GUILHERME OSCAR HINING - biblioteca.unilasalle.edu.br · EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

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GUILHERME OSCAR HINING

EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATO GRAFIA EM

CAMADA DELGADA

CANOAS, 2011

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EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATO GRAFIA EM

CAMADA DELGADA

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Química.

Orientação: Profª. Drª. Marisa Tsao

CANOAS, 2011

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EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Aprovado pelo avaliador em 15 de dezembro de 2011.

AVALIADOR:

_____________________________

Profª. Drª. Marisa Tsao

Unilasalle

Trabalho de Conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário La Salle – Unilasalle

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RESUMO

As micotoxinas são metabólitos secundários altamente tóxicos produzidos por

algumas cepas de fungos. Dentre as toxinas mais perigosas, encontram-se as

aflatoxinas, que representam grande risco a saúde humana e animal sendo

potencialmente carcinogênicas.

A contaminação por aflatoxinas pode representar prejuízos econômicos e sérios

danos à saúde, sendo pertinente, medidas de controles sistemáticos desta toxina

por meio de monitoramento e a fiscalização dos alimentos.

A química analítica mostra-se aliada neste contexto. Através dos ensaios analíticos é

possível a extração da toxina dos alimentos e a sua posterior quantificação pela

técnica da cromatografia em camada delgada (CCD). Embora existam outras

técnicas para quantificação desta toxina, a CCD é uma técnica bastante usada,

principalmente, em países em desenvolvimento por não requisitar grandes aparatos

tecnológicos e apresentar resultados analíticos satisfatórios e que foi objeto deste

trabalho de conclusão de curso.

Foram analisadas 48 amostras, entre elas, amendoim e derivados de milho, que

pertencem ao grupo de alimentos de alta suscetibilidade de contaminação por

aflatoxinas. Os resultados das análises mostraram que as aflatoxinas continuam a

contaminar alimentos para consumo humano, inclusive, com níveis de contaminação

superior ao limite máximo permitido pela legislação do país.

Palavras-chave: Aflatoxinas. Ensaios analíticos. Cromatografia em camada delgada.

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ABSTRACT

Mycotoxins are highly toxic secondary metabolites produced by some strains of fungi.

Among the most dangerous toxins, are the aflatoxins, which represent a great risk to

human and animal health being potentially carcinogenic.

The aflatoxin contamination may represent economic losses and serious damage to

health, and relevant control measures of this toxin through systematic monitoring and

surveillance of food.

The analytical chemistry appears to be allied in this context. Through the analytical

tests it is possible to extract the toxin from food and their subsequent quantification

by the technique of thin layer chromatography (TLC). Although there are other

techniques for quantification of this toxin, the TLC is a technique widely used,

especially in developing countries for not ordering large technological devices and

present analytical results were satisfactory and that the subject of this course

conclusion.

We analyzed 48 samples, including, peanuts and corn derivatives, which belong to

the high susceptibility of food contamination by aflatoxins. The test results showed

that aflatoxins continue to contaminate food for human consumption, even with

contamination levels exceed the maximum allowed by law in the country.

Key-words: Aflatoxins. Analytical tests. Thin layer chromatography.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura química das aflatoxinas ............................................................ 16

Figura 2 – Núcleo furano e cumarina ........................................................................ 17

Figura 3 – Biotransformação da aflatoxina B1. .......................................................... 29

Figura 4 – Aflatoxina B2 ............................................................................................. 30

Figura 5 – Carta controle ........................................................................................... 39

Figura 6 – Etapas da extração das aflatoxinas.......................................................... 44

Figura 7 – Delimitação da cromatofolha .................................................................... 47

Figura 8 – Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará

sob luz UV (comprimento de onda de 366 nm) ......................................... 48

Figura 9 – Delimitação da placa de camada delgada bidimencional ......................... 50

Figura 10 – Distribuição das regiões de amostragem ............................................... 53

Figura 11 – Distribuição das amostras analizadas .................................................... 54

Figura 12 – Percentual de amostras contaminadas .................................................. 55

Figura 13 – Grupos de aflatoxinas identificados nas amostras contaminadas .......... 56

Figura 14 – Panorama geral do estudo realizado ...................................................... 57

Figura 15 – Relação entre origem das amostras e contaminação ............................ 58

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina ................. 21

Quadro 2 – Absorbância das soluções ...................................................................... 37

Quadro 3 – Valores de absortividade molar (ε) das aflatoxinas em acetonitrila

em 350 nm ............................................................................................. 38

Quadro 4 – Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas em alguns alimentos ..... 40

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Principais fungos e suas toxinas. ............................................................ 19

Tabela 2 – Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água ................ 24

Tabela 3 – Atividade de água para algumas espécies fúngicas ................................ 25

Tabela 4 – Limite mínimo da umidade relativa do ar ................................................. 25

Tabela 5 – Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas .................. 26

Tabela 6 – Toxicidade de algumas aflatoxinas.......................................................... 31

Tabela 7 – Distribuição das amostras ....................................................................... 52

Tabela 8 – Amostras de outros estados .................................................................... 53

Tabela 9 – Tipos de amostras e sua contaminação .................................................. 54

Tabela 10 – Aflatoxinas quantificadas nas amostras contaminadas ........................ 55

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Afla. Aflatoxina

AFB1 ou B1 Aflatoxina B1

AFB2 ou B2 Aflatoxina B2

AFG1 ou G1 Aflatoxina G1

AFG2 ou G2 Aflatoxina G2

AM Amostra

ANVISA Agência Nacional Vigilância Sanitária

AOAC Association of Official Analytical Chemists

C Concentração (mol/L)

CCD (TLC) Cromatografia em camada delgada

DNA Ácido desoxirribonucléico

EP Ensaio de proficiência

FC Fator de correção

FEPPS Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde

FR Formulário de registro

HPLC High performance liquid chromatography

HMF High moisture food

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia

IPB Instituto de Pesquisas Biológicas

IMF Intermediate moisture food

LACEN Laboratório Central de Saúde Pública

LMF Low moisture food

LD Limite de detecção

LQ Limite de quantificação

LMT Limite máximo tolerado

MM Massa molecular

NBR Norma Brasileira de Regulamentação

P Padrão

PEMQSA Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária dos

Alimentos

RBC Rede Brasileira de Calibrações

RS Rio Grande do Sul

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RF Fator de retenção

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

SVS Secretaria de Vigilância em saúde

TFA Ácido trifluoracético

UV Ultra violeta

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LISTA DE SÍMBOLOS

A Absorbância

aw atividade da água

ε Absortividade molar

Absortividade molar média

cm centímetro

λ comprimento de onda

ºC grau centígrado

kg quilograma

g grama

h hora

min minuto

µg micrograma

mL mililitro

µL microlitro

nm nanômetro

ppb partes por bilhão

T Temperatura

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................... ....................................................... 14

2.1 Contaminação por aflatoxinas .................. ....................................................... 14

2.1.1 Natureza química das aflatoxinas .................................................................... 15

2.2 Fungos ........................................ ....................................................................... 16

2.2.1 Ocorrência e condições de contaminação........................................................ 18

2.2.2 Medidas preventivas ........................................................................................ 21

2.3 Produção e condições para o crescimento de mico toxinas ......................... 21

2.3.1 Substrato .......................................................................................................... 22

2.3.2 Atividade de água (aw) ..................................................................................... 22

2.3.3 Temperatura ..................................................................................................... 24

2.4 Origem da contaminação de alimentos por micotox inas .............................. 25

2.4.1 Descontaminação e inativação de micotoxinas ................................................ 26

2.5 Biotransformação das aflatoxinas ................................................................... 27

2.6 Toxicidade .................................... ...................................................................... 29

2.7 Detecção das aflatoxinas ...................... ............................................................ 30

2.8 Controle de qualidade de ensaios analíticos ... ............................................... 31

2.8.2 Ensaio de proficiência ...................................................................................... 32

2.9 Padrões de aflatoxinas ........................ ............................................................. 33

2.9.1 Cuidados com padrões de aflatoxinas ............................................................. 34

2.9.2 Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões .......... 35

2.10 Legislaçãosobre micotoxinas ........................................................................ 38

2.11 Fiscalização ..................................................................................................... 39

3 PARTE EXPERIMENTAL .............................. ........................................................ 40

3.1 Metodologia analítica ........................................................................................ 40

3.2 Materiais e equipamentos ...................... ........................................................... 40

3.3 Reagentes ..................................... ..................................................................... 41

3.4 Descrição do método ........................................................................................ 42

3.4.1 Amostrageme extração .................................................................................... 44

3.4.2 Purificação ........................................................................................................ 44

3.4.3 Partição líquido-líquido ..................................................................................... 44

3.4.4 Concentração e ressuspensão ......................................................................... 45

3.4.5 Determinação e quantificação das aflatoxinas ................................................. 45

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3.4.6 Confirmação ..................................................................................................... 48

3.4.7 Cálculo ............................................................................................................. 49

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... ................................................... 51

5 CONCLUSÃO ....................................... ................................................................. 58

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 59

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1 INTRODUÇÃO

As aflatoxinas são um grupo de furanocumarinas altamente tóxicas produzidas

por algumas cepas de fungos, principalmente, Aspergillus Flavus e Aspergillus

Parasiticus. Nos anos 80, a Vigilância Sanitária do Distrito Federal detectou a

presença de aflatoxinas em amendoins e derivados destinados ao consumo

humano. Desde então, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através

de programas como, Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária

dos Alimentos (PEMQSA), monitora e avalia a qualidade dos alimentos

comercializados no país no que tange à micotoxinas, especialmente, às aflatoxinas.

