Fernando Henrique Carlos de Souza

Redução da reserva ovariana em pacientes adultas com

dermatomiosite

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Doutor em Ciências

Programa de Ciências Médicas

Área de Concentração: Processos Imunes e Infecciosos

Orientador: Prof. Dr. Samuel Katsuyuki Shinjo

Coorientador: Prof. Dr. Clovis Artur Almeida da Silva

SÃO PAULO

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Souza, Fernando Henrique Carlos de

Redução da reserva ovariana em pacientes adultas com dermatomiosite /

Fernando Henrique Carlos de Souza. -- São Paulo, 2015.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Ciências Médicas. Área de concentração: Processos Imunes e Infecciosos.

Orientador: Samuel Katsuyuki Shinjo.

Coorientador: Clovis Artur Almeida da Silva.

Descritores: 1.Hormônio antimülleriano 2.Dermatomiosite 3.Miosite 4.Fase

folicular 5.Folículo ovariano

USP/FM/DBD-070/15

Dedicatórias

À minha amada esposa, Bianca, companheira de

empreitada acadêmica que, com jeito especial de ser,

conseguiu tornar minha vida mais feliz e completa.

Ao meus pais, Marcos e Lore, por todos os porquês

respondidos, por me ensinar a sonhar e por ter sonhado junto

comigo, sempre com paciência e ternura.

À minha irmã Ana, pelas risadas e companheirismo.

À Janete, Ginel e Bruna, minha nova família.

Aos meus filhos, Eduardo e Júlia, por darem ainda mais

sentido à minha vida.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Samuel Katsuyuki Shinjo, meu orientador e amigo,

exemplo de médico e pesquisador. Por sorte ou destino, nossos caminhos

se cruzaram. Seu conhecimento e percepção do mundo enriqueceram-me,

fazendo com que essa caminhada fosse muito mais leve.

Ao Prof. Dr. Clovis Artur Almeida da Silva, meu co-orientador, que

em muito contribuiu por sua expertise nesta linha de pesquisa.

À Profa. Dra. Eloisa Bonfá, pelos ensinamentos, exemplos e

sugestões preciosas na confecção desta tese.

Ao Dr. Lucas Shiguehara Yamakami, Dr. Daniel Brito de Araújo e

Dra. Andrea Rocha de Saboia Mont’Alverne, companheiros e amigos desta

jornada.

À Dra. Vilma dos Santos Trindade Viana e à bióloga Elaine Pires

Leon, por terem realizado as análises laboratoriais com todo primor e

carinho.

À equipe de enfermagem, pela ajuda desde meus primeiros

momentos no Serviço de Reumatologia.

Aos professores, que encontrei durante minha formação e fazem

parte de mim.

À todas as pacientes do ambulatório de miopatias e voluntárias,

que participaram deste estudo, sem as quais nada seria possível.

À minha família por tudo o que significam e por toda a alegria que

me proporcionam.

E à todas as outras pessoas, anônimas a este trabalho, mas não à

minha vida...

Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP): 2011/15609-5 para Samuel K. Shinjo e 2011/12471-2 para Clóvis A.

Silva; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq):

301411/2009-3 para Edmund C. Baracat e 302724/2011-7 para Clóvis A. Silva; Núcleo de

Apoio à Pesquisa “Saúde da Criança e do Adolescente” da Unversidade de São Paulo

(USP) (NAP-CriAd-SP) para Clóvis A. Silva.

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no

momento desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de

Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações,

teses e monografias. Elaborado por Annelise Carneiro da Cunha, Maria

Julia de A.L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão,

Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3ª ed. São Paulo. Divisão de

Biblioteca e Documentação: 2011.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Abstract

1. Introdução..................................................................................................

1.1. Dermatomiosite.....................................................................................

1.2. Função gonadal em doenças reumáticas.............................................

1.3. Reserva ovariana em doenças reumáticas...........................................

1.4. Falência ovariana precoce em doenças reumáticas.............................

1 2

3

4

7

2. Objetivos.................................................................................................... 9

3. Pacientes e Métodos................................................................................. 10

3.1. Pacientes.............................................................................................. 10

3.2. Métodos................................................................................................ 11

3.3. Análise Estatística................................................................................ 16

4. Resultados................................................................................................. 17

5. Discussão................................................................................................... 21

6. Conclusão.................................................................................................. 23

7. Referências................................................................................................ 24

Anexos

Lista de Abreviaturas

DM

PM

MCI

ELISA

MII

Dermatomiosite

Polimiosite

Miopatias por corpos de inclusão

Ensaio de imunoadsorção ligado à enzima

Miopatias inflamatórias idiopáticas

FSH Hormônio folículo estimulante

LH Hormônio luteinizante

HAM Hormônio anti-mülleriano

CFA Contagem de folículos antrais

LES Lúpus eritematoso sistêmico

Anti-CoL Anticorpo anti-corpo lúteo

CFF

CPK

Ciclofosfamida intravenosa

Creatinofosfoquinase

MTX Metotrexato

VHS Velocidade de hemossedimentação

PCR Proteína C-reativa

FOP Falência ovariana prematura

MMT Manual muscle testing

VAS Visual analog scale

HAQ Health assessment quality

Lista de Tabelas

Tabela 1- Características demográficas, laboratoriais, dados da doença, características ginecológicas e tratamento medicamentoso prévio em pacientes com dermatomiosite e controles saudáveis...........................................................

