo 14h L: 10h

E). Avaliou-se o número de ovos depositados após 24 e 48 horas. Cada casal de inseto foi

considerado uma unidade experimental em delineamento estatístico inteiramente casualizado.


O número médio de posturas, de ovos e ovos/postura observados nos testes de preferência de

oviposição foi calculado e submetido à análise de variância (ANOVA). As porcentagens de

primeira escolha e de residência observadas nos testes em olfatômetro, assim como as

porcentagens de posturas e ovos observadas no teste de oviposição, foram transformadas em

arcoseno (x + 1) para comparação entre duas médias, pelo teste t de Student, utilizando-se o

programa estatístico SAS 8.2. (SAS Institute 1981, Zar 1984).

89


5.3.1. Resposta olfativa de fêmeas de Euschistus heros aos compostos químicos extraídos de

vagens de soja da cultivar BRS 267

De modo geral, as fêmeas de E. heros apresentaram atratividade olfativa aos compostos

químicos testados. As porcentagens de primeira escolha foram maiores nos tratamentos com extrato

bruto de soja, frações do extrato, voláteis isolados de vagens de soja e misturas de padrões de

voláteis do que nos seus respectivos controles (Tabela 5.3).

Observou-se que a porcentagem de residência foi maior para o extrato bruto (52,6%) do que

para o metanol (29,2%). Resultado semelhante foi observado quando se comparou a fração

metanólica do extrato (54,7%) com o controle metanol (26,5%). Não se observou diferença

significativa na porcentagem de residência entre a fração hexânica do extrato e o controle hexano,

embora as fêmeas de E. heros tenham apresentado maior porcentagem de primeira escolha para a

fração de hexano.

As fêmeas não apresentaram preferência significativa quando foram comparadas as duas

frações do extrato de vagens de soja (metanólica e hexânica), embora numericamente, a fração

metanólica do extrato tenha apresentado maior porcentagem de primeira escolha e de residência

(56,3 e 44,4%) do que a fração hexânica (43,8 e 35,3%) (Tabela 5.3).

Os voláteis extraídos de vagens de soja apresentaram atratividade aos insetos, observando-se

porcentagem de primeira escolha e de residência de 60 e 40% respectivamente, para o tratamento e

de 40 e 28% para o controle (diclorometano). Ao avaliar separadamente, as misturas de padrões de

90

voláteis alcanos e aldeídos observou-se porcentagem de primeira escolha maior para os voláteis do

que para seus respectivos controles (Tabela 5.3).

Tabela 5.3. Comparação das porcentagens de primeira escolha e de residência de fêmeas de

Euschistus heros em olfatômetro em “Y”, em resposta aos diferentes voláteis testados.

Número médio (± EP)1

TratamentosPrimeira Escolha (%)2 Residência (%)2

Extrato bruto de sojavs.Metanol

69,8 ± 7,1 a

30,2 ± 7,1 b

52,6 ± 5,3 a

29,2 ± 5,0 b

Fração de hexanovs.Hexano

52,6 ± 11,8 a

47,4 ± 11,8 b

43,9 ± 8,6 a

37,3 ± 7,9 ab

Fração de metanolvs.Metanol

59,1 ± 10,7 a

40,9 ± 10,7 b

54,7 ± 7,8 a

26,5 ± 6,8 b

Fração metanolvs.Fração de hexano

56,3 ± 12,8 a

43,8 ± 12,8 ab

44,4 ± 9,4 a

35,3 ± 7,4 a

Voláteis de vagens de soja (200 μL)vs.Diclorometano

60,0 ± 13,1 a

40,0 ± 13,1 b

40,0 ± 9,1 a

28,0 ± 9,4 b

Misturas de voláteis (alcanos)vs.Hexano

60,0 ± 11,2 a

40,0 ± 11,2 b

33,9 ± 7,4 a

28,0 ± 6,8 a

Mistura de voláteis (aldeídos)vs.Diclorometano

60,0 ± 13,1 a

40,0 ± 13,1 b

25,0 ± 5,9 a

23,0 ± 8,6 a1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste t de

Student (P < 0,05). 2 Dados transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.

91

Foram identificados vários compostos voláteis presentes nesta cultivar em estágio R6 (item

4.3.2), sendo que compostos como o (E)-2-hexenal, decanal, nonanal e (Z)-3-hexenol têm sido

relatados como importantes no processo de busca da planta hospedeira pelos insetos (Visser 1983).

Estudos com o percevejo Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Heteroptera: Miridae)

demonstram que fêmeas e machos respondem ao (E)-2-hexenal, (Z)-3-hexenol e nonanal, sendo que

esses aldeídos e álcoois estão presentes na planta hospedeira e nos insetos adultos (Chinta et al.

1994). Além disso, o (E)-2-hexenal é um dos compostos que ocorre com maior freqüência na

composição de compostos defensivos de muitas espécies de pentatomídeos (Aldrich 1988). Para E.

heros observou-se que o (E)-2-hexenal e o decanal são utilizados como feromônios de alarme ou de

defesa (Moraes et al. 2008).

Portanto, o fato dos insetos responderem positivamente a compostos constitutivos de ambos,

plantas e insetos, indica que tais compostos podem estar envolvidos em comportamentos distintos,

como a busca por plantas hospedeiras e a atração por feromônios. Por esta razão, a ação biológica

destes voláteis sobre o comportamento de oviposição de E. heros deve ser avaliada isoladamente,

pois através dos resultados obtidos apenas com os ensaios em olfatômetro, não é possível afirmar

que os voláteis de soja atrativos às fêmeas, atuem como mediadores do comportamento de

oviposição.

92

5.3.2. Oviposição de Euschistus heros em substrato artificial tratado com compostos químicos

extraídos de vagens de soja

Na avaliação do número de posturas e de ovos depositados em substrato artificial tratado

com diferentes compostos químicos presentes em vagens de soja (`BRS 267´), observou-se que

todos os compostos avaliados influenciaram a oviposição de E. heros, como veremos a seguir.

5.3.2.1. Oviposição em substrato artificial tratado com extrato bruto de soja e frações do

extrato

Fêmeas de E. heros ovipositaram significativamente mais em algodão hidrófilo tratado com

extrato metanólico de vagens de soja (10 mg/mL) do que em algodão tratado com metanol puro

(Fig. 5.2). A porcentagem de posturas foi de 63,7% para o tratamento contra 36,3% para o controle.

Ao comparar a oviposição em substratos tratados com a fração hexânica do extrato de soja e

o hexano puro, observou-se porcentagem de posturas significativamente maior para a fração

(60,4%) do que para o controle (39,6%). Resultado semelhante foi observado quando se comparou a

fração metanólica do extrato com metanol puro, obtendo-se 73,4% das posturas no tratamento e

apenas 26,6% no controle. A porcentagem de ovos também foi maior nos tratamentos com as

frações hexânica e metanólica do que nos seus respectivos controles (Fig. 5.3).

93

0

20

40

60

80

100

Extrato bruto de soja Metanol

Tratamentos

Nú

me

ro m

éd

io (

%)

Posturas

Ovos


substrato artificial tratado com extrato bruto de soja ou metanol puro (controle). Médias seguidas

pela mesma letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste t de Student

(P < 0,05).

a a

b b

94

0

20

40

60

80

100

Fração Hexano Hexano Fração Metanol Metanol

Tratamentos

Nú

mer

o m

édio

(%

)

Posturas

Ovos


substrato artificial tratado com frações metanólica ou hexânica do extrato bruto de soja ou com

hexano e metanol (controles). Médias seguidas pela mesma letra entre os tratamentos, não são

significativamente diferentes pelo teste t de Student (P < 0,05).

Os resultados demonstram que a oviposição de E. heros é mediada por compostos químicos

presentes no extrato de vagens de soja.

Embora seja um inseto polífago, E. heros apresenta preferência significativa em ovipositar

em folhas de soja (Villas Bôas & Panizzi 1980), indicando que as fêmeas respondem a compostos

químicos presente nesta leguminosa.

a a

b

aa

b

b b

95

Quando o extrato de vagens foi separado em duas frações químicas (hexânica e metanólica)

ainda foi observada preferência das fêmeas pelas áreas tratadas com as frações do extrato. Portanto,

esses resultados sugerem que o comportamento de escolha de locais de oviposição pelos percevejos

fitófagos é mediado por múltiplos componentes, com naturezas químicas diferentes, como

observado para insetos de outras ordens, como Lepidoptera (Nishida 1995, Honda et al. 1997) e

Diptera (De Jong & Städler 1999).

