Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte · de N. Infelizmente, a maioria dos organismos, animais e vegetais, não consegue incorporar essa forma de nitrogênio a esqueletos

Capítulo 6

Fixação Biológicade Nitrogênio – Estado da Arte

Veronica Massena ReisKátia Regina dos Santos Teixeira

Introdução

O nitrogênio é um elemento químico presente abundantemente,em sua forma mais estável, na atmosfera. A estabilidade do gás N

2 é

devido à presença de uma forte ligação tríplice, entre as duas moléculasde N. Infelizmente, a maioria dos organismos, animais e vegetais,não consegue incorporar essa forma de nitrogênio a esqueletos decarbono. É necessário que essa ligação tríplice seja rompida e onitrogênio esteja na forma de íons amônio. Algumas espécies debactérias, um grupo de organismos unicelulares e procarióticos, sãocapazes de realizar essa reação de redução do N

2 a NH

4+. Esse processo

biológico é conhecido como Fixação Biológica de Nitrogênio – FBN.Isso é possível porque esses microrganismos possuem a enzimanitrogenase, caracterizada como um complexo enzimático, responsável

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152 Capítulo 6

pela quebra da ligação tríplice usando energia celular na forma deadenosina trifosfato (ATP).

A incorporação de nitrogênio, via FBN, nos diferentes ecossistemasde nosso planeta, faz parte dos ciclos biogeoquímicos naturais.O entendimento desse processo biológico passa pelos conhecimentosdas espécies capazes de fixar o nitrogênio e sua classificaçãofilogenética. Passa também pelo entendimento do sistema fisiológicode equilíbrio entre a enzima nitrogenase e o seu maior inimigo, ooxigênio, e pela compreensão dos processos enzimáticos ligados àassimilação do nitrogênio fixado nas células microbianas e sua interaçãocom a nitrogenase.

Organismos capazes de fixar o nitrogênio atmosférico

O estudo de bactérias fixadoras de N2 ou

diazotróficas

associadas

às plantas tem mostrado a ocorrência de uma grande variedade demicrorganismos isolados a partir das mais diversas famílias do reinovegetal, além do solo e dos sistemas aquáticos. Tal diversidade levouos cientistas a formularem teorias evolucionárias nas quais a capacidadede fixar nitrogênio foi adaptada a partir de um ancestral comum aolongo do processo evolucionário. Estudo comparativo entre as seqüênciasde aminoácidos deduzidas a partir dos pares de genes nifDK e nifNE dediversos organismos fixadores de nitrogênio do grupo de Archaea eBacteriaceae reforça a teoria divergente do processo evolucionárioassociado à FBN. A hipótese da origem desses genes parálogos, ou seja,que apresentam uma extensa semelhança entre suas seqüênciasprimárias, propõe que no processo evolutivo houve um evento deduplicação em série de um gene ancestral comum seguido por diver-gência, constituindo esses operons parálogos (FANI et al., 2000). Aindasegundo esses autores, uma duplicação desses operons, seguida peloprocesso de divergência evolucionária, teria sido a responsável pelaorigem dessa família de genes parálogos conhecidos como operons nifDKe nifNE. A origem do gene ancestral é discutível, porém acredita-seque ele tenha tido participação em processos de destoxificação celularem um cenário onde a atmosfera ancestral apresentava um caráteraltamente redutor. Os eventos desse processo, segundo a hipótese dos

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autores, podem ser representados esquematicamente como apresentadona Fig. 1.

As primeiras bactérias a alcançar renome internacional foram asdo gênero Rhizobium, sendo estas posicionadas na subdivisão alfa-proteobacteria, e até hoje representam o grupo mais estudado. Nessegrupo, dentro da ordem Rhodospirillales, temos a família I, onde estãoincluídos gêneros conhecidos como Rhodospirillum e Azospirillum. Jána família II, temos a recente reformulação de gêneros, como foi o casoda mudança de algumas bactérias do gênero Acetobacter para o recém-criado Gluconacetobacter. Dentro desse grupo, na ordem VI, estãotambém posicionadas as bactérias simbióticas pertencentes à famíliaRhizobiales, que inclui gêneros importantes como Rhizobium,Allorhizobium e Sinorhizobium junto com outro membro famoso, o gêneroAgrobacterium. Já Mesorhizobium foi posicionado na família IV,Phyllobacteriaceae, e a família VII, chamada de Bradyrhizobiaceae,inclui Bradyrhizobium, e a família Hyphomicrobiaceae inclui o gêneroMesorhizobium. Beijerinckia e Derxia estão posicionadas na famíliaVI, Beijerinchiaceae. Já na subdivisão beta-proteobacteria temos a ordem Ichamada de Burkholderiales, que inclui algumas espécies fixadoras

Fig. 1. Ilustração da hipótese evolutiva da origem da nitrogenase.Fonte: Fani et al. (2000).

