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Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAHidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAProfessor Dr. Ademir NevesLABINC – Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia Departamento de QuÃmica – UFSC E-mail: [email protected] Fone: 0xx/48/3319219; FAX: 0xx/48/3319711Florianópolis 2003Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAGenoma humanoSimples mutação de ~40 000 Genes qualquer gene codificados
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Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Hidrolases Sintéticas:Hidrolases Sintéticas:
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Professor Dr. Ademir NevesLABINC – Laboratório de Bioinorgânica e CristalografiaDepartamento de Química – UFSCE-mail: [email protected]: 0xx/48/3319219; FAX: 0xx/48/3319711
Florianópolis2003
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
23 cromossomas 3 bilhões de pares de bases do DNA
~40 000 Genes codificados os quais são transcritos no mRNA
antes da síntese daProteína (em estudo)
Simples mutação de qualquer gene ou degradação de uma proteína pode
ter sérias consequências
Dada a importância de se manter o código genético e a função específica decada proteína específica, a natureza arquitetou de forma sábia as ligações fósforo-diéster para juntar os nucleosídeos no DNA e RNA e as ligações
peptídicas que acoplam os aminoácidos nas proteínas.
A meia vida do DNA para a hidrólise das ligações fosfo-diéster - 130 000 a 106 anos a 25 oC e pH-neutro (RNA – 4 a 103 anos).
Ligações peptídicas – meia vida = 7 anos sob as mesmas condições
Genoma humano
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
OBase
H
XO
CH2OP
O
O
O-
P O
O-
O CH2OBase
H
XOX = H, DNA = OH, RNA
N
H
CR H
C
O
NC
H R
C
O
Cadeia polipeptídica
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Ironicamente, as mesmas propriedades que fazem com que essas ligações sejam tão úteis nos biopolímeros, também podem ser problemáticas. Ex.: 1) mutações no DNA precisam ser identificadas e reparadas; 2) mRNA precisa ser hidrolisado para que a proteína codificada não seja sintetizada de forma desnecessária;
3) proteínas precisam ser degradadas nos seus aminoácidos correspondentes uma vez exercidass as suas funções.
Natureza utiliza enzimas denominadas de HIDROLASES E/OU NUCLEASES
=> HIDROLASES SINTÉTICAS
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Por que desenvolver hidrolases sintéticas – metalonucleases ?
1) Gerar moléculas capazes de clivar o DNA em sítios específicos não reconhecidos por enzimas de restrição; Possíveis novas drogas.
2) Utilização no sequenciamento do genoma; endonucleases que reconhecem 4, 6 ou 8 seqüências de bases resulta num grande no. de fragmentos – mais difícil de serem separados. Nas proteínas muitas vezes ocorre o oposto: peptidases naturais fornecem fragmentos os quais são muito grandes para o sequenciamento.
3) Utilização na análise conformacional de ácidos nucléicos e proteínas.
4) Elucidação do papel dos íons metálicos nas hidrolases naturais
5) Vantagem em relação a agentes que clivam o DNA através de processos oxidativos ( geração de radicais e não produzem fragmentos consistentes com aqueles produzidos pelas hidrolases naturais – 5’-fosfato e 3’-hidroxil).
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
ML
L
L
L
OH2
OH2
Complexos Mononucleares
ML
OH2
L
L
L
OH2
Estratégia Utilizada - Hidrolase Sintética (íon metálico no sítio cataliticamente ativo)
Sítios lábeis cis-orientados
Reduzir pKa da H2O coordenada
(fornecer nucleófilo em pH neutro)
Ativar o substrato e/ou estabilizar o
estado de transição
Liberar produtos a umavelocidade razoável
M M
L2L2
L
OH
ponte
OH2
L
L1
L
ponte
Complexos binucleares
1
21
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Complexos MononuclearesComplexos Mononucleares
R-NH2 + R'-CO
HCH3OH/3hs
0 0C
R-N=CH-R' CH3OH
[H2/Pd/C]R-NH-CH-R'
** SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. Acta Crystallographica Section C, v. C57, 356-358, 2001.
* SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. J. Chem. Soc.,Dalton Trans., v. 18, 2616-2623, 2001.
