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FRANCISCO IROCHIMA PINHEIRO
NOVO SISTEMA DE APLICAÇÃO DE DROGAS EM CIRURGIAS
OFTALMOLÓGICAS
Tese apresentada à Universidade Federal
do Rio Grande do Norte para obtenção do
Título de Doutor em Ciências da Saúde
pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde.
Natal - RN
2011
FRANCISCO IROCHIMA PINHEIRO
NOVO SISTEMA DE APLICAÇÃO DE DROGAS EM CIRURGIAS
OFTALMOLÓGICAS
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte para obtenção do Título de Doutor
em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Oréfice
Coorientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa
do Egito
Natal - RN
2011
Pinheiro, Francisco Irochima
Novo sistema de aplicação de drogas em cirurgias oftalmológicas.
Francisco Irochima Pinheiro. -- Natal, 2011.
xv, 80f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Programa
de Pós-graduação em Ciências da Saúde.
New drugs application system in ophthalmic surgeries.
1. Sistemas de Liberação de Medicamentos/Métodos. 2. Procedimentos
Cirúrgicos Oftalmológicos. 3. Mitomicina C. 4. Patentes.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Profa. Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão
iv
FRANCISCO IROCHIMA PINHEIRO
NOVO SISTEMA DE APLICAÇÃO DE DROGAS EM CIRURGIAS
OFTALMOLÓGICAS
Presidente da Banca:
Prof. Dr. Fernando Oréfice - UFMG
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Anselmo Gomes de Oliveira - UNESP
Prof. Dr. Marcelo Bezerra de Melo de Mendonça - UFPE
Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Junior - UFRN
Prof. Dr. Jeancarlo Fernandes Cavalcante - UFRN
v
Dedicatória
Ao meu pai, João Batista Pinheiro, por ter me ensinado desde a minha infância a
apreciar as ciências e pelo incentivo constante ao caráter inventivo.
À minha mãe, Maria Neide, por ter sido minha primeira professora com a mais alta
qualificação pedagógica: ―Mestrado‖ na paciência, ―Doutorado‖ na persistência e ―Pós-
doutorado‖ na vida.
Aos meus avôs Leonardo Pinheiro (in memoriam), João Alfredo (in memoriam) e
Maria Cachina (in memoriam). Minhas eternas saudades!!
À minha querida avó Maria Leocádia. Mulher forte, guerreira e exemplo de vida.
Ao meu irmão Leonardo e à minha irmã Aline pelo companheirismo constante.
Aos meus sogros Laércio e Aldeíza pela atenção dispensada, a qual só se
observa na relação entre pais e filhos. Minha eterna gratidão!
Aos meus cunhados Gley, Gleydson, Georgia e Wallace por provarem que o
termo família suplanta os laços de consanguinidade.
Aos sobrinhos Guilherme, Enzo, Leonardo, Camila e Helena pela terapia do riso e
pelas alegrias dominicais.
Ao irmão Kerginaldo pela bolsa de estudos até o pré-vestibular.
À minha Tia Socorro pelo acesso ao Colégio Marista e pela bolsa de estudos em
um dos momentos mais difíceis.
À minha Tia Maria José pelo suporte em tempos de faculdade.
À Maria José de Amorim Simonetti e a José Nazareno Simonetti por terem me
acolhido como um filho. Minha eterna gratidão!
E por fim, à minha esposa Karina, luz do meu viver, que multiplica minhas alegrias
e divide minhas tristezas. Meu eterno amor!
vi
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Fernando Oréfice, Professor Titular do Departamento de Oftalmologia
e Otorrinolaringologia da UFMG, exemplo de dedicação constante à ciência e ao
ensino. Obrigado pelo incentivo e orientação científica.
Ao Dr. Acácio Alves de Souza Lima Filho, Chefe do Setor de Farmacologia Ocular
da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP/EPM. Professor, conselheiro,
incentivador e amigo. Obrigado pelos exemplos de dignidade, integridade, honestidade
e amor à ciência.
À Dra. Andréia Cristina Santos de Lourenço pela condução técnica nos
laboratórios da Ophthalmos Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A. (São
Paulo – SP, Brasil).
Ao Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito pela disponibilidade e primorosa
orientação científica.
Ao Escritório Águia Marcas e Patentes na pessoa da Sra. Maria Lúcia Mosca pela
consultoria prestada perante o Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI).
Ao Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares pela orientação na análise estatística.
À Profª. Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão pela competente coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN).
Ao Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN) mais especificamente ao Laboratório de Sistemas Dispersos (LASID).
À Ophthalmos Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A. (São Paulo –
SP, Brasil) pelo patrocínio e suporte logístico, o que tornou possível a realização dessa
tese.
vii
Sumário
Dedicatória ................................................................................................................... v
Agradecimentos ......................................................................................................... vi
Listas ............................................................................................................................ x
Resumo ...................................................................................................................... xv
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
1.1 Objetivos ................................................................................................................. 5
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 6
2.1 Administração de medicamentos no olho humano ............................................ 6
2.2 Mitomicina C (MMC) ............................................................................................... 8
2.3 Papel da MMC na oftalmologia ........................................................................... 11
2.4 Mitomicina C nas cirurgias refrativas da córnea ............................................... 13
2.5 Dose e tempo de exposição da MMC .................................................................. 14
2.6 Indicações da MMC nas cirurgias de PRK .......................................................... 16
2.7 Métodos de aplicação da MMC nas cirurgias de PRK ...................................... 17
2.8 Tentativas de padronização dos métodos de aplicação ................................... 18
2.9 Biodisponibilidade da MMC e bioensaio ........................................................... 20
2.10 Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e MMC ............................ 22
2.11 Manipulação e estabilidade da MMC em solução ............................................ 23
2.12 Potenciais riscos do uso da MMC na córnea .................................................. 25
2.12.1 Efeitos nas células epiteliais .......................................................................... 26
viii
2.12.2 Efeitos nos ceratócitos estromais ................................................................ 27
2.12.3 Efeitos no endotélio ........................................................................................ 29
3 MÉTODOS ............................................................................................................... 31
3.1 Tipo de estudo ..................................................................................................... 31
3.2 Procedimentos e técnicas laboratoriais ............................................................ 31
3.2.1 Confecção e esterilização dos discos de papel filtro .................................... 31
3.2.2 Determinação do volume das gotas de SSB em frascos de colírio
padronizados .............................................................................................................. 32
3.2.3 Impregnação dos discos com MMC ................................................................. 33
3.2.4 Espectrofotometria e dosagem da MMC nos discos ...................................... 35
3.2.5 Bioensaio (Método de disco-difusão em ágar) ................................................ 36
3.2.5.1 Confecção das placas de antibiograma ........................................................ 36
3.2.5.2 Inoculação das placas de teste .................................................................... 37
3.2.5.3 Aplicação dos discos e das soluções nas placas de teste ......................... 38
3.2.6 Medida dos halos de inibição ........................................................................... 41
3.3 Análise estatística ............................................................................................... 43
3.4 Depósito do Pedido de Patente ........................................................................... 43
4 RESULTADOS ......................................................................................................... 45
4.1 Volume médio das gotas de SSB ........................................................................ 45
4.2 Varredura por espectrofotometria ...................................................................... 47
4.3 Ensaio de teor para determinar a recuperação da MMC nos discos ................ 48
4.4 Medida dos halos de inibição ............................................................................. 50
ix
4.5 Depósito do Pedido de Patente ........................................................................... 53
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 55
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 61
7 ANEXOS ................................................................................................................... 62
8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 68
Abstract
Apêndice
Glossário
Bibliografia consultada
x
Lista de figuras
Figura 1. Ceratectomia fotorrefrativa (Photorefractive keratectomy- PRK) ............. 1
Figura 2. Perda da transparência da córnea (haze) pós-PRK ................................... 2
Figura 3. Vias de administração de medicamentos no olho .................................... 7
Figura 4. Aplicação tópica transoperatória de mitomicina C (MMC) durante a
cirurgia de PRK ............................................................................................................ 8
Figura 5. Fórmula estrutural da MMC (C15H18N4O5) ................................................... 9
Figura 6. Mecanismo de ação da mitomicina C (MMC) ........................................... 10
Figura 7. Ciclo celular ............................................................................................... 10
Figura 8. Proliferação e diferenciação dos ceratócitos .......................................... 11
Figura 9. Mitocin® ...................................................................................................... 22
Figura 10. Extratos e componentes celulares da córnea ....................................... 26
Figura 11. Discos de papel filtro Whatman® 41 com 8 mm de diâmetro ............... 32
Figura 12. Pesagem das gotas de SSB (Solução Salina Balanceada) ................... 33
Figura 13. Diluição da mitomicina C (à esquerda) e impregnação dos discos (à
direita) ......................................................................................................................... 34
Figura 14. Tipos de placas confeccionados ............................................................. 36
Figura 15. Placa semeada com Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) ......... 37
Figura 16. Inserção de disco de papel estéril .......................................................... 38
Figura 17. Concentrações de MMC e água estéril ................................................... 39
xi
Figura 18. Aplicação da solução de MMC no sítio com disco estéril .................... 40
Figura 19. Medida do diâmetro do halo de inibição com paquímetro (mm –
milímetros) ................................................................................................................. 42
Figura 20. Gráfico demonstrativo da variação do volume das gotas em função
dos frascos e dos operadores .................................................................................. 46
Figura 21. Gráfico demonstrativo da variação do volume das gotas considerando
os operadores ........................................................................................................... 47
Figura 22. Gráfico demonstrativo da varredura para determinar o melhor
comprimento de onda para leitura no espectrofotômetro de absorção no UV .... 48
Figura 23. Gráfico da curva de calibração empregada na avaliação do teor de
mitomicin C nos discos. ............................................................................................ 49
Figura 24. Correspondências entre os halos de inibição ....................................... 52
Figura 25. Novo sistema de aplicação de drogas em cirurgias oftalmológicas
(Ophthalmos Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A.) .................. 54
xii
Lista de tabelas
Tabela 1. Ensaio de teor para determinar a recuperação da MMC nos discos
impregnados .............................................................................................................. 49
Tabela 2. Correspondência entre os halos produzidos pelos discos impregnados
e as soluções testadas ............................................................................................. 51
Tabela 3. Comparação entre o incremento na concentração de MMC e o halo de
inibição nas placas do tipo I ..................................................................................... 53
xiii
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
ATCC American Type Culture Collection
cm centímetro
Com. Comércio
°C Grau Celsius
DNA Deoxyribonucleic Acid
D Dioptrias
et al e colaboradores
E.U.A. Estados Unidos da América
eximer excited dimer
g/m2 grama por metro quadrado
G1 Síntese protéica da intérfase do ciclo celular
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Ind. Indústria
Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
LASIK Laser in situ keratomileusis
Ltda. Limitada
mg miligrama
mL mililitro
mm milímetro
MMC mitomicina C
nm nanômetro
nº número
pH potencial hidrogeniônico
xiv
PI Patente de Invenção
PRK Photorefractive keratectomy
p450 Pigmento que absorve a luz com comprimento de onda próximo a 450
nanômetros
RK Radial keratotomy
RNA Ribonucleic acid
S Duplicação do DNA na intérfase do ciclo celular
S.A. Sociedade Anônima
SP São Paulo
SSB Solução salina balanceada
UV Radiação ultravioleta
UVB Radiação ultravioleta tipo B
µg micrograma
µL microlitro
µm micrômetro
% porcentagem, por cento
± mais ou menos
+ positivo, soma
x multiplicado por, vezes
® marca registrada
xv
Resumo
A aplicação tópica corneana do antimitótico mitomicina C (MMC) durante as cirurgias
refrativas ainda é caracterizada por uma falta de padronização e grande empirismo. Por
isso, a criação de um sistema capaz de disponibilizar a droga de forma padronizada
representa uma inovação que vem beneficiar os pacientes submetidos àqueles
procedimentos. Objetivo: Elaborar um novo sistema de aplicação da MMC durante o
período transoperatório da cirurgia de ceratectomia fotorrefrativa (Photorefractive
keratectomy- PRK) com posterior depósito do Pedido de Patente. Métodos: O projeto
representou um estudo experimental in vitro para criação de um sistema de liberação
de MMC a 0,02%. A droga foi impregnada em discos estéreis de papel filtro do tipo
Whatman® 41 com 8 mm de diâmetro. Após o processo de secagem, os discos foram
aplicados em placas de antibiograma semeadas com Staphylococcus epidermidis
(American Type Culture Collection – ATCC 12228), recebendo em seguida uma gota
de água estéril. Decorrido o período de 1 minuto, os discos foram removidos e as
placas incubadas por 48 horas a 35oC. O volume médio das gotas de frascos de colírio
foi medido pelo método de pesagem em balança analítica. O halo de inibição, em
milímetros, foi correlacionado com a dose da MMC impregnada no disco. Com o
delineamento da invenção, procedeu-se o Depósito do Pedido de Patente no Instituto
Nacional da Propriedade Industrial. Resultados: A correspondência entre os halos de
inibição produzidos pela MMC indicou a dose de 16µg como a ideal para ser
impregnada nos discos. O volume médio de uma gota obtida dos frascos de colírio foi
37,7 µL. Com a aplicação de uma gota de solução salina balanceada e após o período
de um minuto, o sistema liberou uma concentração considerada adequada para a
cirurgia de PRK. Conclusão: Um novo sistema de aplicação de MMC foi criado para
sua aplicação transoperatória na ceratectomia fotorrefrativa (PRK). A publicação do
Pedido de Patente sob o número PI 0704739-8 outorga aos autores a prioridade
exclusiva de sua Propriedade Intelectual. A pesquisa teve o patrocínio da Ophthalmos
Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A. (São Paulo-SP, Brasil) e a
indispensável contribuição científica de pesquisadores das áreas de Farmácia,
Medicina, Biologia, Estatística e Direito, revestindo o trabalho de um caráter
multidisciplinar, requisito inerente às exigências do Programa de Pós-Graduação de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
1
1 INTRODUÇÃO
A ceratectomia fotorrefrativa (Photorefractive keratectomy - PRK) é uma
modalidade de cirurgia refrativa que se propõe a corrigir as ametropias do sistema
óptico do olho por meio da remoção cirúrgica do epitélio da córnea com posterior
fotoablação a laser do estroma anterior subjacente (1) (Figura 1).
