Imunogenicidade da vacina LBSapSal e Investigação ...‡ÃO... · Exemplo de dedicação e comprometimento com a academia e ciência; Ao meu co-orientador Dr. Rodolfo Giunchetti,

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO - UFOP

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB

Laboratório de Imunopatologia - LIMP

―Imunogenicidade da vacina LBSapSal e Investigação

Parasitológica/Molecular em Cães Após Desafio

Intradérmico com Leishmania (Leishmania) chagasi e

Extrato de Glândula Salivar de Lutzomyia longipalpis‖

RODRIGO DIAN DE OLIVEIRA AGUIAR SOARES

Ouro Preto – MG

Março de 2010

RODRIGO DIAN DE OLIVEIRA AGUIAR SOARES

―Imunogenicidade da vacina LBSapSal e Investigação

Parasitológica/Molecular em Cães Após Desafio

Intradérmico com Leishmania (Leishmania) chagasi e

Extrato de Glândula Salivar de Lutzomyia longipalpis‖

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo

de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

Co-orientador: Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti – Laboratório de Imunopatologia,

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro

Preto

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo

de Pesquisas em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Ouro Preto, como

parte integrante dos requisitos para obtenção

do Título de Mestre em Ciências Biológicas,

área de concentração: Imunobiologia de

Protozoários.

Ouro Preto – MG

Março de 2010

Catalogação: [email protected]

S676i Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar.

Imunogenicidade da vacina LBSapSal e investigação

parasitológica/molecular em cães após desafio intradérmico com leishmania

(Leishmania) chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis

[manuscrito] / Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares. – 2010.

xvi, 123 f.: il., color; graf., tab.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto

de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.

1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Vacinas - Teses. 3. Cão - Teses.

I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 616.993.161

mailto:[email protected]

I

Colaboradores

Dra. Marta de LanaI

Dr. Olindo Assis Martins FilhoII

Dra. Andréa Teixeira CarvalhoII

Dr. Nelder Figueiredo GontijoIII

Dr. Luiz Cosme Cotta MalaquiasIV

Dr. Marcus José MarquesV

Dr. Rodrigo Correa OliveiraVI

I – Laboratório de Doença de Chagas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.

II – Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Centro René Rachou,

Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais.

III – Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos, Departamento de Parasitologia,

Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,

Minas Gerais.

IV – Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Alfenas, Alfenas,

Minas Gerais, Brasil

V – Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia, Universidade Federal de Alfenas,

Alfenas, Minas Gerais, Brazil

VI – Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisa René Rachou,

Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais.

Suporte Financeiro

FAPEMIG – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – Estudo da Resposta Imune

Celular, Humoral e Molecular em Cães Imunizados com Saliva de Flebotomíneos e com

uma Vacina anti-LVC. FAPEMIG (Projeto No 2222/2002CBB)

PAPES IIIB – Programa de Apoio a Pesquisa em Saúde, FIOCRUZ/RJ – Estudo da

Resposta Imune Celular, Humoral e Molecular em Cães Imunizados com Saliva de

Flebotomíneos e com uma Vacina anti-LVC

FEOP Projeto Convênio CPqRR/UFOP/FEOP/Canil de Experimentação em Leishmanioses.

PRONEX (FAPEMIG/CNPq) - Leishmaniose visceral canina: programa interinstitucional

para o desenvolvimento de métodos de combate à endemia

REUNI – Bolsa de Pós-Graduação Institucional de Assistência ao Ensino - Plano de

Reestruturação e Expansão das Universidades Federais.

Apoio e Instituições Parceiras Universidade Federal de Ouro Preto

Centro de Pesquisa René Rachou, FIOCRUZ/MG

Universidade Federal de Minas Gerais

II

Aos meus pais,

Ricardo Aguiar Soares e Lucimere de Oliveira, e irmãos,

Rodolfo, Milli e Rudge

III

―A alma do homem é como água;

Vem do Céu

Ao Céu volta

E depois retorna à Terra,

Em eterna alternância.‖

J. W. von Goethe

IV

Agradecimentos

A Deus por me guiar em todos os caminhos e pela oportunidade de apredizado nesta

vida;

Aos meus pais Ricardo Aguiar Soares e Lucimere de Oliveira Aguiar Soares pela

direção e exemplos de perseverança e conduta. Por acreditarem em mim e depositarem

seus esforços e investimentos em meu crescimento e formação. Pelo grande amor e

cuidados que sempre tiveram por mim;

Aos meus avós Geraldo Soares (in memoriam) e Armênia Aguiar Soares (in

memoriam), Tacredo Lopes (in memoriam) e Maria de Oliveira pelo carinho e boas

lembranças.

Aos meus irmãos Rodolfo Dian de Oliveira Aguiar Soares, Milli Dian de Oliveira

Aguiar Soares e Rudge Dian de Oliveira Aguiar Soares que cada um, a seu modo, me dá

alegria de vida; pela companhia e torcida. Mesmo não podendo ter escolhido, vocês são

os melhores amigos que eu poderia ter.

À minha namorada Suelem Louzada Soares, pelo carinho e compreensão desta fase de

minha vida, pelo companheirismo e confiança e por estar sempre ao meu lado apoiando-me

em todas as decisões; te amo muito.

A Arte & Manha, minha república em Ouro Preto que me acolheu e me ensinou muito

nos anos da graduação. Por me compreenderem em todos os momentos e me

incentivarem na caminhada acadêmica. Muito obrigado a cada um: alunos, amigos e ex

alunos;

Aos amigos de Ponte Nova, que mesmo distantes, torceram sempre por mim, os tenho

guardados comigo.

Ao meu orientador Alexandre Barbosa Reis, pela oportunidade e por compartilhar

comigo seu grande conhecimento. Pela imensa contribuição na minha formação

acadêmica e científica. Por ter sido um grande Mestre e amigo nesses anos. Muito

V

obrigado por tudo, pelos vários conselhos e principalmente por me oferecer o privilégio

de participar desde o início dos estudos em leishmaniose visceral canina na UFOP ao

longo destes 6 anos. Exemplo de dedicação e comprometimento com a academia e

ciência;

Ao meu co-orientador Dr. Rodolfo Giunchetti, que o considero como meu irmão mais

velho de Ouro Preto, por estar sempre presente, cobrando e disposto a dar aquele

―puxão de orelha‖ quando necessário, meu sincero agadecimento pela contribuição em

todas as etapas deste trabalho e por todo o apoio fornecido ao longo desta caminhada,

que foram fundamentais no meu desenvolvimento científico e no amadurecimento dos

resultados.

À Profa. Cláudia Martins Carneiro por todos os momentos de aprendizado, por toda a

dedicação ao laboratório de Imunopatologia/NUPEB, pelo estímulo, conselhos e

incentivo em minha jornada científica. Pela agradabilíssima companhia ao longo destes

vários anos.

À Profa. Vanja e ao Prof. Wanderson pelos ensinamentos e convívio ao longo destes

anos.

À Dra. Andréa Teixeira Carvalho pelos ensinamentos ao longo da minha iniciação

científica, nos trabalhos na bancada - seja na minha primeira contagem diferencial de

leucócitos ou na citometria de fluxo - e pela contribuição na análise dos resultados deste

trabalho.

Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB que

contribuíram de forma essencial no desenvolvimento da pesquisa, na manutenção da

colônia de cães destinados à experimentação e realização dos diferentes experimentos.

Seguramente toda a dedicação e trabalho desempenhados por vocês foram de grande

valia na obtenção dos diferentes resultados gerados no laboratório. Em especial, a Lígia,

Fernando, Jamille, Isadora, Flávia, Levi, Kelly, Taís, Lilliane, Luiza.

VI

E aos amigos e companheiros de pós-graduação, Samuel L. Braga, Micheline, Caio,

Caroline, Lucilene, Sheler, Paula, Amanda, Carol, Kátia, Lorena obrigado pela

execelente convivência.

Ao Henrique G. Ker pela convivência e amizade nestes últimos anos, e pela motivação

dia a dia para realização e conclusão desta dissertação.

As grandes amizades geradas ao longo destes 6 anos de ciência, em especial ao Wendel,

Raquel, Nádia e Juliana pelos grandes momentos compartilhados, e pelo auxílio nas

técnicas e metodologias desenvolvidas durante nossa formação científica, como pelo

crescimento e aprendizado conjunto.

Ao meu grande amigo Bruno Mendes Roatt, companheiro de DOTA, mas acima de tudo

o irmão de todo dia, que sei que sempre posso contar, até nos momentos mais

inesperados e difíceis, que muito me auxiliou ao longo de toda nossa formação

científica e que com certeza continuará me ajudando ao longo do nosso doutorado.

À Maria Chaves dos Santos e a Tânia funcionárias do Laboratório de

Imunopatologia/NUPEB, por colaborar na conservação da ordem diária, contribuindo

para o bom funcionamento diante das diversas atividades desempenhadas no nosso

laboratório.

À Profa. Marta de Lana pelo seu exemplo de dedicação, ética e inteligência, desde a

minha graduação até na minha formação científica.

Ao Laboratório de Doença de Chagas, representados pela Profa. Terezinha Bahia, Prof.

André Talvani, Prof. Evandro, Girley, Jaqueline, Vitor, Rafael e demais pela agradável

convivência.

À Cidoca (Maria Aparecida Reis Trópia), secretária dedicada do programa de pós-

graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, pela prontidão na resolução

dos tramites burocráticos e pela grande simpatia em sempre nos atender.

VII

Ao Biotério da UFOP e todos os seus funcionários: por todo esforço e trabalho na

manutenção e cuidado dos animais de experimentação.

Ao Prof. Luís Carlos Crocco Afonso, coordenador da pós-graduação, que através do

programa de pós-graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB,

concedeu oportunidade de realização desse trabalho;

.

À Pro-Reitoria de Pesquisa de Pós-Graduação da UFOP em nome do Prof. Tanus Jorge

Nagem e do Prof. André Barros Cota, pelo apoio à nossa linha de pesquisa.

VIII

Índice Lista de Tabelas .............................................................................................................. X Lista de Diagrama ........................................................................................................ XI Lista de Figuras .......................................................................................................... XII Lista de Abreviaturas e Siglas .................................................................................. XIII

Resumo ......................................................................................................................... XV Abstract ...................................................................................................................... XVI 1. Introdução ................................................................................................................... 1 2. Revisão da Literatura ................................................................................................. 5

2.1 Aspectos gerais das Leishmanioses ..................................................................... 6 2.2 Imunopatologia e Biomarcadores de Progressão Clínica na LVC .................. 7

2.3 Vacinologia em Leishmanioses .......................................................................... 12 2.3.1 Vacinas de Primeira Geração ...................................................................... 13 2.3.2 Vacinas de Segunda Geração ....................................................................... 16 2.3.3 Vacinas de Terceira Geração ....................................................................... 19

2.3.4 Vacinas a base de Antígenos Salivares de Flebotomíneos .......................... 21

3. Justificativa ............................................................................................................... 26 4. Objetivos .................................................................................................................... 28

4.1- Objetivo Geral ................................................................................................... 29 4.2 - Objetivos Específicos........................................................................................ 29

5. Material e Métodos ................................................................................................... 31 5.1 – Manejo da colônia de cães destinados a experimentação ............................... 32 5.2 – Desenho Experimental ..................................................................................... 32

5.2.1 – Produção do antígeno vacinal, preparo do adjuvante saponina e obtenção

de glândulas salivares de Lutzomyia longipalpis ................................................. 33

5.2.2 – Grupos experimentais ................................................................................ 34 5.2.3 – Infecção Experimental .............................................................................. 34

5.3 – Avaliações imunológicas e Ensaios de Imunogenicidade Pós Vacinal .......... 38

5.3.1 – Obtenção de amostras de sangue periférico ............................................. 38

5.3.2 – Leucograma ............................................................................................... 38 5.3.3 – Avaliação da resposta imune humoral anti-Leishmania ......................... 38

5.3.3.1 – Obtenção do antígeno para a reação imunoenzimática anti-

Leishmania ......................................................................................................... 38 5.3.3.2 – Pesquisa de anticorpos anti-Leishmania ........................................... 39

5.3.4 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo .............................................. 40 5.3.4.1 – Citometria de fluxo ............................................................................. 40

5.3.4.2 – Obtenção e preparo da suspensão de leucócitos do sangue periférico

para imunofenotipagem ex vivo utilizando microplacas .................................. 43

5.3.4.3 – Ensaio de imunofenotipagem celular em leucócitos do sangue

periférico no contexto ex vivo e in vitro utilizando microplacas ..................... 43


periférico no contexto ex vivo utilizando tubos ................................................ 45

5.3.5 – Avaliação da resposta celular no contexto in vitro................................... 46

5.3.5.1 – Obtenção do antígeno solúvel vacinal (VSA) de L. braziliensis e do

antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) para os ensaios in vitro ...................... 47

5.3.5.2 – Obtenção de células mononucleares do sangue periférico destinadas

aos ensaios in vitro ............................................................................................ 47

5.3.5.3 – Ensaio de proliferação linfocitária e obtenção das células

mononucleares do sangue periférico pós-cultivo para imunofenotipagem .... 48 5.4 – Avaliações parasitológicas ............................................................................... 50

IX

5.4.1 – Punção de medula óssea, cultivo em NNN/LIT e confecção das lâminas

................................................................................................................................ 50 5.4.2 – PCR ................................................................................................................ 51 5.5 – Análise estatística dos dados ............................................................................ 53

6. Resultados ................................................................................................................. 54 6.1 – Reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães

imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis

associada à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à

saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio

experimental com L. chagasi ..................................................................................... 56

6.2 – Leucograma de cães imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina

de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L.

braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e

após o desafio experimental com L. chagasi ............................................................ 58

6.3 – Análise do perfil imunofenotípico de células T (CD5+, CD4

+ e CD8

+) e células

B (CD21+) circulantes no sangue periférico de cães imunizados com extrato de

glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis

(LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis

(LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L. chagasi............................ 60

6.4 – Avaliação do número de monócitos CD14+ sanguíneos e do perfil de ativação

pela expressão de CD80+, MHC-I

+ e MHC-II

+ em linfócitos circulantes de cães





6.5 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de

linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+, CD21

+) submetidos a estimulação antigênica com

antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células

de cães imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis




6.6 - Avaliação da ativação linfocitária pela expressão de MHC-II+ e análise de

correlações entre a frequência de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+,CD21

+) e o perfil

imunofenotípico de linfócitos MHC-II+ cultivados in vitro com antígeno solúvel

vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães





6.7 – Investigação clínica e parasitológica da medula óssea de cães imunizados

com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva

de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva

de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L. chagasi 72

7. Discussão ................................................................................................................... 73 8. Conclusão .................................................................................................................. 90 9. Perspectivas ............................................................................................................... 93 10. Bibliografia .............................................................................................................. 95

X

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Painel de anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de

leucócitos sanguíneos ..................................................................................................... 42

Tabela 2 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular de

leucócitos do sangue periférico ou de células mononucleares do sangue periférico

estimuladas in vitro para fenotipagem em microplacas de 96 orifícios ......................... 45


leucócitos do sangue periférico para fenotipagem em tubos .......................................... 46

Tabela 4: Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolas vacinais

antes e após o desafio experimental com L. chagasi. ..................................................... 59

XI

Lista de Diagrama

Diagrama 1: Esquema do desenho experimental utilizado na avaliação de cães

inoculados com diferentes protocolos vacinais e desafiados intradermicamente com L.

chagasi ............................................................................................................................ 37

XII

Lista de Figuras

Figura 1: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães controle e submetidos

a diferentes protocolos vacinais antes e após o desafio com L. chagasi ........................ 57

Figura 2: Perfil imunofenotípico de linfócitos circulantes em cães controle e

submetidos a diferentes protocolos vacinais antes e após o desafio com L. chagasi ..... 61

Figura 3: Perfil imunofenotípico de monócitos circulantes e da expressão de moléculas

de ativação linfocitária em cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais

antes e após o desafio com L. chagasi ............................................................................ 63

Figura 4: Análises in vitro do índice de proliferação e perfil imunofenotípico

empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou

antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) avaliados 90dias após o desafio

experimental com L. chagasi (90Dpd) ........................................................................... 66

Figura 5: Análises in vitro do índice de proliferação e perfil imunofenotípico

empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou

antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) avaliados 435dias após o desafio

experimental com L. chagasi (435Dpd) ......................................................................... 67

Figura 6: Análises in vitro do perfil de ativação linfocitária pela expressão de MHC-II e

das correlações entre a frequência de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+,CD21

+) e o perfil

imunofenotípico de linfócitos MHC-II+ empregando-se como estímulos o antígeno

solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel

direito) avaliados 90dias após o desafio experimental com L. chagasi (90Dpd) ........... 70

Figura 7: Análises in vitro do perfil de ativação linfocitária pela expressão de MHC-II e

das correlações entre a frequência de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+,CD21

+) e o perfil

imunofenotípico de linfócitos MHC-II+ empregando-se como estímulos o antígeno

solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel

direito) avaliados 435dias após o desafio experimental com L. chagasi (435Dpd) ....... 71

XIII

Lista de Abreviaturas e Siglas % - percentual

ºC - graus Celsius

Ac - Anticorpo

Acm - Anticorpo monoclonal

Ag - Antígeno

ALM - Antígeno de L. major

ALA - Antigeno de L.amazonensis

APC - Células apresentadoras de antígeno

BCG - Bacillus Calmette-Guérin

CA - Cães Assintomáticos

CCZ - Centro de controle de zoonoses

CD - Cluster of differentiation

CD5 - Marcador de superfície celular delinfócitos T

CD4 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T

auxiliares/indutores

CD8 - Marcador de superfície celular da subpopulação de

linfócitosTcitotóxico/supressores

CD14 - Marcador de superfície celular de monócitos e granulócitos

CD21 - Marcador de superfície celular de linfócitos B

CD80 – Molécula co-estimulatório presente em monócitos e linfócitos B para ativação

de linfócitos T

IRR - Instituto René Rachou – Belo Horizonte - Minas Gerais

CMBlast - Meio de cultura celular

CO - Cães Oligossintomáticos

CPM - Contagem por minutos

CS - Cães Sintomáticos

CMF - Canal médio de fluorescência

CMSP- Células Mononucleares do Sangue Periférico

Con-A - Concavalina A

Dpd – Dias após desafio

ED - via endovenosa de inoculação

EDTA - Anticoagulante quelante de cálcio

ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay

FACS - Fluorescence Activated Cell Sorter

FACSdil - Solução diluente de anticorpos

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz - Rio de Janeiro - RJ

FL1 - Fluorescência do tipo 1 - Isoticianato de Fluroceína

FL2 - Fluorescência do tipo 2 - Ficoeritrina

FL3 - Fluorescência do tipo 3 - Cy-5

FITC - Isotiocianato de fluoresceína

FSC - Forward Scatter (Tamanho celular)

gp - glicoproteína

ICB - Instituto de Ciências Biológicas (UFMG)

ID - via intradérmica de inoculação

Ig - Imunoglobulina

IgA - Imunoglobulina da classe A

IgE - Imunoglobulina da classe E

IgG - Imunoglobulina da classe G

IgG1- Imunoglobulina da subclasse G1

IgG2- Imunoglobulina da subclasse G2

IgM - Imunoglobulina da classe M

XIV

IFN-- Interferon-gama

IL-2 - Interleucina 2




LB - linfócitos B

LC – Leishmaniose Cutânea

Leishmune

– Vacina anti-LVC

Leish-Tec

- Vacina anti-LVC

LIT - Liver Infusion Tryptose

LT - linfócitos T

LTA - Leishmaniose Tegumentar Americana

LV - Leishmaniose Visceral

LVC - Leishmaniose Visceral Canina

LVH - Leishmaniose Visceral Humana

MAPA- Ministerio da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MHC-I - complexo de histocompatibilidade principal de classe I

MHC-II - complexo de histocompatibilidade principal de classe II

MS - Ministério da Saúde

NaCl – Cloreto de sódio

NNN - Nicole, Novy & Neal (Meio de cultivo bifásico)

NO - óxido nítrico

OMS - Organização Mundial de Saúde

PBMC - Peripheral blood mononuclear cells

PBS - Phosphate buffer saline

PCLV- Programa de Controle da Leishmaniose Visceral

pH - Potencial hidrogeniônico

PHA - mitógeno fitohemaglutinina A

RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta

RPMI 1640 - Roswell Park Memory Institute (Meio de Cultivo Celular)

rpm - rotação por minuto

SCN – Soro de camundongo normal

SGE - sand fly gland extract (Lutzomyia longipalpis)

SGL - Lisado de glândula salivar

SFB - Soro Fetal Bovino

SLcA - Antígeno solúvel de Leishmania chagasi

SMF- Sistema Monocítico Fagocitário

SRBC - Sheep Red Blood Cells

SRN - Soro de rato normal

SSC - Side Scatter (Granulosidade celular)

TA – Temperatura ambiente

Tad – Tempo antes do desafio

Th - Células T helper

Th1 - Células T CD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas (IL-2 e IFN-)

Th2 - Células T CD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10)

TM - Teste de Montenegro

TNF- - Fator de Necrose Tumoral tipo

UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais

UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto

VSA - Antígeno Solúvel Vacinal

WHO - World Health Organization

XV

Resumo

Leishmaniose visceral humana (LVH) e leishmaniose visceral canina (LVC) são as mais

importantes doenças emergentes causadas por Leishmania (L.) chagasi com elevada

prevalência nos países latino-americanos, principalmente no Brasil. Durante um século de

investigação, depois da descoberta do agente etiológico da leishmaniose, poucos avanços

têm ocorrido na pesquisa do tratamento e até mesmo de vacinas e as medidas de controle

têm sido decepcionantes. O desenvolvimento de uma vacina protetora contra a LVC é uma

abordagem alternativa para interromper o ciclo da LV doméstica. Considerando a

importância das proteínas salivares de flebotomíneos sendo potentes imunógenos,

obrigatoriamente co-depositados com o parasito de Leishmania durante a transmissão, a sua

inclusão em uma vacina anti-Leishmania iria explorar a imunidade anti-saliva após uma

picada de flebotomíneo infectado e preparar uma resposta imune protetora anti-Leishmania.

Assim, neste trabalho foi investigada a imunogenicidade e efeito protetor da vacina

LBSapSal em cães após o desafio. Vinte cães foram classificados em quatro grupos: i)

controle (n = 5) receberam 1 mL de solução salina estéril 0,9%; ii) grupo Sal (n = 5)

receberam extrato de glândula salivar (SGE), elaborado a partir de 5 ácinos das glândulas

salivares de Lutzomyia longipalpis em 1 ml de solução salina estéril 0,9%; iii) Grupo LBSal

(n = 5) receberam 600 μg de proteína de promastigotas de L. braziliensis mais SGE em 1

mL de solução salina estéril 0,9%, (iv) o grupo LBSapSal (n = 5 ) recebeu 600 μg de

proteína de promastigotas de L. braziliensis e 1 mg de saponina em conjunto com a SGE em

1 mL de solução salina estéril 0,9%. O protocolo de imunização constou de três injeções

subcutâneas em intervalos de 4 semanas. Posteriormente, os cães foram inoculados por via

intradérmica com 1 × 107 promastigotas em fase estacionária de L. (L.) chagasi na presença

de glândula salivar de L. longipalpis e acompanhado por um período de 435 dias após o

desafio (435dpd). Análise da resposta imune humoral mostrou que antes e durante o

acompanhamento longitudinal após o desafio, o grupo LBSapSal mostrou aumento dos

níveis de IgG total, IgG1 e IgG2, sugerindo uma possível resposta imune mista (tipo I e II)

após a vacinação. A investigação da resposta imune celular com base no perfil

imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) mostrou um

aumento no número absoluto de linfócitos T CD5+ circulantes, refletida pela maior

contagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+, em 435dpc. Interessantemente, a vacina induziu

um aumento de linfócitos T CD8+ circulantes durante todo o período após o desafio,

possivelmente indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra a infecção por

Leishmania como tem sido sugerido previamente para a LVC. Consistente com essa

hipótese, o grupo LBSapSal apresentou aumento da atividade linfoproliferativa in vitro

sobre a estímulação antigênica com SLcA (antígeno solúvel L. chagasi) em 90 e 435 dpc,

bem como aumento da freqüência (índice de estimulação) de linfócitos T CD5+ e CD8+

SLcA-específico em 435dpc. Estes resultados suportam a hipótese de que a indução de

células T CD8+ podem desempenhar um papel de proteção no mecanismo de controle do

parasitismo por Leishmania após a vacinação com LBSapSal, associado com a resposta

imune antígeno-específica para antígenos do agente etiológico da LVC. A avaliação clínica

sobre sinais sugestivos de LVC mostrou que todos os animais permaneceram assintomáticos

durante todo o acompanhamento. O estudo da proteção realizado pela análise de amostras

do aspirado de medula óssea através de abordagens parasitológicas (cultura em meio NNN /

LIT e inquérito microscópico) e moleculares (PCR) de todos os grupos não revelou a

presença de parasitas. Estes resultados mostraram que a via intradérmica de infecção

experimental tem um curso longo para iniciar as manifestações clínicas e, assim, a detecção

do parasita, e por isso necessitam de um período maior de acompanhamento, que poderão

fornecer informações importantes que conduzirão a uma melhor compreensão sobre a

imunogenicidade da vacina e sua eficácia.

XVI

Abstract

Human visceral leishmaniasis and canine visceral leishmaniasis (CVL) are the most

important emerging diseases caused by Leishmania (L.) chagasi with high prevalence in

Latin American countries mainly in Brazil. During a century of research after the

discovery of the etiologic agent of leishmaniasis few advances have occurred in

research on treatment and even vaccines and measures control have been disappointing.

The development of a protective vaccine against CVL is an alternative approach for

interrupting the VL domestic cycle. Considering the importance of sand fly salivary

proteins are potent immunogens obligatorily co-deposited with Leishmania parasites

during transmission, their inclusion in an anti-Leishmania vaccine would exploit anti-

saliva immunity following an infective sand fly bite and set the stage for a protective

anti-Leishmania immune response. Thus, in this work it was investigated the

immunogenicity and protective effect of LBSapSal vaccination in dogs after challenge.

Twenty mongrel dogs were categorized into four groups: i) control (n = 5) received 1

mL of sterile saline 0.9%; ii) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE)

prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL of sterile

saline 0.9%; iii) LBSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote

protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; (iv) the LBSapSal group (n = 5) received

600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE

in 1 mL sterile 0.9% saline. The immunization protocol consisted of three subcutaneous

injections at intervals of 4 weeks. Afterwards, the dogs were intradermally infected with

1×107 late-log-phase promastigotes of L. (L.) chagasi in the presence of sand fly saliva

of L. longipalpis and accompanied by a follow-up of 435 days post challenge (435dpc).

