Gotardo Ma Dr Araiq

UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA

CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Desenvolvimento de métodos para análise de medicamentos utilizando reflectância difusa e

espectrofotometria

MARA ANDRÉIA GOTARDO

Tese de Doutorado 2006

1

MARA ANDRÉIA GOTARDO

Desenvolvimento de métodos para análise de medicamentos utilizando reflectância difusa e

espectrofotometria

Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química.

Orientadora: Profª Drª Helena Redigolo Pezza

ARARAQUARA 2006

2

3

DADOS CURRICULARES

1. Formação Acadêmica 1.1. Graduação

Farmácia - Bioquímica

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP

Período: 1995 a 1999

1.2. Pós-Graduação Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara


Doutorado em Química

Instituto de Química - UNESP - Araraquara


2. Artigos Publicados 2.1. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Migration of diethylhexyl phthalate from PVC bags into intravenous cyclosporine solutions. J. Pharm. Biomed. Anal., v. 38, n. 4, p. 709-713, July 2005.

2.2. GOTARDO, M. A.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of hydrochlorothiazide in pharmaceutical formulations by diffuse reflectance spectroscopy, Eclet. Quím., v. 30, n. 2, p. 17-24, 2005.

2.3. CIAPINA, E. G.; SANTINI, A. O.; LOS WEINERT, P.; GOTARDO, M. A.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Spectrophotometric determination of diclofenac in pharmaceutical preparations assisted by microwave oven, Eclet. Quím., v. 30, n. 1, p. 29-36, 2005.

2.4. GOTARDO, M. A.; GIGANTE, A. C.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of furosemide in pharmaceutical formulations by diffuse reflectance spectroscopy. Talanta, v. 64, n. 2, p. 361-365, Oct. 2004.

4

2.5. GIGANTE, A. C.; GOTARDO, M. A.; TOGNOLLI, J. O.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Spectrophotometric determination of formaldehyde with chromotropic acid in phosphoric acid medium assisted by microwave oven. Microchem. J., v. 77, n. 1, p. 47-51, May 2004.

2.6. QUEIROZ, R. H. C.; PEREIRA, R. C.; GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.; MELCHIOR. E. Determination of clofazimine in leprosy patients by high-performance liquid chromatography. J. Anal. Toxicol., v. 27, n. 6, p. 377-380, Sept. 2003.

2.7. GOTARDO, M. A.; TOGNOLLI, J. O.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Determination of propranolol in pharmaceutical formulations by combined spot test-diffuse reflectance spectroscopy, 2006 (submetido).

3. Trabalhos apresentados em Congresso 3.1. GOTARDO, M. A.; DORETTO, K. M.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Determinação de metoclopramida em medicamentos utilizando a combinação espectroscopia de reflectância difusa – spot test. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 29., 2006, Águas de Lindóia. p. 101.

3.2. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Migration of DEHP from PVC bags containing large parenteral solutions with cyclosporine. In: COLACRO: CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE CROMATOGRAFIA E TÉCNICAS AFINS, 10., 2004, Campos do Jordão., v. 1, p. 140.

3.3. GOTARDO, M. A.; L. PEZZA; H.; R. PEZZA. Spot test quantitativo para a determinação de furosemida em formulações farmacêuticas. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 27.; CONGRESSO LATINO AMERICANO DE QUÍMICA, 26., 2004, Salvador, p. QA239.

3.4. RIBEIRO, P. R. S.; GOTARDO, M. A.; L. PEZZA; H.R. PEZZA. Spot test quantitativo para a determinação de metildopa em formulações farmacêuticas por espectroscopia de reflectância difusa. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 27.; CONGRESSO LATINO AMERICANO DE QUÍMICA, 26., 2004, Salvador, p. QA238.

3.5. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. PVC bags containing large parenteral solutions with cyclosporine: should DEHP migrate? In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 4., 2003, Ribeirão Preto. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 39, p. 123, 2003.

5

3.6. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Uso da cromatografia gasosa de alta resolução na determinação de DEHP. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE QUÍMICA, 42., 2002, Rio de Janeiro. p. 171. 3.7 GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Plasticizers identification in plastic bag used to large-volume parenteral solution (LVPS) by high-resolution gas chromatography. In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 3rd, 2001, Águas de Lindóia. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 13, p. S49, 2001.

3.8. GOTARDO, M. A.; SANTIAGO-SILVA, M.; MONTEIRO, M. PVC plastic bag for large-volume parenteral solution (LPVS): is DEHP present? In: PHARMATECH, 6th., ANNUAL MEETING OF THE SBTF, 3rd, 2001, Recife. Proceedings. Recife: [s.n.], 2001, p.221-222.

3.9. GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.; DREOSSI, S. A. C.; QUEIROZ, R. H. C. A rapid, specific and sensitive HPLC analysis of clofazimine in human plasma samples. In: CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE CROMATOGRAFIA E TÉCNICAS AFINS, 7., 1998, Águas de São Pedro. Livro de Resumos. São Carlos: Acta Eventos, 1998. p.175-175.

3.10. GOTARDO, M. A.; QUEIROZ, R. H. C. HPLC analysis of clofazimine in plasma. In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 1st, 1997, Ribeirão Preto. Bolletino Chimico Farmaceutico Rivista di Scienze Farmaceutiche e Biologiche. Milano: Società Editoriale Farmaceutica, v. 136, n. 2, p. 50, 1997.

6

DEDICATÓRIA Aos meus pais João e Dirce,

por todo amor e essencial apoio para a minha vida.

Aos meus irmãos Miriam e João Roberto,

por quem tenho muito carinho e admiração.

Ao Henrique,

que surgiu na minha vida para torná-la mais alegre

e iluminada, pelo apoio, carinho e amor.

7

AGRADECIMENTOS

A CAPES pela bolsa de Doutorado.

À Profª Helena Redigolo Pezza pela orientação, confiança e preocupação em ajudar,

sempre com muita energia e perseverança.

Ao Prof. Leonardo Pezza pela confiança, apoio e amizade.

Ao Prof. João Olímpio Tognolli pela colaboração na parte estatística deste trabalho.

Á Profª Drª Adriana Vitorino Rossi (Unicamp – Campinas) pela atenção e auxílio na

parte de montagem e uso do sistema portátil.

Aos membros da banca examinadora pela atenção e importante colaboração na

apreciação crítica deste trabalho.

Ao Prof. Massao Ionashiro pelos valiosos ensinamentos, incentivo e sincera

amizade.

Aos amigos do Grupo Fritz Feigl: Alberto (Fritz), Paulo, Elaine, Luciana, Keity,

Liliane, Patrícia, Zé Luiz, Fernanda, Sahra, Suelen, Joel, Marcão, Fabrícia, Tuane e

Thiago.

Aos amigos do Grupo Latig: Adriano, Cláudio, Elias, Emanuel, Gilbert e Marcelo.

Aos funcionários da biblioteca, seção de pós-graduação e do Departamento de

Química Analítica pela atenção e gentileza com que sempre me atenderam.

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RESUMO

Este trabalho propõe métodos por espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot

test para determinação de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em

formulações farmacêuticas e também um método espectrofotométrico no visível para

determinação de metildopa em formulações farmacêuticas. Os métodos reflectométricos

foram baseados em reações em papel de filtro, utilizando p-dimetilaminocinamaldeído

(PDAC) como reagente cromogênico para furosemida e hidroclorotiazida; 2,6-

dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) para propranolol e p-cloranil para atenolol. Estas reações

produziram compostos coloridos com máximo de AR (log 1/R) em 585 nm para furosemida e

hidroclorotiazida; 500 nm para propranolol e 550 nm para atenolol. Planejamentos

experimentais foram empregados no desenvolvimento de todos os métodos e, as condições

otimizadas para as respectivas reações de spot test foram: 10 μL de solução de furosemida

em acetona, 20 μL de HCl 6,3% (m/v) em metanol e 20 μL de PDAC 0,4% (m/v)

em metanol, nesta ordem, com aquecimento a 80ºC por 5 minutos; 20 μL de solução de

hidroclorotiazida em acetona, 20 μL de HCl 10% (m/v) em metanol e; 20 μL de PDAC 0,4%

(m/v) em metanol, nesta ordem, com aquecimento a 80ºC por 8 minutos; 30 μL de solução de

propranolol em etanol 35% (v/v) e 30 μL de solução de DCQ 70 mg/mL em acetona e; 20 μL

de solução de atenolol em metanol e 20 μL de p-cloranil 8,00 × 10-2 mol L-1 em dioxano. As

curvas analíticas foram lineares nas faixas de concentração de 7,56 × 10-3 – 6,05 × 10-2 mol L-1

(r=0,9987) para furosemida, 3,36 × 10-2 – 1,01 × 10-1 mol L-1 (r=0,9979) para

hidroclorotiazida, 1,35 × 10-2 – 8,45 × 10-2 mol L-1 (r=0.9991) para propranolol e 1,13 × 10-2 –

7,88 × 10-2 mol L-1 (r=0,9992) para atenolol. O método espectrofotométrico para a

determinação de metildopa em formulações farmacêuticas utilizou p-cloranil como reagente

cromogênico e H2O2 como acelerador da reação. Planejamentos experimentais foram

9

realizados e a condição ótima para a reação foi obtida com a adição de 770 μL de p-cloranil e

85 μL de H2O2 4,55 mol L-1 para um volume final de 5,00 mL, em meio de metanol. A lei de

Beer foi obedecida na faixa de concentração de 4,20 × 10-4 a 2,48 × 10-3 mol L-1, com r =

0.9993. Tal método foi adaptado, com sucesso, a um dispositivo portátil baseado em medidas

fotométricas. Todos os métodos desenvolvidos neste trabalho foram aplicados na análise de

diversas marcas comerciais de formulações farmacêuticas e, comparados estatisticamente com

métodos descritos nas farmacopéias. Os resultados, para todos os métodos, foram

concordantes com relação à precisão e exatidão, demonstrando a possibilidade de se utilizar

métodos alternativos, vantajosos e confiáveis para a determinação de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulações farmacêuticas.

Palavras-chave: espectroscopia de reflectância difusa; spot test; espectrofotometria;

furosemida; hidroclorotiazida; propranolol; atenolol; metildopa.

10

ABSTRACT

This work proposes methods by diffuse reflectance spectroscopy using spot tests for

the determination of furosemide, hydrochlorothiazide, propranolol and atenolol in

pharmaceutical formulations and also a visible spectrophotometric method for the

determination of methyldopa in pharmaceutical formulations. The reflectometric methods

were based on spot test reactions on filter paper, using p-dimetylaminocinnamaldehyde (p-

DAC) as chromogenic reagent for furosemide and hydrochlorothiazide, 2,6-dichloroquinone-

4-chloroimide (DCQ) for propranolol and, p-chloranil for atenolol. These reactions produced

colored compounds with maximum AR (log 1/R) at 585 nm for furosemida and

hydrochlorothiazide; 500 nm for propranolol and 550 nm for atenolol. Experimental designs

were employed in the development of all methods and, the conditions optimized for the

respective spot test reactions were: 10 μL of furosemide solution in acetone, 20 μL of HCl

6.3% (w/v) in methanol and 20 μL of PDAC 0.4% (w/v) in methanol, in this order,

with heating at 80ºC for 5 minutes; 20 μL of hydrochlorotiazide solution in acetone, 20 μL of

HCl 10% (w/v) in methanol and 20 μL of p-DAC 0.4% (w/v) in methanol, in this order, with

heating at 80ºC for 8 minutes; 30 μL of propranolol solution in ethanol 35% (v/v) and 30 μL

of DCQ solution at 70 mg/mL in acetone and, 20 μL of atenolol solution in methanol and 20

μL of p-cloranil at 8.00 × 10-2 mol L-1 in dioxane. The analytical curves were linear in the

concentration ranges of 7.56 × 10-3 – 6.05 × 10-2 mol L-1 (r=0.9987) for furosemide, 3.36 × 10-2 –

1.01 × 10-1 mol L-1 (r=0.9979) for hydrochlorothiazide, 1.35 × 10-2 – 8.45 × 10-2 mol L-1

(r=0.9991) for propranolol and (r=0.9992) for atenolol. The spectrophotometric method for

the determination of methyldopa in pharmaceutical formulations used p-chloranil as

chromogenic reagent and H2O2 as accelerator of the reaction. Experimental designs were

carried out and the optimal condition for the reaction was obtained with the addition of 770

11

μL of p-chloranil and 85 μL of H2O2 at 4.55 mol L-1 for a final volume of 5.00 mL, in

methanol medium. Beer´s law was obeyed in a concentration range from 4.20 × 10-4 to 2.48 ×

10-3 mol L-1, with r = 0.9993. Such method was successfully adapted to a portable device

based on photometric measurements. All methods developed in this work were applied for

analysis of some commercial brands of pharmaceuticals and statistically compared with

methods described in the pharmacopeias. The results for all methods were in agreement in

relation to precision and accuracy, demonstrating the possibility of using alternative,

advantageous and reliable methods for the determination of furosemida, hydrochlorothiazide,

propranolol, atenolol and methyldopa in pharmaceutical formulations.

Keywords: diffuse reflectance spectroscopy; spot test; spectrophotometry;

furosemida; hydrochlorothiazide; propranolol; atenolol; methyldopa.

12

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Estrutura química da furosemida 24

Figura 2. Estrutura química da hidroclorotiazida 25

Figura 3. Estrutura química do propranolol 27

Figura 4. Estrutura química do atenolol 28

Figura 5. Estrutura química da metildopa 29

Figura 6. Vista superior do acessório de reflectância Labsphere modelo RSA-HP-53

67

Figura 7. Espectros de reflectância obtidos a partir do produto da reação de spot test entre butenamida e p-dimetilaminocinamaldeído, em meio ácido. As análises foram realizadas utilizando um acessório de reflectância Labsphere, modelo DRA-CA-3300. Concentração de butemanida = 1,37 × 10-3 mol L-1. Figura 7a. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de %R. Figura 7b. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de )/1log( R . Figura 7c. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de )(Rf

69

Figura 8. Distribuição das publicações de métodos por espectroscopia de reflectância difusa na região do visível para análises quantitativas. Período: 1960-2006

71

Figura 9. Suporte utilizado na realização dos spot tests (Baseado em: TUBINO et al., 1997)

78

Figura 10. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre furosemida e PDAC, em meio ácido, após aquecimento a 80ºC por 5 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm. Solução padrão de furosemida: 3,78 × 10-2 mol L-1

83

Figura 11. Gráficos tridimensionais obtidos para estabelecer condições ótimas de tempo e temperatura de aquecimento (A) e de volumes de PDAC e de ácido adicionados (B)

88

Figura 12. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre furosemida e PDAC, em meio ácido, após aquecimento a 80ºC por 5 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm. Solução padrão de furosemida: 3,78 × 10-2 mol L-1

89

Figura 13. Curva analítica para a determinação de furosemida. Coeficiente de

correlação linear (r) = 0,9987. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Faixa de concentração das soluções padrão de furosemida: 7,56 × 10-3 a 6,05 × 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios padrão para 3 repetições

90

13

Figura 14. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio ácido, após aquecimento a 80ºC por 8 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm. Solução padrão de hidroclorotiazida: 4,20 × 10–2 mol L-1

94

Figura 15. Gráfico de Pareto do planejamento fatorial fracionário para a reação entre hidroclorotiazida e PDAC, sobre papel de filtro

97

Figura 16. Gráfico tridimensional obtido no estabelecimento das melhores condições de tempo e temperatura de aquecimento para a reação entre hidroclorotiazida e PDAC sobre papel de filtro

99

Figura 17. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio ácido, sobre papel de filtro. As análises dos spot tests foram realizadas a cada 5 minutos até 40 minutos. Solução padrão de hidroclorotiazida: 1,01 × 10-1 mol L-1

100

Figura 18. Curva analítica para a determinação de hidroclorotiazida. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9979. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Concentrações das soluções padrão de hidroclorotiazida: 3,36 × 10-2 a 1,01 × 10-1 mol L-1. As barras representam os desvios padrão para 3 repetições

101

Figura 19. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre propranolol e DCQ. Os spot tests foram analisados 10 min. após a adição das soluções sobre o papel de filtro. O comprimento de onda máximo foi em 500 nm. Solução padrão de propranolol: 8,45 × 10–2 mol L-1

106

Figura 20. Gráfico de Pareto do planejamento fatorial completo para a reação entre propranolol e DCQ, sobre papel de filtro

119

Figura 21. Superfície de resposta obtida no planejamento composto central para valores de AR em função da concentração de DCQ e mistura etanol-água (%, v/v) como solvente para propranolol

112

Figura 22. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre propranolol e DCQ. As análises dos spot tests foram realizadas a cada 2 minutos até 60 minutos. Solução padrão de propranolol: 8,45 × 10-2 mol L-1

113

Figura 23. Curva analítica para determinação de propranolol. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9991. Valores de AR foram obtidos em 500 nm. Concentrações das soluções padrão de propranolol: 1,35 × 10-2 a 8,45 × 10-2 mol L-1. As barras representam o desvio padrão para 3 repetições

114

Figura 24. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre atenolol e p-cloranil. O comprimento de onda máximo foi em 550 nm. Solução padrão de atenolol: 7,88 × 10–2 mol L-1

120

14

Figura 25. Efeito da concentração de p-cloranil na resposta (AR). As barras representam os desvios padrão para 3 repetições

121

Figura 26. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre atenolol e p-cloranil. As análises dos spot tests foram realizadas no tempo zero, após 1 minuto e a cada 2 min. até 40 min. Solução padrão de atenolol: 7,88 × 10-2 mol L-1

122

Figura 27. Curva analítica para a determinação de atenolol. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9992. Valores de AR foram obtidos em 550 nm. Concentrações das soluções padrão de atenolol: 1,13 × 10-2 a 7,88 × 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios padrão para 3 repetições

123

Figura 28. Espectro de absorção do produto da reação entre metildopa e p-cloranil. O comprimento de onda analítico foi 535 nm. Concentração final de metildopa = 1,07 × 10–3 mol L-1; caminho óptico: 1,0 cm

135

Figura 29. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre metildopa e p-cloranil. As medidas de absorbância foram realizadas a cada 2 minutos até 60 minutos. Concentração final de metildopa: 7,14 × 10–4 mol L-1

135

Figura 30. Superfície de resposta obtida a partir dos valores de absorbância em função do volume adicionado de p-cloranil e volume de H2O2

138

Figura 31. Curva analítica para a determinação espectrofotométrica de metildopa. Valores de absorbância foram obtidos em 535 nm. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9993. As barras representam o desvio padrão para 3 repetições

139

Figura 32. Dispositivo portátil de medidas fotométricas: (a) Montagem do sistema para medidas fotométricas. (b) Esquema da cela de Teflon® (Fonte: CRIVELENTE, 2003)

143

Figura 33. Curva analítica para a determinação de metildopa por medidas fotométricas utilizando dispositivo portátil. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9986. As barras representam o desvio padrão para 3 repetições

144

15

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Métodos por espectrofotometria no visível descritos na literatura para a determinação de furosemida emedicamentos

33

Tabela 2. Métodos analíticos por CLAE descritos na literatura para a determinação de furosemida associada ou não a outros fármacos em comprimidos

36

Tabela 3. Métodos por espectrofotometria UV derivativa descritos na literatura para a determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas combinadas

40

Tabela 4. Métodos analíticos por CLAE descritos na literatura para a determinação de hidroclorotiazida associada ou não a outros fármacos em comprimidos

42

Tabela 5. Comparação entre alguns métodos espectrofotométricos e seus reagentes cromogênicos descritos na literatura para a determinação de propranolol em formulações farmacêuticas

46

Tabela 6. Métodos espectrofotométricos no visível descritos na literatura para a determinação de metildopa em formulações farmacêuticas

54

Tabela 7. Número de marcas comerciais de formulações farmacêuticas analisadas em cada método desenvolvido e conteúdo declarado de fármaco por comprimido

77

Tabela 8. Quantidades adicionadas de fármaco padrão dadas em mg e em concentração (mol L-1)

81

Tabela 9. Combinações das variáveis estudadas e resultados dos planejamentos 22 com ponto central

87

Tabela 10. Resultados de recuperação de furosemida padrão adicionada em amostras de três formulações farmacêuticas comerciais diferentes

91

Tabela 11. Determinação de furosemida em formulações farmacêuticas comerciais 92

Tabela 12. Matriz do planejamento fatorial fracionário 96

Tabela 13. Matriz do planejamento fatorial completo com ponto central 98

Tabela 14. Resultados de recuperação de hidroclorotiazida padrão adicionada em três formulações farmacêuticas comerciais diferentes

102

Tabela 15. Determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas comerciais

103

Tabela 16. Matriz e resultados do planejamento fatorial completo 108

Tabela 17. Matriz e resultados obtidos no planejamento composto central 111

16

Tabela 18. Resultados de recuperação de propranolol adicionado em formulações farmacêuticas

116

Tabela 19. Determinação de propranolol em formulações farmacêuticas comerciais 117

Tabela 20. Resultados de recuperação de atenolol padrão adicionado em três formulações farmacêuticas comerciais diferentes

125

Tabela 21. Determinação de atenolol em formulações farmacêuticas comerciais 126

Tabela 22. Matriz do planejamento composto central e valores de absorbância referentes a cada experimento

137

Tabela 23. Resultados de recuperação de metildopa adicionada em formulações farmacêuticas

141

Tabela 24. Determinação de metildopa em formulações farmacêuticas comerciais 142

Tabela 25. Determinação de metildopa em formulações farmacêuticas comerciais 146

17

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AAS espectrometria de absorção atômica

CCD cromatografia em camada delgada

CCDAE cromatografia em camada delgada de alta eficiência

CLAE cromatografia líquida de alta eficiência

CLS mínimos quadrados clássicos

DCQ 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida

DDQ 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona

DNA ácido desoxirribonucléico

FIA análise por injeção em fluxo

ILS mínimos quadrados inverso

LDR light dependent resistor (resistor dependente de luz)

LED light emitting diode (diodo emissor de luz)

ND não descrito

PCR regressão de componentes principais

PDAC p-dimetilaminocinamaldeído

PLS mínimos quadrados parciais

PTFE politetrafluoretileno

PVC cloreto de polivinila

RDC resolução da diretoria colegiada

RMN ressonância magnética nuclear

SDS dodecil sulfato de sódio

TCNE tetracianoetileno

TCNQ 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano

UV Ultravioleta

18

LISTA DE SÍMBOLOS A absorbância

RA densidade óptica para medida de reflectância

b caminho óptico

C concentração

I intensidade da radiação refletida

0I intensidade da radiação incidente

r coeficiente de correlação linear

R reflectância ou poder de reflexão

s coeficiente de dispersão

ε absortividade molar

k coeficiente de absorção molar

λ máx. comprimento de onda de máxima absorção

19

Sumário

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO .............................................................................22

I. 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ..............................................................................23 I. 1.1. Furosemida ..................................................................................................................................... 23 I. 1.2. Hidroclorotiazida........................................................................................................................... 24 I. 1.3. Propranolol...................................................................................................................................... 26 I. 1.4. Atenolol ............................................................................................................................................ 27 I. 1.5. Metildopa ......................................................................................................................................... 28

CAPÍTULO II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DOS FÁRMACOS EM ESTUDO................................29

II. 1. FUROSEMIDA .......................................................................................................30 II. 1.1. Espectrofotometria na Região do Visível ........................................................................... 30 II. 1.2. Espectrofotometria na região do UV ................................................................................... 32 II. 1.3. Cromatografia .............................................................................................................................. 33 II. 1.4. Titulometria .................................................................................................................................. 36 II. 1.5. Outras Técnicas Analíticas ...................................................................................................... 36

