Guias Microbiologia de Alimentos Unicordoba

Elaborado por: Mónica María Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos. Alba Manuela Durango Villadiego. MSc.

TABLA DE CONTENIDO

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1. INTRODUCCIÓN 12. GUÍA Nº 1: Técnica Ecométrica. 23. GUÍA Nº 2: Estudio microbiológico a manipuladores, utensilios y

medio superficies, ambiente. 74. GUÍA Nº 3: Cuantificación de microorganismos por el

método de recuento en placa. 145. GUÍA Nº 4: Técnica del número más probable (NMP). 226. GUÍA Nº 5: Recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables. 317. GUÍA Nº 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de

origen animal o vegetal. 338. GUÍA Nº 7: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 369. GUÍA Nº 8: Recuento de Mohos y levaduras. 3910.GUÍA Nº 9: Investigación de Salmonella en alimentos. 4111.GUÍA Nº 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 4412.GUÍA Nº 11: Recuento de Bacillus cereus. 4713.GUÍA Nº 12: Investigación de Listeria monocytogenes. 5014.GUÍA Nº 13: Investigación de Vibrio parahaemolytico. 5315.GUÍA Nº 14: Control microbiológico de conservas no alteradas. 5616.GUÍA Nº 15: Recolección de muestras de agua para

Análisis acteriológico. 5917.GUÍA Nº 16: Cuantificación de microorganismos por el

método de filtración por membrana. 6318.GUÍA Nº 17: Número más probable de Pseudomona aeruginosa. 6719.GUÍA Nº 18: Presencia-ausencia de coliformes en muestras de

agua (método del sustrato definido). 6920.GUÍA Nº 19: Prueba del tiempo de reducción del azul de

metileno (T.R.A.M.). 7121.GUÍA Nº 20: Microbiología de leche y derivados. 7322.GUÍA Nº 21: Microbiología de cárnicos. 7623.GUÍA Nº 22: Microbiología de ovoproductos. 7924.GUÍA Nº 23: Microbiología de pescados y mariscos. 8225.GUÍA Nº 24: Microbiología de frutas y hortalizas. 8526.GUÍA Nº 25: Microbiología de cereales y panificación. 8827.GUÍA Nº 26: Microbiología de bebidas. 9128.GUÍA Nº 27: Microbiología de aguas. 9429.ANEXOS 96

I

LISTA DE TABLAS

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1. TABLA No.1: Tabla de NMP y límites de confianza cuando se usan 5 tubos con 10 ml de muestra. 26

2. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos paramuestras puras. 26

3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos paramuestras diluidas. 27

ii

LISTAS DE FIGURAS

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1. Figura No. 1: Técnica Ecométrica. 52. Figura No. 2 Diluciones decimales. 193. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. 204. Figura No. 4: Siembra en Superficie. 215. Figura No. 5: Técnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras

líquidas) 28.6. Figura No. 6: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras

líquidas). 297. Figura No. 7: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas

líquidas o sólidas) 30

iii

LISTA DE ANEXOS

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Anexo A: División laboratorio de alimentos y bebidas alcohólicas-Laboratorio de Microbiología de Alimentos INVIMA. 96Anexo B: Normatividad relacionada con alimentos. 97

iv

INTRODUCCION

La calidad de los alimentos está constituida por tres áreas de estudio, lascuales son: calidad microbiológica, calidad fìsico-química y calidad sensorial.Entre estas áreas la que revista mayor importancia es la calidad microbiológica,puesto que a través de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos,es decir, su capacidad de no producir daño (enfermedad) a las personas que loconsumen.

Para llevar a cabo el análisis microbiológico de los alimentos es necesariodisponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materiasprimas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo(envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de laempresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente).

En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se deben contar con unadotación mínima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras,baños termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro;con una dotación de medios de cultivo y reactivos, los cuales se debenencontrar en óptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de materialde vidriería.

El laboratorio además debe contar con un sistema de calidad en el cual secontemplen los procedimientos de preparación de medios de cultivo yreactivos, los procedimientos de limpieza y desinfección de materiales, equiposy áreas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cualdebe contar con una formación en el área donde se desempeñará.

En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo elanálisis microbiológico de los alimentos.

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLASPROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

GUÍA Nº 1: TECNICA ECOMETRICA

1. INTRODUCCIÓN

En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se debe realizar una evaluaciónsistemática de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en ellaboratorio y aún los comerciales, ya que éstos varían ampliamente según sucomposición, modo de preparación, etc. Es muy importante el control que setenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de losresultados.

Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado unatécnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimientoefectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y lainhibición de la flora acompañante. Esta técnica se ha denominadoecométrica porque evalúa la susceptibilidad de los medios de cultivo a lacolonización por cepas interferentes.

Esta técnica implica una siembra por estría con ayuda de un asa bacteriológica,obteniéndose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en númerodecreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura Nº 1 seilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismosque se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar coloniasvisibles, aún en la estría central. En cambio los microorganismos que sesuponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formarcolonias mas allá del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante(Ver figura 1).

2. OBJETIVO

Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediantela técnica ecométrica.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos y cepas Materiales*3 suspensiones de cepas demicroorganismos que deben crecer enel medio de cultivo

asasbacteriológicas

incubadoraMecheros

6 cajas de agarselectivo ( EMB,hektoen, BPLS,salado manita,Baird Parker)

3 suspensiones de cepas demicroorganismos que no deben creceren el medio de cultivo Cinta de

enmascarar* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

1. Tomar 6 cajas del medio a analizar.2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como se

observa en la figura 1.3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que

supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo.4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismos que

supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo.5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5

estrías en cada cuadrante y una estría central (Ver figura 1), sin quemar elasa y tomando inóculo sólo una vez.

6. Incubar a 37ºC por 24-48 horas.

5. RESULTADOS

1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantesde cada caja.

2. El resultado se expresa como un número de 6 cifras. Se anota un númerode 0 a 5 según el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estríacentral considerada como la quinta.

3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmenteel microorganismo utilizado.

4. Al final se informará un número de 6 cifras.

6. INTERPRETACIÓN Y REPORTE

Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismosque deben crecer y las tres últimas cifras los sectores positivos de crecimientopor parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. Así un medioselectivo perfecto daría un resultado de 555000, pero en la práctica se aceptala fórmula 55001 o aún otra más desfavorable. Se reporta según lasindicaciones de la hoja de informe.

7. BIBLIOGRAFÍA

1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. EditorialPanamericana. Buenos Aires, Argentina.

2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentospara el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995.

3. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual deBioseguridad. Editorial Ginebra. 2ª edición, 1994.

4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiología de los alimentos. Fundamentosecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de losalimentos. Editorial Acribia.

5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.

38. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO

Todos los grupos deben traer:

Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.

4

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVOTÉCNICA ECOMETRICA

INFORME

1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

No de caja Sectores positivos Microorganismo1 _______________ ___________________2 _______________ ___________________3 _______________ ___________________4 _______________ ___________________5 _______________ ___________________6 _______________ ___________________

La fórmula final obtenida será: _____________________________________

Conclusión: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5

Figura No. 1: Técnica Ecométrica

Microorganismos que SI crecen Microorganismos que NO crecen

6

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS


GUÍA Nº 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES,SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE.

1. INTRODUCCIÓNPara asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atención tanto a losmicroorganismos patógenos como a los alterantes, que pudieran llagar a lasmaterias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), delos equipos, tuberías, superficies, aire, etc.

Según el Ministerio de la Protección Social se denomina manipulador a todapersona que trabaje a cualquier título y aunque sea ocasionalmente, en unlocal o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan,procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos omaterias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, elmanipulador juega un papel importante en la fabricación de sus productos, yaque se puede convertir en una fuente de contaminación.

Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, lossitios de importancia donde residen los microorganismos saprófitos y que seconstituyen en una fuente de contaminación para manipuladores de alimentosson la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismomas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, estemicroorganismo reside también en las fosas, tracto nasofaríngeo y la mayoríade las veces se encuentra asociado a furúnculos, heridas y lesiones de la piel.Debido a sus condiciones metabólicas, esta bacteria puede crecer y/oreproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine losalimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado comoindicador de contaminación por manipuladores. La presencia deStaphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indicacontaminación a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. Laimportancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad quetiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causarintoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es elagente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicaciónalimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir enuna fuente de contaminación.

Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, puedentransferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son loscoliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal,específicamente de la región anal, la presencia de estos también se investigaen las manos dedos y uñas de los manipuladores e indican contaminación deorigen fecal.

7

Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos:1. No presentar heridas, ni afecciones cutáneas en brazos o manos.2. No padecer enfermedades infectocontagiosas.3. Practicar buena higiene personal.4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las áreas de envasado se

hace indispensable el uso de mascarilla.5. Recibir capacitación sobre manejo higiénico de alimentos.

Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricacióno preparación de alimentos, deben estar diseñados, construidos, instalados ymantenidos de tal forma que se evite la contaminación del alimento y se faciliteel proceso de limpieza y desinfección de los mismos. Igualmente es importanteel estudio microbiológico del aire (ambiente), ya que este se pone en contactocon los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambienteadecuado, debidamente desinfectado o esterilizado.

2. OBJETIVOS

1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva enfosas nasales y zona faríngea de los manipuladores, mediante la realizaciónde frotis y cultivos.

2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparación delnúmero de UFC antes y después del lavado.

3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos,dedos y uñas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos.

4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equiposy las superficies.

5. Evaluar la contaminación del ambiente.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram Escobillones estérilA. Ogy Aceite de inmersión Baja lengua estérilA. Plate count Plasma fresco Gasa estérilA. EMB Reactivo de Kovacs Portaobjetos estérilesA. Púrpura Bromocresol MicroscopioCaldo BHI IncubadoraCaldo Brilla Baño serológicoCaldo Indol Tubo taparosca estérilCaldo lactosado Asa bacteriológica* Algodón y alcohol al 70%

8

4. PROCEDIMIENTO

4.1. MANIPULADOR

4.1.1. Fosas nasales y Faringe

1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestrafaríngea y nasal respectivamente.

2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua.3. Frotar con un escobillón los pilares amigdalianos, realizar un frotis y

sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol).4. Introducir un escobillón en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las

paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar BairdParker (Salado de Manitol).

5. Incubar por 24-48 horas a 37ºC.6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar

colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros quecontrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halosamarillos).

7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de interés ycolorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupadosen racimos.

8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusióncerebro corazón (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales yfaringe.

9. Incubar por 24 horas a 37ºC.10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml

de plasma fresco, incubar a 37ºC en baño serológico por 4 horasobservando cada hora la formación de coagulo.

4.1.2. Manos

4.1.2.1. Evaluación del método de desinfección

1. Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Púrpura deBromocresol.

2. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace.3. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Púrpura de

Bromocresol.4. Incubar ambas cajas a 37ºC por 24-48 horas.5. Observar y contar el número de UFC en las cajas de Agar Púrpura de

Bromocresol, antes y después del lavado.

4.1.2.2. Evaluación de contaminación fecal

1. Frotar un escobillón humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uñasdel manipulador.

2. Introducir el escobillón dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubodurham.

93. Tapar bien el tubo.4. Incubar a 37ºC por 24-48 horas.5. Realizar la lectura (turbidez y producción de gas indican presencia de

coliformes totales).6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de

Agar EMB.7. Incubar a 37ºC durante 24 horas.8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de

coliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metálico).9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo

durham) y a uno con caldo indol.10. Incubar en baño serológico a 45ºC por 24-48 horas, asegurándose de que

el nivel del agua cubra el medio de cultivo.11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para la

determinación de indol.12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la producción de

indol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales).Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia deColiformes fecales.

4.2. ESTUDIO MICROBIOLÓGICO A UTENSILIOS, EQUIPOS YSUPERFICIES.

Procedimiento de la esponja o gasa estéril.

1. Con la ayuda de una bolsa de plástico, a manera de guante, tomar laesponja estéril, evitando posibles contaminaciones.

2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear elutensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda elárea.

3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operación yagregar el resto del caldo lactosado.

4. Cerrar y marcar la bolsa.5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente.6. Incubar la bolsa con la espoja a 37ºC durante 24 horas.7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla.8. Incubar a 37ºC durante 24 a 48 horas.9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez.10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2.

4.3. ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE.

4.3.1. Evaluación de la Contaminación Bacteriana.

1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos.2. Cerrar la caja e incubar a 37ºC por 24-48 horas.3. Contar y reportar el número de colonias.

104.3.2. Evaluación de la Contaminación Fúngica.

4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos.5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 días a 22ºC.6. Contar y reportar el número de microorganismos.


5.1. Fosas nasales y zona faringea

La determinación del Staphylococcus aureus en estos casos es consideradauna prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva onegativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva.

5.2. Manos

Evaluación del método de desinfección.

Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos enmanipuladores y se reporta la diferencia entre las UFC antes y después dellavado.

Evaluación de la contaminación fecal.

La determinación de coliformes totales y fecales, en este caso es una pruebade presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales ofecales; indican que el proceso de sanitización no es el ideal o contaminaciónde origen fecal.

5.3. Estudio microbiológico a utensilios, equipos o superficies.

La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpiezay desinfección no es el adecuado o contaminación de origen fecal.

5.4. Evaluación microbiológica al ambiente.

Se reporta el número de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos,si es mayor indica que el ambiente está contaminado y se debe repetir elproceso de desinfección o esterilización del ambiente.

6. BIBLIOGRAFÍA

1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. EditorialPanamericana. Buenos Aires, Argentina.


3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobremanipuladores, 1997.

114. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos.

Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos.Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez.Medellín, 1994.


Todos los grupos deben traer:

Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar

12




GUÍA Nº 3: CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR EL METODODE RECUENTO EN PLACA.

1. INTRODUCCIÓNEl recuento en placa es el método más utilizado y más recomendado por laComisión Internacional sobre especificaciones Microbiológicas en los alimentos(ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificación de la poblaciónmicrobiana presente en los alimentos sólidos o líquidos, sembrando enprofundidad o en superficie. La mayoría de los alimentos no son estériles, sinoque contienen una población microbiana, que varía ampliamente en número,dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan dilucionespara su cuantificación, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir,presentarían un recuento tan alto que sería imposible realizar su conteo. Paraeso se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), lascuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicandopor el factor de dilución, que es el inverso de la dilución. La dilución inicialsiempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestrava a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero loimportante que se guarde la relación: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partesde diluyente.