Analysis of the humoral immune response showed that before and during the

longitudinal follow-up after the challenge, the LBSapSal group showed increased levels

of total IgG, IgG1 and IgG2, suggesting a possible mixed immune response (type I and

II) after vaccination. The investigation of the cellular immune response based on the

immunophenotypic profile of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) showed an

augment absolute number of circulating CD5+ T lymphocytes, reflected by higher

counts of T CD4+ and T CD8

+ lymphocytes, in 435dpc. Interestingly, the vaccine

induced an increase circulating T CD8+ lymphocytes throughout the period after

challenge, possibly indicating the establishment of protective immunity against

Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Consistent with this

hypothesis, the LBSapSal group exhibited increased lymphoproliferative activity upon

in vitro antigenic stimuli with SLcA (soluble L. chagasi antigen) in 90 and 435 dpc as

well as increased frequency (stimulation index) of SLcA-specific CD5+ and CD8

+ T-

lymphocytes in 435dpc. These results support the hypothesis that induction of CD8+ T-

cells may play a protective role in the mechanism of control of parasitism by

Leishmania after LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune

response to antigens from the etiological agent of CVL. The clinical evaluation

regarding suggestive signs of CVL showed that all animals remained asymptomatic

during the all follow-up. The protection study performed by analysis in aspirates of

bone marrow samples through parasitological (culture in NNN/LIT medium and

microscopical investigation) and molecular approaches (PCR) of all groups did not

reveal the presence of parasites. These results showed that the intradermal route of

experimental infection has a long course to start the clinical manifestations and

therefore the detection of the parasite, and so needing a longer period of follow-up, that

may provide important information that will lead to a better understanding on vaccine

immunogenicity and efficacy.

1. Introdução

AGUIAR-SOARES, R.D.O. _________ Introdução

2

Do ponto de vista epidemiológico, a Leishmaniose Visceral (LV) apresenta

ampla distribuição podendo ocorrer em regiões de clima tropical, subtropical e

temperado, (Deane & Deane, 1962; Alvar et al., 2004). Endêmica em 87 países, sendo

66 no velho mundo e 21 no novo mundo, porém, aproximadamente 90% dos casos

notificados concetram-se na Índia, Sudão, Bangladesh, Nepal e no Brasil (WHO, 2005).

Esta ampla distribuição posiciona a LV como uma das mais importantes doenças

emergentes, com elevada prevalência nos países da America Latina (Tesh, 1995). No

Brasil, observa-se que 19 das 27 unidades federativas já registraram casos da doença

com aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão autóctone, atingindo

as cinco regiões brasileiras. De forma interessante, aproximadamente 70% do total de

casos notificados no Brasil encontram-se no Nordeste, seguido pela região Sudeste,

Norte, e Centro-Oeste. No Brasil, registra-se em média cerca de 3.500 casos de LV/ano

e a incidência pode chegar a 20,4 casos/100.000 habitantes em algumas localidades de

estados nordestinos, como Piauí, Maranhão e Bahia (MS/Brasil, 2006).

Na tentativa de se estabelecer medidas de controle da LV a Organização

Mundial de Saúde (OMS) preconiza como prática profilática o tratamento de pessoas

doentes, aspersões de inseticida com efeito residual em domicílio e peridomicílio, além

da eutanásia do reservatório urbano do parasito, o cão (WHO, 2005; MS/Brasil, 2006).

Entretanto, o sacrifício de cães soropostivos muitas vezes sem qualquer sinal clínico da

infecção, torna-se cada vez mais questionável e difícil (Desjeux, 2004). Este fato está

relacionado a indignação e resistência dos proprietários de animais com leishmaniose

visceral canina (LVC) em aceitar esta medida, considerando o papel que o cão

representa na sociedade atual como animal de companhia ou guarda. Infelizmente até o

momento não há qualquer esquema terapêutico eficaz na promoção da cura

parasitológica dos animais com LVC, de forma a impedir a transmissão do parasito a

flebotomíneos. Além disto, o tratamento da LVC pode possibilitar a seleção de cepas

resistentes às drogas utilizadas para o tratamento humano e por isto o emprego da

terapêutica anti-LVC tem sido contra indicada ou proibida quando se trata da utilização

de antimoniais pentavalentes ou de outras drogas leishmanicidas (MS/Brasil, 2006).

Neste sentido, considerando que a prática quimioterápica na LVC é ainda ineficaz

(Neogy et al., 1994, Moreno et al., 1999, Rhalem et al., 1999, Baneth & Shaw, 2002,

Nieto et al., 2003, Noli & Auxilia, 2005, Saridomichelakis et al., 2005, Pasa et al.,

2005, Vouldoukis et al., 2006) e que na profilaxia da LV as medidas antivetoriais são

pouco eficientes, e que há possibilidade de surgimento de novas epidemias, a


3

imunoprofilaxia apresenta-se como principal alternativa a ser incluída nos programa de

controle da LV. Vacinas contra LVC podem ser um importante instrumento a ser

considerado para controlar a infecção canina e impedir a infecção humana, levando a

OMS a estimular o desenvolvimento de pesquisas que busquem potencias vacinas

contra LVC (O'Hagan & Valiante, 2003).

Nosso grupo de pesquisa tem investido nos últimos anos grandes esforços para

criação e estabelecimento do centro de referência em testes de drogas e vacinas para

leishmanioses. Este centro atualmente conta com uma grande infra-estrutura

interdisciplinar, interdepartamental (NUPEB, EF/UFOP) e interinstitucional

(FIOCRUZ/MG e UFMG), testando nos últimos anos diferentes propostas de vacinas

anti-LVC em ensaios de Fase I, II e III. Hoje, com o apoio destas instituições e do

Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde (DECIT) além de

financiamento de um Programa de Núcleos de Excelência

(PRONEX/FAPEMIG/CNPq) foi possível ampliar as instalações (laboratórios, biotérios

de roedores e canis) e consolidar-se na excelência em testes vacinais, especificamente

para LVC. Assim, são de fundamental importância os investimentos científicos e

biotecnológicos com ênfase no desenvolvimento de vacinas que possam ser aplicadas

em programas governamentais de controle da LV.

Neste sentido, recentemente foi proposto o estudo de dois novos

imunobiológicos compostos por antígenos brutos de promastigotas de L. braziliensis

associados ao adjuvante saponina (LBSap) e/ou saliva de Lutzomyia longipalpis

(LBSapSal) (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c). Os

resultados obtidos mostram que estas vacinas não induzem alterações clínicas e/ou

alterações adversas que contra-indicariam seu uso. Desta forma, a utilização destas

vacinas foi considerada segura para uso como imunoprofilático em cães (Giunchetti,

2007; Vitoriano-Souza et al., 2008).

Além disto, a vacina LBSapSal tem demonstrado forte imunogenicidade, tanto

no âmbito da resposta celular quanto humoral, indicando o estabelecimento de

mecanismos imunoprotetores potencialmente capazes de atuarem contra a infecção pelo

agente etiológico da LVC. Assim, o potencial imunogênico da vacina LBSapSal está

sustentado particularmente pela capacidade dessa vacina promover a expansão clonal de

linfócitos T CD8+ do sangue periférico. Quando avaliada a atividade linfoproliferativa

os cães vacinados apresentaram aumento na intensidade de proliferação celular além de

elevada produção de óxido nítrico in vitro. Outra evidência de forte imunogenicidade


4

promovida pela vacina LBSapSal foi o aumento da frequência de linfócitos T CD8+

após estímulo específico com componentes vacinais (VSA) e de antígenos solúveis de

L. chagasi (SLcA) observados em células mononucleares do sangue periférico (CMSP)

estimuladas in vitro. Em relação a resposta imune humoral, essa vacina foi capaz de

induzir intensa reação imunogênica, caracterizada por elevados níveis de anticorpos IgG

total e das subclasses (IgG1 e IgG2) anti-Leishmania (Giunchetti, 2007; Giunchetti et

al., 2008c).

Considerando estes resultados promissores de imunogenicidade da vacina

LBSapSal e a necessidade de se compreender a resposta imune e aspectos

parasitológicos após o desafio experimental com L. chagasi, propomos o presente

estudo que busca ampliar as avaliações de Fase I e II em cães imunizados com a vacina

LBSapSal (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al, 2008c), empregando-se uma análise

detalhada da imunogenicidade em um acompanhamento longitudinal de 435 dias pós-

desafio intradérmico com L. chagasi adicionadas a extrato de glândulas salivares de L.

longipalpis (SGE). Vale ressaltar ainda, que este trabalho pretende contribuir para a

compreensão dos eventos imunológicos e parasitológicos pós-desafio intradérmico do

parasito conjuntamente com o SGE em cães, sendo considerado um estudo pioneiro

com esta forma de infecção experimental em cães para testes de eficácia vacinal.

2. Revisão da Literatura

AGUIAR-SOARES, R.D.O. _ Revisão da Literatura

6

2.1 Aspectos gerais das Leishmanioses

O gênero Leishmania descrito em 1903 por Ross compreende protozoários

digenéticos da Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae, que apresentam

formas promastigotas e paramastigotas, que se desenvolvem no tubo digestivo do

hospedeiro invertebrado e formas amastigotas, que parasitam células do Sistema

Monocítico Fagocitário (SMF) do hospedeiro vertebrado.

A transmissão entre hospedeiros vertebrados ocorre através da picada de fêmeas

de flebotomíneos, pertencentes à ordem Díptera, família Psychodidae, subfamília

Phlebotominae, sendo conhecidos dois gêneros: Lutzomyia, presente no Novo Mundo, e

Phlebotomus, no Velho Mundo (Lainson & Shaw, 1987). No Brasil, são encontradas

inúmeras espécies de flebotomíneos, sendo Lutzomyia longipalpis a principal espécie

vetora da Leishmania (Leishmania) chagasi.

As leishmanioses apresentam amplo espectro clínico podendo variar desde uma

lesão cutânea localizada, com cura espontânea, até uma doença sistêmica generalizada

com elevado grau de morbidade e mortalidade. As diferentes manifestações clínicas das

leishmanioses dependem de vários fatores como: espécie de Leishmania envolvida e sua

virulência e aspectos relacionados à condição nutricional e imunológica do hospedeiro.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) divide as leishmanioses em quatro principais

formas clínicas denominadas: leishmaniose cutânea localizada, leishmaniose cutâneo

mucosa, leishmaniose cutânea difusa e leishmaniose visceral (LV), sendo que no Novo

Mundo as três primeiras formas são agrupadas em uma única denominação conhecida

por leishmaniose tegumentar americana (LTA). É importante ressaltar que a LV é a

mais devastadora entre as manifestações clínicas das leishmanioses; estimam-se

500.000 novos casos da doença e 59.000 mortes todos os anos (Desjeux, 2004; WHO

2005) e assim como na LTA a LV pode se dividir em quatro formas clínicas

(Assintomática ou Inaparente, Oligossintomática ou Subclínica, Sintomática Aguda e

Crônica ou Calazar propriamente dito). No Brasil são reportados aproximadamente

3.500 casos de LV anualmente, destes cerca de 10% evoluem ao óbito (Dantas-Torres,

2005).

No Brasil, Deane (1956) e Deane (1961), forneceram grande contribuição para o

entendimento de aspectos relacionados à epidemiologia da L. chagasi, em que ficou

documentada a participação do cão como reservatório doméstico, e da raposa (Dusicyon

vetulus), como reservatório silvestre do parasito. Desta forma, desde a década de 50 foi


7

estabelecido que o cão é um importante elo no ciclo de transmissão da LV. Além disto,

do ponto de vista epidemiológico a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é considerada

mais importante que a doença humana em função de sua alta prevalência e pelo fato de

cães infectados apresentarem intenso parasitismo cutâneo, fundamental para manter o

ciclo de infecção pelo inseto vetor (Molina et al., 1994, Giunchetti et al., 2006). A

importância dos cães como fonte de infecção de L. chagasi fica ainda mais evidente

quando se observa que a maioria dos focos de LV humana no Brasil é precedida de

casos caninos e estão intimamente relacionadas às áreas onde se encontram altos índices

de soroprevalência canina (Palatnick-de-Souza et al., 2001; Molina et al., 1994).

2.2 Imunopatologia e Biomarcadores de Progressão Clínica na LVC

Em relação à imunidade protetora e aos processos imunopatológicos, durante a

infecção por parasitos do gênero Leishmania, evidências experimentais demonstram que

os aspectos referentes ao parasito e ao hospedeiro podem influenciar de maneira crucial

o curso da infecção. Neste sentido, a incapacidade do hospedeiro em controlar a

infecção pode estar relacionada a dois fatores principais: o estabelecimento de um perfil

de imunidade celular e humoral capaz de favorecer a formação de um microambiente

apropriado para a instalação do parasito; e a habilidade de algumas cepas de Leishmania

resistirem aos efeitos microbicidas ocorridos durante os processos de imunidade inata e

adaptativa do hospedeiro (Grimaldi & Tesh, 1993).

O estudo de aspectos imunopatológicos na LV tem empregado principalmente

modelos experimentais como camundongos, hamsters e cães, entretanto, o curso da

infecção em cada um destes modelos apresenta características próprias na evolução da

doença (Hommel et al., 1995; Garg & Dube, 2006). É importante ressaltar que o cão é

considerado um excelente modelo experimental para o estudo da LV, pois apresenta

curso da infecção semelhante à doença humana, além de ser o modelo no qual as

medidas de controle são aplicadas (Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Reis

et al., 2009). Diante da importância do cão como modelo experimental, diferentes

estudos vem sendo realizados para compreender melhor o curso da infecção e identificar

biomarcadores de resistência e susceptibilidade que possam nortear o desenvolvimento

e testes de imunobiológicos anti-LVC (Reis et al., 2009).

Do ponto de vista clínico, estudos em infecções experimentais demonstraram

que os sinais clínicos na LVC podem tornar-se evidentes no período de um mês a sete


8

anos (Genaro, 1993; Vexenat et al., 1994; Acedo-Sanchez et al., 1996). Além disto,

uma grande dificuldade relacionada ao diagnóstico clínico é o fato dos sinais clínicos na

LVC serem muito inespecíficos. O curso crônico da doença e seu longo período de

incubação podem gerar atraso, falha e principalmente confundimento no diagnóstico

clínico (Cardoso & Cabral, 1998). Outra grande dificuldade no diagnóstico clínico se

deve principalmente ao fato de 50-60% dos cães infectados não apresentarem qualquer

sinal da doença (Lanotte et al., 1979; Gradoni et al., 1980; Mancianti et al., 1986;

Abranches et al., 1991; Brandonisio et al., 1992). É importante ressaltar ainda que a

classificação clínica mais amplamente empregada e reconhecida na literatura científica

foi preconizada por Mancianti et al., (1988) que categoriza a LVC em três grupos

clínicos distintos, a saber: (i) cães assintomáticos (CA), animais que não apresentam

nenhum sinal clínico sugestivo da infecção por Leishmania; (ii) cães oligossintomáticos

(CO), apresentam no máximo três sinais clínicos da doença entre eles opacificação das

córneas, perda moderada de peso, alopecia localizada e ou adenopatia linfóide; e (iii)

cães sintomáticos (CS), animais com três ou mais sinais clínicos característicos da LVC

como lesões cutâneas, perda intensa de peso, onicogrifose, ceratoconjuntivite, apatia,

paresia dos membros posteriores, dentre outros.

Nos últimos anos os estudos clínicos da LVC permitiram identificar diversos

biomarcadores bioquímicos/hematológicos, parasitológicos e imunológicos capazes de

segregar animais assintomáticos de oligo e sintomáticos e permitiram uma melhor

compreensão dos mecanismos fisiopatológicos que conduzem a evolução da doença. A

anemia normocítica normocrômica e aumento dos níveis de proteínas séricas totais são

os principais achados bioquímicos/hematológicos (Reis et al., 2006a). Acredita-se que

estas alterações bioquímicas estariam associadas a uma resposta imune humoral

policlonal, levando ao aumento generalizado dos níveis de imunoglobulinas no soro

(Marzochi et al., 1985; Reis et al., 2006a, c), caracterizado por hipergamaglobulinemia

e hipoalbuminemia, com diminuição da relação Albumina/Globulina (Cardoso &

Cabral, 1998, Almeida et al., 2005; Strauss-Ayali et al., 2007, Giunchetti et al., 2008b).

A anemia, um sinal clínico frequente na LVC, acometeria cerca de 50-70% dos casos de

LVC (Moreno et al. 1998; Amusategui et al., 2003). O quadro hematológico se agrava

estando associado diretamente com a evolução das manifestações clínicas da LVC,

sendo caracterizada por marcante anemia e leucopenia em decorrência da linfopenia,

eosinopenia e monocitopenia (Reis et al., 2006a, c).


9

Buscando compreender melhor os mecanismos imunopatológicos na LVC,

alguns estudos avaliaram aspectos da resposta imune celular e humoral em cães

portadores de diferentes formas clínicas. Estes estudos subsidiam a busca racional de

imunógeno hábil na indução de imunidade protetora promovendo o controle da infecção

frente a parasitos do gênero Leishmania (Reis 2001; Reis et al., 2006a, b, c; Fujiwara,

2003).

Nas últimas décadas, vários grupos de pesquisa concentraram esforços

estudando imunopatologia de cães natural e experimentalmente infectados por L.

chagasi / L. infantum (Cabral et al., 1992; Martinez-Moreno et al., 1993,1995; Pinelli

et al., 1994, 1995, 1999a, b; Brandonisio et al.1996; Bourdoiseau et al., 1997; Nieto et

al., 1999; Alvar et al., 2004; Tafuri et al., 2004; Solano-Gallego et al., 2004, 2005;

Giunchetti et al., 2006, Reis et al., 2006a, b, c; Strauss - Ayali et al. 2007, Lage et al.,

2007, Cardoso et al., 2007; Rodriguez-Cortes et al., 2007a; Giunchetti et al., 2008a, b).

Considerando a resposta imune humoral anti-Leishmania, diferentes estudos tem

avaliado a progressão da doença considerando a relação entre as formas clínicas e os

níveis de isotipos IgG, em ambas as infecções experimental e natural por L. (L.)

infantum / L. (L.) chagasi (Solano-Gallego et al., 2000, 2001a, b; Leandro et al., 2001;

Vercammen et al., 2002; Quinnell et al., 2003; Cordeiro-da-Silva et al., 2003; Reis et

al., 2006c). Embora a maioria destas investigações empregarem protocolos bem

definidos de ELISA e Western Blot, dados controversos sobre perfis de isotipos de

imunoglobulinas (Ig) são frequentemente documentados (Reis et al., 2009), desta

forma, ainda na literatura não há um consenso sobre qual isotipo (IgG1 ou IgG2)

relacionado a resposta humoral anti-Leishmania estaria associado à resistência ou

susceptibilidade na LVC (Day, 2007).

Além da categorização clínica, a avaliação da carga parasitária também consiste

em importante estratégia para o estudo da LVC. Uma forma de se avaliar a carga

parasitária é a obtenção de um índice, denominado de ''Leishman Donovan Units''

(LDU), no qual é avaliado o número de amastigotas de Leishmania por 1.000 células

nucleadas (Stauber, 1955 modificado por Reis et al., 2006a). A imuno-histoquímica

anti-Leishmania seria outra ferramenta para o estudo da carga parasitária em diferentes

compartimentos (Tafuri et al., 2001, 2004; Sanchez et al., 2004; Reis et al., 2006a, b, c;

Giunchetti et al., 2006, 2008a, b). A quantificação do parasito por metodologias

moleculares, a exemplo da reação de PCR em tempo real também vem sendo

empregada (Alves et al., 2009). Buscando-se ampliar a identificação de biomarcadores


10

de progressão clínica na LVC, recentemente, nosso grupo de pesquisa tem utilizado a

classificação da intensidade da carga parasitária tecidual em: baixo (BP), médio (MP)

ou alto (AP) parasitismo, através de análise estatística de tercis dos valores da LDU de

diferentes tecidos (Reis et al., 2006a, b, c; Giunchetti et al., 2008a, b; Guerra et al.,

2009; Reis et al., 2009). Esta estratégia de análise permitiu identificar que cães do grupo

assintomáticos geralmente apresentam baixo parasitismo enquanto que no grupo de CS

é observado alta carga parasitária em diferentes tecidos (pele, medula óssea, baço,

fígado e linfonodo) (Reis, 2001; Reis et al., 2006a, b, c; Giunchetti et al., 2006, 2008a,

b). De forma interessante, ficou demonstrado que a densidade parasitária da medula

óssea e do baço são os indicadores parasitológicos mais confiáveis para decodificar o

estado clínico na LVC (Reis et al., 2006b).

Os primeiros estudos abordando a LVC sintomática mostraram que a resposta

imune celular é debilitada, já que as células mononucleares do sangue periférico

(CMSP) destes animais não respondem aos antígenos do parasito in vitro e in vivo.

Entretanto, a imunidade protetora tem sido geralmente associada a uma resposta imune

celular, manifestada por uma forte resposta proliferativa das CMSP aos antígenos de

Leishmania (Cabral et al., 1992, Pinelli et al. 1999a, b), acompanhados da produção de

IFN- e TNF-, que são necessários para a ativação de macrófagos e morte de parasitos

intracelulares (Pinelli et al., 1995).

O estudo da resposta imune celular foi ampliado pelo emprego de abordagens

imunofenotípicas por citometria de fluxo em leucócitos caninos circulantes como

marcadores imunológicos do estado clínico e da densidade parasitária (Reis et al.,

2006b). Ficou demonstrado que a LVC assintomática é caracterizada pelo aumento de

populações e subpopulações de linfócitos T (CD5+, CD4

+, CD8

+) e B (CD21

+). Por

outro lado, a dificuldade de controlar a infecção por L. chagasi, característica de cães

sintomáticos, esta relacionada a drástica redução de linfócitos T CD4+, T CD8

+ bem

como de linfócitos B CD21+ (Reis et al., 2006b). De forma interessante, ao

recategorizar estes animais de acordo com a carga parasitária da medula óssea, Reis et

al, (2006b) observaram um menor número de células T CD5+, e suas subpopulações

(CD4+ e CD8

+), bem como um menor número de células B (CD21

+) e monócitos

(CD14+), principalmente em cães com alto parasitismo.

Estes estudos evidenciaram que a resposta imune sistêmica na LVC é

caracterizada por um perfil relacionado a resistência em animais assintomáticos, no qual


11

há participação de células T (CD4+, CD8

+) e B (CD21

+), o que parece refletir em maior

controle do parasitismo tecidual (Reis et al., 2009).

Há diferentes estudos na literatura que buscam compreender melhor a resposta

imune compartimentalizada na LVC. Esta estratégia permitiu ampliar as investigações

imunopatológicas na tentativa de se identificar perfis de respostas que possam estar

associadas à resistência ou susceptibilidade a infecção por L. chagasi (Reis et al., 2009).

Neste sentido, tem sido demonstrado que dentre as lesões de pele mais comuns

se destacam descamação, alopecia, dermatite pustular, dermatose nodular e doença

ulcerativa, que podem estar associadas com a resposta imune (Adler e Theodor, 1932;

Cunha, 1938; Torres, 1941; Ferrer et al., 1988, Giunchetti et al., 2006). Do ponto de

vista histológico, Dos - Santos et al. (2004) demonstraram que a presença de infiltrado

inflamatório dérmico na LVC independentemente da presença de Leishmania. No

entanto, o parasitismo da pele foi sempre associado à inflamação na LVC. Cães

sintomáticos apresentam maior intensidade inflamatória na pele geralmente associada a

altas cargas parasitárias cutâneas (Giunchetti et al., 2006). Por outro lado, cães

assintomáticos apresentariam menor infiltrado inflamatório cutâneo e

consequentemente, menor parasitismo tecidual (Giuncheti et al., 2006). A capacidade de

flebotomíneos se infectarem com L. infantum a partir do repasto sanguíneo na pele de

cães com LVC parece ser inversamente proporcional a contagem de células T CD4+

circulantes (Guarga et al., 2000).

A base celular e molecular da histopatologia e resposta imune nos linfonodos

vêm sendo descrita nos últimos anos na LVC (Keenan et al. 1984a, b; Martinez-Moreno

et al., 1993; Tafuri et al., 2001; Lima et al., 2004; Giunchetti et al., 2008a; Alves et al.,

2009). Tem sido demonstrado que todos os linfonodos de cães infectados por L. chagasi

evoluem para uma linfadenite crônica, independentemente da região anatômica

analisada, com hipertrofia e hiperplasia das zonas cortical e medular,

caracteristicamente observadas em cães assintomáticos (Lima et al., 2004; Giunchetti et

al., 2008a). Alves et al.(2009) relataram que a carga parasitária em linfonodos pré-

escapulares significativamente superior em cães sintomáticos. Neste estudo, ficou

evidenciado que o perfil das citocinas de linfonodos pré-escapulares de cães

assintomáticos era marcado pela exacerbada expressão de mRNA de IFN-e TNF-.

Por outro lado, cães sintomáticos apresentaram elevados níveis de mRNA de IL-10 e de

TGF-, sugerindo um papel destas citocinas com a progressão da doença e da

proliferação do parasito neste órgão (Alves et al., 2009).


12

O baço, considerado um dos principais órgãos afetados durante a LVC,

apresenta alterações significativas na sua morfologia bem como no contexto

imunológico, que são altamente significativos e estão intimamente envolvidos com a

resposta imune sistêmica (Mebius & Kraal, 2005). Entre os achados histológicos mais

comuns no tecido esplênico na LVC se destacam a inflamação da cápsula (mais intensa

em cães sintomáticos), hipertrofia e hiperplasia na polpa vermelha e depleção da polpa

branca (Reis et al., 2009). De forma interessante, Lage et al. (2007) ao avaliarem a

expressão de citocinas em esplenócitos observaram que animais apresentando alto

parasitismo expressam tanto IL-10 como IFN- indicando que a LVC é marcada por

uma produção equilibrada de citocinas Th1/Th2, com um acúmulo predominante de IL-

10. De fato, tem sido relatado que ambas as respostas imunes, Th1 e Th2, ocorrem no

baço durante LVC, com participação precoce de IL-4 que pode estar envolvida na

persistência do parasito mesmo na presença de elevada expressão de IFN- (Strauss-

Ayali et al., 2007, Reis et al., 2009).

Os estudos com ênfase nos eventos relacionados à resposta imune celular e

humoral têm contribuído para o entendimento de mecanismos envolvidos na

resistência/susceptibilidade à infecção, e para uma melhor análise dos eventos

imunopatológicos envolvidos com a progressão clínica na LVC. Assim, os estudos

realizados até o momento foram muito importantes possibilitando uma melhor

compreensão da história natural da LVC, atualmente suas abordagens metodológicas

são incorporadas nos atuais trabalhos que visam avaliar a imunogenicidade de novas

vacinas anti-LVC (Giunchetti, 2007).

2.3 Vacinologia em Leishmanioses

O controle epidemiológico da LV depende de ações contra os vetores e os

reservatórios. O cão é o principal reservatório da leishmaniose no peri-domicilio, e o

desenvolvimento de uma vacina protetora contra LVC é uma alternativa fundamental

que poderá interromper o ciclo da LV (Tesh, 1995; Dye, 1996), e assim diminuir a

infecção canina e humana. Há uma grande necessidade de investir no desenvolvimento

de vacinas profiláticas seguras para humanos e cães contra as leishmanioses, devido

principalmente a resistência do parasito às drogas empregadas no tratamento, à

toxicidade da quimioterapia, o aumento da incidência da doença em indivíduos

imunocomprometidos, além das dificuldades enfrentadas pela vigilância epidemiológica


13

onde uma das bases de controle da doença é a eutanásia de cães soropositivos (Tesh,

1995).

