Influência da suplementação de colágeno V bovino na ... · Suplementação de Colágeno V em ratos com artrite induzida Silvana Ramos Atayde A Deus pela fé que me mantém viva

SILVANA RAMOS ATAYDE

Influência da suplementação de colágeno V bovino na inflamação e

remodelamento da matriz extracelular na artrite induzida em ratos

São Paulo

2016

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Patologia

Orientadora: Profa. Dra. Vera Luiza Capelozzi

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Atayde, Silvana Ramos Influência da suplementação de colágeno V bovino na inflamação e remodelamento da matriz extracelular na artrite induzida em ratos / Silvana Ramos Atayde. -- São Paulo, 2016.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Patologia.

Orientadora: Vera Luiza Capelozzi. Descritores: 1.Artrite experimental 2.Ratos 3.Colágeno 4.Suplementação

alimentar 5.Inflamação 6.Matriz extracelular

USP/FM/DBD-384/16

Ao meu avô Benedito Alves de Moraes (in memoria),

por sempre acreditar, confiar e ser meu exemplo de vida.

Aos meus pais, Otávio Atayde e Aparecida Ramos Atayde, por suas histórias de sucesso na educação dos filhos, diante de todas as

adversidades.

Aos meus sobrinhos, Gabriel, Mariana, Felipe e Lucas motivo de entusiasmo e alegria de viver.

Aos meus irmãos Sergio Roberto Atayde, Sandra Ramos Atayde e Sonia

Maria Atayde Ruis, e meus cunhados Janaína e David pelo incentivo e ajuda nos momentos de ansiedade.

AGRADECIMENTOS

Agradecimentos

Suplementação de Colágeno V em ratos com artrite induzida Silvana Ramos Atayde

A Deus pela fé que me mantém viva de modo honesto no trabalho e no estudo.

A Dra. Professora Walcy Rosolia Teodoro, sou inteiramente grata por essa orientação que ultrapassa a tese, bem como o imenso carinho nos momentos de dificuldade. Agradeço, sobretudo, o privilégio de haver trabalhado em um tema para o qual você tanto vem contribuindo com novas perspectivas.

A Professora Dra. Vera Capelozzi na qualidade de orientadora, um agradecimento todo especial por sua permanente solicitude em todas as fases do projeto, pela paciência, pela maneira carinhosa de ser. Muito obrigada por sua amizade.

A Dra Ana Paula Velosa agradeço por sua constante presença, e as ricas

orientações a esse trabalho, assim como sua compreensão nos passos do meu aprendizado.

Ao Dr Ricardo Fuller, agradeço por todos os ensinamentos transmitidos durante a pós-graduação.

A Priscila Cristina Andrade, agradeço pelo auxilio e companhia que foram

necessários para realização deste trabalho.

Aos pesquisadores Sérgio Catanozi, Antônio Santos Filho, pelos ensinamentos particulares que cada área.

Aos amigos pesquisadores do laboratório de Matriz extracelular, Isabele Camargo Brindo da Cruz, Lais Araújo dos Santos, Isadora Begalli Mendes, Verônica Protocevich Toledo, José Eduardo Rodrigues, Jurandir Tomaz de Miranda, sempre tão dedicados. Com certeza, sem essa cumplicidade e carinho teria sido mais difícil. Meu muitíssimo obrigada pelas múltiplas e inestimáveis contribuições. Vocês são lembranças muito felizes de uma época inesquecível.

As minhas amigas da ETEC Getúlio Vargas por me apoiarem e me

incentivarem na elaboração dos meus estudos, que foi decisivo para o meu crescimento profissional.

A todos meus familiares e amigos,

“Eu aprendi. Que sou mais forte que imaginava... Que posso ir mais longe depois de pensar que não podia...

Que realmente a vida tem valor e eu tenho valor diante da vida! ” Veronica Shoffstall

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 01

1.1. Processo inflamatório articular: aspectos gerais 02

1.2. Sinóvia 04 1.2.1. Sinovite 06 1.3. Artrite Reumatóide 10 1.4. Modelos experimentais de artrite e inflamação articular 15 1.5. Colágeno 17 1.5.1. Colágeno tipo V 22 1.5.2. Colágeno tipo V em processos patológicos 26 1.6. Suplementação 28

2.OBJETIVOS 32

2.1. Objetivo Geral 32

2.2. Objetivos Especificos 32

3. MÉTODOS 33

3.1. Extração e isolamento do ColV 34

3.2. Caracterização do ColV bovino por Imunoblot 35 3.2.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 35 3.2.2. Transferência das bandas de colágeno para membrana de nitrocelulose 35 3.2.3. Imunoblot 35 3.3. Desenvolvimentos do modelo experimental 37 3.3.1. Animais 37 3.3.2. Indução da Inflamação Articular 37 3.3.3. Protocolo de Suplementação com Colágeno V 38 3.4. Microscopia óptica 40 3.4.1. Imunohistoquímica para de Linfócitos, Macrófagos e Interleucinas 40 3.4.2. Quantificação de Linfócitos, Macrófagos e Interleucinas 41 3.5. Avaliação do colágeno no tecido sinovial 43 3.5.1. Avaliação do colágeno total por análise de imagem 43 3.5.2. Imunofluorescência para colágeno do tipo I 44 3.6. Dosagem de citocinas no soro 46 3.6.1. Análise estatística 47

4. RESULTADOS 48

5. DISCUSSÃO 70

6. CONCLUSÕES 82

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 84

APÊNDICE 106

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% Porcentagem

l Microlitro

µm Micrômetro

AA Artrite por Adjuvante

AR Artrite Reumatoide

Caspase Cysteine asparagil specific proteases

CAPPesq Comitê de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa

CD3 Linfócito T

CD20 Linfócito B

CD68 Marcador de macrófago e monócitos

CEP-FMUSP Comissão de Ética em Pesquisa-Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo

CFA Adjuvante Completo de Freund

CGRP Calcitonin Gene Related Peptide

COLI Colágeno tipo I

COLIII Colágeno tipo III

COLV Colágeno tipo V

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ET AL. E colaboradores

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

H&E Hematoxilina & Eosina

IFN Interferon

IL Interleucina

MALT Tecido linfoide secundário associado a mucosa

mBSA Albumina Metilada Sérica

MEC Matriz extracelular

mM Mili molar

mm Milímetro

MMP Metaloproteinase

nm Nanômetro

PBS Tampão Fosfato Salino

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride.

Th Células T

Treg Células T regulatórias

LISTA DE FIGURAS E TABELA

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Representação do tecido sinovial e seus componentes na estrutura articular do joelho 05

Figura 02 Representação esquematica de uma articulação acometida pelo processo de sinovite e 09

componentes celulares envolvidos

Figura 03. Principais células, citocinas e auto-anticorpos envolvidos na patogênese da AR 13

Figura 04. Esquema ilustrativo da tripla hélice do colágeno 18

Figura 05. Famílias e tipos de colágeno e suas estruturas supramoleculares 20

Figura 06. Diagrama esquemático da biossíntese dos colágenos fibrilares. 21

Figura 07. Estrutura do Colágeno tipo V 24

Figura 08. Desenho esquemático da interação dos colágenos I e V nas fibrilas heterotípicas. 25

Figura 09. Imunoblot para o colágeno tipo V padrão comercial e colágeno tipo V extraído de 36

placenta bovina

Figura 10. Contenção e introdução de sonda orogastrica metálica entre a boca e o apêndice 38

xifoide do animal para realização da suplementação (gavagem)

Figura 11. Esquema dos grupos de estudo com indução de artrite e suplementação com COLV 39

Figura 12. Imagem representativa da análise de imagens pelo software Image-Pro Plus 6.0

44

Figura 13. Células inflamatórias em coloração H & E, imunoexpressão de fibras de colágeno

51

em coloração Picrosirius

Figura 14. Gráficos de quantificação do infiltrado inflamatório, edema e das fibras de colágeno 54

finas e grossas nos grupos de animais.

Figura 15. Imunofluorescência para colágeno dos tipos I e V no tecido sinovial dos grupos de 56

animais.

Figura 16. Gráficos de quantificação da expressão de colágeno tipo I e colágeno V nos grupos 57

dos grupos de animais.

Figura 17. Imunoexpressão de CD3 +, CD20 + e CD68 no tecido sinovial dos grupos de animais. 59

Figura 18. Gráficos de quantificação da expressão de CD3 +, CD20 + e CD68 no tecido 61

sinovial dos grupos de animais.

Figura 19 - Imunoexpressão de interleucinas IL1 β+ e IL10 no tecido sinovial dos grupos nos 63

grupos de animais.

Figura 20. Gráficos de quantificação da expressão de interleucinas IL1 β+ e IL10 tecido 64

sinovial nos grupos de animais

Figura 21. Gráficos do perfil de citocinas IL1 β+ e IL10, TNFα e IL17 no soro dos grupos 65

de animais

Figura 22. Imunoexpressão de MMP2 e Caspase-9 no tecido sinovial dos grupos de animais 67

Figura 23. Representação Gráfica de imunoexpressão de MMP2 e Caspase 9 nos grupos de 69

animais.

LISTA DE TABELA

Tabela 1 Distribuição histológica e imunohistoquímicas de acordo com os grupos ......................53

RESUMO

Resumo


Resumo

Atayde SR. Influência da suplementação de colágeno V bovino na inflamação e

remodelamento da matriz extracelular na artrite induzida em ratos [Tese]. São Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2016

Considerando que o colágeno tipo V (Col V) pode ser exposto em processos de

remodelamento tecidual, gerando autoimunidade em diversas patologias, postulamos

que a administração oral de Col V possa modular a inflamação e remodelamento da

sinovite articular experimental, evitando a destruição articular. Neste estudo a artrite foi

induzida em ratos Lewis, machos com aproximadamente 250g, por injeção intra-

articular de 500 µg de albumina de soro bovino metilada (mBSA) emulsificada em

adjuvante de Freund completo (ACF) (10 µl), seguido por reforços intra-articulares de

mBSA (500 ug) em solução salina (50 µl), após 7 e 14 dias da primeira injeção (grupo

com artrite induzida; AI). Animais sem indução de artrite receberam solução salina (50

ml) por via intra-articular (grupo controle; CT). Após a primeira injeção de

mBSA/ACF, a suplementação de Col V bovino (300µl/500µg) foi administrada por via

oral nos animais com AI, durante 15 e 30 (AI-ColV15, n=10; AI-ColV30, n=10 ) dias e

nos animais CT por 30 (CT-ColV30, n=10) dias. Nossos dados demonstraram que após

15 e 30 dias, a administração oral de Col V levou à diminuição do edema e infiltrado

inflamatório severo, conteúdo total de fibras de colágeno, colágeno tipo I, subpopulação

de linfócitos, macrófagos, IL-1β, IL-10 e metaloproteinase 2 no tecido sinovial, e

redução IL-1β, TNFα, IL-17 e IL-10 no soro. Ocorreu maior expressão de caspase 9 no

tecido sinovial dos animais que receberam o Col V. Pode-se concluir que a

suplementação com Col V bovino reduziu a inflamação sinovial e resposta fibrótica

independentemente do tempo, possivelmente por aumento da apoptose das células

inflamatórias.

Resumo


Descritores: artrite experimental; ratos; colágeno; suplementação alimentar;

inflamação; matriz extracelular.

SUMMARY

Summary


Atayde SR. Influence of bovine Collagen type V supplementation on inflammation

and remodeling of extracellular matrix in arthritis induced in rats [Thesis]. São

Paulo: "Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo"; 2016.

Whereas type V collagen (Col V) can be exposed in tissue remodeling process,

leading to autoimmunity in various pathologies, we postulate that the oral

administration Col V can modulate inflammation and remodeling of joint experimental

synovitis, preventing joint destruction. In this study, arthritis was induced in Lewis male

rats of approximately 250g, by intra-articular injection of 500 µg serum albumin

methylated from bovine serum (mBSA) (500 µg) emulsified in complete Freund's

adjuvant (CFA) (10 µl), followed by stiffeners intraarticular of mBSA (500 µg) in saline

(50 µl) after 7 and 14 days from the first injection (group induced arthritis; AI). Animals

received no arthritis induction brine (50 µl) by intraarticular (control group; CT). After

the first injection of mBSA / CFA supplementation Col V bovine (300μl / 500μg) was

administered orally in animals with AI for 15 and 30 (AI-ColV15, n = 10, I-ColV30, n =

10) days and animals CT per 30 (CT-ColV30, n = 10) days. Our data showed that after

15 and 30 days, oral administration of Col V led to the reduction of edema and severe

inflammatory infiltrate, total content of collagen fibers, collagen type I, subpopulation

of lymphocytes, macrophages, IL-1β, IL-10 and metalloproteinase 2 in synovial tissue

and reduced the IL-1β, TNFα, and IL-17 IL-10 serum. There increased expression of

caspase-9 in the synovial tissue of animals receiving Col V. It can be concluded that

supplementation with bovine Col V reduced synovial inflammation and fibrotic

response regardless of time, possibly by increased apoptosis of inflammatory cells.

Descriptors: arthritis, experimental; rats; collagen; supplementary feeding;

inflammation; extracellular matrix.

1. INTRODUÇÃO

Introdução 2


1.1 PROCESSO INFLAMATÓRIO ARTICULAR: ASPECTOS GERAIS

O processo inflamatório articular, descrito genericamente como Artrite, atinge as

articulações sinoviais do organismo. É caracterizado tipicamente pela presença da

inflamação dolorosa local, ocasionando limitação ou perda da função do local envolvido

(McInnes e O’Dell, 2010; Bellucci et al., 2016). Atualmente, são descritos mais de 100

tipos de artrite, sendo a osteoartrite (OA) e a artrite reumatoide (AR) as mais estudadas.

Diferentemente da OA, que se destaca por ser a mais comum das afecções reumáticas ,

atingindo aproximadamente um quinto da população mundial, a AR gera grande interesse

por ser a mais severa (Alamanos et al, 2006; Bellucci et al., 2016). Existem, ainda, vários

outros tipos de artrite, como por exemplo: gota, lúpus, síndrome de Reiter e etc. Apesar

de terem mecanismos fisiopatológicos diferentes, todos os tipos de artrite apresentam

como principais sintomas a rigidez, dor, inchaço e restrição dos movimentos nas

articulações afetadas (Moreira e Carvalho, 2004; Alamanos et al., 2006; McInnes e

O’Dell, 2010).

A etiologia dos tipos de artrite, onde não há fator autoimune associado, ainda é

desconhecida, embora se acredite que fatores genéticos possam estar envolvidos. No

entanto, as chances de desenvolver artrite aumentam quando se associam fatores de risco

como: a obesidade; a sobrecarga articular e as lesões prévias e recidivas, como nas

atividades desportivas de alto rendimento e nas atividades laborais repetitivas. No que se

refere às artrites de carácter autoimune, a etiologia normalmente deve-se a uma falha no

sistema imunológico, que induz as células de defesa do organismo a não reconhecerem

os antígenos próprios, tornando-os alvo dos mecanismos de autoimunidade, podendo

3 Introdução

Silvana Ramos Atayde Suplementação de Colágeno V em ratos com artrite induzida

estar relacionada a uma herança genética (Moreira e Carvalho, 2004; Cieza e Stucki,

2005; Alamanos et al., 2006; Bellucci et al., 2016).

De maneira geral, englobando os tipos de artrite, estudos radiológicos

demonstraram que a frequência da artrite gira em torno de 5% em indivíduos com menos

de 30 anos e, atinge 70% a 80% naqueles com mais de 65 anos. Contudo, somente 20%

a 30% dos portadores de alterações radiológicas apresentam sintomas da doença.

Particularmente na articulação do joelho, evidenciou-se que 52% da população adulta

apresentam sinais radiológicos da doença e somente 20% apresenta alterações

consideradas graves ou moderadas. A incidência desta patologia aumenta com a idade,

atingindo 85% da população até os 64 anos sendo que, aos 85 anos ela é universal. Seu

impacto social e seu grau de incapacidade é tão importante que motivou a Organização

Mundial de Saúde a criar a Década do Osso e da Articulação em 2010 (OMS, 2000;

Klarenbeek et al., 2010).

Neste sentido, diversos estudos na literatura mundial têm buscado métodos para

uma propedêutica clínica satisfatória através de ensaios experimentais, por propiciarem

de maneira precoce, a avaliação das estruturas fundamentais da articulação. Ainda,

apresentam a finalidade de estabelecer a intervenção terapêutica e farmacológica nas

alterações funcionais e sintomatológicas apresentadas pelos pacientes portadores destas

patologias. Exatamente por isso, a sinóvia tem sido o tecido-alvo dos grandes centros de

pesquisas na atualidade, principalmente, por suas características e importância na

composição articular.

Introdução 4


1.2. SINÓVIA

A sinóvia é a principal estrutura acometida nas doenças inflamatórias articulares

(Cruvinel, et al., 2010). Esta é um dos componentes das articulações móveis do

organismo, as quais têm como principal função a união dos ossos adjacentes,

possibilitando o movimento. As articulações são também formadas por outras estruturas,

como: a capsula articular ou membrana fibrosa, que envolve a extremidade dos ossos; a

cavidade articular, delimitada pela cápsula articular e preenchida pelo líquido sinovia l;

cartilagem articular, que reveste os ossos subcondrais; ligamentos e discos e meniscos

(Figura 1A).

A sinóvia é a camada mais interna da capsula articular, formada pela membrana

sinovial, que consiste em uma fina camada de células de revestimento, com cerca de 50nm

em humanos, composta por macrófagos, sinoviócitos, adipócitos, mastócitos, fibras

nervosas, células endoteliais vasculares, ocasionalmente linfócitos e capilares

fenestrados, que repousam em uma matriz especializada conhecida como íntima e

subíntima.

A camada íntima contém dois tipos de células: as do tipo A, originárias da medula

óssea, que expressam os marcadores de macrófagos, incluindo CD68 e CD14, e as células

do tipo B, sinoviócitos funcionalmente semelhantes a fibroblastos, envolvidas na síntese

do colágeno (Edwards, 1995; Smith, Walker, 2011). A camada íntima está associada a

uma matriz fibrilar fina ou amorfa com fibras de colágeno ausentes ou intermitentes,

apoiada sobre uma tela mais espessa (~100 nm) de tecido conjuntivo frouxo, chamado

subsinovial, que inclui um sistema extensivo de vasos linfáticos e moléculas

transportadas. Ao lado destas fibras, existe um tecido conjuntivo frouxo relativamente

5 Introdução


rico em colágeno, bastante distensível, adjacente aos ligamentos, tendões, periósteo ou

outras estruturas fibrosas que permite à membrana movimentar-se livremente (Edwards,

1995; Cruvinel, et al., 2010; Smith, Walker, 2011) (Figura 1B)

Figura 1. Representação do tecido sinovial e seus componentes na estrutura articular do joelho (Adaptada da Wikipédia, enciclopédia livre; http://slideplayer.com.br/slide/355099/)

O líquido sinovial das articulações, normalmente funciona como um lubrificante

biológico, bem como um suporte bioquímico, através do qual nutrientes e citocinas

reguladoras podem atravessar e chegar à superfície articular (Figura 1). As células da

membrana sinovial formam uma camada descontínua, separada por espaços intercelula res

de diversos mícrons de largura. A matriz extracelular desse tecido é composta

principalmente por colágeno tipo I, III, IV, V e VI, além de sulfato de condroitina,

proteoglicanos e fibronectina (Edwards, 1995; Chang, Wu, 2006; Blewis et al., 2007).

Em condições patológicas, como nos processos patológicos inflamatór io s,

Introdução 6


observa-se a presença de infiltrados celulares, assim como a produção de citocinas,

enzimas e outras proteínas biologicamente relevantes, desencadeando um estado

denominado sinovite (Linsenmayer, 1991; Levick, 1995; Smith et al., 2003; Chen et al.,

2008).

1.2.1. Sinovite

Na sinovite, o evento principal é o processo inflamatório agudo, iniciado na

membrana sinovial com infiltrado de linfócitos e macrófagos (Klimiuk et al., 1999;

Dorner, Burmester, 2003). Esta inflamação possui características bem definidas como

vasodilatação, aumento da permeabilidade, recrutamento e ativação de leucócitos. A

vasodilatação é induzida por mediadores químicos como histamina e é a causa do eritema

e estase do fluxo sanguíneo. O aumento da permeabilidade vascular é induzido pelas

histaminas, cininas e outros mediadores que aumentam a permeabilidade das células

endoteliais. Este processo pode ser por lesão endotelial direta, pelo aumento da passagem

de líquidos através do endotélio ou induzida por leucócitos. O aumento de fluxo permite

a entrada de leucócitos e proteínas plasmáticas nos locais da infecção ou da lesão do

tecido, resultando em edema local devido ao extravasamento do líquido dos vasos

sanguíneos (Bogliolo, 2000; Robbins et al., 2005).

Neste processo agudo observa-se predomínio de neutrófilos no infilt rado

inflamatório, que são posteriormente substituídos pelos macrófagos (Guidugli, 1997;

Bogliolo, 2000; Robbins et al., 2005). Além das células inflamatórias, várias substâncias

são produzidas e liberadas concomitante e sequencialmente nos locais da lesão,

provenientes do plasma ou de células em resposta ao fator desencadeante, e são

7 Introdução


denominados mediadores de resposta inflamatória (Lopes, Amato, 2006). Como

mediadores da resposta inflamatória destacam-se:

A histamina, importante vasodilatador que está entre as primeiras substâncias a

serem liberadas no processo agudo em resposta a vários estímulos;

A serotonina, outro mediador da fase aguda da inflamação, com função similar à

histamina;

As prostaglandinas e leucotrienos, produzidos pelos mastócitos, macrófagos e

células endoteliais e muitos outros tipos de células, estão envolvidos em reações

vasculares e sistêmicas da inflamação, assim como no aumento da permeabilidade

vascular;

O Fator ativador de plaquetas (PAF), que além da agregação plaquetária, é

conhecido por múltiplos efeitos inflamatórios;

Os radicais livres derivados de oxigênio, que são espécies reativas de oxigênio

(ROS; reative oxygen species), que podem ser liberados extracelularmente pelos

leucócitos após a exposição microbiana, ou por imunocomplementos, ou após

estimulo fagocítico e agem amplificando a resposta inflamatória;

O Óxido Nítrico (NO; Nitric oxide), mediador que possui um mecanismo endógeno

para controle das respostas inflamatórias;

As citocinas, proteínas produzidas por vários tipos de células, que modulam

funções da resposta imune. Estas proteínas tem um papel importante, tanto na

resposta inflamatória aguda, como na crônica. Dentre as citocinas que estão

envolvidas na modulação da resposta inflamatória, temos o Fator de Necrose

Tumoral (TNF), Interleucina 1 (IL-1) e 6 (IL-6) e fator de transformação de

crescimento beta (TGF-β);

Introdução 8


As quimiocinas, substâncias químicas produzidas por diversos grupos de linfócitos ,

que tem a função de atrair células inflamatórias para a região lesada;

O sistema complemento, composto por proteínas plasmáticas que opsonizam

partículas, como os micróbios, facilitando a fagocitose e destruição por macrófagos.

Além disso, contribuem para a resposta inflamatória, aumentando a permeabilidade

vascular e a quimiotaxia dos leucócitos, regulando funções efetoras da imunidade

humoral e inflamação (Bogliolo, 2000; Dorner, Burmester, 2003; Robbins et al.,

2005).

