Genética e

Melhoramento de Plantas

Universidade de Évora 2005

Estrutura dos ácidos nucleicosÁcido Desoxirribonucleico (DNA)Ácido Ribonucleico (RNA)

Dos genes às proteínas (eucariotas): transcrição e tradução

Engenharia Genética de PlantasIdentificação de genes de interesseExtracção de RNA total e purificação de mRNAIsolamento e clonagem de genes de interesse

Desenho de primers degeneradosDesenho de primers específicos para isolamento das extremidades (5’ e 3’ de um gene)Construção de Vectores de ClonagemAvaliação de colónias recombinantes com enzimas de restrição

Constituído por uma sequência de apenas quatro nucleótidos.

Os diferentes nucleótidosapresentam uma estrutura comum:

Um grupo fosfato ligado por uma ligação fosfoester a uma pentose(desoxirribose), a qual se liga a uma base azotada resultando num desoxirribonucleótido.

As bases azotadas podem ser purinas(adenina e guanina) ou pirimidinas(citosina e timina).

Os desoxirrinucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiester originando uma cadeia simples.

DNA: Ácido DesoxirriboNucleico

Duas cadeias simples ligam-se entre si devido àcomplementaridade das suas bases azotadas (A=T, G=C), através de ligações por pontes de hidrogénio, originando uma cadeia dupla.

James Watson and Francis Crick(1953):

Estrutura em dupla hélice com orientação das duas cadeias antiparalela.

Constituído por uma sequência de apenas quatro nucleótidos.

Os diferentes nucleótidosapresentam uma estrutura comum:

Um grupo fosfato ligado por uma ligação fosfoester a uma pentose(ribose), a qual se liga a uma base azotada resultando num desoxirribonucleótido.

As bases azotadas podem ser purinas(adenina e guanina) ou pirimidinas(citosina e uracilo).

Os ribonucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiester originando uma cadeia simples.

RNA: Ácido RiboNucleico

Apresenta uma estrutura em cadeia simples.

Estrutura de um gene:Promotor:Promotor: Região do DNA à qual se liga a enzima RNA polymerase antes de iniciar a

transcrição do DNA em RNA. DeterminaDetermina:: região de início da transcrição; a cadeia de DNA que servirá como template; número de transcritos; frequência da transcrição.

Gene:Gene: Segmento de DNA constituído por um conjunto de intrões e exões que será transcrito em mRNA, codificando os exões a síntese proteica.

TerminadorTerminador:: Região terminal que bloqueia a enzima RNA polimerase e induz a sua dissociação.

5’ – Promoter UTR Exon1 Intron1 Exon2 UTR Terminator – 3’

GENE

Poly A

Transcription

Transcrição (decorre no núcleo): síntese de uma cadeia de RNA mensageiro (mRNA) pela enzima RNA polimerase que decorre de 5’ para 3’ tendo como modelo apenas uma das cadeias de DNA. A nova cadeia resultante será complementar àcadeia de DNA que lhe serviu de molde apresentando uracilo em vez de timina:

Modificações pós-transcrição:

5’ capping: ligação de uma molécula de 7-metilguanilato àextremidade 5’ do mRNA durante a transcrição, tendo como objectivo a protecção da nova cadeia.

Clivagem da extremidade 3’ e adição de uma cauda Poly (A)

Ainda no núcleo o mRNAtranscrito primário sofre a clivagem da extremidade 3’ e posterior adição de uma cauda poly(A).

A dimensão da cauda poly(A)varia entre 100 a 250 adeninas.

No citoplasma a dimensão da cauda diminui.

A funçãon da cauda poly(A) não é ainda bem conhecida.

Splicing:

clivagem dos intrões no inteior da cadeia de mRNA e simultânea ligação dos exões, correspondendo à última fase do processamento das moléculas de mRNA no núcleo.