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na família I Burkholderiaceae pertencentes ao gênero Burkholderia, ena família III, chamada de Oxalobacteraceae, que inclui o gêneroHerbaspirillum, e na família IV Alcaligenaceae, temos o gêneroAlcaligenes. Mais distante temos a ordem VI chamada de Rhodocyclales,onde encontramos o gênero Azoarcus. Na subdivisão gamma-proteobacteria está classificada uma minoria de bactérias diazotróficas,até então descritas ou recentemente renomeadas, incluindo na classeVIII Pseudomonadales os gêneros Pseudomonas e Azotobacter e naordem XII Enterobacteriales a família I, Enterobacteriaceae, ondeencontramos os gêneros Erwinia, Klebsiella, Pantoeae e Serratia.A subdivisão delta possui, em sua maioria, bactérias anaeróbicasobrigatórias redutoras de enxofre, incluindo espécies de Desulfovibrioe Desulfobacter. Entretanto, nenhum relato de associação entre bactériasdiazotróficas pertencentes a essa subdivisão de espécies vegetais foifeito até o momento. No filo Firmicutes encontramos posicionados naclasse I Clostridia, ordem I Clostriaiales, família I Clostridiaceae, o gêneroClotridium, e na classe III, Bacilli, ordem I Bacillales, família IBacillaceae o gênero Bacillus, e na família VII Paenibacillaceae, ogênero Paenibacillus. Todo esse quadro de complexidade das relaçõesfilogenéticas pode ser resumido como apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Organismos fixadores de nitrogênio associados a gramínease outras espécies não leguminosas.

Gênero Espécie Planta hospedeira Referência

Classe I: Proteobacteria – subdivisão alfa

Azospirillum A. brasilense Gramíneas Tarrand et al. (1978)A. lipoferum Gramíneas Tarrand et al. (1978)A. amazonense Gramíneas Magalhães et al. (1983)A. halopraeferens Kallar grass Reinhold et al. (1987)A. irakense Arroz Khammas et al. (1989)A. doebereinerae Miscanthus Eckert et al. (2001)

Gluconacetobacter G. diazotrophicus Cana-de-açúcar, Cavalcante eDobereiner,

Pennisetum, café, 1988, reclassificação feitaabacaxi, batata-doce por Yamada et al. (1997)e Eleusine coracana

G. johannae Rizosfera de café (a) Fuentes-Ramírez et al.(2001)

Continua...

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Tabela 1. Continuação.

Gênero Espécie Planta hospedeira Referência

Classe I: Proteobacteria – subdivisão alfa

G. azotocaptans Rizosfera de café (a) Fuentes-Ramírez et al.(2001)

Beijerinkia B. fluminensis Cana-de-açúcar Krieg e Holt (1984) (b)Derxia D. gummosa Cana-de-açúcar Krieg e Holt (1984)

Classe II - Proteobacteria – subdivisão beta

Burkholderia B. vietnamiensis Arroz Gillis et al. (1995)B. kururiensis Aqüífero poluído com Zhang et al. (2000)

trichloroethylene (TCE) (c)B. “brasilensis” * Arroz, mandioca, Baldani et al. (1997)

batata-doce, cana-de- primeira citaçãoaçúcar e milho

B. tropica Cana-de-açúcar Reis et al. (2004),Herbaspirillum H. seropedicae Gramíneas Baldani et al. (1986)

H. rubrisubalbicans Cana-de-açúcar Baldani et al. (1996)H. frisingense Pennisetum, Miscanthus Kirchhof et al. (2001)

e SpartinaAlcaligenes A. faecalis Arroz You et al. (1991)

A. latus Arroz Malik et al. (1997)A. paradoxus Arroz Malik et al. (1997)

Azoarcus A. indigens Kallar grass Reinhold et al. (1993)A. communis Kallar grass Reinhold et al. (1993)

“Azovibrio” ** A. restrictus Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek(2000)

“Azospira” ** A. oryzae Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek(2000)

“Azonexus” ** A. fungiphilus Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek(2000)

Classe III - Proteobacteria – subdivisão gamma

Azotobacter A. paspali Paspalum notatum Krieg e Holt (1984)Klebsiella K. pneunoniae Milho, cana-de-açúcar, Krieg e Holt (1984)

batata-doce, trigoK. oxytoca Arroz, trigo Kovttunovych et al. (1999)K. planticola Arroz, trigo Ladha et al. (1983)K. terrigena Gramíneas Haahtela et al. (1988)

Pantoea P. agglomerans Trigo Ruppel et al. (1992)

4. Filo BXIII – Firmicutes phy. nov. Classe III – “Bacilli”

Paenobacillus P. azotofixans Gramíneas Seldin et al. (1984)

a. Descrição recente: descrição baseada nas estirpes isoladas de um único hospedeiro; b. Primeiraversão do Bergey´s Manual; c. Descrito recentemente e posteriormente verificado que a estirpe-padrão era diazotrófica. Não há maiores relatos de ocorrência. “ “ Indica que o organismo foiproposto. * Baldani et al., em preparação. ** Não foi incluído na atualização do Manual Bergey’sdisponível on line (2002).

