CURSO DE BIOMEDICINA

ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER

Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de

Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula

IBMR– CAMPUS CATETE

2016

ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER

Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de

Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula

Monografia apresentada à coordenação do curso

de Biomedicina, como cumprimento parcial das

exigências para conclusão do curso de

Bacharelado em Biomedicina do Instituto

Brasileiro de Medicina e Reabilitação.

Orientadores: Drª. Marta Helena Branquinha de Sá & Dr. André Luis Souza dos

Santos

Co-orientador: Doutorando Michel Gomes Chagas

IBMR – CAMPUS CATETE

2016

IBMR – CAMPUS CATETE

ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER

Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de

Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula

Monografia apresentada à coordenação do

curso de Biomedicina, como cumprimento

parcial das exigências para conclusão do curso

de Bacharelado em Biomedicina do Instituto

Brasileiro de Medicina e Reabilitação.

Aprovada em___ de _________de _____.

Conceito:_________ (_____________).

Banca Examinadora

_______________________________________

Profª.

_______________________________________

Profº.

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Profª.

_______________________________________

...A vitória é o resultado de uma cuidadosa experimentação e inteligente

argumentação... Contra toda esta evidência, quase a única defesa restante para o

cientista cético é a ignorância.

(George R. Price, 1955)

RESUMO

As espécies do gênero Wallaceina são tripanossomatídeos flagelados monoxênicos

isolados de hospedeiros invertebrados pertencentes à ordem Hemíptera, que apresentam

ao longo do ciclo de vida as formas promastigota, endomastigota, coanomastigota,

brochomastigota e opistomorfa (Kotysgov et al.,2004). Sabe-se muito pouco a respeito

deste gênero e por isso o presente trabalho tem por objetivo investigar o perfil

proliferativo e a possível presença de peptidases produzidas por Wallaceina inconstans

e Wallaceina brevicula. Para se analisar o perfil proliferativo, as espécies foram

cultivadas a 28ºC e 37ºC em meio Warren, e as células foram estimadas pela contagem

em câmara de Neubauer. As células cultivadas a 28ºC atingiram o ápice da fase

logarítmica em 48 horas. Entretanto, as células cultivadas a 37ºC não apresentaram

proliferação relevante, observando-se uma morfologia típica de células mortas. Para se

analisar o perfil de peptidases expressas pelas duas espécies, extratos celulares totais

obtidos dos parasitos em diferentes tempos de cultivo foram utilizados em SDS-PAGE

contendo gelatina incorporada ao gel como substrato. Após a corrida, os géis foram

incubados em sistemas tampão com diferentes faixas de pH: 5,0, 7,0 e 9,0. Após a

incubação observou-se que os géis incubados em pH 5,0 apresentaram cinco bandas de

maior intensidade referentes ao tempo de 48 horas, representando o período de maior

expressão de peptidases nas duas espécies. Observou-se ainda que nos valores de pH 7,0

e 9,0 as cinco bandas se apresentavam com menor intensidade, para ambas as espécies.

Os géis das duas espécies incubados em pH 5,0 somados ao inibidor proteolítico E-64,

demonstraram uma inibição na expressão de bandas, enquanto que os demais não

apresentaram inibição proteolítica relevante. A inibição da expressão de bandas

observadas na utilização do inibidor E-64 sugere uma possível presença de cisteína-

proteases produzidas pelas duas espécies de tripanossomatídeos, e portanto, os

resultados obtidos indicam uma adaptação destes dois tripanossomatídeos a mesma

temperatura e pH encontrados no trato digestivo de insetos da ordem Hemíptera, 28ºC e

pH 5,0, as quais são ideais para proliferação e atividade proteolítica observadas nas

espécies estudadas.

Palavras Chave: Wallaceina brevicula , Wallaceina inconstans, Peptidase, Inibidor

proteolítico.

ABSTRACT

The species of the genus Wallaceina are trypanosomatid flagellated monoxenic

isolated of invertebrate hosts belonging to the order Hemiptera, which feature

throughout the life cycle the promastigote, endomastigote, choanomastigote,

brochomastigote and opisthomorphs forms (Kotysgov et al., 2004). We know very little

about this genre and so the present study aims to investigate the proliferative profile and

the possible presence of peptidases produced by Wallaceina inconstans and Wallaceina

brevicula. To analyze the proliferative profile, species were grown at 28 ° C and 37 ° C

in Warren medium, and the cells were estimated by counting in a Neubauer chamber.

Cells grown at 28°C reached the summit of the log phase in 48 hours. However, cells

grown at 37°C showed no significant proliferation, observing a typical morphology of

dead cells. To analyze the peptidase profile expressed by two kinds, total cell extracts

obtained from parasites at different cultivation times were used in SDS-PAGE

containing gelatin incorporated into the gel as substrate. After the run, the gels were

incubated in buffer systems with different pH values: 5,0, 7,0 and 9,0. When analyzing

the data, it was observed that the gels incubated at pH 5.0 showed five bands of greater

intensity related to the time of 48 hours, representing a period of increased expression of

peptidases in the two species. It was also observed that at pH 7,0 and 9,0 five bands

performed with lower intensity for both species. The gels of the two species incubated

at pH 5,0 added to proteolytic inhibitor E-64 showed an inhibition in the expression of

bands, while others showed no relevant proteolytic inhibition. Inhibition of the

expression of bands observed in the use of the E-64 inhibitor suggests a possible

presence of cysteine proteases produced by two species of trypanosomes, and therefore,

the results indicate an adaptation of these two trypanosomatids to the same pH and

temperature found in the digestive tract of Hemiptera order of insects, 28°C and pH

5,0,which are ideal for proliferation and proteolytic activity observed in the studied

species.

