UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA

Fundada em 18 de Fevereiro de 1808

Monografia

Identificação de células hepáticas progenitoras em hepatocolângio carcinomas

e em carcinomas hepatocelulares puros

Luiza Barbosa Oliveira

Salvador (Bahia)

2012

II

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA

Fundada em 18 de Fevereiro de 1808

Identificação de células hepáticas progenitoras em hepatocolângio carcinomas

e em carcinomas hepatocelulares puros

Luiza Barbosa Oliveira

Professor-orientador: Luiz Antonio Rodrigues de Freitas

Monografia de conclusão do curso médico da Faculdade de Medicina da Bahia (FMB) da Universidade Federal da Bahia (UFBA), apresentada ao Colegiado do Curso de Graduação em Medicina da FMB-UFBA.

Salvador (Bahia)

2012

III

Monografia: Identificação de células hepáticas progenitoras em hepatocolângio carcinomas e em carcinomas hepatocelulares puros

Luiza Barbosa Oliveira Professor-orientador: Luiz Antonio Rodrigues de Freitas

Co-orientadora: Juliana Ribeiro de Freitas COMISSÃO EXAMINADORA

Membros Titulares: • Luiz Antonio Rodrigues de Freitas, Professor da FMB-UFBA.

• Daniel Athanazio, Professor da FMB-UFBA.

• Helma Cotrim, Professora da FMB-UFBA.

TERMO DE REGISTRO ACADÊMICO:

Monografia aprovada pela Comissão, e julgada

apta à apresentação pública no III Seminário

Estudantil da Faculdade de Medicina da Bahia,

com posterior homologação do registro final do

conceito (apto ou não apto), pela coordenação do

Núcleo de Formação Científica. Chefia do

Departamento de Patologia e Medicina Legal.

Salvador (Bahia)

2012

IV

Todos estão loucos, neste mundo? Porque a

cabeça da gente é uma só, e as coisas que há e

que estão para haver são demais de muitas, muito

maiores, diferentes, e a gente tem de necessitar de

aumentar a cabeça, para o total.

(João Guimarães Rosa)

V

EQUIPE

• Luiza Barbosa Oliveira, Estudante de Medicina da FMB-UFBA;

• Luiz Antonio Rodrigues de Freitas, Professor da FMB-UFBA;

• Juliana Ribeiro de Freitas, Professora da FMB-UFBA;

• Cathya Boechat, bióloga formada pela UCSAL.

VI

INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA • Faculdade de Medicina da Bahia

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

• Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DA BAHIA

VII

FONTES DE FINANCIAMENTO

1. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB); 2. Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz; 3. Laboratório de Anatomia Patológica IMAGEPAT.

VIII

Meus agradecimentos a Dr. Luiz Freitas e Dra.

Juliana Freitas, pelos ensinamentos e

oportunidades gerados ao longo desses dois anos,

e a Cathya Boechat, sem a qual a execução desse

trabalho não seria possível.

1

ÍNDICE

I. RESUMO 3

II. OBJETIVOS 4

III. INTRODUÇÃO 5

IV. MATERIAIS E MÉTODOS 9

V. RESULTADOS 11

V.1. Características histopatológicas dos hepatocolângio carcinomas 11

V.2. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos hepatocolângio

carcinomas 12

V.3. Características histopatológicas dos carcinomas hepatocelulares 12

V.4. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos carcinomas

hepatocelulares

12

VI. DISCUSSÃO 14

VII. CONCLUSÕES 17

VIII. PERSPECTIVAS 18

IX. ANEXOS 19

IX.1. Tabelas 19

IX.2. Figuras 20

2

IX.3. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisas 36

3

I. RESUMO

IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS HEPÁTICAS PROGENITORAS EM

HEPATOCOLÂNGIO CARCINOMAS E EM CARCINOMAS HEPATOCEL ULARES

PUROS. O câncer de fígado é, no mundo, o quinto mais comum em homens e o nono em

mulheres. Trata-se de uma neoplasia maligna altamente agressiva, com taxa de sobrevida em

cinco anos de apenas 8,9%. Podem-se destacar dois tipos principais de câncer primário de

fígado: o carcinoma hepatocelular e o colangiocarcinoma. Uma terceira categoria de neoplasia

maligna hepática é o chamado hepatocolângio carcinoma que, como o próprio nome sugere,

mostra aspectos dos dois tipos de tumores. A caracterização de uma neoplasia maligna

contendo elementos de duas linhagens celulares hepáticas reforça a implicação de uma célula

hepática progenitora bipotencial na origem do câncer de fígado. Essa célula pode ser

reconhecida através de suas características morfológicas e perfil imuno-histoquímico típico. O

presente estudo identificou células com características de células precursoras hepáticas em

todos os casos de uma série de 4 hepatocolângio carcinomas e 4 carcinomas hepatocelulares

puros. A presença de células com perfil “progenitor” em neoplasias primárias do fígado pode

contribuir na compreensão da histogênese desses tumores, trazendo subsídios para o

desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Além disso, é importante para a sua

classificação, uma vez que constitui possível fator prognóstico.