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156 Capítulo 6

Nitrogenase

A enzima que catalisa o processo de redução do nitrogênioatmosférico a NH

4+ é denominada nitrogenase e esta reação é acoplada

à produção de H2. Atualmente, são conhecidos três tipos de nitrogenase:

um que possui molibdênio (Mo, nitrogenase-1) e ferro (Fe); outro emque o vanádio (V) substitui o Mo (nitrogenase-2); e um terceiro, que sótem ferro (nitrogenase-3). Azotobacter chroococcum e A. paspali, alémda nitrogenase tradicional, possuem a nitrogenase de vanádio. JáAzotobacter vinelandii possui os três tipos de nitrogenase (PAU et al., 1989).A fisiologia dos microrganismos diazotróficos é marcada pelaspropriedades inerentes desta enzima. São elas: alta sensibilidade aooxigênio; necessidade dos metais Fe, Mo ou V, seus componentesestruturais; suprimento adequado de poder redutor; MgATP para a suaatividade; ambiente onde o nitrogênio combinado não esteja disponível.A nitrogenase é uma enzima relativamente lenta e para produzir níveisadequados de nitrogênio fixado o conteúdo enzimático em bactériasdiazotróficas é de aproximadamente 10% da proteína celular total(KLUGKIST et al., 1985). Também é uma enzima dispendiosa em termosenergéticos, consumindo duas moléculas de ATP para cada elétrontransferido pelo sítio catalítico (HOWARD; REES, 1996). Além daregulação da expressão gênica, a nitrogenase também é regulada noâmbito enzimático em muitos organismos.

A enzima, ou o complexo enzimático, é composta de duasunidades: a dinitrogenase redutase (também chamada de componenteII ou Fe-proteína) e a dinitrogenase (ou componente I ou MoFe-proteína).Nesse complexo enzimático, essas unidades interagemcooperativamente durante o processo de FBN. A dinitrogenase redutase,ou Ferro proteína, é responsável pela transferência de elétrons paraque ocorra a redução do N

2, e, em virtude de sua atividade redox,

geralmente é mais sensível ao oxigênio que a dinitrogenasepropriamente dita, ou MoFe proteína. A dinitrogenase, por sua vez, é aenzima que apresenta o sítio ativo da reação, onde são encontradascondições adequadas para a redução do N

2. Em resumo, a estequiometria

da reação pode ser representada como:

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A dinitrogenase redutase serve de doador de elétrons para adinitrogenase, sendo um dímero composto de duas subunidades idênticas.Já a dinitrogenase consiste de um tetrâmero de dois pares de subunidadesnão idênticas (α e β). A nitrogenase-1 só se expressa em meio contendoMo, mas se este elemento falta e houver V, então temos a síntese danitrogenase-2 (HALES et al., 1986; ROBSON et al., 1986). Nesse caso,o que modifica é a dinitrogenase-2, que se pensa ser composta de doispares diferentes, formando um hexâmero com as duas subunidades α e β,além de um par de uma unidade menor (δ) contendo 2 átomos de V, 23 deFe e 20 grupos sulfito por molécula. A dinitrogenase redutase-2 contém 4átomos de Fe e 4 grupos sulfito por dímero (EADY et al., 1988). Na faltade Mo e V e na presença de Fe temos a nitrogenase-3 (CHISNELL et al.,1988). Dinitrogenase redutase-3 é um dímero com duas subunidadesidênticas, enquanto a dinitrogenase-3 é um tetrâmero composto de doispares não idênticos das subunidades α e β, podendo ser um hexâmerodesde que o operon dos genes estruturais para essa enzima possua aregião de leitura open reading frame – ORF – que potencialmentecodifica para uma proteína similar α unidade δ. Dinitrogenase redutase-3 contém aproximadamente 24 átomos de Fe e 18 grupos sulfito pormolécula. A dinitrogenase-3 também pode ser isolada em pelo menosduas configurações ativas: α

2β

2 e α

1β

2.

Os genes que codificam as proteínas da nitrogenase-1 sãochamados de nif; os genes para a nitrogenase-2 são chamados de vnf;e, no caso da nitrogenase-3, de anf. Rhodospirillum capsulatus eR. rubrum contem apenas os genes anf, além dos nif (MASEPOHL;KLIPP, 1996). A expressão de cada nitrogenase é controlada peladisponibilidade dos metais. Quando o molibdênio está presente, somentea nitrogenase-1 ou MoFe-nitrogenase é sintetizada. Na falta deste e napresença de vanádio, temos a nitrogenase-2 ou VFe-nitrogenase. Quandoambos estão ausentes, temos apenas a nitrogenase-3 ou Fe-nitrogenase.As nitrogenases alternativas são detectadas pela formação de etano(C

2H

6) em adição ao etileno (C

2H

4) no teste-padrão de redução

de acetileno (PAU et al., 1989). Infelizmente, a importância dessessistemas alternativos em ambientes naturais é muito pouco estudada.

nitrogenase

N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP 2 NH

3 + 16 ADP + 16 PO

4-3 + H

2

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158 Capítulo 6

Mais detalhes sobre a caracterização da estrutura do sistema nitrogenasepodem ser consultados em Marin et al. (1998).