GenomaGenomaTotal conjunto de genes de um organismo

TranscritomaTranscritomaConjunto de sequências transcritas (mRNA)

ProteomaProteomaConjunto de proteinascodificado pelo genoma

CCóódigo gendigo genéético: tico: envolve o reconhecimento de tripletos(conjunto de três nucleótidos) do mRNA denominados codões pelos complementares anticodões do tRNA.

Codão de iniciação: AUG (Met)Codões stop: UAA; UAG; UGA

O código genético é universal e degenerado (61 codões codificam para a síntese de apenas 20 aa):

vários codões = 1 aa1 codão ≠ vários aa

InIníício da traducio da traduççãoão: reconhecimento do codão de iniciação (mRNA) AUG pelo anticodão (tRNA) UAC transportando o aminoácido inicial Meteonina.

O ribossoma(rRNA+proteina) movendo-se ao longo da cadeia de mRNA (de três em três nucleotidos) cataliza a síntese proteica.

Final da traduFinal da traduççãoão: reconhecimento do

codão de terminação (mRNA) UAG pelo

anticodão (tRNA) AUC com a consequente

separação das duas subunidades que

constituem o ribossoma.

Melhoramento genético:

Consiste na adição ou subtracção de um ou mais genes de um organismo, introduzindo ou silenciado uma determinada característica.

Vantagem:

Ultrapassar a barreira da espécie: um gene que codifica uma característica numa determinada espécie pode ser introduzido numa outra espécie mesmo que filogenéticamente muito afastada recorrendo a técnicas de biologia molecular.

Interesse:

Criar plantas tolerantes ou resistentes a determinadas condições de stress biótico e/ou abiótico.

Exemplo: Introdução de Resistência ao Fungo Uncinula necator (Oídio) em Videira (Vitis vinifera)O fungo em questão possui parede de quitina pelo que as proteínas com capacidade de a hidrolizar – quitinasesquitinases – podem conferir à planta potencialidade para resistir a esse stress biótico.

11ºº PASSO: PASSO: Pesquisar na bibliografia a existência de espécies vegetais resistentes a este fungo.

Ex.: Vitis rupestris22ºº PASSO: PASSO: Pesquisar na base de dados se o gene está descrito para a espécie classificada como

resistente. Caso não esteja, será objectivo isolar este gene na espécie resistente para introduzir na espécie sensível (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

33ºº PASSO: PASSO: Isolamento de RNA total Isolamento de RNA total do organismo do qual se pretende isolar o gene (espécie resistente – V. rupestris) e purificapurificaçção de ão de mRNAmRNA.

44ºº PASSO: PASSO: TranscriTranscriçção Reversaão Reversa

55ºº PASSO: PASSO: Desenho de primers degenerados permitindo-nos amplificar uma sequência correspondente ao gene que se pretende isolar. Para tal seleccionam-se na base de dados as sequências ORF (Open ReadingFrame) de várias espécies, ou seja, a região estritamente necessária para a codificação da síntese da proteína. A ORF inicia-se com a sequênciaKozak (CCGCCATGGG) e finaliza com um dos codões stop, correspondendo sempre à maior sequência encontrada;

66ºº PASSO:PASSO: Alinhamento das diferentes sequencias de um mesmo gene codificando a mesma proteína em diferentes espécies e desenho de um primerdegenerado (sequencia de 20 a 30 oligonucleótidos) forward(extremidade 5’) e outro reverse (extremidade 3’);

77ºº PASSO:PASSO: Amplificação de uma sequência de cDNA por PCRPCR utilizando os primersdegenerados.

Extracção de RNA total (Protocolo do “Hot Borate”)A integridade do RNA é avaliada em gel de agarose onde

devem ser visíveis duas bandas mais fortes correspondentes ao RNA ribossomal (28S e 18S);Pode ocorrer contaminação com DNA;O trabalho com RNA requer mais cuidados, uma vez que este é mais instável que o DNA;A grande desvantagem de trabalhar com o RNA será a de não

existir forma de o amplificar.

