INIBIDORES DE AQUAGLICEROPORINAS, SEUS MÉTODOS E

(11) Número de Publicação: PT 105786(51) Classificação Internacional:

A61K 31/4745 (2006)

(12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO

(22) Data de pedido: 2011.07.04

(30) Prioridade(s):

(43) Data de publicação do pedido: 2013.01.04

(73) Titular(es):

UNIVERSIDADE DE LISBOAALAMEDA DA UNIVERSIDADE, CIDADE UNIVERSITÁRIA 1649-004 LISBOA PT

(72) Inventor(es):

MARIA DA GRAÇA TAVARES REBELO DE SOVERAL RODRIGUES PT

ANGELA CASINI IT

(74) Mandatário:

MARIA SILVINA VIEIRA PEREIRA FERREIRARUA CASTILHO, N.º 50, 5º - ANDAR 1269-163 LISBOA PT

(54) Epígrafe: INIBIDORES DE AQUAGLICEROPORINAS, SEUS MÉTODOS E APLICAÇÕES

(57) Resumo: A PRESENTE INVENÇÃO REVELA MODULADORES COM BASE METÁLICA QUE SE LIGAM SELETIVAMENTE A PROTEÍNAS TRANSMEMBRANARES AQUAGLICEROPORINAS AQPS, TAIS COMO AQP3, AQP7 E AQP9, LEVANDO À SUA INIBIÇÃO. A INIBIÇÃO SELETIVA DOS CANAIS AQP É EFETUADA POR COMPOSTOS TETRACOORDENADOS COM COMPLEXOS DE OURO(III). A PRESENTE INVENÇÃO TAMBÉM DIVULGA A SUA UTILIZAÇÃO NO FABRICO DE FÁRMACOS, COSMÉTICOS E REAGENTES QUÍMICOS PARA O DIAGNÓSTICO, TRATAMENTO, PROFILAXIA E PREVENÇÃO DE CONDIÇÕES CLÍNICAS DIRETAMENTE OU INDIRETAMENTE RELACIONADAS COM A FUNÇÃO DE AQUAGLICEROPORINAS AQPS. A PRESENTE INVENÇÃO TEM APLICAÇÃO NAS INDÚSTRIAS DE CUIDADOS DE SAÚDE E COSMÉTICA E NA INDÚSTRIA QUÍMICA.

RESUMO

“INIBIDORES DE AQUAGLICEROPORINAS, SEUS MÉTODOS E

APLICAÇÕES”

A presente invenção revela moduladores com base metálica

que se ligam seletivamente a proteínas transmembranares

aquagliceroporinas AQPs, tais como AQP3, AQP7 e AQP9,

levando à sua inibição. A inibição seletiva dos canais AQP

é efetuada por compostos tetracoordenados com complexos de

ouro(III). A presente invenção também divulga a sua

utilização no fabrico de fármacos, cosméticos e reagentes

químicos para o diagnóstico, tratamento, profilaxia e

prevenção de condições clínicas diretamente ou

indiretamente relacionadas com a função de

aquagliceroporinas AQPs.

A presente invenção tem aplicação nas indústrias de

cuidados de saúde e cosmética e na indústria química.

1

DESCRIÇÃO

“INIBIDORES DE AQUAGLICEROPORINAS, SEUS MÉTODOS E

APLICAÇÕES”

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo da inibição seletiva

do transporte transmembranar do glicerol através de

aquagliceroporinas, em geral, e aos respetivos compostos

moduladores com base metálica, em particular. A presente

invenção refere-se ainda a métodos e utilizações dos

referidos compostos moduladores nas indústrias de cuidados

de saúde e cosmética.

Antecedentes e Estado da Técnica

As aquaporinas (AQPs) pertencem a um grupo altamente

conservado de proteínas membranares chamado de principais

proteínas intrínsecas (MIPs) presentes em todos os tipos de

organismos e envolvidas no transporte de água e pequenos

solutos, tais como o gicerol, nitrato e ureia [1].

As 13 isoformas humanas de AQPs (AQP0-12) são expressas

diferencialmente em muitos tipos de células e tecidos no

organismo e podem ser subdivididas em dois grupos

principais: 1) as que são estritamente seletivas para a

água (chamadas de aquaporinas ortodoxas) e 2) as que para

além de água são também permeáveis a pequenos solutos

incluindo o glicerol (chamadas “aquagliceroporinas”)[2].

Ambos os grupos de canais são utilizados em muitas funções

fisiológicas [3].

Existe um considerável potencial para a transferência de

conhecimento sobre a estrutura, função e fisiologia das AQP

2

para a clínica, e certamente existe um elevado potencial

translacional em terapêuticas baseadas em aquaporinas. Os

fármacos moduladores com base em AQP são previstos como

tendo um largo potencial de utilização no tratamento de

várias doenças tais como doenças renais, cancro, obesidade,

glaucoma, edema cerebral e epilepsia [4].

Especificamente no cancro, as AQPs foram descritas como

sendo sobre-expressas em vários tipos de tumores e como

estando associadas ao risco aumentado de metástases e com

desenlace desfavorável, e a expressão forçada de AQPs foi

demonstrada como promovendo a proliferação celular [5] e a

invasão [6]. Notavelmente, as AQPs são também essenciais

para a angiogénese [7] incluindo a angiogénese tumoral [8].

Presentemente estão descritos muito poucos inibidores de

AQPs que sejam candidatos adequados para ensaios clínicos.

Apesar de várias AQPs serem inibidas por compostos

mercuriais tais como o HgCl2 [9], estas substâncias são

não-seletivas na sua ação e são extremamente tóxicas.

Outros sais inorgânicos tais como o AgNO3 e o HAuCl4, que

são aptos para interagir com os grupos sulfidrilo das

proteínas como os mercuriais, também demonstraram inibir a

permeabilidade à água em membranas plasmáticas de raízes, e

em particular para o AgNO3 foi descrita a inibição

eficiente da permeabilidade à água em glóbulos vermelhos

humanos (hRBC) (EC50 = 3,9 M) [10]. Vários outros

candidatos bloqueadores da AQP1 também foram descritos,

incluindo o tetraetilamónio [11], a acetazolamida [12] e o

DMSO [13]; contudo, outros estudos indicaram pouca ou

nenhuma inibição da AQP1 pelos sais de tetraetilamónio ou

acetazolamida [14] e a inibição pelo DMSO resulta de um

efeito de controlo osmótico mais do que de uma verdadeira

3

inibição [15]. Recentemente, vários artigos descreveram a

inibição da AQP4 por uma série de arilsulfonamidas (Pedido

de patente US 2007/0281978 A1), fármacos antiepiléticos e

moléculas relacionadas, com forte inibição em concentrações

micromolares baixas [16]; contudo, estes resultados não

puderam ser confirmados, sem atividade inibitória

encontrada mesmo a elevadas concentrações de qualquer um

dos inibidores putativos de AQP4 [17]. Muito recentemente,

Yool e colaboradores descreveram a inibição da AQP1 e da

AQP4 por um análogo da sulfonamida Bumetamida [18].

Sumário da invenção

A presente invenção descreve moduladores de inibição com

base metálica de aquagliceroporinas transmembranares

celulares que se ligam seletivamente a pelo menos uma

aquagliceroporina, preferencialmente AQP3, AQP7 e AQP9.

Uma forma de realização preferida da presente invenção

proporciona moduladores de inibição com base metálica de

aquagliceroporinas transmembranares celulares que consistem

em compostos tetracoordenados a complexos de ouro(III).

Em outra forma de realização da presente invenção, os

moduladores de inibição de aquagliceroporinas

transmembranares celulares compreendem compostos

inorgânicos onde os derivados de Au(III) e Au(I) apresentam

ligandos dadores de azoto monodentados, bidentados ou

tridentados, grupos fosfano e trifenilfosfina trisulfonato

de sódio.



aquagliceroporinas transmembranares celulares compreendendo

4

compostos orgânicos de ouro, onde os ligandos orgânicos são

preferencialmente 6-(1,1-dimetilbenzil)-2,2'-bipiridina),

substituído-2-fenil-piridina ou a parte 2-

[[(dimetilamino)metil]fenil] e 1,3-bis(piridin-2-

ilmetil)benzeno é preferida, juntamente com grupos fosfina

e ligandos tiolato.


moduladores de inibição de aquagliceroporinas

transmembranares celulares compreendem complexos

ditiocarbamato de Au(III), Au(I) e Au(III) com ligandos

carbenos N-heterocíclicos (NHC), complexos de ouro

multinucleares, preferivelmente compostos de Au dinucleares.



aquagliceroporinas transmembranares celulares compreendendo

centros metálicos tais como Pt(II), Pd(II) e Cu(III) e

preferivelmente complexos heteronucleares tais como Au/Ti,

Au/Ru, Au/Pt, Au/Pd.


moduladores de inibição das aquagliceroporinas

transmembranares celulares são preferencialmente

selecionados a partir da cisplatina, NAMI-A, sulfadiazina

de prata, aurotioglucose e auphen.



aquagliceroporinas transmembranares celulares usados no

tratamento, profilaxia e prevenção de condições clínicas,

tais como cicatrização, cancro e crescimento de tumores,

angiogénese, condições patológicas da pele, obesidade,

5

doenças renais, doenças das glândulas salivares, doenças

alérgicas, glaucoma, edema cerebral e epilepsia ou qualquer

condição clínica relacionada com a função da AQP3.


moduladores de inibição com base metálica de

aquagliceroporinas transmembranares celulares são

utilizados para o fabrico de compostos farmacêuticos e kits

(conjuntos) de reagentes de diagnóstico em que em que o

substrato ativo é selecionado com base em propriedades bio-

fisiológicas semelhantes a cada um dos acima mencionados

moduladores de inibição de aquagliceroporinas.


proporciona conjuntos ou kits de diagnóstico, utilizados na

deteção da atividade de aquagliceroporinas.

