CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO PR-REITORIA DE PS-GRADUAO, PESQUISA E EXTENSO REA DE CINCIAS TECNOLGICAS Curso de Mestrado em Nanocincias GRACIELA SCHNEIDER VITALIS UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMO ALTERNATIVA DE MEDICAO INTRACANAL. Santa Maria, RS 2012 GRACIELA SCHNEIDER VITALIS UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMOALTERNATIVA DE MEDICAO INTRACANAL. Dissertao apresentado ao Curso de Mestrado emNanocinciasdoCentroUniversitrio FranciscanodeSantaMariacomorequisito parcialparaobtenodottulodeMestreem Nanocincias. Orientador(a): Prof(a). Dr(a). RENATA PLATCHECK RAFFIN Santa Maria, RS 2012 Se vi mais longe foi por ter me apoiado em ombros gigantes Isaac Newton AGRADECIMENTOS Agradeo aos meus pais pela oportunidade e valorizao do estudo, pela dedicao a mim prestada, e apoio em cada deciso tomada. Ao meu grande marido, Carlos F. Brilhante Wolle, pelo amor eterno, palavras de incentivo, colaborao, dedicao e pacincia, muita pacincia. Sem o teu apoio seria impossvel realizar qualquer sonho.Ao meu filho rico, que me ensinou o que o verdadeiro amor, e a importncia que tem um simples e sincero sorriso. s pessoas que de uma forma ou outra, me deram suporte para estar ausente, me substituindo em afazeres dirios, fazendo com que, mesmo a distancia, eu tivesse confiana e serenidade para saber que meu filho estava bem. Em especial Jussara. Ao meu irmo Alex e minha cunhada Mait, pelo companheirismo, dedicao e todo apoio desprendido a minha famlia. Ao meu sogro, cunhados, concunhadas e sobrinhos, pelos fins de semana de descontrao e momentos de alegria. Em especial Luciana, por ter se mostrado forte e segura nos momentos em que tudo parece ruir. Aos meus amigos, que por hora, um pouco afastados devido s circunstncias, nunca deixaram de estar ao meu lado. Em especial a Mariana Sudati Rodrigues, pela cumplicidade e dedicao nossa amizade.Aos meus colegas de mestrado, que foram muitos, pelo companheirismo, ajuda mtua e horas descontradas no laboratrio, em especial Michelli, Ricardo, Delita, Fran e Ana. Gabi Farias, pela amizade, oportunidade de convvio e muita ajuda no laboratrio. Isabel Roggia e Gabi Moraes, pelo apoio e auxlio nas horas de maior sufoco, sempre dispostas a nos ajudar. A aluna Camilla Filippi, pela dedicao e auxlio no laboratrio de microbiologia. Aos professores Roberto Christ e Sandra Cadore pela colaborao a este trabalho. professora Patrcia Gomes pela dedicao e carinho com que trata a docncia. Aos demais professores do Mestrado em Nanocincia, por todo conhecimento ofertado, colaborando para o meu crescimento pessoal e profissional. Ao Anderson Veras Maciel pela receptividade e disposio. Karla, Gustavo, Madjer, Micheline e Fernanda Corra, pelo auxlio e colaborao. PUCRS e UFPEL pela oportunidade de trabalhar com pessoas dedicadas e dispostas a colaborar para o desenvolvimento deste trabalho, em especial ao Juliano Soares, Luciana Zollmann, Professora Dra. Adriana Etges e Silvana Pereira de Souza.s pessoas que nasceram com o dom de fazer da docncia a sua profisso, me fazendo entender que pesquisa no se faz sozinho, e que o conhecimento uma troca de experincia: Professora Solange Fagan, que foi a grande incentivadora desta louca aventura, pela amizade e doao ao meio acadmico. Professora Maria Martha Campos, pelo exemplo, incentivo, acolhimento e colaborao. E professora, e minha orientadora, Renata Raffin, pela coragem de ter aceitado o desafio de me orientar, dedicando a mim muita pacincia, conhecimento, palavras de incentivo e amizade. O que me possibilitou desvendar os mistrios de se fazer pesquisa, servindo de exemplo e estmulo docncia. Muito Obrigada! RESUMO Amedicaointracanaltemporobjetivoeliminarosmicrorganismospresentesno interiordosistemadecanaisradiculares,possibilitandooreparodostecidosperirradiculares danificadospelaaomicrobiana.Apesardosinmerosmedicamentosutilizados,aindano existeumfrmacoideal.Assim,esteestudovisadesenvolverecaracterizarnanopartculas contendoclorexidina,avaliarseuprocessodedegradaonaassociaocomapastade hidrxidodeclcioeanalisarsuaeficciaatravsdetestesinvitroeinvivo.Foram desenvolvidasecaracterizadasnanopartculaslipdicasslidascontendoclorexidinanas concentraes de 0,2 e 0,5 %, na forma de suspenso e gel, apresentando valores de tamanho mdio de partcula de 88,5 nm e 84,6 nm,respectivamente. Asamostras foram armazenadas por90diasmantendo-seestveisemtemperaturaambienteegeladeira,porminstveisem estufaa40C.Odoseamentodaclorexidinalivreassociadapastadehidrxidodeclcio mostrouumareduode33%defrmacoaps14diasdeanlise,jaclorexidina nanoencapsulada sofreu degradao de apenas 10 % do seu total. O teste de difuso em gar frenteC.albicanseE.faecalis,peloperodode72h,mostrouhalosdeinibiodemenor tamanho, porm com aumento crescente. Apesar deste resultado aparentemente desfavorvel, aconcentraoinibitriamnimamostrouvaloresiguaisparaasnanopartculasem comparao ao frmaco livre frente aos mesmos microrganismos. Para observar a penetrao das nanopartculas no interior dos tbulos dentinrios foi utilizado como mtodo de anlise a microscopiaeletrnicadevarreduraassociadaenergiadispersivaderaiosX,atravsda identificao de tomos de cloro. Esta tcnica permitiu observar a presena das nanopartculas no interior dos tbulos e depositadas sobre a superfcie dentinria. No teste in vivo em ratos, foipossvelobservar,radiograficamenteehistologicamente,aaodasnanopartculas lipdicas de clorexidina, inclusive da associao pasta de hidrxido de clcio, melhorando as propriedadesmicrobianasdamistura.Osresultadossugeremqueaclorexidinapodeser associadaananopartculaslipdicasslidas,mantendoaaoantimicrobianadaclorexidina, possibilitandoseuusocomomedicaointracanalemOdontologiaeauxiliandona preservaodofrmacoquandoemassociaocomapastadehidrxidodeclcioevitando sua degradao pelo elevado valor de pH.

Palavras-chave:clorexidina,hidrxidodeclcio,medicaointracanal,nanopartculas lipdicas slidas. ABSTRACT Intracanal medication aims to eliminate micro-organisms present within the system of canals, making the repair of tissues damaged by microbial action. Despite the numerous drugs used,thereisnotanidealdrug.Thisstudyaimedtodevelopandcharacterizenanoparticles containing chlorhexidine. Furthermore, it aimed to evaluate its degradation when associated to calciumhydroxide,andtoanalyzetheirperformanceinvitroandinvivo.Solidlipid nanoparticles containing chlorhexidine were developed and characterized in concentrations of 0.2and0.5%chlorhexidine(suspensionandgel),showingaverageparticlesizevaluesof 88.5 nm and 84.6 nm, respectively. The samples were stored for 90 days and remained stable at5Candroomtemperature,butunstableat40C.Thefreechlorhexidineconcentration reduced in 33% when associated to calcium hydroxide after 14 days ofanalysis. O the other hand,nanoencapsulatedchlorhexidinedegradedonly10%atthesameconditions.Theagar diffusion test against C. albicans and E. faecalis, for 72 h, showed smaller zone of inhibition but they increased size. Despite this seemed unfavorable, the MIC result showed equal values for chlorhexidine in free form and in nanoparticles. To verify the penetration of nanoparticles inthedentintubules,SEM/EDSwasused,throughtheidentificationofchlorineatoms, allowing the observation of nanoparticles in the interior of dentin tubules and deposited on the dentinsurface.Intheinvivotestusingrats,itwasabletoobserve,histologicallyand radiographically,theeffectofthelipidnanoparticles,includingwhenassociatedtocalcium hydroxide,improvingtheantimicrobialpropertiesoftheassociation.Theseresultssuggest thatchlorhexidinecanbeassociatedtosolidlipidnanoparticles,keepingitsantimicrobial effect, enabling its use as intracanal medication in dentistry, and assisting in the preservation ofthedrugwheninassociationwithcalciumhydroxidepastetoavoidtheirdegradationby high pH value. Keywords:calciumhydroxide,chlorhexidine,intracanalmedication,solidlipid nanoparticles. LISTA DE ABREVIATURAS ACN Acetonitrila; ANOVA Anlise de Varincia; ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria; ATCC American Type Culture Collection; B&B Microscopia ptica Brown e Brenn BHI Brain Heart Infusion; BV Balo volumtrico; CA Acetato de clorexidina; CDA Diacetato de clorexidina; CEUA Comisso de tica no Uso de Animais; CIM- Concentrao inibitria mnima; CL Clorexidina;CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia; COBEA Conselho Brasileiro de Experimentao Animal; DMSO Dimetil sulfxido; DP Desvio Padro; DPR Desvio Padro Relativo; EDS Espectrometria dispersiva de raios-X; EDTA cido Etilenodiaminotetractico; ES Estufa; GE Geladeira; HCA Pasta de hidrxido de clcio; IARC International Agency of Research on Cancer; IPD ndice de polidisperso; LPS Lipopolissacardeo; MEV Microscopia Eletrnica de Varredura; MET Microscopia Eletrnica de Transmisso; MFA Microscopia de Fora Atmica; MHA Agar Muller-Hinton; MMT montmotilonita; NBR - Nanopartculas Lipdicas Slidas sem o frmaco; NC Nanocpsulas; NCL Nanopartculas Lipdicas Slidas de Clorexidina; PCL Poli (-caprolactona); PLGA Poli (L-cido lctici-co-cido gliclico); PUCRS Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul; TA Temperatura ambiente; UFC unidades formadoras de colnia;UFPEL Universidade Federal de Pelotas; UFRGS Universidade Federal do Rio grande do Sul;UNIFRA Centro Universitrio Franciscano. SUMRIO LISTA DAS FIGURAS .......................................................................................................... 15 LISTAS DAS TABELAS ....................................................................................................... 18 1.INTRODUO ............................................................................................................... 18 1.1. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 19 2.REFERENCIAL TERICO ............................................................................................ 20 2.1. A ESTRUTURA DENTRIA .......................................................................................... 20 2.2. O TRATAMENTO ENDODNTICO .............................................................................. 23 2.3. A CLOREXIDINA ............................................................................................................ 26 2.4. AS NANOPARTCULAS ................................................................................................. 32 3. METODOLOGIA ............................................................................................................... 37 3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ..... 37 3.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 37 3.1.2. Preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina ..................................... 37 3.1.3. Preparo das suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina. ....... 38 3.1.4. Preparo dos gis contendo NCL. .................................................................................... 40 3.2. CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS ........................................................ 41 3.2.1. Determinao do potencial zeta ...................................................................................... 