Palavras-chaves: 1. Hepatoma; 2. Colangiocarcinoma; 3. Colangiohepatoma.

4

II. OBJETIVOS

Principal: verificar a presença de células hepáticas progenitoras em uma série de quatro casos

de hepatocolângio carcinomas e quatro casos de carcinomas hepatocelulares puros.

Secundários:

1. Analisar as características anatomopatológicas desses tumores, através da revisão de

lâminas coradas com hematoxilina e eosina;

2. Acessar o perfil imuno-histoquímico desses dois tipos de neoplasia.

5

III. INTRODUÇÃO

O câncer primário de fígado (CPF) é o quinto mais comum em homens e o nono em

mulheres. A Sociedade Americana do Câncer (American Cancer Society) estima que, em

2007, ocorreram 711.000 novos casos ao redor do mundo [1], que se distribuem

geograficamente de forma heterogênea. A maioria dos casos ocorre na região da África

subsaariana e da Ásia oriental, consideradas áreas de alta incidência (taxa de incidência

ajustada por idade – ASIR – em homens maior que 20/100.000). América do Norte, América

do Sul e Oceania são consideradas áreas de baixa incidência (ASIR menor que 6,0/100.000),

enquanto países mediterrâneos da Europa, como Espanha, Itália e Grécia são áreas de

incidência intermediária (ASIR de 15 a 20/100.000) [2]. No Brasil, as taxas de incidência

padronizadas por idade para câncer do fígado e das vias biliares intra-hepáticas variam de

1,76 (Jaú) a 11,96 (Porto Alegre), segundo dados divulgados pelo Instituto Nacional do

Câncer (INCA). Salvador possui um ASIR de 6,60, o terceiro maior do país segundo mesma

fonte [3].

O CPF é uma neoplasia altamente agressiva, com taxa de sobrevida em cinco anos de

apenas 8,9% [1]. A situação era ainda mais grave quando os tumores só eram detectados em

estágios avançados. O aprimoramento das técnicas de imagens possibilitou a detecção precoce

e o acompanhamento de nódulos suspeitos de malignização em pacientes diagnosticados com

cirrose hepática de etiologias diversas, o que foi fundamental para melhorar o prognóstico da

doença.

Destacam-se dois tipos principais de câncer primário de fígado: o carcinoma

hepatocelular (CHC) e o colangiocarcinoma (CC).

O carcinoma hepatocelular, constituído por hepatócitos neoplásicos, é o tipo

histológico mais comum de câncer primário de fígado, correspondendo a 70% a 85% dos

casos [1]. Ocorre frequentemente associado à doença crônica do fígado e cirrose [4]. As

principais causas de cirrose em pacientes com CHC incluem hepatite B, hepatite C, doença

alcoólica do fígado e esteato-hepatite não-alcóolica, sendo o vírus B da hepatite (VHB) a

causa isolada mais comum de CHC. Embora a maioria dos casos de carcinoma hepatocelular

relacionados ao vírus B se desenvolva em pacientes com cirrose estabelecida, o VHB é causa

6

notória de CHC na ausência de cirrose. Já o risco de carcinoma hepatocelular causado pelo

vírus C da hepatite está relacionado a uma infecção crônica com consequente

desencadeamento de fibrose e eventualmente cirrose [5].

A Organização Mundial de Saúde (OMS) reconhece quatro padrões arquiteturais do

CHC: trabecular, pseudoglandular e acinar, compacto e esquirroso. O padrão trabecular é

definido pelo crescimento das células neoplásicas em cordões de espessuras variadas que

lembram as traves hepáticas e são separados por espaços semelhantes a sinusóides. O padrão

pseudo-glandular é caracterizado pelo arranjo das células em estruturas acinares com eventual

produção de bile. O padrão compacto geralmente é produzido pela progressão do câncer,

quando os espaços entre as células se tornam cada vez mais imperceptíveis, dando ao tumor

uma aparência sólida. O padrão esquirroso é marcado por fibrose intensa e consequente

atrofia das trabéculas tumorais [6].