Uma vacina ideal contra leishmaniose deve ter várias propriedades, incluindo:

(a) deve ser segura; (b) um número mínimo de imunizações capazes de induzir a longo

prazo proteção contra a maioria ou todos os patógenos causadores da leishmaniose

humana; (c) ser livre de produtos animais que são usados para fabricar o produto; (d) ter

uma relação custo-eficácia viável a fabricação, e (e) deve ser eficaz no tratamento e

prevenção das leishmaniose. Outros atributos (por exemplo: não necessitar de agulha

para aplicação; ser dose única) também poderiam ser listados (Coler & Reed 2005).

No entanto, em se tratando de uma vacina contra um protozoário com aspectos

biológicos tão complexos, estas propriedades seriam de difícil aplicação, pois uma

vacina contra LVC deveria apresentar algumas características como: (i) indução de

mecanismos imunoprotetores efetivos, (ii) impedir a transmissão vetorial e (iii) permitir

a diferenciação sorológica entre cães vacinados dos naturalmente infectados por L.

chagasi.

2.3.1 Vacinas de Primeira Geração

A primeira geração de vacinas contra a leishmaniose, preparadas com parasitos

totais inativados, foram considerados promissores devido à sua facilidade de produção e

baixo custo. Estas vacinas têm sido objeto de inúmeros pesquisadores durante várias

décadas. Os estudos demonstram que estas vacinas apresentam segurança e induzem

imunogenicidade e proteção, podendo constituir em futuras vacinas efetivamente

profiláticas (Noazin et al., 2008).

Considerando os resultados de vários ensaios clínicos utilizando antígenos totais

apresentam eficácia em torno de 0-75% contra leishmaniose cutânea, os resultados

obtidos contra leishmaniose visceral obtiveram níveis inferiores de proteção (Modabber,

1995; Nadim et al., 1983; Khalil et al., 2000; Genaro et al., 1996; Mayrink et al., 1996;

Sharifi et al., 1998, De Luca et al., 2001).

Vacinas de Primeira geração que chegaram a ensaios clínicos em seres humanos

começaram no Brasil na década de 1940, onde foram realizados testes de eficácia

envolvendo as chamadas ―Vacinas Mortas‖ compostas por antígenos totais do parasito.

A maioria dos ensaios desenvolvidos foram contra LTA (Antunes et al., 1986 ; Velez et

al., 2005; Armijos et al., 2004; Sharifi et al., 1998; Momeni et al., 1999), enquanto

apenas um contra LV foi realizado (Khalil et al., 2000).


14

Entre os primeiros estudos, Pessoa e Pestana desenvolveram uma vacina

constituída por 18 cepas dermatotrópicas de Leishmania, marcando a literatura

científica como o primeiro ensaio clínico vacinal realizado em humanos utilizando uma

vacina anti-LTA (Pessoa & Pestana, 1940, Pessoa, 1941a, Pessoa, 1941b).

Um marco para o desenvolvimento científico na elaboração de vacinas composta

de promastigotas vivas de Leishmania, certamente foi o estabelecimento de condições

para o cultivo in vitro destes parasitos por Nicolle (1908). Promastigotas de L. major

cultivadas em meio de cultura foram utilizados pela primeira vez na Rússia em 1937,

para induzir proteção contra a infecção natural (Greenblatt, 1980). Estes estudos

possibilitaram a realização de inúmeros ensaios imunoprofiláticos, contra espécies de

Leishmania dermatotrópicas, a exemplo das vacinações em massa, realizadas nas

décadas de 60 e 70 na ex-União Soviética e Israel (Greenblatt, 1980, Kellina et al.,1981)

e mais recentemente no Irã, sendo denominado por leishmanização (Genaro et al.,

1996a, Mauel, 2002). Os efeitos indesejáveis advindos da utilização de vacinas

constituídas por promastigotas virulentas vivas culminou com a interrupção desta

prática vacinal (Mauel, 2002).

Na busca de uma vacina de primeira geração, alguns estudos tem empregado o

uso de parasitos autoclavados (Sharifi et al., 1998; Momeni et al., 1999; Khalil et al.,

2000; Satti et al., 2001) como a melhor forma de esterilização e preservação do

imunobiológico. No velho mundo, todas as vacinas utilizavam antígeno autoclavado de

L. major (ALM), enquanto que na América a maioria das vacinas utilizavam lisado

autoclavado de L. amazonensis (ALA) (Velez et al., 2005; Armijos et al., 2004), ou

uma mistura de espécies autóctones utilizada por Antunes et al. (1986), que obtiveram

um valor de eficácia vacinal de 67,3% em estudo controlado em campo na região

amazônica.

Vacinas de primeira geração têm sido utilizadas com sucesso para a

imunoterapia contra leishmaniose cutânea em humanos no Brasil (Mayrink et al., 2006)

e Venezuela (Convit et al., 1987). Avaliações da imunogenicidade de indivíduos

submetidos a imunização com a Leishvacin

(vacina composta por promastigotas de L.

amazonensis) revelou aumento da produção de IFN- pós vacinal correlacionado com

uma forte proliferação celular (Mendonça et al., 1995) com predominância de linfócitos

T (LT) CD8+ específicos contra antígenos de Leishmania (Mendonça et al., 1995, De

Luca et al., 1999).


15

Resultados promissores empregando-se vacinas de primeira geração também

têm sido descritos em contra LVC. Ensaios de Fase I e II empregando-se uma vacina

composta por antígenos de L. braziliensis associado ao BCG como adjuvante revelou

proteção de 90% em cães experimentalmente infectados com L. chagasi (Mayrink et al.,

1996). Entretanto, ao se testar esta composição vacinal, em ensaio clínico vacinal duplo-

cego randomizado de Fase III no Município de Montes Claros–MG não foi possível

identificar mecanismos imunoprotetores contra a infecção natural por L. chagasi

(Genaro et al., 1996b). Outro estudo de Fase III contra LVC realizado no Irã (Mohebali

et al., 2004), avaliou uma vacina com ALM associado ao BCG como adjuvante, sendo

observado uma taxa de 69% de redução na soroconversão de cães vacinados. Mais

recentemente, tem sido demonstrado que outra vacina contra LVC composta por

promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis foi capaz de induzir a expansão de

linfócitos T CD8+ e a atividade linfoproliferativa Leishmania-específica em cães

(Giunchetti et al., 2008d).

Outro estudo empregando-se uma vacina constituída por promastigotas de L.

amazonensis associado ao BCG como adjuvante foi avaliada em paralelo ao grupo

composto pela vacina Leishmune (Fort Dodge Saúde Animal Ltda) (Araújo et al.,

2008, Araújo et al., 2009). Embora os cães não tenham sido desafiados

experimentalmente, este trabalho possibilitou a compreensão de importantes eventos

envolvidos na resposta imune pós-vacinal. Neste contexto, foi observado que tanto o

grupo vacinado com o imunógeno constituído por antígeno bruto de L. amazonensis

como pela Leishmune apresentaram uma resposta imune com envolvimento tardio

preferencialmente de linfócitos T (CD4+ e CD8

+), com aumento específico da produção

de citocina intracitoplasmática IFN- em células mononucleares do sangue periférico

submetidas à cultura com antígeno de L. chagasi. Desta forma, foi observado em ambos

imunógenos o envolvimento de linfócitos T CD8+, que recentemente vem sendo

associado a mecanismos imunoprotetores na LVC (Reis et al., 2006b).

Estes resultados estimulam a utilização de antígenos brutos como potenciais

candidatos a vacina contra LVC, considerando que são capazes de promover resposta

imune celular e reduzir a taxa de infecção (Mayrink et al., 1996) ou mesmo estimular a

modulação do sistema imune, desencadeando uma resposta celular com envolvimento

de linfócitos T CD8+ (Araújo, 2006), importantes para resistência à infecção por L.

chagasi (Reis et al., 2006b). Devido a isto, nosso grupo de pesquisa vem trabalhando


16

com o desenvolvimento de vacinas de primeira geração, como a vacina LBSapSal

propasta neste trabalho, e como a vacina LBSap (constituída por antígenos de

Leishmania braziliensis associado ao adjuvante saponina), onde resultados preliminares

demonstraram que a vacina LBSap é capaz de induzir uma forte atividade imunogênica

após o processo vacinal, particularmente relacionada a expansão de linfócitos T CD8+

circulantes e de linfócitos T CD8+ Leishmania-específicos, (Giunchetti et al., 2007).

Estes resultados estimularam a continuidade dos estudos empregando-se o desafio

experimental em cães imunizados com a vacina LBSap, que está sendo conduzido no

Canil de Experimentação em Leishmanioses da UFOP.

2.3.2 Vacinas de Segunda Geração

Vacinas de segunda geração candidatas ao controle das leishmanioses têm sido

muito estudadas nos últimos anos podendo ser agrupadas em quatro tipos de estratégias

vacinais mais comumente utilizadas: vacinas vivas; vacinas que utilizam veículos que

facilitam o endereçamento antigênico; vacinas baseadas em antígenos purificados de

Leishmania; e vacinas com antígenos recombinantes.

Na categoria de vacinas vivas podemos incluir as vacinas com Leishmania spp.

geneticamente modificadas, ''knock out'' Leishmania spp., onde genes essenciais são

depletados, como por exemplo, timidilato redutase dihidrofolato sintase (Cruz et al.,

1991), cisteína-proteinase (Souza et al., 1994; Alexander et al., 1998) ou transportador

de biopterina (Papadopoulou et al., 2002). Estes parasitas passam por um ciclo de vida

curto, suficiente para gerar uma resposta imune específica causando infecção abortiva e

não acometimento da doença ao homem. Outra abordagem surgiu após a conclusão do

genoma da Leishmania que possibilitou a inclusão de ―cassetes suicidas'' incluindo

genes sensíveis a drogas (Muyombwe et al., 1998; Davoudi et al., 2005). Embora

geneticamente modificadas de forma a impedir a infecção, estas vacinas por

apresentarem o parasito vivo apresentam impedimentos éticos que inviabilizam seu uso.

Buscando orientar o endereçamento antigênico de forma induzir um padrão de

resposta imune protetora, tem sido empregado bactérias ou vírus recombinantes

expressando antígeno de Leishmania. Como exemplo de vacinas que utilizam bactérias

como veículos de entrega, podemos citar: antígeno gp63 de Leishmania major

(metaloprotease de superfície), clonado em mutante de Salmonella thypymurium (Yang

et al., 1990; Xu et al., 1995) ou no BCG (Connell et al., 1993) que obtiveram redução


17

do parasitismo em 67%-78% e 42%, respectivamente; e o antígeno LCR1 de L. chagasi

(semelhante a proteína flagelar de T. cruzi) com BCG (Streit et al., 2000). Entre os

exemplos de vacinas baseadas em vírus como veículos de entrega pode-se citar: vírus

expressando a proteína de superfície de promastigotas G46/M-2/PSA-2 que protege

parcialmente contra infecção por L. amazonensis (McMahon-Pratt et al., 1993), ou

expressando o antígeno LACK de L. infantum (receptor do parasita análogo ao receptor

ativado de proteína quinase C em mamíferos) que no primeiro ―boost‖ de vacinação,

protegeu parcialmente camundongos BALB/c contra L. major (Gonzalo et al., 2002) e

cães contra a infecção por L. infantum (Ramiro et al., 2003).

Outra abordagem para vacinas de segunda geração inclui o uso de sub-frações

purificadas de Leishmania. Neste tópico, se destacam os resultados obtidos pelas

vacinas contra LVC, entre elas o FML-saponina (Borja-Cabrera et al., 2000; da Silva et

al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002) e LiESAp-MDP (Holzmuller et al., 2005;

Lemesre et al., 2005; 2007; Bourdoiseau et al., 2009).

A preparação glicoprotéica enriquecida de promastigotas de L. donovani,

nomeado FML (fucose-manose ligante) (Palatnik et al., 1993), antigênica para uso

humano (Palatnik et al., 1995) e canino (Borja-Cabrera et al., 1999), foi formulada com

o adjuvante Quillaja saponaria saponin e passou por Ensaios de Fase I-III se tornando

licenciada no Brasil com a denominação de Leishmune® (Parra et al., 2007; Fort Dodge

Saúde Animal Ltda). O antígeno FML revelou resultados promissores do ponto de vista

imunogênico e imunoprofilático ou ainda como agente imunoterápico, em ratos e

hamsters (Santos et al., 2002; Palatnik et al., 1994; Santos et al., 2003), e em ensaios de

campo com cães (Borja-Cabrera et al., 2000; da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al.,

2002). Os resultados em ensaios de Fase III são considerados controversos uma vez que

não foram confirmados e realizados por outros grupos de pesquisa. Além disto, a vacina

Leishmune® apresenta o problema de não ser possível a distinção entre cães vacinados

dos infectados pelas técnicas sorológicas utilizadas e preconizadas pelo Ministério da

Saúde. Além disso, é fundamental que sejam realizados estudos sobre o potencial de

infecciosidade de cães vacinados para flebotomíneos e sobre a redução da doença na

população humana na região onde os cães foram vacinados (Miró et al., 2008;

MS/Brasil, 2005, 2007).

A vacina composta por uma proteína 54 kDa excretada de promastigotas de L.

infantum associada ao adjuvante muramyl dipeptide (MDP), foi avaliada no sul da

França (Lemesre et al., 2007) revelando eficácia vacinal de 92%. Esta vacina apresenta-


18

se altamente promissora, considerado os resultados de Fase III, entretanto, a dificuldade

de estabilidade antigênica parece ser o maior entrave para a padronização da produção

deste imunobiológico.

Recentemente, em estudo realizado por Fernandes et al. (2008), empregando a

proteína recombinante de amastigota A2 em cães, revelaram a indução de uma resposta

imune com a presença de IFN- com proteção parcial (4/7 cães foram positivos) dos

animais desafiados experimentalmente. A vacinação com antígeno A2 não converteu

testes sorológicos que utilizam antígenos de promatigotas, permitindo então a

discriminação entre os animais vacinados e infectados, um requisito importante de

candidatos vacinais contra LVC para não interferirem com o programa de controle da

leishmaniose visceral. É importante ressaltar que recentemente esta vacina foi

licenciada no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e é

comercializada com o nome de Leish-Tec® (Hertape Calier Saúde Animal S/A).

Os multicomponentes de proteínas fundidas Leish-111f contendo os antígenos

TSA (antioxidante tiol-específico), LmSTI1 (proteína 1 indutora de stress em L. major)

e Leif (fator de iniciação de alongamento em Leishmania), apresentaram

imunogenicidade em cães sem, no entanto, conferir proteção frente o desafio com L.

chagasi (Fujiwara et al., 2005) ou L. infantum (Moreno et al., 2007). Além disto, estes

antígenos não foram capazes de prevenir a infecção natural por L.infantum, ou a

progressão da doença em cães avaliados em canil aberto (Gradoni et al., 2005).

Molano et al. (2003) avaliaram a administração intraperitoneal de uma proteína

recombinante formada pela fusão genética de cinco fragmentos intracelulares

antigênicos de L. infantum (proteínas ribossomais ácidas, Lip2a, Lip2b, P0 e histona

H2A) associado BCG (Soto et al., 1998). Neste estudo foi demonstrado níveis de

infecção de 10-50% em cultura de amostras de linfonodos em diferentes tempos de

avaliação após o desafio experimental de cães com baixa dose de inóculo (5x105

promastigotas de L. infantum).

Mais recentemente, Carcelén et al. (2009) avaliaram um ensaio duplo-cego

experimental em cães, da proteína quimérica ―Q‖ de Leishmania administrados em dose

simples (Q) ou dupla (Q + Q) sem adjuvante. Em 1/7 dos cães vacinados com dose

simples (Q) e 4/7 dos cães vacinados com dose dupla (Q+Q) apresentaram PCR positiva

na pele, em contraste com 6/7 de positividade em cães do grupo controle.

Poot et al. (2009) avaliaram a proteína recombinante JPCM5-Q em cães

buscando identificar um adjuvante que apresentasse melhor desempenho. Neste estudo


19

foram avaliados o dipeptídeo muralil (MDP), hidróxido de alumínio, Matrix C e

Propionibacterium acnes morta, em combinação com E. coli ou baculovírus. Os

resultados clínicos e parasitológicos obtidos durante os 10 meses de avaliação indicaram

que a proteção não foi induzida por nenhuma das combinações de adjuvantes.

No Brasil, duas vacinas de segunda geração (Leish-Tec

e Leishmune

) foram

liberadas pelo MAPA para comercialização, embora necessitarem de avaliações para

identificar o real potencial de imunogenicidade e proteção, além de avaliações que

verifiquem a infectividade de flebotomíneos alimentados em cães vacinados, para que

sejam indicadas como ferramentas a serem empregadas no programa de controle da

leishmaniose visceral (PCLV) do Ministério da Saúde no Brasil (MS/Brasil, 2007,

2009).

2.3.3 Vacinas de Terceira Geração

Em 1995, surgiu a vacina de DNA como uma nova alternativa biotecnológica na

vacinologia e uma proposta de caminho a ser trilhado no futuro das vacinas contra LVC

(Waine and McManus, 1995). Essas vacinas são capazes de suscitar respostas imunes

envolvendo células T CD4+ e CD8

+, que podem ainda ser moduladas pela adição de

citocinas e/ou oligonucleotídeos CpG (Alarcon, Waine e McManus, 1999; Restifo et al.,

2000). Também podem ser administradas por estratégias ―prime-boost‖ que envolvem o

condicionamento com o DNA e reforço com a proteína (McShane, 2002).

Os antígenos mais estudados em vacinas de DNA foram anteriormente

analisados como proteínas recombinantes (Liew & Xu, 1995; Aguilar-Be et al., 2005;

Rodríguez-Cortés et al., 2007b; Gurunathan et al., 1998; Solioz et al., 1999; Ahmed et

al., 2004; Campos-Neto et al., 2002; Iborra et al., 2004; Rafati et al., 2001; Ghosh et

al., 2001; Fragaki et al., 2001). A maioria delas foram testadas como vacinas simples

(Gurunathan et al., 1997; Liew & Xu, 1995; Aguilar-Be et al., 2005; Gurunathan et al.,

1998; Ahmed et al., 2004; Campos-Neto et al., 2002; Ghosh et al., 2001; Fragaki et al.,

2001; Melby et al., 2001; Sukumaran et al., 2003; Basu et al., 2005; Gamboa-Léon et

al., 2006), e alguns, como combinação de genes (Ahmed et al., 2004; Campos-Neto et

al., 2002; Iborra et al., 2004; Rafati et al., 2001; Campbell et al., 2003;) ou como

―prime-boost‖ heterólogos (HPB) (Rafati et al., 2005) ou ainda vírus expressando a

proteína recombinante (Ramiro et al., 2003; Gonzalo et al., 2002). Adjuvantes foram

adicionados às formulações em apenas dois dos estudos citados (Rafati et al., 2005;


20

Melby et al., 2001). Apenas uma pequena parcela destes estudos foi realizada em cães

(Ramiro et al., 2003; Saldarriaga et al., 2006; Rafati et al., 2005; Rodríguez-Cortés et

al., 2007b).

LACK é a vacina de DNA mais testada até o momento contra a LC ou LV

(Gurunathan et al., 1997, 1998, 2000; Zavala et al. 2001; Gonzalo et al., 2002; Tapia et

al., 2003; Lange et al., 2004). Um ensaio de vacinação contra LVC conduzido por

Ramiro et al. (2003) utilizando DNA-LACK seguido por um reforço de Vaccinia vírus

recombinante contendo mesmo gene revelou proteção de 60% após 17 meses de

acompanhamento. Estes resultados altamente promissores foram ofuscados por outros

estudos em que a imunização com LACK não ofereceu nenhuma proteção contra

leishmaniose tegumentar (Ahmed et al., 2004; Dumonteil et al., 2003) e visceral em

modelos murinos (Melby et al. 2001; Marques-da-Silva et al., 2005).

Vários outros antígenos foram testados com sucesso como vacinas de DNA

contra infecção cutânea ou visceral. O primeiro grupo inclui proteína ribosomal ácido

P0 (Iborra et al., 2003), nuclease P4 (Campbell et al., 2003) e proteína paraflagellar 2

(PRP-2) (Saravia et al., 2005), enquanto o segundo contém ORFF (Sukumaran et al.,

2003; Tewary et al., 2005), a proteína da membrana do cinetoplasto-11 (KMP-11)

(Basu et al., 2005), CPA e CPB (Rafati et al., 2005) e NH36, uma componente principal

do fucose manose ligante (Aguilar-Be et al., 2005).

Depois de imunizações iniciais de DNA com as frações de um biblioteca de

expressão de cDNA de L. donovani que totalizaram cerca de 30.000 plasmídeos

construídos, foi identificado um pequeno número de vacinas de DNA que codificam

proteínas histonas isoladamente ou coletivamente, induziu uma forte resposta Th1 e

proteção no modelo murino (Melby et al., 2000). Saldarriaga et al. (2006) combinaram

esses plasmídeos que codificam proteínas histona com plasmídeos mostrados em

estudos anteriormente que codificam proteínas que induzem uma resposta imune celular

TH1 e/ou proteção imunidade em modelos murinos de infecção por Leishmania [ P36

(LACK) (Gurunathan et al.,1997; 1998; Melby et al.,2001); PSA-2 (Sjolander et

al.,1998); TSA / peroxidoxin e STI1(Campos-Neto et al., 2001; Mendez et al., 2001)

ARP-1 (Melby et al., dados não publicados); H1(Melby et al., dados não publicados)].

Dessa forma, Saldarriaga et al. (2006) conduziram um estudo de vacinação em

cães empregando uma vacina de DNA multicomponente codificando 10 antígenos da

Leishmania (H1, H2A, H2B, H3, H4, LACK, PSA-2, TSA / peroxidoxin, STI1 e ARP-

1). Neste estudo, após o desafio com L. donovani foi observado indução da atividade


21

linfoproliferativa e produção de IFN- conferindo redução da carga parasitária no

linfonodo e em um modelo de infecção in vitro.

Um estudo realizado por Rafati et al. (2005) utilizando uma combinação para

imunização com DNA e proteínas cisteína proteinases tipo I (CPB) e tipo II (CPA) de L.

infantum, revelou após 12 meses do desafio com baixa dose (5x106 promastigostas de L.

infantum) um resultado parasitológico de 20% de infecção em cães, utilizando-se PCR

em amostras de sangue.

Um estudo adicional multi-antigênico com DNA plasmidial codificando quatro

proteínas (KMPII, TRYP, LACK e GP63) não conseguiu demonstrar a proteção contra

desafio experimental por L. infantum em cães (Rodriguez-Cortés et al., 2007b).

Embora as vacinas de DNA contra a Leishmania tenham sido consideradas uma

alternativa biotecnológica altamente promissora, o entusiasmo inicial de seu uso parece

ter sido reduzido em função da complexidade e dificuldades que surgiram neste modelo

vacinal (Kedzierski et al., 2006).

2.3.4 Vacinas a base de Antígenos Salivares de Flebotomíneos

Durante o repasso sanguíneo de fêmeas de flebotomíneos em mamíferos, o

conteúdo da glândula salivar é regurgitado juntamente com promastigotas de

Leishmania na pele do hospedeiro (Titus & Ribeiro,1988). Para tanto, flebotomíneos

desenvolveram estratégias para favorecer o repasto sanguíneo, driblando mecanismos

fisiológicos do hospedeiro vertebrado. Além da homeostase, flebótomos também devem

evadir a resposta imune inata e adquirida do hospedeiro. Para superar esses obstáculos,

flebotomíneos possuem dentro de sua secreção salivar uma grande diversidade de

componentes farmacológicos potentes, tais como anticoagulantes (Charlab et al., 1999),

fatores antiplaquetários (Ribeiro et al., 1999), vasodilatadores (Lerner et al., 1991) e,

sobretudo, imunomoduladores e moléculas anti-inflamatórias (Kamhawi et al., 2000).

Estes mediadores, com atividades redundantes e sinérgicas, fornecem um

microambiente favorável para uma adequada alimentação sanguínea e também são

importantes para o estabelecimento do parasita.

Considerando este amplo repertório de mecanismos para favorecer o repasto

sanguíneo no hospedeiro vertebrado, recentemente, tem sido investigado o papel de

componentes salivares de flebótomos no estabelecimento da infecção por Leishmania

como uma estratégia para ser empregada no controle da doença. Desta forma, vários


22

estudos têm caracterizado e isolado um número de moléculas responsáveis por estes

efeitos sobre a homeostase do hospedeiro e explorado a possibilidade de neutralizá-las

(Anderson et al., 2006; Oliveira et al., 2006).

O maxadilan, um dos principais componentes identificados na saliva de L.

longipalpis, foi descrito como responsável pela modulação do sistema imune e tem sido

relatado que inibe tanto a proliferação de linfócitos T como o estabelecimento de reação

hipersensibilidade retardada quando inoculado na presença de antígeno de Leishmania

(Qureshi et al., 1996), além de inibir a expressão de TNF- em macrófagos e aumentar

a produção de IL-10 (Bozza et al., 1998, Soares et al., 1998).

Um dos primeiros estudos que avaliou o efeito da saliva sobre a infecção por

Leishmania foi descrito por Titus & Ribeiro (1988). Neste trabalho, ficou demonstrado

que a saliva de L. longipalpis favorecia a infecção por L. major em camundongos,

aumentando tanto o tamanho da lesão, como a carga parasitária nas lesões. Desta forma,

foi observado que componentes do extrato de glândulas salivares (SGE) de L.

longipalpis, apresentavam papel importante na infecção e na proteção do parasito (Titus

& Ribeiro, 1988). Estudos semelhantes avaliaram o efeito do SGE de L. longipalpis e P.

papatasi sobre a infecção por L. major e L. amazonensis em camundongos (Theodos et

al., 1991). Este estudo possibilitou a observação de que SGE de L. longipalpis favorecia

a infecção de L. amazonensis e o SGE de P. papatasi aumentava a infecção por L.

major. Resultados semelhantes foram obtidos por Samuelson et al. (1991), sendo

observado exacerbação das lesões cutâneas e da carga parasitária em camundongos

BALB/c desafiados com L. braziliensis associado ao SGE de L. longipalpis.

Para se compreender melhor qual seria o papel da saliva sobre o sistema imune,

um experimento conduzido por Titus (1998), avaliou a capacidade de proliferação em

esplenócitos de camundongos BALB/c e C57BL/6 imunizados com antígeno de

eritrócitos de ovelha (―sheep red blood cells‖ - SRBC) e SGE de L. longipalpis, sendo

observado um efeito imunossupressor da saliva atuando na inibição da proliferação de

linfócitos T CD4+ antígeno-específico ou na presença de um potente mitógeno

inespecífico (Concanavalina A). Num contexto evolutivo, este efeito imunossupressor

poderia estar relacionado a uma estratégia desenvolvida por artrópodes, pela atividade

imunossupressora de proteínas da saliva, para prevenir a sensibilização de seus

hospedeiros contra proteínas vasomoduladoras importantes para o repasto sanguíneo

(Titus, 1998). Além disto, na presença de SGE de L. longipalpis, macrófagos são

incapazes de participar do processo de apresentação antigênica, sendo refratários a


23

ativação por IFN- e incapazes de produzir peróxido de hidrogênio ou óxido nítrico

(NO), fundamentais para o controle do parasitismo (Hall & Titus, 1995).

