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Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Biologia Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA, 1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae) Lucas Leiva Zupolini Ribeirão Preto 2012 Monografia apresentada ao Departamento de Biologia, da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (USP), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA ... · costa – cegamente, inexoravelmente compelindo por um apoio. Rachel Carson, The Edge of the Sea (1955) ... dia em que

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Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Biologia

Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA,

1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae)

Lucas Leiva Zupolini

Ribeirão Preto – 2012

Monografia apresentada ao

Departamento de Biologia, da

Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão

Preto (USP), como parte dos

requisitos para a obtenção do

título de Bacharel em Ciências

Biológicas.

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Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Biologia

Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA,

1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae)

Lucas Leiva Zupolini

Orientador: Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi

Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto

Ribeirão Preto – 2012

Monografia apresentada ao

Departamento de Biologia, da

Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão

Preto (USP), como parte dos

requisitos para a obtenção do

título de Bacharel em Ciências

Biológicas.

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Zupolini, L.L.

“Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA, 1851

(Decapoda, Brachyura, Portunidae).”

vii+93p.

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.

Orientador: Pileggi, L.A.G.; Co-orientador: Mantelatto, F.L.M.

1. Arenaeus 2. Portunidae 3. Taxonomia 4. Sistemática Molecular 5.

Heterocronia

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“To understand the shore, it is not enough to catalogue its

life. Understanding comes only when, standing on a beach,

we can sense the long rhythms of earth and sea that

sculptured its land forms and produced the rock and sand of

which it is composed; when we can sense with the eye and

ear of the mind the surge of life beating always at its shores -

blindly, inexorably pressing for a foothold”

Para se compreender a costa, não é suficiente catalogar sua

vida. O entendimento só vem quando, em pé em uma praia,

podemos sentir os longos ritmos da terra e do mar que

esculpiram suas formas de relevo e produziram a rocha e a

areia do qual é composta; podemos sentir com os olhos e os

ouvidos da mente a onda de vida batendo sempre em sua

costa – cegamente, inexoravelmente compelindo por um

apoio.

Rachel Carson, The Edge of the Sea (1955)

“The diversity of organisms, similarities and differences

between kinds of organisms, patterns of distribution and

behavior, adaptation and interaction, all this was merely a

bewildering chaos of facts until given meaning by the

evolutionary theory”

A diversidade de organismos, similaridades e diferenças entre

as espécies de organismos, padrões de distribuição e de

comportamento, adaptações e interações, tudo isso era

meramente uma confusão caótica de fatos até lhes ser dado

significado pela teoria evolutiva.

Ernst Mayr, Animal Species and Evolution (1963)

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A todas as pessoas que seguiram comigo durante esse

percurso, especialmente à minha família e aos meus pais

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Agradecimentos

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Em primeiro lugar, agradeço ao Prof. Dr. Fernando L. M. Mantelatto pela oportunidade em

tomar contato com o meio acadêmico, com a rotina de um laboratório de Biologia Molecular e,

principalmente, com uma porção, mesmo que ínfima, da biodiversidade marinha de crustáceos. No

dia em que me foi perguntado se tinha preferência por alguma linha de pesquisa e respondi, sem

hesitar, que queria trabalhar com um grupo marinho, jamais tinha conhecimento que me seria

oferecida a chance de trabalhar com um dos grupos dos seres mais cativantes (mesmo que eles não

se considerem como tal) e ao mesmo tempo complexos. Agradeço ainda, pelo engajamento,

planejamento, preocupação (com material, coletas, prazos, bolsas e muito mais) e todo o momento

em que foi dedicado qualquer esforço a mim e ao projeto a mim inerente. Só não posso me esquecer

ainda, de agradecer por todas e quaisquer sugestões e discussões na elaboração e no andamento do

projeto e dos textos referentes a este, que muito me acrescentaram, não apenas para suas finalidades

imediatas, mas também por toda minha vida.

Agradeço ao meu orientador, Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi, por toda a confiança,

dedicação, preocupação e paciência a mim oferecidas ao longo desses meses. Por todas as vezes que

liguei ou mandei e-mails, muito frequentemente, desesperados, por não saber ligar o gás da

Molecular, do PCR que não saía, do alinhamento que me confundia, dos dados que pareciam

saturar, e mesmo assim, sempre fui recebido com um sorriso no rosto. A propósito, seu jeito alegre

me contagiou diversos momentos em que a preocupação com os empecilhos e os prazos me

consumiam a tranquilidade. Agradeço ainda por todos os ensinamentos, desde meu início na

molecular, nas análises dos resultados e nos procedimentos mais diversos. E também por todas as

discussões que, definitivamente, muito contribuíram à construção de minhas opniões. Muito

obrigado!

Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e ao grupo

Santander (processos CNPq nº 106440/2011-0 e PIBIC/Santander nº 2011.1.2786.59.4) pelos

auxílios financeiros concedidos a mim durante o período de realização do projeto. Também

agradeço aos projetos que proporcionaram todo o apoio financeiro e logístico, direta ou

indiretamente, para o desenvolvimento desta pesquisa junto ao LBSC (Laboratório de Bioecologia e

Sistemática de Crustáceos), concedidos ao e/ou coordenados do Prof. Dr. Fernando Mantelatto:

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – Processos nºs. 1998/07454-5

e 2002/08178-9 (Projetos Individuais de Pesquisa), 2010/50188-8 (Projeto Temático Biota),

2009/54931-0 (Projeto Coleções Científicas); à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES) – Processo nº. 315/2009 (Projeto Cooperação Internacional) 02630/2009–

5 (LGP Post-Doctoral fellowship); ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) – Processos nºs. 472746/2004-9, 471794/2006-6, 473050/2007-2,

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Agradecimentos

v

471011/2011-8 (Edital Universal, Auxílio Individual à Pesquisa), 491490/2004-6, 490122/2006-0,

490353/2007-0 (Projetos Cooperação Internacional); 301359/2007-5, 302748/2010-5

(Produtividade em Pesquisa).

Agradeço à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Riberião Preto (FFCLRP-USP) e ao

Departamento de Biologia pela infra-estrutura disponibilizada para execução do projeto, e ao

Instituto de Oceanografia (IO-Cananéia) pelo espaço e infra-estrutura oferecidos em parte das

coletas.

Agradeço, sinceramente, aos curadores, Ingo Wehrtmann (Universidad de Costa Rica),

Fernando Alvarez e José L. Villalobos (Universidad Autónoma Nacional de México), Luis Ernesto

Arruda Bezerra e Jesser F. de Souza-Filho (Universidade Federal de Pernambuco), que

disponibilizaram material emprestado para as análises e tornaram possível a realização do projeto.

Agradeço ainda a H. Boos, R.C. Costa, A. Castilho, J. Bolaños e T.M. Dawanso pela doação de

material, essencial no desenvolvimento deste trabalho, assim como também a F.L. Mantelatto, A.

Costa, D. Rosa, R. Robles, F. Carvalho, N. Rossi, I. Leone e R. Amaral pelo material coletado e a

todas as outras pessoas que auxiliaram nos procedimentos de coleta. Muito obrigado.

Ao Prof. Marcelo Pinheiro (UNESP - São Vicente) pelo auxílio na busca de literatura.

À Prof.ª Maria Helena de Souza Goldman (Laboratório de Biologia Molecular de Plantas –

FFCLRP/USP) e à Dr. Andréa Carla Quiapim pela disponibilidade em realizar parte dos

sequencimamentos e a execucação dos mesmos. Também à técnica Adga Facincani do

Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

(FCAV/UNESP), bem como ao próprio departamento citado, pela possibilidade de execução de

parte do sequenciamento e pela realização do mesmo.

Igualmente, agradeço a Mariana Terossi e a Rafael Robles por todo momento em que lhes

tomei a atenção, com dúvidas em algo e pedindo auxílio. O mesmo sentimento de gratidão devo à

Tatiana Magalhães e à Ana F. Gomes (Kelps) que muito me ajudaram, especialmente, mas não

apenas, no início das análises morfológicas e também moleculares. À Tati, pelo auxílio na edição

das sequências, à Mari, Léo, Rafa, Gabriela Zanarotti (Gabi), Mariana Negri (Kana) e Natália Rossi

pelas reações de sequenciamento, à Raquel Buranelli, Tati e Léo pela ajuda no manuseio das lupas e

câmeras e à Kana por todo ensinamento e acompanhamento na submissão das sequências no

GenBank. Dessa forma, aproveito para agradecer a todos que, de alguma forma me ajudaram e/ou

me suportaram no LBSC. Agradeço especialmente a Kana, Raquel, Vanda, Camila e Nati, por

terem dedicado seu tempo aos meus (inúmeros) questionamentos. Agradeço ainda pela companhia,

pelos bons momentos compartilhados, todas as conversas e discussões com toda a galera do LBSC

que muito contribuíram para o desenvolvimento do projeto e também da minha pessoa. Em

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Agradecimentos

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especial, agradeço à Natália (Ligeira) pela companhia de IC e por todos os momentos felizes que

me tornaram mais próximo dessa grande pessoa.

À Maira Massarani (Preta) pela disponibilidade em realizar as ilustrações, muito obrigado!

A todos os meus grandes amigos e companheiros que me deram suporte todo esse tempo, em

especial, Manoela Campos, Juliana Ribeiro, Cecília Rocha, Eduarda Romanini, Dalila Ribeiro,

Natália Grilli, Mayra Scanzani, Rafael Gil, Talita Fernandes, Robson Amaral (Johnny), Daniel

Lopes, Vinicius Katata, João Maricato e Rhanan Vareschi. Principalmente ao Johnny, a quem devo

um enorme sentimento de gratidão por todos os momentos de ajuda, tranquilidade e alegria

proporcionados quando o desespero me tomava conta.

A todos os mestres e professores que não apenas “deram uma aula”, mas sim me prepararam

para a vida e me direcionaram para a carreira Biológica, em especial, à Biologia Marinha e

Evolutiva.

Por último, à minha família, à qual um “muito obrigado” é irrisório por toda a ajuda, carinho e

proteção dedicados a mim ao longo desses anos.

E a todas as pessoas que, de alguma forma, auxiliaram a criação, produção e ao

desenvolvimento deste projeto, muito obrigado!

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Sumário

vii

Resumo ................................................................................................................................................ 1

Abstract ............................................................................................................................................... 2

Introdução........................................................................................................................................... 3

Introdução Geral ............................................................................................................................... 3

A Sistemática Molecular ................................................................................................................... 4

O Problema Taxonômico .................................................................................................................. 5

Objetivos .......................................................................................................................................... 10

Materiais e Métodos ........................................................................................................................ 11

Obtenção dos Dados Morfológios .................................................................................................. 11

Obtenção dos Dados Moleculares ................................................................................................... 15

Análise de Saturação e Sinal Filogenético dos Dados ..................................................................... 22

Análise de Distância Genética ......................................................................................................... 23

Busca pela melhor árvore filogenética – “Maximum Likelihood” .................................................. 24

Busca pela melhor árvore filogenética – Inferência Bayesiana ....................................................... 25

Busca pela melhor árvore filogenética – Máxima Parcimônia ........................................................ 26

Resultados ........................................................................................................................................ 29

Revisão Taxonônima ....................................................................................................................... 29

Arenaeus cribrarius ....................................................................................................................... 29

Arenaeus mexicanus ...................................................................................................................... 36

Chava de Identificação ................................................................................................................... 41

Análises Moleculares ...................................................................................................................... 49

Saturação e Sinal Filogenético dos Dados ....................................................................................... 49

Distância Genética ........................................................................................................................... 52

Análises Filogenéticas ..................................................................................................................... 57

Discussão .......................................................................................................................................... 66

Revisão Taxonômica e Morfologia Comparativa ........................................................................... 66

Variação Ontogenética e Eventos de Heterocronia ......................................................................... 69

Evolução Molecular e Filogenia do Gênero .................................................................................... 71

Relações Inter-Genéricas e Evolução Morfológica do Grupo ......................................................... 73

Conclusões ........................................................................................................................................ 79

Referências ........................................................................................................................................ 80

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Resumo

1

Espécies crípticas são aquelas que apresentam morfologia muito semelhante e sua distinção

baseada nesse caráter se torna muito difícil e algumas vezes equivocada. O gênero de siris Arenaeus

DANA, 1851 representa bem essa problemática. Apesar de ser composto por duas espécies apenas,

A. cribrarius LAMARCK, 1818 e A. mexicanus GERSTAECKER, 1858, estas apresentam

morfologia bastante semelhante e a distinção entre elas baseia-se em pequenas variações

morfológicas. Enquanto A. cribrarius distribui-se ao longo da costa Atlântica americana, A.

mexicanus pode ser encontrado ao longo da costa Pacífica das Américas. Em função da escassez de

estudos taxonômicos e sistemáticos a respeito do grupo e da semelhança entre os nichos e habitats

ocupados por essas espécies, levanta-se questionamentos a respeito da validade taxonômica destas

entidades. Além disso, o entendimento da história evolutiva do grupo é igualmente prejudicado.

Nesse contexto, o presente estudo tem o objetivo de realizar uma revisão taxonômica do grupo,

abordando diversos caracteres morfológicos capazes de separar ou não essas entidades em duas

espécies distintas. Além disso, análises moleculares foram processadas para averiguar a distância

genética entre elas e construir uma filogenia do grupo, a partir dos métodos de “maximum

likelihood”, inferência bayesiana e máxima parcimônia, utilizando como marcadores genes

mitocondriais 16S rDNA e COI (citocromo oxidase I). As análises morfológicas revelaram

consistência em grande parte dos caracteres tradicionalmente utilizados na literatura para distinção

de A. cribrarius e A. mexicanus e apenas a presença de um espinho partindo do epistoma, entre as

antênulas, em A. cribrarius e sua ausência em A. mexicanus, foi uma característica capaz de

diferenciá-las que não aparece descrita na literatura. Além disso, as variações morfológicas entre os

juvenis e indivíduos adultos de A. cribrarius, quando tomadas em conjunto, tornam a forma juvenil

desta espécie bastante semelhante à forma adulta observada em A. mexicanus, sugerindo a

ocorrência de um evento heterocrônico na evolução do grupo. Nas análises moleculares, ambos os

genes utilizados foram capazes de separar as duas espécies em clados distintos e irmãos de forma

consistente, apesar das relações externas de parentesco ainda permanecerem não completamente

resolvidas. Apesar disso, é sugerida e discutida sua proximidade com os gêneros Portunus

(Portunus) WEBER, 1795 e Callinectes STIMPSON, 1860. Em suma, o volume de dados aqui

obtidos é suficiente para se manter a validade taxonômica de ambas as espécies, permanecendo

como análogas únicas em um gênero à parte.

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Abstract

2

Cryptic species are those that have a very similar morphology and their distinction based upon

this feature becomes very difficult and sometimes misleading. The swimming crab genus Arenaeus

DANA, 1851, represents very well this problematic situation. Although consisting of only two

species, A. cribrarius LAMARCK, 1818 and A. mexicanus GERSTAECKER, 1858, they resembles

each other very much and their distinction is based upon tiny morphological variations. While A.

cribrarius is distributed along the American Atlantic coast, A. mexicanus may be found along the

American Pacific coast. Due to the scarcity of taxonomic and systematic studies about this group

and to the similarity between the niches and the habitats occupied by these species, some questions

about the taxonomic validity of these entities are raised. Moreover, the understanding about the

evolutionary history of the group is equally affected. Hence, this study aimed to make a taxonomic

revision about the group, encompassing several morphological characters that enable to split or not

these entities into two distinct species. Furthermore, molecular analyses were processed to check

the genetic distance between them and build up a phylogeny of the group, based on the maximum

likelihood, Bayesian approach, and maximum parsimony methods, using as molecular markers the

genes 16S rDNA and COI (cytochrome oxidase I). Morphological analyses have showed

consistence in most of the characters traditionally employed in the literature to distinguish A.

cribrarius from A. mexicanus, and solely the presence of a spine standing out from the epistome,

between the antennules, in A. cribrarius and its absence in A. mexicanus, was a new and good-

character to differentiate them. Besides, morphological variations between juveniles and adults

from A. cribrarius, when taken as a group, render the juvenile stage of these species very similar to

the adult morphology of A. mexicanus, suggesting the occurrence of a heterochronic event in the

evolution of the group. In molecular analyses, both genes employed were able to split both species

into two distinct sister clades in a consistent way, even though the external relationship still remains

not completely resolved. Instead of this, it is suggested and discussed its relation with the genus

Portunus (Portunus) WEBER, 1795 and Callinectes STIMPSON, 1860. Summarizing, the amount

of data yielded here is enough to keep the taxonomic validity of both species, remaining them as

analogous species in a separate genus.

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Introdução

3

Introdução Geral

A taxonomia é uma ciência que pode ser definida, em poucas palavras, como “a teoria e a

prática da classificação dos organismos” (Mayr, 1969), enquanto a sistemática engloba toda a

“diversidade de organismos e qualquer e toda relação entre eles” (Stimpson, 1961). Entretanto, com

o desenvolvimento do pensamento evolutivo, a partir da segunda metade do século XIX, passou a

existir uma preocupação de que essa classificação dos organismos refletisse sua história evolutiva.

Dessa forma, ambas as ciências passaram a seguir juntas.

Talvez o mais interessante destas áreas do conhecimento sejam suas contribuições não

restritas a elas mesmas, mas igualmente importantes a outros ramos da biologia. Mayr (1969) traz

uma breve lista da dependência de outras vertentes da biologia em relação à taxonomia e à

sistemática. Por exemplo, são indispensáveis à pesquisa a respeito de organismos de interesse

econômico e médico e provêm ferramentas e dados para outras áreas de estudo dos sistemas

biológicos, em especial, permitindo a classificação dos indivíduos, o que é essencial para o

desenvolvimento das demais áreas.

A descrição taxonômica dos organismos, que serve de base para a identificação e

classificação destes, tradicionalmente, é realizada com base na morfologia dos indivíduos.

Entretanto, algumas espécies, mesmo divergindo geneticamente ao longo do tempo, “falham” em

adquirir diferenças morfológicas conspícuas (Mayr, 1969). Espécies morfologicamente muito

semelhantes, dificilmente distinguíveis, são ditas espécies crípticas (“cryptic species” sensu

Knowlton, 1986) (“sibling species” sensu Mayr, 1963; para a distinção adotada no presente

trabalho entre “sibling” e “cryptic species” ver Knowlton, 1986). Normalmente, são diferenciadas

por divergências comportamentais e ecológicas, padrão de coloração e diversos caracteres

bioquímicos e genéticos, assim como diminutas variações morfológicas que, em alguns casos, são

tomadas como diagnósticas (Knowlton, 1986). Surpreendentemente, a maior parte destes

organismos foi descoberta como sendo espécies distintas a partir, não de estudos taxonômicos, mas

de outros que explorassem aspectos de importância médica, genética, citológica, agrícola, entre

outras (Mayr, 1969).

Essa dificuldade em se detectar e distinguir espécies crípticas com base apenas em sua

morfologia externa leva à busca de caracteres alternativos para serem utilizados em sua

classificação. Nesse contexto, a sistemática molecular vem exibindo destaque crescente dentro

dessas ciências classificatórias.

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Introdução

4

A Sistemática Molecular

A sistemática molecular também utiliza o método comparativo em suas análises, contudo as

comparações envolvem, direta ou indiretamente, informações sobre as sequências de ácidos

nucléicos e proteínas (Avise, 2004). Uma de suas características que mais atraem atenção é que, de

acordo com Avise (2004), a filogenia representa o fluxo da hereditariedade (“the stream of

heredity”) e apenas os traços genéticos são genealogicamente informativos. Isso reflete a

importância desse ramo da sistemática frente às abordagens tradicionais, baseadas em

características observáveis e cujas bases genéticas são, em geral, desconhecidas ou mal

compreendidas.

Além disso, como se considera que os processos seletivos, que atuam durante o curso

evolutivo, dependam da variabilidade genética (Mayr, 1963) e que os fatores tradicionalmente

utilizados na taxonomia são bastante influenciáveis por fatores não genéticos (Avise, 2004), a

sistemática molecular mostra-se como uma ferramenta de especial interesse em análises

filogenéticas. E, somando-se a isso, o número de fatores que podem ser considerados nas análises é

enorme, visto a proporção de informações contida no material genético (Avise, 2004).

Dentro deste contexto, genes mitocondriais têm sido utilizados como ferramentas nas

resoluções de uma ampla variedade de problemas taxonômicos e filogenéticos dentro de Decapoda,

como em grupos de relações controversas (Schneider-Broussard et al., 1998; Schubart et al., 2000a;

Williams et al., 2001; Mantelatto et al., 2009a e b; Schubart & Reuschel, 2009; Pileggi &

Mantelatto, 2010) ou mesmo em estudos em níveis taxonômicos mais amplos (Ahyong & O'Meally,

2004; Lefébure et al., 2006). Sua popularidade nessas metodologias é decorrente de uma maior

facilidade em seu emprego, já que a quantidade de genoma mitocondrial em uma célula é muito

superior àquela de um gene nuclear, o que torna sua amplificação menos complicada (Schubart,

2009).

Outros fatores que favorecem sua aplicação são uma maior taxa de mutação do que no

genoma nuclear, permitindo que um sinal filogenético seja acumulado em um período de tempo

relativamente mais curto, e pelo fato de que, por não haver recombinação e ser herdado de forma

uniparental, o genoma mitocondrial pode ser interpretado de uma forma mais simplificada

(Schubart, 2009). Além disso, a disponibilidade de conjuntos de “primers” universais para tais

genes e do sequenciamento destes no GenBank, para diversas espécies, aumentam a preferência do

emprego desses genes em estudos filogenéticos dentro de Crustacea (Toon et al., 2009).

Os genes mitocondriais mais utilizados nesses trabalhos são 16S rDNA, 12S rDNA,

citocromo-oxidase I (COI) e citocromo b (cyt-b) (Schubart et al., 2000b). Enquanto os dois

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Introdução

5

primeiros são genes estruturais de ribossomos, não codificantes e de funções catalíticas importantes

durante a síntese protéica, tanto COI como cyt-b são codificantes e essenciais na cadeia respiratória.

Mesmo que de acordo com Schubart et al. (2000b), o gene 16S rDNA apresente tanto regiões

variáveis como conservadas, podendo ser utilizado para eventos de especiação antigos como

também recentes, seu emprego é mais comum em análises de divergência genética interespecífica,

visto que para as intraespecíficas a variação encontrada pode ser muito pequena ou mesmo nula

(Francisco & Galetti Jr., 2005; Vergamini et al., 2011). Nesse último caso, o gene COI tem

mostrado resultados satisfatórios, demonstrando variação genética entre populações (Pileggi &

Mantelatto, 2010; Vergamini et al., 2011).

Por outro lado, o próprio fato dos genes mitocondriais serem herdados de forma uniparental

leva a uma perspectiva linear da evolução dentro do grupo estudado, enquanto o esperado seria um

padrão reticulado, como encontrado nos genes nucleares (Neigel & Avise, 1986). Somando-se a

isso, existe o fenômeno de introgressão entre os genes mitocondriais, que seria a aquisição de genes

exógenos ao genoma mitocondrial de uma espécie, tornando errônea a interpretação a partir de

filogenias baseadas somente nesses genes (Neigel & Avise, 1986). Portanto, atualmente considera-

se a necessidade da utilização concomitante de marcadores nucleares mais conservados junto a

genes mitocondriais, ao menos na construção de filogenias em níveis taxonômicos elevados

(Schubart, 2009). A utilização conjunta dos genes 16S rDNA e COI tende a ser suficientemente

consistente na demonstração de divergência genética entre grupos estudados, ao menos, ao nível

específico e genérico.

Considerando-se esses aspectos, genes mitocondriais, como 16S rDNA e COI, representam

importantes ferramentas na diferenciação de complexos de espécies crípticas (Keenan, 1998; Lai et

al., 2010) ou de espécies de ampla distribuição geográfica que, potencialmente, constituem

complexos de espécies crípticas (Mantelatto et al., 2011). Além disso, diversos autores (Schubart et

al., 2001a e 2001b; Kitaura et al., 2002; Goetze, 2003; Reuschel & Schubart, 2006; Mantelatto et

al., 2007 e 2009a e b; Robles et al., 2007; Pileggi & Mantelatto, 2010) tem mostrado a eficiência

desses genes na resolução de problemas taxonômicos associados à espécies crípticas, e há muita

informação em que se basear para utilizá-los.

O problema taxonômico

Portunidae RAFINESQUE, 1815, compreende grande parte dos crustáceos popularmente

conhecidos como “siris” (Ng et al., 2008; De Grave et al., 2009), entre os quais, muitos exibem

grande importância econômica e ecológica, como Scylla sp. (“caranguejo da lama”) DE HAAN,

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Introdução

6

1833, Callinectes sp. STIMPSON, 1860 (“siri-azul”), Portunus pelagicus LINNAEUS, 1758 (“siri-

azul”), Portunus trituberculatus MIERS, 1876 (“gazami-crab”) e Arenaeus cribrarius (“siri-chita”)

LAMARCK, 1818 (cf. Fushimi & Watanabe, 1991; Robles et al., 2007; Lai et al., 2010; Pinheiro &

Hattori, 2006). A despeito dessa importância e da grande diversidade do grupo, que compreende

espécies marinhas e não marinhas (i.e. estuarinas), tem-se dedicado relativamente pouco esforço às

revisões taxonômicas de seus componentes (Mantelatto et al., 2009b). Os trabalhos realizados

mostram diversos problemas na classificação desta família, com muitos grupos parafiléticos

(Mantelatto et al., 2007; 2009b; Karasawa et al., 2008), sinonímias (Schubart et al., 2001a;

Mantelatto et al., 2007; Robles et al., 2007) e complexos não resolvidos de espécies crípticas

(Keenan, 1998; Mantelatto et al., 2009b; Lai et al., 2010), sendo que uma revisão mais extensa a

respeito pode ser encontrada em Karasawa et al. (2008).

Arenaeus DANA, 1851, é um gênero de siris que não “escapa a essa regra”, sendo formado

apenas por duas espécies, A. cribrarius LAMARCK, 1818 (Figura 1-A) e A. mexicanus

GERSTAECKER, 1858 (Figura 1-B) (Ng et al., 2008). Algumas características diagnósticas como

a ausência de fendas longitudinais no palato e o formato em “V” das fissuras supraorbitais,

amplamente abertas, são comumente utilizadas para distinguir o gênero de outros semelhantes,

como Callinectes, Portunus WEBER, 1795 e Achelous DE HAAN, 1833 (Rathbun, 1930; Garth &

Stephenson, 1966; Rodríguez, 1982; Williams, 1984; Melo, 1996). Entretanto, entre si, as espécies

são distinguidas com base em pequenas variações morfológicas e exibem uma morfologia externa

bastante semelhante (Figura 1).

A distribuição destas duas espécies é relativamente grande, sendo que A. cribrarius pode ser

encontrado ao longo da costa oeste do Oceano Atlântico desde Vineyard Sound, Massachusetts,

EUA até La Paloma, Uruguai (Juanicó, 1978; Williams, 1984), incluindo ocorrência também para a

costa argentina (Scelzo, 2001) (Figura 2). No Brasil, distribui-se do Ceará ao Rio Grande do Sul

(Melo, 1996). Enquanto que A. mexicanus é encontrado ao longo da costa leste do Oceano Pacífico,

desde Baja California, México, até a Bahía de Ancón, Peru (Fonseca, 1970; Dexter, 1974).

Contudo, a espécie já foi coletada no Chile, em períodos sob influência do evento El Niño (Guzmán

& Peredo, com. pess. apud Retamal & Arana, 2000) (Figura 2).

Apesar dessa grande distribuição e ocupação de diversos ambientes, o conhecimento a

respeito da biologia e história de A. cribrarius está limitado a alguns trabalhos sobre sua fisiologia

(Norse, 1978), embriologia e desenvolvimento (Stuck & Truesdale, 1988; Pinheiro & Fransozo,

1993; Pinheiro & Hattori, 2002; 2006), ecologia trófica (Leber, 1982; DeLancey, 1989; Carmona-

Suárez & Conde, 2005), biologia reprodutiva (Pinheiro, 1995; Pinheiro & Fransozo, 1998; 1999;

2002; Pinheiro & Taddei, 2000; Pinheiro & Terceiro, 2000), bioecologia e distribuição (Leber,

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Introdução

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1982; Moreira et al., 1988; Avila & Branco, 1996; Pinheiro et al., 1997; Mantelatto & Fransozo,

2000; Carmona-Suárez & Conde, 2002; Guerra-Castro et al., 2007), principalmente devido ao

interesse comercial e econômico da espécie. Enquanto que nas áreas taxonômica e sistemática os

estudos são muito escassos, não tendo sido encontrada qualquer literatura mais recente nessa

temática cujo enfoque seja a espécie em questão. Para o caso de A. mexicanus, o cenário é ainda

mais precário, sendo ausentes estudos taxonômicos e sistemáticos e bastante escassos estudos

também em outras áreas, excetuando-se algo a respeito de distribuição e ecologia da espécie (Garth,

1960; Cornejo, 1998; Retamal & Arana, 2000; Godínez-Domínguez et al., 2002; Granda et al.,

2004).

Assim, além da similaridade morfológica, ambas as espécies do gênero aparentam ocupar

ambientes e nichos bastante semelhantes, habitando preferencialmente regiões costeiras não muito

profundas e de sedimento arenoso em diferentes oceanos, e alimentando-se majoritariamente de

outros crustáceos (Garth, 1960; Garth & Stephenson, 1966; Williams, 1984; Pinheiro et al., 1997;

Cornejo, 1998; Godínez-Domínguez et al., 2002; Pinheiro & Hattori, 2002; Carmona-Suárez &

Conde, 2005), o que em associação à escassez de dados, levanta questionamentos a respeito do quão

divergentes são.

Essa incerteza, em função da ausência de dados concretos, não se restringe ao “status”

taxonômico das espécies, a própria validade do gênero já foi questionada. Stephenson et al. (1968),

em um trabalho a respeito de espécies análogas de portunídeos, i.e. com um representante em cada

uma das costas americanas (Pacífica e Atlântica), como as espécies de Arenaeus, aproximaram o

gênero a uma das espécies de Callinectes, questionando a existência do próprio gênero.

Outros trabalhos existentes, a respeito da sistemática, não visaram à resolução das relações

filogenéticas do gênero e, como consequência, não foram incluídas ambas as espécies (Weber et al.,

2003; Mantelatto et al., 2007 e 2009b; Robles et al., 2007; Karasawa et al., 2008; Schubart &

Reuschel, 2009). Nestes trabalhos apenas a espécie do Atlântico (A. cribrarius) foi analisada, sendo

ausentes dados sobre A. mexicanus, o que inviabiliza qualquer inferência a respeito do gênero em

um contexto global. Além disso, em parte destes estudos, a espécie foi utilizada apenas como grupo

externo em relação às espécies de enfoque principal.

Em razão dessa problemática taxonômica observada dentro do gênero Arenaeus, faz-se de

grande importância a resolução das relações internas e de uma revisão taxonômica do grupo,

incluindo dados moleculares na análise quando os morfológicos disponíveis são incapazes de

cumprir tal objetivo de forma clara.

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Introdução

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Figura 1: Espécies do gênero Arenaeus DANA, 1851. A. cribrarius LAMARCK, 1818 (A) (CCDB 754) e A.

mexicanus GERSTAECKER, 1858 (B) (CCDB 2936) são as únicas espécies que compõem o gênero e exibem

uma morfologia externa bastante semelhante, sendo distinguíveis com base em pequenas variações morfológicas.

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Introdução

9

Figura 2: Mapa das distribuições geográficas teóricas das espécies de Arenaeus. A. cribrarius (em azul) distribui-se ao

longo da costa oeste do Oceano Atlântico desde Vineyard Sound, Massachusetts, EUA, até Mar del Plata, Argentina,

sendo que no Brasil, distribui-se do Ceará ao Rio Grande do Sul. Já A. mexicanus (em verde) pode ser encontrado ao

longo da costa leste do Oceano Pacífico, desde Baja California, México, até o norte do Chile. Para referências consultar

o texto.

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Objetivos

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Dentro das premissas anteriormente expostas, os objetivos do presente estudo foram:

• Realizar uma revisão taxonômica a respeito do gênero Arenaeus, incluindo exemplares das

espécies componentes de diversas localidades e populações distintas;

• Obter dados moleculares de sequências parciais dos genes mitocondriais 16S rDNA e

citocromo-oxidase I (COI) para análise da evolução molecular dentro do grupo e construção de

filogenias;

• Testar a hipótese de sinonímia entre as espécies do gênero.

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Materiais e Métodos

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Obtenção dos Dados Morfológicos

Os espécimes analisados foram obtidos por empréstimo ou doação das seguintes coleções

carcinológicas: University of Louisiana at Lafayette's Zoological Collection (ULLZ); Museo de

Zoologia da Universidad de Costa Rica (UCR), Museu de Oceanografia da Universidade Federal de

Pernambuco (MOUFPE) e Colección Nacional de Crustáceos (CNCR) da Universidad Nacional

Autónoma de México (UNAM). Material adicional foi analisado a partir de lotes já depositados na

Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) da Faculdade de Filosofia Ciências e

Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP), Universidade de São Paulo (USP). Coletas para obtenção de

material adicional ocorreram em Parnamirim (RN), Ubatuba (SP), Guarujá (SP), Peruíbe (SP), Ilha

Comprida (SP) e Cananéia (SP), utilizando-se captura por meio de redes de arrasto do tipo “otter-

trawl”, em profundidades de até 20m, ou mesmo coleta manual com a utilização de puçás ou

semelhante na área de varrido do litoral. Os espécimes coletados foram fixados e preservados em

álcool 80% e depositados na Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB).

As características morfológicas analisadas basearam-se nas descrições prévias de Rathbun

(1930), Garth & Stephenson (1966), Rodríguez (1982), Williams (1984) e Melo (1996). Os dados

morfológicos foram obtidos por meio do estudo comparativo de indivíduos adultos, fêmeas e

juvenis com um estereomicroscópio acoplado a câmara clara. A identificação de indivíduos fêmeas

e machos, em Portunidae, é facilmente realizada com base na morfologia do abdome. Os machos

apresentam-no em forma de “T” invertido (para gêneros como Arenaeus e Callinectes) (Figura 3-

A), enquanto as fêmeas apresentam-no mais largo e arredondado, próximo a triangular (Figura 3-B).

A partir dessa estrutura também se pode diferenciar um juvenil de um espécime adulto, que, quando

fêmeas, apresentam abdome triangular (Figura 3-C), e, quando machos, apresentam o abdome ainda

não descolado, “preso” aos esternitos torácicos, mesmo que sua configuração se assemelhe à

morfologia adulta (Williams, 1974; para outras referências ver Pinheiro & Fransozo, 1993).

A realização de fotografias se deu com a utilização de uma câmera digital C-7070 da

Olimpus®, um estereomicroscópio ZEISS® DiscoveryV20 acoplado a uma câmera ZEISS® Axio

Cam MRc 5 ou de um estereomicroscópio LEICA® M205 C acoplado a uma câmera LEICA®

DFC 295. Enquanto as medições foram realizadas com o uso de um paquímetro digital (precisão:

0,01 mm), sob a visualização de estereomicroscópio, quando possível, para maior acuracidade.

Além de se conferir a consistência das principais características diagnósticas entre as espécies

(Tabela 1), outros caracteres também analisados (Figura 4) foram o padrão de coloração, tanto na

carapaça, como nos apêndices (e.g. antenas e antênulas, pedúnculos oculares e quelípodos) e

morfologia dos segmentos e apêndices corporais.

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Materiais e Métodos

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Na carapaça, considerou-se seu formato, a presença e profundidade relativa dos sulcos inter-

regionais, proeminência relativa do lóbulo interbranquial, formato do ângulo posterolateral e

número de dentes anterolaterais. Em relação a este último item, foram incluídos na contagem o

dente orbital externo e o espinho lateral, comumente agrupados como dentes/espinhos anterolaterais

nas descrições tradicionais (Rathbun, 1930; Garth & Stephenson, 1966; Williams, 1984; Melo,

1996), entretanto, foram excluídos da descrição dessas estruturas, já que mesmo sendo dentes

antero-laterais, seus padrões morfológicos diferem drasticamente daquele aplicado aos demais

dentes e, dessa forma, são descritas à parte. Considerou-se também o tamanho e largura relativos,

tanto dos dentes como do próprio espinho lateral.

Figura 3: Morfologia dos somitos abdominais de portunídeos (e.g. gêneros Arenaeus e Callinectes), utilizada na

caracterização do sexo dos espécimes. Os machos apresentam o abdome em formato de “T” invertido (A), já as

fêmeas, apresentam essa estrutura mais larga e em formato arredondado (B). Por outro lado, as formas juvenis de

fêmeas exibem-na em formato triangular (C). Modificado de Pinheiro & Fransozo (1993).

Na fronte dos animais, observou-se o padrão de distribuição de cerdas entre as regiões

suborbital, subepática, antenal, pterigostomial, sub-branquiais e também no epistoma,

caracterizando-nas como presentes ou ausentes. Para o rostro, foram analisados seu tamanho e

largura relativos, número, distribuição e formato dos dentes nele presentes e formato dos seios da

região. Nas órbitas, foram caracterizados o ângulo e os dentes orbitais internos, sulcos, lóbulos,

dentes e seios presentes nas bordas superior e inferior. Também foram descritas a morfologia e a

presença de espinhos, tubérculos ou dentes de antênulas e antenas, quelípodos e patas, tanto as

natatórias como as ambulatórias. Nos quelípodos, observou-se a presença de franja de cerdas nas

superfícies interna e externa e de espinhos, dentes e outras proeminências em cada um dos artículos.

Algo semelhante se deu para o formato, comprimento e largura dos artículos das patas natatórias e

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Materiais e Métodos

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ambulatórias. Também, fez-se uma análise dos somitos abominais e do telso, considerando o padrão

de fusão dos segmentos, da presença de cerdas nas bordas e de espinhos, assim como o formato dos

segmentos e do próprio telso.

Figura 4: Esquema de um portunídeo generalizado mostrando os principais termos utilizados na descrição dos

espécimes. Vista dorsal à esquerda. 1- rostro; 2- regiões orbitais; 3- região gástrica (lóbulo intermediário); 4-

regiões hepáticas. Setas indicam os sulcos inter-regionais localizados entre as regiões 3 e 4. Algarismos romanos

indicando o tipo de apêndice: I- quelípodo, II- patas ambulatórias e III- patas natatórias. Letras indicam o

artículo, ou porção dele, dos apêndices; D- dátilo, P- palma, Pr- própodo, C- carpo, M- mero, Cx- coxa; a base e

o ísquio fusionados estão indicados no desenho. Vista ventral à direita, mostrando apenas os esternitos torácicos

e os somitos abdominais. T- telso; algarismos arábicos indicam o segmento abdominal. (Modificado de

Rodríguez, 1982).

Por último, na análise do primeiro par de pleópodos masculinos, os gonopódios,

consideraram-se suas proporções, conformação, presença e distribuição de espinhos, baseando-se

nas descrições e ilustrações de Rodríguez (1982), Stephenson & Campbell (1959) e Garth &

Stephenson (1966). O segundo par de pleópodos, tradicionalmente não descrito para Arenaeus, nem

para gêneros próximos, foi analisado segundo a distribuição de cerdas, presença ou ausência de

ornamentação e conformação da extremidade terminal.

A partir dos caracteres morfológicos observados, buscou-se criar uma chave de identificação

para as espécies do gênero simplificada e bastante prática, utilizando caracteres pouco plásticos, de

fácil observação e de fácil diferenciação entre as espécies.

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Tabela 1: Caracteres da morfologia das espécies de Arenaeus comumente utilizados nas diagnoses de cada uma,

segundo as descrições de Rathbun (1930), Garth & Stephenson (1966), Williams (1984) e Melo (1996). (-) Indica

ausência de dados na literatura.

Caráter morfológico Arenaeus cribrarius Arenaeus mexicanus

Coloração

Carapaça

Amarelo claro em um fundo

dourado ou castanho claro, ou

ainda marrom vináceo claro ou

marrom oliva. Cobertura densa

na face dorsal com pequenas e

arredondadas manchas brancas

Muito semelhante àquela de

A. cribrarius, mas as manchas

brancas são menos

uniformemente distribuídas

Quelípodos

As manchas na superfície dorsal

dos quelípodos são maiores que

as da carapaça

Manchas brancas presentes

em menor escala do que em

A. cribrarius, podendo,

inclusive, estar ausente

Ornamentação

da Carapaça

Antero-

Lateral Dentes antero-laterais amplos

Dentes antero-laterais mais

longos e mais estreitos que

em A. cribrarius. Espinho

lateral relativamente maior

Rostro Com quatro pequenos dentes Apenas dois dentes pequenos

Órbita Lóbulo intermediário estreito e

subtruncado

Lóbulo intermediário mais

estreito. Dente interno mais

proeminente

Quelípodos

Carpo Dois espinhos curtos, um interno

e outro externo

Espinho ou tubérculo externo

reduzido

Palma Um espinho na extremidade

distal

Dois espinhos na extremidade

distal

Patas natatórias Mero -

Um pouco maior em

comprimento em proporção a

A. cribrarius

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Obtenção dos Dados Moleculares

Os genes 16S mtDNA e o citocromo oxidase I (COI) foram utilizados como marcadores

moleculares e os dados obtidos por meio de protocolos, seguindo a metodologia de Mantelatto et al.

(2007, 2009b) e Pileggi & Mantelatto (2010). Além de indivíduos de ambas as espécies do gênero

em estudo, também foi extraído material de membros dos gêneros Callinectes, Achelous, Charybdis

DE HAAN, 1833, e Liocarcinus STIMPSON, 1871, assim como também foram adicionadas outras

sequências depositadas no GenBank de espécies selecionadas dos gêneros Portunus, Callinectes,

Achelous, Charybdis, Thalamita LATREILLE, 1829, e Liocarcinus.

A escolha de representantes, priorizando a espécie-tipo, destes gêneros seguiu filogenias

prévias (Mantelatto et al., 2007 e 2009b; Karasawa et al., 2008; Schubart & Reuschel, 2009) e teve

o intuito de produzir um melhor posicionamento das espécies do gênero Arenaeus e do próprio

gênero como um todo em relação aos demais gêneros de siris.

Duas espécies de Liocarcinus foram selecionadas para melhor enraizar as topologias, L.

depurator LINNAEUS, 1758 e L. vernalis RISSO, 1816, já que a adição de mais sequências do

clado irmão em relação ao grupo interno melhora as chances de se obter uma topologia mais

parcimoniosa (Smith, 1994). Nesse caso, Liocarcinus representa Polybiidae ORTMANN, 1893

(sensu Schubart & Reuschel, 2009), ou Carcinidae MACLEAY, 1838 (sensu Martin & Davis, 2001;

Ng et al., 2008), grupo-irmão de Portunidae, que inclui todos os demais gêneros analisados e em

relação aos quais se procura posicionar Arenaeus.

Os testemunhos genéticos dos quais as amostras de tecido foram retiradas para análise estão

depositados em suas respectivas coleções de origem e suas sequências produzidas a partir destes,

armazenadas no banco de dados do GenBank. Estes dados e os números de acesso no GenBank

referentes às sequências se encontram na Tabela 2.

O tecido muscular extraído foi incubado em banho-seco a 55ºC por um período de 12-24h em

600 µL de “lysis buffer” e 200 µL de proteinase-K (500µg/mL). As proteínas em solução foram

separadas com a adição de 200 µL de NH4Oac 7,5M seguida de centrifugação a 14000 rpm (18ºC)

por 10 min. O material genético na solução restante foi precipitado com 700 µL de isopropanol

mantido a baixas temperaturas acompanhado de centrifugação, seguindo os mesmos parâmetros

descritos anteriormente. Em seguida, o “pellet” resultante foi lavado com 15 µL de etanol 70%,

secos a temperaturas de 30ºC – 45ºC e ressuspendidos com 20 µL de tampão TE.

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Materiais e Métodos

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Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e

datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.

Espécie Local e Data de coleta Número de

coleção

Número de acesso no

GenBank 16S/COI

Achelous spinimanus Brasil, Ubatuba, São Paulo,

2003 CCDB 987 DQ388056

f/ -

Arenaeus cribrarius Costa Rica, Isla Pajaros,

Limón, 2006

UCR 2470-

10 JX123457/JX123423

Arenaeus cribrarius Costa Rica, Playa Negra,

Cahuita, 2010 CCDB 2930 JX123458/JX123424

Arenaeus cribrarius Venezuela, Fálcon, 1999 ULLZ 5173 DQ407667g/ -

Arenaeus cribrarius Venezuela, La Restinga,

2011 CCDB 3635 JX123459/JX123425

Arenaeus cribrarius Brasil, Parnamirim, Rio

Grande do Norte, 2011 CCDB 3391

JX123460/JX123426-

JX123427

Arenaeus cribrarius Brasil, Maceió, Alagoas,

1981

DOUFPE

6871 - /JX123428

Arenaeus cribrarius Brasil, Macaé, Rio de

Janeiro, 2011 CCDB 3255 JX123461/JX123429

Arenaeus cribrarius Brasil, Ubatuba, Enseada de

Ubatuba, São Paulo, 2005 CCDB 2725

- / JX123430-JX123431-

JX123432

Arenaeus cribrarius Brasil, Ubatuba, São Paulo,

2011 CCDB 1536

JX123462/JX123433-

JX123434

Arenaeus cribrarius Brasil, Caraguatatuba, São

Paulo, 2001 CCDB 754 - /JX123435

Arenaeus cribrarius Brasil, Guarujá, São Paulo,

2011 CCDB 291 JX123463/JX123436

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Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e

datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.