HN N
N
N
N
CH3
HISMIMI*
N
N
CH3
HN N
NH
HISMIMA**
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Complexo 1
Complexo 2
H3C CuCl
NN
NN
NH
Cl
H
Cl1'
C15'C7'
C9'
N14'
N8'
C10'
C13'
N11'
C12'
Cu1'
C6'
C5'
N1'
C4'
C2'N3'
Cl2'
Cl2
N3
C4
C2
C5
N1
Cl1
C6
Cu1
C7
N8
N11
C9
C10
C12
N14
C13
C15
Cu(1)-N(1)1,9596(19)Cu(1)-N(11)1,9872(19)Cu(1)-N(8) 2,096(2)Cu(1)-Cl(2)2,2882(11)Cu(1)-Cl(1)2,5789(10)N(8)-C(9) 1,268(3)
Cl(2)-Cu(1)-Cl(1) 103,22(4)
(= 0,14)
Cu(1)-N(11)1,9540(19)Cu(1)-N(1)1,9662(18)Cu(1)-N(8)2,0784(17)Cu(1)-Cl(1)2,2875(8)Cu(1)-Cl(2)2,9242(11)
Cl(1)-Cu(1)-Cl(2) 100,23(4)( = 0,03)
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Titulação potenciométricaTitulação potenciométrica
LCu – (OH2)2 LCu –(OH2)(OH ) + H +
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
-Log[H+]
Cu
N
N OH2
N
OH2
Cu
N
N OH
N
OH2
Complexo 1
pKa 8,94
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
-Log[H+]
Cu
N
N OH2
N
OH2
Cu
N
N OH
N
OH2
Complexo 2
pKa 9,30
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Voltametria Cíclica: Complexo 1Voltametria Cíclica: Complexo 1
CH3OH (pHap = 9): -1,207 V vs Fc+/Fc
800 600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000 -1200
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5 CuII/Cu
IFc+/Fc
I (A)
E (mV)
CH2Cl2
1000 500 0 -500 -1000 -1500-100
-50
0
50
100
150
200
250
CuIICu
II/Cu
IICu
I
CuII/Cu
I
Fc+/Fc
I (A)
E (mV)
CH3OH
1000 500 0 -500 -1000 -1500
-50
0
50
100
150Cu
IICu
II/Cu
IICu
I
Fc+/Fc
I (A)
E (mV)
CH3OH (pHap = 9)
CH2Cl2: -0,676 V vs Fc+/Fc
CH3OH: -0,553/-1,263 V vs Fc+/Fc
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
RPE: complexos de CuRPE: complexos de CuIIII sete linhas:
g 4,3 e A// = 82 x 10-4 cm-
1 Complexo 1: etanol/H2O
2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
Inte
nsid
ade
Campo (G)
1000 1200 1400 1600 1800 2000-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
inte
nsid
ade
campo (G)
g// = 2,240g = 2,062
A// = 164,5
estado tripleteinteração entre dois
centros de CuII
transição proibida Ms = 2
transições permitidas Ms= 1
g1 = 1,950
Equilíbrio dímero-monômero
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Síntese do complexo binuclearSíntese do complexo binuclear
M = 304 -1.cm2. mol-1 em CH3CN (2:1)
Cu2C20H32N10O10Cl2. 1/2 CH3CN (M = 791,04 g.mol-1)
C, 31,88(32,12) H, 4,27(4,12)
N, 18,89 (18,04)
IV (KBr): (OH) 3616/3539; (NHar) 3242; (NHsec) 3125; (CHar/CHalif)
2949-2864; (C=N/C=C) 1619-1428; (ClO4) 1091; (CHar) 749 em cm-1.