Após processo inflamatório lesivo, o tecido sinovial pode adquirir uma estrutura

similar ao de tecidos linfóides terciários, com predomínio de linfócitos T CD4+. A

hiperplasia das células sinoviais (células do tipo B), o infiltrado linfocitário e a

neoangiogênese levam à formação do pannus (tecido sinovial proliferado), que atinge o

osso subcondral e, em seguida, a cartilagem articular, com destruição progressiva

(Edwards, 1995). As perdas focais de osso marginal e subcondral contribuem

decisivamente para a morbidade dos diferentes tipos de artrite (Figura 2). Estudos em

tecidos humanos e provenientes de modelos animais apontam o osteoclasto como a

principal célula envolvida neste processo. A ativação e o recrutamento de tais células são

influenciados por citocinas e mediadores inflamatórios. Apesar da identificação de mais

de 100 tipos diferentes de citocinas, quimiocinas e outros fatores envolvidos na

patogênese da artrite, o TNF-α continua ocupando lugar de destaque na doença erosiva

da articulação, por meio da ativação dos osteoclastos (Klimiuk et al., 1999; Dorner,

Burmester, 2003). Ainda, a produção de citocinas, predominantemente as pró-

inflamatórias, tem papel fundamental na iniciação e perpetuação da inflamação crônica

na membrana sinovial. A resposta de linfócitos T do tipo 1 (Th1) gera a produção de

interferon-gama (IFN-γ), que estimula a liberação de TNF- α, IL-1β e matriz

9 Introdução


metaloproteinases (MMPs) pelos macrófagos e fibroblastos sinoviais (Klimiuk et al.,

1999; Bogliolo, 2000; Dorner, Burmester, 2003).

Adicionalmente, ROS e nitrogênio também têm papel importante na patogênese dos

processos inflamatórios articulares. ROS, como o superóxido, peróxido de hidrogênio,

radicais hidroxila e ácido hipocloroso, bem como radicais reativos de nitrogênio, como

NO e peroxinitrito, contribuem significativamente para o dano, o qual tem sido associado

ao remodelamento anormal das fibras de colágenos, as quais se depositam em número

exacerbado e de maneira desorganizada, afetando a estrutura do tecido envolvido

(Guidugli, 1997; Dorner , Burmester, 2003; Lopes, Amato, 2006).

Figura 2. Representação esquemática de uma articulação acometida pelo processo de sinovite e

componentes celulares envolvidos.

Osteoclasto

Fibroblasto

Macrófago

Células dendríticas

Linfócitos T

Plasmócitos

Linfócitos B

Extensiva

angiogênese

Hiperplasia da

membrana sinovial

Mastócitos

Pannus

Neutrófilos

Introdução 10


1.3. ARTRITE REUMATÓIDE

A AR é uma doença crônica, autoimune sistêmica, que está associada

primariamente com a inflamação e lesão da articulação sinovial, e com o tempo, perda da

função articular. Entre as doenças inflamatórias crônicas das articulações, a AR é a mais

frequente, com prevalência de 0,5-1% da população, sendo três vezes mais comum em

mulheres (Alamanos et al., 2006, Bellucci et al., 2016). Acomete todas as raças, com

discretas variações em gravidade e manifestações clínicas (Cieza e Stucki, 2005).

O processo inflamatório sistêmico que caracteriza a doença, pode se manifesta r

pelo acometimento de múltiplos órgãos como serosas, pulmões e vasos sanguíneos,

entretanto o principal alvo é a membrana sinovial. As articulações são afetadas de maneira

simétrica e aditiva, particularmente as pequenas juntas de mãos e pés, embora qualquer

articulação sinovial possa ser comprometida (Cieza e Stucki, 2005).

A etiologia da AR ainda é desconhecida (Cieza e Stucki, 2005), porém a

patogênese é considerada um processo que envolve várias etapas, podendo se iniciar fora

da articulação (Boissier et al., 2012; Minichiello et al., 2016). O processo inicial envolve

a ativação de células do sistema imune inato, como neutrófilos, macrófagos residentes e

células dendríticas por um ou mais fatores ambientais, levando à ativação da cascata

inflamatória, bem como ao processamento e apresentação de um ou mais auto-antígenos

para as células do sistema imune adaptativo (Boissier et al., 2012; Minichiello et al.,

2016). As modificações pós-translacionais de proteínas, denominadas citrulinação

(desaminação de um resíduo de arginina em citrulina) e carbamilação (transformação de

um grupo amina em um carbomil), podem gerar antígenos que desencadeiam ativação

11 Introdução


imune persistente de linfócitos T em indivíduos com susceptibilidade genética (Yamada

et al., 2003; Minichiello et al., 2016). Em algumas populações, a AR pode estar associada

ao polimorfismo para genes, como o HLA-DRB1, PTNP22, CTLA4 e STAT4 (Boissier

et al., 2012).

O ponto marcante da resposta imune é a produção de autoanticorpos pelos

linfócitos B, como a fator reumatoide (FR) e anticorpos antipeptídeos citrulinados

cíclicos (CCP), que têm uma prevalência de 70-80% e 90%, respectivamente, nos

pacientes com AR (Brzustewicz, Bryl, 2015) (Figura 3). Nas fases mais tardias, as

células imunes interagem com as células endoteliais e estroma para infiltrar a articulação.

As células T regulatórias (Treg), não conseguem conter o processo inflamatório articular

persistente, caracterizado por produção de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas,

anticorpos e MMPs. Este microambiente inflamatório é caracterizado por baixa tensão de

oxigênio, e ativa angiogênese (Semerano et al., 2011; Minichiello et al., 2016). Assim, a

inflamação e angiogênese cooperam para promover e suportar a proliferação de

fibroblastos sinoviais (células do tipo B) que formam o pannus, uma membrana celular

espessada de tecido fibrovascular, que invade a cartilagem e o osso subcondral

(Minichiello et al., 2016).

Na AR, o perfil de secreção de citocinas na sinóvia muda com a progressão da

doença. Nas fases mais iniciais, as citocinas dominantes são IL-2, IL-4, IL-13, IL-17 e

IL-15, já em fases mais estabelecidas da AR, predominam o INFγ, TNF e IL-10, com

pouca ou ausente expressão de IL-2, IL-4, IL-5 e IL-13 (Cope, 2008; Brzustewicz B, et

al., 2015).

O TNF tem um papel central na patogênese da AR. Esta citocina media direta ou

indiretamente a ativação de leucócitos, a adesão, migração e ativação endotelial, a

Introdução 12


angiogênese, a expressão de quimiocinas, e juntamente o RANKL (membro da

superfamília de ligantes do TNF), contribui para a ativação da função efetora de

osteoclastos (McInnes et al., 2016) (Figura 3). Outra citocina de grande importância na

patogênese da AR é a IL-6, produzida principalmente por macrófagos e sinovióc itos

(Células do tipo B). Esta induz a expressão de quimiocinas por células endoteliais, ativa

linfócitos T e B e osteoclastos (Figura 3). Ainda, muitos dos caminhos efetores que

aumentam os sintomas da AR são potencializados pela IL-1, frequentemente em sinergia

com o TNF, desencadeando a síntese de prostanóides e ativação de condrócitos e

sinoviócitos (Células do tipo B) (Brzustewicz &, Bryl, 2015, McInnes et al., 2016). Entre

as citocinas pró-inflamatórias, a IL-17, produzida por linfócitos Th17, também é

encontrada na sinóvia com AR. O envolvimento desta citocina na inflamação, inclui a

indução de migração de neutrófilos para a articulação, potencialização da produção de

IL-1, TNFα e MMPs, como a MMP-2 (Brzustewicz &, Bryl, 2015) (Figura 3).

Por outro lado, na membrana sinovial com AR parece ocorrer uma resposta anti-

inflamatória compensatória, o qual inclui principalmente as citocinas IL4, IL-10 e TGF-

β. A IL4 e IL-10 inibem a produção de citocinas pró-inflamatórias, como INF-γ, TNFα,

IL-15 e IL-1, mas diferentemente da IL-4, na AR a IL-10 está presente num nível

significante na membrana e líquido sinovial. A IL-10 é produzida por linfócitos T e B,

monócitos e macrófagos. O papel dos grandes níveis de IL-10 no curso da inflamação

aguda é controlar o grau de inflamação, ou mesmo parar este processo (Brzustewicz &,

Bryl, 2015). Entretanto, na AR, geralmente o desbalanço entre as citocinas pró-

inflamatórias e anti-inflamatórias contribui para a cronicidade da inflamação. Em suma,

as citocinas pró-inflamatórias inibem a síntese de proteoglicanos e colágeno e aumentam

sua degradação pelas MMPs e colagenases que promovem destruição de cartilagem

(Moreira e Carvalho, 2004).

13 Introdução


Figura 3 – Principais células, citocinas e auto-anticorpos envolvidos na patogênese da AR.

A AR pode acometer qualquer uma das 68 articulações sinoviais do organismo.

Desde o início, o quadro clínico, caracterizado por dor e edema das articulações, é

poliarticular, envolvendo especialmente as pequenas articulações de mãos e pés (70% dos

casos). Entretanto, em um terço dos pacientes, a doença pode estar limitada a uma ou

duas articulações, geralmente um ou ambos os joelhos. Outra manifestação clinica é a

rigidez articular (enrijecimento), percebida principalmente pela manhã, após o período de

inatividade noturna (rigidez matinal), melhorando com a movimentação (Cieza e Stucki,

2005).

Introdução 14


O tratamento para AR sofreu muitas mudanças ao longo dos anos. Os

glicocorticoides, anti-inflamatórios não esteroides e alguns fármacos modificadores da

doença antirreumática (DMARDs) se apresentavam, inicialmente, como as únicas opções

terapêuticas para controle da doença. Porém, nas últimas duas décadas os avanços

terapêuticos têm sido consideráveis, com o desenvolvimento do tratamento com os

agentes biológicos, para bloqueio de citocinas pró-inflamatórias ou modulação da função

de linfócitos, seguido pelo desenvolvimento de pequenas moléculas para alvos de

sinalização intracelular. No entanto, apenas uma minoria dos pacientes obtém remissão

da doença, especialmente a longo prazo, deste modo mais investigações são necessárias

para avaliação mais precisa destas opções terapêuticas mais recentes (Semerano et al.,

2016).

15 Introdução


1.4 MODELOS EXPERIMENTAIS DE ARTRITE E INFLAMAÇÃO

ARTICULAR

Diversos modelos experimentais têm sido utilizados na avaliação de drogas e

tratamentos que modulam a inflamação articular. Estes modelos se assemelham à doença

humana, permitindo o estudo de eventos comuns, como a permeabilidade vascular, a

migração celular, a dor e a hiperplasia sinovial (Gallin, 1993). Destacam-se entre os

modelos utilizados:

Artrite induzida por zymozan (Zy) - O Zy é um polissacarídeo derivado da parede

celular do fungo Saccharomyces cerevisae, que induz reação inflamatória quando

injetado na articulação (Gallin, 1993). Os mecanismos de desenvolvimento de processo

inflamatório são múltiplos, incluindo: ativação da via alternativa do sistema

complemento; granulação de mastócitos com aminas vasoativas, como a serotonina e

histamina; estimulação de macrófagos e neutrófilos, para a liberação de mediadores

inflamatórios (Bogliolo, 2000; Robbins et al., 2005), e degradação da cartilagem articular

e do osso subcondral na fase crônica da artrite (Brackertz et al., 1977).

Artrite induzida por Colágeno II (CIA; Collagen Induced Arthritis) - A CIA é

desencadeada pela injeção de colágeno tipo II, emulsificado em adjuvante incompleto de

Freud. As limitações principais são a especificidade ao antígeno de indução e a

dificuldade em se estabelecer o início da lesão, o que limita a observação do efeito de

intervenções (Trentman et al., 1977).

Artrite induzida por antígeno - A artrite induzida por albumina bovina sérica metilada

(mBSA) é associada ao adjuvante de Freund, que é usado para desencadear a resposta

Introdução 16


imune. Neste modelo é possível determinar precisamente o início da artrite,

demonstrando se há expressão de anticorpos na membrana sinovial, presença de depósitos

de imunocomplexos e complemento nos tecidos, semelhante a AR humana, entre outras

características histológicas (Griffiths, 1992).

Monoartrite induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA; Complete Freund

Adjuvant) - Este modelo de inflamação articular é realizado através de injeção intra -

articular de CFA. Este modelo produz uma monoartrite unilateral na região articular, cuja

inflamação é observada após quatro semanas, seguida de hipertrofia sinovial, infiltração

de células mononucleares, exsudado no líquido sinovial e formação de pannus no tecido

sinovial, obtendo-se características típicas de uma artrite generalizada (Prakken et al.,

2002; Barton et al., 2006; Kanai et al., 2007; Fernandes et al., 2011).

O tipo de resposta observada em modelos de imunização e reforço com o antígeno

é referida como uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia. Esta é iniciada após a

apresentação do antígeno por células apresentadoras de antígenos (APCs), via complexo

de histocompatibilidade principal (MHC) classe II, para os linfócitos T com receptores

específicos para o antígeno, que são os responsáveis por desencadear a resposta imune de

citocinas (Brackertz et al., 1977; Trentman et al., 1977; Gallin, 1993). A utilização de

mBSA desencadeia infiltrado com grande quantidade de neutrófilos e linfócitos T CD4+

nas articulações, sendo ideal para estudos de reações inflamatórias e entendimento de

processos que envolvem as estruturas lesionadas, além das respostas do organismo às

terapêuticas implementadas (Brackertz et al., 1977; Trentman et al., 1977; Barton et al.,

2006; Fernandes et al., 2011).

17 Introdução


1.5 COLÁGENO

O colágeno é uma glicoproteína de importância fundamental na constituição da

matriz extracelular (MEC) da maioria dos tecidos, assim como na sinóvia, sendo

responsável por grande parte das propriedades físicas teciduais. As características

biomecânicas dos tecidos resultam da organização dos colágenos em macromoléculas que

fornecem não apenas suporte, mas apresentam importante papel funcional. Sabe-se que

além de atuar como suporte, o colágeno também participa na diferenciação, adesão,

migração e proliferação celular. Essa proteína também pode exercer atividade antigênica,

variando de acordo com o tipo de colágeno e órgão envolvido (Prockop et al., 1979; Gelse

et al., 2003).

Até o momento, são descritos 28 tipos de colágeno em vertebrados, numerados com

algarismos romanos (I-XXVIII) (Ricard-Blum, 2011). As moléculas de colágeno são

formadas pelo entrelaçamento de três cadeias polipeptídicas, denominadas cadeias ,

arranjadas numa conformação de tripla hélice, que se estabiliza por pontes de hidrogênio

intercadeia, conferindo à molécula alta estabilidade, rigidez e forma de bastão (Figura 4)

(D'Arcangelo et al, 1994). As cadeias podem ser idênticas (homotriméricas) ou distintas

(heterotriméricas), sendo essas últimas mais frequentes (D'Arcangelo et al, 1994).

As cadeias α do colágeno podem variar em tamanho, desde 662 até 3152

aminoácidos, e cada uma delas possui uma sequência de aminoácidos característ ica

(D'Arcangelo et al, 1994; Shoulders, Raines, 2009), e uma série de repetições da

sequência de aminoácidos Glicina-X-Y, na qual X é frequentemente prolina e Y,

hidroxiprolina (Prockop et al., 1979) (Figura 4). As cadeias possuem sequências

adicionais de 15 a 20 aminoácidos que não fazem parte da tríplice hélice e são

Introdução 18


denominadas de telopeptídeos, também conhecidos como extensão não colagenosa (NC)

da molécula. Existem duas extensões, a aminoterminal (NH2) e carboxiterminal (COOH).

Há evidências de que o domínio COOH contém informações essenciais para a formação

da tríplice hélice, enquanto o NH2-terminal apresenta dados importantes para a regulação

final do diâmetro das fibrilas (Prockop et al., 1979; Alberts et al., 1994).

Figura 4 Esquema ilustrativo da tripla hélice do colágeno. Em (a) a primeira estrutura cristalina de alta

resolução de uma tripla hélice do colágeno formado a partir de (ProHypGly)4 - (ProHypAla) -

(ProHypGly)5. Em (b) observa-se o eixo de uma tripla hélice (ProProGly)10 com três linhas preenchidas

observada como uma fita. Em (c) nota-se a tripla hélice destacando-se a ligação com hidrogênio. Observam-

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2846778/figur

19 Introdução


se em (d) os três tipos de ligação para esse papel de formação do colágeno. Fonte: Adaptado de Shoulders

e Raines, (2009) .

Os colágenos podem ser divididos em subfamílias, com base na sua estrutura

supramolecular: colágenos fibrilares, que possuem a tripla hélice ininterrupta (colágeno

tipo I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII); formadores de rede (colágeno tipo IV, VIII, X);

associados a fibrilas com tripla hélice interrompida (FACITs; IX, XII, XIV, XVI, XIX,

XX, XXI, XXII); associados à membrana com tripla hélice interrompida (MACITS; XIII,

XVII, XIII, XXV), fibrilas de ancoragem (VII), colágenos que formam filamentos

bandeados (VI, XXVI, XXVIII) e MULTIPLEXINs (XV, XVIII) (Gelse et al., 2003;

Ricard-Blum, 2011; Achilias et al., 2016) (Figura 5).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Raines%20RT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19344236

Introdução 20


Figura 5 – Famílias e tipos de colágeno e suas estruturas supramoleculares. Baseado em Achilleas et al.,

2016.

A biossíntese do colágeno é extensivamente estudada em colágenos que formam

fibrilas, que são sintetizados como moléculas de pró-colágeno, formadas por um

propeptídeo NH2-terminal, seguido por um curto N-telopeptídeo não helicoidal, uma

tripla hélice central, um C-telopeptídeo e um propeptídeo COOH-terminal (Ricard-Blum,

2011). No processo de biossíntese, há diversas etapas bioquímicas que se iniciam no

núcleo com a transcrição gênica, estimulada por fatores de crescimento, incluindo o TGF-

β (D'Arcangelo et al, 1994). Após a tradução, as cadeias pró-α sofrem várias modificações

pós-translacionais no retículo endoplasmático rugoso, tais como hidroxilação dos

Grupos Microfibrila Fibrila de colágeno

Fibra de colágeno

Dímero

Tetramero

Monômero

Rede

Fibrilas de colágeno I (XII ou XIV Fibrilas de colágeno II (IX)

Citoplasma

N-terminal NC

C-terminal

N-terminal NCGlobular C-terminal

Endostatina

Tetrâmero Filamentos bandeados

Filbrilas de ancoragem

Colágenos fibrilares

Colágenos que formam

rede

Fibrilas de ancoragem

Colágenos que formam filamentos bandeados

21 Introdução


resíduos de prolina e lisina e posterior glicosilação dos resíduos de lisina e hidroxilis ina,

sendo essa última fundamental para a formação das pontes cruzadas intramoleculares de

hidrogênio (Gelse et al., 2003; Prockop et al., 1979; Ricard-Blum, 2011; Shoulders,

Raines, 2009).

No retículo endoplasmático rugoso, após a solvatação dos resíduos de tirosina, as

três cadeias alfas entrelaçam-se formando as moléculas em forma de tripla hélice,

estabilizadas por pontes de hidrogênio. Essas moléculas de pró-colágeno são

empacotadas no complexo de Golgi e secretadas na matriz extracelular em forma de pró-

colágeno (Figura 6) (Alberts et al., 2010; Smith et al., 1986).

Figura 6. Diagrama esquemático da biossíntese dos colágenos fibrilares. 1) As cadeias pró-alfa são

sintetizadas no lúmen do retículo endoplasmático. 2) As cadeias sofrem hidroxilação de alguns resíduos de

prolina e lisina. Em seguida, as hidroxilisinas sofrem glicação ou glicosilação e as três cadeias pró-alfa

entrelaçam-se formando a tripla hélice de pró-colágeno, que é empacotado no complexo de Golgi e

secretado; 3) No espaço extracelular, os pró-peptídeos amino e carboxi-terminal são clivados e as moléculas

recém-formadas de colágeno agregam-se, originando as fibrilas. 4) A união das fibrilas formam as fibras de colágeno (Bachinger et al., 2010).

Introdução 22


Em geral, após secreção na matriz extracelular, os pró-peptídeos NH2- e COOH-

terminais são removidos das cadeias α pelas enzimas NH2- e COOH-proteinase. Esse

processo resulta em uma molécula nativa de tripla hélice, com dimensões aproxima das

de 300nm de comprimento e 1,5nm de diâmetro, a qual retém os telopeptídeos curtos,

com poucos aminoácidos. No processo de fibrilogênese, as moléculas de colágeno

agregam-se segundo uma orientação cabeça-cauda, formando as fibrilas de colágeno

(Smith et al., 1986; Prockop et al., 1979; Gelse et al., 2003Alberts et al., 2010).

Apresentam um padrão de bandeamento com uma periodicidade que varia de 64nm a

67nm e, quando analisadas por microscopia eletrônica, revelam a presença característ ica

de bandas claras e escuras (Bruckner, 2010).

1.5.1. Colágeno tipo V

O colágeno tipo V (Col V) é ubiquamente distribuído, sendo encontrado na

maioria dos tecidos. Esse tipo de colágeno caracteriza-se por compor diferentes

isoformas, das quais a mais frequente é a heterotrimérica [α1(V)]2, α2(V)], que está

presente no interstício de órgãos, como pele (Konomi et al., 1984), pulmão (Konomi et

al., 1984), esôfago, rins, sinóvia, estroma da córnea e outros (Konomi et al., 1984;

Linsenmayer et al., 1990). A isoforma heterotrimérica, com três cadeias distintas α1(V)

α2(V) α3(V), é encontrada na placenta humana e bovina e a homotrimérica [α1(V)]3 no

endométrio de camundongos e região da interface dermo-epidérmica (Chung et al., 1974;

Bonod-Bidaud et al., 2012).

O Col V é quantitativamente o menor componente nos tecidos, variando de 2 a

5% do total de fibras de colágeno. Similar aos outros colágenos fibrilares, o Col V é

sintetizado na forma de pró-colágeno com os NH2- e COOH- pró-peptídeos termina is.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Linsenmayer%20TF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2159749

23 Introdução


Porém, no ambiente extracelular, enquanto os domínios COOH- pró-peptídeos termina is

das cadeias α são clivados, por carboxipeptidases, e o domínio globular NH2- pró-

peptídeo terminal da cadeia α2(V), por amino-peptidases, o domínio globular NH2- pró-

peptídeo terminal da cadeia α1(V) é retido (Figura 7 A). Esta característica diferencia o

Col V de outros colágenos fibrilares, como os tipos I e III, sendo atualmente considerado

pertencente à subclasse de colágenos fibrilares reguladores, caracterizados por

transformação incompleta do NH2-propeptídeo (Figura 7 A, B) (Linsenmayer et al.,

1990; Gelse et al., 2003; Gopalakrishnan et al., 2004).


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gopalakrishnan%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15136578

Introdução 24


Figura 7. Estrutura do Colágeno tipo V. A) Colágeno V formado por três cadeias α. A estrutura dos

domínios das cadeias α juntamente com o número de aminoácidos (aa) para a cadeia α1. Todas as cadeias

contêm o pró-peptídeo C-terminal (NC1 ). Uma pequena porção da sequência não colagenosa (C-

telopeptídeo) permanece na extremidade C-terminal. O domínio colagenoso (COL1) é composto por uma

sequência de Gly-X-Y. O (COL2) é o domínio N-terminal que está separado do domínio COL1 por um

domínio não colágeno (NC2). Nas cadeias α1 e α3 o domínio N-terminal (NC3) é composto por um domínio

PARP (prolina e arginina) e um domínio variável VAR . Os locais de clivagem das N- e C-proteinase

estão indicadas (↓). B) A estrutura da isoforma mais comumente encontrada do colágeno V [α1(V)]2 α2(V)

é apresentada. C) Formação das fibrilas heterotípicas de colágenos I e V. O colágeno tipo I forma um

arcabouço da fibrila e o colágeno tipo V, que retém um domínio globular N-terminal, localiza-se no interior

da fibrila. Esse domínio globular, voltado para o exterior da fibrila, impede a agregação de mais moléculas

de colágeno e, desse modo, regula o diâmetro das fibrilas heterotípicas. Fonte: Adaptado de Smith , Birk , (2012).