Key words: Wallaceina brevicula , Wallaceina inconstans, Peptidase, Proteolytic

inhibitor.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Representação da diversidade de hospedeiros e distribuição dos

tripanossomatídeos entre eles..........................................................................................13

Figura 2. Principais estruturas e organelas encontradas em um modelo de

tripanossomatídeo............................................................................................................14

Figura 3. As formas mais comumente encontradas dos tripanossomatídeos.................15

Figura 4. Fotografia dos insetos vetores Calocoris sexguttatus e Nabis brevis.............16

Figura 5. Coloraçao com Giensa de Wallaceina spp em cultura....................................16

Figura 6. Curva de proliferação de W.inconstans e W.brevicula a 28 ºC.......................27

Figura 7. Curva de proliferação de W.incontans e W.brevicula a 37 ºC........................28

Figura 8. Comparação das curvas de proliferação nas duas temperaturas estudadas.....29

Figura 9. SDS-PAGE com incubação em diferentes faixas de pH................................30

Figura 10. SDS-PAGE de extratos celulares totais das duas espécies incubados em pH

5,0 ,somados à DTT e inibidores de diferentes classes de peptidases...........................31

Figura 11. SDS-PAGE de extratos celulares totais incubados em pH 5,0 e DTT, com e

sem a adição do inibidor proteolítico E-64....................................................................31

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS - Acquired immunodeficiency syndrome

BHI - Brain heart infusion

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DTT – Dithiothreitol

EGTA - Ethylenedioxy-bis-(Ethylenenitrilo)-Tetraacetic Acid

EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid

GP63 – Glicoproteína 63

HIV- Human immunodeficiency virus

HIV-1 - Human immunodeficiency virus do tipo 1

HAART - Highly active antiretroviral therapy

KDNA - Ácido desoxirribonucléico do cinetoplasto

kDa – Kilodalton

PMSF - Phenylmethanesulfonyl fluoride

SFB – Soro fetal bovino

SDS-PAGE - Polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate

SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica

TCD4 - Cluster of differentiation 4

Wi – Wallaceina inconstans

Wb – Wallaceina brevicula

Sumário

1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................12

1.1.A Familia Trypanosomatidae.............................................................................12

1.2.Wallaceina spp....................................................................................................16

1.3.Enzimas Proteolíticas.........................................................................................19

1.4.Inibidores Proteoliticos.......................................................................................20

2 – JUSTIFICATIVA.....................................................................................................23

3 – OBJETIVO...............................................................................................................24

3.1. Objetivo Geral..................................................................................................24

3.2. Objetivos Especficos........................................................................................24

4 – METODOLOGIA.....................................................................................................25

4.1.Micro-organismo e Condicóes de Cultivo.........................................................25

4.2. Obtençao do Extrato Celular para Análise em Gel de Poliacrilamida.............25

4.3. Detecçao de Atividade Proteolitica para Análise em Diferentes Faixas de pH e

Temperatura, e Determinaçao da Classe de Peptidases..................................................25

5 – Resultados.................................................................................................................27

5.1. Detecçao de Atividade Proteolitica em Diferentes Faixas de pH e

Temperatura....................................................................................................................27

5.2. Determinaçao da Classe das Peptidases...........................................................30

6 – DISCUSSÃO............................................................................................................32

7 – CONCLUSÃO..........................................................................................................35

8 – REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.....................................................................37

Este trabalho foi desenvolvido no Instituto de Microbiologia Paulo Góes (IMPG) na

Universidade Federal do Rio do Janeiro (UFRJ), no Laboratório de Investigação de

Peptidases (LIP) sob a orientação da professora Dra. Marta Helena Branquinha de Sá,

do professor Dr. André Luiz Souza dos Santos e sob a co-orientação do doutorando

Michel Gomes Chagas.

12

1- INTRODUÇÃO

1.1. A Família Trypanosomatidae

A classe Kinetoplastea está dividida em duas subclasses: Prokinetoplastina (ordem

Prokinetoplastida) e Metakinetoplastina (ordens Eubodonida, Parabodonida,

Neobodonida e Trypanosomatida). Prokinetoplastida, Eubodonida, Parabodonida,

Neobonida podem ser de vida livre, comensais ou parasitos; entretanto, todos os

membros da ordem Trypanosomatida são parasitos. Os tripanossomatídeos são

extremamente bem sucedidos e seus membros são encontrados parasitando vertebrados,

invertebrados (incluindo muitos insetos) e plantas. Estima-se que os tripanossomatídeos

tenham surgido há aproximadamente 100 milhões de anos atrás, e entre eles estão

reunidas espécies de parasitos causadores de doenças em humanos e animais, podendo

acarretar danos à saúde e prejuízos à economia e vida social humana (revisto por

LOPES et al., 2010).

Os tripanossomatídeos estão divididos em doze gêneros (Leishmania, Trypanosoma,

Endotrypanum, Herpetomonas, Leptomonas, Crithidia, Blastocrithidia, Phytomonas

Wallaceina, Angomonas, Strigomonas e Sergeia), figura 1, com base em características

morfológicas, filogenéticas e quanto à especificidade do hospedeiro (BORGHESAN et

al., 2013). Neste último caso, podem ser divididos em: monoxênicos, quando

desenvolvem todo o seu ciclo de vida em apenas um hospedeiro (geralmente um

invertebrado), ou heteroxênicos, quando desenvolvem o seu ciclo de vida em

hospedeiros diferentes (invertebrado e planta ou invertebrado e vertebrado) (revisto por

LOPES et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2011). Cinco gêneros da família

Trypanosomatidae são constituídos por protozoários denominados heteroxênicos, sendo

inseridos nesse grupo, os gêneros Leishmania, Trypanosoma, Phytomonas,

Sauroleishmania e Endotrypanum. Os dois primeiros abrigam importantes agentes

etiológicos de doenças humanas como a leishmaniose, a tripanosomíase americana e a

africana (NASCIMENTO et al., 2010) O gênero Phytomonas inclui aqueles

tripanosomatídeos que utilizam como segundo hospedeiro plantas como cafeeiros e

palmeiras (REY, 2001; CAMARGO, 1999). Embora a família Trypanosomatidae inclua

protozoários de relevante importância médica, a maioria dos gêneros pertencentes a esta

família é formada por espécies que desenvolvem seus ciclos biológicos somente no

13

inseto (hospedeiro invertebrado) (WALLACE 1966; WALLACE et al., 1983). Esses

tripanossomatídeos denominados monoxênicos,pertencem aos gêneros Blastocrithidia,

Crithidia, Herpetomonas, Rhynchoidomonas e Leptomonas, além dos recentemente

criados: Angomonas, Strigomonas e Wallaceina ( TEIXEIRA, 2011; WALLACE,

1966).

Figura 1. Representação da diversidade de hospedeiros e distribuição dos tripanossomatídeos entre eles.

Os tripanossomatídeos heteroxênicos alternam entre hospedeiros invertebrados e vertebrados (vermelho)

ou plantas (verde). O desenvolvimento dos parasitos monoxênicos ocorre em um único hospedeiro

invertebrado (seta curva azul), embora tripanossomatídeos de insetos já tenham sido isolados de plantas e

vertebrados (setas azuis claras) (Adaptado de SANTOS et al. 2007).

