Freemartinismo em bovinos: revisão de literatura ...entre a segunda e terceira semana de vida embrionária. Já a teoria do TDF, abordada por Grunert et al. (2005), estabeleceu que

ARTIGO DE REVISÃO

Freemartinismo em bovinos: revisão de literatura

Freemartins in cattle: a review

Jaci de Almeida1, Osvaldo A. Resende2

1Centro Universitário de Barra Mansa (UBM)Rua vereador Pinho de carvalho, 267, Barra Mansa, RJ, Brasil, CEP 27330-550

2Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA/Agrobiologia – Seropédica)Rodovia BR 465 km 7, Seropédica, RJ, Brasil, CEP 23890-000

R E V I S T A P O R T U G U E S A

CIÊNCIAS VETERINÁRIASDE

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Resumo: O freemartinismo é a mais freqüente forma de inter-sexualidade encontrada nos bovinos, sendo resultante da anas-tomose dos vasos sanguíneos placentários, que conduzem a umacirculação comum entre os embriões, permitindo que a diferen-ciação sexual do macho, anterior a da fêmea, interfira com odesenvolvimento normal do trato reprodutivo desta. As fêmeasfreemartin podem apresentar clitóris hipertrofiado, presença depêlos longos na vulva, vagina mais curta, em fundo cego, sendoem algumas regiões do Brasil chamada de vaca "maninha",apresentando características de machos (pescoço e espáduasmusculosos), ausência de cérvix, ovários poucos desenvolvidosou ausentes, pouco desenvolvimento do sistema mamário, vestí-gios de gônadas masculinas e hipoplasia dos ductos de Muller,sendo considerada infértil (em mais de 90% das ocorrências).Assim, esta síndrome é fator limitante tanto para o sistemareprodutivo, quanto para o produtivo em ambos os sexos, poiscausa prejuízos econômicos para os pecuaristas. Considerandoa importância desta patologia, bem como a falta de informaçõessobre a situação atual da mesma, esta revisão foi realizada como objetivo de obter dados sobre a prevalência, incidência, sintomatologia, sinais clínicos, métodos de diagnóstico, quepossibilitem esclarecer dúvidas dos proprietários e profissionaisde campo.

Palavras-chave: Avaliação clínica, Freemartin, bovinos

Summary: Freemartins are the most frequent form of interse-xuality found in cattle, and results from the anastomosis of placental vessels, leading to a common circulation betweenembryos, allowing the male sexual differentiation, prior to thefemale's, to interfere with the normal development of her repro-ductive tract. Freemartin females may have hypertrophied clitoris, presence of long hairs on the vulva, shorter and blindvagina, presenting characteristics of males (muscular neck andshoulders), absence of cervix, atrophied or absent ovaries, unde-veloped mammary system, traces of male gonads and Mullerianduct hypoplasia, being considered infertile (more than 90% ofthe cases). Thus, this syndrome is a limiting factor for both thereproductive system and for production, because it causes eco-nomic losses for cattle farmers. Considering the importance ofthis disease, and the lack of information about its current state,this review was undertaken in order to obtain data on the preva-lence, incidence, symptoms, clinical signs and diagnostic methodsenabling clarify questions from owners and professionals aboutfreemartism.

Keywords: Clinical evaluation, Freemartin, cattle

Introdução

O termo freemartin é utilizado para designar umavaca ou novilha estéril, mas por extensão, aplica-se auma fêmea concebida em uma gestação múltipla hete-rossexual. Como consequência desta gestação, emmais de 90% das ocasiões, se estabelece uma anasto-mose vascular coriônica entre as placentas dos fetosgêmeos por volta dos 30 aos 40 dias de gestação, ocor-rendo antes do dimorfismo sexual. Isto origina umacirculação fetal comum de células (quimerismohematopoiético) e substâncias plasmáticas como hor-mônios (Ayala-Valdovinos et al., 2000), levando afêmea a um estado intersexual onde os genitais externospreferencialmente são femininos na aparência e o graude afecção dos genitais internos é muito variavel, tendocomo características a hipoplasia gonadal, regressãodos condutos de Müller, masculinização das glândulase estimulação dos condutos de Wolff (Tran, 1977).

O freemartinismo não pode ser prevenido, porém,pode ser diagnosticado por vários métodos, que variamdesde exames simples das membranas da placenta atéa avaliação do cariótipo. Em alguns casos, o gêmeomasculino pode ter sido abortado em uma fase inicialda gestação (antes do quadragésimo dia de gestação).Neste caso, não haverá nenhuma evidência de free-martinismo. Muitos pecuaristas criam normalmente asfêmeas nascidas da gestação de gêmeos de sexosdiferentes, justamente por não saber que a maioria dasfêmeas nascidas nestes casos é estéril.

Considerando a importância desta patologia, bemcomo a falta de informações sobre a situação atual, apresente revisão foi desenvolvida com o objetivo deobter informações sobre os aspectos de prevalência,incidência, etiologia, sintomatologia e diagnóstico, pos-sibilitando esclarecer dúvidas existentes, reduzindo osprejuízos econômicos na pecuária de corte e leite.

*Correspondência: [email protected]: +(55) 21 2682 1049

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Almeida J e Resende OA RPCV (2012) 107 (583-584) 133-141

Revisão bibliográfica

O termo freemartismo diz respeito a uma forma deintersexualidade conhecida há séculos, sendo primeiradescrição anatômica documentada no final do séculoXVIII (Hafez e Hafez, 2004).

A ocorrência de anormalidades na diferenciaçãosexual tem sido descrita em muitas outras espécies,tais como eqüinos, ovinos, suínos e humanos (Basruret al., 1970; Campbell, 2004; Grunert et al., 2005;Payan-Carreira et al., 2008). Segundo Nascimento eSantos (2003) há três aspectos para a diferenciaçãosexual no desenvolvimento embrionário e fetal: sexocromossômico, sexo gonadal e sexo fenotípico.Aberrações na diferenciação podem ocorrer em qual-quer desses três estágios, levando ao que é conhecidocomo intersexualidade. No entanto, o sexo cromossô-mico é determinado no momento da fertilização,quando o oócito X é fertilizado por um espermato-zóide que possui o cromossomo X ou Y (Zenteno-Ruiz et al., 2001). Na seqüência é determinado o sexogonadal, no qual o gene SRY (Sex DeterminingRegion in chromosome Y), localizado no cromossomoY, é responsável pela diferenciação da gônada mas-culina. Se o indivíduo é do sexo genético XX e nãopossui o gene SRY, a gônada se diferencia em ovário.Já o sexo fenotípico se desenvolve de forma ativa nomacho, estimulado pela testosterona produzida pelasgônadas diferenciadas (Nascimento e Santos, 2003).Na ausência dos hormônios masculinos, ou se os teci-dos não respondem a eles, a tendência passiva é dediferenciação em genitália externa feminina. A dis-posição natural é que qualquer feto desenvolva umagenitália externa e conformação corporal femininas naausência dos efeitos masculinizantes dos andrógenos(Howden, 2004). Grunert et al. (2005) afirmam que aintersexualidade, no entanto, é considerada uma alteração no desenvolvimento orgânico do animal, quese contrapõe às características determinadas pelo sexogenético (cromossômico), levando o mesmo indivíduoa apresentar características marcantes dos dois sexos.Por outro lado, outras alterações do desenvolvimentodo aparelho reprodutor ocorrem durante a vida embrio-nária e podem ser decorrentes de malformações dasestruturas primitivas do aparelho reprodutor, as quaisse desenvolvem ou sofrem regressão.

Segundo Ayala-Valdovinos et al. (2000, 2011), asíndrome freemartinismo não é herdável, ao contrárioda propensão em gerar gêmeos, cuja incidência variaentre as raças bovinas (Simental 2,4 a 4,6%, HolsteinFriesian 0,5 a 4,2% e Charolesa 2,5 a 3,2%), sendo amaioria dos partos gemelares dizigóticos (gêmeos nãoidênticos) e somente 2 a 10% monozigóticos (gêmeosidênticos). Por outro lado, Marcum (1974), avaliando22949 partos em gado Zebu, encontrou somente 50(0,22%) nascimentos de gêmeos. Segundo o autor, ospartos gemelares são menos freqüentes nas raçaszebuínas (B. taurus indicus) que em gado de origem

européia (B. taurus taurus). Grunert et al. (2005) afir-mam ser a freqüência de partos gemelares em bovinosde 0,3 a 0,9% ao ano, dos quais 95% são dizigotos,destes 45% são heterossexuais e potenciais geradoresde animais freemartin. Já Potter e Blackshaw (1980)afirmam que a freqüência da "Sindrome Freemartin" éestimada em 92% dos partos gemelares heterossexuais(macho x fêmea) de bovinos. Esta síndrome tambémpode ser observada em nascimento singular de fêmea,devido à morte fetal precoce e reabsorção do gêmeomacho no útero depois do estabelecimento da anasto-mose vascular. Entretanto, Smith et al. (1977) relata-ram um caso de uma novilha fértil nascida gêmea deum macho, com a comunicação vascular entre osgêmeos ocorrida no útero, como evidenciado pela presença de XX e XY células no sangue, sendo que afertilidade da novilha quimérica pode ser atribuível ao estabelecimento de anastomoses vasculares dasmembranas fetais após o período crítico na diferencia-ção gonadal no feto fêmea. Também têm sido descritosnascimentos de novilhas subférteis, em grupos e sim-ples, com o trato reprodutivo interno normal, dasquais algumas eram quimeras XX/XY (Wijeratne etal., 1977).

Fisiologia do freemartinismo

Para que ocorra o freemartismo em bovinos, sãoindispensáveis algumas condições. Primeiro que hajaliberação de dois oócitos, sendo um deles fecundadopor espermatozóide X e o outro fecundado por esper-matozóide Y, gerando gêmeos dizigóticos; segundo aimplantação de heterosexos (XX e XY) no útero; e porúltimo que se produza fusão placentária durante a gestação precoce, levando a anastomose de vasos sanguíneos cório-alantóideos, entre os embriões(Figura 1), culminando com a modificação naorganogênese feminina (Grunert et al., 2005).

Ainda segundo Grunert et al. (2005), a anastomosedos vasos cório-alantóideos e a fusão da circulação

Figura 1 - Anastomose vascular placentária de fetos bovinos.Fonte: Robert A. Foster, Departamento de Patologia, Faculdade deVeterinária de Ontario, Universidade de Guelph – Apud. Ayala-Valdovinos et al. (2011).

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rentes e glândulas vesiculares sob a influência deandrógenos testiculares, e nas fêmeas, os ductos deMüller resultam no desenvolvimento do útero, dastubas uterinas, da cérvix e da vagina anterior (Rey etal., 2003). O MIF produzido pelos testículos domacho bloqueia o desenvolvimento dos ductos deMüller na fêmea de gêmeos heterossexuais (Cabiancaet al., 2007), causando anomalias no trato reprodutivo.Além disso, as gônadas do indivíduo freemartin altamente masculinizado parecem também produzirMIF em alguns casos, mantendo altas concentraçõesdesse hormônio no plasma sanguíneo (Rota et al.,2002). Ainda não está claro quando a produção deMIF pelo freemartin se inicia e qual a concentraçãosérica desse hormônio que influencia a organogênesedo trato reprodutivo durante a vida fetal (Cabianca etal., 2007).

Na teoria celular, fala-se da anastomose dos vasoscório-alantóideos ocorrerem antes da migração dosgonócitos para a crista genital do embrião, havendo apossibilidade de eles passarem do macho para afêmea. Sendo que a presença de células XY na cristagenital primitiva do embrião fêmea determinaria ofreemartinismo (Ohno et al., 1962).

Ohno (1962) descreve a teoria do antígeno H-Y(presente na membrana de espermatozóides porta-dores de cromossomo Y), baseando-se no fato dodesenvolvimento dos órgãos do sistema genital masculino depender da presença do cromossomo Y no blastema gonadal, pois seus genes codificariam oantígeno H-Y (Ag H-Y). Segundo o autor, esseantígeno dissemina-se pela fusão da circulação sanguínea, ocupando receptores específicos da mem-brana das células XX da gônada feminina, sendoresponsável pela produção do quimerismo XX/XY.Estes aparecem em alto número no sistema hemato-poiético desde os estágios iniciais da vida fetal (Nikuet al., 2007).

As quimeras sanguíneas, como também são chama-dos os gêmeos bovinos heterossexuais (Niku et al.,2007), apresentam duas ou mais populações de célulasgeneticamente distintas derivadas de mais de um zigotoem um único indivíduo (Hafez e Hafez, 2004).Segundo Iannuzzi et al. (2005) é importante ressaltarque uma quimera sanguínea é totalmente diferente deuma quimera celular, porque são independentes.Portanto, podem acontecer isoladamente ou não. Oquimerismo celular ocorre no início da divisão celular,durante a metáfase. Já o quimerismo sanguíneo oufreemartinismo, o de interesse nesta revisão, ocorreentre a segunda e terceira semana de vida embrionária.

Já a teoria do TDF, abordada por Grunert et al.(2005), estabeleceu que o gene SRY, presente no cromossomo Y, produz o fator responsável pela dife-renciação do blastema gonadal, transformando a gônada indiferenciada em testículo. Como o desen-volvimento das gônadas do feto macho é mais precocedo que o observado na fêmea, há possibilidade que as

das membranas fetais permitem o intercâmbio devárias substâncias, mas principalmente de andrógenosde origem testicular, de células (hemácias e leucóci-tos) e do TDF (fator de diferenciação testicular). Pelapassagem de células XX e XY há possibilidade doaparecimento de quimeras cromossômicas (XX/XY) epela passagem de substâncias ou hormônios inibidoresda evolução e diferenciação dos ductos de Müller(fator inibidor dos ductos de Müller - MIF), produzi-das pelas células de Sertoli, como também pela passagem do fator de diferenciação testicular (TDF),também inibidor do desenvolvimento diferenciaçãodos dutos de Müller (Grunert et al., 2005).

Já a modificação na organogênese do sistema genitalda fêmea, deve-se ao desenvolvimento mais precocedos testículos relativamente aos ovários. A testos-terona produzida pelas células de Leydig, da gônadado feto macho, sob ação da enzima 5 α-redutase,transforma-se em dihidrotestosterona, responsávelpelo desenvolvimento da genitália externa. As outrassubs-tâncias já mencionadas (fator inibidor dos ductosde Müller e fator de diferenciação testicular) inibirãoa evolução dos órgãos originários do paramesonefro(ductos de Müller), ovidutos, útero, cérvix e vagina(Marcum, 1974).

Etiologia

A etiologia do freemartin foi originalmente descritapor Keller e Tandler (1916) e Lillie (1916; 1917) apud(Grunert et al., 2005). Os nascimentos gemelares sãonaturalmente pouco freqüentes, segundo Grunert eBirgel (1982), sendo resultado de dois mecanismosdiferentes: os heterozigóticos oriundos de dois ovócitosno mesmo estro e fecundados por dois esperma-tozóides diferentes, variando sua freqüência segundoas raças (Menissier e Frebling, 1974); e os monozigó-ticos, que são produtos de divisão natural de umembrião. Na vaca, a gestação gemelar se desenvolvenormalmente até o parto, sendo que o índice de nasci-mento normal pode passar dos 20% (Derivaux eEctors, 1984).

Várias teorias constituíram a base do conhecimentodo freemartinismo. Na teoria hormonal, destacam-seas trocas recíprocas de componentes celulares ehumorais do sangue, pela fusão da circulação sanguínea, conseqüente à anastomose dos vasos dasmembranas cório-alantoidianas de fetos heterosse-xuais. Sugere-se que o MIF, hormônio produzidopelas células de Sertoli, seja o principal responsávelpelo freemartinismo, juntamente com a testosteronaproduzida pelas células de Leydig (Brace et al., 2008).Nos estágios iniciais do desenvolvimento dosmamíferos, os fetos de ambos os sexos apresentamdois pares de ductos: mesonéfricos ou de Wolff e osparamesonéfricos ou de Müller. No macho, os ductosde Wolff se desenvolvem em epidídimo, vasos defe-

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transferências e as ações do gene SRY e do TDF sejamresponsáveis pela alteração do desenvolvimento dosistema genital do feto feminino, caracterizando ahipoplasia de alguns órgãos e masculinização de outros.

Sinais clínicos do freemartinismo bovino

O quadro clínico do freemartismo adulto caracteri-za-se inicialmente segundo Grunert et al. (2005), poralterações da constituição, que torna-se masculinizada(maior desenvolvimento das porções craniais doorganismo, como pescoço curto e grosso, cabeça pesada e tórax mais desenvolvido), semelhante àqueles típicos de machos (animal freemartin montando outras fêmeas), bom estado de carne, commaior massa muscular e acúmulo de gordura.

A troca de sangue entre os gêmeos bovinos heteros-sexuais resulta em vários níveis de masculinização dotrato reprodutivo da fêmea (Padula, 2005). Grunert etal. (2005) apresentam, ainda como sinais clínicos, avulva pequena com pêlos longos na comissura ventral(Figura 2), possibilidade da formação de pseudo-prepúcio, hipertrofia do clitóris nos casos máximos demasculinização. Também pode ser observado em

freemartin, o desenvolvimento de uma formaçãohiperplásica na vagina (Figura 3).

Não se deve esquecer que o macho quimérico prove-niente de parto gemelar heterossexual apresentadiminuição da fertilidade e uma menor concentração emotilidade espermáticas, o que tem sido relacionadocom a diminuição da atividade dos túbulos seminífer-os, causada possivelmente por transmissão da lin-hagem de células germinativas XX provenientes desua irmã gêmea (Rejduch et al., 2000). No entanto,Padula (2005) afirma que o feto macho desenvolve-senormalmente e sua fertilidade pode não ser afetada.

Alterações anátomo-patológicas

As alterações anátomo-patológicas, macro e micros-cópicas, caracterizam no freemartismo a masculiniza-ção do aparelho genital, apresentando as seguintescaracterísticas: ovários de tamanho pequeno ou cons-tituem-se verdadeiros cordões, assemelhando-se aostúbulos seminíferos e, nos graus extremos de mascu-linização, transformam-se em um resquício de gônadamasculina, com epidídimos e canais deferentes atro-fiados. Excepcionalmente, essas gônadas podem teruma situação extra inguinal e subcutânea, sendo entãoa formação de ovariotestis (Grunert et al., 2005). Nosdemais constituintes do aparelho reprodutor pode-seobservar clitóris hipertrofiado, presença de pêlos longos na vulva, vagina mais curta, em fundo cego,ausência de cérvix, vestígios de gônadas masculinas ehipoplasia dos ductos de Müller (Brace et al., 2008).Já o sistema de condutos de Wolff estimulado, caracte-riza-se pela presença do epidídimo, plexo pampini-forme, condutos deferentes, ampolas e glândulasvesiculares hipoplásicas (Grunert et al., 2005).

Diagnóstico

A detecção precoce de fêmea freemartin é impor-tante para o manejo do rebanho, principalmente quando se trata de animais de produção, onde a altaincidência de infertilidade acarreta sérios problemaseconômicos. Para Grunert et al. (2005), o diagnósticodo freemartismo baseia-se na demonstração daambivalência sexual e ocorrência do quimerismoXX/XY. Existem várias técnicas tradicionalmenteempregadas para o diagnóstico de freemartismo, entreelas citam-se:

Ultrassonografia e sexagem fetal

Nos bovinos, o exame é realizado pelo método bidimensional de imagem ultrassonográfica em temporeal (Modo-B), por via retal, utilizando sonda trans-dutora múltipla, emissora de sinais sonoros de alta

Figura 2 - Bezerra freemartin com vulva pequena e pêlos longos nacomissura ventral.

Figura 3 - Formação hiperplásica na vagina em bezerra freemartin.

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freqüência ou ultrassom, propagados pelos tecidos.Estes sinais refletem-se como ecos sendo captadospelo transdutor e convertidos em imagem em duasdimensões, exibidas no monitor. A intensidade deretorno produz vários graus de brilho e variam conforme a natureza da estrutura tissular gerando asimagens (Hansen e Delsaux, 1987). Segundo Raja-mahendran et al. (1994), o transdutor de baixa freqüência produz grande penetração tecidual compouca resolução e o de alta freqüência tem menorincidência e melhor definição. O exame de órgãosreprodutivos de bovinos e visualização fetal é normal-mente realizado com sondas de 5 MHz.

Muller e Wittkowski (1986) foram os primeirospesquisadores a visualizarem por ultrassonografia,características sexuais fetais em bovinos. Basearam-seno desenvolvimento do escroto no macho e da glân-dula mamária na fêmea. Estes parâmetros permitirama determinação sexual em 94% dos casos examinados,entre os dias 70 e 120 de gestação.

Segundo Beal et al. (1992), o sexo pode ser diagnosticado com acurácia aos 60 dias de prenhez. A evidenciação do macho é mais facilitada pela presença da bolsa testicular.

O tubérculo genital, em bovinos, é a estruturaembrionária que dará origem ao pênis no macho e aoclitóris na fêmea, descrito ultrassonograficamente,como estrutura dupla de lóbulos ovalados, hiper-ecogênica, em ambos os sexos (Curran, 1992; Stroud,1996). A sua localização relativa constitui outro método para a sexagem fetal, pois, migra da suaposição inicial, na região inguinal (entre os membrospélvicos), para próximo do úraco (ventralmente) nomacho (Figura 4) e para a região do períneo, próximoa inserção da cauda na fêmea (Figura 5), de acordocom Beal et al. (1992) e Curran (1992).

O período ideal para diagnóstico é entre 55 e 60(Curran e Ginther, 1991), 59 e 68 (Curran, 1992), 55e 70 para vacas grandes ou idosas e entre 60 e 80 diasde gestação para raças pequenas ou vacas novas (Bealet al., 1992). O diagnóstico pode ser impreciso ouimpossível de ser realizado antes dos 60 ou após os100 dias de prenhez (Rajamahendran et al., 1994;Stroud, 1996).

Segundo Curran (1992), a acurácia é de 100 %quando se obtém uma boa imagem das estruturas, oque ocorre em 67 % das sexagens a campo. A deter-minação do sexo apresenta-se trabalhosa após 70 diasde prenhez em bovinos, pois o feto torna-se grande eo corno grávido poderá projetar-se precocemente paraa cavidade abdominal, principalmente em raças degrande porte e vacas idosas, dificultando o posiciona-mento do transdutor. A identificação fica prejudicadasem a retração do útero, que somado a manipulaçãocom a sonda poderia comprometer a gestação (Beal etal., 1992).

No exame clínico reprodutivo a ultra-sonografiatem sido largamente usada comercialmente no Brasil,

para diagnóstico de gestação e sexagem fetal, nos pro-gramas de IATF. Na maioria dos casos as gestaçõesgemelares são diagnosticadas, e na bovinocultura lei-teira a sexagem de gêmeos é vantajosa, uma vez quepermite a interrupção seletiva de gestações não dese-jadas, como as que envolvem fetos macho e fêmea,originando freemartin (Rajamahendran et al., 1994).

Exame clínico

Alguns sinais clínicos são característicos dos órgãosgenitais de animais freemartin. No entanto, outrasvezes, a aparência dos órgãos genitais externos deuma bezerra recém-nascida é normal. Assim, a anam-nese somada ao exame físico no recém-nascido enovilhas, permite identificar o animal portador defreemartismo.

O exame físico dos recém-nascidos e animaisjovens, nos quais não há possibilidade de realizar apalpação retal, faz-se mediante a introdução de umtubo de ensaio (150x10 mm) no vestíbulo vaginal. Avagina de uma bezerra sadia, permite uma penetraçãocom uma variação de 12 a 14 cm (Figura 6) e, no

Figura 4 - Sexagem fetal de um macho bovino através da ultrassono-grafia

Figura 5 - Sexagem fetal de uma fêmea bovina através da ultrassono-grafia

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freemartin, consegue-se introduzir apenas 4 a 5 cm dotubo (Figura 7).

Na inspeção por vaginoscopia nos animais inter-sexuados, evidencia-se o fundo cego cranial da vaginae a ausência do óstio vaginal do cérvix. Na palpaçãoem freemartin adulto, permite-se a detecção de gôna-da indiferenciada e de tamanho reduzido, a ausênciadas trompas uterinas, agenesia ou hipoplasia do corpoe cornos uterinos, percepção de segmentos tubulares(condutos de Müller e de Wolff) e glândulas vesicu-lares rudimentares (Grunert et al., 2005). Além disso,o animal adulto apresenta inicialmente um históricode falha reprodutiva, com ausência de comportamentoestral ou falha na concepção na presença do macho(Padula, 2005). Peretti et al. (2008) afirmam que emmais de 80% dos casos, os animais normais efreemartin podem ser diferenciados com base nosachados de um exame clínico mediante palpação retal.

Prova de tolerância a homo-enxerto

Quando existe anastomose vascular entre os gêmeosem uma gestação heterossexual, estes tendem a trocarcélulas sanguíneas (quimerismo hematopoiético).Neste caso de parto gemelar entre macho e fêmea nosbovinos, este quimerismo permite o diagnóstico dofreemartismo da fêmea, já que ambos apresentam osmesmos antígenos de superfície, e portanto, serãoaltamente tolerantes ao transplante de pele dos co-gêmeos. Entretanto, a prova de tolerância a homo-en-xerto é complicada, pois nem sempre o gêmeo do sexomasculino esta disponível para a prova de laboratório(Ayala-Valdovinos et al, 2000).

Prova sorológica

Este método de diagnóstico, apesar de pouco utilizado, é possível devido à anastomose vascularocorrida entre os gêmeos, havendo populações de

eritrócitos procedentes de dois tipos de células precur-soras, cada uma com diferentes antígenos de superfí-cie. Este intercâmbio sanguíneo durante o desenvolvi-mento embrionário precoce gera tolerância imunoló-gica (James e Dove, 1996). Entretanto, não há produçãode anticorpos contra as células do irmão gêmeo, seusantígenos de superfície podem ser detectados porprovas hemolíticas utilizando marcadores de grupossanguíneos específicos. Estas provas, porém, sópodem ser realizadas depois que os portadores atin-girem um mês de idade, pois a maturação antigênicade glóbulos vermelhos até este momento pode nãoestar completa (Long, 1979).

Análises citogenética, molecular e de FISH (fluorescente in situ hibridização)

Segundo Padula (2005) e Brace et al. (2008), o diagnóstico citogenético para o freemartinismo normalmente é realizado por meio da cariotipagem delinfócitos periféricos e outros tecidos ou por estudosde PCR (reação em cadeia da polimerase). A alteraçãoé identificada pela presença de ambos os pares de cro-mossomos sexuais "XX/XY" (Camargo e Robayo,2005). A avaliação citogenética pela cariotipagem doslinfócitos permite a detecção de quimerismo XX/XY,com 93% de segurança no diagnóstico do freemar-tismo dos bovinos (Grunert et al., 2005).

A PCR é indubitavelmente a técnica mais sensívelpara a detecção de quimerismo, quando comparada àcariotipagem (Padula, 2005), pois permite que aseqüência específica do cromossomo Y seja detectadade forma rápida e fácil (Satoh et al., 1997).

Existem outras técnicas que são utilizadas paradiagnóstico do freemartinismo, como FISH, análise degrupo sanguíneo, além de técnicas mais simples, quepodem ser realizadas a campo, como tratamentos comgonadotrofinas e outros hormônios (Padula, 2005). Aimportância da realização dessas análises citogenéti-cas está no fato de que só assim é possível fazer odiagnóstico diferencial para outras intersexualidades

Figura 6 - Teste do tubo de ensaio em bezerra sadia com vagina de 12 a14 cm

Figura 7 - Teste do tubo de ensaio em bezerra freemartin com vagina de4 a 5 cm

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que apresentam as mesmas características clínicas,como, por exemplo, o intersexo diplóide/triplóide"XX/XXY" (Meinecke et al., 2007). O diagnósticoprecoce desta alteração evita que animais sejam criadosaté a puberdade para que, apenas neste momento, sejapercebida a esterilidade (Kanagawa e Basrur, 1968).

Diagnóstico diferencial

Grunert et al. (2005) referem que em algumas situações é necessário fazer o diagnóstico diferencialentre freemartinismo e hipoplasia grave ou aplasia dosductos paramesonéfricos, pois, no freemartin, obser-va-se a constante presença das glândulas vesiculares,o que não ocorre nos casos de aplasia ou hipoplasia.Ainda segundo o autor, a diferenciação será perfeitaquando se associa o exame clínico à determinação docariótipo do animal ou quando é realizada a avaliaçãodo DNA genômico dos cromossomos sexuais.

Prognóstico

O prognóstico em relação à vida do freemartin ébom, pois os animais se desenvolvem, adequada-mente, e podem ser utilizados quando for convenientepara produção de carne de vitela ou submetido a sistema de engorda (Grunert et al., 2005). No tocantea função reprodutiva, o prognóstico é mau, pois essesanimais são estéreis (Jainudeen e Hafez, 2004;Iannuzzi et al., 2005; Di Meo et al., 2008).

Na literatura existem poucos relatos de vacas férteiscogemelares com um macho e com quimerismo decromossomos sexuais (Eldridge e Blazak, 1977; Smithet al., 1977). Segundo Smith et al. (1977) há possibili-dade de que a anastomose vascular e a conseqüentepassagem de células sanguíneas, entre os gêmeos heterossexuais bovinos, culminem com um quimeris-mo hematopoiético, mas não resulte invariavelmenteem esterilidade da bezerra, já que a futura gônadafeminina pode ser sensível ao efeito de virilização porum curto período durante a gestação, sendo que emalguns casos a anastomose das membranas fetaispoderia ocorrer depois da migração das células germi-nais e provavelmente depois do período crítico dediferenciação do ovário fetal.

No tocante ao valor pecuniário, Grunert et al. (2005)ressaltam que os freemartins são animais extremamentedesvalorizados comercialmente, sendo que na vendanão retornariam ao criador, nem o valor do peso do ani-mal em carne e, assim, o prognóstico é ruim.

Tratamento

Não existe qualquer possibilidade de tratamento curativo, sendo recomendável que os animais sejameliminados (Basrur e Basrur, 2004; Grunert et al., 2005).