0
10
20
30
40
50
60
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
% T
[Cu(CH3CN)4]ClO4 + HISMIMA 1) CH3CN / CH3OH / argônio
2) O2 / sopropanolH
H .(ClO4-)2 H3C Cu
Cl
NN
NN
N
Cl
HH2O / pH 9,3 / NaClO4.H2O
2+
H3C Cu
NN
N N
NH
Cu
NN
NN
CH3
NH
O
O
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Magnetoquímica do complexo binuclear sólidoMagnetoquímica do complexo binuclear sólido
Dependente:* Ângulo CuO\Cu
* distânciaentre centros de CuII
0 50 100 150 200 250 300
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000c:/Origin50/simi.opj - Marciela dimero Cu-imina
eff
(2K) = 1.06 BM
eff (300K) = 3.04 BM
J = -13 cm-1 g = 2.0
par = 20 % TIP = 1020 x 10-6 cm
3/mol
C = -140 K I = -0.3 KR = 1.260
1
6
B C
[ 1
0-6 c
m3 /m
ol ]
Temperature (K)
0 50 100 150 200 250 300
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
eff (
BM
)
D E
J = -13 cm-1 Acoplamento antiferro
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Reatividade frente a um substrato modeloReatividade frente a um substrato modelo
Complexos1 e 2
O
NO2
NO2
P
O
OO
NO2
O2N -
+ catalisador
O
NO2
NO2
-
++ catalisador 2,4-dinitrofenilosfato
• Hidrólise 2,4-BDNPP
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Complexo 1
7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,01
2
3
4
5
6
7
k obs (
x105 .s
-1)
pH
8,78 0,05(8,94)
Efeito do pHEfeito do pH
Complexo 2
7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
k obs(x1
05 .s-1)
pH
9,38 0,02(9,30)
[Cu(L)(H[Cu(L)(H22O)O)22] ] [Cu(L)(H [Cu(L)(H22O)(OH)]O)(OH)]++ + H + H++
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Efeito da concentração do complexoEfeito da concentração do complexo
k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)
(6,67 0,17) x 10-4
k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)(3,07 0,35) x 10-4
Complexo 1
0 10 20 30 40 50 60 70 800
1
2
3
4
5
[complexo] (x 10 3.mol.L-1)
k obs
(x 1
05 .s-1)
k obs
(x 1
05 .s-1)
[complexo]1/2
(x 103.mol
1/2.L
-1/2)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
3
4
5
Complexo 2
20 30 40 50 60 70 80 90 100 1101,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
k obs
(x 1
05 .s-1)
[complexo] (x 10 3.mol.L-1)
k obs
(x 1
05 .s-1)
[complexo]1/2
(x 103.mol
1/2.L
-1/2)
0 2 4 6 8 100
1
2
3
4
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Efeito da concentração do complexoEfeito da concentração do complexo
Complexo Kf (mol-1.L) k (s-1)
1 11,9 x 103 5,7 x 10-6
2 12,8 x 103 4,3 x 10-6
LCu + -OPO(OR)(OR´) K2
LCu-OPO(OR)(OR´)
LCu-OPO(OR)(OR´)k3 -OR + 2-OPO2(OR´)
5,0])[2(5,0(][ Tf CuKLCu
]2
])[2(5,0(.[
][5,0
f
Tf
K
CuKk
dt
ORdv
´)])((.[. 32 OROROPOkKk
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Efeito da concentração do substratoEfeito da concentração do substrato