Figura 1: Ceratectomia fotorrefrativa (Photorefractive keratectomy - PRK). A- Desepitelização com
espátula, B- Fotoablação a laser e C- Aposição de lente de contato. (Ilustração: Francisco Irochima
Pinheiro).
A constatação de complicações graves observadas no pós-operatório de
pacientes tratados para elevadas ametropias limitou a indicação dessa modalidade
cirúrgica no final dos anos 90 (2-4). Estudos demonstraram que um elevado consumo
tecidual da córnea provocado pela ação do laser determina uma intensa ativação,
proliferação e diferenciação dos ceratócitos em fibroblastos e miofibroblastos (5-7). Essa
cascata de eventos celulares induz à formação de um tecido opaco de reparação, que
leva à perda da transparência da córnea (haze) e ao consequente comprometimento da
visão (7-11) (Figura 2). Porém, com a introdução dos antimitóticos como a mitomicina C
(MMC) no arsenal terapêutico oftalmológico, surge uma nova perspectiva capaz de
2
modular o processo de cicatrização tecidual e melhorar os resultados cirúrgicos do
PRK em pacientes com altas ametropias (12-13).
Figura 2: Perda da transparência da córnea (haze) pós-PRK. (Destaque) Fibroblastos, miofibroblastos
e fibrose. (Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
Atualmente, a MMC é aplicada diretamente na superfície ocular durante o
transoperatório do PRK com a finalidade de inibir a replicação do DNA, a mitose e a
transdiferenciação dos fibroblastos (14-17). Quanto ao modo de aplicação, uma
diversidade de métodos é observada. Em todos, as soluções da MMC são preparadas
por diluições e rediluições em seringas, procedimentos estes sujeitos a erros de
doseamento quando realizados por pessoas sem o devido treinamento técnico. Não
obstante, esponjas cirúrgicas e papéis filtro com diferentes dimensões e formatos são
imersos nas soluções previamente preparadas e aplicados na superfície da córnea
durante o ato cirúrgico (18-22). Tais métodos se caracterizam por uma falta de
padronização que pode levar a significativas variações na biodisponibilidade da droga
3
transferida aos tecidos oculares, expondo-os aos potenciais e severos efeitos tóxicos
da droga (23-26).
Diante de todos os riscos que cercam o emprego da MMC durante as cirurgias
oftalmológicas, novos sistemas de liberação da droga vêm sendo desenvolvidos na
tentativa de promover um maior controle e segurança na sua aplicação (21,27). Em dois
estudos experimentais, Khoury et al propuseram uma nova padronização na aplicação
da MMC (21,27). A ideia consistiu em saturar esponjas cirúrgicas padronizadas por
imersão em soluções da droga e aplicá-las na área a ser tratada. Em um dos
experimentos in vitro, foi avaliado um sistema de liberação composto por uma esponja
cirúrgica em forma de disco com dimensões padronizadas para conduzir a MMC ao
leito estromal da córnea durante o PRK (21). Já em outro estudo in vivo, a MMC foi
aplicada na esclera através de semicirculos de esponjas cirúrgicas durante a cirurgia
filtrante antiglaucomatosa (trabeculectomia) (27). Apesar dos esforços empenhados
nesses estudos, vários aspectos ainda precisam ser revistos para que a aplicação da
MMC seja considerada totalmente segura.
Com a melhoria dos biomateriais, a MMC também vem sendo incorporada em
géis termorsensíveis e polímeros biodegradáveis, transformando esses compostos em
dispositivos liberadores do fármaco para outras modalidades de cirurgias oculares (28-
30). Como resultado de toda essa evolução, o que se observa são avanços evidentes na
inovação tecnológica dos sistemas de liberação de drogas (31). Consequentemente,
também se percebe um aumento no número de pedidos de patentes nesse segmento,
uma vez que tal ato assegura aos pesquisadores envolvidos o direito à Propriedade
Intelectual sobre o objeto de invenção (32-33).
Seguindo a perspectiva que se vislumbra, esta tese versa sobre o processo de
invenção e posterior depósito do Pedido de Patente de um método alternativo de
4
administração da MMC durante a cirurgia de PRK. O estudo foi impulsionado pela
necessidade de se dispor de um sistema de liberação transoperatória da droga
caracterizado por um baixo custo, boa reprodutibilidade, isenção do uso de seringas na
preparação da dose, respeito ao uso extemporâneo, controle da dose, maior segurança
e possível ampliação do prazo de validade da droga.
A pesquisa foi realizada na Ophthalmos Indústria e Comércio de Produtos
Farmacêuticos S.A. (São Paulo-SP, Brasil) e no Laboratório de Sistemas Dispersos
(LASID) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN (Natal-RN, Brasil).
Todo estudo aqui relatado foi patrocinado pela mencionada indústria farmacêutica
conforme consta da Declaração de Conflito de Interesse, objeto do Anexo1. Ainda
deve-se ressaltar o caráter multidisciplinar da pesquisa, pois todo o estudo contou com
a indispensável colaboração de profissionais das áreas de Farmácia, Medicina,
Biologia, Estatística e Direito.
5
1.1 Objetivos
Objetivos gerais
Elaborar um novo sistema de aplicação transoperatória de drogas nas cirurgias
oftalmológicas;
Assegurar aos inventores do novo método os direitos de exclusividade sobre a
Propriedade Intelectual da criação por meio do Depósito do Pedido de Patente no
Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI).
Objetivos específicos
Determinar o volume médio das gotas de solução salina balanceada (SSB)
instiladas a partir de frascos de colírio padronizados;
Determinar a massa da MMC a ser impregnada nos discos de papel filtro
Whatman® 41 com 8 mm de diâmetro, para que o sistema libere uma concentração
de 0,02% da droga após a instilação de uma gota de SSB e decorrido o período de
um minuto;
Avaliar o método de disco-difusão em ágar como ferramenta capaz de
correlacionar a atividade antimicrobiana da MMC com sua concentração nos discos
de papel filtro.
6
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Administração de medicamentos no olho humano
A maioria das doenças oculares é tratada com a simples aplicação de
medicamentos na superfície ocular pela via tópica. Essa via consiste na utilização de
soluções e suspensões sob a forma de colírios, pomadas e géis aplicados diretamente
sobre a superfície do olho (córnea e conjuntiva). É também por essa via que cerca de
90% das formulações oftalmológicas disponíveis no mercado são aplicadas por meio
de um procedimento prático, seguro, com boa adesão do paciente e reduzidos efeitos
colaterais (34-35). No entanto, o emprego ocular dos medicamentos também pode ser
realizado através de outras vias de administração. Na via periocular, o princípio ativo é
introduzido por meio de injeções nos compartimentos virtuais adjacentes ao olho (via
subconjuntival e via subtenoniana) ou nos espaços peri e retrobulbar (36-39). Já na via
intraocular, a droga é injetada diretamente nos compartimentos internos do olho, ou
seja, na câmara anterior (via intracameral) e na câmara vítrea (via intravítrea) (40)
(Figuras 3). Por sua vez, a administração sistêmica das drogas se dá, na sua grande
maioria, pela ingestão de comprimidos, drágeas e cápsulas (via oral) ou pela utilização
das vias intramuscular e intravenosa.
Com a contínua evolução tecnológica da indústria farmacêutica, novas
formulações e sistemas de administração de drogas vêm sendo desenvolvidos. Como
resultado, observa-se uma ampliação do arsenal terapêutico oftalmológico,
possibilitando uma oferta mais efetiva das drogas aos tecidos oculares. Lipossomas,
microemulsões, polímeros biodegradáveis, micro e nanopartículas de
7
liberação controlada, além de sistemas de aplicação tópica transoperatória são
exemplos dos avanços promovidos por essa evolução.
Figura 3: Vias de administração de medicamentos no olho. 1- Via tópica, 2- via subtenoniana, 3- via
subconjuntival, 4- via intracameral, 5- via intravítrea e 6- via periocular e 7- via retrobulbar.(Ilustração:
Francisco Irochima Pinheiro).
Na aplicação tópica transoperatória, o fármaco é administrado diretamente na
superfície do olho durante o ato cirúrgico. A droga é disponibilizada aos tecidos alvos
por meio de reservatórios compostos por esponja cirúrgica ou papel filtro previamente
embebidos em uma solução da droga. O uso de um trépano funcionando como
8
reservatório para a solução da droga durante o período de aplicação representa outro
método menos convencional que também é utilizado (41) (Figura 4). Porém, o risco de
extravasamento da droga para áreas onde o seu efeito é indesejável e potencialmente
danoso ainda está presente em todos os métodos disponíveis atualmente.