Freemartinismo citado na literatura

Em trabalho avaliando 134 búfalos de rio (13 tourosjovens, 119 fêmeas de com problemas reprodutivos edois machos gêmeos), através de exames clínicos ecitogenéticos, Di Meo et al. (2008) observaram que asfêmeas apresentavam conformação do corpo e geni-tália externa normais, porém algumas com sériosproblemas nos órgãos sexuais internos. Sendo que dasfêmeas e os dois machos gêmeos (121 animais), comproblemas reprodutivos, 25 (20,7%) animais apresen-taram cromossomos sexuais anormais e todas asfêmeas eram estéreis devido a problemas nos ductossexuais internos.

Ayala-Valdovinos et al. (2007) ao estudarem 20fêmeas bovinas da espécie B. taurus taurus proce-dentes de partos múltiplos heterossexuais, identi-ficaram 19 (95%) de bovinos freemartin através daanálise citogenética e molecular (PCR), ressaltando aalta freqüência desta síndrome reportada na literatura.Dos animais estudados 15 bezerras não mostraramanormalidades externas aparentes da diferenciaçãosexual. Porém, três novilhas apresentaram característi-cas freemartin, como vagina curta cranialmente, cegacom ausência de cérvix, uma com vulva com clitórishipertrofiado e uma com tufo de pêlos na comissuravulvar inferior. Após sacrifício destes animais obser-vou-se trato reprodutor hipoplásico sem gônadasdiferenciadas. Um animal produto do cruzamentoentre Holandês x Simental, mantido até os 18 mesesde idade, apresentou anormalidades de diferenciaçãosexual como prepúcio não bem diferenciado comorifício externo funcional, uma estrutura peniana deimplantação posterior e ventral ao ânus, e duas estru-turas cutâneas representando bolsas escrotais não bemdiferenciadas. Após os dezoito meses, ao ser sacrifi-cado, observou-se na análise anatomopatológica desteanimal testículos hipoplásicos intra-abdominais comepidídimo e condutos deferentes, glândulas vesicu-lares próstata e um pênis hipoplásico.

Ao estudarem bovinos que apresentaram quimeris-mo sanguíneo, Niku et al. (2007) concluíram que porhaver a mistura de sangue entre os fetos por volta dos30-35 dias de gestação, a composição do sangue deambos os gêmeos, macho e fêmea, seria a mesma. Aoaplicarem o método do Y-ISH (Y-chromosome-specificin situ hybridization), técnica extremamente específi-ca e sensível para detecção do cromossomo Y, emfêmeas freemartin, o resultado foi positivo quando utilizada amostra de sangue e negativo quando usadoqualquer outro tipo de tecido para extração de ADN,ou seja, presença e ausência do cromossomo Y,respectivamente. Portanto, o sistema hematopoiéticofreemartin é fortemente quimérico já a partir de fasesiniciais do desenvolvimento fetal, antes mesmo do início da anastomose vascular funcional. Desta forma,em casos de quimerismo sanguíneo em animais,somente as fêmeas apresentam dois perfis genéticos.

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Uma pesquisa realizada por Iannuzzi et al. (2005)envolvendo 42 búfalos (40 fêmeas e dois machosgêmeos de fêmeas) de rio fenotipicamente com problemas reprodutivos, encontrou-se 10 animaisfreemartin (oito fêmeas e dois machos). Os doismachos apresentaram conformação de corpo e pênisnormais, mas um deles desenvolveu significanteredução de um dos testículos. Entre as oito fêmeas,seis apresentaram a formação do corpo, vagina eclitóris normais e as outras duas mostraram o tratogenital de conformação de macho (pélvis fechada),apresentando fenótipo de macho. Outras observaçõesclínicas foram: ovários pequenos ou não detectáveis,atrofia dos ductos de Müller e dos canais internos davagina e vagina fechada com ausência dos canaisinternos. Os autores concluíram que todas as fêmeasfreemartin eram estéreis e que, ao serem descartadas,obteriam economia de tempo e dinheiro nas propriedades.

Rejduch et al. (2000) trabalhando com touros,encontraram dois animais nascidos de gestaçõesgemelares que apresentaram espermatogônias, indi-cando a presença de quimerismo XY/XX. Sendo quea freqüência de espermatogônias XX nos testículosdos touros avaliados não mostrou correlação com onúmero de células XX no sangue. O volume do ejaculado não foi afetado, enquanto a concentração emotilidade espermáticas foram menores, quando com-parados a touros com cariótipo normal. Com estaevidência é sugerido que as células XX nos testículosforam células germinativas primordiais da fêmea(Ohno, 1969). Esta condição, em alguns casos, estáassociada com mudanças na morfologia, motilidade eviabilidade dos espermatozóides e com defeitos noacrossoma ou, às vezes, com aspermia (Vieira et al.,2011).

Duas hipóteses foram propostas para tentar explicaro que pode acontecer quando ocorre o intercâmbio decélulas primordiais entre gêmeos. A primeira delasrefere que as células germinais XX nos testículos dostouros podem levar ao excesso de produção de esper-matozóide X e, por conseguinte à elevação do númerode filhas nascidas. A segunda hipótese seria que ascélulas germinais XX no testículo do touro gêmeo nãopoderiam ser viáveis, e a sua degeneração levaria àreduzida fertilidade do touro (Long, 1979).

Conclusões

Ainda existe uma grande incidência de partos geme-lares dizigóticos, originando freemartinismo nosrebanhos leiteiros, que na grande maioria das vezesnão são catalogados. Somados à falta de conhecimen-to de muitos pecuaristas, e ao maior desenvolvimentoem relação às demais fêmeas do rebanho, as fêmeasfreemartin comumente são mantidas nas propriedades.O problema tem aumentado principalmente em

fazendas que fazem o uso da aplicação de eCG(gonadotrofina coriônica eqüína) ou FSH (hormôniofolículo estimulante) nos protocolos de IATF(Inseminação Artificial em Tempo Fixo) para incre-mentar os resultados da técnica. E mesmo havendorelato na literatura de animais provenientes de partogemelar dizigótico, sem comprometimento no desen-volvimento, a maioria dos trabalhos atesta a infertili-dade, sendo indicada a eliminação dos mesmos dareprodução. Neste contexto, o diagnóstico precoce degestações gemelares heterossexuais, através da ultras-sonografia, torna-se importante na pecuária leiteira,para evitar a criação animais inférteis, e conseqüente-mente economizando alimento, mão-de-obra e maximização do espaço físico da propriedade pelodescarte de animais freemartins.

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ARTIGO DE REVISÃO

Terapias antioxidantes na criopreservação espermática

Antioxidant therapies on sperm cryopreservation

Ellen C. B. da Silva*, Maria M. P. Guerra

Laboratório de Andrologia, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco,Recife, PE, Brasil



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Resumo: A congelação do sêmen consiste em uma biotécnicareprodutiva de grande importância para a indústria da produçãoanimal, uma vez que rompe a barreira tempo-espaço pelapreservação da viabilidade dos espermatozoides, possibilitandoo transporte e o armazenamento do material genético. Em con-trapartida, a ação do frio, seja por refrigeração ou congelação,constitui evento atípico e estressante sobre as células, com estímulo à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), oque determina a redução da integridade estrutural e funcionaldos espermatozoides e consequentemente, baixas taxas de concepção após inseminação artificial. Em decorrência disto,grande atenção tem sido dada aos sistemas de defesa antioxi-dantes, bem como às novas perspectivas em termos de terapiasantioxidantes utilizadas no sêmen criopreservado, sendo este ofoco da presente revisão.

Palavras-chave: antioxidantes enzimáticos, antioxidantes nãoenzimáticos, espécies reativas de oxigênio, lipoperoxidação

Summary: The freezing of semen consists in a reproductivebiotechnical technique of great importance to the animal pro-duction industry, since it breaks the space-time barrier by allowing sperm viability preservation, permitting the transportand storage of genetic material. On the other hand, the coldaction, either by refrigeration or freezing, is an atypical andstressful event for the cells, stimulating the reactive oxygenspecies (ROS) generation, which determines the reduction ofstructural and functional sperm integrity and, consequently, lowconception rates after artificial insemination. Thus, great atten-tion has been given to the antioxidant defense systems, as wellas to the new perspectives of antioxidant therapies used on cry-opreserved semen, which is the focus of this review.

Keywords: enzymatic antioxidants, non-enzymatic antioxi-dants, lipid peroxidation, reactive oxygen species

Introdução

Os antioxidantes são compostos que regulam,removem e suprimem a formação de espécies reativasde oxigênio (ROS) ou contrariam suas ações (Sikka,1996; Sikka, 2004; Maneesh e Jayalekshmi, 2006),evitando o início ou a propagação das reações emcadeia de oxidação (Degáspari e Waszczynskyj, 2004)na maioria dos tecidos e flúidos orgânicos (Barreiros

et al. (2006) citado por Silva et al. (2011)). De modogeral, o mecanismo de defesa antioxidante é divididonas etapas de prevenção, onde é inibida a produção deROS; de intercepção, que interrompe a reação emcadeia; e de reparação, que não é observada nos esper-matozoides em virtude do carente sistema enzimáticoque possui em seu citoplasma e que é essencial para aexecução dos reparos (Saleh e Agarwal, 2002).

No sêmen, estão presentes antioxidantes intra eextracelulares que constituem os sistemas de defesaantioxidantes enzimáticos e não enzimáticos (Sanockae Kurpisz, 2004; Silva et al., 2011), responsáveis pelaproteção dos espermatozoides contra os insultosoxidativos (Stojanovic et al., 2001; Maneesh eJayalekshmi, 2006; Chi et al., 2008). Contudo,durante o período de maturação os espermatozoidesperdem a maior parte de seu citoplasma e, com isso,são privados de uma fração dos antioxidantesendógenos, o que os torna vulneráveis à ação das ROS(Carvalho et al., 2002). Deste modo, os espermato-zoides maduros passam a depender, basicamente, daproteção dos antioxidantes presentes no plasma seminal(Carvalho et al., 2002; Alvarez e Moraes, 2006), quese torna a mais importante forma de proteção utilizadapor estas células no combate às ROS (Sikka, 2004).

Em contrapartida, a criopreservação do sêmenfavorece o desequilíbrio entre oxidantes e antioxi-dantes, em favor dos agentes oxidativos, com compro-metimento da integridade estrutural e funcional dosespermatozoides (Watson, 2000; Guerra et al., 2004).Concomitantemente, grande atenção tem sido dadaaos sistemas de defesa antioxidantes e às novas perspectivas em termos de terapias antioxidantes utilizadas no sêmen criopreservado a fim de melhormanter a viabilidade destes gametas, sendo este o focoda presente revisão.

Terapias antioxidantes

O plasma seminal é dotado de uma série de antioxi-dantes responsáveis pela proteção dos espermato-zoides contra agentes oxidativos (Aitken et al., 1995;

*Correspondência: [email protected]: +(55) 55 81 33206412; Fax: +(55) 81 33206057

144

Silva ECB e Guerra MMP RPCV (2012) 107 (583-584) 143-149

Maneesh e Jayalekshmi, 2006). Dentre os antioxi-dantes presentes no sêmen estão os enzimáticos, comosuperóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e sistema glutatião peroxidase/glutatião redutase (GSH-Px/GSH-Red) (Carvalho et al., 2002; Zini et al., 2002; Alvarez e Moraes, 2006), e os não-enzi-máticos, como α-tocoferol, ascorbato, urato, piruvato,glutatião, taurina e hipotaurina, que reduzem as con-centrações de oxidantes no sêmen à níveis fisiológicose mantêm a fertilidade natural e assistida mais adequada (Agarwal e Saleh, 2002; Saleh e Agarwal,2002).

Durante o processamento do sêmen destinado aoarmazenamento, o desequilíbrio entre a geração deROS e a atividade antioxidante é desencadeado tantopelo comprometimento da capacidade protetora dosantioxidantes presentes no ejaculado, a partir da mar-cante redução de suas concentrações após diluição dosêmen (Sarlós et al., 2002) ou remoção do plasmaseminal (Guerra et al., 2004), quanto pelo estímulo àprodução de ROS, durante a criopreservação (Watson,2000). O desequilíbrio em favor dos oxidantes resultaem efeitos tóxicos e comprometimento da funcionali-dade celular (Stornelli et al., 2005), o que conduz, frequentemente, a apoptose, morte celular (Turrens,2003) e redução da fertilidade dos espermatozoides(Purdy, 2006).

A fim de melhorar a qualidade do sêmen criopre-servado (Peris et al., 2004; Jang et al., 2006) por meioda prevenção ou redução do processo peroxidativo(Kheradmand et al., 2006), diversos pesquisadorestêm-se dedicado a realizar estudos relacionados àadição de antioxidantes nos diluidores seminais dasdiversas espécies, como é o caso da equina (Marqueset al., 2002; Silva et al., 2009) e da ovina(Kheradmand et al., 2006; Câmara et al., 2011; Silvaet al., 2011; Silva et al., 2012). Neste contexto, podemser destacados entre os antioxidantes já estudados comesta finalidade a SOD (Marti et al., 2008; Câmara etal., 2011; Silva et al., 2011), a CAT (Câmara et al.,2011), a GSH-Px, a GSH-Red (Marti et al., 2008), ahipotaurina (Lopes et al., 1998), a vitamina E (Silva etal., 2008), a vitamina C (Kheradmand et al., 2006), oresveratrol (Sarlós et al., 2002; Silva et al., 2012) e aquercetina (Silva et al., 2012).

O uso de antioxidantes exógenos no sêmen temdeterminado resultados favoráveis, como a redução daconcentração de malonaldeido (MDA) nas amostrasseminais em decorrência da redução da peroxidaçãolipídica e, em virtude disto, menos danos espermáti-cos e melhor conservação destes gametas durante oprocesso de criopreservação (Sarlós et al., 2002).Entretanto, apesar de os antioxidantes ou agentes que-lantes reduzirem as taxas de peroxidação dos fos-folipídios endógenos dos espermatozoides (Jones eMann, 1976), a terapia com antioxidantes pode apre-sentar efeitos indesejáveis se a dose de segurança forultrapassada (Carvalho et al., 2002). Concomitan-

temente, estes agentes devem ser utilizados com mo-deração, até mesmo pelo fato de inibirem a formaçãodas ROS e suas funções fisiológicas desempenhadasnos espermatozoides (Carvalho et al., 2002), a exemploda hiperativação, capacitação e reação acrossómica(De Lamirande et al., 1997; Sanocka e Kurpisz,2004).

Antioxidantes enzimáticos

Os antioxidantes enzimáticos são macromoléculas,oriundas ou não do próprio organismo, que protegemo mesmo contra as ROS e espécies reativas denitrogênio (RNS), podendo atuar diretamente sobreestes agentes ou reparar os danos por eles causados noorganismo (Barreiros et al., 2006). Em sistemas repro-dutivos, é observado que as concentrações e o papelprotetor destas enzimas antioxidantes diferem entremachos férteis e inférteis (Kasimanickam et al.,2006), o que sugere a existência de uma correlaçãopositiva entre a ação antioxidante e a fertilidade, comdespertar do interece para o uso das terapias antioxi-dasntes na manutenção da melhor qualidade dosêmen.

Superóxido dismutase (SOD)

Nos sistemas eucariontes existem duas formas deSOD: a SOD-Cobre-Zinco, localizada principalmenteno citosol, e a SOD-Manganês, localizada principal-mente na mitocôndria (Ferreira e Matsubara, 1997),que desempenham papel chave no mecanismo dedefesa celular contra a toxicidade do oxigênio e alipoperoxidação (Abu-Erreish et al., 1978; Sikka,1996). A ação protetora da SOD decorre de suacapacidade em catalisar a dismutação do O2

++ emH2O2 e O2 (Figura 1) (Ferreira e Matsubara, 1997), osquais sofrem ação subsequente da GSH-Px e da CAT(Turrens, 2003). Nesse contexto, foi demonstrado queamostras de sêmen suíno apresentam maior viabili-dade após congelação e descongelação quando possuem alta atividade de SOD e alta proporção deGSH-Px, antes da congelação (Cerolini et al., 2001),bem como que a integridade acrossómica de esperma-tozoides ovinos congelados foi superior com a adiçãoda SOD ao meio diluidor (Silva et al., 2011).

Catalase (CAT)

A catalase consiste em uma enzima antioxidanteencontrada na região do peroxissoma e mitocôndriadas células, a qual desempenha importante papel protetor contra os danos oxidativos (Abu-Erreish etal., 1978). Em virtude de sua ação complementar àSOD, a CAT converte o H2O2 em O2 e H2O (Figura 2)(Sikka, 1996; Maneesh e Jayalekshmi, 2006), reduzin-do o risco de formação do radical hidroxila via reação

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de Fenton (Luz et al., 2011). A ativação da CAT éobservada quando as concentrações celulares de H2O2

ultrapassam os níveis fisiológicos, constituindo umaresposta aguda contra o stress oxidativo e os efeitosdeletérios deste oxidante sob os espermatozoides(Noblanc et al., 2011).

Sistema glutatião peroxidase/glutatião redutase(GSH-Px/GSH-Red)

A glutatião peroxidase está presente no organismodos mamíferos em quatro formas principais (GSH-Px1, GSH-Px 2, GSH-Px 3 e GSH-Px 4), sendo a GSH-Px 4 responsável pela proteção dos espermatozoides(Alvarez e Moraes, 2006). Assim como a GSH-Red, aGSH-Px é um antioxidante enzimático envolvido nainibição da peroxidação lipídica (Maneesh eJayalekshmi, 2006) e na proteção contra danos oxida-tivos (Abu-Erreish et al., 1978), estando associada àinibição das ROS e a consequente manutenção damotilidade espermática (Sikka, 2004). Contudo, éválido ressaltar que a GSH-Red não age removendodiretamente as ROS, mas sim regenerando a glutatiãoa sua forma reduzida, que constitui o substrato daGSH-Px no ciclo metabólico da glutatião (Figura 3).

O efeito protetor da GSH-Px decorre de sua atuaçãocomo catalisador da redução/degradação do H2O2 e deoutros peróxidos orgânicos (Figura 3) (Sikka, 1996;Ferreira e Matsubara, 1997; Alvarez e Moraes, 2006),sendo, portanto, mais versátil do que a CAT emrelação aos substratos que metaboliza (Noblanc et al.,2011). Deste modo, a GSH-Px e a SOD são descritascomo responsáveis por desempenhar importante papel

como constituintes do sistema antioxidante que protege os espermatozoides contra os efeitos tóxicosdas ROS (Kasimanickam et al., 2006), de forma quefalhas na expressão da GSH-Px são correlacionadascom infertilidade, resultante dos insultos oxidativos(Noblanc et al., 2011).

Antioxidantes não enzimáticos

Antioxidantes não enzimáticos são micromoléculas,oriundas ou não do próprio organismo, que têm porfunção protegê-lo das ações deletérias das ROS e RNS(Barreiros et al., 2006).

Vitamina E

A vitamina E é um antioxidante não enzimático(Maneesh e Jayalekshmi, 2006), lipossolúvel naturalda membrana (Sikka, 2004) que, assim como a vitami-na C, pode proteger os espermatozoides contra danosoxidativos do ADN e da membrana (Sikka, 1996). Oefeito protetor deste antioxidante decorre de suacapacidade em prevenir a peroxidação lipídica esuprimir, por conseguinte, a produção de malonaldeido(Aitken e Clarkson, 1988), o que é possível pelo fatode atuar como quelante das ROS produzidas durante alipoperoxidação (Ferreira e Matsubara, 1997).

Em contrapartida, a vitamina E pode ter sua funçãocomprometida em casos de elevada concentração deferro (Ferreira e Matsubara, 1997) e, quando em ele-vadas concentrações no interior da célula, o que resultaem efeitos adversos sobre os processos fisiológicos dosespermatozoides (Sikka, 2004). Além disso, a atuaçãoda vitamina E sofre interferência das condições de seuarmazenamento, da composição lipídica das mem-branas espermáticas e das concentrações de antioxi-dantes presentes no sêmen das diferentes espécies (Balle Vo, 2002). Apesar destas limitações e dos variadosresultados obtidos após adição da vitamina E para oarmazenamento do sêmen, em estudo realizado porKheradmand et al. (2006) o α-Tocoferol acetato (anál-ogo da vitamina E) teve um efeito protetor sobre a motilidade e a integridade de membrana de espermato-zoides refrigerados (5 ºC) de ovinos.

Vitamina C

O ácido ascórbico ou vitamina C é comumenteencontrado no organismo na forma de ascorbato, constituindo um antioxidante de notável atuação invivo, uma vez que neutraliza as ROS e RNS por meiode reações de redução, com concomitante inibição daperoxidação lipídica (Barreiros et al., 2006). Ainibição da peroxidação lipídica promovida pela vita-mina C ocorre de forma direta ou indireta sobre asmembranas celulares em meios aquosos e isto se deveao fato deste antioxidante atuar eficientemente sobre

Figura 1 - Reação de dismutação do radical superóxido (O2˙˙) emperóxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular (O2). H+: íonhidrogênio; SOD: superoxido dismutase. Fonte: Abu-Erreish et al.(1978).

Figura 2 - Reação de dismutação do peróxido de hidrogênio (H2O2)em oxigênio molecular (O2) e água (H2O). CAT: catalase. Fonte:Maneesh e Jayalekshmi (2006).

Figura 3 - Reação de redução do H2O2 (peróxido de hidrogênio) aH2O (água), na presença de GSH-Px (glutatião peroxidase; 1) ereação de regeneração da GSH (glutatião reduzida) e GSSG (glutatião oxidada) na presença de GSH-Red (glutatião redutase) eGSH (2 e 3). NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatoreduzida; H+: íon hidrogênio; NADP+: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato. Fonte: Barreiros et al. (2006).

2O2–

+ 2H+

H2O2 + O2SOD

H2O2 H2O + 1/2O2CAT

GSH-Px

GSH

GSH-Red

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O (1)

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ (2)

H2O2 + NADPHH H+ 2H2O NADP+ (3)

146


ROS como O2˙˙, H2O2, hipoclorito (ClO˙), OH˙ e radical peroxil (OOH˙) (Vasconcelos et al., 2007). Emcontrapartida, o ascorbato também pode atuar comopró-oxidante, o que ocorre quando presente em doseselevadas ou quando exposto a metais, fato que deter-mina a lipoperoxidação (Ferreira e Matsubara, 1997)em virtude do estímulo à produção de H2O2 eOH+(Bianchi e Antunes, 1999).

Embora a terapia antioxidante com vitamina C paraa criopreservação de sêmen apresente resultados aindacontroversos, muitos estudos têm demonstrado açãoprotetora sobre os espermatozoides. Memon et al.(2012) demonstraram que o sêmen caprino criopreser-vado na presença de vitamina C apresenta aumento damotilidade, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossoma, morfologia e viabilidadedos espermatozoides, fato também observado porAsadpour et al. (2011) para sêmen bovino.

Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são divididos em dois grupos: o dos flavonoides e o dos não flavonoides(Degáspari e Waszczynskyj, 2004). Os denominadosflavonoides apresentam a estrutura química C6-C3-C6, enquanto que os não flavonoides são classificadoscomo sendo derivados das estruturas químicas C6-C1(ácidos hidroxi bezoico, gálico e elágico), C6-C3 (ácidos cafêico e p-cumárico hidroxi cinamatos) e C6-C2-C6 (trans-resveratrol, cis-resveratrol e trans-resveratrol-glucosídio) (Degáspari e Waszczynskyj,2004).

Os compostos polifenólicos, em particular osflavonoides, possuem uma estrutura ideal para a retirada de radicais, o que decorre da presença devários grupos hidroxila, tornando-os antioxidantesmais potentes do que as vitaminas C e E (Barreiros etal., 2006). Deste modo, em virtude de suas pro-priedades de oxidorredução, os polifenóis podemdesempenhar importante papel na absorção e na neutralização das ROS, exercendo efeito quelantesobre o oxigênio triplete e singlete ou decompondo osperóxidos (Degáspari e Waszczynskyj, 2004), o que,por sua vez, pode prevenir a ocorrência de danosespermáticos (Sikka, 2004).

Em contrapartida, é importante destacar que cadaflavonoide possui efeito biológico dependente de suaestrutura, dose e via de administração, fatores quepodem determinar resultados variáveis após sua utilização (Lima et al., 2001), justificando a não proteção das células e tecidos pelos compostos fenóli-cos, diante de todos os danos oxidativos sofridos(Bianchi e Antunes, 1999). Além disso, tais compostospodem apresentar atividade pró-oxidante, a exemplodo que ocorre com a quercetina ao reagir com o ferro(Bianchi e Antunes, 1999), sendo tal atividade eviden-ciada, especialmente, em compostos que possuem

potencial de oxidação menor que o do Fe3+ e do Cu2+

(Barreiros et al., 2006).Resveratrol

O resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiistilbeno) é umpolifenol (Stojanovic et al., 2001) não flavonoide(Degáspari e Waszczynskyj, 2004), encontrado sobreas formas cis e trans (Trela e Waterhouse, 1996). Ocis-resveratrol é muito instável à ação da luz, enquanto que o trans-resveratrol consiste na formamais estável, permanecendo por longo período quando protegido da luz e em faixa de pH entre 1 e 7(Trela e Waterhouse, 1996). O trans-resveratrol (trans-3-5-4’-trihidroxiistilbeno) é abundantementeencontrado na videira e, embora sua ação protetoranão esteja totalmente esclarecida, destaca-se entre os compostos fenólicos que inibem a formação deROS e retardam o envelhecimento celular e orgânico(David et al., 2007). Na presença de trans-resveratrol,a peroxidação lipídica é inibida mais eficazmente doque com as vitaminas C e E, sem prejuízos a esteprocesso com o incremento da dose empregada,demonstrando ser o resveratrol um melhor antioxi-dante (Stojanovic et al., 2001).

Em experiência realizada por Sarlós et al. (2002),foi verificado que o resveratrol, composto previa-mente não utilizado para a conservação do sêmen, éum potente antioxidante, inibindo a peroxidaçãolipídica com maior eficácia em baixas concentrações(15 µg/109 espermatozoides/1 mL), nas temperaturasde 37 e 5 ºC. Os efeitos benéficos do trans-resveratrolsobre a reprodução também foram evidenciados emestudo realizado por Juan et al. (2005), que, ao trabalharem com a administração oral deste composto(20 mg/kg/dia; 90 dias) em ratos, constataram oaumento da produção espermática e a não manifes-tação de efeitos adversos sobre estas células, emdecorrência da ausência de toxicidade do resveratrol.

Além disso, Kyselova et al. (2003) demostraram quea administração oral de resveratrol (3 mg/L; 28 dias)em ratos, por um período mais curto e em menor concentração do que a usada por Juan et al. (2005),não interferiu na qualidade espermática, assim comona espermatogênese e na fertilidade dos espermato-zoides. Silva et al. (2012) não observaram melhoriasignificativa dos parâmetros espermáticos pós-des-congelação, em amostras de sêmen ovino tratadas comdiferentes concentrações (5, 10, 15 e 20 µg/mL) deresveratrol, embora seja provável que tenha havidoredução das taxas peroxidativas, com base nos resultados obtidos para o potencial de membranamitocondrial e nas observações de Garcez et al.(2010).

Quercetina

A quercetina é um polifenol flavonoide (Stojanovicet al., 2001) que tem sido testado para o tratamento deelevadas concentrações de colesterol e de doenças

147


cardiovasculares (Lima et al., 2001), por sua capaci-dade adstringente (Degáspari e Waszczynskyj, 2004).Este flavonoide possui efeito inibidor da peroxidaçãolipídica similar e sinérgico ao do resveratrol, sendo,portanto, um antioxidante mais potente que as vitami-nas C e E (Stojanovic et al., 2001), em virtude dagrande quantidade de grupos hidroxila em sua estru-tura (Barreiros et al., 2006). Além disso, a quercetinapossui comprovada capacidade inibidora de danosoxidativos induzidos pelo H2O2 no DNA de linfócitoshumanos (Bianchi e Antunes, 1999).

Com base no exposto, foi gerada a perspectiva deque a quercetina pudesse exercer efeito protetor sobreos espermatozoides, fato não confirmado em estudorealizado por Silva et al. (2012) ao congelarem osêmen ovino com diferentes concentrações dequercetina (5, 10, 15 e 20 µg/mL), embora suponha-seque este antioxidante tenha promovido redução daperoxidação lipídica. Por outro lado, em estudo realizado por Zribi et al. (2012) com sêmen humanofoi observado que a adição de 50 µM de quercetina aodiluidor seminal aumenta a motilidade e viabilidadeespermática, bem como reduz a fragmentação doDNA e a oxidação após descongelação do sêmen.

Conclusão

A criopreservação do sêmen, embora possibilite odesenvolvimento da indústria animal, sofre limitaçõesem virtude dos efeitos prejudiciais do frio sobre ascélulas espermáticas, fato que tem conduzido a buscapelo aperfeiçoamento desta biotécnica, com destaquepara as terapias antioxidantes. Em contrapartida, apesar dos antioxidantes serem tidos como um caminho para a inibição dos danos ocasionados pelasROS às células espermáticas, sua ação sofre a influên-cia de diversos fatores, o que tem conduzido àobtenção de resultados variados e contraditórios, apóssua utilização. Por conseguinte, é notória a necessi-dade da realização de estudos mais aprofundados acerca da ação dos antioxidantes sobre a sobrevivênciae a funcionalidade dos espermatozoides para que ouso destes agentes seja aprimorado e as biotécnicasreprodutivas, tais qual a criopreservação do sêmen,possam ser disseminadas com resultados satisfatórios.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia doEstado de Pernambuco (FACEPE), pela concessão deauxílio financeiro e bolsa de doutorado; ao ConselhoNacional de Desenvolvimento Científico e Tecnoló-gico (CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento dePessoal de Nível Superior (CAPES), pela conseção deauxílio financeiro.