Estudos sobre a eficiência da FBN em Azotobacter chroococcummostraram que a nitrogenase de vanádio é menos eficiente que anitrogenase de molibdênio. A estequiometria da reação mostra que ocorreuma perda de no mínimo 25% dos elétrons e energia para a produçãode H

2 para a nitrogenase de Mo,

enquanto a nitrogenase de vanádio

perde aproximadamente 50% (BISHOP; EADY, 1985). É possível que,entretanto, a reciclagem de hidrogênio beneficie mais a nitrogenase deV que a de Mo (YATES et al., 1997).

O quadro atual da caracterização da genética de diversas bactériasdiazotróficas revela que a complexidade da FBN não se restringesimplesmente à bioquímica do processo e sugere que a existência deoutros genes, ainda não identificados, pode ser essencial para aelucidação do processo em diversos grupos de bactérias diazotróficas.

A organização dos genes nif em uma única região do genoma deK. pneumoniae permitiu que a estrutura dos operons, a presença depromotores específicos e a função de vários desses genes fossemdefinidas por meio de estudos de mutação sítio-dirigida e seqüencia-mento da região de 24 kb que contém esses genes. Entretanto, esse tipode organização não é universal e estudos de caracterização em bactériasdiazotróficas, de vida livre ou encontradas em associação, têm resultadoem um quadro bastante completo da organização estrutural de seus genesnif (revisado por MERRICK,1993). No caso de Enterobacter agglomerans,bactéria diazotrófica de vida livre encontrada associada à rizosfera dediversos cereais, apesar de a organização estrutural ser semelhante àobservada para K. pneumoniae, a presença de genes nif no plasmídeopEA3 indica que a presença de genes nif na porção extracromossomalnão é uma característica única das bactérias diazotróficas simbióticas(KREUTZER et al., 1991).

Interação do oxigênio com a FBN

A nitrogenase é uma enzima altamente sensível ao oxigênio enecessita de condições anaeróbias para a purificação de seus dois

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componentes em sua forma ativa (EADY, 1980). Apesar disso, as bactériasdiazotróficas precisam regular o suprimento de oxigênio para proverATP e ao mesmo tempo proteger a nitrogenase contra seu efeito deletério.Dessa forma, esses microrganismos desenvolveram várias estratégiaspara limitar o acesso do oxigênio à nitrogenase, desde o crescimentomicroaerofílico até modificações morfológicas tais como os nódulos nasleguminosas, os heterocistos nas cianobactérias, vesículas em nãoleguminosas e a barreira de difusão ao oxigênio nos nódulos (YATESet al., 1997). Também pode ocorrer dimorfismo de colônias, como em Derxiagummosa (HILL, 1971) e Klebsiella pneumoniae (HILL, 1975).

A inibição da atividade da nitrogenase in vivo pelo O2 vai desde

uma leve alteração reversível até a sua completa perda, dependendoda severidade do estresse. As proteínas Fe da nitrogenase-1 (tempo de½ vida no ar de 30 segundos) são geralmente mais sensíveis ao oxigênioque as proteínas MoFe (t ½ vida no ar de 8 minutos). Já a proteína VFenão mostra essa tolerância (t ½ vida no ar de 40 segundos) (HILL;PATRIQUIN, 1988). A sensibilidade ao O

2 no processo de transferência

de elétrons pode diferir de acordo com o microrganismo. Em Klebsiellapneumoniae, bactéria aeróbica facultativa, a sensibilidade ao O

2 está

relacionada com a piruvato flavodoxina oxidoredutase. Nos aeróbiosobrigatórios, esse caminho é menos conhecido, mas, provavelmente,envolve componentes da cadeia respiratória (HAAKER; KLUGKIST,1987). Os mais bem estudados mecanismos de proteção são os propostospor Dalton e Postgate (1969b) que são a respiratória e a conformacionalem Azotobacter.

O oxigênio inibe a atividade de nitrogenase em três níveis diversos:

• Nível genético, agindo na repressão da síntese.• Causa dano irreversível à proteína-Fe existente.• Causa dano reversível (switch off) da enzima. Nesse caso, a

atividade retorna ao nível inicial quando a pressão parcial deO

2 em equilíbrio com a fase gasosa (pO

2) volta aos níveis

adequados (switch on) sem que haja síntese de novo da enzima(GOLDBERG et al., 1987).

A magnitude do gradiente de pO2 entre o meio ambiente e o sítio

de atividade da nitrogenase é afetado pela taxa de uso do O2 e pela

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160 Capítulo 6

resistência a sua difusão. Em adição, podemos ter uma separaçãoespacial ou temporal do metabolismo de O

2 e da FBN, que pode ser

alcançada por diferenças morfológicas ou bioquímicas (HILL, 1987).Azotobacter possui o mecanismo mais tolerante ao O

2. Sua eficiência

de fixação é máxima perto de 10 µM de O2 (DALTON; POSTGATE,

1969ab), porém em cultura contínua pode crescer sob ar (225 mM deO

2) (POST et al., 1983). Para A. brasilense, os níveis são bem mais baixos,

ficando entre 6 e 9 µM (NELSON; KNOWLES, 1978). Já para Klebsiellapneumoniae a pO

2 ótima da FBN se situa em torno de 0,3 µM (HILL

et al., 1984). Dentre as espécies de Azospirillum, a mais tolerante aoO

2 é o A. amazonense (HARTMANN et al., 1983). Essa tolerância pode

estar ligada à presença de uma hidrogenase tolerante ao oxigênio nessaespécie (FU; KNOWLES, 1989) que, além de diminuir as perdas dehidrogênio pela nitrogenase, pode agir capturando o oxigênio do meio(BURRIS, 1991).