41 3.2.2. Determinao do ndice de polidisperso e dimetro das partculas .............................. 41 3.2.3. Determinao do pH ....................................................................................................... 41 3.2.4. Validao da metodologia para doseamento da clorexidina .......................................... 42 3.2.4.1. Mtodos Cromatogrficos ........................................................................................... 42 3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina ............................................ 42 3.3.DETERMINAODAESTABILIDADEDASSUSPENSESEGISCONTENDO NCL............. ............................................................................................................................. 43 3.4. ENSAIO MICROBIOLGICO ........................................................................................ 43 3.4.1. Preparo da suspenso microbiana ................................................................................... 43 3.4.2. Concentrao inibitria mnima ..................................................................................... 44 3.4.3 Teste de difuso em gar com cilindro de ao inoxidvel ............................................... 46 3.5.AVALIAOINVITRODADEGRADAODACLOREXIDINAQUANDO ASSOCIADA PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO ..................................................... 47 3.5.1. Diviso dos grupos ......................................................................................................... 47 3.5.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 48 3.5.3. Determinao do pH ....................................................................................................... 49 3.5.4. Doseamento da clorexidina ............................................................................................ 49 3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAO NOS TBULOS DENTINRIOS .................. 50 3.6.1. Obteno dos dentes humanos ........................................................................................ 50 3.6.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 50 3.7. ESTUDO IN VIVO ............................................................................................................ 52 3.7.1. Distribuio dos grupos e clculo do tamanho da amostra ............................................ 53 3.7.2.Induo das leses periapicais ....................................................................................... 54 3.7.3.Instrumentao e preenchimento do canal..................................................................... 54 3.7.4. Exame radiogrfico......................................................................................................... 54 3.7.5. Anlise histolgica ......................................................................................................... 55 3.7.6. Anlise Estatstica .......................................................................................................... 56 4. RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 57 4.1. PREPARO DAS NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ........................ 57 4.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 57 4.1.2. Preparo das nanocpsulas polimricas de clorexidina .................................................... 57 4.1.3. Preparo das NCL ............................................................................................................ 58 4.2. CARACTERIZAO DAS NCL ..................................................................................... 59 4.3.DETERMINAODAESTABILIDADEDASSUSPENSESEGISCONTENDO NCL.... ...................................................................................................................................... 64 4.3.1. Dimetro mdio das partculas e ndice de polidisperso............................................... 64 4.3.2. Anlise do pH e doseamento .......................................................................................... 68 4.4.AVALIAOINVITRODADEGRADAODACLOREXIDINAASSOCIADA PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO ................................................................................. 71 4.4.1. Anlise do pH ................................................................................................................. 72 4.4.2. Doseamento .................................................................................................................... 73 4.5. ANLISE MICROBIOLGICA ...................................................................................... 75 4.5.1. Teste de difuso em gar ................................................................................................ 75 4.5.2. Concentrao inibitria mnima (CIM) .......................................................................... 77 4.6. PENETRAO DAS NANOPARTCULAS NOS TBULOS DENTINRIOS .......... 78 4.7. ESTUDO IN VIVO EM RATOS ....................................................................................... 84 4.7.1. Anlise radiogrfica ........................................................................................................ 84 4.7.2. Anlise histolgica ......................................................................................................... 87 5. CONCLUSO ..................................................................................................................... 92 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................. 94 ANEXOS ............................................................................................................................... 108 ANEXO1Validaodametodologiaanalticaparadoseamentodaclorexidinanas suspenses e gis de nanopartculas. ................................................................................... 108 1. Especificidade ..................................................................................................................... 108 2. Linearidade ......................................................................................................................... 109 3. Preciso e repetibilidade ..................................................................................................... 110 4. Exatido .............................................................................................................................. 111 ANEXO 2 Carta de aprovao pelo comit de tica para realizao do experimento em ratos..... .................................................................................................................................. 113 ANEXO3Cartadeaprovaodocomitdeticaparaestudoutilizandodentes humanos. ................................................................................................................................ 114 LISTA DAS FIGURAS Figura1:Estruturadentriaesuadivisomorfolgica. http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-de-canal/ ......................................................................................................................................... 20 Figura 2: Estrutura dentria, em destaque a presena dos tbulos dentinrios. ....................... 21 Figura 3: Estrutura dentria com presena de crie e contaminao do tecido pulpar. ............ 21 Figura 4: Micrografias mostrando a presena de E. faecalis no interior dos tbulos dentinrios de dentes bovinos. Microscopia eletrnica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987). ......... 22 Figura5:InfecodostbulosdentinriosdedentesbovinosporE.faecalis.B&Bstain microscopia ptica (Hapassalo e Orstavik, 1987). ................................................................... 22 Figura6:Esquemadidticodemonstrandoasequnciadeprocedimentodotratamento endodntico: preparo biomecnico, conometria e obturao. .................................................. 23 Figura 8: Estrutura qumica da clorexidina .............................................................................. 26 Figura9:Representaoesquemticade(a)nanocpsulase(b)nanoesferas;eB. Representaoesquemticadenanopartculaslipdicasslidas(STROHER,ARMIJOe RAFFIN, 2010). ........................................................................................................................ 33 Figura10:Mtododeobtenodenanopartculaslipdicasslidascontendoclorexidinapor altas taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax ....................... 40 Figura 11: Fluxograma ilustrativo da microdiluio para determinao da CIM. ................... 45 Figura 12: Placas de 96 poos para microdiluio e definio das CIMs. ............................... 45 Figura 13: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o testede difuso em gar com cilindros de ao inoxidvel. .............................................................................................. 46 Figura 14: Esquema de distribuio das amostras na placa petri. ............................................ 47 Figura15:Etapasrealizadasparaopreparodasamostras.A)eB)Aassociaodosgis pasta de hidrxido de clcio foi feita na proporo 1:1, em peso; C) Mistura dos gis; D) Gis armazenados em recipiente e ambiente apropriado. ................................................................. 48 Figura 16: Preparo das amostras para anlise em CLAE. A)Gis e pastasforam pesadosem umbalovolumtricode10mL;B)Osbalesforamagitadosnovortexpor5minutos;C) Gislevadosparasonicarpor15minutos;D)Ocontedodosbalesfoitransferidopara tubos de ensaios e depois para centrfuga por 15 min. ............................................................. 49 Figura 17: Etapas realizadas para o processo de anlise das nanopartculas lipdicas no interior do elemento dentrio. A) Padronizao das amostras; B) confeco de sulcos para o processo declivagem;C)Clivagemdaestruturadentria;D)Dessecadorutilizadoparaoprocessode desidrataodasamostras;E)Amostrasfixadasemstubemetalizadascomouro;F) MEV/EDS utilizado para registro das micrografias e espectros. ............................................. 52 Figura 18: Fluxograma das etapas para o estudo in vivo. ......................................................... 56 Figura19:Distribuiodotamanhomdiodaspartculas(nm)inicialdassuspenses contendo NCL 0,2 % (linha vermelha); 0,5 % (linha verde) e NBR (linha azul). ................... 60 Figura20:Valoresreferentesasobreposiodosgrficosdopotencialzeta(mV)(A)da suspenso e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspenso e gel NCL 0,5 %; (C) suspenso e gel NBR; e(D)suspensoegeldofrmacolivre.Aslinhasvermelhasrepresentamopotencialzeta inicial, e as linhas verdes aps os 90 dias. ................................................................................ 62 Figura21:Valoresreferentesasobreposiodosgrficosdotamanhomdiodaspartculas (nm)(A)dasuspensoegeldeNCL0,2%;(B)dasuspensoegeldeNCL0,5%;(C) suspenso e gel de NBR. As linhas vermelhas representam as suspenses e as linhas verdes os gis. ........................................................................................................................................... 