A administração ocular pela via tópica transoperatória durante as cirurgias
oftalmológicas ganhou notoriedade com a indicação da MMC nas exéreses de pterígio
(42). Mais recentemente, a aplicação dos antimitóticos nas cirurgias de trabeculectomia
e nos procedimentos refrativos de PRK determinou um novo impulso no estudo dessa
via de administração (43-44).
Figura 4: Aplicação tópica transoperatória de mitomicina C (MMC) durante a cirurgia de PRK.
(Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
2.2 Mitomicina C (MMC)
A MMC é um antibiótico natural isolado pela primeira vez a partir de culturas de
Streptomyces caespitosus por Hata et al em 1956 (45). Quimicamente, é classificada
como uma quinona biorredutível que apresenta ação antimicrobiana contra bactérias
Gram positivas e negativas, além de atividade antitumoral contra certos tipos de
9
tumores sólidos (Figura 5). Na oncologia, a MMC é utilizada pela via endovenosa na
quimioterápica de tumores do estômago e do pâncreas, sendo também indicada no
tratamento do carcinoma da bexiga urinária por meio da aplicação intravesical (46).
Figura 5: Fórmula estrutural da MMC (C15H18N4O5).
Após ser ativada por enzimas como a citocromo p450 redutase, a MMC atua
como um agente alquilante antimitótico promovendo ligações covalentes entre a
adenina e a guanina presentes nas moléculas do DNA celular (Figura 6). Isso impede a
replicação do DNA, a transcrição do RNA e a síntese protéica, comprometendo, por
fim, a mitose celular. Apesar de agir primariamente nas fases G1 e S do ciclo celular, a
MMC é considerada uma droga ciclo celular não específica (Figura 7). Por essas
propriedades, seu uso sistêmico foi inicialmente direcionado para o tratamento
quimioterápico de algumas neoplasias, pois sua ação se manifesta de forma mais
evidente em células com rápida proliferação e intensa atividade mitótica (47).
10
Figura 6: Mecanismo de ação da mitomicina C (MMC). (Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
Figura 7: Ciclo celular. Fase G1- antecede a duplicação do DNA, Fase S- duplicação do DNA e Fase
G2- DNA duplicado e MITOSE – divisão celular. (Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
11
Valendo-se de seu efeito antimitótico, outras áreas da medicina elegeram a MMC
como integrante do seu arsenal terapêutico, sendo a oftalmologia uma das mais
beneficiadas com essa prática. Nesse contexto, na década de 70, Kunitomo e Mori
utilizaram a MMC pela primeira vez na oftalmologia por meio da via tópica para
prevenção da recorrência do pterígio após sua remoção cirúrgica (48).
2.3 Papel da MMC na oftalmologia
Como observado nos demais tecidos corpóreos, a resposta cicatricial resultante
de um procedimento cirúrgico na superfície ocular é composta por uma cascata de
eventos celulares e bioquímicos. Fazendo parte desse processo, a ativação,
proliferação e transdiferenciação dos ceratócitos em fibroblastos e miofibroblastos
promovem a formação de uma matriz de colágeno densa e desorganizada na tentativa
de reparar a ferida operatória (3,5,9) (Figura 8).
Figura 8: Proliferação e diferenciação dos ceratócitos. (Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
12
Na cirurgia de PRK, esse tecido de reparação ocasiona perda da transparência da
córnea (haze), comprometimento da acuidade visual e regressão do tratamento, fato
que limitou a indicação do procedimento nos pacientes com altas ametropias (3).
Apesar de fisiológica, a resposta cicatricial mediada pelos fibroblastos também se
relaciona com complicações e falhas terapêuticas no período pós-operatório de outras
modalidades de cirurgias oculares. Altas taxas de recidiva do pterígio são observadas
após sua remoção cirúrgica como resultado da ativação dos fibroblastos presentes na
cápsula de Tenon, podendo esses índices atingirem até 89% (49). Já na
trabeculectomia, o processo cicatricial leva à oclusão da fístula criada entre a câmara
anterior e o espaço subconjuntival. Esse pertuito teria a função de drenar o humor
aquoso, reduzindo a pressão intraocular (PIO). Como conseqüência de sua
cicatrização, a eficácia da cirurgia em diminuir a PIO não é observada no período pós-
operatório, configurando falência terapêutica do procedimento (50).
Diante da problemática causada pela resposta cicatricial, modular a proliferação
fibroblática nas cirurgias oftalmológicas logo se tornou necessário. Tal papel recaiu
sobre a MMC devido à sua ação antimitótica e os já comprovados benefícios na
oncologia clínica (46). Dessa forma, a MMC foi incorporada como terapia adjuvante nas
cirurgias de pterígio, nas cirurgias filtrantes antiglaucomatosas, no tratamento do haze
pós-PRK, nas neoplasias da conjuntiva e da córnea, no tratamento do penfigóide ocular
cicatricial e, mais recentemente, na profilaxia do haze pós-PRK (12,13,42,51-53).
13
2.4 Mitomicina C nas cirurgias refrativas da córnea
Em 1991, Talamo et al desenvolveram os primeiros estudos utilizando a MMC na
superfície ocular após a fotoablação de 10 córneas de coelhos (54). A redução
significativa da fibrose subepitelial nos animais que receberam colírio de MMC a 0,05%
durante 14 dias após uma fotoablação estromal de 100 µm sugeriu o uso da droga
como modulador da resposta cicatricial na córnea.
O primeiro estudo experimental que demonstrou a diminuição da cicatrização e
dos ceratócitos estromais em córneas de coelhos submetidas ao excimer laser seguido
da aplicação transoperatória da MMC foi realizado em 1997 por Schipper et al (44).
Nesse estudo, os autores utilizaram a droga na concentração de 0,04% com um
período de aplicação de 5 minutos sobre o leito estromal e após um consumo tecidual
de aproximadamente 80 µm.
Porém, só em 2000, Majmudar et al, analisando uma série de casos,
sedimentaram os benefícios da MMC aplicada por dois minutos após a remoção
mecânica do epitélio e da fibrose subepitelial em córneas de pacientes que
apresentavam haze secundário a procedimentos refrativos (12). Os resultados
promissores observados no seguimento entre 6 a 25 meses incentivaram o uso
transoperatório profilático da MMC nas cirurgias fotoablativas da superfície na córnea.
No entanto, o efetivo emprego profilático transoperatório da MMC após o PRK
para inibir a formação do haze só foi demonstrado em 2002 por Carones et al (13). O
estudo se caracterizou por ser prospectivo, randomizado, compreendendo 60 olhos de
pacientes sem cirurgias prévias e com equivalente esférico entre -6,00 e -10,00D. Após
serem submetidos ao PRK, 30 olhos, que receberam a MMC a 0,02% por dois
14
minutos, apresentaram menos haze, depois da fotoablação, do que aqueles que não
foram expostos à ação da droga (13).
Sendo assim, nos últimos 20 anos, o que se observou foi a comprovação dos
benefícios da MMC nos resultados cirúrgicos do PRK, devido ao seu importante papel
como modulador da resposta cicatricial. Tal constatação determinou um marcante
interesse pela retomada das cirurgias fotoablativas da superfície da córnea. Ao mesmo
tempo em que a MMC se firmou como um fator permissivo para a utilização mais
abrangente do PRK, uma padronização de sua dose e de seus métodos de aplicação
não foi observada (55).
2.5 Dose e tempo de exposição da MMC
Sadeghi et al quantificaram a ação antiproliferativa e citotóxica da MMC em um
experimento in vitro com ceratócitos humanos em meio de cultura (24). A concentração
inibitória média da MMC capaz de inibir a proliferação de 50% dos ceratócitos foi de
0,0038% após cinco minutos de exposição. Já a concentração letal média necessária
para eliminar 50% dos ceratócitos foi de 0,028% depois de uma hora de exposição (24).
Netto et al aplicaram a MMC nas concentrações de 0,02% e 0,002% durante 12
segundos, 1 minuto e 2 minutos para profilaxia do haze em córneas de coelhos (56). Foi
observado que, apesar da MMC a 0,02% aplicada por 2 minutos provocar a maior
redução de miofibroblastos estromais no pós-operatório, a MMC a 0,002% durante 12
segundos foi igualmente eficaz na prevenção do haze pós-operatório (56).
A taxa de apoptose dos ceratócitos ocasionada pela MMC em córneas de coelhos
foi avaliada por Song et al (57). Nesse estudo, a MMC foi administrada a uma
15
concentração de 0,02% por 15, 30, 60 e 120 segundos e a 0,005%, 0,01%, 0,02% e
0,04% durante 2 minutos. A taxa de apoptose foi maior nas córneas submetidas às
duas maiores concentrações e naquelas com os maiores tempos de exposição à droga.
No entanto, a correlação estatística mais significante foi observada com a concentração
da droga do que com o tempo de exposição (57).
Rajan et al estudaram a repopulação dos ceratócitos em córneas humanas
mantidas in vitro após a fotoablação estromal. O evento ocorreu primeiro nas córneas
que não receberam MMC, seguidas pelas que receberam MMC a 0,02% por um minuto
e por último nas que receberam MMC a 0,02% por 2 minutos (58).
A eficácia da MMC em concentrações inferiores a 0,02% para prevenção do haze
foi comprovada em estudos realizados por Camellin, Netto et al, Thornton et al, Wallau
e Campos (19,56,59-60). No entanto, Thornton et al verificaram que a mesma eficácia não
é confirmada quando a córnea é tratada para altas miopias, especialmente acima de
6,00D. Os mesmos autores ainda recomendaram a MMC a 0,02% como dose ideal
para o tratamento das altas miopias pela técnica de PRK (59). Quanto a miopia
moderada, Wallau e Campos apresentaram, em 2009, resultados promissores na
prevenção do haze com a aplicação da MMC a 0,002% por um minuto (60). Todavia,
mais estudos são necessários para estabelecer a eficácia de baixas concentrações da
MMC nas miopias moderadas (55).
O tempo ideal de aplicação da MMC no leito estromal durante a técnica de PRK
ainda não foi bem estabelecido (56). Desde modo, a droga vem sendo administrada por
períodos que variam de 12 segundos a 1 minuto, dependendo da profundidade de
ablação (41,59). Segundo estudos de Netto et al e diante da falta de evidências
conclusivas para estabelecer o tempo de exposição ideal, há uma tendência em reduzir
o tempo de aplicação da MMC a fim de diminuir os efeitos colaterais (56).
16
Apesar da inexistência de um consenso quanto à concentração e o tempo de
aplicação ideais para a MMC na cirurgia de PRK, a literatura científica vigente revela
que a maioria dos cirurgiões refrativos utilizam uma concentração menor ou igual a
0,02% com um tempo de aplicação menor ou igual a um minuto (21).
2.6 Indicações da MMC nas cirurgias de PRK
Os parâmetros que norteiam a indicação profilática da MMC para prevenir o haze
pós-PRK são: a magnitude da dioptria a ser tratada, a profundidade de ablação e o
índice profundidade de ablação/espessura da córnea (55). Netto et al apontaram
ametropias maiores ou iguais a -6,00D como uma das indicações para o uso da droga
na prevenção do haze (56). Já outros pesquisadores como Lacayo et al e Mirza et al
apresentam discordância entre os limites de profundidade de ablação a partir dos quais
a MMC estaria indicada (41,61). Tais valores são firmados em 50 µm, 75 µm e até 100
µm, dependendo do estudo (41,55,61). Por sua vez, Lin et al propuseram também como
indicador do uso da MMC o índice profundidade de ablação/espessura da córnea maior
ou igual a 0,18 (7).