A família Trypanosomatidae é constituída por protozoários flagelados e os diferentes

gêneros de tripanossomatídeos descritos compartilham características que podem ser

classificadas como comuns (observadas em outros grupos de organismos) ou singulares

(encontradas apenas entre os kinetoplastídeos). Dentre as características singulares deste

grupo está a presença de mitocôndria única e ramificada que percorre todo o corpo celular.

Esta organela apresenta uma porção especializada, localizada dentro da matriz mitocondrial,

perpendicular ao eixo do flagelo, rica em ácido desoxirribonucléico (20–30% DNA total),

identificada como cinetoplasto. O DNA desta estrutura é denominado k-DNA e se organiza

em redes de cadeias circulares, concatenadas e compactadas. Em muitos tripanossomatídeos,

a posição relativa do cinetoplasto em relação ao núcleo varia de acordo com o estagio no

ciclo de vida (LIU et al., 2005; LIU & ENGLUND, 2007; DE SOUZA, 2008). O glicossoma

também é uma organela singular dessa família e são distintos dos peroxissomas de

14

organismos eucariotos superiores. Além de tornar a transformação de glicose em piruvato

mais eficiente em tripanossomatídeos que em outros organismos eucariotos, já que

compartimentaliza a via glicolítica, o glicossoma também possui outras funções relacionadas

à biossíntese de pirimidinas, recuperação de purinas, síntese de éter-lipídios e β-oxidação de

ácidos graxos (revisto por MICHELS, HANNAERT & BRINGAUD, 2000). Os

reservossomos são organelas endocíticas encontradas nos parasitos do sub-gênero

Schizotrypanum, tal como em Trypanosoma vespertilionis, T. dionisii e T. cruzi. Estas

estruturas foram descritas inicialmente como corpos multivesiculares e compreendem um

importante estoque de proteínas e lipídeos que são assimilados por endocitose e proteínas

secretórias produzidas pelo parasito. A representação esquemática da morfologia dos

tripanossomatídeos pode ser observada na figura 2.

Reservossoma

Microtúbulos

subpeliculares

Acidocalcissoma

Mitocôndria

Glicossoma

Cinetoplasto

Bolsa Flagelar

Vacúolo Contrátil

Estrutura Paraflagelar

Axonema

Citóstoma

Golgi

Núcleo

Nucléolo

Retículo

Endoplasmático

Figura 2. Principais estruturas e organelas encontradas em um modelo de tripanossomatídeo (forma

epimastigota de Trypanosoma cruzi). As estruturas e organelas retratadas como detectadas por

microscopia eletrônica de transmissão. (O diagrama foi adaptado de LOPES et al, 2010).

Dentre as características comuns pode-se destacar a presença do citoesqueleto que é uma

estrutura formada por uma camada de microtúbulos subpeliculares, associados entre si e à

membrana plasmática, garantindo a sustentação da célula. Os microtúbulos subpeliculares

estão distribuídos por todo o corpo do protozoário, exceto na região da bolsa flagelar, que

representa o sítio de endocitose/exocitose de macromoléculas na maioria destes parasitos.

Outro componente comum dos tripanossomatídeos é o flagelo, organela responsável pela

15

motilidade do parasito, que emerge de um corpo basal no citoplasma através de uma

invaginação proeminente da membrana plasmática chamada de bolsa flagelar (LANDFEAR

& IGNATUSHCHENKO, 2001). Todos os estágios evolutivos dos tripanossomatídeos

apresentam um flagelo por célula, mesmo a forma amastigota. Além da motilidade, esta

estrutura também está envolvida nos processos de interação parasito-hospedeiro,

morfogênese celular, divisão celular e evasão do sistema imune (RALSTON et al., 2009).

As formas mais comuns observadas nos tripanossomatídeos estão representadas na figura 3.

Existem outras formas de distinção entre os gêneros que apresentam maior especificidade

avaliando as características nutricionais, bioquímicas, ultra-estruturais e genéticas,

possibilitando uma boa distinção em nível de espécies e cepas (revisto por LOPES et al.,

2010; BORGHESAN et al., 2013).

Figura 3. As formas mais comumente encontradas dos tripanossomatídeos. A. promastigota; B.

opistomastigota, C. amastigota, D. epimastigota, E. tripomastigota, F. coanomastigota, G.

esferomastigota. (Adaptado de LOPES et al.,2010).

16

1.2. Wallaceina spp.

As espécies do gênero Wallaceina são tripanossomatídeos flagelados

monoxênicos isolados de hospedeiros invertebrados pertencentes à ordem Hemíptera

figura 4, que apresentam ao longo do ciclo de vida as formas promastigota e

endomastigota, coanomastigota, brochomastigota e opistomorfa (KOTYSGOV et

al.,2004), figuras 5.

A B

Figura 4. Fotografia do inseto hospedeiro de Wallaceina inconstans, Calocoris sexguttatus (A);

Disponível em: (http://kinetoplast.ucr.edu/Wallaceina%20inconstans/HostMaps.htm). Acesso em:

13/11/2015. Vetor de Wallaceina brevicula, Nabis brevis (B). Disponível em:

(http://forosmedjan.se/Nabis.html). Acesso em 13/11/2015. (MERZLYAK, 2001).

Figura 5. Coloração com Giensa de Wallaceina spp em cultura. Cepa obtida do hospedeiro Nabis

flavomargin-tus (1); Cepa obtida do hospedeiro Nabis limbatus (2). Ch- coanomastigota; br-

brochomastigota; en- endomastigota; p- promastigota; om- opistomorfa(Adaptado de KOTYSGOV et

al.,2014).

17

Em relação à morfologia deste gênero de tripanossomatídeo, nota-se que um

subconjunto de endomastigotas possui um traço específico, um flagelo em loop em torno

do núcleo, figura 5. Essa morfologia foi considerada específica do gênero Wallaceina,

sendo proposto o nome de brochomastigotas para as células que possuem esta

característica. As formas endomastigotas, promastigotas e coanomastigotas possuem

uma variação na posição do cinetoplasto e flagelo que se flexiona dentro do corpo

celular. As formas coanomastigotas possuem tambem uma variação relativa ao

comprimento do flagelo (KOTYSGOV et al.,2004).