O Col V se copolimeriza com os tipos I e III para formar fibrilas heterotíp icas

(I/III/V), sendo o responsável pela regulação da fibrilogênese e por nucleação das fibrilas

de colágeno em formação (Figura 7C e Figura 8) (Konomi et al., 1984; Birk et al., 1990;

Birk, 2001; Bruckner, 2010). A porção tripla hélice helicoidal da molécula de Col V

encontra-se oculta no interior destas fibrilas e o domínio globular NH2- terminal da

cadeia α1(V) se projeta para a superfície (Figura 7C e Figura 8) (Birk, 2001; Bachinger

et al., 2010). Este domínio regula o diâmetro fibrilar, impedindo fisicamente que novos

monômeros se acrescentem à fibrila (Birk, 2001; Bachinger et al., 2010).

Quantidades variáveis de Col V interferem no diâmetro das fibrilas heterotípicas.

Assim, tecidos com menos Col V têm fibrilas com diâmetro maior e tecidos com mais

Col V, como a córnea ou humor vítreo, têm fibrilas mais finas (Konomi et al., 1984;

Linsenmayer et al., 1990; Linsenmayer, 1993) (Figura 8B). Estudos demonstram que o

diâmetro das fibrilas parece ser inversamente proporcional à flexibilidade molecular do

colágeno (Linsenmayer, 1993; Birk, 2001; Bachinger et al., 2010).

Enquanto a cadeia α1(V) está relacionada com a regulação do diâmetro das fibrilas

heterotípicas, a α2(V) é importante na regulação da fibrilogênese (Linsenmayer, 1993;

Birk, 2001; Wenstrup, Florer, 2004). A função e a expressão da cadeia α3(V) ainda é

desconhecida.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Smith%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20705069

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Birk%20DE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20705069


25 Introdução


O Col V apresenta uma série de características peculiares. Devido à retenção do

NH2- pró-peptídeo terminal, região reconhecida como possuindo alta imunogenicidade,

esse colágeno é mais imunogênico que os outros fibrilares (Konomi et al., 1984; Birk et

al., 1990; Gopalakrishnan et al., 2004;). As propriedades do Col V de adesão, migração e

proliferação celular estão em grande parte relacionadas às sequências RGD (arginina,

glicina e ácido aspártico), presentes em maior quantidade na cadeia α2(V) que na α1(V)

(Ruggiero et al., 1994). A adesão do Col V às células é mediada principalmente pelas

integrinas α1β1 e α2β1, que são receptores presentes nas membranas das células e

dependem da conformação em tripla hélice do colágeno (Ruggiero et al., 1994; Ruggiero

et al., 1996).

Figura 8. Desenho esquemático da interação do colágeno dos tipos I, III e V nas fibrilas heterotípicas (A).

Influência da concentração de Col V na determinação do diâmetro das fibrilas heterotípicas (B). Fonte:

Adaptado de Birk, (1990).


Introdução 26


A adesão do Col V às células pode também ocorrer independentemente das

sequências RGD. Nesse aspecto, foi demonstrado que a porção tripla hélice da cadeia

α1(V) possui um fragmento de 30 Kd, que contém um agrupamento de resíduos de

aminoácidos básicos, com grande afinidade à heparina e ao sulfato de heparina (Yaoi et

al.,1990; Delacoux et al., 1998). Desse modo, este sítio do Col V ligante da heparina

interage com os proteoglicanos de sulfato de heparan na superfície das células,

desencadeando sinais de estimulação celular, além de interagir com o heparan sulfato na

MEC dos tecidos (Yaoi et al.,1990; Delacoux et al., 1998).

1.5.2. Colágeno tipo V em processos patológicos

O Col V tem sido associado à autoimunidade em processos patológicos como a

rejeição de transplante de pulmão em modelo murino e em humanos, em transplante de

coração, fibrose pulmonar idiopática, asma de hipersensibilidade, aterosclerose e

esclerodermia experimental (Sumpter,; Mares et al., 2000; Wilkes et al., 2001; Teodoro

et al., 2004; Wilkes, 2004; Callado et al., 2007; Dart et al., 2010; Vittal et al., 2013 Lott

et al., 2013). Trabalhos recentes têm demonstrado que a autoimunidade para o Col V é

direcionada para a cadeia α1(V). Em pacientes com rejeição de transplante de pulmão

foram identificadas células Th1 e Th17 específicas para alguns epítopos da cadeia α1(V),

que induzem um perfil de citocinas pró-inflamatório (Tiriveedhi et al., 2011). Vários

estudos têm demonstrado que a tolerância pela via das mucosas (oral/nasal) com o Col V

diminui o processo inflamatório e remodelamento tecidual em vários destes processos

patológicos (Mares et al., 2000; Wilkes et al., 2001; Sumpter, Wilkes, 2004; Teodoro et

al., 2004; Callado et al., 2007; Dart et al., 2010; Vittal et al., 2013; Lott et al., 2013). Mais

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yaoi%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476



27 Introdução


recentemente, um ensaio clínico fase-1 demonstrou que pacientes com fibrose pulmonar

idiopática, quando submetidos à imunoterapia com uma solução oral de Col V (0,5-1,0

mg) diariamente por 24 semanas, tiveram uma estabilização da função pulmonar (Wilkes

et al., 2015). Estes autores partiram do pressuposto de que a fibrose pulmonar idiopática

possui características autoimunes resultantes da injúria pulmonar, o qual poderia expor

proteínas normalmente ocultas, tais como o Col V, tornando-o um neoantígeno.

Até o presente momento, não se sabe qual a importância do Col V no processo

patológico da sinovite, observado nas articulações com Artrite, sendo de fundamenta l

importância a compreensão da relação desta proteína com os eventos celulares e

proteicos, onde ocorrem, como se desencadeiam e a evolução do processo, assim como

os mediadores implicados (Klimiuk et al., 1999; Dorner, Burmester, 2003). Sabe-se que

atualmente os tratamentos de distúrbios inflamatórios sinoviais se baseiam,

principalmente, na utilização de fármacos citotóxicos que agem na proliferação de células

e promovem diversos efeitos colaterais (Chighizola et al., 2014). Neste aspecto, a

tentativa de se utilizar a suplementação com Col V para auxílio na diminuição do processo

inflamatório parece ser promissora e com o mínimo de toxicidade.

Introdução 28


1.6 SUPLEMENTAÇÃO

A nutrição corresponde aos processos gerais de ingestão e conversão de

substâncias alimentícias em nutrientes que podem ser utilizadas para manter a função

orgânica. Esses processos envolvem nutrientes que podem ser utilizados com finalidade

energética (carboidratos, lipídios e proteínas), para a construção e reparo dos tecidos

(proteínas, lipídios e minerais), para a construção e manutenção do sistema esquelético

(cálcio, fósforo e proteínas) e para regular a fisiologia corpórea (vitaminas, minera is,

lipídios e água). Quando os nutrientes se apresentam em quantidades ótimas, a saúde e o

bem-estar do indivíduo são maximizados (Wolinsky, Hickson, 1996; Maham, Escott-

Stump, 2012).

Doenças inflamatórias, tais como a artrite reumatóide, apresentam envolvimento

multiorgânico e frequentemente são acompanhadas por implicações nutricionais, que

podem causar comprometimento do estado nutricional (Henderson et al., 1994; Bellucc i

et al., 2016). A importância do estado nutricional de pacientes com artrite reumatóide foi

relatada por Alarcon et al (1985), e o seu comprometimento parece estar associado a

maior atividade da doença; tendo sido observada a recuperação do peso corporal nos

períodos de remissão da doença. Prevenção de problemas no estado nutricional e

consequentemente agravo da patologia foram observados por meio de suplementação

alimentar (Lowell, White, 1990).

Suplemento alimentar é todo alimento ou substância que se destina a fornecer

macro e micronutrientes à dieta de um indivíduo, além das necessidades normais, não

podendo ser utilizado como alimentação exclusiva (Wu J et al., 2004; Maham, Escott-

Stump, 2012). Diversos nutrientes são utilizados como suplementos para auxilio no

29 Introdução


tratamento de processos inflamatórios, como por exemplo, as proteínas do soro do leite,

que possuem em sua composição atividade biológica que excede as propriedades de uma

boa fonte de aminoácidos. Foi demonstrado em estudos de cultura de células e em

modelos animais que estas proteínas têm a capacidade de modular a função imune (Cross,

Gill, 1999). Outros suplementos são abundantemente utilizados: a vitamina C é um

antioxidante hidrossolúvel capaz de regenerar o radical tocoferoxil. Assim diferentes

pesquisadores avaliaram a influência da suplementação com vitamina C no estresse

oxidativo (Goldfarb et al., 2005; Collamati et al., 2016). A glutamina é um aminoác ido

não-essencial, sendo considerada essencial em situações clínicas com demanda

aumentada, tais como: procedimentos cirúrgicos, câncer e sepse. A suplementação de

glutamina enteral ou parenteral resulta em aumento da espessura e do volume proteico da

mucosa intestinal. Alguns estudos avaliaram a influência da glutamina na anastomose

intestinal (Souba, 1991, Vicentini et al., 2016; Shu X et al., 2016).

Especificamente o colágeno, na forma hidrolisada, é utilizado devido às suas

propriedades terapêuticas no tratamento de doenças dos ossos e das articulações, tais

como a osteoartrite e a osteoporose (Bello, 2006). O colágeno e suas frações apresentam

importantes funções na alimentação humana, pois é fonte de proteína animal (Moskowitz,

2000). Durante o processo de digestão o colágeno e as demais proteínas ingeridas não

sofrem modificações químicas na boca, sendo apenas reduzidas a partículas menores. No

estômago, as proteínas e polipeptídios são desnaturados por ação do HCl e hidrolisadas

pela pepsina. A digestão no estômago representa apenas 10-20% da digestão total

proteica. A maior parte desta digestão ocorre no lúmen do duodeno e jejuno, sob a

influência do suco pancreático, processando-se, quase completamente no íleo termina l.

No intestino delgado, a enteropeptidase, em pH neutro, ativa o tripsinogênio à tripsina

que, por sua vez, promove a ativação das outras propeptidases do suco pancreático.

Introdução 30


Ocorre, então, a hidrólise luminal de proteínas e polipeptídios, produzindo aminoác idos

(AA) livres e pequenos peptídios com 2-6 AA. Os AA e pequenos peptídeos, produtos da

hidrólise luminal, são então hidrolisados pelas peptidases da borda em escova a AA, di e

tripeptídios que são absorvidos, principalmente, no jejuno proximal (Moskowitz, 2000).

Contudo, é estimado que aproximadamente 2% das proteínas da dieta diária são

absorvidas intactas (Oesser, 2003).

Tendo em vista que o Col V apresenta características bioquímicas e imunológicas

singulares, participa de diferentes processos patológicos inclusive inflamatórios e já foi

utilizada como imunoterapia em fibrose idiopática em humanos, a proposta deste estudo

foi analisar a importância do Col V nas sinovites e sua relação com os eventos celulares

e proteicos. Ainda, avaliar o papel da suplementação com Col V bovino na modulação da

inflamação e no remodelamento do tecido sinovial em modelo experimental de artrite.

2. OBJETIVO

Objetivo 32


2.1 OBJETIVO GERAL

Estabelecer um modelo experimental de inflamação articular, e a seguir avaliar o efeito

da suplementação com Col V bovino na modulação da inflamação e no remodelamento

do tecido sinovial em ratos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para se estudar o efeito da suplementação com Col V bovino na modulação da

inflamação e no remodelamento do tecido sinovial serão realizadas: a análise morfológica

e quantitativa da sinovite; caracterização da resposta imune celular na sinóvia,

recrutamento de macrófagos e linfócitos no tecido sinovial, perfil de citocinas no tecido

e no soro, analise morfológica e quantitativa do colágeno dos tipos I e V no tecido,

metaloproteinase-2 no tecido sinovial e análise da caspase-9, para avaliar a apoptose

celular antes e após a suplementação com Col V bovino em ratos com inflamação

articular induzida.

3. MÉTODOS

Métodos 34


3.1 EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO DO COLV

Para o isolamento do Col V utilizamos placentas bovinas de animais normais,

doadas pelo abatedouro Joaquim de Oliveira Ldta, localizado em Tatuí, na Rua Vicente

Manoel Oliveira nº450, sob a responsabilidade do médico veterinário do local.

Aproximadamente acima da 24ª semana gestacional, as placentas foram coletadas no

momento do abate dos animais e mantidas a -18°C após a retirada. Para o transporte até

a Faculdade de Medicina as placentas foram mantidas em caixa térmica, para evitar o

descongelamento. Inicialmente, as placentas foram lavadas com solução salina gelada e

porções de cerca de 30g de tecido fresco foram seccionados e lavados em solução de

EDTA 50mM, contendo inibidor de proteases (PMSF 5mM) para preservação da

estrutura proteica. Posteriormente, o material foi homogeneizado em homogeneizador de

tecidos e centrifugado a 15.000 rpm por 30 minutos. O tecido foi pesado e submetido à

digestão com pepsina de estômago de porco (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EUA),

na proporção de 1:10 (1g de pepsina/10g de tecido), em Ácido acético 0,5M, pH 2,5, por

16h a 4°C, sob agitação. Após digestão enzimática, o material foi centrifugado a 15.000

rpm durante 1h a 4°C. Para isolamento do colágeno por gradiente sequencial salino o

sobrenadante foi precipitado com Cloreto de sódio 0,9 e 1,2M. Na concentração de 0,9M

foram precipitados os colágenos dos tipos I e III e a 1,2M o Col V. O precipitado de Col

V foi diluído em ácido acético 0,01N e dialisado contra água destilada até a amostra

atingir pH neutro. As amostras obtidas foram congeladas a -18°C, liofilizadas a -50°C e

estocadas em freezer -20°C, para serem utilizadas posteriormente.

35 Métodos


3.2. CARACTERIZAÇÃO DO COLV BOVINO POR IMUNOBLOT

3.2.1 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Para a eletroforese, o Col V extraído de placenta bovina foi diluído em ácido

acético 0,01 N na proporção de 1 mg de proteína para 200µl do ácido. O tampão de

amostra (SDS 10%, glicerina 10%, azul de bromofenol 20% e 2-mercaptoetanol) foi

acrescentado ao colágeno para posterior aquecimento a 100oC, por 3 minutos. Em cada

poço do gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 7,5% foram aplicados cerca 40µg de

colágeno em tampão da amostra. Em seguida foi realizada a eletroforese em tampão de

corrida tris glicina 0,19M, em pH 8,5 e SDS 0,1%, a 4ºC, sob corrente elétrica constante

de 100 volts por cerca de 90 minutos.

3.2.2 Transferência das bandas de colágeno para membrana de nitrocelulose

Após a eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% em presença de SDS, as

amostras foram eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose em tampão de

transferência (Tris-glicina e Metanol 10%) pH=8,3, por 60 minutos a 100V.

3.2.3 Imunoblot

Para verificar a especificidade e pureza do Col V de placenta bovina, os sítios

inespecíficos da membrana de nitrocelulose foram bloqueados com solução de leite em

pó desnatado 5% em fosfato de sódio tamponado (PBS), por 90 min a temperatura

ambiente, sob agitação constante. Após lavagem com PBS 2x de 10 min, as membranas

Métodos 36


foram incubadas por 60 min, a temperatura ambiente, sob agitação constante, com os

seguintes anticorpos: anticorpo policlonal de coelho anticolágeno tipo I (Rockland),

anticorpo monoclonal de camundongo anticolágeno tipo III (Calbiochem) e anticorpo

policlonal de coelho anticolágeno tipo V (Teodoro et al., 2004), diluídos a 1:600, 1:100

e 1:100, respectivamente, em PBS.

Após o período de incubação, as membranas foram lavadas por três vezes de 10

minutos com PBS com Tween20 0,1%. Posteriormente, foram incubadas com os

anticorpos de cabra anti-IgG de coelho 1:1.000 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) e anti-

IgG de camundongo 1:1.000 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) conjugados com fosfatase

alcalina, durante uma hora a temperatura ambiente. Após outro ciclo de lavagens, a reação

foi revelada usando como substratos o NBT (nitrobluetetrazolium; Bio Rad) e o BCIP

(bromocloroindolilfosfato; Bio Rad), diluídos em tampão Tris 0,03M e MgCl 1M,

pH=9,5 (Figura 7).

Figura 09: Imunoblot para o Col V padrão comercial (Sigma Chemical, St. Louis, MO) e Col V extraído

de placenta bovina por gradiente sequencial salino com cloreto de sódio 1,2M.

α1(V)

α2(V)α3(V)

Col V Placenta bovina

PadrãoCol V Sigma

Col V Placenta bovina

Padrão Peso Molecular

250 Kd

140 Kd

100 Kd

37 Métodos


3.3 DESENVOLVIMENTOS DO MODELO EXPERIMENTAL

3.3.1 Animais

O trabalho foi desenvolvido após aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa,

CEP-FMUSP-149/13, da Diretoria Clínica da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo.

Para o desenvolvimento deste projeto foram utilizados 40 ratos Lewis, machos,

com peso médio de 200 - 250g, os quais foram obtidos no Biotério Central da Faculdade

de Medicina da USP. Durante o período de realização dos experimentos, os animais foram

mantidos no Biotério de Manutenção e Experimentação e da Clínica Médica da FMUSP,

com ciclo de 12 h claro/12 h escuro, à temperatura de 22 ± 2oC, recebendo água e ração

padronizada ad libitum.

3.3.2 Indução da Inflamação Articular

A artrite foi induzida através de injeção intra-articular da emulsão de 500µg de

mBSA (Sigma Chemical, St. Louis, MO) em 10 µl de adjuvante completo de Freund

(Sigma Chemical, St. Louis, MO), no joelho direito dos animais. Após 7 e 14 dias foram

injetados, por via intra-articular, no mesmo joelho, 500 µg de mBSA em 50 µl de solução

salina (AI; grupo com artrite induzida, n=30). Nos animais do grupo controle sem artrite,

injetou-se 50 µl de solução salina, por via intra-articular, no joelho direito (CT; grupo

controle, n=10). Todos os animais foram mantidos por um período de 30 dias. A eutanásia

foi realizada em câmara de CO2, de acordo com as normas de ética em experimentação

animal.

Métodos 38


3.3.3. Protocolo de Suplementação com Col V

Para a suplementação com Col V, os ratos foram contidos e uma sonda orogástrica

metálica rígida, acoplada a uma seringa de 1 ml, foi introduzida até o ponto

correspondente à distância entre a boca e o apêndice xifóide dos animais (Figura 10).

Figura 10: Contenção e introdução de sonda orogástrica metálica rígida entre a boca e o apêndice xifóide do animal para realização da suplementação.

A concentração de 500µg de Col V/300 µl de ácido acético 0,01N foi administrada

nos grupos de animais com AI e suplementados com AI, AI-ColV15, AI-ColV30 e CT-ColV30,

como segue abaixo (Figura 11):

Grupo AI-ColV15 (n=10): Artrite induzida por mBSA/adjuvante completo de Freund e

suplementação com 500µg de Col V, por via oral, a partir do primeiro dia até 15 dias após

a indução de artrite.

Grupo AI-ColV30 (n=10): Artrite induzida por mBSA/adjuvante completo de Freund e

suplementação com 500µg de Col V, por via oral, a partir do primeiro dia até 30 dias após

a indução de artrite.

39 Métodos


Grupo AI (n=10): Artrite induzida por mBSA/adjuvante completo de Freund e sem

suplementação (controle com artrite).

Grupo CT-ColV30 (n=10): Injeção intra-articular de solução salina e suplementação

diária com 500µg de Col V via oral, por 30 dias.

Figura 11- Esquema dos grupos de estudo com indução de artrite e suplementação com Col V.

Métodos 40


3.4. MICROSCOPIA ÓPTICA

O tecido sinovial coletado para análise histológica foi fixado em formol 10%,

durante aproximadamente 24 horas. Após este período, as amostras do tecido foram

envolvidas por papel de seda, para garantir melhor disposição espacial, incluídas em

parafina e posteriormente submetidas às técnicas histológicas de rotina. Foram realizados

10 cortes com 4-5 µm de espessura e um espaço de 50µm entre eles. Posteriormente,

foram corados pela hematoxilina eosina (H&E). Para avaliação do conteúdo de colágeno

tecidual em microscópio óptico e luz polarizada, as amostras foram coradas pelo

Picrossirius, preparado a partir de Sirius red 0,2%, em solução saturada de ácido pícrico

(Direct Red 80, C. I. 35780, Aldrich, Milwaukee, WI).

3.4.1 Imunohistoquímica para Linfócitos, Macrófagos e Interleucinas

A imunohistoquímica foi realizada para avaliação dos linfócitos T e B,

macrófagos, IL-1beta e IL-10, através do método da biotina-estreptoavidina-peroxidase.

Resumidamente, cortes de tecido sinovial de 3-4µm foram desparafinizadas e bloqueadas

em uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,3%, por cerca de 4 a 5 minutos para inib ir

a atividade da peroxidase endógena. Os anticorpos utilizados nas reações de

imunohistoquímica foram os seguintes: anticorpo policlonal de coelho anti-CD3 (1:700;

Santa Cruz Biotechnology Inc.), anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD20

(1:600; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anticorpo monoclonal de camundongo anti-

CD68 (1:3.200; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anticorpo monoclonal de camundongo

anti-IL-1 beta (1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc.) e anticorpo monoclonal de

41 Métodos


camundongo anti-IL-10 (1:50; Santa Cruz Biotechnology Inc.). A recuperação antigênica

foi realizada com solução tampão de citrato pH 6,0 em alta temperatura, 125°C por 1

minuto, numa panela de pressão (Pascal). Os cortes foram incubadas com o anticorpo

primário durante a noite a 4ºC. A reação foi revelada com um Kit de biotina-

estreptoavidina-peroxidase, de acordo com as instruções do fabricante. A 3,3

diaminobenzidina (Sigma Chemical, St. Louis, MO) foi utilizada como cromogénio. Os

cortes foram contra-coradas com hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha

HE). Para controles negativos, o anticorpo primário foi substituído por PBS.

3.4.2 Quantificação de Linfócitos, Macrófagos e Interleucinas

Para quantificar as células imunomarcadas foi utilizado o método estereológico

de contagem de pontos de acordo com Gundersen et al. (1988), com modificaçãoes,

utilizando um sistema de análise de imagem (Image-Pro Plus 6.0). Em resumo, o sistema

de análise de imagem consistiu de uma câmera fotográfia Olympus (Olympus Co, St

Laurent, Quebec, Canada), acoplada a um microscópio Olympus (Olympus BX51), a

partir dos quais as imagens foram enviadas para um monitor LG, através de um sistema

de digitalização (Oculus TCX, Coreco, Inc, St. Laurent, Quebec, Canada) e transferido

para um computador (Pentium 1330 Mhz). Utilizando-se os recursos de medidas do

Image-Pro Plus 6.0 foi construído um retículo com 100 pontos, distribuídos

ortogonalmente sobre a imagem adquirida. Dois observadores, sem o conhecimento

prévio dos casos, avaliaram 10 campos randomizados do tecido sinovial, num aumento

de 400X.

