FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO AGGEU … · Aos demais amigos do Laboratório de Imunogenética Maria Carolina Accioly, Andresa Oliveira, Beatriz Coutinho, Elis, Ailton, Lucas

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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO AGGEU MAGALHÃES

DOUTORADO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA EM SAÚDE

RENATA DOS SANTOS ALMEIDA

AVALIAÇÃO DO PAPEL DE MOLÉCULAS IMUNOLÓGICAS SOLÚVEIS,

POLIMORFISMOS GENÉTICOS E MICRORNAS EM LEUCEMIA

LINFOBLÁSTICA AGUDA DE CÉLULAS T DA INFÂNCIA

RECIFE

2017

1





Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biociências

e Biotecnologia em Saúde do Instituto Aggeu

Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz como requisito

para a obtenção do título de Doutor em Ciências.

Área de Concentração: Imunopatogênese de doenças

crônicas, infecciosas e parasitárias/Imunogenética e

terapia celular em doenças crônicas.

Orientadora:

Profª. Drª. Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva

RECIFE

2017

2

Catalogação na fonte: Biblioteca do Instituto Aggeu Magalhães

A447a

Almeida, Renata dos Santos.

Avaliação do papel de moléculas imunológicas

solúveis, polimorfismos genéticos e microRNAs em

leucemia linfoblástica aguda de células T da infância.

2017 / Renata dos Santos Almeida. - Recife: [s.n.], 2017.

136 p. : ilus., tab., graf., 30 cm.

Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia em

Saúde) - Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo

Cruz, 2017.

Orientadora: Norma Lucena Cavalcanti Licinio da

Silva.

1. Leucemia-Linfoma Linfoblástico de Células T

Precursoras - genética. 2. Leucemia-Linfoma

Linfoblástico de Células T Precursoras - imunologia. 3.

Citocinas. 4. Antígenos HLA-G. 5. Sobrevida. 6.

Polimorfismo Genético. 7. MicroRNAs – genética. 8.

MicroRNAs - imunologia. I. Silva, Norma Lucena

Cavalcanti Licínio da. II. Título.

CDU 577.27

3





Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biociências

e Biotecnologia em Saúde do Instituto Aggeu

Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz como requisito

para a obtenção do título de Doutor em Ciências.

Aprovado em: 26/04/2017

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________

Profª. Drª. Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva

Instituto Aggeu Magalhães, Fiocruz-PE

_____________________________________________________

Prof. Dr. Lindomar José Pena


______________________________________________________

Profª. Dra. Milena de Paiva Cavalcanti


______________________________________________________

Profª. Dra. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

______________________________________________________

Profª. Dra. Terezinha de Jesus Marques Salles

Universidade de Pernambuco (UPE)

4

Dedico este trabalho aos meus pais, José

Almeida e Maria do Carmo, que sempre

me incentivaram a lutar pelos meus

sonhos e ideais; pelo amor, apoio,

compreensão, força e estímulo

incondicionais, fundamentais na

realização e conclusão deste trabalho.

5

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado força, coragem e capacidade para a realização deste trabalho.

A minha orientadora, Profa. Dra. Norma Lucena-Silva, pela orientação, paciência e

dedicação nos ensinamentos científicos; pela oportunidade de trabalhar no Laboratório de

Imunogenética e por ter acreditado e investido no meu crescimento profissional, contribuindo

de maneira relevante na minha formação como cientista.

Aos meus irmãos, Felipe e Fernanda, por estarem sempre presentes na minha vida

mesmo que em outra cidade, pela amizade e incentivo, e compreensão nos diversos momentos

em que estive ausente.

A minha cunhada Raíra Maia pelo apoio e estímulo, e a minha sobrinha Rebeca pela

alegria e carinho, tornando minha vida mais leve.

Aos amigos do Laboratório de Imunogenética Fernanda Medeiros, Ester Vinhas, Laís

Baracho, Maíra Lima, Sávio Vieira, Renata Cézar e, especialmente, André Cavalcanti e Renan

Garcia, pela amizade, apoio, convivência e colaboração durante o Doutorado.

A Jair Figueredo, meu primeiro aluno de iniciação científica, pela parceria, amizade e

os bom momentos vividos durante seu período no Laboratório.

Aos alunos de iniciação científica de hoje Felipe Araújo, Karoliny, Mauro e Neila, e aos

de antes Ana Cláudia, Rafaella e Eloísa, pela convivência e momentos agradáveis no período

em que estiveram no Laboratório.

Aos demais amigos do Laboratório de Imunogenética Maria Carolina Accioly, Andresa

Oliveira, Beatriz Coutinho, Elis, Ailton, Lucas e à Profa. Valéria Pereira pelo convívio e apoio

nesta jornada.

Aos membros do Serviço de Oncologia Pediátrica do Hospital IMIP Alessandra Ramos,

Ester Vinhas e Rossana Santos pela parceria e pela ajuda dispensada, importantes para

realização deste estudo.

6

Ao Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúde do

IAM/Fiocruz-PE. Em especial, agradeço aos professores pela contribuição na minha formação

acadêmica.

Ao Prof. Dr. Carlos Luna pelo suporte e ensinamentos das análises estatísticas realizadas

neste trabalho.

À Fundação Oswaldo Cruz pela bolsa concedida durante o Doutorado.

À FACEPE e a CAPES-PROCAD pelo apoio financeiro necessário para a realização

deste trabalho.

Ao Laboratório de Biotecnologia Animal da ESALQ/USP, em especial ao Prof. Dr. Luiz

Coutinho, pela oportunidade de treinamento em sequenciamento de nova geração em seu

Laboratório e pela colaboração científica.

A todos os membros do Laboratório de Biotecnologia Animal da ESALQ/USP por me

receberem muito bem e pela atenção dispensada. Agradeço especialmente à Profa. Dra. Sonia

Andrade pelo suporte e colaboração nas análises de bioinformática, e à Pilar Mariani e Marcela

Paduan por toda a ajuda no treinamento e compartilhamento de seus conhecimentos acerca da

técnica de sequenciamento.

Ao Prof. Dr. Eduardo Donadi da USP/RP pela oportunidade de fazer intercâmbio

estudantil em seu Laboratório, pela colaboração e contribuições a este trabalho. Agradeço

também ao seu grupo de pesquisa pela receptividade no Laboratório, em especial, a Juliana

Massaro pela troca de idéias e conhecimento a respeito das análises de microRNAs.

Aos membros da banca examinadora pelas contribuições, sugestões e críticas a este

trabalho.

Ao Núcleo de Pesquisas Tecnológicas (NPT) do IAM/Fiocruz-PE pela assistência

técnica indispensável neste trabalho.

7

Aos amigos Rafael Freitas e Carla Mola pela amizade, apoio e estímulo, mas também

pelos momentos alegres vividos neste período.

Aos amigos do Departamento de Imunologia do IAM/Fiocruz-PE, em especial, Neide

Xavier, Fábia, Michele, Viviane, Karina, Roni, Camila, Mineo e Janaína pelo convívio alegre

e agradável, deixando o dia a dia mais leve.

À turma 2013.1 de Biociências e Biotecnologia em Saúde pela convivência durante o

Doutorado. Agradeço especialmente às amigas Larissa Isabela, Taciana Higino, Bruna Lima e

Karina pelas conversas, trocas de idéias e amizade.

Às amigas Camila Queiroz e Monique Bandeira pela amizade, apoio e força constantes,

pelas conversas e pelos momentos inesquecíveis vividos durante esses anos.

Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular e Molecular do IAM/Fiocruz-PE pela

amizade, momentos alegres e apoio durante esses anos.

À minha prima Juliana Santos pela amizade incondicional e por estar sempre presente

me dando força e estímulo.

Aos pacientes com leucemia pela participação nesta pesquisa, tornando possível a


A todos aqueles que, mesmo não tendo sido mencionados, contribuíram para a


Muito Obrigada!

Renata Almeida

8

“Por vezes sentimos que aquilo que

fazemos não é uma gota de água no mar.

Mas o mar seria menor se lhe faltasse

uma gota.”

Madre Teresa de Calcutá

9

ALMEIDA, Renata dos Santos. Avaliação do papel de moléculas imunológicas solúveis,

polimorfismos genéticos e microRNAs em leucemia linfoblástica aguda de células T da

infância. 2017. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia em Saúde) - Instituto Aggeu

Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.

RESUMO

A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) de células T é uma doença de alto risco e corresponde

a 15% das LLAs da infância. Moléculas imunológicas, polimorfismos genéticos e perfis de

expressão de microRNAs (miRNAs) têm sido associados ao câncer, mas suas funções na LLA-

T infantil não estão bem esclarecidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar (1) perfil de citocinas

e HLA-G solúvel (sHLA-G) na medula óssea (MO) e/ou sangue periférico (SP) de LLA-T ao

diagnóstico e durante o tratamento, (2) variabilidade da 3’UTR de HLA-G, dos promotores de

TNF e IL10, e do íntron 1 de IFNG e (3) perfil de expressão de miRNAs na LLA-T. Sessenta e

três pacientes referidos ao Hospital IMIP foram estudados. Níveis de citocinas Th1/Th2/Th17

e de sHLA-G foram determinados por citometria de fluxo e ELISA, respectivamente. Os

polimorfismos genéticos foram avaliados por sequenciamento de Sanger e a expressão de

miRNAs por sequenciamento de nova geração. Foram utilizados como controles do estudo SP

e MO de crianças saudáveis. Os miRNAs foram analisados por ferramentas de bioinformática.

P-valor ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Nenhum polimorfismo genético

estudado apresentou associação com a doença. Houve diferença nos níveis de IL-10 e IL-6 no

SP de pacientes versus controles. IL-10, IL-6 e TNF apresentaram diferenças durante o

tratamento (P= 0,033; P= 0,033; P= 0,039, respectivamente); IL-10 (P= 0,001) e IFN-γ (P=

0,015) apresentaram associação com sobrevida geral dos pacientes; e níveis aumentados de

sHLA-G foram associados à leucocitose (P= 0,027). Dez miRNAs apresentaram expressão

diferencial entre LLA-T e LLA-B (P= 4x10-5), e a anotação funcional de seus genes alvo

revelou vias biológicas relacionadas à câncer e vias de sinalização celular do sistema imune.

Esses dados evidenciam a importância de citocinas e sHLA-G na dinâmica do microambiente

tumoral durante o tratamento, e a influência de miRNAs em processos biológicos relacionados

ao desenvolvimento do câncer.

Palavras-chave: Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T. Citocinas. Antígenos HLA-G.

Sobrevida. Polimorfismo Genético. MicroRNAs.

10

ALMEIDA, Renata dos Santos. The role of immunological soluble factors, genetic

polymorphisms and microRNAs on childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia. 2017.

Thesis (Doctorate in Biosciences and Health Biotechnology) - Instituto Aggeu Magalhães,

Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.

ABSTRACT

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a high-risk disease which corresponds to 15%

of childhood ALL. Immunological factors, genetic polymorphisms and microRNA (miRNA)

expression profiles have been associated to cancer, although their function in childhood T-ALL

are not well established. This study aimed to evaluate (1) cytokine and soluble HLA-G (sHLA-

G) profiles in T-ALL bone marrow (BM) and/or peripheral blood (PB) at diagnosis and during

treatment, (2) genetic variability at HLA-G 3’UTR, TNF and IL10 promoter regions, and IFNG

intron 1, and (3) miRNA expression profile in T-ALL. Sixty-three patients referred to IMIP

Hospital were studied. Th1/Th2/Th17 cytokine and sHLA-G levels were determined by flow

cytometry and ELISA, respectively. Genetic polymorphisms were evaluated by Sanger

sequencing, and miRNAs expression, by next generation sequencing. In the study, samples

(BM and PB) from healthy children were used as controls. No association with disease was

observed for any genetic polymorphism. IL-10 and IL-6 levels differed between patients and

controls. IL-10, IL-6 and TNF levels exhibited changes during treatment (P= 0,033; P= 0,033;

P= 0,039, respectively); IL-10 (P= 0,001) and IFN-γ (P= 0,015) were associated with patient

overall survival; and increased sHLA-G levels were associated with leukocytosis (P= 0,027).

Ten miRNAs were differentially expressed between T- and B-ALL (P= 4x10-5) and functional

annotation for miRNA targets revealed biological pathways related to cancer and to immune

system cell signaling pathways. These data demonstrate a significant role for cytokines and

sHLA-G in tumor microenvironment dynamics during therapy, and the importance of miRNAs

in biological processes related to cancer development.

Keywords: T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Cytokines. HLA-G Antigens. Survival.

Genetic Polimorphism. MicroRNAs.

11

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Modelo mínimo para história natural de leucemia aguda da criança. 26

Figura 2 – Estágios da hematopoiese, desenvolvimento de célula T e oncogenes

relacionados a leucemia de células T. 27

Figura 3 – Isoformas de HLA-G geradas pelo processamento alternativo do mRNA do

gene HLA-G. 32

Figura 4 – Efeitos inibitórios exercidos pela molécula HLA-G. 34

Figura 5 – Biogênese e mecanismos de ação dos miRNAs. 37

Figura 6 – Microambiente tumoral na leucemia: interações entre os blastos e as células

estromais da medula óssea. 40

Fluxograma 1 – Principais etapas realizadas para a avaliação do papel de moléculas

imunológicas solúveis, polimorfismos genéticos e microRNAs em LLA-T da infância. 58

Figura 7 – Diagrama das amostras de sangue periférico e medula óssea de crianças com

LLA-T coletadas ao diagnóstico (D0), e nas fases de indução (D19) e consolidação

(D49) da terapia utilizadas para o estudo de citocinas e HLA-G solúvel. 61

Figura 8 – Análise do coeficiente de correlação de Pearson entre os níveis de citocinas

e HLA-G solúvel (sHLA-G) no estroma medular de pacientes com LLA-T. 68

Figura 9 – Influência dos níveis de IL-10 e IFN-γ na sobrevida geral dos

pacientes com LLA-T. 70

Figura 10 – Influência de variáveis clínicas na sobrevida geral dos pacientes com LLA-

T. 71

12

Gráfico 1 – Análise da associação entre os níveis de HLA-G solúvel (sHLA-G) e

contagem de leucócitos no sangue periférico ao diagnóstico. 71

Figura 11 – Influência recíproca de citocinas e sHLA-G em LLA-T de acordo com os

níveis medulares de IL-10 ao diagnóstico (Painel 11A e 11B), e os níveis de IFN-γ após

fase de consolidação da quimioterapia (D49) (Painel 11C e 11D). 73

Figura 12 – Influência dos polimorfismos -1082 G/A em IL10 e +874 T/A em IFNG na

sobrevida geral dos pacientes com LLA-T. 85

Figura 13 – Influência do polimorfismo -308 G/A em TNF e de combinações dos sítios

-1082 G/A em IL10, -308 G/A em TNF e +874 T/A em IFNG na sobrevida geral dos


Figura 14 – Agrupamento hierárquico dos pacientes com LLA-T versus LLA-B,

apresentando os 11 miRNAs diferencialmente expressos com FDR ≤ 4x10-5. 91

Gráfico 2 – Vias biológicas enriquecidas significantes com mais de 100 genes alvos dos

miRNAs identificados com regulação negativa em LLA-T no estudo. 94

Gráfico 3 – Vias biológicas enriquecidas significantes com mais de 100 genes preditos

como alvos do miRNA identificado com regulação positiva em LLA-T no estudo. 95

Gráfico 4 – Análise de vias biológicas enriquecidas comuns e exclusivas dos grupos de

genes regulados por miRNAs diferencialmente expressos em LLA-T. 95

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Alterações genéticas encontradas em LLA-T. 30

Tabela 2 – Características clínicas dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de

células T. 59

Tabela 3 – Dados laboratoriais dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de

células T. 60

Tabela 4 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G na medula óssea de pacientes

com LLA-T ao diagnóstico (D0) e crianças com mielograma normal (controles). 63

Tabela 5 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G no sangue periférico de

pacientes com LLA-T ao diagnóstico (D0) e crianças saudáveis (controles). 64

Tabela 6 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G em 14 pacientes com LLA-T

ao diagnóstico (D0), terapia de indução - Dia 19 (D19) e consolidação - Dia 49 (D49). 65

Tabela 7 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G em pacientes com LLA-T ao

diagnóstico (D0), na terapia de indução - Dia 19 (D19) e na consolidação - Dia 49 (D49). 66

Tabela 8 – Diferenças nos níveis de citocinas e sHLA-G em LLA-T de acordo com os

níveis medulares de IL-10 ao diagnóstico, e os níveis de IFN-γ após a fase de

consolidação da quimioterapia. 74

Tabela 9 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no gene IL10

em pacientes com LLA-T e controles. 75

Tabela 10 – Frequência de haplótipos na região promotora de IL10 estudada presentes

nos pacientes com LLA-T e nos controles. 76

14

Tabela 11 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de ligação para os dois

polimorfismos estudados na região promotora de IL10 em relação aos pacientes com

LLA-T (sob a diagnonal) e aos controles (acima da diagonal). 76

Tabela 12 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no íntron 1

do gene IFNG em pacientes com LLA-T e controles. 77

Tabela 13 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no gene

TNF em pacientes com LLA-T e controles. 78

Tabela 14 – Frequência de haplótipos na região promotora de TNF estudada presentes

nos pacientes com LLA-T e controles. 79

Tabela 15 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de ligação para os cinco

polimorfismos estudados na região promotora de TNF em relação aos pacientes com

LLA-T (sob a diagonal) e aos controles (acima da diagonal). 79

Tabela 16 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados na 3’UTR

do gene HLA-G em pacientes com LLA-T e controles. 80

Tabela 17 – Frequência de haplótipos na região 3’ não-traduzida (3’UTR) de HLA-G

presentes nos pacientes com LLA-T e controles. 82

Tabela 18 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de ligação para os oito

polimorfismos estudados na 3’UTR de HLA-G em relação aos pacientes com LLA-T

(sob a diagnonal) e aos controles (acima da diagonal). 82

Tabela 19 – Associação de polimorfismos nos genes IL10, IFNG e TNF com óbito em


Tabela 20 – Análise de associação dos haplótipos da região promotora de IL10 com

óbito em pacientes com LLA-T. 87

15

Tabela 21 – Análise de associação dos haplótipos da região promotora de TNF com


Tabela 22 – Análise de associação dos haplótipos da região 3’UTR de HLA-G com


Tabela 23 – Análise de associação dos haplótipos da região 3’UTR de HLA-G com

leucócitos totais em sangue periférico ao diagnóstico (D0) em pacientes com LLA-T. 89

Tabela 24 – miRNAs diferencialmente expressos entre LLA-T e LLA-B com FDR ≤

4x10-5. 90

16

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATF Fator Ativador de Transcrição

AP1 Proteína Ativadora 1

C/EBP Proteína de Ligação/Acentuador CCATT

c-MAF Fator Fibrossarcoma c-Músculo-Aponeurótico

CREB Elemento de Resposta a AMP Cíclico

CREMα Modulador Alfa de Elemento de Resposta a AMP cíclico

EFS Event Free Survival

EGIL European Group for Immunological Classification of Leukemias

ETP Early-T Cell Precursor Leukemia

FAB French-American-British

FDR False Discovery Rate

GATA Família de Fatores de Transcrição

HLA-G Human Leukocyte Antigen G

IFN-γ Interferon Gama

IL-10 Interleucina 10

IL-17A Interleucina 17A ou 17

IL1-RA Antagonista do Receptor de Interleucina 1

IL-6 Interleucina 6

INCA Instituto Nacional de Câncer José de Alencar

IRF Fator de Regulação de Interferon

LLA Leucemia Linfoblástica Aguda

LLA-B Leucemia Linfoblástica Aguda de Células B

LLA-T Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T

LLC-B Leucemia Linfocítica Crônica de Células B

LMA Leucemia Mielóide Aguda

LMC Leucemia Mielóide Crônica

miRNA microRNA

NFAT Fator Nuclear Associado a Células T Ativadas

NF-κB Fator Nuclear κB

OMS Organização Mundial de Saúde

PU.1 (SPI1) Proto-oncogene Spi-1

17

RC Remissão Completa

SMD Síndrome Mielodisplásica

SNP Polimorfismo de Único Nucleotídeo

Sp Fator de Especificidade

STAT Proteína Transdutora de Sinal e Ativadora da Transcrição

Th1 T-helper 1 (T auxiliar do tipo 1)



TNF Fator de Necrose Tumoral

UTR Untranslated Region

YY-1 Fator de Transcrição Yin Yang 1

18

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 21

1.1 Câncer Infantil e Definição de Leucemia Aguda 21

1.2 A Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T 23

1.2.1 Classificação da LLA-T 23

1.2.2 Características clínicas e fatores de risco associados 24

1.3 Patogênese da LLA-T 25

1.4 Principais Alterações Genéticas na LLA-T 28

1.5 Imunovigilância e HLA-G 31

1.6 MicroRNAs e Leucemia 36

1.7 Microambiente Tumoral e Citocinas 39

1.8 Polimorfismos em Genes de Citocinas e Associação com Leucemia 42

2 OBJETIVOS 45

2.1 Objetivo Geral 45

2.2 Objetivos Específicos 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS 46

3.1 Desenho e População do Estudo 46

3.2 Considerações Sobre o Tratamento Quimioterápico dos Pacientes com LLA-T 47

3.3 Coleta das Amostras e Isolamento das Células 48

3.4 Quantificação de HLA-G Solúvel 48

3.5 Determinação do Perfil de Citocinas 49

3.6 Extração de DNA Genômico 49

3.7 Genotipagem da 3’UTR de HLA-G 50

3.8 Genotipagem das Regiões Promotoras dos Genes TNF e IL10 e do Íntron 1 de

IFNG 51

3.9 Extração de RNA Total e Análise de Qualidade e Integridade 52

3.10 Ensaios do Sequenciamento de MicroRNAs: preparação das bibliotecas e

sequenciamento de nova geração 53

3.11 Análise dos Dados de Polimorfismos Genéticos, Citocinas, sHLA-G,

Variáveis Clínicas e Sobrevida Geral 53

3.12 Análises dos Dados de MicroRNAs 55

3.12.1 Controle de qualidade e alinhamento das reads (leituras) 55

19

3.12.2 Análise de expressão diferencial de miRNAs 56

3.12.3 Predição de alvos de miRNAs 56

3.12.4 Anotação funcional dos genes alvos preditos 57

4 RESULTADOS 59

4.1 Níveis medulares de citocinas e HLA-G solúvel (sHLA-G) em LLA-T 61

4.1.1 Níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de pacientes com leucemia no dia

0 e em crianças com mielograma normal 62

4.1.2 Níveis de citocinas e sHLA-G no sangue periférico de pacientes com leucemia

no dia 0 e em crianças saudáveis 63

4.1.3 Comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de um subgrupo

de pacientes com amostra biológica para todos os tempos de tratamento:

diagnóstico (dia 0), terapia de indução (dia 19) e terapia de consolidação (dia 49) 64

4.1.4 Comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de pacientes ao

diagnóstico (dia 0) e nos dias 19 e 49 após o início do tratamento – Combinações

dos tempos de tratamento 65

4.1.5 Correlações entre os níveis de citocinas e sHLA-G da medula óssea durante o

tratamento 67

4.1.6 Efeito dos níveis de citocinas e sHLA, e de variáveis clínicas e laboratoriais na

sobrevida de pacientes com LLA-T 69

4.1.7 Avaliação da influência recíproca entre os níveis de citocinas e sHLA-G na

medula óssea de crianças com LLA-T 72

4.2 Polimorfismos em Genes de Citocinas e de HLA-G em LLA-T 74

4.2.1 Polimorfismos no promotor do gene IL10 75

4.2.2 Polimorfismo no íntron 1 do gene IFNG 77

4.2.3 Polimorfismos no promotor do gene TNF 77

4.2.4 Polimorfismos na 3’UTR do gene HLA-G 80

4.2.5 Associação de polimorfismos genéticos com óbito e sobrevida 83

4.3 Perfil de expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda da infância 89

4.3.1 Análise de predição de genes alvos de miRNAs 91

4.3.2 Anotação funcional dos genes alvos preditos 92

5 DISCUSSÃO 96

5.1 Níveis medulares de citocinas e HLA-G solúvel na leucemia linfoblástica aguda

de células T da infância e sua influência na sobrevida 96

20

5.2 O papel de polimorfismos em genes de citocinas e de HLA-G na ocorrência de

LLA-T 99

5.3 Perfil de expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda da infância:

diferentes regulações entre LLA-T e LLA-B 105

6 CONCLUSÕES 110

7 PERSPECTIVAS 111

REFERÊNCIAS 112

APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 128

APÊNDICE B – ANÁLISES DE ASSOCIAÇÃO DE HAPLÓTIPOS COM

LEUCÓCITOS EM SANGUE PERIFÉRICO AO DIAGNÓSTICO 130

APÊNDICE C – LISTA COMPLETA DE VIAS BIOLÓGICAS ENRIQUECIDAS

RELACIONADAS AOS GENES REGULADOS PELOS MIRNAS

DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS 131

ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA 135

ANEXO B – ARTIGOS PUBLICADOS NO DOUTORADO 136

21

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer Infantil e Definição de Leucemia Aguda

A leucemia aguda é uma desordem maligna do sistema hematopoiético que afeta crianças

e adultos, sendo considerada o câncer mais comum na infância, correspondendo em cerca de

30% dos cânceres infantis (PUI et al., 2012; PUI; ROBINSON; LOOK, 2008). É caracterizada

pela proliferação descontrolada de células precursoras hematopoiéticas, com alteração no

processo de maturação. O critério para definição de leucemia estabelecido inicialmente pelo

Sistema Franco-Americano-Britânico (FAB – French-American-British) considerou a presença

de mais de 30% de blastos na população de células não-eritróides da medula óssea (BENNETT

et al., 1985), contudo, a Organização Mundial de Saúde (OMS) sugere utilizar como critério a

presença de 25% ou mais blastos, mas também a presença de 20% ou menos de blastos quando

existe evidências clínicas de leucemia (ARBER et al., 2016; BEHM, 2003;VARDIMAN et al.,

2009).

A infiltração medular de células transformadas pode levar ao comprometimento na

produção dos diversos tipos de células hematológicas, acarretando complicações como a

ocorrência de anemia, infecções recorrentes e hemorragia (ABDUL-HAMID, 2013a;

KARRMAN; JOHANSSON, 2017).

As leucemias agudas podem ser classificadas de acordo com a linhagem acometida em

mieloide aguda (mieloblástica) e linfoide aguda (linfoblástica). A leucemia mieloide aguda

(LMA) correspondem a cerca de 5% dos cânceres pediátricos, enquanto a leucemia linfoblástica

aguda (LLA), a 25% dos casos, sendo considerada o câncer mais frequente na infância (WARD

et al., 2014).

Segundo dados do banco GLOBOCAN 2012, a incidência mundial de leucemia em 2012

foi de 2,7 casos/100.000 pessoas na faixa etária de 0 a 14 anos, e 2,2/100.000 para indivíduos

com idade entre 15 e 39 anos. Já as taxas de mortalidade estimadas foram 1,5/100.000 e

1,6/100.00 para indivíduos com idade entre 0 e 14 anos, e 15 e 39 anos, respectivamente

(FERLAY et al., 2013).

Nos Estados Unidos, em 2014 foram estimados 2.670 e 410 novos casos de LLA em

crianças e adolescentes, respectivamente, com a LLA correspondendo a 26% dos cânceres em

indivíduos com idade entre 0 e 14 anos (WARD et al., 2014).

No Brasil, o câncer foi a segunda causa de morte por doença em crianças e adolescentes

(1 a 19 anos) em 2014, com uma taxa média de mortalidade (2009 a 2013) ajustada por idade

22

de 32,07 por milhão na faixa etária de 0 a 14 anos e 44,25 por milhão para grupo com idade

entre 0 e 19 anos (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ DE ALENCAR GOMES

DA SILVA, 2016).

Segundo estudo realizado pelo Instituto Nacional de Câncer José de Alencar Gomes da

Silva (INCA), a taxa de incidência para câncer do grupo I (leucemias, doenças

mieloproliferativas e doenças mielodisplásicas) foi de 40,35 por milhão no grupo com 0 a 14

anos e 37,75 por milhão naquele com 0 a 19 anos de idade, respectivamente, considerando os

registros de base populacional de 2000 a 2010 (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ

DE ALENCAR GOMES DA SILVA, 2016).

Na região Nordeste, particularmente na cidade do Recife (Pernambuco), a taxa de

incidência de leucemias linfoides por 1 milhão de crianças e adolescente no período de 2003 a

2007 foi de 53,85 casos na faixa etária de 1 a 4 anos; 17,49 casos para faixa etária de 5 a 9 anos;

14,68 casos para grupo com idade entre 10 e 14 anos; e 9,40 casos para indivíduos com 15 a 19

anos. No geral, a taxa de mortalidade no Nordeste foi de 14,41 por milhão para as leucemias

em indivíduos do sexo masculino e feminino (0 a 19 anos) no período de 2009 a 2013

(INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ DE ALENCAR GOMES DA SILVA, 2016).

Embora as taxas de mortalidade sejam relativamente baixas no Nordeste, as leucemias

agudas são consideradas doenças graves que necessitam de um longo tratamento para atingir a

cura e um extenso período de acompanhamento para monitorar o risco de recaída e surgimento

de efeitos tardios, como segunda neoplasia, decorrentes do regime terapêutico inicial (WARD

et al., 2014).

Dentre as leucemias agudas da infância, a leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a mais

frequente e pode ser subdividada em dois tipos: a LLA de células B que corresponde a 85% dos

casos, e a LLA de células T, responsável por 15% das LLAs (PUI, 2008). A LLA-T apresenta

pior prognóstico do que a LLA-B e é considerada de alto risco, com taxa alta de mortalidade e

um tratamento mais intensivo, embora 70-80% das crianças acometidas atinjam a remissão

completa (KRASZEWSKA et al., 2012; SCHRAPPE et al., 2011).

A LLA-T apresenta um pico de incidência na faixa etária dos 9 anos e é predominante no

gênero masculino que exibe 3 vezes mais risco de desenvolver a doença (KARRMAN;

JOHANSSON, 2017). A baixa frequência da LLA-T em crianças, a sua heterogeneidade

genética e o conhecimento insuficiente acerca da biologia da doença são dificuldades

encontradas para avaliação do tratamento no desfecho da doença (KRASZEWSKA et al.,

2012), sendo necessários mais estudos, a fim de melhor compreender sua patogênese e,

23

consequentemente, refinar os tratamentos disponíveis para aumentar a sobrevida e a qualidade

de vida dos pacientes.

1.2 A Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T

1.2.1 Classificação da LLA-T

Morfologicamente, os blastos da LLA-T podem ser de dois tipos: a) L1 – células com alta

razão núcleo/citoplasma (N/C), nucléolo indistinto ou ausente, e ausência de mieloperoxidade

detectável por coloração citoquímica; b) L2–blasto do tipo II, célula grande com alta razão N/C,

cromatina irregular, não condensada, nucléolo visível e poucos grânulos azurofílicos (ABDUL-

HAMID, 2013b; BEHM, 2003; BENNETT et al., 1976).