O uso da MMC durante o PRK ainda é preconizado em outras situações que
envolvem elevado risco para a formação do haze ou falha terapêutica pós-operatória
(21). Dentre estas, estão relacionados os tratamentos para a hipermetropia, cirurgias
refrativas prévias [PRK, LASIK (Laser in situ Keratomileusis), Ceratotomia Radial
(Radial Keratotomy - RK) ou transplante penetrante], complicações prévias do LASIK
ou história prévia de haze no olho contralateral (21).
17
2.7 Métodos de aplicação da MMC nas cirurgias de PRK
A grande diversidade de métodos de aplicação da MMC durante o PRK dificulta
uma comparação entre os estudos disponíveis na literatura científica (27). Tais
procedimentos são caracterizados por um grande empirismo e por uma elevada
variação na biodisponibilidade da droga, quando comparados com outras vias de
administração ocular (27). Em adição, evidencia-se ainda uma grande diversidade de
reservatórios utilizados na administração da droga quanto ao tipo de material, formato e
dimensões. Não obstante, a técnica de aplicação própria de cada cirurgião e a
ausência de uma dose e tempo de exposição ideais contribuem de forma significativa
para uma falta de padronização no procedimento (21).
Materiais como acetato de polivinila (PVA) e celulose de diversas marcas vêm
sendo utilizados sob a forma de esponjas ou papel filtro para aplicação da MMC na
superfície ocular. Discos, anéis ou fragmentos dos mais variados formatos e dimensões
embebidos em soluções de MMC servem como reservatórios para conduzir a droga até
o leito estromal (21).
Kloess et al verificaram uma variação na dose da MMC aplicada na superfície
ocular devido à utilização de diferentes tipos de esponjas cirúrgicas (62). Flynn et al em
um estudo in vitro utilizando quatro marcas distintas de esponjas cirúrgicas mostraram
diferenças significativas na quantidade de MMC liberada (63). Por sua vez, Yamamoto e
Kitazawa analisando doses residuais em esponjas cirúrgicas de pós-operatório de
cirurgias oculares recomendaram a busca por métodos mais precisos de aplicação da
droga (64). Outro fator que demonstrou interferir de forma significativa na quantidade da
MMC transferida aos tecidos oculares foi o tamanho da área de contato do material
com a superfície ocular a ser tratada (27).
18
A técnica de aplicação própria de cada cirurgião também representa um fator de
significante interferência na biodisponibilidade do fármaco aos tecidos oculares (27).
Durante a revisão da literatura, observa-se uma marcante falta de padronização no que
se refere às técnicas utilizadas. No entanto, na maioria dos trabalhos, a MMC é
aplicada imediatamente após a fotoablação a laser, seguida de copiosa irrigação com
solução salina balanceada (SSB) (65). Porém, Jain et al aplicaram a MMC a 0,025% e
0,05% após a desepitelização e antes da aplicação do laser utilizando discos e anéis
de papel filtro (20). Os discos com 5 mm de diâmetro e anéis com 5 mm de diâmetro
externo e 3 mm de diâmetro interno foram embebidos nas soluções de MMC e
aplicados por um minuto no leito estromal de córneas de coelhos (20).
Lee et al adotaram uma técnica na qual o leito estromal era irrigado com
pequena quantidade de SSB entre a fotoablação e a aplicação da MMC. A conduta
tinha como objetivo reduzir a desidratação do estroma, o que poderia induzir a uma
profunda e indesejável absorção da droga (66). Por sua vez, argumentando que os
estudos não justificavam a dose de 0,02% e um maior período de exposição, Camellin
decidiu usar a técnica batizada de brushstroke, na qual ―pinceladas‖ de MMC a 0,01%
eram realizadas no leito estromal após a aplicação do laser (19).
2.8 Tentativas de padronização dos métodos de aplicação
Da mesma forma que se evidencia uma ausência de padronização na aplicação
ocular da MMC e um marcante empirismo nos métodos, uma escassez de trabalhos
buscando normatizar tal procedimento é observada. No entanto, Khoury et al
realizaram dois trabalhos na tentativa de padronizar a administração transoperatória da
19
MMC na superfície do olho. Foram desenvolvidos dois métodos nos quais esponjas
cirúrgicas com dimensões padronizadas eram imersas em soluções com
concentrações conhecidas de MMC durante períodos de tempos padrões (21-27).
Em um dos trabalhos, os pesquisadores quantificaram in vitro a absorção,
expansão e a liberação da droga a partir de discos de esponjas cirúrgicas. Discos com
8 mm de diâmetro foram imersos em uma solução de MMC a 0,02% por dois minutos.
Utilizando uma balança analítica, a quantidade de MMC absorvida pela esponja foi
considerada como sendo a diferença entre a massa do disco embebido na solução e
sua massa quando seco. A expansão da esponja também foi calculada pela diferença
das dimensões dos discos antes e depois de receberem a MMC. Já a quantidade de
MMC liberada pela esponja foi determinada pela quantidade de MMC transferida para
discos de papel filtro. As esponjas embebidas na solução foram colocadas por 30
segundos sobre os discos de papel filtro e a diferença entre a massa final do papel e
sua massa quando seco indicou a quantidade de MMC liberada pelo sistema. Como
conclusão, os autores sugeriram discos de esponjas cirúrgicas com marca e diâmetro
iguais aos utilizados no experimento como sendo o melhor reservatório para a
administração intraoperatória da MMC após o tratamento do leito estromal com excimer
laser (21).
Em outra oportunidade, os mesmos pesquisadores analisaram as mesmas
variáveis, utilizando metodologia semelhante. Porém, os discos de esponjas cirúrgicas
foram cortados pela metade e imersos durante um minuto em uma solução de MMC a
0,04%. A liberação da droga foi avaliada em três situações distintas: in vitro (papel
filtro), em olhos de porcos enucleados e in vivo. Ao final da análise, afirmaram que o
método desenvolvido permitia uma padronização na aplicação transoperatória da MMC
20
para as cirurgias de trabeculectomia, podendo reduzir a incidência de complicações
decorrentes do uso da droga (27).
2.9 Biodisponibilidade da MMC e bioensaio
Toda problemática que envolve o uso transoperatório da MMC se deve ao
empirismo que reveste sua aplicação, dose e tempo de exposição (21,27). Essas
variáveis interferem diretamente na biodisponibilidade da droga nos tecidos oculares.
Consequentemente, as estruturas expostas à ação da MMC estão sujeitas a receberem
quantidades além ou aquém do que seria uma dose terapêutica ideal (21,23-26, 41,55).
Na ocorrência de uma subdose, a ação da droga é insuficiente para atingir o
resultado cirúrgico desejado. Por outro lado, uma elevada biodisponibilidade da droga
pode ocasionar efeitos tóxicos indesejáveis e danos irreparáveis aos tecidos oculares
(23,57). Com isso, pesquisadores se valendo da propriedade antimicrobiana da MMC
realizaram estudos com a finalidade de mensurar a ação da droga por meio de
bioensaios (67-73).
A MMC é um antimitótico pertencente ao grupo das quinonas que apresenta
atividade antibiótica contra bactérias Gram positivas e negativas (46). Esta característica
permitiu quantificar a ação da droga por meio do método de disco-difusão em ágar
(antibiograma). A correlação direta entre o halo de inibição do crescimento bacteriano e
a concentração da MMC presente no disco transformou o antibiograma em uma
excelente ferramenta para quantificar a ação da droga (69-72).
Em 2009, Kaye et al investigando a concentração e a biodisponibilidade do
ciprofloxacino e da teicoplamina em córneas de porcos concluíram que o halo de
21
inibição produzido pela atividade antimicrobiana ao redor dos sítios de implantação nas
placas de antibiograma representa um indicador preciso da concentração da droga (67).
Já Pascual et al desenvolvendo um novo método analítico para medir os níveis
plasmáticos do voriconazol em pacientes tratados para micoses invasivas detectaram
uma significativa concordância entre os resultados obtidos tanto pelo High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) quanto pelo bioensaio (74).
Larrosa et al utilizaram Escherichia coli ATCC 25922 em meio de cultura Müeller-
Hinton para quantificar a ação da MMC liberada a partir de esponjas utilizadas nas
cirurgias oculares (69). As esponjas com dimensões padronizadas foram imersas por
uma hora em concentrações de MMC a 0,02% ou a 0,04%. As placas contendo o meio
de cultura foram semeadas com a bactéria e receberam as esponjas contendo o
fármaco. Após 24 horas de incubação, o diâmetro de cada halo de inibição foi medido
em milímetros. Relacionando-se a concentração da MMC em micrograma com o
diâmetro de cada halo de inibição, foi possível construir uma curva de referência que
refletiu uma relação entre as duas variáveis (69).
A mesma metodologia foi utilizada por Georgopoulos et al para avaliar a ação da
MMC liberada por difusão em meio de cultura. Neste estudo experimental, as placas
foram semeadas com Staphylococcus aureus ATCC 65389 e confeccionadas com
sítios para receberem as amostras contendo MMC (72). Nesse experimento, a técnica
de bioensaio mostrou alta confiabilidade, fato também observado em outras pesquisas
realizadas pelo mesmo autor e colaboradores (70-71,73).
Em outro estudo comparativo entre 16 bioensaios, Engel et al analisaram diversas
variáveis como: o tipo de bactéria utilizada, modo de semeadura do inóculo e aplicação
da droga no meio de cultura. A precisão e a sensibilidade de todos os ensaios testados
22
comprovaram a utilidade desses métodos na quantificação da ação das drogas
testadas (75).
2.10 Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e MMC
No Brasil, a MMC está registrada na Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) sob a denominação de Mitocin®, na forma de 5 mg de pó liofilizado, com
número de registro 1.0180.0122 e em nome da Bristol-Myers Squibb Farmacêutica
S.A.(76) (Figura 9).
Figura 9: Mitocin®. Frasco-ampola âmbar (Bristol-Myers Squibb Farmacêutica S.A.).
A droga tem como indicações descritas em sua bula o tratamento coadjuvante do
adenocarcinoma do estômago ou pâncreas em combinação com outros agentes
23
quimioterápicos, tratamento paliativo quando outras modalidades tenham falhado e
como agente único para o tratamento tópico do carcinoma superficial de células de
transição da bexiga urinária sem invasão além da lâmina própria (76).
Apesar de registrada na Agência Regulamentadora do Brasil, o uso oftalmológico
da MMC não consta como indicação na bula do medicamento. Por esse motivo, a
indicação da MMC, para esse fim, é considerado um uso off label (76-78).
2.11 Manipulação e estabilidade da MMC em solução
O prazo de validade recomendado pelo fornecedor da MMC comercializada no
Brasil se baseia no armazenamento do produto em uma temperatura ambiente entre
15°C e 30°C e protegido da luz. Após a diluição em água estéril, soro glicosado a 5%,
soro fisiológico a 0,9% ou solução de lactato de sódio, a estabilidade da MMC pode
variar de 3 horas a 14 dias. Essa variação depende do tipo de diluente utilizado, da
concentração final atingida, além das condições de temperatura e armazenamento (76).