Complexo 2
0 1 2 3 4 5 6 7 80
1
2
3
4
5
6
1/v 0(
mol
-1.L
.s)
1/[2,4-BDNPP] (mol-1.L)
v 0(x1
09 .mol
.L-1.s
-1)
[2,4-BDNPP] (x103.mol.L
-1)
100 200 300 400 500 600 700 800 9001,50E+008
2,00E+008
2,50E+008
3,00E+008
3,50E+008
4,00E+008
4,50E+008
5,00E+008
Complexo 1
0 1 2 3 4 5 6 7 80
1
2
3
4
5
1/v
0(m
ol-1.L
.s)
1/[2,4-BDNPP] (mol-1.L)
v 0(x1
09 .mo
l.L-1.s
-1)
[2,4-BDNPP] (x103.mol.L
-1)
100 200 300 400 500 600 700 800
2,00E+008
3,00E+008
4,00E+008
5,00E+008
6,00E+008
7,00E+008
8,00E+008
9,00E+008
Complexo Vmax(mol.L-1.s-1) KM (mol.L-1) kcat(s-1) Kass(mol-1.L)a
taxab
1 16,4x10-9 17,3x10-3 3,28 x10-4 57,8 121 2 7,2x10-9 3,03x10-3 1,40x10-4 330,0 51,9
a Kass = 1/KM; btaxa = kcat/ke, onde ke = 2,7x10-6 s-1 a 50 0C (hidrólise da reação espontânea)
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Mecanismo Proposto para (1)Mecanismo Proposto para (1)
Kf
H3C Cu
NN
NN
N
OH2
OH
+
H3C CuCl
NN
NN
N
Cl
H
H2O K1
H3CCu
NN
N N
N
OH
O
P O
NO2
NO2OO
O2N
O2N
K2
O
O P- NO2
O2N
O
O
O2N
NO2
K3
NO2
NO2
O-
H3C CuOH2
NN
NN
N
OH2
H
2+
HH H
H
H
H
H
2+H
H3C Cu
NN
N N
NH
O
OH
H
Cu
NN
H
NN
CH3
N
(a) (b)
(c)
(d)
(e)
H H
H3CCu
NN
N N
N
OP
O
O
NO2
NO2
O
(f)
Neves, Scarpellini, HörnerTerenzi, Inorg. chem.2003, Submetido
H3C CuCl
NN
NN
N
ClH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Micrografia Eletrônica das formas do DNA plasmidial
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNApelo complexo mononuclear (1)pelo complexo mononuclear (1)
H3C CuOH2
NN
NN
N
OH2
H
1 2 3 4
Degradação do DNA Genômico – pH = 8,0
2) 91,56 % da banda de maior peso molecular com: 8,50 % de degradação;- 3) 11,99 % da banda de maior peso molecular com: 88,01 % de degradação;- 4) 4,13 % da banda de maior peso molecular com: 95,87 % de degradação.
Complexo 1
0,00 0,375 1,250 3,750 mM de 1
Neves, Scarpellini, HörnerTerenzi, Inorg. Chem.2003, in press
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu
OH2
NN
NN
N
OH2
H
Degradação do DNA Plasmidial pBSKII – pH = 8,0
Complexo (1)
1) 0,375 mM do complexo: 87,00 % da forma I e 13,00 % de degradação F II;2) 0,750 mM do complexo: 86,74 % da forma I e 13,26 % 3) 1,250 mM do complexo: 85,31 % da forma I e 14,65 % “4) 1,880 mM do complexo: 84,69 % da forma I e 15,31 % “5) 0,000 mM do complexo:
II circular
I superenovelada
1 2 3 4 5
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu
OH2
NN
NN
N
OH2
H
Complexo 1
Determinação do mecanismo: Complexo em [1] = 1,88 mM
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1) 0 mM do complexo
2) 1,88 mM do complexo
3) 1,22 M de Ce4+ (é só Ce4+ no DNA)
4) 1,22 M de Ce4+ + 1,88 mM do complexo.
Seguindo a seqüência, 5,6,7,8 temos DMSO 0,04 M e 9,10, 11, tiouréia 0,04mM.