Embora a morfologia e citoquímica forneçam informações sobre os blastos e sejam

importantes no diagnóstico da doença e definição do tipo de leucemia em linfoide ou mieloide,

elas não permitem a identificação da linhagem celular comprometida na leucemia (BEHM,

2003; ONCIU, 2009).

A identificação imunológica de antígenos de superfície, citoplasmáticos e nucleares,

também conhecidos como Cluster of differentiation (CD) presentes nos blastos permitem

identificar o estágio de maturação da célula transformada, ou seja, associar o estágio de

diferenciação de células progenitoras linfoides imaturas aos estágios iniciais de

desenvolvimento dos linfócitos T normais (ONCIU, 2009; PUI et al., 2012).

Segundo diretrizes do Grupo Europeu para Classificação Imunológica de Leucemias

(EGIL – European Group for Immunological Classification of Leukemias), a leucemia

linfoblástica aguda de células T pode ser classificada em cinco subtipos imunofenotípicos: pro-

LLA-T, pre-LLA-T, LLA-T-cortical e os tipos maduros αβ e γδ. Nesta classificação, todos os

subtipos apresentam CD3 citoplasmático e todos, com exceção do cortical, não apresentam

CD1a (BENE et al., 1995; KRASZEWSKA et al., 2012).

O subtipo pro-T é caracterizado pela expressão de CD7; o pre-T, pela expressão CD2

e/ou CD5 e/ou CD8; o T-cortical, por CD1a+; o maduro, pela expressão de CD3 de superfície,

sendo os grupos a e b caracterizados pela positividade para o receptor de células T (TCR) αβ e

γδ, respectivamente (BENE et al., 1995).

Diferentemente do EGIL, a classificação do St. Jude Children’s Research Hospital

considera primariamente a expressão de CD3 citoplasmático e CD7 para definição de LLA-T,

utilizando outros marcadores como CD5, CD1, CD4 e 8, CD10 e CD3 de superfície (sCD3)

24

para divisão da doença em 4 subtipos: pre-T (sCD3-/ CD5-/ CD1-/ CD4-/ CD8-/ CD10-), T-

inicial (sCD3-/ CD5+/ CD1-/ CD4-/ CD8±/ CD10-), T-comum (sCD3lo/ CD5+/ CD1±/ CD4±/

CD8±/CD10±) e T-tardio (sCD3hi/ CD5+/ CD1-/ CD4+ ou CD8+/ CD10-) (BEHM, 2003). Os

marcadores de prematuridade TdT (terminal deoxinucleotidiltransferase) e eventualmente

CD34 (30% a 50% de células) também são utilizados na caracterização imunológica de blastos

da linhagem T (CAMPANA; COUSTAN-SMITH, 1999).

1.2.2 Características clínicas e fatores de risco associados

As principais características clínicas apresentadas pelas crianças com LLA-T são

aumento do baço, fígado e linfonodos com presença de massa mediastinal e contagem de

leucócitos totais do sangue bem maior do que o observado em leucemias de células B, podendo

atingir mais de 50.000/µL (SCHRAPPE; STANULLA, 2003; UCKUN et al., 1998). Os

pacientes podem apresentar sintomas inespecíficos, como febre, fadiga, palidez, dor nos ossos,

e envolvimento de sistema nervoso central, além de frequentemente exibirem anemia,

trombocitopenia e granulocitopenia na presença ou ausência de leucocitose (AIFANTIS;

RAETZ; BUONAMICI, 2008; KARRMAN; JOHANSSON, 2017; SCHRAPPE; STANULLA,

2003).

Além dessas manifestações clínicas, frequentemente esses pacientes são caracterizados

em relação às alterações genéticas por estudos de citogenética e biologia molecular, uma vez

que diversos rearranjos e mutações genéticas têm sido relatados na doença e estão envolvidos

no seu desenvolvimento. Os achados moleculares mais evidentes são translocações envolvendo

os cromossomos 7 e 14, onde se localizam os genes para os receptores de células T, e mutações

em genes de supressores tumorais, fatores de transcrição e de proteínas envolvidas em

sinalização intracelular, sobrevivência e proliferação celular (BELVER; FERRANDO, 2016;

UCKUN et al., 1998), embora deleções e amplificações também sejam relatadas.

Diferentemente de outras leucemias, por exemplo, LLA-B e leucemia mielóide aguda

(LMA), essas características genéticas não apresentam valor prognóstico suficiente para

estratificação de risco, demonstrando o nível de heterogeneidade da LLA-T e a importância da

investigação dos fatores biológicos relacionados ao desenvolvimento da doença, a fim de

melhor entender a patogenia da doença e aperfeiçoar o tratamento clínico (PUI et al., 2011).

Ao longo das últimas décadas, mesmo com o avanço nas estratégias de tratamento e o

aumento significativo na sobrevida livre de evento, a LLA-T ainda é reportada com prognóstico

reservado quando comparada às LLA-B (LOCATELLI et al., 2012). Geralmente, os fatores

25

considerados de maior risco neste tipo de leucemia são alta contagem de leucócitos totais no

sangue, idade, subtipo de leucemia causado por precursores imaturos de células T (ETP, early-

T cell precursor leukemia) e ausência de resposta precoce a corticosteroide (ARICÒ et al., 2004;

COUSTAIN-SMITH, 2009; PUI et al., 2008, 2011).

1.3 Patogênese da LLA-T

A LLA-T, assim como outros cânceres pediátricos, é considerada uma doença complexa,

multifatorial, envolvendo a interação de múltiplas características genéticas e ambientais

(UCKUN et al., 1998), embora alguns casos estejam associados a predisposição genética

herdada em síndromes, como a Ataxia-Telangiectasia (JANIC et al., 2007).

Diversos fatores ambientais têm sido sugeridos com um papel na doença, podendo-se

citar exposição a substâncias químicas, radiação ionizante e não-ionizante, dieta materna e da

criança e infecções e alergia (BUFFLER et al., 2005). Em relação às infecções, duas hipóteses

são propostas: a hipótese de Kinlen (2004) e a hipótese de Greaves (GREAVES, 1999, 2006).

A hipótese de Kinlen chamada de “mistura populacional” é direcionada para aglomerados

de crianças com leucemia, e propõe que a ocorrência da doença seja resultado de uma resposta

rara a infecções específicas não-identificadas em indivíduos susceptíveis de áreas populacionais

que tiveram reduzida exposição a patógenos, característica mais comum a áreas isoladas ou

rurais. Essa exposição seria decorrente de movimentos populacionais não usuais, levando ao

influxo de pessoas infectadas para esses locais e, consequentemente, ao aumento na ocorrência

da leucemia (BUFFLER et al., 2005; KINLEN, 2004; PUI et al., 2008).

Já a hipótese de Greaves, chamada de “hipótese de infecção-retardada”, se baseia no

princípio de que o sistema imune necessita de exposições a patógenos tanto no período neonatal

como durante a infância para alcançar uma modulação eficiente da resposta imune e

estruturação da rede imunológica de células e citocinas. Assim, a reduzida ou ausente exposição

a infecções comuns no início da vida, principalmente devido à criação em ambiente de alta

higiene, resultaria na desregulação do sistema imune com consequente reposta patológica após

o indivíduo entrar em contato tardiamente com patógenos, culminando na proliferação

aumentada de células linfoides (GREAVES, 2009; PUI et al., 2008).

Greaves (2009) propõe ainda que o gatilho para a desregulação imunológica na leucemia

não é decorrente apenas da exposição retardada a infecções, mas enfatiza que outros fatores são

importantes para a ocorrência da doença, como a presença de um clone pré-maligno adquirido

26

no período pré-natal, e algum nível de susceptibilidade genética, por exemplo, variações

alélicas em genes codificantes de proteínas do sistema imune.

Estudos genéticos em neonatos (amostra do teste do pezinho) têm demonstrado a

existência de alterações genéticas em pacientes que desenvolveram leucemias agudas, incluindo

a LLA-T, sugerindo a importância de alterações genéticas durante a embriogênese no

desenvolvimento da doença, a relevância de tais modificações na ocorrência precoce de

leucemia (entre 0 e 5 anos de idade) e também a necessidade de alterações secundárias, pós-

natais, para o desencadeamento da doença (FASCHING et al., 2000; FORD et al., 1997;

GREAVES, 2006; MA et al., 2013).

Além disso, muitos destes estudos têm sido conduzidos em gêmeos monozigóticos

(BATEMAN et al., 2015; GREAVES et al., 2003; MA et al., 2013), a fim de estabelecer o grau

de influência genética na leucemia, bem como o período entre a detecção da primeira

modificação genética e a manifestação da doença – período conhecido como latência.

Desta forma, um modelo mínimo de história natural para a leucemia aguda em crianças,

incluindo a LLA-T, tem sido proposto (Figura 1).

Figura 1 – Modelo mínimo para história natural de leucemia aguda da criança.

Fonte: Adaptado de Greaves (2009, tradução nossa).

Nota: O gargalo na causa da leucemia se refere aos eventos que desencadeiam as alterações genéticas

secundárias pós-natais essenciais para a doença e que se desenvolvem em apenas 1% dos indivíduos

que apresentam um clone pré-leucêmico silencioso.

Na leucemia de células T, os principais eventos moleculares relacionados ao

desenvolvimento da doença atingem os genes implicados na ontogenia de células T, ou seja,

desde genes envolvidos no comprometimento de células progenitoras linfoides com a linhagem

T até aqueles relacionados ao processo de maturação da célula no timo, como os genes para os

27

receptores de células T (TCR). A Figura 2 ilustra o processo normal de hematopoiese e

diferenciação da célula T, e os oncogenes associados ao desenvolvimento tumoral que acomete

esta linhagem.

Além das diversas proteínas ilustradas participando do processo de migração de

progenitores para o timo e maturação das células no órgão, diversas moléculas solúveis

presentes no microambiente, como as citocinas, também desempenham papel fundamental no

desenvolvimento normal destas células e poucos estudos têm relacionado tais fatores com a

patogênese da LLA-T, e a resposta ao tratamento quimioterápico, aspectos importantes para um

maior conhecimento da biologia da doença e, principalmente, para o avanço na busca de novos

marcadores de prognóstico com possibilidade de aplicação terapêutica.

Figura 2 – Estágios da hematopoiese, desenvolvimento de célula T e oncogenes relacionados a

leucemia de células T.

Fonte: Adaptado de Aifantis; Raetz; Buonamici (2008, tradução nossa).

Nota: Células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (CTH) deixam o nicho quiescente e se

diferenciam se tornando progenitores multipotentes (PMPs). Tais PMPs posteriormente se

comprometem com a linhagem linfoide, gerando os progenitores linfoides comuns (PLC). Vários

subgrupos de progenitores linfoides (incluindo PMPs e PLCs) têm sido sugeridos para representar o

progenitor das células pró-T tímicas. Estes subgrupos migram para o timo (como progenitores iniciais

da linhagem de células T (ETPs, Early T‑cell-lineage progenitors)) e se comprometem com a linhagem,

avançando nos estágios de duplo negativo (DN; CD4-CD8-), DN2, DN3 e DN4. Mediante o sucesso na

recombinação do locus do receptor β de célula T (TCRB), as células pré-T adquirem a expressão do pre-

células pre-TCR-selecionadas atingem o estágio de duplo positivo (DP; CD4+CD8+), etapa em que são

submetidas ao processo de seleção positiva e negativa. As células selecionadas deixam o timo como

simples positiva (SP), sendo células T CD4+ ou CD8+. Os estágios de diferenciação em que os

oncogenes são conhecidos por estarem associados com a LLA-T e requeridos na medula óssea ou timo

estão representados. LMO2, LIM-only 2; TAL1, T-cell acute lymphocytic leukaemia 1. Ikaros, família

de proteínas zinc-finger; MYC e MYB, proto-oncogenes e fatores de transcrição; Notch1, membro da

família de protéinas NOTCH.

28

1.4 Principais Alterações Genéticas na LLA-T

Na LLA-T, aproximadamente 50% dos casos apresentam alguma anormalidade no

cariótipo, seja por um aumento ou redução no número de cromossomos - aneuploidia, por

translocações que podem levar à produção de genes fusionados ou à ativação de genes que

normalmente não são expressos pelas células T, ou deleções que podem caracterizar inativação

de genes supressores tumorais ou ativação de regulador transcricional. A maioria dos genes

envolvidos nas translocações são fatores de transcrição que regulam outros genes,

frequentemente relacionados à diferenciação, proliferação e sobrevivência celular (AIFANTIS;

RAETZ; BUONAMICI, 2008; GRAUX et al., 2006).

As translocações mais frequentes envolvem os loci dos genes dos receptores de células T

(TCR) 14q11 (TCRA/D) e 7q34 (TCRB), que podem ser encontradas em cerca de 35% dos casos

de LLA-T com diversos genes parceiros, entre eles HOX11, HOX11L2, TAL1, LYL1, LMO1 e

LMO2, entre outros. Rearranjos genéticos ocorrem provavelmente durante o estágio de

diferenciação da célula T, no processo de recombinação V(D)J que é essencial para a geração

de diversidade do TCR. Durante a etapa de recombinação, diversos genes transcritos no

processo de desenvolvimento do timócito podem estar com a cromatina em configuração aberta,

o que os deixa susceptíveis à ação das recombinases RAG1 e RAG2, e podem levar aos eventos

inadequados de rearranjo (AIFANTIS; RAETZ; BUONAMICI, 2008; GRAUX et al., 2006;

HUNGER; MULLIGHAN, 2015).

HOX11(TLX1) e HOX11L2(TLX3) são genes homeobox que produzem proteínas de

localização nuclear, com domínio de ligação a DNA e propriedades transcricionais de

transativação (DEAR et al., 1995).

HOX11 tem sido frequentemente relatado com expressão aberrante em células T devido

principalmente a duas translocações, a t(10;14)(q24;q11) e a t(7;10)(q35;q24). O produto deste

gene é essencial para a sobrevivência de células esplênicas durante o desenvolvimento fetal

murino, uma vez que camundongos hox11-/- nascem ausentes de baço (DEAR et al., 1995); o

gene não é expresso normalmente em células T e sua ativação transcricional é exclusiva da

leucemia de células T, não ocorrendo em LLA-B (KEES et al., 2003). As translocações

envolvendo este gene não produzem proteína quimérica, o que ocorre é uma mudança de

promotor, já que HOX11 é justaposto a elementos regulatórios dos genes TCRD ou TCRB,

ficando sob controle transcricional distinto, o que leva à desregulação do gene (HURET et al.,

2013; PÉROT, 1999).

29

Além disso, outros mecanismos de ativação de HOX11 têm sido sugeridos, uma vez que

a expressão do gene pode ocorrer em LLA-T da infância na ausência de aberração no

cromossomo 10q24. Alteração no padrão de metilação do promotor do gene, mutações em

sequências cis-regulatórias, fatores trans-regulatórios dentre outros são alguns mecanismos

alternativos que podem levar a desregulação de HOX11 (KEES et al., 2003; WATT et al., 2000).

O papel de HOX11 no desenvolvimento tumoral tem sido relacionado a sua função

primordial na sobrevivência celular, sendo sugerido que a expressão aberrante nas células T

pode prolongar o tempo de vida destas células (DEAR et al., 1995).

HOX11L2 também apresenta expressão anormal em leucemia de células T e foi

identificado nos pontos de quebra da translocação críptica t(5;14)(q35;q32) que envolve o gene

BCL11B (CTIP2). O rearranjo cromossômico gera a desregulação de HOX11L2, uma vez que

este fica sob controle de sequências regulatórias de BCL11B, altamente expresso durante a

diferenciação de linfócitos T (BERGER, 2002; BERNARD et al., 2001). Em condições

normais, HOX11L2 participa do desenvolvimento do centro respiratório medular ventral, sendo

camundongos deficientes para este gene portadores de uma síndrome semelhante a

hipoventilação central congênita (SHIRASAWA et al., 2000). Ele apresenta um perfil de

expressão restrito, não sendo detectado em baço e linfócitos periféricos de adulto, nem em

medula óssea normal. Entretanto, uma baixa expressão foi observada em timo e baço fetais, e

em timo de adulto, em contraste com a alta expressão de HOX11L2 encontrada em amostras de

LLA-T, mostrando que a expressão do gene no tecido hematopoiético está associada ao fenótipo

maligno (BALLERINI et al., 2002). O mecanismo pelo qual HOX11L2 exerce uma função na

tumorigênese é desconhecido, entretanto a translocação está presente em cerca de 20% dos

casos de LLA-T da infância e foi associada a um pobre prognóstico (BALLERINI et al., 2002).

Outro gene muito reportado em LLA-T é TAL1, também chamado de SCL ou TCL5 e

localizado no cromossomo humano 1p32. Ele codifica uma proteína que pertence à família de

fatores de transcrição hélice-alça-hélice básico, podendo formar heterodímeros com diversas

moléculas desta família, entre elas a proteína E2A que modula a transcrição de genes, e dessa

forma sua alteração pode prejudicar a regulação gênica normal da célula (AIFANTIS; RAETZ;

BUONAMICI, 2008; SANDA et al., 2012).

Aberrações no gene TAL1 são encontradas em até 30% das leucemias de células T,

entretanto a maior proporção dessas alterações se deve a deleções intracromossômicas que

levam a retirada de todos os éxons codificantes do gene SIL, localizado upstream de TAL1, e

da região 5’ não traduzida deste último, resultando na fusão SIL-TAL1, que apresenta a região

codificante do gene TAL1 sob controle transcricional direto do promotor de SIL (VAN DER

30

BURG et al., 2002). Essa modificação culmina com a expressão desregulada da proteína TAL1,

que embora seja normalmente expressa em células hematopoiéticas de linhagem eritróide e

megacariocítica de cérebro adulto e embrionário, em células-tronco hematopoiéticas e linhagem

de mastócitos, não é produzida em células de linhagem linfoide (HURET; LABASTIE, 1998;

VAN DER BURG et al., 2002). TAL1 é essencial para o desenvolvimento da hematopoiese,

uma vez que camundongos mutantes SCL/tal1-/-, que carecem desta proteína apresentam falha

na geração de diversas células da linhagem hematopoiética, hematopoiese indetectável e anemia

fatal durante o desenvolvimento embrionário (PORCHER et al., 1996). Além da fusão SIL-

TAL1, outros eventos de alteração genética podem levar à expressão ectópica de TAL1 em

linfócitos T, como a translocação t(1;14)(p32;q11) encontrada em cerca de 3% dos casos de

LLA-T, e as translocações t(1;7)(p32;q35), t(1;3)(p32;p21) e t(1;5)(p32;q31), que são raras e

pouco conhecidas (HURET, 1998a,b,1999; VAN DER BURG et al., 2002).

Embora todas essas alterações genéticas sejam encontradas na leucemia de células T,

existem controvérsias sobre seu valor prognóstico na doença. Ballerini et al. (2002)

relacionaram a expressão aberrante de HOX11L2 a ocorrência de recaída em crianças com

LLA-T, enquanto Cavé et al. (2004) não encontrou uma diferença significante no prognóstico

de pacientes positivos para expressão de HOX11L2 e HOX11, e para a fusão SIL-TAL em

relação a sobrevida geral e sobrevida livre de evento.

É importante ressaltar que mesmo não sendo utilizado como fator para estratificação de

risco nos protocolos de tratamento, os rearranjos genéticos são importantes sobretudo no

acompanhamento clínico dos pacientes, pois, uma vez detectados, podem ser utilizados na

pesquisa de doença residual mínima, empregada na avaliação da resposta ao tratamento, e

eventual modificação do esquema terapêutico.

Além dos genes mencionados, diversos outros genes associados a translocações

cromossômicas, deleções, duplicações e mutações, como MLL, P15, P16, e NOTCH1, em

conjunto com fatores imunológicos, estão de alguma forma envolvidos na quebra da

homeostase celular, contribuindo para o desenvolvimento do câncer.

A Tabela 1 mostra as principais alterações genéticas em LLA-T e suas frequências.

Tabela 1 – Alterações genéticas encontradas em LLA-T. (Continua).

Gene Alteração genética Frequência (%)

HOX11 (TLX1) t(10;14)(q24;q11) 5-10 t(7;10)(q35;q24)

HOX11L2 (TLX3) t(5;14)(q35;q32) 20-25

31

Tabela 1 – Alterações genéticas encontradas em LLA-T.

(Conclusão)

Gene Alteração genética Frequência (%)

TAL1 t(1;14)(p32;q11) 3

t(1;7)(p32;q34) <1

Mutações geradores de 5’super-

enhancer

5

Deleção de 1p32 25

MLL (KMT2A) t(11;19)(q23;p13) 5

NOTCH1 t(7;9)(q34;q34.3) <1

Mutação ativadora >60

Fonte: Adaptado de Belver; Ferrando (2016, tradução nossa).

Legenda: % percentagem de pacientes positivos para a alteração.

1.5 Imunovigilância e HLA-G

A capacidade do sistema imune reconhecer células inicialmente transformadas ou

neoplásicas e eliminá-las evitando sua expansão é definida como imunovigilância. A

imunovigilância faz parte do processo de imunoedição do câncer, que compreende três etapas

conhecidas como: (i) eliminação, (ii) equilíbrio e (iii) escape (DUNN et al., 2002). Neste

processo, diversas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) têm sido

reportadas com reduzida ou alterada expressão, ou mesmo expressão ausente, de maneira que

a apresentação de antígenos tumorais para células efetoras se torna prejudicada e,

consequentemente, contribui para a evasão do câncer à resposta imune (YAN, 2011).

O antígeno leucocitário humano G (HLA-G) é uma das moléculas do MHC de classe I,

não clássica, codificada pelo gene HLA-G, localizado no cromossomo humano 6p21.3,

caracterizada por apresentar baixo polimorfismo na região codificante, expressão restrita,

diversidade genética nas regiões não codificantes, função distinta e, várias isoformas devido a

ocorrência de splicing alternativo (CAROSELLA et al., 2008).

HLA-G é fisiologicamente expresso principalmente em células trofoblásticas, na medula

do timo de adulto, na córnea, ilhotas pancreáticas, matriz da unha, precursores eritróides e

endoteliais, e células-tronco mesenquimais (CAROSELLA et al., 2008; CASTELLI et al.,

2010; YAN, 2011).

Quando comparado a outros genes do complexo HLA, o gene HLA-G aparentemente

apresenta oito éxons, mas devido a presença de um códon de parada no éxon 6, o éxon 7 está

sempre ausente no RNA mensageiro (mRNA) maduro, e o éxon 8 representa a região 3' não

traduzida (UTR – Untranslated region). Entretanto, a literatura mundial continua considerando

o gene HLA- G com 8 éxons. A proteína apresenta estrutura semelhante às moléculas HLA de

32

classe I clássicas, com algumas isoformas apresentando uma cadeia leve associada à β2-

microglobulina, como resultado do processamento diferencial da molécula. Assim, o gene

codifica apenas a cadeia leve, sendo a β2-microglobulina codificada pelo gene B2M no

cromossomo humano 15q21.1 (DONADI et al., 2011).

O éxon 1 codifica o peptídeo sinal; os éxons 2, 3 e 4, as porções extracelulares de HLA-

G α1, α2 e α3, respectivamente; e os éxon 5 e 6 são responsáveis pela produção da região

transmembrana e do domínio citoplasmático ou intracelular da molécula. Por splicing

alternativo, HLA-G pode gerar 7 isoformas, sendo 4 delas ligadas à membrana (HLA-G1, -G2,

-G3 e –G4) e três solúveis (HLA-G5, -G6 e -G7) (DONADI et al., 2011).

As isoformas HLA-G1 e -G5 são as únicas que possuem os 3 domínios extracelulares e

encontram-se ligadas a molécula de β2-microglobulina. Adicionalmente, uma forma solúvel da

isoforma HLA-G1 pode ser gerada pela clivagem proteolítica da molécula ligada à membrana.

HLA-G2 e -G6 apresentam os domínios extracelulares 1 e 3; HLA-G3 e G7 apenas o

domínio 1 e a molécula HLA-G4, os domínios 1 e 2 (DONADI et al., 2011; REBMANN,

2007; YAN, 2011).

A Figura 3 ilustra as diferentes isoformas produzidas pelo processamento diferencial do

mRNA de HLA-G.

Figura 3 – Isoformas de HLA-G geradas pelo processamento alternativo do

mRNA do gene HLA-G.

Fonte: Adaptado de Donadi et al. (2011, tradução nossa).

Nota: A Figura mostra a estrutura do mRNA de HLA-G e os transcritos que podem

ser gerados por processamento alternativo. A partir desse mecanismo, quatro

isoformas ligadas à membrana e três isoformas solúveis podem ser produzidas

pelo gene.

33

É importante ressaltar que os domínios globulares α1 e α2 de HLA-G formam uma fenda

de ligação a peptídeo muito similar à apresentada pelo MHC de classe I clássico, e um estudo

com uma linhagem de células linfoblastóides B mostrou que a molécula HLA-G apresenta a

capacidade de acoplar peptídeos (LEE et al., 1995). Entretanto, esse processo não representa a

regra e não tem sido amplamente relatado pela literatura, de maneira que a função primária de

HLA-G não constitui a apresentação de antígenos a células do sistema imune. Diferentemente,

a proteína apresenta propriedades imunomoduladoras, exercendo efeitos inibitórios sobre

diversas células do sistema imunológico, como células NK, linfócitos T CD8+, células

dendríticas, monócitos e linfócitos B (ROUAS-FREISS et al., 2014), entre outras.

A molécula HLA-G teve sua função imunológica inicialmente descrita na interface

materno-fetal, onde as células do citotrofoblasto fetal com expressão da proteína de superfície

apresentaram efeito inibitório sobre a atividade citolítica de células NK da decídua materna,

desempenhando papel na tolerância do feto pela mãe, que age biologicamente como enxerto

semi-alogênico (CAROSELLA, 2011; ROUAS-FREISS et al., 1997). A forma solúvel da

proteína também foi encontrada no sangue de gestante, na placenta e no líquido amniótico,

reforçando a importância de HLA-G neste mecanismo de tolerância (WILCZYRISKI, et al.,

2006). A expressão reduzida da molécula e polimorfismos no gene têm sido associados a

abortos de repetição e eclampsia, ou seja, a uma incapacidade do HLA-G exercer sua atividade

inibitória sobre a resposta imune materna na gestação (BARAKONYI et al., 2002;

HYLENYUS et al., 2004).

Em relação a condições patológicas, uma expressão aumentada de HLA-G foi observada

em vários tumores, incluindo carcinoma renal (BUKUR et al, 2003), pulmão (YIE et al., 2007),

ovário (LIN et al., 2007), doenças hematológicas (GROS et al., 2006) entre outros, sendo tal

característica relacionada a um mecanismo de evasão da reposta imunológica de forma similar

ao que ocorre na gestação (WILCZYRISKI, et al., 2006). Uma expressão alterada de HLA-G

também tem sido relatada em outras condições, como em doenças autoimunes, em rejeição de

transplantes, em infecções virais e em inflamação (CRISPIM et al., 2008; RIZZO et al., 2008,

2012; YAN et al., 2009).

O papel imunossupressor de HLA-G é exercido pela interação das isoformas de

membrana expressas pelas células tumorais (no caso de câncer) com receptores inibitórios de

células NK (KIR2DL4), de células B (ILT2 [símbolo atual - LILRB1]), de células T e

monócitos (ILT4 [símbolo atual – LILRB2]), inibindo a atividade citotóxica dessas células

(LEMAOULT et al., 2003; REBMANN et al. 2007), que em condições normais promoveriam

a destruição das células tumorais. HLA-G interage também com células dendríticas (CD) via

34

ILT2 e ILT4, provocando inibição da maturação dessas células, redução na capacidade de

apresentação de antígenos, e também indução de CD tolerogênicas, o que também contribui no

processo de escape do câncer ao ataque do sistema imune (ROUAS-FREISS et al., 2014). A

Figura 4 mostra os principais efeitos que HLA-G gera nas células que expressam os receptores

KIR2DL4, ILT2 e ILT4.

A expressão de HLA-G é regulada principalmente pela região promotora e pela região 3’

não traduzida do gene. Na 3’UTR, dois mecanismos distintos têm sido associados à regulação

de HLA-G: a presença de uma inserção de 14 pares de base (pb) (rs371194629) e de guanina na

posição +3142 (rs1063320). A presença dos 14 pb leva a um evento adicional de splicing, que

culmina com a deleção de 92 bases da 3’UTR do RNA mensageiro, e influencia o

processamento diferencial e a estabilidade da molécula. As isoformas de mRNA que exibem as

92 bases são mais sensíveis à degradação e, portanto, apresentam menor estabilidade molecular;

enquanto aqueles mRNAs com deleção de 92 bases na 3’UTR estão menos propensos à

degradação, exibindo maior estabilidade e meia vida da molécula (HVIID et al., 2003;

ROUSSEAU et al., 2003).

Figura 4 – Efeitos inibitórios exercidos pela molécula HLA-G.

Fonte: Adaptado de Rouas-Freiss et al. (2014, tradução nossa). Nota: A molécula HLA-G solúvel ou de superfície produzida por uma célula tumoral pode exercer diversos

efeitos inibitórios em células do sistema imune pela interação com seus receptores ILT4 e ILT2,

contribuindo para uma falha no processo de Imunovigilância do câncer.

35

Em relação ao sítio polimórfico +3142 (rs1063320), a presença de guanina leva ao

aumento da afinidade a microRNAs (miRNAs) específicos (miR-148a, miR-148b e miR-152)

e, consequentemente, à diminuição na expressão de HLA-G (CASTELLI et al., 2009; TAN et

al, 2007), uma vez que os miRNAs (pequenas moléculas de RNA endógenas) atuam no controle

pós-transcricional de genes impedindo a tradução de RNAs mensageiros em proteínas

(BARTEL, 2004).

Além desses dois sítios variantes, mais 6 polimorfismos foram descritos na 3’UTR de

HLA-G (+3003 C/T (rs1707), +3010 C/G (rs1710), +3027 A/C (rs17179101), +3035 C/T

(rs17179108), +3142 C/G (rs1063320), +3187 A/G (rs9380142) e +3196 C/G (rs1610696)),

evidenciando a variabilidade genética existente nessa região. Alguns desses polimorfismos

também parecem estar envolvidos na afinidade a miRNAs, e, portanto, devem exercer um papel

na regulação pós-transcricional do gene (CASTELLI et al., 2009).

Em relação à leucemia, uma expressão alterada de HLA-G tem sido relatada por diversos

autores (GROS et al., 2006; NUCKEL et al., 2009; YAN et al., 2008).