O colangiocarcinoma, por sua vez, é uma neoplasia que reproduz os aspectos

arquiteturais de dúctulos biliares. A OMS classifica os colangiocarcinomas de acordo com a

sua localização primária em intra ou extra-hepáticos. Essas duas entidades são diferentes em

aspectos epidemiológicos, clínicos e terapêuticos, sendo o colangiocarcinoma intra-hepático

(CCI) considerado uma neoplasia primária de fígado. A incidência do CCI varia

significantemente entre as diferentes partes do mundo. Na Tailândia e em outros países

orientais, por exemplo, esse tipo de tumor chega a ser predominante em relação ao carcinoma

hepatocelular, devido às altas taxas de infecção pelos vermes hepáticos Clonorchis sinensis e

Opistorchis viverrini. Na maioria dos países, entretanto, o CCI representa de 10 a 20% dos

casos de cânceres primários de fígado. É um tumor extremamente agressivo e frequentemente

aparece em um fígado sem doença prévia, embora possam ser identificadas algumas

condições de risco marcadamente aumentado, como colangite esclerosante primária [7].

A histologia dos colangiocarcinomas intra-hepáticos reproduz as características dos

adenocarcinomas. Há formação de estruturas glandulares de arquitetura tubular e/ou papilar,

contidas em um estroma fibroso que varia de escasso a abundante. A secreção de muco pode

ser demonstrada em alguns casos pela reação do PAS-diastase. Invasão perineural e de tratos

portais são outros aspectos importantes, marcadores de malignidade [6].

7

Uma terceira categoria de neoplasia epitelial maligna hepática é o chamado

hepatocolângio carcinoma (HCC) que, como o próprio nome sugere, mostra elementos do

carcinoma hepatocelular e do colangiocarcinoma. Morfologicamente, os dois aspectos destas

neoplasias podem coexistir na mesma área tumoral ou estarem separados por uma porção de

parênquima normal. Muitas vezes as lesões apresentam características intermediárias entre os

tipos CHC e CC, o que torna difícil o seu diagnóstico.

Allen e Lisa (Allen AR, Lisa JR; 1949) foram os primeiros a descrever esse tipo de

neoplasia e, baseados na diversidade de achados anatomopatológicos, propuseram sua

classificação em três subtipos [8]. Essa divisão foi revista e modificada por Goodman e

colaboradores (Goodman et al.; 1985), que alocam os tumores em três categorias: tipo I, áreas

separadas e aparentemente coincidentes de HCC e CC; tipo II, massas independentes de HCC

e CC separadas por uma área de transição contendo características de ambos os tipos de

tumores; e tipo III, constituídos inteiramente de áreas de transição com um misto de

componentes hepatocelular e colangiocelular [9]. A definição da OMS de tumor combinado

inclui elementos inequívocos de carcinoma hepatocelular e colangiocarcinoma intimamente

relacionados e exclui, portanto, os tumores do tipo I de Goodman et al. [6].

A presença de duas linhagens celulares (hepatocelular e colangiocelular) no

tumor misto reforça a implicação de uma célula hepática progenitora (CHP) na sua origem.

Células hepáticas progenitoras são células epiteliais bipotenciais, capazes de dar origem a

hepatócitos e colangiócitos. Primeiramente identificadas em fígados de roedores, elas foram

chamadas de células ovais por causa do seu fenótipo típico: células pequenas, indiferenciadas,

de formato oval, citoplasma escasso e alta relação núcleo-citoplasma. Células com

características semelhantes foram posteriormente identificadas em fígados de humanos e

receberam a denominação de CHPs [10].

No fígado adulto normal, CHPs são células quiescentes que apresentam baixo índice

de proliferação. Mesmo em condições de lesão hepática, são as células epiteliais maduras as

responsáveis pela regeneração do fígado. Células progenitoras são ativadas e desempenham

papel importante quando a capacidade de proliferação de hepatócitos e colangiócitos está

comprometida. Modelos de lesão hepática aguda em camundongos por agentes hepatotóxicos

que inibem a replicação de hepatócitos, como galactosamina-D e nitrosomorfolina-M,

8

mostram proliferação de células ovais próxima a áreas de necrose [11]. A desregulação dos

mecanismos de sinalização que controlam a proliferação e morte celular dessas células está

implicada na hepatocarcinogênese não só de tumores mistos, mas também de alguns subtipos

de tumores puros [12].

Marcadores imuno-histoquímicos podem ser utilizados para identificar linhagens de

células específicas em amostras de carcinoma hepático. HepPar1 e antígeno

carcinoembriogênico policlonal (CEAp) num padrão canalicular possuem boa sensibilidade

para a linhagem hepatocitária. Para a linhagem colangiolar são utilizadas com frequência as

citoqueratinas 7 e 19, que possuem boa sensibilidade e especificidade para o epitélio biliar

[13]. Diversos anticorpos foram propostos para a identificação de células progenitoras, com

ênfase para marcadores biliares (CK7 e CK19), marcadores de células tronco-hematopoiéticas

(c-kit), marcadores neuroendócrinos (cromogranina A e NCAM) e marcadores específicos

(OV-6) [13-14].