II. 2. HIDROCLOROTIAZIDA ...................................................................................37 II. 2.1. Espectrofotometria na região do UV ................................................................................... 37 II. 2.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)............................................................ 40 II. 2.3. Outras Técnicas Analíticas ...................................................................................................... 43

II. 3. PROPRANOLOL ...................................................................................................44 II. 3.1. Espectrofotometria na Região do Visível ........................................................................... 44 II. 3.2. Espectrofluorimetria .................................................................................................................. 47 II. 3.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ........................................................................... 48 II. 3.4. Outras Técnicas........................................................................................................................... 48

II. 4. Atenolol...................................................................................................................49 II. 4.1. Espectrofotometria na Região do Visível ........................................................................... 49 II. 4.2. Outras Técnicas........................................................................................................................... 50

II. 5. Metildopa ...............................................................................................................52 II. 5.1. Espectrofotometria na Região do Visível ........................................................................... 52 II. 5.2. CLAE ................................................................................................................................................ 55 II. 5.3. Outras Técnicas........................................................................................................................... 55

CAPÍTULO III. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS............................................57

CAPÍTULO IV - ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA EM COMBINAÇÃO COM SPOT TEST PARA ANÁLISES QUANTITATIVAS ......61

IV. 1. SPOT TEST ............................................................................................................62

20

IV. 2. ASPECTOS TEÓRICOS DA ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA .............................................................................................64

IV. 2.1. Fundamentos............................................................................................................................... 65 IV. 2.2. Teoria de Kubelka-Munk ......................................................................................................... 66 III. 2.3. Instrumentos .............................................................................................................................. 67 IV. 2.4. Representação do espectro de reflectância..................................................................... 68 III. 2.5. Aplicações da espectroscopia de reflectância difusa para análises quantitativas.......................................................................................................................................................................... 70

CAPÍTULO V. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA UTILIZANDO SPOT TEST PARA A DETERMINAÇÃO DE FUROSEMIDA, HIDROCLOROTIAZIDA, PROPRANOLOL E ATENOLOL EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS. ........74

V. 1. PARTE EXPERIMENTAL....................................................................................75 V. 1.1. Equipamentos ............................................................................................................................... 75 V. 1.2. Material e Solventes................................................................................................................... 75 V. 1.3. Reagentes e Soluções ............................................................................................................... 76 V. 1.4. Amostras ........................................................................................................................................ 77

V. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL..............................................................78 V. 2.1. Spot test ......................................................................................................................................... 78 V. 2.2. Preparação das Amostras ........................................................................................................ 79 V. 2.3. Estudo de Interferências .......................................................................................................... 80 V. 2.4. Estudo de Adição e Recuperação .......................................................................................... 81 V. 2.5. Determinação de peróxido de hidrogênio em dioxano: método modificado ........ 82

V. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................83 V. 3.1. Determinação de furosemida em formulações farmacêuticas ................................... 83 V. 3.2. Determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas ........................ 94

V. 3.2.2.1. Planejamento Fatorial Fracionário: triagem de fatores............................... 96 V. 3.2.2.2. Efeitos do tempo e temperatura de aquecimento......................................... 98

V. 3. 3. Determinação de propranolol em formulações farmacêuticas ............................... 105 Esquema 3 ............................................................................................................................................. 105

V. 3. 4. Determinação de atenolol em formulações farmacêuticas ...................................... 119

CAPÍTULO VI. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO DO VISÍVEL PARA A DETERMINAÇÃO DE METILDOPA EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS128

VI. 1. PARTE EXPERIMENTAL ...............................................................................129 VI. 1.1. Equipamentos ........................................................................................................................... 129 VI. 1.2. Reagentes e Soluções............................................................................................................ 129 VI. 1.4. Amostras..................................................................................................................................... 129

VI. 2. PROCEDIMENTO ..............................................................................................130 VI. 2. 1. Curva analítica ........................................................................................................................ 130 VI. 2. 2. Estudo de interferências...................................................................................................... 130 VI. 2.3. Preparação da amostra ......................................................................................................... 131 V. 2.4. Estudo de Adição e Recuperação ........................................................................................ 131

VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................132

21

VI. 3.1. Planejamento Fatorial de Experimentos ......................................................................... 136 VI. 3.3. Curva Analítica ......................................................................................................................... 139 VI. 3.4. Estudo de interferências ....................................................................................................... 140 VI. 3.5. Estudo de Adição e Recuperação....................................................................................... 140 VI. 3.6. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência.... 141 VI. 3.7. Medidas em dispositivo portátil.......................................................................................... 142 VI. 3.7.1. Curva Analítica ..................................................................................................................... 144 VI. 3.7.2. Análise das amostras de comprimidos ........................................................................ 145 VI. 3.8. Conclusões ................................................................................................................................. 146

CAPÍTULO VII. CONCLUSÕES GERAIS ..........................................................148

CAPÍTULO VIII. PERSPECTIVAS FUTURAS...................................................151

CAPÍTULO IX. REFERÊNCIAS...........................................................................153

22

Capítulo I - Introdução

23

I. 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação

de diferentes fármacos em formulações farmacêuticas. Os fármacos em estudo foram:

furosemida, hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa. Considerações gerais sobre

cada um dos fármacos são dadas a seguir:

I. 1.1. Furosemida

A furosemida, ácido 5-(aminossulfonil)-4-cloro-2-[(2-furanilmetil) amino] benzóico,

(Figura 1) apresenta ponto de fusão de 206ºC, é solúvel em acetona, metanol,

dimetilformamida e soluções aquosas com pH maior que 8,0. É levemente solúvel em água,

clorofórmio e éter; e pouco solúvel em etanol (THE MERCK..., 2001). A furosemida é um

derivado do ácido antranílico ou o-aminobenzóico, pertencente à classe dos diuréticos de alça

(JACKSON, 2003; RANKIN, 2002). Os substituintes cloreto e sulfonamida presentes na

molécula de furosemida são característicos em algumas outras classes de diuréticos e

essenciais para a atividade diurética (RANKIN, 2002). Estes fármacos atuam primariamente

sobre o ramo ascendente da alça de Henle, inibindo o sistema de transporte Na+/K+/2Cl-, com

conseqüente diminuição do volume sangüíneo e do débito cardíaco (JACKSON, 2003).

Figura 1. Estrutura química da furosemida

Cl

COOH

NH

H2NO2S

CH2O

24

Os diuréticos de alça são os diuréticos mais potentes e, por isso, devem ser utilizados

com cautela. A furosemida é indicada no tratamento de edemas relacionados com os sistemas

cardíaco, renal e hepático e é usada na hipertensão arterial em situações especiais como

estados edematosos ou em emergências hipertensivas (JACKSON, 2003). A furosemida

apresenta um efeito salurético (excreção de íons sódio e cloreto) de 8 a 10 vezes maior que os

diuréticos tiazídicos e uma duração da ação mais curta, cerca de 6-8 horas. Ela é excretada,

em cerca de 80%, na sua forma inalterada, e uma pequena parte (cerca de 20%) é

metabolizada. A furosemida causa excreção de íons sódio, cloreto, potássio, cálcio, magnésio

e bicarbonato, podendo levar a desequilíbrios eletrolíticos. A furosemida também pode causar

como efeitos adversos ototoxicidade e distúrbios gastrintestinais. Este fármaco é efetivo por

via oral, mas pode ser usado parenteralmente em casos emergenciais. A dose de furosemida,

20 a 80 mg por dia, deve ser administrada em doses divididas devido a sua curta duração da

ação e cuidadosamente aumentadas até o máximo de 600 mg por dia (RANKIN, 2002).

I. 1.2. Hidroclorotiazida

A hidroclorotiazida (1,1-dióxido-6-cloro-3,4-diidro-2H-1,2,4-benzotiadiazino-7-

sulfonamida) (Figura 2) apresenta ponto de fusão de 273-275ºC, é solúvel em acetona, amônia

diluída, metanol e etanol e é praticamente insolúvel em água (THE MERCK..., 2001).

Figura 2. Estrutura química da hidroclorotiazida

N

NHS

Cl

H2NO2SO O

H

25

A hidroclorotiazida pertence à classe dos farmácos tiazídicos, os quais possuem um

núcleo benzotiadiazina 1,1-dióxido (RANKIN, 2002). Tais fármacos constituem uma

importante classe de agentes diuréticos que atuam no túbulo distal, diminuindo a reabsorção

ativa dos íons sódio e cloreto. Entretanto, estes fármacos apresentam ação diurética moderada

quando comparados aos diuréticos de alça. Os diuréticos tiazídicos levam a uma perda

significativa de potássio, causando hipocalemia (diminuição nos níveis plasmáticos de

potássio) que pode ser evitada através da administração concomitante de diuréticos

poupadores de potássio (triantereno, amilorida, por exemplo) ou suplementos de potássio.

Assim, algumas formulações farmacêuticas contendo hidroclorotiazida em associação com

diuréticos poupadores de potássio são comercialmente disponíveis. A hidroclorotiazida é

efetiva por via oral e é excretada na urina em sua forma inalterada, a duração da ação é de 8-

12 horas (RANKIN, 2002). Os principais efeitos adversos da hidroclorotiazida resultam de

algumas ações renais, sendo a depleção de potássio a mais importante. Outros efeitos incluem

alcalose metabólica e aumento dos níveis séricos de ácido úrico. A hidroclorotiazida é

indicada no tratamento de edemas associados a cardiopatias (insuficiência cardíaca

congestiva), hepatopatias (cirrose hepática) e doenças renais (síndrome nefrótica,

insuficiência renal crônica, glomerulonefrite aguda). Este fármaco também é muito usado no

controle da hipertensão (JACKSON, 2003). A diminuição da pressão arterial pode ser

atribuída à redução no volume sanguíneo e ao relaxamento direto do músculo liso vascular

(RANKIN, 2002). Os diuréticos tiazídicos podem ser administrados uma vez ao dia e são bem

tolerados (JACKSON, 2003).

26

I. 1.3. Propranolol

O propranolol, 1-(isopropilamino)-3-(1-naftiloxi)-2-propanol, (Figura 3) apresenta

ponto de fusão de 163-164ºC, é solúvel em água e praticamente insolúvel em éter, benzeno e

acetato de etila (THE MERCK..., 2001).

Figura 3. Estrutura química do propranolol

O propranolol pertence à classe dos β-bloqueadores muito utilizados no tratamento da

hipertensão associada à doença arterial coronária ou a arritmias cardíacas. Os β-bloqueadores

exercem seus efeitos farmacológicos bloqueando os receptores β-adrenérgicos, levando à

redução na contratilidade miocárdica e na freqüência cardíaca. O propranolol é um β-

bloqueador não seletivo, uma vez que interage com os receptores β1 e β2 com igual afinidade.

Este fármaco também apresenta eficácia para reduzir a gravidade e a freqüência dos ataques

de angina de esforço e para melhorar a sobrevida de pacientes que sofreram infarto do

miocárdio (HOFFMAN, 2003).

O N

OHH

27

I. 1.4. Atenolol

O atenolol, 4-(2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino] propoxi) benzenoacetamida, (Figura 4)

apresenta ponto de fusão de 146-148ºC, é solúvel em metanol, acetona e dimetilsulfóxido;

levemente solúvel em etanol 96%; pouco solúvel em água, isopropanol; muito pouco solúvel

em acetona, dioxano e praticamente insolúvel em acetonitrila, acetato de etila e clorofórmio

(THE MERCK..., 2001).

Figura 4. Estrutura química do atenolol

O atenolol é um agente β-bloqueador seletivo, isto é, exibe afinidade ligeiramente

maior pelos receptores β1 do que pelos receptores β2. Os β-bloqueadores, entre eles, o

atenolol, exercem seu efeito farmacológico bloqueando os receptores β-adrenérgicos, levando

à redução na contratilidade miocárdica e na freqüência cardíaca. Da mesma forma que o

propranolol, o atenolol é muito utilizado em todos os graus de hipertensão e também no

tratamento da angina e arritmias cardíacas (HOFFMAN, 2003).

H3C

CH3

NOH

O

NH2

O

H

28

I. 1.5. Metildopa

A metildopa, α-metil-3,4-diidroxifenilalanina, (Figura 5) é solúvel em água a 25ºC

(~10 mg/ml), em ácidos minerais diluídos e é praticamente insolúvel nos solventes orgânicos

mais comuns (THE MERCK..., 2001). A metildopa é quimicamente relacionada às

catecolaminas e possui atividade anti-hipertensiva. Tal atividade é atribuída ao seu

metabolismo no sistema nervoso central à α-metilnorepinefrina, a qual ativa os receptores α2

adrenérgicos centrais, reduzindo o tônus simpático e conseqüentemente a pressão arterial.

Efeitos adversos da metildopa incluem sonolência, hipotensão postural, retenção de fluidos

com edemas e distúrbios gastrintestinais. A dose inicial habitual de metildopa é de 250 mg, 2

vezes ao dia (HOFFMAN, 2003).

Figura 5. Estrutura química da metildopa

HO

HO

COOH

CH3H2N

29

Capítulo II. Revisão Bibliográfica - Métodos analíticos

para quantificação dos fármacos em estudo

30

Levantamento bibliográfico foi realizado nas principais bases de dados sobre os

métodos analíticos publicados nas revistas científicas de maior circulação para a determinação

de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulações

farmacêuticas. Para melhor compreensão, este levantamento foi descrito em tópicos

subdivididos, como segue:

II. 1. FUROSEMIDA

II. 1.1. Espectrofotometria na Região do Visível

A espectrofotometria na região do visível tem sido amplamente descrita na literatura

como técnica analítica utilizada na determinação de furosemida em preparações farmacêuticas

(AGATONOVIC et al., 1990; CASASSAS; FABREGAS, 1979; GARCÍA et al., 1997;

MOHAMED, 1989; SASTRY et al., 1988; SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI,

1989; SEVILLANO-CABEZA; CAMPÍNS-FALCÓ; SERRADOR-GARCÍA, 1997;

ZIVANOVIC; AGATONOVIC; RADULOVIC, 1990). O método descrito por Agatonovic et

al. (1990) foi baseado na reação entre furosemida e cloreto de paládio (II). A mesma reação

foi utilizada por García et al. (1997) para a determinação espectrofotométrica de furosemida

em preparações farmacêuticas utilizando análise por injeção em fluxo (FIA) (GARCIA, et al.,

1997). O método desenvolvido por Zivanovic, Agatonovic e Radulovic (1990) envolveu a

formação de um complexo colorido a partir da reação entre furosemida e cloreto férrico, em

pH 5,2-6,2. Sastry et al. (1988) descreveram o uso de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona

(MBTH) na determinação espectrofotométrica de diversos fármacos diuréticos, entre eles a

furosemida, em amostras de comprimidos. A reação entre furosemida e MBTH ocorreu na

presença de um agente oxidante - cloreto férrico - com aquecimento a 85ºC por 5 minutos. A

furosemida também foi determinada espectrofotometricamente a partir da reação com

cloramina T, sob aquecimento em banho-maria a 70ºC por 10 minutos, seguida da adição de

31

N,N-dimetilfenilenodiamina (SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1989). O

método descrito por Sevillano-Cabeza, Campíns-Falcó e Serrador-García (1997) foi baseado

na reação entre furosemida e 1,2-naftoquinona-4-sulfonato com aquecimento a 70ºC por 30

minutos e envolveu um procedimento de extração do produto colorido utilizando álcool

isoamílico como solvente extrator. Outros reagentes cromogênicos citados na literatura para a

determinação espectrofotométrica no visível de furosemida em medicamentos foram 7,7,8,8-

tetracianoquinodimetano (MOHAMED, 1989) e 1,3,5-benzenotriol (floroglucinol)

(CASASSAS; FABREGAS, 1979). A Tabela 1 sumariza as condições analíticas dos métodos

espectrofotométricos acima mencionados. A maioria dos métodos espectrofotométricos

relatados apresenta algumas desvantagens como, por exemplo, necessidade de tempos de

espera para o aparecimento da cor, etapas de aquecimento ou de extração por solvente.

32

Tabela 1. Métodos por espectrofotometria no visível descritos na literatura para a determinação de

furosemida em medicamentos.

Reagente Cromogênico λ máx.

(nm)

Condições para a reação Referência

Pd (II) 527 pH 10,0 AGATONOVIC et al., 1990

Pd (II) 527 pH 5,0 - aquecimento a 55ºC

Análise por injeção em fluxo

GARCÍA et al., 1997

FeCl3 513 pH 5,2-6,2 ZIVANOVIC; AGATONOVIC; RADULOVIC, 1990

FeCl3 e 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona

630 Aquecimento a 85ºC por 5 min.

SASTRY et al., 1988

Cloramina T e Dicloridrato de N-N-dimetilfenilenodiamina


SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1989

1,2 - naftoquinona-4-sulfonato de sódio


Extração com álcool isoamílico

SEVILLANO-CABEZA; CAMPÍNS-FALCÓ; SERRADOR-GARCÍA, 1997

7,7,8,8-tetracianoquinodimetano

578 pH 9,0-9,5 MOHAMED, 1989

Floroglucinol 558 Tempo de espera de 20 min.

Produto colorido é estável por 20 min.

CASASSAS; FABREGAS, 1979

II. 1.2. Espectrofotometria na região do UV

O método descrito na Farmacopéia Britânica para a determinação de furosemida em

comprimidos emprega a espectrofotometria na região do UV (271 nm). O procedimento

recomendado requer diversas etapas de diluição e filtração lenta em papel de filtro

(BRITISH…, 2001). A espectrofotometria no UV também foi empregada no método

desenvolvido por Moustafa e Abdel-Moety (1987) para a determinação de formulações

farmacêuticas contendo somente furosemida. Os métodos espectrofotométricos na região do

33

UV, entretanto, apresentam pouca seletividade uma vez que compostos insaturados

apresentam uma ou mais bandas nesta região do espectro.

A espectrofotometria derivativa tem sido amplamente descrita para a análise de

formulações farmacêuticas contendo furosemida em associação com outros fármacos. Alguns

métodos utilizando esta técnica são descritos na literatura para a determinação simultânea de

furosemida e amilorida (TORAL et al., 2002; FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN,

2001) e também de furosemida e espironolactona em formulações farmacêuticas combinadas

(MILLERSHIP; PARKER; DONNELLY, 2005). Dias, Martins e de Oliveira Neto (2005)

propuseram um método por espectrofotometria derivativa na região do UV para a

determinação de furosemida em medicamentos na presença de seus produtos de

fotodegradação.

II. 1.3. Cromatografia

Devido a sua seletividade e sensibilidade, a cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) tem sido empregada para a quantificação de furosemida em formulações

farmacêuticas contendo somente furosemida ou em associação com outros fármacos e

também em estudos de estabilidade (ANAPURE; KHANNA; DIGHE, 1989; BARROSO et

al., 1996; BARROSO; ALONSO; JIMENEZ, 1996; BROCH; ROMERO; COQUE, 2000;

RAPAKA; ROTH; PRASAD, 1982; SEMAAN et al., 2005).

A CLAE em fase reversa utilizando detector UV (254 nm) foi empregada por

Anapure, Khanna e Dighe (1989) para quantificar furosemida e espironolactona em

medicamentos que combinam estes dois fármacos. Rapaka, Roth e Prasad (1982) descreveram

um método por CLAE com detector UV (280 nm) utilizando extração com hidróxido de sódio

para quantificar ácido 4-cloro-5-sulfamoilantranílico - produto de degradação da furosemida -

e furosemida em matérias-primas e em formulações farmacêuticas. Outro método por CLAE

com detector UV (237 nm) para a determinação de furosemida em comprimidos empregou

34

uma coluna C18 homemade (SEMAAN et al., 2005). A CLAE empregando fases móveis

micelares também tem sido descrita para a determinação de furosemida. Broch, Romero e

Coque (2000) utilizaram a CLAE com detector UV (274 nm), coluna C18 e fase móvel

constituída por dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,06 mol L-1 e propanol 8% para a

determinação de furosemida em medicamentos. Este método também foi empregado para o

estudo da estabilidade da furosemida. Neste caso, a separação de furosemida e dos seus

produtos de fotodegradação foi conseguida utilizando-se uma fase móvel com força de

eluição menor (SDS 0,04 mol L-1 e propanol 2%) (BROCH; ROMERO; COQUE, 2000).

A CLAE com detector amperométrico tem sido empregada para a determinação de

furosemida, principalmente, quando se requer grande sensibilidade. Barroso et al. (1996)

utilizaram CLAE com detector amperométrico para quantificar furosemida e piretanida em

formulações farmacêuticas e em amostras de urina. Outro método utilizando CLAE com

detector amperométrico foi aplicado à determinação simultânea de furosemida e triantereno

em amostras de comprimido contendo os dois fármacos e também em amostras de urina

(BARROSO; ALONSO; JIMENEZ, 1996). Os métodos por CLAE, entretanto, apresentam

algumas desvantagens, tais como o alto custo dos cromatógrafos e colunas cromatográficas e

a necessidade de grandes volumes de solventes orgânicos, levando à geração de resíduos

tóxicos.

A cromatografia em camada delgada (CCD) foi descrita para a determinação

simultânea de amilorida, bumetanida, politiazida e furosemida em formulações farmacêuticas

(ZIVANOVIC; AGATONOVIC; RADULOVIC, 1989). Tal método empregou placas de

sílica gel, NH3 25% : propanol (3:7) ou clorofórmio : isopropanol : metanol : ácido acético

(5:3:1:1) como fases móveis e a detecção foi em 254 nm.

Algumas informações sobre os métodos por CLAE descritos acima estão apresentadas

na Tabela 2.

35

Tab

ela

2. M

étod

os a

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icos

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CLA

E de

scrit

os n

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erat

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sulfa

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e só

dio

36

II. 1.4. Titulometria

A titulometria tem sido empregada em alguns estudos envolvendo a determinação de

furosemida em sua forma pura ou em medicamentos (KULICHENKO; FESENKO, 2002;

OSSMAN et al., 1988).

Ossman et al. (1988) propuseram métodos titulométricos indiretos para a determinação

de furosemida em sua forma pura. O método foi baseado na reação entre furosemida e N-

bromosuccinimida ou N-clorosuccinimida. À solução contendo excesso de reagente foi

adicionado iodeto de potássio. Esta solução foi, então, titulada com tiossulfato de sódio,

utilizando amido como indicador. O tempo ótimo para a reação se completar foi de 20

minutos para N-bromosuccinimida e de 30 minutos para N-clorosuccinimida. Kulichenko e

Fesenko (2002) estudaram a solubilidade e as propriedades ácido-base da furosemida e

propuseram um método titulométrico utilizando tensoativos catiônicos com determinação

potenciométrica ou utilizando azul de bromotimol como indicador.

II. 1.5. Outras Técnicas Analíticas

A cromatografia eletrocinética capilar micelar - técnica eletroforética na qual há a

introdução de micelas na solução tampão - foi utilizada para separar e quantificar furosemida,

hidroclorotiazida, clortalidona e triantereno em comprimidos (LUIS et al., 2002). Um método

por espectroscopia de fluorescência associada à calibração multivariada (método dos mínimos

quadrados parciais) foi descrito para a determinação simultânea de furosemida e triantereno

em amostras de urina e em formulações farmacêuticas (LUIS et al., 2004). Medicamentos

contendo furosemida foram analisados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

(RMN) (ABOUL-ENEIN; AL-BADR; RASHED, 1979). Barroso, Alonso e Jimenez (1995)

desenvolveram métodos por voltametria de pulso diferencial e voltametria de onda quadrada

para determinar furosemida em amostras de urina e em formulações farmacêuticas. Um

37

eletrodo de membrana de PVC incorporado com o par iônico furosemida-cloreto de

tricaprilmetilamônio foi desenvolvido por Dias et al., 2004 para quantificar furosemida em

medicamentos.