Primeiramente este grupo taxonômico foi descrito com o nome de Proteomonas

(PODLIPAEV et al. 1990), sendo subsequentemente renomeada para Wallaceina

(BULAT et al.1999). O gênero foi erguido para adotar as espécies recém descritas W.

inconstans, juntamente com a previamente caracterizada Crithidia brevicula (FROLOV

& MALYSHEVA 1989). Segundo KOTYSGOV (2014) todas estas espécies eram

morfologicamente diferentes dos representantes do gênero Crithidia, sendo que as

Wallaceinas apresentavam endomastigotas, um morfotipo geralmente nao reconhecido

em Crithidias. Este gênero possui uma caraterística completamente única: em alguns

endomastigotas, o flagelo forma um loop em torno do núcleo. A taxonomia estabelecida

deste grupo é bastante confusa. Ao longo dos anos alguns isolados atribuídos a várias

espécies descritas mostraram ter afinidade filogenética com o genero Wallaceina.

Atualmente, este gênero possui 7 espécies descritas de tripanossomatídeos

monoxênicos: Wallaceina brevicula, W. inconstans, W. vicina, W. podlipaevi, W.

collosoma, W.rígida e W. raviniae.

A classificação dos tripanossomatídeos baseada em morfologia e ciclo de vida se

mostra muito controversa, visto que é muito contrastante com os recentes achados

filogenéticos. Diferentes espécies de Wallaceinas não podem ser distinguidas umas das

outras mesmo usando marcadores moleculares altamente variáveis. Em resumo, as

numerosas espécies antigas de Wallaceina representam apenas uma espécie dentro do

gênero Crithidia, (KOTYSGOV et al., 2014).

Existem diversas razões que explicam porque diversos nomes diferentes foram

atribuídos aos isolados deste gênero. De acordo com a metodologia tradicional, cepas de

parasitos monoxênicos isolados de diferentes hospedeiros acabam sendo considerados

de diferentes espécies, e também as formas observadas em cultura ocasionalmente não

18

foram documentadas no ciclo de vida desta espécie. (FROLOV 1987; FROLOV et al.

1997). É proposto por KOTYSGOV (2014) que o antigo nome (Crithidia brevicula),

dado para estes flagelados seja retomado, visto que os novos achados filogenéticos

baseados em metodos moleculares corroboram que não há diferenças significativas

entre os isolados do gênero. Pode-se dizer que estes organismos apresentam uma

relação genética e morfológica próxima com outros tripanossamatídeos como,

Leptomonas peterhoffi, Leptomonas sp, e Blastocrithidia gerricola, e também estão

associados geneticamente a organismos patogênicos como Leishmania spp,

(MERZLYAK et al., 2001).

Apesar de importantes características como a posição relativa entre o núcleo e o

cinetoplasto, e a morfologia celular serem levadas em consideração na identificação e

caracterização dos tripanossomatídeos, está cada vez mais claro que este sistema nem

sempre reflete as suas proximidades filogenéticas, tão pouco sua diversidade. Por esse

motivo, a discrepância observada em as análises bioquímicas e moleculares frente à

metodologia taxonômica tradicional tem sido descrita em um número cada vez maior de

trabalhos (MERZLYAK et al., 2001).

Atualmente ainda é utilizada a nomenclatura W. inconstans e W. brevicula para os

tripanossomatídeos aqui estudados, porém sua classificação baseada em seu ciclo de

vida e critérios morfológicos vem se mostrando muito controversa e intrincada. Além

disso, ela não está em concordância com a filogenia conhecida ao se comparar com

novos estudos realizados utilizando-se marcadores moleculares específicos. Com isso,

sua classificação taxonômica exige mais estudos que confirmem sua espécie e gênero

(KOTYSGOV et al., 2014).

A identificação e caracterização de processos permeados por proteinases de uma

grande variedade de micro-organismos estão avançando consideravelmente, tanto em

nível molecular como em nível celular. Os diversos papéis desempenhados pelas

proteases em tripanossomatídeos estão se tornando foco de diversos estudos, visto que

papéis cruciais foram propostos em diferentes processos, como invasão celular,

catabolismo de proteínas, diferenciação, progressão do ciclo celular, citoaderência, e

ainda estimulação e evasão do sistema imune (SOUSA, 2013).

19

1.3. Enzimas Proteolíticas

Enzimas proteolíticas catalisam a clivagem de ligações peptídicas, as quais ligam

resíduos de aminoácidos em proteínas e peptídeos. Existe um conjunto de termos

utilizados pela comunidade científica para se referirem às enzimas proteolíticas,

incluindo: peptidases, proteases e peptídeo-hidrolases. Todas as proteases ligam seus

substratos no sulco ou fenda, onde ocorre a hidrólise da ligação peptídica (SANTOS,

2011).

Estas enzimas foram inicialmente classificadas em exopeptidases ou

endopeptidases, de acordo com a reação catalisada. Exopeptidases são capazes de

hidrolisar o peptídeo nas extremidades de uma cadeia polipeptídica única, liberando

aminoácidos, resíduos de dipeptídeos ou de tripeptídeos, enquanto endopeptidases agem

preferencialmente sobre as ligações peptídicas nas regiões internas de um polipeptídeo

(BARRETT, 1994; BEYNON & BOND, 2001). De acordo com a natureza do sítio

catalítico, as endopeptidases podem ser classificadas como aspártico-, cisteína-, metalo-,

serina-, treonina-, glutâmico- ou asparagino-peptidases (BARRETT, 1994; BEYNON &

BOND, 2001; RAWLINGS et al., 2012).

A intensa pesquisa sobre peptidases gera uma ampla quantidade de

informações, exigindo um sistema de classificação compatível com esta diversidade.

Um método de classificação pode ser facilmente acessado no servidor de base de dados

MEROPS (RAWLINGS et al., 2012). Neste sistema, peptidases das diferentes classes

são agrupadas em famílias com base nas semelhanças estatisticamente significativas e

na sequência de aminoácidos. Cada família é identificada por uma letra que representa o

domínio catalítico, onde A é utilizado para aspártico, C para cisteína, M para metalo, S

para serina, T para treonina, G para glutâmico, N para asparagina e U para mecanismo

de hidrólise desconhecido, seguido por um número característico.