Tumores hepáticos combinados apresentam maior agressividade clínica que tumores

puros, com taxas de sobrevida em três, cinco e dez anos menores que as de CHC e CC [15-

16]. Por outro lado, carcinomas hepatocelulares podem expressar citoqueratinas do tipo biliar,

o que está relacionado a um curso clínico mais agressivo (pior sobrevida) e rápida recorrência

após tratamento cirúrgico. CHCs com essas características possuem padrão de expressão

gênica semelhante ao de células progenitoras [17]. Essas são evidências do papel

desempenhado pelas células precursoras na quimiorresistência dos tumores hepáticos.

A caracterização dos hepatocolângio carcinomas, assim como sua classificação,

embora tenham sido alvos de estudos nos últimos anos, ainda não estão bem estabelecidos. A

identificação de células com perfil de células precursoras nesse e em outros tipos de

neoplasias de fígado é fundamental para a compreensão da hepatocarcinogênese. Além disso,

pode ser a base para a classificação desses tumores, já que configura possível fator

prognóstico, com implicação no tratamento dos pacientes portadores. Uma vez estabelecidos

os mecanismos de progressão do câncer a partir dessa via, haverá subsídios para o

desenvolvimento de novos alvos terapêuticos.

9

IV. MATERIAIS E MÉTODOS

Foram avaliados 8 casos de tumores primários de fígado: 2 casos de hepatocolângio

carcinoma e 4 casos de carcinoma hepatocelular puro foram provenientes de explantes de

pacientes submetidos a transplante hepático em cirurgias realizadas pelo grupo da

Universidade Federal da Bahia (UFBA)/Hospital Português da Bahia no período de 2001 a

2010; 2 casos de hepatocolângio carcinoma foram diagnosticados em um laboratório privado

de anatomia patológica (Laboratório de Anatomia Patológica IMAGEPAT), sendo que em um

deles o material foi obtido através de biópsia de agulha e em outro através de biópsia em

cunha.

O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisas (CEP) do Centro de

Pesquisas Gonçalo Moniz (CPqGM), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e realizado no

Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção (LPBI) do mesmo local.

Dados demográficos dos pacientes como sexo, idade e etiologia da doença hepática

foram investigados nos relatórios de exames anátomo-patológicos.

Dados do exame macroscópico dos explantes e biópsias foram revistos também

através do relatório de exames anátomo-patológicos e fotografias das peças cirúrgicas. Foram

computados os seguintes dados: tumores únicos ou múltiplos, tamanho do tumor e invasão de

vasos hepáticos.

Todos os casos foram revistos através da observação ao microscópio de lâminas

coradas com hematoxilina e eosina. Além da avaliação de componente misto

colangio/hepatocelular da neoplasia, os tumores foram caracterizados histologicamente de

acordo com os padrões reconhecidos pela OMS.

A imuno-histoquímica foi realizada em todos os tumores com os seguintes anticorpos:

HepPar1 (Dako), CEAp (Dako), CK7 (Dako), CK19 (Dako), c-kit (Santa Cruz Corp., Santa

Cruz, CA, USA) e cromogranina A (Dako). O tecido foi cortado de blocos parafinizados. As

lâminas foram desparafinizadas em xilol e hidratadas em álcool absoluto, álcool a 95% e

álcool a 70%. Foi feita a recuperação dos epítopos com método de indução pelo calor, usando

10

solução de citrato (pH 6,0), em panela térmica, por 30 minutos, a 97°C. Peroxidases

endógenas foram bloqueadas com peróxido de hidrogênio a 3% diluído em metanol. As

lâminas permaneceram incubadas com anticorpo primário diluído com diluente Zymed, em

câmera úmida, na geladeira, a 4°C, overnight. Após lavagem com solução salina tamponada

com fosfato (PBS), pH 7,6, as secções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado

(Kit LSAB+, Dako). A reação foi então amplificada com STREPTOAVIDINA-HRP (Kit

LSAB+, Dako). A revelação foi feita com o cromógeno 3, 3’-diaminobenzidina (DAB) e a

contra-coloração com hematoxilina. Por fim, foi realizada a montagem das lâminas com

etellan.

11

V. RESULTADOS

V.1. Características histopatológicas dos hepatocolângio carcinomas

Todos os casos de hepatocolângio carcinoma incluídos no estudo pertenciam ao

subtipo II de Goodman et al. (duas massas distintas de CHC e CC separadas por uma área de

transição).