2. OBJETIVOS1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos

sólidos o líquidos.2. Realizar diluciones logarítmicas en base 10 a partir de los homogenizados.3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate

count.4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar

correspondiente.5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la

calidad de los controles y de las diluciones.6. Informar el número de UFC/g ó ml de alimento.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% HomogenizadorAgar Plate count BalanzaAgar leche Cuchillos-cucharasAgar EMB IncubadoraAgar Tributirina Contador de colonias

Asa bacteriológicaBolsas de polipropilenoCajas petri estériles

* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

4.4. PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES

1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse enrefrigeración a 4ºC por un tiempo máximos de 24 horas.

2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento.3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla

como dilución 10-1.4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilución 10-2 y dilución 10-3,

adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%.5. Agitar unas 25 veces las muestras líquidas, formando un arco con el

antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si elrecipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra ytomar una parte representativa del producto. Para muestras sólidas pesar10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes.

6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco quecontiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta más de 10 veces,hasta homogenizar la mezcla; así se obtiene la dilución 10-1.

7. Tomar 1 ml de la dilución 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml deagua peptonada al 0.1% marcado con la dilución 10-2. Mezclar unas 10veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilución 10-2.

8. Tomar 1 ml de la dilución 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilución10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Así se obtiene ladilución 10-3.

9. De esta forma se tienen las diferentes diluciones, el número de ellas va hadepender del alimento y de los parámetros que existan, pero debensembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 )

4.5. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.

1. Tomar 5 cajas de petri estériles y marcarlas en la tapa como dilución 10-1,10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; además escribir en cadauna de ellas el Nº del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y elnúmero de la muestra.

2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilución 10-1 y tomar 1ml de ladilución y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), lasdiluciones deben sembrarse por duplicado.

3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilución 10-2, tomar 1ml yadicionarlo en la caja marcada como dilución 10-2.

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4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilución 10-3, pipetear 1ml yadicionarlo en la caja marcada como dilución 10-3. El tiempo transcurridoentre la realización de las diluciones y la siembra en la última caja, no debeser mayor de 20 minutos.

5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como controldel diluyente.

6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45ºC, a cada una de las cajas,incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio.

Según la temperatura de incubación, se obtienen los mesófilos aerobios a37ºC, los termófilos cuando se incuban las cajas a 55ºC, los psicrófilos a 7ºCpor 10 días. La temperatura elegida dependerá del objetivo que se pretendacon la realización del recuento.

También dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesófilosaerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelíticos,utilizando agar leche; lipolíticos, utilizando al agar tributirina; coliformes,utilizando agar EMB o VRBD.

Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio decultivo, se pueden detectar loa mesófilos anaerobios y facultativos viables,utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones deanaerobiosis.

a. Mesófilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar PlateCount fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas comocontrol del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica elnumeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC por 24 a 48horas.

b. Termófilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cadauna de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y comocontrol del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertirlas cajas e incubar a 55ºC por 24 a 48 horas.

c. Psicrótrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cadauna de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y comocontrol del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertirlas cajas e incubar a 7ºC por 10 días.

d. Proteolíticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45ºC a cada una delas cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como controldel medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajase incubar a 22ºC por 72 horas.

e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45ºC a cada una delas cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como controldel medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajase incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.

157. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en dirección de las manecillas del

reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obteneruna distribución homogénea de la muestra en el medio de cultivo.

8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.

4.6. PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE.

1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones.2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del

alimento, fecha, dilución y No. del grupo.3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del

diluyente y otra como control del medio.4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente

en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio decultivo.

5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie delmedio, hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC (ver figura 4).7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias.8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilución y por 10.


1. Sacar las cajas de la incubadora.2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del

medio.3. Organizar las cajas de la dilución menor a la mayor.4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el

recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilución.5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC).

6. INFORMES DE RESULTADOS

1. Se reportan solamente dos dígitos, el primero y el segundo de izquierdaa derecha, los otros dígitos deben reemplazarse por ceros.

2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas próximonúmero si el tercer dígito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco.

3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptación o rechazo deun alimento, porque es útil solo como una aproximación primaria en lacalidad bacteriológica de un alimento.

7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

161. Cajas entre 30 -300 UFC

Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y semultiplican por el inverso del factor de dilución. Ej:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 > 300 UFCDil: 10-3 80 UFCDil: 10-4 10 UFC

Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, sepromedia el valor y se multiplican por el factor de dilución.

Se reporta Recuento Estándar en placa 80x103 UFC /g o mL

Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contenganentre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199).

2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC.

Se hace el recuento para cada dilución y se promedian los resultados. Ej:

a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otracaja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 300 UFCDil: 10-3 38 UFCDil: 10-4 10 UFC

Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilución mayores manos del doble de la dilución menor, entonces se reporta el promedio delrecuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC ó 34x103.Se reporta Recuento Estándar en placa 34x103 UFC /g o mL

b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o más del conteo de la otra caja,se informa el recuento menor. Ejemplo:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 200 UFCDil: 10-3 60 UFCDil: 10-4 15 UFC

Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilución mayor esmas del doble de la dilución menor, entonces se reporta la dilución menor o sea20000UFC ó 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estándar en placa 20x103

UFC/ g ó mL.

173. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC

En estos casos se elige la caja con el recuento más cercano a 300, semultiplica por el factor de dilución y se reporta como Recuento Estimado enPlaca.

4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC.

Se cuentan las colonias de la caja con menor dilución y se reporta comoRecuento Estimado en placa.

5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento.

Después de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia desustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de ladilución mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g ó mL. o menos de 10 UFC /gó mL ( para siembra en profundidad) y menos de 102 UFC /g ó mL o menos de100 UFC /g ó mL ( para siembra superficial). Se reporta como RecuentoEstimado en placa: <1x101 UFC /g ó mL o 102 UFC /g ó mL, respectivamente.

6. Todas las cajas presentan mas de 300 UFC

a) Dividir la caja de la dilución mas alta en secciones radiales (2, 4, 8),contar todas las colonias de una sección y multiplicar ese resultado porel factor de dilución y se reporta como Recuento Estimado en placa.

b) Si hay mas de 200 colonias en cada una de las 8 secciones, multiplicarpor 1600 (200x8) y por el factor de dilución; expresar el resultado comomayor que el número resultante. Reportar Recuento Estimado en placa:> 16x105 UFC/g ó mL.

7. Presencia de Spreader

Es el crecimiento de un microorganismo en forma de película, la cual puedeocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar lascolonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado enplaca. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportarpresencia de spreader o accidente de laboratorio.

8. INVESTIGAR

1. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los alimentos o productos donde lacontaminación es esencialmente superficial?

2. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los productos grasos y que se hacecuando el contenido graso es mayor del 20%?

3. ¿Qué precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir dealimentos congelados, deshidratados o pasteurizados?

4. ¿Cuál es la importancia y utilidad del recuento en placa?

18

9. BIBLIOGRAFÍA


2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos.Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos.Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez.Medellín, 1994.

3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisisMicrobiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España,1984.


Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallasabsorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador.

Grupo 1: 100 mL de lecheGrupo 2: 100 g de quesoGrupo 3: 100 mL de suero costeñoGrupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta frescaGrupo 5: 100 g de chorizo.

Figura No. 2 Diluciones decimales

Dilución 10-1

1ml

Dilución 10-2

1ml

Dilución 10-3

10 g

10 ml

90 mlAguapeptona

9 mlAguaPept.

9 mlAguaPept.

19Figura No. 3: Siembra en Profundidad

10-2 10-3 C.D

C.D.10-1 10-2 10-3

1ml

1ml

1ml

1ml

10-1

C.M.

Agar45ªC

15ml

15ml

MezclarY

Solidificar

Incubar

20Figura No. 4: Siembra en Superficie

Agar

10-1

10-2

1ml

10-3 C.D

1ml

1ml

1ml

10-1 10-2 10-3 C.D. C.M.

Incubar

21UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA



GUÍA Nº 4: TECNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

1. INTRODUCCIÓN

Esta técnica sirve para estimar la población de microorganismos viables en unamuestra de alimento. En contraste con el recuento estándar en placa, el NMPes un método indirecto y solo da recuentos estimados de la poblaciónmicrobiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata dealimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz enpoblaciones bajas porque permite el análisis de muestras de tamaño massignificativo. Se usa principalmente para la determinación de coliformes, perovariando el medio de cultivo también se puede utilizar para la cuantificación deStaphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc.

La metodología de la técnica se basa en la siembra de volúmenes secuencialesde base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la dilucionesdecimales. El número de diluciones dependerá del grado de contaminación delalimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos para ese producto:La relación muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio decultivo.

Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivoutilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida dela confirmación de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante osiembra por estría en EMB; el británico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercermétodo emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristalvioleta rojo neutro bilis lactosa. La utilización del método dependerá deltratamiento a que ha sido sometido el alimento.

2. OBJETIVOS

1. Conocer el fundamento de la técnica del número más probable.2. Sembrar muestras puras y diluidas por la técnica del NMP utilizando

diversas modalidades y medio de cultivo.3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes.4. Informar los resultados de la técnica del NMP.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Bilis verde brillantelactosa con durham

Coloración de gram Homogenizador

A. EMB BalanzaAgua peptona 0.1% Cuchillos-cucharas

IncubadoraPipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayo


4. PROCEDIMIENTO

4.1. TECNICA CON 5 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo.2. Marcar 5 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante

lactosa a doble concentración.3. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar.4. Mezclar muy bien el alimento y adicionar 10mL en cada uno de los tubos

(ver figura 5).5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez.

Negativo los que no presentes estos parámetros opresente solamente uno de los dos.

7. Anotar los tubos positivos y buscar en la tabla No. 1, que es una tabla quese usa cuando se utilizan 5 tubos con 10mL de muestra. El resultado delNMP se obtiene en 100mL, si el resultado se tiene que expresar por mL sedivide entre 100.

4.2. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS.

1. Desinfectar Con alcohol al 70% toda el área de trabajo.2. Tomar 9 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde

brillante lactosa, tres de los cuales están a doble concentración y los 6restantes a concentración simple.

3. Marcar los tubos anteriores de la siguiente manera: con el número 10 lostres tubos que tienen doble concentración, con el número 1 tres tuboscon concentración simple y con el número 0.1 los tres tubos restantesque también tienen una concentración normal o simple.

4. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento autilizar.

5. Mezclar muy bien el alimento y sembrar por triplicado 10mL, 1mL y 0.1mL en cada uno de los tubos marcados respectivamente (ver figura 6).

6. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.7. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez.

Negativo los que no presenten estos parámetros o presente solamente uno de los dos.

238. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a

determinar usando pruebas complementarias.9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria.10.Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando se

siembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y0.1mL de muestra en los últimos tres tubos. El resultado del NMP se daen 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100.

4.3. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LÍQUIDAS OSÓLIDAS.

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo.2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a

utilizar.3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma

que para el recuento en placa.4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que

contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados aconcentración simple (ver figura 7).

5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez.

Negativo los que no presentes estos parámetros opresente solamente uno de los dos.

7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria(Ver figura 7).

8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa pormL.

4.4. PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS

Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado elmicroorganismo buscado

4.4.1. Examen microscópico directo:1. realizar frotis a partir de los tubos positivos.2. Colorearlos con Gram.3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X.Este método no es útil ya que no permite distinguir los microorganismosmuertos de los vivos.

4.4.2. Subcultivos:1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, mac-

Konkey ó Endo).2. Incubar por 24-48 horas a 37ªC.3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar.

24

5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.

Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g ó mL dealimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP =No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un análisis de NMP, estándirectamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una seriede resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando unnúmero dado de organismos están presentes en una muestra de alimentos.

En caso de realizar más diluciones que las que posea la tabla empleada, sepuede usar la siguiente fórmula para hallar el NMP por g ó mL:

(NMP de la tabla x Factor de dilución intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/gó mL

6. BIBLIOGRAFÍA






Todos los grupos deben traer:Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta paraenmascarar, Marcador.

Grupo 1: 100 mL de leche crudaGrupo 2: 100 g de quesoGrupo 3: 100 mL de suero costeñoGrupo 4: 100 mL de jugo preparado en casaGrupo 5: 100 g de chorizo.

25

TABLA No. 1TABLA DE NMP Y LÍMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOS

CON 10 ML DE MUESTRANÚMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95%

Mínimo Máximo0 2.2 0 6.01 2.2 0.1 12.62 5.1 0.5 19.23 9.2 1.6 29.44 10.0 3.0 52.95 16.0 8.0 Infinita

TABLA No. 2TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS

NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS10mL 1mL 0.1mL

NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95%Mínimo Máximo

000 <3001 3 0.5 9010 3 0.5 13100 4 0.5 20101 7 1 21110 7 1 23111 11 3 36120 11 3 36200 9 1 36201 14 3 37210 15 3 44211 20 7 89220 21 4 47221 28 10 150300 23 4 120301 39 7 130302 64 15 380310 43 7 210311 75 14 230312 120 30 380320 93 15 380321 110 30 440322 210 35 470330 240 36 1300331 460 71 2400332 1100 150 4800333 >2400

26

TABLA NO. 3TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS

DILUIDASNÚMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/g ó mL LIMITES DE CONFIANZA

10-1 10-2 10-3 99% 95%000 <3 <1 23 <1 17010 3 <1 28 1 21100 4 1 35 2 27101 7 1 36 2 28110 7 2 44 4 35120 11 1 50 2 38200 9 3 62 5 48201 14 3 65 5 50210 15 5 77 8 61211 20 5 80 8 63220 21 4 177 7 129300 23 10 230 10 180301 40 10 290 20 210310 40 20 370 20 280311 70 20 520 30 390320 90 30 660 50 510321 150 50 820 80 640322 210 100 1900 100 1400330 200 100 3200 200 2400331 500 200 6400 300 4800332 1100333 >2400

Fuente: MAN (1975)

De cada dilución se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1 mL. Paracalcular el NMP de diluciones mayores que las que figuran en la tabla,multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, silos tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-2, 10-3, 10-4,multiplicar por 10; si las diluciones son 10-3, 10-4, 10-5, multiplicar por 100.