Descrição Geral da Invenção

Os fármacos moduladores com base de ouro de aquaporinas têm

um largo potencial de utilização no tratamento de estados

edematosos, cancro, obesidade, cicatrização, epilepsia e

glaucoma devido à significativa especificidade e eficácia

do mecanismo de ligação e inibição envolvido.

Na presente invenção os compostos com base de ouro são

considerados como possíveis inibidores de AQPs, e

descrevemos aqui o efeito inibitório altamente específico

de uma série de complexos metálicos baseados em diferentes

metais de transição, compreendendo os seguintes: o fármaco

anticancerígeno cis-[PtCl2(NH3)2] (cisplatina), a

antimetástica trans-[Ru(dmso)(Him)Cl4] (dmso =

dimetilsulfoxido, Him = imidazol, NAMI-A) (Pedido de

Patente WO 98/00431), a antibacteriana Ag(I) sulfadiazina

6

(AgSDZ) [19], o agente antirreumático aurotioglucose (AuTG)

[20], e o composto de ouro(III) anticancerígeno

[Au(phen)Cl2]Cl (phen = 1,10-fenatrolina, Auphen)

[21,22,23] (Figura 1) na permeabilidade ao glicerol da AQP3.

O efeito dos compostos foi testado por um método de fluxo

interrompido em hRBC que especificamente expressam uma

grande quantidade de AQP1 e de AQP3 [24,25] e em linhas de

células PC12 transfetadas com sobre-expressão de AQP1 ou de

AQP3.

O objetivo da presente invenção foi a identificação de

moduladores com base metálica que se ligam seletivamente a

aquagliceroporinas, incluindo a AQP3, e as respetivas

utilizações em métodos para o desenvolvimento e/ ou

produção e/ ou utilização terapêutica de compostos

farmacêuticos e/ ou cosméticos e conjuntos ou kits de

diagnóstico. O objetivo acima referido é conseguido de

acordo com a presente invenção através de certos compostos

com base de ouro, tal como descrito em seguida.

Descrição das Figuras

As seguintes figuras proporcionam as formas de realização

preferidas para a ilustração da descrição e não devem ser

consideradas como limitantes do âmbito da invenção.

Figura 1 – Compostos metálicos utilizados na presente

invenção;

Figura 2 - (A) Permeabilidade à água e ao glicerol (% do

controlo) em hRBC após tratamento durante 5 min com os

compostos utilizados e com HgCl2 (100 e 500 M). O efeito

marcado do Auphen (100 M) está representado.

7

Traçados representativos da permeabilidade à água (B) e ao

glicerol (C) de hRBC (controlo e após incubação com 5 M

Auphen à temperatura ambiente). (D) Permeabilidade à ureia

(% do controlo) após tratamento com Auphen (5 e 100 M).

Figura 3 – Inibição do transporte de glicerol ao longo do

tempo por 5M Auphen. O inserto mostra o decréscimo

progressivo da permeabilidade ao glicerol observado nos

ensaios de atividade, onde o aumento do volume celular

devido á entrada de glicerol diminui drasticamente com o

tempo de incubação.

Figura 4 – Inibição do transporte de glicerol dependente da

concentração em hRBC pelo Auphen (concentrações dos

compostos na gama de 0,5-10 M; IC50 = 0,78 0,08 M).

Figura 5 – Inibição da permeabilidade ao glicerol (% do

controlo) de hRBCs após tratamento com Auphen (2M), e

reversibilidade por lavagem com PBS ou incubação com 2-

mercaptoethanol (1 mM durante 30 min).

Figura 6 - (A) Permeabilidade à água e ao glicerol de

células PC12 selvagens e PC12 transfetadas com a AQP1 ou

com a AQP3. Foram encontradas diferenças significativas

para os clones PC12-AQP3 em relação ao PC12-selvagem. (B)

Efeito do Auphen na permeabilidade ao glicerol de células

transfetadas PC12-AQP3.

Figura 7 – (A) Estruturas dos complexos de Au(III) Audien e

Aucyclam, e do ligando Phen. (B) Efeito do Auphen, Phen,

Aucyclam e Audien na permeabilidade ao glicerol (% do

controlo). (B) Curva dose resposta do Audien (IC50 = 16,62

± 1,61 M).

Descrição detalhada da invenção

Métodos

8

Química

Os compostos de ouro e o NAMI-A foram preparados de acordo

com procedimentos da bibliografia (ver referências ao longo

do texto). A pureza dos compostos foi confirmada por

análise elementar e todos mostraram pureza superior a 98%.

A cisplatina, a sulfadiazina de prata, a aurotioglucose e o

2-Mercaptoethanol foram provenientes da Sigma.

Colheita e preparação dos eritrócitos

Amostras de sangue venoso colhidas em anticoagulante

citrato (ácido cítrico 2,7 %, citrato trisódico 4,5 % e

glucose 2%), foram obtidas a partir de voluntários humanos

saudáveis (Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa).

O sangue fresco foi centrifugado a 750 xg durante 5 min a

4ºC e o plasma e o revestimento branco foram desprezados.

Os eritrócitos empacotados foram lavados três vezes em PBS

(KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,76 mM, Na2HPO4 10,1 mM, NaCl 137 mM,

pH 7,4), diluídos para um hematócrito de 0,5% e

imediatamente utilizados nas experiências.

Culturas de Células e Transfeções

De modo a obter clones de PC12 (linha celular derivada de

um feocromocitoma de medula adrenal de rato) que sobre-

expressem tanto AQP1 de rato como AQP3 de rato, vinte

microgramas de pcDNA3-AQP1 ou pcDNA3-AQP3 foram

transfetados em PC12 selvagem por eletroporação. Após

seleção com sulfato de geneticina (GIBCO) foram analisados

40 clones quanto aos níveis de expressão de AQP1 ou de AQP3.

Dos 20 clones positivos, com níveis de expressão de AQPs

variáveis, selecionámos para cada AQP os que apresentavam

expressão mais elevada. As células PC12 foram cultivadas em

meio Dulbecco’s Eagle’s modificado (Invitrogen)

9

suplementado com 5% de soro bovino fetal, 10% de soro de

cavalo, e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) numa

incubadora com CO2 (10%) a 37 °C. Foi adicionada geneticina

a 0,2 mg/ml à cultura de clones com sobre-expressão de AQPs.

Os níveis de sobre-expressão de AQP foram determinados por

análise Northern blot e expressos em relação às PC12

selvagens. A análise de RNA e a caracterização funcional

destes clones foram descritos com detalhe previamente [32].

Medições do volume celular

O volume médio dos hRBC em solução isotónica foi

determinado utilizando um contador de células CASY-1

(Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany) e foi calculado

como sendo 82 fL. Os volumes de equilíbrio das células PC12

foram obtidos por microscopia de contraste de fase num

microscópio invertido (Axiovert Zeiss 100M) equipado com

uma câmara digital. As células plaqueadas foram desalojadas

por aspiração mecânica com pipeta, lavadas e ressuspensas

em PBS. Para cada conjunto de dados medidos, foi colocada

uma alíquota de suspensão de células numa lâmina de

microscópio e foi tirada e analisada uma média de 6

fotografias com 4-6 células cada, utilizando o software NIH

ImageJ. As células foram consideradas com uma forma

esférica e o diâmetro foi calculado a partir da média da

dimensão máxima e mínima de cada célula. Os volumes

calculados foram 1076 123 m3 para todos os clones

medidos.

Experiências de fluxo interrompido com dispersão da luz

As experiências de fluxo interrompido foram realizadas num

aparelho HI-TECH Scientific PQ/SF-53, com um tempo morto de

2 ms, com controlo de temperatura e ligado a um

microcomputador. As experiências foram realizadas a

10

temperaturas de 10 ºC a 37 ºC. Para cada condição

experimental, foram analisados 5-7 replicados. Para a

medição da permeabilidade osmótica da água (Pf), 100 L de

uma suspensão de eritrócitos frescos (0,5%) ou de células

PC12 (1,5 103 to 3,5 103 células/mm3) foram misturados

com igual volume de PBS contendo 200 mM de sacarose como

osmolito não permeável para produzir um gradiente de 100 mM

de sacarose dirigido para o interior. A cinética de

plasmólise celular foi medida pelo decurso do tempo da

intensidade de luz dispersa a 90º a 400 nm até ter sido

atingido um sinal de luz dispersa estável.

