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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
Pós-graduando: Antonio Carlos Cunha Lacreta Junior
Orientador: Prof. Dr. Júlio Carlos Canola
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Cirurgia Veterinária.
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Julho de 2008
IMPLANTE DE TECIDO PROSTÁTICO DO CÃO NA
OSTECTOMIA PARCIAL DO RÁDIO EM COELHOS
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1. INTRODUÇÃO
O retardamento ou a ausência do processo de consolidação óssea nas
correções cirúrgicas das fraturas são situações indesejadas por cirurgiões, haja
vista que às vezes se tornam um problema de difícil resolução na cirurgia
ortopédica. Infelizmente, ocorrem com freqüência significativa, em virtude da
existência de inúmeros fatores físico-químicos, tanto locais quanto sistêmicos, que
são responsáveis por estas condições. Muitas pesquisas foram e vêm sendo
realizadas com intuito de evitar ou ao menos minimizar a ocorrência de falhas na
consolidação óssea e, a partir delas, introduziu-se várias técnicas cirúrgicas com o
uso de enxertos, ou a utilização de produtos biológicos e sintéticos que estimulam
a osteogênese.
A união óssea inicia-se imediatamente após a fratura por meio de
mecanismos fisiológicos com fases bem definidas (HUNSE & HYMAN, 1998).
Cada uma dessas fases é mediada por substâncias biológicas distintas
específicas e indispensáveis no processo completo da neofomação óssea
(FOSSUM, 1997). Essas substâncias biológicas podem ativar ou impedir a
osteogênese dependendo da sua presença, quantidade ou qualidade em cada
fase da consolidação óssea. Sendo assim, a utilização racional de tais substâncias
de forma exógena, ou, de estimulantes que promovam a produção endógena
delas, chamados de osteoindutores, vêm ganhando espaço nos procedimentos
cirúrgicos das correções de fraturas, com o intuito de acelerar o processo de
consolidação.
Dentre os inúmeros osteoindutores biológicos e sintéticos existentes, a
próstata do cão, recentemente testada mostrou-se efetiva na estimulação da
osteogênese. A teoria da possibilidade da próstata do cão ser um osteoindutor
biológico partiu da observação de ocorrências repetitivas de metástase óssea
(lesões osteoblásticas) em casos de neoplasias prostáticas malignas. Por esta
razão, LeRoy, et al. (2002) testaram a capacidade osteoindutora da próstata,
utilizando-a in vivo nos ossos chatos do crânio de ratos e notaram sua eficácia
pela observação de neoformação óssea periosteal nos locais de implante.
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A eficiência osteoindutora da próstata do cão, comprovada por LeRoy, et al.
(2002), ensejou a oportunidade de verificar se este fato ocorre em outras
situações, mais especificamente na cirurgia ortopédica, onde muitas vezes há
necessidade de estimular a osteogênese. O presente estudo consiste em avaliar a
capacidade osteindutora da próstata do cão em ossos longos, utilizando-a na
ostectomia parcial do rádio em coelhos, tendo como importância a possível
utilização como um coadjuvante nas intervenções cirúrgicas corretivas das fraturas
para estimular o processo de consolidação óssea.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. OSSIFICAÇÃO
O tecido ósseo é formado ou por um processo chamado de ossificação
intramembranosa, que ocorre no interior de uma membrana conjuntiva, ou pelo
processo de ossificação endocondral, que se inicia sobre um molde cartilaginoso,
o qual é destruído gradualmente e substituído por tecido ósseo que se forma a
partir de células vindas do tecido conjuntivo adjacente (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 1995; WEISBRODE, 1995). Durante o crescimento ósseo e o
crescimento ósseo remodelado em vertebrados adultos, o novo osso formado
sempre é depositado em uma matriz óssea pré-existente, enquanto a deposição
óssea inicial na embriogênese, ocorre em tecido não mineralizado (WEISBRODE,
1995; CANCEDDA et al., 2000).
A ossificação intramembranosa é assim chamada por surgir no interior de
membranas de natureza conjuntiva, em um local chamado centro de ossificação
primário. O processo tem início pela diferenciação de células mesenquimatosas
que se transformam em grupos de osteoblastos. Estes sintetizam o osteóide que
logo se mineraliza englobando alguns osteoblastos que se transformam em
osteócitos. Como vários destes grupos surgem quase simultaneamente no centro
de ossificação, há confluência das traves ósseas formadas, dando ao osso
aspecto esponjoso. Entre as traves formam-se cavidades que são penetradas por
vasos sangüíneos, e por estes penetram células mesenquimatosas
indiferenciadas, que irão dar origem à medula óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO,
1995; WEISBRODE, 1995; REMEDIOS, 1999). A parte da membrana conjuntiva
que não sofre ossificação passa a constituir o endósteo e o periósteo
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995; CANCEDDA et al., 2000).
A maior parte do crescimento e da formação se dá por meio da
transformação de cartilagem numa estrutura ossificada. A ossificação endocondral
tem início sobre uma peça de cartilagem hialina, de forma parecida à do osso que
vai se formar, porém de tamanho menor. Consiste essencialmente em dois
processos. Primeiro, a cartilagem hialina sofre modificações, com hipertrofia dos
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condrócitos, redução da matriz cartilaginosa, sua mineralização e morte dos
condrócitos. Segundo, as cavidades previamente ocupadas pelos condrócitos são
invadidas por capilares sangüíneos e células osteogênicas vindas do conjuntivo
adjacente. Essas células diferenciam-se em osteoblastos, que depositarão matriz
óssea sobre a cartilagem calcificada e, desse modo, aparece tecido ósseo onde
antes havia tecido cartilaginoso, sem que ocorra a transformação deste naquele
(ALSBERG et al., 2002).
Tanto na ossificação intramembranosa quanto na endocondral, o primeiro
tecido ósseo formado é do tipo primário. Este, pouco a pouco, é substituído por
tecido secundário ou lamelar. Portanto, durante o crescimento dos ossos, pode-se
ver, lado a lado, áreas de tecido primário, áreas de reabsorção e de tecido
secundário (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995).
2.2. REPARAÇÃO ÓSSEA
A fratura é a quebra de um osso ou cartilagem, onde ocorre sempre
hemorragia local, pela lesão de vasos sangüíneos do osso, do periósteo e dos
tecidos moles adjacentes. Nota-se também destruição da matriz e morte de
células ósseas junto ao local fraturado (WEISBRODE, 1995; BRADDOCK et al.,
2001).
A reparação de uma fratura é variável e depende de fatores biológicos e
mecânicos, que influenciam a seqüência de eventos celulares que ocorre durante
a consolidação (FOSSUM, 1997; MENDES et al., 2001; FIALKOV et al., 2003).
Esses fatores associados da violação dos princípios da cirurgia ortopédica podem
alterar a marcha normal da consolidação óssea, protelando-a ou impedindo-a de
completar-se, e produzindo, respectivamente, retardo de consolidação e
pseudoartrose (BARROS & BARBIERI, 1994; MORAES, 2006).
Todos os processos fisiológicos que ocorrem dentro do osso, incluindo o
processo de reparação durante a consolidação da fratura, são dependentes de
suporte vascular adequado (FOSSUM, 1997). Os estágios de reparação após a
fratura ou ostectomia e sua relação com o suprimento sangüíneo são
fundamentais. Os leitos circulatórios, tanto medulares quanto periosteais,
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proliferam muito, mas o sistema arterial medular desempenha um papel
fundamental no suprimento sangüíneo para a formação do calo ósseo. O
predomínio desse suprimento medular aumenta à medida que progride a fase de
reparação (MORAES, 2006).
A consolidação de uma fratura ou falha óssea é um dos processos mais
notáveis de reparação do organismo, porque dele resulta reconstituição do tecido
lesado em outro semelhante ao original (GIORDANO et al., 2001; MENDES et al.,
2001; HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006) e ocorre por meio de uma série de eventos
iniciais, que culminam em regeneração óssea (REMEDIOS, 1999).
Esta é um processo extremamente complicado, que pode ser dividido em
três fases seqüenciais: inflamatória, durante a qual o tecido necrótico é removido;
reparatória, quando a síntese rápida de nova matriz ocorre; e remodelatória, na
qual a matriz desorganizada da fase de reparo sofre processo de maturação,
transformando-se em estrutura compacta e funcionalmente eficiente. Essas fases
são inter-relacionadas e ocorrem temporariamente (MENDES et al., 2001;
BRADDOCK et al., 2001; ASPENBERG, 2005; MORAES, 2006).
Inicialmente ocorre a injúria do tecido mole e do periósteo ao redor do osso
fraturado. No foco da fratura, a ruptura do sistema canalicular resulta em morte
dos osteócitos localizados nas bordas da fratura dos fragmentos ósseos. Enzimas
lisossomais liberadas pela morte dos osteócitos disparam um processo de
destruição da matriz óssea. Nesta fase aguda ocorre um intenso afluxo de
citocinas para o local da fratura. Essas proteínas como as linfocinas ativam uma
cascata de enzimas proteolíticas, resultando em coagulação e inflamação.
Plaquetas locais liberam fatores de crescimento derivado das plaquetas (PDGF),
TGFβ (fator de crescimento de transformação β) e de crescimento epidermal, que
são mediadores moleculares requeridos para a consolidação (REMEDIOS, 1999).
A fase inflamatória começa imediatamente após a fratura (MORAES, 2006).