A expressão de CD3 (Linfócitos T), CD20 (Linfócitos B), CD68, IL1beta e IL-10

foi determinada de acordo como o número de células positivas, coincidentes com os

Métodos 42


pontos do retículo em cada campo, sendo expressas como uma proporção da área total do

tecido analisado.

43 Métodos


3.5. AVALIAÇÃO DO COLÁGENO NO TECIDO SINOVIAL

3.5.1 Avaliação do colágeno total por análise de imagem

As lâminas coradas pelo Picrossirius foram analisadas em microscópio óptico,

equipado com um polarizador de luz, e quantificadas por um sistema de análise de

imagem. O sistema utilizado consiste de uma câmera CCD Sony, acoplada a um

microscópio Olympus, a partir do qual as imagens são visualizadas no monitor. Através

de um sistema digital inserido num computador (Pentium 4), as imagens foram

processadas por um software Image-Pro Plus 6.0. As amostras foram analisadas às cegas,

sendo selecionados aleatoriamente 5 campos, num aumento de 400x, para as seguintes

regiões: sinovial e subsinovial (Figura 12). A área total do tecido analisado em cada

campo foi medida pelo software Image-Pro Plus 6.0. O colágeno presente nos campos

adquiridos foi avaliado através da seleção de tonalidades birrefringentes vermelho -

alaranjada ou verde-amarelada, correspondentes às fibras de colágeno polarizadas grossas

e finas, respectivamente. A área das fibras de colágeno (grossas e finas) foi dividida pela

área total de tecido analisado e o resultado final expresso em porcentagem.

Métodos 44


Figura 12. Imagem representativa da análise de imagens pelo software Image-Pro Plus 6.0, mostrando

a área total a ser analisada delimitada (verde) e a marcação das fibras finas (azul; setas).

3.5.2 Imunofluorescência para colágeno dos tipos I e V

Para a imunofluorescência do colágeno dos tipos I e V, os cortes de 4µm de

espessura do tecido sinovial dos animais foram aderidos em lâminas, previamente

tratadas com 3-aminopropiltriethoxy Silano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

A reação foi iniciada pela desparafinização dos cortes através da imersão das lâminas em

xilol aquecido, a 60ºC, por 30 minutos, e dois banhos de 10 minutos em xilol em

temperatura ambiente. A reidratação dos cortes foi realizada por sucessivas lavagens em

álcool etílico em concentrações decrescentes (100%-75%), seguido de lavagem em água

corrente, por 10 minutos, um banho em água destilada e 15 minutos em PBS, pH 7,4.

Para a exposição e recuperação de sítios antigênicos, os cortes foram submetidos à

digestão com pepsina bovina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; 10000 UTI/ml)

na concentração de 8mg/ml em ácido acético 0,5N, por 30 minutos, a 37ºC. Ao término

desta incubação os cortes foram submetidos a um ciclo de lavagens com PBS, por três

45 Métodos


vezes de 10 minutos, e os sítios inespecíficos bloqueados com albumina bovina sérica

(BSA) a 5% em PBS, durante 30 minutos, em temperatura ambiente. As lâminas foram

incubadas durante uma noite com os anticorpos policlonais de coelho anti-colágeno do

tipo I (Rockland) (1:50) e anti-colágeno do tipo V (1:100), diluídos em solução de PBS.

Após este período, os cortes foram lavados em PBS, com Tween20 0,05% e incubados por

90 minutos com os anticorpos de cabra anti-IgG de coelho ALEXA 488 (Invitrogen, Life

Technologies) diluídos 1:200 em solução de PBS. Por fim, as lâminas foram novamente

lavadas, por cinco vezes com PBS com Tween20 0,05%, montadas com solução de

glicerina tamponada e analisadas em microscópio de fluorescência (Olympus BX-51,

Olympus Co, Tokyo, Japan).

Métodos 46


3.6. DOSAGEM DE CITOCINAS NO SORO

O sangue foi coletado por punção da veia caudal dos animais e colocado

imediatamente no gelo. Após um período de cerca de 60 minutos a 4ºC, o sangue foi

centrifugado a 1.500rpm, por 10 minutos a 4ºC, e o soro alíquotado e mantido a -70 ºC

até o momento da dosagem das citocinas. Foram realizadas coletas do sangue dos animais

dos quatro grupos, antes do início e no término dos procedimentos experimentais.

A dosagem da IL-1β, IL10, IL-17 e TNF-α no soro foi realizada utilizando o Kit

Cytokine Milliplex Map Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Millipo re

Corporation, Billerica, MA, USA), de acordo com as especificações do fabricante. As

medidas foram realizadas no sistema Multiplex MAGPIX (Millipore, MA, USA),

utilizando o software xPONENT 4.2 para a aquisição e desenho do esquema de ensaio.

3.6.1. Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados mediante testes estatísticos para comparação,

baseado nos tipos de distribuição das variáveis. As distribuições foram consideradas

paramétricas ou não paramétricas segundo sua distribuição utilizando o programa

estatístico GraphPad Prism versão 4.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA).

Os valores obtidos pelos estudos de cada variável contínua foram organizados e

descritos pela média e desvio padrão. Para a comparação entre as médias dos grupos

amostrais foi utilizado o teste ANOVA one-way TEST e como pós teste Turkey para

comparação entre grupos. Para que fosse considerada diferença entre médias e

frequências ou a presença de correlação entre variáveis, foi utilizado o valor de

47 Métodos


significância estatística menor a 5% (p<0,05).

4. RESULTADOS

49 Resultados


A fim de investigar a contribuição da eficacia da suplementação de Col V em

modelos de inflamação articular induzida, foram avaliados os parâmetros histológicos de

imunoexpressão de células inflamatórias, de citocinas e o remodelamento na membrana

sinovial dos grupos de animais estudados.

Na Figura 13 (A-H), identificamos o tecido sinovial dos animais dos grupos

artrite (AI), suplementados com colágeno V (AI-ColV15 e AI-ColV30) e controle (CT-

ColV30) em pequeno aumento, coradas por H&E e Picrossirius sob de luz polarizada. O

tecido sinovial dos animais do grupo CT-ColV30 apresentaram histoarquitetura uniforme

da tela de tecido conjuntivo, tecido adiposo-muscular e vasos (Figura 13 A). Em

contraste, nos animais do grupo AI, observamos presença de edema proeminente,

infiltração de células inflamatórias e espessamento fibroso (Figura 13 C). Por outro lado,

no tecido sinovial dos animais dos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30 foi identificado uma

intensa redução do edema, diminuição expressiva do infiltrado de células inflamatórias e

redução do espessamento fibroso (Figura 13 E e G). Esses resultados foram reforçados

pela análise morfométrica que mostra uma diminuição das células inflamatórias (Figura

14 A e Tabela 1) e do edema (Figura 14 B e Tabela 1) nos grupos AI-ColV15 e AI-

ColV30, em comparação ao grupo AI.

A análise morfológica da histoasquitetura das fibras de colágeno da tela do tecido

conjuntivo da sinóvia do grupo CT-ColV30 mostrou uma birrefringência vermelha-

amarelada (fibras de grossas) e amarelo-esverdeada (fibras finas) (Figura 13 B),

coincidindo com a manutenção da arquitetura corada em H&E (Figura 13 A). Por outro

lado no grupo AI identificamos distorção da histoarquitetura, caracterizada pelo padrão

difuso da birrefringência nos compartimentos sinoviais (Figura 13 D), achados que

corroboram com o espessamento sinovial observado na coloração de H&E (Figura 13

Resultados 50


C). Em contraste a histoarquitetura das fibras colágenas da sinóvia dos grupos AI-ColV15

e AI-ColV30, recuperaram a birrefringência vermelha-amarelada (fibras de grossas) e

amarelo-esverdeada (fibras finas) identificadas no grupo CT-ColV30 quando

comparamos aos animais do grupo AI (Figura 13 F, G e Figura 14 A e B). A análise

quantitativa das fibras colágenas finas e grossas mostrou que a proporção de fibras finas

foi menor nos grupos estudados AI em relação ao CT-ColV30 (Figura 14 C e D, Tabela

1). Quanto ao resultado da análise de fibras grossas identificamos uma diminuição de

fibras grossas no grupo AI quando comparamos com o grupo CT-ColV30, que após a

suplementação nos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30 voltam a apresentar a proporção do

grupo CT-ColV30 (Figura 14 C e D, Tabela 1).

51 Resultados


Resultados 52


Figura 13 - Cortes histológicos de tecido sinovial de animais dos grupos AI, AI-ColV15 e AI-ColV30 e

CT-ColV30. Em (A) mostra tecido sinovial do grupo CT-ColV30 com vasos e membrana sinovial

preservada (seta), e uma escassa quantidade de células inflamatórias (seta). No grupo AI em (B)

observamos a presença de edema proeminente, inflamação da membrana sinovial (seta), infiltrado

inflamatório celular e espessamento fibroso (seta). Em contraste, o grupo AI-ColV15 (C) e AI-ColV30 (D)

observamos redução significativa do edema, infiltrado inflamatório celular (setas) e espessamento fibroso,

além de preservação membrana sinovial (ponta de seta). Entre E-H notamos fibras de colágeno no tecido

conjuntivo sinovial dos grupos AI, AI-ColV15, AI-ColV30 e CT-ColV30. No grupo CT-ColV30 (E),

observamos as colorações com birrefringência vermelho fraco (fibras grossas) e amarelo -esverdeada (fibras

finas) (seta), exibindo distribuição normal e preservada das fibras de colágeno na membrana sinovial (seta)

e compartimento subsinovial. Em (F) mostra que no grupo AI temos predomínio de fibras de colágeno

espessas na membrana sinovial (ponta de seta) e o compartimento subsinovial (setas). Em contraste, os

grupos AI-ColV15 (G) e AI-ColV30 (H) apresentaram uma redução significativa da distribuição das fibras

de colágeno na membrana sinovial (ponta de seta) e o compartimento subsinovial (setas). A -D: coloração

H & E; E-H: coloração Picrossirius visualizado por luz polarizada. I-L Imunofluorescência. Ampliação

original: A-H, X200; I-L, X400.

53 Resultados


Tabela 1 – Distribuição histológica e imunohistoquímica mensurados de acordo com os grupos

Resultados 54


Figura 14. A-D: Os gráficos demonstram, respectivamente, a quantificação do infiltrado inflamatório ,

edema e das fibras de colágeno finas e grossas nos grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15, AI-ColV30. Os

valores são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo. Todos os valores foram quantificados em 10

campos aleatórios, no compartimento do tecido sinovial. Os grupos fo ram comparados usando ANOVA one-way TEST. AI vs CT-ColV30 (p <0,01), AI vs AI-ColV15 (p <0,01), AI vs AI-ColV30 (p <0,01), CT-

ColV30 vs AI-ColV15, CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0,01).

55 Resultados


A Figura 15 A mostra no grupo CT-ColV30 uma distribuição normal do

colágeno do tipo I ao longo dos septos do tecido conjuntivo e células adiposas sinovia is,

que contrasta com a distribuição irregular e espessamento desta proteína no grupo AI.

(Figura 15 C). Quando estudamos a distribuição dessas fibras nos grupos AI-ColV15 e

AI-ColV30 identificamos um retorno da distribuição normal semelhante ao que

observamos no grupo CT-ColV30, coincidindo com o padrão morfológico observado

pela coloração de Picrosírius (Figura 14 F e H). Ainda, a análise morfométrica da sinóvia

do grupo AI mostrou diminuição significativa das fibras de colágeno do tipo I, quando

foram comparadas com os grupos CT-ColV30, AI-ColV15 e AI-ColV30 (Figura 16

A).

A Figura 15 B demonstra a imunomarcação do colágeno do tipo V no grupo CT-

ColV30 que se apresenta com uma histoarquitetura fibrilar de padrão homogêneo e fino

principalmente ao redor de vasos e capilares e entre os septos do tecido conjuntivo e

células adiposas sinoviais. Em contraste, no grupo AI o colágeno do tipo V aumenta sua

expressão, principalmente ao redor das células inflamatórias, mantendo seu padrão fino

e homogêneo Figura 15 D. Por outro lado, nos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30, o

padrão morfológico da distribuição do colágeno do tipo V se apresenta semelhante ao

grupo CT-ColV30 e também envolve vasos e capilares, septos do tecido conjuntivo e

células adiposas sinoviais. Adiconalmente, a análise morfométrica da sinóvia do grupo

AI mostrou aumento significativo das fibras de colágeno do tipo V, quando foram

comparadas com os grupos CT-ColV30, AI-ColV15 e AI-ColV30 (Figura 16 B e

Tabela 1).

Resultados 56


Figura 15. A-H. Imunofluorescência para colágeno dos tipos I e V. Notar em A, grupo CT-ColV30, a

distribuição normal do colágeno do tipo I no tecido sinovial adjacente (setas) e da membrana sinovial e em

C distribuição irregular e espessamento no grupo AI (setas). Em E e G, nos grupos AI-ColV15 e AI-

ColV30, o padrão volta a ser homogêneo semelhante ao grupo CT-ColV30. Notar em B a tênue expressão

para o colágeno V no grupo CT-ColV30, e seu aumento no grupo AI em D. Em F e G observamos a imuomarcação somente ao redor dos vasos, capilares e septos de tecido adiposo (setas).

57 Resultados


Figura 16. A e B: Os gráficos demonstram, respectivamente, a quantificação da expressão de colágeno

tipo I (A) e colágeno V (B) nos grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15, AI-ColV30. Os valores são médias ±

(EM) de 10 animais em cada grupo. Todos os valores foram quantificados em 10 campos aleatórios, no

compartimento do tecido sinovial. Os grupos foram comparados usando ANOVA one-way TEST. AI vs CT-

ColV30 (p <0,01), AI vs AI-ColV15 (p <0,01), AI vs AI-ColV30 (p <0,01), CT-ColV30 vs AI-ColV15,

CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0,01).

Resultados 58


Na Figura 17 A identificamos o tecido sinovial do grupo CT-ColV30 na

coloração de H&E, apresentando aspecto uniforme, como anteriomente descrito. O grupo

AI (Figura 17 B) quando comparado os animais do grupo CT-ColV30 apresentam um

proeminente infiltrado de células inflamatórias, que após a suplementação com colágeno

V, grupos AI-ColV15 e AI-ColV30, mostram uma redução significativa de células

inflamatórias (Figura 17 C-D). Diferentes intensidades de imunoexpressão são exibidas

por linfócitos, macrófagos e citocina, no tecido sinovial de animais dos grupos controle

(CT-ColV30), artrite (AI) e suplementados (AI-ColV15 e AI-ColV30), confirmadas por

análise histomorfométrica. A imunoexpressão de linfócitos CD3+ (linfócitos T) e CD20+

(linfócitos B) em tecido sinovial do grupo artrite é significativamente mais elevada do

que a observada em animais do grupo controle (Figura 17 F e J comparando com G e

K; Figura 18 A-D). Em contraste, o tecido sinovial dos grupos de animais que receberam

suplementação de Col V, grupos AI-ColV15 e AI-ColV30, demonstraram redução

significativa da imunoexpressão de linfócitos CD3+ e CD20+, quando comparados com

o grupo AI (Figura 17 G-H, K-L comparando com F e J; Figura 18 A-D). A

imunoexpressão de macrófagos CD68+ no tecido sinovial dos animais do grupo AI se

mostrou significativamente maior do que a observada em animais do grupo CT-ColV30

(Figura 17 N-M e Figura 18 A-D). Por outro lado, o tecido sinovial dos grupos AI-

ColV15 e AI-ColV30 exibiram diminuição de macrófagos CD68+, quando comparado

com o grupo AI (Figura 17 O-P comparado a N, Figura 18 A-D).

59 Resultados


Resultados 60


Figura 17. Cortes histológicos de tecido sinovial dos grupos de animais AI, AI-ColV15 e AI-ColV30 e

CT-ColV30. Em A, observamos o grupo CT-ColV30 com vasos e membrana sinovial perfeitamente

preservados (seta) e uma escassa quantidade de células inflamatórias. No grupo AI, notamos a presença

proeminente de edema (asterisco), células do infiltrado inflamatório (setas) e espessamento fibroso (B).

Nos grupos AI-ColV15 (C) e AI-ColV30 (D) observamos a redução significativa do edema, células do

infiltrado inflamatório (seta) e espessamento fibroso preservação da membrana sinovial (seta). Em E-L

notamos a imunoexpressão para CD3 + (linfócitos T; E-H), CD20 + (linfócitos B; I-L) e CD68 +

(macrófagos; M-P) nos grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15, AI-ColV30. No tecido sinovial de grupo CT-

ColV30 identificamos escassas células CD3 + (E), CD20 + (I) e CD68 + (M). A imunoexpressão de CD3

+, CD20 + e CD68 + (setas) no tecido sinovial dos grupos AI-ColV15 (G, K, O) e AI-ColV30 (H, L, P) é

significativamente diminuída em relação ao grupo artrite (F, J, N). Coloração H&E: A-D. Ampliação original: A-P; X400

61 Resultados


Figura 18. A-D Gráficos da imunoexpressão para CD3 + (linfócitos T; A), CD20 + (linfócitos B; B) e

CD68 + (macrófagos; C) nos grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15, AI-ColV30. Os valores são médias ±

(EM) de 10 animais em cada grupo. Todos os valores foram quantificados em 10 campos aleatórios, não

coincidentes no compartimento do tecido sinovial. Os grupos foram comparados usando ANOVA one-way TEST. AI vs CT-ColV30 (p <0, 01), AI vs AI-ColV15 (p <0, 01), AI vs AI-ColV30 (p <0, 01), CT-ColV30

vs AI-ColV15, CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0, 01)

Resultados 62


A imunoexpressão da interleucina IL1β+ no tecido sinovial dos animais do grupo

AI teve sua expressão significamente aumentada quando comparada ao grupo CT-

ColV30 (Figura 19 B- A). Entretanto, no tecido sinovial dos grupos AI-ColV15, AI-

ColV30, notamos uma diminuição de interleucina IL1β+, quando comparado com o

grupo artrite (Figura 19 C e D comparado B). Estes achados coincidem com a redução

significativa de macrófagos encontrada após a suplementação com Col V (AI-ColV15,

AI-ColV30) (Figura 18 C). No que se refere à expressão da interleucina IL10+ no tecido

sinovial do grupo AI, identificamos um aumento significativo desta proteína quando

comparamos aos animais do grupo CT-ColV30 (Figura 19 F-E). Em contraste, o tecido

sinovial de ratos que receberam 15 e 30 dias de suplementação com Col V(AI-ColV15,

AI-ColV30) observou-se diminuição significativa na imunoexpressão de interleuc ina

IL10+, quando comparado com o grupo AI (Figura 19 G-H comparado F). Ainda na

Figura 19 identificamos que a redução de interleucina IL-10+ foi maior que a redução da

expressão IL β+ nos grupos (AI-ColV15, AI-ColV30) quando comparados ao grupo AI.

Esses resultados foram confirmados pela análise quantitativa que também mostraram

aumento significativo da interleucina IL1β+ e IL10 no tecido sinovial do grupo AI,

quando comparada ao grupo CT-ColV30. Ainda confirmaram a redução significativa da

IL1β+ e IL10 após a suplementação com colágeno V(AI-ColV15, AI-ColV30) (Figura

20 A e B, Tabela 1)

63 Resultados


Figura 19. Imunoexpressão de interleucinas IL1 β+, (A-D) e IL10 (E-H) no tecido sinovial dos grupos nos

grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15 e AI-ColV30. Em A e E mostram, respectivamente, a imunoexpressão

de interleucinas IL1 β+ e IL10 (seta) no tecido sinovial do grupo CT-ColV30. O grupo AI exibe a

imunoexpressão de interleucinas IL1β+, (B) e IL10 (F) significativamente maior (setas) no tecido sinovial

comparando com os grupos CT-ColV30 (A e B, E e F), AI-ColV15 (C, D e B) e AI-ColV30 (G, H e F).

Ampliação original: A-D e F-I: X400.

Resultados 64


Figura 20. Gráficos de imunoexpressão de interleucinas IL1 β+ e IL10 nos grupos CT-ColV30, AI, AI-

ColV15, AI-ColV30. Em A-B: Os valores são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo. Os valores

são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo. Todos os valores foram quantificados em 10 campos

aleatórios no compartimento do tecido sinovial. Os grupos foram comparados usando ANOVA one-way TEST. AI vs CT-ColV30 (p <0, 01), AI vs AI-ColV15 (p <0, 01), AI vs AI-ColV30 (p <0, 01), CT-ColV30

vs AI-ColV15, CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0, 01)

65 Resultados


A dosagem das interleucinas IL1 β+ e IL10, TNFα e IL17 no soro dos animais do

grupo AI foram significativamente maiores do que a observada em animais do grupo CT-

ColV30 (Figura 21 A-D). Entretanto, no soro dos grupos de animais que receberam

suplementação de Col V por 15 e 30 dias (AI-ColV15, AI-ColV30), notamos uma

diminuição das interleucinas IL1 β+ e IL10, TNFα e IL17, quando comparado com o

grupo AI (Figura 21 A-D). Estes achados coincidem com a redução significativa de

macrófagos encontrada após a suplementação de Col V dias (AI-ColV15, AI-ColV30)

(Figura 18 D).

Figura 21. A-D :Gráficos do perfil de citocinas IL1 β+ e IL10, TNFα e IL17 no soro dos grupos CT-

ColV30, AI, AI-ColV15, AI-ColV30.Os valores são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo. Todos

os valores concluídos em alguns campos, coincidentes aleatórios por suplementados com doses diárias de

COLV 15 e 30 dias. Os grupos são comparados usando ANOVA TEST. AI vs CT-ColV30 (p <0, 01), AI

vs AI-ColV15 (p <0, 01), AI vs AI-ColV30 (p <0, 01), CT-ColV30 vs AI-ColV15, CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0, 01)

Resultados 66


Na Figura 22 A-H e Figura 23 A-B observamos a imunoexpressão de MMP2 e

Caspase-9 no tecido sinovial dos animais dos grupos CT-ColV30, AI e AI-ColV15 e AI-

ColV30. Comparado aos animais do grupo CT-ColV30 (Figura 22 A), observamos que

os animais do grupo AI apresentaram um aumento na imunoexpressão de MMP2 (Figura

22 C). No entanto, uma redução significativa na imunoexpressão de MMP2 foi

encontrada nos grupos de animais suplementados com Col V(AI-ColV15 e AI-ColV30)

(Figura 22 E-G). Diferentes intensidades na expressão de Caspase-9, no tecido sinovia l

de animais dos grupos controle (CT-ColV30), artrite (AI) e suplementados (AI-ColV15

e AI-ColV30), foram confirmadas pela análise quantitativa (Figura 23 B). A

imunoexpressão de Caspase-9 no tecido sinovial do grupo AI foi significativamente

menor, quando comparamos com grupo CT-ColV30 (Figura 22 D comparando B;

Figura 23 B). Em contraste, o tecido sinovial dos grupos de animais que receberam

suplementação de Col V (AI-ColV15 e AI-ColV30) mostrou aumento significativo da

Caspase-9, quando comparados com o grupo AI (Figura 22 F-H comparando com D;

Figura 23 B).

67 Resultados


Resultados 68


Figura 22. A-H- Cortes histológicos de tecido sinovial dos grupos de animais AI, AI-ColV15 e AI-ColV30

e CT-ColV30 imunomarcados com MMP2 e Caspase-9 nos grupos CT-ColV30, AI, AI-ColV15, AI-

ColV30. No tecido sinovial do grupo CT-ColV30 notamos escassas células expressas para MMP2 (A) e

também para Caspase-9(B). Notar a diminuição da expressão de MMP2 (setas) no tecido sinovial dos

grupos AI-ColV15 e AI-ColV30 (E e G) em relação ao grupo AI (setas) (C). A expressão de Caspase-9

no grupo AI (D) foi significativamente menor (setas) quando comparamos com os grupos AI-ColV15 (G) e AI-ColV30 (F e H). Ampliação original: A-P; X400

69 Resultados


Figura 23. Representação Gráfica de imunoexpressão de MMP2 e Caspase 9 nos grupos CT-ColV30, AI,

AI-ColV15, AI-ColV30. Em A-B: os valores são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo. Todos os

valores são médias ± (EM) de 10 animais em cada grupo.. Todos os valores foram quantificados em 10

campos aleatórios no compartimento do tecido sinovial. Os grupos foram comparados usando ANOVA one-way TEST. AI vs CT-ColV30 (p <0, 01), AI vs AI-ColV15 (p <0, 01), AI vs AI-ColV30 (p <0, 01), CT-ColV30 vs AI-ColV15, CT-ColV30 vs AI-ColV30 (p <0, 01)

5. DISCUSSÃO

71 Discussão


O modelo de artrite induzida estabelecido neste estudo demonstrou pronunciado

infiltrado inflamatório na sinóvia dos ratos, caracterizado por presença de linfócitos T e

B, macrófagos, edema, além das citocinas pró-inflamatórias IL-1, TNFα e IL-17 e a

MMP-2. Importante salientar que a suplementação de Col V, por um período de 15 e 30

dias nos animais com indução de artrite, resultou na inibição do infiltrado inflamatório e

edema, de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNFα e IL-17) e enzimas como a MMP-2,

já a partir do 15º dia. Aliado a esses dados, foi observado aumento de apoptose celular

nos animais com a indução de artrite, submetidos a suplementação de Col V.

Existem vários modelos de indução de artrite e inflamação articular utilizados para

avaliação da eficácia de drogas, como a indução de artrite através do Zymosan, artrite

induzida por colágeno tipo II, artrite induzida por antígeno, como a mBSA, monoartrite

induzida por adjuvante completo de Freund, entre outros (Barton et al., 2006; Kanai et

al., 2007; Fernandes et al., 2011; Lott et al., 2013). Na maioria deles a indução gera o

aparecimento de infiltrado inflamatório no tecido sinovial no período de 15 a 30 dias.

Como o objetivo do presente estudo foi avaliar a ação da suplementação com Col V na

inflamação do tecido sinovial da articulação, optamos pela indução de um modelo

experimental baseado na monoartrite induzida por adjuvante completo de Freund (Barton

et al., 2006; Kanai et al., 2007; Fernandes et al., 2011), onde injeta-se o adjuvante

diretamente na articulação, gerando um infiltrado infamatório celular pronunciado, com

formação de pannus e exudado inflamatório. Aliado a isso, associamos a mBSA como

antígeno, no sentido de potencializar o processo inflamatório, com formação de

imunocomplexos e ativação do sistema complemento.

Discussão 72


A ideia da utilização da suplementação de Col V, no tratamento de artrite induzida

experimentalmente deve-se ao fato desta proteína, nos últimos anos, ter sido considerada

um autoantígeno em processos patológicos como a rejeição de transplante de pulmão em

modelo murino e em humanos, em transplante de coração, fibrose pulmonar idiopática,

asma, aterosclerose e esclerodermia experimental (Mares et al., 2000; Wilkes et al., 2001;

Sumpter, Wilkes, 2004; Teodoro et al., 2004; Callado et al., 2007; Dart et al., 2010;

Vittal et al., 2013; Lott et al., 2013). Ao contrário, a tolerância com Col V induzida pela

via das mucosas (oral/nasal) diminui o processo inflamatório e remodelamento tecidual

nestes processos patológicos (Yasufuku et al., 2002; Lott et al., 2013; Wilkes et al., 2015).

O Col V, pertence à família dos colágenos fibrilares, é ubíquo nos tecidos e

localiza-se no interior das fibrilas heterotípicas de colágeno I/III, sendo considerado um

antígeno sequestrado. Suas principais funções são o controle da fibrilogênese e regulação

do diâmetro das fibrilas do colágeno tipo I, porém destaca-se por possuir propriedades

imunogênicas, antigênicas e potencial de tornar-se um autoantígeno quando exposto ao

sistema imunológico, pela ação de metaloproteinases ou outros agentes indutores da lesão

endotelial crônica (Mares et al., 2000; Yasufuku et al., 2001; Haque et al., 2002).

Embora o Col V seja um dos constituintes do tecido sinovial, até o momento, não

existem muitos relatos na literatura científica em relação à importância do Col V, no

processo de sinovite. Acreditamos que com o remodelamento tecidual, decorrente do

processo inflamatório e ação de metaloproteases, epítopos do Col V possam ser expostos

tornando-se antígenos em potencial. Corroborando com essa ideia, pode-se citar um

estudo remoto, onde foi realizada a detecção de anticorpos anti-colágeno em pacientes

com várias doenças reumáticas, entre gota, doenças articulares degenerativas, artrite

reumatoide e outras (Stuart et al., 1983). Os autores demonstraram reatividade para

73 Discussão


colágeno na maioria das doenças artríticas inflamatórias analisadas, porém anticorpos

para Col V nativo foram mais frequentes que anticorpos para qualquer outro tipo de

colágeno. Este foi um achado relativamente específico para artrite reumatoide, uma vez

que menos que 10% de todos os pacientes com outras doenças reumáticas tiveram

anticorpos reativos com este antígeno (Stuart et al., 1983). Embora, atualmente anticorpos

como o fator reumatoide e anticorpos antipeptídeos citrulinados cíclicos, por sua grande

prevalência no soro dos pacientes, sejam considerados marcadores de artrite reumatoide

(Brzustewicz, Bryl, 2015), pode-se levantar a hipótese que o Col V possa ter participação

na patogênese do processo inflamatório sinovial em artrite. No presente trabalho, onde os

animais com artrite induzida foram mantidos por trinta dias, foi observado lige iro

aumento no título de anticorpos antiCol V, em relação ao soro dos mesmos animais antes

da indução da doença (dados não mostrados). Possivelmente, estes dados teriam sido

significantes se os animais com artrite induzida fossem mantidos por um tempo mais

prolongado, suficiente para a detecção de títulos mais relevantes de antiCol V.

Como mencionado anteriormente, no nosso estudo os animais nos grupos com

indução experimental de artrite e suplementação de Col V, administrada por 15 e 30 dias,

apresentaram redução significativa do infiltrado de células inflamatórias, demonstrado

pela diminuição da imunoexpressão de CD68+ (macrófagos), CD3+ (linfócitos T) e

CD20+ (Linfócitos B). Já é bem estabelecido que na inflamação sinovial estão presentes

componentes, tanto da resposta imunológica inata, como adaptativa. Em geral este

processo é caracterizado inicialmente pela ativação de macrófagos, células

apresentadoras de antígenos, que iniciam a cascata inflamatória e processamento e

apresentação de antígenos para os linfócitos T, que por sua vez estimulam a ativação dos

linfócitos B (Boissier et al., 2012; Minichiello et al., 2016). No nosso modelo

Discussão 74


experimental de artrite, o mBSA emulsificado em adjuvante completo de Freund,

funcionou como o antígeno desencadeante do processo inflamatório e influxo celular,

caracterizado por maior proporção de linfócitos T. Considera-se que, mesmo que haja

uma grande quantidade de mecanismos patológicos envolvidos na artrite que

permanecem obscuros, correntemente as células T são claramente colocadas no centro da

patogênese da doença, uma vez que elas estão envolvidas na inicialização e sustentação

da doença (Brzustewicz E e col., 2015). Cabe ressaltar, que no nosso modelo de artrite,

entre as células inflamatórias estudadas, os linfócitos T tiveram expressão mais marcante

e, ao contrário, maior supressão nos animais com artrite induzida e suplementação de Col

V por 15 dias.

Outro fato de grande relevância em nosso estudo foi a diminuição da expressão

de citocinas pró-infamatórias, como a IL1β, TNFα e IL-17, após a suplementação com

Col V. A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória que está relacionada com o estimulo da

proliferação das células sinoviais, resultando na formação de um infiltrado celular

intenso, o “pannus”. Esta citocina também pode estar relacionada à produção de

quimiocinas, como por exemplo, a proteína inflamatória de macrófagos (MIP-2) e a IL-8

(Bezerra, 2008; Ponticos et al., 2015). Nossos resultados mostram que nos grupos AI-

ColV15 e AI-ColV30 ocorreu uma significante redução de IL-1β, no tecido sinovial e no

soro, quando comparado ao grupo de animais com artrite induzida sem suplementação de

Col V, mostrando que possivelmente esta seria uma das vias de inibição que o Col V

estaria interferindo. Considerando que a IL-1β é a principal citocina envolvida na

destruição da cartilagem e do osso (Vervoordeldonk et al., 2002), este dado é de grande

importância numa possível terapia para a artrite.

75 Discussão


Atualmente, o TNFα é considerado a principal citocina determinante da resposta

inflamatória na artrite, uma vez que promove os principais elementos determinantes da

patogênese na doença: destruição do osso e cartilagem, via ativação de osteoclastos e

condrócitos; formação de pannus, pela ativação de células endoteliais e ampliação de

citocinas, além da indução de dor e febre (Brzustewicz E e col.,2015). Aliado a este fato,

o TNF também inibe a função de células T regs e torna as células T efetoras resistentes à

supressão mediada por células Tregs (Brzustewicz E e col.,2015). Considerando que o

TNFα e a IL-1β dividem algumas atividades pró-inflamatórias na artrite, a diminuição

destas citocinas nos animais com indução de artrite, já a partir dos 15 dias de

suplementação com Col V, sugere que esta possa ser um adjuvante na terapêutica para a

artrite.

Ainda, não menos importante na patogênese da artrite é a IL-17, a qual é produzida

por células Th17(CD3+,CD4+), encontradas na sinóvia inflamada. O envolvimento da

IL-17 na inflamação inclui a indução da migração de neutrófilos para a articulação e

aumento na produção de IL-1, TNF, IL6, quimiocinas e MMPs. Em pacientes com artrite

a IL-17 encontra-se em níveis elevados e se correlaciona com os estágios de mais

atividade da doença e lesão tecidual (Vervoordeldonk et al., 2002). Entretanto, nos

últimos tempos as terapias biológicas para artrite reumatóide, voltadas ao bloqueio de IL-

17 tem causado desapontamento, em relação a outras doenças imunes inflamatór ias,

provavelmente devido ao pleiotrofismo desta citocina na artrite (McInnes et al., 2016).

Embora, a suplementação com Col V, também seja eficiente para a diminuição da IL-17

no nosso modelo de artrite induzida, as citocinas IL-1 e TNFα parecem ser um alvo

terapêutico de especial interesse no tratamento da artrite.

Discussão 76


É importante salientar a ação da suplementação com Col V no remodelamento das

fibras colágenas do tecido subsinovial, devido à inibição ou retardo do processo de fibrose

nos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30. Sabe-se que a evolução do processo de fibrose se

dá à custa da formação de fibras grossas constituídas pelo colágeno do tipo I (Kehoe et

al., 2014). Nossos resultados mostram que o tecido sinovial dos animais com artrite e

não suplementados com Col V, apresentaram diminuição de fibras grossas, sinalizadas

pela coloração com picrossirius, visualizado sob luz polarizada, e de colágeno tipo I, que

é o principal colágeno que forma fibras grossas, encontrado no tecido sinovial. Esta

diminuição de colágeno de fibras grossas (colágeno tipo I), provavelmente está

relacionado com a atividade enzimática, uma vez que neste estudo foi determinado o

aumento de MMP-2 no grupo com artrite induzida. Ao contrário, a expressão de Col V

no tecido sinovial dos animais com artrite induzida foi maior em relação ao grupo controle

e aos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30. Considerando que o Col V forma fibras finas, à

primeira vista, este dado parece não corroborar com os resultados que demonstram

diminuição de fibras finas no grupo com artrite induzida, em relação aos outros.

Entretanto, no tecido sinovial, além do Col V, existem outros colágenos que formam

fibras finas, como o colágeno dos tipos III, IV e VI, que não foram analisados neste

estudo, e podem ter refletido na proporção total de fibras finas quantificadas.

A MMP-2, também conhecida como gelatinase-A, é um dos membros chave da

família das metaloproteases, capaz de clivar gelatina, o colágeno dos tipos I, IV e V,

elastina e vitronectina (Chakrabarti et al., 2005). A MMP-2 foi imunoexpressada em

monócitos CD14+ e macrófagos CD68+ infiltrados no tecido sinovial de pacientes com

artrite reumatoide. Ao contrário, a imunoexpressão de MMP-2 foi negativa em linfóc itos

B (CD20+) e linfócitos T (CD3+) infiltrados no tecido sinovial destes pacientes (Zhou et

77 Discussão


al., 2014). Estes autores sugerem que a MMP-2 produzida, tanto por sinoviócitos como

por monócitos e macrófagos podem ter papel importante na angiogênese e progressão da

artrite reumatoide (Zhou et al., 2014). Baseados nestes autores, nossos dados sugerem

que o remodelamento do colágeno se deve à grande expressão da MMP-2 encontrada no

grupo com artrite induzida, provavelmente produzida, em grande parte, pelos

macrófagos, presentes em maior proporção neste grupo. Porém, ainda restam alguns

questionamentos: a maior expressão de Col V, presente no grupo com artrite induzida,

seria devido ao aumento na síntese desta proteína, como tentativa de reparação tecidual,

ou seria pelo aumento da expressão de epítopos imunogênicos, expostos em decorrência

do intenso remodelamento tecidual. Embora no momento, ainda não seja possível

comprovar estas hipóteses, possivelmente as duas estejam corretas.

Porém o fato concreto, demonstrado neste estudo, é que a suplementação com Col

V nos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30, diminuiu a expressão de MMP-2, além de não

desencadear fibrose tecidual. Provavelmente, isto se deva à diminuição do infilt rado

inflamatório constituído principalmente por linfócitos, responsáveis pela produção das

citocinas pró-inflamatórias IL-1, TNFα e IL-17, e macrófagos, que também produzem

citocinas pró-inflamatórias e MMP-2.

Consideramos que o Col V, pelo seu potencial imunogênico, poderia ter se

tornado um antígeno em potencial, no processo inflamatório sinovial no modelo de artrite

induzida por mBSA/adjuvante de Freund. Neste modelo, com a primeira injeção da

emulsão de mBSA e adjuvante completo de Freund, o qual contém Mycobacterium

tuberculosis inativada, ocorre a ativação do sistema imunológico, resultando no influxo

e ativação de macrófagos no tecido sinovial, ativação de linfócitos T e B e formação de

imunocomplexos (albumina/anticorpos antialbumina), os quais aumentam com os

Discussão 78


reforços subsequentes de mBSA. Neste microambiente inflamatório, os macrófagos

ativados produzem uma série de substâncias lesivas como, metabólitos tóxicos do

oxigênio, óxido nítrico (Alberts et al., 1994; Janeway et al., 2001) e metaloproteases,

como a MMP-2. Ainda, os imunocomplexos (albumina/anticorpos antialbumina) ativam

o sistema complemento, potencializando o processo inflamatório e injuria tecidual

(Alberts et al., 1994; Janeway et al., 2001). Embora não tenhamos estudado a imunidade

celular para Col V, no modelo de artrite induzida, acreditamos que com a lesão e

remodelamento tecidual, decorrente do processo inflamatório sinovial, o Col V,

localizado no interior das fibrilas heterotípicas (I/III/V), sejam expostas ao sistema

imunológico, tornando-se um antígeno potencial. Novamente, esta hipótese corrobora

com a presença de anticorpos antiCol V em pacientes com artrite reumatoide (Stuart et

al., 1983).

Recentemente, foi demonstrado que são alguns peptídeos da cadeia α1(V)

envolvidos na rejeição do transplante de pulmão (Tiriveedhi et al., 2011). No nosso

estudo, a suplementação com o Col V envolveu a ingestão e degradação da proteína em

peptídeos, os quais são absorvidos na mucosa intestinal. Possivelmente, alguns destes

peptídeos, no tecido linfoide associado ao intestino (GALT) possam induzir tolerância

para o Col V. Embora, não tenhamos estudado todos os mecanismos de tolerância no

modelo de artrite induzida, suplementado com Col V, sabe-se que estes mecanismos

envolvem: a supressão ativa de células antígeno-específicas, através de células T

regulatórias (Treg), principalmente dos subtipos Th3 e Tr1; anergia clonal de células

específicas para o antígeno e deleção clonal de células específicas para o antígeno (Faria,

Weiner, 1999). Ainda que todos os três mecanismos possam operar simultaneamente em

resposta a tolerância oral, a supressão ativa e deleção clonal são os principais mecanismos

79 Discussão


da supressão imune induzida por tolerância oral (Faria, Weiner, 1999). No presente

estudo foi demosntrado aumento da caspase-9 nos grupos AI-ColV15 e AI-ColV30. Esse

dado sugere que a suplementação com Col V, pela mucosa oral possa ter ativado o

mecanismo de tolerância, através da deleção clonal ou morte celular programada,

considerando que a caspase-9 é um dos componentes da cascata de enzimas ativada

durante apoptose celular. É importante salientar que o aumento da caspase-9 ocorreu

concomitantemente com a diminuição do infiltrado inflamatório e expressão de citocinas

pró-inflamatórias nos grupos com artrite induzida e suplementação de Col V.

Fato interessante a ser mencionado é que o grupo AI-ColV30 apresentou maior

porcentagem de células T em relação ao grupo AI-ColV15. Embora, como mencionado

anteriormente, não tenha sido o objeto deste estudo, avaliar os mecanismos envolvidos

na tolerância oral, pressupomos que a suplementação oral com Col V tenha induzido a

formação de células Treg Th3 (células CD3+, CD4+) que são predominantes na mucosa

intestinal (Akbari et al., 2001; Weiner, 2001). Uma vez ativadas por antígenos

específicos, estas migram dos tecidos linfóides periféricos, neste caso as placas de Peyer

e nódulos linfáticos mesentéricos, para o local da lesão e suprimem a resposta celular de

um modo independente de antígeno. Este fenômeno é referido como uma supressão

“bystander” (Miller et al., 1991). A principal citocina imunossupressora produzida pelas

células Th3 é o TGF-β, porém também produzem quantidades menores de IL10 e IL4

(Weiner, 2001). Esta hipótese corrobora com os achados de Prakken et al. (2002), que

mostraram que a administração pela mucosa nasal de um peptídeo alterado ligante,

análogo a um epítopo artritogênico (Hsp60), induziu um grande efeito de proteção contra

a artrite induzida por antígeno, através da geração de células T regs, que produziram IL-

4, TGF-β e IL-10. Porém, nesse estudo como a administração do antígeno foi nasal as

Discussão 80


células Tr1, que produzem principalmente IL-10, foram predominantes (Prakken et al.,

2002). Infelizmente no presente estudo não realizamos a detecção de TGF-β sérica e no

tecido sinovial, sendo necessários outros estudos, para comprovar a nossa hipótese.

Ainda, no nosso estudo houve diminuição de IL-10 nos grupos suplementados

com Col V, possivelmente relacionada à diminuição de linfócitos B. Sabe-se que a

secreção de citocinas como IL-10 pelos linfócitos B está relacionada à regulação da

amplitude da resposta imune. Na artrite, células B produtoras de IL-10 estão envolvidas

na regulação negativa, assim como na encefalomielite autoimune experimental, na

inflamação T-dependente e intestinal (Katsikis et al., 1994; Dechanet et al., 1995).

O aumento de linfócitos T, no grupo AI-ColV30, em relação ao AI-ColV15,

concomitante à diminuição de IL-10, pode abrir outro leque de possibilidades.

Recentemente, a IL-35 tem emergido como outra citocina chave nos mecanismos de

imunossupressão. Esta citocina induz um importante mecanismo efetor para as células

Treg naturais, mas também é importante para a geração de células Treg induzidas,

estimulando uma população que não expressa FOXP3, IL-10 ou TGF-β (Células iTr35)

(Vignali & Kuchroo, 2012; McInnes et al., 2016). Assim, mais uma vez, mesmo que não

tenhamos avaliado a expressão da IL-35 neste estudo, pode-se sugerir que o aumento de

linfócitos T no grupo AI-ColV30 poderia ser de uma população de células Treg naturais

ou de uma população de células iTr35, dependentes desta citocina. Esta sugestão se apoia

num estudo recente, realizado com indução de tolerância pela via das mucosas com Col

V, num modelo experimental de aterosclerose, onde a diminuição das placas

ateroscleróticas foi associada com a imunorregulação da IL-35 (Park et al., 2016). Ainda,

a IL-35 também promove a geração de células Breg, incluindo as Breg induzidas,

81 Discussão


produtoras de IL-35 (células iBr35), que de modo diferente das células iTr35 utilizam

ambas citocinas IL-10, IL-35 para a sua função supressiva (Wang et al., 2014).

Em suma, mesmo que até o presente momento, não tenhamos elementos

suficientes para sustentar a ideia de que o Col V tenha se tornado um antígeno durante o

remodelamento tecidual, resultante do processo inflamatório. Ainda, que a

suplementação oral com Col V, no modelo de artrite induzida por mBSA/adjuvante de

Freund, tenha desencadeado um processo de tolerância oral, mesmo que os dados do

nosso estudo indiquem mecanismos de deleção clonal (apoptose) de células inflamatór ias

e um possível mecanismo imunorregulatório, que necessita ser melhor investigado. O fato

é que independente do mecanismo induzido, a suplementação com Col V, no modelo de

artrite induzida, por um período de 15 dias, já foi eficiente para a inibição de algumas das

principais citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNFα, IL17), de macrófagos, de linfócitos T

e B, MMP-2 e fibrose, podendo sugerir uma possível estratégica terapêutica, adjuvante

no tratamento da artrite.

6. CONCLUSÕES

83 Conclusões


O nosso estudo demostrou que a suplementação com Col V foi protetora contra a

severidade do processo inflamatório sinovial e progressão da artrite induzida, sugerindo

que esta possa ser um auxilio nas estratégias terapêuticas para o tratamento da artrite

reumatóide.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

85 Referências Bibliográficas


Achilleas D, Theocharis A, Spyros S, Skandalis A, Chrysostomi B, Nikos K.

Extracellular matrix structure. Advanced Drug Delivery Reviews 97: 4–27, 2016.

Akbari O, Dekruyff RH, Umetsu DT. Pulmonary dentritic cells producing IL-10

mediate tolerance induced by respiratory expore to antigen. Nat Immun. 2001; 2:725-

731.

Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos A. Incidence and prevalence of rheumatoid

arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic

review. Semin Arthritis Rheum 2006; 36(3):182–8.

Alarcon TL, Dunn P, Harrell Y, Gumany J, Wathal J, Collins RD. Protein-calorie

malnutrition (PCM) in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1985; 28:139.

Alberts B, Bray D, Lewis J. Molecular Biology of the Cell, 3th edition. New York:

Garland Science; 1994.

Alberts, B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da

Célula. 5a ed. São Paulo: Artmed; 2010. cap19.1131-1204.