De fato, a saliva de flebótomos parece exercer um efeito direto sobre as células

apresentadoras de antígenos de humanos. Glândulas salivares sonicadas (SGS) de L.

longipalpis inibiu a produção de IL-10 e TNF-, mas induziu a produção de IL-6, IL-8

e IL-12p40 em monócitos e células dendríticas (Costa et al., 2004). Além da produção

de citocinas, saliva de flebótomos também interferiu com a expressão de moléculas co-

estimulatórias em macrófagos (expressão reduzida de CD80 e aumenta de HLA-DR) e

monócitos (aumento da expressão de CD80 e HLA-DR). Além disso, os efeitos da

saliva em células do sistema imunológico humano foram inibidos pela incubação in

vitro com anticorpos anti-SGS (Costa et al., 2004), sugerindo a importância de uma

resposta humoral específica para a neutralização da saliva de flebotomíneos e impedir

os efeitos deletérios sobre o sistema imunológico humano.

Estudo conduzido por Peters et al. (2009), em camundongos com infecções

curadas de L. major para mimetizar a leishmanização, revelou que estes camundongos

foram altamente resistentes a infecção transmitida pelos flebotomíneos. Em contraste,

camundongos vacinados com uma vacina morta composto de antígeno autoclavado L.

major (ALM) mais oligodesoxinucleotides CpG, que protegeu contra desafio por

inoculo experimental (Rhee et al., 2002), apresentaram atrasada expressão da imunidade

protetora e não protegeram contra o desafio com flebotomíneos infectados. Análises por

microscopia intra-vital e por citometria de fluxo revelaram que os flebótomos, mas não

o desafio por inoculo experimental, resulta na manutenção de uma resposta neutrofílica

no local da picada de flebotomíneos e estes fagocitam os parasitas depositados. Este

processo parece ser crítico para a progressão da doença, já que os parasitas transmitidos

na ausência de neutrófilos são menos propensos a estabelecer infecção (Peters et al.,

2008). Além disso, a manutenção crônica de neutrófilos parece comprometer a

expressão da imunidade adaptativa (Peters et al., 2009). Estes resultados e outros (Van

Zandbergen et al., 2007; Laskay et al.2008) sugerem que os neutrófilos desempenham

um papel proeminente na promoção patogênese da leishmaniose tegumentar. Desta

forma, na ausência destes neutrófilos e seguida transmissão vetorial, há um aumento da

resposta imune específica contra o parasita que leva a uma eficácia das vacinas mortas

(Peters et al., 2009). Estas observações identificam os fatores imunológicos críticos que

influenciam na eficácia da vacina após a transmissão natural da Leishmania. De forma


24

interessante, recentemente foi descrito que proteínas salivares de L. longipalpis

protegeram hamsters contra a infecção por L. chagasi (Gomes et al., 2008).

Apesar de suas características imunomoduladoras, os componentes salivares de

flebótomos parecem mostrar uma atividade imunogênica, provocando a produção de

anticorpos e de resposta imune do hospedeiro mediada por células. No entanto, o papel

específico dos anticorpos contra a saliva de flebotomíneos no decorrer da infecção por

Leishmania não foi ainda totalmente descrita. Camundongos BALB/c expostos

repetidamente ao repasto sanguíneo de L. longipalpis produziram altos níveis de

anticorpos anti-saliva, com predomínio da subclasse IgG1 (Belkaid et al., 1998).

Mais recentemente, Collin et al. (2009) analisaram cães imunizados com

proteínas de saliva de L. longipalpis (LJL143 e LJM17) e desafiados com flebótomos

não infectados ou infectados. Este estudo revelou uma resposta celular no local da

picada caracterizada por infiltrado linfocitário e expressão de IFN- e IL-12. Estes

resultados reforçam que o emprego de proteínas da saliva de L. longipalpis em cães

poderia ser uma boa estratégia para compor uma vacina anti-LVC (Collin et al., 2009).

Nosso grupo de pesquisa mostrou em soros de cães naturalmente infectados por

L. chagasi, o reconhecimento sérico de dois antígenos constituintes de SGE de L.

longipalpis, a LuLo-D7 (28.6 kDa) e a Lulo Yellow (47,3kDa) (Bahia et al., 2007).

Estas proteínas foram isoladas, identificadas e caracterizadas por espectrometria de

massa e por bioinformática. Atualmente estamos trabalhando na expressão destas

proteínas para compor uma futura vacina recombinante. Além disto, nosso grupo de

pesquisa vem trabalhando com a vacina LBSapSal (constituída por antígenos de

Leishmania braziliensis associado ao adjuvante saponina e extrato de glândula salivar

de L. longipalpis). Resultados preliminares demonstraram que esta vacina é capaz de

induzir uma forte atividade imunogênica após o processo vacinal, particularmente

relacionada a expansão de linfócitos T CD8+ circulantes e de linfócitos T CD8

+

Leishmania-específicos, além de elevada produção de oxido nítrico no soro e de

anticorpos IgG anti-saliva e anti-L.chagasi (Giunchetti et al., 2008c). Estes resultados

estimularam a continuidade dos estudos empregando-se o desafio experimental em cães

imunizados com a vacina LBSapSal.

Neste sentido, considerando que o cão tem papel central no controle da LV, e

que ainda não há tratamento capaz de eliminar o parasito destes animais torna-se

fundamental o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC como medida para combater a

crescente expansão da LV podendo contribuir de forma efetiva nos programas de


25

controle da LV (Marzochi et al., 1985, Genaro, 1993, Hommel et al., 1995, Genaro et

al., 1996a, Gradoni, 2001, Handman, 2001, Mauel, 2002, Brodskyn et al., 2003,

Desjeux, 2004, Ravindran & Ali, 2004, Requena et al., 2004; Dantas-Torres &

Brandão-Filho, 2006; Noazin et al., 2008; Fernandes et al., 2008). Neste sentido, o

presente trabalho busca dar continuidade aos estudos prévios realizados por Giunchetti

et al. (2008c), empregando-se a vacina LBSapSal com o objetivo de se avaliar aspectos

relacionados a imunogenicidade e a eficácia após o desafio intradérmico com L. chagasi

conjuntamente com glândula salivar de L. longipalpis.

3. Justificativa

AGUIAR-SOARES, R.D.O. _______________Justificativa

27

A leishmaniose visceral é uma doença que se apresenta em franco processo de

expansão em diferentes regiões do país e do mundo. O padrão emergente e re-emergente

característico desta doença se deve principalmente ao fato do cão ser o principal

reservatório doméstico do parasito, possibilitando a manutenção da transmissão da

leishmaniose visceral no ambiente urbano. Considerando que as medidas de controle

preconizadas pelo Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCLV) não tem

logrado êxito no combate desta enfermidade. Diante isto, torna-se fundamental o

desenvolvimento de estratégias imunoprofiláticas que sejam capazes de proteger cães

possibilitando assim a redução da transmissão do parasito ao homem. Entretanto, até o

momento, não existe nenhuma vacina contra a leishmaniose visceral canina

recomendada para uso pelo Ministério da Saúde do Brasil em campanhas de Saúde

Pública. Nos últimos anos foi demonstrado a importância de biomoléculas constituintes

da saliva de flebotomíneos favorecendo o processo de infecção de parasitos do gênero

Leishmania sp. despertando o interesse de pesquisadores em construir vacinas cujo

repertório antigênico levasse em consideração peptídeos da saliva de flebotomíneos.

Diversos estudos mostraram a capacidade imunogênica do extrato de glândula salivar

(SGE) de flebotomíneos em fornecer potencial resposta imune associada a proteção

contra a infecção em modelos murinos. Entretanto até o momento nenhum estudo havia

sido proposto para avaliar o potencial imunogênico de SGE conferir imunogenicidade

protetora em cães no sentido de em um futuro próximo tais pepitídeos poderem ser

incorporados em uma vacina anti-LVC. Este estudo caracteriza como o primeiro no

mundo em que empregou SGE na composição do repertório antigênico vacinal da

vacina LBSap passando a constituir uma nova vacina (LBSapSal). Além disto,

considerando os resultados promissores de imunogenicidade pós-vacinal da vacina

LBSapSal em cães, o presente estudo buscou compreender os eventos envolvidos nos

processos de imunogenicidade pós-desafio experimental com L. chagasi em cães

imunizados com esta vacina. Adicionalmente, o presente trabalho contribuirá para

verificar a viabilidade da SGE constituir futuras vacinas anti-LVC com componentes

antigênicos da glândula salivar de L. Longipalpis, construídas através de estratégias que

empregam ferramentas biotecnológicas.

4. Objetivos

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ___________ Objetivos

29

4.1- Objetivo Geral

Avaliar a imunogenicidade da vacina LBSapSal em cães, em um estudo

longitudinal de 435 dias após a infecção/desafio experimental por via intradérmica com

1x107

promastigotas de L. chagasi associada a extrato de glândula salivar de L.

longipalpis e proceder investigação parasitológica e molecular na medula óssea.

4.2 - Objetivos Específicos

Avaliar a imunogenicidade em cães imunizados com a vacina LBSapSal ou

inoculados com seus diferentes componentes em cães antes e após o desafio

experimental com L. chagasi associada a saliva de L. longipalpis, considerando a

análise dos seguintes parâmetros:

Reatividade sérica anti-Leishmania (IgG Total, IgG1 e IgG2);

Leucograma pela análise da população global de leucócitos, neutrófilos totais,

eosinófilos, linfócitos e monócitos;

Número de linfócitos T (CD5+, CD4

+ e CD8

+) e linfócitos B (CD21

+) no sangue

periférico;

Número de monócitos CD14+

no sangue periférico e perfil de ativação dos

linfócitos circulantes através dos marcadores CD80, MHC-II, MHC-I;

Atividade linfoproliferativa e frequência imunofenotípica de linfócitos (CD5+,

CD4+, CD8

+, CD21

+) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel

vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA);

Ativação linfocitária pela análise da expressão de MHC-II+ e análise de


+, CD8

+, CD21

+) e o

perfil imunofenotípico de linfócitos MHC-II+ cultivados in vitro com VSA e

SLcA;

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ___________ Objetivos

30

Avaliação clínica e investigação parasitológica e molecular em amostras da

Medula Óssea empregando-se:

Isolamentos do parasito em meio NNN/LIT;

Identificação de formas amastigotas de Leishmania em esfregaços em

lâminas corados por Giemsa;

Identificação por PCR do DNA do gênero Leishmania.

5. Material e Métodos

AGUIAR-SOARES, R.D.O. Material e Métodos

32

5.1 – Manejo da colônia de cães destinados a experimentação

Para compor este estudo, foram utilizados cães nascidos e criados no canil de

experimentação para testes de drogas e vacinas da Divisão de Biotério Central da

Universidade Federal de Ouro Preto. Os cães receberam a medicação vermífuga a partir

de 21 dias de idade, juntamente com as matrizes, três vezes inicialmente, com intervalo

de 21 dias, seguido de outras três doses, com intervalo de três meses até atingirem idade

de um ano.

A vacinação contra cinomose, adenovírus tipo 2, coronavírus, parainfluenza,

parvovírus e leptospirose canina (Vanguard® HTLP 5/CV-L, Pfizer) foi iniciada aos 45

dias de idade, totalizando três aplicações, conforme recomendação do fabricante. A

vacinação anti-rábica (Vacina anti-rábica fuenzalida modificada®, Tecpar) foi fornecida

em dose única quando os filhotes completaram quatro meses de idade.

Os experimentos destinados a avaliação de imunogenicidade, utilizando

diferentes estratégias imunoprofiláticas contra LVC, foram iniciados quando os cães

atingiram idade média de sete meses sendo que a diferença máxima de idade entre os

cães foi de aproximadamente 45 dias (Giunchetti, 2007). Os animais foram mantidos

em canil totalmente telado com malha suficientemente fina capaz de impedir a entrada

de flebotomíneos, apesar da região, ser considerada, área indene para leishmaniose

visceral e o monitoramento da área com armadilhas CDC não ter capturado nenhuma

espécime vetora em um período de 12 meses. Todas as instalações do canil foram

submetidas a borrifação com inseticida piretróide, a cada três meses, como medida

auxiliar de combate a insetos. É importante ressaltar que estes animais foram

acompanhados após os experimentos de imunogenicidade pós vacinal que compuseram

a tese de doutorado de Rodolfo Cordeiro Giunchetti (Giunchetti, 2007), sendo realizado

o desafio experimental com promastigotas de L. chagasi associadas a glândulas

salivares de Lutzomyia longipalpis e prosseguido por um longo acompanhamento que

totalizou 435 dias, além de análises de parâmetros imunológicos e parasitológicos de

forma a compor o presente estudo.

5.2 – Desenho Experimental

Este estudo foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa os cães foram

sensibilizados com os diversos antígenos e adjuvantes vacinais compondo um protocolo


33

extremamente rigoroso de ensaio de fase I e II em canil fechado seguida da avaliação do

perfil da resposta imune decorrente desta sensibilização (imunogenicidade) e originou a

tese de doutorado do Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti (Giunchetti, 2007), ou seja,

Imunogenicidade pós vacinal. Na segunda etapa deste estudo, os animais foram

desafiados com 1,0x107 promastigotas de L. chagasi em fase estacionária por via

intradérmica sendo inoculados concomitantemente com extrato de saliva de L.

longipalpis. Assim, no presente estudo os animais foram acompanhados por um período

de 435 dias, onde foi realizada a avaliação dos eventos imunológicos após desafio

experimental com L. chagasi, abordando aspectos relacionados a resposta imune celular

(análises ex vivo e in vitro) e humoral, bem como a avaliação parasitológica de medula

óssea.

5.2.1 – Produção do antígeno vacinal, preparo do adjuvante saponina e

obtenção de glândulas salivares de Lutzomyia longipalpis

O imunobiológico desenvolvido para este trabalho que constitui a vacina

LBSapSal foi elaborado a partir de cultura da cepa padrão de Leishmania (Viannia)

braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) cultivada em meio de cultura ágar-sangue,

―Nicolle-Novy-Neal‖ (NNN), associado ao ―Liver Infusion Tryptose‖ (LIT). As

culturas foram mantidas em estufa biológica refrigerada BOD (FANEM® modelo 347),

à temperatura de 23°C ± 1°C. A concentração do antígeno utilizada em cada dose foi de

600 μg diluído em 1mL de solução salina estéril.

A saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) utilizada neste estudo como

adjuvante foi diluída em solução salina estéril 0,85% no momento do inóculo (1mg em

cada dose diluída em 1 mL de solução salina estéril).

O extrato de glândula salivar de L. longipalpis (SGE) utilizado neste estudo

como componente antigênico vacinal foi cedido pelo Laboratório de Fisiologia de

Insetos Hematófagos/ICB/UFMG, a partir da colônia de L. longipalpis proveniente de

Teresina (Piauí) e Abaetetuba (Pará) e obtidas conforme protocolo estabelecido por

Cavalcante et al. (2003). As glândulas salivares de fêmeas de L. longipalpis, não

alimentadas, com idade de quatro dias, foram dissecadas em solução salina levemente

hipotônica não tamponada a 0,8%. Após a coleta, as glândulas foram rompidas em

sonicador por 10 segundos e centrifugadas a 10.000 g por 2 minutos. O sobrenadante foi

coletado e armazenado em freezer -70ºC até o uso, onde no momento do inóculo foi


34

utilizado cinco ácinos de extrato de glândula salivar/dose, diluído em 1 mL de solução

salina estéril a 0,85%

5.2.2 – Grupos experimentais

Um total de 20 cães sem raça definida de ambos os sexos, distribuídos

aleatoriamente em diferentes grupos experimentais foram utilizados neste estudo.

Abaixo encontra-se a descrição detalhada dos grupos experimentais empregados:

Grupo controle (C): composto por 5 cães (três machos e duas fêmeas), que

receberam três aplicações de 1 mL de solução salina estéril a 0,85% por via subcutânea,

em intervalos de 30 dias;

Grupo imunizado com saliva de L. longipalpis (Sal): formado por cinco cães

(dois machos e três fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de cinco

ácinos de extrato de glândula salivar/dose, diluído em 1 mL de solução salina estéril a

0,85%, em intervalos de 30 dias;

Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis associado à saliva

de L. longipalpis (LBSal): composto por cinco cães (dois machos e três fêmeas). Cada

cão recebeu três aplicações subcutâneas 600 μg do antígeno/dose associado a cinco

ácinos de extrato de glândula salivar/dose, diluídos em 1 mL de solução salina estéril a

0,85%, em intervalos de 30 dias;

Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis associado ao

adjuvante saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal): composto por cinco cães

(dois machos e três fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de 600 μg do

antígeno/dose associado ao adjuvante, com 1 mg de saponina/dose, e cinco ácinos de

extrato de glândula salivar/dose, diluídos em 1 mL de solução salina estéril a 0,85%,

em intervalos de 30 dias;

Todos os grupos de cães foram inoculados com três doses dos diferentes

protocolos acima descritos.

5.2.3 – Infecção Experimental

A infecção experimental foi realizada 100 dias após a terceira dose da vacina

pela via intradérmica empregando-se uma concentração de 1,0x107 promastigotas de L.


35

chagasi em fase estacionária de crescimento associadas a dois ácinos de glândulas

salivares de L. longipalpis. O preparo dos parasitos e o protocolo do desafio

experimental seguem descritos a seguir:

Para infecção experimental foi empregado promastigotas obtidas de cultivo de

Leishmania (Leishmania) chagasi da cepa (MHOM/BR/1972/BH46) em meio ágar-

sangue, Nicolle-Novy-Neal (NNN), associado ao Liver Infusion Tryptose (LIT) em

Erlenmeyers de 250 mL. As culturas foram armazenadas em estufa biológica refrigerada

BOD (FANEM® modelo 347), à temperatura de 23°C ± 1°C.

Formas promastigotas em fase estacionária de crescimento (predominantemente

metacíclicas), destinadas ao desafio experimental foram obtidas a partir da expansão de

um inóculo inicial de 10 mL de meio LIT contendo entre 107 a 10

8 promastigotas/mL

em crescimento logarítmico, adicionadas a 40 mL de meio de cultura bifásico

NNN/LIT. A cultura foi ―repicada‖ para outros cinco erlenmeyers utilizando 10 mL de

cultura contendo entre 107 a 10

8 promastigotas/mL adicionados a 40 mL de NNN/LIT.

Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes sendo que no último repique, as

culturas foram adicionadas apenas ao meio LIT para minimizar a presença de hemácias ,

de forma que ao final de 10 dias, foram obtidos em torno de 5.000 mL de cultura

contendo promastigotas em fase estacionária, predominantemente metacíclicas

(conforme curva de crescimento previamente estabelecida para esta cepa em nosso

laboratório), na concentração entre 107 e 10

8 promastigotas/mL. A cultura foi removida

em capela de fluxo laminar e transferida para tubos estéreis de polipropileno de 50 mL

(Falcon®, Becton Dickinson, EUA), submetidos à centrifugação a 400 x g durante 10

minutos a 23°C. Após descartar o sobrenadante, o sedimento de promastigotas foi

homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,85%), seguido de centrifugação na

mesma condição. Este procedimento de lavagem foi repetido por mais uma vez.

Ao fim das lavagens as formas promastigotas metacíclicas foram contadas e

ressuspendidas em solução salina estéril (NaCl 0,85%/pH=7,2-7,4) numa concentração

final de 107 promastigotas. A dose do inóculo foi padronizada para 500 µL adicionados

dois ácinos de glândula salivar de L. longipalpis. O inóculo foi realizado

intradermicamente na face interna da orelha esquerda dos animais.

Amostras de sangue foram coletadas nos intervalos previamente estabelecidos

no cronograma de avaliação longitudinal sendo que o ponto inicial do presente estudo

foi considerado a partir da ultima dose vacinal (estudo de imunogenicidade; Giunchetti,

2007). Desta forma, neste estudo a primeira avaliação realizada foi 85 dias após a


36

terceira dose da vacina. Para facilitar o entendimento das avaliações pré e pós-desafio

com L. chagasi, os tempos foram denominados de Tad (Tempo antes do desafio que

constitui-se em 85 dias após a terceira dose da vacina sendo a última avaliação antes do

desafio experimental); enquanto os tempos pós-desafio foram denominados de Dpd

(Dias pós-desafio: 20Dpd; 90Dpd; 274Dpd e 435Dpd).

A avaliação clínica detalhada dos animais após o desafio experimental foi

realizada mensalmente por médico veterinário e os dados clínicos observados foram

anotados em ficha clínica individual dos cães. As análises e classificação clínica dos

animais foram segundo Mancianti et al. (1988) e Reis et al. (2006a).

As amostras biológicas da medula óssea foram coletadas nos tempos de 115,

195, 320, 435 dias pós-desafio para realização das técnicas parasitológicas nos

diferentes grupos avaliados.

O Diagrama 1, apresentado a seguir, ilustra o delineamento experimental

utilizado no estudo.

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ______________________________________________ Material e Métodos

37

Diagrama 1: Esquema do desenho experimental utilizado na avaliação de cães inoculados com diferentes protocolos vacinais e desafiados intradermicamente com L. chagasi:

controle (C); saliva (Sal); vacina de L. braziliensis associado a saliva (LBSal); e vacina de L. braziliensis associado a saliva e ao adjuvante saponina (LBSapSal). Tad = tempo

antes do desafio; 20Dpd = 20 dias pós-desafio; 90Dpd = 90 dias pós-desafio; 274Dpd = 274 dias pós-desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio.


38

5.3 – Avaliações imunológicas e Ensaios de Imunogenicidade Pós Vacinal

5.3.1 – Obtenção de amostras de sangue periférico

As amostras de sangue periférico foram coletadas em seringas descartáveis

estéreis de 20 mL, através de punção preferencial da veia jugular ou radial. Em seguida,

foram transferidos 5 mL de sangue para um tubo contendo EDTA (na proporção de

1mg/mL) destinados à realização do leucograma e da imunofenotipagem ex vivo por

citometria de fluxo, enquanto 10 mL foram transferidos para dois tubos sem anti-

coagulante, destinados à obtenção de soro para realização dos testes sorológicos. As

amostras de soro foram obtidas por centrifugação dos tubos a 450 x g por 10 minutos a

temperatura ambiente (10’/TA) e subsequentemente aliquotadas e congeladas à –20ºC

até o momento do uso para avaliações sorológicas pelo método de ELISA.

Para realização dos testes de avaliação da resposta imune após estimulação in

vitro, 30 mL de sangue foram coletados em duas seringas descartáveis estéreis

heparinizadas de 20 mL. O sangue permaneceu em temperatura ambiente, por até 3

horas, até o momento do uso.

5.3.2 – Leucograma

Para a avaliação do quadro leucocitário foi utilizada a técnica convencional de

contagem de leucócitos (Dacie & Lewis, 1984) em contador automático de células

(Cobas Micros 60, ABX, França), por ocasião da coleta de sangue. O leucograma foi

determinado pelo número de leucócitos/mm3 e a contagem diferencial de células com

determinação do número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos foi

realizada em esfregaços corados pelo corante panótico rápido (Instant-Prov, Pinhais,

PR, Brasil) e avaliada por microscopia óptica em objetiva de imersão, por meio da

contagem de 100 leucócitos/lâmina.

5.3.3 – Avaliação da resposta imune humoral anti-Leishmania

5.3.3.1 – Obtenção do antígeno para a reação imunoenzimática anti-

Leishmania


39

Antígeno solúvel de promastigotas de L. chagasi (MHOM/BR/1972/BH46) foi

utilizado nos testes de ELISA, produzido in house conforme protocolo e patente

depositado no INPI por pesquisadores de nosso grupo (PI0605889-2). Brevemente os

parasitos foram cultivados por sete dias em meio LIT. Os parasitos foram lavados 3

vezes em solução tampão fosfato pH 7,2 por centrifugação em 600 x g por 10 minutos.

Em seguida, os parasitos foram rompidos com três ciclos durante 1 minuto a 40 Watts

em ultra-som (Sonifier Cell Disruptor® - Brason Sonic Power Co., EUA) em banho de

gelo. Posteriormente, o material sonicado foi centrifugado a 37.000 x g por 1 hora e 30

minutos, a 4°C. O sobrenadante foi dializado contra PBS pH 7,2, durante 24 horas, a

4°C sob agitação. Por fim, o material remanescente no saco de diálise foi filtrado em

filtros estéreis descartáveis, de 0,22 μm (Millipore Co, Massachusetts, EUA) em

condições estéreis e uma alíquota retirada para dosagem de proteína pelo método de

Lowry et al. (1951), sendo ajustada a concentração para 1.000μg/mL. Amostras do

antígeno foram aliquotadas e congeladas em freezer à -80°C até o momento do uso.

Para os testes de ELISA, 2μg/poço do antígeno solúvel de promastigotas de L. chagasi

(SLcA) foram utilizados para sensibilização das placas de 96 poços (MaxiSorp™, Nalge

Nunc Intl., Rochester, NY, USA).

5.3.3.2 – Pesquisa de anticorpos anti-Leishmania

Amostras de soros dos diferentes grupos de cães foram submetidas à reação

imunoenzimática (ELISA), conforme técnica descrita por Voller (1978) e segundo

protocolo descrito por Reis et al. (2006c), empregando-se conjugados HRPO

específicos para cão, anti-IgG total (com afinidade para molécula total de IgG), anti-

IgG1 e anti-IgG2 (com afinidade para cadeia pesada) (Bethyl laboratories, Inc

Montgomery – Texas, EUA). A diluição ótima dos conjugados foi determinada por

titulação, empregando-se soros padrões positivos e negativos, obtendo-se a diluição

padrão de 1:16.000 (IgG total e IgG2) e 1:1.000 (IgG1). O ponto de corte discriminante

negativo/positivo foi determinado, utilizando-se 40 soros-padrão da soroteca do

Laboratório de Imunopatologia (NUPEB-UFOP) de cães negativos pela reação de

imunofluorescência indireta (RIFI). Assim, foram obtidos o ponto de corte

discriminante negativo/positivo, avaliados por densidade óptica, para as reações

realizadas pela análise comparativa entre os grupos C, Sal, LBSal e LBSapSal (IgG

total: 0,11; IgG1: 0,08; IgG2: 0,10). As amostras de soro foram testadas na diluição de


40

1:80 e a leitura realizada em leitor automático de microplaca Multiskan® MCC 340

(Labsystems, Helsinki, Finland), ajustando o comprimento de onda para 492 nm. Os

resultados foram expressos pela média da densidade óptica de cada grupo em Tad,

20Dpd, 90Dpd, 274Dpd e 435Dpd.

5.3.4 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo

5.3.4.1 – Citometria de fluxo

A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular automatizada, que permite

a avaliação simultânea de múltiplas propriedades biofísicas individuais de uma célula

suspensa em meio líquido. Esta caracterização inclui a análise básica de três parâmetros

celulares: tamanho (determinado pela difração do raio laser – Forward scatter - FSC),

granulosidade ou complexidade interna (determinada pela refração e reflexão do raio

laser – Side Scatter – SSC) e intensidade relativa de fluorescências. Estes parâmetros

são detectados em um sistema óptico-eletrônico acoplados, emitindo sinais que podem

ser medidos e armazenados, para posterior análise.