28S

18S

Purificação do mRNA

mRNA

Permite isolar genes que se estejam a expressar(constitutivos ou de expressão diferencial, que só se expressem sob uma determinada condição de stress);A incapacidade de o amplificar levou ao desenvolvimento de

técnicas (TranscriTranscriçção Reversaão Reversa) que permitiram converter este novamente em DNA (DNA complementar DNA complementar ou cDNAcDNA).

DNA

TranscriTranscriçção Reversaão Reversa

Enzimas denominadas Transcriptases Reversas, descobertas por Temin e Baltimore (1960) em retrovírus, catalizam a síntese de cDNA a partir de RNA.O cDNA é mais estável e apresenta a vantagem de poder ser amplificado por técnica de PCR.

TranscriTranscriçção Reversaão ReversaAAAAAAA (…) Poly(A)mRNA template

AAAAAAA (…) Poly(A)

Amplificação por PCR

Degradação da cadeia de mRNA com RNase

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) VIAL 8

GTCGACATCGATACGCGTGGTC VIAL 9

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

AAAAAAAAAAAAAAAGTCGACATCGATACGCGTGGTC

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

Pefw

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

AAAAAAA (…) Poly(A)

PeRev

A transcrição (reversa) do cDNA tem a vantagem de permitir posterior amplificação de um gene de interesse limpo de intrões. O conhecimento da sequência das extremidades do cDNA permite a posterior amplificação das extremidades de um gene. Para tal deverá utilizar-se um primer específico que emparelhe com uma das extremidades e um outro primer que emparelhe com uma zona específica da nossa sequência.

PrimerPrimer:: Sequência de oligonucleótidos (16-24 nucleótidos) complementar a uma região do DNA que ao emparelhar permite o funcionamento da enzima Taqpolimerase e consequente formação de uma nova cadeia de DNA complementar à existente.

Forward (5Forward (5’’)) Reverse (3Reverse (3’’))

5’ 3’AGGCTA(…)AGGCTA(…)

GGCAAT(…)CCGTTA(…)

FwFw RvRv

5’ (…)ATTGCC

Reverse complement

5’ AGGCTA(…)

Os primers devem ser desenhados tendo em conta os seguintes pontos:

a) primer ForwardForward – próximo da extremidade 5’ com a sequência igual à da cadeia modelo; ReverseReverse – próximo da extremidade 3’ com a sequência complementar àda cadeia modelo, sendo a sua sequência colocada em reverse devido a efeitos de encomenda;

b) cada primer não deverá exceder os 25 nucleótidos;

c) o número de nucleótidos de um primer depende da sua temperatura de emparelhamento, determinada da seguinte forma: [2x(A+T)]+[4x(G+C)];

d) a extremidade 3’ de cada primer deverá ser mais rica em G e/ou C.

Polymerase chain reaction (PCR)Amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA, determinada pelo emparelhamento dos primers.

CondiCondiçções necessões necessáárias para a reacrias para a reacçção:ão:a) sequência de DNA que servirá de templateb) um par de primers (forward e reverse)c) DNA polimerase (Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus)d) dNTPs (C, T, G, A)c) tampão de PCR com MgCl2

Programa de PCR:Programa de PCR:1º: Desnaturação: temperatura de 90-95°C2º: Emparelhamento: temperatura varia com primers3º: Temperatura de síntese: temperatura 60-72°C

1. cDNA …………………..… 1µl

2. PCR Buffer (10x) ……….... 5µl

3. MgCl (50mM) …………..… 2µl

4. dNTPs (10mM) …………... 1µl

5. Primer forward (10mM) ….. 1µl

6. Primer reverse (10mM) ……1µl

7. H2O Milli-Q estéril ………. 38.5µl

8. Taq DNA polimerase …….. 0.5µl

50µl

Mix de PCR:

Programa de PCR:

∞

35 ciclos

3’ 5’