Gross et al. (2006) analisaram os níveis de HLA-G solúvel (sHLA-G) em plasma de

pacientes com leucemia aguda (LMA, n= 47; LLA-B, n= 11; LLA-T, n= 17) e mostraram um

aumento na expressão de sHLA-G em 74% das LMA e 89% das LLA em relação ao controle

de indivíduos saudáveis. Os casos de LLA-T exibiram níveis de expressão mais altos do que os

de LLA-B e os níveis elevados da molécula apresentaram associação com leucocitose.

Em outro estudo, o nível de expressão de HLA-G foi determinado por citometria de fluxo

em células B isoladas de sangue periférico de 47 pacientes adultos diagnosticados com leucemia

linfóide crônica de células B (LLC-B). Foi observada uma correlação entre o número de células

com HLA-G de superfície e a presença de imunossupressão humoral e celular, revelada pelo

nível de IgG sérico, número total de células T e células CD4+, além do nível de expressão de

sHLA-G no plasma. Os pacientes com menor percentagem de células HLA-G-positivas

apresentaram sobrevida geral maior do que aqueles com maior percentagem. Adicionalmente,

na análise multivariada foi demonstrado que a expressão de HLA-G é um melhor fator

independente preditor de progressão da doença do que a proteína associada a Zeta 70 (ZAP-

70), marcador prognóstico já estabelecido, perdendo apenas para a classificação de Binet para

estadiamento da doença (NÜCKEL et al., 2009).

Ainda sobre a expressão de HLA-G nas leucemias, Yan et al (2008) não encontrou

expressão da proteína em LLA-B (n=13), mas observou expressão em 18,5% dos pacientes com

LMA (n=54), 22,2% daqueles com leucemia mielóide crônica (LMC) (n=9) e 18,2% dos

pacientes síndrome mielodisplásica (SMD, n=11). Nesse estudo, a expressão de HLA-G foi

36

determinada por citometria de fluxo e apenas as LMA HLA-G+ mostraram-se associadas a um

aumento na percentagem de blastos e a diminuição do total de linfócitos T em relação as LMA

HLA-G-. Este estudo também realizou ensaios funcionais e revelou a inibição exercida pelas

células LMA HLA-G+ sob a lise celular exercida pela linhagem celular NK-92, utilizando

ensaios de citotoxicidade.

A maioria desses estudos foi conduzida em leucemia de adulto, e pouco se sabe sobre o

papel do HLA-G na leucemia da infância, especialmente nas leucemias de células T, que além

de ter pior prognóstico e menor taxa de sobrevida em relação à LLA-B, é caracterizada por

grandes lacunas do conhecimento relativo a sua patogênese. Além disso, o estudo da expressão

de HLA-G em LLA-T contribui na qualificação do HLA-G como marcador de prognóstico na

leucemia, e a possibilidade da sua utilização como alvo para tratamento.

1.6 MicroRNAs e Leucemia

Em adição às alterações numéricas e/ou translocações cromossômicas, existem ainda

diversos genes e moléculas, incluindo proteínas do sistema imune, que podem estar alteradas

na LLA-T. Dentre essas moléculas, merecem destaque os microRNAs (miRNAs) cuja primeira

ligação com câncer foi descrita em leucemia linfocítica crônica de células B (LLC-B), sendo

demonstrada desregulação na expressão de miR-15 e miR-16, miRNAs localizados na região

13q14 que frequentemente está deletada em LLC-B (CALIN et al., 2002).

Os miRNAs são pequenos RNAs endógenos, de fita simples e não-codificantes que

apresentam aproximadamente 22 nucleotídeos de tamanho e atuam reprimindo a expressão de

proteínas ou promovendo a degradação de mRNAs específicos (alvo) pela ligação direta a

3’UTR destas moléculas (BARTEL, 2004; LING; FABBRI; CALIN, 2013; O’CONNELL et

al., 2010). A Figura 5 mostra a biogênese e os mecanismos de ação dos miRNAs.

Os miRNAs podem ser codificados por genes em diversas regiões no genoma, incluindo

regiões intrônicas, exônicas ou intergênicas, sendo transcritos em sua maioria pela ação da RNA

polimerase II. Além disso, eles podem ser transcritos como uma unidade policistrônica,

característica de miRNAs em cluster no genoma (HAYES; PERUZZI; LAWLER, 2014; LIN;

GREGORY, 2015).

Assim como os mRNAs, os miRNAs participam de vários processos biológicos

fundamentais para o desenvolvimento normal de uma célula, como diferenciação e proliferação

celular, apoptose e sobrevivência celular, e estágios de desenvolvimento de um organismo,

tendo a expressão altamente regulada no contexto celular, com a participação de diversas

37

moléculas em cada etapa da biogênese (HA; KIM, 2014; WINTER et al., 2009). Também estão

envolvidos no processo de maturação das células T no timo e mecanismos regulatórios de

autoimunidade (MACEDO et al., 2015).

Figura 5 – Biogênese e mecanismos de ação dos miRNAs.

Fonte: Adaptado de Ling; Fabbri; Calin (2013, tradução nossa).

Nota: O miRNA é inicialmente transcrito como miRNA primário (pri-miRNA) e processado em precursor (pre-

miRNA) pelo complexo microprocessador, composto pelas proteínas Drosha e DGCR8 (Di George syndrome

critical region 8). O pre-miRNA é transportado do núcleo para o citoplasma pela exportina 5 na presença do

cofactor Ran-GTP e, posteriormente, processado na sua forma madura pela Dicer. O miRNA maduro é recrutado

para o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e regula a produção de genes codificadores de proteínas por meio de diversos mecanismos. A interação de miRNAs com a região 3' não-traduzida (3' UTR) de

genes codificantes de proteínas é considerado o principal mecanismo, levando a uma diminuição dos níveis

proteicos seja por degradação do mRNA ou pela inibição da tradução. Também tem sido sugerido que os miRNAs

interagem com a 5’ UTR de genes codificantes de proteínas por complementaridade, causando repressão da

tradução ou ativação de proteínas alvo. De maneira semelhante, os miRNAs podem atingir sequências

codificadoras e inibir a tradução de genes alvo. Ainda, os miRNAs podem interagir com complexos de proteínas

regulatórias, como Argonauta 2 (AGO2) e FXR1 (Fragil X mental retardation-related protein 1) e induzir

indiretamente a tradução de um gene alvo. A produção de miRNAs pode ser aumentada ou bloqueada mediante

várias estratégias inespecíficas, no entanto, a regulação precisa pode ser alcançada pelo uso de mimetizadores de

miRNAs (miRNA mimics), anti-miRNAs, miRNAs antagônicos (antagomiRs) e esponjas de miRNAs, que se

ligam e bloqueiam funcionalmente miRNAs específicos. LNA, ácido nucléico bloqueado; ARE, elemento rico em

AU; TNF, fator de necrose tumoral.

38

Cada miRNA pode ter o potencial de reprimir a expressão de diversos genes alvo e mais

de 100 deles são expressos pelas células do sistema imune, apresentando assim a capacidade de

influenciar amplamente vias moleculares associadas ao desenvolvimento e função das respostas

imunes inata e adaptativa. Além disso, tem sido observado que a expressão de miRNAs está

notadamente desregulada em cânceres de origem imunológica, onde tais moléculas podem

apresentar atividades de supressão ou promoção tumoral dependendo da natureza de seus RNAs

mensageiros (mRNA) alvo (O’CONNELL et al., 2010).

Os miRNAs são moléculas mais estáveis em células e tecidos do que os mRNAs, e

podem ser secretadas em vesículas lipídicas e exossomos, sendo liberadas em fluidos biológicos

como sangue, urina, saliva e outros. Devido a isso, são consideradas mais informativas sobre

os eventos moleculares de uma dada situação biológica do que os mRNAs, podendo ser usados

como biomarcadores no diagnóstico e prognóstico de diversos tipos de câncer, como LLC-B,

câncer de cérebro pediátrico, câncer de ovário, câncer de mama, entre outros (HAYES;

PERUZZI; LAWLER, 2014; LING; FABBRI; CALIN, 2013).

Em 2005, foi demonstrado que o padrão de expressão de miRNAs era capaz de

classificar tumores humanos, incluindo seus subtipos genéticos. Diversos tumores sólidos,

como de próstata, bexiga, mama, rim, derivados do trato gastrointestinal e tumores

hematológicos, incluindo leucemias agudas e linfoma de grandes células B, foram

diferenciandos com base na expressão de miRNAs (LU et al., 2005).

A investigação de expressão diferencial de miRNAs que atuam em mRNAs de genes do

sistema imune, bem como nos mRNAs de genes envolvidos no câncer ou malignização celular

é importante para o entendimento das bases biológicas da evasão do câncer à resposta

imunológica, da promoção tumoral e também para possível utilização dessas moléculas na

terapia clínica contra o câncer.

Em um estudo com LLA-T em crianças, a análise do perfil global de expressão de

miRNAs após depleção de TAL1, juntamente com uma análise global de regiões de ligação para

a proteína revelou genes de miRNAs diretamente controlados por TAL1 e seus parceiros

regulatórios, como o miR-223. A superexpressão de miR-223 sob regulação de TAL1 levou à

redução na expressão de FBXW7, um importante supressor de tumor. Por outro lado, o

knockdown de TAL1 levou ao aumento dos níveis da proteína FBXW7 e uma diminuição de

seus substratos, como MYC e NOTCH1. Tais achados demonstraram que a regulação miR-223

por TAL1 promove o fenótipo maligno em LLA-T por meio da repressão do supressor tumoral

FBXW7 (MANSOUR et al., 2013).

39

Outros autores também têm relacionado o miR-223 a leucemias, como Papakonstantinou

et al. (2013) que reportaram expressão aumentada do miRNA em pacientes com LLC

portadores de mutação no gene IGVH (região variável da cadeia leve de imunoglobulina) em

relação àqueles sem a matução, e Mavrakis et al. (2011) que identificaram 5 miRNAs (miR-

19b, miR-20a, miR-26a, miR-92 e miR-223) capazes de promover o desenvolvimento de LLA-

T em modelo murinho e implicados na patogênese da doença em humano.

Outro miRNA muito relatado na literatura em leucemias, tumores sólidos e na imunidade

é o miR-155 (FERRAJOLI et al., 2013; HIGGS; SLACK, 2013; SONKOLY; STAHLE;

PIVARCSI, 2008). Em estudo com pacientes LLC-B, foi demonstrado níveis de miR-155

significativamente superexpressos na progressão de células B normais para linfocitose

monoclonal de células B (LMB) e para LLC. Esta pesquisa também revelou altos níveis de

expressão plasmática deste miRNA em pacientes que não alcançaram resposta completa

comparados àqueles que alcançaram, demonstrando o valor prognóstico do miR-155

(FERRAJOLI et al., 2013).

Os estudos de miRNAs em leucemia são conduzidos na sua maioria em adultos e pouco

se sabe sobre o papel de miRNAs nas leucemias da infância, além do mais o conhecimento

gerado é limitado a amostra de sangue periférico, pouco se sabendo sobre o controle dos

miRNAs na regulação da expressão gênica na medula óssea crianças com leucemia,

microambiente tumoral principal na leucemia.

1.7 Microambiente Tumoral e Citocinas

Assim como a proteína HLA-G, diversas outras moléculas do sistema imune podem

apresentar expressão anormal no câncer, incluindo as citocinas e os receptores para estas

proteínas. No microambiente da medula óssea, as células estromais (fibroblastos, adipócitos,

células endoteliais e osteoblastos) são a maior fonte de fatores de crescimento e citocinas tanto

em condições normais como em patológicas, entretanto, na leucemia os blastos também

produzam estas moléculas. As células alteradas geneticamente secretam citocinas e quimiocinas

alterando o microambiente tumoral, e a quebra da homeostasia medular favorece a criação de

nichos de células anormais. O blasto pode ainda interagir com as células do estroma de maneira

semelhante ao que ocorre na adesão célula-célula com progenitores hematopoiéticos normais.

Esta interação pode contribuir para o crescimento e a sobrevivência dos blastos, mas também

na resistência a terapia e persistência de doença residual mínima (AYALA et al., 2009;

BAKKER et al., 2016).

40

No contexto do microambiente tumoral da leucemia, as citocinas também apresentam um

papel chave na sobrevivência dos blastos, entretanto, o papel preciso dessas proteínas na

sobrevivência, proliferação das células malignas e na progressão e prognóstico das leucemias,

especialmente na LLA-T, não está bem esclarecido. É de conhecimento geral que a complexa

rede de citocinas e sua sinalização é aberrante nas leucemias. A Figura 6 mostra as interações

entre blastos leucêmicos e células do estroma no microambiente da medula óssea.

Figura 6 – Microambiente tumoral na leucemia: interações entre os blastos e as células estromais da medula

óssea.

Fonte: Adaptado de Ayala et al. (2009, tradução nossa).

Nota: Blastos leucêmicos e células estromais produzem fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de

crescimento básico de fibroblasto (bFGF) e outros mediadores proangiogênicos que também apresentam efeitos

pró-tumorais parácrinos e autócrinos. Integrinas e o receptor CXCR4 são fundamentais para a adesão blasto-estroma e mediam o homing dos blastos e persistência de doença residual após o tratamento. Diferentes

mecanismos têm sido descritos para leucemia mielóide aguda (LMA) e leucemia linfoblástica aguda (LLA), a

última sendo mais dependente do bFGF do que do VEGF como mediador proangiogênico. O microambiente em

LLA é também mais rico em mediadores como interleucinas e em asparagina sintetase, outro mecanismo de

resistência ao tratamento. CXCL12, quimiocina C-X-C ligante 12; IL-7, interleucina 7; IL-8, interleucina 8.

41

Park et al. (2006), estudando pacientes com leucemia aguda (95 LMA, 25 LLA e 11

leucemias bifenotípicas), mostraram que os níveis intracelulares das citocinas IL-4, IL-10 e

IFN-em linfócitos T (não leucêmicos) da medula óssea reduziram significantemente no tempo

de remissão completa em relação ao diagnóstico, se tornando comparáveis aos obtidos nos

controles. Estes achados são importantes sobretudo quando consideradas as funções

desempenhadas pelas respectivas citocinas. IL-4 é uma proteína que inibe a produção de

citocinas pró-inflamatórias, promove crescimento de linfócitos T CD8+ e a diferenciação de

células Th2 (perfil anti-inflamatório) (MOQATTASHI; LUTTON, 2004), e um efeito supressor

e antitumoral de uma variante da proteína (BAY 36-1677) foi reportado em células de LLA-B

(SRIVANNABOON et al., 2001). Já IL-10 apresenta função imunossupressora de perfil Th2,

que inibe a liberação de citocinas pró-inflamatórias e reduz a expressão constitutiva e induzida

por IFN-de moléculas do MHC de classe II e moléculas coestimulatórias (SABAT et al.,

2010). Assim, IL-10 pode ter um efeito supressor em leucemias, mas também pode ser um fator

de escape no processo de imunovigilância no câncer, pois exerce um efeito positivo na

expressão de HLA-G de superfície (GROSS et al., 2006; ROUAS-FREISS et al., 2014). Por

último, IFN-é uma citocina pró-inflamatória que induz a expressão de moléculas MHC I e

está envolvida na regulação do crescimento de células leucêmicas e normais (MOQATTASHI;

LUTTON, 2004).

Em outro estudo sobre o microambiente tumoral, os níveis séricos de TNF, IL-6, IL-10,

IL-1RA e endostatina foram avaliados em pacientes com LMA e síndrome mielodisplásica ao

diagnóstico e comparados com controles. Foi observado que altos níveis de TNF estavam

associados a menores taxas de remissão completa (RC) e que a taxa de RC foi maior em

pacientes com níveis de TNF mais baixos em comparação àqueles com níveis mais altos

(TSIMBERIDOU et al., 2008).

Ainda, os níveis de TNF foram associados à sobrevida geral e à sobrevida livre de evento

(EFS – Event free survival), sendo a sobrevida geral maior nos pacientes com níveis reduzidos

em relação àqueles com dosagens aumentadas. Os altos níveis de TNF se mostraram

correlacionados a elevadas concentrações de β2-microglobulina e as moléculas IL-6, IL-10,

IL1-RA e endostatina não foram correlacionadas a RC, sobrevida geral e EFS (TSIMBERIDOU

et al., 2008). Esses resultados são bastante interessantes, uma vez que TNF é uma citocina pró-

inflamatória envolvida na proliferação celular e apoptose, e sua presença (mRNA) tem sido

associada à resistência a terapia de indução (GAO et al., 1998), ressaltando o significado

prognóstico da citocina.

42

Em adição ao conhecimento dos níveis alterados de citocinas no microambiente tumoral,

é importante ressaltar que polimorfismos nos genes codificantes destas moléculas também

podem contribuir para produção alterada das citocinas, que em última instância, terá um papel

no crescimento e progressão tumoral.

1.8 Polimorfismos em Genes de Citocinas e Associação com Leucemia

O gene TNF que codifica a proteína TNF (ou TNF-α) está localizado no cromossomo

humano 6p21.33, região do antígeno leucocitário humano (HLA – Human Leukocyte Antigen).

Apresenta 4 éxons, 2,7 kb de tamanho e pertence ao MHC de classe III (NCBI RESOURCE

COORDINATORS, 2016; SEDGER; MCDERMOTT, 2014). A produção de TNF é regulada

pelo promotor do gene, que apresenta sítios de ligação para fatores de transcrição, incluindo o

fator nuclear-κB (NF-κB), a proteína ativadora-1 (AP1), o c-Jun e o fator nuclear associado a

células T ativadas (NFAT) (LAUTEN et al., 2002; SEDGER; MCDERMOTT, 2014).

Polimorfismos de único nucleotídeo (SNP – Single nucleotide polymorphisms) na região

promotora do gene TNF (-1031 T/C, -863 C/A, -857 C/T, -308 G/A e -238 G/A) têm sido

associados a diversas doenças autoimunes, como artrite reumatoide (BOECHAT et al., 2013;

ZENG et al., 2013), doença inflamatória intestinal (KOSS et al., 2000; LÓPEZ-HERNÁNDEZ

et al., 2013) e vitiligo (LADDHA et al., 2012), mas também ao câncer, incluindo leucemia

linfoblástica aguda (LLA) da infância (DE DEUS; LUGO; MUNIZ, 2012; LAUTEN et al.,

2002).

Dentre os polimorfismos mencionados, a variante localizada na posição 308 G/A antes

do sítio de ínicio da transcrição (+1) tem sido relacionada a diferenças na produção de TNF em

indivíduos saudáveis, com os genótipos GA e AA, e o alelo A associados à alta produção de

TNF, e o genótipo GG juntamente com o alelo G, à baixa produção (PERREY et al., 1998).

Alterações na produção da proteína devido a presença deste polimorfismo também poderiam

contribuir com o desequilíbrio do sistema imune na leucemia.

De maneira semelhante, SNPs no promotor do gene IL10 (-1082 G/A e -819 C/T),

codificante da proteína IL-10, também foram relacionados a doenças de origem imunológica,

apresentando associação com susceptibilidade à asma (ZHENG et al., 2014) e com produção

de maiores níveis da proteína em lúpus eritematoso sistêmico (ROSADO et al., 2008). Em LLA

da infância, o polimorfismo -1082 G/A foi associado à sobrevida geral dos pacientes, com um

menor tempo de vida nos portadores do genótipo AA (DE DEUS; LUGO; MUNIZ, 2012).

43

O gene IL10 encontra-se localizado no cromossomo humano 1q32.1, apresenta 4,8

quilobases (kb) de tamanho e contém 5 éxons. A transcrição de IL10 é regulada por várias

proteínas que têm afinidade a diferentes sítios de ligação presentes no promotor do gene, como

o NF-κB, os fatores de regulação de interferon (IRF), a proteína ativadora (AP), o fator de

especificidade (Sp), as proteínas transdutoras de sinal e ativadoras da transcrição (STAT), a

proteína de ligação ao elemento de resposta a AMP cíclico (CREB), a proteína de

ligação/acentuador CCATT (C/EBP) e o fator fibrossarcoma c-músculo-aponeurótico (c-MAF)

(IYER; CHENG, 2012).

Em relação à influência de polimorfismos no promotor do gene na produção de IL-10, a

variação na posição -1082 G/A foi associada a diferentes atividades transcricionais, sendo o

genótipo GG considerado alto produtor da citocina, enquanto os genótipos GA e AA,

produtores intermediário e baixo, respectivamente (PALADINO et al., 2006).

Interessantemente, o alelo A apresenta maior afinidade de ligação ao fator de transcrição PU.1

(regulador hematopoiético) do que o alelo G, porém a interação culmina em menor atividade

transcricional, sugerindo que PU.1 atua como regulador negativo da transcrição de IL10

(REUSS et al., 2002).

Além das variações nos genes TNF e IL10, outro polimorfismo relacionado à produção

de citocina é o encontrado no íntron 1 do gene IFNG. Um polimorfismo nessa região

caracterizado por um número variável de repetições do dinucleotídeo CA foi correlacionado à

produção de IFN-γ (PRAVICA et al., 2000) e está total desequilíbrio de ligação com o SNP

+874 T/A, adjacente às repetições de CA. Este SNP é um possível sítio de ligação ao fator de

transcrição NF-κB e o alelo T apresenta maior afinidade a ele, levando a uma maior produção

de IFN-γ. O genótipo TT é considerado alto produtor da proteína, enquanto os genótipos TA e

AA, produtores intermediário e baixo, respectivamente (PRAVICA et al., 2000; WINKLER

et al., 2015).

O gene IFNG encontra-se localizado no cromossomo humano 12q15, apresenta 4 éxons

e 4,9 kb de tamanho. Sua transcrição é regulada por diversos fatores de transcrição, como

NFAT, AP-1, AP-4, GATA, ATF e YY-1 (NAKAYAMA et al., 2001). Como citado

anteriormente, a produção de IFN-γ não é controlada apenas por elementos na região promotora

do gene, mas também por aqueles na região do íntron 1. Os polimorfismos +874 A/T e

microssatélite CA já foram relacionados a uma maior susceptibilidade a vitiligo e a grupos de

risco de LLA infantil, influenciando o desenvolvimento da doença. (CLOPPENBORG et al.,

2005; DWIVEDI et al., 2013).

44

A maioria desses estudos foram conduzidos em doenças autoimunes e adultos, sendo

pouco esclarecido o papel destes polimorfismos na leucemia pediátrica, especialmente na LLA-

T. A leucemia tem um componente imunológico importante, mas ainda há lacunas de

conhecimento em relação ao papel regulador de citocinas de perfil Th1, Th2 e Th17, da

molécula HLA-G no desenvolvimento e evolução da LLA-T da infância.

Diante disso, no presente estudo propomos avaliar polimorfismos genéticos em

moléculas do sistema imune e avaliar a expressão de citocinas, HLA-G solúvel e microRNAs

na medula óssea de LLA-T.

O presente trabalho contribuirá para o conhecimento (1) do envolvimento de

polimorfismos nos genes HLA-G, TNF, IL10 e IFNG com a susceptibilidade no

desenvolvimento da leucemia; (2) do potencial dessas moléculas como marcadores de

prognóstico, e (3) da relação dos níveis de expressão de HLA-G solúvel (sHLA-G) e das

citocinas com a identificação precoce de crianças com maior chance de não responder a

quimioterapia. Além disso, acrescenta informações pertinentes a respeito da imunomodulação

na leucemia por meio da análise de expressão diferencial de citocinas e sHLA-G durante o

tratamento, importantes na avaliação dessas moléculas como alvos para terapia.

A investigação da expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda de células T

da infância por sequenciamento de nova geração e a pesquisa sobre seu efeito em genes alvo

contribuirão para a identificação de marcadores do tipo de leucemia, com possibilidade de

aplicação no diagnóstico, e identificação de genes alvo de miRNAs que possam ser utilizados

como marcadores de gravidade da doença.

Por fim, ressaltamos que além da geração do conhecimento científico, o caráter inovador

do estudo fornecerá uma melhor caracterização genética da criança portadora de LLA-T, com

a possibilidade de identificação de novas alterações genéticas e transferência dos achados para

a assistência.

45

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o papel de polimorfismos genéticos em moléculas do sistema imune, da

expressão de citocinas, HLA-G solúvel e microRNAs na leucemia linfoblástica aguda de

células T da infância ao diagnóstico e durante o tratamento quimioterápico.

2.2 Objetivos Específicos

a) Avaliar o perfil de expressão de citocinas Th1, Th2 e Th17, e HLA-G solúvel secretados

na medula óssea do paciente ao diagnóstico e durante o tratamento;

b) Avaliar a variabilidade da 3’UTR do gene HLA-G, região promotora dos genes TNF e

IL10, e íntron 1 do gene IFNG e suas frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas na

LLA-T;

c) Avaliar o perfil de expressão diferencial de microRNAs na medula óssea de pacientes

com LLA-T e LLA-B, a fim de identificar assinaturas de expressão gênica capazes de

distinguir as duas leucemias;

d) Relacionar variáveis experimentais (citocinas e polimorfismos genéticos) com dados

clínicos, laboratoriais e de desfecho da LLA-T (sobrevida geral e óbito).

46

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Desenho e População do Estudo

Este estudo foi conduzido em uma coorte de 63 crianças (idade entre 4 meses e 16 anos)

com leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) diagnosticadas e tratadas no Serviço

de Oncologia Pediátrica do Hospital Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira

- IMIP (Recife, Pernambuco, Brasil) entre 2005 e 2014.

Para análise da expressão de citocinas e HLA-G solúvel, foram utilizadas amostras de

32 crianças com LLA-T, sendo 21 amostras de medula ósssea e 11 de sangue periférico ao

diagnóstico devido à condição clínica mais grave e impossibilidade de obtenção de aspirados

de medula óssea. Adicionalmente, foram coletadas amostras de medula óssea durante o

tratamento quimioterápico (dia 19 de tratamento – terapia de indução (n= 27), e dia 49 de

tratamento – terapia de consolidação (n=24)) no procedimento de rotina realizado no serviço

para acompanhamento dos pacientes. O tipo de estudo envolvendo a avaliação dos fatores

solúveis nos diferentes tempos de tratamento foi longitudinal. Para a avaliação dos níveis de

citocinas e HLA-G solúvel em pacientes com LLA-T ao diagnóstico versus grupo controle, o

tipo de estudo foi transversal. Nesta análise, o grupo controle foi constituído por amostras de

medula óssea de pacientes (10 crianças; idade= 0-13 anos; 6 do sexo masculino e 4 do sexo

feminino) referidos ao Serviço com suspeita de outros tumores, mas com mielograma normal e

posterior confirmação de ausência de câncer. Também foram utilizadas amostras de sangue

periférico de 11 crianças saudáveis para comparação com as amostras de sangue periférico dos

pacientes com LLA-T em condição clínica mais grave.

O estudo de polimorfismo genético foi do tipo caso-controle, sendo utilizado DNA

extraído de células mononucleares da medula óssea das 63 crianças com diagnóstico de LLA-

T, no grupo caso; e DNA extraído de células monucleares de sangue periférico de 113 crianças

e adolescentes saudáveis (idade= 6-18 anos; 70 do sexo feminino e 43 do sexo masculino; cor

da pele: 46 brancos, 67 não-brancos) sem histórico familiar de doença autoimune, previamente

determinado e descrito pelo nosso grupo de pesquisa, no grupo controle.

O estudo envolvendo a avaliação do perfil de expressão de microRNAs foi descritivo,

sendo utilizadas 16 amostras de medula óssea ao diagnóstico, sendo oito diagnosticadas com

leucemia linfoblástica aguda de células T (idade= 4-16 anos; 7 do sexo masculino e 1 do sexo

feminino; ETP= 1; Pré-T= 4; T-cortical= 1; T-maduro= 2) e oito com leucemia linfoblástica

aguda de células B (idade= 3-17 anos; 7 do sexo masculino e 1 do sexo feminino; Pré-pré-B=

47

5; Pré-B= 3). Não foram utilizadas amostras de crianças saudáveis (grupo controle), pois o

objetivo desta análise foi determinar o perfil de expressão diferencial de microRNAs entre os

dois tipos de leucemia, capaz de distinguir a LLA-T da LLA-B, a fim de melhor compreender

a biologia da LLA-T e aplicar tais achados futuramente no diagnóstico.

O presente estudo foi realizado no Laboratório de Imunogenética do Departamento de

Imunologia pertencente ao Instituto Aggeu Magalhães/Fiocruz-PE.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da FIOCRUZ-PE (CAAE:

13296913.3.0000.5190; Anexo A) e foi obtido consentimento informado para todos os

participantes antes da coleta das amostras (Apêndice A).

3.2 Considerações Sobre o Tratamento Quimioterápico dos Pacientes com LLA-T

O protocolo de tratamento para leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T)

compreendeu três etapas principais de quimioterapia. A primeira etapa incluiu: i) a fase de

indução, realizada durante as primeiras 6 semanas de tratamento; ii) a fase de consolidação,

realizada durante as próximas 8 semanas; e iii) a manutenção primária, realizada para as 6

semanas restantes.

O objetivo da terapia de indução é induzir a remissão completa e restaurar o processo

normal de hematopoiese; a fase de consolidação é realizada após a terapia de indução, a fim de

eliminar as células leucêmicas residuais; e a manutenção tem o objetivo de reduzir o risco de

recaída desde que a remissão tenha sido alcançada (COOPER; BROWN, 2015; INABA;

GREAVES; MULLIGHAN, 2013).

Na fase de indução, os pacientes receberam ciclos de PVDA (prednisona, vincristina,

daunoblastina e asparaginase), associados à ciclofosfamida, aracytin-C e 6-mercaptopurina, e

duas quimioterapias intratecais com metotrexato e aracytin-C para proteção do sistema nervoso

central. Na fase de consolidação, os pacientes receberam altas doses de metotrexato e de 6-

mercaptopurina, enquanto na manutenção primária, além do metotrexato e 6-mercaptopurina,

receberam dexametasona e vincristina.

A segunda etapa de quimioterapia incluiu: i) fase 1 de re-indução por 8 semanas, em

que as crianças receberam ciclos de DVA (dexametasona, vincristina e asparaginase),

associados à daunoblastina e altas doses de metotrexato e aracytin-C; ii) fase A de manutenção

com ciclos de DVA associados à administração de 6-mercaptopurina e metotrexato durante 36

semanas.

48

A terceira e última etapa da quimioterapia para LLA-T incluiu: i) fase 2 de re-indução

durante 4 semanas; e ii) fase B de manutenção com doses de 6-mercaptopurina, metotrexato,

dexametasona e vincristina durante 52 semanas.

Este protocolo faz parte do protocolo RE-LLA implementado no Hospital IMIP para o

tratamento de LLAs da infância.