27

Figura No. 5: Técnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras líquidas)

28

10 ml(doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

Litro 10 ml

Incubar

Figura No. 6: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras líquidas)

29

Litro

1 ml

0.1 ml

10ml

Incubar

Figura No. 7: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas líquidas osólidas)

10 ml 10Gramos

90 mlAgua

peptona

10-1

9 mlA.Pep10-2

9 mlAPep10-3

1ml 1ml

1ml1ml1ml

Incubar

30

UNIVERSIDAD DE CORDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS


MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOSGUÍA Nº 5: RECUENTO DE MESOFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES

1. INTRODUCCIÓNEl número de microorganismos mesófilos aerobios encontrados en losalimentos por el método del recuento en placa es uno de los indicadoresmicrobiológicos de la calidad de los alimentos mas frecuentemente usados.Este índice no es utilizado en productos alimenticios obtenidos por medio deprocesos fermentativos como el queso y ciertos embutidos porque losrecuentos de microorganismos son muy elevados. (Luna, 1991, p 49).

Este recuento es utilizado para determinar si la limpieza, desinfección y elcontrol de temperaturas durante los procesos de tratamiento industrial,transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada; tambiénpermite obtener información sobre alteraciones incipientes en los alimentos, laprobable vida útil del producto, la descongelación incontrolada de los alimentoscongelados o las fallas en el mantenimiento de las temperaturas derefrigeración en alimentos fríos. Además es el método utilizado para poner demanifiesto el origen de la contaminación durante los procesos de elaboraciónde los alimentos. (Luna, 1991, p 49).

El recuento en placa de mesófilos aerobios se puede desarrollar a través decuatro métodos:

1. Método de recuento en placa profunda. (Mayor uso).2. Método de recuento en placa superficial.3. Método de recuento en placa por siembra de gotas en superficie.4. Método de recuento en placa por siembra con asa de platino

calibrado (Para leche principalmente).

2. OBJETIVOS1. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos

viables a partir de alimentos de origen animal o vegetal.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% HomogenizadorAgar plate count Balanza

Cuchillos-cucharasIncubadoraPipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaCajas de petri


4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE MESÓFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES

1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No. del grupo.3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del

diluyente.4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml

del diluyente.5. Verter 15ml de agar plate count fundido a 45ªC en cada una de las

cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Invertir las cajas e incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.9. Luego de cumplido el tiempo de incubación, sacar las cajas y evaluar el

control del medio y del diluyente; posteriormente proceder al conteo delas cajas con las diluciones si no se presentan problemas en loscontroles y si se observa mayor población de microorganismos en lascajas menos diluidas.

5. BIBLIOGRAFÍA



3. LUNA CORTES, Gilma Yaneth, Manual operativo de análisismicrobiológicos para alimentos. Fundación Universidad de Bogotá JorgeTadeo Lozano, 1ª ed. I.S.B.N. 958-9029-00-0, Bogotá 1991.


32




GUÍA Nº 6: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN ALIMENTOSDE ORIGEN ANIMALO VEGETAL

1. INTRODUCCIÓN

El término habitual de coliformes comprende E.coli y otras especiespertenecientes a otros géneros de la familia Enterobacteriaceae, sonmicroorganismos ubicuitarios; se les puede encontrar ampliamente distribuidosen la naturaleza, el suelo, agua y también son carga normal del tracto intestinaldel hombre y animales de sangre caliente (Escobar, 1994, p 66).

En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienizacióneficaz que asegure su inocuidad al consumidor, está indicado por regla general,la determinación de coliformes totales o gérmenes del grupo coli-aerógenes,incubados a 37ªC, que fermentan la lactosa con producción de gas en el mediocaldo lactosa bilis verde brillante (2%), su presencia no tiene necesariamenterelación con una contaminación de origen fecal, y consiguientemente, con laposible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos denaturaleza entérica, sino que es solo una indicación de deficiencias o fallos enel tratamiento industrial, recontaminaciones después del procesos de losalimentos y en última instancia de su calidad higiénica; mala calidad higiénicaen el proceso, falta de higiene de los manipuladores. Ello es debido a ladiversa procedencia de los miembros que integra este grupo demicroorganismos (Escobar, 1994, p 66).

E.coli es un germen cuyo habitat natural es el tracto entérico del hombre y losanimales. La mayoría de las bacterias del grupo E.coli son comensalesinocuos entéricos, pero algunas cepas pueden causarle daño a la saludhumana o animal. Su presencia en un alimento indica generalmente unacontaminación directa o indirecta de origen fecal y por consiguiente, existe elriesgo de que hayan podido llegar al alimento en cuestión microorganismospatógenos de procedencia entérica (Escobar, 1994, p 68).

Resulta claro que E.coli es el indicador de contaminación fecal universal y dehecho es el marcador sanitario ideal en el análisis microbiológico de losalimentos crudos o que no han sido sometidos a ningún tratamiento paraasegurar su inocuidad. Así por ejemplo, si este microorganismo se encuentraen alimentos tales como verduras, hortalizas, moluscos bivalvos, etc., puedeinferirse que ha tenido lugar una contaminación de origen fecal y que por lotanto, han podido llegar a estos alimentos microorganismos patógenos deprocedencia entérica (Escobar, 1994, p 68).

33

2. OBJETIVOS

1. Determinar coliformes totales y fecales, a partir de productos de origenanimal o vegetal.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Bilis verde brillante lactosacon durham


A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaAgua peptona 0.1% Cuchillos-cucharasAgua triptona Incubadora

Pipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petri


4. PROCEDIMIENTO

4.1. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y el recipiente quecontiene la muestra a analizar.

2. Pesar 10 g o medir 10 ml de la muestra y realizar tres o más diluciones deigual forma que para el recuento en placa.

3. Sembrar por triplicado 1 mL de cada una de las diluciones en tubos quecontengan 10 ml de Bilis verde brillante lactosa con tubos durhampreparados a concentración simple.

4. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.5. Leer a las 24 horas los tubos positivos, los negativos reincubarlos otras 24

horas.6. Repicar mediante una asada todos los tubos positivos al agar EMB e

incubar por 24 horas a 35-37ªC.7. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento

característico en agar EMB (colonias con brillo verde metálico).8. Buscar en la tabla No.3 el resultado de NMP.9. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Totales = No. de bacterias

/ g ó ml.

4.2. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES FECALES O TEST DE MAC-KENZEI.

1. Subcultivar todos los tubos positivos de coliformes totales en caldo Bilisverde brillante lactosa y agua triptona o medio SIM.

2. Incubar por 24-48 horas a 44.5ªC en baño serológico cuidando que el34

nivel del agua cubra el contenido de los tubos.3. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillante

lactosa: se le por turbidez y gas.Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo deKovacs y se lee por formación de un anillo rojo en la superficie delmedio.Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubospositivos.

4. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP.5. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de

bacterias / g ó ml

5. BIBLIOGRAFÍA





35




GUÍA Nº 7: RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASAPOSITIVA

1. INTRODUCCIÓN

La intoxicación estafilocócica se produce por el consumo de alimentos en losque se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes,activas por vía oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento(Escobar, 1994, p 94).

Los estafilococos enterotoxigénicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en losalimentos en el momento de su obtención, en especial en los de origen animal,o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de losmanipuladores.

Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosasnasales y faringe, también se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobretodo en procesos cutáneos (acné, furúnculos, heridas infectadas) (Escobar,1994, p 94).

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir dealimentos de origen animal o vegetal.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Coloración de gram HomogenizadorAgar Baird –Parker Plasma fresco BalanzaInfusión cerebro corazón Cuchillos-cucharasAgar azul de O-Toluidina DNA Incubadora

Pipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petri


36

4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASAPOSITIVA

1. Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones.2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha,

muestra, dilución y No. del grupo.3. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como

control del medio y otra como control del diluyente.4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en

las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio Baird-Parker.

5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio,hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas

colonias características (negras, lustrosas, convexas, rodeadas de unhalo claro dentro de anillos opacos). Realizar el conteo finalmultiplicando por el inverso de la dilución y por 10.

4.1. CONFIRMACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUSAUREUS.

4.1.1. Prueba de coagulasa.

1. Realizar la coloración de gram a varias colonias características (raízcuadrada del total y no menos de 3 colonias).

2. Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos.3. Sembrar en igual número de tubos que contienen infusión cerebro

corazón las colonias características y grampositivas.4. Incubar a 37 ªC por 24 horas.5. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como

prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano(o plasma de conejo).

6. Incubar a 37 ªC por 4 horas, observar cada hora hasta la formación delcoágulo. Si después de este tiempo da negativo, incubar hasta 24horas.

7. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y elnúmero de confirmadas positivas, ejemplo:

Total de colonias contadas en la dilución 10-2 = 30 3000Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7Positivas en la prueba de la coagulasa= 5Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva:

3000 x 5X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ó ml.

737

4.1.2. Determinación de termonuclesa.

1. Incubar las placas de Baird Parker positivas por 2 horas a 60ªC.2. Adicionar sobre las placas de Baird Parker 15 ml de agar azul de O-

Toluidina DNA fundido a 45ªC.3. Incubar por 3 horas a 37 ªC.4. Observar presencia de una zona rosada brillante sobre cada colonia de

Staphylococcus aureus indica una prueba positiva.

5. BIBLIOGRAFÍA





38




GUÍA Nº 8: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

1. INTRODUCCIÓN

Los mohos y las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza, porlo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pHy Aw, alto contenido de sólidos como sal o azúcar, temperaturas bajas dealmacenamiento o presencia de antibióticos, pues son capaces dedesarrollarse en las condiciones mas adversas (Escobar, 1994, p 198).

Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas,hidratos de carbono, ácidos orgánicos, proteínas, lípidos, etc.

Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor,decoloración o pigmentación de la superficie de los alimentos, son los grandesalteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubérculos y granos (Escobar,1994, p 198).

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal yvegetal

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% HomogenizadorAgar Ogy Balanza

Cuchillos-cucharasIncubadoraPipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petri


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4. PROCEDIMIENTO

4.1. DETERMINACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No. del grupo.3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del

diluyente.4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml

del diluyente.5. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a

45ªC en cada una de las cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Invertir las cajas e incubar a 22ªC por 5 a 7 días (envolver las cajas con

papel Kraft).9. Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente.10.Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso

de la dilución.

5. INVESTIGACIÓN

1 Fundamento del agar OGY2 Importancia de la determinación de mohos y levaduras y en qué tipo de

alimentos se determinan.

6. BIBLIOGRAFÍA





40




GUÍA Nº 9: INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN

Todas las Salmonellas deberían ser consideradas como potencialmentepatógenas para el ser humano y los animales. La única forma de transmisiónes la oral, por lo que es de suma importancia el análisis de los alimentos paradetectar su presencia en ellos (Escobar, 1994, p 79).

Los alimentos más contaminados son los de origen animal, incluye huevoscrudos, ovoproductos, leche cruda y productos lácteos, carnes y derivados,aves. La infección se disemina en los animales por los alimentos concentradospara animales como por ejemplo harinas de pescado y de sangre (Escobar,1994, p 79).

El hombre, los animales domésticos y salvajes, incluidos las aves de corral,porcinos, bovinos, roedores y animales caseros como tortugas, polluelos,perros y gatos son reservorios importantes de Salmonellas (Escobar, 1994, p79).

2. OBJETIVOS

1. Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de origen animal yen derivados vegetales (harinas de cereales)

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona tamponada Coloración de gram HomogenizadorAgar Hecktoen Reactivo de Kovacs BalanzaAgar BPLS Griess Cuchillos-cucharasCaldo tetrationato de sodio Alfa naftol IncubadoraCaldo selenite- cistina KOH 40% Pipetas 1 y 10mLCaldo nitrato Rojo de metilo Asa bacteriológicaCaldo MR-VP Peroxido hidrogeno 3% Bolsas de polipropilenoAgar citrato GradillaAgar urea Tubos de ensayoAgar kligler Cajas de petriAgar LiaAgar SIMAgar XLD* Algodón y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. DETERMINACIÓN DE SALMONELLAS

4.1.1. Enriquecimiento no selectivo

a. Pesar 25g del producto y disolverlo en 225 ml de caldo lactosado oagua peptonada tamponada.

b. Mezclar e incubar a 37ªC por 18-24 horas.

4.1.2. Enriquecimiento selectivo

1. Pipetear 1ml del anterior cultivo en 10 ml de Caldo Selenite-Cistina eincubar en baño serológico a 43ªC por 24 horas.

2. Pipetar otro mililitro y adicionarlo en un tubo que contenga 10 ml decaldo tetrationato verde brillante e incubar en baño sexológico a 43ªCpor 24 horas.

4.1.3. Siembra en agar selectivo

1. Repicar en dos de los siguientes medios selectivo: agar Hecktoen /XLD / BPLS,a partir de los caldos de enriquecimiento selectivo

2. Incubar de 35 a 37ªC por 24-48 horas.

4.1.4. Identificación bioquímica

1. Observar las colonias típicas: en agar Hecktoen vedes con o sincentro negro oscuro, en BPLS rojas o rosadas con halos rosados.

2. Sembrar las colonias típicas de Salmonellas de cada uno de losagares en medio SIM, Kligler o TSI, LIA, Citrato, Caldo MR-VP,Urea, Nitrato y realizar la prueba de oxidasa.

3. Incubar las pruebas y buscar en las tablas de identificaciónbioquímica.

5. INVESTIGACIÓN

1 Importancia de la determinación de Salmonellas en los alimentos.

6. BIBLIOGRAFÍA


2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos.Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos.Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez.

42

Medellín, 1994.3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis

Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España,1984.


43




GUÍA Nº 10: RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITORESDUCTOR

1. INTRODUCCIÓN

El género Clostridium se define como bacilos gram positivos, al menos en lasetapas tempranas del crecimiento, usualmente móviles por flagelos peritricos,con excepción de Clostridium perfringes, presentan esporas termoresistentesovoides subterminales que deforman el cuerpo del bacilo (Acosta y González,1995, p 298).

Son anaerobios estrictos y algunas cepas presentan aerotolerancia. Sutemperatura óptima de crecimiento es 37ªC; crecen a pH entre 4,7 y 9,0 perosu óptimo es de 7,0. Se desarrollan a niveles de Aw entre 0,94 y 0,97dependiendo de la cepa (Acosta y González, 1995, p 298).

Clostridium perfringes es un bacilo corto, gram positivo inmóvil con esporassubterminal y oval, anaerobio y aerotolerante, fermenta rápidamente la glucosay lactosa; tiene pH óptimo de 7,0, temperatura de 46ªC, nivel de Aw de 0,93 a0,95 y resiste concentraciones de 3% de NaCl y 100 mg de nitrito de sodio(Acosta y González, 1995, p 299).