Em estudo com Heteroptera, Panizzi et al. (2004) observaram que fêmeas de N. viridula

respondem a diferentes extratos obtidos de folhas e vagens de soja e, que as frações dos extratos

também atuam como condicionantes de oviposição. Os autores sugerem que quimioreceptores

localizados nas antenas das fêmeas de N. viridula são responsáveis pelo reconhecimento dos

compostos atrativos. Em estudo recente, observou-se que fêmeas de E. heros apresentam grande

quantidade de sensilas localizadas nas antenas e nas placas genitais (F.A.C Silva & A.R. Panizzi

não-publicado), porém não se sabe ao certo qual o papel que essas estruturas desempenham no

processo de reconhecimento de compostos químicos estimulantes e/ou condicionantes de

oviposição.

Portanto, estudos adicionais utilizando outras ferramentas de avaliação, como registros

eletrofisiológicos das sensilas, poderão indicar a presença de quimioreceptores específicos para

compostos identificados em vagens de soja. Adicionalmente, a identificação e síntese de

estimulantes de oviposição poderão ter implicações práticas no controle de percevejos-praga da

soja.

96

5.3.2.2. Oviposição em substrato artificial tratado com soluções de açúcares

As misturas de açúcares testadas não atuaram como estimulantes de oviposição para

Euschistus heros. O número de posturas, de ovos e de ovos/postura depositados em substrato

artificial tratado com a solução contendo apenas monossacarídeos (solução 1) não diferiu da área

tratada com água destilada (Tabela 5.4). Entretanto, quando foi adicionada à solução 1 outros

açúcares (sillo-inositol, mio-inositol, glucopiranose e galactitol), observou-se redução significativa

na porcentagem de posturas (34,3%) e ovos (31,0%) depositados nas áreas tratadas com a solução 2,

comparadas com as áreas tratadas com água (65,7% de posturas e 69% de ovos). O número médio

de ovos/posturas foi significativamente maior no tratamento controle (18,9) do que no tratamento

com a solução 2 de açúcares (7,1) (Tabela 5.4).

Observou-se que a mistura com os açúcares anteriormente identificados em vagens de soja

`BRS 267´ (ver item 4.3.3), não apresenta efeito condicionante de oviposição para E. heros. O

número médio de posturas foi de 2,2 para o tratamento com a mistura de açúcares (solução 3) contra

3,9 para o controle. O número médio de ovos também foi maior no controle (32,3) do que no

tratamento (15,8). Apenas o tamanho das posturas não foi significativamente diferente entre

tratamento e controle (Tabela 5.4).

97


Euschistus heros em substrato artificial tratado com diferentes soluções de açúcares (concentração

de 0,1 mg/mL).

Número médio (± EP)2

Tratamentos1Posturas Posturas

(%)3

Ovos Ovos

(%)3

Média (± EP)

de

ovos/postura

Solução 1

vs.

Água

12,6 ± 1,6 a

9,7 ± 1,6 a

57,2 ± 6,6 a

42,8 ± 6,6 a

114,8 ± 17,2 a

78,2 ± 12,7 a

58,8 ± 6,5 a

41,2 ± 6,5 a

9,1 ± 0,7 a

[126]4

8,3 ± 0,5 a

[97]

Solução 2

vs.

Água

3,1 ± 0,8 a

5,4 ± 1,1 a

34,3 ± 7,6 b

65,7 ± 7,6 a

22,9 ± 5,3 a

54,8 ± 15,7 a

31,0 ± 7,1 b

69,0 ± 7,1 a

7,1 ± 0,9 b

[31]

18,9 ± 9,1 a

[54]

Solução 3

vs.

Água

2,2 ± 0,5 b

3,9 ± 0,6 a

35,2 ± 6,5 b

64,8 ± 6,5 a

15,8 ± 3,6 b

32,3 ± 6,3 a

35,4 ± 7,4 b

65,0 ± 7,4 a

5,1 ± 0,9 a

[33]

6,9 ± 0,9 a

[59]

1 Solução 1: sacarose, frutose, glicose, maltose, galactose e sorbitol. Solução 2: sacarose, frutose,

glicose, maltose, galactose, sorbitol, sillo-inositol, mio-inositol, glucopiranose e galactitol. Solução

3: sillo-inositol, mio-inositol, glucopiranose e galactitol.

2 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste t de

Student (P < 0,05).

3 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.

4 Número de posturas colocado em cada tratamento, entre colchetes.

98

Alguns açúcares como sacarose e frutose desempenham papel importante no comportamento

dos insetos, atuando como fagoestimulantes (Bernays & Chapman 1994, Swoboda et al. 2004) e

estimulantes de oviposição (Eisemann & Rice 1985, Derridj et al.1996, Lombarkia & Derridj 2002,

Hilker & Meiners 2002). Porém, a resposta dos insetos a esses compostos é dose-dependente, ou

seja, açúcares que são estimulantes em concentrações baixas podem atuar como deterrentes em

concentrações altas (Konstantopoulou et al. 2004). Além disso, alguns açúcares podem perder seu

efeito estimulante quando combinados entre si ou com outros compostos químicos (Blom 1978,

Endo et al. 2004, Bernklau & Bjostad 2008). Esse efeito também foi observado em compostos

glicosídicos mediadores de oviposição da borboleta monarca, Danaus plexippus (Bernays &

Chapman 1994). Nesse estudo, observou-se que quando foram adicionados alguns açúcares

anteriormente identificados em vagens de soja (sillo-inositol, mio-inositol, glucopiranose e

galactitol) à solução 1 (sacarose, frutose, glicose, maltose, galactose e sorbitol), esses mesmos

açúcares testados juntos (solução 3) produziram as menores taxas de oviposição.

Para insetos que podem explorar o mesmo alimento nos estágios imaturo e adulto, como a

maioria dos percevejos fitófagos, acredita-se que os comportamentos alimentar e de oviposição

estejam muito relacionados e que sejam mediados por compostos químicos semelhantes. Em

estudos com o percevejo Neomegalotomus parvus (Westwood) (Heteroptera: Alydidae), observou-

se que a seleção do local para oviposição ocorre por meio de seqüências comportamentais

semelhantes àquelas realizadas para escolha do alimento, quando as fêmeas tateiam e movimentam

as antenas próximas às vagens de feijão-guandu, possivelmente para reconhecer os compostos

químicos liberados pela planta (Ventura & Panizzi 2000).

As fêmeas do percevejo Lygus rugulipennis (Poppius) (Heteroptera: Miridae) exploram o

substrato com as partes bucais para selecionar o local para ovipositar. Análises de microscopia

99

eletrônica revelaram que os estiletes apresentam quimioreceptores associados a neurônios sensíveis

aos compostos químicos presentes na superfície da planta hospedeira, demonstrando que as

estruturas bucais estão diretamente envolvidas com a seleção do local de alimentação e de

oviposição (Romani et al. 2005).

5.3.2.3. Oviposição em substrato artificial tratado com soluções de isoflavonas

Algumas das isoflavonas testadas apresentaram efeito deterrente de oviposição para E.

heros. Observou-se que o número de posturas, de ovos e de ovos/postura depositados nas áreas

tratadas com daidzina e com água (controle) não foi significativamente diferente, embora

numericamente, o controle tenha recebido mais posturas e ovos do que o tratamento (Tabela 5.5).

Ao comparar a oviposição de E. heros em substrato artificial tratado com solução de genistina e

água, observou-se que esta isoflavona apresentou efeito deterrente de oviposição. A porcentagem de

posturas foi de 37,6% no tratamento contra 62,4% no controle. A porcentagem de ovos também foi

menor no tratamento (33,3%) do que no controle (66,7%). Apenas o número de médio de

ovos/postura não diferiu significativamente entre tratamento e controle (Tabela 5.5).

Resultado semelhante foi observado ao avaliar a solução de glicitina, pois a porcentagem de

posturas foi maior no controle (65,4%) do que no tratamento (34,6%). A porcentagem de ovos

também foi maior na área tratada com água (63,4%) do que na área com glicitina (36,6%) (Tabela

5.5).

100


Euschistus heros em substrato artificial tratado com diferentes soluções de isoflavonas

(concentração de 0,01 mg/mL).


Tratamentos Posturas Posturas

(%)2

Ovos Ovos

(%)2

Média (± EP)

de ovos/postura

Daidzina

vs.

Água

3,6 ± 0,9 a

4,5 ± 0,5 a

40,3 ± 8,4 a

59,7 ± 8,4 a

24,5 ± 7,6 a

37,9 ± 8,7 a

40,5 ± 9,4 a

59,5 ± 9,4 a

5,4 ± 1,1 a

[36]3

7,5 ± 0,9 a

[45]

Genistina

vs.

Água

3,9 ± 0,6 b

6,8 ± 0,8 a

37,6 ± 5,7 b

62,4 ± 5,7 a

26,8 ± 4,1 b

59,5 ± 7,9 a

33,3 ± 5,3 b

66,7 ± 5,3 a

7,5 ± 0,8 a

[39]

8,7 ± 0,7 a

[68]

Glicitina

vs.