Em organismos infecciosos, as peptidases desempenham papéis cruciais como

fatores de virulência, além do seu envolvimento em funções celulares básicas. Por

exemplo, peptidases são necessárias para a invasão, colonização, disseminação no

hospedeiro, além de evasão do sistema imune (LOPEZ-OTÍN & BOND, 2008;

VERMELHO et al., 2008). Há uma série de relatos sobre as funções e exploração de

peptidases de tripanossomatídeos como alvos para quimioterápicos. Cisteína- e metalo-

20

peptidases são as classes mais estudadas em tripanossomatídeos, seguidas por serina- e

aspártico-peptidases (YAO, DONELSON & WILSON, 2003; OLIVER et al., 2012).

Coletivamente, as proteases participam em diferentes etapas dos eventos de

interação entre estruturas dos micro-organismos e hospedeiros, sendo consideradas

portanto, fatores de virulência. Consequentemente, a caracterização bioquímica destas

enzimas proteolíticas é de interesse não somente para entender as proteases em geral,

mas, sobretudo para compreender seus papéis em infecções microbianas e desta forma

explorá-las como potenciais alvos no desenvolvimento de quimioterápicos para doenças

microbianas (SANTOS, 2011). A pesquisa por alvos potenciais para o desenvolvimento

de novas drogas tem sido desenvolvida com base nas vias bioquímicas e metabólicas

essenciais para a sobrevivência do parasito. As enzimas alvo destas vias deveriam

apresentar significantes diferenças estruturais e funcionais em relação às pertencentes

aos mamíferos, a fim de se obter uma inibição seletiva do sítio-alvo. Além disso, as

estratégias que visam atingir mais do que uma enzima de uma via metabólica pode ser

mais útil e eficaz (SINGH, KUMAR & SINGH, 2012).

1.4. Inibidores Proteolíticos

Muitos inibidores de peptidases têm se mostrado promissores em ensaios pré-

clínicos em animais e nos primeiros ensaios clínicos em humanos para as infecções

virais, infecções parasitárias, câncer, condições inflamatórias, imunológicas, e

respiratórias, e desordens cardiovasculares e degenerativas, incluindo a doença de

Alzheimer. Contudo, apesar de um grande esforço de investigação ao longo dos últimos

vinte anos, existem relativamente poucos inibidores de peptidases que tenham

progredido com sucesso através de ensaios clínicos e que estejam atualmente

disponíveis como medicamentos relativamente seguros e eficazes para seres humanos.

Estes incluem os inibidores para o tratamento de pressão sanguínea, os inibidores da

protease do HIV-1 para o tratamento da AIDS, inibidores da trombina para o tratamento

de acidente vascular cerebral, e um inibidor da elastase no tratamento da Síndrome da

Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) (ABBENANTE & FAIRLIE, 2005).

Um exemplo de sucesso no tratamento de uma doença infecciosa com inibidores

proteolíticos é a terapia Antirretroviral Altamente Ativa (HAART) utilizada no

tratamento da AIDS. O HAART levou a uma acentuada melhoria na expectativa de vida

de pacientes com AIDS com a queda da viremia do HIV e com a restauração do sistema

21

imunológico com aumento do número de linfócitos TCD4+ e com a estimulação efetiva

da sobrevivência e ativação dos neutrófilos, monócitos, células endoteliais e células

dendríticas. Todas estas propriedades benéficas da HAART culminaram na redução

drástica de infecções oportunistas (PALELLA et al., 1998; POWDERLY, LANDAY &

LEDERMAN, 1998; MASTROIANNI et al., 1999; MEZZAROMA et al., 1999;

MALHOTRA et al., 2000; ALVAR et al., 2008; NISSAPATOM &

SAWANGJAROEN, 2011). Esta redução parece estar baseada não somente no

restabelecimento do sistema imunológico, mas também na inibição direta de aspártico-

peptidases produzidas por patógenos oportunistas, como demonstrado em algumas

bactérias, fungos e protozoários (CASOLARI et al., 2004; FALKENSAMMER et al.,

2007; CENCI et al., 2008; SANTOS et al., 2009; VALDIVIESO et al., 2010; TSANG

& HONG, 2010; BRAGA-SILVA et al, 2010).

A dificuldade no tratamento de doenças parasitárias é em parte devido à

complexidade dos organismos biológicos responsáveis por estas patologias. Assim,

existem diversas abordagens quimioterapêuticas sendo desenvolvidas (MORENO &

GONZALEZ, 2011; PEYROTTES et al., 2012), incluindo a utilização de inibidores

proteolíticos para tratar malária, leishmaniose e tripanossomíases. Por exemplo,

Plasmodium spp., agente causador da malária, tem enzimas proteolíticas que

desempenham papéis fundamentais na hidrólise de hemoglobina e este processo parece

envolver múltiplas classes de peptidases catalisadoras, incluindo cisteína-, metalo- e

aspártico-peptidases. Entre tais enzimas, plasmepsinas e, especialmente, falcipainas

(cisteína-peptidases) são alvos de drogas antimaláricas altamente promissoras

(TEIXEIRA, GOMES & GOMES, 2011).

A atual terapia para infecções causadas por fungos e tripanosomatídeos

apresenta limitações devido à toxicidade dos agentes terapêuticos disponíveis, bem

como a emergência de resistência pelos micro-organismos. Agregado a estes problemas

está o fato de que muitos países endêmicos são economicamente pobres. Por esta razão,

o desenvolvimento de novos antifúngicos e/ou drogas anti-tripanossomatídeos é uma

exigência atual. Um grande número de estratégias visando o bloqueio de processos

biológicos em fungos e tripanossomatídeos tem surgido, uma destas propostas está

baseada na utilização de inibidores proteolíticos. Atualmente, a principal abordagem

tem sido a obtenção de bons inibidores, utilizando proteases como alvo e acreditando

que a inibição da atividade proteolítica será terapêutica. Inibidores de aspártico-

22

peptidases usadas na HAART, tem apresentado propriedades anti-microbianas

(SANTOS, 2011). Tais efeitos tem sido reportados com sucesso em leveduras como

Candida albicans (BRAGA-SILVA et al., 2010), fungos filamentosos como Fonsecaea

pedrosoi (PALMEIRA et al., 2008) e protozoários do gênero Leishmania (SANTOS et

al., 2009; 2013).