A revisão da literatura científica apresenta uma escassez de informações quanto
aos procedimentos de diluições pelos quais as concentrações da MMC são obtidas e
quanto ao modo de armazenamento da solução utilizada durante as cirurgias oculares.
Porém, Teus et al em um trabalho de revisão descreveram o processo de diluição e
rediluição através de seringa de insulina para se obter uma concentração de MMC a
0,02% a partir de 2 mg da droga na forma de pó liofilizado. Os autores utilizaram a SSB
como diluente, porém as condições de manipulação ou de armazenamento da solução
não foram apontadas (55). Mesmo fato é observado em outros dois estudos, onde a
24
água bidestilada e o soro fisiológico a 0,9% foram utilizados como reconstituintes para
se atingir as concentrações desejadas (69,72).
Devido à falta de um controle de qualidade nas condições de preparação e
armazenamento das soluções de MMC utilizadas nas cirurgias oculares, pesquisadores
investigaram a estabilidade e a atividade antiproliferativa da droga em amostras dessas
reconstituições (72,79-82). Em adição, a administração ocular da MMC é categorizada por
Georgopoulos et al e Velpandian et al como sendo de uso extemporâneo (72,79). Isso
implica que a droga deve ser diluída na ocasião do seu uso com posterior e adequado
descarte do resíduo (72,79). Atualmente, a utilização da MMC na oftalmologia representa,
portanto, um procedimento que envolve gastos elevados e desperdício de fármaco,
pois além de ter um alto custo somente cerca de 1% da substância dissolvida é
utilizado (72,79).
Francoeur et al analisaram por meio de HPLC as soluções de MMC destinadas ao
uso transoperatório ocular preparadas em 21 hospitais do Canadá e E.U.A.. Nesse
estudo comparativo, 28% das amostras apresentaram estabilidade química
comprometida, o que foi atribuído a uma evidente falta de padronização e de controle
de qualidade nos procedimentos de preparação e armazenamento (81).
Em outro experimento conduzido por Velpandian et al, a estabilidade e a ação
antiproliferativa da MMC sobre culturas de células humanas foram avaliadas por meio
de HPLC e citometria de fluxo. Foram analisadas formulações extemporâneas em
diferentes concentrações, pHs e em temperaturas distintas. Os resultados indicaram
que a degradação da MMC era maior quando as soluções eram mantidas em
temperatura ambiente e em pH ácido. Já a manutenção das amostras sob baixas
temperaturas e pHs de 7 ou 8 proporcionou uma significante redução na degradação
da droga. Contudo, o estudo da ação antiproliferativa usando a citometria de fluxo
25
revelou que a MMC preservou essa propriedade até 6 meses após sua degradação,
quando mantida em temperatura ambiente (79).
Dados semelhantes foram observados por Woo et al e Hu et al estudando in vitro
o efeito antimitótico da MMC em fibroblastos obtidos a partir da cápsula de Tenon de
pacientes submetidos a cirurgias de catarata (80,82). Porém, os primeiros autores
detectaram a preservação da ação antiproliferativa até 6 semanas após a
reconstituição da droga mantida em temperatura ambiente ou a 4°C, enquanto no
estudo de Hu et al esse efeito se estendeu até 18 meses com as soluções conservadas
em baixas temperaturas (82). Por outro lado, Georgopoulos et al, utilizando teste de
difusão em micro-ágar, concluíram que a atividade citostática da MMC não apresentou
redução significativa após 3 meses de armazenamento da solução a uma temperatura
de 4°C e em um pH de 7,2 (72).
2.12 Potenciais riscos do uso da MMC na córnea
Potenciais danos aos componentes celulares da córnea podem ocorrer após sua
desepitelização seguida da aplicação direta da MMC na sua superfície durante a
cirurgia de PRK. O efeito citotóxico da droga pode se manifestar nas células presentes
nos três extratos da córnea (epitélio, estroma e endotélio) (Figura 10). As células
epiteliais de superfície, as células tronco limbares (stem cells) e os ceratócitos
estromais estão mais vulneráveis a ação da MMC do que o endotélio. Tal evidência é
explicada devido ao efeito antiproliferativo da MMC se manifestar de forma mais
significativa nas células com maior poder mitótico, porém isso não isenta o endotélio da
ação citotóxica da MMC (47,55).
26
Figura 10: Extratos e componentes celulares da córnea. (Ilustração: Francisco Irochima Pinheiro).
2.12.1 Efeitos nas células epiteliais
Estudos experimentais realizados por Chang et al em animais demonstram um
retardo dose-dependente na reepitelização da córnea após sua desepitelização
mecânica e a aplicação da MMC a 0,01% e a 0,02% durante 2 minutos (23). Porém, Lai
et al não indicaram qualquer interferência da MMC na reepitelização em córneas de
coelhos (83). Já Rajan et al observaram, in vitro, um maior período de latência na
reconstituição epitelial de córneas humanas submetidas ao PRK seguido da aplicação
de MMC a 0,02% durante 1 ou 2 minutos. Nesse mesmo experimento, os autores
detectaram um maior retardo na reepitelização das córneas expostas à MMC durante 2
minutos. Essas mesmas córneas apresentaram ao microscópio confocal uma camada
epitelial mais fina e menos diferenciada 1 mês após a realização do procedimento (58).
27
Deficiência de células limbares da córnea também já foi descrita em uma série de
casos relatada por Lichtinger et al. Porém, deve-se ressaltar que os cinco pacientes
que apresentaram a complicação receberam ciclos de MMC a 0,02% ou a 0,04%, pela
via tópica e por longo período para o tratamento de melanose primária adquirida (84).
2.12.2 Efeitos nos ceratócitos estromais
A justificativa farmacológica para introdução da MMC na cirurgia refrativa foi a
necessidade de se inibir a ativação, proliferação e diferenciação dos ceratócitos
deflagradas pelo trauma cirúrgico. Essa propriedade farmacológica previne a produção
de tecido de reparação e a consequente redução da transparência da córnea (haze) (14-
17,47). No entanto, o bloqueio da replicação dos ceratócitos pode provocar, a longo
prazo, uma redução tanto no número dessas células como na sua capacidade de
restaurar a celularidade do estroma após a aplicação do laser (85). Como os ceratócitos
estão envolvidos na manutenção da citoarquitetura da córnea, sua depleção pode
comprometer a estabilidade desse tecido resultando em possíveis ectasias (55). Para
tentar esclarecer esse potencial dano, pesquisas realizadas em córneas de animais e
de seres humanos vêm sendo desenvolvidas com substanciais resultados (58,84-91).
Em um estudo comparativo, prospectivo e randomizado, Kim et al investigaram os
efeitos da MMC no número de ceratócitos e na proliferação de fibroblastos em córneas
de coelhos submetidas ao PRK e expostas a radiação UVB. Os autores demonstraram
uma redução dos dois componentes celulares pesquisados até 3 meses de seguimento
após a realização de exames de imunohistoquímica e microscopia eletrônica (86).
28
Também submetendo córneas de coelhos ao PRK, Netto et al avaliaram o
mecanismo de ação e a toxicidade estromal da MMC em diferentes concentrações e
tempos de exposição. Dentre os achados, foram observados inibição na formação de
miofibroblastos, indução de apoptose celular e bloqueio da replicação dos fibroblastos
no estroma anterior. Não obstante, a toxicidade da MMC foi diretamente proporcional a
sua concentração e ao tempo de exposição (56).
Por sua vez, Rajan et al encontraram um significativo atraso no repovoamento do
estroma anterior nas córneas humanas adquiridas a partir de bancos de olhos e que
receberam a aplicação de MMC durante o procedimento de PRK. Porém, uma redução
quantitativa significante de ceratócitos estromais induzida pela MMC não foi apontada
(58).
Contrariando estudos anteriores, outros ensaios clínicos, prospectivos e
randomizados não detectaram diminuição significativa na população de ceratócitos
após o uso da MMC a 0,02% por 2 minutos durante o PRK (87-88). Em um desses
estudos com seguimento de 3 anos, Gambato et al compararam por meio do
microscópio confocal córneas de 72 olhos de 36 pacientes. O PRK foi realizado em
ambos os olhos, porém em apenas um deles a droga foi administrada, sendo o olho
contralateral o controle (87). Em outro ensaio com seguimento de 5 anos, Midena et al
utilizaram a mesma metodologia e ferramenta para examinar o estroma das córneas de
24 pacientes (88). Nessa análise, os pesquisadores não encontraram efeitos colaterais
significativos sobre os ceratócitos das córneas submetidas ao PRK com uso da MMC
em relação aos das córneas que receberam o tratamento a laser sem MMC.
29
2.12.3 Efeitos no endotélio
O endotélio da córnea é composto por uma monocamada de células hexagonais,
que em condições normais apresentam uma reduzida atividade mitótica devido à
presença de fatores inibitórios no humor aquoso (92). A função básica dessas células é
manter o estado de deturgescência da córnea evitando seu edema e consequente
perda da transparência.
A potencial toxicidade da MMC sobre essas células surgiu a partir da detecção da
droga na câmara anterior após sua aplicação na superfície de córneas, previamente
desepitelizadas, em modelos animais. Contudo, as concentrações encontradas no
humor aquoso após a aplicação da MMC a 0,02% por 2 minutos foram inferior a
0,002% (26,57,93).
Marcantes alterações estruturais e morte celular foram observadas quando a
MMC em concentrações iguais as administradas na superfície da córnea (0,02%) foi
aplicada diretamente no endotélio de córneas humanas mantidas in vitro. Porém, tais
achados não foram detectados quando a dose correspondeu a concentrações iguais ou
menores a 0,01% (25-26,94).
Morales et al demonstraram uma redução na densidade de células endoteliais de
9 córneas de pacientes submetidos ao PRK com MMC a 0,02% por 30 segundos após
um seguimento de 3 meses (95). Embora os autores tenham realizado um ensaio clínico
comparativo, prospectivo e randomizado, outros estudos com o mesmo requinte
metodológico, porém com amostras e seguimentos maiores, não apresentaram
alterações significantes na densidade endotelial (87,95-100).
30
Devido à conhecida vulnerabilidade endotelial aos efeitos da MMC administrada
durante o PRK, a literatura científica atual sugere que mais estudos clínicos sejam
realizados para determinar o impacto do uso da droga a longo prazo (101).
31
3 MÉTODOS
3.1 Tipo de estudo
Foi desenvolvido um estudo experimental in vitro para idealização de um novo
sistema de aplicação de MMC durante a cirurgia de PRK. O objeto da invenção
consistiu em impregnar uma dose conhecida de MMC em discos de papel filtro com 8
mm de diâmetro, de modo que o sistema liberasse uma solução com concentração de
0,02% da droga após receber uma gota de SSB e decorrido o período de um minuto. A
elaboração do sistema e os testes laboratoriais foram realizados na Ophthalmos
Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A. (São Paulo – SP, Brasil) e no
Laboratório de Sistemas Dispersos (LASID) da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte – UFRN (Natal – RN, Brasil) de 2006 a 2010.
3.2 Procedimentos e técnicas laboratoriais
3.2.1 Confecção e esterilização dos discos de papel filtro
Os discos com 8 mm de diâmetro foram confeccionados a partir de folhas de
papel filtro do tipo Whatman® 41 com 89,5 cm de largura, 62,5 cm de comprimento, 190
µm de espessura e gramatura de 79 g/m2. As folhas foram cortadas em uma gráfica
especializada por uma prensa contendo punches com diâmetro correspondente ao
desejado. Cada disco foi submetido a uma inspeção para descarte daqueles que
32
apresentavam cortes irregulares ou qualquer tipo de falha (Figura11). O processo de
esterilização dos discos foi realizado em uma empresa especializada (ACECIL®, São
Paulo, Brasil), utilizando uma mistura de gases composta por 30% de óxido de etileno e
70% de dióxido de carbono.