Espécie Local e Data de coleta Número de

coleção

Número de acesso no

GenBank 16S/COI

Arenaeus cribrarius

Brasil, Peruíbe, São Paulo,

2011 CCDB 3700 JX123464/ JX123437

Arenaeus cribrarius Brasil, Ilha Comprida, Praia

Boqueirão Norte, São

Paulo, 2011

CCDB 3208 JX123465/JX123438

Arenaeus cribrarius Brasil, Ilha Comprida, Praia

Boqueirão Sul, São Paulo,

2011

CCDB 3182 JX123466/JX123439

Arenaeus cribrarius Brasil, Cananéia, São Paulo,

2011 CCDB 3241

- / JX123440-JX123441-

JX123442

Arenaeus cribrarius Brasil, São Francisco do

Sul, Santa Catarina, 2010 CCDB 3516 JX123468/JX123444

Arenaeus cribrarius Brasil, São Francisco do

Sul, Santa Catarina, 2011 CCDB 1457 JX123469/JX123445

Arenaeus cribrarius Brasil, Florianópolis, Santa

Catarina, 2004 CCDB 990 JX123467/JX123443

Arenaeus mexicanus Costa Rica, Golfo

Papagayo, Guanaceste,

2005

UCR 2430-

04 JX123470/JX123446

Arenaeus mexicanus Costa Rica, Playa Organo,

Puntarenas, 1991 UCR 1382 JX123472/JX123447

Arenaeus mexicanus Costa Rica, Puntarenas,

2010 CCDB 2936 JX123471/JX123448

Arenaeus mexicanus Costa Rica, 2005 CCDB 1716 JX123473/JX123449-

JX123450

Callinectes bellicosus México, Golfo da Califórnia - - /AY465907c

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Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e

datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.

Espécie Local e Data de coleta Número de

coleção

Número de acesso no

GenBank 16S/COI

Callinectes bocourti Brasil, São Vicente, São

Paulo, 2002 CCDB 1764 - / JX123451

Callinectes danae Brasil, Enseada de

Ubatuba, Ubatuba, São

Paulo, 2002

CCDB 1766 JX123474/ -

Callinectes danae Brasil, São Vicente, São

Paulo, 2011 CCDB 3665 JX123475/ -

Callinectes ornatus Brasil, Enseada de

Ubatuba, Ubatuba, São

Paulo

ULLZ 4178 AJ298186a/ -

Callinectes sapidus Venezuela, Zulia ULLZ 4188 AJ298190a/ -

Callinectes sapidus Brasil, São Vicente, São

Paulo, 2001 CCDB 1680 JX123476/JX123452

Callinectes sapidus Brasil, Cananéia, São

Paulo, 2011 CCDB 3242 JX123477/JX123453

Callinectes similis EUA, Louisiana ULLZ 4371 DQ407672g/ -

Charybdis hellerii Venezuela, Fálcon ULLZ 4631 DQ407666g/ -

Charybdis hellerii Brasil, Cananéia, São

Paulo, 2011 CCDB 887 - /JX123454

Liocarcinus depurator Espanha, Mar de Alborán MNHN (não

catalogado) FM208767

l/ -

Liocarcinus depurator Portugal MNHN

MB89000354 - /JQ306215

m

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Materiais e Métodos

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Tabela 2: Conclusão. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais

e datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.

Espécie Local e Data de coleta Número de

coleção

Número de acesso no

GenBank 16S/COI

Liocarcinus vernalis Itália, Monte Argentario,

Grosseto CCDB 1739 - /JX123455

Liocarcinus vernalis Itália, Fusaro, Nápoles SMF 32761 FM208768l/ -

Portunus pelagicus India, Gulf of Mainnar,

2003 ULLZ 5682 DQ388052

f/ -

Portunus pelagicus - BIO

MaPrt001 - /DQ889124

e

Portunus trituberculatus Japão, Tokyo, 2002 NHMI CDM-

ZC 5916 AB093006

b/AB093006

b

Portunus trituberculatus - GQ180777i/GQ180779

i

Portunus sanguinolentus Vietnã, Nha Trang - AM410531d/ -

Portunus sanguinolentus - - - /EU284144h

Thalamita danae Cingapura, Labrador, 1999 ULLZ 4760 FJ152165j/ -

Thalamita seurati Kiribati, Pacífico, 2005 FLMNH

UF10716 - /GQ260913

k

CCDB: Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto, Brasil; DOUFPE: Departamento de Oceanografia da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil; ULLZ:

University of Louisiana at Lafayette's Zoological Collection, EUA; SMF : Senckenberg Museum, Frankfurt a.M,

Alemanha.; MNHN: Museu Nacional de História Natural, Universidade de Lisboa, Portugal; BIO: Biodiversity

Institute of Ontario, University of Guelph, Canadá. FLMNH: Florida Museum of Natural History, EUA; NHMI:

Natural History Museum and Institute, China.

a

Schubart et al. (2001a); b Yamauchi et al. (2003);

c Pfeiler et al. (2005);

d Bui et al. (2006);

e Costa et al. (2007);

f

Mantelatto et al. (2007); g

Robles et al. (2007); h

Xing & Lin (2007); i Dai et al. (2009);

j Mantelatto et al. (2009);

k

Plaisance et al. (2009); l Schubart & Reuschel (2009);

m Matzen da Silva et al. (2011)

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Materiais e Métodos

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O DNA genômico, extraído do tecido muscular dos exemplares obtidos, teve sua região de

interesse amplificada por meio de técnica de PCR (“Polymerase Chain Reaction”) (ciclos térmicos

para 16S: desnaturação inicial por 5 min a 95 °C; desnaturação, anelamento e extensão por 40

ciclos: 45 segundos a 95 °C, 45 segundos a 48 °C, 1 min a 72 °C; extensão final de 10 min a 72 °C;

ciclos térmicos para COI: desnaturação inicial por 2 min a 94 °C; desnaturação, anelamento e

extensão por 35 ciclos: 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C, 1 min a 72 °C; extensão final de

10 min a 72 °C) fazendo uso dos “primers” 16SL2 (5’-TGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’) e

16SH2 (5’-AGA TAG AAA CCA ACC TGG-3’) (Schubart et al., 2000b) para o fragmento de 16S,

e para a porção do gene COI, LCO1-1490 (5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG-3’) e

HCO1-2198 (5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’) (Folmer et al., 1994). Os

resultados obtidos foram observados em eletroforese com gel de agarose 1%.

Quando necessário, a temperatura foi ajustada para melhor anelamento do “primer”,

implicando em variações do protocolo (44-52 ºC para o fragmento de 16S e 46-54 ºC para o

fragmento de COI). Em alguns casos, quando a simples variação da temperatura e do volume de

DNA adicionado não resultou em amplificação, testou-se a variação “touchdown” de PCR (Don et

al., 1991; Korbie & Mattick, 2008). Essa técnica se baseia na propriedade exponencial de replicação

da PCR e na especificidade diferencial dos “primers” de acordo com diferentes temperaturas. A

ideia é se iniciar os ciclos de amplificação a temperaturas mais elevadas, produzidos moldes

bastante específicos de DNA em relação ao “template” inicial. Em seguida, a temperatura é

decrescida em um valor a cada ciclo diminuindo a especificidade do “primer” e facilitando a

amplificação final, sem perder a fidelidade ao “template” de DNA inicial (Don et al., 1991; Korbie

& Mattick, 2008). A vantagem na utilização desta técnica reside, principalmente, no fato de que não

se necessita testar diversas temperaturas até se encontrar uma adequada à amplificação, assim o

número de parâmetros a se variar diminui e pode-se obter o produto de uma amplificação mais

facilmente; ganha-se sensibilidade na técnica sem se perder a fidelidade ao fragmento que se deseja

amplificar.

Os ciclos termais de “touchdown” seguiram o protocolo proposto por Korbie & Mattick

(2008) com pequenas modificações (Tabela 3). As temperaturas de “melting” (Tm) dos “primers”

foram baseadas nos valores básicos fornecidos pela plataforma OligoCalc (Kibbe, 2007)

(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) e na média das Tm das fitas “forward”

e “reverse” de cada “primer”, fornecidas pelo fabricante, sendo que esses valores sofreram algumas

modificações ao longo da realização das PCRs.

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Tabela 3: Ciclos termais utilizados na técnica “touchdown” de PCR modificados a partir de Korbie & Mattick

(2008). O primeiro estágio representa a desnaturação inicial. Durante o segundo estágio a temperatura de

anelamento de (Tm +10°C) é decrescida em 1°C por ciclo, até atingir o valor (Tm - 5°C). Esse valor é repetido

por mais 20 ciclos durante o terceiro estágio. Tm = temperatura de “melting” dos “primers” baseado nos

valores base fornecidos pelo sítio OligoCalc (Kibbe, 2007) e a Tm das fitas “forward” e “reverse” de cada

“primer”, fornecidas pelo fabricante, de ≈ 45 °C para H2/L2 (16S) e ≈ 54 °C para LCO1-1490/HCO1-2198

(COI).

Estágio Passo Temperatura Tempo

Primeiro desnaturação 95°C 5 min

desnaturação 95°C 30 s

anelamento (Tm + 10°C) -1°C/ciclo 45 s

elogação 72°C 60 s

desnaturação 95°C 30 s

anelamento Tm - 5°C 45 s

elogação 72°C 60 s

elongação 72°C 10 min

"holding" 4°C ∞Término

Segundo (15

ciclos)

Terceiro (20

ciclos)

O material amplificado foi purificado por meio do Kit SureClean Plus® (Bioline USA Inc.),

seguindo o protocolo da empresa, e sequenciado por um sequenciador automático ABI 3100

Genetic Analyzer® (“Applied Biosystems automated sequencer”) do Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo ou do

Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

(FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), por meio do kit de

reação ABI Big Dye® Terminator Mix (PE Biosystems).

As sequências obtidas foram confirmadas pelo sequenciamento de ambas as fitas (senso e

anti-senso). A edição e o consenso das sequências foram realizados manualmente através do

programa BioEdit 7.0.9 (Hall, 2005). Além disso, o resultado do consenso de ambas as fitas foi

comparado com outras sequências depositadas em banco de dados genéticos utilizando-se o

programa de pesquisa BLASTn (“Basic Local Alignment Search Tool” -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml) para confirmação dos resultados.

Em seguida, as sequências produzidas foram alinhadas em ClustalW (Thompson et al., 1994,

implementado no programa BioEdit). O alinhamento múltiplo em ClustalW consiste em alinhar

todos os pares de sequências e calcular uma matriz de divergência entre elas. Nessa etapa, “gaps”

são introduzidos para aumentar o número de caracteres semelhantes e o programa confere uma

pontuação a esse alinhamento. A cada “gap” criado existe uma penalidade na pontuação e “gaps”

conseguintes recebem uma penalidade menor (Hall, 2008). Isso dificulta que sequências muito

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distantes (i.e. não homólogas) sejam alinhadas pela introdução de muitos “gaps”. Em seguida, o

algoritmo constrói uma árvore-guia com base na matriz de divergência entre elas usando o método

de “neighbour-joining” (Saitou & Nei, 1987). A partir dela é realizado o alinhamento progressivo

de todas as sequências, seguindo os ramos da árvore-guia e considerando a penalidade conferida

pela abertura de “gaps” (Thompson et al., 1994). Esse processo é essencial para eliminar possíveis

ruídos (e.g. resultados duvidosos de sequenciamento) que possam interferir nas análises (Pileggi,

2009).

A partir desse alinhamento “corrigido”, em que o tamanho das sequências foi aproximado,

retirando-se outros genes, no caso de sequências de genoma mitocondrial completo adicionadas a

partir do GenBank, e algumas bases das extremidades não compartilhadas entre a maior parte das

sequências (i.e. bases fruto de uma amplificação de tamanhos desiguais entre os PCRs), foram

realizadas as demais análises. Os “gaps” entre as sequências foram indicados por “-“ e “missing-

data” por ”?”.

Análise de Saturação e Sinal Filogenético dos Dados

Antes de se iniciar qualquer procedimento de inferência filogenética, verificou-se a qualidade

dos dados em relação ao grau de saturação de transições e do sinal filogenético contido nestes.

Para se obter alguma inferência de qualidade, i.e. que tenha grande probabilidade de

representar a história evolutiva de um grupo, as sequências utilizadas não podem exibir uma taxa

muito baixa de substituição, insuficiente para mostrar divergência, mas também não podem ser

extremamente variáveis a ponto de exibirem saturação de substituição (Xia & Lemey, 2009). A

saturação pode ocorrer entre sequências bastante divergentes, em que o número de transversões

supera muito o de transições e isso diminui a informação filogenética nesses dados.

Em razão disso, realizou-se a plotagem dos valores de transições e de transversões de acordo

com a distância de TN93 (Tamura & Nei, 1993) no programa DAMBE (Xia & Xie, 2001) para se

identificar possível saturação nos dados.

Outro fator que afeta a informação filogenética é a presença de ruído aleatório em função de

taxas de alteração de bases bastante elevadas, capazes de randomizar os dados em relação à história

evolutiva (Hillis, 1991). De acordo com isso, o sinal filogenético dos alinhamentos também foi

testado como recomendado por Schneider (2007), pelo método da estatística G1 (Hillis, 1991; Hillis

& Huelsenbeck, 1992). Esse parâmetro mede o grau de “torção” (“skewness”) de uma distribuição

(Sokal & Rohlf, 1981) e plotando-se o comprimento de ramos pelo número de árvores pode-se obter

uma distribuição capaz de indicar o sinal filogenético dos dados. Caso exista sinal filogenético, a

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distribuição se mostrará “arrastada” para a direita, por outro lado, dados sem informação

filogenética exibirão uma distribuição simétrica (Hillis & Huelsenbeck, 1992). Para tal foram

geradas 1.000.000 árvores aleatórias no programa PAUP* 4.0b (“Phylogenetic Analysis Using

Parsimony and Other Methods”) (Swofford, 2002) com a parcimônia como critério de otimização

direta, sendo que a frequência do comprimento de ramos dessas árvores foi plotada no programa

SigmaPlot® 11.0 (Systat Software, Inc.).

Entretanto, de acordo com Xia et al. (2003), esse método pode levar a se considerar a

presença de sinal filogenético em um alinhamento que apresente grupos muito proximamente

relacionados (e.g. espécies irmãs) mesmo quando os demais táxons apresentem completa saturação

de substituição. Assim, para se tornar mais concreta a conclusão a respeito da qualidade da

informação filogenética dos dados, também se calculou o índice de saturação de substituição

(“index of substitution saturation”; Xia et al., 2003). Esse índice baseia-se na entropia da

informação e relaciona o grau de saturação (Iss) a um valor crítico (Iss.c), a partir do qual os dados

são incapazes de retomar a filogenia verdadeira.

Análise de Distância Genética

A matriz de divergência genética foi construída com o intuito de se tornar mais facilmente

visualizável a diferenciação entre os grupos e também de indicar algumas distinções nas sequências

de bases nucleotídicas que não aparecem nas topologias construídas. Porém, esses dados não

representam qualquer relação evolutiva entre os grupos e simplesmente indicam uma relação

fenética entre eles.

O método mais simples de cálculo de distância genética é a distância-p, que se baseia na

proporção observada de diferenças entre as sequências (Hall, 2008). Entretanto, esse método

desconsidera a história evolutiva de cada sítio e muito subestima a diferença genética entre grupos

que divergiram há bastante tempo. Uma análise a priori mostrou valores bastante semelhantes de

distância genética entre clados pertencentes a subfamílias distintas (e.g. Charybdis vs. Arenaeus)

em relação àquela entre grupos que divergiram mais recentemente (e.g. Arenaeus vs. Callinectes).

Dessa forma, optou-se por utilizar um método de cálculo de distância que servisse melhor aos

propósitos iniciais. Entre os modelos de distância, o modelo de TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993 +

Gama) é aquele que mais considera parâmetros, levando em conta múltiplas substituições,

diferenças nas taxas de substituição de nucleotídeos e a desigualdade na frequência de bases (Russo

et al., 2001), com as substituições seguindo uma distribuição gama, que garante a heterogeneidade

entre os sítios (Russo et al., 2001). Dessa forma, a divergência histórica desses grupos não é

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subestimada em função de fatores que não podem ser vistos hoje nas sequências, como a ocorrência

de múltiplas substituições que levam alguns sítios a exibirem a mesma base observada depois de

diversas alterações em um contexto hereditário-temporal.

Levando esses fatos em consideração, as matrizes de divergência genética foram calculadas

no programa PAUP* 4.0b com um valor de gama previamente estimado pelo programa jModelTest

(Posada, 2008), no qual o modelo de substituição, que prevê o valor de gama, foi selecionado a

partir do critério de informação Akaike (Akaike, 1973), como recomendado por Posada & Buckley

(2004), porém corrigido para pequenas amostras (AICc) (Hurvich & Tsai, 1989).

Busca pela melhor árvore filogenética - “Maximum-Likelihood”

O método de busca “maximum likelihood” (ML) (Felsenstein, 1973; 1981) procura pela

árvore que maximiza a probabilidade de se observar um conjunto de dados em questão, seguindo as

taxas de substituição de um nucleotídeo para outro de acordo com o modelo evolutivo especificado

(Hall, 2008). A busca foi realizada com o programa RAxML 7.2.7 (“Randomized Axelerated

Maximum Likelihood”) (Stamatakis, 2006) implementado no sistema CIPRES

(“Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research”) (http://www.phylo.org). RAxML oferece um

algoritmo alternativo para realização do teste de consistência de “bootstrap” (Felsenstein, 1985),

mais rápido que o tradicional (Stamatakis et al., 2008).

O algoritmo de “rapidbootstrap” (Stamatakis et al., 2008) inicia a busca por uma árvore mais

parcimoniosa construída a partir do alinhamento original e em seguida otimiza os valores dos

parâmetros do modelo de substituição e os comprimentos de ramos. Após este passo, inicia-se uma

busca pelas réplicas de “bootstrap” durante várias gerações, comparando-as à original, e

considerando que a árvore em que se baseia uma geração de réplica é aquela resultante da geração

anterior. A cada 10 gerações o algoritmo retoma o alinhamento original e constrói nova árvore mais

parcimoniosa e nela se baseia para novo cálculo de “bootstrap”, seguindo os parâmetros

anteriormente citados. Esse procedimento favorece a velocidade no cálculo de “bootstrap” e

dificulta que o algoritmo fique preso em um “local optima”, enviesando os valores de suporte

(Stamatakis et al., 2008).

Apesar de compreender um algoritmo alternativo, o método de “rapidbootstrap” ainda

mantém a essência do original e dessa forma, é válido esclarecer como este funciona. O método de

“bootstrap” consiste em reamostrar com reposição os dados, ou seja, construir novos alinhamentos

(pseudo-alinhamentos), cuja base que inicia todas as sequências não é necessariamente a primeira

base que aparece no alinhamento original. Esses novos alinhamentos são construídos considerando

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que cada sítio de nucleotídeos nas sequências tenha evoluído independentemente, e a partir deles

são obtidas novas topologias (Felsenstein, 1985; Pereira et al., 2001; Hall, 2008). Os valores de

“bootstrap” representam a frequência com que essas novas topologias se assemelham à topologia

original.

Na estrutura do CIPRES, não é necessário especificar o modelo evolutivo, o próprio

algoritmo do RAxML assume um modelo GTR+Γ+I (“General Time Reversible”, Tavaré, 1986 +

Gama + sítios invariáveis) e calcula o valor de cada parâmetro. Essa assunção é válida já que GTR é

o modelo que mais considera parâmetros, assumindo frequências de bases distintas, e taxa de

variação distinta entre cada possibilidade de substituição (Pereira et al., 2001). Entretanto, deve-se

especificar um ou mais táxons do alinhamento para serem utilizados no enraizamento da filogenia e,

nesse caso, Liocarcinus depurator e Liocarcinus vernalis foram indicados como grupos externos

para ambos os genes. Além disso, adotou-se a opção do próprio programa calcular o número ideal

de réplicas de “rapidbootstrap” de acordo com as necessidades dos dados.

Para a análise do fragmento do gene COI, utilizou-se um comando de partição por posição do

códon, que permite que os parâmetros sejam estimados independentemente entre a primeira, a

segunda e a terceira posições do códon. Isso porque esse gene é codificante e, sabidamente, nesse

caso, a terceira posição envolve mais rapidamente que as demais, enquanto a segunda, envolve mais

lentamente que todas (Xia & Lemey, 2009), exigindo, desse modo, parâmetros distintos para cada

posição.

A árvore produzida foi visualizada e editada no programa FigTree v1.3.1 (Rambaut, 2009),

evitando-se ao máximo qualquer procedimento de edição que pudesse interferir nos resultados. A

topologia final é apresentada apenas com os valores iguais ou superiores a 50% do teste de

consistência.

Busca pela melhor árvore filogenética – Inferência Bayesiana

O método de análise bayesiana (Yang & Rannala, 1997) está baseado na noção de

probabilidade posterior, ou seja, a probabilidade de se observarem certos dados já se conhecendo

algo a respeito deles e isso implica em imporem-se condições às análises (Hall, 2008). Como não

são possíveis de se calcular diretamente essas probabilidades, o algoritmo utiliza uma aproximação

pelo método de “Markov Chain Monte Carlo” (MCMC).

As análises se procederam no programa MrBayes 3.2 (Huelsenbeck et al., 2001), sendo que o

modelo evolutivo que melhor se ajustou aos dados foi escolhido no programa MrModeltest v2.3

(Nylander, 2004) segundo o critério AIC (“Akaike information criterion”). De acordo com Nylander

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(2004), o método de MCMC trabalha sobre a incerteza dos parâmetros e por isso deve-se indicar

apenas a forma geral do modelo, determinada pelo MrModeltest.

Para o fragmento de 16S mtDNA, foram utilizadas duas análises simultâneas (nruns=2)

durante 10.000.000 de gerações com quatro cadeias paralelas cada, sendo apenas uma delas a cadeia

fria (“cold chain”), e a temperatura de aquecimento das cadeias ajustada para 0.1. Para cada análise,

as árvores e os parâmetros eram amostrados a cada 100 gerações. A convergência entre as análises

foi estimada pelo programa Tracer v.1.4 (Rambaut & Drummond, 2007), assim como pela

observação do desvio-padrão de divisão (“standard split deviation”), que, como recomendado pelos

autores do programa, deve representar um valor abaixo de 0.01. A partir de uma observação do

padrão dessa convergência, assumiu-se um valor de “burnin” de 0.25, descartando os primeiros

25% dos dados obtidos, incluindo as árvores e os demais parâmetros também amostrados.