5’ 3’Fw

Rv330 pb 800 pb ± 1000 pb

± 500 pb

5’

5’

1500pb

600pb500pb

100pb

MM PCR 1

A utilização de primers degenerados permite-nos amplificar fragmentos específicos da espécie em estudo (± 500pb);

Por vezes ocorre a amplificação de outros fragmentos denominados inespecíficos dado o emparelhamento inespecífico do primer (se existir uma pequena sequência na extremidade 3’ do primer, sobretudo G ou C, que emparelhem com alguma zona complementar no templete, ocorrerá igualmente síntese de DNA).

-

+

Sequenciação do fragmento amplificadoNa reacção de sequenciação (PCR com apenas 1 primer) o fragmento vai ser

amplificado com nucleótidos marcados que o sequenciador vai reconhecer, sendo o resultado da leitura dado por uma cor diferente para cada nucleótido;

A leitura do fragmento de DNA amplificado permite determinar se este corresponde de facto a um fragmento do gene que se pretende isolar.

Isolamento das extremidades 5’ e 3’ do gene

Desenho de primers específicos

5’………………………………(330pb)GGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCCCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCC(800pb)……………………...3’

Ta=(4x15)+(2x9)Ta=(4x15)+(2x9)--10=7810=78--10= 6810= 68

Ta=(4x17)+(2x8)Ta=(4x17)+(2x8)--10=8410=84--10= 7410= 74

5’ 3’

Fw

Rv

cDNA

AAAAAAGGG

Poly(A)

Poly(T)

3’ 5’CCC

5’PCR primer

± 500pb

± 700pb

Clonagem do Gene Completo

A enzima Taq DNA polimerase possui a capacidade adicional de terminal transferase (para além de DNA polimerase), ou seja, adiciona ao final da cadeia amplificada uma base de adenina (A).

Esta capacidade permite a ligação do fragmento amplificado a um vector de clonagem linearizado possuindo extremidades de timina (T).

5’AATGGGGTTGTGGGCATTGGTAGCTTTCTGTCTGTTGTCATTAATACTGGTTGGCTCAGCAGAGCAATGTGGAGGGCAAGCTGGGGGTAGAGTTTGCCCAGGGGGGGCATGCTGCAGCAAGTTTGGTTGGTGTGGCAACACTGCTGATTACTGTGGCAGTGGCTGCCAAAGCCAGTGCAGTTCCACTGGTGACATTGGCCAGCTTATTACCAGGTCCATGTTCAATGATATGCTTAAGCATAGAAATGAGGGGAGTTGCCCTGGCAAGGGCTTCTACACCTATGACGCTTTCATAGCTGCTGCTAAGGCCTTTCCTGGCTTTGGAACAACTGGTGATACCACTACTCGTAAAAGGGAAATCGCAGCCTTCTTGGCTCAAACTTCTCATGAAACCACTGGGGGGTGGGCTAGTGCACCTGATGGCCCATACGCTTGGGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCCTCCTGCTGGACACCATCTAAA3’

Vector de Clonagem

Ampicilina

Origem de replicação

Gene LacZ

MCS

Permite a selecção de bactérias transformadas.

Apenas as bactérias transformadas, ou seja, que possuam o vector

plasmídico no seu interior apresentam resistência a

este antibiótico.

Responsável pela iniciação da síntese proteica.

Responsável pela síntese do fragmento ω da enzima β-

galactosidase que por complementação com o fragmento α sintetizado pelo cromossoma bacteriano produz actividade da

enzima.

No meio da sequência deste gene éconhecida uma zona com vários locais de restrição identificados

(Multiple Cloning Site).

Qual a importância desta região?Qual a importância desta região?

Vector de Clonagem: Qual a importância da MCS?

Os locais de restrição identificados nesta região são únicos no vector, o que significa que as enzimas de restrição específicas deste locais apenas cortarão o vector uma única vez.

As extremidades que se geram no vector após digestão com uma determinada enzima de restrição são compatíveis com as extremidades geradas num fragmento digerido com a mesma enzima, permitindo assim a integração desse fragmento no vector.

Estando a região MCS inserida no meio da sequência do gene LacZ (responsável pela síntese da enzima β-galactosidase e consequente expressão azul das colónias bacterianas) a interrupção do gene por inserção de um fragmento, leva à inibição da expressão do gene. As bactérias que possuam plasmídio com um fragmento inserido na região MCS (transformadas recombinantes) possuem coloração branca.

Transformação de bactérias

Introdução de um vector plasmídico, integrando o gene de interesse, em bactérias desprovidas de qualquer DNA desta natureza (bactérias competentes).

O objectivo desta técnica consiste obter milhares de cópias do vector introduzido na bactéria e assim do gene inserido neste.

Screening de bactérias recombinantes com enzimas de restriçãoO screening de bactérias recombinantes portadoras do fragmento de interesse pode ser efectuados de duas formas:

1. Por PCRPCR utilizando os primers específicos do gene ou do vector;

2. Por digestão com enzimas de restridigestão com enzimas de restriççãoão que flanqueiem o local de inserção do gene. Neste caso é necessário a incubação prévia das colónias seleccionadas em LB líquido para posterior extracção do DNA plasmídico (protocolo da aula). Somente após esta extracção é que se poderáefectuar a digestão do DNA utilizando enzimas de restrição específicas da zona MCS (podendo ser apenas uma enzima com dois locais de restrição, um na zona 5’ do fragmento e outro na zona 3’ ou duas enzimas diferentes).

Mix Digestão:

1. DNA plasmídico extraido ………. 10µl

2. Buffer (10x) …………………….. 2µl

3. Enzima 5’ ………………………. 0.3µl

4. Enzima 3’ …………………….… 0.3µl

5. H2O Milli-Q estéril ………….…. 7.4µl

20µl Incubar 2-3h a xºC (a temperatura óptima varia com as enzimas, sendo na maior parte dos caso 37ºC)

Screening de bactérias recombinantes com enzimas de restrição1. A reacção de digestão não foi completa,

pois observam-se no gel bandas correspondentes a formas circulares e superenroladas;

2. Apenas as colónias 2 e 4 apresentam o fragmento de interesse (1000 pb);

3. A colónia 1 apresenta um fragmento clonado de peso inferior ao desejado;

4. A colónia 3 apesar de apresentar uma banda correspondente a um fragmento de 1000 pb, apresenta uma outra banda correspondente a um fragmento de peso inferior a 100 pb. Como o vector não possui mais locais de restrição para as enzimas utilizadas, as duas bandas corresponderão a um fragmento de peso total de 1050pb que possui um local de restrição para uma das enzimas utilizadas a 50 pb de uma extremidade.

MM cl.1 cl.2 cl.3 cl.4

1500 pb

600 pb

Polissacáridos

DNA circular com nicks

DNA linear

DNA circular superenrolado

Fragmento linear digerido

100 pb

5’(0pb)

3’(1000pb)

SacI KpnI

Alguns Mecanismos de Transferência de genes de interesse

Construção de Vectores de Expressão

AgrobacteriumBombardeamento de Partículas

Mecanismos de selecção de transgénicos

Melhoramento Clássico vs. Biotecnologia Melhoramento genético: potencialidades, benefícios e riscos

Construção de Vector de ExpressãoUm vector de expressão corresponde a um vector plasmídico integrando uma sequência denominada “cassete de expressão”- sequência de DNA linear que inclui para além dos genes, um promotor e um terminador que controlam a expressão de cada gene em particular. Na “cassete de expressão” podem existir:

a)a) apenas o gene de interesse (ex.: chitinase), não existindo forma de selecção;b)b) o gene de interesse e o gene de selecção (resistência a antibiótico ou herbicida); c)c) o gene de interesse, o gene de selecção e um gene repórter:

- β-glucuronidase (GUS);- Green Fluorescent Proteins (GFP).