A principal proposta deste trabalho é apresentar os níveis de contaminação por

aflatoxinas em produtos de alta suscetibilidade, como amendoim ederivados e

também, derivados de milho, oferecidos ao consumo humano no estado do Rio

Grande do Sul. As amostras foram provenientes, na sua maioria, do PEMQSA e

analisadas entre os meses de agosto e novembro de 2011 no Laboratório de

Micotoxinas vinculado a Seção de Contaminantes pertencente ao Instituto de

Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública - IPB-LACEN/RS,

usando-se a técnica de extração publicada pela Association of Official Analytical

Chemists (AOAC) e Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para quantificação

das amostras.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Contaminação por aflatoxinas

Os primeiros relatos da presença de micotoxinas ocorreram na Europa e na

Ásia provocando epidemias em humanos e animais levando milhares a morte. Na

época, suspeitava-se que a origem destes surtos estavam relacionados à dieta

alimentar

As aflatoxinas foram descobertas em 1960, após mortandade de milhares de

perus jovens ocorrido na Inglaterra, os quais, teriam sido alimentados com ração à

base de amendoim contaminado proveniente do Brasil e da África. “As aves afetadas

morriam geralmente dentro de uma semana, sendo seus sintomas, a perda de

apetite, diminuição da mobilidade, fraqueza das asas, das pernas. A necropsia

sempre revelava lesões necróticas no fígado e congestionamento nos rins.”

(STEVENS et al., 1960 apud MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1).

Segundo a Food Ingredients Brasil (2009) e Jay (2005), a partir da ração que

causou a morte dos animais na época, foram isolados Aspergillus flavus e uma

toxina produzida por esse fungo, a qual foi designada aflatoxina (toxina do

Aspergillus flavus – A-Afla toxina).

Em 1963, pesquisadores separaram, por cromatografia em papel, as

aflatoxinas B e G, assim classificadas por apresentar fluorescência azul (B = blue)

everde (G = green) quando observadas sob luz ultravioleta (366 nm), devido ao anel

furocumarínico. Posteriormente, um grupo de pesquisadores da Inglaterra isolou por

diferenças de mobilidade em cromatografia de camada delgada quatro toxinas:

Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. A partir desta descoberta, as atenções e estudos sobre

micotoxinas vem sendo intensificadas.

Molin e Valentini (1999) relatam sobre a descoberta das fórmulas estruturais

das aflatoxinas B e G, elucidadas em 1963 por Asao et al. (1963) e por Van der

Merwe et al. (1963). A fórmula estrutural da aflatoxina B2 foi determinada

simultaneamente por Chang et al. (1963) nos EUA e por Van Dorp et al. (1963) na

Bélgica e, posteriormente, na Escócia, foi determinada a estrutura química da AFG1

por Cheung e Sim (1964).

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Na Figura 1 abaixo, é representado à estrutura química de cada uma das

quatro principais aflatoxinas: onde AFB1 representa a aflatoxina B1, AFB2 a

aflatoxina B2, AFG1 a aflatoxina G1 e AFG2 representa a aflatoxina G2.

Figura 1– Estrutura química das aflatoxinas

Fonte: Freire et al., 2007.

2.1.1 Natureza química das aflatoxinas

Conforme Araujo (2006) apud kwiatkowski e Alves (2007), as aflatoxinas

pertencem à classe de compostos químicos denominados furanocumarinas.

Possuem um núcleo cumarina associado ao furano e a lactona (Figura 2). As

aflatoxinas do grupo B possuem anel ciclopentona e o grupo G, lactonas

insaturadas, enquanto grupo M são derivados hidroxilados de B1 e B2. As

aflatoxinas são substâncias lipofílicas de baixa massa molecular, onde AFB1, AFB2,

AFG1, AFG2 tem massa molecular de 312, 314, 328, 330 g/mol, respectivamente.

As aflatoxinas são cumarinas altamente substituídas com mais de 18 toxinas

conhecidas. A aflatoxina B1 é produzida por todos os fungos produtores de

aflatoxinas e tem em AFM1 como produto hidroxilado da AFB1. A AFM1 é encontrada

no leite, urina e fezes de animais como um produto metabólico.

16

Figura 2 – Núcleo furano e cumarina

Furano Lactona

(cumarina)

Fonte: Solomons; Fryhle, 2000.

Hoje, sabe-se que das micotoxinas, as aflatoxinas B1, B2, G1, G2 são as mais

importantes. Contaminam facilmente grãos e cereais e são altamente tóxicas e

facilmente entram na cadeia alimentar, seja humana ou animal. “A aflatoxina B1 é o

composto com maior atividade carcinogênica que se conhece, não sendo

desprezível sua atividade mutagênica.” (GOMPERTZ et al., 2002, p. 424).

2.2 Fungos

Os fungos formam filamentos denominados hifas, que em conjunto formam

micélios, os quais, são responsáveis pela fixação dos bolores no substrato e

posterior reprodução. O micélio, também dá aspecto característico às colônias que

forma: “Estas colônias podem ter um aspecto cotonoso, ser secas, úmidas,

compactas, aveludadas, gelatinosas, com variadas colorações.” (FRANCO e

LANDGRAF, 2003, p.3).

Conforme Antón e Lizaso (2001), os fungos que crescem nos alimentos são

conhecidos pelo homem desde a antiguidade. Ele os tem utilizado em seu próprio

beneficio, tanto para melhorar alimentos, como para fins terapêuticos (antibióticos).

“As principais espécies fúngicas produtoras de toxinas pertencem aos gêneros:

Alternaria, Aspergillus, Claviceps, Fusarium, Penicillium, Phitomyces, Myrothecium,

Stachybotrys e Phoma.” (GOMPERTZ et al., 2002, p. 423). Alguns destes gêneros

são toxigênicos, deterioradores de alimentos e produtores de micotoxinas.

Jay (2005) cita que micotoxinas são metabólitos secundários formados durante

a fase exponencial de crescimento dos fungos não tendo significância para o

crescimento ou metabolismo do organismo produtor. No entanto, quando

aminoácidos, acetatos, piruvatos e outros precursores primários são formados em

17

grandes quantidades, a síntese dessas substâncias em micotoxinas pode ser uma

maneira natural dos fungos reduzirem tais precursores. “Elas são substâncias

químicas [...] não são essenciais ao crescimento e ao desenvolvimento dos fungos, o

que significa dizer, que mesmo na ausência destas, há crescimento e

desenvolvimento fúngico.” (MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1).

Conforme Sabino et al. (2008), a produção de micotoxinas pelos fungos

também necessita que condições ambientais como, temperatura e umidade sejam

favoráveis, além disso, necessitam que características bioquímicas nos substratos

propiciem a sua produção e crescimento.

Freire et al. (2007) cita que as micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar

humana e animal por meio de contaminação direta ou indireta. A contaminação

indireta de alimentos e rações ocorre pela contaminação prévia de fungo toxigênico,

bem como, a produção de micotoxinas, e mesmo que o fungo tenha sido eliminado

durante o processamento, essas toxinas ainda permanecerão no alimento. A

contaminação direta ocorre quando um fungo toxigênico coloniza alimentos com

posterior formação de micotoxinas e a ingestão.

“Entre as principais micotoxinas de interesse na área de alimentos citamos:

aflatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumosinas.” (SABINO et

al., 2008, p. 761). A Tabela 1 apresenta as principais toxinas geradas por fungos,

seus substratos predominantes e os efeitos sobre a saúde humana e animal.

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Tabela 1 – Principais fungos e suas toxinas

Principais substratos

Principais fungos produtores

Principal toxina Efeitos

Amendoim, milho. Aspergillus flavus e

Aspergillus parasiticus

Aflatoxina B1 Hepatotóxica, nefrotóxica,

carcinogênica.

Trigo, aveia, cevada, milho e

arroz. Penicillium citrinum Citrinina Nefrotóxica para

suínos

Centeio e grãos em geral.

Claviceps purpúrea Ergotamina Gangrena de extremidades,

convulsões

Milho Fusarium

verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago

Cevada, café, vinho.

Aspergillus ochraceus e Aspergillus carbonarius

Ocratoxina Hepatotóxica, nefrotóxica,

carcinogênica.

Frutas e sucos de frutas

Penicillium expansum e Penicillium

griseofulvum

Patulina Toxicidade vagamente

estabelecida

Milho, cevada,

aveia, trigo, centeio.

Fusarium sp Myrothecium sp Stachybotrys sp Trichothecium sp

Tricotecenos: T2,

neosolaniol, fusanona x, nivalenol,

deoxivalenol.

Hemorragias, vômitos,

dermatites.

Cereais Fusarium

graminearum Zearalenona

Baixa toxicidade; síndrome de

masculinização e feminização em

suínos

Fonte: Food Ingredients Brasil, 2009.

2.2.1 Ocorrência e condições de contaminação

Para Kwiatkowski e Alves (2007) e Molin e Valentini (1999) a infecção fúngica

nas plantas, seu crescimento e a posterior produção de micotoxinas em alimentos

pode ocorrer sob várias condições e, de modo geral, podemos dividir os fungos

19

produtores de micotoxinas em dois grupos principais: os fungos de campo ou pré-

colheita, que são aqueles em que a contaminação inicia-se no plantio e vai até

depois da safra, e fungos de armazenamento, que atacam após a colheita, durante a

silagem.

Conforme Molin e Valentini (1999), os fungos de campo são mais toxigênicos,

pois tem longo período para se desenvolver nas plantas, considerando-se ainda, que

elas ficam sujeitas as intempéries climáticas, como: geadas, granizo, chuva em

excesso ou falta, extremos de temperaturas; condições do solo e relevo, como: falta

de nutrientes, competição com plantas invasoras, ação de roedores e condições de

manejo como: plantio em época errada, atraso na colheita ou fora do tempo. Já os

fungos de armazenamento ou pós-colheita ocorrem, principalmente, devido ao

manejo inadequado durante e após a colheita, com armazenagem e silagens mal

conduzidas, como por exemplo, grãos armazenados com altos teores de umidade,

silos mal vedados, fermentação da silagem, ação de roedores e insetos.