A formação do hematoma que envolve o foco de fratura faz com que os
segmentos lesados fiquem, em suas extremidades, desprovidos de nutrição e
evoluam para necrose (MENDES et al., 2001). Os tecidos moles, o periósteo e a
medula danificados, contendo grande quantidade de material necrótico
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desencadeiam reação inflamatória intensa (REMEDIOS, 1999; MENDES et al.,
2001). No período de 48 horas, o exsudato do hematoma contém vários
mediadores inflamatórios, fatores angiogênicos e fatores de crescimento liberados
pelas plaquetas, células locais, mastócitos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos
(MORAES, 2006). O hematoma promove a formação da primeira população de
células no foco da fratura, incluindo granulócitos, macrófagos, linfócitos e
mastócitos. Os granulócitos têm função bacteriostática e bactericida, entretanto
não participam diretamente do processo de consolidação óssea. Macrófagos
destroem bactérias e juntamente com linfócitos, liberam fatores angiogênicos e de
crescimento celular. Osteoclastos são achados precocemente na fase inflamatória,
e iniciam o processo de reabsorção e remoção do tecido ósseo morto (BARROS &
BARBIERI, 1994).
Na fase de reparo, o hematoma começa a organizar-se por meio da
chegada de plaquetas e deposição de fibrina (CANCEDDA et al., 2000). O
periósteo e o endósteo, próximo à área fraturada, respondem à imensa
proliferação, formando um tecido muito rico em células osteogênicas que
constituem um colar em torno da fratura, que penetra as extremidades ósseas
rompidas (BRADDOCK et al., 2001).
Macrófagos são especialmente importantes iniciando a fibroplasia. Nesta,
ocorre a migração de células osteoprogenitoras do endósteo, cavidade medular,
periósteo e também do endotélio para dentro do sítio de fratura. As células do
endotélio também contém fatores de crescimento que promovem proliferação
óssea. Associadas a fibroblastos, macrófagos e capilares, essas células
mesenquimais pluripotenciais formarão o calo periosteal externo (REMEDIOS,
1999). Os fibroblastos possuem pré-requisitos indispensáveis para a ossificação
na consolidação das fraturas, transformando-se em osteócitos ou se degenerando,
sendo eventualmente substituídos por tecido ósseo (CHAI et al., 1997). Os
macrófagos também são responsáveis pela angiogênese, por meio da produção
de fatores angiogênicos que atuam localmente no calo da fratura frente a
condições de hipóxia. Esses vasos sangüíneos novos representam o suprimento
extra-ósseo, originado dos tecidos moles ao redor da fratura. O suprimento extra-
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ósseo manterá o calo nutrido até 10 dias após a injúria, e com a progressão da
consolidação, sua contribuição será diminuída (CHAI et al., 1997).
O calo periosteal indiferenciado inicia-se ao sofrer uma rápida proliferação e
transformação condrogênica. Essas células precursoras originam-se
provavelmente do periósteo ou da organização do hematoma e diferenciam-se em
condroblastos, fibroblastos e osteoblastos. Variações da tensão de oxigênio local
determinam a diferenciação das células pluripotenciais, ou em cartilagem
produzindo condroblastos; quando a tensão de oxigênio é baixa, ou em osso
produzindo osteoblastos (REMEDIOS, 1999).
O tecido ósseo imaturo que surge nas extremidades ósseas fraturadas é
fruto da ossificação endocondral de pequenos pedaços de cartilagem que aí se
formam, como também por ossificação intramembranosa. Podem ser encontradas
no local da reparação, ao mesmo tempo, áreas de cartilagem, áreas de
ossificação intramembranosa e áreas de ossificação endocondral (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 1995).
Inicialmente há deposição de colágenos I, II e III, mas, com o decorrer do
processo o tipo I predomina. Ocorre deposição de hidroxiapatita de cálcio na
matriz óssea. Desta forma, o calo cartilaginoso se mineraliza envolvendo as
extremidades dos fragmentos da fratura, estabilizando-a (BRADDOCK et al.,
2001). Durante esse processo, partes do calo cartilaginoso são invadidas por
capilares, e um novo osso começa a se formar na região central da cartilagem não
reabsorvida (SCAMMELL & ROACH, 1996). Com a estabilidade, o suporte
sangüíneo medular se restabelece e inicia-se a formação do calo
fibrocartilaginoso, onde a cartilagem gradualmente é substituída por osso por meio
de um processo idêntico ao da ossificação endocondral (REMEDIOS, 1999).
Osteoblastos são sistematicamente mobilizados e recrutados para o local da
fratura (SHIRLEY et al., 2005) e fazem a osteo-orientação para formação dos
canais capilares. Nesse estágio, a união óssea é concluída, porém a estrutura
óssea do foco da fratura é diferente do osso original (REMEDIOS, 1999). Esse
calo ósseo que envolve as extremidades dos ossos fraturados é constituído por
tecido ósseo imaturo que se formou de modo desordenado, mas que une
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provisoriamente as extremidades ósseas fraturadas (JUNQUEIRA & CARNEIRO,
1995).
O processo de remodelação começa quando a fratura está unida por meio
do calo e o osso volta a sofrer forças devido ao movimento. Nessa fase, a
cartilagem mineralizada ou o tecido ósseo primário vão sendo absorvidos e
substituídos por osso estruturado, o qual será modificado em osso lamelar para a
organização do sistema harvesiano. Neste árduo processo, os osteoclastos
removem o osso estrutural e os osteoblastos depositam osso lamelar ao redor do
canal capilar central, essas células são conhecidas como Unidade Óssea
Multicelular (BMU- Bone Multicellular Unit). O processo de remodelação óssea, ou
seja, a transformação do calo na forma original do osso é lento e possui como
principal guia a atividade óssea piezoelétrica, fenômeno de geração de polaridade
elétrica pela pressão exercida no ambiente cristalino (inorgânico) (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 1995; REMEDIOS, 1999; MORAES, 2006).
A união óssea pode ocorrer por meio de dois mecanismos de reparo
diferentes, seja a consolidação direta ou reconstrução osteonal primária por
contato ou por lacuna e consolidação indireta ou reconstrução osteonal secundária
por formação de calo intermediário (WEISBRODE, 1995; FOSSUM, 1997; HULSE
& HYMAN, 1998; REMEDIOS, 1999).
A reconstrução osteonal primária ocorre sem formação de cartilagem
(REMEDIOS, 1999) por meio do perfeito alinhamento anatômico das extremidades
fraturadas e absoluta estabilidade dos fragmentos. Ocorre apenas em fraturas
onde a falha é menor que um milímetro (HULSE & HYMAN, 1998; FOSSUM,
2007). Ocorre reabsorção direta da linha de fratura, seguida por deposição de
osso lamelar pelos osteoblastos (REMEDIOS, 1999). O aspecto morfológico das
extremidades fraturadas se caracteriza por áreas de contato e outras onde estão
presentes lacunas pequenas de diferentes larguras. A reconstrução osteonal
primária ainda é subdividida em consolidações por contato e lacunar (HULSE &
HYMAN, 1998).
Na consolidação por contato, primeiro, a falha é preenchida por osso
fibroso, seguida de reconstrução óssea longitudinal e remodelação Haversiana de
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forma simultânea, por fim, em arranjo de osso lamelar ao longo do eixo
longitudinal do osso (FOSSUM, 1997; HULSE & HYMAN, 1998). Já na
consolidação por lacunas, o processo é muito semelhante ao da consolidação por
contato, com a diferença do osso lamelar arranjar-se primeiramente perpendicular
ao eixo do osso e depois, com o passar do tempo, o osso lamelar novo na lacuna
torna-se longitudinalmente orientado, e restabelece a integridade anatômica e
mecânica do córtex (HULSE & HYMAN, 1998).
A consolidação indireta ou reconstrução osteonal secundária por calo
intermediário ocorre quando as fraturas possuem um ambiente mecânico instável
(FOSSUM, 1997). Neste tipo de consolidação é necessário um ambiente com
micromovimentação para estimular a formação do calo ósseo, já que é dividida em
quatro estágios já descritos, inflamação, calo mole, calo duro e remodelação.
(HULSE & HYMAN, 1998; REMEDIOS, 1999) Essa pequena instabilidade produz
alterações piezoelétricas que aceleram a união óssea (REMEDIOS, 1999).
2.3. FATORES DE CRESCIMENTO ÓSSEO
O termo fator de crescimento define um grupo de polipeptídeos que está
envolvido na proliferação e diferenciação celular e na morfogênese de tecidos e
órgãos da embriogênese até a vida adulta. Estes podem agir como agentes
mitogênicos, melhorando a proliferação de certos tipos de células, ou serem
morfogênicos, alterando, assim, o fenótipo celular (URIST et al., 1983; LIND, 1998;
REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004). Esses fatores são sintetizados
por vários tecidos e tipos celulares e podem afetar células da mesma classe (ação
autócrina) ou de uma classe diferente (ação parácrina) (MOHAN & BAYLINK,
1991; BAYLINK et al.,1993; REMEDIOS, 1999).
As aplicações terapêuticas dos fatores de crescimento após o nascimento
envolvem o reparo de tecidos e órgãos danificados, e também regeneração ou
gênese de tecidos, induzindo novamente o processo de desenvolvimento que
possibilitou a criação do tecido ou órgão durante o desenvolvimento fetal ou pós-
natal (PEREIRA FILHO et al., 2004).