Água

3,0 ± 0,7 a

4,4 ±1,1 a

34,6 ± 7,6 b

65,4 ± 7,6 a

23,6 ± 5,6 a

28,5 ± 5,6 a

36,6 ± 7,9 b

63,4 ± 7,9 a

6,6 ± 1,3 a

[30]

6,8 ± 0,9 a

[44]

1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não são significativamente diferentes pelo teste t de

Student (P < 0,05).

2 Dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x + 1) para análise de comparação.

3 Número de posturas em cada tratamento, entre colchetes.

101

Os resultados indicaram que na concentração testada (0,01 mg/mL) as isoflavonas não

apresentaram efeito condicionante de oviposição para E. heros.

As isoflavonas têm papel fundamental na resistência de plantas de soja contra insetos

(Sutherland et al. 1980, Rao et al. 1990, Piubelli et al. 2005). Ao testar diferentes soluções de

isoflavonas (genistina e daidzina) Toledo et al. (2006) observaram efeito deterrente de alimentação

do percevejo-verde, Nezara viridula.

As vagens de soja (`BRS 267´) apresentam baixa concentração de isoflavonóides (ver item

4.3.4). Das isoflavonas glicosídicas presentes nesta cultivar de soja, a genistina ocorre em maior

concentração (10,94 mg/100g) (M.C. Carrão-Panizzi não-publicado). Segundo Kudou et al. (1991)

o acúmulo de genistina nas sementes de soja ocorre durante os períodos finais de enchimento dos

grãos (estágio R6), coincidindo com o período em que as fêmeas de N. viridula apresentam as

menores porcentagens de oviposição (Panizzi & Alves 1993).

Entretanto, a concentração de isoflavonas em vagens de soja pode sofrer variações de acordo

com as condições ambientais, o tipo de solo, o genótipo, etc. (Carrão-Panizzi & Kitamura 1995,

Carrão-Panizzi et al. 1999, Park et al. 2001, Ribeiro et al. 2007) sugerindo, que a resposta dos

insetos a esses compostos também pode variar. Os resultados do presente estudo sugerem que as

isoflavonas têm influência sobre o comportamento de oviposição de E. heros.

No Capítulo 6 foram realizados estudos para avaliar os comportamentos alimentar e de

oviposição de E. heros sobre diferentes cultivares de soja, que apresentam variação na concentração

de isoflavonas.

102

5.3.3. Efeito dos voláteis extraídos de vagens de soja sobre a oviposição de Euschistus heros

As fêmeas de E. heros que foram aeradas com diferentes compostos voláteis tiveram a

oviposição estimulada. Observou-se que 24 horas após o contato com voláteis extraídos de vagens

de soja (200 µL) o número total de ovos foi de 71, porém após 48 horas esse valor reduziu para 43

ovos (Fig. 5.4). Efeito semelhante foi observado no tratamento com a mistura de padrões de

compostos alcanos e aldeídos, onde 81 e 74 ovos foram depositados respectivamente, 24 após a

aeração das fêmeas, observando-se redução acentuada (19 e 23 ovos) 48 horas após a aeração. A

aeração com hexano P.A. fez com que as fêmeas depositassem mais ovos (45) do que na aeração

com água (28 ovos), 24 horas após o contato. Porém, 48 horas após observou-se redução no número

de ovos depositados pelas fêmeas aeradas com hexano (18), enquanto que as fêmeas aeradas com

água mantiveram o número de ovos (28) (Fig. 5.4).

Na concentração testada (0,1 mg/mL) observou-se que os padrões de voláteis alcanos e

aldeídos apresentam efeito estimulante de oviposição para E. heros, porém este efeito se reduz

drasticamente 48 horas após o contato dos insetos com os compostos químicos. Os voláteis

extraídos de vagens de soja (200 µL) apresentam o mesmo efeito estimulante de oviposição, porém

com período de ação maior, que pode estar relacionado com a menor volatilidade dos compostos. A

mistura de voláteis de plantas mostrou-se mais estimulante do que os voláteis alcanos e aldeídos

isolados, sugerindo que os compostos atuam em sinergia. Portanto, a mistura de voláteis extraídos

das vagens de soja `BRS 267` apresenta potencial maior para uso como condicionante de

oviposição de E. heros em substratos artificiais.

103

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

24 48

Tempo após aeração (horas)

Nú

me

ro t

ota

l de

ov

os

Voláteis totais da planta

Alcanos

Aldeídos

Água

Hexano

Figura 5.4. Número total de ovos depositados por Euschistus heros 24 e 48 horas após o contato

com diferentes compostos voláteis, hexano e água, em olfatômetro.

Compostos voláteis e não-voláteis (açúcares e isoflavonas) presentes em vagens de soja

influenciam positiva ou negativamente a oviposição de Euschistus heros. Estudos complementares

que ajudem a elucidar os mecanismos envolvidos no reconhecimento dos compostos químicos de

soja pelos pentatomídeos fitófagos poderão viabilizar estudos de seleção de genótipos de soja

resistentes e de ferramentas de manejo e controle comportamental de percevejos-praga com uso de

fitoquímicos.

104


Aldrich, J.R. 1988. Chemical ecology of the Heteroptera. Annu. Rev. Entomol. 33: 211-238.



Bernklau, E.J. & L.B. Bjostad. 2008. Identification of feeding stimulants in corn roots for western

corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) larvae. J. Econ. Entomol. 101: 341-351.

Borges, M., K. Mori, M.L.M. Costa & E.R. Sujii. 1998. Behavioural evidence of methyl-2,6,10-

trimethyltridecanoate as a sex pheromone of Euschistus heros (Heteroptera: Pentatomidae). J.

Appl. Entomol. 122: 335-338.

Borges, M., P.H.G. Zarbin, J.T.B. Ferreira & M.L.M. da Costa. 1999. Pheromone sharing:

blends based on the same compounds for Euschistus heros and Piezodorus guildinii. J. Chem.

Ecol. 25: 629-634.

Blom, F. 1978. Sensory activity and food intake: a study of input-output relationships in two

phytophagous insects. J. Zool. 28: 277-340.

105



616-624.





Agrop.Brasil. 34: 1787–1795.

Chinta, S., J.C. Dickens & J.R. Aldrich. 1994. Olfactory reception of potential pheromone and

plant odors by tarnished plant bug, Lygus lineolaris (Hemiptera: Miridae). J. Chem. Ecol. 20:

3251-3267.


J.R.P.; P.S.M. Botelho; B.S. Corrêa-Ferreira & J.M.S. Bento. (eds.). Controle Biológico no


De Jong, R. & E. Städler. 1999. The influence of odour on the oviposition behaviour of the

cabbage root fly. Chemoecology. 9: 151-154.

106

Derridj, S., B.R. Wu, L. Stammitti, J.P. Garrec & A. Derrien. 1996. Chemicals on the leaf

surface, information about the plant available to insects. Entomol. Exp. Appl. 80: 197-201,

1996.

Eisemann, C.H. & M.J. Rice. 1985. Oviposition behaviour of Dacus tryoni: effects of some sugars

and salts. Entomol. Exp. Appl. 39: 61-71.

Endo, N., M. Abe & K. Matsuda. 2004. Feeding stimulants of Solanaceae-feeding lady beetle,

Epilachna vigintioctomaculata (Coleoptera: Coccinellidae) from potato leaves. Appl. Entomol.

Zool. 39: 411-416.


Publishers, Berlin, Alemanha, 390 p.

Honda, K., W. Nishii & N. Hayashi. 1997. Oviposition stimulants for sulfur butterfly, Colias

erate poliographys: cyanoglucosides as synergists involved in host preference. J. Chem. Ecol.

23: 323-331.

Jorge, L.A.C., R.A. Laumann, M. Borges, M.C.B. Moraes, R.A. Cruz, B.N. Milare, &

L. Palhares. 2005. Software para avaliação do comportamento de insetos. Circular Técnica 30,

Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carolos, SP. 1-7.

107



55: 2227-2233.

Konstantopoulou, M.A., F.D. Krokos & B.E. Mazomenos. 2004. Chemical composition of corn

leaf essential oils and their role in the oviposition behavior of Sesamia nonagrioides females. J.

Chem. Ecol. 30: 2243-2256.

Laumann, R.A., M. Borges, M.C.B. Moraes, C.S.S. Pires, E.R. Sujii, B.S. Corrêa-Ferrreira &

C.J. Ávila. 2007. Formulação do feromônio sexual do percevejo-marrom Euschistus heros:

eficiência de atração, vida útil e raio de ação. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 198,

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF. 17 p.

Link, D. 1979. Percevejos do gênero Euschistus sobre soja no Rio Grande do Sul (Hemiptera:

Pentatomidae). Rev. Cent. Cien. Rur. 9: 361-364.