23

2 - JUSTIFICATIVA

A identificação de peptidades das duas espécies de tripanossomatídeos aqui

analisadas e a melhor compreensão de suas características, assim como o perfil

proliferativo destes organismos, se mostra relevante para o melhor entendimento dos

mecanismos evolutivos e metabólicos da Família Trypanosomatidae. Assim também, se

mostram de grande valor para um melhor compreendimento a respeito do gênero

Wallaceina, o qual a atual classificação taxonômica se revela demasiadamente

controversa como aprsentado em estudos recentes que destacam a discrepâncias entre

análises morfológicas e moleculares (KOTYSGOV et al., 2014). Visto que as

peptidases apresentam uma larga e variada distribuição na natureza e, portanto, podem

ser encontradas em uma grande variedade de organismos, os estudos das proteases de

tripanossomatídeos são de suma importância, porque eles podem servir como modelo

para o entendimento da função e evolução das proteases em geral (SANTOS et al.,

2006). Este tipo de enzima realiza funções principais em diversos processos

metabólicos vitais à manutenção da fisiologia e dinâmica das células. A inibição

especifica de peptidases pode ser vista como uma abordagem terapêutica que pode gerar

resultados promissores quanto ao tratamento de infecções virais e parasitárias, assim

como de diversas outras patologias, visto que esta classe de enzimas muitas vezes atua

como fatores de virulência, produzida por protozoários e outros micro-organismos.

24

3 - OBJETIVO

3.1. Objetivo Geral

Investigar o perfil proliferativo e a presença de peptidases produzidas por Wallaceina

inconstans e Wallaceina brevicula.

3.2. Objetivos Específicos

Estabelecer as condições ideais de cultivo in vitro de Wallaceina inconstans e

Wallaceina brevicula;

Avaliar a atividade proteolítica associada à célula em lisados celulares totais de

Wallaceina inconstas e Wallaceina brevicula, por ensaios de SDS-PAGE.

25

4 – METODOLOGIA

4.1. Micro-organismo e condições de cultivo.

As espécies de W. inconstans e W. brevicula foram mantidas através de repiques

semanais em meio Warren (BHI 37g/L, ácido fólico 10µg/L, hemina 1mg/L),

suplementado com 4% de soro fetal bovino (SBF) a 28°C, utilizando-se 0,5% de

inóculo.

4.2. Análise do perfil proliferativo.

Para se analisar o perfil proliferativo, 106 células de cada espécie foram cultivadas a

28ºC e a 37ºC em 1 ml de meio Warren enriquecido com 4% de soro fetal bovino em

placa de 24 poços. Os testes foram realizados em triplicata ao longo de 96 horas

estimando-se as células diariamente na câmara de Neubauer. Ao final da contagem os

resultados foram traduzidos em gráficos estatísticos para se obter uma comparação dos

perfis proliferativos de ambas as espécies.

4.3. Detecção de atividade proteolítica e determinação da classe das peptidases.

4.3.1. Análise de faixas de pH ótimo para a atividade proteolítica.

Para se analisar as atividades proteoliticas expressas pelas duas espécies, extratos

celulares totais obtidos de parasitos em 48 horas de cultivo foram utilizados. As células

foram lisadas na proporção de 400µL de tampão de lise para cada 108 células. O extrato

foi utilizado em SDS-PAGE (gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio)

contendo 1 % de gelatina incorporada ao gel como substrato. Foram aplicados 30µL de

amostra em cada slot, utilizando 200 V e 20 mA para a corrida com um tempo

aproximado de 2 horas. Após a corrida os géis foram incubados em sistemas tampão de

diferentes faixas de pH por 48 horas a 37ºC. Utilizando-se os sistemas tampão, pH 5,0

26

citrato/fosfato, pH 7,0 fosfato e pH 9,0 glicina-hidroxido de sódio, para se analisar o pH

ótimo de expressão proteolítica.

4.3.2. Determinação da classe de peptidases

Para se analisar o perfil de peptidases os géis foram incubados em sistema

tampão pH 5,0. Contendo os seguintes inibidores proteolíticos: pepstatina A

para aspartico-proteases, EGTA, EDTA, 1,10-fenantrolina para metalo-

proteases, PMSF para serina-proteases, e E-64 para cisteína-proteases. Por fim,

foram adicionados aos géis 200 µL de DTT e então incubados a 37ºC por 48

horas.

27

5 - RESULTADOS

5.1. Análise do perfil proliferativo.

Para se analisar o perfil proliferativo, as espécies foram cultivadas a 28ºC e 37ºC

em meio Warren e as células foram estimadas pela contagem em câmara de Neubauer.

As células cultivadas a 28ºC atingiram o ápice da fase logarítmica em 48 horas figura 6.

Entretanto, as células cultivadas a 37ºC não apresentaram proliferação relevante figura

7, observando-se debri celular. O número reduzido de células quando cultivadas em

37ºC sugere uma proliferação reduzida ou quase inexistente, enquanto que as células

cultivadas à 28ºC demonstram uma elevada proliferação, com pico máximo da fase

logaritímica no período de 48 horas figura 8.

Figura 6. Curva de proliferação de Wallaceina inconstans a 28 ºC (A), Curva de proliferação de

Wallaceina brevicula a 28 ºC (B). Gráfico comparativo das duas espécies de parasito cultivadas a 28 ºC

(C). As células foram estimadas por meio de contagem em câmara de neubauer.

28

Pode-se observar que as células apresentam perfis proliferativos semelhantes

quando analisados. O ápice da fase logarítmica das duas espécies é alcançado no

período de 48 horas, apresentando um decaimento e o início da fase de morte logo após

este ponto.

Figura 7. Curva de proliferação de Wallaceina inconstans a 37℃ (A). Curva de proliferação de

Wallaceina brevicula (B) a 37℃. Gráfico comparativo das duas espécies de parasito cultivadas a 37℃

(C). Um elevado decaimento do montante de células da cultura é demonstrado nos gráficos acima, sendo

observado nas duas espécies.

Novamente, pode-se observar um padrão proliferativo semelhante nas duas espécies

analisadas, notando-se uma pequena diferença na contagem de células entre os parasitos

ao decorrer das 96 horas analisadas, em que a espécie Wallaceina brevicula, demonstra

um montante celular levemente mais elevado em comparação a outra espécie.

29

Figura 8. Curva de proliferação de W. inconstans e W. brevicula a 37ºC comparada com a curva de

proliferação das mesmas espécies a 28ºC. A diferença na quantidade de células cultivadas em

temperaturas diferentes é demonstrada acima.

Ao se realizar uma comparação entre as contagens nas duas temperaturas analisadas,

se obtém uma grande diferença no montante celular, em que no cultivo a 37ºC o número

de células decai bruscamente em comparação com o cultivo das células a 28ºC. Este

fato possivelmente pode estar relacionado a presença de uma morfologia de células

mortas e lizadas presente no cultivo celular realizado a 37ºC.

