Identificação de microrganismos por testes

bioquímicosProf. Fabricio Rochedo Conceição

fabricio.rochedo@ufpel.edu.brfabriciorc@pop.com.br

4 de novembro de 2010

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana I

• Identificação de microrganismos;

• Tratamento;

• Epidemiologia – fontes de infecção - rastreabilidade

• Desenvolvimento de produtos biotecnológicos;

• Capacidade de metabolização de substratos particulares;

• Presença de enzimas específicas;

• Indicadores para a identificação de uma bactéria.

IMPORTÂNCIA

UM TESTE BIOQUÍMICO PODE DISTINGUIR GÊNEROS E ESPÉCIES

Provas rápidas – seg. a min.

Catalase

• É uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (3%) em oxigênio e água;

• Indispensável na identificação de cocos Gram positivos;

• Estafilococos são catalase positivos;

• Estreptococos são catalase negativos;

• Exceto os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias decompõe o peróxido de hidrogênio

Controle positivo: Staphylococcus aureus Controle negativo: Streptococcus spp.

O teste da catalase não tem qualquer aplicação na distinção do grupo Enterobacter pois todos são catalase (+)s.

Coagulase

• Presença desta enzima indica patogenicidade

• Na presença de plasma, os produtores de coagulase, como o Staphylococcus aureus, vão desencadear os mecanismos da coagulação

• Proteína de composição química desconhecida, com atividade semelhante a protrombina, capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina (coágulo)

• Diferenciar espécies de Staphylococcus (S. aureus e S. epidermidis)

- +

Coagulase

Oxidase

• Tetrametil-p-fenilenodiamina (1% segundo Kovacs)

• Citocromo oxidase do tipo AA3

• Diferenciar os gêneros Neisseria e Pseudomonas (oxidase positiva) de outros cocos Gram - ;

• Distinguir a família Enterobacteriaceae (oxidase negativa) de outros bacilos Gram negativos (oxidase positiva);

Interpretação do Teste

• Azul (Púrpura): reação +• Rosa: reação –

Provas lentas – 24 h ou mais

Enterobacteriaceae (Gram –)

A- Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella fermentam lactose produzindo ácido e gás B- Shigella e Salmonella não utilizam lactose em seu metabolismo. Degradam a peptona formando amônia.

A BA

Ágar MacConkey - contém bile que inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram +, cristal violeta (inibe algumas bactérias Gram +) e vermelho neutro (indicador de pH), lactose e peptona.

Diferenciação de Salmonella e Shigella

Ágar XLD – Xilose, lisina e deoxicolato (ácido biliar). Meio seletivo usado para isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clínicas e alimentos. Contém phenol red como indicador de pH (ácido – amarelo; alcalino – rosa a vermelho). Salmonella metaboliza o tiosulfato produzindo H2S que reage com o ferro produzindo um composto escuro (centro da colônia negro).

PROVAS IMViC

Indol , Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato

• Esta série de quatro provas permite identificar um organismo do grupo coliforme.

Teste de Indol (reativo de Kovacs) Detecta a ação da enzima triptofanase,

determinando a capacidade do microrganismo produzir Indol através da degradação do aminoácido L-triptofano. Após a incubação, adiciona-se o reativo de Kovacs (p-dimetil aminobenzaldeído). O indol se complexa ao reativo de Kovacs produzindo um anel rosa.

Reação positiva

Reação Negativa

Teste de MR – Vermelho de metila

Reação negativa

Reação positiva

pH >6,2 – Amarelo (negativo)

pH< 4,4 – Vermelho (positivo)

- O Vermelho de Metila é o indicador de pH;- O teste é utilizado na verificação da produção de grandes quantidades de ácidos, como o ácido pirúvico no metabolismo da glicose;- As enterobactérias usam o ácido pirúvico para produzir outros ácidos como ác.lático, ác.acético e ác.fórmico.

Teste de Voges-Proskauer (produção de acetoína) Verifica a capacidade do microrganismo

em produzir ácidos como o Acetilmetilcarbinol (acetoína) como um precursor da síntese de 2,3 butanediol. Adiciona-se NaOH que reage com a acetoína produzindo um composto vermelho.

Reação negativa

Reação positiva

Teste de Citrato de Simmons Diferencia os microrganismos pela capacidade de

usarem o Citrato como única fonte de carbono. Azul de bromotimol como indicador de pH

Para que a bactéria possa utilizar o citrato é necessário que ela tenha a Citrato permease, que vai permitir a entrada desse composto no interior da célula;

Uma vez incorporado, o citrato será degradado pela enzima Citrase, produzindo compostos alcalinos.

Alguns testes bioquímicos para Enterobactérias

Plaqueamento seletivo diferencial:

HE (Hectoen enteric): Proteose peptona;

Extrato de levedura;

Lactose;

Sacarose;

Salicina;

Sais biliares;

Cloreto de sódio;

Tiossulfato de sódio;

Citrato ferrico amoniacal;

Fucsina ácida;

24h

Colônia verde com centro negro

H2S

Obs: Não vai para a autoclave!

Seletivos

Teste da Uréia:Uréia alcalina:

Teste TSI:• Lactose (1%) ;• Sacarose (1%);• Glicose (01%);

• Vermelho de fenol;

• Tiossulfato de sódio;• Sulfato ferroso;

• Cloreto de sódio;• Extrato de carne;• Extrato de levedura;• Peptona

ou24h

TSI (Triple sugar iron): Carboidratos

Indicador de pH

Indicador de H2S

Nutrientes

Chave dicotômica