CHITINASE Vitis rupestris

GUS

pHKTL1 (12.020 Kb)

AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens

É uma bactéria que existe naturalmente no solo infectando um grande número de dicotiledóneas.

Penetra nas raízes através de feridas provocando uma reacção no tecido que se traduz numa multiplicação anormal das células dando origem a tumores.

Os tumores resultam da transferência, integração e expressão nas células da planta de um segmento específico do DNA bacteriano designado de T-DNA (DNA transferido). Esta capacidade faz da bactéria A. tumefaciens um instrumento natural de engenharia genética.

O T-DNA constitui parte do plasmídio Ti (tumour inducing) que ocorre naturalmente nas células de A. tumefaciens e é responsável pela capacidade infecciosa da bactéria.

A forma de explorar a capacidade do A forma de explorar a capacidade do A. A. tumefacienstumefaciens consiste em:consiste em:

alterar a zona de DNA que étransferida (T-DNA), eliminando os genes tumorais e o gene para a opina (aminoácido modificado utilizado como fonte de carbono e azoto pela bactéria), substituindo-os pelo gene ou genes que se pretendem introduzir;

as sequências dos limites são os únicos elementos que é necessário manter (LE e LD) permitindo a transferência da sequência do T-DNA para as células do hospedeiro.

Mapa genético do plasmídio Ti.

Devido às grandes dificuldades em manipular grandes moléculas de DNA como o plasmídeo Ti, foram desenvolvidos vectores em que toda a manipulação é feita recorrendo à Escherichia coli.

Esquema do plasmídeo Ti utilizado para transformação de células vegetais mediada por A. tumefaciens.

Etapas da Etapas da TransformaTransformaççãoão GenGenééticatica mediadamediada porpor AgrobacteriumAgrobacterium: :

1.1. O vector plasmídico Ti retirado da bactéria e manipulado por alteração a região T-DNA. Esta manipulação envolve enzimas de restrição específicas que permitem a digestão do vector em zonas conhecidas;

2.2. A digestão do vector permite a inserção nessas zonas dos genes de interesse (flanqueados por um promotor e um terminador): vector recombinante;

33.. Transformação da estirpe de bactéria Agrobacterium com o vector Ti recombinante, originando bactérias recombinantes;

Vitis rupestris cells

Ti plasmid

AgrobacteriumGenomic DNA

Plant cellGenomic DNA

(carries the gene of the gene of interestinterest)

+

Ti plasmid with the gene of interest

Gene of interest

Empty plasmid

Restriction enzyme AA Restriction

enzyme AA

c

: chitinase

Vitis rupestris cells

4.4. Infecção (co-cultura que decorre em média 2 dias) do hospedeiro com transferência do vector Ti para as células desse (o material vegetal utilizado depende do sistema de regeneração seguido);

5. Transferência da região T-DNA (suporta os genes de interesse) do vector Ti da bactéria para o genomagenoma do hospedeiro;

6.6. Integração do T-DNA no genoma da planta: células transformadas;

7.7. Multiplicação da região T-DNA integrada no genoma da planta originando uma nova planta integrando esse(s) gene(s): planta transgénica.

8. 8. Expressão dos genes introduzidos no hospedeiro quando sob a condição de stress que se tentou combater.

Agrobacterium

Ti plasmid with the new gene

Plant cell

cell’s DNA

Transgenic plant Cell division

The new gene

+ Transformation

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

A regeneração de plantas (embriogénese somática) a partir de

zonas integrando o genes GUS origina plantas transformadas. A análise

histoquímica realizada em plantas permite detectar por expressão da

coloração azul as plantas que integram este gene repórter.