II. 2. HIDROCLOROTIAZIDA

II. 2.1. Espectrofotometria na região do UV

A maioria dos métodos analíticos para a determinação de hidroclorotiazida em

medicamentos emprega a espectrofotometria no UV (ALBERO et al., 2002; CARLUCCI; DI

GIUSEPPE; MAZZEO, 1993; DINC; USTUNDAG, 2003; DINC, 2002; EL-WALILY et al.,

1995; ERK; ONUR, 1996; ERK, 1999, 2002; FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN,

2002, 2004; JOSEPH-CHARLES et al., 2003; KARGOSHA; SARRAFI, 2001; MAHADIK,

2000; MARTIN et al. 1995, 1998; PANDERI, 1999; PANZADE; SALAMA et al., 2000;

SASTRY et al., 1988; URBÀNYI; O´CONNELL, 1972). A Farmacopéia Britânica descreve

um método por espectrofotometria no UV em 273 nm para a determinação de

hidroclorotiazida em comprimidos (BRITISH…, 2001). Os métodos por espectrofotometria

no UV descritos na literatura são, principalmente, para a determinação de hidroclorotiazida

em associação com um ou mais fármacos. Entretanto, medidas diretas na região do UV estão

sujeitas às interferências provenientes de fármacos e/ou de excipientes presentes na

formulação farmacêutica, resultando em baixa seletividade, uma vez que todos os compostos

insaturados apresentam uma ou mais bandas na região UV do espectro eletromagnético. Desta

forma, os métodos por espectrofotometria no UV para a determinação de hidroclorotiazida

associada a outros fármacos presentes em formulações farmacêuticas são baseados em

medidas derivativas a fim de se obter métodos com maior seletividade do que os métodos

espectrofotométricos convencionais. Além disso, muitos destes métodos aplicam ferramentas

quimiométricas, tais como: mínimos quadrados clássicos (CLS), mínimos quadrados inverso

38

(ILS), regressão de componentes principais (PCR) e mínimos quadrados parciais (PLS) sobre

os dados dos espectros UV e sobre suas derivadas de primeira ou segunda ordem. Algumas

informações sobre as determinações de hidroclorotiazida associada a outros fármacos por

espectrofotometria derivativa com ou sem aplicação de métodos quimiométricos estão

apresentadas na Tabela 3.

39

Tabela 3. Métodos por espectrofotometria UV derivativa descritos na literatura para a determinação

de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas combinadas.

Fármaco(s) associado(s) Método(s) quimiométrico(s)

empregado(s)

Referência

Amilorida, atenolol e timolol CLS, PCR, PLS FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN, 2004

Amilorida PLS FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN, 2002

Amilorida Regressão linear múltipla MARTIN et al., 1995

Benazepril, triantereno, cilazapril Método de Vierordt ERK, 1999

Benazepril Derivada 2ª ordem PANDERI, 1999

Benazepril CLS, ILS, PCR DINC, 2002

Captopril - PANZADE; MAHADIK, 2000

Captopril, enalapril, fosinopril Derivada 2ª ordem SALAMA et al., 2000

Cilazapril Derivada 1ª ordem ERK; ONUR, 1996

Enalapril Derivada 1ª ordem EL-WALILY et al., 1995

Enalapril Derivada 2ª ordem CARLUCCI; DI GIUSEPPE; MAZZEO, 1993

Espironolactona CLS, ILS, PCR, PLS DINC; USTUNDAG, 2003

Espironolactona, canrenona PLS MARTIN et al., 1998

Fosinopril Derivada 1ª ordem ERK, 2002

Irbesartan Derivada 1ª ordem JOSEPH-CHARLES et al., 2003

Irbesartan Derivada 1ª ordem ALBERO et al., 2002

Losartan Derivada 1ª ordem ERK, 2001

Triantereno PLS e PCR KARGOSHA; SARRAFI, 2001

Valsartan Derivada 1ª ordem SATANA et al., 2001 CLS: mínimos quadrados clássicos; ILS: mínimos quadrados inverso; PCR: regressão de componentes principais; PLS: mínimos quadrados parciais.

40

II. 2.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Dentre os métodos cromatográficos, a CLAE, em fase reversa, com detector UV tem

sido a mais descrita para a determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas

(ATAY; TAMER; ARIKAN, 2001; CETIN; SUNGUR, 2005; ERK; KARTAL, 1999; ERK,

1999, 2001; KARTAL; ERK, 1999; OZKAN, 2001; PANDERI; PARISSI-POULOU, 1999).

Com o objetivo de reduzir o consumo de solventes e tornar os métodos por CLAE mais

seletivos, colunas micro-bore (com diâmetro interno entre 1,0 a 4,6 mm) têm sido utilizadas

(PANDERI; PARISSI-POULOU, 1999). CLAE com detecção por quimiluminescência

também tem sido empregada para a determinação de hidroclorotiazida em formulações de

comprimidos (OUYANG et al., 1999). Neste caso, a detecção foi baseada na reação entre

hidroclorotiazida e cério (IV) em meio de ácido sulfúrico, sensibilizada pelo corante

fluorescente rodamina 6G (OUYANG et al., 1999). Os dados sobre as determinações por

CLAE estão apresentados na Tabela 4.

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43

II. 2.3. Outras Técnicas Analíticas

A Farmacopéia Brasileira descreve um método para quantificar hidroclorotiazida em

comprimidos utilizando titulação em meio não-aquoso (FARMACOPÉIA..., 1988).

Um método por FIA baseado na reação de quimiluminescência entre hidroclorotiazida

e cério (IV) foi desenvolvido por Ouyang et al. (1998). A mesma reação foi utilizada em outro

método utilizando quimiluminescência para a determinação de hidroclorotiazida em

formulações farmacêuticas (PULGARIN; MOLINA; OLIVARES NIETO, 2004).

A cromatografia eletrocinética capilar micelar foi utilizada por Luis et al. (2002) para

a separação e quantificação de clortalidona, furosemida, triantereno e hidroclorotiazida e

também no método desenvolvido por Quaglia et al. (2002) para a determinação de losartan e

hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas.

Poucos métodos por espectrofotometria na região do visível são citados na literatura

para a determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas (SASTRY et al.,

1989; SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1988). Os métodos mencionados

envolveram reações químicas com dicloridrato de N,N-dimetilfenilenodiamina e cloramina T

(SASTRY et al., 1989) e 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona após hidrólise alcalina

(SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1988).

44

II. 3. PROPRANOLOL


A maioria dos métodos analíticos descritos na literatura para a determinação de

propranolol em formulações farmacêuticas emprega a espectrofotometria na região do visível.

Estes métodos são baseados em reações entre propranolol e diferentes reagentes

cromogênicos. Salem (2002) desenvolveu métodos baseados na reação do propranolol

(doador de elétrons) e reagentes aceptores de elétrons, tais como: iodo, p-cloranil, bromanil,

2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ), tetracianoetileno (TCNE) e 7,7,8,8-

tetracianoquinodimetano (TCNQ), produzindo complexos de transferência de carga coloridos

(SALEM, 2002). Gölcü, Yücesoy e Serin (2004) descreveram dois métodos por

espectrofotometria no visível para determinar propranolol em formulações farmacêuticas.

Tais métodos foram baseados em reações de complexação do fármaco com Cu (II) e Co (II).

Um método indireto utilizando a espectrofotometria no visível foi descrito para a

determinação de propranolol e piroxicam em formulações farmacêuticas e em matérias-

primas (GOWDA; SEETHARAMAPPA; MELWANKI, 2002). Este método foi baseado na

oxidação de propranolol por um excesso de N-bromosuccinimida, em meio ácido, seguida

pela reação do excesso de oxidante com cloridrato de prometazina e cloridrato de

metidilazina, resultando em um produto colorido. Outro método indireto foi proposto por

Sastry, Srinivas e Prasad (1996). Tal método foi baseado na reação do propranolol com N-

bromosuccinimida, a qual foi adicionada em concentração conhecida e em excesso. A

concentração de N-bromosuccinimida que não reagiu foi determinada pela diminuição na

absorbância do corante celestine blue. O método proposto por El-Eman et al. (2003) foi

baseado na reação de acoplamento oxidativo entre propranolol e 3-metil-2-benzotiazolinona

hidrazona (MBTH), na presença de Ce (IV). Outros métodos espectrofotométricos para a

determinação de propranolol em formulações farmacêuticas envolveram reações com azul de

45

bromotimol (RADULOVIC; JOVANOVIC; ZIVANOVIC, 1986) e ácido 4-amino-3,5-

dinitrobenzóico diazotizado (IDOWU; ADEGOKE; OLANIYI, 2004). O método descrito por

Zivanovic, Radulovic e Jovanovic (1988) envolveu a reação entre propranolol e cloreto

férrico, em meio ácido, na presença de tiocianato de amônio. O complexo colorido formado

foi extraído com clorofórmio.

A Tabela 5 apresenta as condições analíticas dos métodos espectrofotométricos acima

mencionados, bem como os reagentes cromogênicos envolvidos nas reações químicas para

determinação de propranolol em formulações farmacêuticas. A maioria dos métodos

espectrofotométricos descritos apresenta algumas desvantagens, tais como tempo de espera

para o aparecimento da cor, etapas de derivatização ou extração com clorofórmio e alguns são

indiretos.

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47

II. 3.2. Espectrofluorimetria

Alguns métodos fluorimétricos têm sido desenvolvidos para a determinação de

propranolol em formulações farmacêuticas. Tais métodos foram baseados na fluorescência

natural da molécula de propranolol (FERNÀNDEZ-SÀNCHEZ et al., 2003; LA PEÑA;

SALINAS; DURÁN, 1991; RUIZ et al., 1998) ou em reações de derivatização (RAMESH et

al., 2003). Um método por espectrofluorimetria foi descrito para a determinação simultânea

de propranolol e hidralazina em formulações farmacêuticas. Os espectros foram registrados

após aquecimento da amostra em meio aquoso a 70ºC por 15 minutos e resfriamento a 20ºC e

suas derivadas (1ª ordem) foram utilizadas (LA PEÑA; SALINAS; DURÁN, 1991). Outro

método empregando espectrofluorimetria derivativa foi descrito por Ruiz et al. (1998) para a

determinação simultânea de propranolol e pindolol em formulações farmacêuticas. Neste

método, os espectros foram registrados a 25ºC e suas derivadas (1ª ordem) foram utilizadas.

Um sensor óptico sensível à fluorescência foi desenvolvido por Fernàndez-Sànchez et al.

(2003) para determinar propranolol e pindolol em formulações farmacêuticas e em amostras

de urina. Ramesh et al. (2003) propuseram um método por espectrofluorimetria para a

determinação simultânea de piroxican e propranolol em formulações farmacêuticas. O método

foi baseado na reação de oxidação entre o fármaco e excesso de N-bromosuccinimida, seguida

pela reação do excesso de N-bromosuccinimida com cloridrato de metdilazina, resultando em

espécies fluorescentes (RAMESH et al., 2003).

48

II. 3.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A CLAE com detector UV (270 nm) foi utilizada por DasGupta (1985) para a

quantificação de propranolol em formulações farmacêuticas. O método empregou uma coluna

C18 e verapamil como padrão interno. Outro método por CLAE no UV (290 nm) foi proposto

por Hitscherich et al. (1987). Este método empregou coluna de cianopropilsilano para separar

e quantificar propranolol e hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas. Martinez, Coque

e Camanas (1997) desenvolveram um método por CLAE com detector UV (225 nm) com o

propósito de separar e quantificar diversos β-bloqueadores, entre eles o propranolol, em

formulações farmacêuticas. O método empregou fases móveis micelares em diferentes valores

de pH.

II. 3.4. Outras Técnicas

A Farmacopéia Britânica descreve um método por espectrofotometria na região do UV

(290 nm) para a determinação de propranolol em comprimidos (BRITISH…, 2001). Um

método por quimiluminescência e análise por injeção em fluxo foi desenvolvido por Tsogas et

al. (2005) para a determinação de propranolol em formulações farmacêuticas. Tal método foi

baseado na reação com pirogalol oxidado por periodato. Trata-se de um método indireto, uma

vez que o propranolol é oxidado por periodato que é adicionado em excesso e a detecção é

feita pela medida de quimiluminescência gerada pela oxidação de pirogalol com o excesso de

periodato. Outro método por quimiluminescência e FIA foi baseado na quimiluminescência

produzida pela reação entre propranolol e permanganato de potássio em meio de ácido

sulfúrico (TOWNSHEND; PULGARIN; PARDO, 2005).

Outras técnicas citadas para a determinação de propranolol em formulações

farmacêuticas têm sido a polarografia de pulso diferencial (EL-RIES; ABOU-SEKKINA;

WASSEL, 2002), a fosforescência à temperatura ambiente (DIAZ et al., 2002; MARTINEZ;

CAMANAS; COQUE, 1994) e a espectrometria de absorção atômica (AAS) (EL-RIES;

49

ATTIA; IBRAHIM, 2000; KHALIL; BORHAM, 2000; KHALIL; EL-RABIEHI, 2000). Um

método titulométrico direto utilizando N-bromosuccinimida como titulante também foi

descrito para determinar propranolol em formulações farmacêuticas (PATHAKA; SHUKLA;

SHUKLA, 1982). Briguenti e Bonato (2005) empregaram a eletroforese capilar para a análise

dos β-bloqueadores: atenolol, metoprolol, pindolol e propranolol em preparações

farmacêuticas. Métodos potenciométricos utilizando eletrodos íon-seletivos também têm sido

descritos na literatura para a determinação de propranolol em formulações farmacêuticas

(ABOUL-ENEIN; SUN, 2000; HASSAN et al., 2003; KARTAMYSHEV; RYASENSKII;

GORELOV, 2002).

II. 4. Atenolol


Diversos métodos espectrofotométricos na região do visível têm sido descritos para

quantificar atenolol em formulações farmacêuticas (AGRAWAL et al., 1992; AL-

GHANNAM; BELAL, 2002; AL-GHANNAM, 2006; AMIN; RAGAB; SALEH, 2002;

GÖLCÜ; YÜCESOY; SERIN, 2004; SALEM, 2002). Um método espectrofotométrico

indireto foi desenvolvido por Agrawal et al. (1992). O método foi baseado na reação de

atenolol com cloridrato de hidroxilamina, produzindo um derivado do ácido hidroxâmico, o

qual formou um complexo colorido com Fe (III) que foi determinado em 510 nm. Métodos

para a determinação de diversos agentes β-bloqueadores, entre eles o atenolol, baseados em

reações que formam complexos de transferência de carga foram descritos por Salem (2002) e

empregaram iodo, p-cloranil, bromanil, TCNE e TCNQ como reagentes cromogênicos.

Golcü, Yücesoy e Serin (2004) descreveram dois métodos por espectrofotometria no visível

para determinar acebutolol, propranolol e atenolol em formulações farmacêuticas. Tais

métodos foram baseados em reações de complexação dos fármacos com Cu (II) e Co (II). Um

método espectrofotométrico cinético para a determinação de atenolol em formulações

50

farmacêuticas foi proposto por Al-Ghannam e Belal (2002). O método foi baseado na reação

entre atenolol e 4-cloro-7-nitrobenzeno-2-oxa-1,3-diazol em pH 8,0 e com aquecimento por

30 minutos, produzindo um composto colorido (460 nm). O método descrito por Al-Ghannam

(2006) para a determinação de atenolol envolveu o uso de corantes ácidos, tais como: azul de

bromofenol, azul de bromotimol e vermelho de bromocresol. O complexo colorido formado

foi analisado por espectrofotometria em 415 nm.


Martinez, Coque e Camanas (1997) desenvolveram um método por CLAE com

detector UV (225 nm) com o propósito de separar e quantificar diversos β-bloqueadores, entre

eles o atenolol, em formulações farmacêuticas. O método empregou fases móveis micelares

em diferentes valores de pH.

A cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) foi empregada para a

determinação de atenolol e nitrendipina em formulações farmacêuticas (ARGEKAR;

SAWANT, 1999). Tal método empregou placas de sílica gel sobre folhas de alumínio como

fase estacionária e clorofórmio: metanol : tolueno : amônia 25% (2:2:5,5:0,1, v/v) como fase

móvel. A detecção foi realizada em 233 nm (ARGEKAR; SAWANT, 1999). Um método

semelhante utilizando CCDAE foi aplicado à determinação de atenolol e amlodipina em

amostras de comprimidos (ARGEKAR; POWAR, 2000). Tal método empregou placas de

sílica gel como fase estacionária e cloreto de metileno : metanol : amônia 25% (8,8:1,3:0,1,

v/v) como fase móvel. A detecção foi realizada em 230 nm.

A Farmacopéia dos Estados Unidos descreve um método por CLAE com detector UV

(226 nm) para a quantificação de atenolol em comprimidos (UNITED..., 2003). O método

recomendado pela Farmacopéia Britânica envolve a espectrofotometria no UV em 275 nm

(BRITISH…, 2001).

51

A espetrofotometria derivativa no UV utilizando métodos quimiométricos foi descrita

por Ferraro, Castellano e Kaufman (2004) para a determinação simultânea de amilorida,

atenolol, hidroclorotiazida e timolol em formulações farmacêuticas e em misturas sintéticas.

A espectrofotometria UV derivativa também foi empregada nos métodos desenvolvidos por

Bonazzi et al. (1996) para a análise de formulações farmacêuticas contendo atenolol,

metoprolol e suas associações, tais como: atenolol-clortalidona, metoprolol-clortalidona e

metoprolol-hidroclorotiazida.

Entre os métodos potenciométricos para a determinação de atenolol está o uso de um

biossensor contendo membrana de bicamada lipídica com superfície estabilizada com DNA

desenvolvido para triagem rápida de atenolol em preparações farmacêuticas (NIKOLELIS;

PETROPOULOU; MITROKOTSA, 2002). Outro método potenciométrico descrito para a

determinação de atenolol em formulações farmacêuticas empregou sensores de membrana de

matriz polimérica de PVC incorporada com o par iônico atenolol-tungstofosfato (HASSAN et

al., 2003). Um método potenciométrico utilizando eletrodo íon-seletivo de membrana de PVC

foi descrito na literatura para a determinação de atenolol em formulações farmacêuticas. O

eletrodo foi construído pela incorporação na matriz de PVC com o par iônico atenolol-tetrakis

(p-clorofenil) borato (SHAMSIPUR; JALALI, 2005).

Briguenti e Bonato (2005) empregaram a eletroforese capilar para a análise dos β-

bloqueadores atenolol, metoprolol, pindolol e propranolol em preparações farmacêuticas.

Outros métodos por eletroforese capilar foram descritos por Shafaati e Clark (1996) para a

determinação de atenolol, na presença de substâncias relacionadas, em formulações

farmacêuticas e por Maguregui, Jimenez e Alonso (1998) para a determinação simultânea de

atenolol e de outros agentes anti-hipertensivos em formulações farmacêuticas e em amostras

de urina.

52

II. 5. Metildopa


O método recomendado pela Farmacopéia Brasileira para a análise de comprimidos

contendo metildopa emprega a espectrofotometria na região do visível. O método é baseado

na reação entre metildopa e tartarato ferroso em pH 8,5 (FARMACOPÉIA..., 1988). Outros

métodos espectrofotométricos, na região do visível, descritos para a determinação de

metildopa são baseados em diferentes tipos de reações químicas. O método desenvolvido por

Nagaraja et al. (1998) envolveu uma reação de oxidação da metildopa por N-

bromosuccinimida, seguida pelo acoplamento oxidativo com isoniazida. A metildopa também

foi determinada pela reação com sulfanilamida diazotizada, na presença de íons molibdato,

em meio ácido (NAGARAJA; VASANTHA; SUNITHA, 2001). O método desenvolvido por

Aman et al. (1998) empregou a reação entre metildopa e ácido barbitúrico, em meio alcalino.

Outros reagentes citados têm sido: periodato (AFKHAMI; KHATAMI, 2003), p-

dimetilaminocinamaldeído (WALASH; ABOU-OUF; SALEM, 1985), vanilina (SALEM,

1985), nitrato de cério (IV) (HELALEH; RAHMAN; ABU-NAMEH, 1997) e cloreto férrico

(ZIVANOVIC; VASILJEVIC; RADULOVIC, 1991). Alguns métodos espectrofotométricos

utilizando FIA também têm sido descritos na literatura (NEVADO; GALLEGO; LAGUNA,

1995; TUBINO; RODRIGUES-JR; VILA, 2004; ABDULRAHMAN; AL-ABACHI; AL-

QAISSY, 2005; RIBEIRO et al., 2005). Tais métodos envolveram reações entre metildopa e

metaperiodato (NEVADO; GALLEGO; LAGUNA, 1995), p-aminofenol em meio alcalino

(TUBINO; RODRIGUES-JR; VILA, 2004), p-toluidina e periodato de sódio

(ABDULRAHMAN; AL-ABACHI; AL-QAISSY, 2005) e molibdato de amônio (RIBEIRO

et al., 2005). Ainda, um método espectrofotométrico para a determinação de metildopa em

formulações farmacêuticas empregou extrato bruto de raiz de batata doce (Ipomoea batatas

(L.) Lam.) como fonte da enzima polifenol oxidase, a qual catalisa a reação de oxidação de

53

catecolaminas levando a formação de compostos coloridos (VIEIRA; FATIBELLO-FILHO,

1998). Dados adicionais sobre os métodos espectrofotométricos citados acima estão

apresentados na Tabela 6. A maioria dos métodos espectrofotométricos citados apresenta

algumas desvantagens, tais como necessidade de tempo de espera para o aparecimento da cor,

etapa de aquecimento e envolvem procedimentos complexos.

54

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55

II. 5.2. CLAE

A CLAE também tem sido descrita para a análise de formulações farmacêuticas

contendo metildopa. Um método por CLAE com detector UV (280 nm) foi descrito por Ting

(1983). O método empregou uma coluna C18, uma mistura de ácido acético 3% : metanol

(96:4, v/v) como fase móvel e teobromina como padrão interno (TING, 1983). A CLAE

utilizando fase móvel micelar foi empregada no método proposto por Camanas et al. (1995)

para a determinação das catecolaminas: L-dopa, metildopa, epinefrina, dopamina e

isoproterenol, bem como de outros compostos freqüentemente associados com essas

catecolaminas, em formulações farmacêuticas (CAMANAS et al., 1995). A CLAE com

detector UV (286 nm) foi empregada para a determinação simultânea de metildopa, amilorida

e hidroclorotiazida em comprimidos (ZECEVIC et al., 2001). As condições ótimas de

separação foram estabelecidas utilizando metodologia de superfície de resposta. A fase móvel

consistiu de água : metanol (75:25, v/v) pH 3,60, a coluna foi uma C18 e o padrão interno

cafeína (ZECEVIC et al., 2001).


Badawy et al. (1996) descreveram um método potenciométrico para a determinação de

L-dopa, carbidopa, metildopa and aspartame utilizando um eletrodo seletivo

trinitrobenzenosulfonato. A polarografia de pulso diferencial também foi descrita para a

determinação de metildopa em formulações farmacêuticas (BALLANTINE; WOOLFSON,

1979). Um método por titulometria foi descrito para a determinação de metildopa em

comprimidos. Neste método, N-bromosuccinimida foi utilizada para titular a solução

contendo amostra, iodo e vermelho de metila (PATHAK; SHUKLA; SHUKLA, 1982). Um

método utilizando espectrofotometria no UV foi descrito por Wahbi et al. (1978). Tal método

empregou a reação com cobaltinitrito de sódio e foi aplicado na determinação de alguns

56

fármacos fenólicos, entre eles a metildopa, em amostras de comprimidos. Outro método

espectrofotométrico no UV (358 nm) para a determinação de metildopa em formulações

farmacêuticas utilizou reação com p-cloranil (KORANY; WAHBI, 1979). Entretanto, este

método apresenta problemas relacionados à necessidade de aquecimento por tempo

prolongado (30 minutos) e à possibilidade de interferências provenientes da matriz, os quais

também absorvem na região do UV (KORANY; WAHBI, 1979).

