IN62

MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO.

SECRETARIA DE DEFESA AGROPECURIA.

INSTRUO NORMATIVA N 62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003.

Oficializar os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua

O SECRETRIO DE DEFESA AGROPECURIA, DO MINISTRIO DA AGRICULTURA,

PECURIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuio que lhe confere o art. 83, inciso IV, doRegimento Interno da Secretaria, aprovado pela Portaria Ministerial n 574, de 8 de dezembro de1998, resolve:

Art. 1 Oficializar os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua, com seus respectivos captulos e anexos, emconformidade com o anexo desta Instruo Normativa, determinando que sejam utilizados noSistema de Laboratrio Animal do Departamento de Defesa Animal.

Pargrafo nico. A metodologia de que trata este artigo ser atualizada, sempre que ainovao tecnolgica assim recomendar, por meio de ato do Diretor do Departamento de DefesaAnimal.

Art. 2 Esta Instruo Normativa entra em vigor na data da sua publicao.

MAAO TADANO

ANEXO

MTODOS ANALTICOS OFICIAIS PARA ANLISES

MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA CAPTULO I - CONTAGEM

PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS

1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a contagem padro de microrganismos mesfilos aerbiosestritos e facultativos viveis.

Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos. 2. FUNDAMENTOS

Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagemseguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia dealimentos; Agar padro para contagem (PCA);

Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem edescarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

5.2 Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies

desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com as instrues contidas no Anexo II,Diluies e solues, deste Manual.

Semear 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis. Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C.

Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em superfcie plana.

5.3 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas.

5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura selecionando as

placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes: Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;

Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias. 6. RESULTADOS

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostraem anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.

Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

FRANK, J.F. Microbial spoilage of foods: Milk and dairy products. In: Food MicrobiologyFundamentals and Frontiers. Michael

P. Doyle, Beuchat, L.R.; Montville, T.J. (Eds.). ASM Press Washington D.C., p. 101-116. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological

Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. FrancesPouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.

CAPTULO II CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS


Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes.

2. FUNDAMENTOS

Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem emmeios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C.

A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento defungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento. 3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia dealimentos;

gar batata glicose 2%; L(+) cido tartrico 10%; Soluo salina peptonada 0,1%.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Preparo das placas Fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C. Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 mL de soluo de cido tartrico

10% para cada 100 mL de meio. Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL.

Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para cima em

estufa a 50C por cerca de 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo temponecessrio para a completa secagem. 5.2 Pesagem e preparo da amostra

Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidasno Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e deleite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de glicose.

A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, de acordo com o Anexo II,Diluies e solues, deste Manual.

5.3 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

5.4 Inoculao em placas Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose

2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo

cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em

duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.

5.5 Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadorade B.O.D.

5.6 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento defungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos. 6. RESULTADOS

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo como Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.


TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R. Yeasts, moldsand mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em:http://www.cfsan.fda.gov

CAPTULO III

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM

PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT 1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveisem produtos UHT, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadoresde alteraes fsicas, qumicas e organolpticas do produto.

Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis.

Aplica-se a amostras de produtos lcteos lquidos, tratados pelo processo UHT. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 diase posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.

2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em garcrebro-corao e em gar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e posterior identificao dos microrganismos presentes.

2.3 Limitaes do Mtodo: Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meiode cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias nadiluio 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluies subseqentes, o quepode resultar em dados finais estimados. 3. REAGENTES E MATERIAIS


gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; gar uria; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-

dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis); Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Corantes para colorao de Gram; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Preparo da amostra: Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradasdevem ser agitadas por 25 vezes.

Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante eaps com etanol 70% ou etanol 70 GL.

Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se

observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ououtros), interromper a anlise e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias.

As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar oresultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.

5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de soluo salinapeptonada 0,1% at 10-2.

Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluies preparadas(10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata.

Adicionar cerca de 20 mL de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de gar nutriente isento de extrato de levedura.

Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas.

5.4 Incubao: Incubar as placas a 30 1C por 72 horas.

5.5 Leitura: Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e observando

suas caractersticas. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da contagem.Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si,

proceder conforme Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de

ABHI. Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus

sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, comdimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis.

No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes, de coloraoentre branco e bege.