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RPCV (2012) 107 (583-584) 151-156

Características termorreguladoras e desempenho de cabras leiteiras noterço inicial da lactação em clima tropical

Thermoregulatory traits and performance of dairy goats in early lactationin tropical weather

Débora A. E. Façanha1, Ângela M. Vasconcelos2*, Fátima R. G. Lima2, Ângela M. X. Eloy3,Auriclécia O. L. Ayura4, Magda M. Guilhermino5, Aline V. Landim2

1UFERSA2Universidade Estadual Vale do Acaraú

3Embrapa Caprinos e Ovinos4UNIMONTES

5UFRN



151

Resumo: Teve-se como objectivo avaliar o comportamento decaracterísticas termorreguladoras, a condição corporal e a pro-dução de leite no início da lactação de 45 cabras de diferentestipos raciais (15 da raça Saanen, 15 cruzadas 1/2 Sem PadrãoRacial Definido (SPRD) x 1/2 Murciana e 15 AlpinasAmericanas). Foram tomadas a temperatura retal, a frequênciarespiratória, o escore da condição corporal a produção diária deleite e as concentrações plasmáticas de triiodotironina (T3) etiroxina (T4) avaliados até os 36 dias da lactação. As concen-trações de T3 e T4 foram obtidas pelo método de radioimuno-ensaio. As variáveis meteorológicas foram registradas às 15 h,no mesmo horário da coleta dos dados fisiológicos. Os resultadosobtidos indicaram que as cabras da raça Alpina Americana tiveram as maiores temperaturas retais e frequencias respi-ratórias, além de menores concentrações de triiodotironina etiroxina, associados a menor produção de leite e condição corporal possivelmente como reflexo de menor adaptação aoclima. As cabras Saanen e 1/2 Murciana SPRD apresentarammenores temperaturas retais e frequencias respiratórias, maiorescore da condição corporal e concentrações séricas de triio-dotironina e tiroxina. As temperaturas retais foram iguais entreos grupos genéticos 1/2 SPRD x 1/2 Murciana e diferente paraas cabras Saanen. No terço inicial de lactação animais mestiçosleiteiros juntamente com as cabras Saanen, demonstrarammaior adaptabilidade, bom desenvolvimento corporal e melhordesempenho lactacional. As cabras Alpinas Americanasmostraram menores respostas adaptativas e produtivas o queevidencia a importância do ambiente térmico na criação dessesanimais.

Palavras-chave: adaptação, caprinos, condição corporal, hormônios tireoideanos

Summary: The objective of this study was to evaluate physio-logical and performance characteristics in early lactation ofdairy goats of several breeds, namely thermoregulation, bodycondition and milk production. Forty five females were used (15Saanen, 15 of crosses between undefined breed and 1/2Murciana and 15 American Alpine). Records were made of

rectal temperature, respiratory rate, body condition score anddaily milk production in the 36 first days of lactation. Plasma concentrations of triiodothyronine and thyroxine were obtainedby radioimmunoassay method. The meteorological variableswere registered at 15 pm, at the same time as the collection ofphysiological indicators. Results indicate that American Alpine goats had higher rectaltemperatures and respiratory frequency, lower concentration oftriiodothyronine and thyroxine, associated to a smaller milk production and body condition, possibly due to the worse climate adaptation. Saanen and 1/2 Murciana crosses presentedlower rectal temperatures and respiratory frequency, higherbody score and triiodothyronine and thyroxine concentrations.Rectal temperatures were similar between the genetic groupsundefined breed x 1/2 Murciana and different for Saanen goats. In the initial third of lactation crossbred goats along withSaanen goats showed greater adaptability, good physical development and better milk production. The American Alpinegoats showed less productive and adaptive responses whichhighlights the importance of the thermal environment in themanagement of these animals.

Keywords: adaptation, goats, body condition, thyroid hormones

Introdução

A caprinocultura representa uma atividade degrande importância econômica e social para oNordeste brasileiro, que detém cerca de 91% do efetivo nacional (IBGE, 2008). Ao longo do tempo,surgiram em diferentes microrregiões animais perfeitamente adaptados às condições semiáridas,todos explorados para a produção de carne e pele, no entanto para o melhoramento genético dessesrebanhos nativos têm-se utilizado em larga escalaraças leiteiras oriundas de clima temperado.

Para melhorar a produtividade dos rebanhos regio-nais foram introduzidas raças exóticas especializadas

*Correspondência: [email protected]: +(55) 88 9623 8559; Fax: +(55) 88 3611 6527

152

Façanha DAE et al. RPCV (2012) 107 (583-584) 151-156

para produção de leite, principalmente as raçasSaanen, Parda Alpina, Anglonubiana e ultimamenteAlpina Americana e Murciana das quais se esperareunir características produtivas superiores e adaptaçãoao ambiente semiárido através de cruzamentos comanimais de raças nativas ou sem padrão racialdefinido.

Em regiões quentes como o nordeste brasileiro, queapresenta altas temperaturas associadas com a umidadedo ar e radiação elevada, os animais de clima tempe-rado podem sofrer alterações no seu comportamentofisiológico durante o processo adaptativo, cujasrespostas podem afetar a ingestão de alimentos eredução do nível de produção. Nesses casos, frequen-temente verifica-se a ocorrência do desequilíbrio térmico, cujos indicadores são alterações na taxametabólica como diminuição nas secreções dos hormônios tiroxina e triiodotiroxina, na temperaturacorporal e frequência respiratória (Souza Junior et al.,2008).

Desta forma é imprescindível dispor de conhecimen-tos sobre os meios fisiológicos e/ou comportamentais,que venham a contribuir com as condições de sobre-vivência dos animais oriundos de regiões temperadasem ambiente quente. Assim a interação entre animal-ambiente deve ser levada em consideração quando sebusca maior eficiência, considerando-se que o conhe-cimento das variáveis climáticas e suas ações sobre asrespostas comportamentais e fisiológicas são prepon-derantes na adequação do sistema de produção aosobjetivos da atividade pecuária (Souza et al., 2012).

Neste contexto, objetivou-se avaliar as respostas termorreguladoras e sua associação com a secreção dehormônios tireoidianos, a variação da condição corpo-ral e a eficiência de produção de leite, no terço inicialda lactação de cabras leiteiras de diferentes gruposgenéticos criadas clima tropical.

Material e métodos

A pesquisa foi desenvolvida no Sítio Acauã, localizado no município de Caucaia, litoral norte doestado do Ceará, com latitude de 3°45’ S, longitude de40º21’ W e altitude de 15 m. Segundo a classificaçãode Köppen o clima local é BSh, semiárido, com pre-cipitação pluviométrica anual em torno de 1350 mm,concentrada de janeiro a maio. De acordo com dadosda Fundação Cearense de Meteorologia e RecursosHídricos (Funceme, 2009), a média anual de tempera-tura do ar é de 26 °C, com umidade relativa do ar de65% na época seca e 87%, na época chuvosa.

Na segunda quinzena do mês de novembro, um totalde 68 cabras em idade reprodutiva foi submetido à sincronização de estro, utilizando-se o protocolorecomendado por Machado e Simplício (2001) e Maiae Santos (2010). Este procedimento foi realizado paraque todos os animais pudessem parir e iniciar a lac-

tação na mesma época, sendo submetidos às mesmascondiçoes meteorológicas.

Após a confirmação do diagnóstico de prenhêz positivo, foram selecionadas 45 cabras adultas, todasde segunda lactação, sendo 15 1/2 Murciana x 1/2Sem Padrão Racial Definido (SPRD), 15 AlpinasAmericanas e 15 Saanen, com idade variando entretrês e cinco anos. Esses animais foram confinados emaprisco de alvenaria com meia parede, coberto comtelhas de barro, com pé direito de 3,0 m, dividido embaias de piso ripado, suspenso a 0,8 m do solo, comsolários amplos, comedouros, bebedouros e saleirosindividuais por baias com corredor central para circu-lação de animais e manejadores. A alimentação eracomposta por capim elefante picado (Pennisetum purpureum Schum.), oferecido ad libitum, e concen-trado comercial em quantidades variando entre 600 e1200 g diários, de acordo com o nível produtivo decada animal. Em cada baia era fornecido sal mineralem barra, com livre acesso.

Os partos ocorreram aos 144 dias de gestação, entrea segunda e a terceira semanas do mês de abril, corres-pondendo à época chuvosa da região. Foi prestadaassistência às matrizes, não tendo sido verificada nenhuma intercorrência nas parições. As crias foramseparadas das mães e transferidas para cabriteiros debaias coletivas, cerca de 12 horas após o nascimento.Foi adotado o aleitamento artificial.

Os dados foram coletados no dia do parto e sema-nalmente até 44 dias após o parto, sempre às 15 h, porse tratar de um horário no qual, teoricamente, oestresse térmico pode ser mais severo. As variáveistermorreguladoras registradas foram: freqüência respiratória, por contagem direta dos movimentos dosflancos durante 60 segundos, temperatura retal, uti-lizando-se um termômetro clínico digital de precisão,introduzido no reto do animal durante dois minutos.Foi aferido o escore da condição corporal, em escalavariando de 1 (muito magra) a 5 (obesa). O controloleiteiro foi realizado semanalmente nos mesmos diasestabelecidos pela rotina de coletas dos dados na propriedade. Foi também coletada uma amostra de 10 mL de sangue de cada animal, por venipunção dajugular, utilizando-se sistema a vácuo. Essas amostrasforam centrifugadas na propriedade, a 3500 rpm,durante 10 minutos, para a extração do plasma, que foiacondicionado em microtubos de 1,5 mL e congeladasa - 20 ºC. As dosagens de triiodotironina (T3) e tiroxina (T4) foram realizadas em duplicata, noLaboratório de Endocrinologia da Embrapa Caprinose Ovinos, utilizando-se kits comerciais de radioimu-noensaio (Chadio et al., 2002). Nestes mesmos dias decoleta de dados nos animais foram realizados, tambémàs 15 h, registos de temperatura do bulbo seco, temperatura do bulbo úmido, temperatura do globonegro e velocidade do vento, por meio de um psi-crômetro, um anemômetro e um globo negro de cobre,instalados no interior de uma baia vazia do aprisco.

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Posteriormente foi estimada a umidade do ar, expres-sa em pressão parcial de vapor, segundo Varejão-Silva(2001). Como Índices de Conforto Térmico foramestimados o Índice de Temperatura de Globo eUmidade (Buffington et al., 1981) e a Carga TérmicaRadiante (Silva, 2007).

Resultados

As médias das variáveis meteorológicas (Tabela 1)demonstram que, durante a fase experimental, o ambiente ocupado pelos animais apresentou valoresconsideravelmente elevados de temperatura e umidadedo ar.

Tabela 1 - Variáveis meteorológicas e índices de conforto térmico, registradas às 15h00min, no interior das instalaçõesdurante o período experimental

Itens Média

Temperatura do ar (ºC) 30,4

Umidade do Ara (Kpa) 2,86

Velocidade do vento (m/s) 1,1

Índice de Temperatura de Globo e Umidade 89,86

Carga Térmica Radiante (W/m2) 767,38aExpressa em Pressão Parcial de Vapor

Os maiores níveis de radiação, traduzida pelasmaiores carga térmica radiante ocasionam aumentosobre as variáveis termorreguladoras (Silva et al.,2007). No presente trabalho a média da Carga TérmicaRadiante (CTR) e o Índice de Temperatura de Globo eUmidade (ITGU) foram elevados, confirmando que aassociação entre radiação e umidade do ar promoveramum ambiente possivelmente fora da zona de confortotérmico para a maioria das raças exóticas, menosadaptadas ao clima tropical.

Pelas variáveis meteorológicas encontradas (Tabela1), pode-se dizer que os animais tiveram que recorrera ajustes fisiológicos de termorregulação (Tabela 2),em busca do equilíbrio térmico.

Morais et al. (2008) em seu estudo com cabras lei-teiras verificaram que os animais utilizaram em maiorescala a termólise respiratória para eliminar o excessode calor e assim manter a temperatura retal em níveis

fisiológicos normais, indicando que esse mecanismofoi eficiente e evitou a hipertermia. No presente estudo observa-se que as médias de temperatura retal(TR) foram iguais entre os animais 1/2 SPRD x 1/2Murciana e Alpinas Americanas e menores (P<0,05)que às Saanen. A frequência respiratória (FR) foimaior (P<0,05) nas cabras Alpinas Americanas o quereflete a maior necessidade de perda térmica, mesmoapresentando a mesma temperatura retal que os animais 1/2 SPRD x 1/2 Murciana. Em regiões áridasé importante a manutenção da temperatura corporal,principalmente através da ofegação e de uma eficienteeconomia de água, através da redução da perda evapo-rativa (Ahmed e El Kheir, 2004). Os animais 1/2SPRD x 1/2 Murciana foram os que menos utilizarama termólise respiratória e, apesar disso, conseguirammanter a temperatura corporal em limites consideradosfisiologicamente normais.

Embora as concentrações de hormônios tireoidianosestivessem dentro da faixa de normalidade para aespécie caprina (Chadio et al., 2002), as concen-trações de tiroxina (T3) e triiodotironina (T4) forammenores (P<0,05) nas cabras Alpinas Americanas,refletindo menor taxa metabólica, provavelmenteassociada com redução na produção de leite e noescore da condição corporal (ECC) verificada nessaraça. Foi verificado neste estudo que os animais dogrupo genético 1/2 SPRD x 1/2 Murciana apresen-taram valores de hormônios tireoidianos maiores(P<0,05), apesar de menores médias de temperaturaretal e freqüência respiratória. Não houve diferença(P>0,05) quanto ao ECC, produção diária de leite (PL)e concentrações séricas de T3 e T4 entre os animais daraça Saanen e os 1/2 SPRD x 1/2Murciana.

A maior TR (39,9 ºC) foi observada nos primeirostrinta dias após o parto nas cabras dos grupos genéti-cos Saanen e os 1/2 SPRD x 1/2 Murciana. Os ani-mais da raça Alpina Americana não exibiram o mesmocomportamento, uma vez que a maior média de temperatura corporal foi registrada no dia do parto(39,6 ºC).

A raça Alpina Americana apresentou maiores con-centração de T3 plasmática entre 2,00 ng/mL e 2,09ng/mL dos 21 aos 36 dias pós-parto coincidindo com

Tabela 2 - Características termorreguladoras e de desempenho de cabras leiteiras de diferentes grupos genéticos no terço inicial dalactação

Variáveis Grupos genéticos CV (%) R2

Saanen 1/2 SPRDg x 1/2 Murciana Alpinas Americanas

TRa(ºC) 39,6a 39,3b 39,3b 0,47 0,82

FRb (mov/min) 37,7b 35,0c 41,8a 12,05 0,68

T3c (ng/ml) 1,98a 2,04a 1,87b 4,38 0,71

T4d (1/2 g/dl) 129,2a 131,4a 104,3b 8,74 0,63

PDLe (kg) 1,26a 1,36a 0,70b 6,43 0,75

ECCf 3,00a 3,00a 2,75b 1,02 0,67

Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. TRa = temperatura retal; FRb= freqüência respiratória (movimentos/min); T3c = concentrações séricas de triiootironina; T4d = concentrações séricas de tiroxina; PDLe = pro-dução diária de leite; ECCf = escore da condição corporal, em escala variando de 1 a 5; SPRDg = sem padrão racial definido.

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o pico da lactação. A secreção de T4 foi normal e cres-cente variando de 148,33 1/2g/dL a 113,09 1/2g/dLaté quatorze dias pós-parto, nos três grupos genéticos,demonstrando maior atividade da tireóide nesse perío-do. O escore da condição corporal (ECC) de todos osgrupos genéticos diminuiu gradativamente com aaproximação do pico da lactação ficando entre 2,75 e300, confirmando a mobilização de tecidos comu-mente observada nesta fase do ciclo lactacional, quecaracteriza o Balanço Energético Negativo.

Pelos coeficientes de correlação entre as variáveismeteorológica, termorreguladoras e de desempenhodas cabras leiteiras (Tabela 3), observa-se que a tem-peratura do ar correlacionou-se de forma positiva esignificativa com a TR e a FR. No entanto, apresentoucorrelação negativa e significativa com as concen-trações de T4. A umidade do ar foi correlacionada sig-nificativamente apenas com a TR e a FR e a veloci-dade do vento com a freqüência respiratória, no entan-to os coeficientes foram muito baixos.

Por outro lado, as correlações entre o Índice seTemperatura de Globo e Umidade (ITGU) e as variáveis termorreguladoras foram elevadas e signi-ficativas, sendo positivas para TR e FR e negativaspara T3 e T4. Diante desses resultados, pode-se constatar que a associação entre temperatura radiantee umidade do ar influenciou mais as reações fisiológi-cas dos animais do que esses elementos isoladamente.

A CTR e o ITGU influenciaram TR e a FR o quepode comprometer a homeotermia. Não houve corre-lação entre o ECC e as variáveis meteorológicas, umavez que o mesmo exibiu um comportamento esperado,variando de maneira compatível com o deficitenergético verificado, sobretudo em função do estágiode lactação no qual os animais se encontravam.

Discussão

Os valores elevados das variáveis meteorológicasverificadas dentro do aprisco podem ser devido à construção de alvenaria, com cobertura em telhas decerâmica, a baixa altura do pé-direito associada àmenor velocidade do vento, normalmente observadana região na época chuvosa, o que pode ter contribuí-

do para o aquecimento (Tabela 1). A associação entreradiação e umidade do ar nesta pesquisa ocasionou umambiente provavelmente fora da zona de conforto térmico dos animais. Isso alerta a necessidade domanejo ambiental visando à proteção contra o excessode radiação, sobretudo nas instalações destinadas aanimais confinados e provenientes de clima tempera-do, para que possam apresentar menores perdas nodesempenho, quando introduzidos em regiões declima quente.

Pelas variáveis meteorológicas encontradas durantea fase experimental (Tabela 1), pode-se dizer que osanimais tiveram que recorrer a ajustes fisiológicos determorregulação (Tabela 2), em busca do equilíbriotérmico para eliminar o excesso de calor e assim manter a temperatura retal em níveis fisiológicos normais, indicando que esse mecanismo foi eficientee evitou a hipertermia.

A semelhança da temperatura retal (TR) entre osanimais 1/2 SPRD x 1/2 Murciana e AlpinasAmericanas e maiores dos animais tipo Saanen, deve-se provavelmente pelo maior porte destas últimas emrelação às outras e isso pode ter dificultado a dissipaçãode calor corporal e possivelmente potencializado amaior estocagem térmica. Em relação à freqüênciarespiratória (FR) a raça Alpina Americana apresentoumaior valor o que reflete diretamente na manutençãoda temperatura cerebral, promovendo a troca de calorque ocorre entre o sangue venoso, que vem da mucosanasal, e o arterial que irriga o cérebro (Aiura et al.,2010). Houve uma necessidade maior de perda térmi-ca, mesmo apresentando a mesma temperatura retalque os animais os 1/2 SPRD x 1/2 Murciana que utili-zaram menos a termólise respiratória e, apesar disso,conseguiram manter a temperatura corporal em limites considerados fisiologicamente normais. Essaobservação pode favorecer esses animais, uma vez queà menor FR é condizente com menores desgastes físico e desvio de energia para a termorregulação, possibilitando um maior aporte de energia para asfunções produtivas.

As concentrações de tiroxina (T3) e triiodotironina(T4) menores nas cabras Alpinas Americanas, refletemmenor taxa metabólica. Isso pode ser explicado pelofato dos hormônios tireoidianos participarem do

Tabela 3 - Coeficientes de correlação entre variáveis meteorológicas e termorreguladoras e de desempenho de cabras leiteiras emambiente tropical

Variáveis TRf FRg T3h T4i PDLj ECCl

(ºC) (mov/min) (ng/ml) (1/2 g/dl) (kg) (1-5)

TAa (ºC) 0,384** 0,395** - 0,139ns - 0,317* - 0,063ns 0,045ns

UAb (kPa) 0,291* 0,214* - 0,094ns 0,081ns - 0,102ns 0,025ns

VVc (m/s) 0,056ns 0,183* 0,142ns 0,085ns 0,082ns 0,032ns

ITGUd 0,439** 0,349** - 0,309** - 0,321* - 0,291* 0,067ns

CTRe (W/m2) 0,351** 0,251* 0,094ns -0,109* -0,066ns 0,034ns

* P > 0,05; **P > 0,01; ns: não significativo TAa = temperatura do ar; UAb = Umidade do ar; VVc = velocidade do vento; ITGUd = Índice deTempeartura de Globo e Umidade; CTRe = Carga térmica radiante; TRf = temperatura retal; FRg = freqüência respiratória; T3

h = concentrações séricas de triiootironina; T4

i = concentrações séricas de tiroxina; PDLj= produção diária de leite; ECCl = escore da condição corporal.

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mecanismo de termorregulação por meio da diminuiçãodas suas concentrações plasmáticas em situação deestresse térmico, reduzindo desta forma o seu efeitocalorigênico e, as raças européias utilizam com maisênfase o metabolismo na termorregulação em altastemperaturas (Silva et al., 2007). Os animais do grupogenético os 1/2 SPRD x 1/2 Murciana apresentaram valores de hormônios tireoidianos maiores e, menorestemperaturas retais e freqüência respiratória. Este conjunto de reações pode indicar maior adaptabilidadeàs condições locais, pelo menor aquecimento corpo-ral, levando, conseqüentemente à menor necessidadede termólise, justificada pelo menor acionamento dasperdas respiratórias e maiores concentrações de T3 eT4. A maior atividade tireoideana pode ser refletida naprodução de leite, devido ao efeito catabólico dos seushormônios, que contribuem diretamente com adisponibilidade de nutrientes para a síntese do leite.Assim, as concentrações séricas dos hormônios T3 eT4 são afetadas pela temperatura e umidade do ar, demodo que, durante o estresse térmico, há uma resposta mais rápida e maior período de latência nasrespostas dos hormônios tireoideanos (Starling et al.,2005).

A semelhança do ECC, produção diária de leite (PL)e concentrações séricas de T3 e T4 entre os animais daraça Saanen e os 1/2 SPRD x1/2 Murciana pode seratribuído ao fato das cabras Saanen serem descen-dentes de animais já criados em clima tropical, portanto mais adaptadas ao calor, como tambémpodem ser considerada os 1/2 SPRD x 1/2 Murciana.Já os animais das raças Alpinas Americanas foramimportados na forma de embriões de cabras criadasem clima temperado e bruscamente introduzidos emregião quente, portanto, as suas reações fisiológicassão características do estresse térmico agudo, no qualainda estão começando a responder com ajusteshomeostáticos inespecíficos e, justamente por isso,ainda não demonstram um perfil adaptativo e produtivo definido.

Ao correlacionar as variáveis meteorológicas e termorreguladoras e de desempenho das cabras leiteiras (Tabela 3), observa-se que nas ocasiões maisquentes houve um incremento da estocagem térmicaque estimulou a termólise respiratória e os níveis deT4 circulante, o que indica uma possível redução daatividade tireoideana em situações de temperaturaambiente mais elevada, umidade do ar e velocidadedo vento.

A associação entre temperatura radiante e umidadedo ar influenciou mais as reações fisiológicas dos animais do que esses elementos isoladamente, levandoa uma possível redução da atividade da tireóide emocasiões de maior estresse ambiental, traduzidas porTR e FR mais elevadas. Essas reações podem ter causado reflexos negativos à produção de leite, con-forme se constata pela correlação negativa (Tabela 3).O comportamento do ECC variou de maneira com-

patível com o deficit energético verificado, sobretudoem função do estágio de lactação no qual os animaisencontravam-se e as cabras dos grupos genéticosSaanen e 1/2 Murciana x 1/2 SPRD apresentaramdesempenho semelhante no terço inicial as lactação;no entanto, os animais 1/2 Murciana x 1/2 SPRDdemonstraram maior adaptabilidade ao ambiente tér-mico, com menor aquecimento corporal, associado àmenor necessidade de redução da taxa metabólica e deacionamento da termólise respiratória. As cabras daraça Alpina Americana demonstraram reaçõesinespecíficas, características de estresse agudo, commenor produção de leite e balanço energético negativomais severo, mesmo em sistema de confinamento, noqual não se encontravam expostas diretamente àscondições climáticas locais.

Conclusões

No terço inicial de lactação animais mestiços leiteiros juntamente com as cabras Saanen, demons-traram maior adaptabilidade, bom desenvolvimentocorporal e melhor desempenho lactacional. As cabrasAlpinas Americanas mostraram menores respostasadaptativas e produtivas o que evidencia a importânciado ambiente térmico na criação desses animais.

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RPCV (2012) 107 (583-584) 157-163

Effect of the finishing feeding system on total cholesterol, vitamin E and β-carotene contents in Alentejana purebred bullocks

Efeito do maneio alimentar de acabamento sobre os teores de colesteroltotal, vitamina E e β-caroteno em novilhos de raça Alentejana

Mário A.G. Quaresma1*, Inês Trigo-Rodrigues1, José P. C. Lemos1, Rui J. B. Bessa1,2

1Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Av. Universidade Técnica, Pólo Universitário Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

2Unidade de Produção Animal, L-INIA, Instituto Nacional de Recursos Biológicos, Fonte Boa, 2005-048 Vale de Santarém, Portugal



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Summary: The objective of this study was to assess the effectof different finishing options on total cholesterol and majorlipid soluble antioxidants (α−tocopherol, γ−tocopherol and β−carotene) contents in longissimus lumborum muscle. Afterweaning, 32 young bulls of purebred Alentejana were divided intwo groups, 8 animals were transferred to a feedlot (CCC) andfed on concentrate feeding during an 8 month period and thenslaughtered. The remaining 24 animal were maintained on extensive pasture conditions for 15 months and finished onpasture (PPP, n=8) or on concentrate feeding for 2 months (PPC, n=8) or 4 months PCC, n=7). The intramuscular contentsof total cholesterol, α− and γ−tocopherol and β−carotene wereanalyzed by HPLC. Intramuscular total cholesterol contentsranged between 38.5-41.0 mg/100 g of meat and was not influenced by the finishing feeding regimens (p>0.05). α−Tocopherol and β−carotene contents were significantly andnegatively affected by the period length on concentrate feeding,while γ-tocopherol contents were not influenced by the finishing feeding. Major contents of both α−tocopherol (6.56µg/g of meat) and β−carotene (0.07 µg/g of meat) wereobserved on the PPP group, while minor contents of those com-pounds were found in the CCC group (1.77 and 0.01 µg/g ofmeat for α−tocopherol and β−carotene, respectively). Thus,proper supplementation of dietary antioxidants should be con-sidered in feedlot fed animals.

Resumo: Pretendeu-se avaliar o efeito de diferentes sistemas deacabamento nos teores de colesterol, α−tocoferol, γ−tocoferol eβ−caroteno na carne de bovino. Após o desmame, 32 vitelos de raça Alentejana foram divididos em 2 grupos, 8 foram transferidos para um parque de engorda e alimentados com alimento concentrado durante um período de 8 meses até aoabate (CCC). Os restantes 24 vitelos foram mantidos emcondições de pastoreio durante um período de 15 meses, destes8 animais foram abatidos no final do período (PPP), e os 16 animais restantes foram transferidos para o parque de engorda ereceberam alimento concentrado durante 2 meses (PPC, n=8)ou 4 meses (PCC, n=7). O teor de colesterol total, β−caroteno,α− e γ−tocoferol foram determinados por HPLC.O teor de colesterol total (38,5-41,0 mg/100 g de carne) não foiinfluenciado pelo maneio alimentar da fase de acabamento

(p>0,05). Os teores de α−tocoferol e β−caroteno foram negati-vamente influenciados pela duração do período de acabamentocom alimento concentrado (p<0,05), enquanto o teor de γ−tocoferol não foi influenciado pelo sistema de acabamento. A maior concentração de α−tocoferol (6,56 µg/g de carne) e β−caroteno (0,07 µg/g de carne) foi encontrada na carne de animais do grupo PPP, enquanto os teores mais baixos foramencontrados em carne dos animais do grupo CCC (1,77 e 0,01 µg/g de carne respectivamente para o α−tocoferol e β−caroteno). Nos animais submetidos a acabamento longo comalimento concentrado deverá ter-se em consideração a necessi-dade de suplementação da dieta com antioxidantes.

Introduction

In recent years, consumers have become increasinglyinterested in food origin, animal welfare, environmentalprotection and healthiness, which have contributed toan increased demand of meat from animals rearedunder extensive systems (Sepúlveda et al., 2008).Meat healthiness is mainly correlated to its lipid con-tent and composition (Fisher et al., 2000; Wood et al.,2003). Grass-fed cattle and wild ruminants are knownto have lean meat with the proper fatty acid profile forhuman nutrition (Cordain et al., 2002; Hoffman andWiklund, 2006; Quaresma et al., 2012) and a superiorantioxidant capacity (Descalzo et al., 2007). Meatantioxidant capacity is of great importance to thepreservation of bright red colour and nutritional quality, since the control mechanisms that withstandoxidation reactions in vivo are less effective afterslaughter. Such oxidation reactions are delayed oreven stopped by the antioxidant potential of vitamin Eand β-carotene, which have been positively correlatedwith pasture feeding (Daley et al., 2010).

Despite pasture-raised beef antioxidant and nutri-tional advantages, cattle finished on pasture is usuallyassociated with less tender meat (Mitchell et al.,

*Correspondência: [email protected]: +(351) 213602042; Fax: +(351) 213652810

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Quaresma MAG et al. RPCV (2012) 107 (583-584) 157-163

1991), darker meat (Priolo et al., 2001) and lowerflavour characteristics compared to concentrate-fedbeef (Schroeder et al., 1980; Hedrick et al., 1983;Vestergaard et al., 2000). Less preferred characteris-tics of pasture raised beef are correlated with increaseage at slaughter and leaner carcasses. Meat fat contentis an important parameter, being positively correlatedwith improved sensory attributes, as flavour and ten-derness (Dolezal et al., 1982; Muir et al., 1998), whilecarcass fat cover is of particular importance to the pre-vention of cold-shortening (Koohmaraie et al., 1988).

Taking into account consumer demands on meat andthe problems involved with the sensorial attributes ofgrass-fed beef. It is essential to establish a finishingperiod long enough to improve beef sensorial attribu-tes, but without losing the nutritional benefitsacquired during the grazing period (Cerdeno et al.,2006), which are essential characteristics for theintended added value, specific preference and demandfor the product by the consumer.

This study is the second publication of a controlledtrial in which four different finishing options wereapplied to Alentejana autochthonous cattle breed. Theeffect of the feeding system on total lipids, intramus-cular fatty acids and conjugated linoleic acid isomers of beef cattle was already published (Alfaia etal., 2009), and the objective was to assess the effect ofdifferent finishing options on total cholesterol andlipid soluble antioxidant vitamins (α-tocopherol, γ-tocopherol) and β-carotene contents in longissimuslumborum muscle.