63 Figura 22: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses de NCLs (A) 0,2% e (B) 0,5% no tempo 0 (linhas vermelhas) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linhas verdes), GE (linhas azuis) e ES (linhas pretas)............................................................. 65 Figura 23: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses NBRs no tempo0(linhavermelha)eaps90diasdearmazenamentoemTA(linhaverde),GE(linha azul) e ES (linha preta). ............................................................................................................ 66 Figura 24: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NCLs (A) 0,2%e(B)0,5%notempo0(linhasvermelhas)eaps90diasdearmazenamentoemTA (linhas azuis), GE (linhas verdes) e ES (linhas pretas) ............................................................ 67 Figura 25: Proliferao fngica nas amostras dos gis de NBRs armazenadas em GE e ES. .. 68 Figura 26: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NBRs no tempo 0 (linha vermelha) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linha verde). ................ 68 Figura 27: Sobreposio de cromatogramas correspondente ao gel de NCL 0,5 % (linha preta) e NCL 0,5 % HCA aps 2 (linha vermelha) e 14 dias (linha rosa). ......................................... 74 Figura28:Placasapsoperodode72horasparaanlisedodimetrocompaqumetro digital. ....................................................................................................................................... 76 Figura29:Micrografiaeletrnicadaexposiodostbulosdentinriosapsoprocessode remoo da smear layer nas amostras do grupo controle. ........................................................ 79 Figura30:Microscopiaeletrnicadevarredura.A)Micrografiaeletrnicadadeposiodas NCLsobreasuperfciedentria.B)MicrografiaeletrnicadapresenadeNCLnointerior dos tbulos dentinrios. ............................................................................................................ 80 Figura 31: A) Micrografia da estrutura dentria com a suspenso de NCL depositada (1) sobre aluzdocanale(2)nointeriordostbulosdentinrios.B)EspectrodoEDSmostrando presenadecloro(1)nasuperfciedentriaeemmenorquantidadedetomoscloro(2)no interior dos tbulos dentinrios. ............................................................................................... 81 Figura32:MicrografiasdeNCLobliterandoaentradadostbulosdentinrios(A)emgele (B) em suspenso. ..................................................................................................................... 82 Figura 33: Micrografia dos tbulos dentinrios. A) em gel. B) em suspenso. ....................... 82 Figura 34: A) Micrografia de NCL na superfcie dentria e no interior dos tbulos dentinrios e B) seus respectivos espectros em EDS. ................................................................................. 83 Figura35:A)Micrografiadaregioapicaldocanalradicularemnimapresenade NCLsobreasuperfciedentinria,confirmadaB)peloespectrodoEDSqueidentificou pequena quantidade de cloro. ................................................................................................... 83 Figura36:Imagensradiogrficasrepresentativasdaslesesperiapicaisemratosapsa utilizao de medicaointracanal deacordo com cadagrupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA. ......................................................................................................................................... 85 Figura37:Grficoreferentesreasderadiolucidezdaslesesperiapicaisapartirdas imagens radiogrficas aps o tratamento com diferentes medicaes intracanal. ................... 86 Figura38:Imagensdaslminashistolgicasrepresentativasdaslesesperiapicaisemratos apsautilizaodemedicaointracanaldeacordocomcadagrupo:(A)Controle;(B)Gel CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA. ........................................................................................................................ 88 Figura39:Grficoreferenteaosescoresdoinfiltradoinflamatrioapartirdaanlise histopatolgica .......................................................................................................................... 89 Figura40:Sobreposiodecromatogramas:linhaazulcorrespondenteananopartcula lipdica sem a presena de frmaco; linha preta correspondente ao hidrxido de clcio e linha vermelha correspondente amostra padro de clorexidina....................................................... 108 Figura 41: Curva padro da clorexidina obtida por CLAE. ................................................... 110 Figura 42: Fluxograma do teste de exatido. .......................................................................... 111 LISTAS DAS TABELAS Tabela1:Componentesutilizadosnafaseorgnicaparaopreparodassuspensescontendo nanocpsulas de clorexidina. .................................................................................................... 38 Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspenses contendo NCL. . 39 Tabela 3: Diviso dos grupos de acordo com a medicao testada para determinao da CIM. .................................................................................................................................................. 44 Tabela 4: Diviso dos grupos de acordo com a formulao. .................................................... 47 Tabela 5: Distribuio dos grupos. ........................................................................................... 51 Tabela 6: Distribuio dos animais nos diferentes grupos experimentais. ............................... 53 Tabela 7: Composio das nanocpsulas polimricas alterada por este estudo. ...................... 58 Tabela8:Valoresreferentescaracterizaofsico-qumicadassuspensescontendoNCL 0,2 e 0,5 % e NBR, e do frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP). ............................... 59 Tabela 9: Valores referentes caracterizao fsico-qumica dos gis contendo NCL 0,2 e 0,5 % e NBR, e frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP). .................................................. 61 Tabela 10: Dimetro mdio das partculas e IPD das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP). ....................................................................................................................................... 65 Tabela 11: Dimetro mdio das partculas e IPD dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP). .................................................................................................................................................. 67 Tabela12:MdiadopHedoseamentodassuspensesdeNCLs0,2e0,5%,NBReCL (+DP). ....................................................................................................................................... 69 Tabela 13: Mdia do pH e doseamento dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP). ..... 70 Tabela 14: pH inicial e final de cada formulao. .................................................................... 72 Tabela15:Concentraoinicial(%)defrmacoeapsoperodode14diasnosdiferentes grupos, e sua reduo neste perodo. ........................................................................................ 74 Tabela 16: Mdia dos halos de inibio (mm) + DP da soluo de CL e das NCL. ................ 76 Tabela 17: CIM de acordo com a formulao e o tipo de microrganismo. .............................. 77 Tabela 18: Anlise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 81 Tabela 19: Anlise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 83 Tabela 20: Anlise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 84 18 1.INTRODUO A estrutura dentria formada por esmalte, dentina e cemento. A dentina composta porinmerostbulosdentinriosquepossuemdimetrovariandode2,5m(prximo polpa)a1m(najunodentina-esmalteecemento-dentina)totalizandoaproximadamente 15.000tbulosem1mm2dedentinaprximojunocemento-dentina.Pelapresenade cries,fraturasoudesgastesdaestruturadentria,osmicrorganismospodempenetrar, multiplicar-se e invadir numerosos tbulos expostos (COHEN e BURNS, 1998) e, devido ao dimetro, podem alcanar uma profundidade de 200 m nas reas cervical e mdia da raiz, e cerca de 60 m na regio apical (LOVE, 1996).Asbactriasquepenetramnostbulosdentinriossoaprincipalcausadas inflamaespulpareseperiapicais.Devidoaisso,oobjetivodotratamentoendodntico elimin-lasdoscanaisradiculares,parapossibilitararesoluoeoreparodostecidos perirradiculares danificados pela ao bacteriana (COHEN e BURNS, 1998). Para auxiliar no processo de desinfeco do canal principal e seus tbulos dentinrios soutilizadosagentesqumicos,comosoluesirrigadoras,emedicamentosintracanal (LEONARDO, 2008). O uso de medicaes intracanal tem sido defendido por alguns autores (HELING et al, 1992;EVANSetal,2003;SIRNetal,2004,VIANNAetal,2004;SOARESetal,2006; LEONARDO,2008)porreduzironmerodemicrorganismosqueresistiramaopreparo biomecnico,tornandoosistemadecanaisradicularesummeioimprprioparaoseu desenvolvimento e proliferao.Dentreasalternativasdemedicaointracanal,encontra-seaclorexidina,quevem sendoamplamentepesquisadadevidoainmerasqualidadesqueapresenta,comoao antimicrobianaimediataeamploespectroantimicrobianosobrebactriasGram-positivas, Gram-negativas,anaerbicasfacultativaseaerbias,almdeatuartambmemlevedurase fungos (HENNESSEY, 1973; SEN, SAFAVI, SPANGBERG, 1999).Parapotencializarosbenefciosdaclorexidina,podemosbuscarauxliona nanotecnologia,atravsdesistemasdeliberaocontroladadefrmacos,queapresentam diversasvantagenssobreosistemadeadministraoconvencional.Dentreasvantagens, destacam-seamaioreficciateraputica,proporcionadapelaliberaoprogressivae controlada do frmaco a partir da nanopartcula e, a diminuio significativa da toxicidade por 19 utilizarmenorconcentraodofrmacoepossuirmaiortempodeao.Almdisso,esse sistema evita a instabilidade e decomposio do frmaco (bio-inativao prematura); alm de possibilitar a penetrao mais profunda nos tecidos em decorrncia do seu reduzido tamanho (NHUNG et al, 2007). 1.1. OBJETIVOS