Esta diferenciao necessria porque as colnias de B.sporothermodurans no devem ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao no produto.

Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas

de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que segue:

Repicar 3 a 5 colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72h. Realizar os testes confirmatrios.

5.6 Colorao de Gram Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues constantes do

Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase

conforme item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de

bastonetes Gram positivos, reportar o nmero encontrado como a contagem total demicrorganismos aerbios mesfilos.

5.7 Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipetade Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota deperxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.

A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao deborbulhas indica prova positiva para catalase.

A maioria dos membros do gnero Bacillus apresentam reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a

prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrlise daesculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato e produo de urease, conforme abaixodescrito.

5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico,descartveis e estreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtroimpregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase.

Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podemocorrer.

O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de uma reao positiva.

No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva.

O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva.

5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados eincubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h.

O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose.

5.10 Hidrlise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo garesculina inclinado. Incubar a 36 1C por 72h.

A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.

5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base

adicionados de glicose. Incubar a 36 1C por at 72 horas.

A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao doacar presente.

O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose.

5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de

cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para

reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas

de p de zinco. Nessa situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa,enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade.

O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato a nitrito.

5.13 Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas contendo garuria.

Incubar a 36 1C por 72h. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica

positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease.

6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios

viveis presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV,Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.

O nmero de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans no dever ser reportado como resultado da contagem de mesfilos aerbios.

Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo OBS doCertificado Oficial de Anlise (COA): Presena de Bacillus sporothermodurans.

Somente ser reportado o nmero de unidades formadoras de colnias de outrosmesfilos encontrados.

Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo demicrorganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quandoidentificado(s).

Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT a30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/mL.

Para todos os produtos UHT, o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias a 36 1C deve ser expresso como alterado ou sem alterao. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para

alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G.

Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. p. 759-764.

SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration ofmicroorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),2001. p. 53-62.

MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. FrancesPouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.

CAPTULO IV CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E

DE Clostridium perfringens 1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfito redutores e deClostridium perfringens em alimentos.

Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferroIII, formando um precipitado negro.

2.2 Fermentao tempestuosa: Baseia-se na verificao da fermentao tempestuosa doleite presente no meio leite com ferro, caracterstica do Clostridium perfringens.p.

Essa fermentao caracteriza-se por formao de cogulo bem definido, com grandeformao de gs, durante incubao temperatura seletiva de 46 1C.

2.3 Testes confirmativos: A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade, reduode nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose, fermentao da rafinose e liquefao dagelatina. 3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia dealimentos; Soluo salina peptonada 0,1%;

gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP) -base; gar estoque; gar motilidade - nitrato tamponado;

Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina; Caldo vermelho de fenol-base;

Soluo de rafinose 10% ;

Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi); Meio tioglicolato; Alfa naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Soluo de cicloserina 5%; Polimixina B; Kanamicina; Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida; Gerador de anaerobiose; Reagentes para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com asinstrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1% e homogeneizar poraproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.

5.2 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Inoculao em Placas A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II,

Diluies e solues, deste Manual. A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar

cerca de 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio. Deixar solidificar em superfcie plana.

5.4 Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem

inverter), em jarra de anaerobiose a 36 1C por 18 a 24 horas.

5.5 Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC e no gar SFP.

Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colnias tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium

sulfito redutores presentes por grama da amostra em anlise. Escolher 5 colnias negras e repicar para tubos com gar estoque. Incubar em

anaerobiose a 36 1C por no mnimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato oucaldo de carne cozida (com selo estril de vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leomineral).

5.6 Testes confirmativos para Clostridium perfringens 5.6.1 Colorao de Gram: A partir de cultura pura em gar estoque ou dos meios usados

paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando for verificada apresena de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a provade fermentao tempestuosa.

5.6.2 Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 mL da cultura fresca obtida nomeio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro.Adicionar o selo estril e incubar a 46 1C em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo no apresentar reao claramente positiva).

Alternativamente, pode ser utilizada uma suspenso da cultura em teste, obtida pelalavagem da superfcie do gar estoque com soluo salina peptonada 0,1%, transferindo 1 mLdesta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at 6 horas a 46C, com formao de cogulo firme e grande quantidade de gs (fermentaotempestuosa).