Os componentes hepatocelulares dos quatro casos estudados correspondiam, na maior

parte de sua extensão, ao padrão trabecular ou macrotrabecular de CHC e eram formados por

células com atipias nucleares que variaram de leve a intensa (graus 1 a 4 nucleares de

Edmondson-Steiner). Em algumas regiões dos casos 1 e 4, puderam ser observadas áreas de

diferenciação pseudo-acinar do componente CHC, com eventual produção de bile.

Os componentes colangiolares de três dos quatro casos eram compostos por glândulas

tubulares pequenas, de aspecto irregular. As células dessas glândulas mostraram intenso

pleomorfismo, embora possuíssem uma morfologia cuboide. Em um dos casos do estudo

(caso 2), essas glândulas assumiam aspecto regular, morfologia aproximadamente redonda,

contendo células de tamanho e forma mais homogêneos. Apesar disso, as atipias nucleares

deixaram claro que se tratava de neoplasia maligna. O componente CC do caso 2 foi

classificado como carcinoma colangiolocelular (CLC). Em todos os casos, as formações

glandulares estavam contidas em um estroma desmoplásico que variou de escasso a

abundante.

Nos quatro casos de hepatocolângio carcinoma estudados foi possível a identificação

de uma zona de transição ou zona intermediária. Essa região pode ser definida como uma área

entre os componentes hepatocelular e colangiolar do tumor misto, que não apresenta

diferenciação específica, mas mostra aspectos intermediários entre os dois tipos de tumores.

Em todos os casos foram observadas células de morfologia precursora (células pequenas, de

formato oval e citoplasma escasso) isoladas no estroma. Nos casos 1 e 4 houve células de

morfologia hepatocitóide (células poligonais de tamanho intermediário entre a célula oval e o

hepatócito) . Houve ainda, no caso 1, a formação de estruturas glandulares compostas de

células hepatocitóides.

12

V.2. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos hepatocolângio carcinomas

HepPar1: a marcação para HepPar1 foi positiva, padrão granular, em todos os casos, nas áreas

de componente CHC bem diferenciado. Em áreas restritas de CHC pouco diferenciado (casos

2 e 4) e em regiões de CC, a marcação foi negativa. Além disso, em zonas intermediárias,

esse marcador torna-se progressivamente negativo à medida que o componente CHC vai

sendo substituído pelo componente CC.

CEAp: em todos os casos de HCC, o CEA policlonal mostrou positividade em padrão

canalicular nas áreas de CHC e positividade em padrão padrão luminal nas áreas de CC.

CK7 e CK19: a marcação para CK7 e CK19 foi fortemente positiva, padrão citoplasmático,

em todas as áreas de componente colangiolar, incluindo a área de carcinoma colangiolocelular

(caso 2). Esses marcadores foram ainda positivos em células de aspecto hepatocitóide ou de

célula precursora, nas zonas intermediárias.

c-kit e cromogranina A: esses marcadores foram testados apenas nos HCCs provenientes de

explantes hepáticos (casos 1 e 2). Foram negativos em ambos.

V.3. Características histopatológicas dos carcinomas hepatocelulares puros

Entre os carcinomas hepatocelulares puros, houve 3 casos de padrão trabecular e 1

caso reproduziu o padrão pseudo-acinar (células neoplásicas arrumadas em arranjos

glandulares produtores de bile). Essa classificação foi estabelecida de acordo com o padrão

morfológico de maior extensão do tumor, já que um mesmo caso apresentou áreas de aspectos

diferentes. O grau nuclear desses tumores variou de 1 a 3 (classificação de Edmondson-

Steiner).

V.4. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos carcinomas hepatocelulares puros

13

HepPar1: 2 casos de CHC puro foram positivos e 2 casos foram negativos para o HepPar1. Os

casos de maior grau de atipia nuclear (casos 5 e 8 – grau 3) foram negativos, enquanto casos

de menor grau (casos 6 e 7 – graus 1 e 2) foram positivos.

CK7: todos os casos de carcinoma hepatocelular puro apresentaram células tumorais, isoladas

ou agrupadas em pequenos grupos, fortemente positivas para CK7, em maior ou menor

número. A marcação foi positiva em células isoladas de morfologia precursora ou em ninhos

de células hepatocitóides. De uma maneira geral, a marcação foi positiva para um maior

número de células nos casos 6 e 7.

CK19: todos os casos de CHC puro apresentaram positividade para CK19 em células isoladas

com fenótipo de células precursoras. Comparada à marcação por CK7, a intensidade da

marcação por CK19 foi menor e a frequência mais escassa. Apenas em um dos casos (caso 8),

a marcação foi negativa.