A análise multiparamétrica de diferentes componentes celulares pode ser

realizada empregando-se além da análise morfométrica das células, reações contendo

fluorocromos distintos, tais como o isotiocianato de fluoresceína (FITC – emite

fluorescência verde ou tipo 1 - FL1), ficoeritrina (PE - emite fluorescência laranja ou

tipo 2 - FL2) e a ficoeritrina conjugada à cianina 5 (PE-CY5 - emite fluorescência

vermelha ou tipo 3 - FL3). Neste contexto, para a realização dos ensaios de

imunofenotipagem das células obtidas a partir do sangue periférico, foram utilizados

anticorpos monoclonais específicos anti-receptores de células caninas (Tabela 1).

Alguns dos anticorpos monoclonais utilizados na fenotipagem de leucócitos do sangue

periférico foram adquiridos já marcados com fluorocromos, entre eles, o anti-CD21

FITC, anti-MHC-I R-PE, anti-CD80 R-PE e o anti-CD14 PE-Cy-5. Os demais

anticorpos são puros, não sendo marcados com fluorocromos. Neste caso, foi

empregado anticorpo secundário anti-rato marcado com FITC (Tabela 1) para revelação

da marcação.

Para aquisição, armazenamento e análise dos dados referentes à resposta celular

foi empregado o citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Diego, EUA),


41

equipado com um sistema de computador contendo o software Cell Quest, fornecido

pelo fabricante do equipamento.


42

Tabela 1 – Painel de anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de leucócitos sanguíneos

Anticorpos Monoclonais Hospedeiro Clone Isotipo Fluorocromo Diluição final Célula alvo/Atuação

Anti-CD5 Rato YKIX322.3 IgG2a FITC 1:800 Linfócitos T

Anti-CD4 Rato YKIX302.9 IgG2a - 1:1000 LT auxiliares

Anti-CD8 Rato YCATE55.9 IgG1 - 1:200 LT citotóxicos/supressores

Anti-CD21 Camundongo IOB1a IgG1 FITC 1:100 Linfócitos B

Anti-CD14 Camundongo TÜK4 IgG2a R-PE-Cy5 1:200 Monócitos e Granulócitos

Anti-CD80 Camundongo 16-10A1 IgG2 R-PE Não Diluído Molécula co-estimuladora

Anti-MHC-I Camundongo 2G5 IgG2b E-PE 1:10 Células Nucleadas

Anti-rato IgG Ovelha Policlonal Rat IgG - FITC 1:400 Controle de Conjugado

Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela SEROTEC Ltd (Oxford - Inglaterra), exceto anti-CD80 (BD Pharmingen™, San Jose, EUA).


43

5.3.4.2 – Obtenção e preparo da suspensão de leucócitos do sangue

periférico para imunofenotipagem ex vivo utilizando microplacas

O preparo da suspensão leucocitária, bem como o ensaio de imunofenotipagem

foi realizado de acordo com protocolo descrito por Reis (2001), Reis et al., (2005) e

Giunchetti (2007). Da amostra de sangue colhido em EDTA, foram retirados 3,5 mL e

transferidos para um tubo de 50 mL (Falcon®, Becton Dickinson, San Jose, EUA),

completando-se o volume com solução PBS pH 7,2/10% SFB (Soro Fetal Bovino -

GIBCO, Grand Island, New York, USA) sendo posteriormente homogeneizada e

submetida a centrifugação a 450 x g, por 10’/TA. Em seguida, o sobrenadante foi

aspirado e foram adicionados 45 mL de solução de lise (Facs lysing solution - Becton

Dickinson, San Jose, EUA) sendo o material imediatamente submetido a agitação

manual por 10 segundos. O material foi incubado em repouso por 10’/TA e, em seguida,

centrifugado a 450 x g, por 10’/TA. O sobrenadante foi desprezado de uma só vez, e a

suspensão celular ressuspendida em 40 mL de PBS pH 7,2, homogeneizada. Novamente

o material foi submetido à centrifugação a 450 x g, por 10’/TA. O sobrenadante foi

desprezado, o sedimento homogeneizado, ressuspendido em 30 mL de PBS pH 7,2/10%

SFB centrifugando-se o material a 450 x g, por 10’/TA para última lavagem.

Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspendido em 2

mL de solução de PBS pH 7,2/10%SFB.

Antes de iniciar o protocolo de imunofenotipagem, era realizado um teste de

controle de qualidade da suspensão celular: em 30 μL da suspensão foram adicionados

200 μL de solução fixadora para citometria - MaxFacsFix (10,0 g/L de paraformaldeído,

10,2 g/L de cacodilato de sódio e 6,65 g/L de cloreto de sódio, pH 7,2), em tubo de

poliestireno de 5mL (Falcon® 2054, Becton Dickinson, San Jose, EUA), específico

para leitura no citômetro de fluxo (FACScan - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).

O teste permitia avaliar antecipadamente a qualidade do perfil celular das amostras após

a lise, com relação às propriedades de tamanho e granulosidade e a existência de

autofluorescência.


periférico no contexto ex vivo e in vitro utilizando microplacas


44

Os anticorpos monoclonais foram preparados na diluição previamente

estabelecida por titulação (Tabela 1). As diluições foram realizadas em solução de PBS

pH 7,2/20% SFB (FACS dil) e os anticorpos distribuídos em microplacas de 96

orifícios, fundo em "U" (LIMBRO, INC Biomedicals, Inc. Aurora, Ohio, EUA). As

placas foram preparadas uma semana antes dos experimentos de fenotipagem e

armazenadas em freezer à -20ºC (Cônsul, São Paulo, Brasil). Em cada orifício, foram

colocados 30 μL dos anticorpos anti-CD5, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD21, diluídos

previamente, conforme ilustrado na Tabela 2. Cada fileira horizontal de uma placa (12

orifícios) compreendia a marcação fenotípica das células de um único cão para os

anticorpos citados anteriormente. Os orifícios 1, 2 e 3 representavam os controles de

qualidade da reação os quais permitiam avaliar a ocorrência de possíveis reações

inespecíficas. Os anticorpos empregados foram das subclasses IgG1 ou IgG2, conforme

mostrado na Tabela 1. No orifício 1 foi adicionado apenas PBS pH 7,2/20% SFB (Facs

dil) junto à suspensão celular. No orifício 2 foi empregada uma mistura de soros de rato

normal (SRN), diluído 1:6.000 em solução de PBS pH 7,2/20% SFB, e no orifício 3

uma mistura de soros de camundongo normal (SCN), diluído 1:6.000 em solução PBS

pH 7,2/20% SFB, servindo de controles isotípicos das reações. Já o orifício 4 foi

utilizado para verificar a ocorrência de ligação inespecífica dos anticorpos secundários

anti-rato. Reações apresentando resultados de frequência de fluorescência superiores a

2% nos orifícios acima citados foram desconsideradas e repetidas em uma nova coleta

de material. A Tabela 2 ilustra a quantidade e diluição dos anticorpos utilizados para

fenotipagem em leucócitos do sangue periférico, utilizando-se microplacas.

O ensaio de imunofenotipagem de leucócitos em microplacas foi realizado

adicionando-se em cada orifício 30 μL da suspensão celular e, após a adição das células,

a placa foi submetida à agitação, cuidadosa e lenta, em Vórtex (Fisher, Vortex Genie 2,

Bohemia, NY, EUA), e deixada sob incubação por 30 minutos, ao abrigo da luz e à

temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 140 μL de PBS 1X/pH 7,2, para

remoção do excesso de anticorpos livres, que não ligaram durante o processo de

incubação. Após a centrifugação a 600 x g por 10 minutos em temperatura ambiente, o

sobrenadante foi desprezado de uma só vez, e a placa vertida sobre papel toalha

absorvente para eliminação do sobrenadante residual. O sedimento celular foi

ressuspenso agitando-se a placa em vórtex e, foram adicionados aos orifícios sobre a

suspensão celular, 60 μL do anticorpo secundário, exceto no primeiro e oitavo orifícios,

que receberam 60 μL da solução FACS dil. A placa foi submetida à agitação lenta no


45

vórtex, para homogeneizar o material, sendo deixada em incubação por 30 minutos, ao

abrigo da luz à temperatura ambiente. Em seguida as células foram lavadas por 2 vezes

com 140 μL de PBS 1X/pH 7,2, submetidas a centrifugação a 600 x g por 10 minutos

em temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado de uma só vez e a placa

vertida sobre papel toalha absorvente. As células foram ressuspensas utilizando-se

vórtex para então serem adicionados 170 μL da solução fixadora (MaxFacsFix). Com o

auxílio de uma pipeta multicanal, as células foram transferidas para uma estante

contendo tubos de 500 μL (Thomas Laboratory Specialities, EUA.). Após 30 minutos,

foi realizada a leitura do material no citômetro de fluxo (FACScan – Becton Dickinson,

San Jose, CA, EUA), com aquisição de 20.000 eventos/tubo.

Tabela 2 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular de leucócitos do

sangue periférico ou de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro para fenotipagem

em microplacas de 96 orifícios

Orifícios Anticorpo 1ário

/diluição Anticorpo 2ário

/diluição

1 30 μL FACS dil 60 μL FACS dil

2 30 μL SRN (1:6.000) 60 μL anti-rato (1:400)

3 30 μL SCN (1:6.000) 60 μL anti-camundongo (1:600)

4 30 μL FACS dil 60 μL anti-rato (1:400)

5 30 μL anti-CD5 (1:800) 60 μL anti-rato (1:400)



8 30 μL anti-CD21* (1:100) 60 μL FACS dil

FACS dil: PBS pH 7,2/20%SFB; SRN: Soro de Rato Normal: SCN Soro de Camundongo Normal. *Para o

anticorpo anti-CD21, foram adicionados 60 μL FACS dil, na etapa de revelação pelo conjugado, pois era o

único anticorpo marcado (FITC) utilizado na fenotipagem de microplacas.


periférico no contexto ex vivo utilizando tubos

Esta segunda metodologia para fenotipagem celular foi realizada empregando-se

um processo simples de marcação primária em quatro tubos de poliestireno de 5 mL

(Falcon® 2054, Becton Dickinson, San Diego, EUA), utilizando-se anticorpos

monoclonais em quantidades e diluições descritas na Tabela 3. Os tubos foram

preparados uma semana antes dos experimentos de fenotipagem e armazenados em

freezer à -20ºC. Em tubos contendo 50 μL de FACS dil (controle da suspensão celular),


46

50 μL dos anticorpos anti-CD14 R-PE-Cy5, 5 μL de anti-MHC-I R-PE ou 1 μL de anti-

CD80 R-PE, foram adicionados 50 μL de sangue colhido em EDTA. As células foram,

então, misturadas ao anticorpo com o auxílio de um vórtex e incubadas por 30 minutos

ao abrigo da luz, em temperatura ambiente. Para lise dos eritrócitos, foram adicionados

2 mL de solução de lise (Facs lysing solution - Becton Dickinson, San Jose, EUA) sob

agitação no vórtex, incubando-se por 10 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo

da luz. Logo após esta etapa, foram feitas 2 lavagens adicionado 1 mL de PBS 1X/pH

7,2, sendo o material homogeneizado no vórtex e centrifugado a 450 x g por 10

minutos, em temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento

ressuspendido em 200 μL de solução fixadora (MaxFacsFix), para então, realizar-se a

leitura no citômetro de fluxo (FACScan – Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), com

aquisição de 20.000 eventos/tubo.


leucócitos do sangue periférico para fenotipagem em tubos

Tubos Anticorpo 1ário

/diluição

1 50 μL FACS dil

2 50 μL anti-CD14 R-PE-Cy5 (1:200)

3 50 μL anti-MHC-I R-PE (1:10)

4 1 μL anti-CD80 R-PE (puro)

FACS dil: PBS pH 7,2/20%SFB.

5.3.5 – Avaliação da resposta celular no contexto in vitro

Buscando ampliar as análises de imunogenicidade foram realizados testes in

vitro para avaliar as frequências imunofenotípicas de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+,

CD21+) e a capacidade linfoproliferativa antígeno-específica nos grupos de cães

submetidos a diferentes protocolos vacinais e desafiados por L. chagasi. É importante

ressaltar que os ensaios para avaliação do perfil imunofenotípico após estimulação

antígeno-específica foram realizados conforme descrito na metodologia de

imunofenotipagem em microplacas, conforme descrito no item: ―5.3.4.3 – Ensaio de

imunofenotipagem celular em leucócitos do sangue periférico no contexto ex vivo e in

vitro utilizando microplacas‖. Portanto, nesta parte, serão descritas a forma de cultivo

bem como a obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

destinadas a avaliação da capacidade linfoproliferativa e imunofenotipagem das PBMC


47

antígeno-específicas. Estes ensaios possibilitam uma avaliação funcional da resposta

celular frente ao antígeno vacinal (VSA) ou antígeno relacionado ao agente etiológico

da LVC (L. chagasi)(SLcA). Neste contexto, propomos esta segunda estratégia para

avaliação da imunogenicidade utilizando como ferramentas a avaliação da atividade

linfoproliferativa 90 dias pós-desafio (90Dpd) e 435 dias pós-desafio (435Dpd), bem

como a análise da frequência imunofenotípica realizada pela comparação entre as

culturas das PBMC estimuladas com antígeno em relação às culturas controles não

estimuladas, em ambos os tempos citados anteriormente, nos diferentes grupos em

estudo.

5.3.5.1 – Obtenção do antígeno solúvel vacinal (VSA) de L. braziliensis e

do antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) para os ensaios in vitro

Para os ensaios de cultivo celular (linfoproliferação e imunofenotipagem de

linfócitos) foi utilizado antígeno solúvel vacinal (VSA), constituído por L. braziliensis

(MHOM/BR/75/M2903), da mesma partida do cultivo descrito no item ―5.2.1 –

Produção do antígeno vacinal, preparo do adjuvante saponina e obtenção de glândulas

salivares de Lutzomyia longipalpis‖, além de antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA)

(MHOM/BR/1972/BH46). Após obtenção da massa de promastigotas, os parasitos

foram submetidos a três ciclos de congelamento e descongelamento e posteriormente, a

três ciclos de rompimento mecânico em homogeneizador elétrico com pistão de teflon

(Virtis, Holanda) por 1 minuto com intervalos de 30 segundos. Em seguida, o material

antigênico foi centrifugado a 37.000 x g, durante 90 minutos à 4°C. Subsequentemente

o material foi distribuído em sacos de diálise e dializado contra PBS 1X/pH 7,2 à 4°C,

sob agitação por 72 horas. O material foi recolhido, filtrado em membrana de 0,22 μm,

e uma alíquota foi separada para dosagem da concentração de proteínas pelo método de

Lowry et al. (1951). O material antigênico foi ressuspenso para uma concentração final

protéica de 1 mg/mL. O material foi aliquotado e conservado em freezer à - 70°C

(Forma Scientific, EUA) até o momento do uso.

5.3.5.2 – Obtenção de células mononucleares do sangue periférico

destinadas aos ensaios in vitro


48

As seringas heparinizadas de coleta do sangue destinadas aos ensaios de cultivo

celular foram descontaminadas com álcool 70% e encaminhadas à capela de fluxo

laminar (Veco, Campinas, São Paulo, Brasil), para dar início ao processamento do

material. Logo em seguida, os 30 mL de sangue coletados foram diluídos em RPMI

1640 (Invitrogen Co., Grand Island, NY, USA), em dois tubos de polipropileno de 50

mL (Falcon®, Becton Dickinson, San Jose, EUA), contendo cada um 15 mL de sangue

e 15 mL de RPMI 1640. Posteriormente, o sangue foi centrifugado a 450 x g por 10

minutos em temperatura ambiente. Este procedimento de lavagem foi importante para

retirada do excesso de plasma. Em seguida, no interior da capela de fluxo laminar, o

sobrenadante foi retirado com auxílio de pipeta Pasteur, e foi adicionado novamente

RPMI 1640, até completar o volume final para 30 mL em cada tubo. Subsequentemente,

30 mL de sangue diluído foi aplicado lentamente sobre 10 ml de Ficoll-hypaque

(Histopaque® 1.077 - Sigma Co., E.U.A) gelado (4ºC) em tubos de 50 mL de

polipropileno (Falcon®, Becton Dickinson, San Jose, EUA), os quais foram

centrifugados a 450 x g por 40 minutos em temperatura ambiente. Após este

procedimento, foi removido o anel celular contendo células mononucleares do sangue

periférico (PBMC), com auxílio de pipeta Pasteur, e as células lavadas com RPMI 1640

heparinizado [30 μL de heparina 5.000 UI/mL (Heparin®, Cristália) para cada 100 mL

de RPMI] por duas vezes, seguido de uma lavagem final em RPMI 1640 puro, ambas

em centrifugação a 450 x g por 10 minutos à 4º C. Ao final, as células foram

ressuspensas em 1 ou 2 mL em RPMI 1640 conforme a quantidade de sedimento obtido.

Para a contagem, foi utilizada a câmara hematocitométrica de Neubauer (Boeco,

Germany). Para tanto, foram utilizados 10 μL da suspensão celular diluídos em 190 μL

de solução de Azul de Trypan (Sigma Co., E.U.A) (diluição 1:20) para a realização da

contagem de células mononucleares e da análise de viabilidade celular. O valor obtido

foi multiplicado pelo volume ressuspendido e o fator de diluição. Assim, o volume final

foi ajustado para conter 1x107 células/mL.

5.3.5.3 – Ensaio de proliferação linfocitária e obtenção das células

mononucleares do sangue periférico pós-cultivo para imunofenotipagem

O ensaio de proliferação linfocitária foi realizado para cada cão utilizando

culturas em triplicatas, em placas de 96 orifícios (Nunc, Naperville, EUA), na presença

do antígeno solúvel vacinal (VSA), de antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA), do


49

mitógeno fitohemaglutinina A (PHA, Difco, Detroit, Michigan) ou na ausência de

qualquer estímulo (cultura controle não estimulada). Foram utilizados 150 μL de meio

para cultivo de células caninas (10% Soro fetal bovino/1% de Estreptavidina/Penicilina,

2 mM L-glutamina e 0,1% -mercaptoetanol, em RPMI 1640) em cada um dos orifícios

avaliados. Para isto, foram adicionados 25 μL da suspensão de linfócitos contendo 107

células/mL, ou seja, 250.000 células/orifício nos poços que correspondem ao controle,

ao mitógeno PHA e nas culturas com a presença dos estímulos VSA ou SLcA. Foram

adicionados 25 μL dos estímulos (VSA ou SLcA) diluídos em meio de RPMI 1640, na

concentração final de 25 μg/poço de cada antígeno. Do agente mitogênico PHA, foram

adicionados 25 μL da solução de uso diluída em RPMI 1640 nos respectivos orifícios da

placa (concentração final de 2,5 μg/poço), destinados à avaliação do controle de

viabilidade funcional celular e da capacidade linfoproliferativa. Como controle de

proliferação, as células também foram cultivadas na ausência de qualquer estímulo

(antígenos ou PHA). As células foram estimuladas com PHA por 3 dias e com os

antígenos por 5 dias, e mantidas à 37°C em estufa incubadora (Forma Scientific, EUA)

com 5% de CO2. Foi adicionado 1 μCi de [3H] timidina (Sigma Chemical Co., EUA) em

cada orifício, nas últimas 6 horas de incubação. As células foram isoladas em papel de

fibra de vidro (modelo 943-AHWathman, EUA), através de um coletor automático de

células (Titertek Cell Harvester, Flow Laboratories, Irvine, Scotland, UK), e a

incorporação de [3H] timidina foi determinada por contagem em líquido de cintilação

em um contador automático de cintilação (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA). As

contagens foram expressas em contagens por minuto e descritas nos resultados na forma

de índice de proliferação, obtida pela divisão entre a média das contagens por minuto da

linfoproliferação das culturas estimuladas por VSA ou SLcA, dividido pela média das

contagens por minuto da linfoproliferação das culturas controles não estimuladas.

A suspensão celular destinada a reação de imunofenotipagem após cultivo com

VSA ou SLcA foi obtida em condições semelhantes à descrita anteriormente. Neste

sentido, as PBMC foram cultivadas em triplicata em placas de 48 orifícios (Costar,

Cambridge, MA, USA) contendo 650 μL de meio de cultivo para células caninas.

Foram adicionados 50 μL de PBMC em cada orifício (5,0 x 105 células/orifício), 100 μL

de VSA (25 μg/mL) ou 100 μL de SLcA (25 μg/mL). As culturas controles foram

preparadas da mesma forma, adicionando-se 100 μL de RPMI 1640 no lugar dos

estímulos antigênicos. A incubação foi realizada à 37°C em estufa incubadora (Forma

Scientific, EUA) com 5% de CO2 por 5 dias.


50

Após este período, as placas foram centrifugadas a 450 x g, em temperatura de

18oC por 10 minutos. As células destinadas a imunofenotipagem foram removidas em

tubos de poliestireno (Falcon® 2054, Becton Dickinson, San Diego, EUA) com 3 mL

de RPMI para subsequente centrifugação a 450 x g em temperatura de 18oC por 10

minutos. Posteriormente, os tubos foram vertidos e as células fixadas com 2 mL de

solução de lise (Facs lysing solution - Becton Dickinson, San Jose, EUA),

homogeneizadas e após 10 minutos de incubação, foram submetidas a centrifugação a

450 x g em temperatura de 18oC por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e

adicionado 300 μL de PBS 1X/pH 7,2. Desta forma, as células estavam prontas para

serem submetidas ao protocolo de imunofenotipagem pela metodologia de microplacas,

que foi descrito no item: ―5.3.4.3 – Ensaio de imunofenotipagem celular em leucócitos

do sangue periférico no contexto ex vivo e in vitro utilizando microplacas‖. É

importante ressaltar que estes resultados serão apresentados através do índice de

proliferação obtido pela divisão do valor médio da frequência de linfócitos T (LT)

CD5+, CD4

+, CD8

+ e de linfócitos B CD21

+, das culturas estimuladas (VSA ou SLcA)

pelos respectivos fenótipos das culturas controles não estimuladas (cultivadas apenas

com meio RPMI).

5.4 – Avaliações parasitológicas

5.4.1 – Punção de medula óssea, cultivo em NNN/LIT e confecção das lâminas

A coleta de medula óssea foi realizada como descrita por Penny et al. (1970).

Antes de se iniciar o procedimento anestésico foi administrado 0,044mg/Kg de atropina,

por via subcutânea, com o objetivo de se minimizar efeitos colaterais relacionados a

depressão cardiorrespiratória do sedativo. Após 10 minutos, os animais foram

tranquilizados com Cloridrato de Xilazina 2%, na dosagem de 0,1 mL/kg de peso por

via intravenosa. Após cerca de dois minutos, foi administrado o anestésico geral

Tiopental Sódico diluído a 2,5% (Thionembutal®) em solução salina estéril (NaCl

0,85%), e aplicado na dose de 0,3mL/kg de peso por via intravenosa. Constatado o

estado de anestesia geral, o cão foi posicionado em decúbito lateral para coleta da

medula óssea na crista da tíbia e realização dos procedimentos de tricotomia e anti-

sepsia local (Polivinil Pirrolidona Iodo 10% - PVPI Tópico). Posteriormente, com

auxílio de agulha 18G 40x12 acoplada a uma seringa descartável (BD Plastipak®,


51

Becton Dickinson Ltda, Brasil) de 20 mL, a cavidade medular foi acessada e realizada a

aspiração da medula óssea. Um volume máximo de 1,0 mL de medula óssea foi

aspirado por coleta.

Imediatamente, após a retirada da agulha, uma a duas gotas do aspirado foi

colocada em tubo de vidro contendo 3 mL do meio de cultura NNN/LIT próximo ao

bico de Bunsen para evitar contaminação. Para cada animal foram feitos dois tubos

previamente identificados.

Os tubos foram armazenados em estufa biológica refrigerada BOD (FANEM®

modelo 347), à temperatura de 23°C ± 1°C e após 7 dias, foram feitas duas lâminas de

cada tubo para avaliação em microscópio óptico afim de se identificar o parasito. Após

análise das lâminas, foi retirado 1 mL do meio de cada tubos e repassado para um novo

tubo contendo 3 mL NNN/LIT e após 7 dias feita uma nova avaliação em microscópio.

Esse procedimento foi repetido mais duas vezes sendo que ao final de três ―repiques‖,

não sendo identificados parasitos, os tubos eram descartados. Os tubos que foram

identificados contaminados, presença de bactérias ou hifas de fungos, foram

imediatamente descartados.

Além disso, uma gota do aspirado medular era colocada em lâmina de vidro

previamente desengordurada com éter para realização dos esfregaços, seguindo a

mesma técnica dos esfregaços sanguíneos, tendo sido realizados dois esfregaços por

animal.

As lâminas contendo os esfregaços foram identificadas com o número do cão e

coradas pelo Giemsa e guardadas para posterior observação ao microscópio óptico, em

aumento de 100X, para pesquisa de formas amastigotas do parasito nos esfregaços.

5.4.2 – PCR

A extração do DNA foi realizada a partir das amostras de medula óssea

coletadas no momento da punção e congeladas a -70ºC em tampão T.E (Tris-EDTA) na

proporção de 1:1 v/v. Para obtenção do DNA da amostra um kit de extração WizardTM

Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA) foi utilizado seguindo

recomendações do fabricante e brevemente descrito a seguir: as amostras de medula

óssea armazenadas em -70°C foram descongeladas e delas foi retirada uma alíquota de

200µL, a este volume foi adicionado 700µL de solução de lise celular. Em seguida a

amostra foi homogeneizada por 10 minutos e centrifugada a 15.000g por um minuto


52

(Microcentrífuga Eppendorf - Modelo 5415C). Posteriormente foi descartado o

sobrenadante e o precipitado agitado com o auxílio de vortex por 15 segundos. Em

seguida foi adicionado 200µL de solução de lise nuclear e 75µL de solução de

precipitação protéica. Novamente, com o auxílio do vortex, a amostra foi

homogeneizada por 30 segundos e centrifugada a 15.000g por três minutos. O

sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde se adicionou 200µL de isopropanol

(Merck), em seguida a amostra foi homogeneizada por aproximadamente 30 segundos.

Após este procedimento a amostra foi centrifugada a 15.000g por um minuto, o

sobrenadante descartado e o precipitado novamente levado ao vortex por 15 segundos.

Posteriormente foi acrescentado 200µL de etanol a 70% (Merck), a amostra foi

homogeneizada e centrifugada a 15.000g por um minuto, sendo desprezado o

sobrenadante e a amostra deixada por 35 a 45 minutos em temperatura ambiente (TA)

até a total evaporação do etanol. Foi adicionado 100µL de solução de hidratação e as

amostras foram mantidas por 24 horas/TA, sendo periodicamente homogeneizadas.

Após este prazo foram armazenadas em geladeira a 4°C até o momento da análise da

qualidade do DNA extraído e o início da reação de PCR.

Foram usados como controles positivos amostras de DNAs padrões obtidos de

cepas referência de L. chagasi (MHOM/BR/1972/BH46). Estas cepas são provenientes

do criobanco do Laboratório de Imunopatologia (Instituto de Ciências Exatas e

Biológicas - Universidade Federal de Ouro Preto). Além destes foram utilizados como

controles negativos, DNAs de cães negativos do canil da UFOP.