A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na colorao de Gram eofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa, realizar as seguintesprovas:

5.6.3 Prova da motilidade Inocular a cultura, com agulha, em gar motilidade-nitrato tamponado.

Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas. O Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha de

inoculao. 5.6.4 Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao gar 0,5 a

1 mL de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito. Para confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p de zinco. O aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato, enquanto que

a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo do nitrato. O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito. 5.6.5 Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em

vrios pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a sua preparao, regener-lo por

aquecimento a 50C por 2 horas em banhomaria, antes da inoculao. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao, manter os tubos em

geladeira por 1 hora. Observar a fermentao da lactose pela produo de bolhas de gs e pela mudana da

cor do meio de vermelho para amarelo e tambm a liquefao da gelatina por meio dapermanncia do estado lquido aps o resfriamento por cerca de 1 hora em geladeira.

O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a 36 1C. 5.6.6 Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para

fermentao da rafinose. Aps inoculao, adicionar 1 a 2 mL de selo estril: vaspar ou vaselina ou parafina lquida

ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h.

Verificar a fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenolpara amarelo.

As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens.

O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 2h.

CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS Meio motilidade nitrato Meio lactose-gelatina Espcies de Clostridium Motilidade Nitrato cido/ gs Liquefao.gelatinaC. perfringens A - + AG/T + (48h) C.perfringens B - + AG/T + (48/72h) C. absonum + + AG/CS -* C. baratii - + AG/CS - C. celatum - + AG/CS - C. paraperfringens - + AG/CS - C. sardiniense AG/CS -*

A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; -

= negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina 6. RESULTADOS

6.1 Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutores presentes na amostra:

Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colniasnegras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes do Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, desteManual.

6.2 Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes Grampositivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentaotempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 2h, da rafinose emat 72 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 2h.

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes, de acordocom o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.

Expressar o resultado em UFC/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.

LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the MicrobiologicalExamination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. FrancesPouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330.

MacFADDIN, J.F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medicalbacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1985. 928p. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p.

CAPTULO V CONTAGEM DE Staphylococcus aureus


Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus aureus. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. Para os produtos destinados ao comrcio no MERCOSUL, a contagem final se referir

apenas a Staphylococcus coagulase positiva. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em combinaocom 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina.

O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de potssio,produzindo colnias negras.

O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a verificaodas atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus , por meio do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da colnia, respectivamente.

2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular o plasmade coelho pela ao da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.

2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e

tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos

pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de

toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o

perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas.

2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido aofato de que algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reaona prova da coagulase. Alm disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva.

3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos; gar Baird-Parker - base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila; gar estoque; Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com asinstrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte deamostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.

5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos

estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo

com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular, sobre a superfcie seca do gar Baird-Parker, 0,1 mL de cada diluio

selecionada. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo

cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio.

Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtoslquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10o), o que corresponder diluio 10-1.

5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas.

5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias. Contar as colnias tpicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo

claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio. Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com

apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de colnias tpicas e atpicas. Selecionar 3 a 5 colnias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colnia em tubos

contendo BHI, para confirmao. Incubar a 36 1C, por 24 horas. Observao: para a obteno do nmero final de UFC/mL ou g, utilizar, de preferncia,

apenas uma diluio, pois, uma colnia atpica pode tornar-se tpica na diluio subseqente em funo da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competio bacteriana.

5.6 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubosestreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.

Incubar a 36 1C por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o

tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para

Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para

Staphylococcus aureus. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um

tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, paraa realizao dos testes complementares.

5.7 Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar asseguintes provas confirmativas:

5.7.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A

presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testescomplementares.

5.7.2 Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm dedimetro no gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.

Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos.

Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um

halo de clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo dereao positiva para termonuclease.

Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.

5.7.3 Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira

ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir parauma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.

Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para

catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva.

6. RESULTADOS

Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias selecionadas erepicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em considerao a diluio utilizada.

Quando o nmero de colnias confirmadas for diferente do nmero de colniasselecionadas e repicadas, calcular a proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.

O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas. Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL

ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov

BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos deidentidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Divisode Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade deProdutos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p.

GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical andPathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St.Louis, 1994, p. 863-912.

HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256.

LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public HealthAssociation. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403.

MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importanciaclinica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60.

MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p.

PAHO. Organizacin Panamericana de la Salud. Contaminacin microbiana de losalimentos vendidos en la va pblica en ciudades de Amrica Latina y caractersticas socio-economicas de sus vendedores y consumidores. Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al.(Eds.). 1996, 176p.

SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne Toxinoses caused by Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, and Clostridium perfringens. In:

Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. Washington: ASM, 1994, p. 130-140. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens Na illustrated text. London: Wolf

Publishing Ltd, 1991.p. 235-265.

CAPTULO VI CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES

TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais e coliformestermotolerantes em alimentos.

Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes, devendo ser utilizadaquando o limite mximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sobteste em gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colniassuspeitas.

O gar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composio sais biliares ecristal violeta, responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro,um indicador de pH que revela a fermentao da lactose pelos microrganismos presentes.

A adio de sobrecamada visa a preveno do crescimento e do espraiamento de colniasna superfcie do gar.

2.2 Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmao da presena de coliformestotais feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubao a 36 1C.

A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente nomeio.

O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e umcorante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsveis pela inibio de microrganismosGram positivos.

2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena decoliformes termotolerantes feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo EC e posterior incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C, em banho-maria com agitao oucirculao de gua. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactosepresente no meio.

O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere umpoder tamponante impedindo a sua acidificao.

A seletividade devido a presena de sais biliares responsveis pela inibio demicrorganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia dealimentos;

gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);

Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostrade acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem edescarte de amostras", deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.


estabelecidos pelo laboratrio. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs

(mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colnia, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos

os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubadospor mais 24 horas.

5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos

contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com

agitao. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de

gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitadogentilmente.

Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos

os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubadospor mais 24 horas. 6. RESULTADOS

Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformestotais se referem determinao contagem de coliformes a 35C e os resultados da contagemde coliformes termotolerantes correspondem determinao coliformes a 45C.

Para o clculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes, proceder deacordo com as indicaes contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias,deste Manual.

Expressar o resultado em UFC/g ou mL.

7. BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de

identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Divisode Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade deProdutos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p.

ICMSF. Microorganismos de los Alimentos - Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia,Zaragoza, Espanha.

HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.

KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination ofFoods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes &Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.

CAPTULO VII CONTAGEM DE Bacillus cereus


Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus. Aplica-se a matrias primas e alimentos.

2. FUNDAMENTOS

2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob testeem gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA).

Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo de lecitinase pelo B.cereus .

No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdioevidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio.

A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a floraacompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento,poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/mL) como agente seletivo.

Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus . No MYP, o indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.

2.2 Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento emsuperfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina. 3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia dealimentos; Soluo salina peptonada 0,1%;

gar nutriente; gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA);

gar estoque; gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado; gar tirosina; gar motilidade - nitrato; cido sulfanlico soluo 0,8%; Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5%; Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/mL; Emulso de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado; cido actico 5N; Zinco em P; Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina; Reagentes para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem edescarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL da soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.


estabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Inoculao A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas conforme o Anexo II,

Diluies e solues, deste Manual. Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 mL de cada diluio

selecionada. Com auxilio de ala de Drigalski ou basto tipo hockey, espalhar o inculo

cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro. Utilizar, no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou mL

distribuir 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra.

5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas.

5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no

gar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de dimetro e rodeadaspor halo de precipitao de lecitina hidrolizada, no gar PEMBA.

Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de

bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou sub-terminais. Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as

seguintes provas:

5.6 Identificao Bioqumica 5.6.1 Motilidade e reduo de nitrato Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as

mveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a

3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade parareduo de nitrato.

Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramasde p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa,enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade.