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A formação óssea é um processo regulado pela replicação celular óssea e
sua função diferenciada, a qual é representada por mudanças na síntese de
colágeno ósseo (CANALIS, 1985). Durante a consolidação óssea ocorre
expressão de diversos fatores de crescimento, sugerindo um forte envolvimento
dos mesmos com os processos de formação óssea e cartilaginosa (OREFFO,
2004). Modelos experimentais utilizando cultura celular de osteoblastos e modelos
clínicos revelam que os fatores de crescimento ósseo influenciam na atividade
celular, tornando-se ferramentas poderosas para a consolidação de fraturas e
aplicação de enxertos (LIND, 1998; KHAN et al., 2000). Os osteoblastos são
produtores de diversos fatores de crescimento ósseo. A produção desses fatores é
regulada por hormônios sistêmicos e mecanismos locais de estresse (BAYLINK et
al., 1993).
Os fatores de crescimento ósseo mais pesquisados recentemente são o
PDGF (Fator de crescimento derivado de plaqueta), IGFs (Fatores de crescimento
similar a insulina), TGFβ (Fator de crescimento transformador β), BMPs (Proteínas
ósseas morfogênicas), FGF (Fator de crescimento de fibroblastos) (MOHAN &
BAYLINK, 1991; REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004; PEREIRA
FILHO et al., 2004), EGF (Fator de crescimento epidérmico), Somatotropina
(hormônio de crescimento) (CANALIS, 1985; MASTROCINQUE et al., 2004), ETs
(Endotelinas) (STERN et al., 1995; LeROY et al., 2004), VEGF (Fator de
crescimento vascular endotelial) (STREET et al., 2002) e OGP (Peptídeo de
crescimento osteogênico) (SUN & ASHHURST, 1998).
2.3.1. Fator De Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF)
O PDGF foi um dos primeiros fatores de crescimento a ser identificado. O
caminho para o seu isolamento teve início com a descoberta de que fibroblastos
cultivados proliferavam somente quando completados com soro, mas o mesmo
ocorria quando se utilizava o plasma (PEREIRA FILHO et al., 2004). Sintetizado
nas plaquetas e armazenado em grânulos, também é produzido por monócitos,
macrófagos, células endoteliais, fibroblastos e células musculares, sendo
armazenado nas plaquetas (REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004),
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também são achados na matriz óssea (MOHAN & BAYLINK, 1991), em
leiomiócitos e nos capilares (BARBIERE & COSTA, 2004).
O PDGF apresenta três isoformas, PDGF-AA, PDGF-BB e PDGF-AB, essas
exercem seus efeitos sobre células alvo pela ativação de dois receptores, α e β.
Estes receptores são estruturalmente relacionados à proteína tirosinaquinase
(BARBIERE & COSTA, 2004).
Possuem atividade mitogênica potente para células mesenquimais incluindo
fibroblastos, leiomiócitos e osteoblastos e estimulam a expressão de TGFsβ
proveniente de macrófagos (MASTROCINQUE, et al., 2004). Atua indiretamente,
sobre a neovascularização, a síntese de colágeno e a reparação óssea. Estimula
a produção de várias moléculas da matriz extracelular, como fibronectina,
colágeno, colagenase, proteoglicanos e ácido hialurônico (BARBIERE & COSTA,
2004).
Após a fratura, PDGF é liberado pelas plaquetas e depositado no sitio de
fratura. Desta forma, promove proliferação fibroblástica, quimiotaxia para células
inflamatórias e mesenquimais e aumento da síntese de colágeno e cartilagem
(REMEDIOS, 1999). A atividade osteogênica aumentada já foi descrita em
osteotomia de tíbia em ratos e defeitos da calota craniana em coelhos
(MASTROCINQUE et al., 2004). A isoforma PDGF-BB é a que apresenta maior
efeito quimiotáxico sobre os osteoblastos (LIND, 1998).
2.3.2. Fator De Crescimento Similar a Insulina (IGF)
As IGFs são fatores secretados pelos osteoblastos durante a formação
óssea para aumentar a osteogênese e acelerar a deposição óssea (PEREIRA
FILHO et al., 2004), portanto, são reguladores do crescimento ósseo, estimulando
a replicação e a diferenciação celular (REMEDIOS, 1999).
Existem dois tipos, IGF-I e IGF-II. Cada um deles se liga a um receptor de
membrana IGF específico, que resulta em atividade de quinase, levando a mitose
de células formadoras de osso (PEREIRA FILHO et al., 2004). O IGF-II tem menor
efeito quimiotáxico em osteoblastos (LIND, 1998). O IGF-I chamado de
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somatomedina C, é sintetizado por hepatócitos sob a influência da somatotropina,
bem como de fibroblastos e osso (MILLIS, 1999).
O IGF-I é estocado na matriz óssea e possui efeito proliferativo dose
dependente em fibroblastos, precursores de osteoblastos e na síntese
osteoblástica de colágeno. Os IGFs inibem a degradação de colágeno por inibição
da expressão de colagenase, sendo o IGF-I, o inibidor mais potente (MILLIS,
1999). Proporcionam proliferação e aumento da atividade metabólica de
osteoblastos, estimulando a mitogênese, resultando em maior produção de
osteocalcina com grande especificidade para atividade osteoclástica, regulando a
maturação óssea e a mineralização da matriz óssea (MASTROCINQUE et al.,
2004). Também é responsável por anabolismo ósseo, atuando de forma autócrina
ou parácrina para os osteoblastos (PEREIRA FILHO et al., 2004). Causa aumento
na expressão de outros fatores de crescimento com os BMP-2 e BMP-4
(MASTROCINQUE et al, 2004).
2.3.3. Fator De Crescimento Transformador ββββ (TGF-ββββ)
Os TGFs-β constituem uma superfamília de mediadores locais que regulam
a proliferação e as funções da maioria das células dos vertebrados (PEREIRA
FILHO et al., 2004). Chamado de fator de crescimento multifuncional atua como
mediador da fisiologia celular normal e da embriogênese dos tecidos
(MASTROCINQUE et al., 2004). Também é considerado o maior regulador do
metabolismo ósseo (REMEDIOS, 1999).
A superfamília dos TGFs-β possui cinco mediadores (TGF-β1 a β5)
(REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004). São produzidos por plaquetas,
macrófagos, osteoblastos e osteócitos, sendo encontrados em maior quantidade
na matriz óssea e nas plaquetas (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999;
MASTROCINQUE et al., 2004; PEREIRA FILHO et al., 2004).
Muitas células normais possuem receptores para estes polipeptídeos, que
são ativados pela serina-tironina proteinoquinase. Osteoblastos e plaquetas
apresentam grande número destes, referidos como receptores I e II (MILLIS, 1999;
REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004).
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Os TGFs-β participam dos processos inflamatório e de reparação
(MASTROCINQUE et al., 2004) e são liberados a partir da degradação de
plaquetas no local da lesão, possibilitando e ajudando o início dos eventos de
reparação (MILLIS, 1999). Também são liberados por macrófagos e matriz óssea
e, adicionalmente, apresentam quimiotaxia para macrófagos, fibroblastos,
condrócitos e osteoblastos (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et
al., 2004). O tipo TGF-β1 tem forte quimiotaxia para osteoblastos (LIND, 1998,
PEREIRA FILHO et al., 2004) e quando atuam sobre osteoclastos, inibem a
reabsorção óssea (MILLIS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004).
Regulam a proliferação e diferenciação de células mesenquimais em
condroblastos, osteoblastos e osteoclastos, direcionado a consolidação óssea
(MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999), sendo mitogênicos para fibroblastos e
estimuladores potentes de colágeno, fibronectina e na produção de proteoglicanos
pelos osteoblastos (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Verifica-se em trabalhos realizados em ratos que sua aplicação
subperiosteal nos ossos do crânio e no fêmur ou em sítios de fratura resultam em
formação óssea, por proliferação periosteal, condrogênese e formação de osso
intramembranoso, mediante em ossificação endocondral (MILLIS, 1999;
REMEDIOS, 1999).
2.3.4. Proteínas Morfogênicas Ósseas (BMPs)
As BMPs são glicoproteínas e foram descritas por URIST (1962) como
substâncias que induzem a formação de osso e cartilagem em sítios extra-
esqueléticos. Desde então, cerca de 20 substâncias foram identificadas (MILLIS,
1999; GRANJEIRO et al., 2004; PEREIRA FILHO et al., 2004; GRANJEIRO et al.,
2005). Pertencem à superfamília de proteínas denominadas de fator de
crescimento transformador, da qual fazem parte pelo menos 43 membros
(MASTROCINQUE et al., 2004). Essas proteínas são tidas atualmente como as
mais promissoras em relação à osteoindução e apresentam potencial na
reparação de defeitos ósseos, conforme inúmeros experimentos animais,
15
principalmente a BMP2, BMP4 e BMP7 (PEREIRA FILHO et al., 2004). Estão
presentes na matriz óssea (MASTROCINQUE et al., 2004).
Há uma alta afinidade dessas proteínas por receptores específicos,
encontrados principalmente nas superfícies de membranas dos osteoblastos e
células semelhantes a fibroblastos, e como as BMPs agem nas células, elas
aumentam a expressão de marcadores associados a estas, como fosfatase
alcalina, receptores do paratormônio, osteocalcina e outras BMPs, e diminuem a
expressão de achados miogênicos para certas células (MILLIS, 1999;
GRANJEIRO et al., 2004). Células mesenquimais pluripotentes, progenitoras de
osteoblastos, mioblastos, fibroblastos e células neurais, respondem às BMPs
(GRANJEIRO et al., 2004).