Enquanto que para o fragmento do gene COI utilizou-se a partição dos dados por posição do

códon, assim como para as análises de “maximum likelihood”, e assim os parâmetros evolutivos

foram estimados independentemente para cada posição. Os demais parâmetros do algoritmo, exceto

o número de gerações e o modelo de substituição, foram semelhantes aos utilizados para as análises

do gene 16S mtDNA. O primeiro caso de divergência, o número de gerações, teve seu valor

reduzido a 5.000.000, visto que o observado anteriormente foi a aquisição de congruência entre as

análises simultâneas muito rapidamente. Além disso, o modelo assumido para cada posição foi

GTR+Γ+I (“General Time Reversible” + Gama + sítios invariáveis) e permitiu-se ao programa

estimar os valores independentemente para cada uma das posições. Essa atitude partiu do princípio

de que esse modelo de substituição considera o maior número de parâmetros a se calcular e isso não

implica em se impor parâmetros adicionais, que não se ajustem aos dados, por se utilizar um

modelo mais robusto.

A árvore final representa um consenso de maioria (“majority consensus”) de 50% e foi

visualizada e editada no programa FigTree v1.3.1 (Rambaut, 2009), evitando-se ao máximo

qualquer procedimento de edição que pudesse interferir nos resultados. A topologia final é

apresentada apenas com os valores iguais ou superiores a 50% de probabilidade posterior.

Busca pela melhor árvore filogenética – Máxima Parcimônia

A máxima parcimônia (MP) baseia-se no princípio de que qualquer caráter genético de um

indivíduo é transmitido a seus descendentes e, se dois indivíduos compartilham determinada

característica, é mais provável que a tenham herdado a partir de um ancestral comum do que a

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tenham adquirido independentemente (Fitch, 1971). Assim, a MP busca pela árvore com menor

número de passos, assumindo-a como a mais parcimoniosa.

As análises de MP foram realizadas no programa POY 5.0.1 (Varón et al., 2010) que possui

um método de homologia dinâmica, capaz de incorporar a ocorrência de inserções, deleções e

substituições entre os sítios. Inicialmente, os “gaps” dos alinhamentos foram retirados através do

programa BioEdit v7.0.9. Esse procedimento é necessário porque o POY apresenta um método de

alinhamento distinto do alinhamento múltiplo. O algoritmo do programa utiliza a alinhamento de

otimização (“optimization alignment”) (Wheeler, 1996), que leva em consideração eventos de

inserção e deleção (“indels”) na produção de um alinhamento mais parcimonioso. Além disso, o

POY inclui um método dinâmico de otimização, que produz novos alinhamentos a cada busca de

árvore realizada (Pileggi, 2009).

Foram construídas 50 árvores iniciais pela adição randômica de sequências através do

algoritmo de Wagner (Farris et al., 1970). Esse método busca conectar um ramo terminal na posição

que minimize o custo de uma árvore e na qual é inserido o próximo ramo terminal, seguindo os

mesmos princípios. Esse procedimento se repete consecutivamente até todos os táxons serem

adicionados (Wheeler et al., 2006; Varón et al., 2010). A matriz de custo foi ajustada para 1,2,1

para substituições, “indels” e abertura de “gaps”, respectivamente, e para o enraizamento destas

árvores foi selecionada, aleatoriamente, uma das espécies de Liocarcinus.

Os cladogramas produzidos foram refinados pelos métodos alternados de “branch-swapping”

(“subtree pruning and regrafting”, SPR, e “tree bisection and reconnection”, TBR), com o intuito

de rearranjar as topologias e permitir que apenas aquelas de menor custo (abaixo de um limiar de

5%) fossem selecionadas. Seguido disso, as árvores tiveram 20% de seus caracteres repesados

aleatoriamente seguindo um procedimento de “ratchet” durante 15 turnos, impedindo que um

resultado fique preso em um “local optima” e siga a busca pelo “global optima” (Wheeler et al.,

2006). Outro método adotado para se evitar esse “local optima” é a fusão (troca) de ramos entre

árvores de composição idêntica, mas que diferem em resolução (“tree fusing”, Goloboff, 1999)

(Wheeler et al., 2006), sendo que o valor adotado foi de 50 trocas.

Em seguida, as melhores topologias foram selecionadas e salvas como um consenso, enquanto

as demais foram descartadas. Para se testar a confiabilidade desses resultados, utilizou-se o método

de Bremer (1988; 1994), já que não se é indicado utilizar o procedimento de “bootstrap” em função

do método dinâmico de alinhamento, o qual já permite rearranjos distintos entre os alinhamentos

produzidos (Varón et al., 2010). O índice de decaimento de Bremer (“Bremer decay index”) é

baseado no princípio da parcimônia e mostra quantos passos adicionais seriam necessários para se

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colapsar um ramo na árvore consenso (Bremer, 1994). Dessa forma, ramos com baixos valores não

são bem suportados.

Para o cálculo dos valores de Bremer, foram construídas 50 árvores de Wagner adicionais,

refinadas pelos métodos de “branch swapping”. A topologia final foi visualizada e editada no

programa FigTree v1.3.1 (Rambaut, 2009), evitando-se ao máximo qualquer procedimento de

edição que pudesse interferir nos resultados, e é exibida apenas com os valores de suporte

superiores a 1.

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Resultados

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Revisão Taxonômica

Arenaeus DANA, 1851

Arenaeus Dana, 1851: 130 (espécie-tipo Portunus cribrarius Lamarck, 1818, por monotipo;

gênero masculino)

Euctenota Gerstaecker, 1856: 131 (espécie-tipo Euctenota mexicana Gerstaecker, 1856, por

monotipo; gênero feminino)

Arenaeus cribrarius LAMARCK, 1818

(Figuras 1-A, 5, 7-A, 8-A; 9 e 11-A)

Portunus cribrarius Lamarck, 1818: 259 (localidade-tipo, Brasil; tipo no Museu de Paris)

Lupa maculata Say, 1818: 445 (localidades-tipo, Georgia e Flórida; tipos não existentes)

Lupa cribraria Milne-Edwards, 1834: 452, explicação das pranchas p. 15, pl. 17, figs. 1-4

Arenaeus cribrarius Dana, 1852: 290, pl. 18, figs. 2A-2B; Rathbun, 1901: 50; 1930: 134, pl.

58, figs. 2-3, pls. 59-60; Hay & Shore, 1918: 434, pl. 34, fig. 3; Williams, 1965: 173, fig. 153;

1974: 30, fig. 86; 1984: 362 fig. 292; Coelho & Ramos, 1972: 188; Taissoun, 1973: 52, foto 9, figs.

8A-9A; Felder, 1973: 55, pl. 8, fig.4; Powers, 1977: 74; Rodríguez, 1982: 150, fig. 5 p.148; Melo,

1996: 311

Neptunus cribrarius Milne Edwards, 1861: 211 (para referência ver Rathbun, 1930)

?Arenaeus websteri Jones, 1968: 156, foto p. 155

Localidade-tipo: Brasil (não especificado)

Distribuição geográfica: Atlântico ocidental – Massachusetts, EUA; Golfo do México,

Antilhas; Colômbia; Venezuela; Brasil (desde o Ceará até o Rio Grande do Sul); Uruguai e Mar Del

Plata, Argentina (para referências ver Williams, 1984; Melo, 1996; Scelzo, 2001).

Material examinado: - 1 macho (CC 30,41 mm) UNAM 9639: MÉXICO, Punta Estrella,

Puerto Morelos, Quintana Roo, 19.ii.1972, (coletores J.C. Nates, A. Cantú, J.L. Villalobos, D. Valle

& P. Schmidstorf);- 1 macho (CC 23,50 mm) UNAM 3579: MÉXICO, El Morro de la Mancha,

Veracruz, 20.viii.1984, (col. D. Baños);- 1 macho (CC 47,50 mm) e 1 fêmea (CC 25,64 mm) UCR

2017-02: COSTA RICA, Playa Tortuguero, Limon, 9.i.1995, (col. J. Cortés);- 1 macho (CC 15,45

mm) e 1 fêmea (CC 27,20 mm) UCR 2470-10: COSTA RICA, N.O. Isla Pájaros, Moín, Limon,

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Resultados

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25.vii.2006, (cols. K. Rodrigues & M. Mug);- 2 fêmeas (CC 33,37 mm e 28,70 mm), CCDB 2930:

COSTA RICA, Playa Negra, próximo Estero Negro, Carretera, Cahuita, 22.v.2010, (cols. F.L.

Mantelatto et al.).;- 1 fêmea (CC 42,41 mm), CCDB 3635: VENEZUELA, La Restinga (El Saco),

25.viii.2011, (col. J. Bolaños);- 1 macho (CC 11,34 mm), DOUFPE 6880: BRASIL, Meireles,

Fortaleza, Ceará, 14.vii.1977, (coletor não informado);- 2 fêmeas (CC 24,10 mm e 18,86 mm),

CCDB 3391: BRASIL, Praia de Pirangi, Parnamirim, Rio Grande do Norte, 8.vi.2011, (col. R.

Robles);- 1 macho (CC 10,46 mm), DOUFPE 6873: BRASIL, Tambaú, Paraíba, 01.vii.1964,

(coletor não informado); 2 machos (CC 35,63 mm e 45,31 mm) DOUFPE 6876: BRASIL, Tambaú,

Paraíba, 25.ix.1972, (coletor não informado);- 1 macho (CC 10,51 mm), DOUFPE 6893: BRASIL,

Candeias, Pernambuco, 30.vii.1988, (coletor não informado);- 1 macho (CC 29,42 mm), DOUFPE

6871: BRASIL, Praia do Jaraguá, Maceió, Alagoas, 28.vi.1981, (coletor não informado);- 1 macho

(CC 17,24 mm), DOUFPE 6861: BRASIL, Santa Cruz Cabrália, Bahia, 10.ii.1999, (coletor não

informado);- 2 machos (CC 48,59 mm e 45,71 mm), CCDB 3255: BRASIL, Macaé, Rio de Janeiro,

10.vii.2011, (col. R.C. Costa);- 1 macho (CC 52,39 mm), CCDB 2725: BRASIL, Enseada de

Ubatuba, Ubatuba, São Paulo, 30.xi.2005, (col. F.L. Mantelatto);- 1 macho (CC 36,72 mm), CCDB

1536: BRASIL, Ubatuba, São Paulo, 17.viii.2011, (col. D. Rosa);- 2 machos (CC 50,75 mm e 47,13

mm), CCDB 754: BRASIL, Caraguatatuba, São Paulo, vii.2001, (col. F.L. Mantelatto);- 1 macho

(CC 29,88 mm) CCDB 291: BRASIL, Praia de Guaiuba, Guarujá, São Paulo, 22.x.2011, (cols. F.

Carvalho, N. Rossi, I. Leone & A. Costa);- 1 macho (CC 29,30 mm), CCDB 3700: BRASIL,

Peruíbe, São Paulo, 14.xii.2011, (cols. L. Zupolini & R. Amaral);- 1 macho (CC 24,31 mm), CCDB

3208: BRASIL, Praia Boqueirão Norte, Ilha Comprida, São Paulo, 17.iv.2011, (cols. F.L.

Mantelatto et al.);- 1 macho (CC 14,44 mm), CCDB 3182: BRASIL, Praia Boqueirão Sul, Ilha

Comprida, São Paulo, 17.iv.2011, (cols. Costa et al.);- 2 machos (CC 15,06 mm e 30,35 mm) e 1

fêmea (CC 34,68 mm), CCDB 3241: BRASIL, Cananéia, São Paulo, 18.iv.2011, (col. T.M.

Dawanso et al.);- 1 fêmea (CC 30,58 mm) e 1 macho (CC 51,61 mm), CCDB 3516: BRASIL, São

Francisco do Sul, Santa Catarina, 10.viii.2010, (col. S. Moura);- 3 fêmeas (CC 22,19 mm, 35,12

mm e 27,69 mm) e 3 machos (18,57 mm, 23,77 mm e 27,44 mm), CCDB 1461: BRASIL, São

Francisco do Sul, Santa Catarina, 28.v.2011, (col. A. L. Castilho);- 1 fêmea (CC 35,02 mm),

CCDB 1457: BRASIL, São Francisco do Sul, Santa Catarina, 25.v.2011, (col. A.L. Castilho);- 1

fêmea (CC 41,52 mm), CCDB 990: Brasil, Praia Santinho, Florianópolis, Santa Catarina,

28.i.2004, (coletor F.L. Mantelatto).

Diagnose: Carapaça mais larga do que longa, com dois espinhos laterais bastante

proeminentes e nove pares de dentes antero-laterais, incluindo os orbitais externos e os espinhos

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laterais; coloração amarelo-alaranjado claro, marrom-amarelada ou ainda marrom vináceo escuro,

geralmente, com manchas brancas abundantes na carapaça formando um retículo no dorso; manchas

brancas mais esparsas e maiores nos quelípodos; rostro estreito e curto, com quatro dentes, sendo os

dois internos mais próximos entre si que em relação aos externos; face superior das órbitas com

duas largas incisões em “V”; espinho no epistoma presente e não muito avançado; 2 espinhos no

carpo, um externo e outro interno, e dois dentículos próximos à face externa; palma com 5 carenas

longitudinais; bordas espiniformes proeminentes no segundo segmento abdominal; sexto segmento

abdominal estreito no macho; margens do telso sinuosas.

Redescrição

Coloração: Amarelo-alaranjado claro, sem manchas visíveis (preservação em álcool) ou com

manchas esparsas, marrom-amarelada ou ainda marrom vináceo escuro, com manchas brancas

formando um retículo no dorso da carapaça, não distribuídas de forma uniforme pela carapaça e

menores nas porções anteriores (especialmente na região gástrica). Manchas nos quelípodos,

quando presentes, relativamente grandes e distribuídas de forma mais dispersa. Extremidade do

dátilo das pernas ambulatórias amarela. Coloração e manchas se perdem em longos períodos de

conservação em álcool.

Carapaça: Carapaça mais larga do que longa, de textura granular quando observada em lupa.

Sulcos inter-regionais aparentemente mais profundos nos jovens que nos adultos. Lóbulo

interbranquial, aparentemente, mais proeminente nos jovens que nos adultos. Ângulo posterolateral

bastante espinhoso ou praticamente arredondado.

Dentes anterolaterais e Espinho lateral: Nove pares de dentes anterolaterais, incluindo os

orbitais externos e os espinhos laterais; dentes anterolaterais de tamanhos discrepantes,

relativamente curtos e largos e com uma franja densa de cerdas abaixo; quatro primeiros dentes,

excluindo o orbital externo, bastante semelhantes e de menor largura nos indivíduos jovens; nos

adultos, quarto dente mais largo que os três primeiros, de proporções semelhantes entre si; sexto e

sétimo dentes bastante aciculados. Espinho lateral bastante proeminente, maior do que o

comprimento dos dentes 6 e 7 somados e aparentemente mais comprido em proporção nos jovens

que nos adultos. Espinho lateral, dentes 6 e 7 moderadamente curvados para frente e de

extremidades brancas.

Fronte: Regiões suborbital, subepática, antenal, pterigostomial e também epistoma,

geralmente, cobertos por cerdas. Regiões sub-branquiais cobertas com cerdas ao menos em parte ou

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de forma esparsa, ou ausente de cerdas. Espinho projetando-se a partir do epistoma, entre as

antênulas, proeminente nos adultos e pouco proeminente nos jovens.

Rostro: Estreito e curto, muito menos avançado que os ângulos orbitais externos e armado

com quatro pequenos dentes, os dois medianos mais proeminentes, avançados e mais amplamente

separados entre si que em relação aos externos, com os quais são parcialmente coalescidos. Dentes

externos pouco desenvolvidos e pouco proeminentes nos indivíduos jovens; dentes internos

semelhantes à forma adulta já nos juvenis. Seios laterais, entre os dentes rostrais externos e os

dentes orbitais internos, em forma de “U”, de bordas praticamente paralelas.

Órbitas: Região supraorbital com três dentes e um lóbulo. Dente orbital interno menos

proeminente em relação ao externo. Borda superior com duas incisões em “V”, a interna bem mais

profunda e marcada que a externa. Incisão externa praticamente não aparente nos indivíduos jovens.

Incisões externa e interna delimitando um lóbulo subtruncado relativamente largo. Dente interno à

órbita pequeno e pouco proeminente, menos avançado que os demais e que o rostro. Borda inferior

formando um amplo seio, de formato triangular, entre os dentes externo e interno. Dente externo

comum às bordas inferior e superior.

Pedúnculos oculares: Coloração semelhante à da carapaça ou ligeiramente divergente desta

em tonalidade. Manchas presentes ou não; se presentes, mais difusas, menos marcadas e de bordas

menos contrastantes com a coloração do pedúnculo.

Antenas e antênulas: Estruturas relativamente curtas. Antênulas com pedúnculo tri-

segmentado e flagelo com diversos segmentos, bastante curtos e achatados, dos quais se projetam

cerdas. Exopodito presente, composto por alguns artículos. Antenas com pedúnculo bi-segmentado

e flagelo longo, com diversos segmentos. Coloração semelhante à da carapaça ou divergente desta,

tanto em tonalidade, como em relação à presença de manchas.

Quelípodos: Curtos e robustos, de dentição formada por tubérculos, dentes e dentículos de

proporções bastante variadas.

Base e Ísquio dos quelípodos: Estruturas relativamente curtas e achatadas. Franja de cerdas

relativamente curtas na face interna. Dente interno na extremidade distal do ísquio ligeiramente

proeminente ou pouco desenvolvido.

Mero dos quelípodos: Estrutura relativamente alongada, prismática de extremidades

triangulares e estreitada próximo à junção base-mero. Franja de cerdas longas na borda interna e

pouco desenvolvida, restrita à porção distal, ou ausente, na borda externa. Três espinhos na face

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interna, geralmente, ordenados de forma crescente em tamanho no sentido próximo-distal. Dente

próximo à extremidade distal pouco proeminente e relativamente obsoleto. Sulco transverso,

próximo ao dente da extremidade distal, profundo e marcado, exceto nos indivíduos jovens. Dente

externo na extremidade distal bastante obsoleto e pouco desenvolvido.

Carpo dos quelípodos: Estrutura relativamente curta e cilíndrica. Dois espinhos curtos, um

interno e outro externo, bem desenvolvidos e agudos; espinho externo contínuo, no sentido

proximal, com uma carena pouco desenvolvida. Dois dentículos, um mais mediano e outro mais

medial, no dorso do carpo, ambos contínuos a carenas relativamente bem desenvolvidas no adulto.

Palma dos quelípodos: Estrutura relativamente alongada e cilíndrica, estreitada próxima às

extremidades. Cinco carenas longitudinais e dois espinhos, um na extremidade proximal, perto da

articulação com o carpo, e outro na distal, acima da base do dátilo. Duas proeminências distais,

próximas ao dátilo, relativamente pouco desenvolvidas; a mais dorsalizada, mais denticular e a mais

lateral, mais tuberosa; eventualmente, ainda menos visíveis nos indivíduos jovens.

Patas ambulatórias: Artículos relativamente largos, achatados e curtos. Mero da terceira pata

ambulatória com franja de cerdas curtas na face interna. Carpo com franja de cerdas curtas na face

interna; franja de cerdas ausente na terceira pata ambulatória. Própodo e dátilo com franjas de

cerdas curtas em ambas as faces, iguais ou não em comprimento entre as faces; franja na face

externa mais dorsalizada que a da face interna.

Patas natatórias: Amplas e robustas. Coxa com uma proeminência dorsal quase denticular na

extremidade distal, próximo à base. Ísquio com franja de cerdas curtas apenas na face interna.

Mero, nos juvenis de menor porte, ligeiramente menor em comprimento em proporção aos

indivíduos adultos; não aplicável a jovens de maior porte; mero com franja de cerdas curtas

presente na face interna e ausente ou restrita à porção distal na face externa; recorte profundo em

ambas as faces na porção distal. Carpo com franjas de cerdas em ambas as faces. Própodo de

formato piriforme; franja de cerdas na face externa mais desenvolvida que na interna. Dátilo ovalar;

franjas de cerdas de mesma proporção em ambas as faces. Própodo e dátilo bastante achatados.

Somitos abdominais e telso: Franja de cerdas bem curtas presente ou não nas bordas dos

somitos. Segundo segmento com dois espinhos laterais geralmente bastante proeminentes. Somitos

3-5 fusionados apenas no macho. Suturas de fusão aparentes ou pouco visíveis apenas nos jovens.

Sexto segmento com margens sinuosas e mais estreito na porção caudal que na base. Extremidade

caudal do telso bastante estreitada, quase aguda, nos machos adultos e pouco estreita nos jovens,

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com uma configuração praticamente triangular equilátera nestes; telso com uma configuração

praticamente triangular nas fêmeas.

Primeiro par de pleópodos masculinos: Alongados, estendendo-se até a extremidade do telso

e, geralmente, cruzando-se em suas porções finais. Cobertura densa de pequenos espinhos nas faces

externas e ventrais, por praticamente toda a porção basal, ausente na face dorsal. Porção terminal

com uma fileira regular de espinhos na superfície inferior. Fileiras de cerdas presentes próximas à

extremidade basal.

Segundo par de pleópodos masculinos: Alongados e finos. Porção basal coberta por fileiras de

cerdas. Porção terminal sem cerdas. Extremidade em forma de pinça. Espinhos ausentes por toda a

estrutura.

Biologia e Ecologia: Arenaeus cribrarius habita águas rasas de praias arenosas ao longo da

costa Atlântica. Pode ser encontrado desde a praia, na zona de varrido, como em profundidades de

até 68 m (Williams, 1984). O sedimento é preferencialmente arenoso, de particulado mais fino, com

silte ausente ou em pequenas proporções (Pinheiro et al., 1997; Guerra-Castro et al., 2007) e

matéria orgânica também em quantidade reduzida (Pinheiro et al., 1997; Mantelatto & Fransozo,

2000), apesar de Mantelatto & Fransozo (2000) terem encontrado uma relação positiva entre a

abundância de A. cribrarius e a presença de particulado mais grosseiro em Ubatuba, São Paulo

(Brasil). Além disso, a espécie é comumente relacionada com zonas de arrebentação de águas

energéticas (Fischer, 1978 apud Guerra-Castro et al., 2007; Williams, 1984).

A espécie é comumente reportada como esteno-halina, não estando associada a grandes

variações de salinidade. Isso se deve ao fato de não ser encontrada em regiões estuarinas (Pinheiro

et al., 1997; Carmona-Suaréz & Conde, 2002) e não suportar baixos valores de salinidade (Norse,

1978).