Link, D. & J. Grazia. 1987. Pentatomídeos da região central do Rio Grande do Sul. An. Soc.

Entomol. Brasil. 16: 116-129.

Lombarkia, N. & S. Derridj. 2002. Incidence of apple fruit and leaf surface metabolites on Cydia

pomonella oviposition. Entomol. Exp. Appl. 104: 79-87.

108

Malaguido, A.B. & A.R. Panizzi. 1998. Danos de Euschistus heros (Fabr.) (Hemiptera:

Pentatomidae) em aquênios de girassol. An. Soc. Entomol. Brasil. 27: 535-542.

Moraes, M.C.B., M. Pareja, R.A. Laumann & M. Borges. 2008. The chemical volatiles

(semiochemicals) produced by Neotropical stink bugs (Hemiptera: Pentatomidae). Neotrop.

Entomol. 37: 489-505.

Nishida, R. 1995. Oviposition stimulants of swalowtail butterflies. In Scriber, J.M., Y. Tsubaki &

R.C. Lederhouse (eds). Swalowtail butterflies their ecology and evolutionary biology. Scientific

Publishers, Gainesville, Flórida, USA. 154 p.

Panizzi, A.R. & R. M. Alves. 1993. Performance of nymphs and adults of the southern green stink

bug (Heteroptera: Pentatomidae) exposed to soybean pods at different phenological stages of

development. J. Econ. Entomol. 86: 1088-1093.

Panizzi, A.R. & E.D.M. Oliveira. 1998. Performance and seasonal abundance of the Neotropical

brown stink bug, Euschistus heros nymphs and adults on a novel food plant (pigeonpea) and

soybean. Entomol. Exp. Appl. 88: 169-175.


bugs (Pentatomidae). In Schaefer, C.W. & A.R. Panizzi (eds.). Heteroptera of economic

importance. CRC Press, Boca Raton, Flórida, USA. 474 p.

109


stink bug using an artificial dry diet and an artificial plant. Pesq. Agropec. Brasil. 35: 709-1715.




Park, Y.K., C.L. Aguiar, S.M. Alencar, H.A.A. Mascarenhas & A.R.P. Scamparini. 2001.

Avaliação do teor de isoflavonas em soja brasileira. Ciênc. Tec. Alim. 3: 156–160.



Ecol. 31: 1509-1525.


J. Agr. Food Chem. 38: 1427-1430.




Romani, R., G. Salermo, F. Frati, E. Conti, N. Isidoro & F. Bin. 2005. Oviposition behaviour in

Lygus rugulipennis: a morpho-functional study. Entomol. Exp. Appl. 115: 17-25.

110







748.


rearing of Piezodorus guildinii (Westwood) (Heteroptera, Pentatomidae). Rev. Bras. Entomol.

52: 131-134.






111

Swoboda, L.E., D.M. Miller, R.J. Fell & D.E. Mullins. 2007. The effect of nutrient compounds

(sugars and amino-acids) on bait consumption by Reticulitermes spp. (Isoptera:

Rhinotermitidae). Sociobiol. 44: 547-563.

Toledo, A.M., C.B. Hoffmamnn-Campo, A.L. Boiça-Júnior, M.C. Salvador, S.H. Myakubo,

S.H. Silva & A.C.F. Mendes. 2006. Efeito de isoflavonóides no comportamento alimentar de

Nezara viridula (L.). P. 83. In Resumos do IV Congresso Brasileiro de Soja, Londrina, PR.

Ventura, M.U. & A.R. Panizzi. 2000. Oviposition behavior of Neomegalotomus parvus (West.)

(Hemiptera: Alydidae): daily rhythm and site choice. An. Soc. Entomol. Brasil. 29: 391-400.




112

CAPÍTULO 6

Comparação do perfil químico e análise de preferência alimentar e de oviposição de

Euschistus heros em vagens de soja de diferentes cultivares

6.1. Introdução

Os compostos fitoquímicos são conhecidos por influenciar o comportamento alimentar dos

insetos herbívoros, entretanto, há inúmeras evidências de que eles podem mediar também o

comportamento de oviposição (Bernays & Chapman 1994, Hilker & Meiners 2002).

A identificação de compostos químicos extraídos de plantas hospedeiras, que atuam como

estimulantes de oviposição para insetos-praga tem ganho importância, devido ao potencial de uso na

manipulação do comportamento dos insetos no campo. Muitos estudos conduzidos nesta área

demonstram que as fêmeas de insetos especialistas (mono e oligófagos) aparentemente, selecionam

a planta hospedeira com base na presença de fitoquímicos que são característicos da família das

plantas utilizadas preferencialmente, pelos insetos imaturos (Städler 1992). Porém, para insetos

generalistas (polífagos), como a maioria dos pentatomídeos fitófagos, as bases químicas que

determinam a seleção do hospedeiro são pouco conhecidas.

O percevejo-marrom, Euschistus heros (F.) (Heteropetra: Pentatomidae) é considerado uma

das principais pragas da soja, Glycine max (L.) Merrill (Fabaceae) (Panizzi et al. 2000) e, embora

seja polífago, apresenta preferência por esta leguminosa (Panizzi & Oliveira 1998), indicando que a

soja apresenta além de características nutricionais favoráveis ao desenvolvimento, fitoquímicos que

são atrativos a este percevejo. Evidentemente, a resposta dos insetos pode variar de acordo com o

113

genótipo de soja, e por esta razão, foram conduzidos estudos com E. heros comparando o

comportamento alimentar e de oviposição desses insetos em diferentes cultivares de soja: BRS 213,

BRS 267, BR 16 e IAC-100. Essas cultivares foram selecionadas por apresentarem características

bem distintintas, como ausência das enzimas lipoxigenases, responsáveis pela formação de alguns

compostos voláteis (BRS 213), menor concentração de isoflavonas (BRS 267), sementes menores e

maior suscetibilidade ao ataque de insetos (BR 16) e resistência ao ataque de insetos, inclusive

percevejos (IAC-100). Buscou-se analisar as respostas dos insetos com base no perfil químico e nas

características físicas, como pilosidade das vagens, das cultivares estudadas.

Dentre os fitoquímicos de soja estudados destacam-se as isoflavonas, que compreendem os

compostos glicosídeos genistina, daidzina e glicitina, bem como suas formas agliconas

correspondentes, genisteína, daidzeína e gliciteína (MacLeod & Ames 1988) e as formas acetil e

malonil (Kudou et al. 1991). Esses compostos têm sido relatados como deterrente alimentar para

percevejos (Toledo et al. 2006) e estão associados com os mecanismos de resistência em algumas

cultivares de soja (Rossetto et al. 1995, Rao et al. 1990).

Os compostos voláteis presentes nas diferentes cultivares de soja também foram

comparados, pois estudos anteriores demonstraram que fêmeas de E. heros respondem

positivamente aos voláteis presentes em extrato de vagens de soja, além de efetuarem

significativamente mais posturas em áreas tratadas com os extratos em comparação com áreas não

tratadas (Silva et al. 2007).

Portanto, visando utilizar os extratos de soja na manipulação do comportamento de

oviposição dos percevejos em laboratório, conduziu-se esse estudo. O objetivo principal foi

identificar os compostos fitoquímicos de diferentes cultivares de soja, que influenciam no

114

comportamento de oviposição de E. heros, selecionando a cultivar mais atrativa aos percevejos,

para fins de aprimoramento de sua criação em laboratório.


Os estudos foram conduzidos no Laboratório de Bioecologia de Percevejos, no Laboratório

de Melhoramento Genético da Embrapa Soja, Londrina, PR e no Laboratório de Semioquímicos da

Embrapa Cenargen, Brasília, DF, de janeiro a julho de 2008.

6.2.1. Cultivo das plantas de soja

Sementes de soja das cultivares BRS 213; BRS 267; BR 16 e IAC-100 foram semeadas em

vasos de plástico (5,0 L) contendo solo esterilizado. Os vasos foram colocados em casa de

vegetação em condições controladas de temperatura (27 ºC), umidade relativa (70 ± 10%),

luminosidade (25000 Lux) e fotoperíodo (L14:E10). Para todos os ensaios foram utilizadas plantas

no estágio reprodutivo (R6) (Fehr et al. 1971).

115

6.2.2. Extração, identificação e quantificação de compostos voláteis, açúcares e isoflavonas de

vagens de soja de diferentes cultivares

Para extração dos compostos voláteis das vagens de soja adaptou-se a metodologia de

Moraes et al. (2005). A análise de Somogy (1945) e Nelson (1944) foi realizada para a

determinação do teor de açúcares redutores nas vagens e, para na análise de isoflavonas utilizou-se

metodologia adaptada de Kudou et al. (1991).