Apesardosinmerosmedicamentosutilizadosentreassessesdotratamento endodntico,aindanoexisteumfrmacoideal.Destaforma,esteestudovisa:(i) desenvolverecaracterizarnanopartculascontendoclorexidina,bemcomoavaliarsua estabilidade; (ii) avaliar in vitro o processo de degradao da clorexidina livre e na forma de nanopartculaapsseumisturacompastadehidrxidodeclcio;(iii)avaliaraao antimicrobianainvitroemcepasdeEnterococcusfaecaliseCandidaalbicans,esuas respectivasconcentraesinibitriasmnimas;(iv)avaliarinvitroapenetraodas nanopartculas no interior dos tbulos dentinrios de dentes humanos extrados e, por fim, (v) avaliar sua ao como medicao intracanal in vivo em dentes de ratos com leso periapical, a partirdaanlisedarespostahistolgicaeradiogrfica,colaborandocomodesenvolvimento de medicamentos mais modernos, completos, eficientes e com menores efeitos indesejveis. 20 2.REFERENCIAL TERICO 2.1. A ESTRUTURA DENTRIA Aestruturadentria(Figura1)compostaporumaporocoronriaeumaporo radicular. A poro mais interna apresenta uma cmara pulpar que preenchida por um feixe vsculo-nervoso chamado de polpa. Na poro coronria, a dentina recoberta pelo esmalte, e na poro radicular, a dentina recoberta pelo cemento. Figura 1: Estrutura dentria e sua diviso morfolgica. http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-de-canal/ Adentinaapresentavriostbulosdentinriosemtodasuaextenso,queso preenchidosporprolongamentosdeclulasespecializadas,osodontoblastos(BHASKAR, 1989).Onmerodetbulosdentinriosaumentaconsideravelmentedapartemdiaat prximopolpa(MARSHALLetal,1997).Assimcomoseudimetro,quepodechegara 2,5 m prximo polpa, enquanto que na juno esmalte-dentina de 0,8 m. Schilkeecolaboradores(2000)estudaramonmeroeodimetrodostbulos dentinriosemhumanoseencontraramnacamadadedentinamaisprofunda, aproximadamente,21.343tbulos/mm2 comdimetromdiode2,90m,enaporomdia 21 dadentinacercade18.781tbulos/mm2comdimetromdiode2,65m,confirmandoque quantomaisprximoapolpa,maiorodimetroequantidadedetbulosdentinrios presentes (MARSHALL et al, 1997) (Figura 2) . Figura 2: Estrutura dentria, em destaque a presena dos tbulos dentinrios. http://periodontiaonline.blogspot.com/2011/03/sensibilidade-dental-uma-luz-no-fim-do.html Muitosdestestbulosdentinriospodemficarexpostosdevidopresenadecries (Figura3),fraturasoudesgastesdaestruturadentria.Quandoexpostos,microrganismos podem penetrar para o seu interior colonizando toda esta regio (COHEN e BURNS, 1998). Figura 3: Estrutura dentria com presena de crie e contaminao do tecido pulpar. http://sites.amarillasinternet.com/sorridente/servicos.html 22 Comoostbulosapresentamdimetromuitomaiorqueosmicrorganismos,estes podem alcanar grandes profundidades de penetrao. Haapasalo e Orstavik (1987) foram os primeirospesquisadoresaintroduzirummodeloparainfecoedesinfecodadentina radicular,invitro,atravsdecilindrosdedentinaobtidosderazesdeincisivosbovinos contaminadosporEnterococcusfaecalis(E.faecalis)peloperodode21dias.Osautores analisaramsuapenetraonostbulosdentinriosatravsdamicroscopiaeletrnicade varredura(Figura4)epticaapscoloraoespecfica(BrowneBrenn)e,observaram,que na infeco leve, a profundidade de penetrao foi de 300 400 m, na infeco moderada de 400 500 m, e em infeco severa chegou a 800 1000 m (Figura 5). Figura 4: Micrografias mostrando a presena de E. faecalis no interior dos tbulos dentinrios de dentes bovinos. Microscopia eletrnica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987). Figura 5: Infeco dos tbulos dentinrios de dentes bovinos por E. faecalis.B&B stain microscopia ptica (Hapassalo e Orstavik, 1987). Estes microrganismos que penetram nos tbulos dentinrios so a principal causa das inflamaes e infeces pulpares e periapicais. 23 2.2. O TRATAMENTO ENDODNTICO AsalteraessistmicassoconsideradasumgrandeproblemadesadenoBrasile tambmnomundo.Noentanto,algumascomplicaesodontolgicaspodemintervirna condiodasadegeraldopaciente,principalmenteseeleapresentaralteraes cardiovasculares,diabetesmellitus,entreoutros,devendoseraprevenoomelhor tratamento. Portanto, mais do que necessrio, importante eliminar riscos de complicaes e melhorar qualitativamente a vida do paciente (GROSSI et al, 1997). Destaforma,otratamentoendodnticotemporobjetivoeliminarosmicrorganismos presentesnosistemadecanaisradiculares,removerotecidopulpardesintegradoquepode servir como substrato para o crescimento microbiano, preencher e vedar o espao endodntico commaterialinerte,estvelecompatvel,impedindoarecolonizaobacteriana,evitandoa periodontiteapical(PINHEIROetal,2009;RICUCCIetal,2009,SINGLAetal,2009) (Figura 6). Figura 6: Esquema didtico demonstrando a sequncia de procedimento do tratamento endodntico: preparo biomecnico, conometria e obturao. http://drarebecamoura.blogspot.com/2010/12/desmistificando-o-tratamento-de-canal.html Paraobtenodesucessonotratamento,adesinfecodosistemadecanais radicularescomapresenadeprocessoinfecciosofundamentalnaterapiaendodntica.A anatomiadocanalradicularcomplexa,contendomuitasramificaeseirregularidades morfolgicas, proporcionando um ambiente favorvel para a colonizao de microrganismos, dificultandooprocessodedesinfeco(LEEetal,2008;MILLEReBAUMGARTNER, 2010). 24 A morfologia complexa do sistema de canais radiculares determina reas inacessveis dopreparobiomecnicocomocanaislaterais,acessrios,secundrios,intercondutos,deltas apicaisetbulosdentinrios,contribuindoparaapermannciademicrorganismosnessas regies (LIN et al., 1991; SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA, 1996). Uma reduo significativa no nmero de microrganismos presentes no canal principal seobtmpeladaaodosefeitosqumicosemecnicosdairrigaoedainstrumentao (SJOGRENetal,1990;HOLLAND,SOARES,SOARES,1992;TROPE,DELANO, ORSTAVIK, 1999). O hipoclorito de sdio a soluo irrigante mais comum usadaem endodontia desde 1900. Pode ser utilizado sozinho ou em combinao com uma soluo quelante, como o cido etilenodiaminotetractico (EDTA), que reduz as bactrias e elimina a lama dentinria (smear layer)aderidasparedesdocanalradicular,promovendoumaumentodapermeabilidadee melhorando o selamento das obturaes (AKISUE et al, 2010; DEWSNUP et al, 2010).Um estudo publicado por Schlafer e colaboradores (2010) assegura que no possvel acessaroscanaislateraisesuasramificaesapicaiscomainstrumentaomecnica.Por isso, usam-se mtodos de desinfeco qumica que tm efeito bactericida, para complementar o mtodo mecnico. Conforme Akisue e colaboradores (2010), a utilizao de hipoclorito de sdioemumintervalodeconcentraesde0,5%a5,25%umeficazagente antimicrobiano.Porm,embaixasconcentraes,ineficazcontramicrorganismos especficose,emaltasconcentraes,tempoucabiocompatibilidade,causandoinflamao periapical. Com tal complexidade, alguns microrganismos permanecem viveis nestas regies de difcilacesso(SJOGRENetal,1990;HOLLAND,SOARES,SOARES,1992;TROPE, DELANO,ORSTAVIK,1999),apresentandoumrpidocrescimentoquandoocanal deixadovazio,semumamedicaointracanalentreassesses(SJOGRENetal,1991; TROPE, BERGENHOLTZ, 2002). Porsetornarumauxiliarimportante,amedicaointracanaldevepossuirao antimicrobianacompotencialparaeliminarmicrorganismosremanescentesaopreparo qumico-mecnico;promoverareparaodostecidosperiapicais(SJOGRENetal,1990; HOLLAND,SOARES,SOARES,1992;TROPE,DELANO,ORSTAVIK,1999);funcionar comoumabarreirafsica,impedindoosuprimentodesubstrato,ocupandoespaoafimde limitar a multiplicao microbiana (CHONG, PITT FORD, 1992). Alm disso, deve reduzir a 25 inflamaoperiapical;apresentarcapacidadedesolubilizarmatriaorgnica,poisa permannciaderesduospodefuncionarcomoreservatriodemicrorganismos(LOPES, SIQUEIRA,2004);teracapacidadedeneutralizarprodutostxicoscomoo lipopolissacardeo(LPS)bacteriano,queumaendotoxinaqueexerceimportantepapelna etiopatogenia das doenas da polpa e dos tecidos perirradiculares (TANOMARU et al, 2003). Ainda,eliminaroexsudatopersistente;noprovocaragressoaostecidosperiapicais; estimularoreparoportecidomineralizadoe,combaterreabsorodentinria(LOPES, SIQUEIRA, 2004). Dentreassubstnciasdeescolhaestohidrxidodeclcio,quefoiintroduzido inicialmente como um agente de capeamento pulpar em 1930, e, desde ento, tem sido usado naterapiaendodnticacomomedicaointracanal(KRITHIKADATTAetal,2007; SIQUEIRAetal,2007;TURKetal,2009).Ohidrxidodeclciotemrecebidodestaque especialporapresentarcertaatividadeantimicrobiana,capacidadedeneutralizartoxinas, manteroselamentotemporriodocanaleestimularareparaodostecidoslocalizadosna regio periapical (ESTRELA et al, 1999). Porm, o tempo necessrio para que o hidrxido de clcio desempenhe suas propriedades de pelo menos duas semanas (NERWICH, FIDGOR, MESSER,1993;TAKAHASHIetal,1996)e,ainda,deveocorreramanutenodealtas concentraesdehidroxilaparaquemantenhaopHemnveisextremamenteelevados (ESTRELA et al, 1999; SJOGREN et al, 1991). Almdisso,ohidrxidodeclcionoconsegueeliminarosmicrorganismosquese encontrammaisprofundamentenostbulosdentinriosounosistemadecanaisradiculares devido a sua baixa solubilidade ou capacidade de difuso (ESTRELA et al, 1999; ERCAN et al; 2007), ou seja, no age quando no h contato direto com o microrganismo e os stios mais distantes acabam por no ter uma elevao significativa do pH (ESTRELA et al, 1995; 1999; 2001).Paracomplementaraaodohidrxidodeclcio,ousodaclorexidinatemsido sugerido por diversos autores (HELING et al, 1992; EVANS et al, 2003; SIRN et al, 2004, SOARES et al, 2006; LEE et al, 2008). Umestudopublicadoem2008porLeeecolaboradoresdescrevequeohidrxidode clcioumexcelenteagenteantimicrobianoparacanaisradicularesinfectados;porm, menos eficaz frente a E. faecalis e C. albicans, microrganismos frequentemente isolados nos casosdeinfecespersistentesdecanaisradiculares,havendoanecessidadedeutilizar medicaointracanalalternativa,comoaclorexidina,quepossuicapacidadedeadsoro 26 dentina,facilitandoaerradicaodafloraresistenteterapia.Paraquehajaamxima atividade antimicrobiana, a superfcie da infeco dentinria deve serexposta a uma soluo concentrada de clorexidina por um perodo suficiente. Siqueira e Sen (2004) referem que medicamentos como a clorexidina e o hidrxido de clcio em associaes tm potencial para serem utilizados como medicamentos intracanal em suspeitadeinfecofngicaebacteriana.ParaTurkecolaboradores(2008),acombinao dessesantimicrobianosmelhoraassuasatividadeseoequilbriodesuasdeficinciascontra infeces polimicrobianas. 2.3. A CLOREXIDINA Em1940,noslaboratriosdepesquisadaImperialChemicalIndustriesLtda., Macclesfield,Inglaterra,aclorexidinafoidesenvolvidaparaserutilizadacomoumagente antiviral; porm, foi abandonada devido sua ineficincia. Anos mais tarde, foi redescoberta devido sua eficcia antibacteriana (ZEHNDER et al, 2006) (Figura 7). Figura 7: Estrutura qumica da clorexidina Fonte: PUBCHEM, 2008. AclorexidinarepresentadapelafrmulamoleculardeC22H30Cl2N10, commassa molar de 505,4 g/mol (PUBCHEM, 2008). Aclorexidinacompostaestruturalmentepordoisanisclorofenlicosnas extremidades, ligados a um grupamento bisguanida de cada lado, conectados por uma cadeia central de hexametileno (DENTON, 1991). Esta bibisguanida catinica uma base forte, mais 27 estvelnaformadesal,sendopraticamenteinsolvelemgua.Ossaisoriginalmente produzidos foram o acetato de clorexidina e cloridrato de clorexidina, mas devido a sua baixa solubilidade em gua foram substitudos, com o passar do tempo, pelo sal atualmente usado, o gluconato de clorexidina (ZAMANY et al, 2003; ZEHNDER, 2006). AssoluesaquosasdeclorexidinasomaisestveisemvaloresdepHde5a8. Acima deste valor, ocorre precipitao da clorexidina, enquanto que em pH cido, h reduo dasuaatividade,devidoperdadaestabilidadedasoluo.EmpHfisiolgico,exerce excelenteatividadeantimicrobiana,proporcionadapelaliberaodasmolculasdecarga positiva (PARSONS et al, 1980; RINGEL et al, 1982) .Oefeitoantimicrobianodaclorexidinasedpelaatraoeadsorodasmolculas catinicasdaclorexidinasuperfciecelulardosmicrorganismos(quecarregada negativamente). Esta interao promove a alterao da permeabilidade da membrana celular, resultandonaperdadoscomponentesintracelularesenodesequilbrioosmticodaclula (HENNESSEY,1973;DELANYetal,1982;GOMESetal,2006).EmpHneutro, rapidamenteadsorvidasuperfciecelulardosmicrorganismos,fazendocomquea concentraodemolculaslivresdeclorexidinanasoluosejabaixa(DAVIES,1973; BONESVOLL et al, 1974). Almdaatividadeantimicrobianadeamploespectro,aclorexidinaapresentaa caractersticadesubstantividade,queaatividaderesultantedaadsoroedasubsequente liberaodaclorexidina,pelasuacapacidadedeligaodeformareversvelssuperfcies dentais (especificamente na hidroxiapatita, presente no esmalte e dentina) e mucinas salivares, sendo lentamente liberada para o ambiente medida que sua concentrao no meio decresce permitindo,dessemodo,umtempodeatuaoprolongado,prevenindoacolonizao bacterianaeodesenvolvimentodobiofilme(BASRANIetal,2002;GOMESetal,2006; SOARES et al, 2007).Asuasubstantividadefoiobservadamantendosuaaoantimicrobianapeloperodo de 48 h (SCHAFER e BOSSMANN, 2005) e 72 horas (SIRN et al, 2004) aps ser removida do canal radicular, o que no ocorre com os demais desinfetantes que rapidamente se dissipam enoapresentamefeitoantimicrobianoresidual.Porm,quantomaiorocontatocomos tecidosperiapicais,dependendodasuaconcentrao,maiorseroosefeitostxicossobre estes tecidos. 