Tabela 2-

Dados da reserva ovariana e anticorpo anti-corpo lúteo em pacientes com dermatomiosite e controles saudáveis ........

Resumo

Souza FHC. Redução da reserva ovariana em pacientes adultas com

dermatomiosite [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de

São Paulo; 2015

Objetivo: Avaliar os marcadores de reserva ovariana e anticorpos anti-corpo

lúteo (anti-CoL) em pacientes com dermatomiosite (DM). Métodos: Todos

as 40 pacientes do sexo feminino com DM, idade entre 18 e 42 anos, foram

convidadas a participar. Os critérios de exclusão foram uso de contraceptivos

hormonais nos últimos seis meses (n=13), associação de neoplasia (n=3),

doenças autoimunes sistêmicas sobrepostas (n=3), gravidez atual (n=2),

cirurgia ginecológica (n=1) e não concordância em participar do estudo

(n=2). Dezesseis pacientes com DM e 23 controles saudáveis selecionados

para participar deste estudo transversal foram avaliados na fase folicular

precoce do ciclo menstrual. Anti-CoL IgG (immunoblotting), hormônio folículo

estimulante (FSH), estradiol, inibina B, níveis séricos do hormônio anti-

mülleriano (HAM) (ELISA) e contagem de folículos antrais (CFA) por

ultrassonografia foram determinados. Resultados: Pacientes e controles

tiveram média de idade, etnia e classe socioeconômica comparáveis

(P>0,05). A média de idade das pacientes foi de 29,1±4,7 anos e duração da

doença de 5,6±3,2 anos. O ciclo menstrual, comorbidade e estilo de vida

foram semelhantes em ambos os grupos (P> 0,05). HAM≤1ng/mL (P=0,027)