3.3 Coleta das Amostras e Isolamento das Células

As amostras de medula óssea foram coletadas em tubos contendo EDTA (1,8 mg/mL)

(Sigma, St. Louis, MO, USA) e utilizadas para análise patológica, sendo o diagnóstico de

leucemia confirmado baseando-se nas características morfológicas dos blastos. Essa

caracterização foi realizada conforme especificações do grupo cooperativo FAB (French-

American-British) (BENNET et al., 1985). Uma alíquota de medula óssea foi submetida à

separação de células no Laboratório de Biologia Molecular do Serviço. A fração mononuclear

foi isolada por centrifugação em gradiente de densidade utilizando o reagente Ficoll-Paque®

(GE Healthcare, USA) conforme as recomendações do fabricante. As células obtidas foram

utilizadas nos experimentos de imunofenotipagem e biologia molecular (genotipagem e ensaio

de miRNAs), e o estroma medular, na determinação do perfil de citocinas e dos níveis de HLA-

G solúvel. Para a identificação da leucemia de linhagem T, os seguintes marcadores foram

utilizados na citometria de fluxo: CD3 (de superfície e citoplasmático), CD7, CD5, CD2, CD4,

CD8 e CD1a. Os marcadores de imaturidade utilizados foram TdT, CD34 e HLA-DR. Já para

a identificação da leucemia de linhagem B, foram utilizados os marcadores CD10, CD34,

CD19, CD22, CD79a (citoplasmático), cadeia leve Kappa (κ), cadeia leve Lambda (λ), TdT

(citoplasmático) e IgM (de superfície e citoplasmático).

3.4 Quantificação de HLA-G Solúvel

As formas solúveis da molécula HLA-G (shedded HLA-G1 e HLA-G5) foram

quantificadas utilizando o RD194070100 sHLA-G ELISA (BioVendor, Laboratory Medicine,

Czech Republic), que consiste em um imunoensaio enzimático do tipo sanduíche. Neste ELISA,

calibradores e amostras são incubados em poços de microplaca pré-revestidas com anticorpo

monoclonal anti-sHLA-G. Após 16-20 horas de incubação e posterior lavagem, anticorpo

monoclonal anti-β2-microglobulina humana marcado com peroxidase de rábano (horseradish

peroxide - HRP) é adicionado aos poços e a placa incubada por 60 minutos com sHLA-G de

49

captura. Após outra etapa de lavagem, o conjugado HRP remanescente é colocado para reagir

com uma solução de substrato (tetrametilbenzidina – TMB). A reação é parada pela adição de

uma solução ácida e a absorbância do produto amarelo resultante é medida. A absorbância é

proporcional à concentração de sHLA-G. A curva de calibração é construída, plotando-se os

valores da absorbância contra concentrações dos calibradores (concentrações conhecidas), e

concentrações de amostras desconhecidas são determinadas utilizando esta curva de calibração.

Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante e os níveis totais

de sHLA-G foram determinados por leitura de absorbância realizada em leitor de Microplaca

MULTISKAN FC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), com densidade óptica de 450 nm

e se baseando em uma curva-padrão de 6 pontos (3,91; 7,81; 15,63; 31,25; 62,50; 125

Unidades/mL). Os resultados foram expressos em U/mL e o limite de detecção do ensaio foi

0.6 U/mL.

3.5 Determinação do Perfil de Citocinas

Os níveis das citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ e IL-17A) foram

determinados utilizando-se o Cytometric Bead Array Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD

Biosciences, USA). A quantificação foi realizada em citômetro de fluxo BD Accuri™ C6

(BD Biosciences) e os resultados obtidos foram analisados utilizando o software FCAPArray™

(BD Biosciences). Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante

e os resultados foram expressos em pg/mL. Os limites de detecção para IL-2, IL-4, IL-6, IL-10,

TNF, IFN-γ e IL-17A foram 2,6 pg/mL, 4,9 pg/mL, 2,4 pg/mL, 4,5 pg/mL, 3,8 pg/mL, 3,7

pg/mL e 18,9 pg/mL, respectivamente.

3.6 Extração de DNA Genômico

O DNA genômico foi obtido utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies, Carlsbad,

CA) segundo o procedimento de isolamento de DNA descrito no protocolo do fabricante. O

reagente TRIzol permite o isolamento de RNA, DNA e proteína de uma mesma amostra de

células. Foi utilizado 1 mL do reagente para cada amostra de células após a recuperação de fase

aquosa realizada no procedimento de extração de RNA, iniciou-se a extração de DNA,

removendo-se o restante de fase aquosa presente acima da interfase.

Foram adicionados 300 µL de etanol 100% gelado ao tubo contendo a interfase e a fase

orgânica e realizada homogeneização, invertendo-se o tubo várias vezes cuidadosamente. Após

50

isso, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 3 minutos e em seguida foram

centrifugadas a 2.000 x g por 5 minutos a 4° C para sedimentar o DNA. O sobrenadante (fenol-

etanol) foi removido e armazenado em outro tubo para posterior extração de proteína. Foi

adicionado 1 mL de solução de citrato de sódio/etanol (0,1 M de citrato de sódio em 10% de

etanol, pH 8,5) ao pellet de DNA e realizada homogeneização por inversão. As amostras foram

incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos, homogeneizando-se ocasionalmente.

Posteriormente, foi realizada centrifugação a 2.000 x g por 5 minutos a 4° C, o sobrenadante

foi descartado com pipeta e o procedimento foi repetido. Em seguida, foram adicionados 1,5

mL de etanol 75% gelado e realizada homogeneização por inversão. As amostras foram

incubadas por 20 minutos à temperatura ambiente, homogeneizando-se ocasionalmente. Após

esse período, foi realizada centrifugação a 2.000 x g por 5 minutos a 4° C, o sobrenadante foi

descartado e os tubos foram deixados abertos para secar o DNA por 10 minutos ou mais tempo

no caso dos pellets ainda apresentarem muito líquido. As amostras de DNA foram ressuspensas

em 100-200 µL de NaOH 8 mM e colocadas em termobloco a 55° C para melhorar sua eluição.

3.7 Genotipagem da 3’UTR de HLA-G

Para amplificação da 3’UTR do gene foi realizada reação em cadeia da polimerase

(PCR) utilizando 100 ng do DNA genômico obtido de cada paciente (item 3.3) e os primers

específicos HLAG8F 5’-TGTGAAACAGCTGCCCTGTGT-3’; HLAG8R 5’-

GTCTTCCATTTATTTTGTCTCT-3’, descritos previamente na literatura (CASTELLI et al.,

2010). A reação foi realizada conforme descrito em Lucena-Silva et al. (2012) em termociclador

Mastercycler gradient (Eppendorf, USA). A amplificação foi realizada em um volume final de

20 µL contendo tampão de PCR 1X; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de desoxinucleotídeos

trifosfato (dNTP); 0,5 pmol de cada primer; 1 unidade de Taq DNA polimerase (BioTools,

Madrid, Spain) e aproximadamente 100 ng de DNA. As condições da amplificação foram: 1)

desnaturação inicial: 94° C durante 3 minutos; 2) 5 ciclos: 94° C por 1 minuto; 63° C por 1

minuto; 72° C por 1 minuto; 3) 35 ciclos: 94° C por 1 minuto; 60° C por 1 minuto; 72° C por 1

minuto; 4) extensão final: 72° C por 7 minutos. O produto de amplificação foi visualizado em

gel de agarose 2% corado com brometo de etídio 0,1 µg/mL e fotodocumentados em

transiluminador de luz ultravioleta (UV). Os produtos de PCR que apresentaram fragmento de

aproximadamente 350 pb foram enviados para o Núcleo de Plataformas Tecnológicas (NPT)

do IAM/Fiocruz-PE para serem sequenciados, sendo utilizado o primer reverso da PCR e o

51

BigDye Terminator Kit em sequenciador ABI3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

USA).

3.8 Genotipagem das Regiões Promotoras dos Genes TNF e IL10 e do Íntron 1 de IFNG

Para amplificação da região promotora do gene TNF foi realizada por PCR utilizando

os primers específicos Forward 5’-CTCAGAGAGCTTCAGGGATAT-3’ e Reverse 5’-

TGGAGAAGAAACCGAGACAGA-3’, que foram desenhados pelo nosso grupo (GOMES,

2014). A amplificação foi realizada em um volume final de 20 µL contendo tampão de PCR

1X; 1,5 mM de MgCl2; 300 µM de dNTP; 0,5 pmol de cada primer; 1 unidades de Taq DNA

polimerase (BioTools) e aproximadamente 100 ng de DNA. As condições da amplificação

foram: 1) desnaturação inicial: 94° C durante 3 minutos; 2) 30 ciclos: 94° C por 45 segundos;

60° C por 30 segundos; 72° C por 45 segundos; 3) extensão final: 72° C por 7 minutos.

Para amplificação da região promotora do gene IL10 foi realizada PCR utilizando

aproximadamente 100 ng de DNA e os primers específicos Forward 5’-

ATCCAAGACAACACTACTAA-3’ e Reverse 5’-TAAATATCCTCAAAGTTCT-3’,

previamente descritos na literatura (PALADINO et al., 2006). A amplificação foi realizada em

um volume final de 25 µL contendo tampão de PCR 1X; 2,5 mM de MgCl2; 300 µM de dNTP;

1,6% de dimetilsulfóxido (DMSO); 0,5 pmol de cada primer; 1 unidade de Taq DNA

polimerase (BioTools) e aproximadamente 100 ng de DNA. As condições da amplificação

foram: 1) desnaturação inicial: 95° C por 3 minutos; 2) 30 ciclos: 95° C por 45 segundos; 56°

C por 45 segundos; 72° C por 1 minuto; 3) extensão final: 72° C por 7 minutos.

Para amplificação do íntron 1 do gene IFNG foi realizada PCR utilizando os primers

específicos Forward 5’-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3’ e Reverse 5’-

TTCTGCTTCTCTATCTATATTA-3’, também desenhados pelo nosso grupo (GOMES,

2014). A amplificação foi realizada em um volume final de 20 µL contendo tampão de PCR

1X; 1,9 mM de MgCl2; 300 µM de dNTP; 0,5 pmol de cada primer; 1 unidade de Taq DNA

polimerase (BioTools) e aproximadamente 100 ng de DNA. A PCR foi realizada de acordo com

as seguintes condições de ciclagem: 1) desnaturação inicial: 94° C durante 3 minutos; 2) 35

ciclos: 94° C por 45 segundos; 55° C por 30 segundos e 72° C por 45 segundos; 3) extensão

final: 72° C por 7 minutos.

Todos as reações foram realizadas em termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf,

USA), sendo os produtos de PCR visualizados em gel de agarose 2% corado com brometo de

etídio 0,1 µg/mL e fotodocumentados em transiluminador de luz UV. Os produtos de

52

amplificação que apresentaram aproximadamente 977 pb (TNF), 600 pb (IL10) e 513 pb (IFNG)

foram enviados para o Núcleo de Plataformas Tecnológicas (NPT) do IAM/Fiocruz-PE para

serem sequenciados, sendo utilizado o primer forward da PCR e, quando necessário o reverse,

e o BigDye Terminator Kit em sequenciador ABI3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

3.9 Extração de RNA Total e Análise de Qualidade e Integridade

O RNA total foi obtido utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) seguindo o

protocolo do fabricante com algumas modificações. Foi utilizado 1 mL do reagente para cada

amostra e realizada homogeneização por pipetagem. Ums incubação a temperatura ambiente

foi realizada durante 3 minutos, sendo posteriormente adicionados 200 µL de clorofórmio

(temperatura ambiente) ao tubo e realizada homogeneização por inversão 30 vezes. O tubo foi

submetido à incubação por 3 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, realizou-se

centrifugação a 13.000 rpm (rotações por minuto) por 15 minutos a 4ºC. A fase aquosa

(superior) foi recuperada e colocada em novo tubo. Foram adicionados ao novo tubo 500 µL de

isopropanol (gelado ou temperatura ambiente) e realizada homogeneização cuidadosa,

invertendo-se o tubo 2 vezes. Foram adicionados 0,5 µL de glicogênio 20 µg/µL (Life

Technologies) e o tubo homogeizado com pipeta. O glicogênio foi utilizado com o objetivo de

aumentar o rendimento de RNA, pois o mesmo funciona como carreador e facilita a

precipitação da molécula. A amostra foi incubada a -20º C overnight (ou 18 horas). Após esse

período, foi realizada centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos a 4º C, sendo o isopropanol

descartado e adicionado 1 mL de etanol 75% gelado preparado com água tratada com DEPC

(Dietilpirocarbonato). O tubo foi homogeneizado com pipeta e submetido a centrifugação a

7.500 rpm a 4º C por 5 minutos. O etanol foi descartado e adicionado mais 1 mL. Após

homogeneização, a amostra foi centrifugada a 11.000 rpm por 5 minutos a 4º C. Este

procedimento foi repetido mais uma vez e ao final o etanol foi descartado e pellet de RNA

colocado para secar em papel toalha com o tubo invertido. O RNA foi eluído em 20-30 µL de

água DEPC e armazenado em freezer -80º C até o uso. Todo o procedimento foi realizado com

os tubos depositados no gelo, exceto a secagem.

Todas as amostras foram quantificadas em espectofotômetro Nanodrop (Thermo

Scientific, Waltham, MA, USA) e apenas as preparações livres de proteínas foram consideradas

no estudo. Posteriormente, a integridade do RNA foi avaliada utilizando o equipamento

Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) com kit de eletroforese microfluídica para

53

RNA conforme especificações do fabricante, sendo consideradas apenas as amostras com RIN

(RNA Integrity Number) acima de 8,0.

3.10 Ensaios do Sequenciamento de MicroRNAs: preparação das bibliotecas e

sequenciamento de nova geração

As bibliotecas foram preparadas de acordo com o TruSeq® Small RNA Library Prep

Guide (Illumina, San Diego, CA), utilizando 1 µg de RNA de cada amostra. Em seguida, foram

preparados 2 pools das bibliotecas e realizado eletroforese em gel de poliacrilamida TBE 6%

para isolamento dos microRNAs. A banda corresponde aos miRNAs foi cortada do gel e

purificada, sendo os dois pools purificados verificados quanto ao tamanho em Bioanalyzer 2100

(Agilent, Santa Clara, CA, USA), a fim de validar as bibliotecas. Estas foram então

quantificadas por PCR quantitativa utilizando o KAPA Library Quantification Kit (KAPA

Biosystems, Foster City, USA) e diluídas para o sequenciamento. O sequenciamento foi

realizado utilizando o HiSeq® Rapid Cluster Kit v2 (Illumina) em plataforma HiSeq 2500

(Illumina). Todo o procedimento experimental de preparação de bibliotecas e sequenciamento

foi realizado no Centro de Genômica Funcional do Departamento de Zootecnia da Escola

Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" (ESALQ/USP) coordenado pelo Prof. Dr. Luiz

Lehman Coutinho, sob contratação de serviço pela Profa. Dra. Norma Lucena-Silva.

3.11 Análise dos Dados de Polimorfismos Genéticos, Citocinas, sHLA-G, Variáveis

Clínicas e Sobrevida Geral

Todos os cromatogramas obtidos dos sequenciamentos de DNA foram analisados

utilizando o programa SeqMan Versão 7.0.0 (DNASTAR®Lasergene, Madison, WI, USA). As

frequências genotípicas e alélicas foram estimadas utilizando o software GENEPOP Versão 4.0

(ROUSSET, 2008; RAYMOND; ROUSSET, 1995), sendo realizadas comparações com as

frequências decorrentes de crianças saudáveis, determinadas pelo nosso grupo de pesquisa. O

teste exato de Fisher com correção de Levene foi aplicado no cálculo do número esperado de

homozigotos e heterozigotos. As medidas das diferenças entre os grupos (LLA-T versus

Controle) foram calculadas utilizando o teste exato de Fisher, sendo o risco relativo estimado

pelo cálculo de Odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95%.

Aderências das proporções genotípicas ao equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)

esperado foram estimadas utilizando o teste exato de Guo e Thompson (1992) disponível no

54

GENEPOP. Para avaliação do desequilíbrio de ligação (Linkage disequilibrium – LD) entre os

sítios polimórficos foi utilizado o software Arlequin versão 3.5.1.2 (EXCOFFIER; LAVAL;

SCHNEIDER, 2005), que calcula o LD para cada grupo e a população de estudo como um todo.

Diante de LD positivo entre alelos dos polimorfismos estudados, mas com fase gamética

desconhecida, o par haplotípico mais provável para cada indivíduo do estudo foi determinado

utilizando o algoritmo Expectation-maximization (EM) implementado no programa Arlquin

para estimar frequências de haplótipos. Foram considerados para análise os haplótipos com

probabilidade igual ou superior a 98%. Os indivíduos que apresentaram inferências com

probabilidade inferior a 98% foram excluídos da análise.

Para as análises de associação dos polirmorfismos genéticos e haplótipos com variáveis

clínicas, foi realizado o teste exato de Fisher, calculando-se também a Odds ratio (OR) com

intervalo de confiança de 95%. Já para a avaliação da influência dos polimorfismos genéticos

na sobrevida geral dos pacientes com LLA-T, os genótipos dos sítios considerados foram

codificados no programa estatístico SPSS e o método de Kaplan-Meier foi aplicado com

comparação das curvas pelo teste log-rank. A sobrevida em dias foi calculada a partir da data

de admissão dos pacientes no Hospital IMIP (ao diagnóstico) até o dia 21 de novembro de 2014

(data de censura) ou até o óbito (antes do dia 21 de novembro).

Em relação às análises dos dados de citocinas, sHLA-G, variáveis clínicas e

laboratoriais foram realizados testes de normalidade, utilizando o teste adequado para cada

grupo dependendo do número amostral (Kolmogorov-Smirnov ou Shapiro-Wilk). Assumindo

que os dados quantitativos não seguiram distribuição normal, foram aplicados testes não-

paramétricos.

As diferenças entre os níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de pacientes com

LLA-T foram avaliadas pelo teste Wilcoxon signed rank, utilizando dados de amostras pareadas

ao diagnóstico (Dia 0 (D0) = pacientes sem tratamento) e no dia 19 de terapia (D19) – terapia

de indução (n= 17), amostras pareadas ao diagnóstico e no dia 49 da terapia (D49) – fase de

consolidação (n= 22) e amostras pareadas do dia 19 e dia 49 do tratamento. Comparações das

concentrações de citocinas e sHLA-G na medula óssea também foram realizadas para 14

amostras pareadas nos três períodos de tratamento avaliados (dia 0, dia 19 e dia 49), aplicando-

se o teste Friedman e análise pós-teste (Friedman) de resultados significantes, a fim de estimar

as diferenças entre cada combinação dos grupos estudados (D0 versus D19, D0 versus D49 e

D19 versus D49).

Para as comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G entre os pacientes ao diagnóstico

e os indivíduos saudáveis (controles), foi aplicado o teste não-paramétrico Mann-Whitney U.

55

Este teste também foi empregado na avaliação de associação entre dados clínicos (leucócitos

totais em sangue periférico) e os níveis de sHLA-G ao diagnóstico. Correlações entre os níveis

das diferentes citocinas e HLA-G solúvel na medula óssea dos pacientes foram determinadas

aplicando o teste do coeficiente de correlação de Pearson. Este teste foi realizado para os dias

0, 19 e 49.

Análises de regressão linear para avaliação da influência recíproca entre os níveis de

citocinas e sHLA-G solúvel na medula óssea de pacientes com LLA-T também foram realizadas

aplicando-se o teste do coeficiente de correlação de Pearson, em que apenas as variáveis com

P-valor inferior a 0,250 foram elegíveis para análise de múltiplas variáveis.

Análise de curva ROC (Receiver Operating Characteristic) foi realizada para todas as

citocinas e sHLA-G em cada período do tratamento dos pacientes (dias 0, 19 e 49), e para

blastos (percentual) e leucócitos totais no dia 5, considerando o óbito como status avaliado.

Foram consideradas a área sob a curva (AUC – Area Under the Curve) com valor igual ou

superior a 0,500, a sensibilidade, especificidade e significância do teste. Adicionalmente, os

valores de ponto de corte estabelecidos na análise de curva ROC foram aplicados na avaliação

da taxa de sobrevida. O método de Kaplan-Meier foi aplicado na análise de sobrevida, com

comparação das curvas pelo teste log-rank. A data de censura dos dados dos pacientes foi da

admissão no Hospital IMIP (ao diagnóstico) até 21 de novembro de 2014 ou até o óbito (antes

do dia 21 de novembro), não considerando as recaídas.

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism Versão

5.01 (GraphPad Software, Inc.) e o software SPSS Versão 20 (SAS Institute, Cary, NC), sendo

consideradas significantes as diferenças com P-valor ≤ 0,05.

3.12 Análises dos Dados de MicroRNAs

3.12.1 Controle de qualidade e alinhamento das reads (leituras)

Os resultados do sequenciamento foram verificados quanto à contaminação por

adaptadores e qualidade das reads, utilizando o software FASTQC (ANDREWS, 2010). O

programa Cutadapt (MARTIN, 2011) foi utilizado para remoção de adaptadores e filtragem das

reads com Phred Score ≥ 24. Além disso, foram mantidas apenas as sequências com tamanho

igual ou superior a 17 nucleotídeos, uma vez que os miRNAs apresentam comprimento entre

17 e 22 nucleotídeos. O programa Bowtie (LANGMEAD et al., 2009) foi aplicado para indexar

o genoma de referência (genoma humano versão hg19) disponível no banco de dados UCSC

56

Genome Browser (ROSENBLOOM et al., 2015), e utilizado dentro do programa miRDeep2

(FRIEDLÄNDER et al., 2008) para alinhar as sequências obtidas com o genoma humano.

Posteriormente, a identificação dos miRNAs nas amostras sequenciadas foi realizada pelo

miRDeep2, utilizando o banco de dados de miRNAs miRBase versão 21 (GRIFFITHS-JONES

et al., 2006; KOZOMARA; GRIFFITHS-JONES, 2014).

3.12.2 Análise de expressão diferencial de miRNAs

A tabela com os miRNAs identificados (precursor e maduro) e suas contagens (mais de

1 read em no mínimo 50% das amostras) foi utilizada para a análise de expressão diferencial

no software R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2008), sendo aplicado o pacote do

Bioconductor edgeR (ROBINSON; MCCARTHY; SMYTH, 2010) que implementa uma

metodologia estatística baseada em distribuição binomial negativa. Foram considerados para

análise apenas os miRNAs diferencialmente expressos (DE) com P-valor corrigido ou Taxa de

Falsa Descoberta (FDR - False Discovery Rate) ≤ 4x10-5. A análise de expressão diferencial

foi realizada entre LLA-B e LLA-T, onde LLA-B corresponde ao grupo de 8 pacientes com

leucemia linfoblástica aguda de células B e LLA-T, ao grupo de 8 pacientes com leucemia

linfoblástica aguda de células T. O grupo de pacientes com LLA-B foi considerado neste

trabalho para comparação com a LLA-T, como um modelo de leucemia linfoblástica aguda

infantil distinta da linhagem T, permitindo a identificação de um perfil de expressão

característico da linhagem T neoplásica. Para análise de agrupamento hierárquico dos miRNAs

DE, a função heatmap.2 foi empregada no programa R, sendo considerado o método de Pearson

e Average Linkage para clusterização de genes e amostras (pacientes).

3.12.3 Predição de alvos de miRNAs

Após obtenção dos miRNAs DE, foi realizada uma predição de genes (RNAs

mensageiros - mRNAs) alvo de miRNAs utilizando o banco de dados miRWalk versão 2.0

(DWEEP et al., 2011; DWEEP; GRETZ, 2015) que está integrado a vários outros bancos de

predição. A análise foi realizada separadamente para os miRNAs reprimidos e os induzidos em

LLA-T em relação à LLA-B. Inicialmente, o número oficial de acesso de cada miRNA – MIMA

– foi obtido no banco miRBase e submetido na seção Predicted Target Module – MicroRNA-

genes Target, considerando a espécie humana. Para as quatro etapas seguintes à identificação

da molécula, foram considerados os parâmetros default, exceto em duas seções da etapa 3:

57

Select start position of miRNA seed (Position 2); e a seleção de outros bancos de predição, onde

foram selecionados todos os disponíveis além do miRWalk, como o MicroT4 versões 4.0 e 5.0

(MIN; YOON, 2010), miRanda versão agosto 2010 (YUE; LIU; HUANG, 2009), miRBridge

versão 4.0 (MEGRAW et al., 2007), miRDB versão 4.0 (RAJEWSKY, 2006), miRMap versão

2013 (BAVAMIAN et al., 2015), miRNAMap versão 2008 (DWEEP et al., 2013), PICTAR2

versão 2 (FELEKKIS et al., 2011), PITA versão 2007 (FANG; RAJEWSKY, 2011), RNA22

versão 2 (FORMAN; COLLER, 2010), RNAhybrid versão 2.1 (HAUSSER et al., 2013) e

Targetscan versão 6.1 (LEE et al., 2009). Posteriormente, a tabela com os genes alvo preditos

por diferentes algoritmos foi obtida (predição de interação com 3’UTR, Putative target genes

predicted by chosen algorithms within mRNA selected regions), sendo selecionados os genes

preditos por no mínimo 3 bancos. Todos os bancos citados empregam algoritmos que

consideram a capacidade de ligação de um dado miRNA à região 3’UTR de um mRNA alvo.

3.12.4 Anotação funcional dos genes alvos preditos

Com o objetivo de identificar as vias biológicas associadas aos alvos preditos, e

consequentemente, relacionadas aos miRNAs estudados, foi realizada uma análise de

enriquecimento funcional, utilizando a ferramenta DAVID versão 6.8 (The Database for

Annotation, Visualization and Integrated Discovery) (HUANG DA; SHERMAN; LEMPICKI,

2009) que fornece dados de diversas categorias funcionais, como processo biológico,

componente celular e função molecular. A análise de vias biológicas foi realizada

separadamente para os genes alvo de miRNAs reprimidos e induzidos em LLA-T, sendo

considerado o banco de dados KEGG Pathways (KANEHISA et al., 2017; KANEHISA et al.,

2016; KANEHISA; GOTO, 2000) e significante apenas as vias com P-valor ≤ 0,05 corrigido

(método Benjamini-Hochberg).

O Fluxograma 1 ilustra as principais etapas das metodologias empregadas na realização

do presente trabalho.

58

Fluxograma 1 – Principais etapas realizadas para a avaliação do papel de moléculas imunológicas solúveis,

polimorfismos genéticos e microRNAs em LLA-T da infância.

Fonte: Elaborado pela autora, 2017.

59

4 RESULTADOS

Neste trabalho, foram estudados 63 pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células

T (LLA-T) que apresentaram mediana de idade de 12 anos e predominância de indivíduos do

sexo masculino (47 dos 63 pacientes). A mediana de leucócitos ao diagnóstico (/mm3) foi

112.200 e 55 pacientes dos 62 com informação disponível apresentaram remissão completa. As

demais características clínicas dos pacientes encontram-se descritas na Tabela 2.

Tabela 2 – Características clínicas dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células T.

Variáveis clínicas N Variáveis de desfecho N

Idade (anos) Doença residual

<5 11/63 Dia 19 <1% 19/28

5-10 23/63 Dia 19 ≥1% 9/28

>10 29/63 Dia 49 <1% 24/24

Sexo Dia 49 ≥1% 0/24

Masculino 47/63 Remissão completa

Feminino 16/63 Sim 55/62

Cor da pele Não 7/62

Branca 16/62 Recaída

Não-branca 46/62 Sim 8/62

Leucócitos ao diagnóstico

(/mm3)[n=59]

Não 54/62

Mínimo 2.900 Óbito

Mediana 112.200 Sim 19/63

Máximo 859.510 Não 44/63

Hepatomegalia

Sim 44/56

Não 12/56

Esplenomegalia

Sim 45/56

Não 11/56

Linfadenopatia

Sim 51/59

Não 8/59

Massa de mediastino

Sim 26/53

Não 27/53


Legenda: Valores totais variam em cada categoria; N – número amostral.

60

Foi realizada uma comparação das características laboratoriais dos pacientes ao

diagnóstico (D0) e ao Dia 5 (D5) de tratamento com corticóide, tratamento submetido aos

indivíduos antes do início da terapia de indução para verificação de resposta a imunossupressor.

As diferenças entre esses dois pontos encontram-se descritas na Tabela 3. A principal diferença

observada foi na contagem de leucócitos, onde ao diagnóstico a mediana foi de 112.200 e no

Dia 5 foi de 9.300. Outra característica marcante foi a percentagem de blastos em sangue

periférico que se apresentou acima ou igual a 5% na maioria dos pacientes ao diagnóstico

diferentemente do D5 em que foi observado um aumento do número de pacientes com

percentagem de blastos inferior a 5% (D0 - 3 pacientes de um total de 59; D5 – 13 pacientes de

um total de 56).

Tabela 3 – Dados laboratoriais dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células T.

Variáveis

Ao diagnóstico Dia 5 do tratamento com

corticóide

Leucócitos (/mm3)1 Leucócitos (/mm3)

Mínimo 2.900

Mínimo 500

Mediana 112.200

Mediana 9.300

Máximo 859.510

Máximo 419.470

Hemoglobina (g/%) Hemoglobina (g/%)

Mínimo 2,30 Mínimo 5,70

Mediana 8,30 Mediana 8,80

Máximo 16,10 Máximo 12,60

Hematócrito (%) Hematócrito (%)

Mínimo 12,40 Mínimo 17,00

Mediana 25,40 Mediana 26,60

Máximo 40,90 Máximo 37,90

Plaquetas (/mm3) 2 Plaquetas (/mm3)

Mínimo 2.000 Mínimo 2.000

Mediana 60.500 Mediana 62.000

Máximo 450.000 Máximo 471.000

Blastos in SP (%) Blastos in SP (%)

<5% 3/59 <5% 13/56

≥5% 56/59 ≥5% 43/56

Mielograma (%)

<20% 1/49

≥20% 48/49

LDH (U/l)3

Mínimo 5,07

Mediana 1.418

Máximo 17.820

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: 1 Leucócitos, hemoglobina e hematócrito ao diagnóstico n=59, e

no dia 5 n=57; 2 Plaquetas ao diagnóstico n=58; no dia 5, n=57; 3 LDH – Lactato desidrogenase, n=54.

61

4.1 Níveis medulares de citocinas e HLA-G solúvel (sHLA-G) em LLA-T

Para o estudo de citocinas, foram considerados 32 pacientes devido à disponibilidade de

amostras para cada tempo de tratamento. A Figura 7 mostra um diagrama com o número de

indíviduos estudados ao diagnóstico (D0), na terapia de indução (Dia 19 – D19) e na

consolidação (Dia 49 – D49). Os níveis de citocinas e sHLA-G em medula óssea de pacientes

com LLA-T foram comparados com os níveis medulares de crianças com medula óssea

morfologicamente normal, cujo diagnóstico de leucemia foi descartado, conforme informado

na seção Materiais e Métodos.