28 Hojeemdia,odigluconatodeclorexidinaamplamenteutilizadonasreasmdica, odontolgica,veterinriaealimentar.Naodontologia,suaaplicaoocorrehalgunsanos comoumpotenteagenteanti-spticoutilizadoprincipalmentecomoagenteativode enxaguatriosbucais,agindonocontroledaplacabacterianaenotratamentodeinfeces periodontais. Naendodontia,temsidopropostonaformadelquidoougel,emdiferentes concentraes, tanto como agente irrigante durante o preparo qumico-mecnico (PARSONS et al, 1980; DELANY et al, 1982; JEANSONNE e WHITE, 1994; LEONARDO et al, 1999; FERRAZetal,2001;ZAMANYetal,2003;ERCANetal,2006),quantocomomedicao intracanal(HELINGetal,1992;SIQUEIRAeUZEDA,1997;LINDKOGetal,1998; GOMES et al, 2003; SOARES et al, 2007; VIANNA et al, 2007).Alguns estudos demonstraram que a atividade antimicrobiana da clorexidina lquida igual ou superior ao gel quando o contato direto foi adotado como metodologia (FERRAZ et al,2001;GOMESetal,2001;VIANNAetal,2004).Poroutrolado,aclorexidinaemgel facilitaainstrumentao,melhorandoacapacidadedosinstrumentosemeliminartecidos orgnicos,compensandosuacapacidadededissolv-loediminuindoaformaodesmear layer (FERRAZ et al, 2001). A smear layer foi definida por Sen e colaboradores (1995) como sendoumacamadaamorfa,irregularegranular,compostaporrestoseraspasdedentina, remanescentes de tecido pulpar e bactrias, que acabam se depositando e obturando a entrada dos tbulos dentinrios prejudicando a ao dos agentes irrigantes e medicao intracanal. AclorexidinaapresentaamploespectrodeaosobrelinhagensGram-positivase negativas (HENNESSEY, 1973), mas de fundamental importncia sua ao sobre a espcie Gram-positiva E. faecalis (BASRANIet al, 2002) e ao fungo C. albicans (WALTIMO et al, 1999,PAQUETTEetal,2007),devidorelaodestesmicrorganismoscomoinsucesso endodntico, por persistirem ao protocolo qumico-mecnico convencional de desinfeco do canal radicular. Apesar de todas estas qualidades, o digluconato de clorexidina pode ser inativado por compostos aninicos (PRADO et al, 2004) e no atua, significantemente, na neutralizao do LPS bacteriano, mesmo em concentraes mais elevadas.A concentrao de clorexidina (na forma de digluconato) normalmente utilizada varia entre 0,12 e 2,0 %; porm, em concentraes iguais ou inferiores a 0,25 % menos agressiva exibindoreaesinflamatriasmaisbrandas,noprovocandonecrosetecidualnemedema 29 persistente. Em concentraes iguais ou maiores a 0,5 % produz necrose tecidual e exacerba o processoinflamatrioretardandooprocessodereparaotecidualdoperiodontoapical (PRADO et al, 2004; FARIA et al, 2007).Isso se deve a formao da para-cloroanilina, que um subproduto gerado a partir da hidrlise da clorexidina em funo do tempo, do pH e do aquecimento. uma amina aromtica que tem se mostrado txica para humanos provocando hemlise,metahemoglobinemiaecianose(BASRANIetal,2007).Almdisso,apara-cloroanilinafazpartedoGrupo2BdaIARC(InternationalAgencyofResearchonCancer) formadoporsubstnciasquepossuempossvelaocarcinognicaemhumanos(IARC, 1997b).Ummaiorinteressepelautilizaodaclorexidinacomoagentededesinfecodos canaisradicularessurgiuparaincrementaraspropriedadesantimicrobianasdohidrxidode clcio,jquealgunsmicrorganismostmmostradocapacidadedesobrevivnciaaopH elevado,principalmenteoE.faecaliseC.albicans.Aadiodaclorexidinapoderia proporcionarmaioratividadeantimicrobianaeconferirmaiorsubstantividadeformulao (TANOMARU et al., 2002).Evansecolaboradores(2003)compararamoefeitoantimicrobianodapastade hidrxidodeclcioedasuaassociaocomclorexidina2%utilizandoummodelo experimental in vitro.Incisivos bovinos foram padronizados e contaminados comE. faecalis por1semana.Apsesteperodo,asraspasdedentinaforamcoletadasesemeadasemgar BHI. A contagem das unidades formadoras de colnia foi feita aps a incubao e revelaram que a associao do hidrxido de clcio com clorexidina foi significantemente mais eficaz na eliminao de E. faecalis que o uso isolado de hidrxido de clcio. Basraniecolaboradores(2003)utilizaramdiferentesmodelosexperimentaispara avaliar o desempenho antimicrobiano da clorexidina (0,2 e 2 % lquida ou gel) e hidrxido de clcio (isolado ou em associao clorexidina gel a 0,2 %) contra E. faecalis atravs do teste de difuso em gar por 48 horas e pelo mtodo de desinfeco da dentina radicular humana in vitro aps 7 dias da aplicao das medicaes. Tanto o teste de difuso em gar como o teste dedesinfecodadentinaradicular,mostrouumasuperioridadedaclorexidinagel2%eda soluodeclorexidina2%semdiferenaestatsticaentreelas.Ohidrxidodeclcio apresentou os piores resultados, confirmando que a clorexidina mais efetiva para eliminao do E. faecalis in vitro. Basrani,GhanemeTjaderhane(2004)avaliaramaassociaoentreohidrxidode clcioeaclorexidinacomoobjetivodedeterminarseaspropriedadesfsico-qumicasda 30 formulaoseriamadequadasparaumaboamedicaointracanal.Osresultadosmostraram queaclorexidinanoafetouoelevadopHdohidrxidodeclcio,nemsuaradiopacidadee tempodetrabalho;porm,diminuiuatensosuperficialeaumentouaviscosidadedo hidrxidodeclcio,confirmandoqueaassociaodasduasmedicaesapresenta propriedades fsico-qumicas satisfatrias. SchafereBossmann(2005)analisaramaeficciaantimicrobianadaclorexidinaedo hidrxidodeclciocontraE.faecalisinvitro.Paraisso,40denteshumanosforam padronizados,esterilizadoseinfectadoscomE.faecalispor9dias.Apsesteperodo,foi feita a diviso em 4 grupos para preenchimento do canal com as seguintes medicaes: pasta dehidrxidodeclcio,soluodeclorexidina2%,associaodehidrxidodeclcio soluodeclorexidina2%numaproporo1:1,eguadestilada.Taismedicaes permaneceramnointeriordocanalradicularpor3dias,paraposteriorcoletadasraspasde dentina,queforamlevadasparaanlisemicrobiolgica.Comoresultados,aclorexidina2% foi significantemente mais eficaz que a pasta de hidrxido de clcio e a associao de ambos, enofoiobservadoaumentonaeficciaantimicrobianadohidrxidodeclcioassociado clorexidina 2 %. Barbinecolaboradores(2008)analisaramquimicamenteapresenadepara-cloroanilina,pormeiodaespectrometriademassasecromatografialquida,nasoluode clorexidina0,2%isoladaouemassociaocomohidrxidodeclcio.Asanlisesforam realizadas em seguida ao preparo das amostras e aps o perodo de 7 e 14 dias. Na soluo de clorexidinafoiencontradaapresenadepara-cloroanilinaapsos14dias.Quandoem associaocomhidrxidodeclcio,houvedecomposiototaldaclorexidinaemdiferentes compostos, porm, no foi demonstrada a presena de para-cloroanilina. Para avaliar se a associao entre o hidrxido de clcio e a clorexidina 0,4 % afetava o desenvolvimento do fentipo osteognico in vitro, da Silva e colaboradores (2008) analisaram amorfologiaeaatividadecelular,aatividadedaenzimafosfatasealcalina,teordeprotena total,imunolocalizaodesialoprotenanotecidosseoeaformaodendulos mineralizados. Os resultados mostraram que a associao entre a pasta de hidrxido de clcio e clorexidina 0,4 % no afetou o desenvolvimento do fentipo osteognico.Delgadoecolaboradores(2010)avaliaramaeficciadohidrxidodeclcioedogel declorexidina2%contraE.faecalispresentesnostbulosdentinriosinvitro.Foram utilizados60denteshumanos.Estesforamcontaminadose,posteriormente,tratadoscom hidrxido de clcio,gelde clorexidina 2 %,associao do hidrxido de clcio com ogel de 31 clorexidina2%esalinacomogrupocontrole.Asamostrasdedentinasforamobtidasnas profundidades de 0 100 e de 100 200 m. Estas foram levadas para contagem de unidade formadora de colnias (UFC) e para anlise da viabilidade bacteriana atravs da microscopia defluorescncia.Comoresultados,tantoaclorexidinacomoohidrxidodeclcio apresentaram ao antimicrobiana contra o E. faecalis, porm, a clorexidina apresentou maior atividadeantimicrobianaquandocomparadacomohidrxidodeclcio,eaclorexidina associada com o hidrxido de clcio teve uma ao semelhante a clorexidina isolada.Vaghelaecolaboradores(2011)avaliarameficciaantimicrobiananoprocessode desinfecodetbulosdentinriosutilizandocomoveculosparaohidrxidodeclcioo propilenoglicol e iodofrmio em leo de silicone em comparao ao gel de clorexidina a 2 % contaE.faecaliseC.albicans.Oestudoinvitroutilizoublocosdedenteshumanoseas raspasdedentinaforamremovidasnumaprofundidadede200me400m.Comogrupo controlefoiutilizadosalina.Ogeldeclorexidinaa2%apresentouumaefetividade antibacterianaeantifngicasuperioraosdemaisgrupos.Otipodeveculoalterouas propriedades antimicrobianas do hidrxido de clcio: quando associado ao propilenoglicol, o hidrxido de clcio teve maior ao antibacteriana contra o E. faecalis, e quando associado ao iodofrmiocomleodesilicone,ohidrxidodeclcioapresentouumamaiorao antifngica contra C. albicans. Kayaogluecolaboradores(2011)compararamaatividadeantibacterianadaprpolis comclorexidinaa2%eohidrxidodeclcioemumestudoinvitrocontraE.faecalis.As raspasdedentinaforamcoletadasnostemposde1e7diasapsousodamedicao intracanal e concluram que a clorexidina foi desinfetante mais potente nos dois tempos e que a ao antibacteriana do prpolis foi semelhante ao hidrxido de clcio. Comoobjetivodeavaliarainflunciadogeldeclorexidinaa2%sobreaopH,a liberao de clcio e a capacidade de reduo de endotoxinas da pasta de hidrxido de clcio, Signorettiecolaboradores(2011)realizaramumestudo,comduraode30dias,ondeo grupoIeraformadoporhidrxidodeclcioem soluosalina,grupoIIhidrxidodeclcio associadoaclorexidina2%egrupoIIIformadoporclorexidina2%.OgrupoIeII apresentaram um pH alcalino durante todo o estudo porm, o grupo I apresentou maior valor depHqueogrupoIIapsos30dias.Emrelaoliberaodeclcio,ogrupoIIliberou mais clcio que ogrupoIaps 15 dias. E ogrupoIIeIIIapresentou uma maior reduo de endotoxinasquandocomparadoaogrupoI.Foiobservadoque,invitro,aadioda clorexidina no interfere nas propriedades qumicas do hidrxido de clcio e que nenhuma das 32 pastasavaliadaspodereduzircompletamenteoteordeendotoxinas;porm,aadiode clorexidinaaohidrxidodeclcio,aumentouareduodeendotoxinasemcomparaoao uso isolado. 