Participam de muitas funções biológicas, incluindo crescimento e
diferenciação celular na embriogênese (MASTROCINQUE et al., 2004). BMPs
induzem irreversivelmente a diferenciação celular e a geração e regeneração
óssea são atribuídas a um coeficiente destas associadas a fatores de crescimento
derivados de osso (URIST et al., 1983). Sua atividade no processo de
osteoindução envolve a diferenciação de células mesenquimais pluripotenciais em
células osteogênicas (REMEDIOS, 1999), por exemplo, condroblastos e
osteoblastos, possuindo quimiotaxia pelas células mesenquimais, entretanto,
apesar de serem osteoindutores potentes, não possuem atividade mitogênica
(MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004; GRANJEIRO et al., 2005).
Dentre os tipos de BMPs, a dois, quatro, cinco, seis e sete, possuem
importância fundamental na regulação da formação do tecido esquelético e
reparação, e estas proteínas têm diferentes potenciais osteoindutores
(MASTROCINQUE et al., 2004). Células osteoprogenitoras da medula óssea são
mais responsivas à estimulação pelo tipo BMP2 (LIND, 1998). Induzem
principalmente a ossificação endocondral (GRANJEIRO et al., 2004).
Quando ocorre uma fratura, BMPs difusas pela reabsorção da matriz óssea,
ativam células osteoprogenitoras, resultando em mais produção de BMPs pelos
osteoblastos, induzindo a formação óssea no sítio da fratura (MILLIS, 1999). Em
experimentos com animais (macacos, ratos, coelhos, cães e carneiros) foram
16
observados resultados efetivos para consolidação de fraturas e formação de osso
lamelar (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999).
2.3.5. Fator De Crescimento de Fibroblastos (FGF)
O FGF é liberado por fibroblastos, osteoblastos, condrócitos, macrófagos,
ossos e células endoteliais no calo da fratura e armazenado na matriz óssea
(REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Seus efeitos são mais pronunciados na neovascularização e formação de
tecido de granulação no foco da fratura do que na função osteoblástica
(REMEDIOS, 1999). São mitogênicos para células endoteliais, fibroblastos,
condrócitos e osteoblastos. Estimula matriz óssea, deposição de colágeno e
angiogênese (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Existem duas formas distintas de FGF: FGF ácido e FGF básico (MILLIS,
1999). Estudo mostra que injeção de FGF básico imediatamente após formação
do calo fibroso da fratura, depois de quatro dias da lesão, causou efeito
significativo na consolidação da fratura (REMEDIOS, 1999).
2.3.6. Fator De Crescimento Epidérmico (EGF)
O EGF é encontrado em muitos tecidos e é liberado por plaquetas durante
sua degradação (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004). Embora muitas
células possuam receptores para EGF, células endoteliais, fibroblastos e células
epiteliais são as que possuem os receptores em maior quantidade, por isso existe
quimiotaxia maior por estes tipos celulares, estimulando a angiogênese e a
atividade da colagenase (MILLIS, 1999).
2.3.7. Somatotropina (STH) – Hormônio de Crescimento
A STH é um hormônio de crescimento produzido na hipófise anterior
(MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004) que possui efeitos anabólicos
generalizados. Possui ação importante no desenvolvimento de animais jovens,
particularmente no crescimento longitudinal dos ossos (MILLIS, 1999). Também
estimula a proliferação e função dos osteoblastos, eleva o crescimento de células
17
imaturas e a produção de IGF pelo fígado e osteoblastos, além de estimular a
produção de outros fatores de crescimento (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et
al., 2004). Podem afetar os osteoclastos, estimulando a reabsorção (MILLIS,
1999).
A STH atua diretamente em receptores próprios, produzindo efeito
anabólico em osteoblastos ou indiretamente, mediante estimulação parácrina dos
IGFs (MASTROCINQUE et al., 2004).
A STH aumenta em duas a cinco vezes a área óssea, o conteúdo mineral e
a densidade ósseas. Em cães foi testada uma STH recombinante com bons
resultados. Experimento realizado com animais, utilizando a STH sistêmica e local
em técnicas de osteotomia, apresentaram bons resultados na consolidação óssea
(MILLIS, 1999).
2.3.8. Endotelinas (ETs)
As ETs são polipeptídeos vasoativos produzidos por vários tecidos e que
também atuam em muitos deles (STERN et al., 1995). Modulam o metabolismo
ósseo regulando, osteoblastos, condrócitos e osteoclastos (KITTEN & ANDREWS,
2001). Existem dois tipos: ET-1 e ET-2 que, respectivamente, agem em receptores
ET-A e ET-B, existentes principalmente nos osteoblastos. Também podem
estimular a síntese de proteínas colágenas e não colágenas, afetar o metabolismo
do cálcio por meio de ações inibitórias da secreção do paratormônio e estimular a
reabsorção dependente de prostaglandinas. Especificamente a ET-1 pode
aumentar os níveis de interleucina – 1, induzindo o aumento de interleucina – 6
(STERN et al., 1995).
2.3.9. Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF)
Sua principal habilidade é a neovascularização (angiogênese), interferindo
diretamente na formação do calo e posterior ossificação, endocondral e
intramembranosa (STREET et al., 2002).
18
2.3.10. Peptídeo de Crescimento Osteogênico (OGP)
OGP estimula a formação óssea e pode acelerar a consolidação da fratura.
Em um experimento, a administração sistêmica de OGP acelerou a formação do
calo ósseo por meio de ossificação endocondral, resultando em diminuição no
tempo de consolidação, principalmente nos casos de instabilidade mecânica da
fratura (SUN & ASHHURST, 1998).
2.4. A PRÓSTATA DO CÃO
Segundo BARSANTI (1995) e BASINGER et al. (1998), a próstata é a única
glândula sexual anexa presente no cão, sendo relativamente grande, com
estrutura densa e compacta, apresentando coloração amarela (ELLENPORT,
1986). No cão é ovóide, bilobada, constituída por cápsula e estroma, ambos
formados por tecido muscular liso, fibroblastos e colágeno. Possui septos
irregulares na região dorsal, que se estendem até o tecido conjuntivo periuretral,
dividindo-a em dois lobos (STABENFELDT & EDQVIST, 1988). Apresenta, na
porção ventral quantidade variável de tecido adiposo (BARSANTI, 1995).
Nos cães adultos, as células epiteliais predominam e o estroma ocupa 10%
do volume, decorrente do aumento das concentrações plasmáticas de
testosterona (BARSANTI, 1995), ao contrário da fase pré-púbere onde o estroma
é predominante (ELLENPORT, 1986).
Embora grande parte das células epiteliais (90 a 95%) produza secreções,
o material secretório fica geralmente armazenado no interior do citoplasma celular
e não nos alvéolos. As células secretoras apresentam forma colunar e cubóide,
possuem citoplasma intensamente eosinofílico e, freqüentemente, formam
pregueamentos alveolares característicos (BASINGER et al., 1998). Estas células
constituem o epitélio colunar secretor (BARSANTI, 1995). Células basais
indiferenciadas localizadas ao longo da membrana basal constituem as células
epiteliais restantes (BASINGER et al., 1998), que se acredita serem as
precursoras do epitélio secretório (BARSANTI, 1995). O epitélio glandular colunar
muda para epitélio transicional na região dos ductos secretórios, em sua porção
distal, onde se abrem no interior da uretra (BARSANTI, 1995).
19
Após o nascimento, a glândula situa-se no interior do abdômen, até que
ocorra a degeneração do úraco remanescente, por volta dos dois meses de idade,
quando migra para a cavidade pélvica (BASINGER et al., 1998).
Em animais pré-púberes a próstata normalmente é observada como um
pequeno aumento de volume nodular na porção proximal da uretra, não atingindo
mais que 1cm de diâmetro na raça Beagle. Durante a puberdade, a próstata
cresce (BASINGER et al., 1998), limitando-se ao espaço retroperitonial caudal à
bexiga urinária, ventral ao reto e dorsal à sínfise púbica e parede abdominal
(GREEN & HONCO, 1996). A bexiga urinária repleta desloca cranialmente a
próstata, e quando a glândula está vazia, pode ser visibilizada a aproximadamente
2,5cm ou mais da borda cranial do púbis (ELLENPORT, 1986).
Fisiologicamente, a função secretória da próstata parece estar associada
ao transporte e manutenção dos espermatozóides, não interferindo na fertilidade.
Basicamente, o fluido prostático é composto por sódio, potássio, cloreto, zinco e
proteína, sendo esta última de concentração baixa quando a secreção não é
induzida pela ejaculação (BASINGER et al., 1998).
A arginina-esterase, uma protease também conhecida como proteína
específica prostática canina (PEPC), foi identificada no plasma seminal do cão,
sendo considerada marcador imunológico específico da glândula normal e
hiperplásica (SOUZA & TONIOLLO, 2001).
Por fim, o antígeno prostático específico (APE), completa a lista dos
marcadores prostáticos, porém há controvérsias quanto à sua produção e
secreção pela próstata canina (SOUZA & TONIOLLO, 2001).
Células prostáticas normais são encontradas em grupos ou blocos,
possuem núcleo redondo e citoplasma acidofílico (BURKHARD & MEYER, 1996).
O núcleo, pequeno e pouco destacado (MUZZI, 1998), possui padrão reticular ou
pontilhado e o citoplasma discretamente granular. Essa conformação é chamada
de padrão em favo de mel (MUZZI, 1998; ZINKL, 1999).