O Pf foi estimado através de Pf = k (Vo/A)(1/Vw(osmout)∞),

onde Vw é o volume molar da água, Vo/A é a razão volume

para área celular inicial e (osmout)∞ é a osmolaridade final

do meio após ter sido aplicado o gradiente osmótico e k é a

constante de tempo da exponencial simples ajustada ao sinal

de luz dispersa de plasmólise dos eritrócitos. Para as

células PC12, foi utilizada uma função exponencial dupla e

a média ponderada da constante de velocidade kde =

(∆I1k1+∆I2k2 1+∆I2), onde ∆I1 e ∆I2 correspondem às

variações de sinal com uma constante de velocidade lenta k1

ou uma rápida k2, foi alternativamente usada para calcular o

Pf [38].

Para a permeabilidade ao glicerol (Pgly), 100 L da

suspensão de eritrócitos ou de células PC12 foram

misturados com igual volume de PBS híper-osmótico contendo

200 mM de glicerol criando um gradiente de 100 mM de

glicerol dirigido para o interior. Após a primeira

plasmólise rápida inicial devido à saída de água, o influxo

de glicerol em resposta ao seu gradiente osmótico foi

11

seguido pelo influxo de água com subsequente re-

turgescência celular. O Pgly foi calculado como Pgly = k

(Vo/A), onde k é a constante de tempo da exponencial

simples ajustada ao sinal de luz dispersa do influxo de

glicerol nos eritrócitos [27]. Para as células PC12, a

velocidade de re-turgescência devida ao influxo de glicerol

foi mediada pelo declive de um ajuste de regressão linear.

Para as experiências de inibição, as células foram

incubadas com diferentes concentrações dos complexos, a

partir de soluções stock recentemente preparadas, durante

vários tempos à temperatura ambiente antes das experiências

de fluxo interrompido. A concentração de inibidor

necessária para atingir 50% de inibição (IC50) foi calculada

pela regressão não linear de curvas de dose-resposta (Graph

Pad Prism, Inc) pela equação: y=ymin+(ymax-ymin)/(1+10((LogIC50-

[Inh])H)), onde y é a percentagem de inibição obtida para cada

concentração de inibidor [Inh] e H é o declive de Hill. A

energia de ativação (Ea) do transporte de água e de

glicerol foi calculada a partir do declive do gráfico de

Arrhenius (lnPf ou lnPgly em função de 1/T) multiplicado

pela constante dos gases R. As osmolaridades de todas as

soluções foram determinadas por depressão do ponto de

congelação num osmómetro semi-micro (Knauer GmbH, Berlin,

Germany) utilizando padrões de 100 e 400 mOsM.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como a média desvio padrão da

média de pelo menos quatro experiências independentes, e

foram analisados com o teste de t Student emparelhado ou

com a análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo

teste Tukey. Um valor de P 0,01 foi considerado como

sendo estatisticamente significativo.

12

Resultados

O efeito dos diferentes complexos metálicos com base de

Pt(II), Ru(III), Ag(I), Au(I,III) (Figura 1) foi testado na

permeabilidade à água e ao glicerol dos hRBCs. Com este

propósito, os hRBCs incubados em tampão PBS isotónico foram

confrontados com uma solução hipertónica de sacarose

(soluto impermeante, induzindo a plasmólise celular) ou

solução hipertónica de glicerol (permeante, as células

plasmolisam devido ao gradiente híper-osmótico e re-turgem

devido à entrada de glicerol). Uma vez que os hRBCs

demonstraram expressar uma grande quantidade de AQP1 e de

AQP3 responsáveis pela permeabilidade membranar à água e ao

glicerol [25,26,27], esta experiência permite a avaliação

direta da atividade destas aquaporinas e é deste modo um

ensaio de despiste de moduladores da função de aquaporinas.

A partir da velocidade de variação do volume celular

(plasmólise e re-turgescência) após impostos os choques

osmóticos, a permeabilidade membranar à água e ao glicerol

pode ser calculada [27].

A Figura 2A mostra o efeito induzido pelos fármacos

metálicos na AQP1 e na AQP3 em comparação com o HgCl2, um

inibidor da atividade de aquaporinas muito conhecido. Os

resultados obtidos demonstraram que o complexo de Au(III)

Auphen é o mais efetivo da série na permeabilidade ao

glicerol, e de longe o mais efetivo em relação ao composto

mercurial (P<0,5). A Figura 2B e C mostram traçados

representativos das experiências de fluxo interrompido com

os hRBC controlo e tratados com Auphen onde é ilustrada a

inibição do fluxo osmótico de água (principalmente através

da AQP1, Figura 2B) ou do fluxo de glicerol (através da

AQP3, Figura 2C). Para os hRBCs controlo, os valores da

permeabilidade osmótica à água (Pf) a 10 ºC foram (4,17

13

0,39) 10-2 cm s-1 (n=5) e os valores da permeabilidade ao

glicerol (Pgly) a 23 ºC foram (1,84 0,23) 10-5 cm s-1

(n=5). Como representado na Figura 2A, o Auphen mostrou um

efeito modesto na permeabilidade à água (ca. 20% de

inibição), porquanto sendo capaz de reduzir drasticamente o

transporte de glicerol com uma permeabilidade residual de

ca. 11% (90% de inibição). O efeito menor obtido para a

permeabilidade à água aponta para um efeito específico na

AQP3, a qual é ela própria um canal transportador de água

[28], mas com uma contribuição menor para o fluxo total de

água através das membranas dos hRBCs onde a AQP1 é o canal

de água principal.

Para assegurar a seletividade do composto, o efeito do

Auphen foi adicionalmente testado no transporte de ureia

como descrito na secção descrição detalhada. Notavelmente

não pode ser observado um efeito significante para nenhuma

das concentrações testadas em comparação com os controlos

(P>0,05) (Figura 2D).

Seguindo estes resultados prometedores, fomos investigar

ainda a inibição do transporte de glicerol através da AQP3

avaliando o efeito do tempo de incubação dos hRBCs com o

Auphen. A Figura 3 mostra o efeito inibitório de uma

concentração fixa de Auphen (5M) onde uma inibição máxima

após um decaimento exponencial da atividade pode ser

observado aos 30 min de incubação das amostras à

temperatura ambiente (t.a.). É relevante mencionar que não

foi detectada hemólise celular mesmo após 3 horas de

incubação com o composto, assegurando um efeito inibitório

não tóxico.

14

Subsequentemente, foi avaliada dependência da concentração

da inibição do transporte de glicerol nos hRBC pelo Auphen

incubado 30 min à temperatura ambiente (Figura 4). De

acordo com os resultados obtidos o valor da IC50 para o

Auphen foi calculado como 0,78 0,08 M.

A energia de ativação (Ea) para o transporte de água e do

glicerol, um parâmetro valioso que indica a contribuição

dos canais proteicos na permeação, foi também estimada a

partir de um gráfico de Arrhenius. Aquando do tratamento

dos hRBC com 5M Auphen, foram obtidos valores de Ea

similares para o transporte de água para o controlo (3,90

0,35 kcal mol-1) e para os hRBCs tratados com Auphen (4,12

0,98 kcal mol-1). Contudo, a Ea para a permeação do

glicerol aumentou ca. 54 % na presença de Auphen (8,52

0,81 a 13,15 1,12 kcal mol-1). Uma vez que a concentração

de Auphen utilizada no ensaio foi mais elevada do que a

IC50 (correspondendo aproximadamente a 80% de inibição), o

aumento na Ea está de acordo com um bloqueio parcial do

canal AQP3. Em relação ao transporte da água, a variação

observada na Ea não foi significativa (P>0,05); na

realidade, nos hRBC a contribuição dos canais para a

permeabilidade à água total é normalmente considerada como

sendo 90% enquanto a bicamada adiciona os restantes 10%

[29]. A inibição total de 20% observada com o Auphen

(Figura 2) somente reduziria a contribuição da via AQP1

para 87,5%, sendo deste modo responsável pelo valor

equivalente (ao controlo) da Ea medida. Estando a AQP1

ainda ativa, esta pode ser responsável pelo fluxo total da

água mantendo-se a Ea para a permeação da água inalterada.

Para avaliar a reversibilidade da inibição com Auphen, os

hRBCs pré-tratados com Auphen 2M durante 30 min à

15

temperatura ambiente foram subsequentemente lavados com PBS

ou com o agente redutor 2-mercaptoetanol (MeOH, 0,1 mM).

Como pode ser observado na Figura 5, a lavagem da amostra

duas vezes com PBS teve um efeito limitado na recuperação

da inibição da permeabilidade ao glicerol pelo Auphen.