Andersson KM, Svensson MN, Erlandsson MC, Jonsson IM, Bokarewa MI. Down-

regulation of survivin alleviates experimental arthritis. J Leukoc Biol. 2015 Jan;

97(1):135-45.

http://www.garlandscience.com/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andersson%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Svensson%20MN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Erlandsson%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jonsson%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bokarewa%20MI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25381389

Referências Bibliográficas 86


Bachinger HP, Mizuno K, Vranka JA, Boudko SP. Collagen Formation and

Structure. Oregon Health &Science University, Portland 2010.

Barton NJ, McQueen DS, Thomson D, Gauldie SD, Wilson AW, Salter DM.

Attenuation of experimental arthritis in TRPV1R knockout mice. Exp Mol Pathol

2006;81:166–70.

Bello A E, Oesser, S. Collagen hydrolysate for the treatment of osteoarthritis and

other joint disorders: a review of the literature. Current Medical Research and

Opinion, v. 22, p. 2221-2232, 2006.

Bellucci E, Terenzi R, La Paglia GM, Gentileschi S, Tripoki A, Tani C, Allunno A.,

Oneyear in review 2016: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol.

2016 Sep-Oct;34(5):793-801

Bezerra, M. C. Rank. RANKL and osteoprotegerin in arthritic bone loss. Pub Med,

São Paulo- Brasil, v. 38, n. 2, p.1-8, 2008.

Birk DE, Fitch JM, Babiarz JP, Doane KJ, Linsenmayer TF. Collagen fibrillogenesis

in vitro: interaction of types I and V collagen regulates fibril diameter. J Cell Science

1990; 95:649-657.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27716458



Birk DE, Fitch JM, Babiarz JP, Doane KJ, Linsenmayer TF. Collagen fibrillogenesis

in vitro: interaction of types I and V collagen regulates fibril diameter. J Cell Science

1990; 95:649-657.

Birk DE. Type V collagen: heterotopic type I/V collagen interactions in the regulation

of fibril assembly. Micron 2001, 32(3):223-37

Blewis ME, Nugent-Derfus GE, Schmidt TA, Schumacher BL, Sah RL. A model of

synovial fluid lubricant composition in normal and injured joints. Eur Cell Mater.

2007 Mar 6;13:26-39.

Bogliolo L, Brasileiro GF. Patologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.

xiv, 1328p, il.

Boissier, M.C. et al. Rheumatoid arthritis: from auto-immunity to synovitis and joint

destruction. J. Autoimmun.(2012) 39, 222–228.

Bonod-Bidaud C, Roulet M, Hansen U. In Vivo Evidence for a Bridging Role of a

Collagen V Subtype at the Epidermis-Dermis Interface. J Invest Dermat 2012; 132:

1841-184.

Brackertz D, Mitchell, GF, Mackay IR. Antigen induced arthritis in mice. Arthrit is

Rheum.v. 20, p. 841-849, 1977.



Bruckner P. Suprastructures of extracellular matrices: Paradigms of functions

controlled by aggregates rather than molecules. Cell Tissue Res 2010; 339: 7–18.

Callado MR, Viana VS, Vendramini MB, Leon EP, Bueno C, Velosa AP, Teodoro

WR, Yoshinari NH. Autoantibody profile in the experimental model of scleroderma

induced by type V human collagen. Immunology. 2007 Sep;122(1):38-46.

Chakrabarti S and Patel KD. Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 in

pulmonary pathology. Exp Lung Res 2005; 31: 599-621

Chang T, Wu L. Methyglyoxal, oxidative stress, and hypertension. Can. J.Physiol.

Pharmacol. 84:1229-1238, 2006.

Chen X, Andresen1 Bt, Hill M, Zhang J, Booth F, Zhang C. Role of reactive oxygen

species in tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction.

CurrHypertens Rev. 4(4):245-255, 2008.

Chighizola CB, Favalli EG, Meroni PL. Novel mechanisms of action of

the biologicals in rheumatic diseases.Clin Rev Allergy Immunol. 2014 Aug;47(1) :6-

16.

Chung E, Rhodes K, Miller EJ. Isolation of three collagenous components of

probable basement membrane origin from several tissues. Biochem Biophys Res

Commun 1976; 23;71(4):1167-74.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chung%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=971306

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rhodes%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=971306

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miller%20EJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=971306

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biochem.+Biophys.+Res.+Commun.+71+%2C+1167+-1174

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biochem.+Biophys.+Res.+Commun.+71+%2C+1167+-1174



Cieza A, Stucki G. Understanding functioning, disability, and health in rheumatoid

arthritis: the basis for rehabilitation care. Curr Opin Rheumatol. 2005;17:183–9.

Collamati A, Marzetti E, Calvani R, Tosato M, D'Angelo E, Sisto AN, Landi F.

Sarcopenia in heartfailure: mechanisms and therapeutic strategies. J Geriatr

Cardiol. 2016 Jul;13(7):615-24

Cope AP. T cells in rheumatoid arthritis, Arthritis Res Ther 10 (suppl 1) (2008) in

Iain B. McInnes, Christopher D. Buckley and John D. Isaacs. Cytokines in rheumato id

arthritis — shaping the immunological landscape. Nature Reviews Rheumato logy

2016; 12: 63-68,

Cross ML, and Gill HS. Modulation of Immune Function by a Modified Bovine Whey

Protein Concentrate. Immunology and Cell Biology 1999;77: 345- 50.

Cruvinel WM. Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos

moleculares e celulares da resposta inflamatória. Rev. Bras. Reumatol. São

Paulo July/Aug. 2010; vol.50 no.4

D'Arcangelo G, Miao GG, Shu-Cheng C. A protein related to extracellular matrix

proteins deleted in the mouse mutant reeler. Nature 1994; 374, 719 - 723

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Collamati%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marzetti%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Calvani%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tosato%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=D'Angelo%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sisto%20AN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27605943





Dart ML, Jankowska-Gan E, Huang G, Roenneburg DA, Keller MR, Torrealba JR,

Rhoads A, Kim B, Bobadilla JL, Haynes LD, Wilkes DS, Burlingham WJ, Greenspan

DS. Interleukin-17-dependent autoimmunity to collagen type V in atherosclerosis.

Circ Res. 2010; 29;107(9):1106-16.

Dechanet J, Merville P, Durand I, Banchereau J, Miossec P. The Ability of

Synoviocytes to Support Terminal Differentiation of Activated B Cells May Explain

Plasma Cell Accumulation in Rheumatoid Synovium J. Clin. Invest. 1995; 95; 456-

463

Delacoux F, Fichard A, Geourjon C, Garrone R, Ruggiero F. Molecular Features of

the Collagen V Heparin Binding Site. J Biol Chem.1998; 273(24):15069-76.

Dijkstra C. D., Döpp E.A., Vogels I. M. C., et al. Macrophages and Dendritic

Cells in Antigen-Induced Arthritis 1987; 26;(5), 513–523.

Dorner T, Burmester GR. The role of B cells in rheumatoid arthritis: mechanisms and

therapeutic targets. Curr Opin Rheumatol. 2003;15:246-52

Durga MSH, Chandrupatla K, Weijers, Yoony YJ, Gent, Inge de Greeuw, Adriaan A.

Lammertsma, Gerrit Jansen, Conny J. Sustained Macrophage Infiltration upon


http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/sji.1987.26.issue-5/issuetoc

http://www.hindawi.com/48267679/










Multiple Intra-Articular Injections: An Improved Rat Model of Rheumatoid Arthritis

for PET Guided Therapy Evaluation. Bio Med Research International 2015

Edwards JCW. Synovial intimal fibroblasts. Ann Rheum Dis 1995 54:395-7

Edyta B, Ewa B. The role of cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis –

Practical and potential application of cytokines as biomarkers andtargets of

personalized therapy. Ann Rheum Dis 76: 527–536, 2015.

Faria AMC, and Weiner HL. 1999. Oral tolerance: mechanisms and therapeutic

applications. Adv. Immunol. 73:153–264.

Fernandes ES, Russell FA, Spina D, McDougall JJ. A Distinct Role for Transient

Receptor Potential Ankyrin 1, in Addition to Transient Receptor Potential Vanilloid

1, in Tumor Necrosis Factor _–Induced Inflammatory Hyperalgesia and Freund’s

Complete Adjuvant–Induced Monarthritis. Arthritis & Rheumatism. 2011; 63(3),

819–829

Gado KI, Gigler G. Zymosan inflammation: a new method suitable for evaluating new

inflammatory drugs. Agents Actions. 1991; 32, 119-121.

Gallin J. Fundamental immunology. In W.E. Paul (Ed.) Inflammation. New York:

Raven Press Ltd. Fundamental Immunology p. 1015-1032, 1993



Gelse K, Poschl E, Aigner T. Collagens: strutcture, function and byosynthesis.

Advanc Drug Delivery Reviews 2003; 55:1531-46.

Gibofsky A. Overview of epidemiology, pathophysiology, and diagnosis of

rheumatoid arthritis. Am J Manag Care 2012; 18: 295 – 302.

Goldfarb AH, Patrick SW, Bryer S, You T. Vitamin C supplementation affects

oxidative- stress blood markers in response to a 30-minute run at 75% VO2max. Int

J Sport Nutr Exerc Metab. 2005;15:279-90.

Gopalakrishnan B, Wang WM, Greenspan DS. Biosynthetic processing of the Pro-

alpha1(V)Pro-alpha2(V)Pro-alpha3(V) procollagen heterotrimer. J Biol Chem. 2004

16;279(29):30904-12.

Griffiths RJ. Characterisation and pharmacological sensitivity of antigen arthritis

induced by methylated bovine serum albumin in the rat.”Agents and Actions, vol. 35,

no. 1-2, pp. 88–95, 1992.

Guidugli JN. Elementos de patologia geral. São Paulo: Santos, 1997. 192 p, il.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20WM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15136578

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Greenspan%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15136578

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15136578/



Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF, Evans SM, Korbo L, Marcussen N, Møller A,

Nielsen K, Nyengaard JR, Pakkenberg B. The new stereological tools: disector,

fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological

research and diagnosis. APMIS 1988, 96(10):857-881

Haque MA, Mizobuchi T, Yasufuku K, Fujisawa T, Brutkiewicz RR, Zheng

Y, Woods K, Smith GN, Cummings OW, Heidler KM, Blum JS, Wilkes DS.

Evidence for immune responses to a self-antigen in lung transplantation: role of type

V collagen-specific T cells in the pathogenesis of lung allograft rejection. J

Immunol. 2002 Aug 1;169(3):1542-9.

Henderson CJ, Lovell DJ, Gregg DJ. A nutritional screening test for use in children

and adolescents with juvenile rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1992; 19:1276-81.

Imamura Y1, Scott IC, Greenspan DS. The pro-alpha3(V) collagen chain. Complete

primary structure, expression domains in adult and developing tissues, and

comparison to the structures and expression domains of the other types V and XI

procollagen chains. J Biol Chem 2000; 24;275(12):8749-59.

Janeway CA Jr, Travers P., Walport M. Immunobiology: The Immune System in

Health and Disease 5th edition. New York: Garland Science; 2001

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Haque%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mizobuchi%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yasufuku%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fujisawa%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brutkiewicz%20RR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zheng%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Woods%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Smith%20GN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cummings%20OW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Heidler%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blum%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilkes%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Imamura%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10722718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Scott%20IC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10722718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Greenspan%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10722718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10722718/



Kanai Y, Hara T, Imai A, Sakakibara A. Differential involvement of TRPV1 receptors

at the central and peripheral nerves in CFA-induced mechanical and thermal

hyperalgesia. J Pharm Pharmacol 2007;59:733–8.

Katsikis P D, Chu F, Brennan M, Maini RN, Feldmann M. Immunoregulatory role of

interleukin 10 in rheumatoid arthritis. J. Exp. Med. 1994;179:1517-1527.

Kehoe O, Cartwright A, Askari A, El Haj AJ, Middleton J. Intra-articular injection

of mesenchymal stem cells leads to reduced inflammation and cartilage damage in

murine antigen-induced arthritis. J Transl Med. 2014 (3)12:157.

Klarenbeek NB, Kerstens PJ, Huizinga TW, Dijkmans BA, Allaart CF. Recent

advances in the management of rheumatoid arthritis. BMJ 2010; 341:6942.

Klimiuk PA, Yang H, Goronzy JJ, Weyand CM. Production of cytokines and

metalloproteinases in rheumatoid synovitis is T cell dependent. Clin Immuno l.

1999;90:65-78.

Konomi H, Hayashi T, Nakayasu K, Arima M. Localization of type V collagen and

type IV collagen in human cornea, lung, and skin. Immunohistochemical evidence by

anti-collagen antibodies characterized by immunoelectroblotting. Am J Pathol 1984;

116(3): 417-426.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kehoe%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cartwright%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Askari%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=El%20Haj%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Middleton%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Konomi%20H%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hayashi%20T%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakayasu%20K%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arima%20M%5Bauth%5D



Levick JR. Fluid movement across synovium in healthy joints: role of synovial fluid.

Ann Rheum Dis. 1995 May; 54 (5): 417–423

Levin AL, Siv FEN, Hoeve JV. Adler’s Physiology of the Eye. Chapter 4: Cornea and

Sclera. Sunders, 11 ed, 2011.

Linsenmayer TF, Fitch JM, Birk DE. Heterotypic collagen fibrils and stabilizing

collagens. Controlling elements in corneal morphogenesis? Ann NY Acad

Science 1990; 580:143-60.

Linsenmayer TF, Gibney E, Igoe F. Type V collagen: molecular structure and

fibrillar organization of the chicken alpha 1(V) NH2-terminal domain, a putative

regulator of corneal fibrillogenesis. J Cell Biol 1993;121(5):1181-9.

Linsenmayer, TF, Collagen In: Hay, ED ed. Cell Biology of Extracellular Matrix.

2.ed. 1991. New York, Plenum Press. p. 7-43.

Lopes AC, Amato VN. Tratado de Clinica Médica.(1) 2 ª ed São Paulo, Roca, 2009;

1498-1500

Lopes AC, Amato VN. Tratado de clínica médica. (3) 2ª ed São Paulo, Roca, 2009;

107-112


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fitch%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2159749


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Linsenmayer+.+Ann+N+Y+Aca+Scl.+1990%3B+580%3A143

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Linsenmayer+.+Ann+N+Y+Aca+Scl.+1990%3B+580%3A143


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gibney%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8501123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Igoe%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8501123




Lott JM, Sehra S, Mehrotra P, Mickler EA, Fisher AJ, Zhang W, Presson RG, Busk

MF, Goenka S, Gunst SJ, Kaplan MH, Wilkes DS, Wenzel SE. Type V collagen-

induced tolerance prevents airway hyper responsive ness. Am J Respir Crit Care Med.

15;187(4):454-7, 2013.

Lowell DJ, White PH. Growth and nutrition in juvenile rheumatoid arthritis. In: Woo

P, White P, Ansell B, editors. Paediatric rheumatology update. London: Oxford

University Press; 1990. p.47-56.

Maham, LK, Escott-Stump S. Krause: Alimentos, nutrição e dietoterapia. 13ª ed. Rio

de Janeiro: Elsevier, 2012. 1227.

Mares DC, Heidler KM, Smith GN, Cummings OW, Harris ER, Foresman B, Wilkes

DS. Type V collagen modulates alloantigen-induced pathology and immunology in

the lung. Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 23(1):62-70,

Martin P, Teodoro WR, Velosa AP. Abnormal collagen V deposition in dermis

correlates with skin thickening and disease activity in systemic sclerosis. Autoimmun

Rev 2012; 11(11):827-35.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martin%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22406224

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Teodoro%20WR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22406224

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Velosa%20AP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22406224





Meng Zhou, Si Qin, Yang Chu, Fengming Wang, Lujun Chen, Yahua Lu.

Immunolocalization of MMP-2 and MMP-9 in human rheumatoid synovium. Int J

Clin Exp Pathol 2014;7(6):3048-3056.

McInnes IB, O’Dell JR. State-of-the-art: rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2010;

69(11):1898–906

Mcinnes, IB, Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England

Journal of Medicine. 2011;365(23), 2.205-2.219

Minichiello E, Semerano L, Boissier MC. Time trends in the incidence, prevalence,

and severity of rheumatoid arthritis: A systematic literature review. Joint Bone

Spine. 2016 Sep 5. pii: S1297-319X(16)30129-

Miller A, Lider O, Weiner HL. Antigen-driven bystander suppression after oral

administration of antigens. J Exp Med. 1991; 174:791-798.

Moelants EA. Regulation of TNF-αwhith a focus on rheumatoid arhtritis. Immuno l

Cell Biol 2013; 91: 393-401.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Minichiello%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27616690

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Semerano%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27616690

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Boissier%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27616690





Moreira C, Carvalho MAP. Reumatologia diagnóstico e tratamento. 2ed. Medsi;

2004.

Moskowitz R. W. Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease. Seminars

in Arthritis and Rheumatism, v. 30, p. 87-88, 2000.

Nam JL. et al. Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with

biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review

informing the EULAR recommendations for the management of RA. Ann. Rheum.

Dis., 2010; 69(6);976-986.

Oesser S, Seifert J. Stimulation of type II collagen biosynthesis and secretion in

bovine chondrocytes cultured with degraded collagen. Cell Tissue Research, 2003

311; 393-399.

Organização Mundial de Saúde (OMS). Década do Osso e da Articulação:

movimento articular, 2000/2010 [citado 2007 out. 22] disponível em: http:/

/www.reumatorj.com.br/decada.htm acesso em 10/09/2015

Ping Zhu, Xiao-Yan Li, Hong-Kun Wang, Jun-FengJia, Zhao-HuiZheng, Jin Ding,

Chun-Mei Fan Oral administration of type-II collagen peptide 250--270 suppresses

specific cellular and humoral immune response in collagen-induced arthritis Clinica l

Immunology (2007) 122, 75-84



Ponticos M, Papaioannou I, Xu S, Holmes AM, Khan K, Denton CP, Bou-Gharios

G, Abraham DJ. Failed degradation of JunB contributes to overproduction of type

I collagen and development of dermal fibrosis in patients with systemic sclerosis.

Arthritis Rheumatol. 2015; 67(1):243-53.

Prakken BJ, Roord S, Kooten PJS, Wagenaar JPA, Eden W, Albani S, Wauben MHM.

Inhibition of Adjuvant-Induced Arthritis by Interleukin-10-Driven Regulatory Cells

Induced Via Nasal Administration of a Peptide Analog of on Arthritis-Related Heat-

Shock Protein 60 T Cell Epitope. Arthritis Rheum 2002; 46(7):1937-1946.

Prockop, DP, Kiviriko, KL, Tuderman, L, Guzman, NA. The biosynthesis of collagen

and its disorders. N. England J. Med 1979;301:12-23.

Ricard-Blum S, Beraud M, Raynal N, Farndale RW, Ruggiero F. Structural

Requirements for Heparin/Heparan Sulfate Binding to Type V Collagen. J Biol Chem.

2006; 281(35):25195-204

Ricard-Blum S. The collagen family. Cold Spring HarbPerspect Biol. 2011; 3(1)

Robbins, S.L. (Stanley Leonard) et al. Patologia: bases patológicas das doenças. 7.

ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005; 1592 p, il., 1 CD-ROM. Tradução de: Robbins and

Cotran Pathologic Basis of Disease.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ponticos%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papaioannou%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Holmes%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Denton%20CP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bou-Gharios%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abraham%20DJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ricard-Blum%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16815843

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Beraud%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16815843

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Raynal%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16815843

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Farndale%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16815843

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ruggiero%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16815843

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Structural%20Requirements%20for%20Heparin%2FHeparan%20Sulfate%20Binding%20to%20Type%20V%20Collagen.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ricard-Blum%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21421911




Ruggiero F, Champliaud MF, Garrone R, Aumailley M. Interactions between cells

and collagen V molecules or single chains involve distinct mechanisms. Experimenta l

cell Research 1994; 210(2):215-23.

Ruggiero F, Comte J, Cabañas C, Garrone R. Structural requirements for a1b1 and

a2b1 integrin mediated cell adhesion to collagen V. J Cell Sci 1996;109 (7):1865-74.

Semerano L, Minichiello E, Bessis N, Boissier MC. Blood vessels, a potential

therapeutic target in rheumatoid arthritis? Joint Bone Spine 2011; 78, 118–123

Semerano L, Minichiello E, Bessis N, Boissier MC. Novel Immuno therapeutic

Avenues for Rheumatoid Arthritis. Trends in Molecular Medicine 2016; 22(3): 214-

229.

Shoulders MD, Raines RT. Collagen Structure and Stability. Annu Rev Biochem

2009; 78: 929-958.

Shu X, Zhang J, Wang Q, Xu Z, Yu T. Glutamine decreases intestinal mucosal injury

in a rat model of intestinal ischemia-reper fusion by down regulating HMGB1 and

inflammatory cytokine expression. Exp Ther Med. 2016; 12(3):1367-1372

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Structural%20requirements%20for%20a1b1%20and%20a2b1%20integrin%20mediated%20cell%20adhesion%20to%20collagen%20V%20

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shoulders%20MD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19344236

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Raines%20RT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19344236

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=19344236

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=19344236






Smith LT. Holbrook KA. Madri JA. Collagen Types I, III, and V in Human

Embryonic and Fetal Skin American J Anatomy 1986;175:507-521.

Smith MD, Barg E, Weedon H, et al. The microarchitecture and protective

mechanisms in synovial tissue from clinically and arthroscopically normal knee

joints. Ann Rheum Dis 2003; 62: 303-7.

Smith MD, Walker JG. The synovium. Rheumatology Editors Hochberg, Silman,

Smolen, Weinblatt, Weisman, Eds. 5th ed. 2011; vol 1: pp. 51-6.

Smith SM, Birk DE. Focus on molecules: collagens V and XI. Exp Eye Res. 2012;

98:105-6.

Souba WW. Glutamine: a key substrate for the splanchnic bed. Annu Rev Nutr.1991;

11:285-308.

Stuart JM., Huffstutter E H, Townes AS, Kang AH. Incidence and specificity of

antibodies to types I, II, III, IV, and V collagen in rheumatoid arthritis and other

rheumatic diseases as measured by i-radioimmunoassay. Arthritis & Rheumatism

1983; 26 (7): 832-840.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Smith%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20705069


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Exp+Eye+Res.+2012+May%3B98%3A105-6.



Sumpter TL, Wilkes DS. Role of autoimmunity in organ allograft rejection: a focus

on immunity to type V collagen in the pathogenesis of lung transplant rejection. Am

J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004; 286(6):L1129-39

Tak PP, Bresnihan B. The pathogenesis and prevention of joint damage in rheumatoid

arthritis: advances from synovial biopsy and tissue analysis. Arthritis Reum 2000;

43: 2619 – 2633.

Teodoro WR, Velosa AP, Witzel SS, Garippo AL, Farhat C, Parra ER, Sonohara S,

Capelozzi VL, Yoshinari NH. Architectural remodelling in lungs of rabbits induced

by type V collagen immunization: a preliminary morphologic model to study diffuse

connective tissue diseases. Pathol Res Pract. 2004;200(10):681-91.

Trentman, DE, Townea AS, Kang AM. Autoimmunity to type II collagen: an

experimental mode lof arthritis. The journal of experimental medicine 1977; 146 (3);

857-868.

Tiriveedhi V, Angaswamy N, Brand D, Weber J, Gelman AG, Hachem R,. Trulock

EP, Meyers B, Patterson G,Mohanakumar T. A shift in the collagen V antigenic

epitope leads to T helper phenotype switch and immune response to self-antigen

leading to chronic lung allograft rejection. Clinical and Experimental Immuno logy

2011; 167: 158–168.