A chamada proteção respiratória é um mecanismo de proteçãoda atividade da nitrogenase e foi formulado por Dalton & Postgate(1969a) para explicar o comportamento de Azotobacter sob condiçõesde FBN. Azotobacter tem a capacidade de ajustar, por adaptação, asua taxa respiratória numa larga faixa de pO

2 sem que a enzima nitroge-

nase seja afetada, exibindo uma das maiores taxas respiratórias dentreas bactérias associativas testadas. Isso significa que, em uma cultura deAzotobacter, se o pO

2 for aumentado, as células passam a respirar mais

rapidamente, procurando consumir todo o O2 através de um processo

respiratório desacoplado da geração de ATP e, portanto, gastandoexcessivamente as fontes de carbono.

Apenas em Azotobacter spp. o switch off enzimático estácorrelacionado com a formação de um complexo enzimático inativo einsensível ao O

2 que contém uma terceira proteína denominada de

Skethna, FeS II ou proteína protetora (ROBSON, 1979), o que lhe confereuma proteção conformacional. A formação desse complexo requer Mg2+

além da proteína FeS II, mas a proporção de cada componente aindapermanece desconhecida (ROBSON; POSTGATE, 1980). A proteçãocontra o oxigênio in vivo ocorre rapidamente e a eficiência é indepen-dente da magnitude e da duração do estresse de O

2, mas diminui durante

o crescimento em altas taxas de respiração (DINGLER; OELZE, 1985).

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A FeS II pode ter outras funções in vivo já que a sua síntese é reguladatanto por NH

4+ como por O

2 (ROBSON, 1980). Em Azotobacter

chroococcum, a nitrogenase de V não forma esse complexo estávelcom a proteína FeS II e é mais sensível ao O

2 (SCHERINGS et al., 1977).

Por sua vez, Dingler & Oelze (1985), estudando o switch off danitrogenase à exposição a repetidos pO

2 excessivamente altos,

observaram que as células de A. vinelandii ficavam cada vez maissensíveis. A ativação do mecanismo de switch off – switch on dependeinteiramente do suprimento de energia e fonte de carbono para queaumente a taxa de consumo de O

2 pela célula, isto é, quanto maior o

fluxo de elétrons para a nitrogenase, maior a estabilidade da enzimacontra o O

2 (KUHLA; OELZE, 1988). Porém o mecanismo regulatório

desse fluxo de elétrons é desconhecido.

Em outros diazotrofos aeróbios, a inativação da nitrogenase peloO

2 está relacionada com a modificação irreversível no componente da

proteína Fe da dinitrogenase, causando uma permanente inativaçãoenzimática. Estudos relacionados com A. lipoferum e A. brasilensedemonstraram que não ocorria modificação da Fe-proteína após aexposição ao pO

2 excessivo e que essa proteína modificada só estava

presente quando as células foram submetidas à anaerobiose (HARTMANN;Burris, 1987). Essa modificação enzimática não ocorre em A. amazonense(SONG et al., 1985). Okon et al. (1983) observaram mudanças na membranade A. brasilense crescido sob alto pO

2. Nessas condições ocorreu um

aumento do teor protéico e no conteúdo de carotenóides, além de umamaior atividade específica da succinato oxidase e superóxido dismutase.

A adição de altas concentrações de açúcar ao meio de cultivo(10%) oferecia uma maior proteção à atividade da nitrogenase deGluconacetobacter diazotrophicus na presença de concentraçõescrescentes de oxigênio (REIS; DOBEREINER, 1998). A atividade danitrogenase (medida pela redução do acetileno) só foi completamenteinibida com 6 kPa de O

2, e, usando-se qualquer um dos outros compostos,

a atividade não se manteve em 2 kPa. Neste caso, o alto açúcar ofereceuma barreira osmótica à difusão do O

2, e, no caso dessa bactéria, isso

pode ser uma vantagem, já que esta concentração de açúcar éencontrada em seu hábitat natural, a cana-de-açúcar.

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162 Capítulo 6

Regulação da atividade da nitrogenase por NH4

+

A atividade da nitrogenase em vários microrganismos diazotróficosé inibida pela adição de NH

4+ de forma rápida e reversível (ZUMFT, 1985).