O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito. 5.6.2 -hemlise em gar sangue de carneiro. Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro. Incubar a 36 1C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do

Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise. 5.6.3 Decomposio da tirosina: Inocular por estrias a superfcie de gar tirosina (inclinado

em tubo ou distribudo em placas). Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao, observar o aparecimento de uma zona

clara prxima ao crescimento produzida pela decomposio da tirosina. Nos casos em que houver dvidas, reincubar por at 7 dias a 36 1C. O Bacillus cereus decompe a tirosina. 5.6.4 Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente,

depositando o inculo no ponto central da placa. Incubar a 36 1C por 48 a 72 horas. Aps incubao verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizide se caracteriza pelo aparecimento de colnias com longas extenses

em forma de razes ou longos fios, tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas podem

apresentar colnias rugosas em forma de galxia. 5.6.5 Teste para verificao da presena de corpsculos de incluso cristalina. A partir das culturas suspeitas repicadas em gar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas

em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presena de corpsculos de inclusocristalina procedendo conforme item 7 do Anexo VII, Procedimentos de colorao, desteManual.

A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que so liberados somente aps a lise do esporngio. Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres.

O Bacillus cereus no produz corpsculos de incluso cristalina. PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS

DO GNERO Bacillus Bacillus

megaterium Bacillus cereus

Bacillus thuringiensis

Bacillus mycoides

Bacillus anthracis

Colorao de Gram

+ +a + + +

Catalase + + + + + Motilidade b -c - Reduo de nitrato

-d + + +

Hemlise em sangue de carneiro

- + + + -d

Decomp. da tirosina

+ + -d

Corpsc.de incluso cristalina

- - + - -

Crescimento rizide

- - - + -

a: 90 a 100% so positivos b: 50 a 90% so positivos c: 90 a 100% so negativos d: a maioria negativa

6.RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra

em anlise seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem decolnias, deste Manual.

Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nasprovas confirmativas, pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes noAnexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual.


BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p.

BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.). 4.ed.Washington DC: American Public Health Association, 2001, p.311-316

MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importanciaclnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275p.

RHODEHAMEL, E.J. and HARMON, S.M. Bacillus cereus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.

CAPTULO VIII CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS


Estabelecer procedimento para a contagem de Enterobactrias. Aplica-se a amostras de produtos de origem animal.

2. FUNDAMENTOS

2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadasem gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia ahabilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicadapor uma viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias.

A seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio. 3. REAGENTES E MATERIAIS


gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG); gar estoque; Soluo salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-

dimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase; Reativos para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostrade acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem edescarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.



5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e

solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose

previamente fundido e mantido a 46C-48C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente o inculo com o meio e deixar em repouso at total

solidificao. Aps adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar solidificar.

5.4 Incubao: Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posioinvertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas.

5.5 Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias de colorao vermelha, rodeadas ou no por halo de precipitao da

bile presente no meio, com 0,5 a 2 mm de dimetro e anotar os resultados de contagem. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. Realizar a prova da oxidase conforme o item 5.6. 5.6 Prova da oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira

estreis, ou de plstico descartveis estreis, realizar a prova da oxidase espalhando a culturasobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel com reativo paraoxidase, comercialmente disponveis.

Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer.

O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.

No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova da oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.

Todas as enterobactrias apresentam reao de oxidase negativa.

5.7 Colorao de Gram: Das colnias oxidase negativas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, seguindo as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao,deste Manual.

Todas as enterobactrias apresentam-se como bastonetes Gram negativos. 6. RESULTADOS

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.

Expressar o resultado em UFC/g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL, V.R.; JANDA, W.M.; SOMMERS, H.M.; WINN,W.C. Enterobacteriaceae . In: Diagnstico micro-biolgico. Texto y Atlas Color. 3ed. Mxico, D.F.:Editorial Medica Panamericana. 1997, p.203-267.

MAC FADDIN , J.F. Pruebas Bioquimicas para la identificacin de bacterias de importanciaclnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275 p.

VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens-Na illustrated text. London: Wolf

Publishing Ltd. 1991, 557p.

CAPTULO IX NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS

E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM GUA E GELO 1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para determinao do Nmero Mais Provvel de coliformestotais e coliformes termotolerantes em amostras de gua e gelo.

Aplica-se a amostras de gua e de gelo usados em estabelecimentos produtores dealimentos. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio,em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan,produzido pela fermentao da lactose contida no meio.

O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatosque lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio sedeve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.