2.4. AS NANOPARTCULAS Sosistemasdeliberaocontroladadefrmacoseapresentamcomoprincipais vantagens ao sistema de dosagem convencional, a maior eficincia teraputica pela liberao progressivaecontroladadofrmacoencapsulado,necessidadedemenorconcentraodo mesmo e, por isso, diminuio significativa da toxicidade e, promoo de um maior tempo de ao (NHUNG et al, 2007).As nanopartculas lbeis podem-se apresentar na forma de lipossomas, nanoemulses, nanopartculas polimricas (nanoesferas e nanocpsulas), e nanopartculas lipdicas slidas.Asnanopartculaspolimricassocarreadoresdefrmacos,queapresentamtamanho inferiora1m,esocompostas,principalmente,porpolmerosbiodegradveis.Podemser nanocpsulasounanoesferasquediferementresipelasuacomposioeorganizao estrutural (SCHAFFAZICK et al, 2003) como mostra a Figura 8A. Asnanoesferasnoapresentamleoemsuacomposioe,porisso,noapresentam umncleooleosodefinidoe,sim,umsistemamonolticoemqueofrmacoencontra-se homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimrica (SCHAFFAZICK etal,2003).Asnanocpsulassosistemasnanovesicularesapresentandoumncleooleoso rodeadoporumamatrizpolimrica.Acavidadepodeconterumcompostoativolquidoou slidoouumadispersomolecular(FESSIetal,1989).Estereservatriopodeserlipoflico ou hidroflico de acordo com a forma de obteno e material utilizado. Tambm podem conter ocompostoativonasuasuperfcieoudifundidonamatrizpolimrica(KHOEEe YAGHOOBIAN, 2009). 33 Figura 8: Representao esquemtica de (a) nanocpsulas e (b) nanoesferas; e B. Representao esquemtica de nanopartculas lipdicas slidas (STROHER, ARMIJO e RAFFIN, 2010). Asnanopartculaslipdicasslidasforamdesenvolvidasnoinciodadcadade1990 comoumsistemadetransportealternativoaosistematradicionalexistente,comoemulses, lipossomasenanopartculaspolimricas(MULLERetal,2000;MEHNERTeMADER, 2001; MULLER et al, 2002; ALHAJ et al, 2008).Apresentamcomoprincipaisvantagenssuaestabilidadequmica,proteodo composto ativo contra degradao, liberao controlada, excelente tolerncia, e produo em larga escala favorvel (ALHAJ et al, 2008), alm de poder ser utilizados tanto com frmacos hidrofbicos como hidroflicos (MULLER et al, 2000).Muitosmtodostmsidodesenvolvidosparaprepararasnanopartculaslipdicas slidas,taiscomoaltapressodehomogenizao(SIEKMANN,WESTESEN,1994; LANDERetal,2000;LIPPACHERetal,2002,LIPPACHERetal,2004),solventeou emulsificao por evaporao (SIEKMANN, WESTESEN, 1994), ultra-som ou altas taxas de cisalhamento e pelo mtodo de difuso do solvente (HU et al, 2005; 2006).Asnanopartculaslipdicascompartculasslidasnasuamatriz(Figura8B)so derivadas a partir de emulses leo/gua mediante a simples substituio de lipdios lquidos por lipdios slidos temperatura ambiente (MULLER et al, 2007). Durante o processo de produo, os lipdios so fundidos e o frmaco dissolvido nesta faseoleosa,queposteriormente,dispersaemumasoluoaquosasurfactante.Apr-emulsoobtidahomogenizadaaaltapressoproduzindoumananoemulsoquente leo/gua.Apsoresfriamento,gotassecristalizamformandonanopartculaslipdicascom partculas de matriz slida (MULLER et al, 2007). Aoseprepararumananopartculalipdicaslidaapenascomlipdiosslidos,as partculasdamatriztendemaformarumcristalperfeitodeixandoumespaolimitadopara 12 A B 34 acomodarofrmaco,istolimitaacapacidadedearmazenamento,podendolevarexpulso docompostoativodamatrizlipdicaduranteoarmazenamento(BUNJES,WESTESENe KOCH, 1996).J a utilizao da mistura de lipdios slidos e lquidos faz com que ocorra a formao departculasdematrizcomimperfeies,proporcionandomaisespaosparaacomodaro composto ativo proporcionando um aumento na quantidade de composto no interior da matriz durante o armazenamento. Poderia se afirmar que a perfeio do sistema sua imperfeio na matriz cristalina (MULLER et al, 2007). O uso da clorexidina em nanopartculasfoi descrito primeiramente porLboutounne e colaboradores(2002)trabalhonoqualfoirealizadaaencapsulaodaclorexidinabaseem nanocpsulasdepoli--caprolactonaesuaatividadebactericidaresidualavaliada,invivo, comoagenteantispticocomparandoumdetergentedesinfetantedeclorexidinaaoque apresentavananocpsulasdeclorexidina,obtendocomoresultadoumaaobactericida sustentada por mais de 8 horas do detergente que continha nanocpsulas de clorexidina. Nhungecolaboradores(2007)compararamaaodogeldenanocpsulasde clorexidina(Nanochlorex)com2-propanol60%(v/v)egelbasedeetanol62%(v/v) (Purrell) como agente antisptico sob a flora da pele de residentes e confirmou ao imediata esustentadadoefeitobactericidadoNanochlorexconstituindo-secomoummeiopromissor de desinfeco e higienizao das mos em diversos procedimentos. Mengecolaboradores(2009)tiveramcomoobjetivoelaborarumcompostoformado poracetatodeclorexidina(CA)intercaladocomcristaisdemontmorilonita(MMT).No estudo de liberao, apresentou um efeito burstinicial nas primeiras 24 horas e continuou seu processodeliberaoat72horas.Aatividadeantibacterianafoianalisadapelomtododa zonainibitriacontraStaphylococcusaureusePseudomonasaeruginosaeosresultados indicaramforteatividadeantibacterianacontrabactriasGrampositivaseGramnegativas. Assim,concluramqueoMMTpoderiasersugeridocomoumcarreadordeentrega controlada de frmacos.Huynhecolaboradores(2010)desenvolveramumsistemadeliberaocontroladade diacetatodeclorexidina(CDA)abasedepoliuretanoemdoisformatos,emfilmesouem sanduches de poliuretano, obtidos atravs da evaporao do solvente. A liberao de CDA foi dependente da concentrao inicial de frmaco, da estrutura do sistema (filme ou sanduche) e da natureza do meio de liberao (gua destilada ou soluo aquosa de NaCl a 0,9 %). A taxa 35 de liberao foi significantemente menor em soluo fisiolgica. Para CDA-filme, a liberao se prolongou porat 11dias e, em CDA-sanduche, por at 29 dias. O estudo antibacteriano foirealizadocomCDA-filmeemStaphylococcusaureuseStaphylococccusepidermidis permanecendo com atividade antibacteriana por 35 dias. Musialecolaboradores(2010)observaramaliberaodeclorexidinaquando associadametilceluloseepoli(cidoacrlico)comocarreadorespolimricos,naformade gel.Astaxasdeliberaoeconcentraodeclorexidinaforamcomparadascomsua respectivaviscosidade,pHecondutividadenastemperaturasde22C,32C(como temperatura corporal de referncia) e 42 C . Em observao em MEV, com auxlio do EDS, os tomos de cloro foram identificados e co-relacionados com a presena de clorexidina, desta formaadistribuiodaclorexidinanamatrizpolimricasemostroumaishomogeneamente dispersanamatrizdepoli(cidoacrlico).Ataxadeliberaodeclorexidinanosistemade metilcelulosefoiafetadapelatemperatura,quantomaioroaumentodatemperatura,maiora taxadeliberaodaclorexidina.Empoli(cidoctrico),atemperaturanoinfluenciou significantemente na liberao do frmaco. Ao final de 10 h, teve-se um aumento em torno de 35%dataxadeliberaonosistemademetilceluloseenquantoquenapoli(cidoctrico)o aumento foi de apenas 0,5 %. NaOdontologia,algunsestudosutilizandonanopartculasvmsendorealizados. Bouillaguetecolaboradores(2006)testaramacitotoxicidadedetrsdiferentescimentos endodnticos: AH Plus, Epiphany e GuttaFlow (que apresenta nanopartculas de prata na sua composio),em culturas celulares atravs do ensaio MTT, e os resultadosmostraram quea maioriadosmateriaisapresentavamriscossignificativos.Apsoperodode72h,o GuttaFlow se apresentou significativamente menos txico que o AH Plus e Epiphany, porm suatoxicidadeaumentavamcomotempoeissopoderiaestaratribudoliberaode partculas de prata. Comoobjetivodeinvestigaraatividadeantimicrobianaeaeficciadeimpedimento deformaodobiofilmenoprocessodedesinfecodecanaisradicularespelousode nanopartculasassociadasaocimentodexidodezincoeeugenol,Kishenecolaboradores (2008)numaprimeiraetapa,avaliaramaspropriedadesfsicaseantimicrobianasdetrs diferentestiposdenanopartculas:nanopartculasdexidodezinco,nanopartculasde quitosanaenanopartculasdexidodezincocomrevestimentodemltiplascamadasde quitosana. A ao antimicrobiana das nanopartculas de quitosana apresentou maior atividade, porm,diminudaquandoadicionadoaocimentodexidodezincoeeugenol.As 36 nanopartculas de xido de zinco, ao contrrio, apresentavam menor ao antimicrobiana, mas emassociaoaocimentodexidodezincoeeugenol,apresentarammaioratividade antimicrobiana.Aadiodenanopartculasdexidodezincoedequitosanaaumentoua atividade antimicrobiana do cimento de xido de zinco e eugenol. Em uma segunda etapa, o efeitodasnanopartculasnaadernciadeE.faecalisnaparededadentinafoiavaliadaeos resultados mostraram que o tratamento com as nanopartculas reduziram, significantemente, a adesodoE.faecalisnadentinaequeaadiodenanopartculasdexidodezincoe nanopartculasdequitosanainibiriamarecolonizaomicrobianaeformaodebiofilme, melhorando a capacidade antimicrobiana dos cimentos endodnticos. GomesFilhoecolaboradores(2010)realizaramoprimeiroestudoparaavaliarouso denanopartculasdepratacomoagenteirrigante.Otrabalhotevecomoobjetivoanalisara respostatecidual,emratos,frenteaimplantesdetubosdepolietilenopreenchidoscom esponja de fibrina embebidas em 1 mL de disperso de 47 ppm de nanopartculas de prata, 23 ppm de nanopartculas de prata, e hipoclorito desdio a 2,5 %. A anlise foi feita em 7, 15, 30,60e90dias,sendoque,paracadaperodo,6ratosforamsacrificadoseosimplantese tecidosadjacentesremovidos,fixadosepreparadosparaanliseemmicroscopiaptica.Os resultadosobtidosmostraramqueambososmateriaisprovocaramreaesmoderadasem7 dias.Apsos15dias,arespostainflamatriadasnanopartculasdeprataa23ppmeo hipocloritodesdioa2,5%foramsemelhantesaogrupocontrolee,aos30dias,as nanopartculasdeprataa47ppmforamsemelhantesaocontrole.Apartirdisto,concluram que a disperso de nanopartculas de prata foi biocompatvel, especialmente em concentraes mais baixa.Pagonisecolaboradores(2010)avaliaram,invitro,aaodenanopartculasdepoli (L-cidolctico-co-cidogliclico),PLGA,contendoazuldemetilenosobaodeluz vermelhadecomprimentodeondacorrespondentea665nmfrenteaE.faecalis.Utilizaram blocos de dentes humanos extrados contaminados com E. faecalis divididos em trs grupos: o grupo I no recebeu tratamento com nanopartculas de azul de metileno nem aplicao de luz; ogrupoIIfoitratadaapenascomnanopartculasdeazuldemetilenoe,ogrupoIIIque recebeutratamentocomnanopartculasdeazuldemetilenoseguidadeaplicaodeluz.O sinergismodaluzcomasnanopartculasdeazuldemetilenopromoveuumareduo significativadasunidadesformadorasdecolnia,sendoautilizaodenanopartculasde PLGAcomomeiodecarreadordefrmacosfotoativadosumcoadjuvantepromissorno tratamento antimicrobiano de canais radiculares. 37 3. METODOLOGIA 3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA Todooprocessodedesenvolvimento,caracterizaoetestedeestabilidadeforam realizados no laboratrio de Nanotecnologia do Centro Universitrio Franciscano (UNIFRA). 3.1.1. Teste de solubilidade Umtestepilotofoirealizadovisandoavaliarasolubilidadedaclorexidinanafase orgnica da suspenso coloidal (sem a presena do polmero), bem como nos componentes da referidafaseoleosa,seguindoametodologiadescritanaFarmacopiaBrasileira(4aedio). Paraisso,foramtestadosdiferentestensoativos,entreelesomonoestearatodesorbitano, monoleatodesorbitanoelecitina;diferentesleos,triglicerdiodecidoscprico/caprlico, cocoato de butilenoglicol, leo de oliva e leo de melaleuca; e, tambm, diferentes polmeros, a poli--caprolactona e o Eudragit L100. A solubilidade da clorexidina em diferentes lipdios tambm foi avaliada, dentre eles a manteiga de karit em diferentes concentraes (5, 7 e 10 %), lcool cetlico, cido esterico e monoestearato de glicerila. 3.1.2. Preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina Para o preparo das suspenses de nanocpsulas de clorexidina, tentou-se reproduzir o mtodo de obteno descrito por Lboutounne e colaboradores (2002). ApartirdaadaptaodametodologiadeLboutounneecolaboradores(2002),alguns componentesdafaseorgnicaforamsubstitudos,comomostraaTabela1,enquantoqueos componentesdafaseaquosamantiveram-seosmesmos,gua(53mL)epolissorbato80 (0,0766 mg). As suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina foram obtidas pelo mtodo dedeposiointerfacialdepolmerospr-formados,descritoporFessiecolaboradores (1989). 38 Tabela 1: Componentes utilizados na fase orgnica para o preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina. ComponentesQuantidade Tensoativo