e número da CFA (P=0,017) foram significativamente reduzidos em

pacientes com DM quando comparados ao grupo controle, enquanto que

níveis séricos de estradiol (P

Abstract

Souza FHC. Reduction of ovarian reserve in adult patients with

dermatomyositis [Thesis]. São Paulo: "Faculdade de Medicina, Universidade

de São Paulo"; 2015

Objectives: To assess ovarian reserve markers and anti-corpus luteum

(anti-CoL) antibodies in dermatomyositis (DM) patients. Methods: All 40

female patients with DM, aged between 18 and 42 years, were invited to

participate. Exclusion criteria were hormonal contraceptive use in the last six

months (n=13), neoplasia associations (n=3), overlapped systemic

autoimmune diseases (n=3), current pregnancy (n=2), gynecological surgery

(n=1) and did not agree to participate of this study (n=2). Sixteen DM

patients and 23 healthy controls were evaluated at early follicular phase of

menstrual cycle were selected to participate in this cross-sectional study. IgG

anti-CoL (immunoblotting), follicle stimulating hormone (FSH), estradiol,

inhibin B, anti-müllerian hormone (AMH) serum levels (ELISA) and

sonographicantral follicle count (AFC) was determined. Results: DM patients

and controls had comparable mean age, ethnicity and socioeconomic class

(P>0.05). DM mean age of onset was 29.1±4.7 years and disease duration

of 5.6±3.2 years. The menstrual cycles, comorbidity and life style were

similar in both groups (P>0.05). AMH≤1ng/mL (P=0.027) and number of the

AFC (P=0.017) were significantly reduced in DM patients when compared to

control groups, whereas serum estradiol level (P

Introdução

1

1.1. Dermatomiosite

As miopatias inflamatórias idiopáticas são um grupo heterogêneo de

doenças autoimunes sistêmicas associadas à alta morbidade e incapacidade

funcional.1 Considerando as características epidemiológicas, clínicas e

histopatológicas, as miopatias inflamatórias idiopáticas podem ser

classificadas em dermatomiosite (DM), DM juvenil, polimiosite, miosite por

corpos de inclusão, entre outras.1

A DM é uma caracterizada pela presença de fraqueza muscular proximal

simétrica dos membros, além de lesões cutâneas típicas, como heliotrópo e

pápulas / sinal de Gottron.1

A incidência anual de DM é de aproximadamente 0,5 a 8,4 casos /

milhão de habitantes, acometendo predominantemente indivíduos do sexo

feminino, na faixa etária de 45 a 55 anos, e nas crianças e adolescentes,

entre 10 e 15 anos.1,2

A causa da DM é desconhecida, mas acredita-se ser multifatorial,

envolvendo interação de fatores genéticos e ambientais. Nesse sentido,

infecções (tratos respiratório e gastrointestinal), imunodeficiências e outros

fatores ambientais (medicamentos, agentes biológicos - vacinas, citocinas,

hormônios, exposição ocupacional) atuariam em indivíduos geneticamente

predispostos, favorecendo alterações nos mecanismos imunorreguladores

responsáveis pelas manifestações da DM. Além disso, a presença de

linfócitos no tecido muscular da maioria dos pacientes, autoanticorpos

Introdução

2

miosite-específicos ou miosite-associados na circulação ou nas células

endoteliais de vasos sanguíneos, detectados nas biópsias musculares,

sugerem fortemente o envolvimento de processos imunológicos na

patogênese da DM comprometendo a função muscular.1,2

Embora o tecido muscular estriado esquelético seja o alvo principal na

DM, sua manifestação pode se acompanhar frequentemente por

comprometimento de tecidos e/ou órgãos, como resultado de processos

inflamatórios sistêmicos. No caso da DM, por exemplo, dentre as

manifestações extramusculares podemos encontrar acometimento

cardiorrespiratório, do trato gastrointestinal, articular e/ou cutâneo.

1.2. Função gonadal em doenças reumáticas

Apesar da DM acometer predominantemente mulheres não existe, até o

momento, relatos de eventual comprometimento da função gonadal como

consequência de mecanismos inflamatórios ligados à doença, ao regime

terapêutico ou à autoimunidade.

Em relação a disfunção gonadal nas doenças autoimunes sistêmicas, há

várias evidências que tais pacientes sejam mais susceptíveis ao

desenvolvimento de alterações menstruais e amenorréia, em decorrência de

diversos fatores que incluem: atividade da doença, terapia com

corticosteroides e / ou imunossupressores (particularmente ciclofosfamida e

Introdução

3

clorambucil) e ainda, possivelmente, mecanismos autoimunes de agressão

direta ao tecido ovariano.2-6

Assim sendo, conforme estudo prévio do nosso grupo, pacientes com

lúpus eritematoso sistêmico (LES) juvenil apresentam maior incidência de

disfunção sexual, menarca atrasada e frequência maior de anormalidades

menstruais em relação aos controles saudáveis pareados por idade e raça.3-6

Além disto, a amenorreia é evidenciada em aproximadamente 12% das

pacientes com LES juvenil.7 Com relação às miopatias inflamatórias

idiopáticas, foi observado em trabalho recente que pacientes com DM juvenil

apresentam também atraso da menarca e baixa reserva folicular.8 A

inexistência de estudos similares na literatura não permite, no entanto,

estender esses achados às miopatias inflamatórias idiopáticas. O fato da DM

afetar mulheres em idade reprodutiva aumentou a preocupação sobre o

impacto desta doença inflamatória crônica autoimune na reserva ovariana e

fertilidade futura.

1.3. Reserva ovariana em doenças reumáticas

Reserva ovariana é um termo utilizado para descrever o potencial

funcional dos ovários. É determinada pelo tamanho do pool de folículos

ovarianos e qualidade dos seus oócitos.9,10 O tamanho deste pool de folículos

é estabelecido precocemente, ainda durante a vida fetal feminina.

Aproximadamente na 5ª semana de gestação, células germinativas migram

Introdução

4

para as cristas gonadais, iniciando o desenvolvimento ovariano. Ocorre então

uma intensa multiplicação mitótica das células germinativas, gerando as

oogônias que, por sua vez, originarão os oócitos primários. Cada oócito é

rodeado por células somáticas, formando os chamados folículos primordiais.

Ao nascimento, cerca de um milhão de oócitos estão presentes nos ovários.

Este número diminui durante a infância, resultando num pool de 300000 a

500000 folículos primordiais na menarca. Ao longo da vida, estes entram em

crescimento, sendo que a maioria sofrerá atresia, a menos que sejam

recrutados pelo hormônio folículo estimulante (FSH), o que ocorrerá apenas

após a ativação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal na puberdade. Entre o

grupo de folículos recrutados, somente um torna-se dominante e ovulará sob

a influência do hormônio luteinizante (LH). Este processo continua por toda a

vida, até a exaustão do pool de folículos primordiais, resultando na

menopausa.11

A determinação dos níveis séricos de FSH, LH e estradiol tem sido

classicamente utilizada para a avaliação da função gonadal em mulheres.

Entretanto, sabe-se atualmente que os níveis de tais hormônios na

circulação sanguínea pouco refletem a dinâmica folicular, visto não existir

forte correlação com a população de folículos primordiais, os quais tem sido

considerados como representantes da reserva funcional ovariana.9-11

Atualmente, os dois exames considerados como melhores marcadores de

reserva ovariana em mulheres pré-menopausadas são: inibina B e hormônio

Introdução

5

anti-mülleriano (HAM),12-15 assim como a contagem ultrassonográfica de

folículos antrais.