Leber (1982) apresentou uma sazonalidade na variação dos ambientes ocupados por A.

cribrarius em uma praia arenosa da Carolina do Norte (EUA). Nos meses de inverno, não foram

coletados espécimes tanto nas zonas de arrebentação, como na de varrido. Entretanto, durante o

verão e início de outono, períodos de maior abundância da espécie, os espécimes foram encontrados

durante o dia na zona de arrebentação e à noite, na zona de varrido. Durante o dia, o animal

permanece enterrado na areia, na zona de arrebentação ou proximidades, onde esse comportamento

facilita a captura de presas (Leber, 1982; Fischer, 1978 apud Guerra-Castro et al., 2007), apesar de

Carmona-Suaréz & Conde (2002) não relatarem essa relação entre os períodos do dia e a

abundância da espécie em Enseada de La Vela (Venezuela).

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Em outras latitudes, os períodos de maior abundância podem variar, como para os meses de

outono e início de primavera para Praia da Barra da Lagoa, Santa Catarina (Brasil) (Avila &

Branco, 1996) e durante o verão e inverno em Santos e São Vicente, São Paulo (Brasil) (Moreira et

al., 1988). A distribuição, geralmente, pode ser relacionada com a faixa térmica suportada pela

espécie, que varia entre 11,0 e 30,8º C (para referências ver Avila & Branco, 1996).

Em relação ao nicho ecológico de A. cribrarius, a espécie preda principalmente organismos

bentônicos, representados em maior parcela por crustáceos, moluscos e peixes (Leber, 1982;

DeLancey, 1989; Carmona-Suaréz & Conde, 2005), sendo encontrado também um grande

percentual de sedimento no estômago desses animais (Carmona-Suaréz & Conde, 2005).

A espécie se reproduz continuamente por todo o ano em regiões tropicais, com uma

intensificação nos meses de verão e inverno (Pinheiro, 1995). Nessas regiões, fêmeas ovígeras ou

fêmeas com gônadas maduras podem ser encontradas durante todo o ano, mas principalmente

durante os períodos de verão e primavera (Pinheiro & Fransozo, 2002). Em regiões temperadas,

fêmeas ovígeras ocorrem em maior quantidade de junho a agosto (Williams, 1984). O acasalamento

ocorre, principalmente, nos meses de outono, em regiões tropicais, envolvendo machos em período

intermuda e fêmeas em período pós-muda (Pinheiro & Fransozo, 2002), sendo que o macho se

mantém sobre a fêmea por quase dois meses durante a reprodução (Pinheiro & Fransozo, 1999).

As fêmeas apresentam desovas múltiplas, visto que grande porcentagem de fêmeas com ovos

em estágio avançados de desenvolvimento embrionário já apresentam gônadas totalmente maduras

(Pinheiro, 1995). Os valores de fecundidade da espécie variam de 135.210 a 682.156 ovos, números

considerados intermediários em comparação a outros portunídeos (Pinheiro & Terceiro, 2002).

Fêmeas ovígeras buscam sedimentos arenosos mais grosseiros como substrato nos períodos de

desova, possivelmente para melhor oxigenação dos ovos (Pinheiro et al., 1996).

A maturidade sexual de fêmeas coincide morfo e fisiologicamente em larguras de carapaça

com valores superiores a 59,7 mm, enquanto que os machos dessa espécie exibem maturidade

sexual morfológica a 52 mm e fisiológica a 63,4 mm, para estudos na região de Ubatuba, São Paulo

(Brasil) (Pinheiro & Fransozo, 1998). Nesse período, as fêmeas exibem um abdômen rosado, que

deve aumentar o potencial para acasalamento após a muda de puberdade (Pinheiro & Taddei, 2000).

Outros caracteres sexuais secundários, que indicam a maturidade sexual morfológica, são os

crescimentos alométricos da largura do abdômen de fêmeas adultas e do comprimento do própodo

quelar de machos (Pinheiro & Fransozo, 1993).

Considerações: O sulco transverso na extremidade distal do mero dos quelípodos é citado

como um “seio” por Rathbun (1930), sendo que o caráter em si não é acompanhado de nenhum

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adjetivo que torne a sua descrição explicativa no sentido de diferenciar morfologicamente as

espécies de Arenaeus. A presença de uma franja de cerdas curtas na bordas dos somitos abdominais

não pode ser considerada um caráter capaz de distinguir indivíduos juvenis de adultos, como

apresentado por Josileen & Menon (2005) para fêmeas de Portunus pelagicus LINNAEUS, 1758.

Além disso, nos jovens, dentículos e carenas no dorso e na extremidade distal do carpo se

encontram menos desenvolvidos e proeminentes do que nos adultos, podendo, inclusive, estar

ausentes ou pouco visíveis. Os sulcos inter-regionais, aparentemente, são mais profundos nos

juvenis do que nos adultos, assemelhando-se à condição observada em A. mexicanus. Um caráter

que apresentou variação, em um dos indivíduos analisados, foi o ísquio do primeiro par de patas

ambulatórias, que apresentou duas proeminências tuberculares em sua extremidade distal.

Arenaeus mexicanus GERSTAECKER, 1856

(Figuras 1-B, 6, 7-B, 8-B, 10 e 11-B)

Euctenota mexicana Gerstaecker, 1856: 131, pl. 5, figs. 3-4 (localidade-tipo, México; tipo no

Museu de Berlim)

Arenaeus bidens Smith, 1871: 90 (localidade-tipo, Corinto, Nicarágua; tipos no Museu de

Zoologia Comparada, Universidade de Harvard); Lockington, 1877

Neptunus mexicanus Milne Edwards, 1879: 212, pl. 42, figs. 3, 3A-3E

Neptunus (Neptunus) mexicanus Miers, 1886: 172

Neptunus cribrarius Cano, 1889: 90, 102, 213

Arenaeus mexicanus Faxon, 1895: 22; Rathbun, 1910: 537, 577, pl. 37, fig. 2; 1930: 137, pl.

58, fig. 1, pl. 61; Schmitt, 1939: 9; Garth, 1948: 35; Holthuis, 1954a: 28; 1954b: 161; Garth &

Stephenson, 1966: 53, pl. 5, fig. D, pl. 8, fig. D, pl. 10, fig. D, pl. 12, fig. B.

Localidade-tipo: México (não especificado)

Distribuição geográfica: Pacífico leste - Baja California, México; El Salvador; Nicarágua;

Costa Rica; Panamá; Colômbia; Equador; Peru e Chile (para referências ver Rathbun, 1930; Garth

& Stephenson, 1966; Guzmán & Peredo, com. pess. apud Retamal & Arana, 2000).

Material examinado: - 1 macho (CC 21,38 mm) e 2 fêmeas (CC 18,74 mm e 16,71 mm),

UNAM 3513: MÉXICO, Playa Pérula, Bahia de Chamela, Jalisco, 15.vi.1984, (cols. J.C. Nates,

J.L. Villalobos & A. Cantú);- 1 macho (CC 22,90 mm) UCR 2430-04: COSTA RICA, Playa

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Naranja, Golfo de Papagayo, Santa Elena, La Cruz, Guanacaste, Pacífico, 15.vii.2005, (coletor R.

Vargas);- 1 fêmea (CC 42,40 mm) UCR 835-001: COSTA RICA, Golfo de Nicoya, Pacífico,

5.v.1981, (coletor não informado), determinante A. Ditte;- 1 fêmea (CC 20,52 mm), CCDB 2936:

COSTA RICA, Puntarenas, Pacific Coast, 25.v.2010, (cols. F.L. Mantelatto et al.);- 1 macho (CC

29,60 mm) e 5 fêmeas (CC 28,90 mm, 26,70 mm, 27,40 mm, 28,40 mm e 24,20 mm), UCR 1382:

COSTA RICA, Playa Organo, Puntarenas, Pacífico, 16.v.1991, (coletor não informado), det. A.

Dittel;- 6 fêmeas (CC 40,20 mm, 37,80 mm, 35,70 mm, 36,10 mm, 37,80 mm e 37,40 mm) UCR

401: COSTA RICA, Caldera, Puntarenas, Pacífico, 29.iv.1970, (col. R. Saenz);- 2 machos (CC

47,60 mm e 55,40 mm) UCR 873: COSTA RICA, Isla del Caño, Pacífico, 17.xii.1970, (col. V.

Cruz); -1 macho (CC 12,04 mm), ULLZ 9113: COSTA RICA, Eastern Pacific Coast, 18.vii.2005,

(col. F.L. Mantelatto);- 1 macho (CC 14,76 mm), CCDB 1716: COSTA RICA, Pacífico, v.2005,

(col. R. Vargas).

Diagnose: Carapaça mais larga do que longa, com dois espinhos laterais bastante

proeminentes e nove pares de dentes antero-laterais, incluindo os orbitais externos e os espinhos

laterais, mais estreitos que em A. cribrarius; coloração amarelo-alaranjado claro, marrom-

amarelada ou ainda marrom vináceo escuro, geralmente com manchas brancas abundantes na

carapaça formando um retículo no dorso; manchas brancas mais esparsas e maiores nos quelípodos,

porém menos marcantes e mais claras que em A. cribrarius; rostro estreito e curto, com apenas dois

dentes medianos; face superior das órbitas com duas largas incisões em “V”; espinho no epistoma

ausente; apenas um espinho (interno) no carpo, o externo reduzido a um dentículo, e outros dois

dentículos próximos à face externa; palma com 5 carenas longitudinais; bordas espiniformes

proeminentes no segundo segmento abdominal; sexto segmento abdominal estreito no macho;

margens do telso sinuosas.

Redescrição

Coloração: Amarelo-alaranjado claro, sem manchas visíveis (preservação em álcool) ou com

manchas esparsas, marrom-vinácea ou mesmo vinácea, nesse último caso de coloração mais forte

na porção anterior do que na posterior. Manchas brancas formando um retículo no dorso da

carapaça, distribuídas de forma não-uniforme, menores nas porções anteriores (especialmente na

região gástrica). Coloração nos quelípodos menos marcante e mais clara, com manchas em menor

quantidade ou mesmo ausentes. Extremidade do dátilo das pernas ambulatórias amarela. Coloração

e manchas se perdem em longos períodos de conservação em álcool.

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Resultados

38

Carapaça: Carapaça mais larga do que longa, de granulação visível através de lentes. Sulcos e

suturas inter-regionais mais profundos. Lóbulo interbranquial bastante proeminente. Ângulo

posterolateral pouco espinhoso ou praticamente arredondado.

Dentes Anterolaterais e Espinho Lateral: Nove pares de dentes anterolaterais, incluindo os

orbitais externos e os espinhos laterais; dentes anterolaterais mais longos e estreitos que em A.

cribrarius e com franja de cerdas abaixo bem desenvolvida ou escassa. Os três primeiros, excluindo

o orbital externo, de tamanhos próximos; quarto e o quinto mais largos; quinto dente aciculado ou

não; sexto e sétimo bastante aciculados. Espinho lateral bastante proeminente e proporcionalmente

maior que em A. cribrarius. Espinho lateral, dentes 6 e 7 moderadamente curvados para frente e de

extremidades brancas.

Fronte: Cobertura de cerdas densa ou escassa pelas regiões antenal, pterigostomial,

subepática, sub-branquial e também pelo epistoma. Espinho partindo do epistoma ausente.

Rostro: Estreito e curto, menos avançado do que os ângulos orbitais externos, na mesma

altura dos internos e armado com dois dentes medianos. Seio mediano entre os dentes presente e em

forma de “U” ou de “V”. Seios laterais em forma de “U”, ligeiramente mais abertos e menos

retangulares que em A. cribrarius.

Órbitas: Região supraorbital com três dentes e um lóbulo. Dente orbital interno menos

proeminente em relação ao externo ou não. Borda superior com duas incisões em “V” deslocadas

medialmente; a primeira, a mais interna, mais profunda e marcada que a segunda. Incisões interna e

externa delimitando um lóbulo subtruncado quase retangular e menos largo que ou praticamente

semelhante a A. cribrarius, em termos de proporção. Dente interno à órbita pequeno e pouco

proeminente, menos avançado que os demais e que o rostro. Borda inferior com um amplo seio

entre os dentes externo e interno, de formato triangular. Dente orbital externo comum às bordas

inferior e superior e mais avançado que o interno.

Pedúnculo ocular: Coloração semelhante à da carapaça, ou divergente em termos de

tonalidade.

Antenas e antênulas: Estruturas relativamente curtas. Antênulas com pedúnculo tri-

segmentado e flagelo com diversos segmentos, bastante curtos e achatados, dos quais se projetam

cerdas. Exopodito presente, composto por alguns artículos. Antenas com pedúnculo bi-segmentado

e flagelo longo, com diversos segmentos. Coloração semelhante à da carapaça ou divergente desta,

tanto em tonalidade, como em relação à presença de manchas.

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Resultados

39

Quelípodos: Relativamente curtos e robustos, de dentição formada por tubérculos, dentes e

dentículos de proporções bastante variadas.

Base e Ísquio dos quelípodos: Estruturas relativamente curtas e achatadas. Franja de cerdas

curtas pouco desenvolvida nas bordas interna e externa, ou apenas a interna. Dente interno na

extremidade distal do ísquio ligeiramente proeminente.

Mero dos quelípodos: Estrutura relativamente alongada, prismática de extremidades

triangulares e estreitada próximo à junção base-mero Franja de cerdas bem desenvolvida na borda

interna e pouco desenvolvida, restrita à porção distal, ou ausente, na borda externa. Três espinhos

na borda interna, ordenados em tamanho crescente no sentido próximo-distal. Dente próximo ao

sulco transverso distal (seio sensu Rathbun, 1930) pouco desenvolvido. Sulco transverso também

pouco profundo. Dente pouco proeminente na extremidade distal, acima do sulco transverso.

Carpo dos quelípodos: Estrutura relativamente curta e cilíndrica. Apenas um espinho,

localizado na face interna; espinho externo reduzido a um dentículo dando origem a uma carena

desenvolvida. Outras duas carenas com dentículos terminais na extremidade distal. Mais dois

dentículos desenvolvidos na extremidade distal, próximos à face externa.

Palma dos quelípodos: Estrutura relativamente alongada e cilíndrica, estreitada próxima às

extremidades. Cinco carenas longitudinais presentes, sendo as superiores as mais desenvolvidas e as

duas inferiores menos aparentes. Espinho agudo na extremidade distal. Dentículo presente na

extremidade distal da segunda carena interna. Dentículo pouco proeminente na extremidade distal

da terceira carena mais interna. Espinho na extremidade proximal bastante proeminente.

Patas ambulatórias: Artículos relativamente largos, achatados e curtos. Mero da terceira pata

ambulatória com franja de cerdas curtas na face interna. Carpo com franja de cerdas curtas na face

interna; ausente na terceira pata ambulatória. Própodo com franja de cerdas desenvolvida apenas na

face interna ou na externa, ou ainda em ambas as faces. Dátilo com franja de cerdas em ambas as

faces, iguais ou não em comprimento; franja na face externa mais dorsalizada que a da face interna.

Patas natatórias: Amplas, robustas e achatadas. Coxa com uma proeminência dorsal quase

denticular na extremidade distal, próximo à base. Ísquio com franja de cerdas apenas na face interna

e pouco desenvolvida. Mero com franja de cerdas curtas ou longas na face interna; face externa do

mero com franja de cerdas pouco desenvolvida ou ausente; mero ligeiramente maior em

comprimento do que em A. cribrarius. Carpo com uma franja de cerdas curtas em ambas as faces.

Própodo de formato piriforme; franja de cerdas na face externa mais desenvolvida e com pelos mais

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Resultados

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longos que na interna. Dátilo ovalar; franjas de cerdas de mesma proporção em ambas as faces.

Própodo e dátilo bastante achatados.

Somitos abdominais e telso: Franja de cerdas bem curtas presente ou não nas bordas dos

somitos. Somitos 3-5 fusionados apenas nos machos. Suturas de fusão visíveis, ao menos uma

delas. Segundo segmento com dois espinhos laterais proeminentes. Sexto segmento estreitado no

ápice, de margens sinuosas. Extremidade caudal do telso bastante estreitada, quase aguda, nos

machos adultos e pouco estreita nos jovens, com uma configuração praticamente triangular

equilátera nestes; telso com uma configuração praticamente triangular nas fêmeas.

Primeiro par de pleópodos masculinos: Alongados, estendendo-se bem além do ponto médio

do telso. Extremidade achatada e arredondada, em formato de “colher”. Cobertura densa de

pequenos espinhos nas faces externas e ventrais, por praticamente toda a porção basal, ausente na

face dorsal. Porção terminal com uma fileira regular de espinhos na superfície inferior. Fileiras de

cerdas presentes próximas à extremidade basal.

Segundo par de pleópodos masculinos: Alongados e finos. Porção basal coberta por fileiras de

cerdas. Porção terminal sem cerdas. Extremidade em forma de pinça. Espinhos ausentes por toda a

estrutura.

Biologia e Ecologia: Arenaeus mexicanus habita regiões costeiras, desde a praia até 40 m de

profundidade, raramente ultrapassando os 90 m (Garth & Stephenson, 1966). As praias são,

geralmente, abertas (Garth, 1960), com áreas expostas (Godínez-Domínguez et al., 2002) e

substrato arenoso ou lamacento (Garth, 1960; Garth & Stephenson, 1966). A maior abundância é

registrada de março a abril na Bahía de Ancón (Peru) (Cornejo, 1998) e as fêmeas ovígeras

concentram-se de março e maio (Garth & Stephenson, 1966). Sua alimentação baseia-se

essencialmente na predação de crustáceos e moluscos (Cornejo, 1998).

Considerações: A região do epistoma entre as antênulas é mais profunda e abaulada do que

em A. cribrarius e não apresenta o espinho observado na espécie anterior. As aberturas dos seios

laterais, externos aos dentes do rostro, são sempre maiores do que em A. cribrarius, não formando

uma configuração retangular, como acontece nesta última. Alguns caracteres mostraram variações,

como uma franja extra de cerdas, que pode estar presente na face dorsal do mero e localizada

medialmente, uma franja de cerdas curtas ao redor das bordas dos segmentos abdominais, que pode

estar ausente. Outra variação importante reside na largura dos lóbulos intermediários de indivíduos

de latitudes distintas. Os animais analisados da Costa Rica exibem-nos mais largos que os do

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México. Em relação a A. cribrarius, essa estrutura, em indivíduos da localidade-tipo, é muito mais

estreita, seguindo a descrição de Rathbun (1930). Por outro lado, a diferença da largura relativa

dessa estrutura entre indivíduos de A. mexicanus da Costa Rica e A. cribrarius não é tão discrepante

e difícil de ser notada, sugerindo uma variação desse caráter em relação a populações distintas em

A. mexicanus.

Chave de Identificação para as espécies do gênero Arenaeus DANA, 1851

Quatro pequenos dentes no rostro; pequeno espinho na região do epistoma, entre as antênulas;

dois espinhos (externo e interno) no carpo................................................................A. cribrarius

Dois pequenos dentes no rostro; espinho na região do epistoma ausente; apenas um espinho

(interno) no carpo.......................................................................................................A. mexicanus

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Figura 5: Detalhes de porção do quelípodo direito (A) e da borda da carapaça (B) nas regiões do rostro e dentes orbitais

de Arenaeus cribrarius (CCDB 3255), evidenciando algumas das características diagnósticas em relação a A.

mexicanus, como o número de espinhos no carpo e de dentes no rostro. Barras correspondem a 0,4 mm. (Ilustrações por

M. Massarani).

B

A

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Figura 6: Detalhes de porção do quelípodo direito (A) e da borda da carapaça (B) nas regiões do rostro e dentes

orbitais de Arenaeus mexicanus (CCDB 2936), evidenciando algumas das características diagnósticas em relação a A.

cribrarius, como o número de espinhos no carpo e de dentes no rostro. Barras correspondem a 0,5 mm. (Ilustrações

por M. Massarani).

B

A

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Figura 7: Detalhe da ornamentação dos carpos de Arenaeus cribrarius (A) (CCDB 754) e de A. mexicanus (B)

(CCDB 2936). (A) Em A. cribrarius, pode-se observar a presença de dois espinhos no carpo, um externo e outro

interno (setas), uma característica diagnóstica da espécie em relação à sua análoga do Pacífico, A. mexicanus. (B) Em

A. mexicanus, por outro lado existe apenas um espinho no carpo, localizado internamente e indicado por uma seta,

enquanto que na face externa existe um dentículo, também indicado por seta.

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Figura 8: Vistas de parte das regiões frontais de Arenaeus cribrarius (A) (CCDB 754) e de A. mexicanus (B)

(CCDB 2936). Algumas das diferenças morfológicas entre as espécies que podem ser utilizadas em sua distinção

são a presença de dois dentes no rostro de A. cribrarius e de um espinho na região de seu epistoma, entre as

antênulas (seta-A), enquanto que em A. mexicanus são encontrados apenas dois dentes no rostro e não há algum

espinho na região do epistoma (seta-B), ao contrário, observa-se um abaulamento no local.

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Figura 9: Imagens do primeiro par de pleópodos masculinos de Arenaeus cribrarius (CCDB 754). (A) Vista dorsal da

estrutura como um todo. (B) Detalhe da ornamentação na porção basal do gonópodo, mostrando a presença de diversos

pequenos espinhos. (C) Detalhe da ornamentação na porção distal, seta indica a presença de uma única fileira de

diminutos espinhos na face inferior da estrutura. (D) Detalhe da extremidade distal em formato de “colher”.

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Figura 10: Imagens do primeiro par de pleópodos masculinos de Arenaeus mexicanus (UNAM 3513). (A) Vista dorsal

da estrutura como um todo. (B) Detalhe da ornamentação na porção basal do gonópodo, mostrando a presença de

diversos pequenos espinhos. (C) Detalhe da ornamentação na porção distal, seta indica a presença de uma única fileira

de diminutos espinhos na face inferior da estrutura. (D) Detalhe da extremidade distal em formato de “colher”.

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Figura 11: Ilustrações das vistas dorsais de um indivíduo juvenil de Arenaeus cribrarius (A) (CCDB 3182) e de um adulto de A. mexicanus (B) (CCDB 2936). Barras

correspondem a 0,25 mm em A e a 0,5 mm em B. (Ilustrações por M. Massarani).

B A

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Análises Moleculares

Saturação e Sinal Filogenético dos Dados

Fragmento do Gene 16S mtDNA

O alinhamento das sequências de 16S mtDNA apresentou um total de 557 pares de base e

exibiu um grau de saturação a partir de uma distância genética de aproximadamente 19%, valor a

partir do qual o número de transversões supera o de transições (Figura 12). Entretanto,

considerando-se o valor do índice de saturação de substituição (Iss), estimado em 0,2189 enquanto o

valor crítico é (Iss.c) de 0,6802, a saturação que ocorreu é baixa o suficiente para não interferir no

sinal filogenético dos dados. Além disso, a distribuição da frequência dos comprimentos de ramos

das árvores geradas apresentou uma configuração inclinada para a direita, assim como se espera

para dados contendo sinal filogenético (Figura 13).