Os procedimentos de extração, identificação e quantificação dos diferentes compostos

(voláteis, açúcares e isoflavonas) estão relatados detalhadamente no Capítulo 4.

6.2.5. Preferência alimentar de Euschistus heros por vagens de diferentes cultivares de soja

Fêmeas de E. heros, provenientes da criação em laboratório foram deixadas em jejum

durante 20 horas, com água ad libitum.

Para condução de teste sem chance de escolha as fêmeas jejuadas (n= 40) foram colocadas

individualmente, em placas de Petri (6,0 cm de diâmetro) contendo uma vagem (R6) de uma das

cultivares de soja testadas. No teste com chance de escolha, as fêmeas (n= 20) foram mantidas em

caixas gerbox (11,0 x 11,0 x 3,5 cm) contendo uma vagem de cada cultivar de soja.

As análises foram conduzidas em sala com temperatura controlada (25 ± 1 ºC) e os insetos

foram observados durante três horas. Avaliou-se o tempo de alimentação (minutos) em cada cultivar

soja.

116

6.2.6. Oviposição de Euschistus heros sobre vagens de diferentes cultivares de soja

Em teste com chance de escolha quinze casais de E. heros com dez dias de idade,

provenientes de criação em laboratório, foram colocados individualmente, em caixas gerbox (11,0 x

11,0 x 3,5 cm) contendo uma vagem (R6) de cada cultivar de soja testada (BRS 213, BRS 267, BR

16 e IAC-100).

Os insetos foram mantidos em condições controladas (25 1 oC, 70 5% UR, fotofase 14h)

e observados diariamente durante quatro dias. Avaliou-se o número médio de posturas e a

porcentagem de posturas foi calculada.


A concentração média de voláteis, açúcares e de isoflavonas, bem como o tempo médio de

alimentação em cada cultivar de soja foram submetidos à análise de variância (ANOVA). As

porcentagens de posturas foram transformadas em arcoseno (x + 1) para comparação pelo teste

de Tukey, utilizando-se o programa estatístico SAS 8.2. (SAS Institute 1981, Zar 1984).

117


6.3.1. Análise do perfil químico de vagens das cultivares de soja

O perfil químico das cultivares de soja (BRS 213, BRS 267, BR 16 e IAC-100) apresentou

variações qualitativas e quantitativas, como veremos a seguir.

6.3.1.1. Identificação e quantificação de compostos voláteis presentes em vagens de diferentes

cultivares de soja

A análise do perfil químico das vagens das diferentes cultivares demonstrou composição

semelhante de voláteis, porém com variação nas concentrações. De modo geral, as cultivares BRS

213 e BRS 267 apresentaram concentração maior de voláteis do que as cultivares BR 16 e IAC-100

(Fig. 6.1). Compostos como o 1-octen-3-ol, 3-octanona e (E)-2-hexenal ocorreram em

concentrações maiores na `BRS 213´ e `BRS 267`. Alguns compostos não foram detectados em

todas as cultivares como o hexanol, geranil acetona e α-pineno na `BR 16´ e o canfeno na `BRS

213´ (Tabela 6.1). O alcano mirceno que foi observado anteriormente na cultivar BRS 267 (ver

Capítulo 4), não foi detectado nesta cultivar e nas demais cultivares analisadas.

Ao comparar os voláteis de cultivares de soja suscetível (Davis) e resistente (PI 227687) a

insetos mastigadores, Liu et al. (1989) observaram a presença de 2-hexenal, 4-hexen-1-ol-acetato e

2,2-dimethilhexanal nas duas cultivares, porém em concentrações muito diferentes. Por exemplo, o

composto 4-hexen-1-ol-acetato, considerado atrativo aos insetos, foi observado em concentração

maior na cultivar suscetível (68%) do que na cultivar resistente (29%). Compostos como o 3-

118

tetradecano e 1-dodecano foram encontrados apenas na cultivar resistente, bem como alguns

hidrocarbonetos insaturados e terpenóides, sugerindo que esses compostos estão associados com o

efeito repelente que esta cultivar apresenta.

Das cultivares analisadas neste estudo, apenas a IAC-100 é considerada resistente a insetos.

Esta cultivar apresentou a mesma composição de voláteis das outras cultivares estudadas, porém em

concentrações menores, sugerindo que o teor de voláteis presentes nas vagens pode estar envolvido

nos mecanismos de resistência da soja ÌAC-100´.

0

20

40

60

80

100

120

140

BRS-213 BRS-267 BR-16 IAC-100

Cultivares de soja

Co

nc

en

tra

çã

o d

e v

olá

teis

(μ

g/2

4 h

)

Figura 6.1. Concentração média (± EP) de voláteis liberados por vagens de cultivares de soja.

Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P <

0,05).

a

b b

a

119

Tabela 6.1. Concentração média (μg/24 h) (± EP) de compostos voláteis extraídos por aeração

forçada de vagens das cultivares de soja BRS 213, BRS 267, BR 16 e IAC-100, em estágio R6.

Concentração média (± EP)

Compostos BRS 213 BRS 267 BR 16 IAC-100

Álcoois

(Z)-3-hexen-1-ol 9,034 ± 2,072 2,945 ± 1,798 4,777 ± 4,369 0,457 ± 0,385

Hexanol 0,058 ± 0,017 0,518 ± 0,303 Nd* 0,383 ± 0,456

Nonanol 0,106 ± 0,130 0,185 ± 0,227 0,042 ± 0,019 0,571 ± 0,358

1-Octen-3-ol 51,360 ± 46,184 37,001 ± 29,752 4,224 ± 2,952 0,742 ± 0,392

(E)-2-None-1-ol 0,258 ± 0,026 0,328 ± 0,161 0,804 ± 0,884 0,795 ± 0,702

2,6 nonadiol 0,065 ± 0,012 0,260 ± 0,182 0,045 ± 0,013 0,667 ± 0,747

Aldeídos

(E)-2-hexenal 3,305 ± 1,320 2,933 ± 0,386 0,704 ± 0,333 0,362 ± 0,425

Nonanal 0,351 ± 0,053 2,063 ± 1,070 0,258 ± 0,174 0,660 ± 0,680

Decanal 0,373 ± 0,030 1,873 ± 1,064 0,196 ± 0,082 0,686 ± 0,834

Cetonas

3-Octanona 9,560 ± 2,739 7,622 ± 2,062 2,369 ± 1,355 0,509 ± 0,548

Alcanos

Geranil acetona 0,147 ± 0,083 0,703 ± 0,319 Nd 1,036 ± 1,006

(Z)-3-hexenil acetato 1,009 ± 0,467 4,046 ± 2,532 0,615 ± 0,173 0,504 ± 0,599

α-pineno 0,012 ± 0,015 0,152 ± 0,085 Nd 0,516 ± 0,462

Canfeno Nd 1,955 ± 0,468 0,253 ± 0,068 0,525 ± 0,489

Undecano 0,114 ± 0,006 0,700 ± 0,303 0,074 ± 0,025 1,098 ± 0,393

Dodecano 0,063 ± 0,009 0,292 ± 0,140 0,027 ± 0,013 1,121 ± 0,540

Tridecano 0,267 ± 0,114 1,453 ± 0,749 0,140 ± 0,097 0,865 ± 0,874

Pentadecano 0,390 ± 0,242 3,392 ± 0,483 0,381 ± 0,246 1,069 ± 1,040

Hexadecano 0,461 ± 0,149 2,302 ± 1,137 0,172 ± 0,109 1,264 ± 1,062

*Nd = não detectado.

120

6.3.1.2. Quantificação de açúcares redutores presentes em vagens de diferentes cultivares de

soja

Não foi observada diferença significativa na concentração de açúcares redutores presentes

em vagens de diferentes cultivares de soja. Através da análise de Somogy & Nelson verificou-se

que a porcentagem média de açúcares redutores nas vagens integrais foi de 9,9% para a cultivar

BRS 267, 7,9% para a `BR 16`; 7,6% para a `BRS 213` e 7,2% para a cultivar IAC-100 (Tabela

6.2). Em todas as cultivares as maiores porcentagens de açúcares foram observadas nas sementes

desengorduradas, pois, com a retirada dos lipídios os açúcares ficam mais concentrados nas

amostras.

Embora não tenham ocorrido diferenças significativas, houve tendência da cultivar BRS 267

em apresentar teor mais elevado de açúcares, nas vagens e nas sementes integrais. Essa cultivar é

recomendada para fins alimentares justamente, por possuir características químicas desejáveis para

o consumo como soja verde ou hortaliça (Carrão-Panizzi et al. 2006, Castiglioni 2006). O teor de

açúcares nas sementes é um fator comercialmente importante, pois pode influenciar no valor

nutricional, na digestibilidade e na qualidade dos produtos derivados de soja. Os principais açúcares

presentes em sementes de soja são glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose (Eldridge et al.