A inibina B é produzida pelas células da granulosa de pequenos

folículos antrais em desenvolvimento. É marcador direto da atividade

ovariana e mantém relação com o número de oócitos obtidos. Na

perimenopausa, há redução precoce e significativa dos níveis de inibina B

associada à elevação dos níveis séricos de FSH com manutenção dos níveis

de estradiol, sendo assim considerada um útil marcador endócrino.16-18

Já o HAM foi inicialmente identificado como um fator que leva à

regressão dos ductos müllerianos no embrião do sexo masculino. É um

hormônio glicoproteico da superfamília dos fatores de crescimento de

transformação beta, expresso nos ovários de fetos do sexo feminino a partir

da 36ª semana de vida intrauterina e com maiores concentrações a partir da

puberdade.15 Em mulheres o HAM é produzido por células da granulosa de

folículos pré-antrais e pequenos folículos antrais, atuando como modulador

do próprio recrutamento folicular e, também, na regulação da

esteroidogênese, determinando o crescimento dos folículos primordiais, além

de estar envolvido no recrutamento de folículos antrais sensíveis ao FSH.15

Considerando que o HAM é produzido somente por folículos ovarianos

em crescimento, estimando assim a quantidade e a atividade das unidades

recrutáveis de um pool inicial de folículos em estágios precoces de

maturação, os seus níveis séricos têm sido usados como o marcador sérico

mais fidedigno para a predição da reserva ovariana.9-15 Contrapondo-se ao

Introdução

6

FSH, inibina B e estradiol, o HAM apresenta, ainda, a vantagem da reduzida

variabilidade de suas concentrações séricas ao longo do ciclo menstrual,11,12

o que lhe confere uniformidade na avaliação e maleabilidade quanto ao

momento de dosagem.

Um outro método não invasivo para avaliação da reserva ovariana é a

contagem ultrassonográfica dos folículos antrais (CFA). Embora o

reconhecimento de seu valor não seja unânime, estudos mostram que a CFA

apresenta nítida correlação positiva com as concentrações dos marcadores

séricos conhecidos, principalmente o HAM.9,15

1.4. Falência ovariana precoce em doenças reumáticas

Estudos sobre alterações da função ovariana têm demonstrado

incidência aumentada de falência ovariana precoce em pacientes com LES

associada à terapia imunossupressora, sendo amenorreia persistente a

manifestação mais comum.19 No entanto, há uma vertente de pensamento

implicando mecanismos autoimunes na lesão ovariana (ooforite autoimune)

que se manifesta por menopausa precoce ou falência ovariana precoce.20

Este distúrbio consiste de síndrome caracterizada por amenorreia secundária,

hipergonadotrofinemia e hipoestrogenemia em mulheres com idade inferior a

40 anos de idade.21 Na maioria dos casos, a causa da disfunção ovariana

prematura não é conhecida, apontando a possibilidade do envolvimento de

mecanismos autoimunes na patogênese. Corroborando-se com este dado,

Introdução

7

observou-se que 39% dos casos com falência ovariana prematura estão

associados a diversas doenças autoimunes (doenças da glândula tireoide,

síndrome de Sjögren, anemia hemolitica autoimune).22-24 Além disso, a

associação temporal entre a presença de autoanticorpos com especificidade

a antígenos ovarianos e falência ovariana prematura tem sido evidenciada

em pacientes com doenças autoimunes como o LES.25 Posteriormente,

estudo realizado no nosso grupo evidenciou que 22% das mulheres adultas

com LES apresentaram um anticorpo específico a uma proteina de 67 kDa do

corpo lúteo de ovário (CoL) que, por sua vez, foi associado com

irregularidades menstruais e níveis elevados de FSH, inserindo o anti-CoL

como marcador precoce de disfunção ovariana.26

A ausência de estudos em mulheres adultas com DM avaliando reserva

ovariana e a possível associação com a presença do anti-CoL com esses

novos marcadores de disfunção gonadal, motivou-nos à realização da

presente estudo.

Objetivos

8

Os objetivos do presente estudo são:

1. Avaliação global da reserva ovariana em pacientes com DM.

2. Verificar possível associação entre os marcadores de reserva ovariana e a

presença do anti-CoL em pacientes com DM.

Pacientes e Métodos

9

3.1. Pacientes

Desenho do estudo e população avaliada. Trata-se de um estudo

transversal realizado entre março de 2011 e dezembro de 2012, com

pacientes do sexo feminino e diagnóstico de DM, segundo os critérios

classificatórios de Bohan e Peter.34 Estas pacientes estavam em

acompanhamento regular no ambulatório de Miopatias Inflamatórias do

Serviço de Reumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo (HC/FMUSP) - São Paulo. O grupo controle

incluiu mulheres saudáveis e selecionadas no mesmo período, através de

convites verbais e de cartazes colocados no HC/FMUSP e em Unidades

Básicas de Saúde da região de Pinheiros - São Paulo.

O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de

Projetos de Pesquisa da Diretoria Clínica do Hospital das Clinicas e da FMUSP

(CAPPesq - nº 0325/11).

