in vitro de moringa ( Lam.) Moringa oleifera · 39 ISSN 1517-1981 Outubro 2000 ISSN1678-1961 Dezembro, 2008 Propagação sexuada de moringa ( Lam.) in vitro Moringa oleifera

39ISSN 1517-1981

Outubro 2000

ISSN 1678-1961

Dezembro, 2008

Propagação sexuada

de moringa

( Lam.)

in vitro

Moringa oleifera

Boletim de Pesquisae Desenvolvimento 39

Aracaju, SE2008

ISSN 1678-1961

Dezembro, 2008

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Propagação sexuada invitro de moringa(Moringa oleifera Lam.)

Ana da Silva Lédo

Maria Salete Alves Rangel

Karla Cristina Santos Freire

Caroline de Araújo Machado

Lucas Fonseca Menezes Oliveira

Disponível em: http://www.cpatc.embrapa.br/index.php?idpagina=fixas&pagina=publicacoesonline

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Presidente: Ronaldo Souza ResendeSecretária-Executiva: Raquel Fernandes de Araújo RodriguesMembros: Semíramis Rabelo Ramalho Ramos, Julio Roberto Araujo de Amorim, Anada Silva Lédo, Daniel Luis Mascia Vieira, Maria Geovânia Lima Manos, Ana VeruskaCruz da Silva Muniz, Hymerson Costa Azevedo.

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Propagação sexuada in vitro de moringa (Moringa oleifera Lam.) / Ana da Silva Lédo ... [et al.] -- Aracaju : Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2008. 17 p. - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimetno / Embrapa Tabuleiros Costeiros, ISSN1678-1961; 39).

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1. Moringa. 2. Propagação in vitro. 3. Germinação. 4. Planta oleifera. I. Lédo, ana da Silva. II.Rangel, Maria Salete Alves. III. Freire, Karla Cristina Santos. IV. Machado, Caroline de Araújo. V.Oliveira, Lucas Fonseca Menezes de. VI. Título. VII. Série.

CDD 635.

Sumário

Resumo .................................................................... 5

Abstract ................................................................... 7

Introdução ................................................................. 8

Material e Métodos .................................................. 10

Resultados e Discussão ............................................ 12

Conclusões .............................................................. 16

Referências Bibliográficas ......................................... 16

Resumo

A moringa (Moringa oleifera Lam.) é uma árvore da família Moringaceae, nativa

do Norte da Índia, destacando-se pelo uso intensivo das propriedades químicas

de suas sementes. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer

metodologias eficientes de propagação sexuada e assexuada in vitro de Moringa

oleifera Lam. Sementes coletadas de vagens maduras foram lavadas em água

corrente com remoção do tegumento e submetidas à imersão em álcool 70% por

30 segundos e em diferentes concentrações de hipoclorito de sódio (NaOCl):

1,0 e 2,0% por 10 minutos e inoculadas em três meios de cultura (0 MS, ½

MS e MS). Os segmentos foliares apresentaram menor contaminação e

oxidação. Para os segmentos foliares recomenda-se a assepsia com NaOCl a 1,0;

1,25 ou 2,0%. Nos meios ½ MS e 0 MS observou-se maior porcentagem de

germinação das sementes 54,17%.

Palavras-chave: Moringa oleifera Lam.; Moringaceae, micropropagação,

germinação in vitro.

Propagação sexuada in vitrode moringa(Moringa oleifera Lam.)

Ana da Silva Lédo¹

Maria Salete Alves Rangel¹

Karla Cristina Santos Freire²

Caroline de Araújo Machado²

Lucas Fonseca Menezes Oliveira²

5Propagação sexuada in vitro de Moringa (Moringa oleifera Lam)

1 Pesquisadora Embrapa Tabuleiros Costeiros, Av Beira Mar, 3250 B. 13 de Julho 49025-040 Aracaju-SE

[email protected]

² Estagiários Embrapa Tabuleiros Costeiros, Av Beira Mar, 3250 B. 13 de Julho 49025-040 Aracaju-SE


Sexual propagation in vitroof Moringa(Moringa oleifera Lam)