57

Capítulo III. Justificativa e Objetivos

58

A hipertensão arterial é a mais comum das doenças cardiovasculares. Em 1998, as

doenças cardiovasculares foram responsáveis por 27% dos óbitos registrados no país

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). O tratamento farmacológico de pacientes hipertensos

visa reduzir a morbidade e a mortalidade decorrentes de doenças cardiovasculares. A terapia

com anti-hipertensivos previne, consideravelmente, acidentes vasculares cerebrais

hemorrágicos, insuficiência cardíaca e insuficiência renal resultantes da hipertensão

(KANNEL, 1996). Dentre os medicamentos indicados para o tratamento da hipertensão

arterial destacam-se a furosemida, a hidroclorotiazida, o propranolol, o atenolol e a metildopa,

os quais são utilizados por grande parte da população brasileira de hipertensos.

A RDC nº 33 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária/Ministério da Saúde, que

institui o Regulamento Técnico sobre Boas Práticas de Manipulação de Medicamentos em

Farmácias, em seu Anexo I (Boas Práticas de Manipulação em Farmácias) (AGÊNCIA

NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2000) estabelece que todos os itens que

comprovem a especificação das matérias primas e que garantam seu teor, pureza e integridade

devem ser re-analisados pelo setor de Controle de Qualidade da Farmácia para certificação do

laudo de análise do fornecedor (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA,

2000). Um grande problema mundial é a falsificação e adulteração de medicamentos

consumidos pela população. O uso destes medicamentos representa um risco para a saúde das

pessoas. No Brasil, este problema foi detectado em 1998, quando uma variedade de

medicamentos, tais como contraceptivos orais, antibióticos, antineoplásicos, e antipiréticos

foram falsificados com sérias consequências. Assim, a análise de formulações farmacêuticas

tem como objetivo não somente o controle de qualidade, mas também demonstrar a

idoneidade do produto.

Diversos métodos têm sido desenvolvidos para a análise de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulações farmacêuticas.

59

Entretanto, a maioria dos métodos descritos na literatura, de modo geral, envolve métodos por

CLAE convencional, a qual requer instrumentação complexa e de alto custo, além de um

excessivo tempo de análise e necessidade de grandes volumes de solventes orgânicos tóxicos.

Outra técnica muito utilizada para a determinação dos fármacos envolvidos neste

estudo é a espectrofotometria no UV e no visível. Todavia, os métodos espectrofotométricos

baseados em medidas diretas no UV estão sujeitos a interferências provenientes da matriz.

Assim, a maioria dos métodos por espectrofotometria no UV é derivativa e envolve,

geralmente, a determinação de diversos fármacos simultaneamente, os quais empregam

análise multivariada, apresentando o inconveniente de necessitar conhecer todos os

componentes presentes na amostra que poderiam influenciar na resposta de absorbância. Os

métodos por espectrofotometria no visível descritos para a determinação dos fármacos em

estudo apresentam problemas relacionados à necessidade de etapas de aquecimento e de

derivatização, tempo de análise relativamente longo, instabilidade do composto colorido

formado e alguns são métodos indiretos.

A partir das considerações descritas acima, a necessidade de métodos simples, rápidos,

de baixo custo e com baixo consumo de reagentes e solventes torna-se evidente,

especialmente para análises de controle de qualidade de furosemida, hidroclorotiazida,

propranolol, atenolol e metildopa.

A combinação da espectroscopia de reflectância difusa com spot test torna-se muito

atraente no desenvolvimento de métodos analíticos, uma vez que esta combinação fornece

medidas rápidas, simples, com baixo consumo de reagentes e solventes e baixa geração de

resíduos. Além disso, pouca atenção havia sido dada à espectroscopia de reflectância difusa

como técnica para análises quantitativas. Atualmente esta técnica tem sido empregada,

principalmente, em métodos para a análise de metais. No entanto, relatos do uso desta técnica

para análises de medicamentos ainda são incipientes.

60

Quando envolve reações rápidas e medidas diretas, a espectrofotometria de absorção

molecular na região do visível consiste de uma técnica muito útil para análises de fármacos.

Além disso, existe a possibilidade de se adaptar métodos espectrofotométricos para

dispositivo portátil de medidas fotométricas, tornando-os práticos para serem usados, por

exemplo, em farmácias de manipulação.

Desta forma, os objetivos deste trabalho foram:

• Desenvolver métodos analíticos para a determinação de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em formulações farmacêuticas por espectroscopia de

reflectância difusa utilizando spot test.

• Desenvolver método analítico para a determinação de metildopa em formulações

farmacêuticas por espectrofotometria na região do visível e adaptação do método para uso em

dispositivo portátil de medidas fotométricas.

• Aplicar os métodos desenvolvidos na análise de formulações farmacêuticas

disponíveis comercialmente e comparar os resultados obtidos pelos métodos propostos com

àqueles obtidos por métodos oficiais.

61

Capítulo IV - Espectroscopia de reflectância difusa em

combinação com spot test para análises quantitativas

62

IV. 1. SPOT TEST

Há muitas décadas os spot tests têm sido discutidos e explorados, principalmente, em

análises clínicas, testes de controle da qualidade do ar, em análises de água e alimentos, em

prospecções geoquímicas e em análises forenses (JUNGREIS, 1997). Os spot tests envolvem,

basicamente, a mistura de algumas gotas de uma solução contendo a substância de interesse

com algumas gotas de uma solução contendo o reagente formando um produto colorido. O

meio para a reação pode ser um suporte de superfície porosa, por exemplo, papel de filtro ou

sílica gel (JUNGREIS, 1997). Historicamente, Friedlieb Ferdinand Runge, químico alemão, é

considerado um dos importantes pioneiros no uso de papel de filtro como suporte para reações

químicas (ANFT, 1955). Schönbein e Goppelsroeder (1861) e Schiff (1859) também são

citados na literatura como pioneiros, mas a reação mais antiga descrita é àquela realizada por

Runge em 1822 (ANFT, 1955). Tal reação foi desenvolvida a partir de um estudo para avaliar

o poder de branqueamento de soluções alvejantes através de um teste para detectar a presença

de cloro em tais soluções. O teste ocorreu sobre uma superfície de papel de filtro impregnado

com amido e iodeto de potássio. Quando gotas da solução alvejante foram adicionadas sobre o

papel, uma mancha azul apareceu na superfície devido à liberação de iodo e sua reação com o

amido (ANFT, 1955). Esta é, provavelmente, a reação de spot test mais antiga utilizando

papel de filtro impregnado e antecede o teste desenvolvido por Schiff, o qual detectou ácido

úrico utilizando papel impregnado com carbonato de amônio (ANFT, 1955; JUNGREIS,

1997). Posteriormente, Fritz Feigl se destacou como um grande estudioso das análises por

spot test de substâncias orgânicas e inorgânicas, tendo estudado reações mais sensíveis e

seletivas e publicado diversos livros científicos (FEIGL, 1966, 1958).

Uma vez que os spot tests levam à formação de um produto colorido, eles podem ser

usados para análises qualitativas - quando a detecção da substância de interesse se dá

visualmente pela presença de cor; para análises semi-quantitativas – na quais escalas de cores,

63

feitas com padrões analíticos de diferentes concentrações, são utilizadas para comparação

com a intensidade de cor do teste e para análises quantitativas, utilizando, por exemplo,

instrumentos para medir a luz refletida, neste caso, a espectroscopia de reflectância difusa.

Para análises semi-quantitativas ou quantitativas, é importante que o procedimento para a

realização do spot test seja bem elaborado, visando à obtenção de uniformidade na cor da

mancha formada e, conseqüentemente, uma boa precisão das medidas. Detalhes importantes

da execução do spot test envolvem o controle do volume da solução a ser adicionada

utilizando micropipetas ou microsseringas e da velocidade da adição das soluções, bem como

a escolha da ordem de adição que resulte em maior uniformidade da mancha colorida formada

(GHAUCH et al., 2000; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; JUNGREIS, 1997).

O fato dos spot tests serem procedimentos especialmente rápidos, simples e que

apresentam baixo consumo de reagentes e solventes o tornam muito interessantes para o

desenvolvimento de métodos analíticos, principalmente do ponto de vista da Química Verde,

a qual tem interesse por métodos e técnicas que reduzem ou eliminam o uso e a geração de

substâncias prejudiciais à saúde humana ou ao meio ambiente (ANASTAS, 1999).

Atualmente, a espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot tests tem sido utilizada

com sucesso em análises quantitativas (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; DMITRIENKO et

al., 2002; FRITZ et al., 2003; GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a, 2004b; GHAUCH et al.,

1999, 2000; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTÍNEZ; CAMPÍNS-

FALCÓ, 2005; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ; CAMPÍNS-FALCÓ,

2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993; NARAYANASWAMY, 1993;

OLIVEIRA; SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; TUBINO; SOUZA,

2006; ZAPOROZHETS; GAWER; SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS et al., 1999;

ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).

64

IV. 2. ASPECTOS TEÓRICOS DA ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA

A percepção óptica dada por uma substância química é baseada em sua interação com

a luz. Absorção, emissão e reflexão ou espalhamento são os três fenômenos mais comumente

empregados para medidas analíticas (GHAUCH et al., 2000).

Ao contrário da espectroscopia de absorção que há muito tempo vêm apresentando

amplo uso como técnica de análise quantitativa, a espectroscopia de reflectância difusa tem

sido pouco estudada. Durante muitos anos, o uso da espectroscopia de reflectância difusa foi

limitado às áreas têxteis, de papel, cerâmica, tintas e pigmentos como técnica analítica de

controle de qualidade para avaliar cor, brancura e brilho das superfícies brancas ou coloridas.

Por exemplo, na indústria têxtil, durante a produção de tecidos tingidos, amostras de tecidos

são retiradas para avaliar se a tonalidade está sendo mantida, sempre tendo como referência o

espectro de reflectância. Na indústria de papel, além da cor, a brancura e brilho também são

avaliados (WENDLANDT; HECHT, 1966). A espectroscopia de reflectância difusa foi

considerada uma técnica inviável para análises quantitativas, uma vez que não era possível

alcançar boa precisão das medidas obtidas a partir de spot tests convencionais (KEALEY,

1972). De acordo com Kealey (1972) as medidas de reflectância obtidas a partir de spot tests

convencionais apresentavam precisão relativa entre 10 e 20% e, portanto, resultados

quantitativos foram considerados inviáveis. Entretanto, com os avanços tecnológicos na área

de dispositivos ópticos, incluindo fibras ópticas e esferas de integração, medidas de

reflectância puderam ser obtidas com bons resultados de precisão (GHAUCH et al., 2000;

TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997).

65

IV. 2.1. Fundamentos

Segundo as teorias discutidas por Wendlant e Hecht (1966) a reflexão da radiação

sobre uma superfície pode ser de dois tipos: especular ou tipo espelho e difusa. Para que se

possa utilizar a reflectância como técnica analítica é necessário entender os tipos de reflexão.

A reflexão especular ou tipo espelho ocorre em superfícies lisas ou polidas e pode ser

definida pela lei de reflexão de Fresnel. Neste tipo de processo os ângulos de incidência e de

reflexão são idênticos e não há transmissão da radiação através da superfície (WENDLANT;

HECHT, 1966).

Ao contrário da reflexão especular, a reflexão difusa acontece em superfícies foscas ou

opacas e ocorre por reflexões múltiplas a partir das superfícies das partículas que constituem o

meio. A reflexão difusa compreende um processo complexo que ocorre quando a radiação

penetra em um substrato sólido. Parte desta radiação retorna à superfície do substrato,

ocorrendo também dispersão múltipla e absorção parcial da radiação pelas partículas ou fibras

que constituem o substrato sólido (WENDLANT; HECHT, 1966).

A reflectância ou poder de reflexão (R) é dada por:

0IIR = , onde: (Equação 1)

R é o sinal que representa a radiação refletida e que pode ser registrado por detectores, tais

como uma fotomultiplicadora ou arranjo de fotodiodos.

=0I intensidade da radiação incidente

=I intensidade da radiação refletida

Os valores de R variam entre 0 e 1 e são normalmente expressos em termos de

reflectância percentual (%)R , isto é:

1000

×=IIR (Equação 2)

66

Considera-se R igual a 1 quando o sinal de reflectância é igual ao da radiação

incidente, condição que pode ser conseguida utilizando um padrão de reflectância máxima,

geralmente pastilhas de BaSO4 e MgO (WENDLANT; HECHT, 1966).

IV. 2.2. Teoria de Kubelka-Munk

Diversos modelos foram desenvolvidos para descrever, em termos quantitativos, a

intensidade da radiação refletida difusamente (SKOOG, 2002). A teoria de Kubelka-Munk é o

modelo mais aceito que relaciona concentração da amostra e reflectância. Esta teoria descreve

a relação entre coeficiente de absorção molar, coeficiente de dispersão e poder de reflectância

em um meio semi-infinito (infinitamente fino) de acordo com a seguinte equação:

sk

RRRf =

−=

.2)1()(

2

, onde: (Equação 3)

=k coeficiente de absorção molar

=s coeficiente de dispersão

Para amostras diluídas, k está relacionado à absortividade molar (ε) e à concentração

(C) pela relação:

Ck .303,2 ε= (Equação 4)

Para a aplicação adequada da equação de Kubelka-Munk é necessária a determinação

da reflectância absoluta do material usado como referência (REINECKE et al., 1988).

Entretanto, a relação linear entre )(Rf e concentração somente é observada na prática

para substâncias que absorvem fracamente e quando o tamanho das partículas que constituem

o meio é relativamente pequeno (1 μm de diâmetro interno) (FREI; MACNEIL, 1973).

Atualmente, diversos gráficos têm sido descritos para análises quantitativas envolvendo

transformações matemáticas da variável dependente (sinal) e/ou independente (concentração),

67

tais como: Rlog versus RC −2 ; R versus ])1/([ 2CC − ; Rlog versus C/1 ; e R versus

Clog (TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997).

Vale mencionar que em análises por espectroscopia de reflectância difusa, o sinal de

reflectância pode ser convertido em densidade óptica para medida de reflectância ( RA ), que é

dada por:

)/1log( RAR = (Equação 5)

III. 2.3. Instrumentos

Os instrumentos para medida de reflectância podem ser acessórios acoplados a um

espectrofotômetro ou podem ser equipamentos portáteis. Em geral, os instrumentos para

medidas de reflectância contêm os seguintes componentes: fonte de luz, suporte para amostra

e para padrão branco usado como referência, esfera de integração, espelhos, detector e

registrador. A Figura 6 apresenta um esquema de um acessório de reflectância Labsphere,

modelo RSA-HP-53.

Figura 6. Vista superior do acessório de reflectância Labsphere modelo RSA-HP-53

Fonte: LABSPHERE. RSA-HP-53 instruction manual. North Sutton, [1999?]. p. 4.

68

A esfera de integração consiste de uma esfera revestida internamente por uma camada

de material altamente refletor. Antigamente, as esferas de integração eram fabricadas com

material metálico revestido com tinta branca ou pó de MgO ou de BaSO4 prensado. Os

revestimentos utilizados atualmente são materiais brancos de politetrafluoroetileno (PTFE) ou

outros termoplásticos (Spectralon®) (STORM; SPRINSTEEN, 2006). As propriedades de

reflectância de uma amostra envolvem a determinação da distribuição espacial da radiação

refletida, com relação à intensidade e ao estado de polarização. A esfera de integração tem a

função de coletar e integrar espacialmente o fluxo de radiação refletida por uma superfície.

Assim, a intensidade da luz refletida em qualquer ponto da esfera corresponde à medida do

fluxo total de radiação refletida pela superfície. Desta forma é possível obter o fluxo de luz

refletida integrado total, o qual é utilizado para as medidas de reflectância (LABSPHERE,

2006).

Os equipamentos para medidas de reflectância podem apresentar esferas de integração

de diferentes tamanhos. Esferas com diâmetro interno maior são mais eficazes na integração

da luz e as medidas são mais exatas do que esferas de menor diâmetro interno. Os

equipamentos para medidas de reflectância também podem apresentar diferentes geometrias,

podendo levar a valores de reflectância diferentes para uma mesma amostra em dois

equipamentos com geometrias distintas. Isto ocorre devido a diferenças nos ângulos de

incidência e de reflexão, os quais são muito importantes para as medidas da reflectância

difusa (WENDLANDT; HECHT, 1966).

IV. 2.4. Representação do espectro de reflectância

Os espectros de reflectância podem ser apresentados de várias maneiras. Os gráficos

são comumente obtidos a partir de (%)R , )(Rf ou )/1(log( RAR em função do comprimento

de onda (nm). A Figura 7 apresenta três espectros obtidos a partir de um mesmo equipamento

69

para medidas de reflectância (acessório Labsphere, modelo DRA-CA-3300) e de um mesmo

papel de filtro colorido, sobre o qual ocorreu a reação entre bumetanida e p-

dimetilaminocinamaldeído, em meio ácido (POLLO, 2006), sendo que a Figura 7a representa

o espectro obtido a partir de (%)R , a Figura 7b o espectro de log (1/R) ( RA ) e a Figura 7c o

espectro de )(Rf versus comprimento de onda (nm).

Figura 7. Espectros de reflectância obtidos a partir do produto da reação de spot test entre butenamida

e p-dimetilaminocinamaldeído, em meio ácido. As análises foram realizadas utilizando um

acessório de reflectância Labsphere, modelo DRA-CA-3300. Concentração de butemanida

= 1,37 × 10-3 mol L-1. Figura 7a. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de %R.

Figura 7b. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de )/1log( R . Figura 7c.

Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de )(Rf

Comprimento de onda (nm)



(a)

(b)

(c)

70

Para compreender as diferenças entre os espectros apresentados na Figura 7, basta

converter (%)R em )(Rf e em )/1log( R , de acordo com as Equações 3 e 5. Desta forma,

pode-se entender porque o espectro de R (Fig. 7a) deve apresentar-se invertido em relação aos

outros espectros (Fig. 7b e 7c).

III. 2.5. Aplicações da espectroscopia de reflectância difusa para análises

quantitativas

Diversos métodos por espectroscopia de reflectância difusa, na região do visível, para

análises quantitativas têm sido descritos na literatura (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003;

BEROZA; HILL; NORRIS, 1968; BRADDOCK; MAREC, 1966; DMITRIENKO et al.,

2002; FRITZ et al., 2003; FRODYMA; FREI, 1964, 1965, 1969; GAZDA; FRITZ; PORTER,

2004a, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; KEALEY, 1972, 1974, 1976, 1977; KIRK;

MOSS; VALENTIN, 1968; LIEU et al., 1967; LIEU; ZAYE; FRODYMA, 1969; LIEU;

FRODYMA, 1966; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTÍNEZ;

CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ;

CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993;

NARAYANASWAMY; SEVILLA III; 1986; NARAYANASWAMY, 1993; OLIVEIRA;

SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; TUBINO; SOUZA, 2006;

ZAPOROZHETS; GAWER; SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS et al., 1999;

ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002; ZAYE; FREI; FRODYMA, 1967). O gráfico

apresentado na Figura 8 apresenta o resultado de um levantamento realizado, no período de

1960 até 2006, nas principais bases de dados, sobre métodos que empregaram a

espectroscopia de reflectância difusa, na região visível do espectro, para análises

quantitativas.

71

Figura 8. Distribuição das publicações de métodos por espectroscopia de reflectância difusa na região

do visível para análises quantitativas. Período: 1960-2006.

Podemos observar (Figura 8) que muitos artigos foram publicados na década de 60 e,

talvez pela dificuldade em obter resultados com boa precisão naquela época, o número de

publicações diminuiu e só voltou a aumentar na década de 90, provavelmente, devido aos

avanços tecnológicos e à facilidade de se obter medidas mais precisas, além da preocupação

em se desenvolver métodos simples, rápidos e com baixo consumo de reagentes e solventes.

Atualmente, o número de publicações envolvendo a espectroscopia de reflectância difusa na

região do visível para análises quantitativas vem aumentando consideravelmente (Figura 8).

Algumas destas análises envolvem a determinação de metais sobre superfície de papel de

filtro (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; TUBINO; ROSSI;

MAGALHÃES, 1997).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Núm

ero

de p

ublic

açõe

s

60 70 80 90 2000-2006

Décadas

72

O método descrito por Tubino, Rossi e Magalhães (1997) foi proposto para a

determinação de Fe(III), Cr(VI) e Ni(II). Ghauch et al. (1999) descreveram um método

semelhante para a determinação de Co(II), Cu(II), Fe(III) e Ni(II). Fosfato, amônio e Cu(II)

também foram determinados por espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot test em

papel de filtro (GHAUCH et al., 2000).

A espectroscopia de reflectância difusa associada à extração em fase sólida (EFS)

também tem sido descrita na literatura. Gazda, Fritz e Porter (2004b) desenvolveram um

método para a determinação de Ni (II) em amostras de água a bordo da Estação Espacial

Internacional. Outros métodos utilizando EFS acoplada a espectroscopia de reflectância difusa

foram propostos para a quantificação de aminas alifáticas (MOLINER-MARTÍNEZ;

CAMPÍNS-FALCÓ, 2005), iodo (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a) e iodeto, Ag (I), Cu

(II), Ni (II), Fe (III), Cr (VI) e outros cátions (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; FRITZ et al.,

2003; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ; CAMPÍNS-FALCÓ, 2005) em

amostras de água. Sílica gel impregnada com reagentes analíticos também tem sido associada

à espectroscopia de reflectância difusa para a determinação de diversos metais

(NADZHAFOVA et al., 2005; ZAPOROZHETS et al., 1999; ZAPOROZHETS; GAWER;

SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).

Além disso, a espectroscopia de reflectância difusa tem oferecido a possibilidade da

construção em laboratório de dispositivos portáteis para análises quantitativas (MATIAS;

OLIVEIRA; MOSCHIM, 1997; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003). Um sensor de fibra óptica

portátil foi desenvolvido por Matias, Oliveira e Moschim (1997) para analisar a fumaça

proveniente de motores de veículos a diesel. O sensor funciona por amostragem da fumaça

sobre a superfície de uma fita adesiva branca, seguida da medida da luz refletida pela fita

marcada. Um outro dispositivo portátil empregando o fenômeno da reflectância difusa foi

desenvolvido para a determinação de Ni (II) em catalisadores (MATIAS; VILA; TUBINO,

73

2003). O método foi baseado na clássica reação entre Ni (II) e dimetilglioxima, em meio

alcalino (NH4OH), a detecção foi realizada por um LDR (light dependent resistor) e a medida

da resistência por um multímetro, a qual foi correlacionada com a reflectância.

Recentemente, a espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot test sobre papel

de filtro foi empregada para a determinação de alguns fármacos em formulações

farmacêuticas (GOTARDO et al., 2004; GOTARDO; PEZZA; PEZZA, 2005; MATIAS;

VILA; TUBINO, 2004; TUBINO; SOUZA, 2006).

O método descrito por Matias, Vila e Tubino (2004) para a determinação de ácido

acetilsalicílico envolveu uma reação de complexação do ácido salicílico, obtido a partir da

hidrólise alcalina do fármaco, com íons Fe (III). O complexo colorido foi submetido à análise

em um reflectômetro homemade, composto por um LED (light emitting diode) e um LDR e

medidas de resistência foram obtidas. Um método utilizando um reflectômetro semelhante foi

descrito por Tubino e Souza (2006) para a determinação de diclofenaco em formulações

farmacêuticas.