Material and methods

Animals and management

The experiment was conducted at EstaçãoZootécnica Nacional (EZN) facilities (Vale deSantarém, Portugal). Thirty two purebred Alentejanayoung bulls, born between March and July of 2003 inEZN herd, were used. The herd was maintained inextensive conditions in alluvium land near the Tagusriver (39°07_N; 8°43_W), animals grazing on rye-grass, summer triticalis and maize stubbles. Afterweaning, in February 2004, with live body weightsranging between 200 and 300 kg, the young bulls weredivided in two groups, 8 animals were transferred to a

feedlot (CCC) and fed on concentrate feeding duringa 8 month period and then slaughtered, while theremaining 24 young bulls were maintained on exten-sive pasture conditions for 15 months (until June2005). In the extensive pasture group, one animalfailed to grow at normal rate and was removed fromthe experiment, 8 bullocks were slaughtered at the endof this pasture period (PPP). The lasting 15 animalswere transferred to feedlot facilities and fed the fat-tening diet described below. Eight bulls were slaugh-tered after 2 months in feedlot (PPC) and the remai-ning 7 animals were slaughtered after 4 months in thefeedlot (PCC).

Animals on concentrate feeding period (all groupswith the exception of PPP) were fed at 2.75% livebody weight, on a diet consisting of 70% concentratefeeding (Composition on Table 1) and 30% molasses -fibrous cubes (Composition on Table 1). The animalswere slaughtered with approximately 600 kg of livebody weight.

Animals were slaughtered at an EZN experimentalabattoir by exsanguination after stunning with a cartridge-fired captive bolt stunner. Carcasses weresuspended by the Achilles tendon and chilled at 10 °Cfor 24 h followed by refrigeration at 2 °C for 5 days.longissimus lumborum muscle samples (ca. 200 g)were collected from the cranial end (L1-L2), trimmedof connective and adipose tissues before being blendedin a food processor, vacuum packed and finally storedat –70 °C until analysis.

Analytical procedures

The simultaneous determination of total cholesterol,β-carotene and tocopherols was performed as previ-ously described (Prates et al., 2006). Briefly, the com-pounds in analysis were extracted from fresh meatsamples with a saponification solution. Afterwards,samples were submitted to chromatography analysisfor compound separation, using HPLC methodologyand a normal-phase silica column. A couple of detec-tors in tandem (UV-visible photodiode array detector,and fluorescence detector) were used for compounddetection.

Tocopherol detection was performed using fluores-cence detection (excitation wavelength of 295 nm andemission wavelength of 325 nm), while the UV-visiblephotodiode array detector was used for simultaneously

Table 1 - Proximate composition of concentrate feeding and concentrate growing supplement used in the experiment (presented asmg/g dry matter)

Proximate composition Concentrate feeding Molasses - fibrous cubes

Crude protein 128 147

Total fat 30 30.2

Crude fiber 65 130

Ashes 90 132.2

Nitrogen-free extract 687 560.6

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detection of both cholesterol (202 nm) and β-carotene(450 nm).

The injection volumes used varied between 10 and100 µl in order to get values inside the linearity rangeof the standard curves. The contents of total choles-terol, tocopherols and β-carotene in meat were calcu-lated, in duplicate for each muscle sample (valuesaccepted for CV <6%), based on the external standardtechnique, from a standard curve of peak area vs. concentration.

Statistical analysis

Total cholesterol, β-carotene, α-tocopherol and γ-tocopherol were subjected to analysis of variance(ANOVA), considering the treatment of different feeding regimens as a single effect, using the GLMprocedure of Statistical Analysis Systems Institute(SAS, 2004). Least squares means were presented andcompared, using the LSD test, when the effect of feeding system was significant (p< 0.05).

Results

Cholesterol

The total cholesterol contents of longissimus lumbo-rum muscle from Alentejana bullocks with differentfeeding regimens are presented in Table 2. The totalcholesterol contents of longissimus lumborum muscleranged between 38.5-41.0 mg/100 g of meat and wasnot significantly influenced by the finishing feedingregimens (p>0.05).

Major lipid-soluble antioxidants in beef

The longissimus lumborum β-carotene and vitaminE (α- and γ-tocopherols) contents are depicted inTable 2. The finishing feeding regimen had a highlysignificant effect (p<0.0001) on both β-carotene andα-tocopherol, but had no significant effect on γ-toco-pherol (p>0.05). α-Tocopherol and β-carotene contents in longissimus lumborum muscle were negatively influenced by the finishing period lengthon concentrate feeding. The highest β-carotene content in longissimus lumborum muscle wasobserved in bulls raised and finished on pasture (0.07_g/g of meat), such β-carotene content was reduced to

less than half (0.03 µg/g of meat) in bulls finished onconcentrate for a two month period, while a fourmonth period on concentrate feeding reduced the β-carotene content to 0.01 µg/g of meat, the same β-carotene content found in animals raised and finished solely on concentrate feeding (CCC group).

α-Tocopherol content on longissimus lumborummuscle was negatively influenced by the length of finishing period on concentrate feeding, revealing aprogressive decline as the concentrate feeding lengthincreases. α-Tocopherol content on longissimus lumborum muscle was not significantly influenced bythe feeding regimen (p>0.05), ranging between 0.07-0.09 µg/g of meat.Vitamin E content in longissimuslumborum was predominantly dependent of α-toco-pherol, which was responsible for 95.3 to 98.9% oftotal vitamin E, while γ-tocopherol was accountablefor the remaining 1.1 to 4.7% of total vitamin E.

Discussion

Total cholesterol content in beef

The absence of significant differences in the totalcholesterol content between groups with differentfeeding regimens is in agreement with previousresults, which showed that muscle cholesterol contentwas not significantly influenced by the finishing regi-men (Leheska et al., 2008) neither by seasonal effects(Alfaia et al., 2006).

However, the cholesterol content in longissimuslumborum muscle in this study (38.5-41 mg/100 g ofmeat) is below the cholesterol contents previouslyquantified in Alentejana purebred steers semitendi-nosus (ST; 42-43 mg/100 g of meat) and longissimusthoracis (LT; 48-49 mg/100 g of meat) muscles(Alfaia et al., 2006). Accordingly to Chizzolini et al.(1999) variations in cholesterol content can be seenamong different species and muscles, but their magni-tude is generally low. Major differences on cholesterolcontent are dependent of differences in muscle fibrecomposition and the relative proportion of each fibretype (Alasnier et al., 1996; Chizzolini et al., 1999). Inthis particular comparison, the total cholesterol content from different muscles within the same breedshows considerable differences on the cholesterol contents. Such differences could be consequence of:1) different muscle fiber composition, since glycolytic

Table 2 - Effect of feeding regimen on total contents of cholesterol, α-tocopherol, γ-tocopherol and β-carotene

Feeding regimens SEM P

PPP PPC PCC CCC

Total cholesterol1 38.5 39.9 40.0 41.0 0.010 0.38

β-carotene2 0.07a 0.03b 0.01c 0.01c 0.039 <0.0001

α-tocopherol2 6.56a 4.78b 2.83c 1.77d 0.290 <0.0001

γ-tocopherol2 0.07 0.08 0.08 0.09 0.007 0.45

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and oxidative muscle fibers are associated with different cholesterol content and each muscle has itsone proportion of glycolytic and oxidative fibers(Chizzolini et al., 1999); 2) different methods for cholesterol saponification and extraction were used inthose studies and differences in between techniques ofcholesterol extraction and quantification have been pre-viously pointed has an important cause for differencesobserved on the cholesterol content in between studies(Chizzolini et al., 1999).

Considering the meat cholesterol contents obtainedin this study, a daily intake of 200 g of meat per dayrepresents a daily ingestion of 77-82 mg of choles-terol, which corresponds to 25.7-27.3% of the recom-mended maximum daily cholesterol intake (300 mgper day) (Krauss et al., 2000).

Major lipid-soluble antioxidants in beef

Skeletal muscle contains a multi-component anti-oxidant system formed by non-enzymatic hydrophilicand lipophilic compounds and endogenous enzymes,like catalase, glutathione peroxidase and superoxidedismutase, that controls oxidative reactions in the liveanimal (Nuernberg et al., 2005).

After slaughter the control mechanisms that with-stand lipid oxidation reactions in vivo are less effectiveand lipid oxidation proceeds in a comparativelyuncontrolled manner (Kerry et al., 2000). Thereforemeat is very susceptible to oxidation, and this is amajor cause for quality deterioration (Lee et al., 2005;Nuernberg et al., 2005; Descalzo and Sancho, 2008),affecting meat sensorial and nutritional qualities.

Vitamin E (α-tocopherol in particular) and β-carotene antioxidant potential remains effectiveafter slaughter, being recognized as major lipophilicantioxidants in meat (Liu et al., 1995; Faustman et al.,1998; Muramoto et al., 2003; Descalzo and Sancho,2008; Insani et al., 2008), their content in beef is variable and dependent of several factors, and diet isone of major importance (Yang et al., 2002a; Yang etal., 2002b; Descalzo et al., 2005). High concentrationsof vitamin E in muscle have been shown to increasethe oxidative stability of beef (Faustman et al., 1989),improving meat quality characteristics such as colour,flavour, texture and nutritional value, as well asincreasing meat shelf-life (Morrissey et al., 1994).

Vitamin E is the primary lipid-soluble antioxidant inbiological systems, being responsible for scavenginglipid peroxy radicals (Liu et al., 1995; Lynch et al.,1999; Müller et al., 2010). Due to its lipophilic structure vitamin E tends to accumulate in cellularmembranes and fat deposits, where it exerts its scavenger function (Thakur and Srivastava, 1996). Inthis study, it was possible to detect and quantify twovitamin E homologues, α- and γ-tocopherol, despitethe existence of eight natural homologues. The presence of vitamin E homologues in meat seems to

be dependent of the animal species and diet, sincethese 2 vitamers E are the only ones commonly detected in beef, veal and reindeer (Sampels et al.,2004; Mestre Prates et al., 2006), although other vitamers E of both tocopherol and tocotrienol familieshave already been detected in the meat of other animals as poultry (Ponte et al., 2008), wild boar(Quaresma et al., 2011) and wild red deer (Quaresmaet al., 2012). The superior α-tocopherol contentsfound in muscle relatively to all other tocopherols andtocotrienols is dependent of α-tocopherol transferprotein (α-TTP), a key-role protein in vitamin Emetabolism present in the liver cells, which has a considerable higher affinity towards α-tocopherolcomparatively to other vitamers E (Decker et al.,2000). Since α-TTP is responsible for vitamin E packing to VLDL proteins, major transporter in theblood stream, α-tocopherol is preferentially distributedthroughout body tissues relatively to other vitamers E.α-Tocopherol is usually, in quantitative terms, the second most important vitamin E homologue in meat.α-Tocopherol has a relevant antioxidant function,which can be classified as complementary antioxidantfunction, since it has the ability to protect against oxy-gen and nitrogen reactive substances (RNS and ROS,respectively), while γ-tocopherol antioxidant protec-tion is limited to ROS (Jiang et al., 2001).

β-Carotene is another important lipid solubleantioxidant that quenches sites localised within thehydrophobic region of biological membranes, con-trasting with the scavenging activity of α-tocopherolclose to the membrane surface (Fukuzawa et al.,1998). Although β-carotene is less reactive than α-tocopherol, both antioxidants exert a co-operativeantioxidant activity at different positions within themembrane (Tsuchihashi et al., 1995; Mortensen andSkibsted, 2000). Moreover, β-carotene is a precursorof retinol (Vitamin A), a critical lipid-soluble vitaminthat is essential for the formation and maintenance ofmany body tissues (Ross, 2010).

Concerning the lipophilic antioxidant moleculesquantified in this study, the α-tocopherol and β-carotene contents in longissimus lumborum musclewere significantly and positively influenced by pasturefinishing and their content was significantly and nega-tively affected by the period length on concentratefeeding, while α-tocopherol contents were not signifi-cantly influenced by the finishing feeding. The resultsobtained in this study on α-tocopherol and β-carotenecontents were in agreement with previous results,which showed that pasture intake promotes anincreased concentration of α-tocopherol and β-carotene in muscle tissues (Yang et al., 1992;Simonne et al., 1996; Yang et al., 2002b; Cerdeno etal., 2006; Descalzo and Sancho, 2008; Dunne et al.,2009; Röhrle et al., 2011).

The total a-tocopherol contents in longissimus lum-borum muscle from PPP group (6.56 mg/g of meat)

161


and from CCC group (1.77 mg/g of meat) is are in therange of values obtained in other studies and reviewedby Daley et al. (2010), 0.75- 2.92 µg/g of muscle ingrain-fed beef and 2.1-7.73 µg/g of muscle in pasture-fed beef. The β-carotene contents in longissimus lum-borum muscle from PPP group (0.07 µg/g of muscle)are below the range of values obtained in other studies(0.74-0.16 µg/g of muscle in pasture-fed beef), whilethe β-carotene contents in longissimus lumborummuscle from the CCC group (0.01 µg/g of muscle) isnear the lower limit previously registered in grain-fedbeef (0.17-0.01 µg/g of muscle) (Daley et al., 2010).

The α-tocopherol and β-carotene contents in longis-simus lumborum muscle from grass-fed beef showedan apparent divergence, with considerable high α-tocopherol and low β-carotene contents. Such diver-gence has already been described by Pellett et al.(1994) and confirmed by Yang et al. (2002a). Highconcentration of α-tocopherol in the diet may interferewith the β-carotene deposition in tissues, such inter-ference may occur at gastrointestinal absorption or tissue deposition (Yang et al., 2002a). A second orcomplementary justification for the relative low β-carotene contents observed in this study in pasture-fed beef is probably a consequence of the low totallipids contents in longissimus lumborum observed inthis experiment by Alfaia et al. (2009). Such sugges-tion is sustained by the difference observed in β-carotene deposition, which is 6.2-10 times higher inintramuscular fat than in muscle tissue (Yang et al.,1992; Yang et al., 2002a).

The inverse association observed between the α-tocopherol levels and the increase of concentratefeeding period is consistent with the higher contentsof α-tocopherol in grass (Weiss, 1998; Fredrikssonand Pickova, 2007), that are 5-10 times higher in greenroughages than in cereals (Geay et al., 2001), and is aconsequence of α-tocopherol depletion that occurs inperiods of absence of α-tocopherol in the diet (Arnoldet al., 1993). Similar inverse association was observedbetween β-carotene contents and the increase of concentrate feeding period, such result is dependent ofβ-carotene higher contents in fresh grass (134-700mg/kg dry matter) (Knight et al., 1996; McDowell,2000; Röhrle et al., 2011) than in cereal-based concentrates (4–63.5 mg/kg dry matter) (Kumar et al.,1995; Coultate, 1996; Knight et al., 1996; Mahal etal., 1998).

In beef, it was established the α-tocopherol contentthat is necessary to delay meat oxidation (3.5 µg/g ofmeat) (Faustman et al., 1989; Mitsumoto et al., 1991).Therefore, animals from the PPP and PPC containedenough α-tocopherol content in longissimus lumbo-rum muscle to retard pigment and lipid oxidations,while animals finished on concentrate feeding for aperiod of 4 or more months, PCC and CCC groups)did not possess the desirable α-tocopherol content.

The comparison of animal groups with different

finishing systems shows that concentrate finishing(CCC) resulted in a lower content of major lipid soluble antioxidants than the other finishing systems.The comparison of pasture finishing group (PPP) withthose groups raised on pasture but finished on concentrate feeding for 2 or 4 month periods (PPC andPCC) showed that inclusion of even a short concen-trate feeding period was associated with the loss of27% (PPC) and 57% (PCC) of the α-tocopherol content and 57% (in PPC) and 86% (PCC) of the β-carotene content.

Previously, Alfaia et al. (2009) showed that the finishing on concentrate feeding was associated with asignificant decrease in the relative content of PUFA 32and 44% of PUFA after 2 and 4 months of concentratefeeding, which was considered a considerable lossregarding beef nutritional value. Beef finishing onconcentrate feeding for 2 and 4 months (PPC andPCC, respectively) was associated with the decline inthe relative content of PUFA and the reduction in bothα-tocopherol and β-carotene contents. Still, the deple-tion in lipid soluble antioxidants occurred faster thanPUFA, resulting in an increased imbalance in the anti-oxidant/pro-oxidant equilibrium. Therefore, beeffinishing on concentrate feeding could be the privi-leged option to adjust beef to sensorial consumer preferences, but this should not be done without theproper supplementation with α-tocopherol, whichshould assure beef antioxidant protection throughoutdisplay.

Acknowledgments

Financial support (Grants AGRO/2003/512 andCIISA2005/76) and laboratory assistance

(Ana Maria Ferreiro, Dra. Cristina Alfaia and Prof.Dr. José Prates) are acknowledged.

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Ovariosalpingohisterectomia em cadelas: comparação entre a técnica detração uterina por via vaginal associada à celiotomia pelo flanco e aabordagem ventral mediana

Ovariohysterectomy in bitches: a comparison between the technique ofuterine traction by vaginal via associated to flank celiotomy with the ventral median approach

Marcelo C. Rodrigues1*, Maria C. O. C. Coelho2, Ana M. Quessada1, Dayanne A. S. D. Lima1,João M. de Sousa1, Cleyton C. D. Carvalho2

1Hospital Veterinário da Universidade Federal do Piauí, Centro de Ciências Agrárias, Campus Universitário, 64.049-550, Teresina, PI, Brasil

2Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil



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Resumo: Em 20 cadelas, distribuídas em dois grupos,descreveu-se uma técnica cirúrgica de ovariosalpingohisterecto-mia (OSH) denominada tracionamento uterino por via vaginal(TUV), a qual foi comparada com a celiotomia retro-umbilical(tradicional) quanto a parâmetros intra e pós-operatórios. A técnica proposta (TUV) apresentou facilidade de remoção dosovários, menor trauma, menos dor e melhor recuperação pós-cirúrgica do que a tradicional, sendo uma alternativa viávelpara a realização de OSH eletiva em cadelas.

Palavras-chave: cão, castração, cirurgia, laparotomia,vagina

Summary: Using 20 bitches divided in two equal groups, a surgical technique of ovariohysterectomy (OH) is described, called vaginal uterine traction (VUT). This procedure is com-pared to a retro-umbilical celiotomy (traditional technique) inrelation to parameters intra and postoperative. The proposedtechnique (VUT) had easy removal of the ovaries, less trauma,less pain and better postoperative recovery than the traditional technique, and is viable for performing elective OHin bitches.

Keywords: dog, castration, surgery, laparotomy, vagina

Introdução

Com o aumento da população animal e a conscien-cialização sobre a necessidade do controle de natali-dade em animais domésticos, a castração de cadelas, éum procedimento justificável e humanitário. Portanto,a ovariosalpingohisterectomia (OSH) é o procedimen-to cirúrgico mais realizado nos serviços de medicina veterinária (Goethem et al., 2006).

A celiotomia retro-umbilical e pelo flanco são asvias de acesso utilizadas para realização de OSH, emcadelas e gatas (Janssens e Janssens, 1991; Coe et al.,2006; Howe, 2006; Stone, 2007), sendo a abordagemna linha média ventral a mais usual (Janssens eJanssens, 1991; Howe, 2006).

A abordagem pelo flanco é uma alternativa, na qualo trauma cirúrgico é menor (McGrath et al., 2004) e os riscos de evisceração reduzidos em relação à abor-dagem pela linha média (Coe et al., 2006). Na práticade pequenos animais, tal abordagem é realizada emgatas e em cadelas pequenas ou de conformação corporal estreita (Howe, 2006).

Atualmente, a laparoscopia, abordagem minima-mente invasiva de acesso à cavidade abdominal(Monnet e Twedt, 2003; Malm et al., 2004), vem ganhando popularidade por apresentar vantagens emcomparação com os procedimentos cirúrgicos tradi-cionais (Silva et al., 2001). Dentre as modalidades deesterilização minimamente invasivas, pode-se citar aOSH vídeo-assistida com único portal (Gower eMayhew, 2008) e por NOTES (cirurgia endoscópicalaparoscópica transluminal por orifícios naturais) hibrida (Brun et al., 2009) ou pura (Silva et al., 2012)

Com a realização da primeira histerectomia videola-paroscópica em mulheres, o interesse pela via vaginalressurgiu dentre as abordagens minimamente invasi-vas (Costa et al., 2003). No entanto, em cadelas, devido às características anatomicas do sistema repro-dutivo, a OSH pela via vaginal apresenta restrições,principalmente pelo espaço operatório limitado(Krakora, 1980; Souza et al., 2012). Entretanto, cirur-gias do tipo NOTES, possibilita OSH vaginal nessaespécie (Brun et al., 2009).

*Correspondência: [email protected] Tel: + (55) 86 8815-9354; Fax: + (55) 86 3215-5537

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Rodrigues MC et al. RPCV (2012) 111 (583-584) 165-172

Em relação à dor na OSH, a reação inflamatória daovariectomia aumenta a liberação de prostaglandinasque estimulam os nociceptores, tornando-a um pro-cedimento doloroso (Teixeira e Figueiró, 2001), ondea manipulação de órgãos abdominais contribui para oincremento da dor durante várias horas após a inter-venção cirúrgica (Mastrocinque e Fantoni, 2001).

A agressão cirúrgica ativa respostas neuronais noci-ceptivas (Mastrocinque e Fantoni, 2001), onde, emáreas não suprimidas pela anestesia geral, os estímu-los aferentes culminam com a produção, pelo córtexda adrenal, do cortisol (Ko et al., 2000), cuja aferiçãoé um parâmetro preciso para avaliar resposta neuro-endócrina ao estresse cirúrgico e tende a aumentar significativamente na dor pós-operatória (Caldeira etal., 2006; Quessada et al., 2009).

Alterações nos parâmetros fisiológicos associadosaos de conduta, também podem ser utilizados paraavaliar dor (Bonafine, 2005). Entretanto, variáveisclínicas relacionadas ao estresse são indicadoresfugazes de dor por sofrerem influencia de diversosfatores (Burrow et al., 2006).

Somando-se as respostas comportamentais, hormo-nais e metabólicas, pode-se obter uma avaliação maisprecisa da dor em diversos períodos do pós-operatório(Robes, 2006).

Novos acessos e novas técnicas visando menos complicações e mais vantagens para o animal e seuproprietário devem ser pesquisados. Em vista disso, opresente trabalho teve como objetivo propor uma técnica cirúrgica menos invasiva para OSH eletiva emcadelas, por meio das vias vaginal e fossas para-lombares, comparando-a com a técnica tradicionalquanto às dificuldades técnicas, complicações, tempotrans-cirúrgico, dor e evolução clínica pós-operatória.

Material e métodos

Em vinte cadelas adultas (2,3 anos ± 1,39), hígidas,de diferentes raças distribuídas ao acaso em dois grupos foram realizadas OSH eletiva. Um grupo foisubmetido à técnica de Tração Uterina por via Vaginal(TUV) e o outro à técnica tradicional por celiotomiaretro umbilical (Stone, 2007).

Foram incluídas no experimento apenas cadelascom resultados normais nos exames: ultra-sonografiaabdominal, hemograma, tempo de sangria, tempo decoagulação, citologia do esfregaço vaginal, dosagensde uréia, de creatinina, de alanina aminotransferase(ALT) e de cortisol sérico.

Foi estabelecido jejum hídrico e alimentar de seis e12 horas, respectivamente. No pré-operatório, reali-zou-se tricotomia perivulvar, perianal e nas fossas paralombares (direita e esquerda) no grupo TUV e noabdômen no grupo tradicional. Foi administradacefalotina sódica1 (30 mg/kg, IV), 30 minutos antes daindução anestésica e cloridrato de tramadol2 (2 mg/kg

IM), dez minutos antes da indução.A medicação pré-anestésica foi constituída de

maleato de acepromazina3 (0,1 mg/kg IM), quinzeminutos antes da indução anestésica, a qual foi feitacom propofol4 (4 mg/kg, IV). A manutenção foiinalatória com isoflurano5, em O2 a 100%, em circuitosemi-fechado. No trans-operatório, administrou-seringer lactato (10 ml/kg/h, IV).

No grupo TUV, as cadelas ficaram em decúbito lateral esquerdo, onde, procedeu-se à antissepsiaperivulvar, perianal, do vestíbulo vaginal, vagina e flanco direito com solução de clorexidina 2%6, seguidade cateterização vesical e obliteração do esfincter analcom sutura em "bolsa de fumo" (fio de náilonmonofilamentado nº 2-07). A pele foi incisada (aproxi-madamente 2 cm), no ponto médio entre a asa do ílioe a parte convexa do hipocôndrio em direção obliquaântero-posterior, os músculos (oblíquo externo,oblíquo interno e transverso) foram divulsionados nosentido de suas fibras e o peritoneu foi incisado. Comauxílio de um instrumento denominado "TracionadorUterino" (TU), feito de aço inoxidável, o pedículoovariano foi exteriorizado (Figura 1A). Duas pinçashemostáticas foram colocadas no pedículo ováricodireito, o qual foi transfixado (fio de poliglactina 910nº 2-08) e seccionado (Figura 1B). Os ligamentosredondo e largo do útero foram secionados, a artériauterina foi ligada (Figura 1C) (fio de poliglactina 910nº 2-0), sendo removidos trompa e ovário.

O corno uterino foi reintroduzido na cavidadeabdominal seguido de síntese, da parede abdominal(fio de poliglactina 910 nº 2-0) e da pele (fio de náilonmonofilamentado nº 2-0) com pontos separados simples. Com o animal em decúbito lateral direitoforam feitos os mesmos procedimentos de antissepsia,diérese e hemostasia contralateral. Antes de se fechara cavidade abdominal, o TU foi introduzido no canalvaginal (Figura 1D) até o fórnix, alcançando a cavi-dade pélvica e abdominal até a incisão lateral esquerda(Figura 1E). O TU foi exteriorizado na incisão laterale a extremidade do mesmo (gancho), foi introduzidano lúmen do corno uterino pela extremidade livre efixada com cordonete de algodão 0009 (Figura 1F),previamente transpassado no orifício do TU. O con-junto foi tracionado caudalmente na vagina, até a sua

1Cefalotina sódica 1g - AB Farmo Química ltda, São Paulo, SP, Brasil2Tramadon – CRISTÁ LIA – Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda,Itapira, SP, Brasil3Acepran 1% – UNIVET S/A-Ind. Veterinária, São Paulo, SP, Brasil4Propovan - CRISTÁLIA – Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda,Itapira, SP, Brasil5Isoforine – CRISTÁLIA – Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda,Itapira, SP, Brasil6Riohex – Rioquímica Indústria Farmacêutica, Rio de Janeiro, RJ,Brasil7Mononáilon – BRASUTURE Ind. Com. Imp. e Exp. Ltda, Rio deJaneiro, RJ, Brasil8Vicryl – ETHICON Inc – Johnson & Johnson Industrial Ltda, SãoPaulo, SP, Brasil9Algodão Extra Forte 000 – J&P COATS – Coats Industrial S/A, SãoPaulo, SP, Brasil

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A B

C D

E

G H

F

Figura 1 - Ovariosalpingohisterectomia em cadelas. (A) Exteriorização do pedículo ovariano, com tracionador; (B) Secção do pedículo; (C)

Ligadura da artéria uterina; (D) Tracionador introduzido no canal vaginal; (E) Tracionador na incisão da fossa paralombar; (F) Corno uterino

ligado ao tracionador; (G) Exteriorização dos cornos e colo uterino na vulva. Tracionador ligado ao corno uterino (seta); (H) Ligadura trans-

fixante no corpo uterino.

168


exteriorização juntamente com o corpo uterino ecorno contralateral (Figura 1G). O útero foi ligadocom sutura transfixante (fio de poliglactina 910 nº 2-0) (Figura 1H) e seccionado. O coto uterino, coma cérvix preservada foi recolocado na cavidade pélvica. A parede abdominal foi fechada como noantímero direito. Ao término da cirurgia foi retirada asutura do ânus.

Os animais do segundo grupo foram submetidos àtécnica tradicional (Stone, 2007), sendo todos os pro-cedimentos cirúrgicos realizados pelo mesmocirurgião.

A avaliação clínica pós-operatória foi realizadadiariamente por dois avaliadores, no turno matutino,por um período de 30 minutos, sendo que nasprimeiras 48 horas os animais permaneceram em canise nos cinco dias subseqüentes em seus domicílios. Emcada grupo foram feitas 70 observações durante ossete dias de pós-operatório (PO).

Os níveis de cortisol (eletroquimioluminescência)foram mensurados em oito momentos: M0: basal; M1: 10 minutos após MPA; M2: tração do pedículoovariano direito; M3: tração uterina; M4, M5, M6 eM7 uma, 12, 24 e 48 horas de PO respectivamente.

O tempo cirúrgico foi mensurado desde a incisãocutânea até a dermorrafia.

A dor PO foi avaliada por meio de alterações comportamentais, fisiológicas e complicações no sítiocirúrgico (Malm et al., 2005), durante sete dias. Foramadotados dois escores, sendo que o primeiro variou de0 a 20 (alterações comportamentais e fisiológicas) e ooutro de 0 a 5 (complicações) (Malm et al., 2005).

O escore total (soma dos escores 1 e 2), demonstrouo grau de recuperação frente aos procedimentos cirúr-gicos. A variação foi de zero a 25 pontos, sendo zerorecuperação total (ausência de dor e de complicações)e 25, o grau máximo de dor e de complicações.

A comparação da evolução clínica das feridas ope-ratórias foi realizada pelo teste exato de Fisher. Para avariável tempo aplicou-se o teste "t-student". Os dadosdo cortisol foram analisados por análise de variância.Para comparação entre médias dos momentos, apli-cou-se o teste de Scott-Knott, e para comparação entregrupos em cada momento, aplicou-se o teste F deanálise de variância. Foi aplicado teste exato de Fisherpara as variáveis dicotômicas, teste de qui-quadradopara as variáveis policotômicas e teste de Kruskal-Wallis para os escores 1, 2 e total. Diferenças foramconsideradas significativas quando P<0,05.

Resultados e discussão

A ovariectomia pelo flanco no grupo TUV foinecessária devido à posição anatômica dos ovários e omaior volume ovárico em relação ao diâmetro da lesãono fundo de saco vaginal, causada pelo tracionador,dificultando a remoção das gônadas pela vagina. Na

técnica de NOTES pura, a quantidade de tecido adiposo em torno da bolsa ovárica de cadelas podedificultar a exteriorização dos ovários, aumentando orisco de ruptura do corno uterino ou a perda de tecidoovárico dentro da cavidade abdominal (Silva et al.,2012).

Não foram observados sinais de lesões visceraise/ou vasculares no grupo TUV. A extremidade rombado tracionador contribuiu para que não ocorressemlesões viscerais e complicações significativas, fatospassíveis de ocorrência em vacas submetidas àovariectomia por via vaginal (Silva et al., 2004).