Critérios de inclusão. Mulheres entre 18 e 42 anos com DM.

Critérios de exclusão. Para pacientes com DM e mulheres do grupo

controle: gestação ou lactação no momento do estudo; uso de

contraceptivos hormonais naqueles últimos seis meses; histórico de cirurgia

ou neoplasia ginecológica; presença de outras doenças autoimunes

sistêmicas; não concordância em participar do estudo; avaliação gonadal

incompleta.

Pacientes e Métodos

10

Após a aplicação dos critérios de inclusão, a população selecionada foi

constituída de 40 mulheres com DM. Destas, 24 foram excluídas por: uso de

contraceptivo hormonal (n = 13), não concordância em participar do estudo

(n = 2), doenças autoimunes associadas (n = 3), gestação atual (n = 2),

cirurgia ginecológica (n = 1) e neoplasia (n = 3).

Desta forma, o estudo foi realizado através de 16 pacientes com DM, as

quais foram comparadas com as 23 mulheres saudáveis.

3.2. Métodos

Dados demográficos e parâmetros gerais. Foram avaliadas idade

atual, etnia, classe socioeconômica (classificada como A, B, C, D ou E, de

acordo com o critério proposto pela Associação Brasileira de Anunciantes e

Associação Brasileira dos Institutos de Pesquisa de Mercados).35

Avaliação clínica, laboratorial e tratamento medicamentoso

das pacientes com DM. Revisão sistemática dos prontuários eletrônicos

com os dados previamente padronizados e parametrizados das pacientes

foram revisados, incluindo dados clínicos, laboratoriais e terapêuticos. A

idade de início da doença e o tempo de duração da mesma foram calculados

levando-se em consideração o começo das manifestações clínicas atribuídas

à DM.

No momento da realização do exame ultrassonográfico e da coleta de

sangue foi avaliada a atividade da doença através da aplicação dos seguintes

Pacientes e Métodos

11

questionários e escores: avaliação da força muscular através do Manual

muscle testing (MMT),36 avaliação global da doença pelo médico e paciente

através da escala visual analógica (EVA) e Health assessment questionnaire

(HAQ);37

Avaliações laboratoriais foram realizadas no início da doença utilizando

métodos automatizados. Incluíram determinação dos níveis séricos de

creatinofosfoquinase (CPK) (referência: 24-173 U/L) e aldolase (referência:

1,0-7,5 U/L).

Os seguintes anticorpos foram investigados: anti-Jo-1 (histidil-), anti

PL-7 (-treonil), anti-PL-12 (alanil-), anti-EJ (glicol), anti-Jo (isoleucil-RNAt-

sintetase), anti-SRP (partícula de reconhecimento de sinal) e anti-Mi-2,

utilizando-se kit de teste de blot (Euroline Blot, Euroimmun, Lübeck,

Alemanha). Utilizou-se o protocolo do fabricante e os resultados foram

analisados conforme trabalho previamente publicado.38

Foram estudadas as medicações utilizadas para o tratamento da DM

(corticosteroides, metotrexato, azatioprina, ciclosporina, ciclofosfamida,

micofenolato de mofetila, leflunomida, imunoglobulina intravenosa humana e

rituximabe), dose cumulativa de corticosteroide, bem como a dose destas

medicações no momento da realização dos exames.

Avaliação ginecológica. Em todas as pacientes e controles foi

realizado o exame ginecológico completo no Centro de Reprodução Humana

do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do HC/FMUSP - São Paulo. As

participantes foram questionadas sobre a idade da menarca, com a qual foi

Pacientes e Métodos

12

calculado o tempo de duração do menacme (idade ginecológica), e também

orientadas a anotar os últimos três ciclos menstruais consecutivos. Ciclo

menstrual normal foi definido como aquele tendo um intervalo entre 25 e 35

dias com duração de três a sete dias de fluxo,3 com ciclos irregulares

correspondendo à alteração do intervalo e/ou duração. Os antecedentes

obstétricos basearam-se em informações das participantes e foram

confirmados em dados coletados nos prontuários.