14

VI. DISCUSSÃO

O hepatocolângio carcinoma é uma forma rara de neoplasia primária de fígado [6]. A

diversidade de achados anátomopatologicos desses tumores reflete um espectro de progressão

da doença que ainda não é bem compreendido. Os aspectos histológicos que permitem a sua

caracterização provavelmente são resultado das diferentes etapas do processo de diferenciação

maligna de uma célula hepática precursora, largamente identificada em séries de casos de

HCC [13, 18, 20]. Os componentes hepatocelular e colangiolar dos tumores mistos, assim

como as células de suas zonas intermediárias, são reflexos desse continuum [18-19].

A identificação de células com perfil de células precursoras em carcinomas

hepatocelulares puros reforça o seu papel na carcinogênese hepática [21-22]. Elas podem ser

derivadas de uma célula-tronco ou surgirem a partir da desdiferenciação de células malignas

maduras [23]. Isso pode explicar os aspectos histopatológicos heterogêneos de CHC em um

mesmo tumor ou no fígado de um mesmo paciente, como descrito pela OMS [6] e observado

em trabalho prévio não-publicado. Algumas linhagens celulares de CHC apresentam

características de células progenitoras (como a expressão dos marcadores imuno-

histoquímicos CD133 e EpCAM) [24] e são capazes de dar origem, in vitro, a duas

populações celulares distintas (hepatocelular e colangiolar) [25]. Células precursoras podem

ainda se comportar como reservatório de clones com potencial de metástase e resistência ao

tratamento, uma vez que demonstrada a sua capacidade de expressão de proteínas

relacionadas à multi-resistência contra drogas [26] e de enriquecimento mediante tratamento

com quimioterápicos [24].

O carcinoma hepatocelular é o tipo histológico mais comum de câncer primário de

fígado e único tumor sólido que prescinde da biópsia para o seu diagnóstico e tratamento. Os

critérios de Barcelona para o manejo clínico do CHC foram revistos recentemente pela

European Association for the Study of the Liver (EASL), que ratificou o uso exclusivo de

técnicas de imagem e de níveis de alfa-feto proteína (AFP) para confirmação diagnóstica

desse tipo de tumor [27]. A não-utilização de biópsia para a decisão de conduta nesses casos

tira a possibilidade de, à luz da biologia molecular, identificar vias carcinogênicas que podem

ser alvos terapêuticos, bem como tipos com marcadores moleculares de significado

prognóstico. Já foi identificado, por exemplo, um novo subtipo de CHC com base na

15

expressão de CK19, o qual apresenta curso clínico mais agressivo, com pior sobrevida e

rápida recorrência após tratamento cirúrgico. Outro possível marcador de evolução da doença

é a presença de células com características intermediárias e/ou estruturas glandulares, que

evidenciam a histogênese do tumor em uma célula hepática progenitora. Esses dois aspectos

podem estar representados em biópsia feita por agulha, como demonstrado no material do

caso 3 do presente estudo (vide figuras 17, 18 e 19 anexas).

A ativação de células hepáticas progenitoras envolve o aumento do número dessas

células e sua diferenciação nas linhagens hepatocelular e/ou colangiolar [10]. Em condições

normais, CHPs são escassas, encontradas apenas em regiões periportais ou de dúctulos

biliares (canais de Hering) [18]. Porém, em condições de doença crônica parenquimatosa do

fígado, como NASH (nonalcoholic steatohepatitis) e doença alcoólica, o número dessas

células está diretamente relacionado ao grau de fibrose hepática [21-22].

A diferenciação de células precursoras em hepatócitos e em células de ductos biliares

envolve a formação de populações intermediárias que também podem sofrer transformação

maligna, conferindo aos tumores características histopatológicas específicas. Células

hepatocitóides são células poligonais de tamanho intermediário entre CHPs e hepatócitos, que

expressam marcadores de ductos biliares. A reação ductular atípica é constituída por pequenos

dúctulos anastomosados de lúmen pouco definido, delineados por células contendo núcleo

oval e citoplasma escasso [10, 19]. Ambos fazem parte do espectro de diferenciação de

células progenitoras, esquematizado na figura 20.

As zonas de transição dos tumores mistos podem ser definidas como regiões entre os

componentes hepatocelular e colangiolar desse tumor, que não apresentam diferenciação

específica. Elas evidenciam o aspecto progressivo de definição das duas neoplasias [13].

Essas áreas são ricas em células de fenótipo intermediário e/ou de células-tronco, o que torna

importante a caracterização do seu perfil-imunohistoquímico no estudo molecular dos

hepatocolângio carcinomas.