A ruptura do corno uterino esquerdo (ligado ao tracionador) durante a tração no canal vaginal em umacadela do grupo TUV foi uma complicação específicada técnica, devido a não liberação do ligamento redondo do corno uterino contralateral e foi corrigidacom ampliação da incisão do flanco. Embora seja considerada rara, a ruptura uterina pode ter origemiatrogênica (Stone, 2007).

A inadequada pressão da sutura no complexo arterio-venoso ovárico, contribuiu para ocorrência dehemorragia no pedículo ovariano direito em duascadelas do grupo tradicional, a qual foi corrigida comalongamento da ferida cirúrgica. Ligadura colocadamuito perto de uma pinça impede a compactação totaldo tecido (Tobias, 2010) e a pressão inadequada,mesmo em suturas por transfixação, não previnehemorragias (Goethem et al., 2006).

Nas cadelas do grupo TUV, foi observada discretadescarga vaginal sanguinolenta autolimitante, no PO,em decorrência da incisão no fórnix vaginal feita como tracionador uterino e em razão da ligadura, do corpouterino, ter sido realizada cranialmente à ferida vagi-nal. O mesmo foi observado em cadelas submetidas àOSH por NOTES híbrida (Brun et al., 2009), NOTESpura (Silva et al., 2012) e em biopsia hepática endos-cópica transvaginal (Souza et al., 2012).

Embora o tempo trans-cirúrgico médio da técnicaTUV (37,0 ± 3,14 min.) tenha sido maior que na tradi-cional (34,30 ± 3,12 min.), não houve diferençaestatística entre os grupos e a experiência do cirurgiãopode reduzir o tempo de procedimento (Figura 2). Emestudo comparativo do tempo para realização de OSH

Figura 2 - Tempo cirúrgico (min), de cadelas submetidas à ovarios-alpingohisterectomia pela técnica de tracionamento uterino por viavaginal e celiotomia retro umbilical

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eletiva em cadelas a técnica que demandou maistempo foi a tradicional em comparação com a abor-dagem pelo flanco (Verma et al., 2004).

O cortisol sérico não apresentou diferença significa-tiva entre os grupos. No entanto, ao serem considera-dos os momentos de cada técnica e os momentos entreas técnicas cirúrgicas, foram observadas diferençassignificativas (P<0,05). Esta interação revela que oefeito das técnicas sobre o nível de cortisol não foramcoincidentes ao longo dos momentos estudados.

O cortisol sérico basal (M0) estava levemente acimados limites para cães (Kerr, 2003), em ambos os grupos(Tabela 1), demonstrando que o maneio do animalinfluenciou na elevação desta hormona. Provavel-mente, tal resultado se deve à resposta neuroendócrinaao estresse, pois a ansiedade e o medo em relação aomaneio e a preparação do animal provocam aumentodas catecolaminas (Fox et al., 1994) e conseqüente-mente do cortisol.

No M1 (10 minutos após a medicação pré-anestési-ca), o cortisol sérico ficou acima dos valores de refe-rência no grupo TUV (Tabela 1). Tal fato deve-se,provavelmente, a resposta neuroendócrina ao estressecausado pelo maneio mais intenso dos animais dogrupo TUV no momento da tricotomia dos flancos eda região perivulvar/perianal. Implicações adversasdevido ao efeito bifásico das fenotiazinas podem terocorrido (Massone, 2008). O maneio do paciente pro-duz uma típica resposta ao estresse com alteraçõeshormonais e metabólicas (Fox et al., 1994; Guimarãeset al., 2007).

No momento da tração do ovário direito (M2), osníveis de cortisol do grupo tradicional, aumentaramem relação aos valores de referência e aos valores dogrupo TUV (Tabela 1). As pequenas incisões, o menortrauma tissular, a menor tração no pedículo ovárico ea menor manipulação dos tecidos e órgãos abdomi-nais, podem ter determinado valores menores nogrupo TUV em relação ao grupo tradicional. Emcirurgias abdominais, onde a manipulação dos tecidose órgãos é maior, a elevação do cortisol é esperada,além do que, o menor tempo de manipulação dopedículo (Malm et al., 2005) e a melhor exposiçãoovárica na abordagem pelo flanco (Janssens eJanssens, 1991), contribuíram para tal resposta dogrupo TUV.

Em ambos os grupos, o cortisol sérico esteve acimados valores de referência no M3 (tração uterina)(Tabela 1). Esse achado pode estar relacionado com os estímulos nociceptivos decorrentes da tração e liga-dura dos pedículos ováricos e das manobras para exteriorização do útero. Tração e ligadura dos pedícu-los ováricos provocam estímulos nociceptivos elevan-do o cortisol até após o término do procedimentocirúrgico (Fox et al., 1998; Ko et al., 2000; Malm etal., 2005; Quessada et al., 2009).

Uma hora após o término da cirurgia (M4) obser-vou-se um aumento significativo do cortisol sérico,

em ambos os grupos (Tabela 1). Tal elevação,provavelmente se deve à resposta sensorial (inclusiveestímulos nociceptivos) e, uma vez recobrada a consciência (recuperação anestésica), o aumento docortisol deu-se pela combinação de efeitos residuaisde tais estímulos com o retorno da resposta cognitivado animal (Fox et al., 1998).

O cortisol normalizou 12 horas após o término dacirurgia (M5) no grupo TUV e a partir das 24 horas doPO (M6) no grupo tradicional (Tabela 1). Nestegrupo, os efeitos residuais da maior tração nos pedículos ováricos, associada à maior manipulaçãotissular e visceral em relação ao outro grupo, justifi-cam os níveis de cortisol elevados no M5. Embora ador pós-cirúrgica seja previsível, a OSH é estressantee causa mudanças comportamentais por pelo menos24 horas após a cirurgia (Hardie et al., 1997), estandoas concentrações de cortisol normalizadas em até 24horas após a intervenção, com ou sem analgesia (Foxet al., 1998; Malm et al., 2005).

O aumento do cortisol durante o trans e PO imedia-to, apesar do uso do tramadol, sugere que o fármaconão suprimiu a resposta à nocicepção, provavelmentepor se encontrar no período de latência (Caldeira etal., 2006), que é em torno de 20-30 minutos(Massone, 2008). Além disso estímulos não álgicosdurante a anestesia passam a se comportar como estí-mulos de dor, e inibir a resposta neuroendócrina apósseu desencadeamento é difícil (Lacerda e Nunes,2008).

Tabela 1 - Valores médios e erros padrão (em µg/dL*) do corti-sol sérico de cadelas submetidas à ovariosalpingohisterectomiapor Tracionamento Uterino por via Vaginal (TUV) e CeliotomiaRetro Umbilical (CRU) nos diferentes momentos avaliados

MOMENTOS TUV CRU

M0 5,57±1,48 Ac 5,61±1,54 Ac

M1 6,87±1,34 Ac 5,33±1,44 Ac

M2 4,06±0,86 Ac 7,40±1,52 Ac

M3 10,27±1,26 Ab 10,95±1,45 Ab

M4 12,25±1,59 Ba 15,93±1,51 Aa

M5 3,96±0,82 Ac 6,72±1,54 Ac

M6 3,72±0,67 Ac 5,28±1,25 Ac

M7 3,61±0,73 Ac 4,45±1,10 Ac

M0: basal; M1: 10 minutos após a medicação preanestésica; M2:tração do pedículo ovariano direito; M3: tração uterina; M4, M5, M6 eM7 uma, 12, 24 e 48 horas de pós-operatório respectivamente.Letras maiúsculas iguais, na horizontal, não diferem entre si pelo testeF a 5% de probabilidade.*Valores de referência para a espécie canina 0,5 a 5,5 µg/dL (Kerr,2003)

Alterações nos parâmetros comportamentais e fisio-lógicos não foram significativamente diferentes entreos grupos. A subjetividade dos avaliadores frente apouca confiabilidade nas variáveis clinicas e compor-tamentais na análise de dor (Lascelles et al., 1998),possivelmente contribuiu para tal achado.

Todos os animais submetidos ao TUV locomove-ram-se espontaneamente a partir do primeiro dia do

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PO. Na abordagem tradicional, um animal não apre-sentou locomoção espontânea nos dois primeiros dias,possivelmente em razão da maior amplitude da lesãocirúrgica e da maior manipulação visceral (Mathews,2000), para correção da hemorragia no pedículo ovárico, o que acarretou na relutância do animal em selocomover (Smith et al., 1996; Bonafine, 2005).

A tentativa de interferência nos ferimentos cirúrgi-cos apresentou diferença estatística significante(P<0,05) entre os grupos, e foi mais evidente nos animais do grupo tradicional em relação aos animaisdo grupo TUV (Figura 3). Tal comportamento podeestar relacionado com maior lesão tecidual e maiortrauma causado em nociceptores da pele e tecido subcutâneo na celiotomia.

Quando as reações do animal à palpação foramavaliadas por dia, observou-se diferença significativaentre os grupos, no primeiro e no terceiro dias (Figura4 e 5), demonstrando que as cadelas do grupo TUVapresentaram menor reação ao desconforto nessesdias. O menor desconforto do grupo TUV, no primeirodia, possivelmente está relacionado com menoresefeitos residuais de estímulos nociceptivos (Fox et al.,1998). O maior estímulo nociceptivo, promovidopelos mediadores inflamatórios da fase intervalar dacicatrização (Hedlund, 2008), devido ao maior trauma,provavelmente justificam o maior desconforto no terceiro dia nas cadelas da abordagem tradicional.

Na análise individual de cada grupo, verificou-seque a descrição "sem reação", esteve presente em 60%dos animais a partir do primeiro dia de observação eem 100% a partir do sexto dia no grupo TUV. Nogrupo tradicional, tal descrição foi observada em 10%das cadelas no primeiro dia e em 90% das mesmas atéo sétimo dia de observação. As descrições "levedesconforto" e "desconforto" foram observadas até oquinto e quarto dias, respectivamente no grupo TUV,enquanto que no grupo tradicional, a situação "levedesconforto" esteve presente em 10% dos animais nosétimo dia e a manifestação de "desconforto" foi maisevidente no primeiro dia (60%), com um decréscimo

gradativo até o quinto dia. No item comportamental"reação agressiva", nenhum animal do grupo TUVapresentou tal conduta. No entanto, no grupo tradi-cional, 10% dos animais manifestaram tal reação noterceiro dia. (Figuras 4 e 5). As diferenças comporta-mentais de cada animal e/ou a não uniformização dapressão sobre o campo cirurgiado, entre os avaliadores(Alves et al., 2001; Burrow et al., 2006), pode terinfluenciado na intensidade dos escores da "reação doanimal à palpação da área operada".

A intensidade do escore de "tensão abdominal" foidiferente significativamente entre os grupos. Oaumento da tensão abdominal teve 22,86% de ocor-rência ao longo dos sete dias nos animais submetidosà técnica TUV e em 60% nas cadelas submetidas a técnica tradicional. A maior manipulação tecidual compossível irritação da serosa, na abordagem tradicional,associada a diferenças comportamentais entre animaise a hiperalgesia da OSH podem desencadear posturase reações anormais (Alves et al., 2001; Robes, 2006).

Os animais da técnica tradicional demonstrarammaior grau de desconforto (estaticamente significativo)do que os animais do outro grupo. Provavelmente istoestá relacionado com a extensão e tipo de tecido comprometido, grau de inflamação existente e carac-terísticas individuais (Otero e Jacomet, 2005).

Figura 3 - Interferência dos animais, nos ferimentos cirúrgicosexternos durante o pós operatório, após ovariosalpingohisterectomiapor Tração Uterina por via Vaginal (TUV) e Celiotomia RetroUmbilical (CRU)

Figura 4 - Reação do animal à palpação da área operada durante opós-operatório em cadelas submetidas a ovariosalpingohisterectomiapor Tração Uterina por via Vaginal

Figura 5 - Reação do animal à palpação da área operada durante opós-operatório em cadelas submetidas a ovariosalpingohisterectomiapor Celiotomia Retro Umbilical

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Embora, os parâmetros fisiológicos relacionadoscom fatores estressantes sejam indicadores fugazes dedor (Burrow et al., 2006), tais variáveis podem ser utilizadas para avaliar e classificar o desconforto deacordo com o escore proposto. Estes parâmetros fisiológicos no transcorrer dos sete dias de PO nãoapresentaram diferença estatística significante entre astécnicas, apesar da técnica TUV, no geral, ter resultadoem menor desconforto.

Em ambos os grupos, o desconforto foi mais evidente no primeiro dia de PO, com diminuiçãogradativa até o sétimo dia. As primeiras horas do POcoincidem com o período de maior dor, e esta tende adesaparecer à medida que as horas e dias passam(Otero e Jacomet, 2005; Quessada et al., 2009), e a dorpós-operatória provocada pela OSH manifesta-se comuma intensidade leve a moderada em razão de fatorescomo duração e extensão da cirurgia, grau de manipu-lação das vísceras, idade e escore corporal do animal(Mathews, 2000).

Apesar dos parâmetros fisiológicos e das compli-cações relacionadas com sítio cirúrgico (escore 2) não terem apresentado significância estatística, nodecorrer dos sete dias de PO, o escore total (escore 1 +escore 2) apresentou diferença significativa entre astécnicas, demonstrando que a abordagem por TUV teveum grau de recuperação PO melhor que a abordagemtradicional em OSH eletiva de cadelas (Figura 6). Ospacientes submetidos a procedimentos realizados pororifícios naturais estão sujeitos a uma menor agressão,o que acarretaria em menor dor pós-operatória e recu-peração mais rápida (Claus et al., 2011).

Conclusões

A técnica de Tração Uterina por via Vaginal é umaalternativa para realizar OSH eletiva em cadelas, comsegurança e eficiência, mostrando-se menos invasiva emenos dolorosa do que a abordagem tradicional. Noentanto novos estudos podem aperfeiçoar tal técnica,disponibilizando-a como uma opção a ser utilizada na

rotina veterinária, quando o acesso aos meioslaparoscópicos não forem possíveis.

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Figura 6 - Grau de recuperação (escore total) de cadelas submeti-das a ovariosalpingohisterectomia por Tração Uterina por viaVaginal e Celiotomia Retro Umbilical em sete dias de observaçãopós cirúrgica

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Substituição do fosfato bicálcico pelo fosfato monoamônio em dietas defrangos de corte

Substitution of dicalcium phosphate by monoammonium phosphate inbroiler diets

Daniel S. Araújo*, Evandro A. Fernandes, Naiara S. Fagundes

Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de UberlândiaAv. Pará, 1720 / Campus Umuarama – Bloco 2T, Uberlândia, MG, Brasil,

CEP 38.400-902



173

Resumo: O fósforo de origem vegetal é insuficiente para supriras exigências nutricionais dos animais, sendo necessária asuplementação com fontes inorgânicas como o fosfato bicálcicoe monoamônio. Avaliou-se o desempenho produtivo de frangosde corte alimentados com rações com diferentes níveis de subs-tituição do fosfato bicálcico pelo fosfato monoamônio. Foramalojados 1280 pintos de um dia de idade, sendo o consumo deração, peso vivo, conversão alimentar real e tradicional e viabi-lidade, avaliados aos sete, 21 e 42 dias de idade. O desempenhodos frangos de corte não foi afetado pela substituição do fosfatobicálcico pelo fosfato monoamônio em nenhuma das idadesestudadas. Conclui-se que o fosfato bicálcico pode ser substi-tuído parcial ou totalmente pelo fosfato monoamônio, semalterar o desempenho de frangos de corte.

Palavras-chave: fontes de fósforo, desempenho, avicultura

Summary: Vegetal phosphorus is insufficient to supply thenutritional requirements of animals, needing supplementationwith inorganic sources such as dicalcium and monoammoniumphosphate. This study evaluated the performance of broilers fedwith diets containing different levels of substitution of the dicalcium phosphate by the monoammonium phosphate. Onethousand two hundred and eighty one-day-old chicks werehoused and feed intake, live weight, real and commercial feedconversion and viability were obtained at seven, 21 and 42 days.Broiler performance was not affected by substitution of dicalcium phosphate by monoammonium phosphate in anystudied ages. Dicalcium phosphate can be partial or totally substituted by monoammonium phosphate without alter broilerperformance.

Keywords: phosphorus sources, performance, poultry

Introdução

A expansão e consolidação do complexo avícolanacional são explicadas pelos avanços tecnológicosnas áreas de genética e de nutrição, bem como nomanejo, na sanidade e na utilização de equipamentos

que possibilitam uma atividade industrial em grandeescala. Várias pesquisas têm sido desenvolvidas paradeterminar as exigências nutricionais das aves emdiferentes idades, sexo e linhagens, com objetivo de seobter alimentação de menor custo, que permita o máximo aproveitamento do potencial genético da ave.

É necessário atentar à relação custo-benefício que aalimentação proporciona, pois, 75% ou mais do custode produção, é referente à alimentação (Bernardes,2004; Alves et al., 2005). Entre os minerais exigidospelas aves, o fósforo e o cálcio são os mais impor-tantes, por serem necessários não apenas para a ótimataxa de crescimento, mas também para a mineraliza-ção óssea. O fósforo participa nos processos metabóli-cos e de absorção de nutrientes, além de ser o mineralque mais onera os custos das rações, sendo indicadocomo o terceiro nutriente mais caro em uma raçãopara monogástricos, ficando atrás somente da energiae da proteína (Bolling et al., 2000).

Segundo Dale (1992), como as dietas das aves sãobaseadas em ingredientes de origem vegetal, princi-palmente o milho e o farelo de soja, cerca de 30% a33% de seus conteúdos em fósforo estão disponíveisàs aves, enquanto que 67% a 70% estão na forma defitato, que é indisponível à atividade disgestiva, dasaves. Assim, o fósforo de origem vegetal é insuficientepara suprir suas exigências nutricionais, sendonecessária a suplementação com fontes de fósforoinorgânico, tais como fosfato bicálcico (18,5% de fós-foro) e fosfato monoamônico (21% de fósforo) (Limaet al., 1999).

O fósforo vem sendo estudado não somente pela suaimportância econômica, mas também devido a suaimportância ambiental, visto que o fósforo ingerido enão aproveitado pelo animal possui potencial poluidordo solo, lençóis freático e águas de superfície (Gebleret al., 2012), sendo importante o uso de fonte de fós-foro de alta biodisponibilidade. O fosfato bicálcicopossui 18,5% de fósforo total e é considerado o valor

*Correspondência: *[email protected]: +(55) 34 3226 3803

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Araújo DS et al. RPCV (2012) 111 (583-584) 173-176

de referencia como 100% de disponibilidade, enquan-to o fosfato monoamônio possui 24% de fósforo comcoeficiente de disponibilidade de 108% (Rostagno etal., 2005).

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desem-penho zootécnico de frangos de corte alimentadoscom dietas com diferentes níveis de substituição dofosfato bicálcico pelo fostato monoamônio.

Material e métodos

O experimento foi realizado na GranjaExperimental de Frangos de Corte localizada naFazenda do Glória da Universidade Federal deUberlândia, Uberlândia/MG. As aves foram criadasem um galpão (pavilhão) de alvenaria e estruturametálica, com cobertura de telha de fibrocimento, pisoconcretado e paredes teladas. O galpão é composto deboxes telados (150 x 190 cm) equipados combebedouro infantil automático, bebedouro pendular ecomedouro tubular. O ambiente no interior do galpãofoi controlado por campânulas a gás, sendo uma paracada quatro boxes, aspersores de teto, ventiladores e

central eletrônica de monitoramento de ambiente. Aforração do teto e as cortinas laterais são de polieti-leno. Todos esses recursos internos permitiramfornecer conforto ambiental às aves do alojamento aofinal do experimento.

Foram utilizadas 1280 aves, macho e fêmea (50:50),da linhagem comercial Cobb, encontradas no mercadobrasileiro1, criadas até os 42 dias de idade. O experi-mento foi conduzido em um delineamento inteira-mente causalizado, composto de cinco tratamentoscom diferentes níveis de inclusão de fosfato bicálcicoe fostato monoamônio. Cada tratamento possui oitorepetições com 32 aves cada. As aves foram distribuí-das por box de acordo com os tratamentos: FB (100%fosfato bicálcico), MAP25 (25% fosfato monoamônio+ 75% fosfato bicálcico), MAP50 (50% fosfatomonoamônio + 50% fosfato bicálcico), MAP75 (75%fosfato monoamônio + 25% fosfato bicálcico) eMAP100 (100% fosfato monoamônio).

1Aves fornecidas pela empresa Granja Planalto Ltda, Uberlândia-MG,Brasil.

Tabela 1 - Níveis nutricionais das rações nas fases pré-inicial, inicial e engorda

Nutrientes Pré-inicial Inicial Engorda

Energia Metabolizavel (Mcal/kg) 2,94 3,10 3,20

Proteína bruta (%) 23,0 21,0 19,0

Cálcio (%) 0,95 0,95 0,88

Fósforo disponível (%) 0,45 0,45 0,42

Metionina disponível (%) 0,62 0,57 0,53

Metionina + Cistina disponível (%) 0,92 0,85 0,79

Lisina disponível (%) 1,30 1,20 1,05

Treonina disponível (%) 0,84 0,78 0,71

Triptofano disponível (%) 0,25 0,22 0,19

Tabela 2 - Composição percentual dos ingredientes das rações de frangos de corte na fase pré-inicial (RPI), inicial (RI) e engorda(RE)

FB MAP25 MAP50 MAP75 MAP100

RPI RI RE RPI RI RE RPI RI EN RPI RI RE RPI RI RE

Milho Grão 56,8 59,6 64,2 56,3 59,2 63,8 55,9 58,7 63,4 55,5 58,3 63,0 55,1 57,9 62,6

Farelo de soja 38,0 33,1 28,0 38,1 33,2 28,1 38,1 33,3 28,2 38,2 33,4 28,3 38,3 33,4 28,3

Óleo degomado 1,20 3,18 3,87 1,35 3,33 4,00 1,49 3,48 4,14 1,63 3,62 4,27 1,78 3,77 4,41

Fosfato bicálcico 1,85 1,89 1,75 1,39 1,41 1,31 0,92 0,94 0,88 0,46 0,47 0,44 0,00 0,00 0,00

Fosf.monoamônio 0,00 0,00 0,00 0,36 0,37 0,34 0,72 0,74 0,69 1,09 1,11 1,03 1,45 1,48 1,37

Calcário 0,92 0,93 0,88 1,22 1,24 1,16 1,52 1,54 1,44 1,81 1,85 1,72 2,11 2,15 2,01

Sal comum 0,45 0,43 0,43 0,45 0,43 0,43 0,45 0,43 0,43 0,45 0,43 0,43 0,45 0,43 0,43

DL-Metionina 0,31 0,29 0,27 0,31 0,28 0,27 0,31 0,29 0,27 0,31 0,29 0,27 0,31 0,29 0,27

L-Lisina 0,25 0,27 0,24 0,24 0,27 0,24 0,24 0,27 0,24 0,24 0,27 0,23 0,24 0,27 0,23

PX-FC 1,2 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

L-Treonina 0,08 0,09 0,09 0,08 0,09 0,09 0,08 0,09 0,09 0,08 0,09 0,09 0,08 0,09 0,09

1MC-Mix Frango inicial/pré-inicial SAA 2kg (®M-Cassab Comércio e Indústria Ltda) – Composição por quilo de ração – Vit-A 11.000UI; D3 2.000UI; E 16mg; Ácido Fólico 400mcg; Pantotenato cálcio 10mg; Biotina 60mcg; Niacina 35mg; Piridoxina 2mg; Riboflavina 4,5mg; Tiamina 1,2mg; B1216mcg; K 1,5mg; Se 250mcg; Colina 249mg; Cu 9mg; Zn 60mg; I 1mg; Fe 30mg; Mn 60mg; Promotor de crescimento 384mg; Coccidicida 375mg;Antioxidante 120mg.2MC-Mix Frango engorda SAA 2kg (®M-Cassab Comércio e Indústria Ltda) – Composição por quilo de ração - Vit-A 9000UI; D3 1600UI; E 14mg;Ácido Fólico 300mcg; Pantotenato cálcio 9mg; Biotina 50mcg; Niacina 30mg; Piridoxina 1,8mg; Riboflavina 4mg; Tiamina 1mg; B12 12mcg; K31,5mg; Se 250mcg; Colina 219mg; Cu 9mg; Zn 60mg; I 1mg; Fe 30mg; Mn 60mg; Promotor de crescimento 385mg; Coccidicida 550mg; Antioxidante120mg.

175


As rações foram formuladas e produzidas à base demilho e farelo de soja para atender os nutrientesdescritos na Tabela 1 e composta de três fases. A com-posição de ingredientes nas fases pré-inicial, inicial,engorda estão descritos na Tabela 2. O manejo dasaves ao longo do experimento seguiu o modelo preconizado pela Granja Experimental de forma agarantir ambiência adequada a cada fase de vida, oferta de água limpa e fresca e ração à vontade.

As aves e as sobras de rações foram pesados comsete, 21 e 42 dias de idade, para determinação do consumo médio de ração, peso vivo médio, conversãoalimentar real (consumo de ração / ganho de peso,incluindo o ganho de peso das aves que morreram noperíodo), conversão alimentar tradicional (consumode ração / peso vivo) e viabilidade.

Os dados produzidos durante o experimento foramestatisticamente avaliados pelo procedimento ANOVAdo Sisvar 4.6 (Ferreira, 2008) e, no caso de diferençassignificativas, as médias foram comparadas pelo testede Tukey a 5% de significância.


Os dados de desempenho de frangos de corte da lin-hagem Cobb, aos sete, 21 e 42 dias de idade, alimen-tados com diferentes concentrações de fosfato bicálci-co e fosfato monoamônio, estão na Tabela 3.

Os diferentes níveis de substituição do fosfato bicál-cico pelo fosfato monoamônio não influenciaram(P>0,05) as variáveis consumo de ração, peso vivo,

conversão alimentar real e tradicional e viabilidadeaos sete dias de idade. Este resultado está de acordocom o encontrado por Borges et al. (1997), que ao uti-lizarem 10 fontes de fósforo diferentes, dentre elasfosfato bicálcico e fosfato monoamônio, não obser-varam diferenças significativas para desempenhozootécnico aos sete dias de idade.

O desempenho dos frangos de corte não foi afetadopela substituição do fosfato bicálcico pelo fosfatomonoamônio, aos 21 dias de idade. O mesmo resulta-do foi encontrado em diversos estudos (Barbosa et al.,1990; Cesar, 1991; Veloso et al., 1991). SegundoDamron e Flunkler (1991), o fosfato monoamônio,pode ser ótima fonte de fósforo para frangos de corteaos 21 dias, quando utilizado via água de bebida.

Aos 42 dias de idade não foi observado diferençasignificativa para o desempenho dos frangos de cortena utilização de fosfato bicálcico e fosfato mono-amônio. Resultados semelhante aos encontrado porVeloso et al. (1996) e Borges et al. (1997) que tambémnão encontraram diferenças para o desempenho.

Segundo Runho et al. (2001), várias pesquisasdemonstraram que não há diferença significativa nopeso vivo, conversão alimentar, consumo de ração eviabilidade com a substituição do fosfato bicálcico poroutras fontes de fósforo mineral, destacando-se o fosfato monoamônio, o que confirma os resultadosobtidos no presente trabalho.

Segundo NRC (1994), quando as exigências nutricionais para frangos de corte não são atendidas,observa-se diminuição no desempenho zootécnico dasaves, piora na conversão alimentar, desenvolvimento

Tabela 3 - Desempenho de frangos de corte da linhagem Cobb aos sete, 21 e 42 dias de idade, para as variáveis consumo de ração(CR), peso vivo (PV), conversão alimentar real (CAr) e tradicional (CAt) e viabilidade V, alimentados com diferentes concentraçõesde fosfato bicálcico e fosfato monoamônio

Variável Tratamentos P valor Erro padrão

FB MAP25 MAP50 MAP75 MAP100

7 Dias

CR (kg) 0,116a 0,115a 0,120a 0,118a 0,122a 0.8279 0,004

PV (kg) 0,175a 0,176a 0,173a 0,176v 0,170a 0,4351 0,097

CAr 0,912a 0,901a 0,953a 0,921a 1,001a 0,5071 0,044

CAt 0,661a 0,656a 0,693a 0,676a 0,718a 0,5603 0,029

V (%) 99,22a 99,19a 99,39a 98,39v 100,00a 0,3584 0,64

21 Dias

CR (kg) 1,053a 1,076a 1,085a 1,079a 1,061a 0,1138 0,009

PV (kg) 0,955a 0,972a 0,974a 0,977a 0,952a 0,1450 0.009

CAr 1,162a 1,164a 1,172a 1,160a 1,175a 0,9084 0,013

CAt 1,103a 1,107a 1,115a 1,105a 1,116a 0,9146 0,012

V (%) 97,67a 97,98a 97,58a 96,37a 100,00a 0,0940 0,89

42 DIias

CR (kg) 4,749a 4,875a 4,820a 4,862a 4,849a 0,4386 0,053

PV (kg) 2,849a 2,923a 2,883a 2,924a 2,927a 0,4357 0,035

CAr 1,628a 1,628a 1,641a 1,614a 1,607a 0,3865 0,013

CAt 1,667a 1,670a 1,694a 1,665a 1,656a 0,2207 0,011

V (%) 90,01a 88,43a 88,20a 88,14a 89,05a 0,6490 0,99

Na mesma linha, médias seguidas de letras diferentes divergem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).

176


anormal como raquitismo entre outros. Os desempenhosdos frangos de corte apresentaram-se estatisticamenteiguais para os diferentes níveis de substituição do fos-fato bicálcico pelo fosfato monoamônio utilizadosneste trabalho, portanto as exigências foram atendidas.

Conclusão

O fosfato monoamônio pode substituir parcial outotalmente o fosfato bicálcico, sem alterar o desem-penho de frangos de corte de um a 42 dias de idade,aumentando assim as opções de ingredientes para aformulação de uma ração de custo mínimo.