I
II
Não houve nenhuma inibição na degradação Não houve nenhuma inibição na degradação mecanismo hidrolítico mecanismo hidrolítico
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu
OH2
NN
NN
N
OH2
H
Complexo 1Reação na ausência de O2: Complexo em [1] = 1,88 mM- Não houve inibição na degradação
Banda 1 – Padrão DNABanda 2 – DNA cortado com a EcoRI (enzima de restrição da Escherichia coli)Banda 3 – Adição da T4DNA ligase ( religação)Banda 4 – T4DNA ligase + Complexo + DNA + EcoRIBanda 5 – Complexo + DNA Banda 6 - Complexo + DNA + T4DNA ligase
Religação através da T4DNA ligase - 5’-fosfato e 3’-hidroxil
Não houve religação (ver banda 6). Porém, vemos na banda 4 que o complexo atua na ligase
1 2 3 4 5 6 7FI
FIIIFII
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu
OH2
NN
NN
N
OH2
H
Complexo 1
Degradação do DNA plasmidial em diferentes pHs a 50 oC, [1] = 1,88 mM, durante 24 h
pH 7.0 7,5 8,0 8,5 9,3
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
1 = complexo2 = padrão
pHs e tampões
Tris pH 7,0
Tris pH 7,5
Tris pH 8,0
Tris pH 8,5
CHES pH 9,3
% da forma I
85,53 36,40 26,81 6,96 1,44
% de degrada-ção da forma I
14,67
63,60
73,19
93,04
98,56
pKa = 8,94
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Anaerobic x aerobic plasmid DNA cleavage. Lanes 1-3, anaerobic conditions; Lanes 4-6. aerobic conditions; Lanes 1 and 4, control plasmid DNA; Lanes 2 and 5, plasmid DNA, 0.1mM Fe(EDTA)2-, 10mM DTT;
Lanes 3 and 6, plasmid DNA, 3.75mM complex 1. All samples were incubated in 100mM CHES buffer pH 9.30 for 4h at 50 °C. Above the image of the gel is shown a histogram of the quantified plasmid DNA
forms observed in the gel.
1 2 3 4 5 60
20
40
60
80
100
Pla
sm
id D
NA
%
F I F II
F II
F I
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
. Kinetic analysis of complex 1 DNA cleavage activity. Plasmid DNA (pBSKII. 4 mM phosphodiester links) and 2 mM Complex 1 were incubated at pH 9.3 (200 mM CHES).
50 C for 0, 2, 4, 6, 8 or 24 h (lanes 1 to 6. respectively).
F II
F I
1 2 3 4 5 6
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu
OH2
NN
NN
N
OH2
H
Complexo 1Determinação do mecanismo: Cinética em gel-agaroseComplexo em [1] = 2,11 mM, Tampão CHES pH 9,3;[DNA: pBSKII] em excesso com 2, 6, 10 ligações fosfato: uma de complexo
y = (y0 – const) exp(-kobsx) + const
y = (100 – y0)(1- exp(-kobsx))
kobs’= Vmax’[cat]/(KM + [cat])
kobs = Vmax[subst]/(KM + [subst])
kobs = 0,0016 min-1
T1/2 = 384 min
Fator catalítico de ~10Fator catalítico de ~1077
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
kobs
Tempo (minutos)
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Fosfatases (hidrolases) e nucleases catalisam a hidrólise de ésteres de fosfato de aminoácidos fosforilados e sacarídeos, nucleotídeos, DNA e RNA, envolvendo a quebra da ligação P-O sob condições fisiológicas em vitro.
Estrutura cristalina da fosfatase ácida púrpura de Fe(III)Zn(II).(STRÄTER, N. et al. Science 1995, 268, 1489)
His 325His 323
OH
His 286
FeZn
OH
H2O
Asn 201
Asp 164
Asp 135
Tir 167
Degradação de eritrócitos
Fonte de radicais hidroxila – degradação óssea
Liberação de fosfato de compostos organofosforados
Em vivo se propõe:
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Estrutura tridimensional da FeIIIZnII - PAP
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Espectros mostrando a interconversão da forma púrpura (Fe2III, 550
nm) na forma rosa (FeIIIFeII, 505 nm) da UFPAP.
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Espectros de EPR em vários valores de pH e gráfico do % da espécie em baixo pH versus pH para a forma de valência mista da bsPAP.
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Espectros Mössbauer da forma ativa a 185 K (A) e inativa a 10 K(B) da UFPAP.
• Parâmetros Mössbauer
(mm/s) Eq(mm/s)
FeIIFeIII 1.22 2.86
0.52 1.83
FeIIIFeIII 0.46 2.12
0.55 1.65
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Mecanismo proposto para as PAPs na hidrólise de ésteres de fosfato:
(GANI, D., WILKIE, J. Structure and Bonding 1997, 89, 133)
Enz
M Fe2+ 3+
H2O OH
ROPO3H-
-H2O
-ROH
OHO
O OP
--
+H2O
- OH
3+2+ FeM
Enz
OHP
O
O OH
- H2PO4-
+ H2O
OH
3+2+ FeM
Enz
O
PRO
O
OH
3+2+ FeM
Enz
Existem dois mecanismos alternativos propostos por Que e Averill
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Mecanismo proposto por Lindqvist e colaboradores para a hidrólise de ésteres de fosfato promovida pelas PAPs.