Abstract

The moringa (Moringa oleifera Lam.) is a tree of family Moringaceae, native of

northern India, and is a multi purpose tree with most of its parts being useful for

a number of applications. This work was in order to establish an effective

methodology for in vitro sexual and asexual propagation of Moringa oleifera

Lam. Seeds collected from mature pods were washed in water to remove the

husk and in chamber of laminar flow, subject to immersion in alcohol 70% for

30 seconds, and then in different concentrations of hypochlorite sodium

(NaOCl): 1.0 and 2.0% for 10 minutes and inoculated in different culture media

(0 MS, ½ MS and MS). Nodal segments obtained from aseptic seedlings in vitro

that were inoculated on MS media with different combinations of BAP (0.05 and

0.1 mg L-1) and IBA (0.05 and 0.1 mg L-1). In the media ½ MS and 0 MS there

was a greater percentage of seed germination (54.17%).

Index terms: Moringa oleifera Lam., Moringaceae, micropropagation, in vitro

germination.

A Moringa oleifera é uma planta da família Moringaceae, do gênero Moringa,

conhecida popularmente por lírio branco, quiabo-de-quina, Acácia-branca, árvore-

rabanete-de-cavalo, cedro e moringueiro (RANGEL, 2003). A espécie é nativa da

Índia, e foi introduzida no Brasil por volta de 1950. É cultivada na África, Ásia,

América Latina e em quase todos os países de clima tropical. No Brasil, é

encontrada em maior número na região Nordeste, principalmente nos estados do

Maranhão, Piauí e Ceará (CYSNE, 2006). Há um esforço no sentido de difundi-la

como hortaliça, por suas folhas serem ricas fontes de vitamina A (AMAYA et al.,

1992; KERR et al., 1998; SILVA; KERR, 1999), como brócolis, cenoura,

couve, espinafre e alface.

A moringa é uma planta de importância econômica significativa com diversas

utilidades na indústria e na medicina (MAKKAR; BECKER,1997), no qual é

utilizado para muitos propósitos, onde a maioria de suas partes são úteis para

várias aplicações, sendo referida como “árvore milagrosa” (FUGLIE, 1999). As

sementes contêm óleo de excelente qualidade podendo ser usado para cozinhar,

confeccionar sabão, na indústria de cosméticos, farmacêutica e no tratamento de

água por floculação e sedimentação, visto que é capaz de eliminar a turvação,

micropartículas, fungos e bactérias substituindo o sulfato de alumínio. As frutas,

sementes, folhas e flores são consumidas como legumes nutritivos em alguns

países (CHAWLA et al.,1988; GERDES, 1994).

As sementes desta planta e de outras espécies do mesmo gênero apresentam

uma propriedade a qual é a mais explorada atualmente: a coagulação de matéria

em suspensão. Esta propriedade das sementes caracteriza a moringa como um

cultivo viável até mesmo para o mercado internacional (RANGEL, 2003). As

sementes possuem polissacarídeos com forte poder aglutinante, o que permite o

uso das sementes pulverizadas no tratamento da água por floculação e

sedimentação, capazes de eliminar a turvação, micropartículas, fungos, bactérias

e vírus (JAHN et al., 1986).

Nas zonas rurais do Nordeste brasileiro a utilização das sementes de moringa no

tratamento d’água para o consumo humano tem sido prática freqüente, dada a

escassez de água potável para a população rural nessa região (GERDES,1997).

Introdução

8 Propagação sexuada in vitro de Moringa (Moringa oleifera Lam)


As sementes também contêm um princípio dotado de atividade antimicrobiana, a

pterigospermina, bem como os glicosídeos moringina, 4-(á-L-ramnosilori)-

isotiocianato de benzila e 4-(á-L-ramnosilori)-fenil-acetonitrila. Estes componentes

antimicrobianos agem principalmente contra Bacillus subtilis, Mycobacterium

phei, Serratia marcescens, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella e

Streptococcus, o que justifica seu emprego na preparação de pomada antibiótica

(RANGEL, 2003).

Recentemente pesquisadores da Universidade Federal de Pernambuco

descobriram que a semente de moringa pode ser usada para combater as larvas

do mosquito Aedes aegypti, transmissor da dengue e da febre amarela. Segundo

o estudo, uma das proteínas contidas nas sementes, a lectina, impede o

processo de digestão da larva, provocando sua morte por desnutrição (AGÊNCIA

FOLHA, 2008).