O par de iniciadores 150 e 152 direcionados para amplificação da região

conservada dos minicírculos de kDNA de Leishmania (Degrave et al., 1994; Passos et

al., 1999) foram usados na realização da PCR . No momento antecedente a realização

do pré-mix foram confeccionadas duas misturas prévias. A primeira continha o volume

de reagentes, por poço, de: 1,31l (H2O Milli Q), 1,25µL (tampão KCl 10X), 0,75µL

(MgCl2 50M), 0,25µL (dNTP 10mM), 1,25µL (primer 150 10pmoles) e 0,19µL Taq

Fermentas (Sinapse®

) totalizando assim 5,0 µL. A segunda mistura preparada foi de

H2O Milli Q (3,75 µL) com o primer 152 a 10pmoles (1,25 µL) totalizando também um

volume final de 5,0 µL por poço. Após estas preparações, com o auxílio de uma pipeta

repetidora, foi adicionando em cada poço da placa (MicroAmp®

Fast Optical 96-Well,

Applied Biosystems) 5,0 µL da primeira mistura, 15 µL de óleo mineral (Nujol®) e 5,0

µL da segunda mistura, contendo o iniciador 152. Em seguida adicionou ao pré-mix 2,5

µL da amostra de DNA.


53

As condições utilizadas na reação de PCR foram: desnaturação inicial a 94°C

por um minuto, seguida por 40 ciclos a 93ºC por 30 segundos, 64°C por 1min, 72°C por

um minuto e uma extensão final a 72°C por sete minutos. O equipamento utilizado para

a realização de PCR foi o Verit Termal Cycler 96well (Applied Biosystems®,

Califórnia, USA).

Conforme descrito por Chicharro et. al. (2002), serão utilizados os seguintes

iniciadores para identificação do complexo Leishmania donovani: Don1: 5´- GGG GTT

GGT GTA AAA TAG GGC CGG - 3´ - Don2: 5´- CCA GGT TCC CGC CCC GGA G

- 3´. (tamanho do fragmento a ser amplificado: 805pb). Os controles negativos e

positivos da PCR foram incluídos em cada conjunto de reação. Como ―branco‖ da

reação foi usado um poço contendo todos os componentes, exceto DNA.

Após amplificação 5µl do produto obtido foram ressuspendidos em um volume

equivalente de tampão da amostra 2X (azul de bromofenol 0,25%, xilenocianol 0,25% e

15% de ficol) e aplicados em gel de poliacrilamida. A corrida eletroforética foi realizada

em gel de poliacrilamida a 8%, a 40mA em TBE (Tris-base a 89mM pH 8,0; ácido

bórico a 89mM, EDTA a 2mM) em um sistema de cubas preparadas para 80 amostras.

Foi utilizado como marcador de tamanho molecular o DNA do bacteriófago X 174

digerido pela enzima HaeIII (Pharmacia, San Francisco, CA, USA). Em seguida, os géis

foram corados pelo nitrato de prata 0,2% (Santos et al., 1993).

5.5 – Análise estatística dos dados

Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental dos softwares

Minitab 13.20 para Windows (Minitab Inc., Pennsylvania, USA) e GraphPad Prism 5.0

(Prism Software, Irvine, CA, USA). A normalidade dos dados foi demonstrada pelo

teste Kolmogorov-Smirnoff. Os testes de análise de variância (ANOVA) seguido pelo

teste de comparações múltiplas de Tukey foram empregados para avaliação entre os

grupos vacinais relacionados aos resultados da resposta humoral anti-Leishmania, bem

como das análises imunofenotípicas. O Teste T pareado foi utilizado nas avaliações da

resposta imune in vitro. Foram empregadas correlações de Pearson (r) para as

avaliações dos resultados do perfil imunofenotípico na linfoproliferação. Os dados

obtidos foram considerados estatisticamente significativos quando o valor de P foi

<0,05.

6. Resultados

AGUIAR-SOARES, R.D.O. _______ Resultados

55

Neste projeto foi estudado a imunogenicidade e eficácia da vacina LBSapSal em

cães após desafio intradérmico com Leishmania (Leishmania) chagasi e extrato de

glândula salivar de Lutzomyia longipalis durante um período de 435 dias. Após

obtenção do conjunto de dados gerados com este trabalho propomos uma apresentação

que facilitasse ao leitor a compreensão dos resultados de imunogenicidade e da

investigação parasitológica e molecular na medula óssea. Inicialmente serão

apresentados os dados referentes à reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-

Leishmania no soro de cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, antes e após

desafio com L. chagasi. Em seguida o estudo de imunogenicidade da resposta imune

celular no contexto ex vivo onde foi explorado pelas técnicas de Leucograma que nos

fornece um panorama da população de leucócitos (neutrófilos totais, eosinófilos,

linfócitos e monócitos). Em seguida os dados de imunofenotipagem por citometria de

fluxo de leucócitos circulantes completam o detalhamento do estudo de

imunogenicidade onde podemos verificar a flutuação da população de linfócitos T

(CD5+) e de suas subpopulações (CD4

+ e CD8

+) além das células apresentadoras de

antígenos (linfócitos B CD21+ e monócitos CD14

+) ao longo do follow up. Ainda no

contexto ex vivo foi estudado algumas moléculas de ativação celular expressas na

população de linfócitos totais (MHC-I+, MHC-II

+ e CD80

+). Análises de correlações são

empregadas para elucidar e auxiliar o entendimento de funções imunológicas que

possam estar sendo ativadas, amplificadas ou mesmo bloqueadas. Finalmente o estudo

de imunogecidade é coroado pelos ensaios de linfoproliferação no contexto in vitro e do

perfil imunofenotípico de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+, CD21

+). Além disto, no

contexto in vitro foi também estudado o perfil de ativação de linfócitos pela expressão

de MHC-II+ e sua correlação com o perfil imunofenotípico de linfócitos T (CD5

+,

CD4+, CD8

+) e linfócitos B (CD21

+) submetidos a estimulação antigênica com antígeno

solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA). Encerramos nosso

estudo com um panorama preliminar da eficácia vacinal da vacina LBSapSal por meio

da avaliação clínica detalhada, do diagnóstico parasitológico da medula óssea através de

isolamento em meio NNN/LIT e análise de esfregaço por aposição e do diagnóstico

molecular pela PCR em cães controle e submetidos aos diferentes protocolos de

imunização.


56

6.1 – Reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães

imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada

à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à

saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L.

chagasi

A Figura 1 ilustra os resultados da avaliação da reatividade sérica de IgG total,

IgG1 e IgG2 nos grupos C, Sal, LBSal e LBSapSal.

A avaliação da reatividade de IgG total revelou aumento significativo (P<0,05)

da média dos valores de densidade óptica do grupo LBSapSal em Tad (0,247±0,061),

20Dpd (0,342±0,020), 90Dpd (0,261±0,048) e 274Dpd (0,230±0,025) em relação aos

grupos C (Tad: 0,074±0,040; 20Dpd: 0,126±0,054; 90Dpd: 0,085±0,027; 274Dpd:

0,075±0,008), Sal (Tad: 0,104±0,047; 20Dpd: 0,220±0,077; 90Dpd: 0,100±0,017;

274Dpd: 0,090±0,012) e LBSal (Tad: 0,081±0,013; 20Dpd: 0,197±0,106; 90Dpd:

0,132±0,096; 274Dpd: 0,071±0,015).

A avaliação da reatividade de IgG1 revelou aumento significativo (P<0,05) dos

valores médios de densidade óptica, no grupo LBSapSal, nos tempos Tad (0,171±0,040)

e 274Dpd (0,121±0,017) com relação aos demais grupos - C (Tad: 0,030±0,020;

274Dpd: 0,028±0,027), Sal (Tad: 0,042±0,044; 274Dpd: 0,030±0,010) e LBSal (Tad:

0,029±0,016; 274Dpd: 0,048±0,044). A reatividade de IgG1 no grupo LBSapSal

também apresentou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de densidade

óptica nos tempos 20Dpd (0,387±0,110) e 90Dpd (0,192±0,057), mas com relação

apenas aos grupos C (20Dpd: 0,027±0,007; 90Dpd: 0,039±0,028;) e Sal (20Dpd:

0,100±0,065; 90Dpd: 0,050±0,020).

De forma semelhante a IgG total, a análise da reatividade sérica de IgG2 anti-

Leishmania evidenciou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de

densidade óptica no grupo LBSapSal nos tempos Tad (0,227±0,043), 20Dpd

(0,428±0,014), 90Dpd (0,288±0,048) e 274Dpd (0,264±0,051) em relação aos demais

grupos - C (Tad: 0,05±0,023; 20Dpd: 0,175±0,079; 90Dpd: 0,096±0,040; 274Dpd:

0,069±0,011), Sal (Tad: 0,093±0,071; 20Dpd: 0,306±0,152; 90Dpd: 0,202±0,167;

274Dpd: 0,141±0,106) e LBSal (Tad: 0,058±0,018; 20Dpd: 0,261±0,142; 90Dpd:

0,140±0,106; 274Dpd: 0,105±0,083).


57

Total IgG

IgG 1

De

nsi

dad

eÓ

pti

ca

IgG 2

Tempos de Avaliação

0

0,25

0,5

0,11 _

0

0,25

0,5

0,08_

0

0,25

0,5

0,1

a,b,ca,b,c

a,b,c

a,b,c

a,b

a,b,c

a,b,c

a,b

a,b,c

a,b,c

a,b,ca,b,c

0,50

0,500,50 _

_

_

0,10_

Tad 20Dpd 90Dpd 274Dpd 435Dpd Tad 20Dpd 90Dpd 274Dpd 435Dpd

Tad 20Dpd 90Dpd 274Dpd 435Dpd

Figura 1: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães controle e submetidos a diferentes protocolos

vacinais antes e após o desafio com L. chagasi: controle (C; ); saliva de L. longipalpis (Sal; )vacina de L.

braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ); e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à

saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). Painel superior ilustra a reatividade de IgG total anti-Leishmania; painel

inferior direito e esquerdo estão representados os resultados da reatividade de IgG1 e IgG2 anti-Leishmania,

respectivamente. O eixo x ilustra os tempos de avaliação: Tad = tempo antes do desafio; 20Dpd = 20 dias pós

desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio. O eixo y

representa os valores médios de absorbância pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:80 [cut-off =

0,11 (IgG total); 0,08 (IgG1); 0,10 (IgG2)]. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras

a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sal e LBSal, respectivamente.


58

6.2 – Leucograma de cães imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina

de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L.

braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após

o desafio experimental com L. chagasi

A resposta celular, antes e após o desafio experimental com L. chagasi, nos

diferentes tempos foi avaliada e encontra-se representado pelo número médio e desvio

padrão das populações de neutrófilos totais, eosinófilos, linfócitos, monócitos bem

como a global de leucócitos (Tabela 4).

Foi detectado um aumento significativo (P<0,05) da média global de leucócitos

no grupo LBSapSal (10.820±981) em relação aos grupos C (8.300±1.319) e Sal

(8.900±1.414) em 20Dpd. De maneira semelhante, em 435Dpd foi também observado

aumento significativo (P<0,05) na média global de leucócitos do grupo LBSapSal

(10.680±2.086) em relação aos grupos C (8.280±832) e Sal (7.200±1.068).

A análise do valor absoluto de neutrófilos totais revelou aumento significativo

(P<0,05) no grupo LBSapSal (6.323±1.297) quando comparado ao grupo Controle

(4.492±938) em 20Dpd. Além disto, o número absoluto de linfócitos apresentou-se

significativamente maior (P<0,05) em 90Dpd e 435Dpd no grupo LBSapSal (90Dpd:

3.629±431; 435Dpd: 3.104±698) em relação ao grupo Sal (90Dpd: 2.881±472; 435Dpd:

1.481±235).

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ________________________________________________________Resultados

59

Tabela 4: Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolas vacinais antes e após o desafio experimental

com L. chagasi.

Valores absolutos (média ± desvio padrão) do leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais frente ao desafio

experimental controle (C), saliva de L. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L.

braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal). Tad = tempo antes do desafio, 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90

dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435dias pós desafio. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras

a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sal, LBSal,respectivamente.

Grupos Tempos Global Leucócitos Neutrófilos Totais Eosinófilos Linfócitos Monócitos

Tad

Controle 9000±628 4968±1177 576±279 3112±699 344,0±110,5

Sal 8300±2326 4706±1395 448±292 2884±917 261,8±94,01

LBSal 9000±907 5316±229 536,8±232 3076±748 259,4±196,5

LBSapSal 10540±1659 5282±542 458±158 3697±698 417,4±273,3

20Dpd

Controle 8300±1319 4492±938 648±476 2887±681 271,6±127,3

Sal 8900±1414 4683±1153 476±110 2779±663 312,5±78,08

LBSal 9720±1392 5970±1159 509±206 2599±262 355,0±126,6

LBSapSal 10820±981 a,b

6323±1297 a 711±336

3526±759 260,4±165,8

90Dpd

Controle 10920±1720 6626±1265 545±275 3070±696 496,2±229,9

Sal 10180±2829 6293±2292 547±200 2881±472 459,2±181,8

LBSal 9580±1985 6218±755 690±84 3160±706 266,0±69,46

LBSapSal 10820±2103 6354±998 778±484 3629±431b 393,4±170,5

274Dpd

Controle 11400±1608 7311±1524 923±409 3562±1318 564,4±154,2

Sal 11250±1652 7627±2421 882±746 2801±860 678,8±343,4

LBSal 12800±1304 7314±1372 941±87 4022±986 383,6±179,7

LBSapSal 12750±500 7492±1183 809±205 3368±533 530,8±177,6

435Dpd

Controle 8280±832 5196±1297 552±328 2206±644 324,8±73,29

Sal 7200±1068 4864±1130 342±282 1481±235 292,4±131,8

LBSal 8580±1274 5297±1494 649±251 2316±875 263,3±41,45

LBSapSal 10680±2086 a,b

6404±2414 882±534 3104±698 b 308,0±77,67

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ____________ Resultados

60

6.3 – Análise do perfil imunofenotípico de células T (CD5+, CD4

+ e CD8

+) e células B

(CD21+) circulantes no sangue periférico de cães imunizados com extrato de glândula

salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal) e

vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal)

antes e após o desafio experimental com L. chagasi

A análise detalhada do perfil imunofenotípico em linfócitos sanguíneos revelou

importantes alterações após o desafio experimental com L. chagasi, particularmente nos

grupos LBSal e LBSapSal (Figura 2). Interessantemente, foi observado aumento

significativo (P<0,05) de LT CD5+ em 274Dpd no grupo LBSal (274Dpd: 3336±490)

em relação grupo Sal (274Dpd: 2129±762). Este aumento no grupo LBSal foi

representado pela expansão das subpopulações de linfócitos T no mesmo tempo

(274Dpd), com aumento significativo (P<0,05) tanto de LT CD8+ (LBSal - 274Dpd:

1050±93) em relação aos grupos C (Tpd274: 609±159) e Sal (Tpd274: 594±106), como

de LT CD4+

(LBSal - 274Dpd: 2065±253) em relação aos grupos Sal (274Dpd:

1306±364) e C (274Dpd: 1419±254). De forma interessante, foi observado aumento

significativo (P<0,05) do valor médio absoluto de linfócitos T (LT) CD5+ no grupo

LBSapSal em 435Dpd (2487±771) quando comparado aos grupos C (435Dpd:

1304±256) e Sal (435Dpd: 1241±347). O aumento significativo de LT CD5+ em

435Dpd no grupo LBSapSal foi representado pela expansão das subpopulações de

linfócitos T no mesmo tempo, com aumento significativo (P<0,05) tanto de LT CD4+

(435Dpd: 1575±304) em relação aos grupos C (435Dpd: 913±206) e Sal (435Dpd:

772±167), como de LT CD8+ (435Dpd: 866±253) em relação ao grupo Sal (435Dpd:

456±232).

Além disto, vale ressaltar que o grupo imunizado com a vacina LBSapSal

apresentou os maiores níveis de linfócitos T CD8+ circulantes. Neste sentido, o grupo

LBSapSal apresentou aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto da

subpopulação de linfócitos T CD8+ em 20Dpd (1096±307) quando comparado aos

grupos C (20Dpd: 543±202), Sal (20Dpd: 575±108), e LBSal (20Dpd: 706±81); em

90Dpd (LBSapSal - 902±120) com relação aos grupos C (90Dpd: 623±90) e Sal

(90Dpd: 697±47), e em 274Dpd (LBSapSal - 1268±176) em relação aos grupos C

(Tpd274: 609±159) e Sal (Tpd274: 594±106).

Considerando o valor médio absoluto de linfócitos B (LB) CD21+, apenas no

grupo LBSapSal foi observado diferença significativa (P<0,05) em 90Dpd (402±123)

com redução significativa desta população celular quando comparado ao grupo C

(90Dpd: 799±236).


61

Figura 2: Perfil imunofenotípico de linfócitos circulantes em cães controle e submetidos a diferentes protocolos

vacinais antes e após o desafio com L. chagasi: controle (C; ), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de

L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva

de L. longipalpis (LBSapSal; ). O eixo x ilustra os tempos avaliados: Tad = tempo antes do desafio; 20Dpd = 20 dias

pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio. O eixo y

representa o número médio de linfócitos T (LT) CD5+, CD4

+, CD8

+ e de linfócitos B (LB) CD21

+. As diferenças

significativas (P<0,05) em relação aos grupos C, Sal, LBSal estão representadas pelas letras a, b, c, respectivamente.


62

6.4 – Avaliação do número de monócitos CD14+ sanguíneos e do perfil de ativação

pela expressão de CD80+, MHC-I

+ e MHC-II

+ em linfócitos circulantes de cães

imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada

à saliva de L. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à

saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L.

chagasi

Buscando-se avaliar o perfil de potenciais células apresentadoras de antígenos, o

número de monócitos CD14+ foi estudado em diferentes grupos vacinais (Figura 3).

Alterações foram observadas durante período de acompanhamento após o desafio

experimental com L. chagasi nos grupos LBSal e LBSapSal. Neste sentido, foi

observada uma diminuição significativa (P<0,05) no grupo LBSal do valor médio

absoluto de monócitos CD14+ nos tempos 90Dpd e 274Dpd (90Dpd: 11±3; 274Dpd:

17±7) em relação aos grupos C (90Dpd: 29±9; 274Dpd: 36±9) e Sal (90Dpd: 37±7; 274;

Dpd: 51±11). Interessantemente, nestes mesmos tempos, a vacina LBSapSal apresentou

diminuição significativa (P<0,05) do valor médio absoluto de monócitos CD14+

(90Dpd: 19±2; 274Dpd: 33±9) em relação ao grupo Sal (90Dpd: 37±7; 274Dpd:

51±11), e aumento significativo (P<0,05) desta população celular em relação ao grupo

LBSal (90Dpd: 11±3; 274Dpd: 17±7).

Já na avaliação de marcadores de ativação linfocitária, por canal médio de

fluorescência, foi observado aumento significativo (P<0,05) da expressão de linfócitos

CD80+ em 90Dpd no grupo LBSapSal (90Dpd: 257±12) em relação aos grupos C

(90Dpd: 223±11) e Sal (90Dpd: 233±13), além de um aumento no grupo LBSal

(90Dpd: 262±21) em relação ao grupo C (90Dpd: 223±11). A avaliação por canal médio

de fluorescência da expressão de linfócitos MHC-II+, revelou redução significativa

(P<0,05) na expressão deste marcador no Tad e 20Dpd nos grupos LBSal (Tad:

452±18; 20Dpd: 475±19) e LBSapSal (Tad: 460±20; 20Dpd: 469±17) quando estes

foram comparados aos grupos C (Tad: 498±24; 20Dpd: 512±14) e Sal (Tad: 497±21;

20Dpd: 501±10).


63

Figura 3: Perfil imunofenotípico de monócitos circulantes e da expressão de moléculas de ativação linfocitária

em cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais antes e após o desafio com L. chagasi: controle (C;

), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e

vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). O eixo x ilustra os tempos

avaliados: Tad = tempo antes do desafio; 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274

dias pós desafio;435Dpd = 435 dias pós desafio. O eixo y representa o número médio de monócitos CD14+

circulantes ou o valor médio da expressão de moléculas de ativação em linfócitos (CD80+, MHC-I

+ e MHC-II

+),

expressas por canal médio de fluorescência (CMF). As diferenças significativas (P<0,05) em relação aos grupos C,

Sal, LBSal estão representadas pelas letras a, b, c, respectivamente.


64

6.5 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de

linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+, CD21

+) submetidos a estimulação antigênica com

antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de

cães imunizados com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis


saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental

com L. chagasi

A avaliação da capacidade linfoproliferativa antígeno-específica foi realizada 90

e 435 dias após o desafio experimental com L. chagasi (90Dpd e 435Dpd) utilizando

dois estímulos antigênicos distintos: antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel

de L. chagasi (SLcA). Os resultados foram expressos por índice de proliferação obtidos

da divisão das médias das contagens por minuto (CPM) entre as culturas estimuladas,

seja por VSA ou SLcA, pelas culturas controles não estimuladas (cultivadas apenas com

meio RPMI) (VSA/RPMI ou SLcA/RPMI) nos diferentes grupos avaliados (Figura 4 e

5). A análise da atividade linfoproliferativa em 90Dpd e 435Dpd entre os diferentes

grupos, revelou aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação, apenas nas

culturas estimuladas com SLcA, do grupo LBSapSal (90Dpd: 6,513±2,092; 435Dpd:

6,790±0,887) em relação as mesmas culturas dos grupos C (90Dpd: 2,667±1,638;

435Dpd: 3,123 ± 0,410) e LBSal (90Dpd: 2,797±0,863; 435Dpd: 3,333±0,501). É

importante ressaltar que a resposta linfoproliferativa não específica obtida pelo estímulo

mitogênico com PHA resultou em valores médios entre 8 e 15 de índice de proliferação,

confirmando a viabilidade da suspensão celular nos diferentes grupos avaliados.

A avaliação do perfil imunofenotípico de CMSP estimuladas in vitro pelo VSA

ou SLcA em 90Dpd e 435Dpd foram avaliadas nos diferentes grupos empregando-se

um índice de proliferação obtido pela divisão das médias das frequências dos fenótipo

avaliados (CD5+,CD4

+,CD8

+,CD21

+) nas culturas estimuladas (VSA ou SLcA) pelos

respectivos fenótipos das culturas controles não estimuladas (cultivadas apenas com

meio RPMI) (Figuras 4 e 5). De forma interessante, em 90Dpd foram observadas

diferenças significativas nas culturas estimuladas com VSA quando avaliada a

subpopulação de linfócitos T CD8+. Neste sentido, os grupos LBSapSal (1,167±0,109) e

Sal (1,084±0,018) apresentaram aumento nos índices de proliferações de linfócitos T

CD8+ quando comparados as mesmas culturas do grupo LBSal (0,984±0,072).

A análise do perfil imunofenotípico in vitro na presença de VSA 435Dpd

(Figura 5) revelou aumento significativo (P<0,05) no índice de proliferação da

população de linfócitos B CD21+ do grupo LBSapSal (1,224±0,263) (P<0,05) quando


65

comparado as mesmas culturas dos demais grupos: C (0,902±0,144), Sal (0,856±0,052)

e LBSal (0,912±0,100). Por outro lado, quando avaliado o perfil imunofenotípico das

CMSP estimuladas in vitro pelo SLcA no mesmo período (Figura 5), foi observado que

a população de linfócitos T CD5+ apresentou aumento no valor do índice de

proliferação do grupo LBSal (0,980±0,018) quando comparado as mesmas culturas do

grupo C (0,940±0,026). Além disto, na presença do SLcA esta população celular (LT

CD5+) apresentou aumento no valor do índice de proliferação do grupo LBSapSal

(1,013±0,012) quando comparado as mesmas culturas dos grupos: C (0,940±0,026) e

LBSal (0,989±0,018). Interessantemente, na presença de SLcA o grupo LBSal

apresentou aumento no valor do índice de proliferação das subpopulações de linfócitos

T CD4+ (0,994±0,025) em relação as mesmas culturas do grupo Sal (0,951±0,028) e da

subpopulação de linfócitos T CD8+(1,280±0,036) quando comparado as culturas do

grupo C (1,130±0,050), revelando a contribuição destas subpopulações celulares para o

aumento da população de linfócitos T CD5+. É importante ressaltar ainda que o grupo

LBSapSal apresentou aumento significativo (P<0,05) no índice de proliferação da

subpopulação de linfócitos T CD8+ (1,260±0,036) nas culturas estimuladas com SLcA

em relação as mesmas culturas do grupo C (1,130±0,050).

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ____________ _____________________________________________ Resultados

66

Figura 4: Análises in vitro do índice de proliferação e perfil imunofenotípico empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA;

painel esquerdo) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) avaliados 90dias após o desafio experimental com L. chagasi (90Dpd) nos

diferentes grupos: controle (C; ), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e

vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). Os painéis superiores ilustram o índice de proliferação

médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) obtido pela divisão dos valores das contagens por minutos (CPM) de

culturas estimuladas (VSA ou SLcA) pelas culturas controles não estimuladas. Os gráficos dos painéis intermediário e inferior ilustram o perfil

imunofenotípico de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+, CD21

+). Estes resultados foram expressos como índice de proliferação médio e desvio padrão de

linfócitos T (LT) CD5+, CD4

+, CD8


+, obtidos pela divisão de culturas estimuladas com VSA ou SLcA pelas culturas

controles não estimuladas, considerando a frequência imunofenotípica de cada população celular avaliada. As diferenças significativas (P<0,05) em

relação aos grupos C, LBSal estão representadas pelas letras a, c, respectivamente.

AGUIAR-SOARES, R.D.O. ____________ _____________________________________________ Resultados

67

Figura 5: Análises in vitro do índice de proliferação e perfil imunofenotípico empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA; painel

esquerdo) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) avaliados 435dias após o desafio experimental com L. chagasi (435Dpd) nos

diferentes grupos: controle (C; ), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e vacina

de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). Os painéis superiores ilustram o índice de proliferação médio e

desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) obtido pela divisão dos valores das contagens por minutos (CPM) de culturas

estimuladas (VSA ou SLcA) pelas culturas controles não estimuladas. Os gráficos dos painéis intermediário e inferior ilustram o perfil

imunofenotípico de linfócitos (CD5+, CD4

+, CD8

+, CD21

+). Estes resultados foram expressos como índice de proliferação médio e desvio padrão de

linfócitos T (LT) CD5+, CD4

+, CD8


+, obtidos pela divisão de culturas estimuladas com VSA ou SLcA pelas culturas

controles não estimuladas, considerando a frequência imunofenotípica de cada população celular avaliada. As diferenças significativas (P<0,05) em

relação aos grupos C, Sal, LBSal estão representadas pelas letras a, b, c, respectivamente.

AGUIAR-SOARES, R.D.O.___________________________________ Resultados

68

6.6 - Avaliação da ativação linfocitária pela expressão de MHC-II+ e análise de


+, CD8

+,CD21

+) e o perfil

imunofenotípico de linfócitos MHC-II+ cultivados in vitro com antígeno solúvel

vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães imunizados

com extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de

L. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de

L. longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L. chagasi

A avaliação da ativação linfocitária antígeno-específica foi avaliada pela

expressão de linfócitos MHC-II+, por canal médio de fluorescência (CMF), 90Dpd

(Figura 6) e 435Dpd (Figura 7) utilizando dois estímulos antigênicos distintos: VSA e

SLcA. Os resultados da avaliação da expressão de linfócitos MHC-II+ foram expressos

como índice de proliferação, obtidos pela divisão das médias do CMF de linfócitos

MHC-II+ das culturas estimuladas (VSA ou SLcA) pelas culturas controles não

estimuladas (cultivadas apenas com meio RPMI).