1979), sendo que os três primeiros açúcares apresentam características positivas ao paladar e a

digestibilidade humana, enquanto que a rafinose e a estaquiose são menos favoráveis (Hymowitz et

al. 1972). A concentração desses compostos pode variar amplamente entre os genótipo de soja,

como observado por Hymowitz & Collins (1974).

Análises comparativas de sementes de soja de diferentes genótipos realizadas por Hou et al.

(2008) indicaram variação de 37,2 a 148,7 (mg/g) na concentração de açúcares totais. Essas

121

variações são determinadas geneticamente e também por alterações ambientais (Stombaugh et al.

2000), sendo essas últimas responsáveis também por variações na composição geral das sementes

de soja. Wilcox e Shibles (2001) observaram que existe relação entre o teor de proteínas e de

carboidratos nas sementes de soja, indicando que os níveis de sacarose decrescem quando aumenta

a concentração de proteínas na semente, dependendo do genótipo e do ambiente de cultivo.

Nesse estudo, a diferença na concentração de açúcares totais observada entre as cultivares,

pode estar realacionada às características genéticas, pois todas as plantas foram cultivadas em

condições ambientais idênticas.

Tabela 6.2. Porcentagem média (mg/100 g) (± EP) de açúcares redutores totais presentes em

vagens verdes desengorduradas, sementes verdes integrais e desengorduradas de soja, de quatro

cultivares.

Porcentagem média (± EP) 1 de açúcares redutores totais

Cultivares de soja Vagem desengordurada Semente integral Semente desengordurada

BRS 213 7,6 ± 0,4 5,5 ± 0,1 9,0 ± 0,4

BRS 267 9,9 ± 0,2 8,3 ± 0,4 9,9 ± 0,6

BR 16 7,9 ± 0,3 8,1 ± 0,3 10,3 ± 0,1

IAC-100 7,2 ± 0,2 8,2 ± 0,3 9,0 ± 0,8

122

6.3.1.3. Quantificação de isoflavonas presentes em vagens de diferentes cultivares de soja

A concentração de isoflavonas foi variável entre as cultivares analisadas. As cultivares IAC-

100 e BR 16 apresentaram os maiores níveis de isoflavonas totais 49,4 e 37,0 (mg/100g)

respectivamente, enquanto que a cultivar BRS 213 apresentou a menor concentração (11,5

mg/100g). Nenhuma das 12 formas de isoflavonas foi detectada nas amostras da cultivar BRS 267

(Fig. 6.2).

0

10

20

30

40

50

60

IAC-100 BR-16 BRS-213 BRS-267

Cultivares de soja

Co

nc

en

tra

çã

o (

mg

/10

0g

)

Figura 6.2. Concentração média (± EP) de isoflavonas presentes em vagens de soja de diferentes

cultivares. Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste de

Tukey (P < 0,05). * Nd = não detectado.

a

b

c

Nd*

123

Em estudo comparando o teor de isoflavonas em plantas de soja maduras cultivadas em

regiões geográficas diferentes, Carrão-Panizzi et al. (1998) observaram que na cultivar IAC-100 a

concentração de isoflavonas em sementes maduras pode variar de 116,4 a 177,3 mg/100 g e na

cultivar BR 16 esses valores variam de 107,1 a 126,5 mg/100 g.

Neste estudo observou-se concentração baixa de isoflavonas em todas as cultivares

avaliadas. As isoflavonas daidzina e glicitina foram detectadas apenas na cultivar IAC-100, nas

concentrações de 4,13 e 1,13 (mg/100 g), respectivamente (Tabela 6.3). Carrão-Panizzi & Kitamura

(1995) também detectaram a presença de daidzina na cultivar IAC-100, porém em concentração

maior 60,3 mg/100 g.

Observaram-se concentrações semelhantes de daidzeína (8,2 e 8,6 mg/100 g) nas cultivares

BR 16 e IAC-100, respectivamente, e níveis elevados de genisteína (16,2 e 15,4 mg/100g) também

foram observados nessas duas cultivares. Na cultivar BRS 213 observou-se concentração de

daidzeína de 3,7 mg/100 g, valor muito acima do que foi observado por Ribeiro et al. (2007).

Porém, esta cultivar apresentou nível significativamente menor de isoflavonas totais, comparado

com as cultivares BR 16 e IAC-100.

Em todas as cultivares analisadas não foram detectadas as isoflavonas na forma acetil,

tampouco a malonil daidzina e a gliciteína (Tabela 6.3). De modo geral, todas as cultivares

estudadas apresentaram teor de isoflavonas muito abaixo do observado por Carrão-Panizzi (1996)

em diferentes cultivares de soja madura. A temperatura (27 ºC) na casa de vegetação durante o

período de cultivo pode ter sido responsável pela redução na concentração de isoflavonas nas

sementes analisadas, já que este fator é considerado determinante na formação de isoflavonas,

durante o período de enchimento das vagens de soja (Kitamura et al. 1991, Tsukamoto et al. 1995,

Carrão-Panizzi et al. 1999).

124

A cultivar IAC-100 apresenta resistência a insetos (Rossetto et al.1995, Piubelli et al. 2005)

provocada por muitos mecanismos, como menor período de enchimento de vagens, rejeição de

sementes novas danificadas, etc. Possivelmente, o teor elevado de isoflavonas seja outro fator

envolvido nos mecanismos de resistência desta cultivar, pois alguns estudos demonstram que as

isoflavonas têm papel fundamental na resistência de plantas contra insetos (Sutherland et al. 1980,

Rao et al. 1990, Piubelli et al. 2005). Resultados anteriores (ver Capítulo 5) indicaram que as

isoflavonas influenciam negativamente na oviposição de E. heros, reforçando a importância desses

compostos como mediadores do comportamento dos pentatomídeos.

Entretanto, a maioria dos estudos sobre o perfil químico da soja apresenta uma abordagem

fitoquímica, buscando avaliar as características favoráveis à comercialização da soja e seus

derivados. Em pesquisas com cultivares de soja resistentes a insetos, poucos autores relacionaram

os mecanismos de resistência com a composição química das sementes (Tester 1977, Grunwald &

Kogan 1981, Liu et al. 1989), a maioria considera apenas as características morfológicas e/ou

genéticas da planta (Jones & Sullivan 1978, Gilman et al. 1982, Ihsan-ul-Had et al. 2003).

As cultivares de soja estudadas (BRS 267, BRS 213, BR 16 e IAC-100) são comerciais e

foram desenvolvidas através de técnicas tradicionais de melhoramento genético e, o fato delas

apresentarem compostos atrativos e/ou repelentes aos insetos, aparentemente, não é um resultado

intencional. Tendo em vista que os fatores químicos que determinam a resistência a insetos nessas

diferentes cultivares de soja não foram elucidados, é possível utilizar os resultados do perfil

químico dos voláteis, açúcares e isoflavonóides obtidos nesse estudo, como base para novas

pesquisas sobre resistência de soja a insetos.

125

.Tabela 6.3. Concentração média (mg/100 g) (± EP) de isoflavonas presentes em vagens de soja das

cultivares BRS 213, BR 16 e IAC-100, em estágio R6.

Concentração média (± EP) 1

Isoflavonas2BRS 213 BR 16 IAC-100

Daidzina 0,00 ± 0,00 Bd 0,00 ± 0,00 Bd 4,13 ± 0,10 Ad

Glicitina 0,00 ± 0,00 Bd 0,00 ± 0,00 Bd 1,13 ± 0,03 Ae

Genistina 1,54 ± 0,04 Bc 4,47 ± 0,03 Ac 5,98 ± 0,23 Ac

Malonil Daidzina 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Af

Malonil Glicitina 2,57 ± 0,42 Bb 4,07 ± 0,03 Ac 5,12 ± 0,19 Ac

Malonil Genistina 0,00 ± 0,00 Cd 3,82 ± 0,12 Bc 8,96 ± 0,33 Ab

Acetil Daidzina 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Af

Acetil Glicitina 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Af

Acetil Genistina 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Af

Daidzeína 3,71 ± 0,18 Ba 8,28 ± 0,04 Ab 8,63 ± 0,20 Ab

Gliciteína 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Ad 0,00 ± 0,00 Af

Genisteína 3,66 ± 0,10 Ba 16,28 ± 0,06 Aa 15,45 ± 0,39 Aa

Isoflavona total 11,48 B 36,92 A 49,4 A1 Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas linhas e minúsculas nas colunas, não são

significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05).