monoestearato de sorbitano monoleato de sorbitano lecitina 0,0766 g Polmero poli--caprolactona Eudragit L100 0,1 g Acetona27 mL leo

triglicerdio de cido cprico/ caprlico cocoato de butilenoglicol leo de oliva leo de melaleuca 0,31 g Clorexidina0,2 % 1 % 2 % 0,02 g 0,1 g 0,2 g

Oscomponentesdafaseorgnicaeaquosaforammensuradosecolocadosem diferentesbqueres.Ambosforamvedadoscomparafilmeparaevitaraevaporaoda acetonaedaguaemantidossobconstanteagitaomagnticaeembanho-mariaa40C pelo tempo de 30 minutos para a completa dissoluo de seus componentes. Aseguir,afaseorgnicafoivertidalentamentecomauxliodeumfunilnafase aquosa.Amisturaformadapermaneceusobasmesmascondiesdetemperaturaeagitao por mais 10 minutos e levada para o rota-evaporador, a 100 rpm, para eliminao do excesso de gua e do solvente orgnico at obteno do volume final desejado de 10 mL de suspenso. As concentraes de clorexidina avaliadas foram de 0,2, 1 e 2 % (m/v). 3.1.3. Preparo das suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina. Assuspensescontendonanopartculaslipdicasslidasdeclorexidina(NCL)foram obtidas por um mtodo indito utilizando apenas alta taxa de cisalhamento.A composio da fase aquosa manteve-se a mesma, gua (90 mL) e polissorbato 80 (3 g).NafaseoleosaalgunscomponentesforamtestadoscomoobjetivodeobterNCLcommelhores 39 caractersticasfsico-qumicas.Oscomponentesutilizadosnafaseoleosaestodescritosna Tabela 2. Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspenses contendo NCL. ComponentesQuantidade Tensoativomonoleato de sorbitano2 g leomanteiga de karit5 g lcool cetlico cido esterico monoestearato de glicerila Clorexidina0,2 %0,2 g 0,5 %0,5 g 1 %1 g 2 %2 g Oscomponentesdafaseoleosaforampesadosecolocadosembanho-mariaa40C at completa fuso da manteiga de karit. A fase aquosa foi pesada e colocada sob constante agitaomagntica,temperaturade55C,atquetodososcomponentesestivessem solubilizados.Afaseaquosafoivertidasobreafaseoleosa.AmisturafoilevadaaoUltra-Turrax pelo tempo de 20 minutos e com agitao de 24.000 rpm (Figura 09). 40 Figura 9: Mtodo de obteno de nanopartculas lipdicas slidas contendo clorexidina por altas taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax O volume final da suspenso foi de 100 mL e diferentes concentraes de clorexidina foramutilizadas(0,2;0,5;1,0e2,0%m/v).Paraefeitocomparativo,forampreparadas suspensesbrancas(NBR),semaadiodeclorexidina,sendoestaspreparadasatravsdo mesmo mtodo. 3.1.4. Preparo dos gis contendo NCL. Osgisforampreparadosapartirdaadiodehidroxietilcelulosea1,5%(m/v)s suspenses.Amisturafoilevadamantidapor24ha5Cparacompletahidrataoda hidroxietilcelulose e formao do gel.Paraobtenodogelcontendoclorexidinalivre(CL),fez-seprimeiramenteogel, adicionando a hidroxietilcelulose gua e, aps 24 h, o frmaco disperso em polissorbato 80 foi acrescentado ao gel. CA B 41 3.2. CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS As suspenses e gis contendo NCL foram caracterizadas com relao determinao do pH, dimetro mdio das partculas, ndice de polidisperso, potencial zeta, teor de frmaco e taxa de associao. 3.2.1. Determinao do potencial zeta O potencial zeta das suspenses e gis de NCL foi avaliado atravs de eletroforese em Zetasizernano-ZSmodeloZEN3600,MalvernInstruments,apsdiluio(500vezes,v/v) emsoluodeNaCl10mMpreviamentefiltradaatravsdemembrana0,45mChromafil Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH& Co. KG, Duren, Alemanha). Os resultados foram obtidos atravs dos valores da mdia de trs amostras diferentes. 3.2.2. Determinao do ndice de polidisperso e dimetro das partculas A determinao do dimetro mdio e do ndice de polidisperso das nanopartculas nas suspensesegisfoirealizadaatravsdeespalhamentodeluzdinmico(Zetasizernano-ZS modeloZEN3600,MalvernInstruments),apssuadiluio(500vezes,v/v)emgua.Os resultados foram determinados atravs dos valores da mdia de trs amostras diferentes. 3.2.3. Determinao do pH O pH das suspenses e gis das NCL foi verificado em um potencimetro (Digimed) previamente calibrado com soluo tampo pH 4,0 e 7,0 e as medidas realizadas diretamente nassuspensesegis.Osresultadosforamexpressosatravsdamdiadetrsamostras diferentes. 42 3.2.4. Validao da metodologia para doseamento da clorexidina Asanlisesforamrealizadasatravsdecromatografialquidadealtaeficincia (CLAE),avaliando-separmetroscomolinearidade,preciso,repetibilidadeeexatido (ANEXO1).Adeterminaodestesparmetrosparadoseamentodaclorexidinaforam realizados de acordo com a Resoluo n 899 de 29 de maio de 2003 do Ministrio da Sade (BRASIL, 2003). 3.2.4.1. Mtodos Cromatogrficos As anlises foram realizadas por CLAE, atravs da modificao da fase mvel descrita por Chiapetta e colaboradores (2008) para quantificao da clorexidina. Utilizou-seumcromatgrafolquidoYL-Clarity,modeloL9100CLAESystem, equipado com bomba modelo YL9110, detector de arranjo de diodo modelo YL9160, Coluna cromatogrfica - Lichropher 100 RP 18 (250 mm, 4,0 mm, 5 m) Merck. Afasemvelutilizadafoiconstitudadeacetonitrila,tampofosfatomonobsicode sdio0,03Metrietilaminaemumaproporode80:20:0,1(v/v),compHaparentede2,0 ajustado usando cido fosfrico. As condies para injeo da amostra foram de volume de injeo de 20 L e fluxo de 1,0mL/min,temperaturadefornode40C,comprimentodeondade260nm,apresentando um tempo de reteno de 3,3 minutos. 3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina Para a extrao da clorexidina das suspenses e gis, as amostras foram colocadas em balesvolumtricosde10mLeseuvolumecompletadocomfasemvelresultandonuma concentraode10g/mL.Osbalescontendoosgisforamagitadosnovrtexpor5 minutos,mantidosemultrassompor15minutose,apsisso,ocontedodosbalesforam transferidos pra tubos de ensaios, os quais foram levados para ultracentrifugar por 15 minutos a 3.500 rpm. As amostras de todos os bales foram filtradas com uma membrana de 0,45 m 43 ChromafilXtraRC-45/25(MACHEREY-NAGELGmbH&Co.KG,Duren,Alemanha)e analisadas em CLAE conforme descrito acima. 3.3.DETERMINAODAESTABILIDADEDASSUSPENSESEGISCONTENDO NCL AssuspensesegisdeNCL0,2e0,5%,juntamentecomoNBReCLforam submetidos ao estudo de estabilidade. Foramarmazenadasem temperatura ambiente (25 2 C),geladeira(42C)eestufa(402C)por90dias.Osparmetrosanalisadosforam: caractersticasorganolpticas(aparncia,coreodor),pH,teoreviscosidade.Foram determinados ainda o dimetro mdio das nanopartculas, ndice de polidisperso e potencial zeta. As leituras foram realizadas nos tempos 0 e 90 dias. 3.4. ENSAIO MICROBIOLGICO Osensaiosmicrobiolgicosforamrealizadosnolaboratriodemicrobiologiada UNIFRA.Paratal,foramutilizadascepasdosmicrorganismosCandidaalbicans(ATCC 90028) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtidas da Americam Type Culture Collection (ATCC). 3.4.1. Preparo da suspenso microbiana As cepas de C.albicansforam semeadasem meiocontendo gar Sabouraud Dextrose incubadas em estufa microbiolgica a 37 C por 24 h. O E. faecalis foi semeado em meio gar BrainHeartInfusion(BHI)a37Cpor24h(VALERAetal,2009).Apsaincubao,as suspenses com os microrganismos em soluo fisiolgica estril foram preparadas com uma turvao de 0,5 na escala Mac Farland, equivalente a 1,5x108 UFC/mL. 44 3.4.2. Concentrao inibitria mnima AConcentraoInibitriaMnima(CIM)amenorconcentraodeumagente antimicrobianocapazdeimpedir,invitro,ocrescimentovisveldedeterminado microrganismo a partir de testes de sensibilidade por diluio em gar ou caldo (ANDREWS, 2001).ACIMdevesernicaparaumamesmasubstncia,considerando-seomesmo microrganismo, porm pode variar dependendo do microrganismo analisado. ACIMfoideterminadapormeiodatcnicademicrodiluioemcaldoMueller-Hinton (Difco) para E. faecalise C. albicans e o ensaio foi realizado em placas de 96 poos de microdiluio nos grupos descritos na Tabela 3. Tabela 3: Diviso dos grupos de acordo com a medicao testada para determinao da CIM. GruposMedicao Suspenso CL 0,5 %Suspenso de clorexidina 0,5% Suspenso NCL 0,5 %Suspenso de nanopartculas lipdicas de clorexidina 0,5% Gel CL 0,5 % Gel NCL 0,5 % Gel de clorexidina a 0,5% Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% Gel NBR Gel de nanopartculas sem frmaco (branco) Gel CL 0,5 % HCAGel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio Gel NCL 0,5 % HCAGel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio HCAPasta de hidrxido de clcio O inculo foi preparado no mesmo meio a uma densidade ajustada para 0,5 da escala McFarland (1,5 x 108 UFC/mL) e diluda numa proporo de 1:10. No poo nmero 1, havia 100 % da suspenso, pasta ou associao. Para o poo de nmero 2, foi adicionado 50 % da quantidadepresentedopoo1reduzindoaconcentraodofrmacoem50%,eassim sucessivamente at antigir a concentrao de frmaco que permitiu o crescimento microbiano, a concentrao de frmaco presente no poo anterior a este foi considerada a CIM, como pode ser visto no fluxograma da Figura 10. 45

Poo n1 Poo n2Poo n3 Poo nN Concentrao = Xconcentrao = X/2concentrao = X/4 concentrao = X/? Figura 10: Fluxograma ilustrativo da microdiluio para determinao da CIM. Paracadaformulao,aprimeiraconcentraopartiude50%daconcentraototal do frmaco presente na suspenso, gel ou associao. Para as suspenses e gis CL e NCL 0,5 %,oCIMfoiavaliadoapartirdaconcentraode2,5mg/mL.ParaamisturaNCL0,5% HCA a concentrao partiu de 1,25 mg/mL. As bandejas (Figura 11) foram incubadas a 37 C e as CIMs foram registradas aps 24 hdeincubaoparaaformalivredeclorexidinae72hparaasformulaescompostaspor nanopartculas.Otestefoifeitoemtriplicataeo2,3,5cloretodetrifeniltetrazliofoiusado como indicador de crescimento bacteriano. Figura 11: Placas de 96 poos para microdiluio e definio das CIMs. 100Ldemeio+ 10 L de inculo 100 L100 L 100 L 100 L da formulao 100Ldemeio+ 10 L de inculo 100Ldemeio+ 10 L de inculo 100Ldemeio+ 10 L de inculo 46 3.4.3 Teste de difuso em gar com cilindro de ao inoxidvel Paraotestededifusoemgarutilizandooscilindrosdeaoinoxidveis,foram utilizadas9placasPetri.Paracadaplaca,foramaplicados15mLdegarMueller-Hinton (MHA)paraformarumacamadabase(Figura12)e,depoisdesolidificado,acrescentados5 mL de meio MHA para formar a camada de superfcie, contendo o inculo do microrganismo numa proporo de 50 mL de meio MHA para 1 mL de suspenso de inculo, na temperatura ideal de 45 C. Figura 12: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o teste de difuso em gar com cilindros de ao inoxidvel. Foramcolocados6cilindros(8,0x1,0x10mm;dimetrointerno=6mm)deao inoxidvelestreisporplacaapsasolidificaodomeioeadicionados100Ldecada formulao em cada cilindro, em triplicata (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988).Asplacasforamincubadasa37Ceosdimetrosdoshalosdeinibioforam medidos com auxlio de paqumetro digital, em milmetros, nos tempos de 24, 48 e 72 h e sua potncia calculada. Cada cepa microbiana foi avaliada contra as seguintes formulaes: P1= CL 0,2 %; P2 =CL0,5%;P3=propilenoglicol;A1=NCL0,2%;A2=NCL0,5%;A3=NBR, distribudas na placa de Petri conforma Figura 13. Asamostraspadro(P1eP2)foramfeitasapartirdadiluiodeclorexidina99,9% (Sigma-Aldrich)emsoluodedimetilsulfxido(DMSO)(Nuclear)deformaaatingira concentrao desejada de clorexidina equivalente a concentrao presente nas NCLs. 5 mL de meio MHA + inculo 15 mL de meio MHA 100 L da formulao 47 A1 P1A3 A2P2 P3 Figura 13: Esquema de distribuio das amostras na placa petri. 