20
2.5. METÁSTASE ÓSSEA NA NEOPLASIA PROSTÁTICA
A incidência de neoplasias prostáticas em cães é baixa (GADELHA, 2003).
BARSANTI (1995) e JOHNSTON et al. (1991) relatam ocorrência de 5% e 0,2 a
0,6%, respectivamente, entre todas as prostatopatias. Os adenocarcinomas são
os mais freqüentes e, com maior incidência, em cães apresentando 10 anos de
idade em média (DI SANTIS et al., 2001). Um estudo realizado com 52 cães na
região de Ribeirão Preto demonstrou 2,63% de ocorrência das neoplasias
prostáticas, 100% delas adenocarcinoma. As ocorrências de hiperplasia próstatica
benigna e de hiperplasia prostática benigna cística foram de 35,53% e 19,74%
respectivamente, mostrando alta prevalência em cães (LACRETA JUNIOR, 2004).
O câncer prostático em cães é clinicamente agressivo e altamente invasivo,
provocando metástases através dos linfonodos ilíacos externos e internos ou dos
plexos venosos vertebrais e, sistêmico, para as vértebras e pulmões. Pode ainda
expandir, invadindo a bexiga urinária e ureteres, assim como a musculatura da
pelve e do cólon. Há também, a possibilidade de ocorrência da metástase para o
coração, rins, mesentério e omento (BARSANTI & FINCO, 1984; JOHNSTON et
al. 1991; DI SANTIS et al. 2001; GADELHA, 2003).
Os sinais clínicos mais comuns de neoplasia são hemorragia uretral,
estrangúria, tenesmo, hematúria, anorexia e perda de peso, dor a palpação do
abdome caudal, dor lombar, dificuldade de locomoção e distúrbios gastrintestinais
(JOHNSTON et al., 1991; KRAWIEC & HEFLIN, 1992; BARSANTI, 1995).
O prognóstico ruim associado ao câncer de próstata no cão pode, em parte,
ser atribuído ao diagnóstico tardio da afecção (GADELHA, 2003).
Há uma importante interação entre os tumores prostáticos e o osso
(BENTLEY et al., 1992). Muitos mecanismos moleculares regulam a patogênese
do carcinoma prostático, sua proliferação e progressão para metástases ósseas
(DEFTOS, 2000). Metástases ósseas são manifestações comuns em pacientes
com câncer prostático avançado. A principal característica destas é a habilidade
em induzir lesões osteoblásticas, que são observadas por neoformação óssea na
trabeculação medular e por diversos graus de reabsorção óssea osteoclástica. As
lesões metastáticas de outros carcinomas, como do cólon, mama e pulmão,
21
normalmente manifestam-se de forma osteolítica, embora uma pequena
porcentagem de carcinomas mamários possa conter também um componente
osteoblástico (GOLTZMAN, 1997; KELLER et al., 2001; LeROY et al., 2002). O
mecanismo tecido específico responsável pela aparência osteoesclerótica do
carcinoma prostático não é totalmente conhecido. Numerosos fatores produzidos
pelas células prostáticas, normais e neoplásicas, têm potencial para estimular a
neoformação óssea, agindo sobre os osteoblastos e osteoclastos (LeROY et al.,
2004). Essas interrelações entre fatores de crescimento, neoplasia prostática e
metastáse osteoblástica são mediadas tanto por ações celulares autócrinas
quanto parácrinas (KOUSTSILIERIS, 1993).
A próstata pode expressar fatores de crescimento ósseo, em particular,
BMPs. Esta situação sugere que as BMPs podem participar da atividade
osteoindutiva das metástases ósseas nas neoplasias prostáticas e que o padrão
de expressão destas proteínas pode ser importante na patogênese de metástase
osteoblástica associada com o adenocarcinoma prostático (BENTLEY et al., 1992;
BOYCE et al., 1999). Outros fatores de crescimento conhecidamente produzidos
pelas células do câncer de próstata e que podem eventualmente contribuir com a
capacidade dessas células estimularem metástases por neoformação óssea são
os TGFs e os FGFs (HARRIS et al., 1994; GUISE & MUNDY, 1998; BOYCE et al.,
1999; DEFTOS, 2000). Interleucinas (IL -1β, IL –6) e fator de necrose tumoral
(TNF - α) também já foram implicados no desenvolvimento de metástases
osteoblásticas (RITCHIE et al., 1997; BOYCE et al., 1999; DEFTOS, 2000). A
expressão de osteoprotegerin (OPG) aumenta em pacientes com câncer de
próstata com metástase óssea, sugerindo sua participação na característica
osteoblástica dessas metástases (BOYCE et al., 1999; COREY et al., 2005).
Dentre todos os fatores de crescimento que desenvolvem resposta
osteoblástica nas metástases do câncer de próstata, a ET-1 e o PTHrP tem sido
identificados como fatores de neoformação óssea potenciais (GUISE & MUNDY,
1998; NELSON et al., 1999; CHIAO et al., 2000; DEFTOS, 2000). Guise et al.
(2003) sugeriram que a formação de metástases ósseas osteoblásticas por
estimulação da proliferação de osteoblastos e neoformação óssea podem ser
22
mediadas por ETs-1 produzidas pelo tumor. Células tumorais localizadas nos
ossos produzem fatores, como as ET-1, que estimulam a atividade osteoblástica,
resultando em neoformação óssea abundante e desorganizada, características
das metástases osteoblásticas (GUISE & MOHAMMAD, 2004). Experimento
realizado por LeROY et al. (2004) apresentou resultados indicando que a ativação
osteoblástica pela próstata ocorre por mecanismo endotelina dependente. As
células prostáticas contém significativa quantidade de ET-1 imunorreativa e
também possuem expressão de receptores específicos para ET-1 (ISHIZAKA et
al., 1999).
LeROY et al. (2002) realizaram experimento utilizando ratos, onde
comprovaram que a implantação de fragmento de próstata com algum grau de
hiperplasia benigna, na região do calvário de ratos, foi capaz de induzir
neoformação óssea. Na avaliação histológica observaram que a neoformação
óssea apresentava hipercelularidade, comparada ao osso pré-existente, aparência
desorganizada, aumento do número de espaços vasculares, osteólise do calvário
e aumento significativo no número de osteoclastos. Havia também um grau
moderado de proliferação celular ao redor do tecido prostático implantado, que
exibia vários graus de degeneração. Ao contrário da próstata, fragmentos de
outros orgãos, como músculo, rim, bexiga e baço, implantados nos animais do
grupo controle e também a escarificação do periósteo no calvário dos animais do
mesmo grupo, não desenvolveram neoformação óssea, assim como proliferação
celular ao redor do implante.
LeROY et al. (2004) observaram que existem mecanismos na próstata livre
de neoplasia, mediados por fatores de crescimento, como as ETs, que influenciam
diretamente esse processo de neoformação óssea.
23
3. OBJETIVOS
3.1. Avaliar a eficácia osteoindutora por meio da implantação de fragmentos da
próstata do cão em falhas ósseas experimentalmente provocadas em rádio de
coelhos.
3.2. Avaliar se há diferenças radiográficas e histológicas da neoformação óssea
dentro das falhas ósseas entre os grupos controle e tratado.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. ANIMAIS
Foram utilizados 28 animais da espécie leporina, machos, adultos jovens,
da raça Nova Zelândia branca, não castrados, com peso variando entre três e
quatro quilogramas. Os coelhos foram obtidos biotério do Hospital Veterinário
Halim Atique, da Universidade de Rio Preto (UNIRP), mantidos em gaiolas
individuais e alimentados com água potável e ração apropriada1 ad libitum.
A próstata foi obtida de três cães adultos jovens atendidos no Hospital
Veterinário da Universidade de Rio Preto (UNIRP) que vieram a óbito ou foram
eutanasiados, excluindo aqueles de causa infecciosa. Esses animais foram
utilizados mediante autorização dos proprietários. A próstata foi removida durante
a necropsia e conservada em meio de cultura refrigerado2 a 4°C. Todos os
animais apresentavam algum grau de hiperplasia prostática benigna ou hiperplasia
prostática benigna cística.
4.2. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados 28 coelhos distribuídos em dois grupos, cada um com 14
indivíduos, denominados grupo tratado (GT) e grupo controle (GC). Cada grupo foi
subdividido em dois outros grupos com sete animais cada (GT1 e GT2 – GC1 e
GC2), de acordo com o tempo de avaliação histológica de 30 (GC1 e GT1) e 60
(GC2 e GT2) dias, respectivamente.
4.2.1. Grupos Tratados (GT1 e GT2)
Nos animais destes grupos foi implantado o fragmento da próstata do cão,
previamente preparado, no terço distal da diáfise do osso rádio direito, após a
ostectomia parcial (falha óssea).
4.2.2. Grupos Controle (GC1 e GC2)
Os animais destes grupos foram submetidos ao mesmo procedimento
cirúrgico do grupo tratado, porém sem o implante do fragmento da próstata. 1 Ração para coelhos Linha Natural - PURINA 2 Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium/Nutrient Mixture F-12 Ham – SIGMA-ALDRICH
25
4.3. PREPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA PRÓSTATA DE CÃO
Em princípio foi realizada a restituição do meio de cultura, base para o
experimento. Para esta restituição foram usadas 22g de meio de cultura em pó,
diluídas em 900 mL de água destilada. A diluição foi realizada, adicionando
lentamente o meio de cultura em pó à água destilada e misturado-o com auxílio de
agitador automático, para que a mistura ficasse homogênea. Após a diluição, o pH
foi aferido (5,9) e corrigido (6,8), com uso de hidróxido de sódio3, a fim de
tamponar o meio de cultura. Em seguida completou-se a diluição com a adição de
mais 100mL de água destilada. O meio então foi submetido à filtração, utilizando
filtro de membrana de 22 micras4 e armazenado em recipiente de vidro estéril sob
refrigeração a 4°C.
