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Fundação Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Oceanografia Disciplina de Poluição Marinha. CROMATOGRAFIA (aula 1). Ítalo Braga de Castro. Definição:. - PowerPoint PPT Presentation
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Fundação Universidade Federal do Rio GrandeInstituto de Oceanografia
Disciplina de Poluição Marinha
Ítalo Braga de Castro
CROMATOGRAFIA(aula 1)
Definição:
É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura por interação entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado com sólido) que permanece dentro da coluna de separação.
Fase Móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através da coluna, carregando os solutos.
Histórico:M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo
CaCO3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Princípio:
1-De acordo com o sistema cromatográfico
•Em Coluna
Cromatografia LíquidaCromatografia GasosaCromatografia Supercrítica
•Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CDC)Cromatografia em Papel (CP)
Classificação:
2-De acordo com a Fase Móvel•Utilização de Gás
Cromatografia Gasosa (CG)Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
•Utilização de Líquido Cromatografia Líquida Clássica (CLC)Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
•Utilização de Gás Pressurizado Cromatografia Supercrítica (CSC)
Classificação:
3-De acordo com a Fase Estacionária•Líquida•Sólida•Quimicamente Ligadas
4-De acordo com o Modo de Separação•Por adsorção•Por partição•Por troca iônica
Classificação:
Mecanismos de separação:
Processos físicos -> Sorção“atrações polares”
S
CROMATOGRAFIA
Em colunaPlanar
L
L F L
CP CCD
CCD
Gás
L
S
F L
CGL
CGS
CGFL
Fluído supercrítico
F LL
CSS CSFL
Líquido
L
S
CLL
CLS CE
F L
CLFL CTI CB
Tipos de Cromatografia
Fase Móvel
Técnica
Fase Estacionária
Classificação:
- Cromatografia Planar Líquido-líquido
- Princípio: partição – relaciona a diferença de solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase móvel e fase estacionária;
- Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
- Análise qualitativa: Rf (fator de retenção);
Rf = distância percorrida pela substância distância percorrida pela fase móvel
Cromatografia em Papel:
Método rápido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromogênicos Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Método simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (sílica, alumina, celite, amido) Métodos de detecção: físico-químicos Princípio: Adsorção (polaridade)
Cromatografia em camada delgada:
Pode ser também chamada de cromatografia líquida clássica.
FE – sílica e alumina;
FM – eluente;
PRINCÍPIO: adsorção
Cromatografia em coluna:
FASE MÓVEL
injeção separação eluição
Fase estacionária
DETECTOR
Cromatografia Gasosa:
Em CG a FEpode ser:
Sólida
Líquida
CromatografiaGás-Sólido (CGS)
CromatografiaGás-Líquido (CGL)
FE sólida com uma grande área superficial e a separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias neste sólido.
FE líquida pouco volátil recobrindo um suporte sólido ou as paredes da coluna capilar. A separação baseia-se em mecanismo de partição das substâncias entre a fase líquida e gasosa.
Cromatografia Gasosa:
Rapidez Alto poder de separação Separação de várias
classes de compostos em uma análise
Sensibilidade (ppm - ppb) Facilidade de registrar
dados Variedade de detetores
(especificidade)
Amostras voláteis
Compostos termicamente
estáveis
Técnicas auxiliares p/ identificação
Cromatografia Gasosa:
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEIS (“evaporáveis”)
(para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente
- nesse gás)
DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
Cromatografia Gasosa (Aplicações):
Ambiental◦ Pesticidas, organoclorados e PCB’s◦ Hidrocarbonetos◦ Aminas e fenóis
Alimentos◦ Análise de ácidos graxos e triglicerídeos ◦ Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico
de alimentos◦ Análise de açúcares e aminoácidos
Farmacêutica Química Forense/Toxicologia
◦ Doping◦ Metabólitos de drogas
Química Industrial Petroquímica
Cromatografia Gasosa (Aplicações):
Cromatógrafo de Fase Gasosa:
1
2
3
4
6
5
Cromatografia Gasosa:
1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento de Sinal.6 - Registro
Gás de Arraste:Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE
Requisitos:INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FE
incompatíveis com DCEH2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC
Requisitos:
CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
CU
ST
O
PUREZA
AB
CA = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
Gás de Arraste:
Componentes necessários à linha de gás:
controladores de vazão / pressão de gás
dispositivos para purificação de gás (“traps”)
1
2
34
5
6
1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário5 - Regulador de Vazão 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
Gás de Arraste:
1
2
3
41 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica
Injetor:
Injeção:
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
COLUNAAmostrasGasosas
AmostrasLíquidas
empacotada = 3,2 mm (1/4”)
0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
Injeção:
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microseringa de 10 L:
Microseringa:
EMPACOTADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pul-verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-ção de m) de FE líquida
ou sólida
Colunas:
Colunas (parâmetros):Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer
a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
p0 = f
Estrutura químicado analito
Temperatura da coluna
Temperaturada
coluna
Pressãode
vapor
Velocidadede
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)
TE
MP
ER
AT
UR
A D
A C
OL
UN
A
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
Colunas (parâmetros):
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
Detectores:
UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída.
SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.
ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas
Detectores:
~ 60 detectores já usados em CG
~ 15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
DCT TCDDetector por
CondutividadeTérmica
DIC FIDDetector porIonização em
Chama
DCE ECDDetector porCaptura de
Eletrons
EM MSDetector Es-
pectrométrico de Massas
Detectores:DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)•É um Detector de 2 canais•mede a diferença, em Condutividade Térmica , entre o Gás de Arraste (Referência) e o do Gás de Arraste + Amostra (analítico)•possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando uma ponte.• As vazões dos 2 canais devem ser praticamente iguais •A presença de um componente, dissolvido no Gás de arraste, ao atingir o canal analítico muda a resistência deste filamento , provocando um desequilíbrio na ponte que gera um sinal proporcional a quantidade deste• A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento , concentração dos componentes e da diferença da Condutividade Térmica entre o Gás de arraste e o componente .
TCD:
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID) .
Detectores:
•baseia-se no princípio de que a concentração de um composto é diretamente proporcional a concentração das partículas ionizadas presentes no mesmo•O Gás de arraste e os componentes que eluem da Coluna atingem a chama . Esta ioniza (queima) as moléculas orgânicas presentes na corrente gasosa .•As partículas ionizadas, entre os eletrodos, gera uma corrente que é medida através de uma resistência
Hydrogen in
Air in
CollectorFlame jet
Column connection
FID:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD)
Detectores:
•É um Detector seletivo, específico para análises de Compostos Eletrofílicos (como os Halogênios nos Clorados) .• A cela do ECD é revestida internamente por uma lâmina do isótopo radioativo de “Ni-63”.•As “Partículas Beta” emitidas pelo isótopo ionizam o Carrier e os Íons e Elétrons resultantes migram para o anodo coletor por influencia de uma voltagem polarizada pulsante , aplicada entre a fonte e o coletor •A freqüência de pulsação é controlada para manter a corrente constante e é a geradora do sinal analítico .•É um Detector não destrutivo e altamente sensível, ideal para análise de pesticidas e agrotóxicos clorados
Collector
63Nickel foil
Make-up gas in
Column connection
ECD:
Detectores:DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
•A GC/MS é uma técnica analítica , também bastante conhecida, que visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de uma mistura .
• Os componentes da amostra, previam. separados no GC, são transferidas p/ o MS, através De uma linha de transferência.
• No MS ocorre a fragmentação da molécula e a detecção, possibilitando ao usuário o detalhamento da estrutura e o peso molecular do composto.
• Utilizando uma biblioteca específica podemos identificar positivamente o composto, baseado na abundância dos seus fragmentos (ions) .
Espectro de Massa (TBT):
• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA (CLC)
• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (CLAE)
Cromatografia Líquida:
Esquema para CLC:
Preparo da coluna
Aplica-se a amostra
Eluente
Detecção e quantificação (espectroscopia ou gravimetria)
Cromatografia Líquida:
Esquema para CLAE:
Coluna fechada
Injeção de amostra
Detector
Cromatogramas
Cromatografia Líquida:
Características da Fase Móvel usada em CLAE:
• Alto grau de pureza ou de fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes;
• Não decompor ou dissolver a FE;
• Ter baixa viscosidade;
• Ser compatível ao detector utilizado;
• Ter polaridade adequada para permitir uma separação dos componentes da amostra.
Cromatografia Líquida de Alta Resolução:
Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE:
• aminoácidos;
• explosivos;
• lipídeos polares;
• metabólicos de animais e plantas;
• pigmentos de plantas;
• produtos farmacêuticos;
• proteínas;
• tintas.
Cromatografia Líquida de Alta Resolução:
FATOR CG CLAE
Requisitos para amostra
Amostra volátil ou derivatizável, termicamente estável na temperatura de operação do sistema cromatográfico.
Amostra solúvel na fase móvel.
Tipos de amostras Gases, líquidos ou sólidos MM: 2 a 1200
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. MM: 32 a 4.000.000
Quantidades mínimas detectáveis
10-12g 10-9
Tempo de análise Minutos até poucas horas
Minutos até poucas horas
Capacidade analítica Excelente, separação de amostras com até 200 componentes.
Excelente, separação de amostras com até 50 componentes.
Tempo de treinamento para um operador
Cerca de 3 meses. Pelo menos 6 meses.
Comparação entre CG e CLAE:
A migração de um analito pela coluna
provoca inevitavelmente o
alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:Separação deficiente de analitos com retenções
próximas.
Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
Eficiência dos sistemas cromatográficos:
Fontes de Informações Qualitativas
RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação
DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas
Identificação individual das espécies contidas na amostra
Determinação da identidade da amostra propriamente dita
Aplicações Qualitativas
de CG
Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados
provenientes de pelo menos duas fontes
Análise Qualitativa:
t’R = fInterações analito / FE
Pressão de vapor do analitoCondições operacionais
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de
uma solução padrão do analito
suspeito
Análise Qualitativa: (tempos de retenção)
Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos eluídos:
Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)
Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)
Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção
Análise Qualitativa: (métodos de detecção)
Padrões cromatográficos:
Padrões
• Externos (Identificação)
•Internos (Quantificação)
•Surogates (Recuperação)
Controle de Qualidade dos dados:
• Programas de Intercalibração
•Materiais de referência
RT: 6.00 - 15.00
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Abu
ndân
cia
rela
tiva
10.43
12.91
10.15
11.78
11.34
12.51
10.678.01 9.51 13.698.82 14.757.08 14.39
Cromatogramas:
Cromatogramas: