Genómica

Licenciatura em Ciências BiomédicasDepartamento de Ciências da Saúde, UCP

Fevereiro 2013

Sumário

• 1. Sequenciação• Evolução histórica:

– O método de Sanger– Sequenciação automática– Sequenciação completa de genomas

• Aspetos técnicos das várias formas de sequenciação– Preparação de fragmentos de DNA para sequenciação.– Reação– Deteção

• Aplicações dos resultados da sequenciação

Sequenciação

• O que é?• Para que serve?• Desafios?

• Eventos que permitiram a sequenciação:– Electroforese em acrilamida– PCR– Fluorimetria em capilares– Miniaturizãção

PERSPETIVA HISTÓRICA DAS TÉCNICAS

3 grupos principais

Manual (Maxam & Gilber e Sanger)

1975/1977

Automática (Baseado

em Sanger)1980’s

Massiva (Next Generation)

2000

Sequenciação Manual

• Maxam e Gilbert– Término de sequências em várias bases

• Sanger– Síntese de sequências que terminam em cada uma

das 4 bases aleatroriamente

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger

Sequenciação automática de Sanger

• Em vez de radioatividade usa-se fluorescência.– Podem usar-se 4 fluorocromos diferentes

• Podem ler-se todas as reações num mesmo tubo capilar (e.g citometria de fluxo) ou poço do gel de eletroforese.

• Os detetores detetam cores diferentes no capilar ou no gel.

• Os resultdos são interpretados pelo software

© John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciação automática de Sanger

© John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciação automática de Sanger

© John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciação automática de Sanger

© John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciação automática de Sanger

© John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciação automática de Sanger

© John Wiley & Sons, Inc.

Manual/Automatizada

Técnicas de sequenciação massiva

• Sequenciação por síntese de novo• A síntese ocorre em dezenas de milhares de

fragmentos ao mesmo tempo. • É retirada uma “foto” em cada passo de forma

a que se sabe como é que a sequencia “cresce”

Um outro suporte são esferas

• Emulsion PCR

ASPETOS TÉCNICOS DAS VÁRIAS FORMAS DE SEQUENCIAÇÃO

Construção de Bibliotecas

• Genómicas DNA library conjunto dos clones de todos os fragmentos do genoma de um organismo.

• cDNA conjunto das regiões de um genoma expressas num momento e/ou condição fisiológica.

© John Wiley & Sons, Inc.

COMO SE OBTEM CADA UMA?

Preparação do DNA

• Fragmentação– Enzimas de restrição– Radiação

• Amplificação– Por clonagem (demorada e muito trabalhosa)– Por PCR

APLICAÇÕES DOS RESULTADOS DE SEQUENCIAÇÃO

Aplicações

• Conhecimento da diversidade• Aplicações individualizadas

Bibliografia

• Korf, Bruce & Irons, Mira (2013) Human Genetics and Genomics 4th edition John Wiley & Sons (Ltd). ISBN-13: 978-0-470-654477. Capítulo 14

• Artigos disponibilizados aos alunos na pasta da intranet relativa à Genómica.

• Snustad Principles of genetics. Capítulo 15 Secção de sequanciação