Vervoordeldonk MJ, Tak PP. Cytokines in rheumatoid arthritis. Curr Rheumato l

Rep. 2002 Jun;4(3):208-17.

Vicentini GE, Fracaro L, de Souza SR, Martins HA, Guarnier FA, Zanoni JN

Experimental cancer cachexia changes neuron numbers and peptide levels in the

intestine: partial protective effects after dietary supplementation with L-glutamine.

PLoSOne. 2016; 16;11(9)

Vignali, D.A.A, Kuchroo, VK. IL‑12 family cytokines: immunological

playmakers. Nat. Immunol. 2012; 13, 722–728

Vittal R, Mickler EA, Fisher AJ, Zhang C, Rothhaar K, Gu H, Brown KM,

Emtiazdjoo A, Lott JM, Frye SB, Smith GN, Sandusky GE, Cummings OW, Wilkes

DS. Type V collagen induced tolerance suppresses collagen deposition, TGF-β and

associated transcripts in pulmonary fibrosis. PLoS One 2013; 21;8(10)

Wakisaka, S. Modulation by pro inflammatory cytocines of Fas/Fas ligand- mediated

apoptotic cell death of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis. Pub Med,

Aichi-japan, n. , p.119-128, 13 jul. 1998.

Wang, R.‑X. et al. Autoimmune disease. Nat. Med. (2014).20, 633–641.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vervoordeldonk%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12010605

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tak%20PP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12010605

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vervoordeldonk%2C+PP+2002

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vervoordeldonk%2C+PP+2002





Weiner H L. Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type

TGF-beta-secreting regulatory cells. Microbes Infect. 2001; 3(11):947-54.

Wenstrup R J. Florer J. B.Type V Collagen controls the initiation of collagen fibril

assembly. J BiolChem 2004

Wilkes DS, Chew T, Flaherty KR, Frye S, Gibson KF, Kaminski N, Klemsz MJ,

Lange W, Noth I, Rothhaar K. Oral immunotherapy with type V collagen in idiopathic

pulmonary fibrosis. Eur Respir J. 2015 45(5):1393-402.

Wilkes DS, Heidler KM, Yasufuku K, Devito-Haynes L, Jankowska-Gan E, Meyer

KC, Love RB, Burlingham WJ. Cell-mediated immunity to collagen V in lung

transplant recipients: correlation with collagen V release into BAL fluid. J Heart

Lung Transplant 2001; 20(2):167.

Wolinsky, I.; Hickson Junior J.F. Nutrition in exercise and sport. 2nd ed. Boca Raton:

CRC Press, 1994

Wu, J, Fujioka M, Sugimoto K, Mu G, Ishimi, Y. Assessment of effectiveness of oral

administration of collagen peptide on bone metabolism in growing and mature rats.

Journal of bone and mineral metabolism. 2004;22: 547-553.



Yamada, R. et al. Peptidy l arginine deiminase type 4: identification of a rheumatoid

arthritis-susceptible gene. Trends Mol. Med. (2003) 9, 503–508

Yaoi Y, Hashimoto K, Koitabashi H, Takahara K, Ito M, Kato I. Primary structure of

the heparin-binding site of type V collagen. Biochim Biophys Acta. 1990;

1035(2):139-45.

Yasufuku K, Heidler KM, O'Donnell PW, Smith GN Jr, Cummings OW, Foresman

BH, Fujisawa T, Wilkes DS. Oral tolerance induction by type V collagen

downregulates lung allograft rejection. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001; 25(1):26-

Yasufuku K, Heidler KM, Woods KA, Smith GN Jr, Cummings OW, Fujisawa T,

Wilkes DS. Prevention of bronchiolitis obliterans in rat lung allografts by type V

collagen- induced oral tolerance. Transplantation 2002; 27;73(4):500-5

Zhi-cheng, Zhang, Shui-juan Zhang,Bo, Jin, Yujin Wu,Xin-fu Yang, Bing Yu,

Qiang-min Xie. Ciclamilast Ameliorates Adjuvant-Induced Arthritis in a Rat Model

BioMed Research International Volume 2015


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hashimoto%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Koitabashi%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Takahara%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ito%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kato%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2203476







APÊNDICE

Apêndice 107


Inhibition of Inflammation and Remodeling Synovial with Collagen V

Supplementation in Experimental Arthritis

1Silvana Ramos Atayde, 2Ana Paula Pereira Velosa, 3Sergio Catanozi, 1Priscila Cristina Andrade, 2Antonio

Santos-filho, 2José Eduardo de Castro M Magalhães,1Leila Antonangelo 2Suzana Beatriz Veríssimo de

Mello, 1Vera Luiza Capelozzi, 2Walcy Rosolia Teodoro

1. Department of Pathology; University of São Paulo, São Paulo, Brazil

2 Department of Rheumatology; Faculty of Medicine, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

3. Discipline of Endocrinology, Faculty of Medicine, University of Sao Paulo, Brazil.

Grants: CAPES, FAPESP (201203543.12), CNPq (#471939/2010-2).

Conflicts of interest: All the authors declare no conflicts of interest

These authors contributed equally to this work.

Address correspondence to:

Walcy Rosolia Teodoro

e-mail: [email protected]

Vera Luiza Capelozzi

e-mail: v r

mailto:[email protected]

Abbreviations list

BCIP 5Bromo-4chloro-3indolyl-phosphate

BSA Bovine Serum Albumin

CFA Complete Freund's Adjuvant

CD3 Cluster of Differentiation 3



CGRP Calcitonin Gene Related Peptide

Col I Collagen type 1

Col V Collagen type 5

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

H&E Hematoxylin & Eosin

IL-1 Interleukin-1

IL-10 Interleukin-10

IL-17 Interleukin-17

mBSA methylated Bovine Serum Albumin

MIP – 2 macrophage inflammatory proteim

NBT Nitro blue tetrazolium

PBS Phosphate-Buffered Saline

RA Rheumatoid Arthritis

TNF-α Tumor Necrosis Factor- Alpha

Abstract

Because collagen type V can be exposed in remodeling processes, we hypothesized that oral administration

of this collagen specie modulates inflammation and remodeling of experimental synovitis, avoiding joint

destruction and may differ according to the temporal administration. Arthritis was induced in Lewis rats by

intra articular (ia) injection of 500 µg of methylated bovine serum albumin (mBSA) emulsified in complete

Freund's adjuvant (CFA) (10 uL) administration once 1, 7 and 14 days, followed by intra-articular booster

of mBSA (50 µg) in saline (50 uL). Control group received saline (50 l, ia). After 30 days after injection

of mBSA, when synovia membrane pathologically related inflammatory changes had already occurred,

acetic acid 0,01N/Col V (Col V control, 300 l/500g), acetic acid 0,01N/Col V (ColV-30 days

supplementation, 300l/500g) were orally administered. After 30 days, oral Col V administration led to:

1) inhibited edema and severe inflammatory cell infiltration, 2) decreased collagen fiber content, 3)

decreased collagen type I, 4) inhibited lymphocytes subpopulation and macrophages, and 5) inhibited IL-

1β, IL-10, IL-17 and TNF-α 6) increased expression of caspase-9 in the synovial tissue receiving Col V. In

conclusion, collagen type V specie inhibited synovia inflammation and fibrotic response, possibly by

increased apoptosis of inflammatory cells .

Keywords: Collagen type V, collagen type I, arthritis, synovia, remodeling, macrophage, lymphocyte,

cytokines.

Introduction

The synovia is the central area of pathology in a number of inflammatory joint diseases, including

rheumatoid arthritis (RA) (1). The inflammatory condition of the synovial membrane of the joints is defined

as synovitis, which results in pannus formation and joint destruction (2). The treatment of this inflammatory

disorder is based mainly on the use of cytotoxic drugs affecting all proliferating cell types (3). In this aspect,

the attempt to decrease the inflammatory process with collagen type V (Col V) supplementation seems to

be promising and without troublesome toxicity.

The synovial tissue consists of a modified space, formed by the lining cells of the synovial

membrane, which functions as a biological lubricant, as well as a biochemical support through which

nutrients and cytokines can penetrate and reach the articular surface (4, 5). It rests on a thick frame (~100

nm) of loose subsynovial connective tissue, whose extracellular matrix consists mainly of collagen type I,

and minor proportion of the types III, IV, V and VI, chondroitin sulfate, proteoglycans, and fibronectin

(6,7,8). The synovial inflammation results in a metalloproteinase environment and joint matrix remodeling ,

exposing neoepitopes of tissue components. In this context, articular cartilage type II, IX and XI collagens

were shown to have arthritic and immunogenic properties (9, 10). Moreover, studies from our group

described intense synovial remodeling process with collagen deposit in rabbits immunized with Col V

(collagen V) (11, 12).

Col V, a minor collagen, is intercalated within fibrils of type I collagen (13). Due to its location,

Col V is considered a sequestered antigen not normally exposed to the immune system. However, interstitial

remodeling leads to Col V exposure, and results in a cryptic antigen becoming a target of immune response.

In the last years, the fact that Col V becomes a neoautoantigen after inflammatory processes involving

tissue remodeling, in pathologies, such as obliterans bronchiolitis after lung graft rejection in murine,

airway hyper responsiveness, idiopathic pulmonary fibrosis, atherosclerosis and experimental systemic

sclerosis, has become important (14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Of note, Col V-induced tolerance

suppresses/downregulates these pathologies development (14, 15, 22, 23).

Because Col V can be exposed in tissue remodeling processes in synovial inflammation ,

supplementation with this collagen type can be a therapeutic option in the reduction of synovial

inflammation and consequent protection of the joint. To test this hypothesis, we employed a well -

established arthritis model by Freund’s Complete Adjuvant (CFA) that induced joint inflammation in rats,

which develop chronic synovial inflammation, pannus formation and joint destruction (24), the model was

reinforced with methylated bovine serum albumin (mBSA). In this study we supplemented the animals with

Col V up to 30 days after joint inflammation induction and verified the profile of the cellular infiltrate,

tissue remodeling and proinflammatory cytokines (24).

Materials and Methods

Preparation and characterization of bovine collagen type V

For extraction of bovine collagen, the tissue samples were sliced and washed in EDTA, containing

proteinase inhibitors (50 mM EDTA, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 0.02 Mm, N-

ethylmaleimide) for 48 hours at 4°C. The samples were homogenized with a Teckman polytron and

submitted to a 12,000 rpm centrifugation for 30 minutes. The residue was treated with pepsin (10,000 dry

unit/ml; substrate/enzyme 10:1) (Sigma Chemical Co.) in 0.5 M acetic acid, stirring at 4°C for 16 h . The

insoluble residue was pelleted by centrifugation (15,000rpm by 60min) and Col V was purified from the

supernatant by differential NaCl precipitation (25). Col V was soluble in 0.7M NaCl and precipitated in

1.2M NaCl (25). The collagen chains were separated by SDS-PAGE (7.5%) under reduction conductions

with 2-mercaptoethanol and electro-transferred onto a nitrocellulose membrane (Sigma Chemical Co.) (26).

The membrane was blocked in 5% skimmed milk in phosphate-buffered saline (PBS) for 1 h at room

temperature, and the immunoreaction was performed by incubation with rabbit policlonal anti-collagen

type I (1:600; Rockland), mouse monoclonal anti-human type III collagen (1:100; Chalbiochem) and rabbit

polyclonal anti- human collagen type V (1:100) (19). After incubation with alkaline phosphatases linked

anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG (1:1,000; Sigma Chemical Co.), the blot was developed using 5-bromo-

4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) as alkaline phosphatases substrate and nitro blue tetrazolium (NBT )

as chromogen.

Animal preparation and experimental protocol

This study was approved by the Ethics in Committee Research for animal studies of University of

São Paulo School of Medicine (São Paulo, Brazil) Nº 295/12.

Thirty male Lewis rats with an average weight of 220–240g and an average age of 3 months were

used. Food and water were given ad libitum. The animals were kept in a room with a controlled environment

and a circadian night–day rhythm of 12 h. All the animals received human care in compliance with the e

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (27).

Arthritis group was induced by intra-articular injection of 500 µg of methylated bovine serum

albumin (mBSA) (Sigma Chemical Co.) emulsified in complete Freund's adjuvant (500 uL) administration

once 1, 7 and 14 days, followed by intra-articular booster of mBSA (50 µg) in saline (50 uL) (28). Control

group received saline (50 μL) using the same protocol. After the last intra-articular injection, arthritis and

control groups were further randomized to be supplemented via gavage with 300 µl of Col V (500μg)

diluted in acetic acid 0.01N administration daily (Suppl) and 30 days (IA/Suppl) (Figure 1).

Synovia histology

The synovia was removed from the right knee under strictly sterile conditions, and fixed in

buffered 10% formalin for 24 hours and embedded in paraffin for light microscopy. Slices (3 μm thick)

were cut and underwent Hematoxylin–Eosin (H&E) staining for morphometric analysis of synovia

architecture, edema and inflammatory cells (monucleated and polymorphonucleated cells).

Thick and thin collagen fibers in synovia were characterized by specific staining Picrosirius -

polarization method (29). Sirius red binds selectively to collagen fibers, giving colored products in which

the bound dye is proportional to the amount of collagen present (29,30,31). Color intensity is proportional

to the collagen concentration allowing measurement of the emitted light during observation using polarized

light. The birefringence also reflects the degree of parallel orientation and state of aggregation of the

collagenous structures (32).

Subpopulations of lymphocytes [T and B] and macrophages, were identified by

immunohistochemistry. The sections were deparaffinized and a 0.3% hydrogen peroxide solution was

applied for 4 x 5 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity. The antibodies used in the

immunohistochemical reactions were CD3 (1:700; Santa Cruz Biotechnology Inc.), CD20 (1:600; Santa

Cruz Biotechnology Inc.), CD68 (1:3,200; Santa Cruz Biotechnology Inc.). Tissue sections were pretreated

in citrate buffer solution pH 6.0 and heated in a Pascal pressure cooker (125°C for 1 minutes) to un -mask

the epitopes. The sections were incubated with the primary antibody overnight at 4oC. The reaction was

revealed using biotin–streptavidin–peroxidase kit (Vector), according to manufacturer instructions. The 3,3

diaminobenzidine (Sigma Chemical, St Louis, MO) was used as a chromogen. The sections were

counterstained with Harris hematoxylin (Merck, Darmstadt, HE Germany). For negative controls, the

primary antibody was replaced with PBS.

(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Measurements were performed using the Multiplex

MAGPIX system (Millipore, MA, USA) using the xPONENT 4.2 software for acquisition and assay

Interleukin-1 [IL-1], interleukin-10 [IL-10], interleukin-17 [IL-17] and Tumor Necrosis Factor-Alpha

[TNF-α] plasma/serum levels were assayed using Kit Cytokine Milliplex Map Rat Cytokine/Chemokine

Magnetic Bead Panel design.

Collagen type I (Col I) was evaluated by immunofluorescence. The slides were immersed in xylene

and dehydrated in decreasing ethanol concentrations. The immunogenic sites were exposed by enzymatic

treatment of the synovia samples with bovine pepsin (10,000 UTD; Sigma Chemical Co.; St. Louis,

Missouri, USA) at 6 mg/ml acid buffer, pH 2.2, for 30 min at 37°C, followed by incubation in 5% BSA/PBS,

pH 7. The slides were incubated overnight at 4°C with rabbit polyclonal anti-collagen types I (Rockland;

Immunochemical Inc., Limerick, PA, USA) diluted at 1:50 in PBS. The slides were washed several times

in PBS-0.05% Tween 20 and incubated for 90 min with Rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen) diluted 1:200

in PBS containing 0.006% Evans blue. The slides were again washed several times in PBS-0.05% Tween

20 and mounted with buffered glycerin. The reaction was visualized under an Olympus fluorescence

microscope.

Morphometric analysis was done using the Image-Pro Plus 6.0 system composed by an Olympus

camera (Olympus Co, St Laurent, Quebec, Canada) coupled to an Olympus microscope (Olympus BX51),

from which the images were sent to an LG monitor by means of a digitizing system (Oculus TCX, Coreco,

Inc, St. Laurent, Quebec, Canada) and downloaded to a computer (Pentium 1330Mhz). The areal fraction

of edema, inflammatory cells, lymphocytes T and B and macrophages positive cells in synovia tissue were

determined at X400 magnification in 10 random fields by the point-counting technique (33,34) using a

reticulum grid with 100 points distributed orthogonally on the acquired image. The areal fraction was

calculated as the proportion of the number of points hitting the morphological parameters in synovial tissue

and the total grid area was expressed as a percentage. The area occupied by collagen fibers in synovia was

determined at X400 magnification in 10 random fields through optical density, adjusting the threshold level

of measurement up to the density of thick fibers (reddish orange) and down for thin fibers (yellow greenish).

The results were calculated by the area of the collagen fibers divided by the total area of synovia expressed

as a percentage.

Statistical analysis

Differences between groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test or one-

way ANOVA on-Ranks followed by Dunn´s test for parametric and nonparametric conditions, respectively.

A p value less than 0.05 was considered significant. The statistical procedure was performed with statistical

software (Graph Pad Prism 6, San Diego California).

Results

Development of arthritis model induced by methylated bovine serum albumin antigen

Synovia membrane from arthritis group presented prominent edema, inflammatory cells

infiltration and fibrotic thickening (Fig. 2A and 2B) compared to control. Arthritis group also showed

distortion of architecture and a diffuse reddish and greenish birefringence respectively of thick and thin

collagen fibers in the synovial frames (Fig. 3A) compared to control (Fig. 3A), equivalent to synovial

thickening described in H&E-staining (Fig. 2A and 2B). An irregular and inhomogeneous distribution of

thickened Col I fibers (Fig. 3A) was observed in arthritis group compared to control (Fig. 3A).

Fraction area of edema and inflammatory cells infiltration along of synovial membrane (Fig. 2A

and 2B) were increased whereas the amount of thick and thin collagen fibers was reduced (Fig. 3A) in

arthritis group compared to control. Lymphocytes T and B, as well as macrophages, can be activated by a

variety of extracellular signals to polarize towards either inflammatory and antimicrobial or wound repair

and inflammation resolution. Arthritis animals presented higher lymphocytes B and T subpopulation, as

well as macrophages than control (Fig. 2A and 2B). IL-1β, IL-10, IL-17 and TNF-α. levels plasm/serum

were higher in arthritis group than control (Fig. 4)

Collagen type V supplementation

Col V supplementation had beneficial effects leading to a significant inhibition of the

inflammation and collagen remodeling and tended to normalize synovia (Fig. 2A and 2B) Supplemented

group with Col V either 30 days showed not prominence of the edema, inflammatory infiltration cells and

fibrotic thickening compared to arthritis group (Fig. 2A and 2B). Supplemented Col V group also showed

attenuation of the diffuse reddish and greenish birefringence respectively of thick and thin collagen fibers

in the synovial frames (Fig.3A) compared to arthritis. Reversion of the irregular and inhomogeneous

distribution of thickened Col I fibers, coinciding with Picrosirius -stained preparations (Fig.3A), was

observed in Col V supplemented group either 30 days (Fig.3A) compared to arthritis. Morphometric

analysis confirmed that Col V supplementation either 30 days led to a reduction in edema and inflammatory

cells infiltration along of the synovia (Fig.2A and 2B) compared to arthritis group. No difference in thick

and thin collagen fibers amount was found between both groups (Fig.3A)

Different immunostaining intensity was exhibited by lymphocytes and macrophages in synovial

tissue from Col V supplemented (Fig. 4) and arthritis rats, and such difference was confirmed by

histomorphometric analysis. Col V supplementation either 30 days reduced macrophages, lymphocytes

subpopulation and also IL-1β, IL-10, IL-17 and TNF-α. levels in plasma/serum compared to arthritis.

Discussion

To our knowledge, this is the first study that has evaluated the potential therapeutic effects of

collagen type V on synovia inflammation and remodeling in experimental arthritis induced by methylated

bovine serum albumin antigen. This current model developed in our laboratory presented synovia

histological changes that resembled human synovitis, such as: inflammatory cells infiltration, damage to

synoviocytes, fibrotic thickening, collagen fiber destruction, and changes in cytokines profile. After four

weeks of Col V supplementation we observed inhibited edema and inflammatory cell infiltration ,

restoration of collagen fibers, and inhibited lymphocytes subpopulation and macrophages in synovia tissue,

and increased IL-1β, IL-10, IL-17 and TNF-α plasma/serum levels in arthritis animals. Therefore, Col V

therapy presented specific ability to modulate the inflammatory and remodeling processes of synovitis, with

the beneficial effects by oral administration route.

In the present study, a model of arthritis induced by methylated bovine serum albumin antigen was

used, in contrast to the classical protocols of Zymosan and type II collagen induced arthritis described in

the literature (35, 36, 37), which present moderate recruitment of macrophages and fibrotic response.

Arthritis-induced model by methylated albumin with 30-day inflammatory infiltrate showed intense

recruitment of macrophages shown by CD68+ cells and fibrosis after 45 days (38, 39). In this model, the

first injection of mBSA emulsion and complete Freund's adjuvant, which contains inactivated

Mycobacterium tuberculosis, activates the immune system, resulting in influx with synovial tissue

macrophages activation, T and B lymphocyte activation, and immune

complex formation (albumin/anti-albumin antibodies), which increases with subsequent mBSA

reinforcement (40, 41). In this inflammatory microenvironment, the activated macrophages produce a

variety of harmful substances such as toxic oxygen metabolites, proteases (metalloproteinases), nitric oxide,

etc. (42, 43). Additionally, the immune complexes (albumin/anti-albumin antibodies) activate the

complement system increasing inflammation and tissue injury (39, 40). In this context, Col V could become

a potential antigen in the inflammatory process in the synovia of mBSA -induced arthritis model, however,

present some limitations since we did not evaluate the cellular and humoral immunity for Col V. We

speculate that Col V, which is located inside the heterotypic fibrils (I/III/V), is exposed to the immune

system becoming a potential antigen.

Collagen type V has been identified in several tissues of adults. This collagen type belongs to the

fibrillar collagens family, being ubiquitous in tissues, localized inside the collagen heterotypic fibrils I/III

and considered a sequestered antigen. Collagen type V main functions are fibrogenesis control, and type I

collagen fibrils diameter regulation. Furthermore, Col V has immunogenic and antigenic properties with

potential to become an autoantigen when exposed to the immune system by metalloproteinases action, or

other inducing agents of chronic endothelial injury (17,23, 44). In the past few years, Col V has been

considered an autoantigen in pathological processes such as lung transplant rejection in mice and humans,

heart transplants, idiopathic pulmonary fibrosis, asthma, atherosclerosis, and experimental scleroderma

(14,15,16,18,19,20,44). Conversely, Col V tolerance induced by mucosal (oral/nasal) decreases

inflammation and tissue remodeling in these pathological processes (20,22,23,44). In our study, we

observed that Col V supplementation acts on collagen fibers of subsynovial tissue decreasing or delaying

fibrotic process when compared to non-supplemented arthritic animals. It has been reported that the

development of fibrosis process is related to large fibers formed by type I collagen (45). However, our

results showed that 30 days of Col V supplementation influenced the proportion of thick fibers on synovial

tissue suggesting delay in the fibrotic process. The delayed synovial remodeling can also be explained by

the reduction of T and B lymphocytes, as well as the macrophages number, in the supplemented animals .