A expressão da atividade da FBN está sob o controle genético e, emadição, é regulada por fatores ambientais. Esse controle se faz necessárioem virtude do alto custo energético da redução de N

2. Em espécies do

gênero Azospirillum, Rhodospirillum, Rhodobacter e uma das espéciesde Azotobacter, A. chroococcum, a adição de amônia em concentraçõesvariando de 1-10 mM às culturas que fixam nitrogênio promove umdecréscimo da atividade quase que imediatamente para 10% ou menosque a atividade inicial. Também nesses organismos nenhuma nitrogenaseé sintetizada. Em outros gêneros, a adição de amônio geralmente resultaem um declínio gradual na atividade da enzima em torno da metadepara cada nova geração, mas não ocorre inativação irreversível dasnitrogenases presentes no momento da adição. Concluindo, em qualquerdiazotrofo, amônio pode inibir tanto a atividade como a síntese ou apenasprevenir a síntese da enzima (RUDNICK et al., 1997).

Na maioria dos diazotrofos, a adição única de uma pequenaquantidade de NH

4+ inibe a atividade da nitrogenase, sendo conhecido

como “NH4+ switch off ”. Após o esgotamento do amônio extracelular,

ocorre a recuperação da atividade enzimática, o que resulta no switchon. Os mecanismos relacionados com esse processo diferem entre osvários microrganismos fixadores de N

2. Não se tem conhecimento de

todos eles, porém o mais bem estudado é o do Rhodospirillum rubrum(POPE et al., 1985), que compreende a formação de um complexo inativoentre a ADP-ribose e um resíduo arginil conservado da proteína-Fe denitrogenase. Isso ocorre pela ação recíproca dos produtos dos genesdraT e draG, que resulta numa inibição total e irreversível após o intervalode tempo em que ocorre a inativação enzimática. A inativação danitrogenase em Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum eAzospirillum lipoferum e A. brasilense ocorre pela transferência dogrupamento ADP-ribose do NAD ao resíduo de arginina 101 (Arg101)da proteína Fe (dinitrogenase redutase) pela ação da enzima dinitrogenaseredutase ADP-ribosiltransferase - DRAT (codificada pelo gene draT ).Essa inativação é reversível pela ação da dinitrogenase redutase-

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ativadora glicohidrolase – DRAG (codificada pelo gene draG) quehidrolisa a ADP-ribose da proteína-Fe quando o suprimento de N torna-se limitante (HARTMANN; BURRIS, 1987; ROBERTS; LUDDEN, 1992).Esse sistema regulatório está relacionado à adição de nitrogênio ou acondições de anaerobiose em A. brasilense (HARTMANN et al., 1986;HARTMANN; BURRIS, 1987; ZHANG et al., 1996) e pela falta de energiaque ocorre na escuridão no caso de Rhodospirillum rubrum (KANEMOTO;LUDDEN, 1984) e Rhodobacter capsulatus (PIERRARD et al., 1993).Estudos de hibridização indicam que esse mecanismo também ocorreem A. brasilense, A. lipoferum (HARTMANN et al., 1986; FU et al., 1989)e aparentemente não está presente em Azotobacter (CEJUDO;PANEQUE, 1988; KLUGKIST; HAAKER, 1984), Azospirillum amazonense(SONG et al., 1985; HARTMANN et al., 1986), Herbaspirillumseropedicae (FU; BURRIS, 1989) e Azorhizobium caulinodans (KUSHet al., 1985). Recentemente, foi observado que íons amônio inibiam aatividade da nitrogenase em estirpes de Azospirillum brasilense quenão possuíam DRAT ou eram nitrogenases mutantes que tinham perdidoo sítio provável da ADP-ribosilação, sugerindo a existência de umsegundo mecanismo de regulação postranslacional (ZANG et al., 1996).Entretanto, esse segundo sistema regulatório tem um efeito menosdramático na atividade da nitrogenase em resposta ao amônio. Emcontraste, em R. rubrum, a alteração no resíduo responsável pelaribosilação elimina essa resposta postranslacional ao escuro e à adiçãode amônio, sugerindo que o mecanismo de regulação DRAT/DARG é oúnico nesta espécie (ZANG et al., 1996). A rápida inativação danitrogenase em Azotobacter chroococcum também sugere a existênciade um mecanismo secundário à inibição da nitrogenase, que é maisrápido que a ADP-ribosilação (MUNOZCENTENO et al., 1996).

Em Azotobacter vinelandii e Rhizobium leguminosarum, aregulação da atividade da nitrogenase pela adição de NH

4+ envolve

um componente elétrico (∆ϒ) que desreprime o potencial de membrana,que pode contribuir para a inibição da atividade da nitrogenase (LAANEet al., 1980). Íons amônio absorvidos por células de A. vinelandii causamum decréscimo no fluxo de elétrons para a nitrogenase (KLUGKIST;HAAKER, 1984). Em Rhodobacter sphaeroides, um metabólico geradopela glutamina sintetase, pela adição de amônio, tem sido proposto como

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um inibidor específico do transporte de elétrons para a nitrogenase(HAAKER et al., 1982). Também em A. amazonense tem sido propostoque o mecanismo inibidor é o decréscimo do potencial de membrana(HARTMANN et al., 1986). A eficácia do “NH

4+ switch off” em

Azotobacter depende da taxa de respiração, do pH, da idade da cultura,da natureza da fonte de carbono (KLUGKIST; HAAKER, 1984) e da razãoC/N dentro da célula (CEJUDO; PANEQUE, 1988).