Os fragmentos da próstata de cão foram obtidos de animais sexualmente
adultos, dois sem raça definida (SRD) e um da raça Boxer, imediatamente após o
óbito ou eutanásia. O tempo entre a morte do animal e a extração da próstata não
ultrapassou 20 minutos. A próstata foi removida em bloco após exteriorização da
bexiga urinária seguida de ligadura da uretra. Ato contínuo à remoção, a mesma
foi armazenada em solução refrigerada de meio de cultura contendo 10µg/mL de
sulfato de gentamicina5 apenas para o transporte até o laboratório. Depois de
retirada do meio refrigerado, foi lavada três vezes, utilizando o mesmo meio de
cultura, porém sem o sulfato de gentamicina. Foram retirados o tecido conectivo
periprostático, a cápsula fibrosa e a uretra e, em seguida, a próstata foi
seccionada em fragmentos com 0,8cm de comprimento e 0,2cm de largura, que
foram colocados em solução de meio de cultura base contendo 100mg/mL de
colagenase6. Imersos na solução os fragmentos ficaram acondicionados em
estufa7 a 37°C durante três horas, onde sofreram digestão enzimática. Após
digestão enzimática os fragmentos foram lavados uma vez na solução de meio de
cultura base enriquecido com 5% de soro fetal bovino8 e três vezes apenas em
3 Sodium hydroxide solution - SIGMA-ALDRICH 4 Filtro de membrana - MILLEX 5 Gentatec (40mg/ml) – CHEMITEC AGRO-VETERINÁRIA LTDA 6 Collagenase, Crude: Type IA – SIGMA-ALDRICH 7 Estufa de cultura Mod 502 - FANEM 8 Soro fetal bovino (inativado, estéril, isento de Mycoplasma) – CULTILAB MAT. CULT. LTDA
26
meio de cultura base, só então foram levados ao centro cirúrgico para serem
implantados nos animais.
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados em câmara de fluxo
laminar vertical9.
4.4. PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os coelhos foram submetidos a jejum alimentar de oito horas, com água a
vontade, previamente às condutas operatórias. No pré-operatório imediato (30
minutos antes do ato cirúrgico) receberam antibioticoterapia à base de
enrofloxacina a 5%10, na dose de 5mg/Kg, por via subcutânea.
Os animais foram pré-medicados com 0,06 mg/kg de sulfato de atropina11
via subcutânea e 1mg/kg de cloridrato de tramadol12, via intramuscular. Após
quinze minutos foi realizada a indução anestésica com cloridratos de cetamina13
(30mg/kg) e xilazina14 (2mg/kg), na mesma seringa, via intramuscular. A
manutenção anestésica foi realizada em aparelho de anestesia inalatória15 com
uma mistura de oxigênio16 (O2) e isoflurano17, por meio de vaporizador universal18,
com máscara, em sistema aberto tipo Baraka. Após o procedimento cirúrgico os
animais foram medicados, por via intramuscular com, flunixin meglumina19 na dose
de 1mg/kg e ioimbina20 na dose de 0,8mg/kg.
O ato cirúrgico foi realizado no membro torácico direito de cada parcela
experimental, que foi tricotomizado e preparado adequadamente com a devida
anti-sepsia. Para o acesso cirúrgico do osso rádio foi realizada uma incisão
longitudinal com aproximadamente quatro centímetros incluindo pele e tecido
subcutâneo na face dorso-medial do antebraço, a cinco centímetros proximal do
carpo (Figura 1A), até a localização do periósteo, que também foi incisado
9 Bio Seg 09 – GRUPO VECO 10 Enrotec 50 (50mg/ml) – FATEC S/A 11 Sulfato de atropina (0,5mg/ml) - ARISTON 12 Cloridrato de tramadol (50mg/ml) genérico – UNIÃO QUÍMICA 13 Dopalen (100mg/ml) - VETBRANDS 14Dopaser (20mg/ml) - CALIER 15 Aparelho de anestesia 2605 serie Origami - TAKAOKA 16 Oxigênio comprimido medicinal – WHITE MARTINS 17 Forane - ABBOTT 18 Multiagente Modular 1410 - TAKAOKA 19 Meflosyl (50mg/ml) – FORT DODGE 20 Ioimbina (0,5%) - FARMÉDICA
27
longitudinalmente, afastado e mantido afastado junto à musculatura adjacente,
assim sendo, expondo a diáfise do rádio (Figura 1B).
A ostectomia parcial, com aproximadamente um centímetro (Figura 1C) foi
realizada no terço distal da diáfise do rádio, perpendicularmente ao eixo
longitudinal, a quatro centímetros da articulação do carpo, com auxílio de uma
serra oscilante21 (Figura 1D), umedecendo o local constantemente com solução de
cloreto de sódio a 0,9%22, evitando assim o aquecimento e a conseqüente necrose
do tecido ósseo. Com intuito de preservar a ulna e os tecidos moles adjacentes ao
local da ostectomia, foram utilizadas lâminas metálicas e curetas odontológicas
entre o rádio e a ulna, através do ligamento interósseo, que também foi excisado.
Este procedimento proporcionou uma falha óssea de aproximadamente um
centímetro de extensão (Figuras 1E e 1F). No grupo tratado, depois de
inspecionar e lavar a falha óssea (sítio do implante) com solução de cloreto de
sódio a 0,9%, foram implantados dois fragmentos da próstata de cão previamente
preparados, com aproximadamente 0,8cm de comprimento e 0,2cm de largura, de
maneira que ficassem justapostos ao periósteo nas porções proximais e distais da
falha (Figuras 1G e 1H). Ato contínuo foi realizada a sutura da fáscia muscular e
da pele com pontos simples separados utilizando mononylon 3-023 (Figuras 1I e
1J).
O mesmo procedimento foi realizado no grupo controle, porém sem a
implantação dos fragmentos da próstata do cão.
No pós-operatório, os animais foram medicados durante cinco dias com
enrofloxacina a 5% na dose de 5mg/Kg, por via subcutânea uma vez ao dia e, por
três dias, flunixin meglumina na dose única diária de 1mg/kg, por via subcutânea.
21 Gison pneumatic tools – Modelo NO. GP-931 22 JP indústria farmacêutica S.A. 23 Mononylon 3-0 ETHICON
28
A B
C D
E F
Figura 1. Imagens fotográficas ilustrando o procedimento cirúrgico de ostectomia do rádio de coelhos. Em A, incisão da pele; em B, exposição da porção distal da diáfise do osso rádio e colocação das curetas entre o rádio e a ulna; em C, mensuração da região da ostectomia do rádio; em D, corte do osso com serra oscilante; em E, retirada do fragmento ósseo; em F, falha óssea produzida no rádio.
29
4.5. AVALIAÇÃO PÓS-OPERATÓRIA
4.5.1. Avaliação clínico-cirúrgica
Os animais foram acompanhados e observados, a fim de se verificar
qualquer alteração de comportamento, reação tecidual na ferida cirúrgica,
claudicação e sensibilidade no apoio, ingestão alimentar e deambulação.
4.5.2. Avaliação radiográfica
Os animais dos grupo GC1 e GT1 foram submetidos a exame radiográfico
do membro torácico em dois momentos: no pós-operatório imediato e 30 dias após
o procedimento cirúrgico. Foram confeccionadas radiografias em projeções
mediolaterais dos membros operados.
Figura 1. (continuação) Imagens fotográficas ilustrando o procedimento cirúrgico de ostectomia do rádio de coelhos. Em G e H, colocação do implante prostático com auxílio de cânula plástica; em I, sutura das fáscias musculares e em J, sutura de pele.
J
G H
I
30
Os animais dos grupos GC2 e GT2 também foram avaliados
radiograficamente, em três momentos: no pós-operatório imediato, 30 e 60 dias
após a cirurgia.
Os exames radiográficos foram realizados em aparelho de Raios-X24, sobre
a mesa, utilizando filmes radiográficos Kodak25, montados em chassi metálico26
com écrans intensificadores27. As radiografias foram confeccionadas utilizando
técnica radiográfica com 30Kvp e três mAs.
Os filmes foram identificados com auxílio de um identificador luminoso28 e
processados automaticamente29.
A avaliação da reparação óssea foi feita mediante a visibilização de reação
proliferativa periosteal observada durante a interpretação radiográfica.
4.5.3. Avaliação das preparações histológicas
Os animais dos grupos GC1 e GT1 foram sacrificados conforme
recomendações do Institute of Laboratory Resources, 1996, no 30˚ dia do pós-
operatório. A ulna e o rádio direitos dos animais foram retirados em bloco durante
a necropsia e os tecidos moles removidos. Os fragmentos ósseos foram fixados
em formol tamponado (pH 7,4) com fosfatos a 10% por 48 horas em temperatura
ambiente. Depois de fixados foram descalcificados em solução de ácido nítrico a
5% por cinco dias em temperatura ambiente. Após a descalcificação, os
fragmentos distal e proximal à falha foram serrados e inseridos em bloco de
parafina30. Os blocos prontos foram levados ao micrótomo31 e cortados
transversalmente com espessura de 4µm, em ato contínuo, dispostos em lâminas
de vidro, corados com hematoxilina32 e eosina33 e recobertos com lamínulas. As
preparações foram avaliadas por microscopia de luz34 em aumentos de 4x e 10x.