2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose, na provapresuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubao a 36 1C. Apresena de gs nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao dalactose presente no meio.

O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e umcorante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dosmicrorganismos Gram positivos.

2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao emtemperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. Apresena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio.

O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere umpoder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena desais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS


Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%.

4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua de acordo com as instruescontidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", desteManual.

No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixardescongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completodescongelamento.

Antes do incio da anlise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro de outro

saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob refrigerao, pelo perodonecessrio para seu completo descongelamento. Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo daamostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no analisar a amostra.

Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou emdescongelamento devero ser descartadas.

Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no continhaperfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder anlise, seguindo oprocedimento estabelecido para amostras de gua.

5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficosestabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em uma srie de

3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla. Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril

sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 mL da diluio 10-1 na terceira srie de 3 tubos contendo o mesmo meio.

Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies, proceder de acordocom as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual. Neste caso,inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendocaldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.

Quando o limite de aceitao for

5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na

prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs

(mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.

Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos osresultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados pormais 24 horas.

5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na

prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com

agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de

gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitadogentilmente.

Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos

os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubadospor mais 24 horas. 6. RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaramresultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformestermotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual.

Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/100 mL.


APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20 ed. Washington DC. Clesceri, L.S.; Greenberg, A.E.; Eaton, A.D.; Franson, M.A.H. (Ed.), 1998. p.9.47-9.55.

HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.

KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination ofFoods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes &Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.

CAPTULO X NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS

E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS


Estabelecer procedimento para a determinao do Nmero Mais Provvel de coliformestotais e termotolerantes em alimentos.

Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio,em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan,produzido pela fermentao da lactose contida no meio.

O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatosque lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio sedeve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua namembrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.

2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformestotais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldoverde brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos deDurhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio.

O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dosmicrorganismos Gram positivos.

2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena decoliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao emtemperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. Apresena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio.

O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere umpoder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena desais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS


Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile lactose 2%; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao)

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Produtos slidos e pastosos: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de

acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem edescarte de amostras", deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.1.2 Produtos lquidos: Preparar as amostras de acordo com as instrues contidas no

Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.


5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao 5.3.1.1 Produtos slidos, pastosos e creme de leite pasteurizado: A partir da diluio inicial

(10-1), inocular volumes de 10 mL em srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio emconcentrao dupla (corresponde diluio 10).

A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio inicial (10-1) em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.

A partir da diluio 10-1, preparar a diluio 10-2 em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.

Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podem ser inoculadas em sries de 3

tubos. 5.3.1.2 Produtos lquidos: Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 mL em

uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Transferir tambm 1 mL da amostra para tubo contendo soluo salina peptonada 0,1% de

forma a obter a diluio 10-1.

A partir da diluio10-1, efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.

A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.

Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podero ser inoculadas em sries de 3

tubos. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de

Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.

Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos osresultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados pormais 24 horas.

5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na

prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs

(mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.

Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos osresultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas.

5.4.2 Coliformes Termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na

prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com

agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de

gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente.

Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos osresultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaramresultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformestermotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentosbsicos de contagem, deste Manual.

Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.


HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em:http:// www.cfsan.fda.gov.

KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination ofFoods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes &Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.

CAPTULO XI NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus


Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos.

Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitao determinados pelalegislao encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL.

2. FUNDAMENTOS 2.1 Determinao do NMP: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras

sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona comsal 10%- piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker.

No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo ocrescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se desenvolvernesta condio.

O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio,produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no gar Baird-Parker.

O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a evidenciao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitao e um de transparncia ao redor da colnia.

Prova da coagulase Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de

coelho pela ao da enzima coagulase.

2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e

tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos

pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de

toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o

perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao deborbulhas.

2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido aofato de algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas.

Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva. 3. REAGENTES E MATERIAIS


gar Baird-Parker-base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila; gar estoque; Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol

glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC); Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%;

Soluo de azul de toluidina 1%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Grm.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Alimentos slidos: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues

contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Esta a diluio10-1. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II,

Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio selecionada em trs sries de trs tubos contendo caldo

telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP. Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar,

vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos). 5.1.2 Alimentos lquidos: Pipetar 1 mL diretamente da amostra e tranferir para cada um

dos trs tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP. Transferir tambm 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de soluo salina

peptonada 0,1% (diluio 10-1). A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II,

Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL das duas diluies subseqentes em sries de trs tubos com caldo GC ou

caldo TSB-NP. Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou

parafina lquida, estreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC.