A sensibilidade ao “NH4+ switch off” e a extensão da inativação

da proteína-Fe depende das condições culturais (GOTTO; YOCH, 1985)e da estirpe utilizada, como por exemplo em Azotobacter vinelandii(GORDON et al., 1981). Aparentemente, a modificação covalente daproteína-Fe não atua em Azotobacter spp., A. amazonense e H. seropedicae(HARTMANN et al., 1986; FU; BURRIS, 1989). Nesses organismos ocorreuma inibição parcial, isto é, parte da atividade inicial permanece apósa adição do NH

4+. Em H. seropedicae, a adição de cloreto de amônio

causa uma inibição parcial imediata da atividade da nitrogenase, istoé, não ocorre uma fase lag (FU; BURRIS, 1989).

Assimilação de amônio e aminoácidos

Em Azospirillum, a assimilação de amônio é mediada pela viaGS-GOGAT. A enzima glutamina sintase (GS) catalisa a reação abaixoe possui uma alta afinidade pelo amônio extracelular, isto é, emconcentrações limitantes.

A GS NADPH-dependente transfere o N-amida da glutamina parao 2-oxo-glutarato numa reação irreversível sem perda do amôniotransferido (VANONI et al., 1991) de acordo com a equação:

GOGATGlutamina + 2-oxo-glutarato + NADPH + H 2 glutamato + NADP + Pi

GSGlutamato + NH

3 + ATP glutamina + ADP + Pi

Mg2+

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O glutamato serve como aceptor pela alta afinidade de assimilaçãodo amônio e, em seguida, ocorre a reação anabólica do metabolismodos aminoácidos e síntese de polímeros.

Uma segunda enzima de assimilação do amônio, a glutamatodesidrogenase dependente de NAD(P)H (GDH), também sintetisaglutamato de acordo com a equação abaixo:

GDH2-oxo-glutarato + NH

3 + NAD(P)H + H+ glutamato + NAD(P)+

Já que a reação de assimilação de amônio via GDH é de baixaafinidade, a sua contribuição para a assimilação de NH

4+ só é importante

em altas concentrações de amônio extracelular (OKON et al., 1976).Entretanto, outras enzimas também são importantes para a assimilaçãode glutamato, tais como a GOT (glutamato-oxoloacetato-aminotransferase) e a GPT (glutamato-piruvato-aminotransferase).

A GPT catalisa a reação:

glutamato + piruvato → 2-oxo-glutarato + alaninae a GOT catalisa a reação:

glutamato + oxolacetato → 2-oxo-glutarato + aspartato

Bactérias diazotróficas, quando em presença de amônio emexcesso, assimilam este via GDH, e a GS presente está na forma inativaque é a forma não adenilada. Já na presença de baixas concentraçõesde amônio ou em meio livre deste as células demonstram altos níveisde GS na forma não adenilada (forma ativa) e a síntese da GDH éreprimida (OKON et al., 1976). O nível de atividade da GOGAT não énecessariamente afetado por concentrações diferenciais de amônio.

A. lipoferum e A. amazonsense apresentam alta atividade dasenzimas GDH, GOT e GPT e são capazes de crescer na presença deglutamato como única fonte de nitrogênio e carbono, mas a atividadeda nitrogenase é reprimida e apenas quantidades de 1 a 2 mM nãoinibem a enzima e o amônio é excretado. Glutamato ou derivados destepodem diminuir a atividade do sistema de assimilação de amônio dealta afinidade. Em A. halopraeferens e A. brasilense, a utilização deglutamato ou outros aminoácidos é tão baixa que a atividade da

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166 Capítulo 6

nitrogenase não é inibida, mesmo em altas concentrações externas(HARTMANN, 1989).

Aminoácidos podem inibir a atividade da nitrogenase, já que sãofontes de N. Para tal precisam ser assimiladas e nem todos osaminoácidos são metabolizados da mesma forma pelas bactérias.Em H. seropedicae, L-histidina, L-lisina ou L-arginina são usados parao crescimento e não afetam a atividade da enzima. Já L-serina eL-alanina inibem a atividade da nitrogenase (KLASSEN et al., 1997).

Mutantes que não são inibidos pela presença de amônio externojá foram produzidos em A. brasilense estirpe Sp6 (TURBANTI et al., 1988),Cd (HARTMANN et al., 1983), além de outros mutantes produzidos apartir do uso de etilenodiamina, substância esta que afeta o sistema deabsorção de amônio pelas células (MACHADO et al., 1991), entre outrossistemas de mutação. Em condições gnotobióticas (isto é, sistemacontrolado estéril onde se deixa a planta limpa por meio da esterilizaçãoda semente ou por cultivo in vitro e inocula-se um microrganismoconhecido, neste caso, uma bactéria diazotrófica – gnoto = conhecido),mutantes excretores de amônio foram capazes de suportar o crescimentode trigo de forma mais eficiente que as estirpes selvagens (CRISTIANSEN-WENIGER; VAN VEEN, 1991). A utilização de aminoácidos pode afetara atividade da nitrogenase de forma diferencial entre espécies do mesmogênero, como é o caso de Azospirillum. Hartmann et al. (1988) discutemque a qualidade e a composição dos aminoácidos presentes nosexsudatos de raízes pode variar muito entre espécies de plantas e fasesdo crescimento, tal como apresentado por Curl & Truelove (1986), eque a utilização de certos aminoácidos, como apresentado emAzospirillum spp., pode ser importante no estabelecimento na rizosferade uma planta, em particular, e também pode influenciar a atividade danitrogenase em associação com a planta. Maiores estudos sobre a presençados diferentes aminoácidos e seus derivativos nestes exsudatos, bemcomo sua quantidade, são necessários para se avaliar o potencial daFBN, já que se sabe que existem diferenças entre variedades de umamesma espécie de planta quanto à forma de disponibilização do N fixado.Da mesma forma, como observado para o oxigênio, a adição de teoreselevados de sacarose também afeta a absorção de diversos aminoácidosque indiretamente inibem a nitrogenase.