Os fungos têm grande capacidade de adaptação e podem se desenvolver em

quase todas as plantas no campo, tipos de cereais, oleaginosas ou em ingredientes

de ração armazenada para consumo posterior. “Em quase todas as matérias-primas

destinadas a gêneros alimentícios, tais como: arroz, milho, feijão, trigo, cevada, soja,

castanha-do-pará, nozes, amendoim, café, sorgo, [...] já foram detectados um ou

mais tipos de micotoxinas.” (SABINO et al., 2008, p. 761.). No entanto, a presença

de fungos não significa contaminação por micotoxinas. Jay (2005) cita que o

crescimento de fungos produtores de toxinas, podem sob determinadas

circunstâncias, não produzir tais toxinas porque tais toxinas não são essenciais ao

crescimento do fungo.

Os alimentos que apresentam maior risco de contaminação por aflatoxinas são

respectivamente, amendoim e milho, conforme Quadro 1.

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Quadro 1 – Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina

Alimento Fungo Micotoxina Risco de contaminação

Amendoim, amêndoas

Aspergillusflavus Aflatoxina alto

Milho

A. flavus Aflatoxina

Fusarium spp Tricotecenos alto

F. moniliforme Zearalenona

Sorgo

Fusarium spp Tricotecenos

Alternaria spp Alternariol, metil etil

alternariol Ac. Tenuazônico,

alto

A. flavus Aflatoxina

Penicillium spp Ocratoxina, Ac. Ciclopiazônico,

tremorgênio, citrinina

Trigo Alternaria spp Alternariol, metil etil

alternariol Ac. Tenuazônico,

moderado

Fusarium spp Tricotecenos

F. graminearum Deoxinivalenol

Cevada P. verrucosum Ocratoxina

Farinha Penicillium Várias

Cereais matinais à base de milho

Fusarium spp Aspergillus

flavus

Tricotecenos, Fumonisinas Aflatoxinas

Cereais matinais à base de trigo

Fusarium spp Tricotecenos Moderado

Queijo Penicillium Várias

Carnes process.salame

Penicillium Várias

Leite e queijo Resíduos Aflatoxina M

Ovos Resíduos Aflatoxinas, ocratoxinas,

tricotecenos

Maçã Penicillium Patulina

Fonte: Adaptado de Taniwaki et al., 2011.

21

A razão pela qual a ocorrência de aflatoxinas é alta em amendoim não foi

completamente estabelecida. Um dos motivos pode ser atribuído ao fato de que A.

Flavus e A. Parasiticus dominarem na micoflora em solos de plantio de amendoim.

(MACHINSKI JUNIOR, 2011).

2.2.2 Medidas preventivas

A prevenção ao crescimento fúngico e produção de micotoxinas é complexa e

pode envolver inúmeras condições. A redução da atividade de água, secagem

rápida e armazenagem com condições controladas de umidade e temperatura,

remoção de unidades danificadas e grãos contaminados, ajuda na prevenção ao

crescimento dos fungos. O uso de cultivares resistentes para amendoim e algumas

práticas, como calagem, secagem e escolha de tipos de solo que interferem na

biossíntese das aflatoxinas. Além disso, cuidar a época de colheita, evitando que o

alimento fique mais tempo exposto, aumenta a segurança do alimento e inibe o

desenvolvimento dos fungos micotoxigênicos. (VIEGAS et al., 2005, ROSSETO et

al., 2003 e FERNADEZ et al., 1997 apud KWIATKOWSKI; ALVES, 2007)

2.3 Produção e condições para o crescimento de mico toxinas

Kwiatkowski e Alves (2007) citam que micotoxinas são encontradas

mundialmente e que regiões que tenham temperatura e umidade alta são as

principais áreas de ocorrência. Neste contexto, o Brasil, devido às condições

climáticas favoráveis, dispõe de condições ideais para o desenvolvimento de fungos.

“O Brasil, devido à prevalência de clima tropical, apresenta condições ideais

para o desenvolvimento desses fungos.” (KWIATKOWSKI; ALVES, 2007, p. 46).

Amaral e Machinski Junior (2006), citam que as aflatoxinas são produzidas por

três espécies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A. nomius. A. Flavus produz

apenas aflatoxinas do grupo B (aflatoxinas B1 e B2), enquanto A. Parasiticus e A.

Nomius produzem aflatoxinas dos grupos B e G (aflatoxinas B1, B2, G1 e G2).

Os fatores mais importantes para produção de micotoxinas são citados: “sendo

que a temperatura, a umidade e o tipo de substrato são os mais importantes.”

(MALLOZZI; CORRÊA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15).

22

2.3.1 Substrato

Alguns substratos são mais suscetíveis ao desenvolvimento de micotoxinas

que outros, principalmente devido ao seu teor de carboidratos. Franco e Landgraf

(2003), cita que além de carboidratos, também substratos ricos em proteínas e

gorduras favorecem a produção de aflatoxinas. “Sementes oleaginosas, como

amendoim e castanha do Brasil também são suscetíveis.” (TANIWAKI et al., 2011,

p.46).

2.3.2 Atividade de água (aw)

Percebe-se que da discussão anterior, a disponibilidade de água também é

fundamental para o crescimento de aflatoxinas. Em geral, a forma mais adequada de

quantificá-la é através de atividade de água (aw), que é a relação entre a pressão de

vapor de um determinado material (P) e a pressão de vapor da água pura (Po), nas

mesmas condições. Em termos práticos, a aw de um alimento reflete a quantidade de

água livre disponível, isto é, a água não comprometida com ligações químicas,

dissolução de solutos, metabolismos, entre outros. “A água existente nos alimentos

nem sempre se encontra disponível para o fungo porque alguns substratos estão

fortemente ligados à água, retendo-a, dificultando sua absorção.” (SCUSSEL, 1998;

MALLOZZI; CORREA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15) .

Nem toda a água do grão está igualmente disponível. Alguma água está fortemente adsorvida nos constituintes do grão através de pontes de hidrogênio de alta energia, inicialmente numa monocamada de moléculas e é referida como água ligada. Fora desta camada a água vai se tornando cada vez mais fracamente ligada quanto mais longe estiver dos constituintes do grão. Eventualmente as moléculas de água vão ficando livres de ligações químicas, mas são retidas em microporos, [...]. À medida que os poros enchem, a água que eles contêm torna-se cada vez mais prontamente disponível aos microrganismos até o grão se saturar e a água ficar completamente disponível. (MOLIN; VALENTINI, 1999, p.10).

Considerando-se a necessidade da disponibilidade de água livre para o

crescimento de microorganismos, sua ausência, torna-se fator limitante para o

crescimento e a velocidade de multiplicação desses seres, retardando a

contaminação e a deterioração dos alimentos.

23

Na Tabela 2, é apresentada a classificados os alimentos quanto aos limites de

atividade de água (aw) presente em sua composição:

Tabela 2– Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água (aw)

Classificação do Alimento Atividade de água ( aw)

alta umidade ou High Moisture Food– HMF aw > 0,90

intermediária ou Intermediate Moisture Food – IMF aw entre 0,89 e 0,60

baixa umidade ou Low Moisture Food – LMF

aw < 0,60

Fonte:Landgraf e Franco, 2003.

Conforme Gonçalez et al. (2001) o Aspergillus flavus requer uma atividade de

água mínima entre 0,78 e 0,80 para o crescimento e 0,83 a 0,87 para produção de

toxina. Para Franco e Landgraf (2003) os alimentos com atividade de água entre

0,80 e 0,85, a deterioração ocorre dentro de uma a duas semanas, causada por uma

grande variedade de fungos. Com aw igual 0,75 a deterioração é retardada e a 0,70

ou inferior, pode não ocorrer. Citam ainda, o conceito “água de alarme” (alarm water)

como parâmetro para estimar a estabilidade de alimentos desidratados durante o

armazenamento. Está relacionado à quantidade de água que não deve ser excedida

e assim, evitar o crescimento de fungos.

Marthe Calanog (1976) apud Jay (2005), relata que em aw 0,94 a temperatura

ótima para produção de aflatoxina B1 é de 24º C.

A Tabela 3, mostra a atividade de água (aw) mínima e atividade de água (aw)

ótima para crescimento e produção de aflatoxinas.

24

Tabela 3 – Atividade de água (aw) para algumas espécies fúngicas

Espécie Fúngica aw mínima aw ótima Processo

A. flavus 0,80 0,98 Crescimento

A. flavus 0,82 0,95 - 0,99 Produção

A. parasiticus 0,80 - 0,83 0,99 Crescimento

A. parasiticus 0,86 - 0,87 0,95 Produção

Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009, apud Taniwaki et al., 2011.

De acordo com Taniwaki et al. (2011, p. 46), “a maioria dos fungos requer

umidade relativa acima de 80% e um mínimo de aw para crescer.” Os limites

mínimos de umidade para crescimento de A. flavus e produção de aflatoxinas em

diferentes alimentos estão relacionados na Tabela 4.

Tabela 4 – Limite mínimo da umidade relativa do ar para crescimento de aflatoxinas

Umidade (%) Alimento

18 Trigo, milho e sorgo

16,5 Arroz não beneficiado

17,5 Arroz beneficiado

17 – 18 Soja

9 – 10 Amendoim

Fonte: Taniwaki et al., 2011.

2.3.3 Temperatura

A temperatura é outro fator importante para o crescimento dos fungos, a

produção de micotoxinas e conseqüentemente, a contaminação de alimentos por

estas toxinas. Sua variação influencia e caracteriza os mínimos e máximos de

crescimento fúngico, em conjunto com outros fatores, como substrato e aw. De uma

forma geral, a temperatura ótima para produção de toxinas encontra-se entre o

mínimo e o máximo da temperatura de crescimento.