Contrariamente, a incubação da amostra de hRBC tratados,

com MeOH durante 30 min produziu uma recuperação quase

completa da permeabilidade ao glicerol (ca. 90%), sugerindo

que o MeOH compete com o Auphen para os grupos tiol.

Os resultados obtidos com o MeOH, assim como a conhecida

afinidade dos iões ouro para a ligação aos grupos

sulfidrilo das proteínas, sugere que a inibição da AQP3

pelo Auphen poderá envolver a ligação proteica direta do

centro de Au aos resíduos de cisteína, como foi já descrito

para o HgCl2. Seguramente, a inibição pelo mercúrio é

provável que ocorra por ligação covalente à Cys 189

localizada imediatamente após a entrada extracelular do

poro de água da hAQP1 [30] e também a outras regiões da

proteína, causando ou o bloqueio ou alterações

conformacionais com a resultante inibição do transporte de

água [31].

Para melhor confirmar o efeito especifico do Auphen no

transporte de glicerol da AQP3, a inibição da permeação do

glicerol pelo Auphen foi também avaliada em células PC12

transfetadas de modo estável com AQP1 ou AQP3 de rato

(Tabela 1) [32].

Tabela 1. Aumento da expressão e permeabilidades de

células PC12. Os aumentos da expressão de mRNA foram

determinados por análise Northern blot e estão

normalizados relativamente ao clone selvagem PC12wt.

16

Clone Nível de

expressão PGly 10

-7 (cm s

-1) Pf 10

-2 (cm s

-1)

PC12wt 1,0 2,16 0,64 3,76 0,50

AQP1 4,0 1,91 0,25 10,11 1,84

AQP3 2,0 3,78 0,24 4,00 0,52

Com este propósito, as células foram plaquedas em frascos e

após atingirem confluência foram destacadas mecanicamente

por pipetagem para dentro e para fora do meio de cultura

celular. As células foram lavadas duas vezes com PBS e

foram resuspensas a uma densidade de 1,5 103 to 3,5 103

células/mm3. As suas permeabilidades à água e ao glicerol

foram analisadas por experiências de fluxo interrompido

semelhantes ás descritas anteriormente para os hRBC e os

resultados estão representados na Figura 6A. O aumento da

permeabilidade à água para as células com sobre-expressão

de AQP1 (2,7 vezes) e o da permeabilidade ao glicerol para

as células com sobre-expressão de AQP3 (1,8 vezes)

correlaciona-se bem com o seu respectivo nível de expressão

de proteína (Tabela 2). Quando tratadas com Auphen (10 a

1000 M) um decréscimo da permeabilidade ao glicerol foi

somente observado para a linha celular PC12-AQP3 (Figura

6B); nenhuma das outras linhas celulares (selvagem e PC12-

AQP1) foram afetadas relativamente à permeabilidade ao

glicerol ou à água (dados não representados).

Para avaliar a hipótese mecanística que considera o centro

de ouro como responsável pela inibição da AQP3, o ligando

Phen, assim como os complexos de Au(III) [Au(dien)Cl]Cl2

[22] (dien = dietilentriamine, Audien) e

[Au(ciclam)](ClO4)2Cl [22] (ciclam = 1,4,8,11-

tetraazaciclotetradecane, Aucyclam) (Figura 7A) foram

testados relativamente ao transporte de glicerol em hRBCs.

17

Deverá ser anotado que o Auphen pode sofrer a hidrólise dos

cloretos em meio aquoso e reagir com biomoléculas por

reações de substituição de ligandos. Por outro lado,

enquanto que o Audien apresenta um núcleo AuN3Cl que também

pode sofrer ativação via libertação do ligando cloreto, o

Aucyclam é um complexo de ouro(III) com um cromóforo AuN4

sem ativação química, resultando numa fraca reatividade e

em efeitos escassos na atividade biológica (p.ex.

anticancerígeno) [22]. Os resultados obtidos, representados

na Figura 7B, confirmam que enquanto com o Audien a uma

concentração de 50 M se atinge uma inibição de 80%

(significativamente mais baixa do que a inibição de 90%

observada para o Auphen à mesma concentração), a sua IC50 é

20 vezes mais elevada do que a observada para o Auphen

(IC50 = 16,62 ± 1,61 M, Figura 7C). Por outro lado, o

Aucyclam e o Phen são totalmente inativos.

Enquanto que a AQP1 é um canal seletivo para a água, a AQP3

permeia tanto a água como o glicerol em eritrócitos humanos.

Para além do facto ser também ser um canal transportador de

água [28], a sua contribuição para o volume total do fluxo

de água através das membranas dos hRBC é mínima comparada

com a AQP1 [25]. Inversamente, foi demonstrado que medeia a

maior parte dos movimentos de glicerol através das

membranas dos hRBC [25,27]. Para além de RBCs, a AQP3 tem

uma ampla distribuição em tecidos, em células epiteliais do

rim, vias aéreas e pele, e em células dendríticas imaturas,

sugerindo um papel na reabsorção de água, secreção das

mucosas, hidratação da pele, doenças alérgicas e regulação

do volume celular [33].

Na presente invenção descrevemos a despistagem de

diferentes fármacos metálicos na inibição da AQP1 e da AQP3

18

em hRBC. De entre os vários compostos testados, foi

observada a inibição potente e seletiva da permeabilidade

ao glicerol através da AQP3 em hRBC pelos complexos

metálicos de ouro(III), nomeadamente Auphen e Audien. Ambos

os compostos são complexos de ouro(III) tetra-coordenados

com geometria quadrada planar nos quais o estado de

oxidação do Au(III), ao contrário do caso do NaAuCl4, está

estabilizado pela presença de átomos de azoto nos ligandos

fenantrolina e dietilenotriamina. Curiosamente, ambos os

compostos foram anteriormente referidos possuírem

propriedades anticancerígenas in vitro [22,23]. Assim, o

Auphen e o Audien inibem o transporte de glicerol em hRBC

com uma IC50 = 0,78 0,08 M e IC50 = 16,62 ± 1,61 M,

respetivamente, enquanto apresentam apenas um efeito

inibitório muito modesto da permeabilidade à água.

O aumento observado na Ea para o transporte do glicerol em

hRBC sem alteração concomitante da Ea para o transporte de

água pelo tratamento com Auphen, aponta para um bloqueio

específico do canal da AQP3 sem afetar a AQP1. Notavelmente,

os compostos Au(III) são muito mais efetivos na AQP3 do que

o inibidor não-específico das aquaporinas HgCl2, e o mais

importante é que são não tóxicos para as células na gama

total de concentrações testadas. Na realidade, durante o

tempo de duração das experiências, não foi detetada

qualquer hemólise mesmo após 4 horas de incubação com os

compostos de Au(III).

A especificidade do Auphen para a AQP3 foi adicionalmente

confirmada pela avaliação do transporte do glicerol em

linhas de células PC12 transfetadas com AQP1 ou com AQP3 de

rato. O efeito inibitório marcado do composto

exclusivamente para o clone de células PC12-AQP3 revela a

19

sua interação específica com resíduos que não podem ser

acedidos em AQP1. Contudo, foi necessária uma concentração

mais elevada de Auphen para produzir o mesmo efeito

inibitório observado nos hRBCs; para além do facto de que o

Auphen poderá ter uma menor afinidade para a AQP3 de rato

do que para a AQP3 humana, a possibilidade de ligação do

Auphen a outros grupos reativos na membrana celular total

decrescendo a sua concentração efetiva no meio e portanto

levando a uma subvalorização da IC50 não deve ser

desprezada. As células PC12 são muito maiores dos que os

RBCs; assim, a presença de um maior número destes grupos

reativos poderá eventualmente contribuir para um maior

decréscimo da concentração efetiva de Auphen disponível

para o bloqueio da AQP3.

A inibição da AQP3 pelo Auphen dependente do tempo está de

acordo com o perfil de reatividade típica deste complexo de

ouro(III) em solução aquosa. De facto, vale a pena

mencionar que, como usualmente encontrado para várias

outros fármacos metálicos, os compostos de ouro(III)

comportam-se como “profármacos” [34]. Por outras palavras,

necessitam de um processo de “ativação química”, i.e. uma

transformação química específica (p.ex. substituição de

ligando, processo redox, hidrólise) antes de poderem reagir

com os alvos biomoleculares; somente as “espécies ativadas”

estão aptas para se ligar ao alvo e produzir os efeitos

farmacológicos. No caso da ativação do Auphen é muito

provável que esta seja atingida pela libertação de pelo

menos um ligando haleto do cromóforo de ouro(III)

tetracoordenado AuN2Cl2 e substituição por ligandos

água/hidróxido [22] antes da possível coordenação metálica

direta à AQP3. De um modo semelhante, o Audien pode ligar-

se à AQP3 após hidrólise do único ligando cloreto, mas de

20

um modo ligeiramente menos eficiente do que o Auphen como

demonstrado pelo seu valor da IC50. Inversamente, o

complexo de Au(III) quimicamente estável Aucyclam revela

falta de propriedades de inibição, suportando a hipótese de

que o centro de ouro é essencial para a inibição e muito

provavelmente está envolvido na ligação à proteína.