Es un microorganismo proteolítico, sacarolítico productor de exotoxinasantigénicas de naturaleza proteica (Acosta y González, 1995, p 299).

2. OBJETIVOS1. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito

reductor a partir de productos cárnicos.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Coloración de gram HomogenizadorAgua triptona Reactivo de Kovacs BalanzaCaldo nitrato Griess Cuchillos-cucharasCaldo MR-VP Peróxido hidrógeno 3% IncubadoraAgar citrato Oxidasa Pipetas 1 y 10mLAgar urea Asa bacteriológicaAgar kligler Bolsas de polipropilenoAgar SIM GradillaAgar SPS Tubos de ensayoCaldo tioglicolato Cajas de petriAgar gelatina* Algodón y alcohol al 70%

44

4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

4.1.1 Recuento en placa

1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual que para el recuentoen placa, tener cuidado de que al homogenizar no se aumentedemasiado la temperatura.

2. Marcar tres (3) cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No delgrupo.

3. Marcar dos (2) cajas, una como control del diluyente y otra como controldel medio.

4. Pipetear en las cajas de petri 1ml de cada una de las diluciones y 1mldel diluyente en la caja marcada como control del diluyente.

5. Verter 15ml de agar SPS fundido a 45ªC en cada una de las cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Colocar las cajas con las tapas hacia arriba en la jara de anaerobiosis.9. incubar a 37ªC por 48 horas.10.Sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente.11.Seleccionar las cajas entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias

negras, calcular el número de esporas Clostridium sulfito reductor porgramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilución.

4.1.2. Recuento en tubo

1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual forma que para elrecuento en placa.

2. Marcar tres (3) tubos con fecha, muestra, dilución y No. del grupo.3. Pipetear en los tubos 1ml de cada una de las diluciones.4. Calentar en el baño serológico a 80ªC durante 10 minutos cada una de

las diluciones.5. Enfriar en un beaker con agua y hielo.6. Verter 12 ml de agar SPS fundido a 45ªC en cada uno de los tubos.7. Dejar solidificar.8. Adicionar una segunda capa (de aproximadamente 3ml) de agar SPS

fundido a 45ªC.9. Dejar solidificar.10. Incubar a 37ªC por 72 horas.11. Seleccionar los tubos entre 30 y 300 colonias y contar todas las

colonias negras, calcular el número de esporas Clostridium sulfitoreductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso dela dilución.

45

4.1.3. Confirmación de las colonias de Clostridium perfringes

1. Elegir como mínimo tres (3) colonias características (negras) y sembrarcada una en tubos con caldo tioglicolato.

2. Incubar en baño setológico a 46ªC por 3-4 horas.3. Realizar un extendido de cada uno de los cultivos y colorearlos con

gram.4. Observar al microscopio, bacilos grandes con extremos redondeados

gram positivos con esporas subterminales.5. Realizar la prueba de la catalasa a partir del cultivo de tioglicolato:

tomar 3ml del cultivo y adicionarle 0.5 ml de peróxido de hidrógeno al3%, mezclar y observar desprendimientos de burbujas de gas, lo queindica una reacción positiva.

6. Inocular a partir del cultivo de tioglicolato en SIM, caldo nitrato, agargelatina y agar Kligler.

7. Incubar a 37ªC por 18-24 horas.8. Considerar positivas las pruebas para Clostridium perfringes cuando se

presentan los siguientes resultados:Catalasa NegativaMovilidad NegativaNitratos PositivaLicuefacción de la gelatina PositivaLactosa Positiva

9. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y elnúmero de confirmadas positivas. Ejemplo:Total de colonias contadas en dilución 10-2 = 3 300Elegidas para realizar las pruebas = 6Colonias que resultaron positivas = 4

300 x 4Reporte de Clostrium perfringes = = 200 bacterias / g ó ml

6

5. INVESTIGACIÓN

1. Fundamento del agar SPS.2. Importancia de la determinación de Clostrium perfringes en alimentos.

6. BIBLIOGRAFÍA1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos

para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995.2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis


3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. AnálisisMicrobiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10Santa fe de Bogotá, 1998.

46




GUÍA Nº 11: RECUENTO DE BACILLUS CEREUS

1. INTRODUCCIÓN

Bacillus cereus, es un bastón aerobio esporulado, ubicuitario y habitualmentese le encuentra en alimentos crudos, secos y elaborados.

Los alimentos no deben permanecer a temperatura ambiente una vez cocidos,ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios estáncontaminados hasta cierto punto (<10/g) por este organismo. La ingestión dealimentos que han sido conservados a temperatura ambiente después de sucocción, permite que las esporas, las cuales sobreviven la ebullición, germineny se multipliquen a niveles altos y verter las toxinas al alimento, para quefinalmente provoquen la intoxicación. (Escobar, 1994, p 147).

2. OBJETIVOS

1. Realizar Recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Coloración de gram HomogenizadorAgar Cereus según Mossel Reactivo de Kovacs BalanzaAgar Gelatina Solución lugol Cuchillos-cucharasAgar Almidón Griess IncubadoraAgar Citrato Simmons Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mLAgar Urea KOH 40% Asa bacteriológicaAgar SIM Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoCaldo nitrato Peroxido hidrogeno 3% GradillaCaldo MR-VP Oxidasa Tubos de ensayoCaldo MR-Glucosa (5%)Caldo MR-Xilosa (5%)Caldo MR-Arabinosa (5%)Caldo cerebro corazón* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE BACILLUS CEREUS

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1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Cereus según Mossel con

fecha, muestra, dilución y No. del grupo.3. Marcar dos cajas que contienen agar Cereus según Mossel, una como

control del medio y la otra como control del diluyente.4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en

las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio agarCereus según Mossel.

5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio,hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas

colonias características (colonias rosadas con bordes regulares eirregulares, con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinasa).Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilución y por10.

8. Tomar al menos tres UFC características, realizarles la prueba de lacatalasa y la coloración de gram; si son catalasa positiva y a lacoloración de gram se observan bastones gram positivos con extremosmas o menos cuadrados encadenas cortas o largas y entrelazadas conespora subterminal, central o elipsoidal que no deforman el cuerpobacteriano realizar la identificación bioquímica.

4.2. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILLUS CEREUS

1. Subcultivar tres colonias características en caldo cerebro corazón.2. Realizar la siguientes pruebas bioquímicas:

Hidrólisis de la gelatina: Siembre dos líneas paralelas en agargelatina e incubar a 37ª por 24 horas

Hidrólisis de almidón: Siembra dos líneas paralelas en agaralmidón e incubar a 37ªC por 24 horas.

Agar Urea: Inocular el fondo por picadura y el bisel por estría eincubar 37ªC por 24 horas.

Agar Citrato Simmons: Inocular el fondo por picadura y el bisel enlínea e incubar 37ªC por 24 horas.

Movilidad: Inocular el fondo (Agar SIM) por picadura e incubar37ªC por 24 horas.

Reducción de nitratos: Caldo Nitrato Producción acetoína: Caldo MR-VP Fermentación de carbohidratos: Glusoca, Xilosa, Arabinosa

3. Comparar los resultados con las características bioquímicas deBacillus cereus: Hidrólisis de la gelatina: Zonas claras alrededor de las colonias

luego de cubrir las colonias con reactivo sublimado de Hg. Hidrólisis de almidón: Zonas claras alrededor de las colonias

luego de cubrir las colonias con lugol. Agar Urea: Tubos con reacción ácida (amarillos), urea-negativos. Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citrato negativo.

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Movil: Crecimiento desplazado a través de la línea de siembra. Reducción de nitratos: Aparición de un color rojo después de

agregar el reactivo Griess Producción acetoína: aparición de un color rojo luego de adicionar

el alfa naftol y el hidróxido de potasio. Fermentación de carbohidratos (Glusoca, Xilosa, Arabinosa) por

medio de viraje del medio a amarillo.

5. INVESTIGACIÓN

1. Fundamento del agar Cereus según Mossel.

6. BIBLIOGRAFÍA





49




GUÍA Nº 12: INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES

1. INTRODUCCIÓN

Listeria monocytogenes es un pequeño bastón de 0,5 a 2 µ, que se presentaen empalizada, no capsulado, no espurado, móvil, se multiplica a temperaturasentre 3 y 45ªC, crece a pH entre 5,6 y 9,6, se destruye por calor a 70ªC durantealgunos segundos, catalasa positivo, oxidasa negativo y anaerobio facultativo(Escobar, 1994, p 224).

Es un germen ubicuitario, se encuentra en el suelo, aire, vegetales, aguasresiduales, afluentes, lodos, etc. El reservorio lo constituyen los mamíferosdomésticos y silvestres, aves y el hombre infectados (Escobar, 1994, p 224).

Se han notificado casos de listeriosis asociados a la ingestión de hortalizascontaminadas y productos lácteos en especial quesos supuestamentecontaminados y leche cruda. También se ha aislado de carne y productoscárnicos.

2. OBJETIVOS

1. Realizar investigación de Listeria monocytogenes a partir de productoslácteos o cárnicos.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agar Mac Bride modificado Coloración de gram HomogenizadorCaldo de enriquecimiento EB Griess BalanzaAgar soya tripticasa (6%estrato levadura)

Peroxido hidrogeno3%

Cuchillos-cucharas

caldo soya tripticasa (6%estrato levadura)

Incubadora

Agar sangre Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mLAgar TSI KOH 40% Asa bacteriológicaAgar SIM Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoCaldo MR-VP GradillaCaldo nitrato Oxidasa Tubos de ensayoAgar UreaCaldo púrpura debromocresol + 0.5% glusosaCaldo púrpura debromocresol + 0.5% esculinaCaldo púrpura de

bromocresol + 0.5% maltosaCaldo púrpura debromocresol + 0.5% manitolCaldo púrpura debromocresol + 0.5%ramnosaCaldo púrpura debromocresol + 0.5% Xilosa* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

4.1. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

1. Pesar o medir asépticamente 25 g o ml de la muestra.2. Agregar 225 ml de caldo de enriquecimiento EB.3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher.4. Incubar a 30ªC durante24 horas y reincubar hasta 7 días.

4.2. SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

1. A partir del caldo de enriquecimiento EB aislar sobre la superficie deuna placa de agar Mac Bride modificado.

2. Incubar a 37ªC durante 24 a 48 horas.3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (las que observadas en

microscopio con transiluminación oblicua se observan azuladas) ysembrar cada una en una placa de agar soya tripticasa (6% deextracto de levadura).

4. Incubar a 37ªC durante 24 a 48 horas.5. Examinar bajo la luz oblicua, hacer Gram y catalasa a las U.F.C.

típicas.6. Comparar con los siguientes resultados: pequeños bastones gram

positivos en empalizada y catalasa positivo.7. A partir de las colonias típicas sembrar en caldo soya tripticasa (6%

de extracto de levadura).8. Incubar a 37ªC durante 24 horas para realizar pruebas bioquímicas y

de fermentación.

4.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1. Sembrar en Agar Urea a partir del caldo soya tripticasa (6% extractode levadura), incubar a 37ªC durante 5 días y observar el virajehacia un color amarillo que indica que el microorganismo no hidrolizala urea.

2. Sembrar en caldo nitrato, incubar a 37ªC durante 5 días y observarresultado negativo (no hay viraje hacia el color rojo).

3. Sembrar en agar SIM, incubar a 37ªC durante 48 horas y observar la

51

movilidad del microorganismo en forma de paraguas.4. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, icubar a 37ªC durante 48 horas

para la reacción del Voges proskauer y 5 días para el rojo de metilo(Listeria monocytogenes es MR positiva y VP positiva).

5. Sembrar en agar TSI, incubar a 37ªC durante 5 días y observar lafermentación de la glucosa y lactosa pero no la producción de gas ysulfuro.

6. Sembrar en tubos de caldo púrpura de bromocresol conteniendo0.5% de los siguientes carbohidratos: glucosa, esculina, maltosa,manitol, ramnosa y xilosa; sembrar a 37ªC durante 7 días y observarla fermentación de la glucosa, esculina, maltosa y ramnosa por unviraje al amarillo del medio de cultivo.

7. Sembrar en agar sangre una cepa de S. aureus de manera vertical ysembrar en forma horizontal Listeria monocytogenes; incubar a 37ªCdurante 24-48 horas y observar la hemólisis en la zona adyacente alS.aureus.

5. INVESTIGACIÓN

1. Fundamento del agar Mac Bride modificado.

6. BIBLIOGRAFÍA





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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOSGUÍA Nº 13: INVESTIGACIÓN DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICO

1. INTRODUCCIÓNV. parahaemolytico es un germen halófilo, gram negativo anaerobio facultativode crecimiento rápido a temperaturas entre 15 y 43 ªC, a pH entre 5 y 9 y aconcentraciones de sal entre 0.5 y 8% (Escobar, 1994, p 240).

Es un enteropatógeno de origen marino. Su relación con enfermedadesasociadas al consumo de alimentos fue descubierta en el Japón por Fujino en1950 después del consumo de pescados y mariscos crudos (Escobar, 1994, p240).

2. OBJETIVOS1. Realizar investigación de Vibrio Parahaemolytico a partir de productos de

origenmarino.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Caldo glucosa sal teepolbroth (GSTB)


Agar TCBS Griess BalanzaAgar sangre Peróxido hidrogeno

3%Cuchillos-cucharas

Agar soya tripticasa (6%NaCl)

Reactivo Kovacs Incubadora

Agar TSI con 3% NaCl Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mLCaldo nitrato con 3% NaCl KOH 40% Asa bacteriológicaAgar SIM con 3% NaCl Rojo de metilo 0.5% Bolsas de polipropilenoCaldo MR-VP con 3% NaCl GradillaAgar Hugo Leifson con 3%NaCl

Oxidasa Tubos de ensayo

Agar LIA con 3% NaCl Aceite mineralCaldo Indol con 3% NaClCaldo soya tripticasa (0%NaCl)Caldo soya tripticasa (3%NaCl)Caldo soya tripticasa (6%NaCl)Caldo soya tripticasa (8%NaCl)Caldo soya tripticasa (10%NaCl)* Algodón y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

1. Pesar o medir asépticamente 25 g o ml de la muestra.2. Agregar 225 ml de caldo GSTB (glucosa sal teepol broth).3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher.4. Incubar a 30ªC durante18 a 24 horas.

4.2. SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

1. A partir del caldo GSTB (glucosa sal teepol broth) aislar sobre lasuperficie de una placa de agar TCBS.

2. Incubar a 37ªC durante 18 a 24 horas.3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (colonias pequeñas con

centro verde azulado).