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Efeito da inclusão de óleo de linhaça na dieta de codornas macho (Coturnix coturnix coturnix) sobre características seminais e avaliação biométrica dos testículos

Effect of flaxseed oil in the diet of male quail (Coturnix coturnix coturnix)on semen characteristics and biometric evaluation of testicles

Edenilse Gopinger*, Angelina S. F. Borelli, Eduardo G. Xavier, Denise C. Bongalhardo,Nelson J. L. Dionello, Jerri T. Zanusso, Victor F. B. Roll

Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Departamento de Zootecnia, Caixa postal 354, CEP-96001-970 Pelotas, RS, Brasil



177

Resumo: Foi avaliado o efeito da inclusão do óleo de linhaçaem substituição ao óleo de soja, na dieta de codornas (codor-nizes) macho (Coturnix coturnix coturnix) sobre característicasseminais e biometria testicular. Foram testadas cinquenta codornas macho, com 45 dias de idade, alojadas em gaiolasindividuais, recebendo água e ração ad libitum. O delineamentoexperimental foi inteiramente casualizado, sendo cada animaluma unidade experimental, com cinco níveis de óleo de linhaçae dez repetições por tratamento. Após 44 dias recebendo raçãoexperimental, iniciou-se o abate dos animais por deslocamentocrânio-cervical para avaliação biométrica dos testículos e avaliação das características seminais. Os dados foram submeti-dos à análise de regressão polinomial. A substituição do óleo desoja pelo óleo de linhaça nos diferentes níveis testados (0, 25,50, 75, 100%) não influenciou o peso dos testículos e nem asvariáveis biométricas (comprimento e largura) dos testículosdas codornas. Nas avaliações das características seminais, oaumento do percentual de óleo de linhaça na dieta das avesresultou em aumento da motilidade espermática e em melhoresíndices de espermatozoides normais. A concentração esper-mática não foi influenciada pelos níveis de óleo de linhaça.

Palavras-chave: Biometria, características seminais, codornas,codornizes

Summary: A trial was conducted to evaluate the inclusion offlaxseed oil in replacement of soybean oil in male quails diet(Coturnix coturnix coturnix) on their biometric of testicles andsemen characteristics. Fifty male quails (forty-five days old)were individually allotted to cages and had ad libitum access tofeed and water. A completely randomized design was used.Each bird was an experimental unit. Five levels of flaxseed oilwith ten replications (quails) each were studied. After forty-fourdays of trial, quails were slaughtered by skull-cervical extrusiontechnique. Biometric evaluation of testicles and semen charac-teristics was conducted. Data were analyzed through polynomi-al regression. The replacement of soybean oil by flaxseed oil in different levels did not influence either testicles weight orbiometric variables (length and width) of testicles. Increasinglevels of flaxseed oil in the diets increased both sperm motilityand normal spermatozoa rates. Sperm concentration was notinfluenced by flaxseed oil.

Keywords: Biometrics, seminal characteristics, quails

Introdução

Atualmente, as condições mundiais privilegiam asatividades que não necessitem de grandes investimen-tos e mão de obra, que ocupem pouco espaço e, ainda,que forneçam retorno financeiro em curto ou médioprazo (Garcia e Pizzolante, 2004). Nesse contexto, acoturnicultura vem se destacando a cada ano comouma atividade produtiva no mercado agropecuáriobrasileiro.

Dentre outras vantagens na criação, as codornasdestacam-se pela boa conversão alimentar, pelamaturidade sexual precoce, pela alta produtividade,pelos pequenos investimentos iniciais, pelo fácilmanejo e pela resistência às doenças e, principal-mente, pelo rápido retorno financeiro. Além disso,tanto a carne quanto os ovos são excelentes fontes denutrientes (Murakami e Ariki, 1998; Singh e Narayan,2002), como vitamina B6, niacina, B1, B2 e aindagrandes concentrações de ferro, fósforo, zinco e cobre(Ferreira, 2010). Desta forma, as aves podem ser uti-lizadas tanto para a produção de ovos quanto para aprodução de carne.

Os lipídeos são substâncias necessárias para ocrescimento e reprodução das aves de produção.Porém, os não ruminantes são incapazes de sintetizaros ácidos graxos linoléico (C18:2ω-6) e linolênico(C18:3ω-3), que são considerados essenciais e, portanto, devem ser fornecidos via dieta (Dolz, 1996).A fonte vegetal mais conhecida e rica em ômega 3 (ω-3) utilizada na dieta de poedeiras é a linhaça(Linum usitatissimum). A composição dos lipídeos dadieta tem efeito sobre a composição dos lipídeos nostecidos animais (Dalton, 2000), sendo que a sementede linhaça tem sido amplamente utilizada com intuitode modificar a composição lipídica da gema dos ovos(Cherian e Sim, 1991; Aymond e Van Elswyk, 1995). *Correspondência: [email protected]

178

Gopinger E et al. RPCV (2012) 107 (583-584) 177-181

Em muitos casos a dieta também é o principal determinante da composição dos ácidos graxos dosespermatozóides (Surai et al., 2000). Kelso et al.(1997) e Blesbois et al. (1997) afirmam que a manipu-lação da dieta pode ser um meio eficaz de alterar operfil de ácidos graxos dos espermatozóides das aves,melhorando a fertilidade. Segundo Hammerstedt(1993), existe evidência de que a composição de lipídios da membrana do espermatozóide é o maiordeterminante sobre a motilidade, a sensibilidade aocalor e, principalmente, a viabilidade. Bongalhardo et al. (2009) avaliaram os efeitos de diferentes lipídiosdietéticos sobre os espermatozóides de galos e con-cluíram que tanto o óleo de peixe, quanto a semente de linhaça, promoveram uma alteração no perfil deácidos graxos dos espermatozóides.

A fertilidade está correlacionada ao número deespermatozóides funcionais no local de fertilização(Robertson et al., 1997). Por outro lado, a fertilidadese correlaciona com peso dos testículos, pois testículosmaiores apresentam maior capacidade de produção detestosterona e maior e melhor atividade espermática(Amoroso et al., 2008). Neste sentido, Mather eWilson (1964) verificaram que em codornas japonesasos estágios de desenvolvimento testicular estão estrei-tamente correlacionados com o peso testicular. Outrosestudos já foram realizados em codornas com o intentode aumentar o peso dos testículos. Por exemplo,Oliveira et al., (2000) realizaram um estudo histológi-co e morfométrico do testículo de codornas adultassubmetidas a três diferentes níveis de proteína naração (16%, 18%, 20%) e verificaram que os diferentesníveis de proteína não afetaram o peso corporal e opeso absoluto do testículo.

O óleo de linhaça vem sendo estudado em diversaspesquisas com poedeiras e frangos de corte, por serum produto que contém altas proporções de ácidolinolênico e, assim sendo, uma excelente fonte deômega 3 (Zambiasi et al., 2007), enriquecendo os ovose a carne de frango com esse nutriente. Por outro lado,são escassas as informações sobre os efeitos do óleode linhaça sobre as características seminais e o desem-penho de codornas. Por esta razão essa pesquisa teve

como objetivo avaliar o efeito da inclusão do óleo delinhaça, em substituição ao óleo de soja, na dieta decodornas macho, sobre as características seminais, abiometria dos testículos e o desempenho das aves.

Material e métodos

O experimento foi realizado no Laboratório deEnsino e Experimentação Zootécnica ProfessorRenato Rodrigues Peixoto (LEEZO) do Departamentode Zootecnia, da Universidade Federal de Pelotas.Foram utilizadas 50 codornas de corte macho(Coturnix coturnix coturnix) com idade de 45 dias epeso médio de 230 g. As aves foram alojadas em gaiolas individuais, com comedouros individuais tipocalha e bebedouros tipo nipple. A água e a ração farelada foram fornecidas à vontade. Os animais permaneceram em ambiente climatizado, com tempe-ratura controlada de 23 ºC±1. A iluminação foi reali-zada por lâmpadas incandescentes de 60 W e o progra-ma de luz controlado por relógio timer.

As aves foram alimentadas com dietas formuladascom diferentes níveis de óleo de linhaça em substitui-ção ao óleo de soja, constituindo um delineamentoexperimental inteiramente casualizado, com cincotratamentos (T1-0%, T2-25%, T3-50%, T4-75% e T5-100% de óleo de linhaça) e com 10 repetições, sendocada animal uma unidade experimental.

As dietas experimentais foram formuladas de modoa atender às exigências nutricionais das aves, sendoisoenergéticas e isoproteicas, diferindo apenas pelosníveis de inclusão de óleo de linhaça em substituiçãoao de soja (Tabela 1).

As aves foram pesadas individualmente no início doexperimento (45 dias de idade) e a cada sete dias, atécompletarem 89 dias de idade, quando foram abatidas.As aves foram sacrificadas por deslocamento da arti-culação crânio-cervical para realizar a coleta dostestículos e ductos deferentes e para avaliação bio-métrica dos testículos e características seminais.

As avaliações biométricas foram realizadas atravésda pesagem, em balança digital, do testículo direito e

Tabela 1 - Composição das dietas para codornas machos, contendo níveis crescentes de óleo de linhaça

Trat.1 Trat.2 Trat.3 Trat.4 Trat.5

Ingredientes kg % kg % kg % kg % kg %

Milho 13,75 55 13,75 55 13,75 55 13,75 55 13,75 55

F. soja 45% 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8

Premix* 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84

Calcário 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68

Óleo soja 0,665 2,66 0,499 1,996 0,332 1,33 0,166 0,664 - -

Óleo linhaça - - 0,166 0,664 0,332 1,33 0,499 1,996 0,665 2,66

Total 25 100 25 100 25 100 25 100 25 100

*Níveis de garantia por kg do produto: ácido fólico: 16,7mg; ácido pantotênico: 204,6mg; bacitracina de zinco: 600mg; BHT: 700mg; biotina: 1,4mg; cálcio: 197,5mg; cobalto: 5,1mg; cobre: 244mg; colina: 42g; ferro: 1695mg; flúor (máximo): 400mg; fósforo: 50g; iodo: 29mg; manganês: 1485mg;metionina: 11g; niacina: 840mg; selênio: 3,2mg; sódio: 36g; vitamina A: 207000UI; vitamina B1: 40mg; vitamina B12: 430mcg; vitamina B2: 120mg;vitamina B6: 54mg; vitamina D3: 43200UI; vitamina E: 540mg; vitamina K3: 51,5mg; zinco: 1535mg

179


esquerdo, separadamente, e das medições de largura ecomprimento realizadas com o auxílio de uma régua.

Para as avaliações das características seminais,primeiro procedeu-se a retirada do sêmen dos ductosdeferentes em uma placa de Petry, com o auxílio deuma lâmina de bisturi (lado não cortante). Após, 5 µLde sêmen foram retirados da placa, colocados sobreuma lâmina de vidro e misturados com 10 µL de clore-to de sódio 0,9% (NaCl); foi colocada uma lamínulasobre a lâmina e a motilidade do sêmen foi avaliadaem microscópio óptico com aumento de 40 vezes,atribuindo valores de 0 a 100% para essa caracterís-tica. O teste de motilidade foi realizado em duplicata,sempre pelo mesmo indivíduo. Para a análise da morfologia, foram colocados 5 µL de sêmen em umalâmina de vidro e adicionados 5 µL do corante eosina-nigrosina, sendo feita uma extensão do sêmen na lâmina. Após a secagem da amostra, a lâmina foiavaliada em microscópio óptico, no aumento de 40vezes. Foram contados cem espermatozóides, catego-rizados entre normais ou com defeito, e o valor foiexpresso em porcentagem de espermatozóides normais. Na análise da concentração espermática, 2 µL de sêmen foram misturados com 2 mL de citratode sódio 2,9%, homogeneizados e a solução levada aoespectrofotômetro para leitura da densidade ótica eposterior conversão para número de espermato-zoides/mL de sêmen.

Os dados de características seminais e avaliaçõesbiométricas foram submetidos à análise de regressãopolinomial com nível de significância de 5%. Osdados de motilidade e morfologia não apresentaramdistribuição normal e foram transformados (transfor-mação angular), antes de serem submetidos à análisede regressão.


A análise de regressão revelou que para as variáveismotilidade e a morfologia espermática, a análise deregressão linear permitiu verificar que existe associa-ção positiva significativa (P<0,05) entre os níveis deinclusão de óleo de linhaça e essas característicasseminais. O aumento dos níveis de óleo de linhaça na

dieta provoca um aumento na motilidade dos esper-matozoides e no número de espermatozoides normais.Porém, a concentração espermática não foi influencia-da pelos níveis de óleo de linhaça presentes nas dietas(Tabela 2).

Estudos realizados por Al-Daraji et al. (2010), testando óleo de girassol, óleo de linhaça, óleo demilho e óleo de peixe sobre as características de fertilidade de codornas machos, concluíram que osanimais alimentados com óleo de peixe e óleo de linhaça também obtiveram melhores índices de moti-lidade e morfologia, além de maior concentraçãoespermática.

A melhora na motilidade pode ser explicada pelofato de que os ácidos graxos do óleo de linhaça(ômega 3) são mais insaturados do que os ácidos graxos do óleo de soja (ômega 6). Esses ácidos graxos fornecidos pela dieta ao animal são incorpora-dos às membranas dos espermatozoides, mudandoassim seu perfil lipídico. Segundo Bongalhardo et al.(2009), a cauda do espermatozoide é a região que pos-sui maior quantidade de ácidos graxos poliinsaturadosda série 3, e uma maior incorporação desses ácidos,provenientes da dieta, pode ter promovido uma maiormotilidade.

Na análise das variáveis morfométricas, não foramencontradas associações significativas entre os níveisde inclusão de óleo de linhaça com o peso, o compri-mento e a largura dos testículos (Tabela 3). A avaliação do peso dos testículos foi feita com intuitode estimar indiretamente a capacidade reprodutiva dasaves, uma vez que testículos maiores apresentammaior capacidade de produção de testosterona e melhor atividade espermática (Amoroso et al., 2008).Hala (2011) verificou que ratos alimentados durante 4semanas com óleo de linhaça ficaram protegidos contra lesões induzidas por valproato de sódio,aumentando o peso de testículos comparados ao controle. Entretanto, no presente trabalho, as dosesestudadas de óleo de linhaça não foram capazes dealterar as medidas biométricas do testículo.

Um efeito que pode influenciar o peso dos testículosé a estação do ano. Artoni et al., (1999) analisaram ahistologia do testículo de codornas japonesas adultas everificaram uma evidente variação no peso testicular,

Tabela 2 - Motilidade, morfologia e concentração espermática no sêmen de codornas machos submetidas a dietas com diferen-tesníveis de óleo de linhaça

OL (%) MO (%) MF (%) CO (x109 esp/ml)

0 67,5 95,4 1,28

25 77,0 95,9 1,38

50 79,0 96,5 1,36

75 79,0 96,5 1,29

100 84,0 97,5 1,48

P 0,0157 0,0387 0,5411

CV (%) 36,00 32,65 38,08

OL: Óleo de linhaça; MO: Motilidade (%); MF: Morfologia (%); CO: concentração espermática (x109 esp/ml); p: nível de significância a 5% pela equação de regressão simples ajustada; motilidade = 0,56-0,00173x; morfologia = 0,21302-0,0005192x; CV: coeficiente de variação (%).

180


no diâmetro dos túbulos seminíferos, na espessura ena composição do epitélio germinativo, sendo que omaior peso testicular foi detectado no final do outonoe no verão (períodos de dias longos). O peso testicularalcançou valor máximo em setembro (período de diascurtos), quando a atividade espermatogênica é muitoimportante.

Como podem ser observadas na Tabela 3, as carac-terísticas biométricas mostram que os testículosesquerdos apresentam-se maiores do que os direitos,independente do tratamento. Amoroso et al. (2008)confirmam que a forma dos testículos é análoga.Sendo assim, nas aves o testículo esquerdo é maior doque o direito. Em codornas, o peso dos testículosequivale a 2,26% do seu peso vivo.

Conclusão

A substituição do óleo de soja pelo óleo de linhaçana dieta não influencia o desempenho zootécnico, nemo peso, o comprimento e a largura dos testículos emcodornas machos. O aumento do teor de óleo de linha-ça na dieta das aves resulta em aumento da motilidadeespermática e no número de espermatozoides normais,sem alterar a concentração espermática.

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Tabela 3 - Biometria dos testículos de codornas machos alimentadas com óleo de linhaça

OL (%) PTD PTE CTD CTE LTD LTE

0 2,85 3,90 2,55 2,53 1,70 1,72

25 2,50 2,88 2,77 2,45 1,45 1,67

50 2,75 3,55 2,51 2,46 1,51 1,72

75 2,75 3,35 2,80 2,68 1,58 1,72

100 2,70 3,40 2,64 2,54 1,63 1,73

P* 0,38 0,51 0,58 0,41 0,92 0,74

CV (%) 25,39 26,61 12,38 11,44 11,13 10,40

OL: óleo de linhaça; PTD: peso testículo direito (g) ; PTE: peso testículo esquerdo (g) ; CTD: comprimento testículo direito (cm); CTE: comprimen-to testículo esquerdo (cm); LTD: largura testículo direito (cm); LTE: largura testículo esquerdo (cm). P*:nível de significância a 5% pela equação deregressão simples ajustada; CV: coeficiente de variação (%)

181


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Parâmetros fisiológicos e eletrocardiográficos em cães com pressãointracraniana aumentada, submetidos a diferentes frações inspiradas deoxigênio durante anestesia com propofol

Physiologic and electrocardiographic parameters in dogs with increasedintracranial pressure, submitted to different inspired oxygen fractions during propofol anesthesia

Emilio de A. Belmonte, Newton Nunes*, Patricia C. F. Lopes, Glaucia B. P. Neto,Ana L. G. de Souza, Luis G. G. G. Dias, Ricardo M. de Almeida

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) – UNESP



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Resumo: Avaliaram-se os efeitos do emprego de frações inspiradas de oxigênio (FiO2) de 1 e 0,6 sobre variáveis eletro-cardiográficas e fisiológicas em cães com pressão intracraniana(PIC) aumentada e anestesiados com propofol. Foram utilizados8 animais, submetidos a dois procedimentos anestésicos, dife-renciados pela FiO2 fornecida, originando assim dois gruposdenominados G100 (FiO2=1) e G60 (FiO2=0,6). Após induçãoanestésica com propofol (10 mg/kg), iniciou-se a infusão contínua do fármaco (0,6 mg/kg/min) e a ventilação controlada.Decorridos 20 minutos da implantação do cateter de fibra óptica do monitor de pressão intracraniana na superfície do córtex cerebral direito, interrompeu-se o fluxo sanguíneo daveia jugular direita para produzir o aumento da PIC e, após 20minutos (M0), mensurou-se a PIC, pressão de perfusão cerebral(PPC), variáveis eletrocardiográficas e fisiológicas. As demaiscolheitas dos dados foram realizadas em intervalos de 15 minu-tos, por um período de 60 minutos (M15, M30, M45 e M60). Osdados numéricos obtidos foram submetidos à Análise de Perfil(P<0,05). Para todos os parâmetros estudados não foram registradas diferenças entre os grupos, permitindo concluir queas variáveis eletrocardiográficas e fisiológicas estudadas nãosão afetadas pelo emprego de diferentes FiO2 em cães com PICaumentada.

Palavras-chave: cães, frações inspiradas de oxigênio, pressãointracraniana, propofol

Summary: The effects of different inspired oxygen fractions(FiO2) of 1 and 0.6 on eletrocardiographic and physiologicparameters in dogs with elevated intracranial pressure (ICP),anesthetized with propofol were evaluated. Eight adult mongreldogs underwent two anesthetic protocols. In each protocol thepatient was submitted to two different FiO2, resulting in twogroups: G100 (FiO2=1) and G60 (FiO2=0.6). Propofol was usedfor induction (10 mg/kg), followed by its continuous infusion(0.6 mg/kg/min.) and mechanical ventilation on controlled pressure mode. A fiber optic catheter was implanted on the surface of the right cerebral cortex for the assessment of

intracranial pressure, and after 20 minutes, the blood flow ofright jugular vein was interrupted in order to increase ICP. Theinitial measurement (M0) of ICP, cerebral perfusion pressure(CPP), physiologic and electrocardiographic variables wererecorded twenty minutes after the obliteration of the jugularvein. Additional recordings were performed at 15-minute intervals during 60 minutes (M15, M30, M45 and M60).Numeric data were submitted to Morrison’s multivariate statis-tical methods (P<0.05). No significant differences wereobserved between the two group experimental protocols on allevaluated parameters. These results suggest that different FiO2

does not impair physiologic and electrocardiographic parame-ters in dogs with increased ICP.

Keywords: dogs, intracranial pressure, oxygen inspired frac-tion, propofol

Introdução

Atualmente, na Medicina Veterinária, são cada vezmais comuns as lesões cranioencefálicas ligeiras ougraves, que necessitam de procedimento anestésicocom protocolo adequado e monitorização mais apro-fundada.

Neste âmbito, a pressão intracraniana (PIC) é umdos principais parâmetros a ser avaliado, e que quandoelevada, pode causar a morte cerebral. Além disso,aumentos exacerbados da PIC estão correlacionadoscom lesões focais no miocárdio e, conseqüentemente,com disfunção cardíaca. Alguns dos danos envolvem ahemorragia petequial no subendocárdio e bandas contráteis, além de miocitólise coagulativa (Kolin eNorris, 1984; Shivalkar et al., 1993).

Em situações de PIC elevada, tanto em cães (Smithe Ray, 1972) como em humanos (Póvoa et al., 2003),estão descritas alterações eletrocardiográficas, taiscomo o aumento do intervalo Q-T, o infra ou supra-

*Correspondência: [email protected]: +(55) 16 3209-2626.

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desnivelamento do segmento S-T, oscilações da freqüência cardíaca (FC), batimentos ectópicos(Smith e Ray, 1972; Póvoa et al., 2003) e onda T cerebral (Póvoa et al., 2003). Em alguns casos, também estão reportadas a taquicardia sinusal e asextrasístoles ventriculares, quando na presença de umestado hiperdinâmico, com excesso de catecolaminascirculantes, as quais promovem alterações de perfusãodo miocárdio, causando isquemia, danos estruturais eaparecimento de transtornos eletrocardiográficos(Shivalkar et al., 1993).

Nos indivíduos com traumatismo cerebral, énecessária frequentemente a intervenção cirúrgica ouindução do coma, sendo os agentes anestésicosinjetáveis como o propofol e os barbitúricos ampla-mente utilizados nessas situações (Johnston et al.,2003). Em cães com evidência de aumento de PIC,Armitage-Chan et al. (2007) sugerem a utilização dopropofol ou do tiopental para a indução e manutençãoda anestesia. Paula et al. (2010) concluíram que ainfusão contínua de propofol (0,8 mg/kg/min) mantéma perfusão cerebral e a autorregulação cerebral emcães normocapneicos.

Durantes esses procedimentos anestésicos a atençãoà ventilação e conseqüente oxigenação do paciente éde extrema importância, pois prejuízos na troca gasosadurante a anestesia podem decorrer da formação deáreas de atelectasia (Strandberg et al., 1986), as quaisestão diretamente relacionadas com a utilização defrações inspiradas de oxigênio (FiO2) elevadas (Lopese Nunes, 2010).

As alterações respiratórias resultantes desse colapsopulmonar podem proporcionar modificações no sistema cardiovascular. A hipercapnia aguda, porexemplo, está relacionada com o aparecimento dearritmias cardíacas e vasodilatação periférica (Ward etal., 2006), parecendo este quadro não ter efeitosinotrópicos e lusitrópicos adversos na função cardíaca.As altas concentrações de dióxido de carbono pro-movem alterações na repolarização, as quais sãorefletidas no aumento da dispersão da onda QT (Kielyet al., 1996). Outra possível alteração respiratória oriunda da atelectasia é a diminuição significativa dapressão parcial de oxigênio no sangue arterial (PaO2)ou hipoxemia (Lopes e Nunes, 2010), que tambémpode originar arritmias cardíacas e vasoconstriçãohipóxica dos vasos pulmonares (Ward et al., 2006), eem caso de hipoxia do miocárdio é possível observaro supra ou infradesnivelamento do segmento ST(Goodwin, 2002).

Porém, em Medicina Veterinária o emprego de FiO2 = 1,0 é freqüente. Lopes et al. (2007) concluíramque o fornecimento de oxigênio a 100%, 80% e 21%deve ser evitado em cães anestesiados com propofol(0,7 mg/kg/min) e mantidos em ventilação espontâ-nea, não sendo observadas alterações nos parâmetroseletrocardiográficos e fisiológicos (Lopes et al.,2008).

Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, estudar os efeitos da administração de diferentes FiO2

sobre os parâmetros fisiológicos e eletrocardiográficosem cães com PIC aumentada, submetidos à infusãocontínua de propofol e mantidos em ventilação con-trolada.

Material e métodos

Foram utilizados oito1 cães adultos, quatro machos equatro fêmeas, sem raça definida, excluindo-sefêmeas prenhas ou em estro, pesando 10,1 ± 2,0 kg,considerados hígidos após exames físico e comple-mentares, dentre os quais hematológico, eletrocardio-gráfico, ecocardiográfico e urianálise. Radiografiastorácicas também foram realizadas, a fim de descartarafecções pulmonares. Os animais foram mantidos emcanis individuais e receberam ração comercial e águaad libitum.

Formaram-se dois grupos (n=8) diferenciados entresi pela fração inspirada de oxigênio fornecida a cadaum, os quais foram denominados: G100 (FiO2 = 1) eG60 (FiO2 = 0,6). Os animais foram submetidos a doisprocedimentos com intervalo de vinte e um dias entreeles.

Antes da anestesia, os cães foram submetidos àrestrição alimentar e hídrica de 12 e duas horas respec-tivamente e adicionalmente realizou-se o exameeletrocardiográfico para a determinação dos valoresbasais.

Os animais foram induzidos à anestesia geral pelaadministração intravenosa de propofol2 na dose de 10mg/kg. Os cães, após serem colocados em decúbitolateral esquerdo sobre colchão térmico ativo3, foramintubados com sonda de Magill, de diâmetro adequadoao porte de cada animal, a qual foi acoplada ao apa-relho de anestesia inalatória com circuito anestésicotipo "semi-fechado"4 equipado com ventiladorvolumétrico/pressométrico5, instalado em linha com ofiltro valvular, fornecendo-se as diferentes FiO2 deter-minadas para cada grupo, controlando-se a mistura degases por meio de analisador de gases6 sendo que ofluxo total foi mantido entre 30 e 50 mL/kg/min.

Instituiu-se então a ventilação mecânica controlada,ajustando-se a freqüência respiratória, volume corrente e pressão inspiratória máxima de 20 cmH2Ode forma a se obter valores de pressão de dióxido decarbono ao final da expiração (ETCO2) constantes

1Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética e Bem-Estar Animalda unidade, protocolo n. 003933-07.2Fresofol 1%, Fresenius Kabi Brasil Ltda, Campinas – SP, Brasil.3GAYMAR – mod. TP-500 – Londres, Inglaterra – Processo FAPESP98/03153-04OHMEDA - mod. Excel 210SE – Processo FAPESP 97/10668 - 45OHMEDA - mod. 7900 – processo FAPESP 97/10668 - 46DIXTAL, mod. DX2010 LCD, Dixtal, Manaus – AM, Brasil (ProcessoFAPESP 02/04625-0).

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entre 35 e 45 mmHg, aferidos em monitor de mecâni-ca respiratória7, cujo sensor foi posicionado naextremidade distal da sonda orotraqueal. A saturaçãode oxihemoglobina (SpO2) foi obtida por leitura diretano mesmo, sendo o sensor conectado na língua do animal.

Concomitantemente, iniciou-se a infusão contínuade propofol, por meio de bomba de infusão8, empre-gando-se a taxa de 0,6 mg/kg/min. A seguir procedeu--se a cateterização transcutânea da artéria metatársica9

para o monitoramento das pressões arteriais média(PAM), sistólica (PAS) e diastólica (PAD). Ao cateterfoi conectada uma torneira de três vias que foi acopla-da ao canal de pressão arterial invasiva do monitormultiparamétrico10, enquanto para o registro da tem-peratura corpórea (TC), o sensor de temperatura foiintroduzido no esôfago e posicionado próximo à basecardíaca.

Em seguida implantou-se cirurgicamente um cateterde fibra óptica11, na superfície do córtex cerebral direito, usando-se "kit"12 de acesso, segundo técnicadescrita por Rezende (2004). Desta forma, foram registrados os valores de temperatura intracraniana(TIC), PIC e realizado cálculo da pressão de perfusãocerebral (PPC) por meio da fórmula PPC = PAM - PIC.

Decorridos 20 minutos da implantação do cateter dePIC, induziu-se o aumento da pressão intracranianapela obliteração da veia jugular. Para tal, a veia jugu-lar direita foi exposta e submetida a uma ligadura temporária com dois fios de algodão, posicionados auma distância de três centímetros um do outro, permitindo a interrupção do fluxo sanguíneo, baseadona técnica descrita por Wu et al. (2005) para coelhos eem estudos piloto. Com isso objetivou-se alcançar valores de PIC acima dos 15 mmHg, já que númerosmenores a esse são considerados normais segundoJohnston et al. (1991) e Plochl et al. (1998).

As variáveis eletrocardiográficas avaliadas foram: afreqüência cardíaca (FC), calculada a partir do registrodo intervalo R-R; a duração e a amplitude da onda P(Ps e PmV, respectivamente); o intervalo entre asondas P e R (PR); a duração do complexo QRS(QRS); a amplitude da onda R (RmV) e o intervaloentre as ondas Q e T (QT). Os parâmetros foram obti-dos por eletrocardiograma (ECG) em derivação DII,com emprego de eletrocardiógrafo computadorizado13.

A mensuração dos parâmetros teve início decorridosvinte minutos da obliteração da veia jugular (M0) erepetiu-se a cada 15 minutos (M15, M30, M45 eM60), totalizando 60 minutos de avaliação. Também,foram observados o ritmo e a presença de batimentosde origem não-sinusal entre os momentos. As variáveisforam submetidas à Análise de Perfil (Morrison, 1967;Curi, 1980) considerando P<0,05.


No presente estudo recorreu-se à ventilação mecâni-ca controlada com o objetivo de manter os cães emnormocapnia (Tabela 1) minimizando, dessa forma,possíveis alterações nas concentrações sanguíneas dedióxido e carbono (CO2), que poderiam influenciardiretamente a PIC e a PPC. Este aspecto torna-se relevante na medida em que a hipercapnia pode preju-dicar a auto-regulação cerebral (McCulloch et al.,2000) e aumentar a PIC, enquanto a hipocapnia podereduzir a PIC (Shenkin e Bouzarth, 1970) e diminuir ovolume sanguíneo cerebral (Smith et al., 1970).