O carcinoma colangiolocelular (CLC) é caracterizado pela formação de pequenas

glândulas homogêneas de aparência “antler-like” contidas em um estroma fibroso abundante,

morfologia semelhante ao de uma reação ductular. Por estar frequentemente associado a uma

16

área de diferenciação hepatocelular trabecular, há quem defenda a sua classificação como um

tipo de tumor misto. Essas características puderam ser observadas no caso 2 do presente

estudo, devidamente classificado como CLC. Esses tumores são positivos para CK7 e CK19 e

possuem padrão de expressão gênica semelhante ao de CHCs com características de CHPs.

Além disso, expressam proteínas associadas à resistência a múltiplas drogas, como MDR1,

MRP1 e MRP3. Todos esses aspectos reforçam a idéia de que os CLCs têm origem nos canais

de Hering, possivelmente em células precursoras hepáticas [28].

Embora a OMS classifique os colangiocarcinomas de acordo com a sua localização

(intra ou extra-hepáticos), é a morfologia das células constituintes desse tipo de neoplasia que

dita o seu comportamento clinico-patológico. Colangiocarcinomas que apresentam células

glandulares altas e produtoras de mucina possuem perfil diferente daqueles formados por

células cuboides mucina-negativas (como o CLC). Essa divergência é confirmada pelo padrão

de expressão imuno-histoquímica e gênica [29].

17

VII. CONCLUSÕES

1. O trabalho verifica a presença de células do compartimento precursor do fígado em

hepatocolângio carcinomas e em carcinomas hepatocelulares puros, inclusive em

material proveniente de biópsia por agulha;

2. Células do compartimento precursor puderam ser identificadas em tumores mistos

e puros pela observação de lâminas coradas com hematoxilina e eosina e através de

marcação imuno-histoquímica, o que corrobora para a aplicabilidade do seu uso

como marcador prognóstico dos tumores hepáticos.

18

VIII. PERSPECTIVAS

Esse estudo foi a primeira etapa de um projeto que visa caracterizar o perfil imuno-

histoquímico do hepatocolângio carcinoma e compará-lo ao perfil do carcinoma hepatocelular

puro. A identificação de células com características de células progenitoras faz parte do

objetivo do trabalho. Para cumprir tais metas, um painel maior de anticorpos, incluindo

CD133, EpCAM e NCAM (marcadores propostos para CHPs) deverá ser testado. A série

completa de casos envolve 20 tumores puros e 5 tumores combinados.

19

IX. ANEXOS

IX.1. Tabelas

Tabela 1. Dados demográficos dos pacientes com HCC

Caso Sexo Idade* Etiologia da doença hepática

Origem do material anátomo-patológico

Ano de obtenção do material

1 M 60 VHC Explante hepático 2006 2 M 60 VHC Explante hepático 2006

3 F 69 Sem doença hepática prévia

Biópsia de agulha 2009

4 F 73 NASH Biópsia em cunha 2011 * Idade à época do diagnóstico Tabela 2. Dados histopatológicos do componente hepatocelular dos HCCs Caso Padrão do CHC Grau nuclear 1 Trabecular/Pseudoacinar 4 2 Macrotrabecular 4 3 Trabecular 1 4 Trabecular/Pseudoacinar 3 Tabela 3. Dados histopatológicos do componente colangiolar dos HCCs

Caso Padrão de morfologia glandular

Morfologia das células glandulares Estroma

1 Tubular Pleomórficas Moderado 2 Tubular Homogêneas Abundante 3 Tubular Pleomórficas Abundante 4 Tubular Pleomórficas Escasso Tabela 4. Características das zonas intermediárias dos HCCs Caso Área de transição Células hepatóides Células ovais 1 S S – Ninhos S 2 S S – Ninhos S 3 S N S 4 S S – Maciços S

20

Tabela 5. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos HCCs Caso HepPar1 CK7 CK19 CEAp c-kit CromoA 1 + + + + - - 2 +/- + + + - - 3 + + + + 0 0 4 +/- + + + 0 0 O símbolo 0 significa que a marcação não foi testada no caso. Tabela 6. Características histopatológicas dos carcinomas hepatocelulares puros Caso Padrão do CHC Grau nuclear 5 Trabecular 3 6 Trabecular 1 7 Trabecular 2 8 Pseudo-acinar 3 Tabela 7. Resultados da marcação imuno-histoquímica dos CHCs puros Caso HepPar1 CK7 CK19 5 - + + 6 + + + 7 + + + 8 - + -

21

IX.2. Figuras

Figura 1. Aspecto macroscópico de um hepatocolângio carcinoma (caso 2). A figura mostra

um nódulo de morfologia heterogênea, formado em sua maior extensão por uma área fibrosa

clara, que é entremeada por pequenas regiões de cor mais escura.

Figura 2. Componente hepatocelular de um hepatocolângio carcinoma (caso 2). As células

neoplásicas estão dispostas em macrotrabéculas e mostram moderada atipia nuclear, nessa

região.