O Auphen também resultou ser ineficaz como inibidor do

transporte de ureia em hRBC. A capacidade da AQP3 para

transportar ureia tem sido controversa [35,36]. No

eritrócito, o transportador de UT-B [37] é responsável pela

muito elevada permeabilidade à ureia, reduzindo a

plasmólise osmótica dos RBCs quando passam através do rim.

Portanto, quando comparada com os transportadores de ureia,

a permeabilidade da ureia através da AQP3 poderá ter

somente uma contribuição negligenciável e portanto a sua

inibição não seria suficiente para se observar um

decréscimo da permeabilidade à ureia. Uma vez que o Auphen

não afetou a permeabilidade à ureia, este resultado indica

que esta droga metálica é específica para a AQP3 e não tem

qualquer efeito no UT-B. O mecanismo da inibição pelo ouro

é muito provavelmente devido à capacidade do Au(III)

interagir com os grupos sulfidrilo das proteínas tais como

os tiolatos das cisteínas. Esta hipótese é parcialmente

confirmada pela recuperação quase completa da atividade da

AQP3 pelo tratamento dos hRBC com MeOH. Contudo, podem

ocorrer outros modos de ligação do Auphen (p.ex. com grupos

histidina).

Os fármacos com base metálica moduladores de aquaporinas

têm um largo potencial de utilização no tratamento de

estados edematosos, cancro, obesidade, cicatrização,

epilepsia e glaucoma. Presentemente estão descritos muito

poucos inibidores de AQPs que sejam possíveis candidatos

21

para ensaios clínicos. Relatamos aqui a potente e seletiva

inibição dos canais AQP3 por complexos de ouro(III)

despistados em hRBC e em células PC12. Os resultados

obtidos sugerem a utilização dos complexos de ouro(III) com

ligando com base de azoto como possíveis inibidores de

aquagliceroporinas, especificamente da AQP3, que poderiam

ser explorados na prevenção, profilaxia e tratamento de

estados patofisiológicos diretamente ou indiretamente

relacionados com aquagliceroporinas (p.ex. AQP3), ou

utilizados como ferramentas biológicas para avaliar a

função da AQP3.

De acordo com um primeiro aspeto da invenção, é proposto um

modulador inibitório das aquagliceroporinas relativamente

às suas propriedades de transporte transmembranar do

glicerol, em que o modulador se liga seletivamente a

aquagliceroporinas, incluindo AQP3, AQP7 e AQP9.

De acordo com outro aspeto da invenção, é proposto um

modulador inibitório de aquagliceroporinas dentro do

contexto do primeiro aspeto mencionado, compreendendo

compostos inorgânicos com a fórmula geral: [Au(substituido-

1,10-fenantrolina)X2]X (X = Cl, OH) do tipo abaixo

apresentado (I), onde R pode ser o protão ou é selecionado

a partir de um grupo constituído por grupos alifáticos,

heteroalifáticos, aromáticos, heteroaromáticos, alifático-

aromáticos, heteroalifático-heteroaromáticos,

cicloalifáticos, e heterocicloalifáticos; ou por aminas

(p.ex. NH2, aminas alifáticas –R-NH2); ou por halogéneos

(p.ex. cloro, iodo); ou por ligandos com grupos hidroxilo

funcionais (p.ex. -R-OH); ou por ligandos contendo éter (de

formula geral –R-O-R’); ou por ligandos contendo carbonilo

(-R-CO-OH); ou por grupos sulfonamídicos, ou por grupos

22

nitrilo/nitro, ou por partes peptídicas. Adicionalmente, a

estrutura envolvente fenantrolina pode incluir um ou mais

átomos substituintes de azoto, oxigénio e/ou enxofre.

(I)




compostos inorgânicos com a fórmula geral: [Au(substituído-

2,2’-bipiridina)Cl2]PF6 do tipo abaixo apresentado (II),

onde a substituição do anel bipiridina é em 6,6’ (a), ou

4,4’ (b), ou 5,5’(c), e onde R é selecionado de um protão

ou a partir de um grupo constituído por grupos alifáticos,









nitrilo/nitro, ou por partes peptídicas. Adicionalmente a

estrutura envolvente bipiridina pode incluir um ou mais


NN

R3 R6

R4 R5

R2 R7

R8R1

23

(II)




compostos inorgânicos com a fórmula geral: [Au(substituído-

2,2’,2”-terpiridina)X]X2 (X =Cl, OH) do tipo abaixo

apresentado (III), onde R é selecionado de um protão ou a

partir de um grupo constituído por grupos alifáticos,









nitrilo/nitro, ou por partes peptídicas. Adicionalmente a

estrutura envolvente terpiridina pode incluir um ou mais


(III)

N

NN

R

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R9

R10

24




compostos inorgânicos com a fórmula geral:

[Au(polipiridil)X2]PF6 (X = Cl, OH) do tipo abaixo

apresentado (IV), onde a parte polipiridil pode ser por

exemplo dipirido[3,2-f:2’,3’ -h] quinoxalina (DPQ),

dipirido[3,2-a:2’,3’-c] fenazina (DPPZ), dipirido[3,2-

a:2’,3’-c] (6,7,8,9-tetrahidro) fenazina (DPQC)).

Adicionalmente, a principal estrutura envolvente

polipiridil pode incluir grupos aromáticos bicíclicos

fundidos 6,6-, 5,6 ou 6,5 com ou sem um ou mais átomos

substituintes de azoto, oxigénio e/ou enxofre.

(IV)



contexto do primeiro aspeto, compreendendo um composto

inorgânico com a fórmula: [Au(dietilenetriamina)Cl]Cl2 do

tipo abaixo apresentado (V).

(V)

NN

NN

NN

NN

NN

NN

DPQ DPPZ DPQC

NH

NH2H2N

25



contexto do primeiro aspeto, compreendendo compostos

inorgânicos onde os derivados Au(III) e Au(I) apresentam

ligandos dadores de azoto monodentados, bidentados ou

tridentados, tais como 2-(2-piridil)imidazol (a), 2-

fenilimidazol (b), e, 2,6-bis(benzimidazol-2-il)piridina

(c), respetivamente, assim como grupos fosfano (p.ex.

trifenilfosfina, 1,3,5-triaza-7-fosfa-adamantano, 3,7-

diacetil-1,3,7-triaza-5-fosfabiciclo[3.3.1]nonano, e

trifenilfosfina trisulfonato de sódio (exemplos

representativos fornecidos em (VI)).

(VI)

Ligandos:

Derivados ouro(III):

Derivados ouro(I):

26



contexto do primeiro aspeto, compreendendo compostos

orgânicos de ouro incluindo os do tipo descrito em (VII),

onde os ligandos orgânicos são por exemplo 6-(1,1-

dimetilbenzil)-2,2'-bipiridina), substituído-2-fenil-

piridina, ou uma parte 2-[[(dimetilamino)metil]fenil].

Adicionalmente 1,3-bis(piridin-2-ilmetil)benzeno como

ligando Au(III) pode também ser considerado, juntamente com

grupos fosfina e ligandos tiolato.

(VII)



contexto do primeiro aspeto, compreendendo complexos

ditiocarbamato Au(III), Au(I) e Au(III) com ligandos

carbenos N-heterocíclicos (NHC), complexos de ouro

multinucleares (p.ex. compostos de Au dinucleares).



contexto do primeiro aspeto, compreendendo complexos

N N

Au

X

PF6-

+

AuMe2N

X

XN

Au

X

X

X = OH, Cl, CH3COO, xylidine, etc.

R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R1

R = H, amine, alogen, alkyl, aryl,

carboxy, alkoxy etc.

X = Cl, CH3COO, SCN,

HOOC-R-COOH, etc.

X = alogen, OH, CH3COO, etc.

X = OH, Cl, CH3COO, xilidina, etc.

R = H, amina, halogéneo, alquilo, arilo, carboxi, alcoxi etc.

X = halogéneo, OH, CH3COO, etc.

X = Cl, CH3COO, SCN, HOOC-R-COOH, etc. X = OH, Cl, CH2COO,

xilidina, etc.R = H, amina, halogéneo,

alquilo, arilo, carboxi,

alcoxi, etc.

X = halogéneo, OH,

CH3COO, etc.


HOOC-R-COOH, etc.

27

metálicos apresentando ligandos orgânicos semelhantes aos

descritos acima, mas com diferentes centros metálicos tais

como Pt(II), Pd(II) e Cu(III). Neste contexto, os complexos

heteronucleares (p.ex. Au/Ti, Au/Ru, Au/Pt, Au/Pd etc.) são

também considerados.