4.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1. Sembrar en el bisel de un tubo con agar soya tripticasa, incubar a37ªC durante 24 horas y apartir de este cultivo realizar la prueba deoxidasa (V. parahaemolytico es oxidasa positivo).

2. Sembrar en agar TSI por picadura en el fondo y por estría en el bisel,incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la fermentación de laglucosa (fondo ácido), pero no de la lactosa (bisel alcalino), ni laproducción de gas y de H2S.

3. Sembrar en agar LIA por picadura en el fondo y por estría en el bisel,incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la descarboxilación de lalisina (bisel y fondo alcalino).

4. Sembrar en agar nitrato, incubar a 37ºC durante 24 horas y observarla reducción de nitritos a nitratos.

5. Sembrar en agar SIM, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar lamovilidad positiva.

6. Sembrar en indol, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar laproducción de indol.

7. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, incubar a 37ªC durante 48 horaspara la reacción del Voges proskauer y 5 días para el rojo de metilo(Vibrio parahaemolytico es MR positiva y VP negativa).

8. Sembrar en dos tubos de agar Hugo Leifson por picadura profunda,agregar en uno de los tubos 1ml de aceite mineral estéril, incubar a37ªC durante 48 horas y observar el metabolismo fermentativo

9. (cambio de color en ambos tubos de verde a amarillo) o elmetabolismo oxidativo; Vibrio parahaemolytico tiene un metabolismofermentativo con respecto a la glucosa.

10. Inocular un tubo de gelatina nutritiva a partir del TSI, incubar a 37ªCdurante 1 a 7 días; refrigerar el medio durante 10 minutos, si el mediocontinua líquido, la gelatina es licuada, si ella se solidifica no lo es(Vibrio parahaemolytico licua rápidamente la gelatina).

54

11. Inocular un tubo con caldo soya tripticasa por suspensión, incubar enbaño termostatado a 42ªC durante 24 horas y observar el crecimientopor turbidez del medio (Vibrio parahaemolytico crece a 42ªC).

12.Realizar el test de halofilismo sembrando en tubos con caldo soyatripticasa con 0, 6, 8 y 10% de NaCl, incubar a 37ªC durante 24horas, observar el crecimiento positivo por turbidez del medio en lasconcentraciones de 6 y 8% de sal.

13.Sembrar en gar sangre a partir de un cultivo de soya tripticasa con3% de NaCl, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la β-hemólisis que se presenta como una zona transparente

5. INVESTIGACIÓN

1. Fundamento del agar TCBS.

6. BIBLIOGRAFÍA





55




GUÍA Nº 14: CONTROL MICROBIOLÓGICO DE CONSERVAS NOALTERADAS.

1. INTRODUCCIÓN

El enlatado (conserva) se define como la conservación de alimentos enrecipientes cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamientotérmico como principal agente que evita su alteración.

El proceso térmico como método de conservación puede ser aplicado acualquier producto alimenticio siempre que se envase en un recipienteadecuado. La principal exigencia es que el envase, una vez cerradoherméticamente no se deteriore durante la manipulación o el almacenamiento.

La alteración de los alimentos que han sido sometidos a tratamiento térmico,puede ser debida a causas químicas o biológicas o a causas de ambos tipos.La alteración química más importante de los alimentos enlatados es elabombamiento por hidrógeno, consecuencia de la presión del hidrógenoliberado al actuar el ácido de un determinado alimento sobre el hierro de la lata.

La acidez de los alimentos enlatados es importante para determinar eltratamiento térmico necesario para conseguir su esterilización y el tipo dealteración a esperar en caso de que el tratamiento térmico se insuficiente o deque se produzcan fugas.

2. OBJETIVOS1. Realizar el control microbiológico a conservas no alteradas.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Infusión cerebro corazón Coloración de gram Abrelatas

Parafina esteril BalanzaAlmidón Cuchillos-cucharasAgua tibia Incubadora

Asa bacteriológicaCajas de petriTubos estérilesToallas desechables

.. Algodón y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. PRE-INCUBACIÓN

1. Retirar las etiquetas de las latas (en caso de tenerlas).2. Lavar bien las latas con agua tibia jabonosa y escobillones en caso de

ser necesario.3. Enjuagar con agua tibia.4. Secar las latas con toallas de papel desechables.5. Envolverlas en papel filtro o en toallas desechables con el fin de

descubrir microfugas durante el período de preincubación.6. Marcar las latas con el No de identificación, fecha y temperatura de

preincubación.7. Incubar una lata a 35ªC y la otra a 55ªC durante 10 días.8. Agitar en invertir la posición de las latas diariamente.9. Observar todos los días con el fin de descubrir microfugas y

abombamiento, si una lata presentase microfugas o abombamientos, sedebe examinar inmediatamente.

4.2. PREPARACIÓN DE LAS LATAS PARA SU ANALISIS

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y las latas aanalizar.

2. Flamear rápidamente la parte a ser abierta, en el caso de estar las latasabombadas tomar precauciones para evitar un peligro.

3. Abrir las latas con ayuda de un abrelatas, preferiblemente en un cubículoo campana aséptica; no se debe abrir la lata por la tapa del fondo, dondelleva impresa su fecha de vencimiento.

4. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de petri la superficieexpuesta al aire.

4.3. ANALISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA

1. Pesar 2 gramos de cada lata, tomando de todas las partes del contenidoa fin de que la muestra sea representativa.

2. Disponer de 6 tubos con caldo Cerebro Corazón adicionado de almidónal 0.1% para las latas incubadas a 35ªC y 6 tubos para la lata incubadaa 55ªC.

3. Adicionar los 2 gramos de cada lata en cada uno de los tubos con caldocerebro corazón adicionado de 0.1% de almidón.

4. Verter una capa de 1cm de parafina estéril en seis tubos (tres de laslatas a 35ªC y tres de las latas a 55ªC), con el fin de crear condicionesde anaerobiosis.

5. Incubar los seis tubos de la lata a 35ªC y los seis tubos de la lata a 55ªC(tres en aerobiosis y tres en anaerobiosis) durante 72 horas.

6. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez enel tubo.

7. Considerar que el producto es estéril comercialmente o satisfactorio,cuando máximo un tubo en aerobiosis muestra desarrollo. (sinembargo

57

si esto ocurre mejorar la asepsia durante las manipulaciones.8. Hacer un frotis directo del producto, desengrasar si es necesario con

xilol.9. Efectuar coloración de gram en el producto para determinar el tipo de

gérmenes presentes.10.Contar el número de células bacterianas por campo; un número elevado,

indicará malas condiciones de higiene durante su proceso o la utilizaciónde materias primas muy contaminadas.

4.4. PRUEBAS ADICIONALES

1. Evaluar el color, olor, aspecto y pH del producto.2. Vaciar el contenido del producto.3. Lavar la lata en la estufa a 37ªC para secarla.4. Observar si tiene o no la capa protectora.

5. INVESTIGACIÓN

1. Criterios de clasificación de las conservas.2. ¿Cuáles son las causas de alteraciones biológicas en las conservas?3. Clases de alteraciones físicas y químicas en las conservas.

6. BIBLIOGRAFÍA

1. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Programa de Microbiología e higiene delos alimentos. Medellín, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional desalud pública “Hector Abad Gómez”, 1990. ca. 150h. QW85 E8-90.




Grupo 1: 2 conservas de atúnGrupo 2: 2 conservas de salchichaGrupo 3: 2 conservas de frutasGrupo 4: 2 conservas de verdurasGrupo 5: 2 conservas mixtas (animal y vegetal)

NOTA: las dos conservas deben de la misma marca y de la mismapresentación y contenido.

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GUÍA Nº 15: RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE AGUA PARA ANÁLISISBACTERIOLÓGICO

1. INTRODUCCIÓN

El agua es un elemento fundamental para la vida, tanto del hombre como delos animales y las plantas. Basta decir que sin ella, no habría vida en esteplaneta.

El agua químicamente pura es un líquido muy escaso y difícil de obtenerdebido a que es un solvente casi universal y en el cual son soluble la mayoríade las sustancias. Por esta propiedad, el agua se contamina frecuentementecon las sustancias con las que entra en contacto.

Son muy pocas las operaciones industriales o de ingeniería que se puedenrealizar con buenos resultados si no se cuenta con adecuados equipos paraobtener aguas a condiciones dadas de calidad. Es de importancia tenerconocimiento a cerca de las condiciones microbiológicas de las aguas quesirven como abastecimiento para las diferentes necesidades de una población,para evitar así contaminaciones ambientales y problemas de salud publica.

Según el Ministerio de Salud al agua potable se le realizan las siguientesdeterminaciones microbiológicas: Coliformes Totales y Fecales por el métodode sustrato definido o de filtración por membrana (Decreto 475 de marzo 10 de1998).

2. OBJETIVOS

1. Realizar la toma de muestras de agua del grifo, pozo, piscina y envasada.2. Conocer el fundamento de las técnicas de filtración por membrana y del

sustrato definido.3. Determinar la presencia de coliformes totales o fecales por el método de

filtración por membrana o del sustrato definido.4. Realizar el conteo teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la

calidad del control.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Tiosulfato sodio 0.01N Frasco o bolsas estériles

Refrigerador portatil* Algodón y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. Cristalería

Las muestras para análisis bacteriológico se deben tomar en frascos que sehayan lavado con extremo cuidado, enjuagados con agua limpia y esterilizadospor lo menos 60 minutos a una temperatura de 170ªC.

Es necesarios evitar que la parte baja de la tapa y la boca del frasco no toquencosa alguna que pueda contaminarla muestra.

4.2. Decloración

Los frascos que se destinen para la recolección de muestras de agua con clororesidual deben llevar un agentes declorador (0.5 ml de tiosulfato de sodio 0.01N por cada 100 ml de agua); su presencia en una muestra de agua clorada enel instante de la recolección, neutraliza cualquier cloro residual y evita que conesto prosiga la acción bactericida del cloro durante el tiempo que la muestra seencuentre en tránsito al laboratorio, en tales condiciones es probable que elexamen bacteriológico indique el verdadero contenido bacteriano de la muestraen el momento del muestreo.

4.3. Preservación y almacenamiento

El examen bacteriológico de las muestras de agua se deben iniciarinmediatamente después de su recolección, sin embargo, muy raras veces sepuede proceder así y se deben establecer normas mas prácticas. El tiempopermisible entre la captación de la muestra y el examen bacteriológico no debeser mayor de 6 horas para aguas muy contaminadas y de 12 para aguasrelativamente puras. En ningún caso ese lapso debe exceder las 36 horas.

En el período que transcurre entre la recolección y el examen, se debemantener la temperatura de la muestra entre 6 y 10ªC (refrigeración, nocongelación). Para lograr estas condiciones, en el transporte se introducen losfrascos con las muestras en un termo o nevera de icopor con bolsas de hielo.

Es importante que al refrigerar las muestras se tomen precauciones y medidaspara prevenir cualquier contaminación proveniente del hielo derretido.

4.4. Captación de las muestras

4.4.1. Muestras de grifo o llaves

1. Observar que el grifo no presente escapes de agua.2. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación:

tipo de muestra, fecha hora3. Abrir el grifo y dejar correr agua durante 2 o 3 minutos para eliminar

impurezas y agua acumulada en el interior de la cañería.

60

4. Restringir el flujo de la llave para recoger el agua sin salpicaduras.5. Destapar el frasco e iniciar la recolección de la muestra hasta las ¾

partes del frasco.6. Tapar el frasco, refrigerar y enviar al laboratorio lo más pronto posible.7. Nota: si se diera el caso que muestras sucesivas del mismo grifo tengan

coliformes, entonces este deberá ser desinfectado con una solución dehipoclorito para eliminar cualquier foco de contaminación externa; eneste caso el laboratorio suministrará la información pertinente.

4.4.2. Muestras de Ríos, Arroyos, Lagos

1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación:tipo de muestra, fecha hora.

2. Sumergir rápidamente el frasco tapado debajo de la superficie del agua(15-20 cm) para evitar recolectar materia flotante.

3. Destapar e invertir el frasco para que la boca quede ligeramente haciaarriba y en sentido opuesto a la corriente (sostener con una mano por suparte posterior, formando con la horizontal un ángulo de 45ª).

4. Mover el frasco lentamente en contra de la corriente mientras entra ellíquido para evitar que el agua que toca la mano entre en el frasco.

4.4.3. Muestra de agua de pozo con bomba

1. Dejar funcionando la bomba por lo menos una hora antes de captar lamuestra.


3. Tomar las muestras en la descarga libre de la bomba o en algún grifocolocado para este fin siguiendo las instrucciones (4.4.1)

4.4.4. Muestra de agua de pozo sin bomba

Es una muestra muy difícil de recolectar, debe hacerse con muchasprecauciones para que el examen bacteriológico tenga significado alguno, peropor lo peligros de contaminación externa, los exámenes bacteriológicos de lasaguas de esta clase de pozo, no tienen mucho significado.


2. Atar un cordel al cuello del frasco.3. Destaparlo en la superficie e inmediatamente sumergirlo con cuidado,

evitando que toque las paredes del pozo.4. Llenar el frasco, sacarlo y taparlo inmediatamente.5. Refrigerar y enviar al laboratorio lo más pronto posible.

4.4.5. Muestra de agua de estanque

1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación:tipo de muestra, fecha hora

61

2. Tomar el frasco por su parte inferior con una mano.3. Invertir el frasco boca abajo.4. Sumergir a una profundidad de 30 cm.5. Destapar el frasco.6. Invertir el frasco boca arriba, hasta que quede inclinado formando un

ángulo de 45ª.7. Desplazar el frasco para crear una corriente que permita llenarlo hasta

las ¾ partes.8. Sacar el frasco y taparlo.9. Refrigerar y enviar al laboratorio.

4.5. Volumen de muestra

El volumen de la muestra debe ser el suficiente para verificar todas las pruebasque se requieran, de preferencia alrededor de 300ml.

5. BIBLIOGRAFÍA


2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisisMicrobiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, Espeña,1984.

3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Aálisi Microbiológicode Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá,1998.



Grupo 1: 200 mL de agua de grifo.Grupo 2: 200 ml de agua envasada.Grupo 3: 200 mL de agua de pozo.Grupo 4: 200 mL de río.Grupo 5: 200 g de agua de pozo con bomba.