2 Não foram detectadas isoflavonas na cultivar BRS 267.

A detecção de daidzeína e genisteína nas diferentes cultivares pode ter ocorrido devido à

ação da enzima beta-glicosidase, que hidrolisa as isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina),

126

transformando-as em suas formas agliconas (Matsuura et al. 1995). A ativação dessa enzima pode

ter sido causada pelo dano mecânico durante a retirada das vagens das plantas, ou mesmo, durante a

extração das isoflavonas, quando as sementes foram moídas para o preparo da farinha

desengordurada.

6.3.2. Preferência alimentar de Euschistus heros por vagens de diferentes cultivares de soja

Em teste com chance de escolha as fêmeas de E. heros apresentaram preferência alimentar

por vagens de soja (R6) da cultivar BRS 267, com tempo de alimentação significativamente maior

que nas demais (50,4 minutos), na cultivar IAC-100 o tempo foi de 33,3 minutos, superior à BRS

213 e BR 16 (Fig. 6.3). No teste sem chance de escolha não foi observada diferença significativa no

tempo de alimentação entre as cultivares BRS 267, BRS 213 e BR 16; já na cultivar IAC-100 os

percevejos apresentaram o menor tempo de alimentação (96,9 min.) (Fig. 6.3).

127

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

BRS-267 BRS-213 BR-16 IAC-100

Cultivares de soja

Tem

po

méd

io d

e al

imen

taçã

o

(min

uto

s)

Com escolha

Sem escolha

Figura 6.3. Tempo médio (± EP) de alimentação de fêmeas de Euschistus heros em vagens de

diferentes cultivares de soja, em testes com e sem chance de escolha. Médias seguidas pela mesma

letra entre os tratamentos, não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05).

No teste com chance de escolha, a preferência alimentar de E. heros por vagens de soja

`BRS 267´ pode estar relacionado ao fato de esta cultivar apresentar níveis maiores de açúcares que

as demais cultivares testadas. Carrão-Panizzi et al. (2006) relata que esta cultivar apresenta

concentração maior de sacarose, o que lhe confere sabor adocicado característico. Esta característica

pode ter um efeito fagoestimulante para os insetos (Tester 1977). Adicionalmente, observou-se

através da análise do perfil químico das vagens, que a cultivar `BRS 267´ apresenta concentrações

maiores de voláteis do que as outras cultivares analisadas; a mistura desses voláteis também foi

a

a

c c

b

b

aa

128

atrativa aos insetos (ver Capítulo 5). Portanto, esses fatores associados podem ter contribuído para a

maior preferência alimentar de fêmeas de E. heros nesta cultivar de soja.

Embora a cultivar IAC-100 seja relatada como resistente a percevejos (Rossetto et al.1995),

no presente estudo observou-se tempo de alimentação maior nesta cultivar do que nas cultivares

BRS 213 e BR 16, em teste com chance de escolha, indicando que outros fatores podem estar

envolvidos no processo de seleção de alimento pelos percevejos.

Entretanto, no teste sem chance de escolha o tempo de alimentação de E. heros na cultivar

IAC-100 foi significativamente menor do que nas demais cultivares avaliadas. Como observado

anteriormente, esta cultivar de soja apresenta concentrações maiores de isoflavonas, sugerindo que

esses compostos podem ter causado a menor preferência alimentar de E. heros. Efeito deterrente de

alimentação causado pelas isoflavonas (genistina e daidzina) foi observado em Nezara viridula (L.)

(Heteroptera: Pentatomidae) (Toledo et al. 2006) e acredita-se que a concentração alta de daidzina

nas sementes de soja pode ser um dos fatores de resistência a insetos (Carrão-Panizzi & Kitamura

1995). No presente estudo, a cultivar IAC-100 apresentou concentração maior de daidzina do que as

demais cultivares analisadas.

Adicionalmente, as características físicas da cultivar IAC-100 também podem ter

influenciado na resposta alimentar dos percevejos, pois as vagens apresentam densidade maior de

tricomas e, isto tem sido relatado como um fator que dificulta a alimentação dos percevejos (Panizzi

1991). Não foi observada preferência alimentar significativa dos percevejos pela cultivar BR 16,

embora esta cultivar seja considerada suscetível aos insetos (Piubelli et al. 2003).

129

6.3.3. Oviposição de Euschistus heros sobre vagens de diferentes cultivares de soja

A oviposição de E. heros em diferentes cultivares de soja foi variável. As fêmeas

depositaram 60% das posturas nas vagens de soja `BRS 267´ demonstrando preferência

significativa por esta cultivar, seguida das cultivares BRS 213 (27,3%), BR 16 (8,85) e IAC-100

(3,9) (Fig. 6.4).

Quando foram oferecidas simultaneamente, vagens de soja com características físicas e

químicas diferentes, os insetos preferiram ovipositar na cultivar de soja BRS 267. Características

físicas das vagens como tamanho e densidade de tricomas, podem ter influenciado na resposta dos

percevejos, ao contrário da cultivar menos aceita (ÌAC-100´), que possui vagens menores e com

densidade maior de tricomas, sendo esses mais ríspidos, o que pode dificultar na fixação dos ovos

pelos percevejos. Ihsan-ul-Had et al. (2003) demonstraram que características morfológicas, como

área foliar e densidade de tricomas influenciam no comportamento de infestação de diferentes

espécies de insetos-praga da soja, determinando o nível de resistência ou suscetibilidade da planta

ao ataque pelos insetos.

Os resultados indicam que vagens de soja da cultivar BRS 267 foram preferidas pelas

fêmeas de E. heros. Resultados anteriores (ver Capítulo 5) demonstraram que extratos químicos

obtidos das vagens desta cultivar apresentam efeito condicionante de oviposição para E. heros, o

que reforça o potencial de uso desta cultivar de soja na manipulação do comportamento de

oviposição de percevejos fitófagos em laboratório, facilitando a manutenção de colônias de

percevejos e, posssivelmente no campo como planta armadilha.

130

0

20

40

60

80

100

BRS-267 BRS-213 BR-16 IAC-100

Cultivares de soja

Nú

mer

o m

édio

de

po

stu

ras

(%)

Figura 6.4. Porcentagem média (± EP) de posturas de Euschistus heros depositadas em vagens de

diferentes cultivares de soja. Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente

diferentes pelo teste de Tukey (P < 0,05).

a

b

cd

131




Boué, S.M., B.Y. Shih, C.H. Carter-Wientjes & T.E. Cleveland. 2003. Identification of volatile

compounds in soybean at various developmental stages using solid phase microextraction. J.

Agr. Food Chem. 51: 4873-4876.



Carrão-Panizzi, M.C. 1996. Avaliação de cultivares de soja quanto aos teores de isoflavonas.

Pesq. Agrop. Brasil 31: 691-698.

Carrão-Panizzi, M.C., K. Kitamura, A.D.P. Beléia & M.C.N. Oliveira. 1998. Influence of

growth locations on isoflavone contents in Brazilian soybean cultivars. Breeding Sci, 48: 409-

413.



Agrop.Brasil. 34: 1787-1795.

132

Carrão-Panizzi, M.C., A.E. Pípolo, L.A. Almeida, J.M.G. Mandarino, M. Kaster, C.A.A.

Arias, G.E.S. Carneiro, J.F.F.Toledo, L.C. Miranda, J.T. Yorinori, W.P. Dias, A.M.R.

Almeida, L.A. Domit, V.T. Benassi, N.E. Arantes, A.C.B. Oliveira, R.L. Brogin, E.S.

Lambert, P.F. Bertagnolli, M.A.S. Rangel & P.I.M. Souza. 2006. BRS 267: cultivar de soja

para alimentação humana. In Reunião de pesquisa de soja da região central do Brasil, 28,

Uberaba. MG., p. 315-317.

Castiglioni, V. 2006. Nova soja de sabor suave. A Lavoura, 109: 12-13.

Eldridge, A.C., L.T. Black & W.J. Wolf. 1979. Carbohydrate composition of soybean flours,

protein concentrates, and isolates. J. Agr. Food Chem. 27: 799-802.

Fan, J.T. & J.H. Sun. 2006. Influences of host volatiles on feeding behaviour of the Japanese pine

sawyer, Monochamus alternatus. J. Appl. Entomol. 130: 238-244.

Gilman, D.F., R.M. McPherson, L.D. Newsom, D.C. Herzog & C. Williams. 1982. Resistance in

soybeans to the southern green stink bug. Crop Sci. 22: 573-576.

Grunwald, C. & M. Kogan. 1981. Sterols of soybeans differing in insect resistance and maturity

group. Phytochemistry 20: 765-768.



133

Hou, A., P. Chen, A. Shi, B. Zhang & Y.J. Wang. 2008. Sugar variation in soybean seed assessed

with a rapid extraction and quantification method. Inter. J. Agron. 2009: 1-8.

Hymowitz, T. & F.I. Collins. 1974. Variability of sugar content in seed of Glycine max (L.) Merril

and G. soja Sieb and Zucc. Agron. J. 66: 239-240, 1974.