30

5.2. Análise de faixas de pH ótimo para a atividade proteolítica.

Após a eletroforese, os géis foram incubados em sistemas tampão com diferentes

fixas de pH: 5,0, 7,0 e 9,0, figura 9. Ao se analisar os dados, observou-se que os géis

incubados em pH 5,0 apresentaram quatro bandas de maior intensidade referentes ao

tempo de 48 horas, representando o período de maior expressão de peptidases nas duas

espécies. Observou-se ainda que nos valores de pH 7 e 9 as quatro bandas se

apresentavam com menor intensidade, para ambas as espécies.

Figura 9. SDS-PAGE com incubação em diferentes faixas de pH. Extratos celulares totais obtidos dos

parasitos Wallaceina inoconstans (Wi) e Wallaceina brevicula (Wb), em 48 horas de cultivo utilizados

em SDS-PAGE, e incubados em sistemas tampão com diferentes faixas de pH: 5,0, 7,0 e 9,0. Valores do

peso molecular aproximado das bandas representado à esquerda da figura.

5.3. Determinação da classe de peptidades

Os inibidores pepstatina A para aspartico-proteases, EGTA, EDTA, 1,10-

fenantrolina para metalo-proteases, e PMSF para serina-proteases, não apresentaram

inibição proteolítica significante, diferentemente dos géis das duas espécies incubados

em pH 5,0 somados ao inibidor proteolítico E-64 para cisteína-proteases que apresentou

expressiva inibição de expressão proteolítica, como demonstrado na figura 10.

48h

~ 70kDa

60kDa

20kDa

~

~

Wi Wb

pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0

31

Figura 10. SDS-PAGE de extratos celulares totais das duas espécies Wallaceina inoconstans (Wi) e

Wallaceina brevicula (Wb), incubados em pH 5,0 ,somados à DTT e inibidores de diferentes classes de

peptidases. Nota-se uma relevante ausência de expressão de bandas na incubação com o inibidor

proteolítico E-64. Valores do peso molecular aproximado das bandas representado à esquerda da figura.

Nota-se também, que as duas espécies de parasitos apresentam expressão de bandas

de peptidase semelhante, mantendo uma expressão de bandas com praticamente mesmo

peso molecular e intensidade, quando utilizada as condições ideais de expressão

proteolítica. A inibição da expressão de bandas observadas na utilização do inibidor E-

64 figura 11, sugere uma possível presença de cisteína-proteases produzidas pelas duas

espécies de tripanossomatídeos.

Figura 11. SDS-PAGE de extratos celulares totais incubados em pH 5,0 e DTT, com e sem a adição do

inibidor proteolítico E-64. O inibidor proteolítico E-64, demonstra acentuada inibição na intensidade das

bandas, sugerindo uma possível presença de cisteína-proteases produzidas pelas duas espécies de

tripanossomatídeos Wallaceina inoconstans (Wi) e Wallaceina brevicula (Wb).

48h

~85kDa

~70kDa

~50kDa

~20kDa

48h

Controle E-64

Wi Wb

Controle Pepstatina A 1-10

Fenantrolina E-64 EGTA EDTA PMSF

Wi Wb

32

Portanto, os resultados obtidos indicam uma adaptação destes dois

tripanossomatídeos a mesma temperatura e pH encontrados no trato digestivo de insetos

da ordem Hemíptera, 28ºC e pH 5,0, as quais são ideais para proliferação e atividade

proteolítica observadas nas espécies estudadas.

6 – DISCUSSÃO

Analisando-se as curvas de crescimento das duas espécies de tripanossomatídeos

estudadas, observa-se que o montante de células cultivadas a 28ºC se mantem elevado,

atingindo o pico de sua fase logarítmica no período de 48 horas e iniciando sua fase de

morte logo após este período. Ao se comparar com as células cultivadas a 37ºC, nota-se

que o montante celular sofre uma queda brusca desde o início de sua fase logarítmica. A

grande diferença estatística entre os tempos de cultivo e a presença de uma morfologia

típica de células lisadas encontradas no cultivo a 37ºC, demonstra que as duas espécies

estudadas não conseguem realizar uma proliferação celular eficiente à temperatura de

37ºC.

As duas espécies apresentaram perfis de crescimento semelhantes nas duas

temperaturas analisadas, no qual sua fase logarítmica tem seu ápice no período de 48

horas, iniciando sua fase de morte após este período mantendo um decaimento constante

ao prosseguir das 96 horas analisadas.

Em relação ao cultivo dos micro-organismos, é importante frisar que a proporção de

soro fetal bovino (SFB), foi mantida a 4% em vez de sua proporção padrão de 10% para

tripanossomatídeos, devido ao fato de que as duas espécies estudadas apresentam uma

proliferação relativamente rápida e elevada, na qual se foi necessário utilizar baixa

concentração de soro a fim de se controlar o montante celular, assim como os ensaios de

SDS-PAGE das duas espécies foram incubados a 37c◦ visto que a atividade proteolítica

se apresentava com maior intensidade a esta temperatura do que a 28c◦.

Ao se observar os géis incubados em diferentes faixas de pH, nota-se que os géis

incubados em pH 5,0 demonstram um perfil de bandas com maior intensidade e, ao se

comparar com as outras duas faixas de pH testadas, é possível notar que a partir do pH

7,0 o perfil de bandas sofre uma queda relevante de intensidade até quase se esvair na

33

faixa de pH 9,0, sugerindo uma diminuição na atividade proteolítica nas duas espécies,

ao se promover uma alcalinização gradativa do meio.

ELIAS (2008) demonstrou que a atividade proteolitica de Phytomonas serpens foi

bloqueada por inibidores de cisteína clássicos (E-64, leupeptin, e cystatin),

demonstrando ser mais ativa em pH 5.0, e mostrando também uma dependência de

agentes redutores como dithiothreitol e l-cysteina para total atividade. Sabe-se também

que inibidores de cisteína-peptidase em determinada concentração causam alterações

ultra-estruturais e de crescimento no tripanosomatídeo Phytomonas serpens, sendo

capazes de parar o crescimento celular, bem como promover alterações na morfologia

celular do parasito (SANTOS et al,. 2006).