Os estudos citados acima revelaram que o uso apropriado da espectroscopia de

reflectância difusa forneceu resultados quantitativos confiáveis, demonstrando o potencial

desta técnica para análises quantitativas.

74

Capítulo V. Desenvolvimento de métodos analíticos por

espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot

test para a determinação de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em

formulações farmacêuticas.

75

V. 1. PARTE EXPERIMENTAL

V. 1.1. Equipamentos

Acessório para reflectância Labsphere RSA-HP-53, contendo esfera de integração (76

mm de diâmetro interno) e lâmpada de tungstênio-halogênio (5W), acoplado a um

espetrofotômetro de arranjo de diodos HP-8453A.

Os métodos de referência foram realizados utilizando espectrofotômetro UV-Visível

Cary 1E, com cubetas de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico.

Estufa com controle de temperatura - Tecnal, Modelo TE-392.

Agitador magnético Corning.

Micropipetas Eppendorf (10 a 100 μL) e Brand (100 a 1000 μL).

V. 1.2. Material e Solventes

Papel de filtro quantitativo Whatman 41 e 42 foram usados como suporte sólido no

método para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente. Papel de

filtro qualitativo Whatman 42 foi usado nos métodos para a determinação de propranolol e

atenolol.

Os excipientes utilizados nos estudos de interferências foram de grau farmacêutico.

Os solventes utilizados nos métodos para a determinação de furosemida e

hidroclorotiazida foram acetona (grau p.a.) e metanol (grau HPLC) (Mallinckrodt, Xalostoc,

México). No método para a determinação de atenolol foi usado metanol grau HPLC (J.T.

Baker, Phillipsburg, EUA) e dioxano (grau p.a.) (Tedia, Fairfield, EUA). Os solventes usados

no método para a determinação de propranolol foram acetona (grau p.a.), etanol (grau HPLC)

(Mallinckrodt, Xalostoc, México) e água desionizada.

76

V. 1.3. Reagentes e Soluções

Nos métodos para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida, p-

dimetilaminocinamaldeído (PDAC) (p.a., Riedel-de haën, Alemanha) foi usado para preparar

a solução de PDAC 2,23 × 10-1 mol L-1 em metanol. Esta solução foi mantida refrigerada por,

no máximo, uma semana. Soluções de ácido clorídrico 6,3% (m/v) (1,73 mol L-1) e 10% (m/v)

(2,75 mol L-1) foram preparadas por diluição adequada do ácido clorídrico concentrado (37%)

(p.a., Mallinckrodt, Xalostoc, México) em metanol e empregadas nos métodos para a

determinação de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente.

No método para a determinação de atenolol foi utilizado p-cloranil (Sigma, St Louis,

EUA) no preparo de uma solução 8,00 × 10-2 mol L-1 em dioxano. Esta solução foi preparada

diariamente.

No método para a determinação de propranolol, 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida

(DCQ) ou reagente de Gibbs (p.a., Sigma, St. Louis, E.U.A.) foi usado para preparar uma

solução 3,33 × 10-1 mol L-1 (70 mg/ml) em acetona. Esta solução foi preparada diariamente.

Solução estoque de furosemida (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de

100,1%, foi preparada na concentração de 1,52 × 10-1 mol L-1 em acetona. Soluções padrão

foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de furosemida em acetona e usadas na

construção da curva analítica (7,56 × 10-3 a 6,05 × 10-2 mol L-1).

Solução estoque de hidroclorotiazida (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de

99,85%, foi preparada na concentração de 1,68 × 10-1 mol L-1 em acetona. Soluções padrão

foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de hidroclorotiazida em acetona e

usadas na construção da curva analítica (3,36 × 10-2 a 1,01 × 10-1 mol L-1).

Solução estoque de propranolol (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de

99,80%, foi preparada na concentração de 1,68 × 10-1 mol L-1 em solução de etanol 35% (v/v)

em água. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de

77

propranolol em etanol 35% (v/v) e usadas na construção da curva analítica (1,35 × 10-2 a 8,45

× 10-2 mol L-1).

Solução estoque de atenolol (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de 99,90%,

foi preparada na concentração de 2,25 × 10-1 mol L-1 em metanol. Soluções padrão foram

obtidas a partir de diluições da solução estoque de atenolol em metanol e usadas na

construção da curva analítica (1,13 × 10-2 a 7,88 × 10-2 mol L-2).

Todas as soluções estoque foram preparadas no momento do uso.

V. 1.4. Amostras

As amostras comerciais das formulações farmacêuticas (comprimidos) analisadas

foram obtidas em farmácias locais e analisadas dentro dos seus prazos de validade.

O número de marcas comerciais de formulações farmacêuticas analisadas para cada

um dos fármacos estudados e o conteúdo de fármaco declarado pelo fabricante em cada

comprimido estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Número de marcas comerciais de formulações farmacêuticas analisadas em cada método

desenvolvido e conteúdo declarado de fármaco por comprimido.

Furosemida Hidroclorotiazida Propranolol Atenolol

Nº Marcas Analisadas 6 6 6 5

Conteúdo Declarado

(mg/comprimido)

40 50 40 25, 50 e 100

78

V. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

V. 2.1. Spot test

Para a realização dos spot tests, as soluções foram adicionadas sobre a superfície de

papel de filtro, cortado em quadrados com área de, aproximadamente, 2 cm2. O papel foi

colocado na parte inferior de um suporte (Figura 9), de acordo com o procedimento descrito

por Tubino, Rossi e Magalhães (1997) com o auxílio de uma pinça. As soluções foram

adicionadas no centro do papel de filtro utilizando uma micropipeta adaptada ao suporte.

Figura 9. Suporte utilizado na realização dos spot tests (Baseado em: TUBINO; ROSSI;

MAGALHÃES, 1997).

A seguir são descritos os procedimentos para a realização dos spot tests em cada

método desenvolvido:

Furosemida:

Inicialmente, 10 μL da solução contendo o fármaco foram adicionados sobre a

superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de HCl (6,3%, m/v) e de

20 μL da solução de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. Em seguida, o papel de filtro foi

aquecido a 80ºC por 5 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento

foi necessário para a formação do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de

reflectância difusa em 585 nm.

79

Hidroclorotiazida:


superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de HCl (10%, m/v) e de

20 μL da solução de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. O papel de filtro foi então aquecido a

80ºC por 8 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento foi

necessário para a formação do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de

reflectância difusa em 585 nm.

Propranolol:


superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 30 μL da solução de DCQ (3,33 × 10-1 mol

L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 500 nm.

Atenolol:


superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de p-cloranil (8,00 × 10-2

mol L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 550

nm.

V. 2.2. Preparação das Amostras

Em todos os métodos desenvolvidos, vinte comprimidos (do mesmo lote), de cada

uma das amostras comerciais estudadas, foram pesados em balança analítica e finamente

triturados em gral de ágata. O valor da massa de um comprimido foi expresso como a média

de 20 determinações, com variação menor que 2% (FARMACOPÉIA..., 1988).

80

Quantidades de amostra equivalentes a 100, 150, 80 e 120 mg de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram pesadas com precisão de

0,0001 g e submetidas à agitação com o solvente adequado (acetona para furosemida e

hidroclorotiazida; etanol 35% (v/v) para propranolol e metanol para atenolol) em um agitador

magnético por 10 minutos. Após a agitação, as soluções foram adicionadas em balões

volumétricos de 10,00 mL e o volume foi completado com o solvente adequado. Alíquotas

destas soluções foram retiradas para a realização dos spot tests, conforme descrito no item

V.2.1. O branco contendo apenas o solvente e os reagentes foi utilizado como referência e

analisado nas mesmas condições.

V. 2.3. Estudo de Interferências

Uma vez que o objetivo deste trabalho foi determinar o fármaco (furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol) em formulações farmacêuticas (comprimidos), o

efeito dos excipientes mais comumente utilizados foi cuidadosamente avaliado.

Em todos os métodos desenvolvidos, os excipientes estudados foram amido, talco,

lactose, estearato de magnésio, etilcelulose, dióxido de silício e croscarmelose sódica. No

método para a determinação de atenolol foram ainda estudados os excipientes lauril sulfato de

sódio e celulose microcristalina.

O procedimento para o estudo de interferências, em todos os métodos desenvolvidos, é

descrito a seguir:

Uma determinada quantidade de fármaco (50, 120, 80 ou 120 mg de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol, respectivamente) e cada um dos excipientes,

separadamente, em quantidade igual e dez vezes maior à de fármaco foram submetidos ao

procedimento descrito no item V. 2.2.

81

V. 2.4. Estudo de Adição e Recuperação

Em todos os métodos desenvolvimentos foi realizado um estudo de adição e

recuperação de fármaco padrão, o qual envolveu o seguinte procedimento:

Às amostras contendo massa equivalente a 50, 100, 80 e 60 mg de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram adicionadas quantidades de

fármaco padrão, de forma a se obter soluções com concentrações finais que abrangessem a

faixa de linearidade da curva analítica (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). Para todos

os métodos, as quantidades adicionadas de fármaco padrão corresponderam a 50, 100, 150 e

200% da massa de fármaco presente na amostra. Ao béquer contendo amostra e fármaco

padrão foi adicionado o solvente adequado, seguindo o procedimento descrito no item V. 2.2.

A Tabela 8 apresenta as quantidades - em massa (mg) e em concentração final (mol L-1) - de

fármaco padrão adicionado nas amostras.

Tabela 8. Quantidades adicionadas de fármaco padrão dadas em mg e em concentração (mol L-1).

Quantidades adicionadas de fármaco padrão Fármaco (mg) (mol L-1)

Furosemida 25 50 75 100

7,56 × 10-3 1,51 × 10-2 2,27 × 10-2 3,02 × 10-2

Hidroclorotiazida

50 100 150 200

1,68 × 10-2 3,36 × 10-2 5,04 × 10-2 6,72 × 10-2

Propranolol

40 80 120 160

1,35 × 10-2 2,70 × 10-2 4,05 × 10-2 5,40 × 10-2

Atenolol

30 60 90 120

1,13 × 10-2 2,25 × 10-2 3,38 × 10-2 4,50 × 10-2

82

V. 2.5. Determinação de peróxido de hidrogênio em dioxano: método modificado

No desenvolvimento do método reflectométrico para a determinação de atenolol foi

realizada a quantificação de peróxido de hidrogênio no dioxano utilizado como solvente para

o p-cloranil. Para tal, foi inicialmente empregado o método espectrofotométrico descrito por

Benatsky e Tomik (1988) para determinação de peróxidos em solventes orgânicos, o qual é

baseado na reação de peróxido com metavanadato de amônio e ácido nítrico concentrado,

formando um composto colorido (λ máx. = 450 nm) (BENATSKY; TOMIK, 1988). Entretanto,

durante o emprego do método observou-se que a etapa de extração descrita não era necessária,

uma vez que o dioxano e a solução contendo metavanadato de amônio misturaram-se de

forma homogênea. Além disso, a quantidade de peróxido na amostra de dioxano não era

conhecida. Desta forma, a quantificação foi realizada pelo método das adições de padrão e

com algumas modificações no método descrito na literatura (BENATSKY; TOMIK, 1988),

como segue:

A solução reagente foi preparada a partir da dissolução de 0,6250 g de metavanadato

de amônio em 3,75 mL de ácido nítrico concentrado. O volume foi completado com água

desionizada em balão volumétrico de 25,00 mL. A 5,00 mL de amostra de dioxano foram

adicionados individualmente 0,50, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 mL de uma solução padronizada de

peróxido de hidrogênio (2,37 × 10-2%, m/m). Em seguida, adicionou-se 10,00 mL da solução

de reagente e o volume foi completado para 25,00 mL em balão volumétrico. As soluções

foram analisadas por espectrofotometria em 450 nm.

83

V. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

V. 3.1. Determinação de furosemida em formulações farmacêuticas

V. 3.1.1. Spot test

O método proposto foi baseado em medidas de reflectância, na região visível do

espectro, do composto violeta formado a partir da reação entre furosemida e PDAC, em meio

ácido (HCl). A reação ocorreu sobre superfície de papel de filtro, após aquecimento a 80ºC

por 5 minutos. A Figura 10 apresenta o espectro de reflectância com valor máximo de AR em

585 nm.

Figura 10. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre furosemida e PDAC, em meio

ácido, após aquecimento a 80ºC por 5 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm.

Solução padrão de furosemida: 3,78 × 10-2 mol L-1.

O PDAC tem apresentado um amplo uso como reagente cromogênico em análises

espectrofotométricas de diversos compostos, tais como: uréia, tiouréia e seus N-alquil/aril

derivados (HUSSAIN; SHAUKAT, 2002), aceclofenaco (ZAWILLA et al., 2002),

diclofenaco de sódio (EL-SHERIF et al., 1997), oxifenbutazona (SAEED; HAQUE;

400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

AR


84

QURESHI, 1993), glafenina e metoclopramida (MOUSSA, 2000). O PDAC também tem sido

usado para análises, em micro-placas, de ácido p-aminohipúrico em amostras de plasma e

urina (AGARWAL, 2002) e para testes rápidos de benzodiazepinas em medicamentos

(LAUDSZUN; KOVAR, 1991). A maioria dos métodos mencionados acima envolve reação

em meio ácido com aquecimento, produzindo compostos coloridos (variando de laranja a

vermelho ou rosa).

O PDAC também foi descrito na literatura para a determinação espectrofotométrica de

furosemida (SHIMDDA; NAGASE, 1977). Uma provável reação entre aminas secundárias

aromáticas e PDAC envolve a condensação do grupo amino secundário protonado com o

grupo carbonila do reagente, formando um sal imínio ou base de Schiff (EL-SHERIF et al.,

1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000). A reação apresentada no Esquema 1 foi

baseada em reações entre outras aminas secundárias aromáticas e PDAC descritas na

literatura (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000).

85

Esquema 1

Um fato interessante no método para a determinação de furosemida foi que a cor do

spot test obtido a partir da adição da solução de furosemida, PDAC e HCl, nesta ordem, foi

mais intensa nas bordas do que no centro da mancha formada. Observou-se também que

quando a solução de reagente foi adicionada por último, a cor do spot test foi mais uniforme e

muito mais intensa.

Sal Imínio

Cl

H2NO2S

NHCH2

COOH

OH+

OCH2

Cl

H2NO2S COOH

NH2+

+CH3

Ch3CHOCH NCH

Rápido

Cl

H2NO2S COOH

OCH2

NH NCHCHCCH3

CH3

++HO

H

Rápido+

NH

OCH2

Cl

H2NO2S COOH

+ CH3

CH3CHC

H

OHNCH

NCHCHCCH3

CH3

Cl

H2NO2S COOH

OCH2

NH

Rápido

OCH2

Cl

H2NO2S

N

COOH

CH3

CH3NCHC CH+

+

Furosemida PDAC

86

De acordo com Wendlandt e Hecht (1966) a cor do spot test deve ser uniforme sobre

toda a superfície sólida para se obter melhor precisão das medidas de reflectância. Neste

sentido, cabe ressaltar que para a elaboração dos spot tests envolvidos em todos os métodos

desenvolvidos neste trabalho levou-se em consideração alguns detalhes, tais como: ordem e

velocidade de adição das soluções, qualidade do papel de filtro utilizado e volume das

soluções adicionadas. Todos estes detalhes mostraram ser importantes para a uniformidade da

cor do spot test e, conseqüentemente, para a obtenção de boa precisão das medidas de

reflectância.

V. 3.1.2. Planejamento Fatorial de Experimentos

Estudos foram realizados para estabelecer as condições mais favoráveis para a reação

entre furosemida e PDAC, em meio ácido (HCl), visando alcançar a intensidade máxima da

cor do spot test, sobre papel de filtro, em 585 nm. Uma vez que a necessidade de aquecimento

para o desenvolvimento da cor foi observada, os fatores inicialmente estudados foram tempo e

temperatura de aquecimento. Utilizando um planejamento fatorial de 2 níveis em torno das

condições utilizadas para a reação em testes preliminares (10 μL de solução de furosemida

3,02 × 10-2 mol L-1, 10 μL de solução de HCl 6,3%, m/v, 10 μL de solução de PDAC 0,4%

m/v e aquecimento à aproximadamente 70ºC por 3 minutos) foi possível variar os dois fatores

(tempo e temperatura de aquecimento) simultaneamente. A partir dos resultados obtidos neste

planejamento, foi realizado um planejamento de modo similar, no qual os fatores avaliados

foram volumes adicionados de PDAC e de HCl. Desta forma, os valores de AR (respostas)

obtidos com volumes fixos das soluções de furosemida, PDAC e de ácido adicionados foram

otimizados em função do tempo e da temperatura de aquecimento. Do mesmo modo, para

tempo e temperatura de aquecimento e volume de furosemida fixos, as respostas (AR) foram

otimizadas em função dos volumes adicionados de PDAC e de ácido. As condições avaliadas

87

e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 9. Cada experimento foi realizado em

três repetições. Brancos de reagentes correspondentes a cada um dos experimentos foram

realizados.

Tabela 9. Combinações das variáveis estudadas e resultados dos planejamentos 22 com ponto central.

Aquecimento Volume Adicionado (μL)

Tempo (min.)

Temperatura (ºC) AR

a HClb PDACc ARa

5 60 0,25056 20 10 0,44373

5 80 0,42155 20 20 0,50385

3 70 0,32493 15 15 0,46108

2 60 0,21077 10 10 0,42623

2 80 0,36943 10 20 0,47133 a Média de 3 determinações b HCl 6,3% (m/v) em metanol c PDAC 0,4% (m/v) em metanol

Os resultados obtidos nos planejamentos fatoriais foram representados em gráficos

tridimensionais, conforme Figura 11.

88

Figura 11. Gráficos tridimensionais obtidos para estabelecer condições ótimas de tempo e temperatura

de aquecimento (A) e de volumes de PDAC e de ácido adicionados (B).

Comparações entre médias foram realizadas utilizando ANOVA e a significância

estatística das diferenças entre as médias foi estimada utilizando teste de Tukey (p≤0,05). Os

resultados demonstraram que as maiores medidas de reflectância sem perda de uniformidade

da cor foram obtidas com aquecimento a 80ºC por 5 minutos, diferindo significativamente

daquelas obtidas com outros tempos de aquecimento e temperaturas. Cabe mencionar que spot

tests obtidos com aquecimento a 90ºC apresentaram reversão de cor do papel e não puderam

ser analisados. Por esta razão, o planejamento foi descontinuado. A partir dos resultados do

planejamento para avaliar volumes de PDAC e de HCl adicionados foi constatado que as

medidas de reflectância obtidas com 20 μL de PDAC e 20 μL de HCl foram

significativamente maiores do que as outras condições estudadas. Analisando os gráficos

tridimensionais é possível observar pontos referentes às condições escolhidas, as quais

mostraram os maiores valores de reflectância (Figura 11).

(A) (B)

89

V. 3.1.3. Estabilidade Óptica

Com o objetivo de avaliar a estabilidade óptica do produto da reação entre furosemida

e PDAC, em meio ácido, foi realizado um acompanhamento cinético do valor de AR em 585

nm a cada 5 minutos até 40 minutos após a adição das soluções no papel de filtro. Os

resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa entre os valores de AR

obtidos nos diferentes períodos de tempo estudados. Portanto, a estabilidade óptica do produto

formado foi de, pelo menos 40 minutos, nas condições estudadas (Figura 12).

Figura 12. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre furosemida e PDAC, em meio

ácido, após aquecimento a 80ºC por 5 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm.

Solução padrão de furosemida: 3,78 × 10-2 mol L-1.

V. 3.1.4. Curva Analítica

A Figura 13 apresenta a curva analítica construída a partir de soluções padrão de

furosemida na faixa de concentração de 7,56 × 10-3 a 6,05 × 10-2 mol L-1. Uma relação linear

(r = 0,9987) foi obtida pela representação gráfica de AR versus log da concentração de

furosemida (mo L-1). O fator 103 foi usado para ajustar a curva analítica com valores de log

maiores do que zero. Valores de AR para esta faixa de concentração foram ajustados pela

5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

AR

Tempo (minutos)

90

equação: AR = -0,17768 + 0,41338 × C, onde C = log [furosemida] × 103 (mol L-1). O limite

de detecção foi 1,05 × 10–3 mol L-1 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×

aDPB3 , sendo a = coeficiente angular da curva

analítica e BDP = desvio padrão do branco para 10 repetições (LONG; WINEFORDNER,

1983).

Figura 13. Curva analítica para a determinação de furosemida. Coeficiente de correlação linear (r) =

0,9987. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Faixa de concentração das soluções

padrão de furosemida: 7,56 × 10-3 a 6,05 × 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios

padrão para 3 repetições.

V. 3.1.5. Estudo de Interferências

O estudo de interferências foi realizado visando avaliar o efeito dos excipientes mais

comumente presentes na amostra. A porcentagem de furosemida encontrada nas soluções

contendo o fármaco padrão e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 96 a 104%, com

coeficientes de variação menores que 5% para três repetições. Esses resultados foram

considerados aceitáveis e, portanto, nenhuma interferência foi constatada a partir destes

excipientes, nas condições estudadas.

0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

AR

log ([furosemida]/mol L-1 x 103)

91

V. 3.1.6. Estudo de Adição e Recuperação

Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulação farmacêutica, a qual contém

todos os excipientes juntos) foram realizados testes de adição e recuperação de fármaco

padrão utilizando 3 amostras de diferentes marcas comerciais de comprimidos. Os resultados

obtidos estão apresentados na Tabela 10. Para todas as amostras, os valores médios de

recuperação (n=3) variaram de 96,7 a 104,6%, com desvios padrão relativos entre 2,1 a 5,1%.

Essas variações foram consideradas aceitáveis, indicando que os componentes das

formulações farmacêuticas analisadas não influenciaram nas análises.

Tabela 10. Resultados de recuperação de furosemida padrão adicionada em amostras de três

formulações farmacêuticas comerciais diferentes.

Amostras Valor Adicionado (mol L-1)

Valor Encontradoa

(mol L-1) Recuperaçãoa

(%)

A -

7,56 × 10-3

1,51 × 10-2

2,27 × 10-2

3,02 × 10-2

(1,51±0,07) × 10-2

(7,39±0,35) × 10-3

(1,46±0,05) × 10-2

(2,21±0,08) × 10-2

(3,02±0,14) × 10-2

-

97,8 ±4,6

96,7±3,3

97,4±3,5

100,0±4,6

B -

7,56 × 10-3

1,51 × 10-2

2,27 × 10-2

3,02 × 10-2

(1,50±0,04) × 10-2

(7,42±0,24) × 10-3

(1,58±0,05) × 10-2

(2,21±0,10) × 10-2

(2,97±0,06) × 10-2

-

98,1±3,1

104,6±3,3

97,4±4,4

98,3±2,0

C -

7,56 × 10-3

1,51 × 10-2

2,27 × 10-2

3,02 × 10-2

(1,51±0,05) × 10-2

(7,51±0,38) × 10-3

(1,48±0,06) × 10-2

(2,25±0,11) × 10-2

(3,05±0,13) × 10-2

-

99,3±5,1

98,0±4,0

99,1±4,9

101,0±4,3 a Média ± Desvio padrão (DP), n = 3.