Figura 11: Discos de papel filtro Whatman®
41 com 8 mm de diâmetro.
3.2.2 Determinação do volume das gotas de SSB em frascos de colírio
padronizados
O volume médio de uma gota de SSB (Ophthalmos, São Paulo, Brasil)
produzidas pela instilação com frasco de colírio convencional de 15 mL (Amcor, São
Paulo, Brasil) foi determinado a partir da pesagem das mesmas, utilizando balança
analítica (Mettler, modelo H33AR, Suíça) (Figura12).
33
Cinco indivíduos (1, 2, 3, 4 e 5) foram recrutados, aleatoriamente, para instilar as
gotas. Três frascos iguais de colírio (A, B e C), cada um contendo 10 ml de SSB,
serviram de reservatórios e aplicadores. Individualmente, cada operador instilou uma
gota em um Becker com massa conhecida e mantido no interior da balança analítica
previamente calibrada. Dez gotas de cada frasco foram instiladas por cada indivíduo,
totalizando a pesagem de 150 gotas de SSB. Todo procedimento foi realizado a uma
temperatura ambiente de 24°C com a aferição dos valores sendo realizada pelo
mesmo técnico. Obtida a massa de cada uma das 150 gotas, o volume médio foi
calculado considerando-se a densidade da SSB igual a 1,0022 g/mL.
Figura 12: Pesagem das gotas de SSB (Solução salina balanceada). Frascos contendo SSB para
pesagem aleatória das gotas (à esquerda) e pesagem das gotas em balança analítica (à direita).
3.2.3 Impregnação dos discos com MMC
A MMC (Mitocin®, frasco-ampola âmbar com 5 mg, Lote 237AEL, Bristol-Myers
Squibb Farmacêutica S.A., São Paulo, Brasil) foi diluída em água estéril purificada
(Ophthalmos, São Paulo, Brasil), utilizando pipeta repetitiva Multipette® Plus
34
(Eppendorf, New York, E.U.A.). A água purificada foi obtida utilizando o aparelho Milli-Q
Plus (Millipore, Massachusetts, E.U.A.), o qual foi abastecido por água tratada pelo
processo de osmose reversa através do equipamento Rios 8 (Millipore, Massachusetts,
E.U.A.).
O frasco-ampola de Mitocin® com 5 mg de pó liofilizado de MMC recebeu 2,5 mL
de água estéril, resultando em uma solução com 2 mg/mL ou 2 µg/ µL (solução X).
Outra solução com 1 mg/mL ou 1 µg/µL (solução Y) foi obtida com a adição de 0,5 mL
da solução X a 0,5 mL de água estéril. Vinte discos receberam 5 µL da solução Y, que
continham 5 µg de MMC. Mais 20 discos receberam 5 µL da solução X, que
correspondia a 10 µg da droga. Em outros 20 discos foram instilados 10 µL, compostos
por 5 µL da solução X e 5 µL da solução Y, o que totalizou 15 µg de MMC impregnados
nestes últimos discos (Quadro 1 e Figura 13).
Doze discos foram impregnados para serem utilizados em um posterior bioensaio.
Seis deles receberam 8 µL da solução Y, correspondendo a 8 µg , enquanto outros 6
discos foram impregnados com 16 µg ao receberem 8 µL da solução X (Quadro 1).
Após a impregnação, todos os discos foram conservados em temperatura ambiente de
24°C e protegidos da luz até sua completa secagem.
Figura 13: Diluição da mitomicina C (à esquerda) e impregnação dos discos (à direita).
35
Quadro 1- Volume recebido pelos discos de papel filtro e teor final da MMC impregnada
VOLUME RECEBIDO
PELOS DISCOS
NÚMERO DE DISCOS
IMPREGNADOS
TEOR DA MMC NOS DISCOS
5 µL da solução Y (1 µg/µL)
20
5 µg
5 µL da solução X (2 µg/µL)
20
10 µg
5 µL da solução X (2 µg/µL)
+ 5 µL da solução Y (1 µg/µL)
20
15 µg
8 µL da solução Y (1 µg/µL)
6
8 µg
8 µL da solução X (2 µg/µL)
6
16 µg
Legenda: MMC – mitomicina C µg - micrograma µL – microlitro
3.2.4 Espectrofotometria e dosagem da MMC nos discos
Uma varredura foi realizada para determinar o melhor comprimento de onda para
a leitura da MMC no espectrofotômetro Aquamate de absorção nos espectros visível e
UV (Thermo Spectronic, Cambridge, Inglaterra), utilizando uma solução de 0,02 mg/mL.
A partir dessa determinação, o teor da MMC foi mensurado nos discos impregnados
com 5 µg, 10 µg e 15 µg. Uma curva de calibração foi criada para avaliar a precisão do
ajustamento da análise durante a dosagem da MMC nos discos.
36
3.2.5 Bioensaio (Método de disco-difusão em ágar)
3.2.5.1 Confecção das placas de antibiograma
Doze placas para antibiograma foram preparadas pelo mesmo técnico, utilizando
como meio de cultura o ágar Müeller-Hinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra). Dois
tipos de placas foram confeccionados: seis do tipo I (Placas I) e seis do tipo II (Placas
II). As placas do tipo I apresentavam 6 sítios equidistantes do centro da placa,
enquanto as placas do tipo II possuíam apenas três sítios com a mesma disposição
(Figura 14). Cada sítio que serviu de referência para aplicação dos discos impregnados
foi confeccionado a partir da implantação de discos estéreis de silicone com 8,2 mm de
diâmetro e 2,5 mm de altura antes da solidificação do meio de cultura. Após a
solidificação, esses discos foram removidos com uma pinça estéril, criando sítios de
referência com 8,2 mm de diâmetro.
Figura 14: Tipos de placas confeccionados. PLACA I – Sítios de 1 a 6. PLACA II – Sítios 1, C1 e C2.
37
3.2.5.2 Inoculação das placas de teste
O Staphylococcus epidermidis (American Type Culture Collection – ATCC
12228) foi utilizado como inóculo em todas as placas, seguindo a normatização
estabelecida pelo National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) para
metodologia dos testes de sensibilidade aos agentes antimicrobioanos por diluição para
bactérias de crescimento aeróbico (Figura 15) (102).
Figura 15: Placa semeada com Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228).
38
3.2.5.3 Aplicação dos discos e das soluções nas placas de teste
Com a superfície das placas semeadas, discos de papel filtro estéreis foram
aplicados em cada sítio, seguindo um procedimento padrão em cada tipo de placa. Nas
6 placas do tipo I, um disco estéril sem nenhuma droga foi inserido com uma pinça no
sítio 1 (controle negativo) (Figura16). Logo em seguida, foi aplicada uma gota de água
estéril no centro do disco a partir de um frasco de colírio convencional. Decorrido o
período de um minuto, o disco foi retirado delicadamente com a pinça e desprezado de
forma adequada.
Figura 16: Inserção de disco de papel estéril.
O mesmo procedimento foi repetido, individualmente, nos sítios 2, 3, 4, 5 e 6,
porém cada disco sem MMC inserido nos respectivos sítios recebeu uma gota de uma
solução composta por MMC diluída em água estéril com concentrações que
39
aumentavam progressivamente em cada sítio (0,010%, 0,015%, 0,020%, 0,025% e
0,030%) (Figura 17).
Dessa forma, o disco estéril presente no sítio 2 recebeu uma gota com uma
concentração de MMC a 0,010%, o sítio 3 uma gota com concentração de 0,015%, o
sítio 4 uma gota com concentração de 0,020%, o sítio 5 uma gota com concentração de
0,025% e o sítio 6 uma gota com concentração de 0,030% (Figura18).
Figura 17: Concentrações de MMC e água estéril.
40
Figura 18: Aplicação da solução de MMC no sítio com disco estéril.
Nas 6 placas do tipo II, o sítio C1 (controle positivo 1) recebeu um disco estéril
impregnado com uma dose de 8 µg de MMC, o sítio 1 serviu de controle negativo
recebendo um disco estéril sem MMC, enquanto no sítio C2 (controle positivo 2) foi
inserido um disco estéril impregnado com 16 µg da droga. Cada disco também foi
removido após um minuto da aplicação de uma gota de água estéril em etapas
individualizadas (Quadro 2). Ao final da aplicação dos discos, cada placa foi incubada
em uma estufa (Quimis®, modelo Q31CR15, Brasil) a uma temperatura de 35°C por 48
horas.
41
Quadro 2- Conteúdo dos discos e composição da gota aplicada nos sítios das placas do tipo I e
do tipo II
PLACAS TIPO I PLACAS TIPO II
SÍTIOS DISCOS GOTAS APLICADAS
SÍTIOS DISCOS GOTAS APLICADAS
1 Sem MMC Água estéril 1 Sem MMC Água estéril
2 Sem MMC MMC a 0,010% C1 8 µg de MMC Água estéril
3 Sem MMC MMC a 0,015% C2 16 µg de MMC Água estéril
4 Sem MMC MMC a 0,020% - - -
5 Sem MMC MMC a 0,025% - - -
6 Sem MMC MMC a 0,030% - - -
Legenda: MMC – mitomicina C µg – micrograma C1 – controle positivo 1 C2 – controle positivo 2
3.2.6 Medida dos halos de inibição
Após o período de incubação, a leitura dos halos de inibição produzidos pela ação
antibiótica da MMC em torno dos sítios de todas as placas foi realizada por um único
indivíduo. Foi considerada como halo de inibição a área sem crescimento bacteriano
detectável a olho desarmado. Esta área teve o diâmetro medido em milímetros
utilizando um paquímetro posicionado na parte posterior da placa (Figura 19).
42
Figura 19: Medida do diâmetro do halo de inibição com paquímetro (mm - milímetros). (Ilustração:
Francisco Irochima Pinheiro).
As médias dos diâmetros dos halos de inibição originados em torno dos sítios das
placas do tipo I foram comparadas com os valores das médias dos halos presentes ao
redor dos sítios das placas do tipo II. Tal comparação teve como objetivo avaliar a
correspondência entre a dose impregnada nos discos aplicados nas placas do tipo II
(controles positivos) com as soluções testadas nas placas do tipo I.
43
3.3 Análise estatística
Os dados foram agrupados e as médias comparadas através do teste t de
Student adotando α < 0,05. A análise foi realizada com o auxílio do aplicativo
Microsoft® Excel versão 2003 (Microsoft® Corporation, New York, E.U.A.).
3.4 Depósito do Pedido de Patente
O processo de Depósito do Pedido de Patente, desenvolvido sob a consultoria do
escritório Águia Marcas e Patentes e Consultoria Ltda., legalmente habilitado junto ao
INPI, abrangeu cinco etapas consecutivas, a saber:
Etapa 1- Consulta à Lei de Propriedade Industrial (LPI) para verificar o caráter
patenteável da invenção;
Etapa 2- Classificação da modalidade da invenção;
Etapa 3- Busca para certificação de que a invenção configurava novidade;
Etapa 4- Redação do Pedido de Patente;
Etapa 5- Depósito do Pedido de Patente no INPI.