SelecSelecçção de Plantas ão de Plantas TransgTransgéénicasnicas

A análise histoquímica com X-Gluc permite verificar a

eficiência da transformação. A área azul corresponde a

zonas onde ocorreu a integração do gene GUS e

sua expressão com síntese da proteina β-glucoronidase.

Calli embriogénicos transformados

LimitaLimitaçções da Tões da Téécnicacnica

Apesar de ser utilizado com sucesso na transformação de muitas dicotiledóneas, apresenta como grande limitação: a reduzida capacidade na transformação de monocotiledóneas.

Na tentativa de incrementar esta capacidade de transformação testaram-se diferentes estirpes de Agrobacterium, condições fisiológicas da bactéria e hospedeiro, bem como técnicas de co-cultura (Godwin et al., 1992), não se conseguindo ainda assim resultados favoráveis.

A transformação de monocotiledóneas requer um sistema alternativo de transformação genética, como por exemplo o bombardemanto de particulas ou a fusão de protoplastos.

A integração de genes pelo Agrobacterium dá-se unicamente ao nível do DNA genómico do hospedeiro. Caso se pretenda introduzir informação noutro qualquer organelo celular, terá de se recorrer a outras técnicas, como por exemplo o bombardeamento de partículas.

Bombardeamento de PartBombardeamento de Partíículas, culas, ““GenGen GunGun”” ou ou BiolBiolíísticastica

Métodologia que permite transformar geneticamente plantas de espécies que o Agrobacterium não infecta (como por exemplo o arroz, o milho, a cevada, etc.).

A tA téécnica cnica baseabasea--sese em:em:projectar a uma pressão elevada (variando esta com o material vegetal em causa, para calli de videira é utilizada uma pressão entre 1100 e 1550 psi) partículas de ouro ou tungsténio de diâmetro variável (1.00µm) com o DNA (vector plasmídico com a cassete de expressão ou apenas a cassete de expressão) agregado.

A força mecânica gerada por uma velocidade elevada permite que sejam quebradas barreiras biológicas, podendo ocorrer integração do DNA estranho no genoma das células bombardeadas (DNA nuclear). Para além deste, esta técnica possibilita a integração ao nível do genoma dos cloroplastos (Ye et al., 1990; Daniell, 1993) e das mitocondrias.

A aplicação desta técnica requer:- uma preparação prévia muito cuidada;- DNA circular ou linear de boa qualidade;- existência de um protocolo de regeneração optimizado.

O aparelho utilizado:O aparelho utilizado:

Câmara de Bombardeamento

Suporte do disco de ruptura (1)

Estrutura onde se colocam os macrocarriers, respectivos

suportes e stopping screen (2)

Suporte do material Vegetal (3)

Disco de ruptura

Suporte do disco de ruptura

(1)

O disco de rupturadisco de ruptura determina a pressão à qual serão projectadas as partículas com o DNA agregado.

Existem diferentes discos de acordo com a pressão que suportam: um disco de 1550psi significa que suporta pressões inferiores a esta e que ao atingir este valor rompe, permitindo que as partículas sejam projectadas sob o material vegetal.

MacrocarrierStopping Screen

(2)Suportes do Macrocarrier

Tampa

(3)

O material vegetal utilizado no bombardeamento de partículas depende do sistema de regeneração utilizado para a espécie vegetal que se pretende transformar, podendo ser calli, embriões, discos foliares, etc.

AnAnáálise lise histoquhistoquíímicamica 2 dias após o bombardeamento permite determinar o sucesso da transformação. O número de pontos azuis corresponde aos pontos em que ocorreu integração do gene GUS e sua expressão.

As primeiras células do material vegetal a serem bombardeadas são normalmente destruídas, no entanto, junto a essas existe uma área de células envolvente em que as partículas penetraram sem as destruir. Algumas destas células vão sobreviver à agressão provocada pela ferida das partículas e incorporar no genoma o DNA transportado. Após a incorporação do(s) gene(s) no genoma da planta, as células podem expressá-lo com a consequente produção da proteína por ele codificada.