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GUÍA Nº 16: CUATIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR EL METODODE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

1. INTRODUCCIÓNLa técnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puedeutilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra yproporciona resultados numéricos más rápidos que los métodos de los tubosmúltiples. Esta es extraordinariamente útil para controlar posibles situacionesde emergencia en elación con el agua potable y para estudiar distintas aguasnaturales. Sin embargo esta técnica tiene limitaciones sobre todo para estudiaraguas con elevada turbidez o que contenga bacterias no coliformes. Para estaagua, y también en caso de que no se haya utilizado anteriormente la técnicade filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante latécnica de fermentación en tubos múltiples para demostrar la aplicabilidad ycomparación de aquella. (Estándar Methods, 17 ed).

2. OBJETIVOS

1. Conocer el fundamento de la técnica de filtración por membrana.2. Sembrar muestras líquidas por medio de la técnica de filtración por

membrana.3. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la

calidad del control.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agar Chromocult Coloración de gram Equipo de filtración por membrana

estérilReactivo de Kovacs Membranas de acetato de celulosa

(0,45µ)Agua esteril Pinzas de punta lisaTiosulfato sodio 0.01N Incubadora

tijerasToallas desechablesBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petriFrasco o bolsas estérilesProbeta esteril

* Algodón y alcohol al 70%63

4. PROCEDIMIENTO

1. Abra el paquete que contiene el filtro de membrana estéril, tome el filtrode membrana con la pinza y colóquelo con la trama hacia arriba sobre laplaca porosa del aparato.

2. Coloque cuidadosamente el embudo sobre el receptáculo y ajusteherméticamente el embudo a la base o receptáculo. Asegúrese de quela llave esté cerrada.

3. Tome la muestra y agítela fuertemente por unos segundos.4. Mida el volumen de la muestra apropiado (100ml) usando una probeta

estéril.5. Vierta la muestra de agua dentro del embudo del portafiltro y filtre

aplicando vacío parcialmente.6. Luego de filtrar la muestra cierre la llave y asegúrese que la membrana

no quede muy seca para evitar que se rasgue.7. Adicione 30 ml de agua estéril por tres veces y filtre aplicando vacío a

través de la membrana.8. Tras el enjuagado y la desconexión del vacío en el proceso de filtrado,

desbloquee y retire el embudo.9. Inmediatamente retire el filtro de membrana con unas pinzas estériles.10.Adhiera la membrana sobre una placa con agar Chromocult, haciendo

un movimiento de rotación para evitar que quede aire atrapado.11. Introduzca una muestra de agua estéril pare el lavado, comprobando

posibles contaminaciones.12. Incube las muestras de agua y la membrana de control a una

temperatura de 35ªC durante 22 a 24 horas.13.Realizar la lectura de los resultados.

5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Lectura: Las colonias de E.coli presentarán una coloración azul violeta oscura,los coliformes totales presentarán colonias rojas y colonias azul violeta oscuro,mientras que otras enterobacterias que pueden crecer en este medio de cultivopresentarán colonias incoloras. Repórtese las colonias contadas como UFC decoliformes totales o fecales.

Tenga en cuenta para el recuento membranas que contengan entre 20 y 80UFC de coliformes totales y no más de 200 UFC por membrana de todos lostipos de microorganismos que puedan crecer.

Comprobación o confirmación de coliformes fecales: Cubrir las coloniascoloreadas de azul violeta oscuro con una gota del reactivo de Kovacs, unacoloración roja del reactivo al cabo de aproximadamente un minuto indica laformación positiva del indol.

64

Cuando se filtran volúmenes mayores de muestra (100ml) corrija el resultadode la siguiente forma:

UFC de Coliformes /100ml = UFC de Coliformes contadosx100ml de muestra de agua

Repórtese como de Recuento de Coliformes Totales/100ml para el recuento decoliformes comprobados, tenga en cuenta el recuento inicial y el % decomprobación positivo, para ello aplique la siguiente fórmula:

% coliformes verificados= Número de UFC comprobados ___x100Número total de UFC presuntivas

En las aguas potables o de buena calidad el recuento de estosmicroorganismos es mínimo, por lo tanto se deberán contar todas las UFC decoliformes, sin tener en cuenta el límite inferior de 20.

Si aparece un crecimiento difuso o congruente que cubre toda la membrana ouna buena parte de ella y las UFC no están separadas entre sí, se reportacomo crecimiento congruente o difuso, con o sin coliformes. Se pedirá otramuestra que debe ser tomada del mismo lugar, al hacer el análisis nuevamentede la muestra de 100ml se deberá dividir en dos alícuotas de 50 ml para evitarel sobrecrecimiento.

Si el número total de UFC supera los 200 o si las colonias no están separadaspara permitir su conteo, se deberá comunicar este resultado como muynumeroso para el recuento.

La dudosa presencia de coliformes se puede confirmar colocando la membranaen caldo lactosa bilis verde brillante, otra alternativa es raspar la membranabien sea con un asa o un escobillón e inocular en el tubo con caldo lactosadoverde brillante. Si este cultivo produce gas en 48 horas a temperatura de 35ºCmas o menos0.5ªC se comunicará la presencia de coliformes.

Para aguas de calidad diferente a la potable al igual que sucede si ningunamembrana tiene recuentos dentro de los parámetros ideales, realice unrecuento total de coliformes en todas las membranas y reporte como recuentoen 100 ml por ejemplo si se han analizado porciones en dos membranas y seencuentran cinco y tres colonias respectivamente, se reportará un recuento de8 colonias/100ml, es decir:

= (5+3) x 100(50 + 50)

De la misma forma si se han estudiado porciones de 50, 25 y 10 ml y elrecuento ha sido 15, 6 y menos de una colonia de coliformes, repórtese unrecuento de 25/100ml.

65

6. BIBLIOGRAFIA

1. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual Técnico y Procedimientos.Programa latinoamericano de Microbiología e Higiene de los Alimentos.Facultad Nacional de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Universidad deAntioquia. Medellín, 1994.

2. MERK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.

66




GUÍA Nº 17: NUMERO MÁS PROBABLE DE PSEUDOMONA AERUGINOSA

1. INTRODUCCIÓN

El género Pseudomona y los otros gram negativos no fermentativos(Alcalígenes, Alteromonas, Flavobacterium, Acrhromobacter Moraxella) sonbacilos o diplobacilos, gérmenes ubicuitarios, carga norma del suelo, aguasdulces y marinas y vegetales (frutas y legumbres), etc. Son aerobiosfacultativos, móviles por un flagelo polar (monotricos) o inmóviles, con rarasexcepciones son oxidasa positiva, tienen un metabolismo estrictamenterespiratorio (oxidativo) y no fermentativo; ciertas especies pueden atacar laglucosa y otros glúcidos por vía oxidativa. Crecen en medios simples atemperaturas de 30ªC, produciendo pigmentos en la mayoría de los casos(Escobar, 1994, p 251).

En el medio hospitalario se comporta como oportunista, produciendoinfecciones y hasta septicemias, son carga norma del muchos alimentosproduciendo alteración en los mismos, su presencia en aguas recreacionalespuede causar problemas de infecciones como conjuntivitis, otitis, etc. (Escobar,1994, p 251).

2. OBJETIVOS

1. Determinar el NMP de Pseudomona aeruginosa en muestras de aguaenvasada o de piscina.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Caldo casoy dobleconcentración

Oxidasa Incubadora

Caldo casoy concentraciónsimple

Solución amortiguadorafosfato pH 7.2

Pipetas 1 y 10mL

Agar cetrimide Asa bacteriológicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petriLámpara luz UV


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4. PROCEDIMIENTO

1. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene la muestra deagua a analizar.

2. Mezclar muy bien la muestra.3. Adicionar la muestra de agua así:

10ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy adoble concentración.

1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy aconcentración simple.

1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy aconcentración simple, a partir de una dilución 1:10 de soluciónbuffer fosfato pH 7,0.

4. Mezclar e incubar por 24 horas a 37ªC.5. Anotar los tubos que presentan crecimiento positivo (turbidez).6. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa mediante un

repique de todos los tubos positivos al agar cetrimide.7. Incubar a 37ªC por 24 horas.8. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa realizando la

prueba de la oxidasa: colocar una colonia en la tirilla, adicionar unagota de agua destilada estéril y leer en los 60 segundos siguientes.La aparición de un color morado o azul indica prueba de oxidasapositiva.

9. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados porcrecimiento en el agar cetrimide por formación de un pigmento verdeazulado, además el olor a frutas característico y la prueba de laoxidasa positiva.

10.Buscar en la tabla correspondiente y expresar el resultado comoNMP de Pseudomona aeruginosa/ 100 ml de agua.

5. INVESTIGACIÓN

1. Importancia de la determinación de Pseudomona aeruginosa en aguasenvasadas.

6. BIBLIOGRAFÍA


2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual Técnico y Procedimientos.Programa latinoamericano de Microbiología e Higiene de los Alimentos.Facultad Nacional de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Universidad deAntioquia. Medellín, 1994.



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GUÍA Nº 18: PRESENCIA-AUSENCIA DE COLIFORMES EN MUESTRAS DEAGUA (METODO DEL SUSTRATO DEFINIDO)

1. INTRODUCCIÓN

La prueba de presencia-ausencia de coliformes es una sencilla modificación delprocedimiento de fermentación en tubos múltiples. La simplificación que sederiva de utilizar una sola porción grande (100ml) en un solo frasco de cultivopara obtener una información cualitativa sobre la presencia-ausencia decoliformes, se justifica por la teoría de la falta de esos microorganismos en unamuestra de agua potable de 100ml (Escobar, 1994, p 331).

La prueba de presencia-ausencia proporciona además una oportunidadopcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otrosindicadores (coliformes fecales, Pseudomonas, Streptococcus fecales yClostridium), también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidadde estudiar un mayor número de muestras por unidad de tiempo y de hacerestudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana, que indicaque la prueba de presencia-ausencia puede aumentar al máximo la detecciónde coliformes en muestras que contienen microorganismos que podrían sobrepasar en su crecimiento al de loas colonias de coliformes, provocandoproblemas para su detección (Escobar, 1994, p 331).

La prueba de presencia-ausencia se recomienda para el estudio habitual de lasmuestras obtenidas en los sistemas de distribución o en las plantas detratamiento de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras porel método de filtro de membrana, además de la prueba de presencia-ausencia.Una vez establecido que los métodos cuantitativos suelen dar resultadosnegativos para coliformes, se puede utilizar únicamente la prueba depresencia-ausencia. Cuando una muestra produce un resultado positivo enesta prueba, se estudiarán las posteriores muestras repetidas mediante unmétodo cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos endos muestras consecutivas (Escobar, 1994, p 331).

2. OBJETIVOS

1. Determinar coliformes totales y fecales en una muestra de agua a través dela prueba de presencia-ausencia( sustrato definido)

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3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Caldo LMX / Fluorocult /Readicult / Collilert

Reactivo de Kovacs Bolsas de polipropileno

IncubadoraLámpara luz UVAsa bacteriológicaGradillaTubos de ensayoCajas de petriPipetas 1 y 10mL


4. PROCEDIMIENTO

1. Inocular 100ml de la muestra de agua en el frasco o bolsa estéril.2. Adicionar el medio de cultivo deshidratado si se trata de materiales listos

para usar (Readicult, Collilert);3. Mezclar vigorosamente para obtener una buena homogenización de la

muestra con el medio.4. Incubar a 37ªC durante 18-24 horas.5. Realizar la lectura del crecimiento comparando con los siguientes

resultados: Coloración verde (amarillenta) del medio con precipitado o

material flotante: presencia de coliformes totales. Fluorescencia a la luz UV: presencia de coliformes fecales

(E.coli).6. Reportar como presencia o Ausencia de coliformes totales o E.coli /

100mlde agua.

5. INVESTIGACIÓN

1. Fundamento de la prueba de presencia-Ausencia.

6. BIBLIOGRAFÍA




70




GUÍA Nº 19: PRUEBA DEL TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DEMETILENO (T.R.A.M.)

1. INTRODUCCIÓN

Cuando se agrega una pequeña cantidad de azul de metileno a la leche , se lemezcla e incuba a 37ªC, sobreviene una decoloración debida al metabolismobacteriano, es rapidez de decoloración es directamente proporcional al númerode gérmenes presentes (Escobar, 1994, p 289).

La mayoría de microorganismos son capaces un su multiplicación de modificarel potencial de oxido-reducción de la leche, razón suficiente para transformar elazul metileno en un compuesto incoloro (Escobar, 1994, p 289).

2. OBJETIVOS

1. Realizar la prueba de tiempo de reducción del azul de metileno a muestrasde leche cruda, pasteurizada o hervida de diferente procedencia.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Azul de metileno (0.5%) Homogenizador

Baño serológicoPipetas 1 y 10mLAsa bacteriológicaGradillaTubos de ensayo


4. PROCEDIMIENTO

1. Agitar muy bien la muestra de leche2. Depositar en un tubo tapa rosca 10 ml de la muestra de leche.3. Adicionar 1ml de la solución de azul de metileno 0.5%.4. Tapar el tubo y mezclar.5. Incubar en el baño serológico a 37ªC y observar la muestra cada 30

minutos, agitando el contenido en cada lectura.6. Anotar el tiempo de decoloración del azul de metileno.

71

5. INVESTIGACIÓN

1. La relación existente entre el tiempo de reducción del azul de metileno, lacalidad de la leche y la carga bacteriana.

2. Factores que influyen en la reducción del azul de metileno.

6. BIBLIOGRAFÍA




72




GUÍA Nº 20: MICROBIOLOGÍA DE LECHE Y DERIVADOS

1. INTRODUCCIÓNLa leche es el producto de secreción de origen animal y sus cualidadessanitarias están influenciadas por muchos factores que intervienen en su cursode producción, elaboración y entrega al consumidor. Las característicasnutritivas de ésta y de sus productos los convierte en alimentos deseables alconsumidor, además de que estos mismos valores nutritivos facilitan laproliferación de muchos microorganismos, los cuales pueden ocasionarcambios indeseables en el producto.

Los microorganismos y los subproductos son indeseables en la leche yderivados si son capaces de alterar las características organolépticas,produciendo enfermedades o si indican manejo descuidado o antihigiénico delproducto. Las decoloraciones, la viscosidad, la putrefacción, la rancidez, lagaseosidad y muchos otros defectos están causados por diversosmicroorganismos que crecen en productos lácteos.