Procedeu-se consulta à LPI nº 9.279/96 em vigor desde 15 de maio de 1997,
substituindo o Código da Propriedade Industrial Lei 5772/71 (102). A finalidade desse
procedimento foi a observância da legislação vigente referente ao Depósito do Pedido
de Patente. O estado da técnica foi analisado para sua classificação e adequado
enquadramento na modalidade de Patente de Invenção (PI) ou Modelo de Utilidade
(MU). Na etapa seguinte, buscas para certificação de que a invenção configurava
novidade foram realizadas nos bancos de patentes nacionais (INPI) e internacionais, a
44
saber: Patentes dos E.U.A. – (United States Patent and Trademark Office - USPTO) e
Base de Patentes do escritório Europeu de Patentes – (European Patent Office - EPO).
Em conformidade com Ato Normativo 127/97, em especial o item 15, foram
elaborados um requerimento, um relatório descritivo, reivindicações, desenhos de
caráter elucidativos e um resumo (103). No relatório foi descrito o que existia no estado
da técnica, destacando os problemas técnicos que a patente resolve. As reivindicações
foram, cuidadosamente, escritas para consequente delimitação dos direitos dos
inventores, após o que o Depósito do Pedido de Patente foi protocolado junto ao INPI.
45
4 RESULTADOS
4.1 Volume médio das gotas de SSB
O volume médio de todas as gotas produzidas pela instilação dos 5 operadores
utilizando os três frascos de colírio (n=150) foi igual a 0,0377 ± 0,003207 mL com
coeficiente de variação de 8,51%. A média das médias dos volumes das 10 gotas
aplicadas com cada frasco por cada operador (n=15) apresentou valor igual a 0,0377 ±
0,002700 mL com coeficiente de variação de 7,08% (Figura 20). Quando se calculou a
média das médias dos volumes das 30 gotas instiladas por cada operador (n=5), o
volume encontrado foi igual a 0,0377 ± 0,002444 mL com um coeficiente de variação
de 6,48% (Figura 21).
46
0,0000
0,0050
0,0100
0,0150
0,0200
0,0250
0,0300
0,0350
0,0400
0,0450
0,0500
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C
Vo
lum
e (
ml)
Figura 20: Gráfico demonstrativo da variação do volume das gotas em função dos frascos e dos operadores. 1Volume médios das gotas em mL: 0,0377 ± 0,003207 (8,51 %) – (n = 150 – todas as gotas)
2Volume médios das gotas em mL: 0,0377 ± 0,002700 (7,08 %) – (n = 15 - médias das médias)
3Volume em microlitros = mL/1000.
47
0,0000
0,0050
0,0100
0,0150
0,0200
0,0250
0,0300
0,0350
0,0400
0,0450
1 2 3 4 5
Operadores
Vo
lum
e (
ml)
Figura 21: Gráfico demonstrativo da variação do volume das gotas considerando os operadores. 1Volume médios das gotas em mL: 0,0377 ± 0,002444 (6,48 %) – (n = 5 – média das médias dos
operadores).
4.2 Varredura por espectrofotometria
A varredura realizada no espectrofotômetro de absorção no UV utilizando uma
solução de 0,02 mg/mL indicou 360 nm como o melhor comprimento de onda para a
leitura da MMC (Figura 22).
48
Figura 22: Gráfico demonstrativo da varredura para determinar o melhor comprimento de
onda para leitura no espectrofotômetro de absorção no UV. Resultado: 360 nm. (ABS –
Absorvância e WAVELENGTH- comprimento de onda).
4.3 Ensaio de teor para determinar a recuperação da MMC nos discos
As médias dos teores da MMC nos discos com 5 µg (n=20), 10 µg (n=20) e 15
µg (n=20) foram determinadas baseadas na curva de calibração com coeficiente de
determinação (R2) igual a 0,9971 demonstrada na figura 23. A taxa de recuperação da
MMC impregnada nos discos com 5 µg, 10 µg e 15 µg foi de 91,45%, 88,97% e
93,36%, respectivamente (Tabela 1).
49
Figura 23: Gráfico da curva de calibração empregada na avaliação do teor de mitomicin C nos
discos. (Abs-absorvância, U.A. – Unidades de Absorvância, µg/mL- microgramas por mililitro, R2 –
coeficiente de determinação).
Tabela 1: Ensaio de teor para determinar a recuperação da MMC nos discos impregnados
Teor (µg)
5 10 15
Média ± sd (CV%) 4,57 ± 0,64 (14.00) 8,90 ± 0,68 (7,64) 14,00 ± 0,95 (6,75)
Recuperação (%) 91,45 88,97 93,36
Legenda: µg – micrograma sd – standard deviation (desvio padrão) CV% - coeficiente de variação em porcentagem
y = 0.0073x + 0.0026
R 2 = 0.9971
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 10 20 30
Concentração (µg/mL)
Ab
s (
U.A
.)
50
4.4 Medida dos halos de inibição
As médias dos diâmetros dos halos de inibição resultante da ação antibiótica da
MMC sobre o Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) apresentaram os resultados
demonstrados na tabela 2. Nenhum halo de inibição foi observado em torno dos sítios 1
(controles negativos), seja nas placas do tipo I, seja nas placas do tipo II. A média dos
halos originados a partir dos sítios C1 das placas II [41,83 ± 0,41 (0,98)] e a média dos
halos dos sítios 2 das placas I [41,33 ± 0,82 (1,98)] não apresentaram diferença
estatística. O mesmo fato ocorreu entre as médias dos halos dos sítios C2 das placas II
[51,67 ± 0,52 (1,00)] e a média dos halos dos sítios 4 das placas I [51,67 ± 0,52 (1,00)].
A figura 24 apresenta a correspondência entre os sítios das placas I e II.
51
Tabela 2: Correspondência entre os halos produzidos pelos discos impregnados e as soluções testadas
Conteúdo do sítio Composição da amostra
Halos em mm (n=6)
1 Disco estéril sem MMC
Água estéril 0
C1 Disco com 8 µg de MMC
Água estéril 41,83 ± 0,41 (0,98)a
C2 Disco com 16 µg de MMC
Água estéril 51,67 ± 0,52 (1,00)b
2 Disco estéril sem MMC
Solução de MMC a 0,010%
41,33 ± 0,82 (1,98)a
3 Disco estéril sem MMC
Solução de MMC a 0,015%
47,33 ± 0,52 (1,09)
4 Disco estéril sem MMC
Solução de MMC a 0,020%
51,67 ± 0,52 (1,00)b
5 Disco estéril sem MMC
Solução de MMC a 0,025%
55,00 ± 0,89 (1,63)
6 Disco estéril sem MMC
Solução de MMC a 0,030%
56,17 ± 1,17 (2,08)
Legenda: MMC – mitomicina C n – número mm – milímetro µg - micrograma 1 – controle negativo C1 e C2 – controles positivos 2- 6 – soluções teste a,b
Para letras iguais não há diferença significativa entre os grupos (t0,05;5,5)
52
Figura 24: Correspondência entre os halos de inibição. Sítios 2 das placa do tipo I e os sítios C1 das
placas do tipo II (verde) e entre os sítios 4 das placas do tipo I e os sítios C2 das placas do tipo II
(vermelho). (MMC – mitomicina C e µg- micrograma).
A tabela 3 apresenta a correlação entre a massa da MMC (µg) contida no
volume de 0,0377 mL de cada solução testada nas placas do tipo I e as médias dos
diâmetros dos halos de inibição produzidos pela ação da droga em torno dos sítios
correspondentes.
53
Tabela 3: Comparação entre o incremento na concentração de MMC e o halo de inibição nas placas do tipo I
Concentração (%) MMC (µg)1 Δ conc. (%)2 Halo (mm) Δ halo (%)3
0,010 3,77 - 41,33 -
0,015 5,65 50 47,33 14,52
0,020 7,54 100 51,67 25,00
0,025 9,42 150 55,00 33,06
0,030 11,31 200 56,17 35,89
Legenda: MMC – mitomicina C µg – micrograma 1 massa da MMC aplicada e calculada pelo volume médio da gota (0,0377 mL)
2 incremento percentual na concentração/dose de MMC aplicada aos discos
3 incremento percentual no halo de inibição decorrente do aumento de MMC nos discos
4.5 Depósito do Pedido de Patente
O objeto da invenção foi considerado inédito, pois não se constataram evidências
de acesso público à matéria reivindicada antes da data do seu depósito. O Pedido de
Patente de invenção foi referido como um ―SISTEMA DE APLICAÇÃO DE DROGAS
EM CIRURGIAS OFTALMOLÓGICAS POR MEIO DE CURATIVO E O CURATIVO‖,
compreendendo um único conceito inventivo. A invenção foi enquadrada na
modalidade Patente de Invenção (PI) e depositada no INPI sob o número PI 0704739-8
(Anexo 3) (Figura 25).
54
Figura 25: Novo sistema de aplicação de drogas em cirurgias oftalmológicas (Ophthalmos
Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A.). Disco impregnado com MMC em envelope
cirúrgico.
55
5 DISCUSSÃO
A diversidade dos métodos para a aplicação off label da MMC durante a cirurgia
de PRK contrasta com a escassez de estudos que tenham por finalidade promover
melhorias na execução desse procedimento. A falta de padronização dos métodos
atuais de aplicação utilizando trépanos, esponjas cirúrgicas e papéis filtro de diferentes
marcas, formatos, dimensões e propriedades físicas reflete uma baixa reprodutibilidade
do procedimento, além de expor os tecidos oculares a grandes variações na dose
preconizada.
Ratificando tais afirmações, Kloess et al observaram que a aplicação
intraoperatória da MMC leva a uma variação na biodisponibilidade da droga devido à
falta de padronização em relação ao tipo de esponja usada como reservatório (62).
Consequentemente, Yamamoto e Kitazawa sugeriram o desenvolvimento de novos
métodos alternativos mais precisos e mais confiáveis (64). Acatando a orientação dos
últimos pesquisadores, Khoury et al tentaram estabelecer um padrão de aplicação da
MMC para as cirurgias de PRK e de glaucoma, utilizando um único tipo de esponja
cirúrgica embebida na solução da droga (21,27)
. O objetivo dos autores era desenvolver
um método simples, econômico e reprodutível. Todavia, a preparação prévia da
solução da droga a partir do conteúdo do frasco-ampola para uso intravenoso não
evitou o desperdício do fármaco, nem promoveu a redução dos custos. Isso ocorre,
pois menos de 1% da MMC reconstituída é utilizado em cada aplicação, tendo que ser
desprezadas grandes quantidades residuais da substância, se observado o uso
extemporâneo.
Diante de tal problemática, a criação de um novo sistema de aplicação
transoperatória da MMC vem trazer evidentes benefícios ao procedimento. Maior
reprodutibilidade, redução no desperdício do fármaco, diminuição dos custos,
56
praticidade, segurança, respeito ao uso extemporâneo e um maior prazo de validade
são possíveis melhorias agregadas ao novo sistema após sua validação e produção
em escala industrial.
Visando alcançar esse objetivo, a presente tese propõe um novo sistema no
qual uma dose conhecida de MMC é impregnada em discos de papel filtro Whatman®
41 com 8 mm de diâmetro, de tal modo que o sistema libere uma solução de 0,02% da
droga após receber uma gota de SSB (Ophthalmos, São Paulo, Brasil) e decorrido o
período de um minuto.