5.3 Incubao: Incubar a 36 1C por 48 horas.

5.4. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento: do meioou precipitado negro em caldo GC e turvao em: caldo TSB-NP.

5.5. Provas confirmatrias: Com pipetas de Pasteur estreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e coloc-la sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker, junto borda da placa, estriando posteriormente com ala, de forma a obter colnias

isoladas. A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de

platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker. Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas. Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou

rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cadacolnia para um tubo contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.

5.5.1 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubosestreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.

Incubar a 36 1C, por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se desprender quando o tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para

Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a provanegativa para Staphylococcus aureus;

Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao dostestes complementares.

5.6 Testes complementares: A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque,realizar as seguintes provas confirmativas:

5.6.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A

presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testescomplementares.

5.6.2 Pesquisa da termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes, com cerca de 2 mm dedimetro, no gar para ensaio da termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.

Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.

O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva paratermonuclease.

Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.

5.6.3 Prova da catalase Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur,

estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa devidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.

Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.

A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva.

6. RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaramresultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Nmero Mais Provvel deacordo com o Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual.

Certificar-se de que a tabela de NMP em uso a indicada para cada caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.


AOAC Official Method 987.09 Staphylococcus aureus in Foods: most probable number method for isolation and enumeration. In: Microbiological Methods. 17 ed., AOAC, Andrews, W.H.(Ed.), cap. 17.5.01, 1998.

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CAPTULO XII NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus


Estabelecer procedimento para a determinao do nmero mais provvel de Vibrio parahaemolyticus.

Aplica-se a amostras de pescado e derivados. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Provas presuntivas 2.1.1 Enriquecimento em caldo seletivo Inoculao em meio de cultura de enriquecimento

seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em

que a presena de Vibrio parahaemolyticus evidenciada pela turvao do meio aps aincubao.

Em sua composio, o meio GSTB apresenta teepol, soluo aquosa de sulfatos de sdioalcalinos primrios que atuam na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos,inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano.

Como o Vibrio parahaemolyticus halfilo obrigatrio, os dois meios contm 3% de cloretode sdio.

2.1.2 Isolamento em gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS) Isolamento se realiza em gar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contm elevada

concentrao de tiossulfato e citrato de sdio, responsveis pela inibio do crescimento dasenterobactrias presentes.

A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando daformao de cido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio.

2.2 Provas de identificao: A identificao de Vibrio parahaemolyticus feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas, morfolgicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS


gar Meller-Hinton sal 3%; gar nutriente sal 3%; gar gelatina sal 3%; gar soja triptona sal 3%; gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS); gar ferro trs acares (TSI) sal 3% ou gar Kligler sal 3%; gar motilidade sal 3%; Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB); Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo peptonado sal 8%; Caldo peptonado sal 10%; Caldo ONPG sal 3%; Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%; Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%; Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%; Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%; Soluo salina peptonada 0,1% sal 3%; Soluo fisiolgica (NaCl 0,85%); Agente vibriosttico O 129 10g ; Agente vibriosttico O 129 150 g; Arabinose; L-arginina;

L-lisina; Manitol; Sacarose; leo mineral ou parafina lquida estreis; Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-

parafenileno-diamina); Teepol; O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo; Etanol 96%; Reagentes para colorao de Gram.

4. EQUIPAMENTOS


5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas noAnexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.

Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.



5.3 Provas presuntivas 5.3.1 Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10-1),

efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duasdiluies) de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, desteManual.

Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB.

5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas. 5.3.3 Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio

parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao.

5.3.4 Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS) 5.3.4.1 Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem

agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citratosacarose sais biliares (TCBS).

5.3.4.2 Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul

esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem. 5.4 Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para

tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.

Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.4.1 Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder

colorao de Gram de acordo com as instrues descritas no Anexo VII, Procedimentos decolorao, deste manual.

O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.

5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldopeptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contend

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