Durante a avaliação histológica foram observadas a espessura do córtex, a 24 Raicenter modelo RC 600 plus 25 Kodak MXG 18X24 26 Metaltronica 18x24 27 Kodak Lanex 28 Metaltronica 29 Macrotec MX-2 30 Erv-plast - ERVIEGAS 31 Leitz mod 1512 32 Hematoxilina-Harris - INBRALAB 33 Eosina amarela - VETEC 34 Microscópio Leica mod DMLS
31
arquitetura tecidual, ocorrência de necrose ou apoptose, interações das interfaces
osso/implante, como reação periosteal proliferativa, osteolítica e formação de
cápsula fibrosa ao redor do implante (rejeição) e suas diferenças entre os grupos
tratados e não tratados.
O mesmo procedimento foi realizado nos grupos GC2 e GT2, sacrificados
aos 60 dias do pós-operatório.
32
5. RESULTADOS
Nas avaliações radiográficas dos ossos rádio e ulna no pós-operatório
imediato, para ambos os grupos, controle (GC) e tratado (GT), visibilizou-se que
as falhas ósseas foram bem confeccionadas, mantendo um centímetro de
comprimento, com as bordas dos fragmentos sem anfractuosidades ou esquírolas
ósseas (Figuras 2A e 2B).
Nas radiografias confeccionadas aos 30 dias do pós-operatório do grupo
controle (GC1), foi visibilizado preenchimento da mesma por material radiopaco, e
discreta proliferação periosteal regular na cortical da ulna adjacente à falha óssea
Figura 2. Imagem radiográfica em projeções mediolateral da falha óssea (setas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho no pós-operatório imediato. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos da próstata) e em B, grupo tratado (com implante de fragmentos da próstata).
A B
33
produzida no rádio (Figura 3A). Já nas radiografias aos 60 dias (GC2), os
fragmentos da ostectomia apresentaram-se arredondados com proliferações
ósseas periosteais discretas partindo dos fragmentos distal e proximal da falha
óssea (pontes) e preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo
(Figura 3B), não apresentando alterações radiográficas mais intensas quando
comparadas às imagens obtidas aos 30 dias do pós-operatório.
No grupo tratado (GT1), visibilizou-se nas imagens radiográficas aos 30
dias do pós-operatório, proliferação periosteal regular nos fragmentos da
A
Figura 3. Imagem radiográfica em projeções mediolaterais da falha óssea (setas pequenas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos da próstata) após 30 dias do procedimento cirúrgico e em B, grupo controle após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar em A e B, o preenchimento da falha óssea por material radiopaco, reação periosteal regular da cortical da ulna adjacente à falha óssea do rádio e formação de ponte óssea (seta grande).
B A
34
ostectomia e no córtex do osso ulna, adjacente à falha óssea produzida no osso
rádio com bom preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo
(Figura 4A). Nas imagens radiográficas do grupo tratado (GT2) aos 60 dias do
pós-operatório, a proliferação periosteal dos fragmentos foi mais evidente e
juntamente com a proliferação periosteal e aumento de espessura cortical da face
cranial da ulna, preencheram quase toda a falha (Figura 4B).
Figura 4. Imagem radiográfica em projeções médio lateral da falha óssea (setas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 30 dias do procedimento cirúrgico. Em B, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar em A e B, o preenchimento da falha óssea por material radiopaco, a reação periosteal regular cortical da ulna adjacente a falha óssea do rádio e espessamento cortical da ulna (seta grande).
B A
35
Ao se avaliar comparativamente as radiografias dos animais aos 60 dias de
pós-operatório, notou-se que, o preenchimento da falha por neoformação óssea foi
mais intenso e mais rápido no grupo tratado (GT2) quando comparado aos
animais do grupo controle (GC2) (Figuras 5A e 5B).
Figura 5. Imagem radiográfica em projeções mediolaterais da falha óssea em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico e em B, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar que o preenchimento da falha óssea é mais evidente em B no grupo tratado.
B A
36
Na avaliação histológica dos fragmentos distal e proximal do rádio realizada
a partir de material coletado após sacrifício dos animais do grupo controle (GC1) e
tratado (GT1) aos 30 dias de pós-operatório, foram encontradas as seguintes
alterações: nas preparações histológicas do grupo controle (GC1) havia
neoformação óssea ao redor dos fragmentos da ostectomia, sem alterações na
espessura cortical e das superfícies periosteal e endosteal. O tecido ósseo
neoformado mostrou-se organizado e com crescimento regular (Figuras 6A, 6B,
7A e 7B). Foram observados osteoblastos nas bordas ósseas e concentração
discreta de osteoclastos.
Nas preparações histológicas do grupo tratado (GT1), foi possível observar
tecido prostático íntegro assim como células endoteliais (Figura 6D). A
neoformação óssea mostrou-se mais desorganizada (Figuras 6C, 6D, 8A e 8B) em
comparação ao grupo controle e localizada adjacente ao implante de tecido
prostático. O córtex apresentou-se mais delgado com superfície periosteal
irregular (Figura 6C). Também foram observados osteoblastos nas bordas ósseas
e maior concentração de osteoclastos. Tecido fibronecrótico sugerindo a formação
de cápsula membranosa foi observado ao redor do implante (Figura 6D).
37
Na avaliação das preparações histológicas dos animais do grupo controle
(GC2) e tratado (GT2), ambos com 60 dias pós-operatório, notou-se neoformação
óssea mais intensa e com maior espessura nos animais do GT2 (Figuras 8C, 8D,
8E e 8F) comparados aos animais do GC2 (Figuras 7C e 7D). Nas preparações
histológicas do GT2 também notou-se maior irregularidade do córtex ósseo e
maior quantidade de lacunas na neoformação óssea quando comparado ao GC2
(Figuras 7C, 8D e 8F).
Figura 6. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Em A (4x) e B (10x), grupo controle (GC1). Notar neoformação óssea organizada (NO) adjacente ao córtex ósseo do rádio (CT) sem alterações; em C (4x) e D (10x), grupo tratado (GT1). Notar neoformação óssea desorganizada (NOD) adjacente ao córtex ósseo do rádio caracterizando irregularidade e lise (CTL) e fragmento prostático (FP) envolvido por tecido fibronecrótico (FN). HE
NO
NO
CT
NOD
NOD
CTL
FP
FN
A B
C D
38
A B
C D
Figura 7. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Grupos controle (4x), A e B (GC1) e, C e D (GC2). Notar neoformação óssea organizada (NO) adjacente ao córtex ósseo do rádio (ct) sem alterações. Em B (GC1) e D (GC2) nota-se desorganização discreta da neoformação óssea (NOD). HE
NO NO
NO NOD
ct ct
ct
ct
39
B A
C D
E F
Figura 8. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Grupos tratados (4x), A e B (GT1) e, C, D, E e F (GT2). Notar em todas as figuras extensa neoformação óssea desorganizada (NOD) com a formação de lacunas em vários graus. A córtex do rádio (ct) apresentou adelgaçamento em vários graus. HE
NOD
NOD
NOD
NOD
NOD NOD
ct
ct
ct
ct
ct ct
40
Nas preparações histológicas dos animais do grupo tratado (GT2) a partir
do terço distal da ulna, adjacente à falha óssea obtida por meio de procedimento
cirúrgico, notou-se neoformação óssea com as mesmas características e
intensidade das encontradas nos fragmentos proximal e distal do rádio, com
exceção do córtex que efetivamente não apresentava o mesmo grau de
adelgaçamento (Figuras 9 A e 9B).
A B
Figura 9. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso ulna de coelhos. Em A e B (4x), grupo tratado (GT2). Neoformação óssea desorganizada (NOD) com a formação de lacunas em vários graus. A córtex da ulna (ctu) evidenciou adelgaçamento discreto. HE
NOD NOD
ctu ctu
41
6. Discussão
A colheita e preparação dos fragmentos da próstata deste estudo seguiram
a mesma metodologia empregada por LeRoy et al. (2002), entretanto, os
fragmentos produzidos, não eram suficientemente firmes, e acabavam se
desfazendo com a manipulação constante. Desta maneira, foram realizados
ajustes na dose da colagenase de 200mg/mL para 100mg/mL e no tempo de
digestão enzimática em estufa, de quatro para três horas. Esses ajustes
permitiram a confecção de um fragmento de 0,8cm x 0,2cm, considerado
suficientemente resistente para manipulação até o momento do implante. Acredita-
se que as condições morfológicas das próstatas utilizadas, possam ter interferido,
pois com doses e tempos maiores, LeRoy et al. (2002), obtiveram fragmentos
ideais com aproximadamente 1mm3. A finalidade da preparação dos fragmentos
prostáticos foi manter as células próstaticas viáveis e remover o colágeno dos
fragmentos, a fim de obter maior contato entre as células endoteliais prostáticas e
o osso, permitindo que os fatores crescimento ósseo que estão na membrana
celular interagissem com o mesmo.