Segundo Cysne (2006), a planta possui um rápido desenvolvimento em

condições favoráveis, atingindo uma altura de até 4 metros em um ano, na fase

adulta a altura varia de 10 a 12 metros de comprimento. A moringa é uma

espécie alógama, que se propaga por sementes e estacas, mesmo em solos

pobres. Não necessita muitos cuidados e sobrevive a longos períodos de seca.

Os frutos verdes, folhas, flores e sementes torradas são altamente nutritivos e

consumidos em muitas partes do mundo. O óleo obtido das sementes da

moringa pode ser usado no preparo de alimentos, na fabricação de sabonetes,

cosmético e como combustível para lamparinas. A pasta resultante da extração

do óleo das sementes pode ser usada como um condicionador do solo,

fertilizante ou ainda na alimentação animal (RANGEL, 2003).

Poucos trabalhos são conhecidos sobre o melhoramento genético da Moringa

oleifera e sobre a propagação in vitro. Na literatura consultada, existem poucos

trabalhos publicados com micropropagação de moringa (STEPHENSON; JED,

2004; ISLAM et al., 2005; CYSNE, 2006).

Os principais usos da cultura de tecidos são a reprodução de plantas in vitro

para produção de mudas, produção de plantas livres de virose, a conservação in

vitro de recursos genéticos de plantas (conservação de germoplasma), a

obtenção de mutantes in vitro, a produção de haplóides e duplos haplóides e a

produção de plantas transgênicas (TORRES et al., 1998).

10 Propagação sexuada in vitro de Moringa (Moringa oleifera Lam.)

Material e Métodos

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, em Aracaju, Sergipe.

Experimento 1. Assepsia de explantes de moringa

Brotações jovens, colhidas de plantas adultas localizadas na Sede da Embrapa

Tabuleiros Costeiros - Aracaju, SE, foram previamente lavadas em água corrente

com detergente bacteriológico. Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram

imersos em álcool 70% (v/v) por um minuto, em seguida, em solução de NaOCl

de acordo com os tratamentos: T1-0,5%; T2-0,75%; T3-1%; T4-1,25% e T5-

2%, por 10 minutos sob agitação e lavadas cinco vezes em água destilada e

autoclavada. Os segmentos nodais e foliares foram inoculados em frascos

contendo meio de cultura de Murashige & Skoog – MS (MURASHIGE; SKOOG,

1962), com 3,0% de sacarose e gelificado com 0,6% de ágar.

A obtenção de métodos de propagação mais eficientes visando à multiplicação

de genótipos promissores de moringa torna-se necessária. Neste contexto a

multiplicação in vitro é uma alternativa para a rápida produção de mudas em

curto espaço de tempo e com alta qualidade fitossanitária. Na micropropagação a

assepsia tem um papel fundamental que é de eliminar patógenos que estejam

localizados externamente aos propágulos.

Quando se deseja iniciar o cultivo de uma determinada espécie, deve-se

primeiramente verificar as formas de propagação, se elas são práticas e

econômicas para o estabelecimento de um manejo sustentável. No caso da

propagação sexuada, o conhecimento do processo germinativo é de fundamental

importância, bem como a domesticação e aclimatação de espécies nativas e

exóticas. No que diz respeito à moringa essas informações são escassas no

Brasil (BEZERRA et al., 1997).

Assim, esse trabalho teve como objetivo de estabelecer metodologias eficientes

de assepsia de explantes oriundos de plantas adultas e germinação in vitro de

moringa.


O pH foi ajustado para 5,8 e todos os tratamentos submetidos à esterilização em

autoclave a 120ºC durante 15 minutos. As culturas foram mantidas em sala de

crescimento com temperatura variando de 25 ± 2º C, umidade relativa do ar

média em torno de 70% e fotoperíodo de 12 horas de luz branca fria (52 µmol

m-2 s-1 de irradiância).

O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado, em

esquema fatorial 5 x 2 (cinco tratamentos de assepsia x dois tipos de explantes)

e doze repetições.