A avaliação do perfil de ativação linfocitária analisada pelo índice de

proliferação de linfócitos MHC-II+ revelou diferenças significativas apenas nas culturas

estimuladas com VSA em 435Dpd (Figura 7). Neste sentido, foi observado aumento

significativo (P<0,05) no índice de proliferação de linfócitos MHC-II+ do grupo

LBSapSal (1,034±0,012) quando comparado aos grupos C (0,988±0,011) e Sal

(1,006±0,020). As culturas que receberam estimulo com SLcA não apresentaram

diferença significativa (P<0,05), apesar de apresentarem perfil semelhante às culturas

estimuladas com VSA em 435Dpd, mostrando tendência de aumento no grupo

LBSapSal (1,091±0,108) do índice de proliferação dos linfócitos MHC-II+ em relação

aos demais grupos: C (0,993±0,030), Sal (1,001±0,023) e LBSal (1,004±0,056).

A avaliação das correlações entre a expressão de linfócitos MHC-II+ e a

frequência de linfócitos T (LT) CD5+, CD4

+, CD8


+ no

grupo LBSapSal revelaram diferença significativas (P<0,05) 90Dpd (Figura 6) e

435Dpd (Figura 7). Neste sentido, em 90Dpd, na presença do VSA, foi observado

correlação negativa entre o percentual de LT CD5+ e a expressão de linfócitos MHCII

+

(p= 0,0376/r= -0,6953). Por outro lado, o percentual de LB CD21+ apresentou

correlação positiva com a expressão de linfócitos MHC-II+ empregando-se o estímulo

do VSA (p= 0,0330/r= 0,6729). Quando avaliadas as culturas estimuladas com SLcA

90Dpd foram observadas diferenças significativas em todos os fenótipos de células T e

B e a expressão de linfócitos MHCII+. Neste contexto, a vacina LBSapSal induziu

correlação positiva entre a expressão de linfócitos MHC-II+ e LB CD21

+ (p= 0,0077/r=

AGUIAR-SOARES, R.D.O.___________________________________ Resultados

69

0,7809) e LT CD8+ (p= 0,0181/r= 0,7960), e correlação negativa quando analisado LT

CD5+ (p= 0,0143/r= -0,7406) e LTCD4

+ (p= 0,0418/r= -0,6848) (Figura 6).

As correlações entre as culturas do grupo LBSapSal em 435Dpd mostraram um

perfil semelhante em ambos os estímulos empregando-se VSA ou SLcA (Figura 7).

Neste sentido, a cultura estimulada com VSA apresentou correlação negativa entre a

expressão de linfócitos MHC-II+ e o percentual de LB CD21

+ (p= 0,0078/r= -0,8122).

Entretanto, na presença deste estímulo, foi observada correlação positiva entre a

expressão de linfócitos MHC-II+ e o percentual LT CD5

+ (p= 0,0116/r= 0,7881) e LT

CD8+ (p= 0,0341/r= 0,7045). Interessantemente, nas culturas estimuladas com SLcA

também foi observada correlação negativa entre a expressão de linfócitos MHC-II+ e o

percentual de LB CD21+

(p= 0,0105/r= -0,7946). Além disto, a expressão de linfócitos

MHC-II+ foi positivamente correlacionada com o percentual de LT CD5

+ (p= 0,0500/r=

0,6663) e com o percentual LT CD8+ (p= 0,0161/r= 0,7658) na presença de SLcA

(Figura 7).

AGUIAR-SOARES, R.D.O.________________________________________________________________________________ Resultados

70

Figura 6: Análises in vitro do perfil de ativação linfocitária pela expressão de MHC-II e das correlações entre a frequência de linfócitos (CD5+,

CD4+, CD8

+,CD21

+) e o perfil imunofenotípico de linfócitos MHC-II

+ empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA; painel


diferentes grupos: controle (C; ), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e

vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). Os painéis superiores ilustram o índice de proliferação

médio e desvio padrão obtido pela divisão dos valores da expressão por canal médio de fluorescência (CMF) de linfócitos MHCII+ de culturas

estimuladas (VSA ou SLcA) pelas culturas controles não estimuladas. Os gráficos dos painéis intermediário e inferior ilustram correlações obtidas no

grupo LBSapSal considerando a expressão de linfócitos MHCII+ e as frequências de linfócitos T (LT) CD5

+, CD4

+, CD8

+, e linfócitos B CD21

+, em

culturas controles não estimuladas ( ) e culturas estimuladas com VSA ( ; painel esquerdo) ou SLcA ( ; painel direito). As diferenças significativas

nos painéis intermediários e inferiores estão representadas pelas correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSapSal.

AGUIAR-SOARES, R.D.O.________________________________________________________________________________ Resultados

71

Figura 7: Análises in vitro do perfil de ativação linfocitária pela expressão de MHC-II e das correlações entre a frequência de linfócitos (CD5+,

CD4+, CD8

+,CD21

+) e o perfil imunofenotípico de linfócitos MHC-II

+ empregando-se como estímulos o antígeno solúvel vacinal (VSA; painel


diferentes grupos: controle (C; ), saliva de L. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L. longipalpis (LBSal; ) e vacina

de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L. longipalpis (LBSapSal; ). Os painéis superiores ilustram o índice de proliferação médio e

desvio padrão obtido pela divisão dos valores da expressão por canal médio de fluorescência (CMF) de linfócitos MHCII+ de culturas estimuladas

(VSA ou SLcA) pelas culturas controles não estimuladas. Os gráficos dos painéis intermediário e inferior ilustram correlações obtidas no grupo

LBSapSal considerando a expressão de linfócitos MHCII+ e as frequências de linfócitos T (LT) CD5

+, CD4

+, CD8

+, e linfócitos B CD21

+, em culturas

controles não estimuladas ( ) e culturas estimuladas com VSA ( ; painel esquerdo) ou SLcA ( ; painel direito). As diferenças significativas (P<0,05)

em relação aos grupos C, Sal estão representadas pelas letras a, b, respectivamente (painel superior); e nos painéis intermediários e inferiores

representadas pelas correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSapSal.

AGUIAR-SOARES, R.D.O.______ ____________________________ Resultados

72

6.7 – Investigação clínica e parasitológica da medula óssea de cães imunizados com

extrato de glândula salivar (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de L.

longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de L.

longipalpis (LBSapSal) antes e após o desafio experimental com L. chagasi

Os animais foram diariamente acompanhados e qualquer registro de sinal clínico

sugestivo de infecção era relatado em ficha clínica. Nenhum sinal clínico característica

de LVC foi observado nos cães vacinados com LBSapSal e nos demais grupos após o

desafio experimental até 435 dias de acompanhamento.

As amostras biológicas da medula óssea foram coletadas nos tempos de 115,

195, 320, 435 dias após desafio para realização das técnicas parasitológicas nos

diferentes grupos avaliados. A pesquisa do parasito realizada na medula óssea através

da confecção de esfregaços por aposição em lâminas coradas por coloração panótica

(Giemsa) foram examinadas ao microscópio óptico, não revelando amastigotas de

Leishmania nos diferentes grupos experimentais e tempos. De forma semelhante, as

tentativas de isolamento do parasito em meio NNN/LIT das punções de medula óssea

nos diferentes tempos e grupos foram negativas. Estes dados estão de acordo com os

resultados da PCR que confirmam a ausência de DNA do gênero Leishmania spp na

medula óssea, nos diferentes grupos e tempos avaliados (dados não mostrados).

7. Discussão

AGUIAR-SOARES, R.D.O.______ ____________________________ _ Discussão

74

Embora as leishmanioses sejam consideradas doenças tipicamente rurais,

recentemente passaram a expandir para diversos centros urbanos emergindo e re-

emergindo em várias cidades do mundo, passando a chamar a atenção de governos para

este grave problema de saúde pública (MS/Brasil, 2006; Ashford, 2000; Maia-Elkhoury

et al., 2008; Dantas-Torres, 2009). A região metropolitana de Belo Horizonte /MG é um

bom exemplo desse processo de urbanização, onde o grande crescimento populacional,

a susceptibilidade da população à infecção e a adaptação do vetor ao ambiente urbano

levaram a um crescimento no número de municípios com notificações de casos de LV

passando de seis municípios na região metropolitana de Belo Horizonte no período de

1994/1995 para 15 municípios no período de 1998/1999 (Profeta da Luz et al., 2001).

Segundo dados da Gerência de Epidemiologia e Informação da cidade de Belo

Horizonte, no ano de 2006 foram diagnosticados 8.101 amostras positivas entre os

82.379 cães avaliados, que representa uma prevalência da ordem de 9,83% (Prefeitura

de Belo Horizonte, 2007).

Em virtude das características epidemiológicas e da complexidade relacionada a

cadeia de transmissão da leishmaniose visceral, as estratégias de controle desta endemia

ainda são pouco efetivas e estão centradas no diagnóstico e tratamento precoce dos

casos humanos, redução da população de flebotomíneos, eliminação dos reservatórios

no ambiente urbano (cães soropositivos) e atividades de educação em saúde (MS/Brasil,

2006). Um grande problema que dificulta a adoção e manutenção prolongada destas

medidas profiláticas é a resistência dos proprietários de cães sororeagentes para

Leishmania em colaborar com o programa de controle, principalmente pelo fato de mais

da metade dos cães infectados apresentarem-se clinicamente saudáveis (assintomáticos).

Mesmo assim, de 1990 a 1994, mais de 80.000 animais foram eutanasiados no Brasil e

durante o mesmo período, houve um aumento de quase 100% na incidência de LV

humana (Dietze et al., 1997). Entre os anos de 1993-1998, mais de dois milhões de cães

foram rastreados e mais de 160.000 cães soropositivos foram eliminados em todo

território brasileiro, mas a incidência de LV humana não foi reduzida a níveis aceitáveis

nas áreas endêmicas (Braga et al., 1998).

Desta forma, a eutanásia de cães com sorologia anti-Leishmania positiva, torna-

se cada vez mais questionável e difícil, além de provocar indignação e um sofrimento

profundo dos proprietários com a perda dos animais. Uma alternativa para evitar a

eutanásia dos animais acometidos pela LVC seria a busca de medidas terapêuticas ou

imunoprofiláticas eficazes e que sejam capazes de retirá-los da condição de


75

reservatórios. Entretanto, as tentativas de tratamentos como de drogas comercialmente

utilizadas com eficácia em humanos, não têm obtido êxito na obtenção da cura

parasitológica em cães, não impedindo a transmissão do parasito a flebotomíneos, além

de haver possibilidade de se selecionar cepas resistentes às drogas utilizadas para o

tratamento humano. Sendo assim, a imunoprofilaxia aparece como uma alternativa

promissora para a prevenção da LVC, atuando no sentido de diminuir a incidência dos

casos caninos e, consequentemente, da doença humana (Marzochi et al., 1985; Genaro,

1993; Hommel et al., 1995; Genaro et al., 1996a; Gradoni, 2001; Handman, 2001,

Desjeux, 2004; Ravindran & Ali, 2004; Requena et al., 2004; Dantas-Torres &

Brandão-Filho, 2006; Noazin et al., 2008; Fernandes et al., 2008).

No intuído de se avaliar candidatos vacinais contra LV, o modelo murino tem

sido amplamente empregado, entretanto, devido a complexidade da relação Leishmania-

hospedeiro muitas vezes os resultados obtidos neste modelo experimental não são

reproduzidos em outras espécies como hamsters e cães (Reis et al., 2010; Gradoni,

2001; Monjour et al.,1988; Dunan et al., 1989). Neste sentido, a melhor estratégia para

triagem de potenciais antígenos candidatos a vacina anti-LVC seria a avaliação

utilizando o próprio cão como modelo experimental (Gradoni, 2001, Giunchetti et al.,

2007; Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d).

Na ultima década diferentes grupos de pesquisa tem se dedicado ao estudo de

uma vacina anti-LVC que tenha eficácia comprovada para de fato poder atuar em

programas de controle da LV (Mayrink et al., 1996; Genaro et al., 1996b; Mohebali et

al., 2004; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c; Giunchetti et al., 2008d;

Araújo et al., 2008; Araújo et al., 2009; Borja-Cabrera et al., 2000; da Silva et al., 2001;

Borja-Cabrera et al., 2002; Parra et al., 2007; Holzmuller et al., 2005; Lemesre et al.,

2005, 2007; Bourdoiseau et al., 2009; Fernandes et al., 2008; Fujiwara et al., 2005;

Moreno et al., 2007; Gradoni et al., 2005; Molano et al., 2003; Carcelén et al., 2009;

Poot et al., 2009; Ramiro et al., 2003; Saldarriaga et al., 2006; Rafati et al., 2005;

Rodríguez-Cortés et al., 2007b). Até o momento, duas composições vacinais, contendo

antígenos de segunda geração, foram licenciadas no Ministério da Agricultura, Pecuária

e Abastecimento, entre as quais as vacinas Leish-Tec

(Hertape Calier Saúde Animal

S/A) e Leishmune

(Fort Dodge Saúde Animal Ltda). Embora estas vacinas sejam

licenciadas e comercializadas em áreas endêmicas de LVC no Brasil para uso

exclusivamente veterinário. Tais vacinas ainda necessitam de estudos para responder se

em cães vacinados apresentam (i) potencial de bloqueio da infecção em flebotomíneos


76

(teste por xenodiagnóstico), (ii) possibilidade de se diferenciar animais vacinados dos

cães com LVC por métodos de diagnóstico convencionais para minimizar o impacto no

programa de controle da LV e (iii) a análise por diferentes grupos de pesquisa através de

estudos multicêntricos sem interesse comercial/científico nestes produtos sobre a real

contribuição na redução da incidência da LV humana e canina em áreas endêmicas para

LV (MS/Brasil, 2005, 2007, 2009). Estas análises fornecerão subsídios para a

proposição destas e de outras vacinas de modo que possam ser indicadas em programas

oficiais de controle da LV.

Considerando a necessidade de investir e ampliar o desenvolvimento de vacinas

anti-LVC que atendam aos pré requisitos acima mencionados, torna-se fundamental o

estudo detalhado dos potenciais imunobiológicos candidatos para que alcancem esta

finalidade. Neste sentido, tem sido proposto que antígenos brutos apresentam bons

indicadores de sucesso no desenvolvimento de vacinas contra protozoários já que

contemplam múltiplas subunidades antigênicas com capacidade de ativação de um

maior repertório de linfócitos T (Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c,

Giunchetti et al., 2008d, Reis et al., 2010). Além disto, apresentam maior estabilidade e

segurança em relação às subunidades purificadas ou vacinas de DNA, que necessitam

de tecnologia mais sofisticada de produção, muitas vezes inacessível a países em

desenvolvimento (Khamesipour et al., 2006, Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al.,

2008c, Giunchetti et al., 2008d). As vacinas de antígenos brutos apresentam ainda uma

vantagem adicional relacionada a menor necessidade de se realizar testes para se chegar

a um produto final, minimizando os custos de produção (Khamesipour et al., 2006).

Desta forma, vacinas de antígenos brutos ainda são consideradas atrativas e vem

apresentando resultados muito promissores como imunoprofilático anti-LVC (Mayrink

et al., 1996, Lasri et al., 1999, Panaro et al., 2001, Araújo et al., 2008, Araújo et al.,

2009, Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d) e por

este motivo tem sido desenvolvidos e avaliados pelo nosso grupo de pesquisa. Neste

sentido, o presente estudo consiste na continuidade das avaliações realizadas por

Giunchetti (2007) e Giunchetti et al. (2008c) empregando-se a vacina LBSapSal que

demonstram a indução de forte imunogenicidade após a imunização de cães. Assim, o

presente estudo avaliou a resposta imune humoral e celular, bem como aspectos clínicos

e parasitológicos de cães vacinados e desafiados experimentalmente por via

intradérmica com L. chagasi associado a glândula salivar de L. longipalpis.


77

Com o objetivo de se avaliar imunobiológicos contra a LVC, a caracterização de

aspectos imunopatológicos da doença no modelo canino tem sido considerada com um

pré requisito importante para a identificação de biomarcadores de resistência e

susceptibilidade a infecção por Leishmania (Reis et al., 2010). Tais estudos são

fundamentais para se identificar perfis imunológicos e parasitológicos em cães

vacinados que possam estar associados ao estabelecimento de imunidade protetora.

Neste contexto, a resposta imune humoral anti-Leishmania na LVC tem sido

descrita por apresentar elevados níveis de IgG Total, IgG1 ou IgG2, que no entanto, não

impedem a evolução da doença (Deplazes et al., 1995, Morales et al., 1997, Cavaliero et

al., 1999, Nieto et al., 1999, Boceta et al., 2000, Solano-Gallego et al., 2000, Leandro et

al., 2001, Solano-Gallego et al., 2001a, Fernandez-Perez et al., 2003, Oliveira-Mendes

et al., 2003, Quinnell et al., 2003, Almeida et al., 2005, Iniesta et al., 2005, Reis et al.,

2006a, Reis et al., 2006c, Cardoso et al., 2007, de Andrade et al., 2007, Day, 2007).

Entretanto, Keenan et al. (1984a,b) preconizaram que embora a presença de anticorpos

específicos anti-Leishmania não fosse suficiente para promover a proteção da doença, a

mesma também não aconteceria na ausência de anticorpos. Além disto, ainda é

controverso na literatura a associação de IgG1 ou IgG2 com um perfil que possa ser

relacionado a resistência ou susceptibilidade a infecção na LVC (Day, 2007). No

contexto da imungecidade de vacinas, alguns pesquisadores admitem que uma vacina

contra leishmaniose visceral não deva ser anticorpogênica, considerando que a resposta

imune contra o parasito é basicamente celular. Por outro lado, antígenos protéicos ou

glicoprotéicos geralmente induzem após seu reconhecimento um repertório de células B

ativadas a produzirem anticorpos específicos contra os epitopos antigênicos. De alguma

maneira, é possível que pelo menos no início do processo infeccioso as Ig(s) possam ter

ação efetora contra as promastigotas inoculadas na derme. De fato o papel das Ig (s) na

resposta imune contra parasitos intracelulares basicamente de macrófagos após o

desafio vacinal é pouco conhecido e necessita de esclarecimentos.

Em estudo prévios, Giunchetti et al. (2008c) demonstraram que a vacinação

com o imunobiológico LBSapSal induz elevados níveis de IgG Total, IgG1 e IgG2 anti-

Leishmania. Interessantemente, no presente estudo ficou demonstrado aumento

significativo (P<0,05) dos níveis de IgG Total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no grupo

LBSapSal antes (Tad) e até 274 dias após o desafio experimental (274Dpd), sendo que

estes níveis permaneceram acima do limiar de positividade até o final do período de

acompanhamento (435Dpd). Tem sido proposto que a reatividade sérica utilizando


78

SLcA após as imunizações (Giunchetti et al., 2008c), indicaria o reconhecimento

antigênico da L. chagasi, sugerindo o estabelecimento de eventos imunogênicos e o

potencial de utilização do imunobiológico avaliado neste estudo (LBSapSal) contra o

agente etiológico da LVC. Além disto, o pico nos níveis de IgG Total, IgG1 e IgG2

anti-Leishmania em 20Dpd demonstrou que o contato com L. chagasi através do desafio

experimental funcionou como um ―Booster‖ na produção de anticorpos anti-

Leishmania, que se mostrou mais intenso no grupo LBSapSal que no grupo LBSal,

provavelmente pela associação do adjuvante saponina que induz uma intensa

reatividade no local do inóculo (Giunchetti et al., 2008c; Vitoriano-Souza et al., 2008;

Moreira et al., 2009). De fato, como demonstrado por Rosario et al. (2005), antígenos

provenientes de cepas de Leishmania dermatotrópicas apresentam reatividade cruzada

quando utilizados em análises sorológicas de cães naturalmente infectados por L.

chagasi, demonstrando o reconhecimento de um repertório antigênico comum entre

diferentes espécies de Leishmania. Este reconhecimento faltamente prejudicaria as

vacinas tornando-se difícil a distinção entre cães vacinados com cães infectados. No

caso das vacinas LBSap e LBSapSal que são constituídas por antígenos heterólogos de

L. braziliensis os animais doentes podem ser distinguidos dos vacinados por vários

métodos como ELISA ou imunocromatografia rk39 ou citometria de fluxo (Lemos et

al., 2008; Andrade et al., 2007, 2009)

Apesar de ainda não ser claro a subclasse de imunoglobulina que estaria

associada a um padrão de resistência na LVC, o aumento de IgG1 e IgG2 parece

caracterizar um perfil misto de resposta imune do tipo 1 e 2, como previamente descrito

em cães utilizando imunoprofiláticos desenvolvidos com antígenos brutos de

Leishmania (Fujiwara, 2003; Fujiwara et al., 2005; Araújo, 2006; Araújo et al., 2009;

Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d). De fato, a

avaliação de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos T estimulados in vitro com

SLcA, demonstrou que a imunização com antígenos brutos de L. amazonensis associado

ao BCG como adjuvante é capaz de estimular um perfil misto de resposta imune com a

produção simultânea de IFN- e IL-4 (Araújo et al., 2009). Desta forma, a manutenção

tanto de IgG1 como de IgG2 após o desafio experimental parece sustentar a hipótese do

estabelecimento de um perfil misto de resposta imune após a imunização com a vacina

LBSapSal.

A análise da resposta imune humoral no grupo C revelou valores acima do limiar

de positividade para IgG Total e IgG2 logo após o desafio experimental (20Dpd)


79

decaindo a níveis abaixo do ―cut-off‖ até 435Dpd, exceto para IgG2 que se apresentou

acima do limiar de positividade no final da avaliação (435Dpd). Estes resultados podem

ser explicados pelo curso da infecção experimental intradérmica utilizada neste estudo.

Neste sentido, estudo pioneiro realizado por Paranhos-Silva et al. (2003) demonstrou

que o inóculo intradérmico com Leishmania chagasi em cães produzia a forma

assintomática de infecção (Santos-Gomes et al., 2001). Além disto, a associação com

lisado de glândula salivar (LGS) de L. longipalpis não contribuiu significativamente

para aumentar a infecção experimental no modelo canino, não alterando o curso da

infecção experimental, diferentemente da infecção no modelo hamster (Warburg et al.,

1994) e camundongos (Titus & Ribeiro, 1988; Theodos et al., 1991; Samuelson et al.,

1991). De acordo com Paranhos-Silva et al, (2003) os níveis séricos de anticorpos anti-

Leishmania não apresentaram diferenças entre o grupo de animais infectados

intradermicamente com L.chagasi com ou sem LGS; ou até mesmo entre estes grupos

em relação ao grupo controle não infectado. Desta forma, estes resultados são

semelhantes aos observados no presente estudo em relação aos baixos níveis de

anticorpos anti-Leishmania produzidos pela infecção pela via intradérmica no grupo

Controle. No entanto, é importante ressaltar que a escolha do desafio experimental por

via intradérmica associada a saliva de L. longipalpis e L. chagasi buscou criar do ponto

de vista experimental um microambiente que simulasse a infecção natural pelo inseto

vetor, já que a vacina LBSapSal contém em sua composição antígenos de glândula

salivar de flebotomíneos. Desta forma, esta estratégia de infecção experimental pioneira

no mundo em avaliações de fase I e II teve como objetivo avaliar se os componentes

vacinais poderiam induzir alterações nos cães imunizados com saliva após este tipo de

desafio experimental.

A avaliação da resposta imune celular contou com o estudo inicial do perfil do

leucograma nos diferentes grupos vacinais. Alterações marcantes foram observadas

particularmente em relação ao número global de leucócitos no grupo vacinal LBSapSal

(20Dpd e 435Dpd). Em 20Dpd foi observado também aumento do número de

neutrófilos totais, apesar de ter também havido a contribuição da população de

linfócitos nesta elevação da global de leucócitos, uma vez que os valores absolutos de

linfócitos do grupo LBSapSal, apesar de não significativos, estiveram mais elevados

que dos demais grupos. Além disto, em 90Dpd o grupo LBSapSal também apresentou

aumento no número de linfócitos. Já 435Dpd, o aumento da global de leucócitos foi

acompanhado pelo aumento do número de linfócitos neste grupo. Estes resultados


80

sugerem a participação concomitante de células da imunidade inata e adaptativa no

grupo imunizadado com a vacina LBSapSal, após o desafio experimental que poderia

atuar no controle da infecção por L. chagasi.

Uma vez que as análises demonstraram a indução de aumento de populações

celulares importantes relacionadas ao controle da infecção por Leishmania, tornou-se

relevante investir no estudo mais detalhado da resposta imune celular. Neste sentido, foi

realizada a imunofenotipagem de leucócitos caninos por citometria de fluxo com o

objetivo de identificar possíveis biomarcadores relacionados a imunogenicidade após o

desafio experimental com L. chagasi. De fato, desde a padronização da metodologia de

citometria de fluxo para imunofenotipagem de leucócitos caninos (Fujiwara et al., 2005,

Reis et al., 2005), esta ferramenta tem sido utilizada na tentativa de estabelecer padrões

associados ao perfil celular ligado a resistência ou susceptibilidade a infecção por L.

chagasi (Reis et al., 2009; Reis et al., 2010; Reis, 2001, Reis et al., 2006b, Giunchetti et

al., 2008a), além do perfil imunogênico em ensaios vacinais anti-LVC (Giunchetti et

al., 2007 e 2008c). Estas abordagens favoreceram a identificação de novos

biomarcadores para análise da história natural da LVC e do desempenho de candidatos

vacinais contra LVC.

Neste sentido, leucócitos do sangue periférico dos diferentes grupos

experimentais foram submetidos a imunofenotipagem por citometria de fluxo. O grupo

LBSapSal apresentou diminuição (P<0,05) do número de linfócitos B CD21+

circulantes após 90 dias do desafio experimental (90Dpd). De forma interessante, esta

diminuição ocorreu posteriormente ao pico de produção de imunoglobulinas anti-

Leishmania (20Dpd) no grupo LBSapSal. Estes eventos poderiam estar associados à

ativação de linfócitos B circulantes e diferenciação em plasmócitos secretores de

imunoglobulinas, justificando a alta produção de anticorpos séricos e possível migração

das células CD21+ para órgãos linfóides que poderiam ainda estar atuando também

como APCs, justificando a redução destas células no sangue. De fato, tem sido proposto

que a migração de linfócitos B circulantes em direção aos órgãos linfóides é um evento

que ocorre com a redução destas células no sangue periférico simultaneamente ao

aumento da secreção de imunoglobulinas (Giunchetti et al., 2008a; Reis et al., 2006b;

Reis et al., 2009).

As avaliações adicionais relacionadas ao perfil imunofenotípico de linfócitos T

circulantes permitiram a identificação de alterações nos grupos LBSal e LBSapSal.