Furthermore, our results showed inhibited IL-1β levels after Col V supplementation. IL-1β is a pro

inflammatory cytokine related to synovial cells proliferation, which results in an intense cellular infiltration ,

the "pannus". This cytokine can also be related to chemokines production such as macrophage

inflammatory protein (MIP-2) and IL-8 (46,47). Interestingly, our results showed a dramatic reduction in

IL-1β in Col V supplemented animals when compared to non-supplemented arthritis group, suggesting an

inhibitory pathway induced by Col V.

Synovitis presents chronic inflammation with an increase of activated neutrophils, macrophages,

and T lymphocytes, leading to “pannus” formation and joint destruction (48). Similarly, in our arthritis

model the increase in “pannus” formation was associated with dramatic inflammatory cells infiltration in

synovia membrane. Therapy with Col V reduced inflammation regardless of 30 days of administration, in

line with the decrease or delayed in the collagen fibers deposition, which may be attributed to the differing

effects of Col V and pathway on synovial inflammation and remodeling. The current Col V administration

reduced the number of lymphocytes and macrophages in synovia membrane compared to arthritis

independent on administration time.

The present protocol of arthritis increased inflammatory cells infiltration and in hibited collagen

content in synovia membrane, and treatment with Col V stimulated collagenesis by oral route. I t was

demonstrated that some Col V alpha1 chain peptides are involved in the control of lung transplantation

rejection after oral administration (49), suggesting a similar mechanism in the current work. After intake

protein degradation into peptides and absorption in the intestinal mucosa. These mechanisms involve active

suppression of antigen-specific cells through regulatory T cells (Treg), particularly of Th3 e Tr1 subtypes,

clonal anergy of specific cells to the antigen, and clonal deletion of cells specific for the antigen (50). While

all three mechanisms can operate simultaneously in response to oral tolerance, the active suppression and

clonal anergy are the main mechanisms of immune suppression induced by oral tolerance. In this context,

we speculate that some of these peptides in the gut-associated lymphoid tissue (GALT) could induce

tolerance to Col V, however, present some limitations since we did not evaluate mechanisms of tolerance

in arthritis model. We hypothesize that oral Col V supplementation has induced Treg Th3 cells formation ,

which are more predominant in the intestine as previously reported in the literature (50, 51). Once activated

by specific antigens, Treg Th3 cells migrate from peripheral lymphoid tissues, such as Peyer's patches and

mesenteric lymph nodes, to the site of injury and suppress cellular response independently of antigen. This

phenomenon is referred as "bystander" suppression (52). The main immunosuppressive cytokine produced

by Th3 cells is TGF-β, although minor amounts of IL10 and IL4 are also produced (53). Nasal

administration of an altered peptide ligand, analogous to an arthritogenic epitope (Hsp60), induces a great

protective effect against antigen-induced arthritis by T regs cells, which produce IL-4, TGF-β, and IL-10

(53). In our study, IL-10 was inhibited in the oral supplemented group possibly related to lower number of

B lymphocytes. It is known that cytokine secretion such as IL-10 by B lymphocytes is related to immune

response amplitude regulation. In arthritis, B cells produce IL-10, which is involved with negative

regulation as well as in experimental autoimmune encephalomyelitis, inflammation, and intestinal T -

dependent antigen response (54,55).

As previously commented, our study presents limitations since we haven’t got the support to end

the discussion assuming that oral Col V supplementation in the arthritis-induced mBSA model has triggered

a process of oral tolerance for Col V, although this collagen type itself has become an antigen in the tissue

remodeling as a consequence of the inflammatory process. Further studies are needed in order to

demonstrate cellular and humoral immunity using Col V in arthritis-induced mBSA model (antigen), and

whether Col V supplementation stimulates Treg cells and pro inflammatory cytokines.

We conclude that Col V supplementation has a protective effect against the severity of synovial

inflammation and arthritis-induced progression, suggesting that this therapeutic strategy may be promisor

for arthritis treatment.

References

1 Smith M D., The Normal Synovium, The Open Rheumatology Journal, 2011, 5, (Suppl 1:M2) 100-106

02 Nagashima M., Tanaka H., Takahashi H. et al Study of the Mechanism Involved in Angiogenesis and

Synovial Cell Proliferation in Human Synovial Tissues of Patients with Rheumatoid Arthritis Using SCID

Mice Lab Invest 2002, 82:981–988

03 Hochberg M C. MD, Silman AJ., Smolen JS., Weinblatt M.E., Weisman M.H., Rheumatology, 2015 (6)

159

04. Edwards JCW. Synovial intimal fibroblasts. Ann Rheum Dis. 1995. 54:395-7.

05. Blewis ME, Nugent-Derfus GE, Schmidt TA, Schumacher BL, Sah RL. A model of synovial fluid

lubricant composition in normal and injured joints. Eur Cell Mater. 2007 Mar 6;13: 26-39.

06.Atayde S A; Yoshinari N.H; Nascimento D.P; Catanozzi S; Andrade P.C; Teodoro W.R; et al.

Experimental diabetes modulares collagen remodeling of joint in rats. Histol Histopathol 2012, 27: 1471 –

1479.

07. Linsenmayer, TF, Collagen In: Hay, ED ed. Cell Biology of Extracellular Matrix.2.ed. 1991. New York,

Plenum Press. p. 7-43.

8. Cremer MA, Rosloniec E.F. The cartilage colla gens: a review of their structure, organization, and role

in the pathogenesis of experimental arthritis in animals and in human rheumatic disease. J Mol Med 199876:

275–288

9 Kempt J.D., Madri J.A. The immune response to human type II and type V (AB2) collagen: antigenic

determinants and genetic control in mice. J Immunol 1981, 11 (2): 90–94

10 Teodoro WR., Miron BG, Tsuzuki L, Ogido I, Velosa AP, Abatepaulo F, Capelozzi VL, Yoshinari NH.

Synovial remodeling process induced by type V collagen immunization in rabbits. Pathol Res

Pract. 2003;199 (9):605-12.

11 Ogido LT, Teodoro WR, Velosa AP, de Oliveira CC, Parra ER, Capelozzi VL, Yoshinari NH.

Abnormal collagen deposition in synovia after collagen type V immunization in rabbits. Histol

Histopathol. 2008 Mar;23(3):263-9.

12 Linsenmayer TF, Gibney E, Igoe F, Gordon MK, Fitch JM, Fessler LI, Birk DE. Type V collagen:

molecular structure and fibrillar organization of the chicken alpha 1(V) NH2-terminal domain, a putative

regulator of corneal fibrillogenesis. J Cell Biol 1993;121:1181–1189.

13 Wilkes DS, Chew T2, Flaherty KR3, Frye S2, Gibson KF4, Kaminski N5, Klemsz MJ6, Lange W2,

Noth I7, Rothhaar K2. Oral immunotherapy with type V collagen in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur

Respir J. 2015 45(5):1393-402.

14 Lott JM, Sehra S, Mehrotra P, Mickler EA, Fisher AJ, Zhang W, Presson RG, Busk MF, Goenka S,

Gunst SJ, Kaplan MH, Wilkes DS, Wenzel SE. Type V collagen-induced tolerance prevents airway

hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 15;187(4):454-7, 2013.

15 Dart ML, Jankowska-Gan E, Huang G, Roenneburg DA, Keller MR, Torrealba JR, Rhoads A, Kim B,

Bobadilla JL, Haynes LD, Wilkes DS, Burlingham WJ, Greenspan DS. Interleukin -17-dependent

autoimmunity to collagen type V in atherosclerosis. Circ Res. 29;107(9):1106-16, 2010.

16 Sumpter TL, Wilkes DS. Role of autoimmunity in organ allograft rejection: a focus on immunity to type

V collagen in the pathogenesis of lung transplant rejection. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004 Jun;

286(6):L1129-39

17 Mares DC, Heidler KM, Smith GN, Cummings OW, Harris ER, Foresman B, Wilkes DS. Type V

collagen modulates alloantigen-induced pathology and immunology in the lung. Am J Respir Cell Mol Bio l

200023(1):62-70

18 Wilkes DS, Heidler KM, Yasufuku K, Devito-Haynes L, Jankowska-Gan E, Meyer KC, Love RB,

Burlingham WJ. Cell-mediated immunity to collagen V in lung transplant recipients: correlation with

collagen V release into BAL fluid. J Heart Lung Transplant 2001 20(2):167

19 Teodoro WR, Velosa AP, Witzel SS, Garippo AL, Farhat C, Parra ER, Sonohara S, Capelozzi VL,

Yoshinari NH. Architectural remodelling in lungs of rabbits induced by type V collagen immunization: a

preliminary morphologic model to study diffuse connective tissue diseases. Pathol Res Pract. 2004; 200

(10):681-91.

20 Callado MR, Viana VS, Vendramini MB, Leon EP, Bueno C, Velosa AP, Teodoro WR, Yoshinari NH.

Autoantibody profile in the experimental model of scleroderma induced by type V human collagen.

Immunology. 2007 Sep;122 (1):38-46.

21 Vittal R, Mickler EA, Fisher AJ, Zhang C, Rothhaar K, GU H, Brown KM, Emtiazdjoo A, Lott JM,

Frye SB, Smith GN, Sandusky GE, Cummings OW, Wilkes DS. Type V collagen induced tolerance

suppresses collagen deposition, TGF-β and associated transcripts in pulmonary fibrosis. Plos One 2013,

21;8(10):e76451

22 Yasufuku K, Heidler KM, Woods KA, Smith GN Jr, Cummings OW, Fujisawa T, Wilkes DS.

Prevention of bronchiolitis obliterans in rat lung allografts by type V collagen -induced oral tolerance.

Transplantation 2002 27;73(4):500-5

23 Yasufuku K, Heidler KM, O'Donnell PW, Smith GN Jr, Cummings OW, Foresman BH, Fujisawa T,

Wilkes DS. Oral tolerance induction by type V collagen downregulates lung allograft rejection. Am J Respir

Cell Mol Biol 2001 25(1):26-34

24 Fernandes E. S., Russell F.A., Spina D., McDougall J.J., Graepel R., Gentry C. et al. Distinct Role for

Transient Receptor Potential Ankyrin 1, in Addition to Transient Receptor Potential Vanilloid 1, in Tumor

Necrosis Factor _–Induced Inflammatory Hyperalgesia and Freund’s Complete Adjuvant–Induced

Monarthritis. Arthritis & Rheumatism Vol. 63, No. 3, March 2011, pp 819–829

25Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature 227(5259):680-5, 1970.

26 Niyibizi C, Fietzek PP, van der Rest M. Human Placenta Type V Collagens Evidence for the Existence

of an α1(V) α2 (V) α3(V) Collagen Molecule. The Journal of Biological Chemistry 259(22): 14170 -

14174,1984

27 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publication No. 85-23, revised 1996.

28 Pearson CM, Wood FD. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by the injection of

mycobacterial adjuvant. VII. Pathologic details of the arthritis and spondylitis. Am J Pathol. 1963; 42:73 -

95.

29 Junqueira L.C.U., Montes G.S., Sanchez E.M. The influence of tissue section thickness on the study of

collagen by the picrosirius polarization method. Histochemistry 1982 74, 153-156.

30 Kuttan R., Di Ferrante N. Sirius red-collagen interaction: an Method for the measurement of collagen

and bacterial collagenase activity. Biochem. Int. 1980 1, 455-462

31 Junqueira L.C.U., Bignolas C., Brentani R.R. A simple and sensitive method for the quantitative

estimation of collagen. Anal Biochem. 1979. 94, 96-99.

32 Marotta M., Martino G. Sensitive spectophotometer method for the quantitative estimation of collagen.

Anal. Biochem. 1985150, 86-90.

33 Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF, Evans SM, Korbo L, Marcussen N, Møller A, Nielsen K,

Nyengaard JR, Pakkenberg B: The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point

sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS 1988, 96(10):857-881.

34 Weibel ER. Morphometry: Stereological theory and practical methods. In : Gil J, editor. Models of lung

disease-microscopy and structural methods. New York: Marcel Dekker;1990. p. 199–247

35 Dijkstra C. D., Döpp, E. A. et al Macrophages and Dendritic Cells in Antigen-Induced Arthritis

Volume 26, Issue 5, pages 513–523, November 1987

36 Griffiths R. J. et al Characterization and pharmacological sensitivity of antigen arthritis induced by

methylated bovine serum albumin in the rat,” Agents and Actions, vol. 35, no. 1-2, pp. 88–95, 1992.

37 Andersson KM1, Svensson MN1, Erlandsson MC1, Jonsson IM1, Bokarewa MI2.Down-regulation of

survivin alleviates experimental arthritis. J Leukoc Biol. 2015 Jan; 97(1):135-45. doi: 10.1189/jlb.3A0714-

317R.

38 Durga M. S. H., Chandrupatla, K.W., Yoony Y. J., Gent, et al Sustained Macrophage Infiltration upon

Multiple Intra-Articular Injections: An Improved Rat Model of Rheumatoid Arthritis for PET Guided

Therapy Evaluation BioMed Research International vol.3 2015

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/sji.1987.26.issue-5/issuetoc

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andersson%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Svensson%20MN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Erlandsson%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jonsson%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bokarewa%20MI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25381389





http://respiratory-research.com/sfx_links?ui=1465-9921-11-1&bibl=B19

39 Kehoe O, Cartwright A, Askari A, El Haj AJ, Middleton J. Intra-articular injection of mesenchymal

stem cells leads to reduced inflammation and cartilage damage in murine antigen-induced arthritis. J Transl

Med. 2014 Jun 3;12:157.

40 Barton NJ, McQueen DS, Thomson D, Gauldie SD, Wilson AW, Salter DM, et al. Attenuation of

experimental arthritis in TRPV1R knockout mice. Exp Mol Pathol 2006;81:166–70.

41 Kanai Y, Hara T, Imai A, Sakakibara A. Differential involvement of TRPV1 receptors at the central and

peripheral nerves in CFA-induced mechanical and thermal hyperalgesia. J Pharm Pharmacol 2007;59:733–

8.

42 Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. Immunobiology: The Immune System in Health and

Disease. 5th edition. New York: Garland Science; 2001

43 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland

Science; 2002.

44 Haque M.A., Mizobuchi T, Yasufuku K, Fujisawa T, Brutkiewicz R.R., Zheng Y., Woods K, Smith

G.N., Cummings O.W., Heidler K.M., Blum J.S., Wilkes D.S. Evidence for immune responses to a self-

antigen in lung transplantation: role of type V collagen-specific T cells in the pathogenesis of lung allograft

rejection. J Immunol. 2002 Aug 1;169(3):1542-9.

45 Ponticos M, Papaioannou I, Xu S, Holmes AM, Khan K, Denton CP, Bou-Gharios G, Abraham

DJ. Failed degradation of JunB contributes to overproduction of type I collagen and development of

dermal fibrosis in patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheumatol. 2015 Jan;67(1):243-53.

46 Bezerra M.C., Carvalho J.F., Prokopowitsch A.S., Pereira R.M. RANK, RANKL and osteoprotegerin

in arthritic bone loss. Braz J Med Biol Res. 2005 Feb;38(2):161-70.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kehoe%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cartwright%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Askari%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=El%20Haj%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Middleton%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24893776



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Haque%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mizobuchi%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yasufuku%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fujisawa%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brutkiewicz%20RR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Woods%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cummings%20OW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Heidler%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blum%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilkes%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12133982


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ponticos%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papaioannou%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Holmes%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Denton%20CP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25303440





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bezerra%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15785827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Carvalho%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15785827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Prokopowitsch%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15785827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pereira%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15785827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bezerra%2C+M.+C+et+al+RANKL+and+osteoprotegerin+in+arthritic+bone+loss

47 Wakisaka, S. et al. Modulation by proinflammatory cytocines of Fas/Fas ligand- mediated apoptotic cell

death of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis. Pub Med, Aichi-japan, n., p.119-128, 13 jul.

1998.

48 Chighizola CB, Favalli EG, Meroni PL. Novel mechanisms of action of the biologicals in rheumatic

diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 2014 Aug;47(1):6-16. doi: 10.1007/s12016-013-8359-x.

49 Tiriveedhi, N. Angaswamy, D. Brand, J. Weber, A. G. Gelman, R. Hachem, E. P. Trulock, B. Meyers,

G. Patterson and T. Mohanakumar. A shift in the collagen V antigenic epitope leads to T helper phenotype

switch and immune response to self-antigen leading to chronic lung allograft rejection. Clinical and

Experimental Immunology 167: 158–168, 2011.

50 Faria, A. M. C., and H. L. Weiner. 1999. Oral tolerance: mechanisms and therapeutic applications. Adv.

Immunol. 73:153–264.

51 Weiner H L. Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-beta-secreting

regulatory cells. Microbes Infect. 2001; 3(11):947-54.

52 Miller A, Lider O, Weiner HL. Antigen-driven bystander suppression after oral administration of

antigens. J Exp Med. 1991; 174:791-798.

53 Akbari O, Dekruyff RH, Umetsu DT. Pulmonary dentritic cells producing IL-10 mediate tolerance

induced by respiratory expore to antigen. Nat Immun. 2001; 2:725-731.

54 Katsikis, P. D., C.-Q. Chu, F. M. Brennan, R. N. Maini, and M. Feldmann. 1994. Immunoregulatory

role of interleukin 10 in rheumatoid arthritis. J. Exp. Med. 179:1517-1527.

55 Julie Dechanet, Pierre Merville, Isabelle Durand, Jacques Banchereau, and Pierre Miossec The Ability

of Synoviocytes to Support Terminal Differentiation of Activated B Cells May Explain Plasma Cell

Accumulation in Rheumatoid Synovium J. Clin. Invest. Volume 95, February 1995, 456-463

Values are means (±EM) of 10 animals in each group. All values were completed in few random, now

coincident fields per supplemented with daily doses for 30 days. Groups are compared using ANOVA

TEST. * IA vs Suppl (p<0, 01), # IA vs IA/Suppl (p<0, 01), *§ Suppl vs IA/Suppl (p<0, 01)

Table 1 Distribution of histological and immunohistochemistry measurements according to the groups.

Distribution of histological and immunohistochemistry

measurements according to the groups GROUPS

VARIABLES

SUPPL IA IA/SUPPL

Inflammatory cells

3,79 ± 1,59 *

23,42 ± 10,26* #

7,32 ±4,09#

Edema

4,15 ±2,86 *

40,82 ±13,40* # *§

17,42 ±3,21 # *§

Thick collagen

6,25 ±1,35*

2,12 ±1,01* #*§

2,75 ±2,02 # *§

Thin collagen

19,32 ±1,86*

11,19 ±2,83* #*§

13,16 ±2,71 #

Lymphocytes T

(CD 3 +)

40,34 ±1,55*

53,74 ±7,07* # *§

26,59 ±7,03 # *§

Lymphocytes B

(CD 20+)

4,14 ±1,40*

31,89 ±7,10* #

5,19 ±2,27#

Macrophages

(CD 68 +)

0,53 ±0,49 *

27,67 ±7,46 * #

1,87 ±2,27#

Collagen type I

40,70 ± 1,45*

27,10 ±4,26 * #

36,19 ±3,00 #

Collagen type V

9,51 ±0,83

22,47 ± 12,42 #

7,33 ± 4,15 #

Interleukin IL1β +

1,31 ±1,69 *

21,96 ±12,29 * #

4,28 ±4,75 #

Interleukin IL10+

1,31 ±1,69 *

27,95 ±17,11 * #

0,13 ±0,03 #

Interleukin IL17+

0,73 ±0,85*

27,24 ±10,65* #

2,19 ±0,50#

TNF α+

1,70 ±0,51*

18,61 ±9,74* #

1,76 ±0,39#

Metalloproteinase 2

MMP2

6,98 ±1,24*

32,10 ±7,36* #

7,86 ±3,96 #

Caspase-9

0,25 ±0,43 *§

1,10 ±1,01

4,40 ±3,87 #

Figure 1 Experimental protocol COL V supplementation.

Figure 2 – Histological sections of synovial tissue from IA, IA/Suppl and Suppl groups. Panel (A and B)

shows synovial tissue from Suppl group with vessels and synovial membrane preserved (arrowhead), and

scarce inflammatory cells (arrow). In arthritis group (Panel A and B) is observed the presence of prominent

edema, synovial membrane inflammation (arrowhead), cellular inflammatory infiltrate and fibrotic

thickening (arrow). In contrast, IA/Suppl (A and B) groups showed significant reduction of the edema,

inflammatory cells infiltrate (arrows) and fibrotic thickening, besides synovial membrane preservation

(arrowhead). Panels A and B shows peroxidase immunostaining to CD3+ (T lymphocytes), CD20+ (B

lymphocytes) and CD68+ (macrophages) in IA, IA/Suppl and Suppl groups. Synovial tissue of control

shows scarce CD3+ (E), CD20+ and CD68+ (A and B) cells. The immunoexpression of CD3+, CD20+ and

CD68+ cells (arrows) in the synovial tissue of IA/Suppl and Suppl is significantly decreased in relation

to IA group Panels (A and B). H&E staining. Original magnification; X400. Values are means (±EM) of

10 animals in each group. All values were completed in few random, now coincident fields per

supplemented with daily doses for 30 days. Groups are compared using ANOVA TEST. IA vs Suppl (p<0,

01), , IA vs IA/Suppl (p<0, 01), Suppl vs IA (p<0, 01)

Figure 3 - Panel A: shows collagen fibers in the synovia connective tissue, immunofluorescence for

collagens I and V fibers expression in the synovial from IA, IA/Suppl and Suppl groups. Suppl group shows

weak red (think fibers) and yellow-greenish (thin fibers) (arrow) birrefringence, displaying preserved and

normal distribution of collagenous fibers in the synovial membrane (arrowhead) and subsynovial

compartment. IA group shows predominance of thickened collagen fibers in the synovial membrane

(arrowhead) and subsynovial compartment (arrows). The immunofluorescence for collagen V fibers

expressed collagen V in the synovial membrane (arrowhead) and subsynovial compartment (arrows). The

Suppl and IA/Suppl groups presented collagen V decreased expression comparing to IA group in the

synovial adjacent tissue (arrows) and synovial membrane (arrowhead). The immunofluorescence for

collagen I fibers expressed collagen I in the synovial membrane (arrowhead) and subsynovial

compartment (arrows). The Suppl and IA/Suppl groups presented collagen I increased expression

comparing to IA group in the synovial adjacent tissue (arrows) and synovial membrane (arrowhead).

Panel B Show immunostaining to metalloproteinase 2, caspase-9 in IA, IA/Suppl and Suppl groups. The

Suppl and IA/Suppl groups shows scarce metalloproteinase 2 expression comparing to IA group in the

synovial adjacent tissue (arrows) and synovial membrane (arrowhead). The immunoexpression of

caspase-9 cells (arrows) in the synovial tissue of IA/Suppl is significantly increased in relation to IA

group.

Picrosírius staining visualized by polarized light; I-L: Immunofluorescence staining Original

magnification: A-H, X200; I-L, X400. Values are means (±EM) of 10 animals in each group. All values

were completed in few random, now coincident fields per supplemented with daily doses for 30 days.

Groups are compared using ANOVA TEST. IA vs Suppl (p<0, 01), IA vs IA/Suppl (p<0, 01), Suppl vs IA

(p<0, 01).

Figure 4 – Immunoexpression of IL1β, IL10, IL17 interleukins and TNFα in synovial serum from IA,

IA/Suppl and Suppl groups. Values are means (±EM) of 10 animals in each group. All values were

completed in few random, now coincident fields per supplemented with daily doses for 30 days. Groups

are compared using ANOVA TEST. IA vs Suppl (p<0, 01), IA vs IA/Suppl (p<0, 01), Suppl vs IA (p<0,

01).

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