25

Segundo a Food Ingredients Brasil (2009, p. 37), “A temperatura ótima para o

crescimento de micotoxinas esta determinado entre 24 °C e 28 °C”. Christensen

(1971) apud Jay (2005) relata que sob condições ideais de crescimento algumas

aflatoxinas podem ser detectadas em 24 horas ou dentro de 4 a 10 dias.

Tabela 5 – Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas

Espécie Fúngica T. mínima (°C)

T. ótima (°C)

T. máxima (°C) Processo

A. flavus 10 - 12 33 43 - 48 crescimento

A. flavus 13 16 - 31 37 produção

A. parasiticus 12 32 42 crescimento

A. parasiticus 12 - 40 produção

Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009 apud Taniwaki et al., 2011.

2.4 Origem da contaminação de alimentos por micotox inas

Para Sabino et al. (2008) cita que devido aos graves problemas que as

micotoxinas podem acarretar, muitos países tem estabelecido medidas para o seu

controle nos alimentos destinados ao consumo humano e também animal.

“Programas de monitoramento dos níveis de contaminação de alimentos por

micotoxinas são essenciais para estabelecer prioridades em ações de vigilância

sanitária.” (CALDAS et al., 2002, p. 320.).

Considerando que o Brasil é um grande produtor e exportador de grãos e

carne, problemas decorrentes da contaminação por micotoxinas resultariam, além

dos problemas de relacionados à saúde pública, em sérios prejuízos econômicos.

“Cada vez maior o número de países que importam e exportam, [...] leva a novos

desafios para a indústria alimentícia e para os órgãos reguladores responsáveis pelo

cumprimento das normas relativas à inocuidade dos alimentos comercializados e a

proteção dos consumidores.” (SABINO et al., 2008, p. 761.). Conforme Molin e

Valentini (1999), a contaminação de silagens, cereais e rações pode gerar danos à

saúde animal, como: diminuição da produtividade, problemas na reprodução,

26

retardado no ganho de peso para animais confinados, pré-disposição a doenças e a

morte dos animais.

Preocupados com a saúde pública, governantes mantêm políticas de

monitoramento destas toxinas, como por exemplo, o Programa Estadual de

Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), que desde 2003,

através da parceria entre estado, municípios e a vigilância sanitária, disponibiliza

material humano e recursos financeiros para a obtenção de amostragens, a

realização das análises e laudos técnicos e, a manutenção contínua da fiscalização

de alimentos.

Neste contexto, o Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN/RS,

instituição vinculada a Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde –

FEPPS, através do seu Laboratório de Micotoxinas, realiza o monitoramento dos

níveis de aflatoxinas em alimentos consumidos no Rio Grande do Sul. Utilizando

metodologias analíticas adequadas, pesquisa e fiscaliza a presença, principalmente,

das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 em alimentos, como: milho e derivados, amendoim e

derivados, trigo e derivados, arroz, castanhas e nozes comercializados no estado.

2.4.1 Descontaminação e inativação de micotoxinas

Não são conhecidos métodos de descontaminação aplicados a produtos

destinados à alimentação capazes de garantir 100 % da qualidade do alimento. Por

isso, a prevenção ainda é o melhor método para controlar micotoxinas em alimentos.

Conforme Sekiyama (2006), deve-se atentar que os testes que demonstraram ser

eficazes in vitro, não apresentaram, necessariamente, a mesma efetividade ao

serem realizados in vivo. Resultados, muitas vezes satisfatórios na eliminação das

contaminações causadas pelos fungos, porém, podem interferir na qualidade dos

alimentos e suas propriedades organolépticas. Perda de nutrientes,

descaracterização da aparência, odores e, em outros, a presença residual de

produtos químicos podem deixar o alimento impróprio para o consumo, tanto na

forma de ração animal quanto para alimentação humana.

Por exemplo, o calor usado no processamento dos alimentos não é eficiente

para neutralizar a ação das aflatoxinas. Franco e Landgraf (2003) citam que

amendoim contaminado quando torrado pode reduzir AFB1 em 70% e AFB2 em 45%.

Prado e Oliveira (1996), fizeram a torração do amendoim com forno de microondas e

27

observaram que em potência máxima de 0,8 kW, por 6 minutos foi capaz de destruir

de 41,52 a 69,56% do total de aflatoxinas presentes em uma amostra previamente

contaminada.

O emprego de calor e hidróxido de sódio mostrou-se eficiente na inativação das

aflatoxinas quando aplicado sobre grãos de milho armazenados. Segundo Camou-

Arriola e Prince (1989) apud Jay (2005), milho naturalmente contaminado com 1600

ppm de aflatoxina quando tratado com de NaOH a 3% e a 100 ºC por 4 minutos, e

posteriormente processado e frito resultou na destruição de 99% da aflatoxina.

Labuza (1983) apud Jay (2005) relatou que AFB1 e AFB2 foram reduzidas em

sementes milho pela ação do bissulfito de sódio, o qual, tem ação antimicrobiana

comparável à do ácido propiônico.

Franco e Landgraf (2003) consideram que a circulação de amônia sobre grãos

de milho durante o armazenamento pode inativar aflatoxinas, porém, altera a

coloração dos grãos.

Sekiyama et al. (2006) cita que o uso de adsorventes como carvão ativado,

colestiramina, aluminossilicato de cálcio e sódio hidratado, glucomanano, entre na

outros, podem ser eficientes quando administrados junto com ração animal, porém o

inconveniente desse método é o fato de ocorrer também, a adsorção de nutrientes

do alimento.

Segundo Molin e Valentini (1999), programas propondo melhoramento genético

iniciados ainda na década de 80, principalmente na cultura do milho, mostrou existir

suficiente variabilidade genética que permite a seleção de plantas tolerantes a

fungos. Desde então, várias linhagens de sementes modificadas geneticamente vêm

surgindo apresentando genótipos resistentes devido a diferenças nos perfis

protéicos.

Asis et al., (2005) apud Kwiatkowski e Alves (2007) relatou que pesquisadores

da Universidade Nacional de Córdoba na Argentina, constataram que podem ser

desenvolvidos genótipos de amendoim com moderada resistência a contaminação

por Aspergillus SP

2.5 Biotransformação das aflatoxinas

Após a ingestão, a aflatoxina B1 é biotransformada por enzimas, dando origem

a um produto reativo, o 8-9-epóxido, que pode se ligar tanto ao DNA quanto à

28

albumina sérica formando adutos de aflatoxina-N7-guanina e aflatoxina-N7-lisina,

respectivamente, sendo que as ligações covalentes dos adutos no DNA um passo

crítico na hepatocarcinogênese das aflatoxinas. (Kwiatkowski e Alves, 2007).

Na Figura 3 é apresentada à estrutura química da B1 e dos possíveis produtos

((a), (b), (c), (d), (e)) após biotransformação desta toxina, por meio de:

a) ataque redutivo ou hidratação da dupla ligação do éter vinílico;

b) abertura da estrutura bi-furanóide;

c) fissão hidrolítica da lactona cumarínica;

d) redução da ciclopentana;

e) hidroxilação.

Figura 3 – Biotransformação da aflatoxina B1

Fonte: Sabino, 1986.

A aflatoxina B1 pode formar um derivado, a toxina M1, substituindo o ligante

hidreto por um grupamento hidroxila.

A aflatoxina B2, também pode formar um derivado, neste caso, a toxina M2,

substituindo-se o ligante hidreto por um grupamento hidroxila, conforme representa a

figura 4:

29

Figura 4 – Aflatoxina B2

Fonte: Sabino, 1986.

2.6 Toxicidade

A toxicidade das micotoxinas esta relacionadacom os níveis da toxina ingerida.

Para Gompertz et al. (2002), os tipos básicos de toxicidade podem ser verificados:

aguda, crônica mutagênica e teratogênica. Efeitos agudos podem deteriorar as

funções hepáticas e renais, fatal em alguns casos. Já entre os efeitos crônicos esta

a indução ao câncer de fígado. Segundo Franco e Landgraf (2003), além da

atividade aguda em diversos animais, pequenas quantidades são suficientes para

causar danos hepáticos e hemorragias no trato gastrointestinal e na cavidade

peritoneal.

Freire et al. (2007, p.13), “As aflatoxinas têm propriedades oncogênicas e

imunosupressivas, induzindo infecções em pessoas contaminadas com essas

substâncias.” Cita que a toxina por possuir capacidade de se ligarem ao DNA das

células afetam a síntese protéica contribuindo para formação de aplasia tímica, que

é a ausência congênita do timo e das paratireóides o que causa queda na imunidade

celular conhecida como síndrome de Di George.

Machinski Junior (2011) relatou que as aflatoxinas são moléculas lipofílicas de

baixo peso molecular podendo ser facilmente absorvidas no intestino delgado,

principalmente na região do duodeno, seguindo posteriormente para o fígado por

meio de suplemento sangüíneo, onde são concentradas devido à alta

permeabilidade da membrana hepática a essa toxina e ao processo de

biotransformação das células hepáticas.

30

Tabela 6 – Toxicidade da algumas aflatoxinas

Aflatoxina LD 50 mg/kg peso vivo

M1 (alguns animais principalmente vacas) 0,320

B1 0,364

G1 0,784

M2 (em alguns animais, principalmente vacas) 1,228

M2 1,696

G2 3,450

Fonte: Adaptado de Antón;Lizaso, 2001.

Doll e Peto (1981) apud Caldas et al. (2002) estimou que 35% dos casos de

câncer humano estejam diretamente relacionados à dieta e à presença de

aflatoxinas em alimentos um fator importante para produção de câncer hepático.

Gompertz et al. (2002), relatou que à aflatoxina B1 é o composto com maior atividade

carcinogênica conhecida, não sendo desprezível sua atividade mutagênica.