As médias de porcentagem de contaminação foram comparadas pelo teste de

Tukey em nível de 5% de probabilidade no programa estatístico Sisvar

(FERREIRA et al., 2000). A intensidade de oxidação foi analisada por meio de

uma escala de notas: 1 (0 %), 2 (1 a 30%), 3 (31 a 70%), 4 (71 a 100%).As

médias referentes às notas de oxidação dos explantes foram submetidas à

análise não paramétrica pelo teste de Kruskal – Wallis a 5% de significância no

programa estatístico SAS (SAS INSTITUTE, 1989).

Experimento 2. Germinação in vitro de sementes de moringa

Sementes coletadas de vagens maduras de plantas adultas foram lavadas em

água corrente com remoção do tegumento. Em câmara de fluxo laminar foram

submetidas à imersão em álcool 70% (v/v) por 30 segundos e, em seguida, em

diferentes concentrações de hipoclorito de sódio (NaOCl): T1=1-1,25% (v/v) e

T2= 2-2,50% (v/v) por 10 minutos. As sementes foram inoculadas em

diferentes meios de cultura (0 MS, ½ MS e MS). O delineamento experimental

foi inteiramente casualizado em esquema fatorial de 3 x 2 (três concentrações

dos sais do meio MS x duas concentrações de NaOCl) com quatro repetições.

Cada parcela foi constituída de três frascos contendo duas sementes.

O pH foi ajustado para 5,8 e todos os tratamentos submetidos à esterilização em

autoclave a 120ºC durante 15 minutos. As culturas foram mantidas em sala de

crescimento com temperatura variando de 25 ± 2º C, umidade relativa do ar

média em torno de 70% e fotoperíodo de 12 horas de luz branca fria (52 µmol

m-2 s-1 de irradiância).

Dez dias após a inoculação avaliou-se a porcentagem de germinação e, aos 30

dias, a porcentagem de contaminação. As médias das variáveis foram

submetidas à análise de variância e comparadas pelo teste de Tukey em nível de

5% de probabilidade no programa estatístico Sisvar (FERREIRA et al., 2000).


Resultados e Discussão

Assepsia de explantes de moringa

Houve diferença significativa entre os tratamentos para a porcentagem de

contaminação. Conforme apresentado na Tabela 1, os segmentos foliares

apresentaram menor contaminação (21,7%) quando comparados com os

segmentos nodais (68,3%). Nas concentrações de 1,0; 1,25 e 2,0% os

segmentos foliares apresentaram menor contaminação (8,3%), em relação às

concentrações de 0,5 e 0,75% de NaOCl (66,7% e 16,7%, respectivamente),

Tabela 2.

O valor de H= 53,56 pelo teste de Kruskal – Wallis foi significativo para

oxidação. Os segmentos foliares apresentaram menor oxidação (1,13) quando

comparados com os segmentos nodais (1,97), Tabela 3.

Para os segmentos nodais faz-se necessária uma nova avaliação para obtenção

de um protocolo de desinfestação mais eficiente.

O controle da contaminação por patógenos que infestam explantes usados na

cultura in vitro é de extrema importância devendo-se pesquisar e determinar

protocolos mais eficientes levando em consideração o agente desinfestante, a

espécie que se trabalha e o tipo de explante.

Tabela 1. Valores médios da porcentagem de contaminação por fungos e bactérias emsegmentos foliares e segmentos nodais de moringa em meio MS.

Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a

5% de probabilidade.

Foliares 21,66a

Nodais 68,33b

Segmentos Porcentagem de contaminação


Explantes Intensidade de Oxidação

Tabela 2. Valores médios da porcentagem de contaminação por fungos e bactérias emsegmentos foliares de moringa em meio MS submetidos a diferentes concentrações dehipoclorito de sódio (NaOCl).

Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a

5% de probabilidade.

Tabela 3. Valores médios de notas atribuídas à intensidade de oxidação em segmentosnodais e foliares de moringa em meio MS.