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAComplexo binuclear de Fe(III)Complexo binuclear de Fe(III)
N
N
O
O
C l
N
N
O
Fe
O
FeOH2
C l
H2O
Cl
O3W
O1
O2
N1'
Fe
N21'
N21
Fe'N1
O2'
O1'
O3W'
Cl'
[Fe2(BPClNOL)2(H2O)2]2+ [Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+
[Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+ [Fe2(BPClNOL)2(OH)2]
[Fe2(BPClNOL)2(OH)2] [Fe2(BPClNOL)2(OH)3]-
pKa = 5.00
pKa = 7.03
pKa = 9.65
Complexo 6
NOH
Cl
N
OH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA
Degradação do DNA Plasmidial pBSKII
N
N
O
O
C l
N
N
O
Fe
O
FeOH2
C l
H2O
0 3 7 5 M p H 6 .1
p H 8 .0
I
I I
I I I
I I
I I I
I
Buffer pH 6.1
020
4060
80100
0 75 150 250 375
Com plex concentration
plas
mid
form
(%)
I
II
III
total cleavage (%)
Buffer pH 8.0
020
4060
80100
0 75 150 250 375
Com plex concentration
plas
mid
form
(%)
I
II
III
total cleavage (%)
Complexo 6
Neves e TerenziInor. Chem.Commun.4 (2001)388-391.
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Mecanismo PropostoMecanismo Proposto
- O complexo 6 não reage com diésteres de fosfato devido à configuração-anti das moléculas de H2O
N
N
O
O
C l
N
N
O
Fe
O
FeOH2
C l
H2O
Complexo 6
- O acesso de 1 ao DNA é proposto com base nas interações eletrostática e hidrofóbica (sais de FeIII não degradam o DNA)
-A largura (11,7 Å) e profundidade (8,8 Å do sulco maior no B-DNA dupla-fita pode facilmente acomodar o complexo 1 no qual as duas moléculas de água/OH-
estão separadas por 7,7 Å. Isto também explica a maior atividade hidrolítica em pH 8 (2 grupos OH-).
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
N
N
O
O
C l
N
N
O
Fe
O
FeOH2
C l
H2O
Complexo 6
Mecanismo PropostoMecanismo Proposto
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
MetodologiaMetodologia
Síntese do ligante H2BPBPMP
CH3
OH OCl
CH3
OH
Reimer-Tiemann
NaOH/CHCl3/H2O
CH3
OH O
HCHO
HCl
CH3
OH
N
N
N
OH
SOCl2
CH3
OH
N
N
N
Cl
NH
N
HO
CH3
OHO
N
N
N
N
NH
2
NaBH4
CH3
OH
N
N
N
OH
N
N
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
C44
C45
C43
C74
C46
N42
C73
C26
C20
O72
C41
C25
C2
O71
C21
C53
C54
N1
C11
C24
Zn1
C16
N52
C40
C22
O1
C55
C12
C23
C30
Fe1
C15
O20
C51
C5
N4
C56
C13
C14
O62
C50
C31
O61
C3
N32
C63
C36
C33
C64
C35
C34
Fe(1)-O(20) 1.890(3)
Fe(1)-O(61) 1.967(3)
Fe(1)-O(1) 2.006(3)
Fe(1)-O(71) 2.034(3)
Fe(1)-N(32) 2.182(4)
Fe(1)-N(1) 2.214(3)
Fe(1)-Zn(1) 3.490(10)
Zn(1)-O(72) 2.030(3)
Zn(1)-O(1) 2.105(3)
Zn(1)-O(62) 2.137(3)
Zn(1)-N(52) 2.142(4)
Zn(1)-N(4) 2.185(4)
Zn(1)-N(42) 2.190(4)
Novas Hidrolases Sintéticas FeZnNovas Hidrolases Sintéticas FeZn
Fe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Titulação espectrofotométrica – espécies em solução300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
A
nm
300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
nm
300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
nm
pH 4,3-5,6 pH 5,6-7,2
pH 7,2-10,0
300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
nm
Fe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OHTitulação EspectrofotométricaTitulação Espectrofotométrica
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Fe
O
Zn
OH2
NN
N
NNO O O
OH
Distribuição das Espécies a partir da Distribuição das Espécies a partir da Titulação EspectrofotométricaTitulação Espectrofotométrica
Fe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OH
pKa = 4,86 pKa = 6,00 pKa = 7,22
Fe
O
Zn
OH
NN
N
NNO OH
OH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
FeO
MO O
O O
FeO
MO
OH OH2H
FeO
M
OH OH2
OH2
FeO
MO O
OH2 OH2
FeO
MO O
OH OH2
FeO
MO
OH OHH
pKa1
pKa2pKa3
III IIIII III
IIIIIIIII
II II
II II II
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Velocidade inicial (vo) em função do pH. Solvente água/acetonitrila 50%, tampões MES, HEPES e CHES 25 mM, LiClO4 0,1 M, [Complexo] = 4,0.10-5 M e [substrato] = 2,0.10-3 M.
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
v 0(.1
09 ) m
ol-1
.L.s
-1
pH
pKa1= 4,63 pKa2 = 7,84
Fe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OHCinética de Hidrólise do 2,4-BDNPPCinética de Hidrólise do 2,4-BDNPPEfeito do pH (pKa cinético)Efeito do pH (pKa cinético)
Neves et al. Inorg. Chem. 2002, 41, 5643
pKa1 = 4.86 pKa2 = 7.22 Potenciométrico
O
NO2
NO2
P
O
OO
NO2
O2N -
+ catalisador
O
NO2
NO2
-
+catalisador + PO43-2
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,0100,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
V0
(x10
8 ) m
ol.L
-1.s
-1
[S] (x103) mol.L
-1
0 500 1000 1500 20000
1
2
3
4
5
6
1 / V
0 (x
10-8)
mol
-1.L
.s
1 / [S] (x103) mol
-1.L
VVmáxmáx = 2,92.10 = 2,92.10-8-8 mol.L mol.L-1-1.s.s-1-1
KKmm = 8,10.10 = 8,10.10-3-3 mol.L mol.L-1 -1 kkcatcat = 7,31.10 = 7,31.10-4-4 s s-1-1
(k(khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 1,8.10 = 1,8.10-7-7 s s-1-1 a 25 a 25ooCC
Fe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OHCinética de Hidrólise em Função da Cinética de Hidrólise em Função da Concentração do 2,4-BDNPPConcentração do 2,4-BDNPP
Velocidade inicial (vo) em função da conc. de substrato. Solvente água/acetonitrila 50%, MÊS 25 mM, LiClO4 0,1 M, [Complexo] = 4,0.10-5 M e [substrato] = 0,5 a 9,0 x 10-3 M, T = 25 oC. kkcatcat/k/khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 4061 = 4061
KKassass = 123 mol.L = 123 mol.L-1-1
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
H2O / EtOHO
Fe ZnAc
Ac
III IIO
Fe ZnAc
OH2 OH2
III II
pKa1 = 4.86
O
Fe ZnAc
OH OH2
III IIpKa2 = 6.0O
Fe ZnOH
OH OH2
III IIpKa2 = 7.22O
Fe ZnOH
OH OH
III II
(RO)2PO2-
III II
+NO2
O2N
O
PO
OR
OR
O
Fe ZnX
HO
-ORR =
III II
O
O
Fe ZnX
OP
ORO
PO3-(O-R)2-
H2O/OH
(4,63 cinético)
(7,84 cinético)
Mecanismo PropostoMecanismo PropostoFe
O
ZnO
OH2
NNN
NNO H
OH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
C52
C53
C51
C54
N5
C55
O3
O4
O2
C42
C41Zn
C43
Fe
C56
N3
C31
C46
C36
C32
C47
C35 C44
N1 O1C45
C33
C34 C21
N4
N2
C19
C14
C22
C18
C13
C25
C15
C26
C23
C12
C24
C16
C11
C17
1 H2L1 + 1 ZnII(ClO4)2 + 1 FeIII(ClO4)3 + 3 NaOH 2+
3+
Zn
N
N
NOH
O
CH3
Fe
N
N
OH2
O
2+(ClO4
-)2
FeIII....ZnII = 3,05 Å – 3,1 Å na enzima
Primeiro exemplo de complexo FeIII-OH-ZnII
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,00
20
40
60
80
100
pKa2pKa1
CBA
%
-Log[H+
]
FeO
MO
OH2 OH2H
FeO
MO
OH OH2H
FeO
MO
OH OHH
pKa1 pKa2III II II IIIII III
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Eletroquímica
600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
I (
A)
E (mV)
E1/2 (pH = 4,0) = - 0,06 V vs NHE
E1/2 (pH = 6,3) = - 0,18 V vs NHE
[FeIIIZnIIL1(OH)(H2O)](ClO4)2
H2O pH = 4,0 - 6,3
(H2O)Fe(OH)Zn(H2O) (HO)Fe(OH)Zn(H2O)
pK = 4,7 comparável aos pKas cinético e termod.
de 4.66.
46
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
FeIII....ZnII = 3.05 Å – 3.1 Å na enzima
His 325His 323
OH
His 286
FeZn
OH
H2O
Asn 201
Asp 164
Asp 135
Tir 167
2+3+
Zn
N
N
NOH
O
CH3
Fe
N
N
OH2
O
2+(ClO4
-)2
OH2
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
B
V0
x 10
9 (m
ol.L
-1
.s-1
)
pH
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,0100,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
1 / [S]
(1 /
V0 )
x 1
0-8
V0
x 10
8 (m
ol.L
-1
.s-1
)
[S] (mol.L-1
)
0 200 400 600 800 10000,0
1,0
2,0
3,0
Efeito isotópico do deutério kH / kD = 0,93
kkcatcat/k/khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 10 = 1044
KKassass = 62.5 mol.L = 62.5 mol.L-1-1
No. de turnovers = 180No. de turnovers = 180
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Zn
N
Fe
NO
N
O
N
NOH
O OP
O O
NO2O2N
III II
Zn
N
Fe
NO
N
O
N
NO
OHH
OH2
2,4-dinitrofenolato
BDNPP
Zn
N
Fe
NO
N
O
N
NO
OHH
P
O
O
O
NO2
O
NO2O2N
O2N
BDNPP
2,4-dinitrofenilfosfato(monoéster)
III
III
II
II
Mecanismo Proposto em função dos dados experimetais
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N S
Figure X. Cleavage profile of plasmid DNA in the presence of increasing concentrations of complex 1. Complex 1 concentration (M) varied from 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5,
and 0 (lanes 1 to 9, respectively). Nicked (N) and supercoiled (S) plasmid DNA are depicted in the figure. Lane 10, 11, 12, 160 M complex 1 in the presence of 20%
glycerol (lane 10), 20% DMSO (lane 11) or control buffer (lane 12).
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH.
Reação de FentonFe
O
CuO
N
N
NNO
N
OH2H
OH
Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Prof. Dr. Hernán Terenzi – Dpto. Bioquímica – UFSCProf. Dr. Wilson Ortiz – Dpto. Física – UFSCarProf. Dr. Antônio S. Mangrich - UFPRProf. Dr. Valderes Drago – Dpto. Física – UFSCDra. Marciela Scarpellini (USA)Dra. Liane Márcia Rossi”(USA)Dr. Adolfo Horn Jr. (UENF – RJ)Dr. Mauricio Lanznaster (Detroit – USA)Dra. Rosmari Hörner (Santa Maria _UFSM)MSc. René Nome – USA – ChicagoDra. Christine Fernandes – UFRJ
AgradecimentosAgradecimentos
NicholasAdemir “Piu”AlessandraRicardoRosely PeraltaAnnelliseRafaelPatriciaMaurícioIvanRenata