Machinski Junior (2011) relata que a Organização Mundial da Saúde

recomenda um controle sistemático dos níveis de aflatoxinas na dieta de populações

de regiões tropicais e subtropicais por terem alta prevalência de aflatoxinas nos

alimentos e rações dessas regiões.

2.7 Detecção das aflatoxinas

Machinski Junior (2011) cita que os níveis de aflatoxina nos produtos

contaminados por micotoxinas só podem ser observados pelo emprego de

metodologia analítica adequada, pois, somente assim, a fiscalização, o controle da

qualidade, as pesquisas e estudos epidemiológicos, estudo da produção e do

metabolismo dos fungos toxigênicos, entre outros, são possíveis de serem

observados e servem para justificar a finalidade das análises.

É bastante difícil detectar a presença de aflatoxinas em grãos uma vez que a

contaminação é extremamente heterogênea. Conforme Sabino (2008), em um lote

de grãos, apenas 0,5% podem estar contaminados e alguns deles, contaminados

31

com altos teores de aflatoxinas. Neste contexto, o erro devido a amostragem pode

ser grande. Grãos de amendoim podem conter até 1000000 ng/g de aflatoxinas e

grãos de milho até 400000 ng/g. Estes extremos de concentração de aflatoxinas em

unidades individuais do produto explicam a grande variabilidade nos resultados de

um lote em particular e a extensão do erro na amostragem.

Gonçalez et al. (2001), também, Amaral e Machinski Junior (2006), citam vários

métodos que podem ser utilizados para detecção e/ou quantificação de micotoxinas.

Entre eles, estão os métodos cromatográficos: cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e cromatografia

gasosa (CG), além dos Métodos de Imunoensaios de Injeção sequencial (SIIA),

imunoenzimático (ELISA) ou com uso de Biossensores de Imunoafinidade.

Dentre os métodos adotados, o de cromatografia em camada delgada ainda é

muito empregada na análise e quantificação de aflatoxinas, por ser uma técnica de

referência para a maioria dos laboratórios brasileiros, não necessitar de

equipamentos onerosos e ser confiável. (AMARAL; MACHINSKI JUNIOR, 2006).

2.8 Controle de qualidade de ensaios analíticos

O controle e a manutenção da qualidade nos ensaios analíticos merecem

cuidados especiais, principalmente, por interferir na confiabilidade analítica com que

este laboratório trabalha. Ações práticas sugerem algumas medidas, dentre elas, a

calibração do equipamento e da vidraria e a participação do laboratório em ensaios

de proficiência. (ALBANO; RAYA-RODRIGUEZ, 2009).

2.8.1 Calibrações de vidrarias e equipamentos

A calibração das vidrarias e de equipamentos eletrônicos utilizados nos

métodos analíticos são componentes fundamentais na qualidade final dos resultados

expressos por eles. Esses instrumentos sofrem desgastes ao longo do tempo

aumentando o risco de variação dos resultados podendo comprometer a qualidade

das mesmas. As calibrações se fazem necessárias periodicamente a fim de que

estes equipamentos sejam revalidados e possam operar dentro da confiabilidade

analítica.

32

A calibração pode ser interna e externa. Calibrações internas são

procedimentos que fazem parte dos controles internos do laboratório e são

registrados em Formulário de Registro (FR) específicos. As calibrações externas são

realizadas por empresas especialmente contratadas para este fim. Para laboratórios

acreditados é necessário que a empresa contratada tenha credenciamento por

órgão certificado, por exemplo, a Rede Brasileira de Metrologia (RBC).

2.8.2 Ensaio de proficiência

Uma das formas de avaliar a qualidade dos ensaios analíticos realizados pelo

laboratório é através da participação nos ensaios de proficiência (ALBANO; RAYA-

RODRIGUES, 2009). Nestes, um laboratório provedor envia amostras previamente

contaminadas e quantificadas aos participantes do programa e estes realizam as

análises determinando e quantificando os níveis de toxinas encontrados de acordo

com a metodologia adotada em cada laboratório, que tem por objetivo obter

resultados satisfatórios em relação ao valor alvo estipulado e dentro do intervalo de

confiança estabelecido pelo laboratório provedor da comparação.

As metodologias empregadas para avaliação dos resultados dos ensaios de

proficiência são, normalmente, o Gráfico de Youden ou Z-score. Segundo Albano e

Raya-Rodriguez (2009), a metodologia de Youden parte da análise de duas

soluções de igual natureza e concentrações próximas, obtendo-se pares de

resultados (x,y) que são então trabalhados estatisticamente e representados por um

gráfico com a identificação do laboratório participante. A avaliação leva em conta a

posição de cada par de resultados em relação ao ponto de intersecção da média de

X e da média de Y e em qual quadrante se posiciona. Duas linhas médias dividem o

gráfico em quatro quadrantes e em situação ideal ocorre distribuição igualitária em

todos eles. Os pontos situados no 1º e no 3º quadrante representam tendência de

resultados baixos ou altos para ambas as soluções, caracterizando erros

sistemáticos. Pontos no 2º e 4º quadrante indicam a ocorrência de erros aleatórios,

refletindo disparidade no desempenho do laboratório.

Na metodologia Z-score, os resultados das amostras X e Y são analisados

separadamente e calcula-se o Z-score pela Equação 1:

Z= (a – b) / s (1)

33

Onde:

a = valor obtido no ensaio do laboratório

b = estimativa do valor real

s = desvio padrão

O desempenho de cada laboratório participante do programa é avaliado a partir

da estimativa do valor real através de consenso e da análise estatística dos

resultados enviados por todos os participantes.

A análise do Z-score segue a seguinte relação:

• Satisfatório: quando IzI ≤ 2

• Questionável: quando 2 <IzI< 3

• Insatisfatório: quando IzI ≥ 3

2.9 Padrões de aflatoxinas

As soluções dos padrões de aflatoxinas, utilizados tanto nos programas de

ensaios de proficiência quanto na validação de sua metodologia, normalmente, têm

sua apresentação na forma concentrada, necessitando que sejam diluídos para

atender a faixa de trabalho. É importante observar que estes padrões, sempre que

possível, não sejam adquiridos na forma de cristais, pois, oferece maior risco a

saúde durante seu manejo por se dispersarem facilmente na área do laboratório.

A concentração das soluções de trabalho dos padrões de aflatoxina é

primordial para a correta quantificação. A necessidade de obtenção de valores

inequívocos para as soluções de trabalho dos padrões começa pela adoção de

medidas seguras, desde sua aquisição através de fornecedores credenciados,

cuidados na conservação e durante a sua manipulação. O uso de vidrarias e

equipamentos calibrados, o uso de solventes de boa qualidade nas diluições e

adequado manejo técnico, também são importantes neste processo, onde as

soluções de trabalho servem de referência e delas dependem todas as

quantificações de amostras, como por exemplo, na técnica de cromatografia em

camada delgada.

34

2.9.1 Cuidados com padrões de aflatoxinas

Os cuidados com padrões iniciam-se pela identificação e escolha do bom

fornecedor, idôneo e que possa atender aos requisitos da qualidade, preço e prazo

de entrega. Ao chegarem ao laboratório, devem ter suas condições de integridade

analisadas, como: embalagem, rótulo, aparência da solução, e as informações

contidas no certificado de análise conferidas, para somente então, proceder à

entrada do material registrando-o em livro de registro próprio.

O certificado de análise, trás informações importantes, dentre elas, a

concentração, a pureza, validade e orientações de manejo, contribuindo para

qualidade e rastreabilidade do produto.

A conservação dos padrões no laboratório deve ser feita estocando-os em

freezer com temperaturas iguais ou inferiores a -20 °C, acondicionados após

fracionamento e diluição, em frasco âmbar, vedado e ao abrigo da luz, para evitar

sua degradação. O freezer deve ser exclusivo não sendo estocados outros materiais

além de padrões primários e soluções de trabalho dos padrões. O acesso deve ser

restrito e controlado, por exemplo, através de fechadura codificada. O controle da

temperatura do freezer deve ser feito diariamente, sendo registrado em Formulário

de Registro (FR) específico, observando-se faixa de tolerância, cabendo ação

corretiva ao sinal de problemas que possam por em risco a conservação dos

padrões.

A manipulação dos padrões e das soluções de trabalho requerem cuidados,

não só na sua preservação, mas também, no manejo feito pelo laboratorista, visto

serem substâncias potencialmente cancerígenas. Devem ser retirados do freezer

uma hora antes de seu uso e mantidos na capela de exaustão em temperatura

ambiente. É imprescindível o uso de luvas e máscara contra vapores tóxicos

durante sua manipulação.

Após o uso, a descontaminação dos equipamentos e da vidraria é feita com

solução de hipoclorito de sódio, a lavagem e, por fim, passagem de acetona P.A.

nas mesmas. Antes de iniciar a descontaminação os frascos contendo padrões de

aflatoxinas devem ser devolvidos ao freezer para evitar que estes sofram inativação

dos componentes.

35

2.9.2 Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões

A concentração das soluções de trabalho do padrão de aflatoxinas pode ser

feita por medição em triplicata, com uso do espectrofotômetro. Neste equipamento,

faz-se incidir um feixe luminoso de comprimento de onda selecionado através de

uma solução do branco (cubeta 1) e outro feixe sobre a solução do padrão em

aferição (cubeta 2). A partir da diferença entre a leitura da absorbância do branco e

da solução do padrão é feito o cálculo para determinar a concentração da solução

de trabalho deste padrão, aplicando-se a lei de Lambert-Beer, conforme Equação 2:

A = ε.b.c (2)

Inicialmente, o equipamento passa por uma rápida calibração, da qual, é obtido

o fator de correção (FC) do equipamento. O FC representa o desvio do

equipamento, é obtido através de medições seriadas de uma solução de dicromato

de potássio de diferentes concentrações em um determinado comprimento de onda.