Vantagens relativamente ao Vantagens relativamente ao AgrobacteriumAgrobacterium: :

Possível utilização em dicotiledóneas e monocotiledóneas;

Inexistência de falsos positivos, correspondentes a plantas não transformadas mas que possuindo a bactéria utilizada como vector da transformação, manifestam a presença do gene;

Necessidade de apenas um antibiótico para selecção das plantas transformadas. A utilização de A. tumefaciens requer a utilização de dois antibióticos, um para eliminar a bactéria e um outro para a selecção das plantas transformadas.

LimitaLimitaçções da tões da téécnica:cnica:

Elevada destruição celular: as camadas celulares mais externas são denominadas de “zona de morte” por serem destruídas devido ao impacto ou fragmentação das partículas ou à rajada de ar produzida (Birch and Franks, 1991);

Baixa estabilidade dos transformante: apesar de ocorrer integração de um gene no genoma de uma célula que poderá regenerar uma planta, esta integração não é estável, apenas 1-5% das células expressam integração estável (Finer and McMullen, 1990);

Limitado na dimensão das construções genéticas: quanto maior o vector de expressão menor a possibilidade de sucesso;

Permite repetições: existe a possibilidade de integrar várias vezes o mesmo gene no genoma da célula vegetal, dando origem a repetições e consequente expressão diferencial do mesmo gene;

Desconhecimento do efeito que a velocidade das partículas pode causar, bem como da composição das mesmas, partículas de tungsténio podem oxidar resultando tóxicas para as células.

SelecSelecçção de tecidos geneticamente transformadosão de tecidos geneticamente transformadosApós transformação, mediada por Agrobacterium ou Bombardeamento de Partículas,

o material vegetal será transferido para meio de cultura suplementado com antibiótico ou herbicida (depende do marcador de selecção utilizado. Ex.: se na cassete de expressão se integrou o gene que confere resistência ao antibiótico higromicina, o agente de selecção adicionado ao meio de cultura será este antibiótico).

Apenas as células expressando o gene de selecção conseguem sobreviver ao agente utilizado originando plantas resistentes a esse. Assume-se que estas plantas, por possuírem o gene de selecção possuem também o gene de interesse (ambos os genes foram integrados na cassete de expressão utilizada).

A integração dos genes no genoma das plantas requer a extracção de DNA cromossomal das plantas putativamente transgénicas e sua análise por PCR.

Na reacção de amplificação são utilizados primers específicos que permitem amplificar um fragmento do gene de interesse, ou qualquer zona presente na “cassete de expressão” (zona dos promotores, terminadores, gene de selecção, repórter ou de interesse).

O resultado do PCR é observado por electroforese, onde a separação dos fragmentos de DNA ocorre de acordo com o seu peso molecular, através de uma corrente eléctrica, migrando do pólo negativo para o positivo.

Hygromycin(HPTII)

β-glucuronidase(GUS)

A obtenção de resistência a determinadas condições de stress biótico ou abiótico épossível utilizando métodos tradicionais ou convencionais.

cruzamento entre espécies sensíveis (Vitis vinifera) e espécies resistentes a esse stress (V. rupestris) originando híbridos, alguns dos quais possuindo a característica desejada. No entanto, este método é muito moroso e não estáisento de forte controvérsia, já que os híbridos assim obtidos podem colocar em causa a tipicidade do produto final.

A biotecnologia, através dos seus métodos de propagação e transformação genética, apresenta grande potencial para o melhoramento de diversas espécies vegetais. Esta metodologia apresenta, relativamente aos métodos de melhoramento convencionais, as seguintes vantagens:

- melhoramento de grande precisão, em que apenas o gene pretendido éintroduzido no genoma da planta;

- redução do tempo de obtenção da nova variedade;- inexistência de barreiras quanto à proveniência do gene responsável pela

característica que se pretende introduzir, podendo ter origem em qualquer outra planta.