Dentre as faixas de pH estudadas, a faixa de pH 5,0 demonstrou ser a faixa de pH

ótimo para a atividade proteolítica nas duas espécies de Wallaceinas spp. analisadas,

podendo-se comprovar este fato, ao se observar uma grande intensidade no perfil de

bandas expressas por estas duas espécies de tripanossomatídeos.

Em tripanossomatídeos, as peptidases estão relacionadas às interações parasita-

hospedeiro, patogenicidade, sobrevivência intracelular e evasão da resposta imune do

hospedeiro, assim como reações de hidrólise de uma ligação peptídica altamente

específica em um substrato de proteína. As cisteínas e metalopeptidases continuam

sendo as atividades mais proeminentes nos tripanossomatídeos. Em Leishmania spp. por

exemplo, o agente causador da leishmaniose, é uma importante peptidase de superfície,

a gp63, sendo expressa em grande quantidade nas formas promastigotas, sendo a

metalopeptidase melhor caracterizada na família Trypanosomatidae. Curiosamente, a

gp63 é predominantemente expressa na forma evolutiva de Leishmania encontrada no

inseto, e diversos tripanossomatídeos de insetos e plantas analisados até o presente

momento possuem moléculas homólogas. Os homólogos da gp63 presentes nos

tripanossomatídeos inferiores desempenham um papel essencial na nutrição assim como

na interação com as células epiteliais do inseto (SANTOS et al., 2006).

O experimento de SDS-PAGE utilizando extratos celulares totais das duas espécies

de tripanossomatídeos estudadas, incubados em pH 5,0 e somados à diferentes

inibidores proteolíticos, demonstrou uma inibição completa da atividade proteolítica nas

duas espécies de Wallaceina spp. quando tratadas com o inibidor de cisteína-proteases

E-64. Os demais inibidores de diferentes classes de peptidases testados não

34

apresentaram inibição de bandas relativa, ou nem sequer apresentaram inibição ou

redução da atividade proteolítica nas duas espécies, que mantiveram a mesma

intensidade no padrão de bandas expressas.

Cisteínas-peptidades produzidas por Phytomonas serpens compartilham epítopos

comuns com a cruzipaína, outra cisteína-peptidase considerada um importante fator de

virulência em T. cruzi e muito bem caracterizada e estudada nesta espécie, além de

serem capazes de hidrolisar diversos substratos proteicos (ELIAS et al., 2008). Cisteína-

peptidades de protozoários têm sido implicados numa variedade de eventos biológicos,

e a expressão destas enzimas é modulada em resposta a diversos estímulos diferentes,

incluindo alterações ambientais e diferenciação (PEREIRA et al., 2009). A cruzipaína é

a cisteína-peptidase mais abundante do Trypanosoma cruzi, o qual é o agente etiológico

da Doença de Chagas. A cruzipaína é um importante fator de virulência do T. cruzi

envolvida em várias etapas cruciais na interação com células de mamíferos. Essa

enzima é expressa em níveis variáveis em todas as formas evolutivas e cepas do

parasito, sendo abundantemente expressa nas formas epimastigotas, encontradas apenas

no inseto vetor (UEHARA et al., 2010).

Portanto, a inibição completa de atividade de peptidades resultante da incubação

realizada com o inibidor proteolítico E-64, sugere uma provável presença de cisteína-

proteases produzidas pelas duas espécies de tripanossomatídeos aqui analisadas, visto

que as condições ótimas de atividade proteolítica foram mantidas, e a atividade se

manteve com a mesma intensidade na presença das outras classes de inibidores

proteolíticos testados.

35

7 - CONCLUSÃO

Os fatos aqui descritos mostraram que dentre as temperaturas analisadas para a

proliferação dos parasitos, quando cultivadas à 28ºC as espécies de tripanossomatídeos,

Wallaceina brevicula e Wallaceina inconstans desempenham uma proliferação celular

relevante, demonstrando que esta temperatura atua como um fator ideal para a sua

proliferação celular. Dentre as faixas de pH aqui estudadas para se analisar a expressão

peptídica, quando mantidas à faixa de pH 5,0 as duas espécies mostraram maior

intensidade de atividade proteolítica resultando em uma maior intensidade de bandas

expressas. Portanto, a temperatura de 28ºC revela-se sendo a condição ótima de cultivo

para as duas espécies descritas no presente estudo, assim como o pH ácido analisado

exerce um fator primordial na atividade proteolítica para estas duas espécies do gênero

Wallaceina.

A inibição total de atividade proteolítica na presença do inibidor de cisteína-

proteases E-64, somado ao fato de que a adição de DTT (dithiothreitol) intensificou a

expressão de bandas, sugere uma possível presença de uma enzima proteolítica desta

classe nas duas espécies de parasitos aqui analisados.

O fato de a proliferação celular se desencadear melhor à temperatura de 28ºC, e a

notável inibição da atividade proteolítica em decorrência da alcalinização do pH no

meio reacional, demonstra que ocorre uma melhor expressão de atividade proteolítica

em pH 5,0 à temperatura de 37ºC. Com isso, pode-se induzir uma reflexão acerca da

origem evolutiva e adaptação destas duas espécies de tripanossomatídeos, sugerindo-se

uma adaptação específica a um único hospedeiro da ordem hemíptera, dado que a

temperatura corpórea e pH do trato digestivo de insetos desta ordem (LUZ et al., 1999;

RAVAN et al., 2009) se assemelham com as condições ideais de proliferação e

atividade proteolítica das duas espécies de Wallaceinas spp. aqui estudadas.

Experimentos com o intuito de se investigar a bioquimica deste gênero, como por

exemplo um Western blotting, utilizando-se anticorpos específicos para cruzipaína e

gp63, possibilitaria se analisar melhor a presença de moléculas homólogas e seriam de

grande interesse para um melhor entendimento a respeito da evolução e proximidades

filogenéticas destas duas espécies em relação à família Trypanosomatidae, assim como

36

uma identificação do perfil proteolítico e de moléculas específicas localizadas no

secretado celular, ajudariam a elucidar melhor seu metabolismo.

A classificação taxonômica assim como outras análises do gênero Wallaceina,

permanece até o presente momento relativamente controversa e não está em

consonância com estudos recentes. Pouco se tem descrito na literatura à respeito deste

gênero que já apresentou diversas nomenclaturas, e por este motivo é nescessário que

sejam realizados mais estudos sobre a espécie, ao passo que se possa concluir de forma

definitiva sua classificação taxonômica e a identificação e expressão de moléculas intra

e extra celulares.

37

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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