O branco é feito com solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,009 mol/L, com o qual, o

equipamento é zerado. As soluções de dicromato de potássio são preparadas em

três concentrações diferentes. As soluções A, B e C, são diluídas com ácido sulfúrico

até possuem, respectivamente, 0,265 mol/L, 0,133 mol/L e 0,066 mol/L.

A leitura em triplicata das absorbâncias para as soluções A, B e C, e o posterior

cálculo da média das absorbâncias foi aplicado na Equação 3 abaixo, da qual,

obteve-se a absortividade molar nas três concentrações.

ε = [A x 1000] / C (3)

Onde:

ε é absortividade molar;

A é absorbância;

C é concentração da solução em mol/L.

36

Quadro 2 – Absorbância das soluções

Solução Concentração de K2Cr2O7 (mol/L)

Absorbância (média) esperada

A 0,265 0,84

B 0,133 0,41 – 0,42

C 0,066 0,21 Fonte: Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2009.

Com os valores da absortividade εA (absortividade da solução A), εB

(absortividade da solução B) e εC (absortividade da solução C) foi calculado a

absortividade molar média, através da Equação4, ilustrada abaixo:

= [εA + εB + εC] / 3 (4)

O fator de correção do espectrofotômetro (FC) foi calculado aplicando-se a

Equação 5 abaixo:

FC = 3160 / (5)

O valor de FC esperado na calibração do espectrofotômetro deve estar dentro

da faixa situada entre 0,95 e 1,05 para ser considerado calibrado. Nos casos em que

FC se encontrar fora da faixa o procedimento deve ser repetido e, caso persistirem

os erros, o equipamento deve ser caracterizado como descalibrado e não apto para

determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões.

Após calculado valor do FC do espectrofotômetro e estando o mesmo dentro

da faixa válida, pode-se então iniciar a quantificação das soluções de trabalho. No

Laboratório de Micotoxinas do IPB-LACEN/RS, adotou-se concentrações situadas:

0,8 a 1,0 µg/mL para AFB1, AFG1 e 0,2 a 0,5 µg/mL para AFB2 e AFG2.

Para obtenção das faixas acima descritas, o padrão puro pode ser diluído em

acetonitrila HPLC até atender a faixa estipulada. A confirmação da concentração é

feita através da leitura em triplicata de cada um dos padrões de aflatoxina no

espectrofotômetro com aplicação da Equação 5 abaixo:

[C] µg/mL = A x FC x MM x 1000 / ε (5)

37

Onde:

[C] = Concentração em µg/mL;

A = Absorbância;

FC = Fator de correção do espectrofotômetro;

MM = Massa molecular da micotoxina;

ε = Absortividade molar da micotoxina.

Quadro 3 – Valores de absortividade molar (ε) das flatoxinas em

acetonitrila em 350 nm

Micotoxinas Absortividade molar

(cm -1.mol -1.L)

Massa molecular

(g/mol)

Aflatoxina B1 20721 312

Aflatoxina B2 22456 314

Aflatoxina G1 17640 328

Aflatoxina G2 17640 330

Fonte: Adaptado do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2010.

O controle e a verificação da concentração das soluções de trabalho pode ser

feito mediante medição trimestral das concentrações através do espectrofotômetro,

como descrito acima. Os dados são transcritos para um formulário de registro e

geram uma Carta Controle.

A carta controle serve para acompanhar o desempenho das soluções de

trabalho dos padrões ao longo do tempo. Um dos principais parâmetros observados

no processo é a absortividade molar (ε). A análise crítica da carta controle, objetiva

principalmente, identificar queda na qualidade dos padrões devido a manipulação

constante, degradação ao longo do tempo, contaminação, inativação, entre outros

processos que prejudiquem a qualidade das soluções de referência.

A Figura 5, mostra o gráfico gerado por uma carta controle:

38

Figura 5 – Carta Controle

Carta de Controle

16000

16500

17000

17500

18000

18500

19000

19500

20000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

Dias

ε

Fonte: do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2010.

2.10 Legislaçãosobre micotoxinas

No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada, RDC n. 7, de 18 de Fevereiro de

2011, dispõe sobre os Limites Máximos Tolerados (LMT) para micotoxinas em

alimentos, que são apresentados no Quadro 4:

39

Quadro 4 – Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas para alguns alimentos

Fonte: Adaptado da Resolução de Diretoria Colegiada, 2011.

2.11 Fiscalização

Os principais órgãos fiscalizadores de micotoxinas no Brasil referenciam o

Ministério da Agricultura através da Secretaria de Defesa Agropecuária, o Ministério

da Saúde pela Divisão de Alimentos, DETEN/SVS, e a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA).

Micotoxina Alimento Limite Máximo Tolerado (µg/Kg)

Aflatoxina

B1 - B2 - G1 - G2

- Alimentos À base de cereais para

alimentação infantil (lactentes,

crianças na primeira infância) 1,0

- Cereais e produtos de cereais,

inclui cevada malteada.

- Feijão

- Produtos de cacau e chocolate

5,0

Aflatoxina

B1 - B2 - G1 - G2

- Castanhas, inclui nozes, pistachios,

avelã e amêndoas;

- Frutas desidratadas e secas;

- Castanha-do-Brasil sem casca para

consumo direto;

- Amêndoas de cacau;

10,0

- Castanha-do-Brasil sem casca para processamento posterior; 15,0

Aflatoxina

B1 - B2 - G1 - G2

- Castanha-do-Brasil com casca para

consumo direto;

- Especiarias: pimenta, canela, noz-moscada, gengibre, outros - Amendoim com casca, sem casca,

cru, torrado, em pasta ou manteiga;

- Milho, milho em grãos (partido,

inteiro, amassado, moído), farinhas

ou sêmolas de milho.

20,0

40

3 PARTE EXPERIMENTAL

Muitas pesquisas foram realizadas após a descoberta, na década de 60, e

ainda são realizadas, seja para identificar os níveis de contaminação ou desenvolver

métodos de análise mais precisos, rápidos e viáveis em termos de custos e menor

impacto ambiental.

3.1 Metodologia analítica

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi desenvolvido no Laboratório de

Micotoxinas que adotou o método de extração e quantificação das aflatoxinas

seguindo a Official Methods of Analysis (2005), 18 th Ed. AOAC – Association of

Official Analytical Chemists, Chapter 49, Method 970.44, 975.35, 968.22, por se

tratar de uma metodologia analítica oficial, de fácil execução, não envolvendo

grandes equipamentos, oferecendo resultados analíticos confiáveis.

3.2 Materiais e equipamentos

• Espectrofotômetro UV/VIS Jasco-7800;

• Cubetas de quartzo (percurso óptico de 1cm);

• Gabinete de visualização ou Cromatovisor Camag;

• Capela de exaustão química Quimis;

• Balança semi-analítica Ohaus-Scout;

• Liquidificador industrial Turbo A;

• Ultra-som Unique-1600;

• Estufa Biopar S22;

• Refrigerador Prosdócimo;

• Freezer Consul;

• Cilindro de gás nitrogênio White Martins, pureza 99,5%;

• Banho Maria Biopar, (50 °C);

• Béquer de 50, 100, 250 e 600 mL;

• Balão volumétrico de 1000 mL;

• Proveta volumétrica de 50, 250 e 500 mL;

• Bastão de vidro;

41

• Funil de vidro;

• Papel filtro Whatman, nº 4;

• Funil de separação de 500 mL;

• Microseringa de 10 µL;

• Micropipetador de 200 e 500 µL;

• Cuba cromatográfica com tampa (1000 mL);

• Pipeta volumétrica de 5 e 10 mL;

• Pipeta graduada de 0,2 mL;

• Espátula de metal;

• Cromatofolha 20x20 cm com sílica gel 60G sem indicador fluorescente;

• Tubos de ensaio;

• Suporte para tubo de ensaio;

• Frasco de vidro para amostra.

3.3 Reagentes

• Metanol p.a., marca Vetec;

• Clorofórmio grau HPLC, marca Vetec;

• Celite 545 p.a., marca Merck;

• Cloreto de potássio p.a., marca Vetec;

• Sulfato de cobre anidro p.a., marca Vetec;

• Sulfato de Amônio p.a. marca Dinâmica;

• Éter Etílico p.a., marca Dinâmica;

• Solução aquosa de H2SO4;

• Ácido Trifloroacético p.a. (TFA), marca Vetec;

• Tolueno p.a., marca nuclear;

• Acetonitrila p.a., marca J. T. Backer;

• Ácido Acético Glacial p.a., marca Vetec;

• Hipoclorito de Sódio 5% p.a., marca Vetec;

• Acetona p.a., marca Vetec;

• Hexano p.a., marca J. T. Backer.

42

3.4 Descrição do método

As aflatoxinas foram extraídas das amostras com solução de metanol/cloreto

de potássio a 4%, passando posteriormente por uma etapa de limpeza com uso de

agentes clarificantes como, solução de sulfato de cobre a 10%, para matrizes de

amendoim e derivados, nozes ou, solução de sulfato de amônio a 30%, para

matrizes como cereais e grãos.

A extração de gordura para amostras de amendoim e derivados foi feito com

hexano em funil de separação. A separação das aflatoxinas em solução é feita com

clorofórmio por partição líquido-líquido da qual uma alíquota é secada com gás

Nitrogênio (N2) e ressuspensa com mistura de tolueno:acetonitrila (98:2mL) com

posterior aplicação na cromatofolha. A quantificação das aflatoxinas foi realizada

com auxílio de luz ultravioleta em 366 nm, através da observação da intensidade das

manchas da amostra comparando-as com as do padrão.

O fluxograma a seguir, representado na figura 6, mostra as etapas do processo

de extração das aflatoxinas até a etapa de Cromatografia em Camada Delgada

(CCD).