De acordo com outro aspeto da invenção, é proporcionado

para a utilização de qualquer dos moduladores inibitórios

de aquagliceroporinas acima mencionados, num método

incluindo a ligação seletiva de qualquer dos referidos

moduladores inibitórios com pelo menos uma respetiva

aquagliceroporina.

De acordo com outro aspeto da invenção, os referidos

métodos incluem a utilização de compostos farmacêuticos e/

ou cosméticos e de conjuntos ou kits de diagnóstico.

Os compostos farmacêuticos e/ ou cosméticos para a

prevenção, profilaxia e/ ou tratamento de patologia de

doença diretamente ou indiretamente relacionada com a

função da AQP3 compreendendo um modulador inibitório da

AQP3 de acordo com qualquer das prévias descrições e

detalhes.

Os compostos farmacêuticos e/ ou cosméticos de acordo com

as prévias descrições e detalhes, para o tratamento e

profilaxia do grupo de patologias incluindo cicatrização,

cancro e crescimento de tumores, angiogenése, condições

patológicas da pele, obesidade, doenças renais, doenças das

glândulas salivares e doenças alérgicas, em que o substrato

ativo é selecionado com base no facto de possuir

propriedades bio-fisiológicas semelhantes a qualquer dos

acima mencionados moduladores inibitórios de

aquagliceroporinas.

28

Referências

[1] J.M. Carbrey, P. Agre, Discovery of the aquaporins and

development of the field, Handb Exp Pharmacol (2009)

3-28.

[2] K. Takata, T. Matsuzaki, Y. Tajika, Aquaporins: water

channel proteins of the cell membrane, Prog Histochem

Cytochem 39 (2004) 1-83.

[3] A.S. Verkman, More than just water channels: unexpected

cellular roles of aquaporins, J Cell Sci 118 (2005)

3225-3232.

[4] A.S. Verkman, Knock-out models reveal new aquaporin

functions, in: E. Beitz (Ed.), Handb Exp Pharmacol,

Spinger, 2009, pp. 359-381.

[5] J. Woo, J. Lee, Y.K. Chae, M.S. Kim, J.H. Baek, J.C.

Park, M.J. Park, I.M. Smith, B. Trink, E. Ratovitski,

T. Lee, B. Park, S.J. Jang, J.C. Soria, J.A. Califano,

D. Sidransky, C. Moon, Overexpression of AQP5, a

putative oncogene, promotes cell growth and

transformation, Cancer Letters 264 (2008) 54-62.

[6] Y.K. Chae, J. Woo, M.-J. Kim, S.K. Kang, M.S. Kim, J.

Lee, S.K. Lee, G. Gong, Y.H. Kim, J.C. Soria, S.J.

Jang, D. Sidransky, C. Moon, Expression of Aquaporin 5

(AQP5) Promotes Tumor Invasion in Human Non Small Cell

Lung Cancer, Plos One 3 (2008) e2162.

[7] S. Saadoun, M.C. Papadopoulos, M. Hara-Chikuma, A.S.

Verkman, Impairment of angiogenesis and cell migration

by targeted aquaporin-1 gene disruption, Nature 434

(2005) 786-792.

[8] C. Clapp, G.M. de la Escalera, Aquaporin-1: a novel

promoter of tumor angiogenesis, Trends in

Endocrinology and Metabolism 17 (2006) 1-2.

29

[9] G.M. Preston, J.S. Jung, W.B. Guggino, P. Agre, The

mercury-sensitive residue at cysteine 189 in the

CHIP28 water channel, J Biol Chem 268 (1993) 17-20.

[10] C.M. Niemietz, S.D. Tyerman, New potent inhibitors of

aquaporins: silver and gold compounds inhibit

aquaporins of plant and human origin, FEBS Lett 531

(2002) 443-447.

[11] H.L. Brooks, J.W. Regan, A.J. Yool, Inhibition of

Aquaporin-1 Water Permeability by Tetraethylammonium:

Involvement of the Loop E Pore Region, Molecular

Pharmacology 57 (2000) 1021-1026.

[12] B. Ma, Y. Xiang, S.M. Mu, T. Li, H.M. Yu, X.J. Li,

Effects of acetazolamide and anordiol on osmotic water

permeability in AQP1-cRNA injected Xenopus oocytel,

Acta Pharmacologica Sinica 25 (2004) 90-97.

[13] A.N. Vanhoek, C.H. Vanos, Inhibition of Water Channels

in Isolated Rat Renal Cortical Plasma-Membranes by

Dimethylsulfoxide and Mercuric Sulfhydryl-Reagents,

Journal of Physiology-London 420 (1990) P142-P142.

[14] R. Sogaard, T. Zeuthen, Test of blockers of AQP1 water

permeability by a high-resolution method: no effects

of tetraethylammonium ions or acetazolamide, Pflugers

Archiv-European Journal of Physiology 456 (2008) 285-

292.

[15] B. Yang, J.K. Kim, A.S. Verkman, Comparative efficacy

of HgCl2 with candidate aquaporin-1 inhibitors DMSO,

gold, TEA+ and acetazolamide, FEBS Lett 580 (2006)

6679-6684.

[16] V.J. Huber, M. Tsujita, M. Yamazaki, K. Sakimura, T.

Nakada, Identification of arylsulfonamides as

Aquaporin 4 inhibitors, Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters 17 (2007) 1270-1273.

30

[17] B.X. Yang, H. Zhang, A.S. Verkman, Lack of aquaporin-4

water transport inhibition by antiepileptics and

arylsulfonamides, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16

(2008) 7489-7493.

[18] E. Migliati, N. Meurice, P. DuBois, J.S. Fang, S.

Somasekharan, E. Beckett, G. Flynn, A.J. Yool,

Inhibition of aquaporin-1 and aquaporin-4 water

permeability by a derivative of the loop diuretic

bumetanide acting at an internal pore-occluding

binding site, Mol Pharmacol 76 (2009) 105-112.

[19] N. Tsipouras, C.J. Rix, P.H. Brady, Solubility of

silver sulfadiazine in physiological media and

relevance to treatment of thermal burns with silver

sulfadiazine cream, Clin Chem 41 (1995) 87-91.

[20] L. Messori, G. Marcon, Metal Ions and Their Complexes

in Medication, Metal Ions in Biological Systems, 2004,

pp. 2799.

[21] F. Abbate, Orioli, P., Bruni, B., Marcon, G., Messori,

L., Crystal structure and solution chemistry of the

cytotoxic complex 2,2-dichloro(o-

phenantroline)gold(III) chloride, Inorganica Chimica

Acta 311 (2000).

[22] L. Messori, F. Abbate, G. Marcon, P. Orioli, M.

Fontani, E. Mini, T. Mazzei, S. Carotti, T. O'Connell,

P. Zanello, Gold(III) complexes as potential antitumor

agents: Solution chemistry and cytotoxic properties of

some selected gold(III) compounds, Journal of

Medicinal Chemistry 43 (2000) 3541-3548.

[23] A. Casini, G. Kelter, C. Gabbiani, M.A. Cinellu, G.

Minghetti, D. Fregona, H.H. Fiebig, L. Messori,

Chemistry, antiproliferative properties, tumor

selectivity, and molecular mechanisms of novel

gold(III) compounds for cancer treatment: a systematic

31

study, Journal of Biological Inorganic Chemistry 14

(2009) 1139-1149.

[24] B.M. Denker, B.L. Smith, F.P. Kuhajda, P. Agre,

Identification, purification, and partial

characterization of a novel Mr 28,000 integral

membrane protein from erythrocytes and renal tubules,

J Biol Chem 263 (1988) 15634-15642.

[25] N. Roudier, J.M. Verbavatz, C. Maurel, P. Ripoche, F.

Tacnet, Evidence for the presence of aquaporin-3 in

human red blood cells, J Biol Chem 273 (1998) 8407-

8412.

[26] G.M. Preston, T.P. Carroll, W.B. Guggino, P. Agre,

Appearance of water channels in Xenopus oocytes

expressing red cell CHIP28 protein, Science 256 (1992)

385-387.

[27] E. Campos, T.F. Moura, A. Oliva, P. Leandro, G.

Soveral, Lack of Aquaporin 3 in bovine erythrocyte

membranes correlates with low glycerol permeation,

Biochem Biophys Res Commun 408 (2011) 477-481.

[28] K. Ishibashi, S. Sasaki, K. Fushimi, S. Uchida, M.

Kuwahara, H. Saito, T. Furukawa, K. Nakajima, Y.

Yamaguchi, T. Gojobori, et al., Molecular cloning and

expression of a member of the aquaporin family with

permeability to glycerol and urea in addition to water

expressed at the basolateral membrane of kidney

collecting duct cells, Proc Natl Acad Sci U S A 91

(1994) 6269-6273.

[29] T.F. Moura, R.I. Macey, D.Y. Chien, D. Karan, H.

Santos, Thermodynamics of all-or-none water channel

closure in red cells, J Membr Biol 81 (1984) 105-111.