Figura 12: Gráfico do número de transições e transversões exibidas pelas sequências parciais do gene 16S rDNA em

função da distância genética entre elas, calculada de acordo com o modelo de distância de Tamura & Nei (1993). A

saturação de substituição é observada a partir de um valor próximo a 19% de distância genética.

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Comprimento das árvores

700 800 900 1000 1100 1200

Fre

qu

ênci

a

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Figura 13: Frequência dos comprimentos de ramos de 1.000.000 de árvores aleatórias geradas no programa PAUP*

4.0b (Swofford, 2002) a partir dos dados das sequências de 16S mtDNA. Espera-se que dados contendo sinal

filogenético apresentem uma distribuição assimétrica e arrastada para a direita, assim como observado.

Fragmento do gene COI

O alinhamento das sequências do gene COI apresentou 683 pares de bases e não chegou a

exibir substituição de saturação como um todo (Figura 14). Além disso, o valor do índice de

saturação de substituição (Iss), calculado em 0,2696, ficou bem abaixo do valor crítico (Iss.c), de

0,7279. Entretanto, quando se calculou o índice utilizando apenas a terceira posição do códon, o

valor encontrado foi bastante elevado 0,5170, mas, mesmo assim, manteve-se substancialmente

abaixo de seu valor crítico, estimado em 0,6522.

Assim como para o gene 16S, a distribuição de frequência dos comprimentos de ramos das

árvores aleatórias produzidas também exibiu um padrão de distribuição típico de dados contendo

sinal filogenético (Figura 15).

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Figura 14: Gráfico do número de transições e transversões exibidas pelas sequências parciais do gene citocromo-

oxidase I (COI) em função da distância genética entre elas, calculada de acordo com o modelo de distância de Tamura

& Nei (1993). Como um todo, não se observa saturação nos dados, permitindo sua utilização em análises filogenéticas.

Comprimento das árvores

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Fre

qu

ênci

a

0

2000

4000

6000

8000

Figura 15: Frequência dos comprimentos de ramos de 1.000.000 de árvores aleatórias geradas no programa PAUP*

4.0b (Swofford, 2002) a partir dos dados das sequências de citocromo-oxidase I (COI). Espera-se que dados contendo

sinal filogenético apresentem uma distribuição assimétrica e arrastada para a direita, assim como observado.

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Distância Genética

Fragmento do Gene 16S mtDNA

A distância genética observada entre as espécies de Arenaeus (4,1-4,7%) (Tabela 4)

mostrou-se bastante superior à divergência intra-específica, que exibiu valores de 0-0,2% em ambas

as espécies.

Em relação à divergência entre Arenaeus e os demais gêneros de siris analisados, Arenaeus

cribrarius apresentou uma distância que variou de 14,6 a 17,9% em relação a Callinectes, de 12,9 a

21,6% com Portunus, de 22 a 23,2% com Achelous, de 16,6 a 19,5% com Charybdis e Thalamita, e

de 32,1 a 38,7% em relação a Liocarcinus. Para A. mexicanus, o cenário observado não foi tão

discrepante, com valores variando de 14,9 a 17,5% com Callinectes, de 11,6 a 23,8% com

Portunus, de 20,6 a 21,3% com Achelous, de 16,8 a 18% com Charybdis e Thalamita, e,

finalmente, de 31,7 a 36,7% em relação a Liocarcinus (Tabela 4).

Fragmento do Gene Citocromo-Oxidase I (COI)

O gene COI exibiu maior variação entre os grupos que o fragmento de 16S rDNA. Dentro

das espécies de Arenaeus, A. cribrarius apresentou uma divergência genética intra-específica de 0-

0,8%, enquanto para A. mexicanus esse valor variou de 0-0,9%. Já dentro o gênero, a variação

observada foi 22,1 a 26,7% (Tabela 5).

A divergência genética em relação aos outros gêneros também foi elevada. A distância de A.

cribrarius e Callinectes variou de 23,7 a 37,2%, em relação a Portunus, de 25,4-40%, com

Charybdis e Thalamita, de 28,3 a 41%, e com Liocarcinus, 36,2 a 63,8%. Para A. mexicanus, esses

valores foram de 28,6 a 34,6% em relação a Callinectes, de 27,7 a 41,5% com Portunus, de 31,5 a

38% com Charybdis e Thalamita, de 34,2 a 41% com Liocarcinus (Tabela 5).

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Tabela 4: Matriz de divergência genética, calculada a partir do modelo TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993+Gama), entre as sequências parciais do gene 16S rDNA de Arenaeus

cribrarius, A. mexicanus e de representante dos gêneros externos (Callinectes danae, C. ornatus, C. sapidus, C. similis, Portunus pelagicus, P. trituberculatus, P. sanguinolentus,

Achelous spinimanus, Charybdis hellerii, Thalamita danae, Liocarcinus depurator e L. vernalis). Os dados de todas as sequências estão agrupados de acordo com as espécies e os

valores destacados são discutidos no texto.

Espécie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. Arenaeus cribrarius 0-0,2%

2. Arenaeus mexicanus 4,1%-4,7% 0-0,2%

3. Callinectes danae 16,2-17,9% 16,6-17,3% 0%

4. Callinectes ornatus 16-16,5% 14,9-15,1% 3,9-4,4% 0%

5. Callinectes sapidus 14,6-16,7% 15,5-16,7% 7-8,2% 8,5-9% 0,6-1,3%

6. Callinectes similis 17-17,6% 17,1-17,5% 0,60% 3,20% 7-7,3% 0%

7. Portunus pelagicus 15,4-16,1% 16,2-16,5% 17,9-19,4% 19,90% 16,8-18% 19,50% 0%

8. Portunus trituberculatus 12,9-14,9% 11,6-13,7% 16,5-17,7% 16-17% 15,4-17,2% 15,9-16,9% 8,40% 0%

9. Portunus sanguinolentus 21,60% 23,7-23,8% 25,00% 24,40% 23,4-24,9% 25,00% 14,30% 12,1-12,2% 0%

10. Achelous spinimanus 22-23,2% 20,6-21,3% 23,6-27,3% 27,90% 25,2-28% 27,00% 25,30% 20-20,1% 29,10% 0%

11. Charybdis hellerii 16,6-17% 17,5-18% 21-21,2% 19,80% 18,8-20,1% 21,10% 19,90% 17,6-18,7% 21,30% 20,60% 0%

12. Thalamita danae 19,2-19,5% 16,8-17,3% 20-20,8% 18,30% 18,2-18,7% 19,10% 18,50% 15,2-15,3% 19,00% 19,70% 11,50% 0,00%

13. Liocarcinus depurator 32,1-34,2% 31,7-32-4% 36-37,8% 33,40% 35,2-36,1% 36,60% 37,50% 27,5-31,4% 39,10% 37,80% 26,80% 33,30% 0,00%

14. Liocarcinus vernalis 36,1-38,7% 35,5-36,7% 37,3-38,8% 36,10% 39,8-40% 38,10% 40,70% 29,9-34,3% 44,30% 36,70% 30,10% 33,70% 6,40%

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54

Tabela 5: Continua. Matriz de divergência genética, calculada a partir do modelo TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993+Gama), entre as sequências parciais do gene citocromo-oxidase I

(COI) de Arenaeus cribrarius, A. mexicanus e os representantes dos gêneros externos (Callinectes bellicosus, C. bocourti, C. sapidus, Portunus pelagicus, P. sanguinolentus, P.

trituberculatus, Charybdis hellerii, Thalamita seurati, Liocarcinus depurator e L. vernalis). Os valores destacados são discutidos no texto. (Países: BR: Brasil; CR: Costa Rica; VE:

Venezuela; PA: Panamá; JP: Japão; Estados da Costa Rica: Lm: Limón; Ch: Cahuita; Gu: Guanaceste; Pt: Puntarenas; Estados brasileiros: Rn: Rio Grande do Norte; Al: Alagoas; Rj:

Rio de Janeiro; Sp: São Paulo; Sc: Santa Catarina; Demais abreviações: ub: Ubatuba, cg: Caraguatatuba; Gu: Guarujá; Per: Peruíbe; pbn: Praia Boqueirão Norte; pbs: Praia Boqueirão

Sul; cn: Cananéia; fl: Florianópolis; sfs: São Francisco do Sul; sv: São Vicente ).

Espécime 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

1. Arenaeus

cribrarius -

CR (Lm)

2. Arenaeus

cribrarius -

CR (Ch)

0,2%

3. Arenaeus

cribrarius - VE 0,1% 0,0%

4. Arenaeus

cribrarius - BR

(Rn1)

0,3% 0,1% 0,2%

5. Arenaeus

cribrarius - BR

(Rn2)

0,3% 0,1% 0,1% 0,3%

6. Arenaeus

cribrarius - BR

(Al)

0,6% 0,4% 0,4% 0,3% 0,6%

7. Arenaeus

cribrarius - BR

(Rj)

0,2% 0,0% 0,0% 0,2% 0,2% 0,5%

8. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-ub1)

0,3% 0,2% 0,2% 0,3% 0,3% 0,2% 0,2%

9. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-ub2)

0,2% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,3% 0,0% 0,2%

10. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-ub3)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0%

11. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-ub4)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0%

12. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-ub5)

0,3% 0,1% 0,2% 0,0% 0,3% 0,3% 0,2% 0,3% 0,1% 0,2% 0,2%

13. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-cg)

0,2% 0,0% 0,0% 0,2% 0,2% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2%

14. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-gu)

0,4% 0,3% 0,3% 0,5% 0,5% 0,7% 0,3% 0,5% 0,3% 0,3% 0,3% 0,5% 0,3%

15. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-per)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,3%

16. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-pbn)

0,0% 0,2% 0,1% 0,3% 0,3% 0,6% 0,2% 0,3% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3% 0,2% 0,4% 0,1%

17. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-pbs)

0,4% 0,3% 0,3% 0,5% 0,5% 0,8% 0,3% 0,5% 0,3% 0,3% 0,3% 0,5% 0,3% 0,3% 0,3% 0,4%

Page 64: Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA ... · costa – cegamente, inexoravelmente compelindo por um apoio. Rachel Carson, The Edge of the Sea (1955) ... dia em que

Resultados

55

Tabela 5: Continua. Matriz de divergência genética, calculada a partir do modelo TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993+Gama), entre as sequências parciais do gene citocromo-oxidase I

(COI) de Arenaeus cribrarius, A. mexicanus e os representantes dos gêneros externos (Callinectes bellicosus, C. bocourti, C. sapidus, Portunus pelagicus, P. sanguinolentus, P.

trituberculatus, Charybdis hellerii, Thalamita seurati, Liocarcinus depurator e L. vernalis). Os valores destacados são discutidos no texto. (Países: BR: Brasil; CR: Costa Rica; VE:

Venezuela; PA: Panamá; JP: Japão; Estados da Costa Rica: Lm: Limón; Ch: Cahuita; Gu: Guanaceste; Pt: Puntarenas; Estados brasileiros: Rn: Rio Grande do Norte; Al: Alagoas; Rj:

Rio de Janeiro; Sp: São Paulo; Sc: Santa Catarina; Demais abreviações: ub: Ubatuba, cg: Caraguatatuba; Gu: Guarujá; Per: Peruíbe; pbn: Praia Boqueirão Norte; pbs: Praia Boqueirão

Sul; cn: Cananéia; fl: Florianópolis; sfs: São Francisco do Sul; sv: São Vicente ).

Espécime 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

18. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-can1)

0,0% 0,2% 0,1% 0,3% 0,3% 0,6% 0,2% 0,3% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3% 0,2% 0,4% 0,1% 0,0% 0,4%

19. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-can2)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,3% 0,0% 0,1% 0,3% 0,1%

20. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sp-can3)

0,3% 0,1% 0,1% 0,3% 0,0% 0,6% 0,2% 0,3% 0,1% 0,1% 0,1% 0,3% 0,2% 0,4% 0,1% 0,3% 0,5% 0,3% 0,1%

21. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sc-fl)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,3% 0,0% 0,1% 0,3% 0,1% 0,0% 0,1%

22. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sc-sfs1)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,3% 0,0% 0,1% 0,3% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0%

23. Arenaeus

cribrarius - BR

(Sc-sfs2)

0,1% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,4% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,3% 0,0% 0,1% 0,3% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0%

24. Arenaeus

mexicanus -

CR (Gu)

23,5% 23,1% 22,9% 22,7% 23,2% 24,2% 23,9% 25,0% 23,2% 22,9% 22,9% 22,7% 24,2% 23,3% 22,9% 23,5% 22,9% 23,5% 22,9% 23,2% 22,9% 22,9% 22,9%

25. Arenaeus

mexicanus -

CR (Pt1)

23,2% 22,6% 22,5% 22,1% 22,8% 23,8% 23,4% 25,4% 22,7% 22,5% 22,5% 22,1% 23,6% 22,9% 22,5% 23,2% 22,5% 23,2% 22,5% 22,8% 22,5% 22,5% 22,5% 0,9%

26. Arenaeus

mexicanus -

CR (Pt2)

24,5% 24,2% 24,0% 23,7% 24,3% 25,3% 23,7% 26,7% 24,3% 24,0% 23,9% 23,7% 24,8% 24,3% 23,9% 24,5% 23,9% 24,5% 24,0% 24,1% 23,9% 24,0% 24,0% 0,6% 0,6%

27. Arenaeus

mexicanus -

CR

22,9% 22,6% 22,5% 22,2% 22,7% 23,6% 23,2% 24,7% 22,8% 22,5% 22,3% 22,2% 23,6% 22,6% 22,3% 22,9% 22,3% 22,9% 22,5% 22,6% 22,3% 22,5% 22,5% 0,3% 0,6% 0,3%

28. Arenaeus

mexicanus -

PA

22,9% 22,6% 22,5% 22,2% 22,7% 23,6% 23,2% 24,7% 22,8% 22,5% 22,3% 22,2% 23,6% 22,6% 22,3% 22,9% 22,3% 22,9% 22,5% 22,6% 22,3% 22,5% 22,5% 0,3% 0,6% 0,3% 0,0%

29. Callinectes

bellicosus 36,5% 35,6% 35,6% 35,7% 35,9% 35,6% 37,2% 33,0% 35,6% 35,6% 35,5% 35,7% 33,8% 36,8% 35,5% 36,5% 35,8% 36,5% 35,6% 35,8% 35,5% 35,6% 35,6% 31,2% 30,5% 33,1% 30,6% 30,6%

30. Callinectes

bocourti 28,3% 27,6% 27,6% 27,0% 27,9% 27,6% 29,3% 25,9% 27,7% 27,6% 27,6% 27,0% 27,4% 28,6% 27,6% 28,3% 27,9% 28,3% 27,6% 27,9% 27,6% 27,6% 27,6% 30,6% 30,2% 31,7% 30,3% 30,3% 28,6%

31. Callinectes

sapidus - BR

(Sp-sv)

25,8% 25,4% 25,2% 25,0% 25,5% 26,6% 25,2% 26,4% 25,5% 25,2% 25,2% 25,0% 24,9% 26,1% 25,2% 25,8% 25,5% 25,8% 25,2% 25,5% 25,2% 25,2% 25,2% 34,5% 34,4% 34,1% 34,1% 34,1% 28,0% 16,4%

32. Callinectes

sapidus - BR

(Sp-cn)

24,7% 24,2% 24,1% 23,7% 23,9% 25,0% 25,4% 25,1% 24,2% 24,1% 24,1% 23,7% 24,5% 24,9% 24,1% 24,7% 24,4% 24,7% 24,1% 23,8% 24,1% 24,1% 24,1% 34,1% 33,9% 34,6% 33,8% 33,8% 23,9% 16,6% 2,9%

33. Portunus

trituberculatus 28,8% 28,2% 28,2% 27,6% 28,5% 28,2% 30,3% 25,7% 28,2% 28,2% 28,2% 27,6% 26,3% 29,1% 28,2% 28,8% 28,8% 28,8% 28,2% 28,5% 28,2% 28,2% 28,2% 29,5% 28,8% 30,2% 28,9% 28,9% 27,2% 26,5% 30,6% 33,8%

34. Portunus

trituberculatus

- JP

27,6% 27,3% 27,1% 26,2% 27,4% 27,7% 29,3% 25,4% 26,7% 27,1% 27,0% 26,2% 26,1% 27,9% 27,0% 27,6% 27,6% 27,6% 27,1% 27,3% 27,0% 27,1% 27,1% 28,4% 27,9% 29,2% 27,7% 27,7% 27,8% 26,7% 30,4% 32,7% 0,3%

35. Portunus

pelagicus 29,6% 29,0% 29,0% 28,3% 29,3% 29,0% 31,0% 28,2% 29,0% 29,0% 29,0% 28,3% 28,6% 29,3% 29,0% 29,6% 29,0% 29,6% 29,0% 29,3% 29,0% 29,0% 29,0% 30,7% 30,6% 31,2% 30,7% 30,7% 33,2% 40,9% 40,5% 36,3% 27,0% 27,2%

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Resultados

56

Tabela 5: Conclusão. Matriz de divergência genética, calculada a partir do modelo TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993+Gama), entre as sequências parciais do gene citocromo-oxidase I

(COI) de Arenaeus cribrarius, A. mexicanus e os representantes dos gêneros externos (Callinectes bellicosus, C. bocourti, C. sapidus, Portunus pelagicus, P. sanguinolentus, P.

trituberculatus, Charybdis hellerii, Thalamita seurati, Liocarcinus depurator e L. vernalis). Os valores destacados são discutidos no texto. (Países: BR: Brasil; CR: Costa Rica; VE:

Venezuela; PA: Panamá; JP: Japão; Estados da Costa Rica: Lm: Limón; Ch: Cahuita; Gu: Guanaceste; Pt: Puntarenas; Estados brasileiros: Rn: Rio Grande do Norte; Al: Alagoas; Rj:

Rio de Janeiro; Sp: São Paulo; Sc: Santa Catarina; Demais abreviações: ub: Ubatuba, cg: Caraguatatuba; Gu: Guarujá; Per: Peruíbe; pbn: Praia Boqueirão Norte; pbs: Praia Boqueirão

Sul; cn: Cananéia; fl: Florianópolis; sfs: São Francisco do Sul; sv: São Vicente ).

Espécime 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

36. Portunus

sanguinolentu

- VI

38,3% 37,9% 37,7% 37,4% 38,0% 39,2% 40,0% 35,6% 38,1% 37,7% 37,4% 37,4% 37,9% 37,9% 37,4% 38,3% 37,1% 38,3% 37,7% 37,8% 37,4% 37,7% 37,7% 40,5% 39,8% 41,5% 39,9% 39,9% 32,4% 36,6% 31,4% 33,5% 37,9% 35,8% 34,7%

37. Charybdis

hellerii 29,6% 28,9% 28,9% 28,3% 29,2% 30,0% 30,9% 28,8% 28,9% 28,9% 28,9% 28,3% 31,1% 29,9% 28,9% 29,6% 28,9% 29,6% 28,9% 29,2% 28,9% 28,9% 28,9% 31,5% 31,2% 31,6% 31,2% 31,2% 28,4% 30,5% 38,0% 37,1% 30,0% 28,8% 31,9% 39,3%

38. Thalamita

seurati 39,7% 38,8% 38,8% 39,8% 38,4% 38,8% 39,3% 35,3% 38,8% 38,8% 38,8% 39,8% 38,9% 40,1% 38,8% 39,7% 39,6% 39,7% 38,8% 38,4% 38,8% 38,8% 38,8% 37,7% 38,0% 37,1% 36,9% 36,9% 31,8% 39,1% 35,0% 35,3% 39,7% 40,0% 54,1% 41,0% 37,9%

39.

Liocarcinus

depurator

36,9% 36,2% 36,2% 35,5% 36,7% 36,2% 37,3% 37,2% 36,2% 36,2% 36,2% 35,5% 36,7% 37,4% 36,2% 36,9% 37,1% 36,9% 36,2% 36,6% 36,2% 36,2% 36,2% 33,8% 33,7% 35,6% 34,2% 34,2% 43,2% 37,1% 38,1% 41,1% 34,6% 35,1% 48,4% 58,3% 34,8% 42,4%

40.

Liocarcinus

vernalis

60,7% 59,2% 59,1% 57,6% 59,5% 59,2% 57,8% 63,8% 59,3% 59,1% 59,0% 57,6% 59,2% 60,7% 59,0% 60,7% 59,4% 60,7% 59,1% 59,4% 59,0% 59,1% 59,1% 40,9% 41,0% 40,9% 40,5% 40,5% 45,7% 41,3% 40,3% 41,0% 36,8% 36,8% 38,2% 50,2% 42,3% 46,8% 20,6%

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Resultados

57

Análises Filogenéticas

Fragmento do Gene 16S mtDNA

O alinhamento final de 16S contou com 34 sequências, das quais 14 são pertencentes a

Arenaeus cribrarius, quatro a A. mexicanus, duas a Callinectes danae SMITH, 1869, uma a C.

ornatus ORDWAY, 1863, três a C. sapidus RATHBUN, 1896, uma a C. similis WILLIAMS, 1866,

uma a Portunus pelagicus, duas a P. trituberculatus, uma a P. sanguinolentus HERBST, 1783, uma

a Achelous spinimanus LATREILLE, 1819, uma a Charybdis hellerii A. MILNE EDWARDS,

1867, uma a Thalamita danae STIMPSON, 1858, uma a Liocarcinus depurator LINNAEUS, 1758

e uma a L. vernalis RISSO, 1816. Essas sequências representam apenas um animal de cada lote,

mesmo que, eventualmente, determinada localidade se repita.

Segundo o MrModeltest, o modelo evolutivo que melhor se ajustou aos dados foi HKY+Γ+I

(Hasegawa et al., 1985 + Gama + sítios invariáveis) com os parâmetros estimados: frequência de

bases, A =36,90%, T = 36,65%, C = 17,21% e G = 9,24%, proporção de sítios invariáveis I=

44,86% e sítios variáveis seguindo uma distribuição gama com parâmetro estimado em 0,5535.

Já os parâmetros estimados pelo modelo GTR+Γ+I na plataforma do CIPRES, obteve os

seguintes valores, não tão discrepantes em relação aos anteriores: frequência de bases, A = 34,30%,

T = 34,05%, C = 19,08% e G = 3,40%, proporção de sítios invariáveis I= 34,04% e sítios variáveis

seguindo uma distribuição gama com parâmetro estimado em 0,4341.