Antes da interrupção do fluxo sangüíneo da veiajugular, obtiveram-se as médias de PIC para G100 de15 ± 5 mmHg e para G60 de 13 ± 4 mmHg, estandoambos dentro dos valores fisiológicos segundoJohnston et al. (1991) e Plochl et al. (1998). Vinteminutos após a interrupção do fluxo sangüíneo da veiajugular direita (M0), os valores de PIC aumentaram46,67% no G100 e 38,46% no G60, mantendo-se inalterados nos momentos seguintes de avaliação(Tabela 1). Dessa forma, é possível afirmar que osanimais apresentaram PIC elevada (Johnston et al.,1991; Plochl et al., 1998) e a metodologia propostapermitiu atingir o objetivo. Segundo Wu et al. (2005),a obliteração da veia jugular direita induz aumento daPIC temporária sem produzir sequelas neurológicas, oque também foi verificado neste estudo. Bagley(1996), ao estudar cães com diversas lesões cerebrais,registou valores entre 30 e 40 mmHg; contudo os animais não apresentaram sequelas após o restabeleci-mento da PIC aos valores normais, tal como constatadono trabalho que apresentamos, onde não se registraramalterações nos cães após o retorno da PIC às médiasiniciais.

Em relação à PPC, os valores considerados normaisencontram-se ente os 50 e 150 mmHg (Steiner eAndrews, 2006). Portanto, neste estudo, a PPC manteve-se dentro da normalidade (Tabela 1). Destemodo, a sustentabilidade dos valores das variáveisintracranianas PIC e PPC observada ao longo do pro-tocolo experimental (Tabela 1), estão de acordo com odescrito previamente por Paula et al. (2010), queobtiveram resultados semelhantes em cães submetidosà infusão contínua de propofol (0,6 mg/kg/min) emantidos em ventilação controlada com FiO2 = 1,0. Osnossos resultados demonstram assim, que a variação

7Monitor DIXTAL DX8.100, Dixtal, Manaus, AM, Brasil (ProcessoFAPESP 03/11125-7).8Bomba de Seringa AS50 – SAMTRONIC, São Paulo, SP, Brasil.9Catéter Insyte – BD Insyte – Becton Dickinson Indústria Cirúrgica,Juiz de Fora, MG, Brasil.10Dixtal, mod. DX-2010LCD, módulo de PA invasiva, Manaus, AM,Brasil (Processo FAPESP 02/04625-011Monitor de temperatura e pressão intracraniana, Mod.110-4BT,Integra Neurocare Camino Labs, San Diego, CA, EUA. (ProcessoFAPESP 00/01084-3)12Kit de acesso cranial Mod.5H-ITH-2, Integra Neurocare CaminoLabs, San Diego, CA, EUA (Processo FAPESP 00/01084-3)13TEB – mod. ECGPC – Software versão 1.10 – São Paulo, SP, Brasil(Processo FAPESP 96/1151-5).

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das concentrações de oxigênio administradas nãoinfluencia os valores de PIC e PPC.

A análise das temperaturas intracraniana e corpóreademonstrou estabilidade das médias desses parâmetros(Tabela 1), provavelmente devido ao emprego decolchão térmico ativo. Num estudo recente (Paula etal., 2010) observou-se que a TIC e a TC se mantiveramconstantes em cães anestesiados com propofol, bemcomo uma correlação estreita entre essas variáveis(TIC 0,1 a 0,2 °C acima da TC), sendo tal evento umindicativo do correto posicionamento do sensor intra-parenquimal de PIC. Contrariamente, no presente tra-balho, observou-se uma correlação entre a TIC e TC(Tabela 1), mas com os valores de TIC inferiores aosvalores de TC em 0,1 a 0,2 ºC.

Sabe-se que a TC ente os 25-26 ºC pode cursar comalterações eletrocardiográficas, tais como prolonga-mento do intervalo PR e do complexo QRS, aumentodo automatismo do miocárdio, entre outras alteraçõesfisiológicas (Haskins, 2007). A estabilidade da TCdescarta a possibilidade deste parâmetro poder inter-ferir nos parâmetros eletrocardiográficos, pois asmédias obtidas durante todo protocolo experimental(Tabela 1) não foram menores que 36 ºC.

A oxigenação arterial pode ser expressa tanto pelaPaO2 como pela SpO2 (Wilson, 2004), sendo que esteúltimo parâmetro indica a capacidade do pulmão emfornecer oxigênio ao sangue (Haskins, 2001) e não aquantidade do gás disponível para os tecidos(O’Flaherty, 1994). Os valores considerados fisiológi-cos para Guyton e Hall (1997) estão entre 92 e 99%.Assim, neste estudo, as médias de SpO2 (Tabela 1)estiveram dentro desse intervalo em ambos os grupos,indicando uma boa oxigenação arterial. Esses achadoscorroboram os dados obtidos por Lopes et al. (2008),em cães anestesiados com propofol (0,7 mg/Kg/min.)e mantidos em ventilação espontânea com diferentesFiO2. Esses autores registraram valores de SpO2 entre97 e 98% para animais respirando FiO2 = 0,6 e de 97%com FiO2 = 1,0.

O aumento súbito de PIC pode desencadear altera-ções nas pressões arteriais (PA). Tal evento foi obser-vado por Shivalkar et al. (1993) em cães, quando aPIC alcançou valores maiores ou iguais a PAM, o quenão foi observado neste estudo. Além disso, consta-tou-se a estabilidade da PAS, PAD e PAM (Tabela 1),não sendo registadas diferenças significativas entre osgrupos. Portanto, pode-se afirmar que as FiO2 empre-gadas não influenciaram esses parâmetros, corrobo-rando Lopes et al. (2008), que em seu estudo com cãessubmetidos à infusão contínua de propofol, mantidosem ventilação espontânea, observaram estabilidade daPAM, com o emprego de diferentes concentrações deoxigênio (100%, 80%, 60%, 40% e 21%).

Relativamente aos parâmetros eletrocardiográficos,Lopes et al. (2008) verificaram que o emprego dediferentes FiO2 não promoveu alterações importantesna condutibilidade cardíaca sugestiva de arritmias ou

mesmo hipóxia do miocárdio, fato esse tambémobservado no estudo aqui apresentado. Ferro et al.(2005) também não registraram alterações eletrocar-diográficas em cães anestesiados com diferentes dosesde propofol (0,2; 0,4 ou 0,8 mg/kg/min) e respirandoespontaneamente ar ambiente (FiO2 = 0,21).

A FC não variou de forma significativa ente os doisgrupos, tendo-se mantido constante ao longo de todoo período de avaliação (Tabela 1) e dentro da normal-idade para a espécie (70 – 160 bpm) (Tilley e Burtnick1999), donde se conclui que o emprego de diferentesFiO2 não influenciou esse parâmetro. Lopes et al.(2008) também não observaram diferenças para FCem cães recebendo FiO2 = 1,0 e FiO2 = 0,6. Smith eRay (1972) observaram alterações da FC quando aPIC atingiu valores entre 50% e 70% da PAS. Nesseestudo, no entanto, o aumento da PIC proporcionadonão influenciou a FC, pois a pressão intracraniana cor-respondeu a 17,39 ± 0,64% da PAS no G100 e a 13,02± 0,39% da PAS no G60.

A condução elétrica atrial, avaliada pela duração eamplitude da onda P (Ps e PmV, respectivamente) nãofoi afetada pelo emprego de diferentes FiO2, o queindica não terem ocorrido alterações volumétricas ouda condutância elétrica nas cavidades atriais, coin-cidindo com os achados de Lopes et al. (2008). Emcães não anestesiados, os valores de PmV não podemultrapassar 0,4 mV e os de Ps não podem ser maioresque 0,04 s ou 40 ms (Tilley e Burtnick 1999;Goodwin, 2002). Diante disso, verifica-se que os valores de PmV obtidos em G100 e G60 estão dentroda normalidade para espécie, enquanto as médias dePs estão aumentadas. Lopes et al. (2008) registrarammédias de Ps elevadas e atribuíram tal ocorrência àinfusão contínua de propofol (0,7 mg/kg/min).

O tempo de despolarização átrio-ventricular traduzi-do pelo intervalo P-R considerado normal para cães éde 0,06 a 0,13 segundos (60 a 130 ms) (Tilley eBurtnick, 1999; Goodwin, 2002). Neste estudo, foipossível constatar estabilidade desse parâmetro permitindo afirmar que as diferentes FiO2 não interfe-riram no tempo de condução elétrica átrio-ventricular.Em cães anestesiados pelo propofol e mantidos emventilação espontânea com diferentes concentraçõesde oxigênio, Lopes et al. (2008) obtiveram os mesmosachados para PR, registrando médias de 82 a 95 mseg.

Para o QRS, que representa o tempo de conduçãoelétrica ventricular, as diferentes FiO2 não promoveramalterações (Tabela 1), pois foi possível verificar esta-bilidade desse parâmetro durante todo protocoloexperimental. Segundo Tilley e Burtnick (1999), oQRS não pode ultrapassar 0,06 s (60 ms) em cães, por-tanto as médias registradas para G100 e G60 estãodentro da normalidade para espécie. Novamente, taisachados coincidem com os relatos de Lopes et al.(2008), que embora tenham mantido a respiraçãoespontânea e utilizado uma dose maior de propofol,obtiveram valores (de 50 a 53 mseg) semelhantes aos

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Tabela 1 - Valores médios e desvios-padrão de PIC, PPC, TIC, parâmetros fisiológicos e eletrocardiográficos emcães com pressão intracraniana aumentada, submetidos à infusão contínua de propofol e mantidos em ventilaçãocontrolada com frações inspiradas de oxigênio de 1,0 ou 0,6

Parâmetro Grupos Momento

Basal M0 M15 M30 M45 M60

PIC G100 - 22 ± 6 21 ± 6 22 ± 7 22 ± 7 23 ± 8

(mmHg) G60 - 18 ± 5 19 ± 6 18 ± 4 17 ± 5 18 ± 6

PPC G100 - 79 ± 8 74 ± 11 72 ± 11 71 ± 12 74 ± 12

(mmHg) G60 - 87 ± 21 85 ± 19 86 ± 20 84 ± 20 83 ± 21

TIC G100 - 37,3 ± 0,6 37,2 ± 0,6 37,0 ± 0,6 36,9 ± 0,6 36,8 ± 0,6

(°C) G60 - 37,3 ± 0,8 37,1 ± 0,9 36,9 ± 0,8 36,8 ± 0,8 36,8 ± 0,8

TC G100 - 37,4 ± 0,5 37,4 ± 0,6 37,2 ± 0,6 37,1 ± 0,5 36,9 ± 0,6

(°C) G60 - 37,3 ± 0,7 37,2 ± 1,0 37,1 ± 0,9 36,9 ± 0,8 36,8 ± 0,8

ETCO2 G100 - 38 ± 2 38 ± 2 38 ± 2 37 ± 3 38 ± 2

(mmHg) G60 - 37 ± 2 37 ± 3 37 ± 3 37 ± 3 36 ± 2

SpO2 G100 - 97 ± 2 97 ± 2 98 ± 0 98 ± 0 97 ± 1

(%) G60 - 97 ± 1 97 ± 1 97 ± 1 97 ± 1 97 ± 1

PAM G100 - 101± 8 96 ± 10 95 ± 10 92 ± 10 97 ± 9

(mmHg) G60 - 105 ± 19 104 ± 17 104 ± 17 101 ±18 101 ± 18

PAS G100 - 131 ± 16 127 ± 16 126 ± 22 121 ± 19 128 ± 16

(mmHg) G60 - 140 ± 29 140 ± 25 138 ± 26 137 ± 27 136 ± 27

PAD G100 - 83 ± 6 78 ± 10 79 ± 9 76 ± 8 79 ± 9

(mmHg) G60 - 86 ± 16 85 ± 14 82 ± 18 82 ± 15 83 ± 13

FC G100 109 ± 24 135 ± 27 137 ± 27 130 ± 26 131 ± 21 136 ± 21

(bat/min.) G60 109 ± 24 144 ± 35 139 ± 33 137 ± 33 137 ± 33 140 ± 26

Ps G100 42 ± 7 47 ± 4 46 ± 5 48 ± 5 48 ± 5 47 ± 5

(mseg.) G60 42 ± 7 48 ± 3 45 ± 4 47 ± 3 47 ± 3 46 ± 2

PmV G100 0,14±0,05 0,23±0,06 0,22±0,07 0,24±0,05 0,23±0,06 0,22±0,04

(mV) G60 0,14±0,05 0,26±0,07 0,25±0,07 0,26±0,06 0,26±0,07 0,24±0,06

PR G100 94 ± 14 80 ± 7 80 ± 9 82 ± 10 82 ± 9 82 ± 9

(mseg.) G60 94 ± 14 82 ± 8 83 ± 9 84 ± 10 83 ± 8 82 ± 5

QRS G100 53 ± 6 55 ± 8 53 ± 7 53 ± 6 53 ± 5 52 ± 6

(mseg.) G60 53 ± 6 52 ± 7 51 ± 6 50 ± 6 51 ± 5 50 ± 5

QT G100 196 ± 23 206 ± 25 206 ± 24 210 ± 26 209 ± 20 205 ± 19

(mseg.) G60 196 ± 23 200 ± 19 206 ± 28 203 ± 23 205 ± 29 204 ± 23

RmV G100 1,06±0,59 1,24±0,60 1,25±0,51 1,20±0,54 1,24±0,56 1,15±0,58

(mV) G60 1,07±0,59 1,24±0,65 1,25±0,63 1,27±0,66 1,26±0,66 1,18±0,54

Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si pela Análise de Perfil (P <0,05). Médias seguidas por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pela Análise de Perfil (P <0,05).PIC: pressão intracranina, PPC: pressão de perfusão cerebral, TIC: temperatura intracranina, TC: temperatura corpórea, ETCO2: pressão de dióxidode carbono ao final da expiração, SpO2: saturação de oxihemoglobina, PAM: pressão arterial média, PAS: pressão arterial sistólica, PAD: pressãoarterial diastólica, FC: freqüência cardíaca, Ps: duração da onda P, PmV: amplitude da onda P, PR: intervalo entre as ondas P e R, QRS: duração docomplexo QRS, RmV amplitude da onda R, QT: intervalo entre as ondas Q e T (QT). G100: ventilados com FiO2 = 1,0; G60: ventilados com FiO2 = 0,6.

proposto para a FC, o emprego de diferentes FiO2 nãopromoveu alterações no intervalo QT, coincidindocom os dados obtidos por Lopes et al. (2008). A alteração do intervalo QT é um achado referido porSmith e Ray (1972), em cães com aumento de PIC,devido à assincronia nas taxas de repolarização doscardiomiócitos ventriculares. Todavia nesse estudonão se constatou tal evento, diferindo do estudo deSmith e Ray (1972), provavelmente devido aos valoresde PIC registrados terem sido menores que os obser-vados pelos autores supracitados.

A intensidade do impulso elétrico necessário para adespolarização ventricular, representada pela variável

registados neste estudo e, também, observaram que asdiferentes concentrações de O2 não interferiram noQRS.

O intervalo QT representa a sístole ventricular e aatividade do sistema nervoso autônomo sobre ocronotropismo cardíaco, sendo este, inversamente pro-porcional à FC (Tilley, 1992). Neste estudo, não foramregistradas alterações no intervalo QT, estando estedentro do intervalo (150-250 ms) estabelecido porTilley e Burtnick (1999). A estabilidade de QT, emG100 e G60, pode ser justificada pela inalterabilidadeda FC, já que tais parâmetros são inversamente pro-porcionais (Hutchisson et al., 1999). Portanto, como

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RmV (Fox et al., 1999), a partir de M0, manteve-sedentro do intervalo de 1,20 a 1,38 mV descrito porWolf et al. (2000), caracterizando assim a manutençãoda impedância da musculatura cardíaca normal(Santos et al., 2004). Com a igualdade entre os gruposobservada, também é possível afirmar que as diferentesFiO2 empregadas não alteraram esta variável.

Conclui-se que o aumento da pressão intracraniananão proporcionou alterações nos parâmetros eletrocar-diográficos. Além disso, em cães normocapneicoscom pressão intracraniana aumentada, submetidos ainfusão contínua de propofol (0,6 mg/kg/min) e man-tidos em ventilação controlada, o emprego de FiO2 =1,0 ou FiO2 = 0,6 não interfere nas variáveis fisioló-gicas e eletrocardiográficas.

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RPCV (2012) 107 (583-584) 191-198

Avaliação da expressão de fHER2 em tumores mamários felinos e sua correlação com variáveis clinicopatológicas

Evaluation of fHER2 expression in feline mammary tumors and its correlation with clinicopathological features

Maria Soares1, Jorge Correia2, Sandra Carvalho2, Fernando Ferreira1*

1CIISA, Departamento de Morfologia e Função, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL, Lisboa, Portugal2CIISA, Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL, Lisboa, Portugal



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Resumo: O recetor para o fator de crescimento epidérmicohumano de tipo II (HER2) é uma glicoproteína com reconheci-da importância no cancro da mama na mulher, que condicionao prognóstico e tratamento de um subtipo de tumor mamário,designado por HER2 positivo (HER2+), e cujo papel começa aser investigado em oncologia felina.Com o objetivo de otimizar a imunodeteção desta proteína emtumores mamários felinos (TMF), verificar a incidência destesubtipo de tumores em gatas e estudar a hipótese desta espécieser considerada como um modelo em oncologia comparadaforam utilizados trinta casos de TMF, sujeitos a dezasseis proto-colos de imunohistoquímica diferentes, com variações na recu-peração antigénica e no anticorpo utilizado.Os resultados obtidos mostraram diferenças na deteção da proteína fHER-2 em função do protocolo utilizado. Não foiencontrada qualquer marcação com os anticorpos SP3 e oTAB250 e o protocolo mais adequado na deteção dos TMF-fHER2+ foi o que associou um maior tempo de recuperaçãoantigénica (banho-maria a 95 ºC, 60 minutos) ao anticorpoA0485. Não foram encontradas associações entre os TMF-fHER2+ e as características avaliadas (classificação histopa-tológica do tumor, grau de malignidade, índice de Ki-67, tama-nho do tumor, presença de metástases regionais e idade da gataao diagnóstico), o que é semelhante ao descrito na mulher. As semelhanças encontradas com a mulher para este subtipo detumor mamário, a par da elevada incidência de TMF-fHER2+(33,3%) permitem consolidar a gata como um importante modelo em oncologia mamária comparada, abrindo novas perspetivas no diagnóstico e tratamento dos TMF.

Summary: The Human Epidermal Growth Factor Receptortype 2 (HER2) is a protein with known importance in womenbreast cancer, which determines the prognosis and treatment ofa unique molecular breast cancer subtypes (HER2+) and its roleis starting to be investigated in feline oncology. The aim of the study was to optimize the immunodetection ofHER2 in feline mammary tumors (FMT), evaluate the incidenceof this subtype of tumor and determine the possibility of thisspecie being considered as a model for comparative oncology.For that, thirty samples of FMT were used and submitted to sixteen different immunohistochemical protocols, with differentantigen retrieval methods and different antibodies.The results showed differences in protein immunodetection,

depending on the protocol used. Thus, there was no stainingwith SP3 and TAB250 (anti-HER2 antibodies) and the best pro-tocol for detection of FMT-fHER2+ was the one that conjugatesthe longer antigen retrieval method (water bath at 95 ºC for 60minutes) with the A0485 antibody. No associations were foundbetween FMT-fHER2+ and the characteristics considered(histopathological classification, grade of malignancy, Ki-67index, tumor size, presence of regional metastases and age atdiagnosis), which is similar to what is described in woman.Therefore, the similarities found in this subtype of tumorbetween the two species, together with the high incidence ofFMT-fHER2+ (33.3% of positive cases) allow the consolidationof cat as an important species in comparative oncology andopens new perspectives in the diagnosis of FMT.

Introdução

Os tumores mamários felinos (TMF) são a terceiraneoplasia mais frequente, logo atrás das neoplasiashematopoiéticas e da pele, representando cerca de17% dos tumores nesta espécie. Ao contrário dostumores mamários da cadela, na gata, estes tumoressão, maioritariamente, malignos (85%) apresentandoum prognóstico bastante reservado e um tempo médiode sobrevida muito reduzido - 8 a 12 meses (Lana et al., 2007). Ao exame histopatológico, os TMF apresentam, normalmente, invasão linfática e sãogeralmente classificados como carcinomas, sendo osmais comuns, os de tipo: cribriforme, tubular, tubulo-papilífero e sólido (Lana et al., 2007; Ordás et al.,2007; Burrai et al., 2010; Rasotto et al., 2011).

Nas duas últimas décadas, a oncologia humanadesenvolveu grandes esforços para encontrar a atualclassificação molecular dos tumores mamários. A tipificação molecular é realizada por rotina queratravés de técnicas de imunohistoquímica (IHC) querpor técnicas de hibridação in situ fluorescentes ou cro-mogénicas (FISH - Fluorescence In Situ Hybridizationou CISH - Chromogenic In Situ Hybridization) muitopadronizadas e que mostram benefícios relevantessobretudo na selecção de terapêuticas específicas que

*Correspondência: [email protected]: + (351) 213652800; Fax: + (351) 213652810

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Soares M et al. RPCV (2012) 107 (583-584) 191-198

têm vindo a aumentar o tempo de vida e o períodolivre de doença das pacientes (Stebbing et al., 2000;Gancberg et al., 2002; Bilous et al., 2003; Sáez et al.,2006; Wolff et al., 2007). Um dos marcadores obriga-toriamente analisado é o recetor para o fator de cresci-mento epidérmico humano de tipo II (HumanEpidermal Growth Factor Receptor-2, HER2), umaglicoproteína pertencente à família dos recetores ativadores de tirosinas cinases, estando a sua sobre-expressão relacionada com o tipo de tumor mamáriohumano mais agressivo, o HER2 positivo (HER2+).Estas neoplasias apresentam células tumorais com umelevado número de recetores HER2, devido à amplifi-cação funcional do gene HER2 localizado no cromos-soma 17 (Ménard et al., 2000; Wolff et al., 2007). Adimerização deste recetor, que está localizado namembrana citoplasmática, conduz à ativação de váriasvias de sinalização intranucleares que promovem: aproliferação celular pela via da MAPK (Mitogen-acti-vated protein kinase); a inibição da apoptose pela viada PI3K (phosphoinositide 3-kinase)/Akt; ou a formação de metástases, por subexpressão dasadesinas (Ménard et al., 2004; Wolff et al., 2007).Estruturalmente, o HER2 apresenta 3 domínios funcionais: o intracelular, o transmembranar e oextracelular (Carney et al., 2003; Gauchez et al.,2008). Este último tem impulsionado a indústria farmacêutica a desenvolver anticorpos específicosanti-HER2 que inibam a dimerização através do seureconhecimento à superfície da célula. Atualmente, oúnico anticorpo terapêutico anti-HER2 disponível(trastuzumab, Herceptin®, Genetech) veio melhorar otempo de sobrevida das pacientes com tumoresHER2+ e as taxas de resposta à quimioterapia(Stebbing et al., 2000). Adicionalmente, os tumoresmamários HER2+ são, geralmente, acompanhados deuma co-amplificação do gene da Topoisomerase IIα,fato que justifica a quimioterapia com os inibidoresdesta enzima (p.ex. doxorubicina, epirubicina) apesarda sua elevada toxicidade. Desta forma se compreendeque a análise da expressão do HER2 assuma umaimportância capital por condicionar o prognóstico e otratamento dos tumores mamários nas mulheres(Bhargava et al., 2005; Tanner et al., 2006; Fountzilaset al., 2012).

Em medicina veterinária, alguns estudos têm identi-ficado uma sobre-expressão da oncoproteína HER2em tumores mamários felinos (De Maria et al., 2005;Millanta et al., 2005; Wiston et al., 2005; Ordás et al.,2007; Burrai et al., 2010; Rasotto et al., 2011) levan-tando a hipótese de existirem tumores mamáriosfHER2+ na gata, provavelmente, semelhantes aos dosubtipo HER2+ da mulher. No entanto, as incidênciasreportadas por estes estudos apresentam valores muitodíspares (5,5% a 92,5%). Pensamos que à semelhançados estudos iniciais realizados na mulher, os valoresdiscrepantes resultem do uso de diferentes protocolosde fixação e/ou de recuperação antigénica e da uti-

lização de diferentes anticorpos anti-HER2 pelosdiferentes autores. Assim, o nosso estudo surge com oobjetivo de padronizar e otimizar a imunodeteção daoncoproteina fHER2 testando diferentes protocolos derecuperação antigénica e uma bateria de cinco anti-corpos anti-HER2, em paralelo, nas mesmas amostras.Adicionalmente, o possível efeito de vários parâmetrosclinicopatológicos (idade ao diagnóstico, tamanho dotumor, metastização regional, classificação histopa-tológica e grau de malignidade e índice de Ki-67) napositividade para a imunomarcação de fHER2 foiavaliado.

Material e métodos

Amostras

Foi realizado um estudo retrospectivo com trintatumores classificados como carcinomas mamáriosfelinos e com um tempo de fixação em formol inferiora 72 horas, pertencentes ao Arquivo de Tecidos doServiço de Anatomia Patológica, da Faculdade deMedicina Veterinária, Universidade Técnica deLisboa. Os tumores foram obtidos a partir de trintagatas que se apresentaram à consulta no HospitalEscolar entre 2009 e 2011. A informação clínica foirecolhida por rotina. A classificação histopatológicados tumores foi realizada por um Médico-VeterinárioPatologista com experiência em patologia mamária(JC) e os critérios adotados foram os publicados pelaOrganização Mundial de Saúde (OMS). Os tumoresforam categorizados de grau I ao grau III de mali-gnidade, estabelecido a partir do seu pleomorfismocelular, da formação tubular e do número de mitosespresentes (Elston e Ellis, 1998; Misdorp et al., 1999).Em 21 dos 30 casos foram analisados os linfonodosregionais para pesquisa de metástases regionais.

Técnica de imunohistoquímica para fHER2 e Ki-67

Para a imunodeteção da glicoproteína de membranafHER2 foram utilizados os seguintes anticorposprimários: um anticorpo policlonal de coelho anti-HER2 (clone A0485 da DAKO, Glostrup, Dinamarca),dois anticorpos monoclonais de coelho anti-HER2(clone 4B5 da Ventana, Arizona, EUA e clone SP3 daZytomed, Berlim, Alemanha) e dois anticorpos mono-clonais de rato anti-HER2 (clone CB11 da Zytomed eclone TAB250 da Invitrogen, California, EUA). Paraotimizar a imunodeteção do fHER2, as amostrasforam individualmente submetidas a dezasseis proto-colos diferentes, resumidos na Tabela 1.

Em todos os protocolos foram usados cortes de teci-do com 4 µm de espessura, em lâminas histológicasStarfrost® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA)e secos a 60 ºC durante uma hora. Em seguida, oscortes foram desparafinados e reidratados através de

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passagens por xilol e por soluções de álcool, gradua-das em concentrações decrescentes, até serem coloca-dos em água destilada. Posteriormente, os tecidosforam submetidos a diferentes procedimentos pararecuperação antigénica (Tabela 1): com solução detampão citrato (NaCH3COO, pH = 6) em panela depressão (2 atm durante 2 min) ou em banho-maria (95 ºC durante 30 min ou 60 min). Para a imunomar-cação com o anticorpo TAB250, na recuperaçãoantigénica foi ainda realizado através de um métodoenzimático (Protease K, Zymed durante 10 min) acon-selhado em estudos prévios (O'Malley et al., 2001;Thomson et al., 2001). Seguiu-se o bloqueio da peroxidase endógena (solução de bloqueio de peroxi-dase, Zytomed, durante 10 min), a incubação dasamostras com o anticorpo primário a testar duranteuma hora à temperatura ambiente e, finalmente, aincubação com o anticorpo secundário durante 30 min(HER2easy kit IHC, Zytomed). Entre todos os passosforam realizadas lavagens com solução de tampão fosfato salino (PBS). Como sistema de deteção foi utilizado o cromogéneo 3,3’-Diaminobenzidina-tetrahidroclorido (DAB, DAKO), seguido de uma coloração com hematoxilina de Mayer. Controlos positivos e negativos foram usados em cada protocolo,sendo que o controlo positivo foi obtido a partir deblocos contendo tecido de carcinoma mamáriohumano com sobre-expressão de HER2 e previamenteclassificado como 3+ e o controlo negativo obtido apartir de carcinoma mamário humano sem sobre-expressão de HER2, previamente classificado como 0(ver Critérios de Interpretação). Em paralelo, foiusado um controlo negativo suplementar com IgG decoelho (Abcam, Cambridge, RU) ou IgG de rato(DAKO), incubados durante 60 minutos em substitui-ção e na mesma diluição do anticorpo primário anti-HER2 correspondente.

Para a avaliação do Ki-67 foram realizados cortescom 4 µm de espessura que foram colhidos para lâmi-nas histológicas Starfrost® e secos a 60 ºC durante umahora. O protocolo de imunohistoquímica utilizado foiidêntico ao já descrito, com utilização da panela depressão (a 2 atmosferas durante 2 minutos) para recu-peração antigénica e incubação do anticorpo primário

(clone MM1, Novocastra, Newcastle, UK) duranteuma hora à temperatura ambiente, utilizando umadiluição de 1:1000. Como controlo positivo e negativoforam utilizados cortes de tonsilas de cão.

Critérios de interpretação

Foram seguidas as diretrizes da DAKO para a clas-sificação da imunomarcação do HER2 (DAKO, 1999)onde: 0, corresponde a ausência de marcação; 1+, corresponde a uma marcação membranar incompleta ede fraca intensidade, em qualquer proporção de célu-las tumorais; 2+, é definido como uma marcaçãomembranar completa das células tumorais, com intensidade não uniforme ou fraca mas incluindo, nomínimo, 10% das células neoplásicas presentes nofragmento corado e, finalmente, 3+, quando há umamarcação membranar uniforme e de intensidade forteem pelo menos 10% das células neoplásicas. Assim,as amostras analisadas foram consideradas fHER2positivas (fHER2+) quando classificadas como 2+ ou3+ e fHER2 negativas (fHER2-) quando 0 ou 1+. Amarcação citoplasmática foi considerada como nãoespecífica. Todas as lâminas foram sujeitas a umaclassificação independente e cega por parte de umMédico-Veterinário Patologista (JC) e dois Médico-Veterinários (MS e FF). As classificações discor-dantes foram discutidas, utilizando um microscópiomulti-ocular.