Los análisis microbiológicos que se le deben practicar a la leche y derivados seencuentran consignados en el Decreto 2437 de agosto 30 de 1983 emanadodel Ministerio de Salud, los cuales abarcan los siguientes:

LECHE HiGIENIZADAS O PASTEURIZADA: Recuento de microorganismosmesófilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales y Fecales.

LECHE EN POLVO: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios yfacultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureuscoagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Bacillus cereus,Salmonella y determinación de Esporas de Clostridium sulfito reductor.

LECHE ULTRAPASTEURIZADA: Recuento de microorganismos mesófilosaerobios y anaerobios, Coliformes Totales y Fecales. (Decreto 476/98).

YOGURT O KUMIS: Coliformes Totales, Fecales, recuento de mohos ylevaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89).

HELADOS: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasapositiva y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89).

CREMA DE LECHE PASTEURIZADA: Coliformes Totales, Fecales, recuentode mohos y levaduras, Staphylococcus aureus coagulasa positiva ySalmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89).

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AREQUIPE: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasapositiva, recuento de mohos y levaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89,11961/89).

QUESO FRESCO: Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus coagulasapositiva, recuento de mohos y levaduras y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86,1804/89, 11961/89).

A las leches crudas o pasteurizadas se les puede realizar la prueba de tiempode reducción del azul de metileno con el fin de determinar de una forma rápidasu calidad y conocer de una manera aproximada su carga bacteriana.

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, colifomes totales y fecales a partir de leche hervida.

2. Determinar coniformes fecales, Recuento de mohos y levaduras y Recuentode Staphylococcus coagulasa positiva a partir de queso fresco.

3. Realizar recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables, coniformestotales y fecales, recuento de mohos y levaduras y de Staphylococcuscoagulasa positiva a partir de arequipe.

4. Realizar pruebas microbiológicas al yogurt y suero costeño elaborados en lagranja de Berástegui.

5. Realizar la prueba del tiempo de reducción del azul de metileno a leches dediferente calidad y procedencia.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Bilis verde brillante lactosacon durham


A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaAgua peptona 0.1% Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua triptona Griess IncubadoraAgar Baird –Parker Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Hecktoen KOH 40% Asa bacteriológicaAgar BPLS Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoCaldo tetrationato de sodio Peroxido hidrogeno 3% GradillaCaldo selenite- cistina Azul de metileno (0.5%) Tubos de ensayoCaldo nitrato Cajas de petriCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar plate countAgar Ogy* Algodón y alcohol al 70% 74

4. PROCEDIMIENTO

De acuerdo al producto a analizar.

5. INVESTIGACIÓN

1. Consecuencias del crecimiento de hongos en productos lácteosfermentados

6. BIBLIOGRAFÍA






Grupo 1: 200 mL de leche hervida.Grupo 2: 200 g de queso fresco.Grupo 3: 200 mL de suero costeño.Grupo 4: 200 mL de arequipe.Grupo 5: 200 g de yogurt.

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GUÍA Nº 21: MICROBIOLOGÍA DE CARNICOS

1. INTRODUCCIÓN

La carne es, tanto por su valor nutritivo como su valor sensorial, uno de losalimentos más importantes para el hombre. Es el alimento básico para cubrirlas necesidades de proteínas de alta calidad.

La carne como material biológico, es una materia prima muy delicada. Lacalidad de los productos obtenidos de ella depende tanto de los animales deabasto como del proceso de la materia prima a partir de éstos, así como de suprocesado, y distribución hasta el consumidor. Además, la tecnología tiene quetener en cuenta las características biológicas y los cambios que acontecen enésta durante su obtención y procesado así como las exigencias higiénicas paraun aprovechamiento óptimo de la carne.

Tras la producción de carne, la obtención de ésta y su procesado tienentambién una gran importancia económica. Además de una óptima obtención yprocesado de la carne exigen un alto estándar higiénico, para poder ofrecer alconsumidor carne y productos cárnicos que se pongan en riesgo sanitariomínimo, por ello la higiene, tiene que estar completamente integrada en lamoderna tecnología de los alimentos.

Los análisis microbiológicos practicados a los productos cárnicos procesadossegún el Decreto 2162 /83 y el 2131/97 son los siguientes:

Cárnicos cocidos: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP decoliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva,Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigación deSalmonella e investigación de Listeria monocytogenes.

Cárnicos crudos madurados o ahumados: NMP de coliformes totales yfecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporasClostridium sulfito reductor, investigación de Salmonella e investigación deListeria monocytogenes.

Cárnicos crudos: NMP de coliformes fecales, recuento de estafiloccoscoagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor,investigación de Salmonella.

2. OBJETIVOS1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos

viables, Staphylococcus coagulasa positiva, coniformes totales y fecales apartir de productos cárnicos.

76

2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productoscárnicos.

3. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfitoreductor a partir de productos cárnicos.

3. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaA. leche Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua peptona 0.1% Griess IncubadoraAgua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Baird –Parker KOH 40% Asa bacteriológicaAgar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoAgar BPLS Peroxido hidrogeno 3% GradillaCaldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayoCaldo selenite- cistina Cajas de petriCaldo nitratoCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar plate countAgar SPSCaldo tioglicolatoAgar gelatina* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO


5. INVESTIGACIÓN

1. Importancia de la investigación de Listeria monocytogenes en productoscárnicos.

6. BIBLIOGRAFÍA


2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis

77





Grupo 1: Cárnicos crudos: 200 g de Chorizo o carne frescaGrupo 2: Cárnicos crudos: 200 g de Hamburguesa.Grupo 3: Cárnicos Escaldados: 200 g de Salchicha.Grupo 4: Cárnicos Ahumados: 200 g de SalchichónGrupo 5: Cárnicos Cocidos: 200 g de Morcilla ó butifarra

78




GUÍA Nº 22: MICROBIOLOGÍA DE OVOPRODUCTOS

1. INTRODUCCIÓN

Los huevos tienen una vida muy corta, puesto que tienden a descomponerserápidamente o a ser alimento de numerosos microorganismos, entre ellos laSalmonella.

Con el fin de prolongar la conservación de los huevos evitando a la vez sucont6aminación microbiana, se someten a diversos procesos industriales, conlo que se convierten en ovoproductos.

Los ovoproductos se pueden obtener a partir de huevos sin cáscara; Estosovoproductos tienen que ser pasteurizados a una temperatura menor de 65ªCdurante un tiempo menor de 4 minutos.

Los análisis microbiológicos que se le realizan a lo derivados del huevo son lossiguientes:

Mayonesa: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformestotales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuentode Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras e investigación deSalmonella. (Resolución 17882/85).

Pastas alimenticias al huevo: Mesófilos aerobios facultativos viables,NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasapositiva, Recuento de Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras,recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor e investigación deSalmonella. (Resolución 4393/91)

Sabajón: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformestotales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, recuentode mohos y levaduras e investigación de Salmonella. (Invima)

2. OBJETIVOS

1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, Staphylococcus coagulasa positiva, mohos y levaduras, coliformestotales y fecales a partir de ovoproductos.

2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir deovoproductos.

3. Realizar recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos.

79

3. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaA. leche Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua peptona 0.1% Griess IncubadoraAgua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Baird –Parker KOH 40% Asa bacteriológicaAgar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoAgar BPLS Peroxido hidrogeno 3% GradillaCaldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayoCaldo selenite- cistina Cajas de petriCaldo nitratoCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar plate countAgar SPSCaldo tioglicolatoAgar gelatinaAgar Cereus según MosselAgar almidónCaldo MR-Glucosa (5%)Caldo MR-Xilosa (5%)Caldo MR-Arabinosa (5%)Agar SIM* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO


5. INVESTIGACIÓN

1. Cuáles son los riesgos microbiológicos por el consumo de las aves y losderivados del huevo.

6. BIBLIOGRAFÍA


2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis

80





Grupo 1y 2: MayonesaGrupo 3 y 4: Pastas alimenticias al huevoGrupo 5: Sabajón

81




GUÍA Nº 23: MICROBIOLOGÍA DE PESCADOS Y MARISCOS

1. INTRODUCCIÓN

Los productos como pescados y mariscos contienen gran cantidad desustancias nutritivas, en las cuales priman las proteínas y son muy escasos loscarbohidratos razón por la cual es muy fácil que las bacterias procedan adescomponer las sustancias nitrogenadas de este produciendo colores,sabores y olores desagradables, haciendo al producto inconsumible.

Según las normas nacionales (Invima) a los pescados y mariscos se le realizanlas siguientes determinaciones microbiológicas:

Pescado fresco y congelado, incluido el congelado en el mar, bloques depescado picado o no y moluscos antes del consumo (peligrosidadreducida): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium.

Pescado de agua dulce (peligrosidad reducida): Recuento de mesófilos(para determinar vida útil), coliformes fecales, Staphylococcus aureus,Salmonella y Vibrium.

Productos empanados, precocidos incluyendo porciones “dedos” ypasteles de pescado, normalmentese cocinan antes del consumo(peligrosidad escasa): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus,Salmonella y Vibrium.

Gambas, langostinos, mariscos congelados crudos, normalmente seconsumen tras la descongelación, pero pueden consumirse tras unademora impredecible (peligrosidad escasa): Coliformes fecales,Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium.

2. OBJETIVOS

1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, Staphylococcus coagulasa positiva, coliformes fecales a partir depescados y mariscos.

2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella y Vibrium a partir depescados y mariscos.

3. Conocer las normas del comercio internacional que existen para productosmarinos.

82

3. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaAgua peptona 0.1% Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua triptona Griess IncubadoraAgar Baird –Parker Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Hecktoen KOH 40% Asa bacteriológicaAgar BPLS Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoCaldo tetrationato de sodio Oxidasa GradillaCaldo selenite- cistina Tubos de ensayoCaldo nitrato Cajas de petriCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar Plate countAgar TCBSCaldo soya tripticasa* Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

De acuerdo al producto a analizar

5. INVESTIGACIÓN

1. ¿Cuales son las principales enfermedades transmitidas por alimentos quese pueden contraer por el consumo de productos marinos crudoscontaminados?

6. BIBLIOGRAFÍA




83



Grupo 1: Pescados de agua dulce = 200 gGrupo 2: Pescado de agua salada = 200 gGrupo 3: productos empanados, precocidos (dedos, pasteles) = 200 gGrupo 4: Mariscos (camarón, langostas) = 200 gGrupo 5: Moluscos (ostras, mejillones, caracol): 200 g

84




GUÍA Nº 24: MICROBIOLOGÍA DE FRUTAS Y HORTALIZAS

1. INTRODUCCIÓN

Las frutas son alimentos muy saludables ya que poseen generalmente muypoca grasa y muchas vitaminas y fibra, lo cual las hace indispensable en ladieta, supliendo estas, los requerimientos que otros alimentos no puedenproporcionar, haciendo parte de una dieta integral y equilibrada.

Contrario de lo que sucede en la mayoría de los alimentos, las frutas continúancon su proceso de respiración después de la recolección, generando esto unaserie de "alteraciones", que en muchos casos vienen precedidas de una malarecolección, clasificación y/o almacenamiento, reflejándose esto en eldesarrollo de podredumbres, hecho que no favorece la comercialización, laeconomía y la calidad del producto.

Por otra parte los cultivos frutales están a la intemperie, lo cual los pone encontacto con una gran cantidad de factores (agua de riego, polvo, insectos,pájaros, etc.) que son de vital importancia al momento de determinar la cargamicrobiana de las frutas.

Según el Invima a las frutas y derivados se les realizan las siguientesdeterminaciones microbiológicas:

Pulpas de frutas congeladas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuentode mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos ylevaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor.

Pulpas de frutas pasteurizadas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuentode mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos ylevaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor.

Pulpas de frutas ultrapasteurizadas (Resolución 7992 de junio 21-91):Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento demohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor.

Pulpas de frutas concentradas con dos o más frutas (Resolución 7992 dejunio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales,recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor.

Pulpas de frutas azucaradas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuentode mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos ylevaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor.

85

Frutas en almíbar (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilosaerobios, oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras yesporas de Clostridium sulfito reductor.

Mermelada de frutas (Resolución 15789/84): Recuento de mesófilosaerobios, oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras yesporas de Clostridium sulfito reductor.

Jalea de frutas (Resolución 15789/84): Recuento de mesófilos aerobios,oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de

Clostridium sulfito reductor.

2. OBJETIVOS

1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, oniformes totales y fecales a partir de frutas.

2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfitoreductor a partir de frutas.

3. Realizar recuento de mohos y levaduras a partir de pulpas de frutas.

3. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaA. leche Peroxido hidrogeno 3% Cuchillos-cucharasAgua peptona 0.1% IncubadoraAgua triptona Pipetas 1 y 10mLAgar ogy Asa bacteriológicaAgar plate count Bolsas de polipropilenoAgar SPS GradillaCaldo tioglicolato Tubos de ensayoAgar gelatina Cajas de petriCaldo nitratoAgar kligler

Algodón y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO


5. INVESTIGACIÓN

1. ¿Por qué en las frutas y derivados no se investigan estafilococossalmoneras?

86

¿Cuáles son los patógenos de importancia en las frutas y derivados?

6. BIBLIOGRAFÍA



3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Aálisi Microbiológicode Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá,1998.



Grupo 1: Pulpa de fruta congelada: 200 g.Grupo 2: Pulpa de fruta azucarada: 200 g.Grupo 3: Néctar de frutas: 200.Grupo 4: Mermelada: 200 g.Grupo 5: Frutas en almíbar: 200 g.

87




GUÍA Nº 25: MICROBIOLOGÍA DE CEREALES Y PANIFICACIÓN

1. INTRODUCCIÓN

Los cereales son las semillas de ciertas gramíneas y en conjunto constituyen elproducto alimenticio más importante del mundo. Cocinados o molidos ytransformados en harinas, aceites y otras sustancias, son excelente fuente deenergía para el hombre y el ganado. La cerveza y otras bebidas alcohólicas seelaboran con cereales fermentados.

Denominación que engloba varias especies de la familia de las Gramíneascultivadas por sus semillas, que son importantes productos alimenticios. Elnombre deriva de Ceres, diosa romana de la agricultura. Aunque los cerealesno pertenecen a ninguna familia específica de las gramíneas en sentidoestricto, la elección de algunas especies como fuente de alimento parece haberestado determinada por el mayor tamaño de la semilla o por la facilidad deobtenerla en cantidad suficiente y de liberarla de la cáscara no comestible. Losgranos más cultivados son maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, mijo, avena ycenteno. Todas estas plantas se cultivan desde la antigüedad y tanto su cultivocomo su utilización han constituido un indicador de crecimiento económico, enespecial en los países más pobres. Proceden de Europa, Asia y África, salvo elmaíz, que es de origen americano.