92

V. 3.1.7. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência.

O método proposto foi aplicado na determinação de furosemida em algumas

formulações farmacêuticas disponíveis comercialmente e comparado com o método para a

determinação de furosemida em comprimidos descrito na Farmacopéia Britânica

(BRITISH…, 2001), o qual é baseado em medidas por espectrofotometria no UV (271 nm) e

envolve sucessivas diluições da amostra com NaOH 0,1 mol L-1. As análises foram realizadas

em três repetições e os resultados estão apresentados na Tabela 11.

Tabela 11. Determinação de furosemida em formulações farmacêuticas comerciais.

Método Proposto Método de Referência

Amostrasa Valor Encontradob

(mg/comprimido)

Valor de t

(2,78)c

Valor de F

(19,00)c

Valor Encontradob

(mg/comprimido)

A 39,4±0,5 1,72 1,96 39,6±0,7

B 39,6±1,1 0,45 3,31 40,2±2,0

C 40,8±1,5 0,09 1,86 40,9±1,1

D 39,3±1,5 1,17 1,78 41,0±2,0

E 39,2±1,0 0,97 4,00 39,4±0,5

F 39,3±0,8 0,72 2,56 39,2±0,5 a Valor Declarado: 40mg furosemida/comprimido. b Média ± Desvio padrão (DP), n=3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

Os valores médios de furosemida obtidos pelo método proposto variaram de 39,2 a

40,8 mg/comprimido e os desvios padrão de 0,5 a 1,5 mg/comprimido (Tabela 11). Para todas

as formulações analisadas, os resultados obtidos pelo método de referência e pelo método

proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nível de confiança de 95%. Em

todos os casos, os valores de t e de F calculados não excederam os valores teóricos, indicando

que não houve diferença significativa entre os métodos com relação à precisão e exatidão

(Tabela 11).

93

V. 3.1.8. Conclusões

Este estudo revelou, pela primeira vez, a possibilidade de se empregar a

espectroscopia de reflectância difusa, na região do visível, utilizando spot test na

determinação de furosemida em formulações farmacêuticas. A ordem de adição e os volumes

das soluções de PDAC e de HCl influenciaram significativamente a reação. As melhores

condições para a reação foram obtidas a partir de 10 μL de solução de furosemida, 20 μL da

solução de HCl e 20 μL da solução de PDAC, nesta ordem de adição, e aquecimento a 80ºC

por 5 minutos. Este método foi aplicado com sucesso na análise de furosemida em amostras

de comprimidos de diferentes marcas comerciais. A espectroscopia de reflectância difusa

utilizando spot test oferece vantagens sobre outras técnicas usadas atualmente como

simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes. Assim, o desenvolvimento de métodos

por espectroscopia de reflectância difusa para a análise de medicamentos é encorajado neste

estudo.

94

V. 3.2. Determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas

V. 3.2.1. Spot test

O método proposto foi baseado em medidas de reflectância, na região do visível, do

composto rosa formado a partir da reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio ácido

(HCl). A reação ocorreu sobre superfície de papel de filtro, com aquecimento a 80ºC por 8

minutos. A Figura 14 apresenta o espectro de reflectância com valor máximo de AR em 585

nm.

Figura 14. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em

meio ácido, após aquecimento a 80ºC por 8 min. O comprimento de onda máximo foi 585

nm. Solução padrão de hidroclorotiazida: 4,20 × 10–2 mol L-1.

Este trabalho descreve, pela primeira vez, o uso de PDAC como reagente cromogênico

para a determinação de hidroclorotiazida. Uma provável reação entre hidroclorotiazida e

PDAC é apresentada no Esquema 2, tendo como base aquelas descritas na literatura para a

determinação de aminas secundárias aromáticas (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al.,

2002; MOUSSA, 2000), as quais envolvem a condensação do grupo amino secundário

400 500 600 700 8000,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

AR


95

protonado com o grupo carbonila do PDAC, formando um sal imínio ou base de Schiff

(Esquema 2).

H2NO2S

Cl

SNH

NH

O2

H+O2

H2NO2S

Cl

SNH2

NH

+

+ NCHCHOCHCh3

CH3

Rápido

H2NO2S

Cl

SNH

NH

O2 CH3

Ch3CHC

HNCH+

+OH

NCHCh3

CH3O2H2NO2S

Cl

SNH

NHH

OHC CH

Rápido

+

Lento

+O2 CH3

Ch3NCH

H2NO2S

Cl

SNH

NH

CH CHH2NO2S

Cl

SN

NHCh3

CH3O2

NCHCH CH+

Hidroclorotiazida PDAC

Esquema 2

Sabendo que a ordem de adição das soluções pode influenciar a uniformidade e a

intensidade da cor do spot test, este detalhe foi considerado, estudando-se todas as possíveis

combinações de ordens de adição das soluções. Da mesma forma que no método para a

determinação de furosemida, foi observado que o spot test apresentou uma cor mais uniforme

e intensa quando a solução do analito foi inicialmente adicionada, seguida pela adição da

solução do ácido e, por último, da solução de reagente.

Sal Imínio ou Base de Schiff

96


V. 3.2.2.1. Planejamento Fatorial Fracionário: triagem de fatores

Presumindo que a reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio ácido (HCl)

poderia ser influenciada por vários fatores, as condições mais favoráveis para a reação sobre

papel de filtro foram investigadas visando alcançar a intensidade máxima da cor em 585 nm.

Planejamento fatorial fracionário permitiu o estudo simultâneo dos efeitos que diversos

fatores poderiam ter sobre a reação de spot test. Os fatores avaliados foram: tempo de

aquecimento, temperatura de aquecimento, volume de ácido e volume de reagente. Todos os

experimentos foram realizados com solução padrão de hidroclorotiazida com concentração de

6,72 × 10-2 mol L-1. Brancos de reagentes correspondentes a cada um dos experimentos foram

realizados. A Tabela 12 apresenta a matriz de planejamento e os valores de AR obtidos no

planejamento fatorial fracionário para cada um dos experimentos.

Tabela 12. Matriz do planejamento fatorial fracionário.

Fatores

Experimentos Temperatura (ºC)

Tempo (min.)

Volume de Ácido (μL)a

Volume de PDAC (μL)b

AR

1 60 10 20 10 0,18859

2 60 5 20 20 0,17124

3 60 5 10 10 0,17355

4 90 5 10 20 0,19092

5 60 10 10 20 0,18475

6 90 10 20 20 -

7 90 10 10 10 -

8 90 5 20 10 0,19232 a Solução de HCl 10% (m/v) b Solução de PDAC 0,4% (m/v)

97

Deve-se mencionar que houve dificuldades para se realizar todos os experimentos,

uma vez que o papel não resistiu a temperaturas relativamente elevadas (próximas a 90ºC),

ocorrendo reversão de cor do papel e o espectro de reflectância do produto colorido foi

diferente daquele apresentado pelo composto rosa formado com aquecimento em

temperaturas mais baixas. Por esta razão, os experimentos 6 e 7 (Tabelas 12) não foram

executados.

A partir dos resultados do planejamento fatorial fracionário, o gráfico de Pareto

(Figura 15) foi obtido para visualização dos efeitos estimados dos fatores principais. Embora

nenhum dos fatores tivesse influência significativa – nenhuma barra (fator) ultrapassou a linha

de significância – pode ser notado que os efeitos estimados dos fatores tempo e temperatura

de aquecimento foram maiores do que os fatores volume de ácido e volume de PDAC.

Portanto, tempo e temperatura de aquecimento foram considerados fatores mais importantes

do que volume de ácido e de reagente e foram estudados em seguida.

Figura 15. Gráfico de Pareto do planejamento fatorial fracionário para a reação entre hidroclorotiazida

e PDAC, sobre papel de filtro.

0,0123232

-0,031754

-1,4085

-1,49178

p=.05

Efeito Estimado (Valor Absoluto)

(3)Volume de Ácido (uL)

(4)Volume de PDAC (uL)

(1)Temperatura (ºC)

(2)Tempo (min.)

98

V. 3.2.2.2. Efeitos do tempo e temperatura de aquecimento

Para investigar os fatores tempo e temperatura de aquecimento foi realizado um

planejamento fatorial completo. A Tabela 13 mostra a matriz de planejamento que abrangeu

as mesmas condições utilizadas no planejamento anterior, porém, com um maior número de

níveis entre os valores mínimos e máximos e também contendo um ponto central (Tabela 13).

Tabela 13. Matriz do planejamento fatorial completo com ponto central.

Experimentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Temperatura (ºC) 80 90 60 60 70 80 70 80 80 70 90 60 90 90 60 70

Tempo (min) 5 8 7 8 5 7 7 8 10 8 5 5 10 8 10 10

Vale mencionar que o aquecimento do papel de filtro contendo as soluções não pôde

ser mantido a 90ºC por mais do que 5 minutos. Por isso, as combinações referentes à

temperatura de 90ºC por 7, 8 e 10 minutos não foram realizadas.

A Figura 16 apresenta o gráfico tridimensional obtido a partir dos resultados do

planejamento com ponto central. Analisando a superfície obtida, é possível observar os pontos

referentes às condições escolhidas, os quais mostraram valores de AR mais altos e que

forneceram spot tests com maior uniformidade na cor.

99

Figura 16. Gráfico tridimensional obtido no estabelecimento das melhores condições de tempo e

temperatura de aquecimento para a reação entre hidroclorotiazida e PDAC sobre papel de

filtro.

Como pode ser visto na Figura 16, as respostas de reflectância mais altas foram

alcançadas com o aquecimento a 80ºC por 8 minutos. O formato da superfície analisada

indicou a direção, na qual novos experimentos deveriam ser realizados. Entretanto, devido a

limitações experimentais (tempos e temperaturas de aquecimento relativamente altas) o

planejamento não pôde ser estendido para outras condições experimentais.

0,2 0,18 0,16 0,14 0,12

100


Com o objetivo de avaliar a estabilidade óptica do produto da reação entre

hidroclorotiazida e PDAC, em meio ácido, foi realizado um acompanhamento cinético do

valor de AR em 585 nm a cada 5 minutos até 40 minutos após a adição das soluções no papel

de filtro. Os resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa entre os

valores de AR obtidos nos diferentes períodos de tempo. Portanto, a estabilidade óptica do

produto formado foi de pelo menos 40 minutos, nas condições estudadas (Figura 17).

Figura 17. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre hidroclorotiazida e PDAC, em

meio ácido, sobre papel de filtro. As análises dos spot tests foram realizadas a cada 5

minutos até 40 minutos. Solução padrão de hidroclorotiazida: 1,01 × 10-1 mol L-1.


A Figura 18 apresenta a curva analítica construída a partir das soluções padrão de

hidroclorotiazida na faixa de concentração de 3,36 × 10-2 a 1,01 × 10-1 mol L-1. Uma relação

linear (r = 0,9979) foi obtida representando-se graficamente AR versus log da concentração de

hidroclorotiazida (mol L-1). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analítica com valores

de log maiores do que zero. Valores de AR para esta faixa de concentração foram

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

AR

Tempo (minutos)

101

ajustados pela equação: AR = -0,13487 + 0,17488 × C, onde C = log [hidroclorotiazida] ×

102 (mol L-1). O limite de detecção foi 1,07 × 10–2 mol L-1 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×

aDP3 , sendo a = coeficiente

angular da curva analítica e BDP = desvio padrão do branco para 10 repetições (LONG;

WINEFORDNER, 1983).

Figura 18. Curva analítica para a determinação de hidroclorotiazida. Coeficiente de correlação linear

(r) = 0,9979. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Concentrações das soluções padrão

de hidroclorotiazida: 3,36 × 10-2 a 1,01 × 10-1 mol L-1. As barras representam os desvios




comumente presentes na amostra. A porcentagem de hidroclorotiazida encontrada nas

soluções contendo o fármaco padrão e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 97 a

103% com coeficientes de variação menores que 5% para três repetições. Esses resultados

foram considerados aceitáveis e, portanto, nenhuma interferência foi constatada a partir destes


1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.00.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

AR

log ([hidroclorotiazida]/mol L-1 x 102)

102


Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulação farmacêutica) foi realizado

um estudo de adição e recuperação de fármaco padrão utilizando 3 amostras de diferentes

marcas comerciais de comprimidos. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 14.

Para todas as amostras, os valores médios de recuperação (n=3) variaram de 95,8 a 101,2%,

com desvios padrão relativos entre 1,8 a 4,9%. Essas variações foram consideradas aceitáveis,

indicando que os componentes das formulações farmacêuticas analisadas não influenciaram

nas análises.

Tabela 14. Resultados de recuperação de hidroclorotiazida padrão adicionada em três formulações

farmacêuticas comerciais diferentes.

Amostras Valor Adicionadoa (mol L-1)

Valor Encontradoa

(mol L-1) Recuperaçãob

(%)

A - 1,68 × 10-2

3,36 × 10-2 5,04 × 10-2 6,72 × 10-2

(3,36±0,12) × 10-2 (1,61±0,08) × 10-2

(3,30±0,11) × 10-2 (5,06±0,13) × 10-2

(6,71±0,28) × 10-2

- 95,8 ±4,7

98,2±3,2 100,4±2,6 99,8±4,2

B

-

1,68 × 10-2 3,36 × 10-2

5,04 × 10-2 6,72 × 10-2

(3,35±0,15) × 10-2 (1,65±0,06) × 10-2 (3,33±0,10) × 10-2

(5,01±0,09) × 10-2 (6,74±0,19) × 10-2

-

98,2±3,5 99,1±3,0

99,4±1,8 100,3±2,8

C

-

1,68 × 10-2

3,36 × 10-2 5,04 × 10-2 6,72 × 10-2

(3,34±0,14) × 10-2 (1,70±0,05) × 10-2

(3,34±0,09) × 10-2 (5,00±0,18) × 10-2

(6,75±0,19) × 10-2

-

101,2±2,9

99,4±2,7 99,2±3,6 100,4±2,8

a Média ± Desvio padrão (DP), n = 3.

103

V. 3.2.7. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência.

O método proposto foi aplicado na determinação de hidroclorotiazida em seis


determinação de hidroclorotiazida em comprimidos descrito na Farmacopéia Britânica

(BRITISH…, 2001), o qual é baseado em medidas por espectrofotometria no UV (273 nm) e

envolve sucessivas diluições da amostra com NaOH 0,1 mol L-1. As análises foram realizadas

em três repetições e os resultados estão apresentados na Tabela 15.

Tabela 15. Determinação de hidroclorotiazida em formulações farmacêuticas comerciais.

Método Proposto Método de ReferênciaAmostrasa Valor Encontradob

(mg/comprimido) Valor de t

(2,78)c Valor de F

(19,00)c Valor Encontradob (mg/comprimido)

A 49,2±2,2 0,23 18,66 49,5± 0,5

B 48,5±1,8 0,11 1,92 48,3±1,3

C 49,5±2,6 0,62 13,80 48,6± 0,7

D 51,5±2,6 0,53 1,69 50,5± 2,0

E 50,0±1,0 1,62 6,25 49,1±0,4

F 48,8±1,7 0,38 2,52 48,1±2,7 a Valor Declarado: 50 mg hidroclorotiazida/comprimido. b Média ± Desvio padrão (DP), n = 3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

Os valores médios de hidroclorotiazida obtidos pelo método proposto variaram de 48,5

a 51,5 mg/comprimido e os desvios padrão de 1,0 a 2,6 mg/comprimido (Tabela 15). Para

todas as formulações analisadas, os resultados obtidos pelo método de referência e pelo

método proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nível de confiança de 95%.

Em todos os casos, os valores de t e de F calculados não excederam os valores teóricos,

104

indicando que não houve diferença significativa entre os métodos com relação à precisão e

exatidão (Tabela 15).


O método proposto demonstrou ser uma interessante alternativa aos outros

procedimentos existentes para a análise de comprimidos contendo hidroclorotiazida. Os

resultados do planejamento fatorial de experimentos indicaram que tempo e temperatura de

aquecimento foram os fatores mais importantes para a reação de spot test, influenciando

significativamente na resposta de reflectância. As melhores condições para a reação foram

obtidas a partir de 20 μL de solução de hidroclorotiazida, 20 μL de solução de HCl e 20 μL de

solução de PDAC, nesta ordem de adição, e aquecimento a 80ºC por 8 minutos. Este método

foi aplicado com sucesso na análise de hidroclorotiazida em amostras de comprimidos de

diferentes marcas comerciais. Comparando o método proposto com os outros métodos

descritos para a determinação de hidroclorotiazida em comprimidos, este método oferece

vantagens relacionadas à simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes, preenchendo os

requisitos para o controle de qualidade de medicamentos.

105

V. 3. 3. Determinação de propranolol em formulações farmacêuticas

V. 3.3.1. Spot Test

Desde 1927, a 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) ou reagente de Gibbs tem sido

comumente utilizada para a determinação de fenóis (GIBBS, 1927). O reagente de Gibbs

também tem tido aplicação para a detecção de aminas e hidrocarbonetos aromáticos por

cromatografia em camada delgada (ROSS, 1968). Recentemente, o uso de DCQ tem sido

descrito para a detecção de produtos oxigenados resultantes da biotransformação de substratos

aromáticos (QUINTANA; DIDION; DALTON, 1997) e para a determinação de fármacos, tais

como: ranitidina (EMMANUEL; HALDANKAR, 1989), cefadroxil (SASTRY; RAO;

PRASAD, 1997), mequitazina (EL-RAGEHY; BADAWEY; EL-KHATEEB, 2002),

tolnaftato (SASTRY et al., 1993) e D-penicilamina (AL-MAJED, 1999), que é um produto

caracterítisco da degradação ácida dos antibióticos β-lactâmicos. Vale ressaltar que este

trabalho descreve, pela primeira vez, o uso de DCQ como reagente cromogênico para a

determinação de propranolol.

Considerando que o propranolol possui um grupo naftol substituído, uma possível

reação entre propranolol e DCQ, com base na literatura (SASTRY et al., 1993), é apresentada

no Esquema 3.

Esquema 3

106

A reação apresentada no Esquema 3 foi baseada na reação entre tolnaftato e DCQ

(SASTRY et al., 1993), a qual envolve um acoplamento oxidativo que ocorre com o ataque

eletrofílico do reagente de Gibbs na posição orto do radical naftol substituído presente no

propranolol, formando um produto colorido.

Neste trabalho, a reação entre propranolol e DCQ produziu um composto colorido na

superfície do papel de filtro, cujo espectro de reflectância, com valor máximo de AR em 500

nm, é apresentado na Figura 19.

Figura 19. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre propranolol e DCQ. Os spot

tests foram analisados 10 minutos após a adição das soluções sobre o papel de filtro. O

comprimento de onda máximo foi 500 nm. Solução padrão de propranolol: 8,45 × 10–2

mol L-1.


Estudos foram realizados para estabelecer as condições mais favoráveis para a reação

entre propranolol e DCQ, sobre papel de filtro, visando alcançar a intensidade máxima da cor

do spot test em 500 nm. Todos os experimentos foram realizados com solução de propranolol

na concentração de 8,45 × 10-2 mol L-1.

400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

AR


107

Inicialmente, um planejamento fatorial completo foi realizado, o qual permitiu estudar

simultaneamente três fatores que poderiam ter um efeito importante na reação de spot test. Os

fatores de interesse foram: solvente para DCQ, solvente para propranolol e concentração de

DCQ. O solvente para DCQ foi fixado em 3 níveis: acetona, dioxano e acetonitrila; o solvente

para propranolol também foi fixado em 3 níveis: água, etanol e metanol; e a concentração de

DCQ em 2 níveis: 20 e 60 mg mL-1. Os experimentos não foram realizados na ordem em que

aparecem na Tabela 16 e sim de forma aleatória dentro do conjunto de experimentos, em 2

repetições. Vale mencionar que, em todo o planejamento, brancos correspondentes a cada um

dos experimentos foram realizados. A Tabela 16 apresenta a matriz de planejamento, bem

como os valores de resposta obtidos no planejamento fatorial completo gerado a partir das

combinações dos três fatores estudados, em todos os níveis. Os valores reais correspondentes

aos níveis de cada fator foram codificados com algarismos arábicos (1 a 3) visando remover

as unidades e facilitar a execução dos experimentos.

108

Tabela 16. Matriz e resultados do planejamento fatorial completo.

Fatores Resposta

Experimentosa Solvente para

DCQb

Solvente para

propranololc

Concentração de

DCQd AR (500 nm)

1 1 1 1 0,45827 – 0,46291

2 1 1 2 0,52982 – 0,54688

3 1 2 1 0,45689 – 0,46431

4 1 2 2 0,63241 – 0,62032

5 1 3 1 0,33285 – 0,32345

6 1 3 2 0,44207 – 0,42421

7 2 1 1 0,44081 – 0,41312

8 2 1 2 0,50337 – 0,50874

9 2 2 1 0,32340 – 0,41373

10 2 2 2 0,69243 – 0,64733

11 2 3 1 0,26266 – 0,26624

12 2 3 2 0,38232 – 0,41455

13 3 1 1 0,40156 – 0,44656

14 3 1 2 0,51053 – 0,49586

15 3 2 1 0,33905 – 0,32723

16 3 2 2 0,59637 – 0,57535

17 3 3 1 0,31383 – 0,28374

18 3 3 2 0,40421 – 0,39086

a Cada experimento foi realizado de forma randômica e em 2 repetições. b 1 para acetona; 2 para dioxano e 3 para acetonitrila. c 1 para água; 2 para etanol e 3 para metanol. d 1 para 20 mg mL-1 e 2 para 60 mg mL-1.

109

A partir dos resultados do planejamento fatorial completo, o gráfico de Pareto (Figura

20) foi obtido para visualização dos efeitos estimados dos fatores principais. O gráfico de

Pareto fornece uma representação gráfica para estes fatores e permite olhar a magnitude e a

importância de um efeito. Neste gráfico, as barras (fatores) que graficamente ultrapassam a

linha de significância exercem uma influência estatisticamente significativa sobre o resultado.

Assim, pode ser claramente observado na Figura 20, que todos os fatores exerceram efeito

significativo sobre a resposta. Concentração de DCQ foi o fator que teve maior influência,

seguida pelo solvente para propranolol e, em menor extensão, solvente para DCQ.

-2,56093

-8,78132

11,09

p=.05

Efeito Estimado (Valor Absoluto)

(1)Solvente para DCQ

(2)Solvente para Propranolol

(3)Concentração de DCQ

Figura 20. Gráfico de Pareto do planejamento fatorial completo para a reação entre propranolol e

DCQ, sobre papel de filtro.

Concentração de DCQ foi o fator mais importante entre todos os fatores investigados e

teve um elevado valor positivo. Este fato indicou que as maiores respostas foram obtidas com

solução de DCQ na concentração de 60 mg mL-1. Assim, valores de concentração mais altos

foram investigados no planejamento experimental seguinte, o qual foi do tipo composto

central.

110

Observou-se também no gráfico de Pareto (Figura 20) que o solvente para propranolol

teve um efeito significativo e negativo, indicando que as maiores respostas foram obtidas com

o uso de água. Uma interessante observação foi que misturas etanol-água dissolviam melhor o

propranolol do que estes solventes separadamente. Por esta razão, no planejamento composto

central misturas etanol-água, em proporções variando de 0 a 70% (v/v) foram avaliadas e a

possibilidade de se utilizar metanol como solvente para propranolol foi eliminada.

O gráfico de Pareto (Figura 20) também demonstrou que o solvente para DCQ teve um

significativo, mas baixo efeito negativo sobre a resposta, indicando que as maiores respostas

foram obtidas com acetona. Considerando estes resultados e lembrando que se tratam de

fatores qualitativos, a acetona foi então selecionada para ser o solvente para DCQ.