43

Figura 6–Etapas da extração das aflatoxinas

Fonte: Autoria própria, 2011.

+ 270 mL Metanol + 30 mL KCl 4% liquidificador por 5 min filtrar

+ 150 mL CuSO4 ou (NH4)2SO4

+ 50 cm3celite agitar e filtrar

+ 150 mL H2O + 10 mL clorofórmio

agitação por 3 min + 10 mL clorofórmio

Concentra até secura

Ressuspende em tolueno:Acetonitrila

50 g da amostra

150 mL Filtrado

150 mL Filtrado

Funil de separação

10 mL fase orgânica (Recolhe extrato l)

Funil de Separação

10 mL fase orgânica (+ extrato ll)

Recolhe

CCD

44

3.4.1 Amostrageme extração

A amostragem é iniciada através da trituração de aproximadamente 2 kg de

amostras de amendoim, milho, castanha-do-pará ou arroz, em liquidificador de aço

inox. Homogeneizou-se o produto obtido e procedeu-se o quarteamento. Após,

pesou-se 50g da amostra para um béquer de 250 mL e realizou-se a extração.

Nesta etapa, o objetivo foi separar o analito de interesse da matriz. Para

favorecer o contato entre o substrato sólido e o solvente, triturou-se em liquidificador

industrial a amostra preparada no procedimento anterior com 270 mL de metanol e

30 mL de solução aquosa de Cloreto de potássio a 4 %. Agitou-se por cinco minutos

em velocidade baixa e após, filtrou-se à amostra em papel filtro Whatman® número

quatro através de funil simples recolhendo-se os primeiros 150 mL em uma proveta

graduada.

3.4.2 Purificação

Essa etapa foi realizada devido a freqüente presença de contaminantes, por

exemplo, glicose e corantes, na amostra. Para tanto, procedeu-se da seguinte forma:

transferiu-se o filtrado para um béquer de 600 mL, adicionou-se 150 mL de agente

clarificante, neste caso, uma solução aquosa de sulfato de cobre (CuSO4 10%) para

amostras de amendoim e derivados, castanhas e 50 cm³ de celite 545. Para

amostras de milho e arroz, adicionou-se 150 mL de sulfato de amônio ((NH4)2SO4 a

30%).

Homogeneizou-se a mistura com bastão de vidro e fez-se a filtração em papel filtro

Whatman® Nº 4, através de funil simples e recolhendo-se, novamente, os primeiros

150 mL em proveta.

3.4.3 Partição líquido-líquido

Transferiu-se o filtrado para um funil de separação de 1000 mL. Para amostras

gordurosas, como amendoim e derivados, adicionou-se 40 mL de hexano para

extração da gordura, a qual, pode interferir na visualização dos pontos na etapa de

quantificação. Agitou-se manualmente por 3 minutos e após a separação das fases,

desprezou-se a fase orgânica retornando a amostra para o funil de separação.

45

Adicionou-se 150 mL de água ultra pura e 10 mL de clorofórmio grau HPLC.

Agitou-se durante cinco minutos, cuidando para a amostra não emulsionar. Os gases

desprendidos devido à agitação do funil foram liberados várias vezes durante o

procedimento. Após a agitação, deixou-se em repouso por 10 minutos para a

separação das fases. Foi retirada a fração inferior da solução do funil (fase

orgânica). Esta foi então armazenada em um béquer de 50 mL, identificado como

Extrato I.

Adicionou-se uma segunda alíquota de 10 mL de clorofórmio e procedeu-se uma

segunda extração, como descrito acima, recolhendo a fração e juntando-a com a

primeira (Extrato II).

3.4.4 Concentração e ressuspensão

Retirou-se uma alíquota de 10 mL do Extrato II com auxílio de uma pipeta

volumétrica, transferindo para um tubo de ensaio graduado de 15 mL. Concentrou-

se a amostra em banho maria na temperatura de 50 °C até secura sob corrente de

gás nitrogênio.

Redissolveu-se o extrato com 200 µL de solução de tolueno:acetonitrila

(98:2mL) para amostras de amendoim e derivados e arroz. Para os cereais e

derivados a redissolução é feita com 500 µL da solução tolueno:acetonitrila

(98:2mL). Agita-se por aproximadamente 1 minutos, para garantir a completa

solubilização do extrato.

3.4.5 Determinação e quantificação das aflatoxinas

A determinação e quantificação das aflatoxinas por cromatografia em camada

Delgada foi feito através da comparação visual da amostra ressuspensa com os

padrões, ambos aplicados na mesma cromatofolha de sílica gel 60G sem indicador

de fluorescência. Inicialmente, ativou-se a cromatofolha com aquecimento em estufa

a 110 ºC por 30 min. Delimitou-se a migração das frentes pelos solventes na

cromatofolha.

As delimitações da cromatofolha foram feitas a lápis, onde AM é o ponto de

aplicação da amostra e P, ponto para aplicação do padrão, como mostra a Figura 7:

46

Figura 7 – Delimitações da cromatofolha

Fonte: Instrução de Trabalho, IPB-LACEN/RS, 2009.

Os padrões foram retirados do freezer e deixados à temperatura ambiente em

capela de exaustão por 1h e, quando ambientados foram aplicados na cromatofolha,

conforme delimitações mostradas acima.

Aplicou-se 5 µL dos padrões B1, B2, G1 e G2 com o auxílio de microseringa na

cromatofolha. Em seguida, na mesma cromatofolha, aplicou-se 5 µL de cada uma

das amostras extraídas. Esta placa serviu como primeira verificação da

contaminação por aflatoxinas.

Na cuba cromatográfica foi feita a eluição das amostras e dos padrões. Foi

utilizado como solvente de eluição (corridas) uma mistura de clorofórmio p.a, éter-

etílico p.a, e ácido acético glacial p.a (85mL:15mL:5mL), preparados diretamente na

cuba. Papel filtro foi colocado para forrar o interior da cuba. O papel filtro fica

embebido na solução e tem a função de melhorar a saturação do ambiente interno.

A cuba deve permanecer em repouso nestas condições, por cerca de uma hora,

antes de se colocar a cromatofolha e dar início à eluição.

Após a aplicação dos volumes descritos a cima na cromatofolha, foi colocada

na cuba em posição vertical onde, a parte inferior fica em contato com a solução

eluente. A corrida cromatográfica dura em torno de 30 a 40 minutos, conforme

demarcação na parte superior da placa e supervisão do analista. Após, a

cromatofolha é retirada da cuba e colocada em capela de exaustão para evaporação

dos solventes, por cerca de 10 minutos.

47

A placa foi então avaliada sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 366

nm, em gabinete de visualização.

Para amostras contaminadas com aflatoxinas foi realizada a quantificação. Por

isso, foi necessário preparar uma nova placa com mais pontos de padrão e da

amostra, neste caso, preparou-se uma nova cromatofolha de sílica gel e os volumes

injetados foram: 2 µL, 5 µL, 7 µL, 10 µL, da amostra contaminada e 1 µL, 2 µL, 5 µL,

7 µL, apenas dos padrões a serem usados na quantificação.

Através da Figura 8, observa-se que a fluorescência azul representa a

aflatoxina B1 e B2, e a fluorescência verde, as aflatoxinas G1 e G2, do padrão na

placa de camada delgada submetida a luz ultra-violeta.

Figura 8 – Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará sob luz UV

(comprimento de onda de 366 nm)


Na placa da Figura 8, foi aplicado uma amostra de castanha-do-pará na parte

central da cromatofolha. Os dois pontos luminosos à esquerda são respectivamente

os padrões de aflatoxina B1 e B2 e tem coloração azul. À direita, temos os pontos

G1 e G2 do padrão de aflatoxina, de coloração verde. Observou-se, nesta análise, à

ausência de contaminação por aflatoxinas na amostra.

B1 B2 A G1 G2

48

3.4.6 Confirmação

A confirmação da presença de aflatoxinas na amostra foi feita pulverizando-se

a primeira cromatofolha com solução aquosa de ácido sulfúrico (1:3). Deixou-se

secar a temperatura ambiente e visualizou-se em comprimento de onda de 366 nm.

A troca da fluorescência dos pontos aplicados na cromatofolha para amarelo indicam

contaminação por aflatoxinas. Amostras que não apresentarem mudança para a cor

amarela, confirmam ausência de aflatoxina.

Para amostras contaminadas com aflatoxina B1 e G1, faz-se a confirmação

pela reação com ácido trifluoracético (TFA). Dividiu-se a cromatofolha em dois lados

verticalmente e em cada lado cromatografou-se dois pontos de 3 µL da amostra e 2

pontos de 3 µL do padrão com microseringa. Em um dos lados sobrepôs-se 1 µL de

TFA em um dos pontos dos padrões e em um dos pontos das amostras.

Desenvolveu-se a eluição no sistema: clorofórmio + éter + ácido acético glacial

(85mL:15mL:5mL,). A placa foi examinada em luz ultravioleta com comprimento de

onda em 366 nm. A confirmação se dá quando à aflatoxina com TFA aparece em RF

menor que o quantificado (RF 0,15 – 0,50 cm).

Outra forma de confirmação pode ser feita pela cromatografia bidimensional.

Este recurso pode ser usado quando estiverem presentes no extrato, substâncias

interferentes que proporcionem dúvidas na quantificação das aflatoxinas.

A Figura 9 mostra as delimitações de uma cromatofolha bidimensional. I e II

representam os solventes de eluição e A, B, C, D e E os pontos aplicados na

cromatofolha de amostra e padrão, respectivamente.