Figura 7 – Diagrama das amostras de sangue periférico e medula óssea de

crianças com LLA-T coletadas ao diagnóstico (D0), e nas fases de indução

(D19) e consolidação (D49) da terapia utilizadas para o estudo de citocinas

e HLA-G solúvel.

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: MO – medula óssea; SP – sangue periférico.

Devido a heterogeneidade na coleta de amostras de pacientes com LLA-T, o grande

número de variáveis estudadas, e o número diferente de pacientes em cada tempo de tratamento,

os resultados foram estratificados e apresentados em cinco tópicos:

(a) comparação dos níveis de citocinas e sHLA-G entre pacientes leucêmicos ao

diagnóstico e controles saudáveis;

62

(b) comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G em um subgrupo de pacientes com

amostra biológica para todos os tempos de tratamento: diagnóstico (dia 0), terapia

de indução (dia 19) e terapia de consolidação (dia 49);

(c) considerando que alguns pacientes avaliados no dia 0 foram a óbito antes de

alcançarem os dias 19 e 49 após início de tratamento; outros pacientes não

apresentaram amostras de medula óssea suficiente para os ensaios, rendendo grupos

de pacientes com diferentes tamanhos, as comparações dos níveis de citocinas e

sHLA-G foram realizadas de forma pareada para cada combinação, sendo

consideradas três combinações: dia 0 versus dia 19, dia 0 versus dia 49 e dia 19

versus dia 49;

(d) correlações entre os níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea durante o

tratamento;

(e) efeito dos níveis de citocinas e sHLA, e de variáveis clínicas e laboratoriais na

sobrevida de pacientes com LLA-T;

(f) avaliação da influência recíproca entre os níveis de citocinas e sHLA-G na medula

óssea de crianças com LLA-T.

Considerando que todas as variáveis não apresentaram distribuição Gaussiana, todos os

resultados foram analisados utilizando testes não-paramétricos.

4.1.1 Níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de pacientes com leucemia no dia 0 e em

crianças com mielograma normal

As comparações dos níveis de citocinas na medula óssea entre pacientes com LLA-T ao

diagnóstico e crianças com mielograma sem alteração (controles) não apresentaram resultados

significantes. Em relação à sHLA-G, os níveis (U/mL) na leucemia também não diferiram

daqueles observados nos controles (95,08 versus 185,30, P= 0,094). A Tabela 4 mostra os

valores de mediana e percentis (25 e 75) para as moléculas solúveis observadas em LLA-T

infantil e em controles de medula óssea, e a análise estatística realizada.

63

Tabela 4 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G na medula óssea de pacientes com LLA-T

ao diagnóstico (D0) e crianças com mielograma normal (controles).

Moléculas Mediana dos valores das moléculas (25th-75th)1 P-valor2

T-ALL (D0) Controles

IL-17A, pg/mL 50,76 (ND-66,71) 0,81 (ND-12,35) 0,214

IFN-γ, pg/mL ND (ND-0,38) ND (ND-0,88) 0,524

TNF, pg/mL ND (ND-1,49) ND (ND-1,01) 0,360

IL-10, pg/mL 3,00 (1,57-6,79) 8,41 (ND-11,42) 0,540

IL-6, pg/mL 5,70 (3,12-18,27) 10,25 (ND-45,81) 0,751

IL-4, pg/mL 1,64 (ND-3,63) ND (ND-9,59) 0,911

IL-2, pg/mL 1,14 (ND-3,45) ND (ND-12,99) 0,802

sHLA-G, U/mL3 95,08 (43,19-257,50) 185,30 (173,00-197,50) 0,094


Legenda: 1 Mediana, valores dos percentis 25% e 75%; 2P-valor calculado a partir do teste Mann-Whitney

U; 3 Avaliado em 19 pacientes; ND – não detectável. IL-17A: interleucina-17A; IFN-γ: interferon-gamma;

TNF: fator de necrose tumoral; IL-10: interleucina-10; IL-6: interleucina-6; IL-4: interleucina-4; IL-2:

interleucina-2; sHLA-G: antígeno leucocitário humano G solúvel.

4.1.2 Níveis de citocinas e sHLA-G no sangue periférico de pacientes com leucemia no dia 0 e

em crianças saudáveis

As comparações dos níveis de citocinas no sangue periférico entre crianças com LLA-

T ao diagnóstico e crianças saudáveis apresentaram resultados significantes para IL-10 e IL-6,

com maiores níveis na doença em relação aos controles (IL-10, P= 0,035; IL-6, P< 0,001).

Além disso, os pacientes com LLA-T apresentaram níveis de sHLA-G comparáveis

aqueles observados nos controles (mediana: 87,05 versus 153,20 U/mL, P= 0,341). A Tabela 5

mostra os valores de mediana e percentis (25 e 75) das citocinas e sHLA-G observados na LLA-

T e nos controles saudáveis, e a análise estatística realizada.

64

Tabela 5 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G no sangue periférico de pacientes com LLA-

T ao diagnóstico (D0) e crianças saudáveis (controles).

Moléculas Mediana dos valores das moléculas (25th-75th)1 P-valor2

T-ALL (D0) Controles

IL-17A, pg/mL 15,04 (ND-35,53) ND (ND-8,27) 0,090

IFN-γ, pg/mL ND (ND-0,17) ND (ND-ND) NA

TNF, pg/mL ND (ND-ND) ND (ND-ND) NA

IL-10, pg/mL 1,30 (0,41-3,29) 0,48 (0,08-0,74) 0,035

IL-6, pg/mL 3,94 (3,05-10,74) 0,35 (0,15-0,55) 0,0001

IL-4, pg/mL 0,07 (ND-1,85) ND (ND-ND) NA

IL-2, pg/mL ND (ND-1,74) ND (ND-ND) 0,095

sHLA-G, U/mL3 87,05 (51,66-147,3) 153,20 (48,88-207,7) 0,341


Legenda: 1 Mediana, valores dos percentis 25% e 75%; 2P-valor calculado a partir do teste Mann-Whitney

U; 3 Dados disponíveis para 11 pacientes; Controles são diferentes dos utilizados na análise de citocinas,

estão pareados por idade e sexo, e correspondem a uma amostra dos controles utilizados na análise de

polimorfismos genéticos; ND – não disponível; NA – não avaliado. IL-17A: interleucina-17A; IFN-γ:

interferon-gamma; TNF: fator de necrose tumoral; IL-10: interleucina-10; IL-6: interleucina-6; IL-4:

interleucina-4; IL-2: interleucina-2; sHLA-G: antígeno leucocitário humano G solúvel.

4.1.3 Comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de um subgrupo de

pacientes com amostra biológica para todos os tempos de tratamento: diagnóstico (dia 0),

terapia de indução (dia 19) e terapia de consolidação (dia 49)

A análise a partir do teste de Friedman considerando 14 pacientes que apresentaram

amostra biológica para os três tempos de tratamento revelaram diferenças significantes nas

dosagens de IL-6 (P= 0,032), TNF (P= 0,039) e IL-10 (P= 0,013) durante a quimioterapia. O

teste Post-hoc determinou que os níveis de IL-6, TNF e IL-10 no estroma medular estavam

mais elevados ao diagnóstico em relação às etapas de indução e consolidação. Os níveis de TNF

e IL-6 reduziram significativamente após a terapia de indução, enquanto os níveis de IL-10

mostraram diminuição significativa apenas depois da fase de consolidação.

As dosagens de sHLA-G não apresentaram diferenças significantes no dia 19 da terapia

de indução ou no dia 49 da terapia de consolidação quando comparadas às dosagens ao

diagnóstico de LLA-T.

A Tabela 6 mostra os valores de mediana e percentis (25 e 75) das citocinas e sHLA-G

observados na LLA-T nos dias 0, 19 e 49, com análise estatística realizada para cada molécula

estudada.

65

4.1.4 Comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea de pacientes ao

diagnóstico (dia 0) e nos dias 19 e 49 após o início do tratamento – Combinações dos

tempos de tratamento

As comparações dos níveis de citocinas e sHLA-G da medula óssea entre crianças com

LLA-T revelaram diferenças significantes para as dosagens de IL-10 e TNF. Os níveis de IL-

10 se apresentaram aumentados ao diagnóstico e diminuíram significativamente após a terapia

de consolidação em relação aos níveis no dia 0 (PD0-D49= 0,034) e no dia 19 (PD19-D49= 0,044).

Também foram observados níveis aumentados de TNF ao diagnóstico que apresentaram

redução significativa na terapia de indução (PD0-D19= 0,012). Os níveis de HLA-G solúvel não

apresentaram diferenças significantes entre os três tempos de tratamento da LLA-T.

A Tabela 7 mostra os valores de mediana e percentis (25 e 75) das citocinas e sHLA-G

observados na LLA-T nos dias 0, 19 e 49, com análise estatística realizada para cada

combinação de grupos.

Tabela 6 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G em 14 pacientes com LLA-T ao diagnóstico (D0), terapia de

indução - Dia 19 (D19) e consolidação - Dia 49 (D49).

Moléculas Mediana dos valores das moléculas (25th-75th)1 P-valor2 Análise Post-hoc

Diagnóstico Dia 19 Dia 49

IL-17A, pg/mL 39,74 (ND-66,13) 38,29 (ND-70,94) 45,82 (ND-87,23) 0,348 NA

IFN-γ, pg/mL ND (ND-0,66) ND (ND-0,50) 0,28 (ND-1,96) 0,393 NA

TNF, pg/mL 0,20 (ND-2,08) ND (ND-ND) ND (ND-0,44) 0,039 0,008 (D0 xD19)

IL-10, pg/mL 3,09 (1,91-9,16) 2,77 (1,89-4,57) 1,47 (0,66-3,87) 0,013 0,033 (D0 xD49)

IL-6, pg/mL 5,09 (2,29-7,45) 2,95 (ND-4,75) 3,37 (1,97-6,97) 0,032 0,033 (D0 xD19)

IL-4, pg/mL 0,78 (ND-2,41) 0,62 (ND-2,63) 1,27 (ND-4,41) 0,657 NA

IL-2, pg/mL 0,57 (ND-3,07) ND (ND-2,91) 0,02 (ND-2,89) 0,791 NA

sHLA-G, U/mL3 100,60 (46,29-302,1) 97,47 (53,63-311,4) 99,60 (62,27-436,6) 0,367 NA


Legenda: 1 Mediana, valores dos percentis 25% e 75%; 2 P-valor calculado a partir do teste de Friedman.; 3 Dados disponíveis

para 13 pacientes; ND – não detectável; NA – não avaliado. IL-17A: interleucina-17A; IFN-γ: interferon-gamma; TNF: fator

de necrose tumoral; IL-10: interleucina-10; IL-6: interleucina-6; IL-4: interleucina-4; IL-2: interleucina-2; sHLA-G: antígeno

leucocitário humano G solúvel.

66

Tabela 7 – Níveis de citocinas Th1, Th2, Th17 e sHLA-G em pacientes com LLA-T ao diagnóstico (D0), na

terapia de indução - Dia 19 (D19) e na consolidação - Dia 49 (D49).

Moléculas Mediana (25th-75th)1 P (D0 x D19) 2

n= 17

P (D0 x D49) 3

n= 16

P (D19 x D49) 4

n= 22

IL-17A, pg/mL D0 50,76 (ND-66,71)2 0,594 0,248 0,427

D19 ND (ND-52,72)

D49 52,72 (ND-90,69)

IFN-γ, pg/mL D0 ND (ND-0,38) 0,889 0,203 0,308

D19 ND (ND-0,14)

D49 0,28 (ND-1,48)

TNF, pg/mL D0 ND (ND-1,49) 0,012 0,236 0,477

D19 ND (ND-ND)

D49 ND (ND-0,03)

IL-10, pg/mL D0 3,00 (1,57-6,79) 0,356 0,034 0,044

D19 2,66 (1,56-4,06)

D49 1,63 (0,91-3,41)

IL-6, pg/mL D0 5,70 (3,12-18,27) 0,113 0,379 0,277

D19 3,32 (1,20-8,08)

D49 3,64 (1,96-6,45)

IL-4, pg/mL D0 1,64 (ND-3,63) 0,953 0,445 0,346

D19 ND (ND-3,22)

D49 2,07 (ND-4,13)

IL-2, pg/mL D0 1,14 (ND-3,45) 0,515 0,541 0,878

D19 ND (ND-1,42)

D49 ND (ND-2,57)

sHLA-G, U/mL D0 95,08 (43,19-257,5) 0,910 0,140 0,394

D19 68,96 (48,60-161,10)

D49 75,92 (50,35-178,00)

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: 1 Mediana com valores dos percentis 25% e 75%; 2,3,4 P-valor calculado a partir do teste Wilcoxon signed

rank; ND – não detectável. IL-17A: interleucina-17A; IFN-γ: interferon-gamma; TNF: fator de necrose tumoral; IL-

10: interleucina-10; IL-6: interleucina-6; IL-4: interleucina-4; IL-2: interleucina-2; sHLA-G: antígeno leucocitário

humano G solúvel.

67

4.1.5 Correlações entre os níveis de citocinas e sHLA-G da medula óssea durante o tratamento

Considerando a possível regulação mútua entre os níveis de sHLA-G e citocinas na

medula óssea normal e leucêmica, foi avaliada a correlação entre os níveis de citocinas e sHLA-

G no estroma medular de crianças com LLA-T ao diagnóstico e durante a quimioterapia.

A análise do coeficiente de correlação de Pearson entre as diferentes moléculas ao

diagnóstico revelou correlações positivas significantes entre as citocinas TNF, IFN-γ, IL-2, IL-

4 e IL-17A (Figura 8A). No dia 19 da terapia de indução, os níveis de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-

17A continuaram correlacionados positivamente. Entretanto, os níveis de TNF apresentaram

correlação positiva apenas com os níveis de IL-6 e de IL-10. No dia 49, após a fase de

consolidação, IL-2 e IL-4 apresentaram correlação positiva entre si, e também com os níveis de

IL-17A e de TNF. Assim como no dia 19, TNF e IL-17A não foram correlacionadas.

Adicionalmente, IL-6 foi correlacionada positivamente a sHLA-G e IFN-γ apresentou

correlação positiva com IL-4, como observado ao diagnóstico e no dia 19.

Os resultados das análises realizadas nos dias 0, 19 e 49 podem ser observados nas

Figuras 8A, 8B e 8C, respectivamente. O coeficiente de correlação de Pearson (r) pode assumir

valores entre -1 e 1, sendo 1 a correlação positiva perfeita entre duas variáveis; -1, a correlação

negativa perfeita, e 0, ausência de correlação.

68

Figura 8 – Análise do coeficiente de correlação de Pearson entre os níveis de citocinas e

HLA-G solúvel (sHLA-G) no estroma medular de pacientes com LLA-T.

A

IL-17A IL17-A

IFN-γ 0,864

<0,001 IFN-γ

TNF 0,715

<0,001

0,833

<0,001 TNF

IL-10 0,176

0,446

0,345

0,125

0,231

0,313 IL-10

IL-6 -0,129 0,578

-0,046 0,845

-0,067 0,773

-0,058 0,802

IL-6

IL-4 0,836

<0,001

0,870

<0,001

0,715

<0,001

0,199

0,387

-0,132

0,569 IL-4

IL-2 0,864

<0,001

0,930

<0,001

0,817

<0,001

0,291

0,201

-0,106

0,649

0,933

<0,001 IL-2

sHLA-G -0,243

0,316

-0,124

0,613

-0,029

0,906

0,245

0,313

-0,106

0,666

-0,262

0,278

-0,411

0,081

B

IL-17A IL17-A

IFN-γ 0,657

<0,001 IFN-γ

TNF -0,144

0,475

-0,081

0,687 TNF

IL-10 -0,168

0,404

-0,092

0,649

0,986

<0,001 IL-10

IL-6 -0,116

0,564

-0,044

0,828

0,973

<0,001

0,956

<0,001 IL-6

IL-4 0,886

<0,001

0,814

<0,001

-0,131

0,516

-0,151

0,453

-0,133

0,509 IL-4

IL-2 0,685

<0,001

0,752

<0,001

-0,101

0,615

-0,114

0,571

-0,131

0,516

0,757

<0,001 IL-2

sHLA-G -0,123

0,567

-0,069

0,749

-0,135

0,529

-0,141

0,512

-0,034

0,876

-0,183

0,392

-0,167

0,436

C

IL-17A IL17-A

IFN-γ 0,277

0,191 IFN-γ

TNF 0,399

0,054

0,107

0,617 TNF

IL-10 -0,065

0,764

0,307

0,144

0,104

0,630 IL-10

IL-6 -0,247

0,245

-0,096

0,655

-0,084

0,696

-0,025

0,907 IL-6

IL-4 0,529

0,008

0,471

0,020

0,595

0,002

0,016

0,939

-0,201

0,346 IL-4

IL-2 0,409

0,047

0,323

0,123

0,708

<0,001

0,137

0,523

-0,143

0,504

0,685

<0,001 IL-2

sHLA-G -0,193

0,378

-0,195

0,372

-0,086

0,697

-0,258

0,235

0,619

0,002

-0,160

0,466

-0,261

0,228


Legenda: (A) diagnóstico; (B) dia 19; (C) dia 49. Valores superiores correspondem ao

coeficiente de correlação de Pearson; valores inferiores, P-valor. Em negrito, correlações

significantes estatisticamente.

69

4.1.6 Efeito dos níveis de citocinas e sHLA, e de variáveis clínicas e laboratoriais na sobrevida

de pacientes com LLA-T

Considerando os diferentes níveis de IL-10, TNF e IL-6 na medula óssea durante o

tratamento e a correlação positiva recíproca do nível de citocinas em diferentes tempos de

tratamento, foi avaliada se a presença ou não de certos níveis de citocinas em um determinado

ponto da quimioterapia seria preditiva de óbito na LLA-T pediátrica.

As análises de curva ROC mostraram que os níveis de IL-10 ao diagnóstico e de IFN-γ

no dia 49 foram preditores de sobrevida nos pacientes com LLA-T. A concentração de 4,57

pg/mL de IL-10 no estroma medular (D0) foi definida como ponto de corte preditor de óbito

(AUC= 0,824; sensibilidade= 1,000; especificidade= 0,765, P= 0,049). As análises de

sobrevida pela curva de Kaplan-Meier revelaram que pacientes com níveis de IL-10 inferiores

a 4,57 pg/mL apresentaram sobrevida geral maior (0 mortes/13 pacientes; 100% de

sobrevivência) do que aqueles com dosagens superiores ou iguais a 4,57 pg/mL (4 mortes/8

pacientes; 50% de sobrevivência; P= 0,001).

Na avaliação de IFN-γ (D49), a análise de curva ROC revelou o valor de 1,17 pg/mL

(AUC= 0,865; sensibilidade= 1,000; especificidade= 0,810, P= 0,045) como ponto de corte

para predição de óbito. As curvas de Kaplan-Meir mostraram que pacientes com baixos níveis

de IFN-γ (< 1,17) apresentaram maior sobrevida geral (0 mortes/17 pacientes, 100% de

sobrevivência) comparados com aqueles cujas dosagens foram superiores ou iguais ao valor de

ponto de corte na fase de consolidação (3 mortes/7 pacientes; 57,1% de sobrevivência; P=

0,015).

As Figuras 9A e 9B mostram as curvas de sobrevida obtidas considerando os níveis de

IL-10 ao diagnóstico e IFN-γ no dia 49, respectivamente.

70

Figura 9 – Influência dos níveis de IL-10 e IFN-γ na sobrevida geral dos pacientes com LLA-T.

A

B


Legenda: (A) Análise de sobrevida geral considerando níveis da citocina IL-10 ao diagnóstico (ponto de corte =

4,57 pg/mL); (B) Análise de sobrevida geral considerando níveis da citocina IFN-γ no dia 49 (D49) (ponto de corte

= 1,17 pg/mL).

A análise de associação de variáveis clínicas e laboratoriais com a taxa de sobrevida não

revelou resultados significantes, mesmo quando foram considerados o número de leucócitos

totais em sangue periférico ao diagnóstico utilizando 50.000/mm3 como ponto de corte (P=

0,218), ou o percentual de blastos em sangue periférico ao diagnóstico e no dia 5 (D5) após

início de tratamento com corticoide considerando 5% como ponto de corte (P= 0,940). As

Figuras 10A e 10B mostram as curvas de sobrevida obtidas considerando leucócitos totais e

blastos no dia 5, respectivamente.

Apesar disso, os níveis de sHLA-G na medula óssea foram associados à leucocitose (P=

0,027), mostrando que aqueles pacientes com leucócitos totais no sangue periférico acima de

50.000/mm3 ao diagnóstico apresentaram níveis mais altos de sHLA-G (mediana= 220,20

U/mL) em relação aos pacientes com leucócitos totais abaixo de 50.000/mm3 (sHLA-G

mediana= 69,44 U/mL). Os níveis de sHLA-G no estroma medular não foram associados à

sobrevida dos pacientes com LLA-T.

O Gráfico 1 mostra os níveis de sHLA-G nos dois grupos de pacientes comparados.

71

Figura 10 – Influência de variáveis clínicas na sobrevida geral dos pacientes com LLA-T.

A

B


Legenda: (A) Análise de sobrevida geral considerando a contagem de leucócitos totais ao diagnóstico; (B) Análise de

sobrevida geral considerando blastos em sangue periférico (SP) no dia 5 (D5).

Gráfico 1 – Análise da associação entre os níveis de HLA-G solúvel (sHLA-

G) e contagem de leucócitos no sangue periférico ao diagnóstico.

Ao diagnóstico

>=50.0

00

<50.0

00

0

200

400

600

800P= 0,027

Leucócitos

sHL

A-G

(U

/mL

)


Legenda: 50.000 leucócitos/mm3 em sangue total como ponto de corte. P – P-

valor calculado a partir do teste Mann-Whitney U.

72

4.1.7 Avaliação da influência recíproca entre os níveis de citocinas e sHLA-G na medula óssea

de crianças com LLA-T

Para uma maior investigação do papel do nível de IL-10 ao diagnóstico na taxa de

sobrevida, foi avaliada a influência recíproca dos níveis de sHLA-G no grupo de pacientes com

níveis de IL-10 iguais ou superiores a 4,57 pg/mL e, separadamente, no grupo de pacientes

apresentando níveis de IL-10 inferiores ao ponto de corte (Figuras 11A, 11B). De acordo com

a análise multivariada, o modelo final revelou que crianças apresentando baixos níveis de IL-

10 ao diagnóstico e melhor taxa de sobrevida exibiram uma correlação positive significante

entre os níveis de IL-17A e IL-2 (P= 0,007). O pior prognóstico relacionado ao alto nível de

IL-10 na medula óssea parece estar relacionado à correlação positiva recíproca entre os níveis

IL-17A e TNF (P< 0,001) e também entre os níveis de TNF e IFN-γ (P< 0,001).

Em relação ao papel dos níveis de IFN-γ após a fase de consolidação da quimioterapia

(D49) na taxa de sobrevida, foram identificadas influências recíprocas dos níveis de IL-17 e IL-

4, IL-4 e IL-2, assim como TNF e IFN-γ no grupo de pacientes com bom prognóstico e menores

níveis de IFN-γ (< 1,17 pg/mL; Figuras 11C, 11D). No grupo com altos níveis de IFN-γ, a

modulação de citocinas foi caracterizada pelas influências recíprocas dos níveis de TNF e IL-2

(P= 0,018), bem como de IFN-γ e IL-6 (P=0,040). Uma influência inversa nos níveis de IL-10

e sHLA-G também foi observada em pacientes com desfecho menos favorável, todavia, não foi

significante (P= 0,093), talvez devido ao pequeno tamanho da amostra, como indicado pelo

grande intervalo de confiança.

Os resultados do teste Mann-Whitney U relacionados à expressão de citocinas de acordo

com o nível de IFN-γ na medula óssea sugeriram que os níveis de IL-2, IL-4 e IL-10 devem

também estar indiretamente associados à taxa de sobrevida (Tabela 8).

73

Figura 11 - Influência recíproca de citocinas e sHLA-G em LLA-T de acordo com os níveis medulares de IL-10 ao diagnóstico (Painel 11A e 11B), e os níveis de IFN-

γ após fase de consolidação da quimioterapia (D49) (Painel 11C e 11D).

A B

C D

IFN-γ

IL-4

IL-2 TNF

IL-17

P=0,007

P=0,08

P=0,016 IFN-γ

IL-4

IL-2 TNF

IL-17

P<0,001

P<0,001

P<0,001

IFN-γ

IL-4

IL-2 TNF

IL-17

P<0,001

P<0,001

P=0,005

P=0,070

IFN-γ

IL-4

IL-2 TNF

IL-17

IL-6

IL-10

sHLA-G

P=0,041

P=0,019

P=0,040 P=0,093


Legenda: (A) Ao diagnóstico, IL-10 < 4,57 pg/mL; (B) Ao diagnóstico, IL-10 ≥ 4,57 pg/mL; (C) No D49, IFN-γ < 1,17 pg/mL; (D) No D49, IFN-γ ≥ 1,17 pg/mL. Todas as

linhas representam correlação positiva entre as moléculas exceto a correlação negativa entre sHLA-G e IL-10 encontrada no D49. Linhas sólidas correspondem ao coeficiente

de correlação de Pearson que atingiu significância na análise multivariada.

IL-10 < 4,57 pg/mL (maior sobrevida geral) IL-10 ≥ 4,57 pg/mL (menor sobrevida geral)

IFN-γ < 1,17 pg/mL (maior sobrevida geral) IFN-γ ≥ 1,17 pg/mL (menor sobrevida geral)

74

Tabela 8 - Diferenças nos níveis de citocinas e sHLA-G em LLA-T de acordo com os níveis

medulares de IL-10 ao diagnóstico, e os níveis de IFN-γ após a fase de consolidação da

quimioterapia.

D0 (IL-10) Alto (≥ 4.57) Baixo (< 4.57) P-valor

Fatores solúveis

IL-2 2,52 0,00 0,250

IL-4 1,66 1,64 0,794

IL-6 7,43 4,90 0,405

TNF 0,00 0,00 0,873

IFN-γ 0,07 0,00 0,407

IL-17A 25,38 51,24 0,969

sHLA-G 95,08 89,66 0,767

D49 (IFN-γ) Alto (≥ 1,17) Baixo (< 1,17) P-valor

Fatores solúveis

IL-2 2,82 0,00 0,045

IL-4 4,22 0,00 0,011

IL-6 5,04 3,10 0,634

IL-10 3,80 1,26 0,017

TNF 0,00 0,00 0,182

IL-17A 70,60 0,00 0,086

sHLA-G 91,97 73,62 0,815


Legenda: Todos os fatores solúveis estão expressos em valores de mediana (pg/mL para citocinas e

Unidades/mL para HLA-G solúvel (sHLA-G)). P-valor calculado a partir do teste Mann-Whitney U.

4.2 Polimorfismos em Genes de Citocinas e de HLA-G em LLA-T

Para o estudo de polimorfismos, foram considerados 61 pacientes devido à

disponibilidade de amostras para extração de DNA. Além disso, em cada sítio polimórfico o

número de pacientes com LLA-T e de indivíduos saudáveis (controles) avaliados foi variável,

uma vez que foram considerados apenas sequenciamentos de qualidade. Devido ao número

diferente de polimorfismos avaliados em cada gene e ao diferente número de pacientes e

controles considerados em cada sítio polimórfico, os resultados foram estratificados em 5

categorias:

(a) Polimorfismos na região promotora do gene IL10;

(b) Polimorfismo no íntron 1 do gene IFNG;

(c) Polimorfismos na região promotora do gene TNF;

(d) Polimorfismos na 3’UTR do gene HLA-G;

75

(e) Associação de polimorfismos genéticos com óbito e sobrevida geral dos pacientes

com LLA-T

4.2.1 Polimorfismos no promotor do gene IL10

Para realização das análises de polimorfismos, foram consideradas 53 e 58 amostras de

DNA provenientes de crianças com LLA-T para avaliação dos sítios -819 C/T (rs1800871) e -

1082 G/A (rs1800896) do gene IL10, respectivamente, e 112 amostras de DNA decorrentes de

crianças saudáveis que apresentaram dados em relação aos alelos e genótipos nos

polimorfismos mencionados. Nenhuma diferença significante foi observada quando as

frequências alélicas e genotípicas de cada sítio polimórfico em IL10 foram comparadas entre

LLA-T e o grupo controle. Os genótipos de todos os sítios polimórficos avaliados adequaram-

se às expectativas do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P> 0,05).

A Tabela 9 mostra as frequências alélicas e genotípicas de cada polimorfismo com a

análise estatística realizada.

Tabela 9 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no gene IL10 em pacientes com LLA-T e

controles.

Polimorfismo LLA-T (n) Frequência Controles (n) Frequência P-valor OR (IC95%)

IL10 -819 C/T

C 75 0,708 142 0,634 0,215 1,40 (0,85-2,30)

T 31 0,292 82 0,366 0,215 0,72 (0,43-1,18)

CC 26 0,491 46 0,411 0,401 1,38 (0,72-2,67)

CT 23 0,434 50 0,446 1,000 0,95 (0,49-1,84)

TT 4 0,075 16 0,143 0,308 0,49 (0,15-1,54)

EHW (P-valor) 1,000 0,686

IL10 -1082 G/A

A 71 0,612 147 0,656 0,474 0,83 (0,52-1,31)

G 45 0,388 77 0,344 0,474 1,21 (0,76-1,92)

AA 23 0,397 50 0,446 0,624 0,81 (0,43-1,55)

GA 25 0,431 47 0,420 1,000 1,05 (0,55-1,99)

GG 10 0,172 15 0,134 0,502 1,35 (0,56-3,22)

EHW (P-valor) 0,579 0,529

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: n – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher. OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de

confiança de 95%; EHW – Equilíbrio de Hardy-Weinberg, P-valor > 0,05 = população em equilíbrio.

76

Em relação à análise de reconstrução de haplótipos, foram observadas três combinações

de alelos para a região de IL10 estudada tanto nos pacientes com LLA-T quanto nos controles,

sendo as frequências semelhantes nos dois grupos. Nenhuma associação dos haplótipos com a

doença foi observada. A Tabela 10 mostra os resultados da análise de haplótipos para o gene

IL10.

Tabela 10 – Frequência de haplótipos na região promotora de IL10 estudada presentes nos pacientes

com LLA-T e nos controles.

Haplótipo -1082 -819 LLA-T

N (Frequência)

Controles

N (Frequência) P-valor OR (IC95%)

1 A C 34 (0,333) 65 (0,290) 0,438 1,22 (0,74-2,02)

2 G C 39 (0,382) 77 (0,344) 0,534 1,18 (0,73-1,92)

3 A T 29 (0,284) 82 (0,366) 0,166 0,69 (0,41-1,14)


Legenda: N – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio;

IC95% - Intervalo de confiança de 95%.

A análise do desequilíbrio de ligação (LD) revelou LD significante (P< 0,05) para o par

de sítios polimórficos no promotor de IL10 tanto nos pacientes com LLA-T quanto nos

indivíduos saudáveis (controles). A Tabela 11 mostra os resultados da análise de LD nos

pacientes e controles.

Tabela 11 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de

ligação para os dois polimorfismos estudados na região

promotora de IL10 em relação aos pacientes com LLA-T (sob a

diagnonal) e aos controles (acima da diagonal).

Polimorfismos -819 -1082

-819 C/T - 0,00000

-1082 C/T 0,00000 -


Legenda: P-valores significantes (P< 0,05) estão representados em

negrito e indicam pares de sítios polimórficos em desequilíbrio de

ligação.

77

4.2.2 Polimorfismo no íntron 1 do gene IFNG

Para avaliação do polimorfismo +874 T/A (rs2430561) no íntron 1 do gene IFNG, foram

consideradas 58 amostras de DNA provenientes de crianças com LLA-T e 82 amostras de DNA

decorrentes de indivíduos saudáveis (controles pediátricos) que apresentaram dados em relação

aos alelos e genótipos. Nenhuma diferença significante foi observada quando as frequências

alélicas e genotípicas do sítio polimórfico em IFNG foram comparadas entre LLA-T e o grupo

controle. Os genótipos do polimorfismo apresentaram proporções concordantes com as

esperadas no equilíbrio de Hardy-Weinberg (P> 0,05).

A Tabela 12 mostra as frequências alélicas e genotípicas de IFNG +874 T/A com a análise

estatística realizada.

Tabela 12 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no íntron 1 do gene IFNG em pacientes com

LLA-T e controles.


IFNG +874 T/A

A 71 0,612 104 0,634 0,709 0,91 (0,56-1,49)

T 45 0,388 60 0,366 0,709 1,10 (0,67-1,79)

AA 23 0,397 32 0,390 1,000 1,03 (0,52-2,04)

TA 25 0,431 40 0,488 0,606 0,79 (0,40-1,56)

TT 10 0,172 10 0,122 0,466 1,50 (0,58-3,88)

EHW (P-valor) 0,589 0,812


Legenda: n – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de


4.2.3 Polimorfismos no promotor do gene TNF

Para as análises de polimorfismos, foram consideradas 56, 58, 58, 56 e 54 amostras de

DNA provenientes de crianças com LLA-T para avaliação dos sítios -1031 T/C (rs1799964), -

863 C/A (rs1800630), -857 C/T (rs1799724), -308 G/A (rs1800629) e -238 G/A (rs361525) do

gene TNF, respectivamente, e 108 amostras de DNA provenientes de indivíduos saudáveis

(controles pediátricos) que apresentaram dados em relação aos alelos e genótipos nos

polimorfismos mencionados. Nenhuma diferença significante foi observada quando as

frequências alélicas e genotípicas de cada sítio polimórfico em TNF foram comparadas entre

LLA-T e o grupo controle. Os genótipos de todos os sítios polimórficos avaliados adequaram-

se às expectativas do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P> 0,05).

78

A Tabela 13 mostra as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo com a análise

estatística realizada.

Tabela 13 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados no gene TNF em pacientes com LLA-T e

controles.


TNF -1031 T/C

C 33 0,295 61 0,282 0,898 1,06 (0,64-1,75)

T 79 0,705 155 0,718 0,898 0,94 (0,57-1,56)

CC 5 0,089 7 0,065 0,546 1,41 (0,43-4,68)

TC 23 0,411 47 0,435 0,868 0,90 (0,47-1,74)

TT 28 0,500 54 0,500 1,000 1,00 (0,52-1,90)

EHW (P-valor) 1,000 0,634

TNF -863 C/A

A 27 0,233 44 0,204 0,575 1,19 (0,69-2,04)

C 89 0,767 172 0,796 0,575 0,84 (0,49-1,45)

AA 4 0,069 5 0,046 0,721 1,53 (0,39-5,92)

CA 19 0,328 34 0,315 0,863 1,06 (0,54-2,01)

CC 35 0,603 69 0,639 0,737 0,86 (0,45-1,66)

EHW (P-valor) 0,479 0,767

TNF -857 C/T

C 109 0,940 195 0,903 0,304 1,68 (0,69-4,07)

T 7 0,060 21 0,097 0,304 0,60 (0,25-1,45)

CC 51 0,879 88 0,815 0,379 1,66 (0,65- 4,19)

CT 7 0,121 19 0,176 0,382 0,64 (0,25-1,63)

TT 0 0,000 1 0,009 1,000 0,61 (0,024-15,29)

EHW (P-valor) 1,000 1,000

TNF -308 G/A

A 15 0,134 19 0,088 0,251 1,60 (0,78-3,29)

G 97 0,866 197 0,912 0,251 0,62 (0,30-1,28)

AA 1 0,018 1 0,009 1,000 1,94 (0,12-31,72)

GA 13 0,232 17 0,157 0,288 1,62 (0,72-3,63)

GG 42 0,750 90 0,833 0,217 0,60 (0,27-1,32)

EHW (P-valor) 1,000 0,580

TNF -238 G/A

A 6 0,056 15 0,069 0,812 0,79 (0.30-2.09)

G 102 0,944 201 0,931 0,812 1,27 (0.48-3.37)

AA 0 0,000 0 0,000 ND

GA 6 0,111 15 0,139 0,805 0,77 (0,28-2,13)

GG 48 0,889 93 0,861 0,805 1,29 (0,47-3,54)

EHW (P-valor) 1,000 1,000

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: n – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de

confiança de 95%; ND – Não determinado; EHW – Equilíbrio de Hardy-Weinberg, P-valor > 0,05 = população em equilíbrio.

79

Em relação à análise de reconstrução de haplótipos, foram observadas 5 combinações

de alelos para a região de TNF estudada tanto nos pacientes com LLA-T quanto nos controles,

sendo as frequências semelhantes nos dois grupos. Nenhuma associação dos haplótipos com a

doença foi observada, embora o haplótipo 4- TCCAG tenha apresenta um discreto aumento nos

pacientes com LLA-T (P= 0,073). A Tabela 14 mostra os resultados da análise de haplótipos

para o gene TNF.

Tabela 14 – Frequência de haplótipos na região promotora de TNF estudada presentes nos pacientes com LLA-

T e controles.

Haplótipo -1031 -863 -857 -308 -238 LLA-T

N (Frequência)

Controles

N (Frequência) P-valor OR (IC95%)

1 C A C G G 24 (0,226) 44 (0,209) 0,772 1,10 (0,63-1,94)

2 C C C G A 6 (0,057) 11 (0,052) 1,000 1,08 (0,39-3,02)

3 T C C G G 54 (0,509) 115 (0,548) 0,551 0,86 (0,54-1,37)

4 T C C A G 15 (0,141) 16 (0,076) 0,073 2,00 (0,95-4,22)

5 T C T G G 7 (0,066) 20 (0,095) 0,523 0,67 (0,27-1,64)

6 - Outros - - - - - 0 (0,000) 4 (0,019) 0,305 0,21 (0,01-4,04)


Legenda: N – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de

confiança de 95%; Outros: haplótipos CCCGG e TCTGA.

A análise do desequilíbrio de ligação (LD) revelou LD significante (P< 0,05) para 4

dos 10 possíveis pares de sítios polimórficos no promotor de TNF tanto nos pacientes com

LLA-T quanto nos indivíduos saudáveis (controles). A Tabela 15 mostra os resultados da

análise de LD nos pacientes e controles.

Tabela 15 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de ligação para os cinco

polimorfismos estudados na região promotora de TNF em relação aos pacientes com LLA-T

(sob a diagonal) e aos controles (acima da diagonal).

Polimorfismos -1031 -863 -857 -308 -238

-1031 T/C - 0,00000 0,01084 0,33816 0,00010

-863 C/A 0,00000 - 0,03224 0,34555 0,03718

-857 C/T 0,14944 0,32617 - 0,10084 0,95296

-308 G/A 0,00429 0,01769 0,36232 - 0,79295

-238 G/A 0,00248 0,17992 0,35802 0,16928 -

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: P-valores significantes (P< 0,05) estão representados em negrito e indicam pares de sítios

polimórficos em desequilíbrio de ligação.

80

4.2.4 Polimorfismos na 3’UTR do gene HLA-G

Para análise dos polimorfismos, foram consideradas 61 crianças com LLA-T para

avaliação dos sítios 14-bp Del/Ins (rs371194629), +3003 C/T (rs1707), +3010 C/G (rs1710),

respectivamente, e 60 pacientes para o sítio +3027 A/C (rs17179101). Já para os polimorfismos

+3035 C/T (rs17179108), +3142 C/G (rs1063320), +3187 A/G (rs9380142) e +3196 C/G

(rs1610696), foram avaliadas amostras de DNA de 61, 60, 55 e 54 pacientes com LLA-T,

respectivamente. Para todas as análises, 107 indivíduos (controles pediátricos) saudáveis foram

considerados, apresentando dados em relação aos alelos e genótipos na 3’UTR do gene.

Nenhuma diferença significante foi observada quando as frequências alélicas e

genotípicas de cada sítio polimórfico em HLA-G foram comparadas entre LLA-T e o grupo

controle. Os genótipos de todos os sítios polimórficos avaliados adequaram-se às expectativas

do equilíbrio de Hardy-Weinberg, com exceção do sítio +3027 em que os pacientes com LLA-

T exibiram déficit de heterozigose (P= 0,050) e do sítio +3035 em que tanto os pacientes (P=

0,004) quantos os controles (P= 0,005) apresentaram déficit de heterozigose.

As frequências alélicas e genotípicas de cada polimorfismo podem ser observadas na

Tabela 16.

Tabela 16 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados na 3’UTR do gene HLA-G em pacientes com

LLA-T e controles. (Continua).


14-bp Del/Ins

Ins 46 0,377 85 0,397 0,729 0,92 (0,58-1,45)

Del 76 0,623 129 0,603 0,729 1,09 (0,69-1,72)

Ins/Ins 7 0,115 17 0,159 0,498 0,69 (0,27-1,76)

Del/Ins 32 0,525 51 0,477 0,631 1,21 (0,65-2,27)

Del/Del 22 0,361 39 0,364 1,000 0,98 (0,51-1,89)

EHW (P-valor) 0,427 1,000

+3003 C/T

C 7 0,057 19 0,089 0,397 0,62 (0,25-1,53)

T 115 0,943 195 0,911 0,397 1,60 (0,65-3,92)

CC 0 0,000 1 0,009 1,000 0,58 (0,02-14,40)

CT 7 0,115 17 0,159 0,498 0,69 (0,27-1,76)

TT 54 0,885 89 0,832 0,379 1,56 (0,61-3,98)

EHW (P-valor) 1,000 0,583

+3010 C/G

C 77 0,631 131 0,612 0,815 1,08 (0,68-1,72)

G 45 0,369 83 0,388 0,815 0,92 (0,58-1,46)

81

Tabela 16 – Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados na 3’UTR do gene HLA-G em pacientes com

LLA-T e controles.

(Conclusão)


+3010 C/G

CC 23 0,377 37 0,346 0,738 1,14 (0,60-2,20)

CG 31 0,508 57 0,533 0,872 0,91 (0,48-1,70)

GG 7 0,115 13 0,121 1,000 0,94 (0,35-2,49)

EHW (P-valor) 0,588 0,307

+3027 A/C

A 4 0,033 11 0,051 0,586 0,64 (0,20-2,04)

C 116 0,967 203 0,949 0,586 1,57 (0,49-5,05)

AA 1 0,017 0 0,000 0,359 5,42 (0,22-135,30)

AC 2 0,033 11 0,103 0,138 0,30 (0,06-1,41)

CC 57 0,950 96 0,897 0,383 2,18 (0,58-8,14)

EHW (P-valor) 0,050 1,000

+3035 C/T

C 99 0,811 180 0,841 0,546 0,81 (0,45-1,46)

T 23 0,189 34 0,159 0,546 1,23 (0,69-2,20)

CC 44 0,721 80 0,748 0,718 0,87 (0,43-1,78)

CT 11 0,180 20 0,187 1,000 0,96 (0,42-2,16)

TT 6 0,098 7 0,065 0,550 1,56 (0,50-4,87)

EHW (P-valor) 0,004 0,005

+3142 C/G

C 45 0,375 83 0,388 0,907 0,95 (0,60-1,50)

G 75 0,625 131 0,612 0,907 1,06 (0,67-1,67)

CC 7 0,117 13 0,121 1,000 0,95 (0,36-2,54)

CG 31 0,517 57 0,533 0,873 0,94 (0,50-1,77)

GG 22 0,367 37 0,346 0,866 1,09 (0,57-2,20)

EHW (P-valor) 0,583 0,307

+3187 A/G

A 81 0,736 159 0,743 0,894 0,97 (0,57-1,63)

G 29 0,264 55 0,257 0,894 1,03 (0,61-1,75)

AA 31 0,564 58 0,542 0,868 1,09 (0,57-2,10)

AG 19 0,345 43 0,402 0,501 0,78 (0,40-1,55)

GG 5 0,091 6 0,056 0,511 1,68 (0,49-5,78)

EHW (P-valor) 0,485 0,800

+3196 C/G

C 85 0,787 156 0,729 0,279 1,37 (0,79-2,38)

G 23 0,213 58 0,271 0,279 0,73 (0,42-1,26)

CC 31 0,574 55 0,514 0,506 1,27 (0,66-2,46)

CG 23 0,426 46 0,430 1,000 0,98 (0,51-1,91)

GG 0 0,000 6 0,056 0,180 0,14 (0,01-2,60)

EHW (P-valor) 0,095 0,467


Legenda: n – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de


82

Em relação à análise de reconstrução de haplótipos, foram observadas mais de 7

combinações de alelos para a região 3’UTR de HLA-G tanto nos pacientes com LLA-T quanto

nos controles, sendo as frequências semelhantes nos dois grupos. Nenhuma associação dos

haplótipos com a doença foi observada. A Tabela 17 mostra os resultados da análise de

haplótipos para o gene HLA-G.

Tabela 17 – Frequência de haplótipos na região 3’ não-traduzida (3’UTR) de HLA-G presentes nos pacientes com LLA-T

e controles.

Haplótipo

14p

b

+3003

+3010

+3027

+3035

+3142

+3187

+3196

LLA-T1

Controles2

P-valor OR (IC95%)

UTR-1 Del T G C C C G C 25 (0,245) 53 (0,250) 1,000 0,97 (0,56-1,68)

UTR-2 Ins T C C C G A G 19 (0,186) 54 (0,255) 0,201 0,67 (0,37-1,20)

UTR-3 Del T C C C G A C 26 (0,255) 44 (0,207) 0,386 1,31 (0,75-2,28)

UTR-4 Del C G C C C A C 7 (0,069) 19 (0,090) 0,663 0,75 (0,30-1,84)

UTR-5 Ins T C C T G A C 12 (0,118) 20 (0,094) 0,553 1,28 (0,60-2,73)

UTR-6 Del T G C C C A C 6 (0,059) 7 (0,033) 0,364 1,83 (0,60-5,59)

UTR-7 Ins T C A T G A C 4 (0,039) 9 (0,042) 1,000 0,92 (0,28-3,06)

Outros3 - - - - - - - - 3 (0,029) 6 (0,028) 1,000 1,04 (0,25-4,25)


Legenda: 1,2 Número amostral (Frequência); P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% -

Intervalo de confiança de 95%; Outros: UTR-13 DelTCCTGAC, UTR-16 ITCCTGAG, UTRs desconhecidas DelTGCCCGG,

DelTGCCCAG, DelTGCTCAC, InsTCATGAG.

Em relação à análise do desequilíbrio de ligação (LD), foi revelado LD significante (P<

0,05) em 15 dos 28 possíveis pares de sítios polimórficos na 3’UTR de HLA-G nos pacientes

com LLA-T. Já nos controles, o LD foi observado em 25 dos 28 possíveis pares de sítios

polimórficos na região do gene estudado. A Tabela 18 mostra os resultados da análise de LD

nos pacientes e controles.

Tabela 18 – Probabilidades do teste exato de desequilíbrio de ligação para os oito polimorfismos

estudados na 3’UTR de HLA-G em relação aos pacientes com LLA-T (sob a diagnonal) e aos controles

(acima da diagonal).

Polimorfismos 14-pb +3003 +3010 +3027 +3035 +3142 +3187 +3196

14-pb Del/Ins - 0,00223 0,00000 0,00033 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000

+3003 C/T 0,13164 - 0,00000 0,39735 0,01870 0,00000 0,01160 0,20629

+3010 C/G 0,00000 0,00702 - 0,03946 0,00004 0,00000 0,00000 0,00003

+3027 A/C 0,00739 0,51617 0,10705 - 0,00000 0,03946 0,27448 0,03591

+3035 C/T 0,00000 0,21329 0,00017 0,00032 - 0,00004 0,00080 0,01018

+3142 C/G 0,00000 0,00702 0,00000 0,10705 0,00017 - 0,00000 0,00003

+3187 A/G 0,00024 0,08345 0,00000 0,11676 0,00320 0,00000 - 0,00111

+3196 C/G 0,00000 0,40683 0,24917 0,16325 0,21695 0,24917 0,83419 -

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: P-valores significantes (P < 0,05) estão representados em negrito e indicam pares de sítios

polimórficos em desequilíbrio de ligação.

83

4.2.5 Associação de polimorfismos genéticos com óbito e sobrevida

Considerando que os níveis medulares das citocinas IL-10 e IFN-γ apresentaram

associação com sobrevida geral dos pacientes com LLA-T e que os níveis de TNF exibiram

alteração durante o tratamento quimioterápico, 3 polimorfismos nos genes IL10, IFNG e TNF,

relacionados à produção das citocinas, foram selecionados para avaliação de associação com

óbito e sobrevida geral, a fim de verificar se também existe influência nestas variáveis clínicas.

Foram avaliados os polimorfismos IL10 -1082 G/A, IFNG +874 T/A e TNF -308 G/A,

considerando em cada sítio o genótipo de alta produção da citocina (alto produtor) juntamente

com o genótipo heterozigoto versus genótipo baixo produtor para avaliação de associação com

óbito e sobrevida geral dos pacientes com LLA-T.

Os três polimorfismos avaliados nos genes IL10, IFNG e TNF não apresentaram

associação com óbito, mesmo quando os genótipos foram estratificados e combinados de

acordo com o potencial de influência na produção da proteína. A Tabela 19 mostra a análise

realizada para os três polimorfismos genéticos em relação ao óbito de pacientes com LLA-T.

Tabela 19 – Associação de polimorfismos nos genes IL10, IFNG e TNF com óbito em pacientes com LLA-T.

Polimorfismo Óbito P-valor OR (IC95%)

Sim (n) Não (n)

IL10 -1082 G/A

GG + GA 10 25 0,773 0,75 (0,24-2,32)

AA 8 15

IFNG +874 T/A

TT + TA 13 22 0,257 2,13 (0,64-7,10)

AA 5 18

TNF -308 G/A

AA+GA 4 10 1,000 0,80 (0,21-3,01)

GG 14 28


Legenda: n – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de confiança de 95%.

Em relação à sobrevida geral, nenhum polimorfismo genético dos três avaliados

apresentou associação quando os genótipos foram avaliados individualmente ou em

combinação (alto produtor + heterozigoto versus baixo produtor).

Na análise do sítio polimórfico -1082 G/A do gene IL10, a sobrevida geral dos pacientes

com LLA-T portadores do genótipo GG (alto) foi 80% (2 óbitos; 10 pacientes), seguido de 68%

(8 óbitos; 25 pacientes) e 65,5% (8 óbitos; 23 pacientes) de sobrevida para aqueles com

84

genótipos GA e AA (P= 0,483), respectivamente Quando a combinação dos genótipos GG e

GA foi considerada em relação ao genótipo AA, a sobrevida geral dos pacientes com a

combinação foi 71,4% (10 óbitos; 35 pacientes), enquanto a sobrevida para portadores de AA

foi 65,2% (8 óbitos; 23 pacientes; P= 0,334).

Para o polimorfismo +874 T/A no gene IFNG, a sobrevida geral para os pacientes com

genótipo AA foi 78,3% (5 óbitos; 23 pacientes); para aqueles com genótipo TA, 68% (8 óbitos;

25 pacientes) e os pacientes portadores de TT, 50% (5 óbitos; 10 pacientes). Mesmo que as

taxas de sobrevida sejam relativamente diferentes, a análise não atingiu significância estatística

(P= 0,293). Quando a combinação TT+TA (alto produtores) foi considerada, a sobrevida geral

não apresentou diferença significativa (62,9%; 13 óbitos; 35 pacientes) em relação ao genótipo

AA (baixo produtor; 78,3%; 5 óbitos; 23 pacientes; P= 0,201).

A Figura 12 mostra as curvas de Kaplan-Meier analisadas para os polimorfismos em

IL10 e IFNG.

Considerando o polimorfismo -308 G/A no gene TNF, a sobrevida geral para o genótipo

AA foi de 100%. Não houve óbito nesse grupo representado por um paciente com LLA-T. Já

nos pacientes com genótipo GA, a sobrevida cumulativa foi de 69,2% (4 óbitos; 13 pacientes),

e 66,7% (14 óbitos; 42 pacientes) naqueles com genótipo GG. Quando os pacientes foram

agrupados de acordo com genótipos AA+GA (alto produtores), a sobrevida geral foi de 71,4%

(4 óbitos; 14 pacientes) contra 66,7% (14 óbitos; 42 pacientes) para os pacientes com genótipo

GG (P= 0,566).

Em adição, a sobrevida geral dos pacientes com LLA-T também foi avaliada

considerando a combinação de dois sítios polimórficos. Para os polimorfismos -1082 G/A em

IL10 e +874 T/A em IFNG, as combinações de genótipos foram realizadas de acordo com seu

potencial de produção das citocinas, sendo considerado: (1) IL10(GG+GA) + IFNGAA, alto e

baixo produtores; (2) IL10AA + IFNG(TT+TA), baixo e alto produtores; (3) IL10(GG+GA) +

IFNG(TT+TA), alto produtores; e (4) IL10AA + IFNGAA, baixo produtores. A sobrevida geral

dos pacientes com LLA-T não foi estatisticamente diferente (P= 0,244) para as combinações

de genótipos avaliadas, embora tenha ocorrido variação, sendo observado: (1) 87,5% (2 óbitos;

16 pacientes); (2) 68,8% (5 óbitos; 16 pacientes); (3) 55,6% (8 óbitos; 18 pacientes); e (4)

50,0% (3 óbitos; 6 pacientes), respectivamente.

Em relação aos polimorfismos -1082 G/A em IL10 e -308 G/A em TNF, as combinações

de genótipos também foram realizadas de acordo com seu potencial de produção das citocinas,

sendo considerado: (1) IL10AA + TNFGA, baixo e alto produtores; (2) IL10(GG+GA) +

TNFGG, alto e baixo produtores; (3) IL10(GG+GA) + TNF(AA+GA), alto produtores; e (4)

85

IL10AA + TNFGG. A sobrevida geral dos pacientes com LLA-T não foi estatisticamente

diferente (P= 0,468) para as combinações de genótipos avaliadas, embora tenha ocorrido

variação, sendo observado: (1) 100,0% (0 óbitos; 2 pacientes); (2) 68,4% (6 óbitos; 19

pacientes); (3) 66,7% (4 óbitos; 12 pacientes); e (4) 61,9% (8 óbitos; 21 pacientes),

respectivamente.

A Figura 13 mostra as curvas de Kaplan-Meier analisadas para os polimorfismos em

TNF e as combinações de genótipos de IL10 e TNF, e IL10 e IFNG.

Considerando a análise de haplótipos, nenhum dos haplótipos detectados no gene IL10

apresentaram associação com óbito, sendo observadas frequências semelhantes no grupo de

pacientes com LLA-T que foi a óbito e no grupo daquele que estão vivos. Também não foi

observada associação com leucócitos totais em sangue periférico ao diagnóstico considerando

50.000/mm3 como ponto de corte (Apêndice B). A Tabela 20 mostra os resultados da análise

de associação com óbito.

Figura 12 - Influência dos polimorfismos -1082 G/A em IL10 e +874 T/A em IFNG na sobrevida geral dos pacientes com

LLA-T. (Continua).

A

B

86

Figura 12 - Influência dos polimorfismos -1082 G/A em IL10 e +874 T/A em IFNG na sobrevida geral dos pacientes com

LLA-T.

(Conclusão)

C

D


Legenda: (A) e (B) Análises de sobrevida geral considerando os genótipos de IL10 -1082 G/A individualmente ou em

combinação; (C) e (D) Análises de sobrevida geral considerando os genótipos de IFNG +874 T/A individualmente ou em combinação.

Figura 13 - Influência do polimorfismo -308 G/A em TNF e de combinações dos sítios -1082 G/A em IL10, -308 G/A em

TNF e +874 T/A em IFNG na sobrevida geral dos pacientes com LLA-T. (Continua)

A

B

87

Figura 13 - Influência do polimorfismo -308 G/A em TNF e de combinações dos sítios -1082 G/A em IL10, -308 G/A em

TNF e +874 T/A em IFNG na sobrevida geral dos pacientes com LLA-T.

(Conclusão)

C

D


Legenda: (A) e (B) Análises de sobrevida geral considerando os genótipos de TNF -308 G/A individualmente ou em combinação.

(C) Análise de sobrevida geral considerando a combinação de genótipos nos sítios -1082 G/A de IL10 e -308 G/A em TNF, sendo: A1, IL10AA + TNGGA; A2, IL10(GG+GA) + TNFGG; A3, IL10(GG+GA) + TNF(AA+GA); A4, IL10AA + TNFGG.

(D) Análise de sobrevida geral considerando a combinação de genótipos nos sítios -1082 G/A de IL10 e +874 G/A em IFNG,

sendo: B1, IL10(GG+GA) + IFNGAA; B2, IL10AA + IFNG(TT+TA); B3, IL10(GG+GA) + IFNG(TT+TA); B4, IL10AA +

IFNGAA.

Tabela 20 – Análise de associação dos haplótipos da região promotora de IL10 com óbito em pacientes

com LLA-T.

Haplótipo -1082 -819 Óbito P-valor OR (IC95%)

Sim

N (Frequência)

Não

N (Frequência)

1 A C 13 (0,382) 21 (0,309) 0,508 1,38 (0,58-3,28)

2 G C 12 (0,353) 27 (0,397) 0,829 0,83 (0,35-1,95)

3 A T 9 (0,265) 20 (0,294) 0,819 0,86 (0,34-2,18)


Legenda: N – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95%

- Intervalo de confiança de 95%.

Em relação ao gene TNF, dos cinco haplótipos detectados apenas o haplótipo 3- TCCGG

exibiu associação com óbito, sendo observada uma frequência maior nos pacientes que foram

a óbito em relação aos que estão vivos (P= 0,022). Os haplótipos também foram avaliados em

relação à contagem de leucócitos em sangue periférico ao diagnóstico (ponto de corte:

50.000/mm3), entretanto nenhuma associação com essa variável foi observada (Apêndice B).

A Tabela 21 mostra os resultados da análise de associação com óbito.

88

Tabela Tabela 21 – Análise de associação dos haplótipos da região promotora de TNF com óbito em pacientes com LLA-T.

Haplótipo -1031 -863 -857 -308 -238 Óbito P-valor OR (IC95%)

Sim

N (Frequência)

Não

N (Frequência)

1 C A C G G 4 (0,118) 20 (0,278) 0,083 0,35 (0,11-1,11)

2 C C C G A 2 (0,059) 4 (0,055) 1,000 1,06 (0,18-6,11)

3 T C C G G 23 (0,676) 31 (0,430) 0,022 2,76 (1,17-6,51)

4 T C C A G 4 (0,118) 11 (0,153) 0,770 0,74 (0,22-2,52)

5 T C T G G 1 (0,029) 6 (0,083) 0,425 0,33 (0,04-2,89)


Legenda: N – Número amostral; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de

confiança de 95%.

Por último, considerando o gene HLA-G, nenhum dos haplótipos detectados nos

pacientes com LLA-T exibiu associação com óbito, embora a frequência do haplótipo UTR-5

tenha sido menor no grupo de óbito (0,036) versus não-óbito (0,149; P= 0,172). Tabela 22

mostra os resultados da análise de associação com óbito.

Tabela 22 – Análise de associação dos haplótipos da região 3’UTR de HLA-G com óbito em pacientes com LLA-T.

Haplótipo

14

pb

+3

00

3

+3

01

0

+3

02

7

+3

03

5

+3

14

2

+3

18

7

+3

19

6

Óbito

P-valor OR (IC95%)

Sim1 Não2

UTR-1 Del T G C C C G C 9 (0,321) 16 (0,216) 0,307 1,72 (0,65-4,52)

UTR-2 Ins T C C C G A G 7 (0,250) 12 (0,162) 0,393 1,72 (0,60-4,95)

UTR-3 Del T C C C G A C 6 (0,214) 20 (0,270) 0,621 0,74 (0,26-2,08)

UTR-4 Del C G C C C A C 2 (0,071) 5 (0,067) 1,000 1,06 (0,19-5,82)

UTR-5 Ins T C C T G A C 1 (0,036) 11 (0,149) 0,172 0,21 (0,03-1,73)

UTR-6 Del T G C C C A C 1 (0,036) 5 (0,067) 1,000 0,51 (0,06-4,58)

UTR-7 Ins T C A T G A C 2 (0,071) 2 (0,027) 0,302 2,77 (0,37-20,69)

Outros - - - - - - - - 0 (0,000) 3 (0,040) 0,559 0,36 (0,02-7,17)

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: 1,2 Número amostral (Frequência); P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo

de confiança de 95%.

Como os níveis da molécula HLA-G na medula óssea de pacientes com LLA-T foram

associados à contagem de leucócitos totais em sangue periférico ao diagnóstico, as diferentes

combinações de alelos observadas neste estudo foram avaliadas em relação à associação com

89

leucocitose (ponto de corte= 50.000/mm3). A análise pelo teste exato de Fisher não revelou

associação dos haplótipos com desta variável, sendo observada frequências semelhantes para

os grupos com leucometria abaixo e acima de 50.000 células. Tabela 23 mostra os resultados

da análise de associação leucócitos.

Tabela 23 – Análise de associação dos haplótipos da região 3’UTR de HLA-G com leucócitos totais em sangue periférico ao

diagnóstico (D0) em pacientes com LLA-T.