O coelho é um modelo experimental muito usado nos estudos que
envolvem a fisiopatologia óssea frente às fraturas e seus diferentes tipos de
tratamento. Muitos modelos experimentais são utilizados para estudar o processo
de consolidação de fraturas, o problema é que devido às diferenças anatômicas,
biológicas e técnicas, nem sempre esses modelos possuem parâmetros
adequados para a espécie de interesse final, para qual se realiza o experimento.
Independente de vantagens e desvantagens próprias de cada modelo, o ideal será
aquele que melhor se adeqüar ao estudo proposto (MATOS et al., 2001).
Aproximadamente 35% de todos os estudos científicos do sistema músculo-
esquelético são realizados em coelhos (PEARCE et al., 2007). Já foram descritos
estudos ortopédicos usando coelhos como modelos experimentais com diversas
finalidades, dentre elas, o uso de enxertos, comportamento da consolidação de
fraturas, técnicas cirúrgicas ortopédicas, uso de fatores de crescimento, utilização
de materiais biológicos e sintéticos como indutores de crescimento ósseo, entre
outras. Algumas vantagens do uso desses animais são a facilidade de manuseá-
42
los, o porte (tamanho), baixo custo de manutenção, não requer muito espaço para
mantê-los durante o período experimental e especialmente a curta maturidade
esquelética, cerca de seis meses após a maturidade sexual (MATOS et al., 2001;
PEARCE et al., 2007). Em comparação com outras espécies, as alterações ou
mudanças no esqueleto do coelho são mais rápidas, assim como a fase de
remodelação óssea (PEARCE et al., 2007), desta forma, otimiza e diminui o tempo
do experimento. TAVARES et al. (1994), BARROS et al. (2001), DEL CARLO et al.
(2003), LIMA et al. (2004), MORAES et al. (2004), MIRANDA et al. (2005) e CIANI
et al. (2006) utilizaram a ostectomia do osso rádio em coelhos com sucesso. Por
esses motivos o coelho foi escolhido como modelo experimental para essa
pesquisa, assim como a ostectomia do osso rádio como a sede da lesão
experimental.
TAVARES et al. (1994), MORAES et al. (2004) e MIRANDA et al. (2005),
utilizaram técnica anestésica fixa com cetamina e cloridrato de xilazina em
coelhos. Tentou-se reproduzir as técnicas descritas por estes autores e não
obtêve-se êxito. A analgesia foi pobre e os animais apresentavam dor quando o
periósteo era pinçado. Isto pode ser explicado pela extensa gama de
medicamentos com mesmo princípio farmacológico, porém produzidos por
empresas diferentes, portanto com suas particularidades em relação à ação dos
princípios, ou ainda, por conta do tipo de ambiente que pode oferecer estímulos
diferentes, mais ou menos intensos. A modalidade anestésica, utilizando derivado
opióide na medicação pré-anestésica (cloridrato de tramadol), um agonista α2-
adrenérgico (cloridrato de xilazina) associado à anestésico dissociativo (cloridrato
de cetamina) na indução e o isofluorano na manutenção anestésica, promoveram
analgesia adequada, durante a monitorização não houve oscilações dignas de
nota nos parâmetros dos pacientes, que também obtiveram retorno anestésico
sem excitações.
Com relação à avaliação clínica, alguns animais restringiram-se se
alimentar no pós-operatório imediato e outros diminuíram a ingestão do alimento.
Não demonstraram qualquer alteração da marcha ou claudicação. Não houve
contaminação da ferida cirúrgica e a cicatrização ocorreu entre o sétimo e o 10°
43
dia de pós-operatório, corroborando os achados de BARROS et al. (2001), DEL
CARLO et al. (2003), LIMA et al. (2004), MORAES (2006) e LIMA et al. (2007).
Radiograficamente houve discreta diferença entre os animais dos grupos
controle GC1 (30 pós-operatório) e GC2 (60 dias pós-operatório). O GC1
apresentou preenchimento da falha óssea por material radiopaco, e discreta
proliferação periosteal regular na cortical do osso ulna adjacente à falha óssea
produzida no osso rádio. Já nas radiografias aos 60 dias (GC2), os fragmentos da
ostectomia apresentaram-se arredondados com discretas proliferações ósseas
periosteais partindo dos fragmentos distal e proximal da falha óssea (pontes) e
preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo, características
também observadas nos animais do grupo tratado GT1 (30 dias pós-operatório).
Nas imagens radiográficas do grupo tratado (GT2) aos 60 dias do pós-operatório,
a proliferação periosteal dos fragmentos foi mais evidente e juntamente com a
proliferação periosteal e o aumento de espessura cortical da face cranial da ulna,
preencheram quase toda a falha. Em experimentos com coelhos, MATOS et al.
(2001), LIMA et al. (2004), MORAES et al. (2004), CIANE et al. (2006), MORAES
(2006) também preenchimento da falha óssea por material radiopaco durante a
avaliação pós-operatória.
Os achados radiográficos do GT1 semelhante ao GC2 e o preenchimento
mais evidente e acentuado da falha óssea observado no GT2 corroboram com as
análises realizadas por LeROY et al. (2002) no que diz respeito à osteoindução
mediada por fatores de crescimento liberados por fragmentos da próstata do cão.
Segundo REMEDIOS (1999), na primeira fase da consolidação óssea, a fase
inflamatória, plaquetas locais liberam fatores de crescimento derivado das
plaquetas (PDGF), TGFβ (fator de crescimento de transformação β) e de
crescimento epidermal, que são mediadores moleculares requeridos para a
consolidação. GUISE & MUNDY (1998), NELSON et al. (1999), CHIAO et al.
(2000), DEFTOS (2000) e LeROY et al. (2004) citaram a expressão desses fatores
pelas células da próstata, assim como de BMPs, ETs e PTHrP, todos
considerados fatores de crescimento ósseo.
44
As preparações histológicas do grupo controle (GC1), exibiram pouca
formação de tecido ósseo, havia neoformação óssea ao redor dos fragmentos da
ostectomia, sem alterações na espessura cortical, e nas superfícies periosteal e
endosteal. O tecido ósseo neoformado mostrou-se organizado e com crescimento
regular. Foram observados osteoblastos nas bordas ósseas e concentração
discreta de osteoclastos. Essas características também já haviam sido relatadas
por MATOS et al. (2001), LeROY et al. (2002), LIMA et al. (2007) e MONTEIRO et
al. (2007)
Assim como LeROY et al. (2002) notaram em seu experimento, nas
preparações histológicas do grupo tratado (GT1) a neoformação óssea mostrou-se
mais desorganizada em comparação ao grupo controle e localizada adjacente ao
implante de tecido prostático. O córtex apresentou-se mais delgado com superfície
periosteal irregular. Também foram observados osteoblastos nas bordas ósseas e
maior concentração de osteoclastos.
No GT1, foi possível observar, à histologia, o implante do fragmento da
próstata, assim como células endoteliais adjacente à neoformação óssea, fato
esse observado por LeROY et al. (2002). Entretanto, neste estudo, notou-se a
ocorrência de tecido fibronecrótico sugerindo formação de cápsula membranosa
ao redor do implante, fato esse, que pode ser explicado por um reconhecimento
“not self” pelo sistema imunológico dos coelhos, resultando em rejeição.
Na avaliação das preparações dos animais do grupo controle (GC2) e
tratado (GT2), ambos com 60 dias pós-operatório, notou-se neoformação óssea
mais intensa e com maior espessura nos animais do GT2 quando comparados aos
animais do GC2. Também notou-se maior irregularidade do córtex ósseo,
sugerindo atividade de remodelação por ação dos osteoclastos, e maior
quantidade de lacunas na neoformação óssea no GT2 comparado ao GC2 . Por
esta análise pode-se dizer que o tecido ósseo neoformado no GT2 é imaturo, ao
contrário do tecido ósseo maduro observado no GC2. Segundo MARTINEZ &
WALKER (1999) e REMEDIOS (1999), citados por PAGLIOSA & ALVES (2007),
as células mesenquimais indiferenciadas encontradas na medula óssea, atuam na
45
recuperação óssea, produzindo formação de calo ósseo por meio de osteindução
mediada por fatores de crescimento.
Notou-se neoformação óssea na face cranial da ulna, na região da falha
óssea do rádio dos animais do GT2, com as mesmas características e intensidade
das encontradas nos fragmentos proximal e distal do rádio, com exceção do córtex
que efetivamente não apresentava o mesmo grau de adelgaçamento. A
proliferação óssea pode ter ocorrido por intermédio de contato do implante do
fragmento da próstata com a ulna, e o menor grau de adelgaçamento, frente à
menor ação dos osteoclastos, já que a ulna não sofreu ostectomia, portanto não
havia áreas de desvitalização ou necrose. LeROY et al. (2002), que trabalharam
com ossos íntegros do crânio de coelhos, fizeram a mesma observação.
46
7. CONCLUSÕES
Implantes de fragmentos da próstata do cão são capazes de induzir
osteogênese em falhas ósseas produzidas nos ossos rádio de coelhos.
O preenchimento das falhas ósseas por material radiopaco, mais evidente
nos animais que receberam implante, está diretamente relacionado à neoformação
óssea observada no exame histológico, e que é pertinente à estimulação
osteogênica mediada por fatores de crescimento expressados pela próstata.
A partir deste estudo, outros modelos experimentais poderão ser realizados
para determinar formas de manutenção dos fragmentos de próstata em bancos,
assim como, a quantificação do volume a ser implantado em diferentes espécies
animais.
47
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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