Os cladogramas obtidos pelas três análises distintas mostraram elevada congruência em

relação à validade e a monofilia das espécies de Arenaeus e também sobre sua relação com os

demais gêneros. Todos os indivíduos de A. cribrarius formaram um clado monofilético (Figuras 16-

A, 17-A, 18-A), grupo-irmão daquele formado pelos espécimes de A. mexicanus (Figuras 16-B, 17-

B, e 18-B). Essa topologia é bem suportada, em todos os casos, com valores de “bootstrap” (Figura

16) e de “posterior probabilities” (Figura 17) de 100% e índice de Bremer de 9 (Figura 18). Nessas

topologias, as imagens constituem um dos representantes dos gêneros analisados, dando-se

preferência para a espécie-tipo, quando esta foi incluída nas análises (e.g. Callinectes sapidus e

Portunus pelagicus), afim de ilustrar a morfologia geral dos grupos.

Além disso, em todos os casos, Callinectes aparece como grupo-irmão de Arenaeus, com

valores de suporte relativamente elevados (94, 87 e 2, respectivamente para “bootstrap”, “posterior

probabilities” e índice de Bremer), e ambos os gêneros formando um clado irmão em relação àquele

formado pelas espécies de Portunus (Figuras 16, 17, 18).

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Resultados

58

Por outro lado, o posicionamento de Achelous em relação aos demais gêneros ficou bastante

incerto. Nas análises de ML, esse grupo aparece mais próximo a Portunus + (Callinectes +

Arenaeus), do que este seria de (Thalamita + Charybdis), enquanto que esse arranjo permanece

como uma politomia nas análises de BAY e invertida, ou seja, com (Charybdis + Thalamita) grupo-

irmão de Portunus + (Callinectes + Arenaeus), nas análises de MP.

Fragmento do Gene Citocromo-Oxidase I (COI)

O resultado do alinhamento múltiplo de COI contou com a participação de 40 sequências, das

quais 21 pertenciam a A. cribrarius, cinco a A. mexicanus, uma a Callinectes bellicosus

STIMPSON, 1859, uma a C. bocourti A. MILNE EDWARDS, 1879, duas a C. sapidus, uma a

Portunus pelagicus, duas a P. trituberculatus, uma a P. sanguinolentus, uma a Charybdis hellerii,

uma a Thalamita seurati NOBILI, 1906, uma a Licocarcinus depurator e uma a L. vernalis.

Os parâmetros estimados, segundo o modelo de GTR+Γ+I, para a primeira posição do códon

foram: frequência de bases, A = 25,60%, T = 22,12%, C = 21,75% e G = 30,53%, proporção de

sítios invariáveis I = 68,47% e sítios variáveis seguindo uma distribuição gama com parâmetro

estimado em 9,6534; para a segunda posição do códon: frequência de bases, A = 14,49%, T =

43,40%, C = 24,59% e G = 17,50%, proporção de sítios invariáveis I = 97,33% e sítios variáveis

seguindo uma distribuição gama com parâmetro estimado em 0,1138; e para a terceira posição do

códon: frequência de bases, A = 32,60%, T = 44,43%, C = 17,51% e G = 5,45%, proporção de

sítios invariáveis I = 1,58% e sítios variáveis seguindo uma distribuição gama com parâmetro

estimado em 2,373.

Na plataforma do CIPRES, assumindo o mesmo modelo, os valores, em geral, não divergiram

significativamente, assumindo os seguintes parâmetros: para a primeira posição do códon:

frequência de bases, A = 26,55%, T = 22,52%, C = 19,74% e G = 31,17%, proporção de sítios

invariáveis I = 66,10% e sítios variáveis seguindo uma distribuição gama com parâmetro estimado

em 2,303; para a segunda posição do códon: frequência de bases, A = 13,87%, T = 44,07%, C =

24,61% e G = 17,43%, proporção de sítios invariáveis I = 91,55% e sítios variáveis seguindo uma

distribuição gama com parâmetro estimado em 0,020; e para a terceira posição do códon: frequência

de bases, A = 34,67%, T = 44,72%, C = 16,12% e G = 4,47%, proporção de sítios invariáveis I =

0,011% e sítios variáveis seguindo uma distribuição gama com parâmetro estimado em 0,8681.

Assim como nas análises de 16S rDNA, todos os representantes de cada uma das espécies de

Arenaeus formaram clados separados (Figuras 19, 20 e 21), e dessa forma, os espécimes de A.

cribrarius (Figuras 19-A, 20-A e 21-A) constituíram um grupo-irmão em relação aos de A.

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Resultados

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mexicanus (Figuras 19-B, 20-B e 21-B). Essas topologias foram bem suportadas pelos testes de

consistência, exibindo 100% para “bootstrap” e “posterior probabilities” e 8 para o índice de

decaimento de Bremer.

Além disso, não houve a separação, dentro dessas espécies, em subpopulações distintas. Nas

análises de ML, praticamente todos os espécimes representam politomias, enquanto que, alguns

poucos subgrupos são formados nas análises de BAY e MP, nesse último caso, em especial, vários

subgrupos aparecem sem suporte algum.

Por outro lado, em relação aos gêneros externos, o posicionamento de Arenaeus e também dos

demais gêneros se mostrou bastante incerto. Apesar de Arenaeus + Callinectes formarem um grupo,

irmão, ao menos a algumas, das espécies de Portunus nas análises de ML e MP, Charybdis e

Thalamita tomam uma posição interna em relação ao gênero Callinectes, como grupo-irmão a C.

bellicosus. As próprias espécies de Portunus não formam um grupo monofilético e nas análises de

BAY aparecem próximas a Liocarcinus.

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Figura 16: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 557 pares de base do gene mitocondrial 16S rDNA pelo método de busca por “maximum-likelihood”

(ML). Os números correspondem aos valores de “bootstrap” e são exibidos apenas valores 50%. Estados brasileiros:

SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; RN: Rio Grande do Norte; Demais abreviações: C. Rica: Costa

Rica; Ub: Ubatuba; Gu: Guarujá; PBS: Praia Boqueirão Sul; Res: La Restinga; SFS: São Francisco do Sul; PBN: Praia

Boqueirão Norte; Fl: Florianópolis; Per: Peruíbe; Fál: Fálcon; Guan: Guanaceste; Punt; Puntarenas; Cn; Cananeía; SV:

São Vicente. (Fotos: A. cribrarius e A. mexicanus, por L. Zupolini; C. sapidus, retirado em 19/05/2012 de NOAA, no

sítio http://oceanexplorer.noaa.gov/welcome.html; P. pelagicus retirado de Lai et al., 2010; A. spinimanus por A.

Fransozo; T. danae por J. Poupin; L. depurator por H. Hillewaert).

L. depurator

T. danae

A. spinimanus

C. sapidus

A. mexicanus

B

A

A. cribrarius

P. pelagicus

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Figura 17: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 557 pares de base do gene mitocondrial 16S rDNA por inferência bayesiana (BAY). Os números

correspondem aos valores de probabilidade posterior e são exibidos apenas valores 50%. Estados brasileiros: SP:

São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; RN: Rio Grande do Norte; Demais abreviações: C. Rica: Costa Rica;

Ub: Ubatuba; Gu: Guarujá; PBS: Praia Boqueirão Sul; Res: La Restinga; SFS: São Francisco do Sul; PBN: Praia

Boqueirão Norte; Fl: Florianópolis; Per: Peruíbe; Fál: Fálcon; Guan: Guanaceste; Punt; Puntarenas; Cn; Cananeía; SV:

São Vicente.

B

A

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Resultados

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Figura 18: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 557 pares de base do gene mitocondrial 16S rDNA pelo método da máxima parcimônia (MP). Os

números correspondem aos valores do índice de decaimento de Bremer e são exibidos apenas valores 2. Estados

brasileiros: SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; RN: Rio Grande do Norte; Demais abreviações: C.

Rica: Costa Rica; Ub: Ubatuba; Gu: Guarujá; PBS: Praia Boqueirão Sul; Res: La Restinga; SFS: São Francisco do Sul;

PBN: Praia Boqueirão Norte; Fl: Florianópolis; Per: Peruíbe; Fál: Fálcon; Guan: Guanaceste; Punt; Puntarenas; Cn;

Cananeía; SV: São Vicente.

A

B

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Resultados

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Figura 19: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 683 pares de base do gene mitocondrial citocromo-oxidase I (COI) pelo método de busca por “maximum-

likelihood” (ML). Os números correspondem aos valores de “bootstrap” e são exibidos apenas valores 50%. Estados

brasileiros: SC: Santa Catarina; SP: São Paulo; AL: Alagoas; RN: Rio Grande do Norte; RJ: Rio de Janeiro; Demais

abreviações: C. Rica: Costa Rica; PBN: Praia Boqueirão Norte; PBS: Praia Boqueirão Sul; SFS: São Francisco do Sul;

SV: São Vicente; Can: Cananéia.

A

B

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Resultados

64

Figura 20: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 683 pares de base do gene mitocondrial citocromo-oxidase I (COI) por inferência bayesiana (BAY). Os

números correspondem aos valores de probabilidade posterior e são exibidos apenas valores 50%. Estados

brasileiros: SC: Santa Catarina; SP: São Paulo; AL: Alagoas; RN: Rio Grande do Norte; RJ: Rio de Janeiro; Demais

abreviações: C. Rica: Costa Rica; PBN: Praia Boqueirão Norte; PBS: Praia Boqueirão Sul; SFS: São Francisco do Sul.

A

B

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Resultados

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Figura 21: Cladograma de diversas populações de Arenaeus cribrarius e A. mexicanus construído a partir de um

fragmento de 683 pares de base do gene mitocondrial citocromo-oxidase I (COI) pelo método da máxima parcimônia

(MP). Os números correspondem aos valores do índice de decaimento de Bremer e são exibidos apenas valores 2.

Estados brasileiros: SC: Santa Catarina; AL: Alagoas; RN: Rio Grande do Norte; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro;

Demais abreviações: C. Rica: Costa Rica; PBN: Praia Boqueirão Norte; PBS: Praia Boqueirão Sul; SFS: São Francisco

do Sul.

A

B

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Discussão

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Revisão Taxonômica e Morfologia Comparativa

O presente estudo confirmou a monofilia do gênero Arenaeus e a validade de suas espécies

representantes. Dessa forma, Arenaeus cribrarius e A. mexicanus devem ser tidas como espécies

conceitualmente válidas, em concordância com as revisões mais recentes (Martin & Davis, 2001;

Ng et al., 2008; De Grave et al., 2009), apesar da grande similaridade observada entre elas (Figura

1). Esses aspectos semelhantes, além dos ecológicos, abrangem diversos caracteres de sua

morfologia, e assim as espécies se enquadram muito bem no conceito de “cryptic species”, que são

aquelas morfologicamente muito parecidas, mas reprodutivamente isoladas (Mayr, 1963 e 1969;

Knowlton, 1986). Várias das características analisadas reforçaram essa ideia pelo fato de estarem

bastante conservadas em ambas. Entretanto, outras características morfológicas revelaram-se

importantes na diferenciação das espécies de Arenaeus, como o número de dentes do rostro, o

número de espinhos no carpo e a presença ou ausência de um espinho no epistoma, por variarem

entre as espécies. Outras, ainda, apresentaram divergência intraespecífica, demonstrando

plasticidade fenotípica, ou mesmo mostraram-se conservadas em ambas as espécies estudadas,

tendo baixa relevância na taxonomia do grupo.

De acordo com Rathbun (1930), a coloração nos quelípodos pode ser usada como critério de

diferenciação entre as espécies e, mesmo que haja grande variação no padrão de coloração dos

indivíduos, o padrão de distribuição das manchas nos quelípodos mostrou-se útil para se distinguir

Arenaeus mexicanus, que praticamente não apresenta manchas visíveis ou as apresenta de forma

esparsa e em pequena quantidade, de Arenaeus cribrarius, o qual possui manchas marcantes e

relativamente bem distribuídas nos quelípodos. Contudo, esse padrão só se aplica nos casos em que

as manchas na carapaça são visíveis, já que a coloração e as próprias manchas são perdidas com um

longo tempo de preservação em álcool, desfavorecendo a utilização desse caráter em espécimes

coletados há um longo período. Além disso, a própria coloração da carapaça varia bastante em

tonalidade, mesmo dentro de cada espécie. Em Brachyura é comum o padrão de coloração variar

bastante entre espécies, dentro da mesma espécie, e até mesmo no próprio indivíduo em estágios

diferentes de seu desenvolvimento (Chia et al., 1993; Palma & Steneck, 2001; Reuschel &

Schubart, 2007). Portanto, mesmo que a coloração não seja diagnóstica entre as espécies, o padrão

de distribuição de manchas e a forma como estas se apresentam nos quelípodos são caracteres

taxonomicamente significativos.

Além disso, diversos outros caracteres tradicionalmente descritos pela literatura como

distintos entre as espécies foram corroborados na análise atual. Os dentes anterolaterais de A.

mexicanus apresentaram-se proporcionalmente mais estreitos do que os de A. cribrarius (Figuras 1

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Discussão

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e 11-B) e o espinho lateral, mais agudo e comprido em A. mexicanus (Figura 1-B) do que na outra

espécie (Figura 1-A). O número de dentes no rostro (Figuras 5-B e 6-B) também se mostrou

taxonomicamente informativo, assim como a descrição em A. cribrarius do formato praticamente

retangular dos seios laterais na mesma região (Figura 5-B). Esse último caráter não havia sido

descrito em A. mexicanus, contudo mostrou-se informativo no presente estudo, diferenciando-o da

primeira espécie, visto que em A. mexicanus os seios laterais não se apresentam em formato

retangular ou semelhante, suas bordas são divergentes e não paralelas como no caso anterior

(Figuras 6-B e 11-B).

Outros caracteres distintivos foram o número de espinhos no carpo (Figura 7) e o

comprimento relativo do mero da perna natatória (Figuras 1 e 11-B), confirmados pela literatura. A

profundidade e o grau de aparência de um seio ou sulco transverso no mero, apesar de

tradicionalmente não descritos em A. mexicanus, também se apresentaram divergentes entre os

indivíduos adultos das espécies analisadas. A presença de um espinho partindo do epistoma na

região entre as antênulas, bastante proeminente em A. cribrarius (Figura 8-A), e ausente em A.

mexicanus (Figura 8-B), também não aparece na literatura, contudo parece ter valor taxonômico

relevante dentro do gênero.

Outras características, entretanto, diferiram, ao menos em alguns aspectos, do proposto pelas

revisões anteriores. Segundo Rathbun (1930), o lóbulo intermediário na borda orbital superior é

estreito em A. cribrarius e tende a ser ainda mais estreito em A. mexicanus; contudo, nas análises

mostrou-se relativamente largo em A. cribrarius e substancialmente largo nos indivíduos analisados

de A. mexicanus pertencentes à Costa Rica (Figuras 5-B e 6-B), com variações sem valor

taxonômico. Por outro lado, para os espécimes pertencentes ao México, que corresponde à

localidade-tipo, essas estruturas diferiram significativamente em largura em relação a A. cribrarius,

confirmando, em parte, as descrições de Rathbun (1930). Vale ressaltar que mesmo nessa revisão o

caráter é descrito de forma confusa, com terminologia distinta entre as espécies, tornando ainda

menos preciso o, já subjetivo, texto. Enquanto que nos demais trabalhos essa estrutura nem é citada

nas descrições.

Além disso, de acordo com Garth & Stephenson (1966), o ângulo posterolateral é

“suavemente arredondado” em Arenaeus, contudo em A. cribrarius, além de arredondado, este

caráter também se apresentou de forma espinhosa e bastante proeminente. Os mesmos autores

descrevem as margens do primeiro segmento abdominal de ambos os sexos como espiniformes,

entretanto, este somito abdominal é praticamente não aparente, sendo que é o segundo segmento

abdominal que apresenta esta projeção lateral espiniforme de suas margens. Esse caráter aparece na

diagnose do gênero Arenaeus no trabalho de Garth & Stephenson (1966), contudo não é descrito em

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Discussão

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outros gêneros nos quais parece também estar presente (e.g. Callinectes sp., obs. pes.), devendo ser

revisado antes que lhe seja atribuído alguma significância taxonômica a nível genérico. Além disso,

apesar de Stephenson & Campbell (1959) afirmarem o valor taxonômico do formato das margens

do telso em Portunus, este caráter apresentou grande variação dentro das espécies analisadas, não

sendo útil na distinção destas.

Outros caracteres mostraram-se presentes tanto em A. mexicanus como em A. cribrarius e

com isso, apesar de não serem relevantes para a distinção das espécies do gênero, podem ser úteis

em sua diferenciação em relação a outros grupos de braquiuros ou de decápodes. Fissuras abertas

nas bordas orbitais superiores (Figuras 5-B e 6-B) e o número de carenas no carpo e na palma

(Figuras 5-A e 6-A) parecem ser comuns dentro do gênero ou variar de forma semelhante. Outros,

como a presença de nove dentes anterolaterais, que é um caráter comum às espécies americanas de

Portuninae (Garth & Stephenson, 1966), e os somitos abdominais 3-5 fusionados nos machos e 2

fissuras orbitais, que são comuns em Portunidae (Karasawa et al., 2008), representam condições

compartilhadas com clados superiores.

Além disso, a descrição das antenas e antênulas mostrou-se não divergente em relação ao

plano básico de Brachyura (McLaughlin, 1980) e aparentemente semelhante ao observado em

outros clados [Dardanus sp. (Crustacea; Anomura) e Callinectes sp., obs. pes.]. Isso pode indicar

que esses caracteres também estejam presentes em níveis filogenéticos superiores dentro de

Decapoda e sejam compartilhados por um número abrangente de grupos. Consequentemente, não

apresentam valor taxonômico e, de certo modo também sistemático, relevante para o gênero

estudado, em função de sua conservação ao longo da evolução desses grupos.

A própria morfologia dos pleópodos dos machos de ambas as espécies também se mostrou

bastante similar (Figuras 9 e 10). Em ambos os casos, observa-se grande semelhança na distribuição

de espinhos na região basal do primeiro par de pleópodos (Figuras 9-B e 10-B) e na armadura

subterminal dessa mesma estrutura (9-C e 10-C). Pequenas variações, praticamente imperceptíveis,

podem ser fruto da diferença de tamanho entre os indivíduos (A. cribrarius: CC 50,75 mm; A.

mexicanus: CC 21.36 mm) e, talvez, do desenvolvimento desses caracteres também. O segundo par

de pleópodos é ainda mais conservado entre os grupos. Talvez técnicas com maior grau de

percepção e precisão (e.g. microscopia eletrônica de varredura) possam ser capazes de apontar

características de uma forma mais detalhada e assim indicar alguma divergência substancial entre as

espécies.

Por outro lado, existiu certa variação morfológica ao longo do desenvolvimento ontogenético

de A. cribrarius, sendo algumas características juvenis deste compartilhadas com a forma adulta de

A. mexicanus. Esses caracteres, quando tomados em conjunto, tornam bastante similar a morfologia

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Discussão

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do juvenil de A. cribrarius à morfologia adulta de A. mexicanus. A esses eventos na evolução de

certos aspectos de um grupo capazes de produzir paralelos entre suas variações (e.g. morfológicas)

durante suas fases ontogenéticas e a filogenia (i.e. sua história genealógica) são chamados de

eventos heterocrônicos.

Variação Ontogenética e Eventos de Heterocronia

Um elevado número de indivíduos juvenis e adultos foi analisado para A. cribrarius,

permitindo notar grande variação durante o desenvolvimento ontogenético da espécie, cujas

características juvenis se assemelham consideravelmente à forma adulta observada de sua análoga,

A. mexicanus, como às próprias descrições (Rathbun, 1930; Garth & Stephenson, 1966) desta

última espécie. O evento evolutivo que leva à retenção das características juvenis no adulto é

conhecido por pedomorfismo (Gould, 1977; Larson, 1980; Arthur, 2011) e pode estar presente no

processo de formação de A. mexicanus a partir de um ancestral comum, detentor das características

juvenis de A. cribrarius, sendo que o próprio tamanho relativo dos animais parece corroborar este

dado.

Entre os caracteres que realmente diferiram entre as formas juvenis e adultas analisadas para a

espécie do Atlântico, A. cribrarius, está o menor grau de desenvolvimento apenas dos dentes

rostrais externos nos jovens (Figura 11), enquanto os internos já se encontram bastante

proeminentes, assemelhando-se à forma adulta; a configuração dos seios laterais do próprio rostro,

que é praticamente em formato de “U”, ao invés de retangular, como no adulto; a visibilidade das

suturas de fusão dos somitos abdominais; o comprimento e largura relativos do espinho lateral; e o

grau de desenvolvimento de algumas outras estruturas como dentículos e carenas. Garth &

Stephenson (1966) já haviam relatado a diferença de formatos do telso, classificando-os como

“cordiformes, mas com bordas côncavas” nos indivíduos de menor porte, e de “extremidade

atenuada” naqueles de maior porte. Contudo, essa descrição para “indivíduos de menor porte”

aplica-se ao caso dos juvenis, enquanto que mesmo os adultos de porte relativamente menor já

apresentam a extremidade do telso atenuada.

Essas estruturas, exceto os espinhos carpais, tanto o interno como o externo, que são bastante

proeminentes já nos indivíduos juvenis de A. cribrarius (Figuras 5-A e 11), tornam, quando

tomadas em conjunto, o juvenil de A. cribrarius muito semelhante à forma adulta de A. mexicanus

(Figura 11). Nesse contexto, essas diferenças morfológicas observadas entre as espécies de

Arenaeus podem ser fruto de alterações na expressão de genes do desenvolvimento destas.

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Discussão

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De acordo com Gould (1977), as “novidades evolutivas” podem surgir por dois processos

distintos, a aquisição de novos caracteres ou a alteração no tempo de desenvolvimento de

características que já existiam no ancestral. Esse último caso corresponde a eventos de heterocronia

e produzem paralelos entre a ontogenia do indivíduo e a filogenia de seus ancestrais (Gould, 1977),

sendo que este processo parece explicar a evolução dentro do gênero Arenaeus.

As distinções morfológicas observadas entre as duas espécies podem ser relacionadas à

ontogenia desses caracteres. Por exemplo, um dos caracteres diagnósticos entre elas é a presença de

dois espinhos carpais (interno e externo) em A. cribrarius e apenas um em A. mexicanus (apenas o

interno, enquanto o externo é reduzido a um dentículo). Um retardo no desenvolvimento do

“espinho” externo poderia ter produzido a forma de um dentículo vista em A. mexicanus (Figuras 5-

A e 6-A). Outros caracteres, como proeminência do lóbulo intermediário e outras diferenças de

proporções (e.g. comprimento relativo do espinho lateral e largura dos dentes antero-laterais)

podem ser tomados como consequência de retardos na ontogenia desses caracteres pela comparação

entre juvenis e adultos de A. cribrarius. Além disso, existem quatro dentes no rostro de A.

cribrarius, contudo, nos juvenis, os dois externos são bem menos desenvolvidos que dos adultos,

enquanto os internos já se assemelham à condição adulta. Já em A. mexicanus, existem apenas dois

dentes rostrais. Caso o desenvolvimento dos dentes externos de uma condição ancestral, semelhante

à de um indivíduo adulto de A. cribrarius, fosse bastante atrasado em relação ao desenvolvimento

de outras estruturas, poderia ser obtida a condição vista em A. mexicanus.