22

Figura 3. Componente hepatocelular de um hepatocolângio carcinoma (caso 1). As células

dessa região apresentam padrão pseudo-acinar de diferenciação, formando estruturas

glandulares onde pode ser observada a produção de bile.

Figura 4 (A e B). Componente colangiolar de um hepatocolângio carcinoma (caso 1), formado

por glândulas tubulares pequenas, irregulares, contidas em um moderado estroma fibroso. As

células formadoras dessas glândulas mostram intenso pleomorfismo, embora mantenham seu

caráter cuboide.

A B

23

Figura 5. Componente colangiolocelular de um hepatocolângio carcinoma (caso 2). O

carcinoma colangiolocelular é caracterizado por glândulas regulares, formado por células

homogêneas contidas em um estroma fibroso abundante. As atipias nucleares, entretanto, não

deixam dúvida de que se trata de neoplasia maligna.

24

Figura 6. Zona intermediária de um hepatocolângio carcinoma (caso 4). Nota-se a transição da

morfologia hepatocelular (à esquerda) para a morfologia colangiolar (à direita), com formação

progressiva de estruturas ductulares em meio a estroma fibroso.

25

Figura 7 (A e B). Zona intermediária de um hepatocolângio carcinoma (caso 1). Em áreas de

transição, as estruturas glandulares são formadas por células de morfologia semelhante a

hepatócitos (células hepatóides).

A

B

26

Figura 8 (A e B). Marcação imuno-histoquímica de um hepatocolângio carcinoma (caso 1)

pelo HepPar1. À direita, em A, vê-se área do componente hepatocelular do tumor, fortemente

positiva para o marcador. À medida que o tumor progride para o componente colangiolar (à

esquerda), a marcação se torna mais fraca e heterogênea. Na zona de transição (maior

aumento em B), apenas algumas células apresentam marcação.

A

B

27

Figura 9. Marcação imuno-histoquímica do componente hepatocelular de um hepatocolângio

carcinoma (caso 4) pelo CEAp. Observa-se delimitação de canalículos biliares pelo marcador,

em área de CHC padrão trabecular.

28

Figura 10 (A e B). Marcação imuno-histoquímica de área colangiolar de hepatocolângio

carcinoma (caso 1) por CK7 (A) e CK19 (B). As células glandulares do tumor apresentam

forte positividade para ambos os marcadores.

A

B

29

Figura 11 (A e B). Marcação imuno-histoquímica de área colangiolocelular de hepatocolângio

carcinoma (caso 2) por CK7 (A) e CK19 (B). As células glandulares do componente

colangiolocelular também apresentam forte positividade para os marcadores.

A B

Figura 12. Marcação imuno-histoquímica de zona intermediária de hepatocolângio carcinoma

por CK7 (caso 1). Observa-se marcação negativa do componente hepatocelular do tumor

(parte inferior da figura). A marcação progride em intensidade à medida que as células

assumem morfologia glandular (parte superior da figura).

30

Figura 13. Marcação imuno-histoquímica de zona intermediária de hepatocolângio carcinoma

por CK7 (caso 1). A marcação é positiva em células hepatóides dispostas em formações

glandulares.

Figura 14 (A e B). Maciço neoplásico de células hepatóides, positivo para marcação por

CK19.

A B

31

Figura 15 (A e B). Componentes hepatocelular e colangiolar de um hepatocolângio carcinoma

(caso 3), evidenciados em material de biópsia por agulha.

A

B

32

Figura 16. Marcação positiva do componente hepatocelular do hepatocolângio carcinoma

(caso 3 – material de biópsia por agulha) para HepPar1.

Figura 17. Marcação positiva do componente colangiolar do hepatocolângio carcinoma (caso

3 – material de biópsia por agulha) para CK7.

33

Figura 18. Marcação imuno-histoquímica de carcinoma hepatocelular pouco diferenciado

(caso 5) para HepPar1. O tumor, situado à esquerda, é negativo para o marcador. À direita,

observa-se área de hepatócitos não-neoplásicos fortemente positiva para o marcador.

34

Figura 19. Marcação imuno-histoquímica de carcinoma hepatocelular (caso 5) para CK7 (A) e

CK19 (B). Observam-se células de formato oval positivas para ambos os marcadores.

A

B

35

Figura 20. Etapas de diferenciação de uma célula hepática progenitora.

Célula-tronco

Célula Hepática Progenitora

(CHP)

Reação ductular atípica

Ductulos biliares

Células hepatocitóides

Hepatócitos

36

IX.3. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisas

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisas do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (Fundação

Oswaldo Cruz) sobre o projeto do qual foi extraído o subprojeto para redação da monografia.

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