[30] B.L. de Groot, H. Grubmuller, Water permeation across

biological membranes: mechanism and dynamics of

aquaporin-1 and GlpF, Science 294 (2001) 2353-2357.

32

[31] D.F. Savage, R.M. Stroud, Structural basis of

aquaporin inhibition by mercury, J Mol Biol 368 (2007)

607-617.

[32] M. Echevarria, A.M. Munoz-Cabello, R. Sanchez-Silva,

J.J. Toledo-Aral, J. Lopez-Barneo, Development of

cytosolic hypoxia and hypoxia-inducible factor

stabilization are facilitated by aquaporin-1

expression, J Biol Chem 282 (2007) 30207-30215.

[33] M. Hara, A.S. Verkman, Glycerol replacement corrects

defective skin hydration, elasticity, and barrier

function in aquaporin-3-deficient mice, Proc Natl Acad

Sci U S A 100 (2003) 7360-7365.

[34] A. Casini, C. Hartinger, C. Gabbiani, E. Mini, P.J.

Dyson, B.K. Keppler, L. Messori, Gold(III) compounds

as anticancer agents: Relevance of gold-protein

interactions for their mechanism of action, Journal of

Inorganic Biochemistry 102 (2008) 564-575.

[35] A.K. Meinild, D.A. Klaerke, T. Zeuthen, Bidirectional

water fluxes and specificity for small hydrophilic

molecules in aquaporins 0-5, J Biol Chem 273 (1998)

32446-32451.

[36] A. Rojek, J. Praetorius, J. Frokiaer, S. Nielsen, R.A.

Fenton, A current view of the mammalian

aquaglyceroporins, Annu Rev Physiol 70 (2008) 301-327.

[37] S.M. Bagnasco, The erythrocyte urea transporter UT-B,

J Membr Biol 212 (2006) 133-138.

[38] M.P. van Heeswijk, C.H. van Os, Osmotic water

permeabilities of brush border and basolateral

membrane vesicles from rat renal cortex and small

intestine, J Membr Biol 92 (1986) 183-193.

Lisboa, 06 de Agosto de 2012

1

REIVINDICAÇÕES

1. Moduladores de inibição com base metálica de

aquagliceroporinas transmembranares celulares

caracterizados por qualquer um dos referidos

moduladores se ligar seletivamente a pelo menos uma

aquagliceroporina, preferencialmente AQP3, AQP7 e

AQP9.


aquagliceroporinas transmembranares celulares de

acordo com a reivindicação 1 caracterizados por

consistirem num composto inorgânico de fórmula geral

[Au(substituído-1,10-fenantrolina)X2]X (X = Cl, OH),

compreendido em (I), onde R é um protão ou é

selecionado de um grupo constituído por grupos

alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos,

heteraromáticos, alifático-aromáticos,

heteroalifático-heteroaromáticos, cicloalifáticos, e

heterocicloalifáticos; ou por aminas tais como NH2 e

aminas alifáticas –R-NH2); ou por halogéneos tais como

cloro e iodo; ou por ligandos com grupos funcionais

hidroxilo tais como -R-OH; ou por ligandos contendo

éter com a fórmula geral –R-O-R’; ou por ligandos

contendo carbonilo -R-CO-OH; ou por grupos

sulfonamídicos, ou por grupos nitrilo/nitro, ou por

partes peptidícas; ainda, a estrutura envolvente

fenantrolina contém preferencialmente um ou mais

átomos substituintes de azoto, oxigénio e ou enxofre.

2

(I)




consistirem em compostos inorgânicos de fórmula:

[Au(substituído-2,2’-bipiridina)Cl2]PF6 compreendidos

em (II), onde a substituição do anel bipiridina é em

6,6’ (a), ou 4,4’ (b), ou 5,5’(c), e onde R é

selecionado de um protão ou de um grupo constituído

por grupos alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos,



heterocicloalifáticos; ou por aminas tais como NH2 e

aminas alifáticas –R-NH2; ou por halogéneos tais como







bipiridina contém preferencialmente um ou mais átomos

substituíntes de azoto, oxigénio e ou enxofre.

(II)

NN

R3 R6

R4 R5

R2 R7

R8R1

3





[Au(substituído-2,2’,2”-terpiridina)X]X2,

compreendidos em (III), onde X =Cl, OH, onde R é

selecionado de um protão ou de um grupo consistindo em

grupos alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos,



heterocicloalifáticos; ou aminas tais como NH2 e

aminas alifáticas –R-NH2; ou por halogéneos tais como







terpiridina contém preferencialmente um ou mais átomos

substituintes de azoto, oxigénio e ou enxofre.

(III)





[Au(polipiridil)X2]PF6 em que X = Cl, OH,

N

NN

R

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R9

R10

4

compreendidos em (IV), onde a parte polipiridil é

preferencialmente dipirido[3,2-f:2’,3’ -h] quinoxalina,

dipirido[3,2-a:2’,3’-c] fenazina, dipirido[3,2-

a:2’,3’-c] (6,7,8,9-tetra-hidro) fenazina; ainda, a

estrutura envolvente polipiridilo principal contém

preferencialmente 6,6-, 5,6 ou 6,5-grupos bicíclicos

aromáticos fundidos com ou sem um ou mais átomos

substituíntes de azoto, oxigénio e ou enxofre.

(IV)




consistirem em um composto inorgânico de fórmula:

[Au(dietilenetriamina)Cl]Cl2 compreendida em (V).

(V)




compreenderem compostos inorgânicos onde os derivados

Au(III) e Au(I) apresentam ligandos dadores de azoto

monodentados, bidentados ou tridentados tais como 2-

(2-piridil)imidazole (a), 2-fenilimidazol (b), e, 2,6-

NN

NN

NN

NN

NN

NN

DPQ DPPZ DPQC

NH

NH2H2N

5

bis(benzimidazol-2-il)piridina (c), respetivamente,

assim como grupos fosfano tais como trifenilfosfina,

1,3,5-triaza-7-fosfa-adamantano, 3,7-diacetil-1,3,7-

triaza-5-fosfabiciclo[3.3.1]nonano, e trifenilfosfina

trisulfonato de sódio, representados em (VI).

(VI)




compreenderem compostos orgânicos de ouro

representados em (VII), onde os ligandos orgânicos são

6-(1,1-dimetilbenzil)-2,2'-bipiridina), substituída-2-

Ligandos:

Derivados ouro(III):

Derivados ouro(I):

6

fenil-piridina, ou uma parte 2-

[[(dimetilamino)metil]fenil]; ainda, 1,3-bis(piridin-

2-ilmetil)benzeno como ligando Au(III), juntamente com

grupos fosfina e ligandos tiolato, em que X = OH, Cl,

CHCOO, xilidina e derivados (a); em que X = OH,

halogéneo, CHCOO e grupos derivados onde R é

selecionado de um protão ou de um grupo consistindo em

grupos alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos,



heterocicloalifáticos; ou aminas; ou por halogéneos;

ou por ligandos com grupos funcionais hidroxilo tais

como -R-OH em (b); e em que X = Cl, CHCOO, SCN ou

compostos com fórmula geral HOOC-R-COOH (c).

a b c

(VII)



acordo com as reivindicações 1 a 8 caracterizados por

compreenderem complexos ditiocarbamato de Au(III),

Au(I) e Au(III) com ligandos carbenos N-heterocíclicos

N N

Au

X

PF6-

+

AuMe2N

X

XN

Au

X

X


R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R1




HOOC-R-COOH, etc.








alcoxi, etc.

X = halogéneo, OH,

CH3COO, etc.


HOOC-R-COOH, etc.

N N

Au

X

PF6-

+

AuMe2N

X

XN

Au

X

X


R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R1




HOOC-R-COOH, etc.








alcoxi, etc.

X = halogéneo, OH,

CH3COO, etc.


HOOC-R-COOH, etc.

7

(NHC), complexos de ouro multinucleares, tais como

compostos de Au dinucleares.




compreenderem centros metálicos tais como Pt(II),

Pd(II) e Cu(III) e complexos heteronucleares tais como

Au/Ti, Au/Ru, Au/Pt, Au/Pd.



acordo com a reivindicação 10 caracterizados por os

moduladores serem selecionados a partir da cisplatina,

NAMI-A, sulfadiazina de prata, aurotioglucose e

auphen.



acordo com a reivindicação 10 caracterizados por as

células serem hRBC.



acordo com todas as reivindicações anteriores

caracterizados por serem usados no tratamento,

profilaxia e prevenção de condições clínicas, tais

como cicatrização, cancro e crescimento de tumores,

angiogénese, condições patológicas da pele, obesidade,

doenças renais, doenças das glândulas salivares,

doenças alérgicas, glaucoma, edema cerebral e

epilepsia.

8



acordo com a reivindicação 13 caracterizados por as

condições clínicas serem relacionadas com a AQP3.



acordo com a reivindicação 13 caracterizados por serem

utilizados no fabrico de compostos farmacêuticos,

cosméticos e conjuntos de diagnóstico.