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Considerações finais

Vários estudos mostram que a nitrogenase necessita de condiçõesótimas para a sua síntese e atividade. Oxigênio, nitrogênio, aminoácidospodem atuar em diversos níveis e são compostos comuns no ambienteexterno das células. Tanto no solo como na rizosfera e no interior dasplantas, esses compostos estão distribuídos e podem causar uma inibiçãoda enzima que é de custo elevado à célula bacteriana, mas, por suavez, podem estimular o seu crescimento. Na rizosfera, compostosnitrogenados também são usados por todos os outros microrganismos e,nesse caso, as vantagens competitivas das bactérias diazotróficas sobreas outras são perdidas. Num ambiente onde a competição por fontes decarbono é a força maior que comanda a flutuação populacional, essesmicrorganismos, diazotróficos ou não, têm que ser versáteis parasobreviver.

Os estudos sobre fisiologia, abordados nesta revisão, englobamem sua maioria trabalhos que foram realizados em laboratório usandoculturas puras ou mesmo extratos enzimáticos. Muito pouco se conhecesobre esses efeitos in situ e como os outros microrganismos podem afetara assimilação dessas moléculas. Não é uma tarefa fácil e mesmo paraassociações simbióticas, como as das leguminosas, que formam nódulos,muito ainda falta ser respondido. O principal problema das associaçõesde espécies não leguminosas com bactérias diazotróficas é que não háa formação de nenhuma estrutura visível, como os nódulos dasleguminosas, que proteja e agrupe as bactérias. Uma vez distribuídas novegetal, sem nenhum padrão aparente, as células ficam mais suscetíveisàs trocas com o meio externo. Nos estudos de quantificação dessesorganismos, as raízes apresentam maiores números e a rizosfera é umsítio muito importante. É necessário que estudos sejam feitos, usandoplantas vindas do campo, e que metodologias mais sensíveis sejamdesenvolvidas para se obter uma avaliação real do papel dessesorganismos em associação com plantas.

Algumas técnicas alternativas já estão disponíveis, tais como ouso de soros policlonais contra a enzima nitrogenase, que podem seraplicados em cortes de tecido vegetal, possibilitando a localização da

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168 Capítulo 6

enzima. Também se pode isolar genes estruturais de nitrogenase demicrorganismos presentes nas plantas que podem informar a quenitrogenase pertence por meio da comparação de seqüências pelo usoda reação em cadeia da polimerase. Genes repórteres podem ser ligadosa genes reguladores da nitrogenase e indiretamente indicar alocalização da enzima na sua forma potencialmente ativa. Eletrodosde oxigênio e amônio, de dimensões diminutas, podem ser introduzidosdiretamente no tecido vegetal e estimar a quantidade desses elementos,dando uma idéia de onde a nitrogenase pode ser sintetizada ou perma-necer ativa e complementar às informações genéticas.

Todos esses métodos são extremamente laboriosos e caros.Um método antigo, rápido e barato é o da redução de acetileno usandoplantas. O grande problema da aplicação desse método em plantas decampo é a alteração do estado fisiológico, principalmente em relaçãoà exposição ao oxigênio de plantas retiradas de seu local de plantio.Para vasos e outros sistemas menores, onde as condições podem sermais controladas, não há dificuldade. Atualmente, vários métodosusando o isótopo mais pesado do nitrogênio (15-N) investem na marcaçãodo N por intermédio da adição de adubo marcado ou na abundâncianatural desse isótopo que, através de anos (milhares), ficam em númeromaior que o ar, permitindo a sua detenção. Esses métodos são chamadosde métodos de diluição isotópica, uma vez que o N

2 fixado do ar dilui a

marcação do solo. Para maiores detalhes, veja o capítulo referente aoassunto.

Vale lembrar que nenhum método usado individualmente é capazde estabelecer diferenças entre sistemas associativos fixadores denitrogênio em plantas que não formam nódulos. Existe muita controvérsiaquanto à quantidade fixada, já que ela é variável em relação ao ambientesolo-água-planta.

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Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte · de N. Infelizmente, a maioria dos organismos, animais e vegetais, não consegue incorporar essa forma de nitrogênio a esqueletos