Com base nos resultados obtidos no planejamento fatorial completo, um planejamento

composto central foi então delineado visando obter as melhores condições para a reação. Os

fatores estudados foram concentração de DCQ e solvente para propranolol. Os pontos (níveis)

de um planejamento composto central estão a uma distância de 2 unidade codificada do

ponto central (normalmente codificado como ponto zero); desta forma todos os pontos estão

sobre uma circunferência com raio 2 . A Tabela 17 apresenta a matriz usada para o

planejamento composto central e os valores de resposta para cada um dos experimentos. O

experimento correspondente ao ponto central foi realizado em quatro repetições.

111

Tabela 17. Matriz e resultados obtidos no planejamento composto central.

Fatores Resposta Experimentos

Concentração de DCQ

(mg mL-1)a

Solvente para Propranolol

% (v/v) Etanol em água a AR (500 nm)

1 20 (-1) 10% (-1) 0,46570

2 80 (+1) 10% (-1) 0,53543

3 20 (-1) 60% (+1) 0,46486

4 80 (+1) 60% (+1) 0,54286

5 50 (0) 35% (0) 0,55065

6 50 (0) 35% (0) 0,56264

7 50 (0) 35% (0) 0,55828

8 50 (0) 35% (0) 0,56023

9 10 (- 2 )b 35% (0) 0,38359

10 90 (+ 2 )b 35% (0) 0,53933

11 50 (0) 0% (água) (- 2 )b 0,43494

12 50 (0) 70% (+ 2 )b 0,43496 a Os valores codificados estão entre parênteses. b Os valores experimentais foram aproximados a 2 para facilitar a preparação das soluções.

A metodologia de superfície de resposta é uma poderosa ferramenta experimental para

otimizar parâmetros múltiplos e inter-relacionados. No desenvolvimento deste método,

experimentos foram conduzidos de forma a alcançar valores de cada um dos fatores estudados

(variáveis independentes) que fornecessem maiores valores de AR (variável dependente). Os

valores da variável dependente foram medidos para cada uma das condições da variável

independente (concentração de DCQ e solvente para propranolol). Em seguida, uma

superfície de resposta foi obtida.

A Figura 21 apresenta o gráfico tridimensional obtido a partir dos dados experimentais

e ajustados a uma superfície de resposta.

112

Figura 21. Superfície de resposta obtida no planejamento composto central para valores de AR em

função da concentração de DCQ e mistura etanol-água (%, v/v) como solvente para

propranolol.

O modelo de regressão quadrático (valor de p < 0,0005), em termos de fatores

escalonados é dado por:

22 000075,0005151,0000039,0005377,0291554,0 yyxxZ −+−+= (Equação 7)

onde, Z é o fator de resposta correspondente ao valor de AR. Os fatores x e y são:

concentração de DCQ e solvente para propranolol, respectivamente.

O coeficiente de regressão calculado (R2) foi 81%, indicando que a equação obtida

explica a relação entre os resultados experimentais e os efeitos dos fatores estudados.

Nota-se pelo formato da superfície que a região ótima foi encontrada e também que as

respostas máximas foram alcançadas com concentração de DCQ 70 mg mL-1 e etanol 35%

(v/v) como o solvente para propranolol.

113

Cabe mencionar que a ordem de adição das soluções para o spot test foi considerada e

que as seguintes combinações foram estudadas: adição da solução do fármaco, seguida pela

adição da solução de reagente e o inverso. Observou-se que o spot test apresentou cor mais

intensa e uniforme quando a solução de reagente foi adicionada inicialmente e seca ao ar,

seguida pela adição da solução de fármaco.


Os resultados obtidos no estudo de estabilidade óptica do produto formado na reação

entre propranolol e DCQ demonstraram que não houve diferença significativa entre os valores

de AR obtidos no período de 10 a 60 minutos após a adição das soluções no papel de filtro.

Portanto, a estabilidade óptica do produto formado foi de pelo menos 50 minutos, nas

condições estudadas (Figura 22).

Figura 22. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre propranolol e DCQ. As análises

dos spot tests foram realizadas a cada 2 minutos até 60 minutos. Solução padrão de

propranolol: 8,45 × 10-2 mol L-1.

0 10 20 30 40 50 600,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

AR

Tempo (minutos)

114



propranolol na faixa de concentração de 1,35 × 10-2 a 8,45 × 10-2 mol L-1. Uma relação linear

(r = 0,9991) foi obtida representando-se graficamente AR versus log da concentração de

propranolol (mol L-1). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analítica para valores de log

maiores que zero. Valores de AR para a faixa de concentração estudada foram

ajustados pela equação: AR = 0,114360 + 0,421087 × C, onde C = log [propranolol] × 102

(mol L-1). O limite de detecção foi 8,16 × 10–3 mol L-1 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ×

aPD B3

, sendo a = coeficiente

angular da curva analítica e BDP = desvio padrão do branco para 10 repetições (LONG;

WINEFORDNER, 1983).

Figura 23. Curva analítica para determinação de propranolol. Coeficiente de correlação linear (r) =

0,9991. Valores de AR foram obtidos em 500 nm. Concentrações das soluções padrão de

propranolol: 1,35 × 10-2 a 8,45 × 10-2 mol L-1. As barras representam o desvio padrão para

3 repetições.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

AR

log ([propranolol]/mol L-1 x 102)

115



comumente presentes na amostra. A porcentagem de propranolol encontrado nas soluções

contendo o fármaco padrão e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 94 a 103% com








Para todas as amostras os valores médios de recuperação (n=3) variaram de 95,0 a 104,7%,



nas análises.

116

Tabela 18. Resultados de recuperação de propranolol adicionado em formulações farmacêuticas.

Amostras Valor Adicionadoa

(mol L-1)

Valor Encontradoa

(mol L-1)

Recuperaçãoa

(%)

A

-

1,35 × 10-2

2,70 × 10-2

4,05 × 10-2

5,40 × 10-2

(2,65±0,10) × 10-2

(1,29±0,02) × 10-2

(2,68±0,06) × 10-2

(4,24±0,08) × 10-2

(5,53±0,14) × 10-2

-

95,4±1,5

99,3±2,4

104,7±2,1

102,5±2,5

B

-

1,35 × 10-2

2,70 × 10-2

4,05 × 10-2

5,40 × 10-2

(2,68±0,10) × 10-2

(1,32±0,03) × 10-2

(2,56±0,120× 10-2

(4,14±0,14) × 10-2

(5,46±0,01) × 10-2

-

97,5±2,4

95,0±4,6

102,3±3,4

101,2±0,2

C

-

1,35 × 10-2

2,70 × 10-2

4,05 × 10-2

5,40 × 10-2

(2,70±0,10) × 10-2

(1,36±0,06) × 10-2

(2,66±0,12) × 10-2

(3,95±0,08) × 10-2

(5,32±0,15) × 10-2

-

100,7±4,6

98,4±4,4

97,5±1,9


V. 3.3.7. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência

O método proposto foi aplicado na determinação de propranolol em algumas


determinação de propranolol em comprimidos descrito na Farmacopéia Britânica

(BRITISH…, 2001), o qual é baseado na espectrofotometria no UV (290 nm) e envolve

sucessivas diluições da amostra com metanol. As análises foram realizadas em três repetições

e os resultados estão apresentados na Tabela 19.

117

Tabela 19. Determinação de propranolol em formulações farmacêuticas comerciais.




(2,78)c Valor de F

(19,00)c Valor Encontradob (mg/comprimido)

A 38,9±0,3 1,06 2,67 38,5±0,5

B 41,0±1,5 0,88 1,86 40,1±1,1

C 39,7±0,4 1,60 6,02 38,6±1,1

D 38,0±1,1 1,10 9,16 38,1± 0,4

E 41,0±2,4 0,72 1,44 39,7±2,0

F 37,4±0,5 0,47 1,04 38,6±0,5

a Valor Nominal: 40 mg propranolol/comprimido b Média ± Desvio padrão (DP), n = 3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

Os valores médios de atenolol obtidos pelo método proposto variaram de 37,4 a 41,0

mg/comprimido, com desvios padrão de 0,30 a 2,38 mg/comprimido (Tabela 19). Para todas

as formulações analisadas, os resultados obtidos pelo método de referência e pelo proposto

foram comparados aplicando-se testes t e F, com nível de confiança de 95%. Em todos os

casos, os valores de F e de t calculados não excederam os valores teóricos, indicando que não

houve diferença significativa entre os métodos com relação à precisão e exatidão (Tabela 19).


Este trabalho demonstrou, pela primeira vez, o uso de DCQ como reagente

cromogênico para a determinação de propranolol e também da espectroscopia de reflectância

difusa utilizando spot test como uma interessante alternativa aos outros procedimentos

existentes para a análise de comprimidos contendo propranolol. Planejamento fatorial foi

empregado a fim de se otimizar as condições para a reação de spot test e as melhores

condições foram obtidas a partir de 30 μL de solução de propranolol em etanol 35% (v/v) e 30

118

μL de solução de DCQ 70 mg/mL em acetona. O método proposto foi aplicado com sucesso

na análise de propranolol em amostras de comprimidos de diferentes marcas comerciais. Os

resultados obtidos pelo método proposto mostraram boa concordância quando comparados

com àqueles obtidos pelo método da Farmacopéia Britânica, indicando que não há diferença

significativa entre ambos métodos com relação à precisão e exatidão. O método proposto

oferece vantagens relacionadas à simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes sobre os

outros métodos descritos para determinação de propranolol em comprimidos, podendo ser

recomendado para análises de rotina no controle de qualidade de medicamentos.

119

V. 3. 4. Determinação de atenolol em formulações farmacêuticas

V. 3.4.1. Spot Test

O p-cloranil (2,3,5,6-tetracloro-p-benzoquinona) tem sido usado como reagente

cromogênico para a determinação de diversos fármacos, tais como: sulfato de isoprenalina e

metildopa (KORANY; WAHBI, 1979), fluoxetina e sertralina (BEBAWY et al., 1999),

salbutamol (BAKRY et al., 1996), nortriptilina (ATTIA, 2000), antidepressivos (IBRAHIM et

al., 1983) e beta-bloqueadores, entre eles, o atenolol (SALEM, 2002). Estes métodos são

baseados na interação entre doadores de elétrons (fármacos) e p-cloranil, o qual age como

aceptor de elétrons formando complexos de transferência de carga intensamente coloridos

(FOSTER, 1968; SALEM, 2002).

Baseando-se na reação entre atenolol e p-cloranil em solução, previamente descrita na

literatura (SALEM, 2002), realizou-se esta reação em papel de filtro, a qual resultou no

aparecimento imediato de cor, a qual foi utilizada no desenvolvimento de spot tests

quantitativos. A Figura 24 apresenta o espectro de reflectância com valor máximo de AR em

550 nm.

120

Figura 24. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre atenolol e p-cloranil. O

comprimento de onda máximo foi em 550 nm. Solução padrão de atenolol: 7,88 × 10–2

mol L-1.

Sabendo que reações envolvendo p-cloranil podem ser aceleradas com o uso de H2O2

(WEINERT et al., 2004) e que o dioxano é um solvente peroxidável (JACKSON et al., 1970),

a concentração de peróxido presente no dioxano utilizado neste estudo foi determinada. A

quantificação foi realizada com base no método espectrofotométrico descrito por Benatsky e

Tomik (1988) para a determinação de peróxido em solventes orgânicos, o qual envolve reação

com metavanadato de amônio e ácido nítrico concentrado, resultando em um composto

colorido (450 nm). Os resultados obtidos revelaram que o dioxano analisado continha 0,0016

g% (m/v) de H2O2, que foi uma quantidade menor que aquela descrita nas especificações no

rótulo que é de 0,005 g% (m/v) (dioxano p.a - Tedia, Fairfield, EUA).

400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

AR


121

V. 3.4.2. Efeito da concentração de p-cloranil no spot test

O efeito da concentração de p-cloranil na resposta (AR) foi estudado utilizando

planejamento univariado, tendo sido fixada a concentração de atenolol em 7,88 × 10-2 mol L-1.

Os resultados obtidos no planejamento univariado estão apresentados na Figura 25.

Figura 25. Efeito da concentração de p-cloranil na resposta (AR). As barras representam os desvios


Observando o gráfico podemos notar que a adição da solução padrão de atenolol sem

p-cloranil (primeiro ponto do gráfico) não apresentou resposta de reflectância, indicando que

não houve reação entre o analito e componentes do papel. Também podemos observar que os

valores de AR obtidos aumentaram continuamente conforme o aumento da concentração de p-

cloranil até 8,00 × 10-2 mol L-1. Com a adição de soluções de p-cloranil em concentrações

maiores do que 8,00 × 10-2 mol L-1 a resposta de reflectância (AR) estabilizou, não tendo

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

AR

Concentração de p-cloranil (mol L-1)

122

ocorrido diferença significativa entre as concentrações de 8,00 × 10-2, 1,00 × 10-1 e 1,20 × 10-1

mol L-1. Porém, com a adição da solução de p-cloranil a 1,4 × 10-1 mol L-1 os valores de AR

foram menores e significativamente diferentes de todas as demais (p<0,05). Assim, os

resultados obtidos indicaram que a solução de p-cloranil na concentração de 8,00 × 10-2 mol

L-1 foi suficiente para que a reação de spot test se completasse, sendo, portanto, a

concentração escolhida.


Os resultados obtidos no estudo de estabilidade óptica do produto formado na reação

de spot test entre atenolol e p-cloranil demonstraram que não houve diferença significativa

entre os valores de AR obtidos nos diferentes períodos de tempo estudados. Portanto, a

estabilidade óptica do produto formado foi de pelo menos 40 minutos, nas condições

estudadas (Figura 26).

Figura 26. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre atenolol e p-cloranil. As análises

dos spot tests foram realizadas no tempo zero, após 1 minuto e a cada 2 min. até 40 min.

Solução padrão de atenolol: 7,88 × 10-2 mol L-1.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

AR

Tempo (minutos)

123



atenolol na faixa de concentração de 1,01 × 10-2 a 7,88 × 10-2 mol L-1. Uma relação linear

(r = 0,9992) foi obtida pela representação gráfica de AR versus log da concentração de

atenolol (mol L-1). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analítica com valores de log

maiores do que zero. Valores de AR para esta faixa de concentração foram ajustados pela

equação: AR = 0,13469 + 0,32613 × C, onde C = log [atenolol] × 102 (mol L-1). O limite de

detecção foi 2,80 × 10–3 mol L-1 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×

aDPB3 , sendo a = coeficiente angular da curva analítica e

BDP = desvio padrão do branco para 10 repetições (LONG; WINEFORDNER, 1983).

Figura 27. Curva analítica para a determinação de atenolol. Coeficiente de correlação linear (r) =

0,9992. Valores de AR foram obtidos em 550 nm. Concentrações das soluções padrão de

atenolol: 1,13 × 10-2 a 7,88 × 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios padrão para 3

repetições.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

AR

log [atenolol] x 102 (mol L-1)log ([atenolol]/mol L-1 × 102)

124



comumente presentes na amostra. A porcentagem de atenolol encontrado nas soluções

contendo o fármaco padrão e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 99 a 104%, com








Para todas as amostras os valores médios de recuperação (n=3) variaram de 95,3 a 104,0%,



nas análises.

125

Tabela 20. Resultados de recuperação de atenolol padrão adicionado em três formulações

farmacêuticas comerciais diferentes.

Amostras Valor Adicionadoa (mol L-1)

Valor Encontrado (mol L-1)a

Recuperação (%)a

A -

1,13 × 10-2

2,25 × 10-2

3,38 × 10-2

4,50 × 10-2

(2,23±0,06) × 10-2

(1,10±0,19) × 10-2

(2,17±0,08) × 10-2

(3,25±0,03) × 10-2

(4,58±0,13) × 10-2

-

97,0±0,2

96,7±3,8

96,1±0,9

101,9±2,9

B

-

1,13 × 10-2

2,25 × 10-2

3,38 × 10-2

4,50 × 10-2

(2,22±0,04) × 10-2

(1,08±0,01) × 10-2

(2,34±0,09) × 10-2

(3,27±0,03) × 10-2

(4,36±0,08) × 10-2

-

95,8±0,6

104,0±4,2

96,8±0,9

97,0±1,8

C

-

1,13 × 10-2

2,25 × 10-2

3,38 × 10-2

4,50 × 10-2

(2,16±0,08) × 10-2

(1,08±0,03) × 10-2

(2,22±0,04) × 10-2

(3,22±0,07) × 10-2

(4,41±0,12) × 10-2

-

95,3±3,0

98,7±1,8

95,4±2,0

98,1±2,7

a Média ± Desvio padrão (DP), n = 3.

V. 3.4.7. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência

O método proposto foi aplicado na determinação de atenolol em algumas formulações

farmacêuticas disponíveis comercialmente e comparado com o método para a determinação

de atenolol em comprimidos descrito na Farmacopéia Britânica (BRITISH…, 2001), o qual é

baseado na espectrofotometria no UV em 275 nm e envolve aquecimento a 60ºC por 15

minutos e diluições com metanol. As análises foram realizadas em três repetições e os

resultados estão apresentados na Tabela 21.

126

Tabela 21. Determinação de atenolol em formulações farmacêuticas comerciais.

Método Proposto Método de ReferênciaAmostrasa

Valor Encontradob


(2,78)c Valor de F

(19,00)c Valor Encontradob

(mg/comprimido)

A 98,6±1,3 1,23 6,76 99,5± 0,5

B 98,4±1,5 0,21 9,00 98,6±0,5

C 47,8±1,3 0,25 10,56 48,0±0,4

D 49,1±1,6 0,01 3,16 49,1± 0,9

E 24,1±0,4 0,87 5,06 24,6±0,9 a Valor Declarado: Amostras A e B: 100 mg atenolol/comprimido; Amostras C e D: 50 mg de

atenolol/comprimido; Amostra E: 25 mg de atenolol/comprimido. b Média ± Desvio padrão (DP), n = 3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

Para todas as formulações analisadas, os resultados obtidos pelo método de referência

e pelo proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nível de confiança de 95%.

Em todos os casos, os valores de F e de t calculados não excederam os valores teóricos,


exatidão (Tabela 21).


Este estudo demonstrou o uso da espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot

tests para o controle de qualidade de atenolol em comprimidos. O método envolveu um

procedimento de spot test muito simples, no qual 20 μL da solução contendo o fármaco e 20

μL da solução de reagente (p-cloranil) foram adicionados em papel de filtro. A reflectância do

produto colorido foi medida a 550 nm. Um planejamento univariado foi realizado, resultando

na escolha da melhor concentração de p-cloranil que foi de 8,0 × 10–2 mol L-1. O método foi

aplicado com sucesso na determinação de atenolol em amostras de comprimidos de diferentes

127

marcas comerciais, apresentando bons resultados de precisão e exatidão quando comparados

ao método da Farmacopéia Britânica. Desta forma, este trabalho apresenta uma proposta

viável de método para a análise de atenolol em comprimidos, oferecendo vantagens

relacionadas à simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes e de solventes.

128

Capítulo VI. Desenvolvimento de método analítico por

espectrofotometria na região do visível para a

determinação de metildopa em formulações farmacêuticas

129

VI. 1. PARTE EXPERIMENTAL

VI. 1.1. Equipamentos

As medidas de absorbância, tanto para o método proposto como para o método da

Farmacopéia Brasileira, foram realizadas utilizando um espectrofotômetro UV-Visível Cary

1E, com cubetas de vidro de 1,0 cm de caminho óptico.

Agitador magnético Corning.

Micropipetas Eppendorf (10 a 100 μL) e Brand (100 a 1000 μL).

VI. 1.2. Reagentes e Soluções

Os excipientes usados no estudo de interferentes foram de grau farmacêutico. Os

solventes utilizados foram acetona (grau p.a.) e metanol (grau HPLC) (Mallinckrodt,

Xalostoc, México). p-Cloranil (p.a., Sigma, St. Louis, USA) foi usado para preparar

diariamente uma solução 4,07x10-2 mol L-1 (1,0%, m/v) em acetona. Solução de peróxido de

hidrogênio 4,55 mol L-1 foi preparada por diluição adequada de peridrol 30% (Merck,

Darmstadt, Alemanha) e padronizada conforme descrito na literatura (OHLWEILER, 1982).

Solução estoque de metildopa, grau de pureza de 99,50%, (Henrifarma, São Paulo, Brasil) foi

preparada na concentração de 1,68 × 10-2 mol L-1 (4000 ppm) em metanol. Soluções padrão

foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de metildopa em metanol e usadas na

construção da curva analítica numa faixa de concentração de 4,20 × 10-4 a 2,48 × 10-3 mol L-1

(100 a 590 ppm).

VI. 1.4. Amostras

As amostras comerciais dos medicamentos contendo metildopa foram obtidas em

farmácias locais e foram analisadas dentro dos seus prazos de validade. Quatro formulações

130

farmacêuticas (comprimidos) contendo 250 mg de metildopa por comprimido, conforme

declarado no rótulo, foram analisadas.

VI. 2. PROCEDIMENTO

VI. 2. 1. Curva analítica

Alíquotas (125 a 740 μL) da solução estoque de metildopa (1,68 × 10-2 mol L-1) foram

transferidas para balões volumétricos de 5,00 mL visando a obtenção de uma curva analítica

na faixa de concentração de 4,20 × 10-4 a 2,48 × 10-3 mol L-1. Em seguida, 770 μL da solução

de p-cloranil (4,07 × 10-2 mol L-1) e 85 μL de H2O2 (4,55 mol L-1) foram adicionados. O

volume final (5,00 mL) foi completado com metanol. As medidas de absorbância foram

realizadas em 535 nm (b=1,0 cm). Branco de reagentes preparado de forma similar, porém

omitindo-se o fármaco foi utilizado como referência em todas as medidas. A curva analítica

foi obtida representando-se graficamente valores de absorbância versus concentração de

metildopa (mol L-1).

VI. 2. 2. Estudo de interferências

O efeito dos excipientes mais comumente empregados nas formulações farmacêuticas

de metildopa foi cuidadosamente estudado visando avaliar a presença de possíveis

interferentes. Os excipientes estudados foram: amido, talco, estearato de magnésio, ácido

tartárico, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, celulose, hidroxipropilmetilcelulose, lactose,

etilcelulose, dióxido de silício e croscarmelose sódica. Para este estudo, soluções contendo

metildopa (4,0 mg/mL) e cada um dos excipientes, separadamente, em concentração igual e

dez vezes maior à concentração de metildopa foram submetidas à agitação com metanol em

um agitador magnético por 10 minutos. O volume foi completado para 10,00 mL e, após

131

filtração em papel de filtro Whatman 41, as soluções foram analisadas sob as mesmas

condições descritas no item VI. 2.1.

VI. 2.3. Preparação da amostra

Vinte comprimidos (do mesmo lote) de cada amostra das diferentes marcas comerciais

estudadas foram pesados em balança analítica e pulverizados em gral de ágata. O valor da

massa de um comprimido foi expresso como a média de 20 determinações, com variação

menor que 2% (FARMACOPÉIA..., 1988). Uma porção de amostra pulverizada equivalente a

100 mg de metildopa foi pesada com precisão de 0,0001 g e submetida à agitação com

metanol em agitador magnético por 10 minutos. Em seguida, foi realizada uma diluição em

balão volumétrico de 25,00 mL, completando-se o volume com metanol. Esta solução foi

filtrada em papel de filtro Whatman 41 e uma alíquota do filtrado foi submetida ao

procedimento descrito no item VI. 2.1.