A metodologia utilizada considerou três variáveis, sendo duas independentes e
uma dependente. O volume da gota de SSB a ser aplicada no disco impregnado e a
dose da MMC presente no disco representaram as variáveis independentes, enquanto
o diâmetro do halo de inibição originado ao redor dos sítios nas placas de antibiograma
foi considerado como a variável dependente.
A lei de Tate postula que o peso de uma gota de um determinado líquido é
diretamente proporcional à sua tensão superficial e ao raio do orifício externo do
gotejador que a originou (105). Tendo por base essa lei, foi avaliada a variabilidade do
volume das gotas a serem instiladas pelos diferentes operadores. Como o líquido
pesado foi sempre o mesmo (SSB), portanto com propriedades constantes (densidade
e tensão superficial), e como os frascos de colírio utilizados para sua instilação
apresentavam o mesmo desenho de fabricação, o único fator passível de interferência
seria o modo de aplicação da gota por parte dos operadores.
Mesmo sem uma técnica de gotejamento padronizada para o processo de
pesagem, o volume médio das gotas (0,0377 mL) aplicadas pelos indivíduos recrutados
permaneceu invariável quando considerados os 5 operadores de forma isolada. Isso
refletiu pouca influência do modo pelo qual as gotas foram aplicadas, logo o fator
57
―operador‖ não interferiu no volume do diluente que seria ofertado ao sistema durante a
aplicação da MMC, apesar de outros estudos demonstrarem o contrário (105-107).
Uma revisão da literatura revela que o volume médio das gotas de soluções
oftálmicas é de 39 µL, variando de 25,1 µL a 69,4 µL (105-106). O desenho e as
dimensões do tipo de frasco utilizado, propriedades físico-químicas das soluções
avaliadas e o modo de aplicação são fatores implicados como contribuintes para essa
variabilidade. Apesar de já estabelecido que um mesmo frasco possa produzir gotas
com diferentes volumes, quando posicionados a 45° e a 90°, Estacia e Tognon não
verificaram diferenças estatisticamente significantes no volume das gotas de
latanoprosta provenientes de frascos posicionados nas duas posições (105).
Devido à ação antimicrobiana da MMC, o método de disco-difusão em ágar
semeado com Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) foi escolhido para determinar
a dose ideal da droga a ser impregnada no disco. O mesmo ensaio microbiológico vem
sendo utilizado por vários pesquisadores como uma importante ferramenta para se
correlacionar a atividade antimicrobiana dos fármacos com a sua concentração nos
discos de difusão nas placas de antibiograma (67-75). Em 2009, Kaye et al compararam
concentrações do ciprofloxacino e da teicoplamina em discos de papel filtro e botões de
córneas trepanados de animais. Nesse estudo, os autores demonstraram que o halo de
inibição do crescimento bacteriano produzido pela atividade antimicrobiana representou
um parâmetro fiel na determinação da concentração das drogas nos discos (67).
Pascual et al ao desenvolverem um novo método para avaliar as concentrações
plasmáticas do voriconazol em pacientes com micoses invasivas observaram uma
idêntica variação analítica entre os resultados obtidos tanto pelo HPLC como pela
análise do halo de inibição no antibiograma (74). A correlação entre os halos de inibição
originados ao redor dos sítios de implantação e a concentração da MMC também foi
58
bem estabelecida por Larrosa et al e Georgopoulos et al (69,72). Os resultados relatados
por esses autores indicaram que o método de bioensaio disco-difusão em ágar permite
quantificar de forma adequada a atividade antimicrobiana da MMC e, indiretamente,
sua concentração no espécime testado. Respaldados por esses estudos prévios,
optou-se pelo método de bioensaio para determinar a massa ideal da droga a ser
impregnada nos discos de papel filtro Whatman® 41 com 8 mm de diâmetro.
A correlação entre os halos de inibição produzidos pelos discos impregnados
com 8 µg e 16 µg de MMC e os halos produzidos pelas soluções de 0,01% e 0,02%,
respectivamente, suscitou aspectos importantes a serem observados. Primeiro, indicou
a massa de 16 µg como sendo a ideal para que o sistema liberasse uma solução de
0,02% após o período de um minuto. Segundo, apontou que, ao final de um minuto, os
discos de papel filtro Whatman® 41 podem reter cerca de 50% da MMC impregnada,
pois se os discos impregnados com 8 µg de MMC liberassem 100% da droga ao
receberem uma gota com um volume próximo de 40 µL, os halos produzidos por esses
discos corresponderiam ao da solução de 0,02%. Apesar de Larrosa et al também
demonstrarem a taxa de retenção da MMC em esponjas utilizadas em cirurgias de
glaucoma, uma comparação com o papel filtro utilizado nessa tese torna-se
inadequada devido a suas diferentes propriedades físicas, formatos, dimensões e
modos de aplicação (69).
Outro dado relevante consistiu no fato de que o aumento gradual das
concentrações de MMC nas gotas utilizadas nas placas do tipo I não foi acompanhado
por um incremento proporcional nos diâmetros dos respectivos halos de inibição.
Sendo assim, quando a concentração de MMC na gota foi elevada em 100%, ou seja,
de 3,77 µg para 7,54 µg, o halo de inibição teve um incremento de apenas 25%. Do
mesmo modo, quando a concentração da droga sofreu um acréscimo de 200%,
59
passando de 3,77 µg para 11,31 µg, o halo de inibição apresentou um incremento de
apenas 35,89%.
Analisando o teor da MMC impregnada nos discos com 5 µg, 10 µg e 15 µg
percebeu-se que, em média, 88,97% da droga foram recuperados a partir dos discos
com 10 µg, enquanto nos discos com 5 µg e 15 µg esse valor correspondeu a 91,45%
e 93,36%, respectivamente. Aqui, a não automação do processo de impregnação e o
maior volume utilizado para impregnar os discos com 10 µg podem ter influenciado
uma menor recuperação da droga naqueles discos. Quando comparado com o menor
volume de 5 µL recebidos pelos discos de 5 µg e 15 µg, o volume de 10 µL utilizado na
impregnação dos discos com 10 µg pode ter ocasionado uma maior perda da
substância para a superfície sobre a qual os discos permaneceram em contato durante
o processo.
Devido a tais interferências, o estudo aqui descrito ao mesmo tempo em que
sugere o novo sistema de aplicação de MMC tem ciência da necessidade de uma
validação do método utilizado e da corroboração de mais estudos para que uma
possível produção em escala industrial seja possível.
De acordo com a nova proposta, diante de um paciente com indicação de PRK
com uso de MMC, o cirurgião oftalmológico incluiria em seu material cirúrgico um disco
de papel impregnado com 16 µg de MMC. Cada disco seria armazenado em um
envelope estéril, que, por sua vez, estaria contido em outro invólucro. Este último
invólucro seria aberto durante a preparação da mesa cirúrgica, sendo seu conteúdo
(envelope + disco estéril com MMC) colocado na mesa estéril. Após os procedimentos
de assepsia e antissepsia, o procedimento se iniciaria com o posicionamento do
paciente em decúbito dorsal na maca acoplada ao laser para realização da cirurgia de
PRK.
60
Com um demarcador, a área da córnea a ser desepitelizada seria delimitada
com uma leve compressão perpendicular. Com uma espátula, o epitélio contido na área
demarcada seria removido com movimentos centrípetos. A aplicação do excimer laser
empregado de forma convencional ou personalizada seguiria à desepitelização e à
remoção dos debris remanescentes. O disco de papel impregnado seria colocado com
uma pinça na região central da córnea de forma que seu centro coincidiria com o centro
da área desepitelizada. Logo em seguida, uma gota de SSB estéril (Ophthalmos, São
Paulo-SP, Brasil) contida em um frasco de colírio padronizado seria aplicada sobre a
superfície do disco. Decorrido o período de um minuto, o disco seria removido com
pinça e uma irrigação copiosa com 30 mL de SSB seria realizada sobre a área tratada.
O estado da arte aqui descrito, depositado no INPI sob o número PI07042739-8
e intitulado ―SISTEMA DE APLICAÇÃO DE DROGAS EM CIRURGIAS
OFTALMOLÓGICAS POR MEIO DE CURATIVO E O CURATIVO‖ proporciona uma
gama de possibilidades para novas pesquisas e benefícios na aplicação
transoperatória de fármacos na superfície ocular.
61
6 CONCLUSÕES
Um novo sistema de aplicação de drogas no período transoperatório de cirurgias
oftalmológicas foi idealizado;
A exclusividade dos direitos sobre a Propriedade Intelectual da invenção foi
assegurada por meio do Depósito do Pedido de Patente protocolado no INPI sob o
número PI 0704739-8;
O volume médio das gotas de SSB instiladas a partir de frascos de colírio
padronizados foi igual a 37,7 µL;
A massa de MMC a ser impregnada nos discos de papel filtro para que o sistema
liberasse uma concentração de MMC a 0,02%, após receber uma gota de SSB e
decorrido um minuto, foi de 16 µg;
O método de disco-difusão em ágar se mostrou uma ferramenta útil para quantificar
de forma adequada a atividade antimicrobiana da MMC e, indiretamente, sua
concentração nos discos de papel filtro Whatman® 41 com 8 mm de diâmetro.
62
7 ANEXOS
Anexo 1
Declaração de Conflito de Interesse ........................................................................ 63
Anexo 2
Depósito do Pedido de Patente ................................................................................ 66
63
Anexo 1 - Declaração de Conflito de Interesse
64
65
66
Anexo 2- Depósito do Pedido de Patente
67
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Abstract
The topical corneal application of antimitotic mitomycin-C (MMC) during refractive
surgery is still characterized by a lack of standardization and considerable empirism.
For this reason the creation of a system capable of reliable drug delivery represents a
beneficial innovation for patients submitted to these procedures. Objective: Elaborate a
new MMC delivery system during the transoperatory period of photorefractive
keratectomy (PRK) followed by patent application. Methods: The project consists of an
in vitro experimental study to create an MMC (0.02%) release system. The drug was
impregnated in sterile Whatman® 41 paper filter discs with a diameter of 8 mm. After
drying, the discs were applied to antibiogram plates seeded with Staphylococcus
epidermidis (American Type Culture Collection – ATCC 12228), followed by the addition
of a drop of sterile water. At the end of 1 minute, the discs were removed and the plates
incubated for 48 hours at 35oC. Mean drop volume in the collyrium flasks was measured
using analytical balance weighing. The inhibition halo (mm) was correlated with the
MMC impregnated into the disc. After completion of the invention design a patent
application was lodged at the National Institute of Industrial Property. Results: The
correspondence between MMC-produced inhibition halos indicated that a dose of 16µg
was ideal for impregnating into the discs. The mean drop volume obtained from the
collyrium flasks was 37.7 µL. A minute after the application of one drop of balanced
saline solution, the system released an adequate concentration for PRK surgery.
Conclusion: A new MMC delivery system was created for transoperatory application in
photorefractive keratectomy (PRK). Publication of the patent application (number PI
0704739-8) gives the authors exclusive intellectual property rights. The study was
sponsored by Ophthalmos Indústria e Comércio de Produtos Farmacêuticos S.A. (São
Paulo-SP, Brazil) and received the indispensable scientific contribution of researchers
from the fields of Pharmacy, Medicine, Biology, Statistics and Law, characterizing the
work as multidisciplinary, in accordance with norms established by the Postgraduate
Health Sciences Program of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN).