Avaliação laboratorial da reserva ovariana. Amostras de sangue

foram coletadas na fase folicular inicial (entre o 2º e o 4º dias do ciclo

menstrual). Todos os soros foram centrifugados e armazenados a - 70 oC até

a análise. As dosagens de FSH, LH e estradiol foram realizados por

radioimunoensaio (Cobas®, Roche, Mannheim, Alemanha) e testados em

duplicata no Laboratório de Hormônios e Genética Molecular da FMUSP (LIM

42). Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio recomendados pelo

fabricante foram limitados a 5,7% e 3,6%, respectivamente. Considerou-se

concentração sérica de FSH elevada quando ≥ 10 UI/L (indicativa de baixa

reserva ovariana).39-41 A dosagem do HAM foi realizada no Laboratório de

Investigação Médica da Disciplina de Reumatologia da FMUSP (LIM 17),

através do ensaio de imunoadsorção ligado a enzima (AMH Gen II ELISA,

Beckman Coulter Inc., Brea, CA, Estados Unidos), em duplicata, nas 16

pacientes com DM e 23 controles. Os coeficientes de variação intra e inter-

análise foram limitados a 5,4% e 5,6% respectivamente. Posteriormente, o

HAM também foi dosado através de outro kit comercial (AMH/MIS AnshLabs

Pacientes e Métodos

13

ELISA, Estados Unidos), em duplicata, utilizando-se os soros armazenados

das 16 pacientes com DM e de 23 controles saudáveis (os soros de dois

controles não estavam mais disponíveis). Os coeficientes de variação intra e

inter-análise foram limitados a 3,1% e 2,7%, respectivamente. Níveis de

HAM < 1.0 ng/mL foram considerados como reduzidos conforme sugestão

dos fabricantes dos dois testes de ELISA.42,43

Avaliação ultrassonográfica da reserva ovariana. Uma

ultrassonografia transvaginal para CFA e medida do volume ovariano foi

realizada no mesmo dia da coleta de sangue (fase folicular inicial) somente

nas participantes que relatavam já ter tido relação sexual vaginal

previamente (16 pacientes com DM e 23 controles). Os exames foram

realizados por um mesmo observador, com transdutor endovaginal de 6,5

MHz (HD3, Philips Ultrasound, Bothell, WA, Estados Unidos), sem

conhecimento do grupo ao qual pertenciam as participantes e dos resultados

dos exames séricos colhidos. Os ovários foram medidos em três planos

perpendiculares e seus volumes calculados através da fórmula da elipsoide

(volume = diâmetro longitudinal x diâmetro anteroposterior x diâmetro

transversal x 0,523). O volume médio de ambos os ovários foi obtido para

cada participante. Para a CFA foram considerados folículos de 2 a 10 mm de

diâmetro médio.39 Os valores de CFA foram classificados da seguinte forma:

mais de 10 folículos (reserva ovariana normal), ≤ 10 folículos (reserva

ovariana baixa) e ≤ 5 folículos (reserva ovariana muito baixa).44

Pacientes e Métodos

14

Detecção do anti-CoL. A dosagem do anticorpo anti-corpo lúteo foi

realizada no Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de

Reumatologia da FMUSP (LIM 17), usando eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot como descrito por Pasoto et al.26

3.3. Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão para

variáveis contínuas paramétricas, medianas (interquatil 25% - 75%) para

variáveis contínuas não paramétricas, número (percentagem) para variáveis

categóricas. O teste t de Student foi utilizado para comparar médias ± desvio

padrão e o teste de Mann-Whitney para comparar medianas (interquatil 25%

- 75%). O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar diferenças entre

variáveis categóricas. O teste de Spearmann para avaliar correlação entre as

diferentes variáveis contínuas. Em todos os testes estatísticos, adotou-se o

nível de significância de 5% (P < 0,05).

Resultados

15

4. Resultados

A Tabela 1 descreve as características demográficas, os dados

ginecológicos das pacientes e controles. Inclui, ainda, os parâmetros

laboratoriais, de atividade da doença e tratamento prévio instuído.

A média da idade, no momento do estudo, foi similar em pacientes

com DM e controles (31,4 ± 6,8 vs. 33,4 ± 4,9 anos, P = 0,337), assim

como as frequências de caucasianos, classe socioeconômica C e D e hábitos.

(P > 0,05).

Não foram encontradas diferenças quanto à idade da menarca, idade

ginecológica, frequência de alterações menstruais de ambos os grupos (P >

0,05). (Tabela 1).

No momento do estudo, 68,8% das pacientes estavam usando

prednisona, com dose média de 6,3 mg/dia (0 - 18,8 mg/dia) e 75% pelo

menos um agente imunossupressor (azatioprina, metotrexato, ciclosporina

ou rituximabe). Os tratamentos até então instituídos estão demonstrados na

Tabela 1.

A Tabela 2 demonstra a comparação dos marcadores de reserva

ovariana e do anticorpo anti-CoL entre pacientes e controles.

A mediana do valor estradiol foi significativamente maior no DM

versus controles (P < 0,001). Os níveis séricos de FSH, inibina B e volume

ovariano foram semelhantes nos dois grupos (P > 0,05). Anti-CoL foi

observado em apenas uma paciente com DM.

Resultados

16

Observou-se uma correlação positiva entre os resultados obtidos com

os kits ELISA AMH Gen II e EUA AMH / MIS AnshLabs ELISA em pacientes

com DM (r = + 0,916, P < 0,001) e nos controles saudáveis (r = + 0,926, P

< 0,001). As frequências de HAM reduzidos (≤ 1ng/mL) foram

significantemente maiores nas pacientes com DM com os kits AMH Gen II

ELISA (13% vs. 50%, P = 0,027) e EUA AMH / MIS AnshLabs ELISA (13%

vs. 50%, P = 0,027) em relação aos controles. A mediana dos níveis de HAM

(Gen II ELISA) [1,3 (0,2 - 6,6) vs. 2,7 (0,1 - 6,6) ng/mL, P = 0,200 e (EUA

AMH / MIS AnshLabs ELISA) [1,5 (0,3 - 6,6) vs. 2,3 (0,3 - 6,6) ng/mL, P =

0,202] foi significantemente reduzida nas 16 pacientes com DM comparadas

aos 23 controles (Tabela 2).