Haplótipo

14p

b

+3003

+3010

+3027

+3035

+3142

+3187

+3196

Leucócitos em SP (D0) P-valor OR (IC95%)

> 50.0001 < 50.0002

UTR-1 Del T G C C C G C 15 (0,220) 9 (0,346) 0,290 0,53 (0,20-1,44)

UTR-2 Ins T C C C G A G 13 (0,191) 2 (0,077) 0,222 2,84 (0,59-13,56)

UTR-3 Del T C C C G A C 17 (0,250) 7 (0,269) 1,000 0,90 (0,32-2,52)

UTR-4 Del C G C C C A C 5 (0,073) 1 (0,038) 1,000 1,98 (0,22-17,85)

UTR-5 Ins T C C T G A C 8 (0,118) 4 (0,154) 0,732 0,73 (0,20-2,68)

UTR-6 Del T G C C C A C 5 (0,073) 1 (0,038) 1,000 1,98 (0,22-17,85)

UTR-7 Ins T C A T G A C 4 (0,059) 0 (0,000) 0,573 3,70 (0,19-71,16)

Outros - - - - - - - - 1 (0,015) 2 (0,077) 0,184 0,179 (0,01-2,07)

Legenda: 1,2 50.000/mm3, número amostral (Frequência); P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio;



4.3 Perfil de expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda da infância

Para o estudo de microRNAs, foram considerados oito pacientes com LLA-T e oito

pacientes com LLA-B. No grupo com LLA-T, um paciente apresentou subtipo ETP; quatro

apresentaram subtipo pré-T; um, cortical; e dois apresentaram subtipo maduro. Já no grupo com

LLA-B, cinco pacientes apresentaram subtipo pré-pré-B e três, subtipo pré-B.

Na análise de expressão diferencial considerando a comparação LLA-B versus LLA-T,

foram observados 77 miRNAs DE com FDR ≤ 0,05, sendo 46 deles reprimidos e 31 deles

induzidos em LLA-T em relação à LLA-B. Dos 77 miRNAs DE, foram selecionados para

estudo aqueles com FDR ≤ 4x10-5, uma vez que eles apresentam alta significância estatística e

podem estar mais relacionados com a linhagem celular acometida. A partir desta triagem, 11

miRNAs (considerando diferentes precursores) foram considerados para análise, sendo 10

subexpressos e 1 superexpresso em LLA-T em relação à LLA-B. A Tabela 24 mostra os

miRNAs selecionados para o estudo.

90

Tabela 24 - miRNAs diferencialmente expressos entre LLA-T e LLA-B com FDR ≤ 4x10-5.

miRNA (precursor) logFC FDR Localização

cromossômica

miRNAs em Cluster

hsa-miR-708-3p (hsa-mir-708) -8,97 0,00000 11q14.1 -

hsa-miR-708-5p (hsa-mir-708) -8,16 0,00000 11q14.1 -

hsa-miR-497-5p (hsa-mir-497) -5,73 0,00000 17p13.1 hsa-miR-195

hsa-miR-455-3p (hsa-mir-455) -5,69 0,00004 9q32 -

hsa-miR-151a-5p (hsa-mir-151a) -5,40 0,00000 8q24.3 -

hsa-miR-151b (hsa-mir-151a) -5,40 0,00000 8q24.3 -

hsa-miR-151a-3p (hsa-mir-151a) -5,08 0,00000 8q24.3 -

hsa-miR-151b (hsa-mir-151b) -4,94 0,00000 14q32.2 hsa-miR-342

hsa-miR-371b-5p (hsa-mir-371b) -4,85 0,00000 19q13.42 hsa-miR-373, hsa-miR-372, hsa-miR-371a

hsa-miR-195-5p (hsa-mir-195) -4,27 0,00000 17q13.1 hsa-miR-497

hsa-miR-629-3p (hsa-mir-629) 3,00 0,00000 15q23 -


Legenda: logFC - Fold Change em logaritmo de base 2. Os valores negativos de logFC indicam que o miRNA

está reprimido em LLA-T em relação à LLA-B. Já os valores positivos, indicam que o miRNA está induzido em

LLA-T em relação à LLA-B.

Em relação ao agrupamento hierárquico, o heatmap dois grandes grupos de pacientes

com um perfil de expressão distinto: o primeiro composto por 1 indivíduo com LLA-B (subtipo

pré-B) e 7 indivíduos com LLA-T (subtipos: 1 ETP, 4 pré-T, 1 cortical e 1 maduro); e o

segundo, por 1 indivíduo com LLA-T (subtipo maduro) e 7 pacientes com LLA-B (subtipos: 5

pré-pré-B e 2 pré-B).

A Figura 14 mostra o heatmap com a clusterização hierárquica dos 11 miRNAs

(segundo o precursor de origem) e os 16 pacientes considerados na análise.

91

Figura 14 – Agrupamento hierárquico dos pacientes com LLA-T versus LLA-B, apresentando os 11

miRNAs diferencialmente expressos com FDR ≤ 4x10-5.

Fonte: Elaborado pela autora, 2017. Legenda: O primeiro grupo é formado por BALL_L13 (Pré-B), TALL_L25 (T madura), TALL_L19 (Pré-T),

TALL_L21 (Pré-T), TALL_L24 (ETP), TALL_L26 (T cortical), TALL_L18 (Pré-T) e TALL_L23 (Pré-T); o

segundo por: TALL_L20 (T madura), BALL_L10 (Pré-pré-B), BALL_L16 (Pré-pré-B), BALL_L11 (Pré-pré-B),

BALL_L15 (Pré-pré-B), BALL_L12 (Pré-B), BALL_L09 (Pré-B) e BALL_L14 (Pré-pré-B). Em vermelho,

miRNAs regulados positivamente; em verde, regulados negativamente. Todos os miRNAs representados

encontram seguidos de seu precursor de origem.

4.3.1 Análise de predição de genes alvos de miRNAs

Para a análise de predição de alvos, os miRNAs DE foram considerados

independentemente de seus precursores de origem, sendo utilizada a lista de 10 miRNAs não

redundantes nesta etapa. A partir da busca no miRWalk v.2.0, foram encontrados 367.298 genes

redundantes (alvejado por mais de um miRNA) alvos dos miRNAs subexpressos em LLA-T,

considerando todos os bancos de dados de predição disponíveis na plataforma. Após a triagem

92

de predição por no mínimo três bancos, 14.098 genes alvo não redundantes permaneceram na

análise para posterior estudo de vias biológicas. Em relação ao único miRNA superexpresso

em LLA-T (hsa-miR-629-3p), foram preditos 51.719 genes redundantes alvos deste miRNA

segundo os 12 bancos de dados integrados no miRWalk. Após a triagem por predição de bancos

(mínimo de 3 bancos), 8.762 genes alvo não redundantes foram considerados para anotação

funcional.

4.3.2 Anotação funcional dos genes alvos preditos

A análise de enriquecimento funcional foi realizada separadamente para a lista de genes

alvo de miRNAs subexpressos e superexpressos em LLA-T. Foi considerada a anotação

funcional de vias biológicas baseadas no banco de dados KEGG.

Para os genes alvo de miRNAs regulados negativamente, foram encontradas 97 vias

biológicas enriquecidas com P-valor corrigido ≤ 0,05 (Apêndice C), destacando-se as vias

hsa01100:Metabolic pathways, hsa05200:Pathways in cancer, hsa04151:PI3K-Akt signaling

pathway, hsa04144:Endocytosis, hsa04010:MAPK signaling pathway e hsa05166:HTLV-I

infection, que apresentaram mais de 200 genes enquadrados. O Gráfico 2 mostra as 35 vias

biológicas enriquecidas contendo mais de 100 genes alvos de miRNAs.

Em relação à anotação funcional dos genes preditos alvos do miR-629-3p superexpresso

em LLA-T, foram encontradas 88 vias biológicas enriquecidas com P-valor corrigido ≤ 0,05

(Apêndice C), destacando-se a via hsa05200:Pathways in cancer que apresentou mais de 200

genes enquadrados. O Gráfico 3 mostra as 16 vias biológicas enriquecidas contendo mais de

100 genes alvos do miRNA hsa-miR-629-3p.

A partir da anotação das vias biológicas enriquecidas, foi realizada uma análise por

gráfico de Venn para determinação das vias comuns anotadas para os grupos de genes alvo de

miRNAs sub- e superexpressos em LLA-T, bem como das vias únicas observadas em cada

grupo. Esta análise revelou 69 vias biológicas comuns aos dois grupos, como

hsa05200:Pathways in cancer, hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway, hsa04144:Endocytosis,

hsa04010:MAPK signaling pathway, hsa05166:HTLV-I infection, hsa04014:Ras signaling

pathway, hsa04015:Rap1 signaling pathway, hsa05205:Proteoglycans in cancer,

hsa04510:Focal adhesion, hsa04024:cAMP signaling pathway, entre outras.

Por outro lado, 28 vias biológicas foram exclusivas do grupo de genes regulados pelos

miRNAs subexpressos em LLA-T, com destaque para hsa01100:Metabolic pathways,

hsa04062:Chemokine signaling pathway, hsa04141:Protein processing in endoplasmic

93

reticulum, hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis, hsa04611:Platelet activation,

hsa04142:Lysosome, hsa04115:p53 signaling pathway, hsa04721:Synaptic vesicle cycle e

hsa04330:Notch signaling pathway.

Para o grupo de genes regulados pelo miR-629-3p superexpresso em LLA-T, foram

observadas 19 vias biológicas exclusivas, destacando-se hsa00532:Glycosaminoglycan

biosynthesis - chondroitin sulfate/dermatan sulfate, hsa05230:Central carbon metabolism in

cancer, hsa04670:Leukocyte transendothelial migration, hsa04520:Adherens junction,

hsa05203:Viral carcinogenesis, hsa03015:mRNA surveillance pathway, hsa04130:SNARE

interactions in vesicular transport, hsa04210:Apoptosis e hsa04064:NF-kappa B signaling

pathway.

O Gráfico 4 mostra o número de vias biológicas enriquecidas comuns e exclusivas dos

grupos de genes regulados por miRNAs sub- e superexpressos em LLA-T. A lista completa de

vias analisadas encontra-se no Apêndice C.

94

888

330

272

223

212

207

188

178

175

167

166

161

155

154

145

144

137

136

133

126

124

123

123

116

116

115

113

109

109

108

108

107

106

104

102

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

hsa01100:Metabolic pathways

hsa05200:Pathways in cancer

hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway

hsa04144:Endocytosis

hsa04010:MAPK signaling pathway

hsa05166:HTLV-I infection

hsa04014:Ras signaling pathway

hsa04015:Rap1 signaling pathway

hsa05205:Proteoglycans in cancer

hsa04510:Focal adhesion

hsa04024:cAMP signaling pathway

hsa04810:Regulation of actin cytoskeleton

hsa04020:Calcium signaling pathway

hsa05169:Epstein-Barr virus infection

hsa04022:cGMP-PKG signaling pathway

hsa04062:Chemokine signaling pathway

hsa04141:Protein processing in endoplasmic reticulum

hsa04921:Oxytocin signaling pathway

hsa04390:Hippo signaling pathway

hsa04261:Adrenergic signaling in cardiomyocytes

hsa04910:Insulin signaling pathway

hsa04550:Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells

hsa04310:Wnt signaling pathway

hsa04068:FoxO signaling pathway

hsa04514:Cell adhesion molecules (CAMs)

hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis

hsa04360:Axon guidance

hsa04152:AMPK signaling pathway

hsa04728:Dopaminergic synapse

hsa04071:Sphingolipid signaling pathway

hsa04611:Platelet activation

hsa04722:Neurotrophin signaling pathway

hsa04380:Osteoclast differentiation

hsa04142:Lysosome

hsa04919:Thyroid hormone signaling pathway

Número de genes

Vias Biológicas (Termos)

Gráfico 2 – Vias biológicas enriquecidas significantes com mais de 100 genes alvos dos miRNAs identificados com regulação negativa em LLA-T no estudo.

94


95

Gráfico 3 – Vias biológicas enriquecidas significantes com mais de 100 genes preditos como alvos

do miRNA identificado com regulação positiva em LLA-T no estudo.


Gráfico 4 – Análise de vias biológicas enriquecidas comuns e exclusivas dos grupos de genes

regulados por miRNAs diferencialmente expressos em LLA-T.


Legenda: Set A – Vias biológicas relacionadas a genes regulados por miRNAs subexpressos em LLA-T, n= 97; Set B – Vias biológicas relacionadas a genes regulados por miRNA superexpresso em LLA-

T, n= 88.

240

185

152

148

144

136

136

128

124

119

119

113

108

103

103

102

0 50 100 150 200 250 300

hsa05200:Pathways in cancer

hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway

hsa04144:Endocytosis

hsa04010:MAPK signaling pathway

hsa05166:HTLV-I infection

hsa05205:Proteoglycans in cancer

hsa04014:Ras signaling pathway

hsa04015:Rap1 signaling pathway

hsa04024:cAMP signaling pathway

hsa04510:Focal adhesion

hsa04810:Regulation of actin cytoskeleton

hsa04020:Calcium signaling pathway

hsa05203:Viral carcinogenesis

hsa04022:cGMP-PKG signaling pathway

hsa05169:Epstein-Barr virus infection

hsa04390:Hippo signaling pathway

Número de genes

Vias Biológicas (Termos)

96

5 DISCUSSÃO

5.1 Níveis medulares de citocinas e HLA-G solúvel na leucemia linfoblástica aguda de

células T da infância e sua influência na sobrevida

Dados da literatura reportam que os níveis de citocinas na medula óssea e no sangue

periférico variaram de níveis não detectáveis a níveis elevados significantes na leucemia ao

diagnóstico. No curso da quimioterapia, o microambiente das citocinas muda, e de acordo com

o perfil de citocinas pode ser responsável pela recuperação da medula ou resistência à

quimioterapia (BI et al., 2016). Neste estudo, foi relatado que os fatores solúveis da medula

óssea estavam associados à fase da doença LLA-T, à taxa de sobrevida e pior prognóstico,

incluindo: i) altos níveis medulares de TNF, IL-10 e IL-6 ao diagnóstico quando comparados à

fase de consolidação , ii) níveis reduzidos de IL-10 na medula óssea ao diagnóstico e níveis

medulares diminuídos de IFN-γ após a consolidação da quimioterapia foram associados a

elevada taxa de sobrevida, e iii) a contagem elevada de leucócitos ao diagnóstico, fator bem

conhecido relacionado ao pior prognóstico, foi associada a altos níveis de sHLA-G no estroma

da medula.

O achado de um aumento dos níveis de TNF na medula ao diagnóstico está de acordo

com estudos anteriores em diversas neoplasias hematológicas (SANCHEZ-CORREA et al.,

2013; TSIMBERIDOU et al., 2008; YAN et al., 2011). Níveis séricos altos de TNF têm sido

correlacionados com desfecho desfavorável em pacientes adultos com leucemia mielóide aguda

(LMA) (SANCHEZ-CORREA et al., 2013; TSIMBERIDOU et al., 2008; YAN et al., 2011),

síndromes mielodisplásicas (SMD) (KORNBLAU et al., 2010) e leucemia linfocítica crônica

(LLC) (FAYAD et al., 2001). Embora não tenha sido observada correlação entre os níveis

medulares de TNF e sobrevida na LLA-T, é reconhecido que o TNF influencia direta ou

indiretamente o crescimento de tumor (LIPPITZ, 2013; SANCHEZ-CORREA et al., 2013;

SEDGER; MCDERMOTT, 2014).

Os pacientes que apresentaram níveis elevados de IL-10 na medula (≥ 4,57 pg/mL)

apresentaram menor sobrevida geral, o que está de acordo com vários estudos em neoplasias

hematológicas e outros tipos de câncer, mostrando que níveis mais altos de IL-10 influenciam

na sobrevida livre de evento do paciente e na sobrevida geral (BOHLEN et al., 2000; FAYAD

et al., 2001; ZHAO et al., 2015). A IL-10 é uma citocina pleiotrópica principalmente conhecida

pela sua função imunossupressora; age diminuindo a expressão de moléculas de superfície

(moléculas co-estimulatórias e de adesão) em células tumorais (DING et al., 1993), favorecendo

97

um comprometimento da imunovigilância e levando o tumor ao escape do reconhecimento

imunológico e do ataque (KEBELMANN-BETZING et al., 2001). Na LLA-T, o pior

prognóstico associado aos níveis elevados de IL-10 ao diagnóstico pareceu estar relacionado a

um intenso microambiente pró-inflamatório, com a presença de altos níveis de TNF e correlação

positiva entre TNF e IL-17. A coprodução de IL-17 e TNF por células Th17 no câncer (DUNNE

et al., 2016), e os seus efeitos sinérgicos na indução de IL-6 (RUDDY et al., 2004) têm sido

relatados. A IL-6 na presença da citocina TGF-β (não mensurada neste trabalho) está envolvida

na diferenciação da resposta imune de perfil Th17, no desenvolvimento tumoral e nos danos

aos tecidos (AWASTHI et al., 2009). Níveis elevados de IL-6 na medula óssea também foram

observados no presente estudo de LLA-T, entretanto, nenhuma correlação entre os níveis de

IL-6 e a sobrevida dos pacientes foi encontrada ao contrário de outros investigadores que

observaram uma sobrevida global menor em pacientes com LMA (SANCHEZ-CORREA et al.,

2013) e LLC que apresentavam níveis elevados de IL-6 (FAYAD et al., 2001).

Não houve diferenças significativas nos níveis de citocinas e de sHLA-G no grupo de

crianças com níveis elevados ou baixos de IL-10 ao diagnóstico; contudo, no grupo de pacientes

que apresentaram baixos níveis de IL-10 na medula ao diagnóstico, os níveis de IL17 foram

positivamente correlacionados aos de IL-2, um fator de crescimento de linfócitos. Por

conseguinte, as diferenças na sobrevivência pareceram estar relacionadas à intensidade de

expressão de IL-10 e à maneira que IL-17 influencia as alterações das citocinas no

microambiente do tumor. Semelhante ao relatado para leucemia mielóide aguda, as células

blásticas podem induzir células T produtoras de IL-10/IL-17, como uma estratégia de

imunossupressão da medula a favor da proliferação de blastos (MUSURACA et al., 2015).

Contudo, é esperado que IL-17 e IL-2 apresentem uma correlação inversa, uma vez que

o modulador alfa de elemento de resposta a AMP cíclico (CREMα) induz efeitos opostos sobre

ambas as citocinas dependendo do tipo celular. Assim, por regulação diferencial sobre a

metilação do promotor de IL-2 e IL-17, o CREMα induz uma elevada expressão de IL-17

associada à falha na expressão de IL-2 em células T CD4 de memória efetoras e IL-2 elevada

associada à supressão de IL-17 em células T CD4 naive e de memória central (HEDRICH et

al., 2012). Isto pode indicar que a citocina IL-2 foi produzida por outra célula e não a célula T

produtora de IL-17, na tentativa de superar a imunossupressão induzida por IL-10 e de diminuir

a influência da IL-17 na medula. O desequilíbrio da resposta imune Th17 e Th1 na medula

óssea mostrou estar associado com sobrevida na leucemia mieloide, ou seja, o aumento na

frequência das células Th1 foi associado com sobrevida prolongada, enquanto o aumento no

98

número de células Th17 foi preditor de prognóstico reservado, corroborando com nossa

observação (HAN et al., 2014).

Também ao diagnóstico, a mediana do nível de sHLA-G na medula óssea dos pacientes

com a contagem de leucócitos igual ou superior a 50.000/μL foi superior quando comparada a

dos pacientes com menos de 50.000/μL leucócitos (229,2 U/mL x 69,49 U/mL, P= 0,028). A

alta densidade de células na medula óssea, como esperado nesses pacientes com mais de

50.000/μL leucócitos em sangue periférico, pode favorecer hipóxia na medula, que pode mediar

a expressão do HLA-G por meio dos elementos de resposta à hipóxia no gene HLA-G

(CASTELLI et al., 2014; YAGHI et al., 2016). Isso pode representar um efeito benéfico in situ,

restringindo o crescimento celular, como sugerido pela correlação negativa entre sHLA-G e IL-

2 medulares, embora não tenha alcançado significância (P= 0,081).

Os níveis das citocinas pro-inflamatórias TNF e IL-6 na medula diminuíram

significantemente após a terapia de indução (D19), enquanto os níveis de IL-10 diminuíram

significativamente apenas após a fase de consolidação (D49). Isto pode ser devido aos blastos

da LLA, incluindo a LLA-T, que são capazes de produzir tanto IL-10 quanto seu receptor, IL-

10R, o que reforça os papéis imunossupressores parácrino e autócrino da IL-10 em LLA

(KEBELMANN-BETZING et al., 2001). Também têm sido reportadas alterações nos níveis

plasmáticos de IL-10 no sangue periférico de pacientes pediátricos durante o regime

terapêutico, mostrando uma diminuição gradual dos níveis de citocinas durante as fases de

quimioterapia, como relatado aqui (HIROKI et al., 2015).

No D49, após a fase de consolidação da quimioterapia, os níveis de IFN-γ na medula

óssea foram associados à taxa de sobrevida das crianças. O IFN-γ é conhecido pela sua função

citotóxica em células imunes infectadas e em células tumorais. As células T auxiliares do tipo

1 (Th1, linfócitos CD4+ e CD8+), mas também as células natural killer (NK) e natural killer T

(NKT) são os principais produtores desta citocina (SCHOENBORN; WILSON, 2007). Estudos

demonstraram um papel relevante do IFN-γ na leucemia, com efeitos antiproliferativos,

regulação da apoptose e equilíbrio na liberação de quimiocinas pró e antiangiogênicas em

células de leucemia mielóide aguda (ERSVAER et al., 2007), e sensibilização de células de

leucemia mieloide à morte celular programada (VARELA et al., 2001). No entanto, Regis et al.

(2009) demonstraram que o receptor de IFN-γ (IFN-γR) é regulado negativamente em células

T neoplásicas humanas, o que poderia levar à transdução ineficaz de sinais de citocinas e ao

prejuízo em seus efeitos.

Na LLA-T da infância, a sobrevida prolongada foi associada aos níveis de IFN-γ na

medula inferiores a 1,17 ng/mL, que evoluíram com níveis indetectáveis de IL-2, IL-4, IL-17 e

99

TNF em pelo menos metade dos pacientes, e correlação positiva dos níveis de IFN-y e TNF,

bem como dos níveis de IL-4 e IL-2 ou IL-17, sugerindo que o equilíbrio entre as células Th1

(IL-2), Th2 (IL-4) e Th17 (IL-17) é importante para a recuperação da medula.

Comparando os níveis de citocinas na medula óssea em pacientes com níveis de IFN-γ iguais

ou superiores a 1,17 ng/mL no D49 de quimioterapia com aqueles em pacientes que

apresentaram menores níveis de IFN-γ e tiveram sobrevida prolongada, foi observado um

aumento significante dos níveis de IL-2, IL-4 e IL-10 na medula óssea de crianças com pior

sobrevida. Neste caso, o modelo final de influência recíproca entre as moléculas revelou

correlações positivas significativas entre as citocinas IFN-y e IL-6, e também entre TNF e IL-

2; e uma correlação negativa entre IL-10 e sHLA-G, embora esta não tenha sido significativa

(P= 0,093). Esses achados sugerem um atraso na obtenção de homeostase imunológica na

medula óssea, mesmo não havendo diferença na detecção de blastos residuais mínimos (ponto

de corte de 0,01%) no D49 em qualquer um dos grupos que exibiram níveis de IFN-γ altos ou

baixos.

Em conclusão, na LLA-T pediátrica, os baixos níveis de IL-10 na medula óssea ao

diagnóstico foram associados à sobrevida prolongada; enquanto os níveis elevados de IFN-γ na

presença de desequilíbrio da resposta imune celular após a fase de consolidação da

quimioterapia estiveram associados a pior prognóstico. O papel de sHLA-G no estroma da

medula óssea em LLA-T não está claro, uma vez que seus níveis aparentemente não mudaram

do diagnóstico até a fase de consolidação; mais estudos são necessários para esclarecer se a

correlação negativa entre sHLA-G e IL-10 no D49 desempenha ou não um papel na recuperação

da medula óssea.

5.2 O papel de polimorfismos em genes de citocinas e de HLA-G na ocorrência de LLA-T

Como observado no presente estudo, diferentes citocinas apresentaram alterações em

seus níveis durante o curso do tratamento, mas também em sangue periférico de pacientes com

LLA-T em relação a controles saudáveis. Ainda, os níveis de IL-10 e IFN-γ foram associados

à sobrevida geral dos pacientes. Diante disso, considerando que a produção de moléculas

imunológicas está sob controle genético, foram avaliados polimorfismos em regiões

regulatórias dos genes IL10, IFNG, TNF e HLA-G, que influenciam a produção das respectivas

moléculas, a fim de verificar a associação com susceptibilidade à LLA-T, com óbito e sobrevida

geral dos pacientes.

100

Os polimorfismos -819 C/T (rs1800871) e -1082 G/A (rs1800896) localizados no

promotor de IL10 não apresentaram associação com risco de desenvolver LLA-T, mostrando

que apesar dos níveis de IL-10 serem maiores na doença em relação aos controles estes

polimorfismos não representam um fator importante na susceptibilidade à LLA-T.

O polimorfismo -1082 G/A também não exibiu associação com óbito e sobrevida geral

dos pacientes, mesmo quando os genótipos de alta e média produção -1082 GG e GA foram

combinados e comparados ao genótipo de baixa produção AA, sugerindo que esta variação

também não apresenta efeito no desfecho clínico dos pacientes com LLA-T.

Estes resultados estão de acordo com os dados reportados por Hiroki et al. (2015) que

também não observaram associação do SNP -1082 G/A com susceptibilidade à LLA infantil, e

por Talaat et al. (2014) que não constataram associação do polimorfismo com a susceptibilidade

ao linfoma difuso de grandes células B, outro tipo de neoplasia hematológica.

Diferentemente, outros autores conseguiram associar o polimorfismo rs1800896 a

alguma variável clínica de leucemia (DE DEUS et al., 2012; HIROKI et al., 2015; LAUTEN et

al., 2002; OVSEPYAN et al., 2015).

Ovsepyan et al. (2015) descreveram uma associação do genótipo AA com maior

incidência de estágios mais avançados de leucemia linfocítica crônica em adultos (estágios

Binet B e C).

Lauten et al. (2002) mostraram que o genótipo GG em crianças com LLA apresentava

efeito protetor contra uma má resposta a prednisona, um dos fármacos utilizados na

quimioterapia.

Já Hiroki et al. (2015), revelaram uma forte associação do polimorfismo com risco de

óbito, mostrando que o percentual de óbitos foi maior naqueles pacientes com genótipo GG,

considerado de alta produção de IL-10.

Por último, De Deus et al. (2012) correlacionaram o SNP -1082 G/A com sobrevida em

LLA pediátrica, em que os pacientes com genótipo AA apresentaram pior sobrevida (44%) do

que aqueles com genótipos AG e GG cuja sobrevida foi 69% (censura até 126 meses). O

polimorfismo também exibiu associação com sobrevida quando em combinação com o sítio -

308 G/A no gene TNF, mostrando que pacientes com IL10AA + TNFAA apresentaram menor

sobrevida (38%) versus pacientes com IL10GG + TNFGA (75%).

Apesar de não ter atingido significância, nosso estudo mostrou que pacientes com

genótipos IL10AA + TNFGG, relacionados a baixa produção em ambas citocinas, apresentaram

pior sobrevida (61,9%) em relação àqueles com outras combinações (IL10[GG+GA] + TNF

[AA+GA], 66,7%; IL10(GG+GA) + TNFGG, 68,4%; IL10AA + TNFGA, 100% de sobrevida).

101

Isso sugere que a combinação de IL10 com TNF pode ser importante na sobrevida geral

dos pacientes e a presença de genótipos de baixa e alta produção de IL-10 e TNF,

respectivamente, parecem desempenhar um papel no desfecho clínico da LLA-T.

Em combinação com IFNG +874 T/A, o SNP IL10 -1082 G/A também não apresentou

associação com sobrevida geral em LLA-T, embora os pacientes com genótipos IL10AA +

IFNGAA tenham apresentado menor sobrevida (50%) do que aqueles com outras combinações

(55,6%-87,5%).

Em relação à análise de haplótipos, nenhuma das três combinações de alelos observadas

apresentou associação com a doença, com óbito ou leucocitose ao diagnóstico. Entretanto,

apesar de não ter atingido significância, o haplótipo IL10 -1082 A/-819 T apresentou discreta

redução em LLA-T (0,284) em relação aos controles (0,366; P= 0,166). Em adição, o mesmo

haplótipo exibiu frequência diminuída no grupo de pacientes com contagem de leucócitos acima

de 50.000/mm3 (P= 0,181).

A falta de significância dos resultados pode estar relacionada ao tamanho da amostra,

entretanto, como a LLA-T é uma doença rara, seriam necessários mais anos de estudo para uma

avaliação com tamanho amostral maior. É importante esclarecer se os haplótipos desempenham

um papel importante na manifestação clínica da doença e se em um grupo maior de pacientes o

gene IL10 continua sem associação com a doença e desfecho clínico.

O polimorfismo +874 T/A (rs2430561) localizado no íntron 1 de IFNG tem sido

associado à produção de diferentes níveis de IFN-γ, com os genótipos TT, TA e AA

correlacionados à alta, média e baixa produção, respectivamente (PRAVICA et al., 2000). No

presente estudo, a análise desta variação não revelou associação dos alelos e genótipos com a

susceptibilidade para LLA-T. As frequências alélicas e genotípicas foram semelhantes entre

LLA-T e o grupo controle, sugerindo que o polimorfismo não representa um fator importante

no risco de desenvolver LLA-T.

Além disso, o polimorfismo +874 T/A também não apresentou associação com óbito

quando os genótipos TT e TA foram combinados e comparados ao genótipo AA, demostrando

que este SNP não deve exercer um papel importante no desfecho clínico da LLA-T.

Em relação à sobrevida geral, quando os três genótipos foram avaliados, os pacientes

portadores de AA apresentaram maior sobrevida do que aqueles com genótipo TA ou TT,

embora a análise não tenha atingido significância. A maior sobrevida geral em pacientes com

genótipo baixo produtor se contradiz com o papel do IFN-γ no câncer, que em maiores níveis

aumenta a resposta imune anti-tumoral (URBANOWICZ et al., 2010; ZAIDI; MERLINO,

2011). Mesmo quando pacientes com genótipos TT e TA foram combinados e comparados

102

àquele com AA, a sobrevida geral não foi estatisticamente diferente, mostrando que o

polimorfismo +874 T/A não está associado com o tempo de vida dos pacientes após

diagnóstico.

Esses dados sugerem que a variação +874 T/A parece não estar relacionada a diferenças

na produção da citocina em LLA-T, entretanto, é necessário correlacionar os níveis da proteína

com cada genótipo para uma maior avaliação.

Diferentemente, foi relatada uma associação dos genótipos AA e AT com

susceptibilidade à leucemia linfocítica crônica de células B (LLC-B) em indivíduos poloneses

(URBANOWICZ et al., 2010). Em outro estudo, Dwivedi et al. (2013) mostraram uma

associação dos TT e AT com o ínicio de vitiligo generalizado, sugerindo o efeito do alelo T no

início precoce da doença.