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de

Tukey a 5% de probabilidade

Germinação in vitro de sementes de moringa

O início da germinação com a emissão da radícula foi observado aos sete dias

após a inoculação (Figura 1). Não houve efeito significativo da interação entre os

fatores e da concentração de NaOCl na porcentagem de germinação. Entretanto,

nos meios de cultura 0 MS e ½ MS observou-se maior porcentagem de

germinação das sementes (54,17%) quando comparados com meio MS

(16,67%) conforme apresentado na Tabela 5. Não houve efeito significativo dos

fatores meio e NaOCl isolados ou não na porcentagem de contaminação que foi

apenas de 1,4%.

Em estudos conduzidos por Cysne (2006) em diferentes concentrações de

NaOCl a percentagem de contaminação variou entre 0 e 10%, sendo que a partir

da concentração de 0,25% de NaOCl não houve contaminação das sementes

que obtiveram de 85 a 90% de germinação.

NaOCl 0,5% 66,7a

NaOCl 0,75% 16,7b

NaOCl 1,0% 8,3b

NaOCl 1,25% 8,3b

NaOCl 2,0% 8,3b

Tratamentos Porcentagem de contaminação

em segmentos foliares

Segmentos Nodais 1,97a

Segmentos Foliares 1,13b


Observou-se nas primeiras 24 horas após a inoculação das sementes o início da

coagulação do meio de cultura (Figura 2). Os cotilédones das sementes de

moringa contêm polissacarídeos com forte poder aglutinante e propriedades de

coagulação (JAHN et al., 1986). A remoção do tegumento das sementes

proporcionou o contato desses polissacarídeos com substâncias presentes no

meio de cultura que pode ter interferido na germinação das sementes e no

desenvolvimento das plântulas.

Observaram-se 94,44% de coagulação de meios de cultura inoculados com

sementes submetidas a 2,5% de NaOCl e 43% de coagulação em meios com

sementes desinfestadas com 1,25% de NaOCl (Tabela 4). Não houve diferenças

significativas entre os meios de cultura, sendo observados 70,83; 65,00 e

70,83% de coagulação dos meios 0 MS, ½ MS e MS, respectivamente (Tabela

5).

Provavelmente a indisponibilidade de nutrientes do meio de cultura pela

coagulação tenha afetado a percentagem de germinação das sementes que

alcançou valores abaixo de 50%, discordando dos resultados obtidos por Cysne

(2006).

Estudos comparativos sobre a germinação in vitro de sementes com e sem

tegumento deverão ser conduzidos para o estabelecimento de um protocolo

eficiente de obtenção de plântulas assépticas.

Figura 1. A- Sementes sem tegumento de moringa aos cinco dias após a inoculação invitro; B- Etapas da germinação a partir de 10 dias após a inoculação (Fotos: AnaLédo, 2007).

A B


Tabela 4. Valores médios da porcentagem de germinação e coagulação do meio decultura durante o estabelecimento de plântulas assépticas de moringa em diferentesconcentrações de hipoclorito de sódio (NaOCl).


Tukey a 5% de probabilidade.

Tabela 5. Valores médios da porcentagem de germinação e coagulação do meio decultura durante o estabelecimento de plântulas assépticas de moringa em diferentesconcentrações de sais do meio MS.


Tukey a 5% de probabilidade.

Figura 2. Efeito da coagulação de substâncias do meio de cultura promovida porpolissacarídeos presentes no endosperma de Moringa oleifera Lam. (Foto: Ana Lédo,2007).

NaOCl 1% 47,22a 43,00b

NaOCl 2% 36,11a 94,44a

Tratamentos % Germinação % Coagulação

MS 16,67b 70,83a

½ MS 54,17a 65,00a

0 MS 54,17a 70,83a

Meio de cultura % Germinação % Coagulação


Conclusões

Diante dos resultados observados, conclui-se que:

- Os segmentos foliares apresentam menor contaminação e oxidação;

- Para os segmentos foliares recomenda-se a assepsia com NaOCl a 1,0; 1,25

ou 2,0%;

- A ausência do meio de cultura MS ou a redução da concentração dos sais à

metade promovem maior germinação de sementes de moringa cultivadas in vitro;

- Na presença de NaOCl a 1-1,25% ocorre menor coagulação meio de cultura

por polissacarídeos presentes nos cotilédones de sementes de moringa

cultivados in vitro;

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