Ainda em relação à reserva ovariana houve CFA (10,5 ± 5,6 vs. 17,3

± 10,7, P = 0,017) menor em pacientes. (Tabela 2).

Resultados

17

Tabela 1. Características demográficas, laboratoriais e clínicas; dados ginecológicos, e tratamento instituído em pacientes com dermatomiosite e controles saudáveis.

Variáveis DM

(n=16) Controles (n=23)

P

Idade atual (anos) 33,4 ± 6,8 31.4 ± 6,8 0,337

Etnia (branco) 13 (81,2) 14 (60,9) 0,175

Classe socioeconômica C ou D

Idade ao diagnóstico (anos)

Duração da doença (meses)

12 (75,0)

29,1 ± 4,7

5,6 ± 3,2

13 (43,5)

-

-

0,317

-

-

Tabagismo

Diabetes mellitus

0

1 (6,3)

1 (4,3)

0

0,255

0,398

Dados laboratoriais

Anticorpo antinuclear

Anticorpo anti Jo-1

Anti anti-Mi-2

Creatinofosfoquinase (U/L)

Aldolase (U/L)

Parâmetros da doença

MMT (0-80)

HAQ (0,00-3,00)

EVA do paciente (0-10 mm)

EVA do médico (0-10 mm)

14 (37,5)

5 (31,3)

2 (12,5)

117 (82-209)

5,3 (4,2-6,5)

80 (79-80)

0 (0,00-1,20)

1,2 (0,0-3,0)

1,5 (0,2-3,5)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Ciclos menstruais

Idade da menarca (anos) 11,5 (11-13) 12 (12-13) 0,343

Idade ginecológica (anos) 20,0 (17-24) 19 (14-24) 0,200

Duração do fluxo (dias) 4,0 (3-10) 5 (2-10) 0,223

Intervalo do fluxo (dias) 30 (15-40) 30 (15-35) 0,639

Tratamento prévio

Corticosteroides 16 (100,0) - -

Azatoprina 14 (87,5) - -

Antimaláricos

Metotrexato

Ciclosporina

IVIG

Rituximabe

Leflunomida

11 (68,8)

9 (56,3)

8 (50,0)

4 (25,0)

4 (25.0)

1 (6.3)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Valores expressos em n (%), média ± desvio padrão e mediana (interquatil 25% -75%). DM: dermatomiosite; MMT: manual muscle testing; HAQ: health assessment questionnaire; EVA: escala visual analógica IVIG: imunoglobulina intravenosa humana.

Resultados

18

Tabela 2. Marcadores de reserva ovariana e anti-CoL em pacientes com dermatomiosite e controles saudáveis.

Variáveis DM

(n=16)

Controles

(n=23) P

FSH, UI/L 6,2 ± 2,0 6,6 ± 3,8 0,617

Níveis elevados (> 10 UI/L) 2 (8,7) 2 (8,7) 0,778

Estradiol (pg/mL) 45 (29-126) 34 (24-128)

Discussão

19

Este foi o primeiro estudo na literatura que identificou uma diminuição

da reserva ovariana em pacientes com DM, em idade reprodutiva.

Para evitar condições que poderiam interferir com os testes de

avaliação da reserva ovariana, aplicamos critérios de seleção rigorosos em

nossas pacientes e controles. Desta forma, foram excluídas mulheres que

poderiam não estar em idade reprodutiva, cirurgias ginecológicas recentes,

gravidez ou lactação no momento do estudo, neoplasia e/ou doenças

autoimunes sistêmicas associadas. Além disso, o perfil hormonal ovariano

aqui descrito foi determinado sem o efeito de qualquer hormônio exógeno,

como uso de anticoncepcional oral ou injetável, por um período mínimo de

pelo menos seis meses e aguardando, também, o retorno de duas

menstruações consecutivas. Assim, estas duas condições, tempo e

menstruação, remeteram-nos a uma atividade ovariana normal e, portanto, a

um valor fidedigno de todos os hormônios, inclusive do HAM.