Neste sentido, os grupos LBSal e LBSapSal apresentaram aumento (P<0,05) do número


81

de linfócitos T CD5+ do sangue periférico em 274Dpd e 435Dpd, respectivamente. Este

aumento contou com a contribuição (P<0,05) das subpopulações de linfócitos T CD4+ e

CD8+

que também se apresentaram aumentadas. Interessantemente, a vacina LBSapSal

induziu aumento na subpopulação de linfócitos T CD8+ circulantes em todo o período

pós desafio. De forma interessante, estudos imunofenotípicos descritos na LVC relatam

que o aumento de linfócitos T CD5+, bem como das subpopulações de linfócitos T

CD4+ e CD8

+ estão relacionadas a um perfil de resposta imune associada à resistência

frente a infecção por L. chagasi (Pinelli et al., 1994a, Pinelli et al., 1994b, Pinelli, 1997,

Reis, 2001, Reis et al., 2006b, Reis et al., 2010). Adicionalmente, o aumento de

linfócitos T CD8+ circulantes em cães vacinados contra LVC tem sido considerado

como um marcador de resistência de uma possível infecção por Leishmania (Giunchetti

et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c). De fato, linfócitos T CD8+ atuam de forma

significativa no combate a patógenos intracelulares, por induzirem a lise de células

infectadas (Berke, 1995). Neste sentido, é possível especular que a expansão de

linfócitos T CD5+ e CD4

+, bem como o aumento sustentado de linfócitos T CD8

+

observado em todo o período pós desafio com L. chagasi, particularmente no grupo

imunizado com a vacina LBSapSal, parece refletir a tentativa do sistema imune em

combater um ―eventual parasitismo‖ que possa estar ocorrendo após o desafio

experimental.

Em concordância com esta hipótese se destacam os resultados da análise da

atividade linfoproliferativa. Esta avaliação permitiu em estudo prévios a identificação

de células de memória antígeno-específicas induzidas pelo processo vacinal com o

imunobiológico LBSapSal (Giunchetti, 2007). No presente estudo, foi observado

aumento (P<0,05) do índice de proliferação de células do grupo LBSapSal, quando

utilizados o estímulo SLcA em 90 e 435 Dpd. Este resultado indica a identificação de

antígenos (SLcA) relacionados ao agente etiológico da LVC por linfócitos de memória

do grupo LBSapSal no período precoce (90Dpd) e tardio (435Dpd) ao desafio com L.

chagasi. Desta forma, além do reconhecimento sérico utilizando SLcA evidenciado por

este grupo vacinal, a identificação de linfócitos de memória responsivos a estes

antígenos poderia estar relacionada a uma resposta específica contra a infecção por L.

chagasi, sustentando a hipótese da vacina LBSapSal induzir uma resposta imune

específica contra o agente etiológico da LVC. Interessantemente, estudos em cães

imunizados com uma vacina bivalente composta por antígenos brutos de Leishmania

proveniente de cepas dermatotrópicas (L. amazonensis e L. braziliensis) associado ao


82

BCG como adjuvante revelou maior habilidade na capacidade linfoproliferativa em

resposta ao estímulo com antígenos de L. chagasi (Giunchetti et al., 2008d). Por outro

lado, tem sido demonstrado na LVC ativa que na presença de mitógeno inespecífico há

redução da capacidade proliferativa tanto de linfócitos (De Luna et al., 1999) como de

esplenócitos submetidos a cultivo in vitro (Reis, 2001). Além disto, a habilidade para

estimular a atividade linfoproliferativa utilizando antígenos de Leishmania tem sido

associada a um perfil de resposta imune relacionada à resistência na LVC, sendo

característico de animais assintomáticos (Pinelli et al., 1994a, Pinelli et al., 1994b, Reis,

2001, Reis et al., 2009).

Os resultados da atividade linfoproliferativa no grupo imunizado com a vacina

LBSapSal estimularam análises adicionais buscando identificar o perfil imunofenotípico

de linfócitos estimulados in vitro com os estímulos VSA ou SLcA. De forma

interessante, no período precoce pós desafio com L. chagasi (90Dpd) foi observado no

grupo LBSapSal aumento (P<0,05) do índice de proliferação de linfócitos T CD8+

VSA-específicos, apesar de não ter apresentado aumento significativo da atividade

linfoproliferativa. De fato, este resultado reflete a expansão de linfócitos T CD8+

circulantes observados no grupo LBSapSal 90Dpd. Além disto, a análise do estímulo

antigênico vacinal (VSA) no período tardio pós desafio com L. chagasi (435 Dpd)

evidenciou que de forma similar aos dados obtidos no ex vivo, o grupo LBSapSal

apresentou aumento (P<0,05) do índice de proliferação de linfócitos B CD21+ VSA-

específicos. Este resultado reforça a hipótese de ativação policlonal de células B,

justificando assim os altos níveis de anticorpos séricos, sendo o único grupo com

valores séricos acima do limiar de positividade em 435 Dpd.

Além disto, no período tardio (435 Dpd) pós desafio com L. chagasi, foi

observado aumento (P<0,05) do índice de proliferação de linfócitos T CD5+ antígeno-

específicos no grupo LBSapSal na presença de SLcA, sendo representado pelo aumento

(P<0,05) do índice de proliferação da subpopulações de linfócitos T CD8+ antígeno-

específicos. Estes resultados estão em concordância com os dados imunofenotípicos ex

vivo relatados em linfócitos T (CD5+. CD4

+, CD8

+) circulantes. De forma similar,

embora o grupo LBSal não tenha apresentado aumento significativo (P<0,05) da

atividade linfoproliferativa SLcA-específica em 435Dpd, surpreendentemente, foi

observado aumento (P<0,05) do índice de proliferação de linfócitos T CD5+, associado

ao aumento das subpopulação de linfócitos T CD4+ e CD8

+ quando utilizado o mesmo

estímulo antigênico (SLcA). Evidências experimentais comprovaram que a ativação de


83

células T CD8+ poderia ocorrer a partir de antígenos exógenos fagocitados por APC e

apresentados via MHC-I, por um mecanismo denominado de cross-priming (Brossart &

Bevan, 1997). Este mecanismo explicaria a ativação de linfócitos T CD8+ estimulados

in vitro com antígenos solúveis presentes nos grupos LBSal e LBSapSal.

Adicionalmente, Reis (2001) descreveu que linfócitos T CD8+ provenientes do baço de

cães assintomáticos, na presença de antígeno de Leishmania, são recrutados em maior

número em relação a cães oligo e sintomáticos, evidenciando a importância desta célula

em mecanismos relacionados à resistência a infecção por L. chagasi em cães. Neste

sentido, tanto no homem e como no cão a infecção assintomática por L. infantum tem

sido associada à expansão de linfócitos T CD8+ Leishmania-específicos (Pinelli et al.,

1995, Mary et al., 1999). Os dados em conjunto do perfil imunofenotípico in vitro

demonstram maior habilidade da vacina LBSapSal induzir células de memória

Leishmania-específicas que vem sendo associadas ao controle do parasitismo no cão

(Reis et al., 2009). Esta hipótese é sustentada pelo aumento de linfócitos T CD8+ no

período precoce (90Dpd) e tardio (435Dpd) pós infecção com L. chagasi, bem como

pelo aumento das populações de linfócitos T (CD5+. CD4

+) Leishmania-específicos no

período tardio.

Um outro ponto crítico relacionado à atividade linfoproliferativa in vitro, além

do perfil de ativação linfocitária, é a disponibilidade de células apresentadoras de

antígenos (APC). Neste sentido, buscando ampliar as investigações dos fatores que

poderiam contribuir para a ativação da imunidade adaptativa, foi avaliado o perfil de

potenciais APC circulantes. Assim, foi observada diminuição (P<0,05) do número de

monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSal e LBSapSal em 90 e 274 Dpd. Este

resultado parece refletir uma possível migração destas células para órgãos alvos do

parasitismo, entretanto, apenas avaliações histológicas poderiam validar esta hipótese.

No entanto, 90 Dpd foi observado os maiores níveis de expressão de linfócitos CD80+

nos grupo LBSal e LBSapSal. Este resultado parece refletir mecanismos de ativação

linfocitária exatamente no período em que há uma provável migração de monócitos

CD14+

em direção aos tecidos. Isto permite especular em uma primeira hipótese, sobre

um possível papel de monócitos CD14+ migrarem em direção aos tecidos alvos do

parasitismo e exercerem seu papel de APC ativando populações de linfócitos. De fato,

tem sido demonstrado que as maiores contagens de monócitos CD14+ circulantes estão

associadas aos maiores níveis de expressão de CD80 em linfócitos de cães imunizados

com a vacina LBSapSal (Giunchetti et al., 2008c), reforçando a hipótese da participação


84

de células da imunidade inata (monócitos CD14+) contribuírem na ativação da

imunidade adaptativa (linfócitos CD80) após o desafio com L. chagasi. Em uma

segunda hipótese podemos especular que esta diminuição de monócitos CD14+

circulantes pode estar diretamente relacionado a presença do SGE no desafio

experimental, além de sua presente na composição da vacina LBSapSal, que em

associação com o adjuvante saponina poderia estar levando a esta diminuição de

monócitos CD14+ circulantes e aumento dos níveis de expressão de CD80 em linfócitos.

Costa et al. (2004), demonstraram em humanos que glândulas salivares sonicadas de L.

longipalpis induzem um efeito supressor/modulador em células apresentadoras de

antígenos, interferindo inclusive na expressão de moléculas co-estimulatórias destas

células, como por exemplo, levam a um aumento da expressão de CD80 e HLA-DR em

monócitos.

A expressão de MHC-II, classicamente relacionado à apresentação de antígeno

exógeno por APC (macrófagos e células dendríticas) aos linfócitos T CD4+, tem sido

associado a um perfil de ativação linfocitária em cães com LVC (Reis et al., 2006b,

Giunchetti et al., 2008a). Neste sentido, a avaliação de moléculas de ativação pela

expressão de MHC-II em células de cães com LV apresentou-se aumentada em

linfócitos provenientes do linfonodo poplíteo (Giunchetti et al., 2008a) e em linfócitos

circulantes de cães assintomáticos (Reis, 2001, Reis et al., 2006b). No presente estudo,

foi proposta a avaliação em linfócitos circulantes da expressão de MHC-I+ e MHC-II

+,

além da expressão de CD80, como potenciais marcadores de ativação celular frente ao

desafio experimental com L. chagasi. Embora não tenham sido identificadas diferenças

na avaliação da expressão de linfócitos MHC-I, os grupos LBSal e LBSapSal

apresentaram redução na expressão de linfócitos MHC-II circulantes em Tad e 20Dpd.

Este resultado poderia indicar que linfócitos ativados expressando MHC-II poderiam

estar em órgãos linfóides ou mesmo em outros tecidos alvos do parasitismo.

Buscando compreender melhor o perfil imunofenotípico da expressão de MHC-

II em cães vacinados e desafiados com L. chagasi, novas estratégias de análise foram

propostas considerando o estudo in vitro destas células estimuladas com VSA ou SLcA.

Neste sentido, a análise do índice de proliferação considerando a expressão de linfócitos

MHCII+ revelou aumento significativo (p<0,05) no grupo LBSapSal em 435Dpd

quando estimulado com VSA. Apesar do estímulo com SLcA não ter apresentado

diferença significativa no grupo LBSapSal, o perfil deste resultado foi semelhante na

presença do VSA. Desta forma, estes resultados parecem indicar que na presença de


85

antígenos de Leishmania ocorre ativação linfocitária pelo aumento da expressão de

MHC-II apenas no grupo imunizado com a vacina LBSapSal. Considerando a

importância da expressão de moléculas MHC-II na superfície de linfócitos de cães com

LV como um marcador de resistência frente a infecção por L. chagasi (Reis et al.,

2006b; Reis et al., 2009), é possível especular que o perfil imunofenotípico do grupo

LBSapSal esteja relacionado a maior habilidade destes cães em controlar o parasitismo.

Estes resultados estimularam o estudo de linfócitos cultivados in vitro com VSA

e SLcA por análises de correlação entre o perfil de expressão de MHC-II em linfócitos e

a frequência de linfócitos T (CD5+, CD4

+ e CD8

+) e B (CD21

+). Os resultados

demonstraram correlações significativas apenas no grupo LBSapSal. Neste sentido,

foram observadas correlações positivas entre a expressão de MHC-II+ e a frequência de

linfócitos CD21+ no período precoce (90Dpd) e correlação negativa no período tardio

(435Dpd) pós desafio com L. chagasi, reforçando a hipótese de ativação e migração

para órgãos linfóides de linfócitos B para iniciar a produção de anticorpos anti-

Leishmania no período inicial após o desafio experimental.

Correlações negativas entre a expressão de MHC-II em linfócitos e o percentual

de linfócitos T CD5+ foram observadas no período inicial pós desafio em ambos os

estímulos antigênicos (VSA e SLcA), e apenas na presença do SLcA a correlação foi

negativa para linfócitos T CD4+ e positiva para linfócitos T CD8

+. Estes resultados

parecem indicar que o evento inicial após o desafio experimental com L. chagasi é

marcado pela habilidade da vacina LBSapSal promover ativação linfocitária,

aumentando a expressão de MHC-II, que poderia estar diretamente relacionado a

expansão de linfócitos T CD8+ cultivados in vitro com SLcA. De fato, neste mesmo

período (90Dpd) foi observado aumento de linfócitos T CD8+ circulantes, reforçando a

hipótese da participação desta população celular no estabelecimento de imunidade

potencialmente protetora contra o desafio experimental com L. chagasi. É importante

ressaltar ainda que mesmo no período tardio pós desafio (435Dpd) linfócitos de

memória Leishmania-específicos (CD5+, CD8

+) foram positivamente correlacionados a

expressão de MHC-II em linfócitos de cães imunizados com a vacina LBSapSal. Estes

dados revelaram a capacidade da vacina LBSapSal em induzir e manter, mesmo após

longo período do desafio experimental com L. chagasi (435Dpd), um perfil de ativação

linfocitária associado a expansão de linfócitos T CD8+ Leishmania-específicos,

reforçando a presença destes biomarcadores que vem sendo relacionados a mecanismos

imunoprotetores na LVC (Reis et al., 2009, Reis et al., 2010).


86

Diferenças entre o desafio experimental e o natural como: número de parasitos,

estágio do ciclo de vida (amastigota ou promastigota), via de infecção, presença ou não

de saliva do vetor, dentre outras são variáveis importantes que devem ser levadas em

consideração quando a infecção experimental é realizada em potenciais candidatos a

uma vacina anti-LVC (Reis et al., 2010). O desafio experimental pela via endovenosa

com alto número de parasitos (107-10

8 promastigotas) parece ser o modelo de desafio

mais eficiente em cães, pois promove o estabelecimento de infecções rápidas,

facilitando o estudo do curso da doença, eficácia de drogas e também a eficácia de

vacinas, sendo usado na maioria das vezes (Genaro,1993). Entretanto, este tipo de

desafio experimental pode ocultar a real eficácia vacinal, devido a possibilidade da

infecção/desafio suprimir uma resposta de proteção que poderia estar presente em cães

vacinados (Poot et al., 2005; Peters et al., 2008, 2009). Além disto, este modelo de

infecção é considerado muito agressivo e incompatível com as condições naturais de

transmissão do parasito, o que poderia levar a interpretações equivocadas em ensaios de

Fase I e II de candidatos vacinais (Moreno & Alvar, 2002; Reis et al., 2010). Desta

forma, a prática de reproduzir um modelo de infecção experimental que mais se

aproxime da transmissão da Leishmania pelo vetor na natureza é cada vez mais

preconizada e desejada por diversos pesquisadores. Isto tem estimulado nosso grupo de

pesquisa a elaborar diferentes protocolos de desafio experimental que pudesse

aproximar da infecção natural. As tentativas de infecção desafio na ―ponta da

probócida‖ de flebotomíneos infectados ainda é um obstáculo a ser alcançado

principalmente quando se trata do modelo cão. O professor Alexandre

Reis, em um estudo prévio conduzido em 2002 conseguiu uma eficiência de 65% de

infecção em L. longipalpis após primeiro repasto em um cão sintomático doador de

parasitos e uma eficiência de infecção para o vetor de 85% após o segundo repasto.

Entretanto, ao colocar as fêmeas infectadas para alimentarem em quatro cães saudáveis

estes animais não produziram anticorpos anti-Leishmania após 12 meses do repasto

sanguíneo (dados não publicados – Comunição Pessoal). Estes resultados mostraram

que a infecção experimental pela picada de vetores infectados de cão para cão capaz de

lograr sucesso na infecção é ainda um grande desafio científico para os vacinologistas

da área. Diante disto, nosso grupo de pesquisa, optou em empregar o desafio sugerido

por Genaro (1993) que utilizou 1x107 promastigotas de L. chagasi pela via intradérmica

em que obteve um período pré-patente (caracterizado pelo encontro de parasitos na

medula óssea) superior a 27 meses (860 dias), mas com bom índice de sucesso na


87

infecção/desafio. Para incrementar este desafio experimental buscando mimetizar os

eventos decorrentes da infecção na ―ponta da proboscida‖ foi incluído extrato de

glândula salivar de L. longipalpis. Neste sentido, o presente trabalho empregou pela

primeira vez o desafio experimental pela via de inoculação intradérmica conjuntamente

com extrato de glândula salivar (SGE) de L. longipalpis para avaliar uma vacina contra

LVC.

A presença do parasito na medula óssea dos cães imunizados e desafiados foi

investigada por meio de microscopia ótica em esfregaços do aspirado medular corado

pelo Giemsa e, indiretamente, por mielocultura em NNN/LIT, bem como através do

diagnóstico molecular por PCR. De forma interessante, as três técnicas empregadas não

permitiram a identificação do parasito e de seu DNA na medula óssea durante o

acompanhamento de 435 Dpd. Estudos realizados por Genaro (1993) analisando cães

experimentalmente infectados pela via intradérmica empregando-se inóculo de 1x107

promastigotas de L. chagasi, não revelou parasitismo da medula óssea em esfregaços

confeccionados em lâminas ou em cultura do aspirado medular durante o

acompanhamento de 27 meses de infecção. Interessantemente, dois dos quatro (2/4)

cães apresentaram emagrecimento leve transitório como único sinal clínico observado,

mas que culminou com ganho e estabilização do peso. Esses resultados corroboram com

os achados clínicos e parasitológicos do presente trabalho, em que todos os grupos

experimentais não apresentaram sinais clínicos da doença e não foi possível detectar

presença do parasito na medula óssea durante o acompanhamento por 435 Dpd. Desta

forma, os resultados do presente estudo reafirmam que a via de inóculo intradérmica

induz o desenvolvimento de uma infecção assintomática em cães por um longo período

(435Dpd), tornando importante um maior tempo de acompanhamento dos animais para

detecção do parasito na medula óssea.

Em estudo realizado por Paranhos-Silva et al. (2003) com infecção experimental

com ―baixo‖ número de parasitos (4x104

promastigotas) inoculados intradermicamente

conjuntamente com lisado de glândula salivar (SGL) demonstraram infecção no baço

apenas após 9 meses em dois de seis (2/6) cães através de cultura da punção do baço e

em três de cinco (3/5) por PCR do baço. Interessantemente, a adição de SGL de L.

longipalpis no inóculo infeccioso não alterou o curso da infecção por L. chagasi, além

de não favorecer a detecção precoce de amastigotas ou induzir um aumento na carga

parasitária no baço. Similarmente, Santos-Gomes et al. (2001) ao desafiar cães pela via

intradérmica com 108 promastigotas produziu apenas sinais leves da doença em um dos


88

cinco (1/5) animais em estudo. Desta forma, estes trabalhos demonstraram uma lenta

progressão da doença independe da dose ou presença de componentes salivares de

flebotomíneos quando empregado o inóculo experimental pela via intradérmica. Killick-

Kendrick et al. (1994) demonstraram em infecção intradérmica com inóculos entre 5-8

promastigotas metacíclicas retiradas do intestino médio de P. perniciosus, que mesmo

após 5 anos de acompanhamento nove dos vinte e um (9/21) cães permaneceram

assintomáticos, apesar de serem parasitologicamente positivos nos isolamentos em meio

NNN para punções na medula óssea, baço e linfonodo poplíteo. Destes nove cães, seis

(6/9) apresentaram resposta imune mediada por células para Leishmania.

Interessantemente, outros quatro animais não apresentaram exames parasitológicos

indiretos positivos nem sinais clínicos da doença, demonstrando o longo curso de

evolução da doença quando a infecção experimental se dá pela via intradérmica.

Em infecção experimental por L. infantum, seja através da picada do

flebotomíneo (Rioux et al., 1979) cão para cão ou por injeção intradérmica de

promastigotas metacíclicas provenientes do intestino médio de flebotomíneos (Killick-

Kendrick et al., 1994), o período pré patente da doença ocorre em torno de 16-24

meses. Estudos com cães naturalmente infectados indicam que a doença pode apresentar

período pré patentes ainda mais longos e até mesmo nem apresentar sinais clínicos da

LVC (Adler & Theodor, 1932; Abranches et al., 1991). Na verdade, pouco se sabe

sobre a dinâmica natural da infecção por Leishmania chagasi/L. infantum em cães.

Sabe-se que baixo número de parasitos (10-1.000) são injetados pela via intradérmica,

durante um ou, provavelmente, repetidas inoculações, e que o estado nutricional e

doenças concomitantes podem afetar o curso da infecção (Warburg & Schlein, 1986)

Sob tais condições variáveis, um período pré patente de cerca de 110 dias até o

aparecimento de resultados positivos na sorologia anti-Leishmania foi estimado por

Quinnel et al. (1997). Entretanto, a determinação do período pré patente em animais

naturalmente infectados é de difícil precisão tendo sido relatada até 33 meses para que

ocorra a presença do parasito na medula óssea (Longstaffe et al.,1983). Além disto,

alguns animais naturalmente infectados nunca convertem a sorologia anti-Leishmania, e

mesmo após 20 meses de infecção, apenas metade dos animais sorologicamente

positivos desenvolvem sinais clínicos da doença (Hommel et al., 1995).

Desta forma, os resultados do presente estudo confirmam as observações

anteriores de outros grupos de pesquisa que também empregaram o inóculo do parasito

pela via intradérmica (Paranhos et al., 1993; Killick-Kendrick et al., 1994; Santos-


89

Gomes et al., 2001; Paranhos – Silva et al., 2003; Genaro,1993). Neste sentido, como a

infecção por L. chagasi leva um longo período para se desenvolver em cães infectados

pela via intradérmica, assim como o aparecimento dos sinais clínicos da LVC, se faz

necessário um período superior aos 435Dpd de acompanhamento parasitológico da

medula óssea para a detecção do parasito.

Os resultados apresentados neste trabalho estimulam o estudo de estratégias

vacinais abordando antígenos brutos de Leishmania em associação com antígenos

presentes na saliva do vetor. Neste sentido, a vacina LBSapSal apresenta grande

diversidade antigênica induzindo a expansão de linfócitos T (CD5+, CD4

+, CD8

+)

circulantes e Leishmania-específicos, apresentando um perfil de ativação linfocitária

(CD80 e MHC-II) compatível com o controle do parasitismo.

8. Conclusão

AGUIAR-SOARES, R.D.O.______ ____________________________ __ Conclusão

91

O conjunto de dados obtidos neste trabalho que realizou a avaliação da

imunogenicidade e uma avaliação preliminar de eficácia da vacina LBSapSal após

desafio intradérmico com Leishmania chagasi associado a extrato de glândula salivar de

Lutzomyia longipalpis durante um acompanhamento de 435 dias pós desafio nos

permitiu estabelecer as seguintes conclusões:

A vacina LBSapSal foi capaz de desencadear um perfil de resposta imune

celular compatível com proteção, caracterizado pela expansão de linfócitos T-

totais (CD5+) preferencialmente por uma elevada flutuação de linfócitos T

(CD8+) circulantes durante os 435 dias após o desafio.

A produção elevada e prolongada tanto de IgG1 quanto de IgG2 anti-Leishmania

gera um perfil misto de resposta imune no grupo LBSapSal mantido por longo

tempo após o desafio experimental com L. chagasi.

A queda de células apresentadoras de antígenos (APCs) seja linfócitos BCD21+

ou monócitos CD14+ circulantes associado aumento na expressão CD80 e queda

na expressão de MHCII em linfócitos totais após o desafio experimental parece

ser induzida pelo efeito supressor/modulador de peptídeos de SGE presentes na

vacina LBSapSal.

A vacina LBSapSal é boa indutora de memória antígeno específica sendo capaz

de induzir uma forte atividade linfoproliferativa frente ao estímulo específico

com antígeno de Leishmania chagasi (SLcA) acompanhado por um

reconhecimento preferencial de células T CD8+-SLcA específicas mesmo após

435 dias do desfio experimental.

A vacina LBSabSal apresentou excelente habilidade de estabelecer e fortalecer a

capacidade de linfócitos T-totais (CD5+) apresentarem antígenos do parasito via

MHC caracterizada por uma marcada resposta imune VSA-específica com forte

aumento na expressão de moléculas de MHC-II além de um recrutamento

preferencial da subpopulação de LT CD8+-VSA/SLcA em 435 dias do desfio

experimental.

AGUIAR-SOARES, R.D.O.______ ____________________________ __ Conclusão

92

O desafio intradérmico com 1x107 promastigotas de L. chagasi associado a

extrato de glândula salivar de L. longipalpis exige um acompanhamento mais

prolongado uma vez que animais do grupo controle e vacinado em 435 dias pós

desafio ainda não haviam apresentado sinais clínicos da LVC além de ausência

do parasito ou de seu DNA na medula óssea.

A LBSapSal funcionou como um excelente protótipo de vacina para avaliar os

eventos de imunogenicidade decorrentes das proteínas presentes no extrato de

glândula salivar de L. Longipalpis no modelo canino ampliando as perspectivas

de desenvolvimento biotencológico de vacinas anti-LVC constutídas por

proteínas recombinates ou peptídeos sintéticos de componentes antigênicos da

saliva de flebotomíneos.

9. Perspectivas

AGUIAR-SOARES, R.D.O.______ ____________________________ _Perspectivas

94

Após a conclusão do presente estudo surgi novas perspectivas que poderão

contribuir somando conhecimento para imunogenidade e eficácia da vacina LBSapSal.

Cabe ressaltar que pesquisadores de nosso laboratório vêm trabalhando no sentido de

alcançar os resultados de várias destas propostas dando continuidade aos estudos desta e

de outras vacinas.

Continuidade da análise longitudinal dos eventos da resposta imune celular

e humoral no contexto ex vivo e in vitro e da investigação clínica,

parasitológica e molecular na medular óssea até 885 dias após o desafio

experimental.

Padrão de citocinas (IFN-, TNF-, TGF-, e IL-10) séricas e em

sobrenadante de cultura de células mononucleadas do sangue periférico

(CMSP) estimuladas in vitro com antígeno solúvel vacinal (VSA) ou

antígeno solúvel de Leishmania chagasi (SLcA) após as imunizações e

dutante todo estudo longitudinal.

Perfil imunofenotípico (CD5+, CD4

+, CD8

+ e CD21

+) das células do baço e

linfonodo estimuladas in vitro com VSA ou SLcA após a eutanásia dos

cães;

Eficácia vacinal após o desafio por L. chagasi avaliando o parasitismo em

diferentes tecidos (pele, baço, linfonodo, fígado), através de técnicas como:

imuno-histoquímica anti-Leishmania; PCR em tempo real; bem como

xenodiagnóstico, para avaliar a infectividade de flebotomíneos alimentados

nos diferentes grupos experimentais.

10. Bibliografia

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Imunogenicidade da vacina LBSapSal e Investigação ...‡ÃO... · Exemplo de dedicação e comprometimento com a academia e ciência; Ao meu co-orientador Dr. Rodolfo Giunchetti,