Según el Invima, a los cereales y productos de panificación se le realizan lassiguientes determinaciones microbiológicas, dependiendo de la clase

Galletas y Colaciones: Resolución No. 11488 de agosto 27-84Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcuscoagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras.

Harina de trigo para panificación: Norma No. 267 del INVIMARecuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcuscoagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Salmonella y Bacilluscereus.

Avena en hojuelas para consumo humano: Norma No. 2159 del INVIMARecuento de mesófilos, oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras,Salmonella.

Harina de avena para consumo humano: Norma No. 2160 del INVIMARecuento de mesófilos, oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras,Salmonella.

88

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de microorganismos Mesófilos aerobios, oniformestotales y fecales a partir de cereales y productos de panificación.

2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productos decereales y productos de panificación.

3. Realizar recuento de hongos y levaduras a partir de cereales y productos depanificación.

3. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaAgar plate count Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua peptona 0.1% Griess IncubadoraAgua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Baird –Parker KOH 40% Asa bacteriológicaAgar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoAgar BPLS GradillaCaldo tetrationato de sodio Tubos de ensayoCaldo selenite- cistina Cajas de petriCaldo nitratoCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar ogyAgar B.cereus-MosselAgar lecheAgar almidón


4. PROCEDIMIENTO


5. INVESTIGACIÓN

¿Cuáles son los factores que permiten la invasión y el crecimiento delos microorganismos en los granos de cereales?

89

6. BIBLIOGRAFÍA






Grupo 1: Galleta: 200 g.Grupo 2: Colación: 200 g.Grupo 3: Harina: 200 g.Grupo 4: Pan: 200 g.Grupo 5: Bizcocho: 200 g.

90




GUÍA Nº 26: MICROBIOLOGÍA DE BEBIDAS

2. INTRODUCCIÓN

Las bebidas refrescantes constituyen un conjunto muy heterogéneo en el quese distinguen dos tipos de productos cuyas características microbiológicas sonmuy diferentes, las cuales son: las bebidas a base de extractos naturales defrutas o de otros vegetales y los zumos de frutas o bebidas a base de zumos defrutas.

Otro tipo de bebidas son las alcohólicas, las cuales se producen a partir dediversas materias primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas yproductos azucarados; Entre ellas se encuentran bebidas no destiladas comola cerveza y el vino, y destiladas como el whisky y el ron.

Un último tipo de bebidas consumidas por sus características refrescantes yestimulantes son las aromáticas entre las cabe mencionar el café, el té y lasobtenidas a partir del cacao.

Según el Invima los análisis microbiológicos que se le realizan a las bebidasson los siguientes:

Cerveza: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, recuentode esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos ylevaduras.

Gaseosas: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, recuentode esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos ylevaduras.

Refresco líquido en bolsa: Recuento de mesófilos, oniformes totales yfecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento demohos y levaduras.

Café: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales,Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras.

Aromática: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales,Staphyfilococcus coagulasa positiva y recuento de mohos y levaduras.

3. OBJETIVOS

1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativosviables, Staphylococcus coagulasa positiva, oniformes totales y fecales apartir de bebidas.

2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfitoreductor a partir de bebidas.

91

4. MATERIALES



A. EMB Reactivo de Kovacs BalanzaA. leche Plasma fresco Cuchillos-cucharasAgua peptona 0.1% Griess IncubadoraAgua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mLAgar Baird –Parker KOH 40% Asa bacteriológicaAgar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoAgar BPLS Peroxido hidrogeno 3% GradillaCaldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayoCaldo selenite- cistina Cajas de petriCaldo nitratoCaldo MR-VPAgar citratoAgar ureaAgar kliglerAgar LiaInfusión cerebro corazónAgar plate countAgar SPSCaldo tioglicolatoAgar gelatina


5. PROCEDIMIENTO


6. INVESTIGACIÓN

¿Cuáles son las barreras naturales al crecimiento de losmicroorganismos que presentan las bebidas?

7. BIBLIOGRAFÍA






Grupo 1: CervezaGrupo 2: AromáticaGrupo 3: CaféGrupo 4: Refresco líquido en bolsaGrupo 5: Jugo

93UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA



GUÍA Nº 27: MICROBIOLOGÍA DE AGUAS

1. INTRODUCCIÓN

Según el Invima los análisis microbiológicos que se le realizan a las bebidasson los siguientes:

Agua potable: oniformes totales y fecales. (Decreto 475/98). Agua potable envasada: Recuento de mesófilos aerobios y facultativos

viables, oniformes totales y fecales y Pseudomona aeruginosa.(Resolución 12186/91).

2. OBJETIVOS

1. Realizar NMP de oniformes totales y fecales a partir de agua potable.2. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos

viables, oniformes totales y fecales a partir de agua envasada.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Caldo LMX / Fluorocult /Readicult / Collilert

Coloración de gram Bolsas de polipropileno

Caldo casoy dobleconcentración

Reactivo de Kovacs Incubadora

Caldo casoy concentraciónsimple

Oxidasa Lámpara luz UV

Agar cetrimide Solución amortiguadorafosfato pH 7.2

Asa bacteriológica

GradillaTubos de ensayoCajas de petriPipetas 1 y 10mL


4. PROCEDIMIENTO


5. INVESTIGACIÓN94

1. ¿Cuáles son los principales riesgos por el consumo de agua que no cumplecon los criterios de potabilidad?

6. BIBLIOGRAFÍA




95

ANEXO A: División laboratorio de alimentos y bebidas alcohólicas-Laboratoriode Microbiología de Alimentos INVIMA.

96

ANEXO B: Normatividad relacionada con Alimentos

A continuación encontrará una recopilación de normas relacionadas conproductos alimenticios.

CLASEDE

NORMA

NÚMERO AÑO DEADOPCIÓN

EXPEDIDAPOR

TEMA PRINCIPAL

Decreto2278Ver » 1982

Ministerio deSalud

Reglamenta el sacrificio deanimales de abasto públicopara consumo humano,procesamiento, transporte ycomercialización de su carne.


Ministerio deSalud

Se establecen las normas deidentidad y pureza de losendulcolorantes utilizados enlos productos alimenticios.

Decreto2162Ver »

1983Ministerio deSalud

Regula la producción,procesamiento, transporte yexpendio de los productoscárnicos procesados.


Ministerio deSalud

Regula la producción,procesamiento, transporte ycomercialización de la leche.

Decreto561Ver »


Regula la captura,procesamiento, transporte yexpendio de los productos dela pesca.


Minsalud yMintransporte

Reglamenta la sanidadportuaria y vigilanciaepidemiológica en naves yvehículos terrestres.


Ministerio deSalud

Subrogase el Capítulo 1 delTítulo 1 del Decreto No 2278de agosto 2 de 1982


Ministerio deSalud

Reglamenta lacomercialización y publicidadde los alimentos de fórmula,para lactantes ycomplementarios de la lechematerna.


Ministerio deSalud

Por la cual se dictan normasreferentes a la composición,requisitos y comercializaciónde las Bebidas HidratantesEnergéticas para Deportistas.


Ministerio deSalud

Regula las condicionessanitarias de producción,empaque y comercialización,al control de la sal paraconsumo humano.


Ministerio deSalud

Reglamenta la fortificación dela harina de trigo y seestablecen las condiciones decomercialización, rotulado,vigilancia y control.


Ministerio deSalud

Disposiciones sobreproductos cárnicosprocesados.

Decreto3075Ver »


Regula las actividades defabricación, procesamiento,preparación, envase,almacenamiento, transporte,distribución ycomercialización de alimentosen el territorio nacional.


Minsalud yMinagricultura

Modifica algunos artículos delDecreto 2437/83 y deroga elDecreto 2473/86 sobreleches.

Decreto698Ver »

1998Minsalud yMinagricultura

Modifica los artículos 23 y 24del decreto 547 de 1998sobre la sal para consumohumano.


Minsalud yMindesarrollo

Crea el Comité Nacional delCODEX alimentarios y se fijansus funciones.

Decreto612Ver »


Reglamenta la expedición deregistros sanitariosautomáticos para alimentos,cosméticos y productosvarios.


Ministerio deSalud

Por el cual se promueve laaplicación del sistema deanálisis de peligros y puntosde control crítico HACCP enlas fábricas de alimentos y sereglamenta el proceso decertificación.


Ministerio deSalud

Adiciona literal al artículo 50del Decreto 3075 de 1997.

Decreto 1175Ver »

2003 Ministerio dela ProtecciónSocial

Por el cual se modificaparcialmente el Decreto 3075 de1997, especialmente lo relativoal artículo 65 - expedición delcertificado de inspecciónsanitaria para exportación

Resolución 126Ver »

1964 Ministerio deSalud

Regula la elaboración ycontrol de grasas y aceitescomestibles para consumohumano.



Norma sobre grasas y aceitescomestibles.



Normas sobre alimentosprocesados de base vegetalpara uso infantil

Resolución6328Ver »


Por la cual se crea un comitéprovisional y un comitéasesor para el estudio yaprobación de la publicidad opropaganda de los alimentosy bebidas alcohólicas.

Resolución11488Ver » 1984

Ministerio deSalud

Norma con respecto alprocesamiento, composición,requisitos y comercializaciónde los alimentos infantiles, delos alimentos o bebidasenriquecidos y de losalimentos o bebidas de usodietético.



Se reglamenta lascaracterísticas organolépticasfísico químicas ymicrobiológicas de lasmermeladas y jaleas defrutas.


Ministerio deSalud

Se reglamenta lascaracterísticas organolépticasfísico químicas ymicrobiológicas de losderivados del tomate.



Recomendaciones diarias deconsumo de calorías ynutrientes.



Lista de colorantes permitidosen la Industria alimentaria



Modifica la resolución 10593de 1985.



Reglamenta Laboratorios decontrol de calidad dealimentos.



Regula los alimentosrelacionados con lamayonesa, su elaboración,conservación ycomercialización.



Regula lo concerniente a lamostaza, su elaboración,conservación ycomercialización.


Ministerio deSalud

Regula lo concerniente aprocesamiento, composición,requisitos, transporte ycomercialización de losderivados lácteos.



Identificación a los empaquesy envases de la sal paraconsumo humano.



Por la cual se modifica laresolucion la Resolución 2310de 1986.



Modifica parcialmente laresolución número 2310 del24 de febrero de 1986.



Por la cual se declaran aptoslos equinos como animales deabasto público en el territorionacional.



Por la cual se modifica laResolución 11488 de 1984 enen lo que se refiere alaspartame comoendulcolorante artificial.



Regula lo concerniente a losantioxidantes que se puedenutilizar en los alimentos.



Regula lo referente a losconservantes que se puedenutilizar en alimentos.



Regula lo relacionado a losacidulantes, alcalinizantes,reguladores de pH de laacidez utilizados en losalimentos.



Por la cual se definen lascaracterístiscas de las especies ocondimentos vegetales y sedictan normas sanitarias y decalidad de estos productos y desus mezclas.



Regula la fabricación,empaque y comercializaciónde pastas alimenticias.



Por la cual se reglamentaparcialmente lo relacionado conla elaboración, conservación ycomercialización de jugos,concentrados, néctares, pulpas,pulpas azucaradas y refrescos defrutas.



Por la cual se fijan lascondiciones para los procesosde obtención, envasado ycomercialización de aguapotable tratada, con destinoal consumo humano.


1992Minsalud -Mincomex

Por la cual se establece unadelegación de los vistosbuenos en los registros deimportación a los productosalimenticios elaborados oprocesados en el exterior.



Regula condiciones sanitariasde las ventas de alimento enla vía pública.



Establece las medidassanitarias sobre producción,elaboración ycomercialización de la panela.

Resolucion 19304Ver »


Elaboracion y control degrasas y aceites comestiblespara el consumo humano



Modifica la resolución 10593de 1985 en el sentido dehacer obligatorio ladeclaración expresa detartrazina.


1998 INVIMA Por la cual se adopta elformulario único parasolicitud, modificación yrenovación del RegistroSanitario para los productosalimenticios y se establece lanomenclatura para laexpedición de RegistroSanitario de los alimentos defabricación nacional y de losimportados.



Por la cual se adopta elSistema de Análisis deRiesgos y Puntos Críticos decontrol HACCP en losproductos pesqueros yacuícolas.



Define los exámenes delaboratorio en alimentos ybebidas alcohólicas en saludpública, departamentales ydistritales, los laboratoriosclínicos y los laboratorios decitohistopatología.



Por la cual se oficializa lanorma técnica colombianaNTC 512-1 relacionada con elrotulado de alimentos.


2000 INVIMA Mediante la cual se deroganlas Resoluciones 238148/99 y248903/99. RegistrosSanitario de Panela



Incentivos promocionales enalimentos.



Por la cual se establecen losrequisitos para lacomercialización de las avesbeneficiadas enteras,despresadas y/o deshuesadasque se someten a la técnicade marinado.


Ministerio deSalud

Prohibir BROMATO DEPOTASIO para usoalimentario o en tratamientode la cebada para BebidasAlcohólicas

Resolución1987Ver » 2002 ICA

Por la cual se modifica laResolución 1746 del 23 dejulio de 2002


2002 ICA Por la cual se prorroga lasuspensión de la expediciónde Documentos Zoosanitariospara la Importación debovinos, porcinos, demásespecies susceptibles y susproductos de riesgo desdeEcuador


2002 INVIMA Por la cual se establecen losrequisitos sanitarios para laaprobación de las licencias yregistros de importación delazúcar de caña o de remolachaazucarera en estado sólido.

Resolución2002001697Ver » 2002 INVIMA

Establece requisitos paraaprobación de Registros deImportación a la leche en polvo yderivados lácteos en polvo


2002 INVIMA

Se adoptan unos conceptos yrecomendaciones de la SalaEspecializada de Alimentos yBebidas Alcohólicas


2002 INVIMA Se adoptan unos conceptos yrecomendaciones de la SalaEspecializada de Alimentos yBebidas Alcohólicas

Acuerdo Ver » 2003 Acciones conjuntas paracontrolar la fabricación ilegalde la panela

Circular DG-0100-196Ver »

2002 INVIMA Aplicación y cumplimiento dela Resolución 0402 de 2002.Pollo Marinado

NormaTécnica

NTC 512-1Ver »

CuartaActualización

Industrias AlimentariasRotulado

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