16. Compostos farmacêuticos de acordo com a

reivindicação 15 caracterizados por serem utilizados

no tratamento, profilaxia e prevenção de condições

clínicas, tais como cicatrização, cancro e crescimento

de tumores, angiogénese, condições patológicas da

pele, obesidade, doenças renais, doenças das glândulas

salivares, doenças alérgicas, glaucoma, edema cerebral

e epilepsia, em que o substrato ativo é selecionado

baseado em propriedades bio-fisiológicas semelhantes a

cada um dos acima mencionados moduladores de inibição

de aquagliceroporinas.

17. Conjuntos de diagnóstico de acordo com

reivindicação 15 caracterizados por serem utilizados

na deteção da atividade de aquagliceroporinas.

Lisboa, 22 de Outubro de 2012.

1/7

Figura 1

aurothioglucose

OS Au

OHHOHO

OH

n

SN-

O O

N

N

H2N Ag+

silver sulfadiazine

NH3

Pt

Cl

NH3Cl

cisplatin NAMI-A

Ru

N

NH

DMSO

ClCl

Cl Cl

HN

HN

NN

Au

Cl Cl

Cl-

+

Auphen

cisplatina sulfadiazina de prata

aurotioglucose

2/7

Sca

ttere

d li

gth

inte

nsi

ty (

a.u

.)

0 1 2 3 4 5

B

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tempo (s)

Inte

nsi

da

de

da

Lu

z D

ispe

rsa

(a

.u.)

C

Inte

nsi

dad

e d

a L

uz

Dis

pers

a

(a.u

.)

Tempo (s)

Intensidade da

Luz Dispersa

(a.u.)

Sca

ttere

d li

gth

inte

nsi

ty (

a.u

.)

0 1 2 3 4 5

B

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tempo (s)

Inte

nsi

da

de

da

Lu

z D

ispe

rsa

(a

.u.)

C

Inte

nsi

dad

e d

a L

uz

Dis

pers

a

(a.u

.)

Sca

tte

red li

gth

inte

nsi

ty (

a.u

.)

0 1 2 3 4 5

B

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tempo (s)

Inte

nsi

da

de

da

Lu

z D

ispe

rsa

(a

.u.)

C

Inte

nsi

dad

e d

a L

uz

Dis

pers

a

(a.u

.)

Tempo (s)

Intensidade da

Luz Dispersa

(a.u.)

Sca

ttere

d li

gth

inte

nsi

ty (

a.u

.)

0 1 2 3 4 5

B

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tempo (s)

Inte

nsi

da

de

da

Lu

z D

ispe

rsa

(a

.u.)

C

Inte

nsid

ad

e d

a L

uz D

isp

ers

a

(a.u

.)

3/7

Figura 2

Figura 3

D

100 107 98

0

20

40

60

80

100

120

140

Control Auphen 5 ! M Auphen 100 ! M

Per

mea

bilid

ade à

Ure

ia (

%)

Controlo

Controlo Auphen

5 µM

Auphen

100 µM

Permeabilidade

à Ureia (%)

D

100 107 98

0

20

40

60

80

100

120

140

Control Auphen 5 ! M Auphen 100 ! M

Per

mea

bilid

ade à

Ure

ia (

%)

Controlo

Permeabilidade ao

Glicerol (%)Intensidade da

Luz Dispersa

(a.u.)

4/7

Figura 4

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5-20

0

20

40

60

80

100

Log [Auphen] mM

Inh

ibiti

on

(%

)In

ibiçã

o (

%)

Inibição (%)

Log [Auphen] µM

5/7

Figura 5

Permeabilidade ao

Glicerol (%)

Controlo Auphen Auphen+Lavagem Auphen+MeOH

6/7

Figura 6

GlicerolÁgua

1.0

2.7

1.1 1.0

0.9

1.8

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

PC12-WT PC12-AQP1 PC12-AQP3

Water Glycerol

Pe

rmea

bili

dad

e G

li N

orm

aliz

ad

a

AÁgua Glicerol

Permeabilidade Gli

Normalizada


1.0

2.7

1.1 1.0

0.9

1.8

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5


Water Glycerol

Pe

rmea

bili

dad

e G

li N

orm

aliz

ada

AÁgua Glicerol

0 10 20 30 40 50 60

Tempo (s)

Inte

nsid

ad

e d

e L

uz D

ispe

rsa (

a.u

.)

[Auphen, mM]

0

0.01

0.1

1

BIntensidade da

Luz Dispersa (a.u.)

Tempo (s)

[Auphen, mM]

0 10 20 30 40 50 60

Tempo (s)

Inte

nsid

ad

e d

e L

uz D

ispe

rsa (

a.u

.)

[Auphen, mM]

0

0.01

0.1

1

B

7/7

Figura 7

Au

N

NHHN

Cl

2+ 2Cl-

Audien

NH HN

HNNH

Au

(ClO4-)2

Cl-

Aucyclam

NN

Phen

A

Au

N

NHHN

Cl

2+ 2Cl-

Audien

NH HN

HNNH

Au

(ClO4-)2

Cl-

Aucyclam

NN

Phen

A

Au

N

NHHN

Cl

2+ 2Cl-

Audien

NH HN

HNNH

Au

(ClO4-)2

Cl-

Aucyclam

NN

Phen

A

Permeabilidade ao

Glicerol (%)

Phen

100 µM

Auphen

50 µM

Aucy

clam

100 µM

Controlo Audien

50 µM

-1 0 1 2 3-20

0

20

40

60

80

100

Log [Audien] mM

% In

hib

itio

n

C

Inib

içã

o (

%)

Inibição (%)

Log [Audien] µM

-1 0 1 2 3-20

0

20

40

60

80

100

Log [Audien] mM

% In

hib

itio

n

C

Inib

içã

o (

%)

M0589.02 1/2

Relatório de Pesquisa de Portugal Ref. do pedido:

105786

CLASSIFICAÇÃO DA MATÉRIA

A61K 31/00, B01J31/18 De acordo com a Classificação Internacional de Patentes

DOCUMENTAÇÃO E BASES DE DADOS ELETRÓNICAS PESQUISAD AS

WPI, XPESP, GOOGLE DOMÍNIOS TÉCNICOS PESQUISADOS

A61K, B01J De acordo com a Classificação Internacional de Patentes DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES

Categoria* Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens relevantes Relevante

para a reivindicação

X

X

A

A

CASINI ET AL, Chemistry, antiproliferative properties, tumor selectivity,

and molecular mechanisms of novel gold(III) compounds for cancer treatment: a systematic study, J Biol Inorg Chem, 14:1139–1149,

2009.06.20 [Todo o documento, em particular a figura 1 e tabelas 1 e 2]

CASINI ET AL, Gold (III) compounds as anticancer agents: Relevance of

gold-protein interactions for their mechanism of action, Journal of Inorganic Biochemistry, 102, 564-575, 2007.11.28

[Todo o documento, em particular a figura 1]

CASINI ET AL, Organometallic Antitumour Agents with Alternative Modes of Action, Top. Organomet. Chem., 32, 57-80, 2010

[Páginas 69-72]

NIEMIETZ CM ET AL, New potent inhibitors of aquaporins: silver and gold compounds inhibit aquaporins of plant and human origin, FEBS

Letters, 531, 443-447, 2002.10.22 [Todo o documento]

2, 11, 13, 15, 16

2, 11, 13, 15, 16

2, 9-17

2, 9-17

* Categorias dos documentos citados: A X Y E L

Estado da técnica; Documento de particular relevância quando considerado isoladamente; Documento de particular relevância quando combinado com um ou mais deste tipo de documentos; Pedido de patente anterior publicado na mesma data ou em data posterior à do pedido; Documento citado por qualquer outra razão;

T &

P

D O

Princípio ou teoria subjacente à invenção; Documento membro da mesma família de documentos de patente; Documento publicado antes da data de pedido mas depois da data de prioridade; Documento citado no pedido; Documento que se refere a uma divulgação oral, uso, exibição ou qualquer outro meio.

Data do termo da pesquisa

2012.12.10

Técnico examinador:

Nuno Pedroso Assinatura

Telefone: 21 881 81 00 Data de elaboração do Relatório de Pesquisa

2012.12.10

INPI, Campo das Cebolas, 1149-035 LISBOA Fax: 21 886 98 59

Nota: Esta pesquisa refere-se aos elementos apresentados até à data da elaboração deste relatório de pesquisa. Quaisquer elementos que possam ter sido entregues posteriormente a esta data, não foram objeto de apreciação técnica.

M0589.02 2/2

Relatório de Pesquisa de Portugal Ref. do pedido:

105786

UNIDADE DE INVENÇÃO O pedido não está de acordo com os requisitos de unidade de invenção (art. 71º) e foram

encontradas as seguintes invenções:

1. Reivindicações nº 2, 9-17:






7. Reivindicações nº 8-17:

Documents

INIBIDORES DE AQUAGLICEROPORINAS, SEUS MÉTODOS E