Hymowitz, T., F.I. Collins, J. Panczner & W.M. Walker. 1972. Relationship between the content

of oil, protein, and sugar in soybean seed. Agron. J. 64: 613-616.

Ihsan-ul-Had, M.A., S.A. Kakakhel & M.A. Khokhar. 2003. Morphological and physiological

parameters of soybean resistance to insect pests. Asian J. Plant Sci. 2: 202-204.

Ikeda T., N. Enda, A. Yamane, K. Oda & T. Toyoda. 1980. Attractants for the Japanese pine

sawyer, Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae). Appl. Entomol. Zool. 15:

358-361.

Jones, W.A. & M.J. Sullivan. 1978. Susceptibility of certain soybean cultivars to damage by stink

bugs. J. Econ. Entomol. 71: 534-536.



55: 2227-2233.

134

Liu, S.H., D.M. Norris & P. Lyne. 1989. Volatiles from the foliage of soybean, Glycine max, and

lima bean, Phaseolus lunatus: their behavioral effects on the insects Trichoplusia ni and

Epilachna varivestis. J. Agr. Food Chem. 37: 496-501.

MacLeod, G. & J. Ames. 1988. Soy flavor and its improvement. CRC Critical Reviews in Food

Sci. Nutr. 27: 219-243.

Matsuura, A., J. Sasaki & S. Murao. 1995. Studies on β-glucosidases from soybeans that

hydrolyse daidzin and genistin: isolation and characterization of an isozyme. Biosc. Biotech.

Biochem. 59: 1623-1627, 1995.

Moraes, M.C. B., R. Laumann, E.R. Sujii, C. Pires & M. Borges. 2005. Induced volatiles in

soybean and pigeon pea plants artificially infested with the Neotropical brown stink bug,

Euschistus heros, and their effect on the egg parasitoid, Telenomus podisi. Entomol. Exp. Appl.

155: 227-237.

Nelson, N.A. 1944. Photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose.

J. Biol. Chem. 153: 375-380.

Panizzi, A.R. 1991. Ecologia nutricional de insetos sugadores de sementes. In Panizzi, A.R. &

J.R.P. Parra (eds.). Ecologia nutricional de insetos e suas implicações no manejo de pragas.

Manole, São Paulo, Brasil, 359 p.

135

Panizzi, A.R. & E.D.M. Oliveira. 1998. Performance and seasonal abundance of the Neotropical

brown stink bug, Euschistus heros nymphs and adults on a novel food plant (pigeonpea) and

soybean. Entomol. Exp. Appl. 88: 169-175.

Panizzi, A.R., J.E. McPherson, D.G. James, M. Javahery & R.M. McPherson. 2000. Stink bugs

(Pentatomidae). In Schaefer, C.W. & A.R. Panizzi (eds.). Heteroptera of economic importance.

CRC Press, Boca Raton, Flórida, USA. 474 p.



Ecol. 31: 1509-1525.


J. Agr. Food Chem. 38: 1427-1430.




Rossetto, C.J., P.B. Gallo, L.F. Razera, N. Bertoletto, T. Igue, P.F. Medina, O. Tisselli Filho,

V. Aguilera, R.F.A.Veiga & J.B. Pinheiro. 1995. Mechanisms of resistance to stink bug

complex in the soybean cultivar ‘IAC-100’. An. Soc. Entomol. Brasil 24: 517-522.

136



Silva, F.A.C., A.R. Panizzi, R.A. Laumann, M.C.B. Moraes & M. Borges. 2007. Oviposição de

Euschistus heros (L.) (Heteroptera: Pentatomidae) em substrato artificial tratado com extrato

químico de soja. P. 115. In Resumos do V Encontro Brasileiro de Ecologia Química. Londrina,

PR.

Somogy, M. 1945. Determination of blood sugar. J. Biol. Chem. 160: 69-73.

Städler, E. 1992. Behavioral responses of insect to plant secondary compounds. In: Rosenthal,

G.A. & M.R. Berenbaum (eds.). Herbivores: their interactions with secondary plant metabolites,

vol. II. Academy Press, San Diego, USA, 256 p.

Stombaugh S.K., H.G. Jung, J. H. Orf & D.A. Somers. 2000. Genotypic and environmental

variation in soybean seed cell wall polysaccharides. Crop Sci. 40: 408-412.



Tester, C. 1977. Constituents of soybean cultivars differing in insect resistance. Phytochemistry 16:

1899-1901.

137

Toledo, A.M., C.B. Hoffmamnn-Campo, A.L. Boiça-Júnior, M.C. Salvador, S.H. Myakubo,

S.H. Silva & A.C.F. Mendes. 2006. Efeito de isoflavonóides no comportamento alimentar de

Nezara viridula (L.). P. 83. In Resumos do IV Congresso Brasileiro de Soja, Londrina, PR.

Tsukamoto, C. S., S. Shimada, K. Igita, S. Kudou, M. Kokubun, K. Okubo & K. Kitamura.

1995. Factors affecting isoflavone content in soybean seeds: changes in isoflavonas, saponins,

and composition on fatty acids at different temperatures during seed development. J. Agr. Food

Chem. 43: 1184-1192.

Wilcox, J.R. & R.M. Shibles. 2001. Interrelationships among seed quality attributes in soybean.

Crop sci. 41: 11-14.


138

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Para estabelecer uma criação de percevejos fitófagos em laboratório muitos fatores devem

ser avaliados, como recipientes de criação, dietas nutricionalmente balanceadas, substratos para

oviposição e condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos insetos imaturos e adultos.

Esses fatores associados podem garantir o sucesso de uma criação e, por esta razão, busca-se a

padronização de metodologias, que sejam eficazes e reduzam a mão-de-obra na manutenção de

colônias de percevejos em laboratório.

O uso do algodão hidrófilo para acomodar as posturas de diferentes pentatomídeos, facilita a

rotina de manutenção das colônias e favorece a obtenção de gerações sucessivas de insetos sadios e

de qualidade. Os mecanismos fisiológicos e comportamentais envolvidos na escolha do algodão

pelos percevejos não foram totalmente esclarecidos, mas há evidências de que mecanorreceptores

presentes na genitália participem deste processo. As fibras do algodão podem estimular estes

mecanoreceptores, desencadeando uma seqüência de comportamentos que termina com a

oviposição sobre o algodão. Estudos eletrofisiológicos e análises da seqüência comportamental de

fêmeas ovipositantes poderão esclarecer como os mecanoreceptores, presentes nas diferentes

espécies de pentatomídeos fitófagos, atuam sobre a oviposição.

O padrão de distribuição dos ovos na postura parece influenciar na escolha do local de

oviposição. Piezodorus guildinii, por exemplo, prefere substratos de forma alongada que acomodam

bem os ovos dispostos em duas linhas paralelas. Nezara viridula e Edessa meditabunda preferem

superfícies maiores e planas. Devido à grande variação no padrão de postura observada entre as

espécies de pentatomídeos, torna-se difícil selecionar um único substrato de oviposição, se forem

139

consideradas apenas a textura e a forma do substrato. Por isso, outras características atrativas devem

ser associadas para aumentar a aceitação do substrato pelos percevejos.

Extrato de vagens de soja da cultivar BRS 267 pode ser utilizado em associação com o

algodão, pois apresenta efeito condicionante de oviposição para Euschistus heros. Os voláteis

liberados pelas vagens de soja desta cultivar também atraem as fêmeas de E. heros. Surge, assim, a

perspectiva de outras aplicações práticas para os compostos voláteis desta cultivar, como o uso dos

compostos em iscas atrativas, para monitorar as fêmeas de percevejos no campo.

As fêmeas de E. heros apresentam preferência alimentar e de oviposição por vagens de soja

da cultivar BRS 267. Esses resultados indicam que as características químicas que são desejáveis

nas plantas de soja (sabor mais adocicado e menor teor de isoflavonas), visando sua

comercialização, podem interferir nos mecanismos de resistência da planta aos percevejos e por

isso, devem ser melhor investigadas. As diferenças observadas na composição química e na

resposta alimentar e de oviposição de E. heros nas diferentes cultivares de soja, abrem discussão

sobre o papel que os compostos voláteis, açúcares e isoflavonas desempenham nos mecanismos de

resistência da soja a esses insetos.

Por fim, o conjunto de resultados aqui apresentados sugere a potencialidade da manipulação

de substratos artificiais de oviposição para percevejos, associados com extratos químicos de sua

planta hospedeira principal, melhorando o processo de manutenção de colônias de percevejos em

laboratório, sem a necessidade de utilizar plantas in natura como locais para oviposição.

Documents

FATORES FÍSICOS E QUÍMICOS MEDIADORES DA OVIPOSIÇÃO DE