O índice Ki-67 reflete o quociente entre o númerode células tumorais marcadas pelo anticorpo anti-Ki-67 e de células tumorais não marcadas (coradas comhematoxilina) em 1000 células avaliadas. Foram con-sideradas positivas as células tumorais com marcaçãonuclear. Para a contagem celular foram usados camposde visualização com ampliação de 400x (Yerushalmiet al., 2010; Rasotto et al., 2011).

Análise de resultados

Na análise estatística dos resultados foi utilizado osistema operativo IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM,Nova Iorque, EUA). Para avaliar o efeito do índice Ki-67 (por comparação de médias) e da idade dos animaisao diagnóstico na classificação do fHER2, foi utilizado

Tabela 1 - Resumo dos protocolos imunohistoquímicos utilizados na deteção do fHER2

Anticorpo primário

Clone Diluição Tempo de incubação

CB11 Pré-diluído 60 min

4B5 Pré-diluído 60 min

1:2501:300

SP3 1:100 60 min Panela de pressão a 2 atm durante 2 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)

1:50 Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)Banho-maria a 95 ºC durante 60 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)

1:250 Panela de pressão a 2 atm durante 2 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)Proteinase K durante 10 min

Recuperação antigénica

A0485

TAB250

Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)

Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (pH = 6)60 min

60 min

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o teste de t de Student após verificação dos pressu-postos de normalidade e variância pelos testes deShapiro-Wilk e de Lavene. Uma vez que a amostranão respeitava os pressupostos de normalidade quandoavaliado o tamanho da massa tumoral, foi utilizado oTeste de Mann Whitney U para determinação do efeitodo tamanho do tumor na classificação do fHER2. Aassociação entre a sobre-expressão do fHER2 e o grau de malignidade, a classificação histológica e a presença de metástases regionais nos linfonodos foi cal-culada pelo teste Exato de Fisher. Em todos os testes foiconsiderando um nível de significância de 0,05.

Resultados

A idade média das gatas à altura do diagnóstico foide 10,4 anos com um intervalo de idades entre os 5 eos 14 anos. Os trinta tumores analisados apresentaramum tamanho médio de 2,43 cm (intervalo entre 0,2-6cm). Após exame histopatológico, 36,7% dos tumoresforam classificados como carcinomas cribriformes(n=11), 30% como carcinomas tubulo-papilíferos (n =9) e 23,3% como carcinomas tubulares (n = 7). Foramainda observados um carcinoma sólido, um carcinomamucinoso e um carcinoma das células escamosas.Relativamente ao grau de malignidade verificou-seque 73,3% (n = 22) dos tumores apresentava grau demalignidade III, 23,3% (n = 7) o grau II e, por fim,3,3% (n = 1) o grau I. Dos 21 linfonodos avaliados,cerca de 43% apresentavam lesões infiltrativas porcélulas neoplásicas.

Relativamente à imunomarcação do fHER2, os anti-corpos CB11, 4B5 e A0485 mostraram marcaçãomembranar específica, confirmando uma reatividadecruzada interespécie, enquanto que os anticorposTAB250 e SP3 não apresentaram qualquer marcaçãoindependentemente do protocolo usado. Os controlospositivos e negativos apresentaram as classificaçõesesperadas (3+ e 0, respetivamente), enquanto os con-trolos adicionais com soro de coelho e de rato confir-maram a especificidade da marcação em tecidos degata (Figura 1).

Dos vários protocolos testados, o protocolo com ummaior tempo de recuperação antigénica (banho-mariaa 95 ºC durante 60 minutos) seguido da imunodeteçãocom o anticorpo A0485 foi o que mostrou melhoresresultados com 33,3% dos tumores a serem classifica-dos como fHER2+ (n = 10, 4 casos classificados como3+ e 6 como 2+). Por outro lado, o método da panelade pressão foi a técnica mais eficaz na deteção dofHER2 quando os anticorpos CB11 (26,7% de TMF-fHER2+) ou 4B5 (20% de TMF-fHER2+) foram usados (Tabela 2 e Figura 1). De salientar que apenaso anticorpo 4B5 apresentou uma marcação citoplas-mática inespecífica.

O índice Ki-67 nas amostras tumorais felinasmostrou uma média de 30% e um intervalo de valores

entre os 5% e os 56%. A intensidade da marcação variou entre moderada a forte e os controlosmostraram os resultados esperados (Figura 1, G e H).

A associação entre as variáveis clinicopatológicasestudadas e a classificação do fHER2 após recupera-ção antigénica em banho-maria a 95 ºC durante 60minutos e a imunomarcação com o anticorpo A0485estão sumarizadas na Tabela 3 (idade ao diagnóstico,tamanho do tumor, índice Ki-67) e na Tabela 4 (clas-sificação histopatológica, grau de malignidade e pre-sença de metástases nos linfonodos regionais). Aanálise estatística não demonstrou diferenças signi-ficativas (p<0,05) entre o grupo de TMF-fHER2- e ogrupo TMF-fHER2+.

Figura 1 - Deteção do fHER2 e do Ki-67 em tumores mamários degata. (A) Marcação de HER2 em controlo positivo humano classifi-cado como 3+ (400x). (B) Controlo negativo com IgG de Coelhoapós recuperação antigénica (400x). (C) Expressão de fHER2 emcarcinoma cribriforme felino após RA com o anticorpo CB11 (clas-sificação 0) (400x). (D) Expressão de fHER2 em carcinoma cribri-forme felino após RA com o anticorpo A0485 (classificação 1)(400x). (E) Expressão de fHER2 num carcinoma tubular, classifica-do com 1+ após RA e incubação com o anticorpo 4B5. De notar amarcação citoplasmática inespecífica (400x). (F) Expressão defHER2 num carcinoma tubulo-papilífero com classificação 3+ apósRA em banho-maria a 95 ºC durante 60 minutos e incubação com oanticorpo A0485 (400x). (G) Marcação nuclear específica de Ki-67em carcinoma cribriforme fHER2- (400x) e em carcinoma cribri-forme fHER2+ (H) (400x); RA – Recuperação Antigénica.

195


Tabela 2 - Frequências de tumores mamários felinos de acordo com as classificações do fHER2 obtidas após o uso de diferentes protocolos de recuperação antigénica e de diferentes anticorpos anti-HER2

Classificação fHER2 0 1+ 2+ 3+ TOTAL

Anticorpo / Método de RA

RA 30 min 24 (80%) 6 (20%) 0 (0%) 0 (0%)

CB11 RA 60 min 18 (60%) 10 (33,3%) 2 (6,7%) 0 (0%)

PP 9 (30%) 13 (43,3%) 6 (20%) 2 (6,7%)

RA 30 min 23 (76,7%) 6 (20%) 1 (3,3%) 0 (0%)

4B5 RA 60 min 15 (50%) 10 (33,3%) 5 (16,7%) 0 (0%)

PP 16 (53,3%) 8 (26,7%) 4 (13,3%) 2 (6,7%)

RA 30 min 16 (53,3%) 5 (16,7%) 8 (26,7%) 1 (3,3%)

RA 60 min 15 (50%) 5 (16,7%) 6 (20%) 4 (13,3%)

PP 6 (20%) 16 (53,3%) 5 (16,7%) 3 (10%)

30 (100%)

RA 30 min – Recuperação antigénica em banho-maria a 95 ºC durante 30 minutos; RA 60 min – Recuperação antigénica em banho-maria a95 ºC durante 60 minutos; PP – Panela de pressão (2 atm durante 2 min).

Tabela 3 - Efeito da idade ao diagnóstico, do tamanho do tumor, do índice Ki-67 e o nível de expressão do fHER2 em tumoresmamários felinos

TMF-fHER2 TMF-fHER2+ p

(n = 20) (n=10)

Idade (Anos)

Média (±EPM; min-máx) 10,75 (±0,52; 6-14) 9,7 (±0,83; 5-13) 0,275

Tamanho do tumor (cm)

Média (±EPM; min-máx) 2,27 (±0,3; 0,2-5) 2,78 (±0,43; 1-6) 0,350

Índice Ki-67 (%)

Média (±EPM; min-máx) 32,5 (±3; 5-56) 24 (±4,7; 7-47) 0,123

EPM=erro padrão da média

Tabela 4 - Associação entre a classificação histológica, o grau de malignidade, a metastização nos linfonodos regionais e o nível deexpressão do fHER2 em tumores mamários felinos

TMF-fHER2- TMF-fHER2+ p

Classificação histopatológica n=20 (%) n=10 (%)

Cribriforme 8 (40%) 3 (30%) 0,57

Tubulo-papilífero 5 (25%) 2 (20%)

Tubular 6 (30%) 3 (30%)

Sólido 1 (5%) 0 (0%)

Mucinoso 0 (0%) 1 (10%)

Escamoso 0 (0%) 1 (10%)

Grau de malignidade n (%) n (%)

I 0 (0%) 1 (10%) 0,17

II 6 (30%) 1 (10%)

III 14 (70%) 8 (80%)

Linfonodos n = 13 (%) n = 8 (%)

Sem metástases 8 (61,5%) 4 (50%) 0,67

Com metástases 5 (38,5%) 4 (50%)

A0485

196


Discussão

O nosso estudo apresentava como objetivo principala otimização do protocolo de imunodeteção do fHER2em amostras parafinadas de tumores mamários felinos.Para tal procurámos seguir as linhas de orientação daSociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) eda DAKO, sobretudo no que concerne ao tempo defixação dos tecidos e aos critérios de interpretação,fatores críticos para a correta deteção e quantificaçãoda proteína HER2 (Bilous et al., 2007; Oyama et al.,2007; Wolff et al., 2007). Desta forma, foi avaliadauma bateria de protocolos onde se fizeram variar ométodo de recuperação antigénica e/ou o anticorpoprimário utilizado. O número de TMF com sobre-expressão do fHER2 variou consideravelmente consoante o anticorpo e o método usado (0% -33,3%). De facto, dois dos anticorpos anti-HER2 testados (TAB250 e SP3) não mostraram reconhecer ofHER2, o que poderá dever-se ao facto dos tecidosterem sido fixados em formol não tamponado queinduz alterações conformacionais no domínio extra-celular do recetor, impedindo que seja reconhecidopor anticorpos que reconheçam esta porção da proteína(O’Malley et al., 2001; Ricardo et al., 2007).Adicionalmente, estes resultados podem encontrarexplicação no fato dos anticorpos comerciais anti-HER2 serem dirigidos contra a proteína HER2humana que apresenta uma homologia de sequênciaaminoacídica de 93% quando comparada com a pro-teína fHER2. Assim, poderá acontecer que a porçãoreconhecida por estes dois anticorpos não seja total-mente homóloga e, que portanto, a proteína felina nãoseja reconhecida independentemente do protocolo utilizado.

Relativamente aos três anticorpos que reconhecerama oncoproteína fHER2, foi o anticorpo A0485 queapresentou melhores resultados, conseguindo detetarsobre-expressão do fHER2 em 33,3% dos TMF anali-sados, seguindo-se o anticorpo CB11 e o 4B5 com26,7 e 20% de casos positivos, respetivamente, valorespróximos aos publicados por De Maria et al. (2005)(n=40, 39% TMF-fHER2+) e Ordás et al. (2007)(n=30, 40% TMF-fHER2+). De salientar que dois outros trabalhos apresentaram resultados bastante díspares; os valores mais baixos até agora reportados(Rasotto et al. (2010), n=73, 5,5% TMF-fHER2+) uti-lizaram tempos de incubação do anticorpo primáriomuito reduzidos (18 min) e o estudo que aponta parauma elevada incidência da sobre-expressão do fHER2em TMF (90%, n=30) utilizou critérios de interpre-tação diferentes dos aprovados pela DAKO e pelaASCO, o que poderá ter aumentado significativa-mente o limiar de positividade (Wiston et al., 2005).

Assim, os nossos resultados apontam para que oanticorpo A0485 seja o mais adequado na deteção daproteína fHER2 em amostras parafinadas de gata, àsemelhança daquilo que está descrito para os tecidos

mamários de mulher (Lebeau et al., 2001; O'Malley etal., 2001; Thomson et al., 2001; Schrohl et al., 2011),sobretudo se associado a um maior tempo de recu-peração antigénica (60 minutos em banho-maria a 95 ºC). Alternativamente, o anticorpo CB11 quandocombinado com o método de recuperação antigénicaque usa a panela de pressão, também permite uma boaimunodeteção do fHER2.

A maioria dos tumores avaliados apresentava umelevado índice de Ki-67, com uma média de 30%, o que salienta o comportamento agressivo destas neoplasias. De facto, a proteína Ki-67 é essencial àdivisão celular, atingindo o seu pico de expressãodurante a mitose, pelo que um maior índice tem sidoassociado, em Medicina Humana e mais recentementeem Medicina Veterinária, a um pior prognóstico e,consequentemente, a tumores mais agressivos (Harriset al., 2007; Yerushalmi et al., 2010; Santos et al.,2013).

Após a análise estatística dos resultados não encon-trámos qualquer diferença entre as variáveis clinico-patológicas avaliadas e a sobre-expressão do fHER2+nos tumores mamários analisados, resultados que sãoconcordantes com estudos anteriores (Millanta et al.,2005; Rasotto et al., 2010). A presença de metástasesregionais também não se correlacionou de forma significativa com nenhum dos grupos de tumores(TMF-fHER2+ e TMF-fHER2-). Também na mulher,os tumores HER2+ não mostram qualquer correlaçãocom as diferentes variáveis clinicopatológicas (Stuarte Schnitt, 2001; Wolff et al., 2007; Farzadnia et al.,2007; Adly et al., 2010), levantado a hipótese da gataser utilizada como modelo. Desta forma, pensamosque novos estudos que permitam compreender osmecanismos oncogénicos destes tumores são funda-mentais de forma a abrir portas a novos métodos dediagnóstico e a tratamentos mais dirigidos.

Agradecimentos

Os autores agradecem à FCT (SFRH/BD/70720/-2010), ao Serviço de Anatomia Patológica do InstitutoPortuguês de Oncologia e à Dra. Joana Rita Teixeira,da Escola Superior de Saúde Egas Moniz.

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CASO CLÍNICO

Trauma elétrico em preguiça de vida livre: relato de caso

Electric trauma in a wild sloth: a case report

Dayanne Anunciação S. D. Lima1*, Wagner C. Lima1, Marcelo C. Rodrigues2,

Ana Maria Quessada2, Karynne M. M. dos Santos3, Charlys Rhands C. de Moura1,

Cláudia S. Magalhães1, João M. de Sousa2

1Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal do Piauí – UFPI2Hospital Veterinário da Universidade Federal do Piauí – UFPI

3Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal do Piauí – UFPI



199

Resumo: As preguiças do género Bradypus são largamenteencontradas em grande parte da região Nordeste do Brasil. Ocrescimento da população humana tem levado à destruição dasáreas de ocorrência natural dessas espécies que cada vez maissão encontradas em zonas urbanas e sujeitas a acidentes diversos. Um exemplar de Bradypus variegatus foi encami-nhado para um Hospital Veterinário apresentando inapetência,otorragia bilateral, desidratação moderada e queimaduras localizadas nos membros torácicos e pélvicos decorrentes dechoque elétrico em fios de alta tensão. Após avaliação clínica,laboratorial e eletrocardiográfica, foi instituído tratamentoambulatorial e cirúrgico. Não houve melhora do quadro clínico e o mesmo evoluiu para o óbito. Alterações nutricionais,imunológicas e microbiológicas justificam a gravidade doquadro clínico e a progressão para o óbito. O eletrocardiogramaestava normal, apesar de a fibrilhação ventricular ser um eventoesperado nestes casos. A ausência de fibrilhação ventricularpode estar relacionada à capacidade de reversão espontânea aalterações cardíacas que a preguiça possui. Dessa forma, a abor-dagem de emergência em casos de trauma elétrico é obrigatória,principalmente tratando-se de animais silvestres. Não menosimportantes são o manejo nutricional e o acompanhamento pormeio de exames laboratoriais.

Palavras-chave: animal silvestre, Bradypus variegatus,queimadura, choque

Summary: Sloths of the genus Bradypus are largely found inmuch of northeastern Brazil. The human population growth hasled to the destruction of areas of natural occurrence of thesespecies, and these animals are more often found injured in urbanareas, mainly by electric shocks. A specimen of Bradypus variegatus was transported to a veterinary practice with a history of trauma after contact with electrical power lines. Itpresented low level of consciousness, somnolence, bilateralotorrhea, burns and moderate dehydration. After clinical, labo-ratory and electrocardiographic tests, ambulatorial and surgicaltreatments were initiated. There was no clinical improvement,and the animal died. Nutritional, immunological and microbio-logical alterations justified the severity of the clinical progres-sion and death. The electrocardiogram was normal, although

ventricular fibrillation was an expected event. The absence ofventricular fibrillation may be related to the resistance that slothhas to heart changes with the possibility of spontaneous rever-sion. Thus, an emergency approach in cases of electrical traumais mandatory, especially when dealing with wild animals. Noless important are the nutritional management and monitoringthrough laboratory tests.

Keywords: wild animals, Bradypus variegatus, burn, shock

Introdução

As preguiças são mamíferos da família Bradypo-didae composta por dois géneros, Choloepus eBradypus, diferenciados entre si pelo número dededos. O género Bradypus é largamente encontradoem grande parte da região Nordeste do Brasil (Silva etal., 2005). São animais de porte médio, apresentamcoloração geral cinza tracejada de branco ou castanho--ferrugem, podendo ter manchas claras ou negras.Possuem membros compridos, corpo curto, caudacurta e grossa, adaptados para o seu modo de vida.Com comportamento solitário, noturno e diurno, apreciam ficar nas copas das árvores expostas ao solmatinal e têm hábito alimentar composto basicamentepor folhas de diversas espécies arbóreas. O crescimen-to da população humana tem levado à destruição dasáreas de ocorrência natural dessas espécies que cadavez mais são encontrados em zonas urbanizadasnecessitando de cuidados veterinários imediatos (Silvaet al., 2005).

Dentre as várias afecções que podem acometer ani-mais silvestres em áreas urbanas, os choques elétricosestão em destaque, inclusive em preguiças já que,pelos seus hábitos arborícolas, estes animais podemalcançar postes de alta tensão e serem vítimas dedescargas elétricas (Petrucci et al., 2009; Araújo et al.,2010; Fonseca et al., 2011). As preguiças apresentammovimentos muito lentos, baixa taxa metabólica e

*Correspondência: [email protected] Federal do Piauí, Centro de ciências Agrárias,Campus Socopo, CEP 64049-550, Teresina, PI

200

Lima DASD et al. RPCV (2012) 107 (583-584) 199-202

sistema cardiovascular com algumas peculiaridades(Silva et al., 2005). Objetivou-se relatar detalhada-mente um caso de trauma elétrico em preguiça de vidalivre.

História pregressa, diagnóstico e tratamento

Um exemplar de B. variegatus, fêmea, sem idadedefinida, foi atendido no Hospital Veterinário daUniversidade Federal do Piauí (HVU), com história detrauma elétrico após contato com fios de alta tensão.À inspeção, o animal apresentava ulceração cutâneanas regiões palmar e plantar e na face lateral esquerdado dorso (Figura 1), baixo nível de consciência esonolência, com pouco ou nenhum movimento quandoestimulado, otorragia bilateral, condição corporalmagra e desidratação moderada. O animal foi encami-nhado para o internamento no HVU e, após a realiza-ção dos exames clínico e eletrocardiográfico, ficousob observação quanto à evolução do quadro clínico.

Os parâmetros eletrocardiográficos (Pms, PmV,PRms, QRSms, RmV, QTms e RRms) foram registra-dos em derivação DII e amplitude 2N com velocidadede 25 mm/s (Figura 2); a frequência cardíaca (FC) foicalculada através do intervalo RR; a frequência respi-ratória (ƒ) obtida pela contagem dos movimentos daparede torácica em um minuto e a temperatura retal(TR) pela inserção de termómetro clínico digital naampola retal durante 1 minuto. Amostra de sangue foicoletada para análise hematológica.

Durante o internamento, foi administrado fluidoendovenoso (Ringer com lactato 10 mL/kg/hora), anti-

biótico (enrofloxacina 10 mg/kg/24-24h, via intramus-cular - IM), analgésico (tramadol 2 mg/kg/8-8h/IM) eanti inflamatório (dexametasona 1 mg/kg/24-24h/IM).A cada 12 horas, o animal foi submetido à limpeza ecurativo das feridas com uso de solução salina (NaCl0,9%) e nitrofurazona. O animal permaneceu 10 diasinternado sob alimentação e ingestão de água forçada(aspersão em folhas frescas de imbaúba previamentelavadas). Não havendo melhora satisfatória do quadroclínico, o animal foi encaminhado para o centro cirúr-gico para debridamento das feridas (Figura 3). Aindução anestésica consistiu da associação de quetami-na (2,5 mg/kg) e xilazina (0,3 mg/kg) administrada namesma seringa por via IM, seguida da manutençãocom isoflurano diluído em 100% de oxigénio oferecidopor meio de máscara facial em circuito semi-aberto.Após a cirurgia o quadro clínico deteriorou-se e dentro de 48 horas, ocorreu o óbito do animal. Foisolicitado o exame post-mortem.


A manutenção de um Bradypus em cativeiro é umdesafio, dado este género ser muito vulnerável ao"stress" adaptativo com consequente baixa imunológicae, na maioria das vezes, com alteração respiratória dedifícil resolução (Miranda e Costa, 2006). Além disso,as queimaduras estão intimamente relacionadas aalterações agudas nos sistemas nutricional, imuno-lógico e microbiológico que podem interferir na recuperação do paciente. Ocorre ativação de mecanis-mos inflamatórios, imunidade celular e alterações de

Figura 1 - Exemplar de Bradypus variegatus, fêmea, sem idade definida, apresentando ulceração cutânea decorrente de queimaduras causadas por trauma elétrico após contato com fios de alta tensão.

Figura 2 - Traçado eletrocardiográfico de um exemplar de Bradypus variegatus, fêmea, sem idade definida, registado em derivação DII eamplitude 2N com velocidade de 25 mm/s, após trauma elétrico por contacto com fios de alta tensão.

201


mediadores do sistema imunitário (Barbosa et al.,2009). Tais elementos podem justificar a gravidadedo quadro clínico do animal sem resposta ao trata-mento instituído e progressão para o óbito.

A frequência cardíaca da preguiça está sob o controledo sistema nervoso autónomo e é menor do que o registado em outros mamíferos do mesmo tamanho,tais como cães e coelhos (Silva et al., 2005). Nessecaso em questão, a frequência cardíaca de 79 bpm e arespiratória de 10 mpm observadas durante o exameclínico no dia do atendimento estavam normais para aespécie (60-110 bpm e 10-80 mpm, respectivamente)(Gilmore et al., 2000; Duarte et al., 2004; West et al.,2007; Hanley et al., 2008). A termorregulação é vitale, baseada nas alterações climáticas do ambiente,garante uma grande faixa de variação (24-33 ºC)(Gilmore et al., 2000; Miranda e Costa, 2006; Hanleyet al., 2008) como observado neste estudo em que atemperatura retal do animal manteve-se entre 33 e 34 ºC. Na análise laboratorial, a hematologia confir-mou a condição de desidratação observada durante oexame clínico da preguiça (hematócrito > 40%)(Gilmore et al., 2000).

Não foram diagnosticadas alterações eletrocardio-gráficas, sendo o ritmo sinusal normal prevalente. Osdados obtidos (Tabela 1) foram semelhantes aosencontrados em outros estudos (Silva et al., 2005). Noeletrocardiograma de vertebrados o conjunto deondas é semelhante entre as espécies, independente-mente de a condução elétrica ventricular ser mediadapelas fibras de Purkinje (mamíferos e aves) ou pormúsculos apropriados (animais poiquilotérmicos)(Prosser e Brown Jr., 1975 citado por Silva et al.,2005). Extensos estudos em animais indicam que afibrilhação ventricular é a principal causa de morte emcasos de choque elétrico e resulta da elevação dosníveis de catecolaminas e ativação do sistema nervososimpático aumentando o trabalho cardíaco (Bradford eRegan, 1985). Podem estar associadas a queimadurasprofundas e paragem respiratória proveniente de par-alisia bulbar resultante de incontroláveis contraçõestetânicas dos músculos respiratórios. Devido àqueimadura grave da musculatura ocorre maior libertação de mioglobina a qual se deposita nos

túbulos renais e induz efeitos tóxicos diretos. Parareduzir este evento adverso recomenda-se a adminis-tração imediata de soluções alcalinas (Bradford eRegan, 1985), como foi feito neste animal. A ausênciade fibrilhação ventricular nesta preguiça pode estarrelacionada à resistência característica que a espéciepossui comprovada em um estudo comparativo com ogato doméstico devido sua semelhança de porte(Oliveira et al., 1980). Foi observado que além daresistência, uma vez que a fibrilhação era induzida, arecuperação era mais rápida do que no gato com 40%das preguiças apresentando reversão espontânea doquadro. Em outro estudo comparativo das característi-cas mecânicas de enfarte em preguiça, gato e rato, nãosó a contratilidade, mas também o processo de relaxa-mento foram retardados na preguiça em relação àsoutras espécies (Gilmore et al., 2000).

O laudo necroscópico foi conclusivo para sepsis aqual pode ser explicada pela ruptura da barreira deproteção constituída pela pele provocando infecção,fator determinante de mortalidade (Ramakrishnan etal., 2006) como aqui observado. Pode ser feito o iso-lamento de microrganismos no local da infecção,ainda que, em lesões de queimaduras, seja predomi-nante a microbiota normal da pele como, por exemplo,os géneros Staphylococcus e Streptococcus (Diniz etal., 1995). Ressalta-se que o estado nutricional inade-quado intensifica as complicações e as taxas de mor-bidade e mortalidade, geralmente elevadas empacientes queimados (Farrell et al., 2008).

Tabela 1 - Variáveis eletrocardiográficas obtidas em Bradypusvariegatus durante exame clínico após trauma elétrico de altatensão.

Parâmetro Duração (ms) Amplitude (mV)

Onda P 0,04 (*0,05±0,02) 0,08 (*0,05±0,07)

Intervalo PR 0,11 (*0,13±0,02) --------

Segmento PR 0,07 (*0,07±0,02) --------

Complexo QRS 0,06 (*0,07±0,02) --------

Intervalo QT 0,34 (*0,38±0,04) --------

Onda R 0,03 0,05

Onda T -------- 0,03 (*0,08±0,15)

* Valores de referência para a espécie segundo Silva et al. (2005).

Figura 3 - Debridamento da ulceração tecidual decorrente de queimaduras causadas por trauma elétrico após contato com fios de alta ten-são, em um exemplar de Bradypus variegatus, fêmea, sem idade definida.

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Conclusão

Dessa forma, a abordagem de emergência em casosde trauma elétrico é estritamente necessária para conseguir a ideal resolução do quadro clínico dos animais acometidos por esse agravo, principalmenteem se tratando de animais silvestres. Não menosimportantes são o maneio nutricional e o acompa-nhamento através de exames laboratoriais.

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RPCV (2012) 107 (583-584) 205

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Actividade associativa

A SPCV colaborou na organização da reunião inter-nacional "ApiCOWplexa: Apicomplexa in farm ani-mals" que teve lugar de 25 a 28 de outubro em Lisboae contou com a presença de cerca de 131 participantesoriundos dos seguintes países: Alemanha (17),Argentina (4), Austrália (6), Áustria (1), Bélgica (1),Brasil (10), Republica Checa (1), Espanha (12), EstadosUnidos da América (4), França (7), Grécia (1), Holanda(3), Israel (1), Itália (1), Noruega (2), Polónia (2),Portugal (22), Reino Unido (14), Roménia (2), Servia(1), Suécia (5), Suíça (11), Tailândia (1), Turquia (2).

Este encontro discutiu o conhecimento atual sobre osparasitas do filo Apicomplexa com impacto em pro-dução animal (Toxoplasma, Neospora, Besnoitia,Sarcocystis, Eimeria, Cryptosporidium, Babesia,Theileria, etc.) e desenrolou-se em torno de tópicoscomo epidemiologia e impacto económico, biodiversi-dade e genética populacional, genómica funcional ebioinformática, expressão génica, diagnóstico, invasãoe motilidade, sobrevivência intracelular e modulação dacélula hospedeira, patobiologia da doença, vacinas ealvos terapêuticos (www.apicowplexa.net).

Foram apresentadas 125 comunicações científicasdas quais 15 foram expostas por oradores estrangeirosconvidados.

A revista International Journal of Parasitology publi-cou um número especial dedicado a esta reunião intitu-lado "International Meeting on Apicomplexan Parasitesin Farm Animals (ApiCOWplexa) 2012" (Volume 43,nº 2, pp. 105-188, Fevereiro 2013), disponível em:ht tp : / /www.sciencedirect .com/science/ jour-nal/00207519/43/2.

O próximo encontro terá lugar em Pine Bay Hotel inKusadasi, Aydin, Turquia, entre os dias 31 de outubro e2 de novembro de 2013. Para informações detalhadassobre o encontro (inscrição, formulário para a submis-são de resumos, calendário, organização, oradores con-vidados, etc.) como por favor visite o sítio do encontroem http://www.apicowplexa.net/

A SPCV apoiou ainda a organização das "XXXVI JORNADAS MÉDICO-VETERINÁRIASDA AEFMV-UTL", que decorreram entre os dias 9 e 11 de novembro de 2012 na Faculdade de MedicinaVeterinária (FMV-UTL).

A convite da "Asociación Nacional de Porcino-cultura Científica" (ANAPORC), e através da FederaçãoPortuguesa das Associações de Suinicultores (FPAS), oPresidente da SPCV apresentou uma comunicaçãosobre o tema "La peste porcina africana, todavía unaamenaza para la porcicultura en la EU", no âmbito doXXXIII Simpósio ANAPORC, que decorreu nos dias25 e 26 de outubro de 2012, em Lisboa.

Movimento de sócios

De 1 de Julho a 31 de Dezembro de 2012 foi admi-tida a sócia que a seguir se indica.

Efectivos: 2437 Ana Filipa Pereira

SUPLEMENTO

Documents

Freemartinismo em bovinos: revisão de literatura ...entre a segunda e terceira semana de vida embrionária. Já a teoria do TDF, abordada por Grunert et al. (2005), estabeleceu que