Outro caso que pode explicar a evolução do grupo, é uma plasticidade fenotípica

heterocrônica, que resulta em mais de uma forma adulta sem que haja distinção genética entre elas

(Haye et al., 2010). Por exemplo, o anomuro Pleuroncodes monodon H. MILNE EDWARDS, 1837

(Anomura: Munididae), exibe duas formas distintas ao longo da costa sudeste Pacífica americana

com comportamentos ecológicos igualmente divergentes entre elas. Ao norte, os indivíduos

apresentam menor tamanho quando atingem a maturidade e são pelágicos, enquanto que ao sul, o

porte destes é maior e são bentônicos. Entretanto, apesar da disparidade, ambas as formas

constituem apenas uma única espécie, com fluxo gênico entre elas (Haye et al., 2010). Os autores

propõem alguns cenários e/ou explicações para a fixação dessa plasticidade fenotípica

heterocrônica, até mesmo considerando a diferença no padrão de correntes e da disponibilidade de

oxigênio entre essas localidades, entretanto é tudo muito incerto e apenas hipotético.

Essa incerteza em relação ao motivo da fixação desses eventos heterocrônicos em geral (e não

apenas os inerentes à plasticidade) é bastante comum, visto que não existe a possibilidade de se

afirmar a respeito do cenário em que ocorreram, nem em relação ao padrão ancestral. Além disso, é

possível que alguns genes do desenvolvimento, incluindo regiões regulatórias e codificantes,

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Discussão

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tenham evoluído por deriva genética, mesmo que a maioria das mutações que afetem o padrão de

expressão de um gene ou alterem a conformação de sua proteína codificada estejam sobre ação de

seleção (Arthur, 2011).

De acordo com Mayr (1963), existe a possibilidade de uma pressão seletiva para a

manutenção do fenótipo entre espécies crípticas, algo que iria ao encontro das semelhanças de

nichos e ambientes ocupados por ambas as espécies de Arenaeus. Nesse caso, alguns genes

relacionados à morfologia externa apresentariam maior grau de conservação, algo também deduzido

pelo pequeno número de novidades evolutivas observadas. Aquelas encontradas podem ser

produzidas apenas pela alteração na ontogenia de estruturas já existentes no ancestral, sem o

surgimento de novas estruturas e grandes alterações no material genético relacionado a estas.

Entretanto, os fatores que levaram a essa fixação de uma possível forma pedomórfica na costa

Pacífica são desconhecidos.

Evolução Molecular e Filogenia do Gênero

Tanto os valores de divergência genética, como os diversos cladogramas obtidos apontam

para a separação de ambas as espécies do gênero. Além disso, o grau de variabilidade dos genes

está de acordo com o proposto na literatura e não foi capaz de indicar a formação de sub-populações

em isolamento genético.

O fragmento de 16S exibiu pouca variação intra-específica, como esperado para um gene

mais conservado, em oposição ao esperado para o fragmento de COI, o qual é mais variável

(Schubart et al., 2000b; Vergamini et al., 2011), e apresentou os maiores valores de divergência.

Além disso, a saturação observada nas sequências de 16S rDNA, provavelmente, está relacionada

ao tempo de divergência de alguns táxons analisados, como Liocarcinus, que pertence a outra

família. Entretanto, essa saturação, como apresentado anteriormente, foi insuficiente para

“deteriorar” a informação filogenética neles contida, além disso, um valor próximo de 20% é tido

como aceitável para inferências filogenéticas (Russo, 2001).

Apesar de não exibir saturação de substituição, a terceira posição do códon nas sequências de

COI exibiram grande alteração e uma proporção de sítios invariáveis muito baixa, ao contrário da

segunda posição, que praticamente teve 100% de sítios invariáveis. Umas das estratégias a se

seguir, quando se observa saturação nos dados, é retirar todas as terceiras posições das análises e

utilizar apenas a primeira e a segunda posição dos códons (Schneider, 2007). Entretanto, como o

observado aqui, a proporção de sítios invariáveis é muito grande entre as duas primeiras posições e

a maior parte da informação hereditária concentra-se na terceira posição. Dessa forma, a exclusão

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Discussão

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desses sítios pode levar a uma estimativa ruim da história filogenética, assim como do tempo de

divergência (cf. Xia & Lemey, 2009).

A distância genética observada entre os grupos é concordante com o observado nas

filogenias construídas. A adoção de diversos fatores na análise de distância, apesar de elevar

substancialmente os valores em relação a um modelo mais simples (e.g. distância-p), levou a um

resultado que melhor reflete a história de separação desses grupos, servindo melhor aos propósitos

ilustrativos dessa abordagem, sem sacrificar a histórica filogenética das espécies estudadas.

Em relação às filogenias construídas, as análises da sistemática molecular suportaram as

evidências da taxonomia morfológica, pela separação, de acordo com ambos os genes utilizados,

das duas espécies em dois clados distintos (grupos A e B, Figuras 16-21). A variação inter-

específica, de 4,1-4,7% para o gene 16S rDNA e de 22,1 a 26,7% para o gene COI, foi bastante

superior à variação observada dentro de cada uma das espécies, com valores de 0-0,2% (16S) e 0-

0,8% (COI) para A. cribrarius e 0-0,2% (16S) e 0-0,9% (COI) para A. mexicanus. Esses dados

reforçam a distinção destas entidades.

A variação intra-específica observada para o gene COI refletiu mais um processo estocástico

que a formação de subpopulações. Todas as variações encontradas em alguns dos espécimes não foi

compartilhada com os indivíduos da mesma população e, dessa forma, estes não aparecem juntos no

cladograma formando um subgrupo dentro da espécie (Figuras 19, 20 e 21). A grande conservação

das sequências deste gene pode ser indicativa da ocorrência de fluxo gênico entre as populações ou

de um acúmulo muito baixo de mutações em razão do curto espaço de tempo de separação das

espécies.

Em outros grupos de decápodes já foi relatada uma ampla distribuição de espécies sem

diferenciação genética substancial (i.e. com fluxo gênico entre elas), até mesmo entre populações

das costas Pacífica e Atlântica americanas (Mantelatto et al., 2011). Isso pode ocorrer em função da

relativa escassez de barreiras que impeçam o fluxo gênico entre espécies marinhas, de ampla

distribuição e grande potencial dispersivo, nas quais pode ser observada pequena heterogeneidade

genética entre as populações e a aquisição lenta dessa divergência (Palumbi, 1992; Liu et al., 2009).

Entretanto, mesmo dentro de algumas espécies de siris, como Callinectes danae (Weber &

Levy, 2000), Portunus trituberculatus (Liu et al., 2009) e Portunus pelagicus (Klinbunga et al.,

2007) observa-se diferenciação e considerável grau de heterogeneidade genética entre

subpopulações relativamente próximas. Assim, estudos mais detalhados sobre o grau de fluxo

gênico entre as populações dentro de cada espécie de Arenaeus devem ser realizados para se afirmar

a respeito de populações panmíticas. Mesmo assim, o fato de a própria distância genética existente

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Discussão

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entre as espécies ser muito superior à distância genética intraespecífica reforça a ideia de que deve

ser mantida a condição taxonômica atual destas espécies.

Outro ponto a ser destacado é que, baseando-se nos valores de divergência genética entre as

espécies, de fato, estas não exibiram intercâmbio genético e a formação do Ístmo do Panamá,

provavelmente, foi uma barreira efetiva em sua prevenção. Vale lembrar que de acordo com Lessios

(2008), a possibilidade de fluxo genético entre os Oceanos Pacífico e Atlântico foi restaurada com o

término da abertura do canal do Panamá, e para outros grupos, a dispersão por esse meio é discutida

(Lessios, 2008; Mantelatto et al., 2011), de modo que, para algumas espécies, mesmo o fechamento

do Ístmo não teria sido uma barreira eficiente na completa separação de suas populações em ambas

as costas americanas. Logo, existe indicação de que, de fato, as espécies de Arenaeus sejam

reprodutivamente isoladas e, unido aos demais dados obtidos, mereçam a manutenção do título de

espécies distintas.

Relações Inter-Genéricas e Evolução Morfológica do Grupo

Além das relações entre as espécies de Arenaeus, as filogenias propostas, mesmo baseadas em

um número restrito de espécies, sugerem seu parentesco com outros gêneros de siris e, baseando-se

nesses dados unidos ao conhecimento da morfologia geral dos grupos analisados, é possível se

inferir algo a respeito da evolução morfológica destes, assumindo algumas proximidades entre os

gêneros Arenaeus, Callinectes e as espécies utilizadas de Portunus.

Em relação a seu parentesco com outros gêneros, Arenaeus é apresentado como grupo-irmão

de Callinectes e ambos formando um clado com as espécies utilizadas de Portunus em todas as

filogenias baseadas no gene 16S rDNA. Por outro lado, as filogenias construídas a partir das

sequências do gene COI mostraram-se bastante divergentes, inclusive com uma maior (e

questionável) proximidade de Charybdis e Thalamita. Uma hipótese que pode explicar o que tenha

ocorrido é uma atração entre os ramos distantes (“long-branch attraction”) desses grupos com

Callinectes bocourti. Esse processo, em que táxons divergentes aparecem como grupos-irmãos em

função de artefatos na estimativa dessas filogenias baseando-se em mudanças de bases convergentes

e paralelas, é relativamente comum e não inerente a apenas uma metodologia (cf. Bergstern, 2005).

Algumas das estratégias para se evitar esse “erro” são retirar a terceira posição dos códons de

sequências codificantes, que podem sofrer saturação ou exibirem um padrão randômico, ou

adicionar táxons intermediários, para “quebrar” esses ramos longos (cf. Bergstern, 2005). A

primeira opção não é de grande validade para solucionar o empecilho aqui encontrado, já que os

testes de saturação não indicaram a presença desse problema nos dados. Já a segunda parece ser

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Discussão

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bastante útil, visto que C. bellicosus, na realidade, compõe um grupo (“danae-group”) que divergiu

a aproximadamente 13 milhões de anos atrás do grupo (“bocourti-group”) a que pertencem C.

bocourti e C. sapidus (Robles et al., 2007).

Além disso, esse artefato parece ter influenciado também a modelagem da evolução molecular

entre os táxons estudados. Nas análises de ML e MP, em que se deve indicar os grupos externos, as

sequências de Liocarcinus realmente tomam uma posição basal, entretanto, nas análises de BAY,

em que esse procedimento não ocorre, diversas incongruências surgem como a parafilia de

Portunus (que também aparece na filogenia de ML), o posicionamento basal de Callinectes e a

condição derivada de Liocarcinus. Esses problemas devem ser melhor estudados e alternativas

devem ser tomadas para que exista maior coerência entre os dados obtidos das análises de 16S

rDNA, assim como de outros trabalhos (Mantelatto et al., 2007; 2009b; Karasawa et al., 2008;

Schubart & Reuschel, 2009) e da própria morfologia desses grupos.

Desconsiderando essas incongruências observadas nas análises das sequências do gene COI, a

proximidade entre os gêneros Arenaeus e Callinectes já foi sugerida algumas vezes na literatura. Na

descrição do primeiro, Garth & Stephenson (1966) iniciam a diagnose de Arenaeus como “Próximo

a Callinectes”, indicando a afinidade entre os dois. Já em outro trabalho, Stephenson et al. (1968)

chegaram a questionar a validade do gênero Arenaeus em função da elevada proximidade deste em

relação a Callinectes. Mais especificamente, em função de uma análise fenética da morfologia de

membros dos gêneros, os autores sugeriram que A. cribrarius seria mais próximo a C. bellicosus, do

que este último seria em relação a C. exasperatus GERSTAECKER, 1856, C. gladiator

BENEDICT, 1893 e C. marginatus MILNE-EDWARDS, 1861. Entretanto, a ausência de uma

perspectiva evolutiva torna questionável a proposição. Mesmo assim, a proximidade morfológica

entre os gêneros é apresentada de forma concreta.

Como exemplo dessa maior proximidade, os somitos abdominais, em especial o sexto, são

estreitados em sua largura, em ambos os gêneros Arenaeus e Callinectes (Figura 22), ao contrário

de muitas espécies do gênero Portunus e de Charybdis. Além disso, apenas Arenaeus exibe a

extremidade do telso bastante atenuada (i.e. praticamente aciculada).

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Figura 22: Morfologia dos somitos abdominais de espécies de portunídeos. Arenaeus (C) e Callinectes (B)

compartilham a característica dos somitos abdominais, em especial o sexto, mais estreitados do que nas espécies de

Portunus (A) e Charybdis (D). A- Portunus pelagicus (CC 68 mm), retirado de Lai et al. (2010). B e C- Callinectes

bocourti e Arenaeus mexicanus, respectivamente; retirados de Garth & Stepheson (1966); barras correspondem a 10

mm. D- Charybdis (Charybdis) goaensis PADATA, RIVONKER, ANIL, SAWANT & KRISHNAMURTHY, 2010;

retirado de Padate et al. (2010); barra corresponde a 1 mm.

Outras filogenias construídas também suportam o parentesco entre Arenaeus e Callinectes.

Schubart & Reuschel (2009) apresentaram duas topologias, uma construída a partir do gene nuclear

da histona H3 e outra a partir de vários fragmentos de genes mitocondriais, incluindo 16S e NDH-1

(NADH desidrogenase I), que indicam essa proximidade. Em ambos os casos, os dois gêneros

aparecem juntos em um grupo, irmão em relação ao grupo de Portunus pelagicus, que inclui P.

trituberculatus.

Contudo, existem casos de divergência. Mantelatto et al. (2007, 2009b) apresentam filogenias

distintas, obtidas a partir do gene 16S mtDNA, em que Arenaeus aparece em posições divergentes

ao proposto no presente estudo. Em um momento, o gênero em questão é apresentado como grupo-

irmão do clado Portunus pelagicus-Callinectes e em outro trabalho, como mais próximo ao grupo

de Portunus pelagicus, do que em relação a Callinectes. Entretanto, tais ramos nas topologias

discutidas não apresentam valores elevados dos testes de consistência (i.e. “bootstrap” e “Bayesian

posterior probalities”) e, dessa forma, são incapazes de resolver a problemática de parentesco entre

tais grupos.

Apesar disso, é muito comum a ideia de uma maior proximidade entre os gêneros Arenaeus,

Callinectes e certas espécies de Portunus, incluídas no chamado grupo de Portunus pelagicus

(Mantelatto et al., 2007 e 2009b; Schubart & Reuschel, 2009). De acordo com Stephenson et al.

(1968), este conjunto de espécies seria formado por P. pelagicus, P. sanguinolentus, P. pubescens

DANA, 1852, P. convexus DE HAAN, 1835 e P. trituberculatus, sendo que Mantelatto et al.

incluíram, em 2007, o gênero atlântico P. sayi GIBBES, 1850 ao grupo. Muitas dessas espécies

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Discussão

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apresentam distribuição Índico-Pacífica, exceto P. sayi, e lembram bastante a morfologia dos

gêneros americanos Arenaeus e Callinectes (Mantelatto et al., 2007).

Talvez a característica mais marcante do grupo seja a presença de uma carapaça, geralmente,

muito mais larga do que comprida, com um espinho lateral, comumente bastante avançado, e

associada a bordas antero e postero-laterais menos abruptas e mais côncavas que em outros grupos

de Portunus (Stephenson & Campbell, 1958) (Figura 23). Entretanto, uma carapaça com as

primeiras características citadas é encontrada em diversos outros grupos do gênero. Inclusive um

espinho lateral bastante avançado é um caráter muito plástico, variável dentro dos gêneros e

convergente, ou seja, seu surgimento em diferentes grupos seria fruto de evolução paralela entre

eles e sua funcionalidade estaria relacionada ao hidrodinamismo dessa estrutura, que favorece a

natação (Stephenson & Campbell, 1958; Mantelatto, F.L.M. com. pess.).

Figura 23: Ilustrações da morfologia das carapaças de Portunus tuberculatus STIMPSON, 1860 (A), e de Arenaeus

mexicanus (B), em suas vistas dorsais. Apesar de exibirem características similares, como a presença de um espinho

lateral bastante proeminente e uma carapaça bastante larga, as espécies que compõe o grupo de Portunus pelagicus,

assim como A. mexicanus, diferem substancialmente na morfologia das margens antero e postero-lateral da carapaça em

relação aos demais grupos de Portunus. Barras correspondem a 10 mm. (Retirado e modificado de Garth & Stephenson,

1966).

A morfologia do primeiro par de pleópodos masculinos também pode ser algo interessante a

se analisar entre esses grupos, visto que Stephenson & Campbell (1968) definiram-na como

bastante semelhante entre três das espécies do grupo de Portunus acima discutido, sendo elas P.

pelagicus, P. sanguinolentus e P. pubescens, e não compartilhada com as demais espécies de

Portunus discutidas no estudo citado e não pertencentes ao grupo de P. pelagicus. Além disso, as

características dessa estrutura, como “todas alongadas, suavemente curvas, e praticamente de lados

paralelos, cuja armadura terminal é constituída por espinhos lateralmente dispostos, robustos e

dirigidos para trás”, nesses três gêneros, lembram bastante as descrições e ilustrações de Garth &

Stephenson (1966) para o gênero Callinectes e se assemelham às observações apresentadas no

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Discussão

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presente estudo a respeito do gênero Arenaeus (Figuras 9, 10 e 24). De fato, esse padrão comum a

essas espécies difere daquele observado em grupos externos além das demais espécies de Portunus

discutidas por Stephenson & Campbell (1968), como aquele formado por Charybdis e Thalamita.

Este último grupo, além de divergir na morfologia geral da estrutura, também difere na presença de

armadura subterminal nas faces inferiores e também superiores dos gonopódios (Stephenson et al.,

1957; Stephenson, 1972) (Figura 25).

Por último, Karasawa et al. (2008), baseando-se em dados morfológicos de grupos recentes e

extintos, propuseram uma topologia ainda diferente para o posicionamento de Arenaeus e

Callinectes. No trabalho mencionado, estes gêneros aparecem como membros de uma politomia que

os aproxima de outros subgêneros de Portunus, como Portunus (Xiphonectes) e Portunus

(Monomia). De acordo com os autores, a mudança de um telso tão longo quanto largo para uma

condição muito mais longa do que larga dessa estrutura representaria o estado de caráter não

ambíguo e apomórfico compartilhado por esses grupos de portunídeos. Entretanto, essa proposição

constitui algo a ser confirmado em estudos posteriores em função de sua não concordância com os

demais trabalhos.

Figura 24: Ilustrações das porções distais do primeiro par de pleópodos masculinos de espécies representantes do

gênero Callinectes (A-B) e do grupo de Portunus pelagicus (C-D). Grande similaridade pode ser encontrada entre a

conformação dessas estruturas entre Callinectes arcuatus ORDWAY, 1863 (A), C. bellicosus, Portunus pelagicus (C),

P. sanguinolentus (D) e as espécies de Arenaeus, apresentadas neste estudo. Barras correspondem, em A e B, a 1 mm, e

a 0,5 mm em C e D. A-B: modificados a partir de Garth & Stephenson (1966); C-D: modificados a partir de Stephenson

& Campbell, 1859).

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Figura 25: Ilustrações das porções distais do primeiro par de pleópodos masculinos de espécies representantes dos

gêneros Thalamita (A- T. danae) e Charybdis (B- C. hellerii). Ambos os grupos apresentam características que os

diferem em relação ao padrão observado entre as espécies do grupo de Portunus pelagicus, de Callinectes e de

Arenaeus. Barras correspondem a 0,5 mm. A- modificado a partir de Stephenson (1972); B- modificado a partir de

Stephenson et al. (1957).

Vale esclarecer que essas características aqui propostas como congruentes entre essas espécies

de Portunus e os gêneros Callinectes e Arenaeus, geralmente, não são apontadas na literatura e

aparecem apenas como sugestão para estudos posteriores. Além disso, o gênero Portunus ainda

permanece bastante problemático, apesar dos esforços de diversos pesquisadores (Mantelatto et al.,

2007 e 2009b; Lai et al., 2010), e a argumentação de forma extensa a respeito do tema não é cabível

à discussão inicialmente proposta no presente estudo.

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Conclusões

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O volume de dados aqui obtidos, tanto morfológicos como genéticos, mostra claramente a

divergência entre as espécies do gênero de siris Arenaeus, apresentando ainda uma gama de

caracteres morfológicos que podem facilitar a sua distinção. Muitos desses caracteres já haviam

sido apresentados na literatura, entretanto a falta de uniformização na apresentação dos dados e de

algumas incongruências com a morfologia dos animais comprometiam sua utilização. Neste

trabalho, buscou-se ao máximo solucionar esses empecilhos, proporcionar uma diagnose concisa e

objetiva e uma chave de identificação bastante prática, úteis na separação dessas espécies apesar da

grande semelhança morfológica observada entre elas.

As relações externas ao gênero, apesar de relativamente bem suportadas por diversos dados e

opniões distintas, ainda permanecem em aberto e, nesse sentido, o presente estudo fornece muitos

caracteres potenciais capazes de solucionar parte do problema das relações entre alguns dos grupos

de portunídeos conhecidos e que deveriam ser analisados mais profundamente.

Outro ponto levantado foi a possível ocorrência de um evento de hetetocronia na evolução do

gênero Arenaeus. É muito conhecida a ideia de que a “ontogenia recapitula a filogenia”, entretanto,

de fato, ainda se sabe muito pouco a respeito da evolução do desenvolvimento, especialmente entre

Crustáceos. Apesar da quantidade de características apontadas como congruentes entre a forma

juvenil de Arenaeus cribrarius e a forma adulta de Arenaeus mexicanus, não se conhece a respeito

do padrão morfológico ancestral e assim as conclusões apresentadas são baseadas em hipóteses,

tomando o cunho de sugestões e não afirmações. Esse hiato no conhecimento do desenvolvimento

evolutivo do gênero é outro aspecto a ser explorado por outros tipos de abordagem.

Portando, frente a todos os dados e sugestões levantadas ao longo deste trabalho, refuta-se a

hipótese de sinonímia entre as espécies do gênero Arenaeus e se mantém sua validade taxonômica;

sugere-se um padrão de evolução do desenvolvimento entre suas espécies componentes e também

de evolução morfológica entre os gêneros similares, apontado características congruentes entre eles.

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