3.5.AVALIAOINVITRODADEGRADAODACLOREXIDINAQUANDO ASSOCIADA PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO Adegradaodaclorexidinalivreeemnanopartculasassociadaounopastade hidrxidodeclciofoiavaliadanolaboratriodeNanotecnologiadaUNIFRAatravsda quantificao de clorexidina por CLAE e anlise do pH. 3.5.1. Diviso dos grupos Paraavaliaradegradaodaclorexidina,osgruposparaanliseforamdivididosde acordo com a Tabela 4. Tabela 4: Diviso dos grupos de acordo com a formulao. GruposMedicao Gel CL 0,5 % Gel NCL 0,5 % Gel de clorexidina a 0,5% Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% Gel NBR Gel de nanopartculas sem frmaco (branco) Gel CL 0,5 % HCAGel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio Gel NCL 0,5 % HCAGel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio HCAPasta de hidrxido de clcio 48 3.5.2. Preparo das amostras A associao dos gis pasta de hidrxido de clcio (Calen) foi feita na proporo 1:1 (m/m),sobreplacadevidrocomauxliodeumesptulaplsticaearmazenadorecipientee ambiente apropriado, visando evitar sua degradao precoce (Figura 14). Figura 14: Etapas realizadas para o preparo das amostras. A) e B) A associao dos gis pasta de hidrxido de clcio foi feita na proporo 1:1, em peso; C) Mistura dos gis; D) Gis armazenados em recipiente e ambiente apropriado. AB CD 49 3.5.3. Determinao do pH OpHfoiverificado,emfunodotempo,emumpHmetro(Digimed)previamente calibradocomsoluotampopH4,0e7,0easmedidasrealizadasapartirdadiluiode 0,01 g da amostra em 10 mL de gua. 3.5.4. Doseamento da clorexidina Para o doseamento da clorexidina incorporada ao gel e pasta de hidrxido de clcio, asamostrasforampesadasdeacordocomaconcentrao,deformaaseobteruma concentrao final para anlise de 20 g/mL.Osgisepastasforampesadosemumbalovolumtricode10mLeovolume completado com a fase mvel (Figura 15). Os bales foram agitados no vortex por 5 minutos, mantidosembanhodeultrassompor15minutose,apsisso,ocontedodosbalesfoi transferidoparatubosdeensaios,osquaisforamlevadosparacentrifugarpor15minutosa 3.500rpm.Osobrenadantedasamostrasfoifiltradoemmembrana(0,45mporo)e analisadas em CLAE. Figura 15: Preparo das amostras para anlise em CLAE. A) Gis e pastas foram pesados em um balo volumtrico de 10 mL; B) Os bales foram agitados no vortex por 5 minutos; C) Gis levados para sonicar por 15 minutos; D) O contedo dos bales foi transferido para tubos de ensaios e depois para centrfuga por 15 min. AB CD 50 3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAO NOS TBULOS DENTINRIOS 3.6.1. Obteno dos dentes humanos Paraaavaliaodaprofundidadedepenetraodasnanopartculasnostbulos dentinrios foram utilizados nove dentes humanos extrados cedidos pelo Banco de Dentes da Faculdade de Odontologia da UNIFRA. Sua utilizao foi aprovada pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos da mesma instituio sob parecer de n0 335.2010.2.Oselementosapresentavampiceradicularcompleto,raiznicaeretaeforam armazenadosemsoluofisiolgicaa0,9%,afimdepermaneceremconstantemente hidratados. 3.6.2. Preparo das amostras Oselementosforamseccionadostransversalmentenolimiteamelocementriocom auxliodeumdiscodiamantadoduplo(K.G.Sorensen,SoPaulo,SP-Brasil)esua superfcieexternaimpermeabilizadacomumacamadadeadesivoepxiAraldite (BRASCOLA So Bernardo do Campo, SP). Ocanalfoilocalizadocomauxliodalimatipo K-filen10(DENTSPLYInd.Com. Ltda.Petrpolis,RJ),aqualpercorreutodointeriordocanalatasuavisualizaono forame apical para determinar o comprimento real da raiz. O comprimento real de trabalho foi estabelecido 1 mm aqum do comprimento real da raiz. OpreparobiomecnicofoifeitocomlimasK-file1srie(#15-#40)(DENTSPLY Ind.Com.Ltda.Petrpolis,RJ)eosorofisiolgico0,9%foiutilizadocomoirrigantea cada troca de instrumento. Ao final do preparo, o canal foi irrigado com 10 mL de soluo de EDTA a 17 % para remoo da smear layer. Os canais foram secos com cone de papel absorvente (TANARI Ind. Ltda.Manacapuru,AM)dedimetrocompatvelcomocanalprincipal.Nosgruposnos 51 quaisfoiutilizadamedicao,estasforamintroduzidasnointeriordocanalcomauxliode agulha e seringa at o completo extravasamento da medicao pela regio apical. Oexcessodematerialfoiremovidodasduasextremidadeseoacessocoronrioe apical foram selados com cimento provisrio (COLTOSOL Vigodent Indstria e Comrcio Bonsucesso / RJ - Brasil). Nogrupocontrole,ocanalpermaneceuvazioesuasextremidadesseladascom cimentoprovisrio.Asamostrasforamdistribudasemtrsgruposcomtrselementosem cada grupo, como mostra na Tabela 5. Tabela 5: Distribuio dos grupos. GruposMedicamentoAmostras (n) ControleSem medicao 3 Suspenso NCL 0,5 %Suspenso de nanopartculas de clorexidina a 0,5%3 Gel NCL 0,5 %Gel de nanopartculas de clorexidina a 0,5%3 O medicamento permaneceu no interior do canal por um perodo de 15 dias; aps isso, fez-se a remoo do cimento provisrio e a raiz foi irrigada com soro fisiolgico a 0,9 % para a remoo dos restos dos medicamentos. Foramconfeccionadossulcoslongitudinaisdeorientaonafacemesialenaface distal das razes com disco diamantado duplo (K. G. SORENSEN, So Paulo, SP - Brasil) em baixarotaoparaposteriorclivagemdoselementos.Asamostrasforamlevadasparao interiordeumdessecadorparaoprocessodedesidrataodaestruturadentria,onde permaneceu em vcuo por um perodo de 10 dias. Asamostrasprontasforamfixadasemstub,metalizadascomouroeanalisadasem microscopia eletrnica de varredura (MEV) com voltagem de 10 kV no centro de microscopia daUFRGS(JeolScanningMicroscopeJSM-5800,Japan)paraanlisedapenetraodas nanopartculas de clorexidina no interior dos tbulos dentinrios.Na Figura 16, podemos observar toda a sequncia da metodologia de forma resumida. 52 Figura 16: Etapas realizadas para o processo de anlise das nanopartculas lipdicas no interior do elemento dentrio. A) Padronizao das amostras; B) confeco de sulcos para o processo de clivagem; C) Clivagem da estrutura dentria; D) Dessecador utilizado para o processo de desidratao das amostras; E) Amostras fixadas em stub e metalizadas com ouro; F) MEV/EDS utilizado para registro das micrografias e espectros. Foi utilizado como mtodo auxiliar ao MEV, a espectrometria de energia dispersiva de raios-X (EDS), tcnica na qual a amostra bombardeada por eltrons e a energia dos tomos presentesdetectadaeaconcentraodotomoexpressoemumespectro.Otomode interessefoiocloroporestarpresentenacomposioqumicadaclorexidina,assimcomo Musial e colaboradores (2010) que utilizaram o EDS para localizar tomos de cloro e, assim, identificar a presena de clorexidina em nanocpsulas de metilcelulose e poli(cido acrlico). 3.7. ESTUDO IN VIVO Pararealizaodoestudoinvivo,foramutilizadosratosmachosWistar, imunocompetentes,pesando300350g(N=8porgrupo;Ntotal=56)provenientesdo BiotriodaUniversidadeFederaldePelotas(UFPEL;Pelotas,RS).Osanimaisforam mantidosnoVivriodaPUCRS,emestantesventiladas,equipadascomfiltrosdeentradae ABC FE D 53 sada de ar, com temperatura controlada (22 1 oC) e ciclo claro-escuro de 12 h. Os animais receberam rao peletizada e gua filtrada ad libitum. Osprocedimentosexperimentaisseguiramasrecomendaesparaocuidadocom animaisdelaboratrioenormasticasparaaexperimentaoemanimaisconscientes,do Guia de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) dos EstadosUnidosdaAmrica,quesoadotadaspeloConselhoBrasileirodeExperimentao Animal(COBEA).ForamrespeitadosospreceitosapresentadosnaLeiNo11.794,de9de outubro de 2008 e os protocolos experimentais foram submetidos apreciao do Comit de tica para o Uso de Animais (CEUA) da PUCRS sob numero 10/0021.Paraarealizaodosprocedimentosodontolgicos,osanimaisforamanestesiados pelaadministraointraperitonealdaassociaodexilazina(10mg/kg)equetamina(100 mg/kg). Foi realizada a administrao do frmaco analgsico Paracetamol 80 mg/kg, 2 vezes aodia,viaoraldurantetodooexperimento.Noperododetempoadequado,aeutansiafoi realizadaporanestesiaprofundacomisofluorano.Depoisdaeutansia,asamostras pertinentes ao estudo foram coletadas e o lixo biolgico foi destinado ao setor de descarte da PUCRS. 3.7.1. Distribuio dos grupos e clculo do tamanho da amostra Os grupos foram distribudos de acordo com a medicao utilizada, como descrito na Tabela 6. Tabela 6: Distribuio dos animais nos diferentes grupos experimentais. GruposMedicaoAmostras (n) ControlePropilenoglicol 8 Gel CL 0,5 % Gel NCL 0,5 % Gel de clorexidina a 0,5% Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% 8 8 Gel NBR Gel de nanopartculas sem frmaco (branco)8 Gel CL 0,5 % HCAGel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio8 Gel NCL 0,5 % HCA Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio 8 HCAPasta de hidrxido de clcio8 54 3.7.2.Induo das leses periapicais Com o objetivo de induzir leses periapicais, os animais foram anestesiados atravs da misturadexilazinaequetamina,comodescritoacima.Apsaconfirmaodaanestesia, foramrealizadasaberturascoronriasnosprimeirosmolaresinferiores,combrocas diamantadasesfricas de alta rotao (1/2 mm de dimetro), sob irrigao constante. Aps a remoo da polpa coronria, a cavidade pulpar ficou exposta ao meio bucal por um perodo de 21 dias, para a induo de leso periapical (IWAMA et al, 2003). 3.7.3.Instrumentao e preenchimento do canal Decorridos21diasdainduodaslesesperiapicais,osanimaisforamnovamente anestesiados.O preparo do canal radicular foi realizado pela tcnica escalonada, utilizando-se limas K-file de nmero 08, 10, 15, 20 e 25, sucessivamente, em um comprimento de trabalho de4mm,determinadodeacordocomotamanhomdiodasrazesdemolaresinferioresde rato.Hipocloritodesdioa1%,emumvolumede200L,foiutilizadocomosoluo irrigante.Asecagemdocanalfoifeitacomconesdepapel(TANARIInd.Ltda Manacapuru, AM) de calibre 25, esterilizados e o preenchimento com a medicao intracanal foi realizado com auxlio de seringa e agulha de insulina, conforme a descrio anterior, at o comprimentodetrabalho.Apsacolocaodamedicaointracanal,ascavidadesforam seladascomamlgamadepratae,osratospermanecerampeloperodode30diascoma medicaointracanal(adaptadodeWAGNERetal,2011)paraposterioreutansiae realizao das anlises descritas a seguir. 3.7.4. Exame radiogrfico Aps a eutansia, as mandbulas foram removidas cirurgicamente, dissecadas, fixadas emsoluotamponadadeformalina10%elevadasparaaavaliaoradiogrficadas alteraes periapicais. Utilizou-se um aparelho de Raio X (DABI-ATLANTE, Ribeirao Preto, 55 SP,Brazil)comsensordigital(KODAKDentalSystem,modeloRVG6100Digital Radiography System) e armazenadas com resoluo de 1 Megabit, e salvo em formato JPEG. Asradiografiasforamrealizadasdeformapadronizadaseguindoosseguintes parmetros: a regio do primeiro molar inferior deveria formar angulo perpendicular ao raio-X, a potencia utilizada foi de 70 kvp,com distncia foco/filme de 30cm e tempo de exposio constante de 0,2 s.A rea da leso radiolcida periapical foi medida com o auxilio do programa Adobe Photoshop CS4, verso 11.0 (WOLLE et al, 2012). 3.7.5. Anlise histolgica A anlise histolgica foi