V. 2.4. Estudo de Adição e Recuperação

Estudo de adição e recuperação de fármaco padrão foi realizado com o objetivo de

avaliar efeitos de matriz (formulação farmacêutica) nas análises. Para tanto, quantidades

conhecidas (2,52 × 10-4; 5,04 × 10-4; 7,55 × 10-4 e 1,00 × 10-3 mol L-1) de metildopa foram

adicionadas nas amostras previamente analisadas contendo o equivalente a 1,00 × 10-3 mol L-1

de metildopa. As quantidades de metildopa adicionadas corresponderam a 25, 50, 75 e 100%

da quantidade presente na amostra. O procedimento foi, então, seguido de acordo com o item

VI. 2.3.

132

VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Conforme discutido no item V. 3.4.1., o p-cloranil tem sido usado como reagente

cromogênico para a determinação de diversos fármacos, tais como: sulfato de isoprenalina e

metildopa (KORANY; WAHBI, 1979), fluoxetina e sertralina (BEBAWY et al., 1999),

salbutamol (BAKRY et al., 1996), nortriptilina (ATTIA, 2000), antidepressivos (IBRAHIM et

al., 1983), beta-bloqueadores (SALEM, 2002), sulfato de isoprenalina e metildopa

(KORANY; WAHBI, 1979). De acordo com a literatura (FOSTER, 1968; SALEM, 2002) o

p-cloranil interage com alguns fármacos por dois possíveis mecanismos de reação, um em que

ocorre uma reação de substituição e outro em que o p-cloranil (π-aceptor) interage com

doadores de elétrons formando complexos de transferência de carga como mostra o Esquema

4. No entanto, esses mecanismos não são bem elucidados existindo muita discussão na

literatura a respeito dos produtos formados, considerando-se inclusive que estão envolvidos

equilíbrios químicos complexos e com diversos produtos existindo concomitantemente.

133

Esquema 4

O uso de p-cloranil também foi descrito na literatura na detecção de metildopa em

formulações farmacêuticas por cromatografia em camada delgada (ADIKWU et al., 2002).

Como mencionado anteriormente, um método espectrofotométrico para a determinação de

sulfato de isoprenalina e metildopa utilizando p-cloranil como reagente cromogênico foi

publicado por Korany e Wahbi (1979) (KORANY; WAHBI, 1979). Entretanto, este método

apresenta alguns problemas, por exemplo, aquecimento por tempo prolongado (30 minutos) e

a medida da absorbância para metildopa é realizada na região do UV (358 nm). Além disso, a

p-cloranil Complexo de transferência de carga

em acetona

Par iônico

Amino-quinona (produto de substituição)

Proposta B

Proposta A

134

preparação da amostra requer o uso de HCl concentrado e solução tampão, exigindo várias

etapas de manipulação (KORANY; WAHBI, 1979).

Com o objetivo de desenvolver um procedimento mais simples, o método proposto

utilizou a reação entre metildopa e p-cloranil, a qual foi significativamente acelerada na

presença de H2O2. Esta reação produziu um composto colorido e a medida de absorbância foi

realizada em 535 nm, sem a necessidade de aquecimento. A implicação mais importante

destes resultados sobre àqueles já descritos para a análise de metildopa com p-cloranil

(KORANY; WAHBI, 1979) é que o aquecimento por 30 minutos pôde ser substituído pelo

uso de H2O2.

A Figura 28 apresenta o espectro do produto da reação entre metildopa e p-cloranil, na

presença de H2O2. Como pode ser observado, o espectro exibe bandas largas, as quais são

características de complexos de transferência de carga. Nota-se também na Figura 28 que o

espectro apresenta bandas de absorção máxima em 435 e em 535 nm. Assim, um estudo da

estabilidade óptica do complexo colorido foi realizado por acompanhamento cinético dos

valores de absorbância em 435 e em 535 nm, no tempo zero e a cada 2 minutos até 60

minutos (Figura 29).

135

Figura 28. Espectro de absorção do produto da reação entre metildopa e p-cloranil. O comprimento de

onda analítico foi 535 nm. Concentração final de metildopa = 1,07 × 10–3 mol L-1; caminho

óptico: 1,0 cm.

Figura 29. Estudo da estabilidade óptica do produto da reação entre metildopa e p-cloranil. As

medidas de absorbância foram realizadas a cada 2 minutos até 60 minutos. Concentração

final de metildopa: 7,14 × 10–4 mol L-1.

g g g 435 nm

g g g 535 nm

0 10 20 30 40 50 600,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0 10 20 30 40 50 600,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

Abs

orbâ

ncia

Tempo (min)

400 500 600 700 8000,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Abs

orbâ

ncia


136

Os resultados obtidos demonstraram que em 435 nm houve um aumento progressivo

da absorbância em função do tempo e que em 535 nm houve uma faixa de estabilidade óptica

de 15 a 35 minutos (Figura 29). Portanto, nas condições estudadas (535 nm), a estabilidade

óptica do complexo colorido foi de 20 minutos, o qual foi considerado tempo suficiente para a

execução das análises. Deve-se ressaltar que para a obtenção do complexo colorido (Figura

28), a presença de H2O2 foi essencial. Na ausência de H2O2, a reação foi extremamente lenta e

o produto não foi estável.

Em estudos anteriores realizados em nosso laboratório, foi desenvolvido um método

espectrofotométrico para a determinação de sacarina utilizando p-cloranil, o qual também

utilizou H2O2 como agente acelerador da reação (WEINERT et al., 2004). Nossos resultados

corroboram com aqueles já descritos para a análise de sacarina, sugerindo que reações

envolvendo p-cloranil e doadores de elétrons podem ser aceleradas com o uso de H2O2.

VI. 3.1. Planejamento Fatorial de Experimentos

Visando investigar as melhores condições para a reação entre p-cloranil e metildopa na

presença de H2O2 um planejamento fatorial utilizando planejamento composto central foi

empregado. Neste caso, as melhores condições para a reação significaram as concentrações

mínimas de reagentes que resultaram numa resposta máxima, isto é, a maior absorbância

possível.

Planejamento composto central permitiu estudar simultaneamente os dois fatores que

poderiam ter um efeito importante na reação. Os fatores de interesse foram concentração de p-

cloranil e concentração de H2O2. Estes fatores foram estudados na forma de volumes

adicionados das soluções de p-cloranil e de H2O2 em concentrações fixadas em 4,07 × 10-2

mol L-1 e 4,55 × 10-1 mol L-1, respectivamente. A Tabela 22 apresenta a matriz do

planejamento composto central e os resultados de absorbância. O experimento correspondente

137

ao ponto central foi realizado em 4 repetições. Todos os experimentos foram realizados com

solução de metildopa 1,59 × 10-3 mol L-1.

Tabela 22. Matriz do planejamento composto central e valores de absorbância referentes a cada

experimento.

Fatores Respostas

Experimentos Volume de p-cloranil (μL)a

Volume de H2O2 (μL)b

A (535 nm)

1 600 40 0,4397

2 1100 40 0,5454

3 600 90 0,5921

4 1100 90 0,5813

5 850 65 0,5978

6 850 65 0,6151

7 850 65 0,6094

8 850 65 0,6165

9 500 65 0,5946

10 1200 65 0,5973

11 850 30 0,5758

1. 850 100 0,6055 a Solução de p-cloranil: 4,07 × 10-2 mol L-1. b Solução de H2O2: 4,55 mol L-1.

Os valores de absorbância experimentalmente obtidos no planejamento composto

central foram ajustados a uma superfície de resposta visando o estabelecimento das melhores

condições para a reação (Figura 30).

138

Figura 30. Superfície de resposta obtida a partir dos valores de absorbância em função do volume

adicionado de p-cloranil e volume de H2O2.

O modelo de regressão quadrática (valor de p< 0,0005), em termos de fatores

escalonados é dado por:

2000037,0009891,0000965,0177376,0 yyxZ −++= (Equação 7)

onde, Z é o fator resposta correspondente ao valor de absorbância. Os fatores x e y são o

volume de p-cloranil e volume de H2O2, respectivamente. O valor do coeficiente do fator 2x ,

bem como dos coeficientes das interações dos fatores foram muito pequenos e por esta razão

não foram mostrados.

Pode-se observar pela forma da superfície (Figura 30) que a região ótima foi

encontrada e que as respostas máximas foram alcançadas com cerca de 770 μL da solução de

p-cloranil e 85 μL da solução de H2O2.

0,61 0,56 0,51 0,46 0,41 0,36 0,31

139

VI. 3.3. Curva Analítica

A Figura 31 apresenta a curva analítica obtida a partir dos valores de absorbância

versus concentração de metildopa (mol L-1). A lei de Beer é obedecida na faixa de

concentração de 4,20 × 10-4 a 2,48 × 10-3 mol L-1, com um coeficiente de correlação linear de

0,9993. Os valores de absorbância para esta faixa de concentração foram ajustados pela

equação: A = - 0,04006 + 364,315 × C, onde C = concentração de metildopa (mol L-1) e o

valor do coeficiente angular corresponde numericamente a absortividade molar (ε), que é 3,64

× 102 L. mol-1. cm-1. O limite de detecção foi 1,51 × 10-5 mol L-1 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×

aDPB3 , sendo a =

coeficiente angular da curva analítica e BDP = desvio padrão do branco para 10 repetições e o

limite de quantificação 5,03 × 10-5 mol L-1 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×

aDPB10 (LONG; WINEFORDNER, 1983).

Figura 31. Curva analítica para a determinação espectrofotométrica de metildopa. Valores de

absorbância foram obtidos em 535 nm. Coeficiente de correlação linear (r) =

0,9993. As barras representam o desvio padrão para 3 repetições.

0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Abs

orbâ

ncia

(535

nm

)

Concentração de metildopa (mol L-1)

140

VI. 3.4. Estudo de interferências


comumente presentes na amostra (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). A porcentagem

de metildopa encontrada nas soluções contendo o fármaco padrão e cada um dos excipientes,

separadamente, foi de 94,0 a 103,0% com coeficientes de variação menores que 5% para três

repetições. Esses resultados foram considerados aceitáveis e, portanto, nenhuma interferência

foi constatada a partir destes excipientes, nas condições estudadas.

VI. 3.5. Estudo de Adição e Recuperação

Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulação farmacêutica, a qual contém

todos os excipientes juntos) foi realizado um estudo de adição e recuperação de fármaco

padrão utilizando 3 amostras de diferentes marcas comerciais de comprimidos. Os resultados

obtidos estão apresentados na Tabela 23. Para todas as amostras, os valores médios de

recuperação (n=3) variaram de 96,3 a 105,9%, com desvios padrão relativos entre 1,9 e 6,1%.

Essas variações foram consideradas aceitáveis, indicando que os componentes das

formulações farmacêuticas analisadas não influenciaram nas análises.

141

Tabela 23. Resultados de recuperação de metildopa adicionada em formulações farmacêuticas.

Amostras Valor Adicionado

(mol L-1)a

Valor Encontrado

(mol L-1)a

Recuperaçãoa

(%)

A

-

2,52 × 10-4

5,04 × 10-4

7,56 × 10-4

1,01 × 10-3

(9,83±0,45) × 10-4

(2,54±0,14) × 10-4

(5,26±0,10) × 10-4

(7,42±0,29) × 10-4

(1,05±0,05) × 10-3

-

100,8±5,6

104,2±0,2

98,1±3,8

104,0±5,0

B

-

2,52 × 10-4

5,04 × 10-4

7,56 × 10-4

1,01 × 10-3

(1,02±0,04) × 10-3

(2,48±0,10) × 10-4

(5,34±0,30) × 10-4

(7,46±0,30) × 10-4

(1,01±0,06) × 10-3

-

98,4±3,9

105,9±5,9

98,7±4,0

100,8±6,0

C

-

2,52 × 10-4

5,04 × 10-4

7,56 × 10-4

1,01 × 10-3

(1,04±0,02) × 10-3

(2,56±0,13) × 10-4

(5,30±0,17) × 10-4

(7,67±0,47) × 10-4

(9,73±0,30) × 10-4

-

101,6±5,2

105,2±3,3

101,5±6,2


VI. 3.6. Aplicação do método proposto e comparação com o método de referência.

O método proposto foi aplicado à determinação de metildopa em algumas formulações

farmacêuticas disponíveis comercialmente e comparado com o método para a determinação

de metildopa em comprimidos (FARMACOPÉIA..., 1988). Tal método é baseado em

medidas por espectrofotometria na região do visível (520 nm) e envolve a reação entre

metildopa e solução de tartarato ferroso. As análises foram realizadas em três repetições e os

resultados estão apresentados na Tabela 24.

142

Tabela 24. Determinação de metildopa em formulações farmacêuticas comerciais.



(mg/comprimido)

Valor de t

(2,78)c

Valor de F

(19,00)c

Valor Encontradob

(mg/comprimido)

A 250,3±3,1 0,67 2,97 249,0±1,8

B 248,1±0,6 2,32 4,00 249,9±1,2

C 248,6±2,3 0,26 1,83 248,9±1,7

D 258,5±3,1 0,02 4,90 258,5±1,4 a Valor Nominal: 250 mg metildopa/comprimido b Média ± Desvio padrão (DP), n = 3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

Os valores médios encontrados variaram de 248,1 a 258,5 mg/comprimido e os

desvios padrão de 0,6 a 3,1 mg/comprimido (Tabela 24). Para todas as formulações

analisadas, os resultados obtidos pelo método da Farmacopéia Brasileira (FARMACOPÉIA...,

1988) e pelo proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nível de confiança de

95%. Em todos os casos, os valores de F e de t calculados não excederam os valores teóricos,


exatidão.

VI. 3.7. Medidas em dispositivo portátil

O método desenvolvido para a determinação de metildopa foi adaptado para o uso em

um sistema de medidas portátil descrito por Rossi, He e Tubino (2000). Tal sistema consiste

em um dispositivo para medidas fotométricas, o qual é baseado em uma relação entre a

resistência de um sensor (LDR) e a intensidade de luz que incide sobre sua superfície. Assim,

a resistência varia em função da intensidade de cor de uma solução. Este sistema é constituído

por um multímetro digital (ET-1502 – Minipa®), ao qual é acoplada uma cela de PTFE

143

(politetrafluoretileno) (Teflon®) preto contendo um compartimento para a inserção de um

tubo de vidro de fundo chato (5,0 cm de altura e 5,0 mm de diâmetro interno), o qual é

preenchido com a solução a ser analisada. O volume desta solução deve ser padronizado,

neste trabalho, o volume da solução a ser analisada foi de 1,2 mL. Utilizou-se uma luminária

(lâmpada compacta fluorescente 9 W – Startec) como fonte de luz incidindo continuadamente

sobre o sistema, a fim de se evitar variações da luz ambiente sobre o LDR. A cela de teflon foi

cedida pelos autores do dispositivo para a realização desta etapa do trabalho.

A Figura 32a apresenta uma foto do sistema montado para realizar as medidas

fotométricas no dispositivo portátil e a Figura 32b um esquema da cela de Teflon® para

medidas fotométricas, incluindo LDR, tubo de vidro, janela de vidro e contato elétrico.

Figura 32. Dispositivo portátil de medidas fotométricas: (a) Montagem do sistema para medidas

fotométricas. (b) Esquema da cela de Teflon® (Fonte: CRIVELENTE, 2003).

(a)

(b)

144

As condições experimentais adotadas para as análises de metildopa no dispositivo

portátil foram àquelas estabelecidas no desenvolvimento do método espectrofotométrico

descrito anteriormente.

VI. 3.7.1. Curva Analítica

A curva analítica foi construída na faixa de concentração de 7,14 × 10–4 a 2,48 × 10–3

mol L-1, utilizando o mesmo procedimento descrito no item VI. 2.1. A solução contendo o

produto colorido foi, então, transferida para o tubo de vidro (1,2 mL), o qual foi introduzido

na cela de PTFE para a medida da resistência. As medidas foram realizadas em triplicata. A

Figura 33 apresenta a curva analítica obtida a partir dos valores de resistência (ohm) versus

concentração de metildopa (mol L-1). Uma relação linear (r=0,9986) foi obtida a partir da

equação: y = 2,35 × 104 × C + 9,33543.

Figura 33. Curva analítica para a determinação de metildopa por medidas fotométricas utilizando

dispositivo portátil. Coeficiente de correlação linear (r) = 0,9986. As barras representam o

desvio padrão para 3 repetições.

0,0008 0,0012 0,0016 0,0020 0,00240

10

20

30

40

50

Res

istê

ncia

(103 oh

ms)

Concentração metildopa (mol L-1)

145

Comparando-se a curva analítica obtida por espectrofotometria (Figura 31) e a curva

obtida a partir das medidas de resistência no dispositivo portátil (Figura 33) nota-se uma

diferença na dispersão das medidas (barras verticais nos gráficos). Embora a mesma reação

tenha sido utilizada no método espectrofotométrico e no método adaptado ao dispositivo

portátil, as medidas espectrofotométricas apresentaram valores de desvio padrão relativos

(dispersão) menores (variando de 1,4 a 3,8%) do que as medidas de resistência, as quais

apresentaram valores de desvio padrão relativo de 2,5 a 7,9%. Entretanto, mesmo com menor

precisão de medidas, o coeficiente de correlação linear obtido (0,9986) foi considerado

adequado, indicando uma boa correlação entre concentração de metildopa e medidas de

resistência.

VI. 3.7.2. Análise das amostras de comprimidos

As amostras analisadas foram preparadas conforme o procedimento descrito no item

VI. 2.3. Os resultados obtidos a partir das medidas de resistência das soluções contendo o

produto colorido da reação entre metildopa e p-cloranil foram estatisticamente comparados

com aqueles obtidos pelo método da Farmacopéia Brasileira (FARMACOPÉIA..., 1988). Para

todas as formulações analisadas, os resultados obtidos pelo método da Farmacopéia e pelo

método adaptado para o dispositivo portátil foram comparados aplicando-se os testes t e F,

com nível de confiança de 95%. Em todos os casos, o valor de F e de t calculados não

excederam os valores teóricos, indicando que não há diferença significativa entre ambos

métodos com relação à precisão e exatidão (Tabela 25). Estes resultados evidenciaram a

aplicabilidade do sistema de medidas portátil para a determinação de metildopa em

formulações farmacêuticas.

146

Tabela 25. Determinação de metildopa em formulações farmacêuticas comerciais.

Método Fotométrico Método de ReferênciaAmostrasa

Valor Encontradob (mg/comprimido)

Valor de t (2,78)c

Valor de F (19,00)c

Valor Encontradob (mg/comprimido)

A 247,1±7,7 0,14 2,47 249,0±1,8

B 251,9±3,6 0,92 9,00 249,9±1,2

C 250,4±4,2 0,59 6,10 248,9±1,7

D 260,9±4,1 0,52 8,58 258,5± 1,4 a Valor Nominal: 250 mg metildopa/comprimido b Média ± Desvio padrão (DP), n = 3. c Valores teóricos de t e F em nível de confiança de 95%.

VI. 3.8. Conclusões

Os resultados obtidos neste trabalho indicaram que o método espectrofotométrico

proposto foi efetivo para a determinação de metildopa em formulações farmacêuticas. Além

disso, foi possível obter rapidez na reação entre metildopa e p-cloranil com a adição de H2O2.

O produto colorido formado apresentou absorção máxima na região visível do espectro (535

nm) contornando as inconveniências dos métodos baseados em medidas na região do UV, os

quais estão sujeitos a interferências de substâncias comumente presentes nas formulações

farmacêuticas que absorvem nesta região do espectro. Planejamento fatorial foi empregado

para estabelecer as melhores condições para a reação. Os maiores valores de absorbância

foram obtidos a partir de 770 μL de solução de p-cloranil e 85 μL de H2O2. O método

espectrofotométrico proposto foi estatisticamente comparado com o método descrito na

Farmacopéia Brasileira, demonstrando boa concordância em relação à precisão e à exatidão.

O método espectrofotométrico desenvolvido foi, então, adaptado a um dispositivo portátil

baseado em medidas fotométricas. As principais vantagens deste dispositivo são:

147

simplicidade, facilidade de se obter e operar o equipamento e baixo custo. O método adaptado

ao dispositivo portátil foi estatisticamente comparado com o método da Farmacopéia

Brasileira apresentando bons resultados de precisão e exatidão. Portanto, este sistema

representa uma opção para que farmácias de manipulação possam realizar o controle de

qualidade de medicamentos com confiabilidade e baixo custo.

148

Capítulo VII. Conclusões Gerais

149

Os métodos analíticos desenvolvidos neste trabalho para a determinação de

furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol utilizando a combinação espectroscopia

de reflectância difusa - spot test foram aplicados com sucesso na análise de formulações

farmacêuticas comerciais e foram considerados confiáveis, podendo ser úteis no controle de

qualidade de medicamentos. Além disso, os métodos por espectroscopia de reflectância difusa

demonstraram, de maneira inédita, o uso desta técnica combinada com spot test para a

quantificação de fármacos em formulações farmacêuticas. A combinação espectroscopia de

reflectância difusa - spot test oferece vantagens relacionadas principalmente à simplicidade,

rapidez e baixo consumo de reagentes e solventes, sendo muito interessante do ponto de vista

da Química Verde, a qual tem interesse por métodos e técnicas que reduzem e eliminam o uso

e a geração de substâncias prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente.

A falta de interferências dos excipientes avaliados demonstrou uma boa seletividade

dos métodos desenvolvidos no presente trabalho. Os métodos descritos na Farmacopéia

Britânica (2001) utilizados para comparação com os métodos reflectométricos propostos são

baseados em medidas diretas na região do UV e estão sujeitos a interferências provenientes de

excipientes presentes nas formulações ou possíveis falsificações e/ou adulterações, resultando

em baixa seletividade, uma vez que todos os compostos insaturados apresentam uma ou mais

bandas na região UV do espectro eletromagnético.

O método espectrofotométrico para a determinação de metildopa em formulações

farmacêuticas foi aplicado com sucesso na análise de formulações farmacêuticas comerciais.

O produto da reação entre metildopa e p-cloranil, na presença de peróxido de hidrogênio

apresentou absorção máxima na região do visível (535 nm), evitando possíveis interferências

de excipientes que absorvem na região do UV. Os resultados demonstraram que o uso de

peróxido de hidrogênio foi extremamente útil, uma vez que agiu como um acelerador da

reação, evitando a necessidade de aquecimento. Considerando estes resultados, sugere-se que

150

outros métodos envolvendo reações entre doadores de elétrons e p-cloranil podem ser

melhorados com o uso de peróxido de hidrogênio.

O método espectrofotométrico foi adaptado ao dispositivo portátil de medidas

fotométricas e os resultados da comparação com o método oficial indicaram que este sistema

representa uma boa opção para que farmácias de manipulação possam realizar controle de

qualidade destes medicamentos com confiabilidade e baixo custo.

151

Capítulo VIII. Perspectivas Futuras

152

Diante dos resultados obtidos no presente trabalho, surgem algumas perspectivas de

trabalhos futuros que dão continuidade à linha de pesquisa envolvendo o desenvolvimento de

métodos analíticos para a determinação de medicamentos. Entre elas, destacam-se:

a) Aplicação dos métodos analíticos desenvolvidos para a quantificação de

furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em fluidos biológicos, visando a

monitorização dos níveis terapêuticos destes fármacos e a análise de doping, uma vez que tais

fármacos estão incluídos na lista de substâncias proibidas pelo Comitê Olímpico

Internacional.

b) Aplicação do método espectrofotométrico para a determinação de metildopa em

amostras de fluidos biológicos visando a monitorização terapêutica.

c) Automação dos métodos propostos, tanto por espectroscopia de reflectância difusa

como por espectrofotometria, utilizando análise por injeção em fluxo.

d) Estudar mais detalhadamente a reação entre metildopa e p-cloranil, na presença de

peróxido de hidrogênio, com intuito de elucidar o mecanismo da reação e compreender a

formação do produto colorido.

153

Capítulo IX. Referências

154

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