A literatura também tem reportado ausência de associação deste polimorfismo com o

risco de desenvolver LLA infantil (WINKLER et al., 2015), como também doenças

cardiovasculares em artrite reumatoide (GARCÍA-BERMÚDEZ et al., 2012), evidenciando que

o polimorfismo não está relacionado com susceptibilidade nas populações estudadas.

Como os níveis de IFN-γ não apresentaram diferenças na LLA-T ao diagnóstico em

relação aos controles e o polimorfismo IFNG +874 T/A não apresentou associação com

susceptibilidade à doença, o gene IFNG deve ter um pequeno papel no risco de

desenvolvimento desta leucemia, mas pode estar relacionado à resposta ao tratamento

quimioterápico, como reportado por Cloppenborg et al. (2004).

Em relação aos polimorfismos -1031 T/C, -863 C/A, -857 C/T, -308 G/A (rs1800629)

e -238 G/A na região promotora do gene TNF, nenhum deles apresentou associação de alelos

ou genótipos com a susceptibilidade à LLA-T, sugerindo que tais variações não representam

um fator importante no risco de desenvolver LLA-T.

Considerando que os genótipos GG, GA e AA do sítio -308 G/A estão correlacionados

à baixa, média e alta produção de TNF, foi realizada uma combinação dos pacientes portadores

de AA e GA para avaliação de associação com óbito em relação àqueles com genótipo GG. O

polimorfismo TNF -308 G/A também não apresentou associação com óbito nos pacientes com

LLA-T, mostrando que esse sítio não deve exercer um papel fundamental no desfecho clínico

da LLA-T.

Em adição, o sítio TNF -308 G/A não apresentou associação com sobrevida geral dos

pacientes, mesmo quando os genótipos AA e GA foram combinados, sugerindo que esta

variação genética pode não apresentar uma função relevante no prognóstico do paciente.

103

Diferentemente do presente estudo, De Deus et al. (2012) observaram uma associação

de TNF -308 G/A com sobrevida em LLA pediátrica, porém a associação foi significante

quando em combinação com o polimorfismo IL10 -1082 G/A. Aqueles pacientes com genótipos

IL10AA + TNFAA apresentaram menor sobrevida geral (38%), enquanto aqueles com

genótipos IL10GG +TNFAG, maior sobrevida (75%). Neste estudo, a maioria dos pacientes

apresentavam LLA de células B, cujo componente genético é diferente da LLA-T.

Isso poderia explicar as diferenças encontradas em relação ao nosso estudo, sugerindo

que os efeitos dos polimorfismos de TNF em LLA-T podem ser distintos dos em LLA-B. Em

adição, no presente estudo o sítio polimórfico TNF -308 G/A também foi avaliado em

combinação com IL10 -1082 G/A em relação à sobrevida geral, porém a associação não foi

significante. Ao contrário de De Deus et al. (2012), foram consideradas 4 tipos de combinação:

IL10AA + TNFGA; IL10(GG+GA) + TNFGG; IL10(GG+GA) + TNF (GA+AA) e IL10AA +

TNFGG, que correspondem a combinações de genótipos de acordo com o potencial de

produção das citocinas.

Em outro estudo com LLA da infância, o alelo A do SNP TNF -308 G/A foi associado

a um maior risco de recaída em LLA-B, porém à proteção em LLA-T que exibiu menor

incidência de recidiva (FRANCA et al., 2014).

Outros autores (LAUTEN et al, 2002) também associaram o mesmo polimorfismo com

recaída em LLA infantil, onde os pacientes com genótipo GA (em adição a um fator de risco

para fraca resposta ao tratamento) apresentaram maior risco de recaída comparados àqueles

com genótipo GG.

Esses trabalhos mostram como os estudos de associação de polimorfismos no promotor

de TNF com susceptibilidade à LLA e suas variáveis clínicas são bastante variáveis. Além disso,

as consequências funcionais do sítio TNF -308 G/A nos níveis da proteína também não são

claras.

Em um estudo funcional e de meta-análise sobre o papel de polimorfismos no promotor

de TNF, foi revelada ausência de associação dos SNPs -857 C/T, -308 G/A, -238 G/A e

diferentes haplótipos (GGC/GGC e outros) com a produção de TNF (MEKINIAN et al., 2011).

A ausência de associação dos polimorfismos no promotor de TNF com a

susceptibilidade a LLA-T e variáveis clínicas podem ser devido ao tamanho da amostra

avaliada, sendo necessários mais estudos com maior número amostral para replicação dos

dados.

Por outro lado, os polimorfismos estudados podem exercer individualmente um pequeno

efeito na susceptibilidade à LLA-T e no risco de óbito, e por isso não apresentaram associação.

104

Os dados sugerem que essas variações podem não exercer grande influência na produção

diferencial de TNF, embora seja necessário confirmar correlacionando-se os níveis da proteína

com cada genótipo em cada sítio de variação avaliado.

Apesar dos SNPs não terem sido associados à doença, a análise de haplótipos revelou

um discreto aumento do haplótipo -1031T/-863C/-857C/-308A/-238G em LLA-T, com uma

tendência para associação desta combinação de alelos com a susceptibilidade à doença (P=

0,073; OR= 2,00). Este haplótipo apresenta o alelo A na posição -308, que está relacionado a

uma maior ativação transcricional do gene e consequentemente maior produção da citocina

(PERREY et al., 1998; WILSON et al., 1997), entretanto exibe o alelo T na posição -1031 e

alelo C nas posições -857 e -863, relacionados a menor atividade transcricional do promotor de

TNF (HIGUCHI et al., 1998). Desta forma, não está claro como esse haplótipo exerce efeito na

patogênese da leucemia, entretanto, é interessante notar que o gene TNF está localizado na

região do HLA que apresenta forte desequilíbrio de ligação e diversos outros genes

inflamatórios adjacentes, o que poderia influenciar na associação do gene à doença (HORTON

et al., 2004; ROSELLI et al., 2013).

Além disso, no presente estudo foi observada uma forte associação do haplótipo -

1031T/-863C/-857C/-308G/-238G com óbito em pacientes com LLA-T (P= 0,022; OR= 2,76),

com a frequência desta combinação maior no grupo de pacientes que foi a óbito. Este haplótipo

está relacionado a menor produção de TNF, o que poderia explicar sua associação, já que TNF

exerce um importante papel na resposta anti-tumoral com atividade citotóxica (TIAN; WANG;

MA, 2014).

Em relação ao gene HLA-G, os resultados mostraram que nenhum dos 8 sítios

polimórficos na 3’UTR estão associados com o risco de desenvolver LLA-T. Levando em

consideração que os níveis de sHLA-G também não foram diferentes dos controles, os dados

sugerem que HLA-G não representa um fator essencial no desenvolvimento da doença.

Em um estudo com leucemia mieloide aguda (LMA) em adultos, Locafaro et al. (2014)

também não observaram associação de polimorfismos na 3’UTR de HLA-G com a

susceptibilidade à doença. Por outro lado, os autores encontraram associação do haplótipo

UTR-3 (14 bp Del, +3003T, +3010C, +3027C, +3035C, +3142G, +3187A e +3196C) com o

risco de desenvolver LMA.

Em outro estudo, Rizzo et al. (2014) demonstraram que o polimorfismo 14pb Del/Ins

em HLA-G está associado com a sobrevida geral em pacientes com LLC e os pacientes com

genótipo del/del exibiram menor sobrevida do que aqueles com genótipos ins/del ou ins/ins.

105

No presente trabalho, a análise de haplótipos também não revelou associação com a

LLA-T e com variáveis clínicas como óbito e leucócitos, corroborando com os dados

genotípicos e mostrando que HLA-G não representa um fator relevante na patogênese e

desfecho clínico desta doença.

Os estudos de associação de polimorfismos na 3’UTR de HLA-G com câncer são

realizados em sua maioria em tumores sólidos, sendo muito pouco avaliado em leucemias. O

presente estudo é o primeiro a correlacionar polimorfismos na 3’UTR com a susceptibilidade à

LLA-T da infância. Embora os dados tenham revelado ausência de associação com a doença,

mais estudos com uma coorte maior são necessários para replicar esses achados e também

verificar a associação de haplótipos com outras variáveis clínicas da LLA-T.

5.3 Perfil de expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda da infância: diferentes

regulações entre LLA-T e LLA-B

Neste estudo, foram utilizadas células mononucleares da medula óssea de pacientes com

LLA-T e LLA-B para a comparação dos perfis de expressão de miRNAs entre as duas doenças,

uma vez que a medula óssea é o foco principal de desregulação celular e imunológica nas

leucemias. Além disso, a literatura tem demonstrado que os miRNAs são moléculas

sucientemente informativas na diferenciação de tumores humanos (LU et al., 2005), incluindo

as leucemias agudas infantis (LU et al., 2005; MARCUCCI et al., 2010; SCHOTTE et al., 2009,

2011).

É importante enfatizar que o componente mononuclear de cada leucemia avaliada

apresentou um percentual de blastos (células transformadas) acima de 70, mostrando que a

maior população de células presentes nas amostras estudadas foi a tumoral. Isso garantiu que

os perfis de expressão de miRNAs determinados fossem característicos dos subtipos de câncer

estudados.

O presente estudo é o primeiro a avaliar o perfil global de expressão de miRNAs em

crianças com LLA-T e LLA-B do estado de Pernambuco referidos ao Hospital IMIP, um centro

de referência no tratamento de leucemias pediátricas do Recife. Embora o tamanho amostral

seja pequeno, esses pacientes representam o perfil de leucemias agudas de Pernambuco e

também do Nordeste do Brasil.

Pelo sequenciamento de nova geração de miRNAs de células leucêmicas dos subtipos

T (ETP, Pré-T, T-cortical e T-madura) e B (Pré-pré-B e pré-B), foram identificados 77 miRNAs

106

diferencialmente expressos, destacando-se 11 miRNAs com FDR ≤ 4x10-5 que foram

selecionados para estudo neste trabalho. Destes 11 miRNAs, 10 deles (hsa-miR-708-5p, hsa-

miR-708-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-

miR-151b (precursor hsa-mir-151a), hsa-miR-151b (precursor hsa-mir-151b), hsa-miR-371b-

5p e hsa-miR-195-5p) apresentaram subexpressão em LLA-T (ou supererexpressão em LLA-

B), e 1 deles (hsa-miR-629-3p), superexpressão em LLA-T (subexpressão em LLA-B).

Vários miRNAs dos 10 distintos acima mencionados já foram reportados em leucemias

agudas pediátricas ou cânceres hematológicos, incluindo miR-708-5p (anterior miR-708), miR-

151a-5p (anterior miR-151-5p), miR-195-5p (anterior miR-195) e miR-497-5p (anterior miR-

497).

Schotte et al. (2009) avaliaram a expressão de miRNAs em leucemia linfoblástica aguda

da infância por clonagem e PCR em tempo real, e revelaram uma série de miRNAs

diferencialmente expressos em diversos subtipos genéticos de LLA-B (rearranjo do MLL;

fusões TEL-AML, BCR-ABL ou E2A-PBX; hiperdiplóide), em LLA-T e células da medula óssea

CD34+ (marcador de célula-tronco hematopoiética), entre eles miR-151a-5p e miR-708-5p.

miR-151a-5p apresentou superexpressão em células de LLA-B comparado à células

CD34+ normais, mostrando ser um miRNA relacionado à LLA-B sem as alterações genéticas

citadas. Já o miR-708-5p apresentou expressão aumentada tanto em LLA-B com alteração de

MLL quanto em LLA-B sem alterações genéticas (designado como B-other) em relação às

células CD34+. Em LLA-T, apresentou superexpressão comparada a células CD34+, mas não

tão evidente quantos os subtipos genéticos de LLA-B.

Em outro estudo, utilizando PCR em tempo real, miR-151a-5p apresentou expressão

reduzida (48 vezes menos) em LLA-T comparado à LLA-B (pré-B) (SCHOTTE et al., 2011),

o que corrobora com nossos dados e sugere que miR-151a-5p deve estar envolvido com a

linhagem linfóide, uma vez que também apresentou expressão em LLA-T como mencionado

anteriormente. Entretanto, miR-151a-5p parece estar mais relacionado à linhagem B ausente de

alterações genéticas.

MiR-151a-5p é um miRNA cuja sequência é igual a do miR-151b, diferindo apenas em

três nucleotídeos que não estão presentes em miR-151b, que por sua vez o torna menor. Dessa

forma, na literatura, as duas moléculas foram consideradas como mesmo miRNA (NOREN

HOOTEN et al., 2013), fazem parte da mesma família de miRNAs (miR-28) e apresentam

mesma sequência seed, atuando assim nos mesmos genes alvo (semelhante predição

computacional de alvos).

107

Em relação à miR-708-5p, Schotte et al. (2011) mostraram que o miRNA está

hipoexpresso em LLA-T em relação à LLA-B, assim como descrito no presente estudo, embora

o fold change tenha sido diferente (3.884 versus 286 (valor absoluto)).

A regulação negativa de miR-708-5p também foi observada em crianças com LLA-T

(medula óssea) de Ribeirão Preto, estado de São Paulo. A expressão desse miRNA estava

diminuída em relação à LLA-B (Pré-B), e interessantemente, em relação à MO normal

(OLIVEIRA et al., 2015), sugerindo que miR-708-5p deve ser característico de LLA-B, mas

pode ser expresso pela MO normal.

Outro miRNA relacionado à leucemia foi o miR-195-5p, descrito com alta expressão no

sangue periférico de adultos com leucemia linfocítica de células B (LLC-B) em relação a células

CD19+ normais (ZANETTE et al., 2007). De acordo com o miRBase v.21 (KOZOMARA;

GRIFFITHS-JONES, 2014), este miRNA está em cluster com miR-497-5p no cromossomo 17

e apresenta modulação semelhante (subexpressão em LLA-T versus LLA-B) ao seu parceiro

miR-195-5p. Isto é esperado de miRNAs em cluster, uma vez que eles devem sofrer mesma

regulação transcricional devido à localização cromossômica (WINTER et al., 2009). miR-497-

5p teve sua expressão associada a uma melhor sobrevida geral em pacientes com linfoma difuso

de grandes células B, estando relacionado a um aumento na sensibilidade destes pacientes à

quimioterapia (TROPPAN et al., 2011).

Considerando nossos achados e os estudos acima citados, pode-se sugerir que miR-708-

5p, miR-151a-5p, miR-195-5p e miR-497-5p são miRNAs preferencialmente expressos na

linhagem B neoplásica e podem ser utilizados para diferenciar este tipo celular da linhagem T

maligna.

Outro miRNA subexpresso em LLA-T no estudo foi miR-371b-5p que ainda não havia

sido reportado em leucemias. Diferentemente, este miRNA foi relacionado ao câncer de

pâncreas, facilitando a proliferação celular e diminuindo a sobrevida dos pacientes (HE et al.,

2014), e também a condrossarcoma (MUTLU et al., 2015).

Dos 10 miRNAs descritos neste trabalho, o único com expressão aumentada em LLA-T foi

miR-629-3p que, embora não tenha sido relacionado à leucemia por outros autores, tem sido

descrito como preditor de câncer gástrico (SHIN et al., 2015) e preditor de prognóstico de

pacientes com glioblastoma tratados com temozolomida (HUI-YUAN et al., 2014). Apesar

disso, o miR-629-5p, codificado pelo mesmo precursor miR-629, mas com diferentes mRNAs

alvo, teve sua expressão associada a diferentes neoplasias hematológicas (DI LISIO et al., 2012;

SCHOTTE et al., 2011).

Em relação à clusterização hierárquica baseada na expressão dos 11 miRNAs (de acordo

108

com o precursor), foi possível separar os pacientes em dois grandes grupos (LLA-T e LLA-B),

com exceção de dois pacientes: um com LLA-B (L13) que agrupou com a linhagem T, e um

com LLA-T (L20) que agrupou com a maior parte dos pacientes LLA-B. O paciente L13

apresenta leucemia do tipo pré-B e foi agrupado com pacientes com leucemia do tipo T madura,

Pré-T, ETP e T-cortical, respectivamente, todas com estágio de maturação diferente.

Similarmente, o paciente L20 (leucemia T madura) mostrou agrupamento com leucemia do tipo

pré-pré-B e pré-B, ou seja, diferentes imunofenótipos de LLA-B. É importante notar que na

LLA-B, o subtipo pré-pré-B é considerado uma linhagem bastante imatura, caracterizada pela

negatividade para CD10 e IgM citoplasmática e de superfície; enquanto, a pré-B é mais

diferenciada que a anterior e caracterizada pela expressão de CD10 e IgM citoplasmática

(BEHM, 2003).

Dessa forma, os dados mostram que os miRNAs estudados parecem não estar

relacionados ao estágio de diferenciação das leucemias, mas sim aos subtipos linfoides B e T.

Entretanto, uma avaliação com maior número de amostras é necessário para confirmação e

também para investigação da relação dos miRNAs com diferentes subtipos genéticos de cada

LLA.

Para conhecer mais sobre o papel dos miRNAs estudados, foi realizada uma análise de

vias biológicas relacionadas aos genes alvos destas moléculas, entretanto, foi considerado

separadamente os alvos de miRNAs reprimidos em LLA-T e o induzido na doença. Foram

descritas 97 e 88 vias enriquecidas para os alvos de miRNAs sub- e superexpressos,

respectivamente, sendo 69 delas comuns aos dois grupos, como hsa05200:Pathways in cancer,

hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway, hsa04144:Endocytosis, hsa04010:MAPK signaling

pathway, hsa05166:HTLV-I infection, hsa04014:Ras signaling pathway, etc, sendo a maioria

relacionada à sinalização celular. Isso mostra que, possivelmente, diferentes genes codificantes

de proteínas de uma mesma via biológica apresentam uma expressão reduzida ou aumentada, e

dependendo de sua função, podem estar contribuindo para um desequilíbrio nos processos

celulares normais característicos da linhagem T, além de colaborar com a desregulação de redes

de interação entre várias vias do sistema imune.

Interessantemente, algumas vias foram únicas para cada grupo de genes alvo analisados,

apresentando enriquecimento funcional no grupo de miRNAs reprimidos ou induzidos em

LLA-T. Na anotação funcional de genes que podem interagir como miR-629-3p, 19 vias

biológicas foram exclusivas, entre elas hsa04064:NF-kappa B signaling pathway,

hsa04210:Apoptosis, hsa04670:Leukocyte transendothelial migration e hsa04520:Adherens

junction. Por outro lado, na análise dos genes relacionados aos miRNAs subexpressos na LLA-

109

T, 28 vias foram exclusivas, destacando-se hsa01100:Metabolic pathways,

hsa04062:Chemokine signaling pathway, hsa04115:p53 signaling pathway e hsa04330:Notch

signaling pathway. Essas vias podem estar com atividade diferente e/ou alterada na linhagem

T devido à expressão dos genes relacionados, considerando que são alvos dos miRNAs

estudados. Essa observação é mais evidente na via hsa04330:Notch signaling pathway,

extremamente importante no comprometimento da linhagem linfoide T e no desenvolvimento

da LLA-T (BELVER; FERRANDO, 2016), embora não tenha apresentado alta significância

estatística (P= 0,054) como as outras.

Pelo conhecimento do mecanismo de interação miRNA-mRNA e seu efeito biológico,

os genes alvo do miRNAs induzido (miR-629-3p) devem apresentar baixa expressão protéica,

e, consequentemente, menor atividade nas vias relacionadas; já aqueles alvos dos miRNAs

reprimidos, alta expressão de suas respectivas proteínas, e portanto, maior atividade das

processos biológicos associados. Entretanto, para confirmação destas hipóteses, seria

necessário validar a interação miRNA-mRNA e avaliar o nível das proteínas de interesse, a fim

de conhecer melhor o papel destas moléculas na função da célula.

110

6 CONCLUSÕES

a) Não foram observadas diferenças significativas entre os níveis de citocinas e HLA-G

solúvel em pacientes com LLA-T infantil em relação aos controles;

b) Ao analisar os tempos de tratamento para avaliação do efeito da terapia, observou-se

diminuição progressiva dos níveis de IL-10, IL-6 e TNF ao longo do tratamento;

c) O aumento nos níveis de IL-10 ao diagnóstico e de IFN-γ no dia 49 da terapia de

consolidação foi relacionado com pior prognóstico (menor sobrevida geral);

d) Níveis mais elevados de HLA-G solúvel foram observados em pacientes com

leucocitose antes do início da terapia, porém não houve influência na resposta destes

pacientes durante o tratamento;

e) Apesar da associação entre o haplótipo -1031T/-863C/-857C/-308G/-238G da região

promotora de TNF com o óbito, os polimorfismos genéticos analisados nos genes HLA-

G, IL10, TNF e IFNG não exerceram influência na susceptibilidade à LLA-T e não

foram associados com outras variáveis clínicas dos pacientes;

f) Dez miRNAs foram identificados diferencialmente expressos entre LLA-T e LLA-B,

sendo nove subexpressos e um superexpresso em LLA-T. Estes miRNAs estão

envolvidos em sessenta e nove vias biológicas, incluindo aquelas relacionadas à câncer

e sistema imune, podendo influenciar direta ou indiretamente o desenvolvimento da

LLA-T ou serem determinantes para o acometimento neoplásico da linhagem T.

111

7 PERSPECTIVAS

O sequenciamento de nova geração realizado para avaliação do perfil de expressão de

microRNAs nas leucemias linfoblásticas agudas de células T e B gerou uma grande quantidade

de dados, sendo os resultados apresentados nesta tese referentes às análises iniciais necessárias

para o conhecimento dos microRNAs diferencialmente expressos entre as duas doenças e as

possíveis vias biológicas envolvidas nessas diferenças. A partir destes dados, é fundamental

realizar uma seleção dos microRNAs diferencialmente expressos de interesse e possíveis genes

alvo para validação funcional. Adicionalmente, outras análises de bioinformática são

necessárias para aprofundar o conhecimento acerca do papel dos microRNAs na determinação

destes tipos de leucemia. Essas atividades serão realizadas no âmbito do projeto de Pós-

Doutorado da aluna Renata dos Santos Almeida.

112

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128

APÊNDICE A- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

129

130

APÊNDICE B – ANÁLISES DE ASSOCIAÇÃO DE HAPLÓTIPOS COM LEUCÓCITOS

EM SANGUE PERIFÉRICO AO DIAGNÓSTICO

Tabela B1- Análise de associação dos haplótipos da região promotora de IL10 com leucócitos totais

em sangue periférico ao diagnóstico (D0) em pacientes com LLA-T.

Haplótipo -1082 -819 Leucócitos em SP (D0) P-valor OR (IC95%)

> 50.000/mm3

N (Frequência)

< 50.000/mm3

N (Frequência)

1 A C 27 (0,375) 6 (0,273) 0,451 1,60 (0,56-4,58)

2 G C 27 (0,375) 7 (0,318) 0,801 1,29 (0,46-3,55)

3 A T 18 (0,250) 9 (0,409) 0,181 0,48 (0,18-1,31)

Legenda: N – Número amostral; SP – Sangue periférico; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher;

OR – Odds Ratio; IC95% - Intervalo de confiança de 95%.


Tabela B2 – Análise de associação dos haplótipos da região promotora de TNF com leucócitos totais em sangue periférico ao

diagnóstico (D0) em pacientes com LLA-T.

Haplótipo -1031 -863 -857 -308 -238 Leucócitos em SP (D0) P-valor OR (IC95%)

> 50.000/mm3

N (Frequência)

< 50.000/mm3

N (Frequência)

1 C A C G G 18 (0,257) 6 (0,214) 0,797 1,27 (0,44-3,63)

2 C C C G A 5 (0,071) 1 (0,036) 0,671 2,08 (0,23-18,63)

3 T C C G G 33 (0,471) 15 (0,536) 0,656 0,77 (0,32-1,86)

4 T C C A G 9 (0,129) 4 (0,143) 1,000 0,88 (0,25-3,15)

5 T C T G G 5 (0,071) 2 (0,071) 1,000 1,00 (0,18-5,49)

Legenda: N – Número amostral; SP – Sangue periférico; P-valor calculado a partir do teste exato de Fisher; OR – Odds Ratio;



131

Quadro 1 – Vias biológicas enriquecidas (Kegg pathways) comuns e únicas relacionadas aos genes regulados pelos miRNAs diferencialmente expressos.

(Continua).

Vias biológicas comuns Vias biológicas únicas de genes regulados por

miRNAs reprimidos

Vias biológicas únicas de genes regulados por

miRNA induzido

hsa05200:Pathways in cancer hsa01100:Metabolic pathways hsa00532:Glycosaminoglycan biosynthesis -

chondroitin sulfate / dermatan sulfate

hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway hsa04062:Chemokine signaling pathway hsa05230:Central carbon metabolism in cancer

hsa04144:Endocytosis hsa04141:Protein processing in endoplasmic

reticulum hsa05014:Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)

hsa04010:MAPK signaling pathway hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis hsa04320:Dorso-ventral axis formation

hsa05166:HTLV-I infection hsa04611:Platelet activation hsa04670:Leukocyte transendothelial migration

hsa04014:Ras signaling pathway hsa04142:Lysosome hsa04520:Adherens junction

hsa04015:Rap1 signaling pathway hsa04270:Vascular smooth muscle contraction hsa05203:Viral carcinogenesis

hsa05205:Proteoglycans in cancer hsa05142:Chagas disease (American

trypanosomiasis) hsa03015:mRNA surveillance pathway

hsa04510:Focal adhesion hsa04114:Oocyte meiosis hsa05160:Hepatitis C

hsa04024:cAMP signaling pathway hsa04723:Retrograde endocannabinoid signaling hsa04130:SNARE interactions in vesicular

transport

hsa04810:Regulation of actin cytoskeleton hsa04912:GnRH signaling pathway hsa04210:Apoptosis

hsa04020:Calcium signaling pathway hsa04540:Gap junction hsa04923:Regulation of lipolysis in adipocytes

hsa05169:Epstein-Barr virus infection hsa04925:Aldosterone synthesis and secretion hsa04064:NF-kappa B signaling pathway

hsa04022:cGMP-PKG signaling pathway hsa04911:Insulin secretion hsa04960:Aldosterone-regulated sodium

reabsorption

hsa04921:Oxytocin signaling pathway hsa04971:Gastric acid secretion hsa05032:Morphine addiction

hsa04390:Hippo signaling pathway hsa04664:Fc epsilon RI signaling pathway hsa05161:Hepatitis B

hsa04261:Adrenergic signaling in cardiomyocytes hsa05031:Amphetamine addiction hsa05412:Arrhythmogenic right ventricular

cardiomyopathy (ARVC)

AP

ÊN

DIC

E C

– L

IST

A C

OM

PL

ET

A D

E V

IAS

BIO

LÓ

GIC

AS

EN

RIQ

UE

CID

AS

RE

LA

CIO

NA

DA

S A

OS

GE

NE

S R

EG

UL

AD

OS

PE

LO

S M

IRN

AS

DIF

ER

EN

CIA

LM

EN

TE

EX

PR

ES

SO

S

131

132

Tabela C1 – Vias biológicas enriquecidas (Kegg pathways) comuns e únicas relacionadas aos genes regulados pelos miRNAs diferencialmente expressos.

(Continua).


miRNAs reprimidos


miRNA induzido

hsa04910:Insulin signaling pathway hsa04115:p53 signaling pathway hsa05414:Dilated cardiomyopathy

hsa04550:Signaling pathways regulating

pluripotency of stem cells

hsa05120:Epithelial cell signaling in Helicobacter

pylori infection hsa05410:Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)

hsa04310:Wnt signaling pathway hsa04730:Long-term depression

hsa04068:FoxO signaling pathway hsa04721:Synaptic vesicle cycle

hsa04514:Cell adhesion molecules (CAMs) hsa05416:Viral myocarditis

hsa04360:Axon guidance hsa05030:Cocaine addiction

hsa04152:AMPK signaling pathway hsa04330:Notch signaling pathway

hsa04728:Dopaminergic synapse hsa04962:Vasopressin-regulated water reabsorption

hsa04071:Sphingolipid signaling pathway hsa04961:Endocrine and other factor-regulated

calcium reabsorption

hsa04722:Neurotrophin signaling pathway hsa00514:Other types of O-glycan biosynthesis

hsa04380:Osteoclast differentiation hsa00410:beta-Alanine metabolism

hsa04919:Thyroid hormone signaling pathway

hsa04724:Glutamatergic synapse

hsa04070:Phosphatidylinositol signaling system

hsa04660:T cell receptor signaling pathway

hsa04668:TNF signaling pathway

hsa04725:Cholinergic synapse

hsa04916:Melanogenesis

hsa04931:Insulin resistance

hsa05231:Choline metabolism in cancer

hsa04915:Estrogen signaling pathway

132

133


(Continua).


miRNAs reprimidos


miRNA induzido

hsa04750:Inflammatory mediator regulation of

TRP channels

hsa04922:Glucagon signaling pathway

hsa04066:HIF-1 signaling pathway

hsa05215:Prostate cancer

hsa04713:Circadian entrainment

hsa04012:ErbB signaling pathway

hsa05222:Small cell lung cancer

hsa04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis

hsa04970:Salivary secretion

hsa04350:TGF-beta signaling pathway

hsa05100:Bacterial invasion of epithelial cells

hsa00562:Inositol phosphate metabolism

hsa05220:Chronic myeloid leukemia

hsa04720:Long-term potentiation

hsa05214:Glioma

hsa04917:Prolactin signaling pathway

hsa05211:Renal cell carcinoma

hsa04662:B cell receptor signaling pathway

hsa04920:Adipocytokine signaling pathway

hsa05218:Melanoma

hsa04918:Thyroid hormone synthesis

hsa05212:Pancreatic cancer

hsa04370:VEGF signaling pathway

133

134


(Conclusão).


miRNAs reprimidos


miRNA induzido

hsa05210:Colorectal cancer

hsa04924:Renin secretion

hsa04150:mTOR signaling pathway

hsa05221:Acute myeloid leukemia

hsa05223:Non-small cell lung cancer

hsa05217:Basal cell carcinoma

hsa05213:Endometrial cancer

hsa04930:Type II diabetes mellitus

134

135

ANEXO A - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

136

ANEXO B – ARTIGOS PUBLICADOS NO DOUTORADO

ALMEIDA, R. D. S. et al. Cytokines and soluble HLA-G levels in bone marrow stroma and

their association with the survival rate of patients exhibiting childhood T-cell acute

lymphoblastic leukemia. Cytokine, Oxford. Aceito em 2017. doi:

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CAVALCANTI, A. et al. Gene polymorphism and HLA-G expression in patients with

childhood-onset systemic lupus erythematosus: a pilot study. HLA, Oxford. Artigo aceito em

2017. doi: 10.1111/tan.13084.

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Documents

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO AGGEU … · Aos demais amigos do Laboratório de Imunogenética Maria Carolina Accioly, Andresa Oliveira, Beatriz Coutinho, Elis, Ailton, Lucas