Além disto, realizamos uma avaliação completa da reserva ovariana em

pacientes com DM e mulheres saudáveis. Todas as avaliações foram

realizadas na fase folicular precoce do ciclo menstrual, o que proporcionou

uma estimativa mais acurada da reserva folicular. Neste período as

concentrações séricas de FSH, LH, estradiol e HAM, bem como a CFA,

apresentaram menor variabilidade inter e intraciclo menstrual.45,46

O efeito dos contraceptivos hormonais se baseia principalmente na

inibição da secreção das gonadotrofinas hipofisárias que resulta, em última

análise, na redução da atividade ovariana e inibição temporária dos níveis de

Discussão

20

estrógeno, inibina B, LH e FSH.47 De forma semelhante, estudos recentes

têm evidenciado que níveis reduzidos de HAM podem ser observados em

mulheres que utilizam contraceptivos hormonais.47,48

A concentração sérica do FSH é o método mais utilizado na avaliação

da reserva ovariana, porém apresenta variabilidade inter e intraciclo

menstrual, assim como o estradiol e a inibina B. Estes hormônios

apresentam, portanto, acurácia limitada no diagnóstico de baixa reserva

ovariana.48 Já, atualmente, os melhores testes de triagem para a reserva

ovariana são o HAM e ultrassonografia com CFA.48

Entretanto, os imunoensaios para medição do HAM têm mudado ao

longo dos anos. Assim sendo, não existe um padrão único para medição do

HAM.47 Relatórios recentes da possibilidade de níveis falsamente altos ou

baixos das medições por kits ELISA AMH Gen II47 nos motivou,

posteriormente, à ratificação dos valores pelos kits ELISA AMH / MIS

AnshLabs. Os kits mostraram forte correlação positiva que minimiza em

última análise a possibilidade de instabilidade dos valores encontrados,

sendo um aspecto relevante do presente estudo.

Ainda neste estudo, o achado de níveis reduzidos de HAM (≤ 1 ng/mL),

bem como o número mais baixo da AFC, sugere o diagnóstico de reserva

ovariana reduzida em nossos pacientes adultos com DM.

A reserva ovariana em doenças reumáticas autoimunes pode ser

influenciada por idade, tabagismo, status da doença.8,45 Pacientes e controles

na nossa casuística têm idades semelhantes e a frequência de tabagismo foi

Discussão

21

muito baixa, comparável nos dois grupos. Já a análise clínica e laboratorial

da atividade de doença dos pacientes com DM, revelou uma doença com

enzimas musculares, em sua maioria, dentro dos padrões de normalidade e

força muscular preservada.

A causa da diminuição na quantidade e / ou qualidade dos folículos

ovarianos pode estar relacionada à ooforite autoimune. O anti-CoL foi

evidenciado em 22% das mulheres adultas com LES e foi associado a

irregularidades menstruais e níveis elevados de FSH.26 Porém, em outro

estudo em adultos com LES, avaliados pelo mesmo parâmetro, o anti-CoL

não foi definido como um marcador de disfunção gonadal.49 Em relação ao

presente estudo, os anticorpos anti-CoL não influenciaram na reserva

ovariana baixa evidenciada em nossas pacientes.

Os imunossupressores, com destaque à ciclofosfamida, apresentam

impacto negativo na função reprodutiva, comprometendo a maturação e

destruindo os folículos primordiais.3 Podem alterar os ciclos menstruais,

levando a índices maiores de amenorreia e à redução da reserva ovariana,

particularmente no LES e DM juvenil.3,26,45,46 A dose cumulativa de

metotrexato também se associou com níveis reduzidos de HAM. 46 Altas

doses de drogas imunossupressoras podem ser correlacionadas com a

atresia folicular.46 No presente estudo todas as pacientes tiveram exposição,

a longo prazo, a vários agentes imunossupressores, corticosteroide e mais da

metade deles têm feito uso de metotrexato, mas nenhum foi tratado com

ciclofosfamida. Entretanto, a importância dos diversos medicamentos, no

Discussão

22

achado de reserva ovariana diminuída nas pacientes com DM, não foi

estabelecida em nosso trabalho, devido ao número limitado de pacientes.

O pequeno tamanho da amostra, aliás, é a principal limitação deste

estudo transversal, devido a rigorosos critérios de seleção em uma doença

rara. Além disso, a inclusão de pacientes exclusivamente a partir de um

centro de atendimento terciário pode superestimar a gravidade da DM, bem

como os efeitos adversos das diversas terapias utilizadas, não

representando, em última análise, as manifestações clínicas e laboratoriais

em relação à doença na população como um todo.

Assim sendo, o presente trabalho foi o primeiro a identificar uma

diminuição da reserva ovariana durante idade reprodutiva de pacientes com

DM.

Estudos longitudinais, multicêntricos e com expressiva população de DM

serão necessários para avaliar se atividade e tratamentos utilizados possam

causar prejuízo ao ovário e interferir na capacidade reprodutiva.

Conclusões

23

Como conclusões do presente estudo, temos:

1. Redução da reserva ovariana foi evidenciada em pacientes com DM.

2. A presença de anti-CoL não influenciou na reserva ovariana em pacientes

com DM.

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Folha_de_rosto[1].doc + fichaDedicatórias,_agradecimentos,_etc...[1]1-Introdução2-Objetivos3-Métodos4-Resultados5-Discussão6-Conclusões7-Referências