49

Figura 9 – Delimitações da placa de camada delgada bidimencional

Fonte: Instrução de Trabalho, IPB-LACEN/RS, 2009

Delimitou-se a migração das frentes dos solventes na placa cromotográfica

através de dois sulcos paralelos a lados contíguos, sendo as distâncias entre os

sulcos e seus respectivos lados iguais a 5 cm e 6 cm. Aplicou-se volumes de 3 µL

para padrões e amostras. Os solventes de eluição usados são: Solução I:

Clorofórmio PA. e Acetona PA. ; Solução II : Tolueno PA.: Acetato de Etila PA.: Ácido

Fórmico PA.

A quantificação foi feita comparando-se a intensidade de fluorescência das

manchas de menor intensidade das aflatoxinas das amostras com a intensidade das

manchas dos padrões. Como é conhecido o valor do volume do padrão injetado e a

concentração do padrão pode-se então calcular a concentração da aflatoxina

presente na amostra conforme descrito a seguir.

3.4.7 Cálculo

O cálculo para determinação da concentração de cada composto na amostra

analisada (C) é comparado por visualização com RF de cada padrão de aflatoxina,

expresso em µg/kg (ppb), calculado através da Equação 6:

WZ

VYSppbC

.

..)( = (6)

Onde:

.... E

.... D

.... C II→→→→

. A

I↑↑↑↑

.

50

S = volume em µL de padrão de fluorescência igual à da amostra;

Y = concentração do padrão de micotoxina em µg/mL usada na

cromatofolha

Z = volume em µL da mancha do extrato da amostra na qual a intensidade

de fluorescência foi igual a do padrão;

W = massa em gramas da amostra contida no extrato final;

V = volume final do extrato em µL, levando em conta diluições eventuais.

51

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisadas 48 amostras no período de agosto a novembro de 2011. A

maior parte das amostras foram provenientes do Programa Estadual de

Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), coletadas em

diversos pontos no estado do Rio Grande do Sul, conforme cronograma da vigilância

sanitária. Contudo, uma amostra analisada foi proveniente de outra região do Brasil.

Outras 12 amostras, foram adquiridas no comércio da região metropolitana de Porto

Alegre. A distribuição dos pontos de coleta e a procedência ou beneficiamento das

amostras foi feita de acordo com as regiões geográficas, sendo que a maior parte

das amostras é oriunda do Rio Grande do Sul, conforme mostra o Tabela7.

Tabela 7 – Distribuição das amostras

Regiões Pontos de Coleta da Amostra

Pontos de Beneficiamento

Região Noroeste do RS 04 06

Região Nordeste do RS 05 12

Região Centro-Leste RS 04 05

Região Metropolitana de Porto Alegre 34 16

Região Centro-Oeste do RS - 01

Outro estado 01 06

Não Informado - 02

TOTAL 48 48

Fonte: autoria própria, 2011.

As amostras provenientes ou beneficiadas em outro estado estão distribuídas

conforme mostra a Tabela 8:

52

Tabela 8 – Amostras de outros estados

Estado Ponto de Coleta da Amostra

Ponto de Beneficiamento

Santa Catarina 01 01

Paraná - 01

São Paulo - 04


A melhor representação para a distribuição geográfica dos pontos em que as

amostras foram coletadas e os pontos onde as amostras foram

beneficiadas/produzidas, incluindo-se aí todas as regiões, esta demonstrado na

figura 10:

Figura 10 – Distribuição das regiões de amostragem


Percebe-se que a maioria das amostras coletadas, assim como, analisadas de

acordo com a região de beneficiamento/produção do alimento, foi proveniente da

região metropolitana e capital do Rio Grande do Sul, seguido da região nordeste,

também do RS.

53

A distribuição das amostras quanto ao tipo de alimentos analisados estão

representados conforme mostra a Tabela 9:

Tabela 9 – Tipos de amostras e sua contaminação

Alimento Amostrado

Quantidade de Amostras

Amostras Contaminadas

% de Amostras Contaminadas

Amendoim 11 02 18,18

Derivados de Amendoim 19 02 10,53

Farinha de Milho 14 - 0,0

Arroz Descascado 02 - 0,0

Castanha-do-Pará 02 - 0,0

TOTAL 48 04 8,33


A Figura 11, representa melhor a distribuição dos alimentos analisados:

Figura 11 – Distribuição das amostras analisadas


Observa-se que a maioria das amostras analisadas foram de derivados de

amendoim, seguido de farinha de milho. Verifica-se também, que as amostras de

arroz e castanha-do-pará são pouco representativas quanto à contaminação destes

produtos por aflatoxinas por constituírem pequeno número de amostragem.

54

A figura seguinte, representa o percentual total de contaminação das amostras.

Figura 12 – Percentual de amostras contaminadas


Percebe-se que 8,33% das amostras estavam contaminadas, Este valor é

considerável quando se trata de alimentos destinados ao consumo humano e os

risco decorrentes destas toxinas para saúde humana.

Na Tabela 10, é apresentado o valor de aflatoxinas totais quantificadas nas

amostras contaminadas.

Tabela 10 – Aflatoxinas quantificadas na amostras contaminadas

Amostra Contaminada

Aflatoxina B1

(µg/Kg)

Aflatoxina B2

(µg/Kg)

Aflatoxina G1

(µg/Kg)

Aflatoxina G2

(µg/Kg)

Aflatoxina Total

(µg/Kg)

Amendoim 79,40 22,86 - - 102,26

Amendoim 52,93 16,01 - - 68,94

Derivado amendoim

5,35 - - - 5,35

Derivado amendoim

Traços - - - traços


Das aflatoxinas encontradas nos ensaios, os grupos presentes nos alimentos

contaminados foram AFB1 e AFB2, não sendo encontradas, AFG1 nem AFG2 em

nenhuma das amostras analisadas.

55

A figura a seguir, representa a distribuição dos grupos de aflatoxinas

encontradas nos alimentos contaminados.

Figura 13 – Grupos de aflatoxinas identificadas nas amostras contaminadas


Verificou-se que das quatro amostras contaminadas, em todas, constatou-se

contaminação por AFB1, seguido da AFB2, em duas amostras.

A Figura 14, mostra um panorama geral do estudo realizado sobre os níveis de

contaminação por aflatoxinas nas amostras analisadas e os resultados obtidos.

56

Figura 14 – Panorama geral do estudo realizado


Em duas amostras de amendoim os valores de aflatoxinas quantificadas na

amostragem, mostraram-se acima do valor permitido pela legislação. Em outras

duas amostras, dentro do Limite Máximo Tolerado (LMT) de aflatoxinas para

alimentos derivados de amendoim.

Uma amostra de derivados de amendoim apresentou traços de aflatoxina

AFB1, porém com valores abaixo do limite de quantificação adotado pelo laboratório

(para AFB1 o LQ = 1,2 µg/kg), não sendo possível sua quantificação devido à

limitação na sensibilidade do método.

Outro dado importante sobre a contaminação das amostras analisadas, diz

respeito a origem das amostras. A Figura 15, mostra a relação entre a origem das

amostras e sua contaminação.

57

Figura 15 – Relação entre origem das amostras e contaminação


Observa-se que amostras beneficiadas no Rio Grande do Sul apresentaram

apenas uma contaminação. No entanto, amostras oriundas de outros estados,

apesar de um universo pequeno de amostras, apresentou por sua vez,

contaminação por aflatoxinas em metade das amostras analisadas.

Em duas amostras de amendoim in natura adquiridas não foi relatado sua

origem. As duas amostras não apresentaram contaminação.

A partir dos resultados apresentados, verificou-se que para efeitos de

monitoramento, a identificação da procedência das amostras pode ajudar a delimitar

possíveis focos de contaminação, e com isso estabelecer políticas para prevenção

de doenças em decorrência da ingestão destes alimentos, além de auxiliar a

vigilância sanitária quanto às ações de controle e fiscalização.

58

5 CONCLUSÃO

O monitoramento das condições sanitárias dos alimentos consumidos pelos

gaúchos, no que tange às aflatoxinas, merece atenção especial e, a justificativa para

manutenção de programas públicos como o Programa Estadual de Monitoramento e

Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), dentre outros, está no fato de não

estarmos livres da contaminação por aflatoxinas nos alimentos.

A fiscalização por órgãos controladores do estado deve ser permanente

quando se trata de alimentos, principalmente, pelo fato das aflatoxinas terem sua

produção e disseminação sensivelmente afetados por fatores climáticos e pelas

circunstancias de manejo e beneficiamento dos alimentos. Neste sentido, alimentos,

dentre eles: milho e derivados, amendoim e derivados, muito suscetíveis a

contaminação por aflatoxinas, necessitam que seus processos envolvendo

fabricação e inclusive, comercialização, permaneçam, ainda, sob severas

regulamentações, oferecendo assim, melhores garantias de qualidade aos alimentos

colocados ao consumo humano.

Embora a amostragem realizada tenha sido feita sob um pequeno período do

ano, de agosto a novembro de 2011, e não abranger todas as regiões do estado e,

ser apenas representativa para amendoim e derivados e farinha de milho, constatou-

se que apenas uma amostra oriunda do RS apresentou contaminação por

aflatoxinas. No entanto, amostras beneficiadas e provenientes de outros estados,

mas, disponíveis no comércio do RS, apresentaram maior freqüência de

contaminação, sendo que em uma das amostras foi verificado uma contaminação

cinco vezes superior ao permitido pela legislação vigente, a RDCn. 7, de 18 de

Fevereiro de 2011.

A técnica por cromatografia em camada delgada utilizada para quantificação

das aflatoxinas neste Trabalho de Conclusão de Curso, mostrou-se eficiente, mas,

apresentou seu limitante na quantificação de amostras quando contaminações é a

níveis de traços. Neste sentido, a adoção de técnicas com maior sensibilidade se faz

necessária. A cromatografia líquida apresenta-se como alternativa por sua alta

sensibilidade propiciando que baixas concentrações de contaminação possam ser

quantificadas.

59

REFERÊNCIAS

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GUILHERME OSCAR HINING - biblioteca.unilasalle.edu.br · EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado