Inoculação de bactérias fitopatogênicas_Romeiro_uni7

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSADEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIALABORATRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS

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INOCULAO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS

Reginaldo da Silva Romeiro Professor Titular da UFV

INOCULAO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS Deve-se entender por inocular, em Fitopatologia, o ato de colocar propgulos do patgeno em contato com rgos de uma planta, de tal forma a propiciar a penetrao e a colonizao dos tecidos deste, sob condies ideais de meio ambiente, para que a interao mrbida planta-patgeno a que chamamos doena tenha curso e culmine na reproduo dos sintomas tpicos da enfermidade. H que se chamar a ateno para um detalhe importante de terminologia. O termo inocular aplica-se apenas a seres vivos. Assim sendo, inocula-se uma planta com uma bactria fitopatognica que pode, ainda que apenas potencialmente, infect-la e provocar doena. Para vacinaes, por exemplo, que no visam provocar doenas e sim ativar o sistema imune e as defesas de organismos, usa-se o termo imunizar e no inocular. E, em hiptese alguma, deve-se dizer "inocular" quando o alvo um ser inerte. No se inocula solo, por exemplo - infesta-se o solo. Ou a gua, ou a areia, ou a regio da rizosfera. Tambm no se inoculam placas de Petri com meio de cultura ou tubos com meio lquido ou inclinado. O correto dizer que se procede ao plantio ou ao semeio do patgeno em meio de cultura, que tambm um ser inerte.

PREPARO DO INCULO Geralmente usam-se, como inculo, clulas bacterianas obtidas de cultura na fase logartmica de crescimento e suspendidas em soluo salina (NaCl a 0,85%) ou PBS (Tampo de fosfato 0,1M em soluo salina, com pH ajustado para 7,0). A suspenso de clulas bacterianas viveis em gua destilada pode ocasionar plasmlise ou choque osmtico, fazendo o inculo perder grande parte de sua viabilidade. Sempre que possvel, a inoculao deve ser feita com uma concentrao de inculo definida para que resultados obtidos possam ser comparados com os de outros trabalhos e para que se possa repetir a inoculao sempre que isto se fizer necessrio.

Cultivo da bactria Deve-se escolher um meio de cultura que suporte com facilidade o crescimento de procariotas quemioeterotrficos, como o caso da maioria das fitobactrias (Romeiro, 1995). Tradicionalmente tm sido usados como rotina os meios NYGA (Schaad, 1988), BDA (Dhingra & Sinclair, 1985; Tuite, 1969)), meio 523 de (Kado & Heskett, 1970), etc. A produo massal de clulas bacterianas a serem usadas como inculo pode ser feita em meio lquido ou meio slido de cultura. Em ambos os casos, deve-se preparar a suspenso com culturas na fase exponencial de crescimento, o que corresponde, para a maioria das fitobactrias, a culturas com 18-24 horas de idade. O modo de coleta das clulas bacterianas para preparo do inculo depende se o cultivo est sendo feito em meio lquido ou slido. O cultivo em meio slido implica na repicagem para vrios tubos com meio inclinado ou para vrias placas com meio slido. Neste ltimo caso, adiciona-se superfcie da placa 100-200l de cultura em meio lquido e procede-se ao semeio com esptula de Drigalsky, incubando-se a seguir. Aps incubao e crescimento, adiciona-seTELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: [email protected]

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salina aos tubos ou placas e coletam-se as clulas por raspagem, com ala de repicagem ou esptula de Drigalsky. O cultivo em meio lquido consiste na simples repicagem para tubos ou Erlenmeyers contendo o meio. A incubao deve ser, se possvel, sob contnua agitao e a temperatura constante. Aps o crescimento, como no recomendvel fazer inoculao com as clulas suspendidas no meio de cultura (Fahy & Persley, 1983), elas so coletadas por centrifugao e re-suspendidas em salina, numa operao denominada lavagem, em jargo de laboratrio.

Lavagem das clulas bacterianas advindas de meio lquido de cultura A operao de lavagem visa eliminar a maior parte possvel de componentes do meio de cultura associado de alguma forma s clulas bacterianas a serem usadas como inculo. Quando o cultivo feito em meio slido, esta operao dispensvel na maioria das vezes salvo quando se tratam de espcies produtoras de grande quantidade de toxinas em meio de cultura pois pode haver risco do efeito da toxina associada ao inculo mascarar ou interferir com os resultados da inoculao. Para o caso de cultivos em meio lquido, trata-se de procedimento obrigatrio. Procedimento a) Utilizar preferencialmente centrfuga refrigerada. Centrfugas sem refrigerao podem aquecer muito a preparao comprometendo a viabilidade do inculo b) Proceder centrifugao a 15.000 g/ 20 minutos. Descartar o sobrenadante. c) e) Ressuspender o precipitado em salina. d) f) Repetir a centrifugao por mais dois ciclos idnticos ao primeiro. e) g) Ao final do terceiro ciclo, as clulas bacterianas podem ser consideradas tecnicamente livres dos componentes do meio de cultura.

Turbidimetria e concentrao do inculo Inoculaes devem ser realizadas, preferencialmente, com concentraes conhecidas de clulas bacterianas viveis. Numa suspenso bacteriana, nem todas as clulas esto vivas e, quanto mais velha a cultura, maior o nmero de clulas mortas (Figura 1). Os mtodos mais rpidos e confiveis de se estimar a concentrao de inculo em suspenses de clulas bacterianas so os turbidimtricos. A maioria dos pesquisadores emprega fotmetros ou espectrofotmetros comuns (Gerhardt, 1994; Kiraly et al., 1970; Klement et al., 1990) como se fossem turbidmetros, negligenciando as pequenas variaes decorrentes de difrao, absoro, etc.

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Fase exponencial de crescimento

Figura 1: Curva tpica de crescimento bacteriano, com destaque para a fase logartmica ou exponencial, na qual a maioria das clulas presentes est vivel e biologicamente ativa. As quantificaes de turbidez ao espectrofotmetro pressupem uma aproximada obedincia lei de l'Ambert-Beer (Clark & Switzer, 1977), segundo a qual a absorbncia diretamente proporcional concentrao que, no caso, seria a quantidade de clulas por unidade de volume. Para o caso de suspenses de partculas em forma de bastonete com dimenses de clulas bacteriana, as leituras devem ser feitas em comprimentos de onda na faixa de 540 a 600nm. No Laboratrio de Bacteriologia de Plantas do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Viosa tem-se, padronizadamente, feito essas leituras a 550nm. A prtica tem ensinado que leituras de absorbncia so confiveis quando maiores que 0,05 e menores que 1,2. Os resultados de leituras so sempre expressos em A (absorbncia) ou OD (densidade tica) indicando-se ao mesmo tempo o comprimento de onda no qual a leitura foi feita, ex: A550 = 0,85 ou OD550 = 0,85.

Ajuste da concentrao do inculo A concentrao de inculo ajustada por diluio. As clulas bacterianas so colhidas do meio de cultura e prepara-se uma suspenso concentrada. Por meio de diluies tentativas, ajusta-se a turbidez para o valor desejado.TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: [email protected]

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A maioria das inoculaes, para efeito de deteco de patogenicidade, pode ser feita com concentrao de inculo ajustada para OD550=0,1, o que corresponde, aproximadamente, a 108 cel/ml. Lelliott & Stead (1987) assumem que, a 600nm, 108-109 c.f.u./ml correspondem a uma absorbncia de 0,3-0,4.

PR-TRATAMENTO E PS-TRATAMENTO DE PLANTAS A SEREM ARTIFICIALMENTE INOCULADAS fato sobejamente conhecido e estabelecido que bactrias que incitam enfermidades em plantas penetram por aberturas naturais e, ou ferimentos e que o congestionamento de gua nessas portas de entrada torna-se fator limitante do fracasso e do sucesso das infeces (Agrios, 1997; Goodman, 1986; Goto, 1990; Kiraly et al., 1970; Klement et al., 1990; Lelliott & Stead, 1987; Romeiro, 1976; Romeiro, 1988; Romeiro, 1995; Scortichini, 1995; Sigee, 1993). Assim sendo, plantas a serem inoculadas com patgenos bacterianos que penetram por estmatos, hidatdios e lenticelas, na maioria dos casos, devem ser colocadas por 24 horas antes e 24 horas aps a inoculao, em cmara mida, com umidade relativa de 100%.

MTODOS MAIS COMUNS PARA INOCULAO ARTIFICIAL DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS

a) Atomizao Nestes casos, a penetrao ocorrer, principalmente, atravs de estmatos (em maior nmero, distribuidos por todo o filoplano) e de outras aberturas naturais. O controle da umidade relativa torna-se crtico por ser condicionante da abertura estomatal e da congesto de gua na cmara sub-estomtica e nos hidatdios. Existem muitos aparelhos passveis de serem usados ou adaptados como atomizadores (Figura 2).


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PRESSO

Figura 2: Tipos de atomizadores utilizveis para a inoculao de bactrias fitopatognicas: (a) - Manual, tipo "De Vilbiss; (B) - Improvisado com uma agulha de injeo; (C) - Manual, comum; (D) - Acoplado a um compressor Procedimento a) Utilizar mudas jovens, sadias, em bom estado nutricional, livres de insetos e caros, cultivadas em vasos ou sacos de polietileno. b) Manter as mudas em cmara mida (UR = 100%) por 24 horas como pr-tratamento, antes da inoculao. c) Preparar suspenso de inculo de OD550 = 0,1 a 0,2, a partir de cultura na fase exponencial de crescimento. Tentativamente esta concentrao pode ser aumentada ou diminuida, para cada caso especfico. d) Atomizar o filoplano de maneira uniforme, tendo o cuidado de aplicar o inculo em ambas as faces das folhas. A atomizao deve ser interrompida imediatamente antes do ponto de escorrimento. e) A atomizao pode ser feita com atomizador manual ou motorizado, sendo que, no ltimo caso, a distribuio de inculo tende a ser mais uniforme. O acoplamento de um compressor a um atomizador manual, quando possvel, torna-o um atomizador motorizado e capaz de promover uma inoculao mais uniforme e eficiente.TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: [email protected]

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f) Existem atomizadores de diferentes espcies como os do tipo "De Vilbiss" e os improvisados como pistolas de pintura, acoplamento de duas pipetas de Pasteur, seringas hipodrmicas adaptdas pelo dobramento da ponta em ngulo reto, etc. g) Imediatamente aps a atomizao, manter as plantas em cmara mida por 24 horas. Com sacos plsticos de diferentes tamanhos e um pouco de criatividade possvel improvisar diferentes tipos de ambiente com umidade relativa em torno de 100%.

b) Uso de abrasivos Trata-se de bom mtodo para o caso de fitobactrias que preferencialmente penetram por ferimentos embora traga consigo a desvantagem de, por falta de prtica, o pesquisador super-estimar a fora de seus dedos e causar injrias mecnicas muito extensas aos tecidos (Romeiro, 1976). Se isto acontecer, essas injrias vo se manifestar visualmente sob forma de necroses fcilmente confundveis com sintomas necroticos incitados pelo patgeno. O abrasivo mais comumente usado carborundum", um p preto, finssimo, de uso rotineiro para inoculao de certos virus de plantas. Procedimento a) Utilizar mudas jovens, sadias, em bom estado nutricional, livres de insetos e caros, cultivadas em vasos ou sacos de polietileno. b) Polvilhar na superfcie do rgo a ser inoculado pequena quantidade de carborundum, finssimamente granulado. c) Proceder imerso de um chumao de gase na suspenso de inculo e, o mais suavemente possvel, passe o chumao na superfcie do rgo a ser inoculado. d) O prprio dedo indicador de quem procede inoculao pode substituir, com igual eficincia, o chumao de gase. e) Imediatamente, transferir as plantas para cmara mida e l mant-las por 24-48 horas.


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c) Injeo

Figura 3: Inoculao de P. syringae pv. pisi em folha de fumo por injeo (Esquerda) e o sintoma de HR resultante (Direita). Esse mtodo muito eficiente porm muito drstico pois as clulas bacterianas so introduzidas diretamente no interior dos tecidos. usado principalmente para a conduo de testes de hipersensibilidade em folhas (Figura 3). O uso de cmara mida como tratamento ps-inoculao pode ser benfico mas no essencial. Mesmo no caso de associaes compatveis podem ocorrer sintomas atpicos ou sintomas semelhantes aos de hipersensibilidade (Goodman & Novacky, 1994; Goodman, 1986).


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d) Inoculao de folhas pelo uso de tesoura

INOCULAO

SUSPENSO DE INCULO

INCUBAO

SINTOMAS

CMARA MIDA

Figura 4: Inoculao por seccionamento do limbo foliar com tesoura previamente embebida em suspenso de inculo. O mtodo consiste em imergir uma tesoura previamente esterilizada na suspenso de inculo bacteriano e fazer cortes a partir dos bordos do limbo foliar (Figura 4). Desta forma, ao mesmo tempo que se faz o ferimento que serve de porta de entrada para o patgeno, o inculo depositado, sem excessos, no stio de infeco. Imediatamente aps a inoculao, mantenha as plantas em cmara mida por 24 horas. um mtodo eficiente, por exemplo, at mesmo para quantificar resistncia de feijoeiro a Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Rava, 1985; Rava & Romeiro, 1990; Rava et al., 1990), conforme escala da Figura 5.


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Figura 5: Escala de avaliao de resistncia de variedades de feijoeiro a X. axonopodis pv. phaseoli, em que a inoculao feita pelo seccionamento do limbo com tesoura (Adaptado de (Rava & Romeiro, 1990))

e) Inoculao por picada Utilizando um estilete, alfinete ou outro instrumento perfurante previamente mergulhado em suspenso de inculo, pica-se a superfcie do rgo a ser inoculado procedendo-se desta forma s operaes concomitantes de abertura de porta de entrada e de deposio de inculo. Este mtodo pode ser usado, com eficincia, para qualquer rgo. Acoplando-se um alfinete entomolgico a um pincel comum de pintura, de pelo macio, improvisa-se um timo e eficiente intrumento para inoculao por picada (Figura 6). O instrumento pode perfeitamente ser esterilizado por autoclavagem, sempre que necessrio.

CERDAS

ALFINETE10


Figura 6: Esquema mostrando como o acoplamento de um alfinete entomolgico a um pincel comum de pintura permite improvisar um timo e eficiente intrumento para inoculao por picada (Adaptado de (Kiraly et al., 1970)

f) Inoculao por presso Este tipo de inoculao pode ser usado em situaes especiais (Dhingra & Sinclair, 1985), quando o encharcamento de folhas com suspenso de inculo se faz necessrio . Foi utilizado, por exemplo, por (Ferreira & Romeiro, 1986) e por (Ferreira, 1986) como tcnica padronizada para inocular variedades diferenciadoras de soja com isolamentos de P. syringae pv. glycinea com vistas identificao de raas fisiolgicas. Assim como a inoculao por injeo, este mtodo tambm muito drstico (Figura 7). Como consequncia, um mtodo muito empregado para testes de HR em plantas cujas folhas, por muito coriceas, so praticamente impossveis de serem infiltradas de outra forma como mandioca, eucalpto, ip (Romeiro & Lima Junior, 1998) etc. Trabalhando-se com um compressor de ar acoplado a uma pistola de pintura ou equipamento similar, consegue-se mais uniformidade na dispensa do inculo e mais eficincia bem como tem-se a possibilidade de padronizar a presso.

Figura 7: Exemplo de inoculao por presso, em que se usa uma pistola comum de pintura para encharcamento de folhas de eucalipto com suspenso de clulas de Acidovorax avenae. Adaptado de (Romeiro & Lima Junior, 1998).TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: [email protected]

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g) Seccionamento da parte area Geralmente empregado para inocular monocotiledneas (gramneas, por exemplo), o mtodo consiste em seccionar, com lmina de barbear, a parte area de plntulas e despositar uma gota de inculo na rea seccionada. preciso cuidado para no seccionar a planta abaixo do ponto de crescimento. As folhas novas que surgem, quando a inoculao tem sucesso, j o fazem exibindo sintomas (Figura 8). Dependendo do patgeno (E. carotovora, por exemplo) no h surgimento de folhas novas - a planta seccionada simplesmente no mais emite folhas e morre. Esse mtodo j foi usado, por exemplo, para inocular Erwinia stewartii em milho doce (Coplin, 1978) e A. avenae em arroz (Romeiro et al., 1989)

SECCIONAMENTO

INOCULAO

INCUBAO

SINTOMAS

CMARA MIDA

Figura 8: Esquema explicativo do procedimento para inoculao por seccionamento da parte area

h) Inoculao com palito Palitos comuns de madeira so previamente esterilizados, imersos em suspenso de inculo e introduzidos no caule da planta ou no ponto de insero da folha no caule. Consegue-se assim, sem a drasticidade do mtodo de injeo, introduzir o patgeno profundamente nos tecidos. Este mtodo foi usado por, por exemplo, por (Calzolari & Bazzi, 1985) para inocular plantas de alho com P. fluorescens.


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i) Inoculao via hidatdios Os hidatdios geralmente situam-se nos bordos do limbo foliar (Figura 9) e so importante porta de entrada para as fitobactrias. Xanthomonas campestris pv. campestris um tpico patgeno que penetra, em condies de campo, via hidatdios. Da os sintomas de leso cuneiforme nos bordos da folha (Kiraly et al., 1970; Romeiro, 1995).

HIDATDIOSFigura 9: Localizao dos hidatdios no limbo foliar Procedimento a) Colocar as plantas a serem inoculadas em cmara mida por 24 horas. b) Passar suavemente um cotonete ou pincel de pintura previamente imersos em suspenso de inculo pelos bordos da folha, sem permitir escorrimento. c) As plantas inoculadas no devem retornar cmara mida e sim serem mantidas, se possvel, em local ventilado. d) A temperatura de incubao deve estar entre 25oC e 30oC e nunca ultrapassar 30oC.

j) Inoculao de razes lavadas a) Colocar as sementes para germinar de preferncia em leito de vermiculita ou areia. b) Quando as plntulas apresentarem o primeiro par de folhas definitivas, remover cuidadosamente a planta e lavar seu sistema radicular sob gua corrente. c) Com tesoura estril, seccionar as extremidades de algumas raizes. d) Imergir o sistema radicular em suspenso de inculo por alguns minutos e) Replantar a muda em vasos com solo estril. Aguar moderadamente. f) Sintomas podem demorar de dias a semanas para surgir, dependendo do patossistema em estudoTELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: [email protected]

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l) Inoculao de raizes "in situ" Esta uma variao do mtodo anterior, em que a planta no arrancada. Estando a planta no vaso, iserir um escalpelo no substrato (terra, terrio, etc) e fazer vrios cortes no sistema radicular. Irrigar ento o vaso com a suspenso de inculo.

m) Infestao do solo Pode-se infestar o solo com uma quantidade conhecida de inculo que seria expressa, por exemplo, em c.f.u./g de solo, como utilizado em vrias instncias pra para incular estacas de roseira com A. tumefaciens (Napoleo, 1996; Silva, 1998; Silva & Romeiro, 1998) e para inoculao de tomteiro com R. solanacearum (Moura, 1996; Moura et al., 1996a; Moura et al., 1996b; Romeiro et al., 1998; Romeiro et al., 1997) A infestao pode ser feita misturando-se a suspenso de inculo e o solo usado para preparar os vasos ou, j estando as plantas em vasos, simplesmente proceder irrigao com a suspenso bacteriana, ferindo e, ou, no ferindo o sistema radicular

n) Inoculao por seccionamento do pecolo Este mtodo foi usado, por exemplo, por Pine et al. (1955) especificamente para estudar a translocao de C. michiganense subsp. michiganense via xilema de plntulas de tomateiro. O mtodo consiste em seccionar o pecolo foliar prximo ao seu ponto de insero no caule e, na rea seccionada, depositar uma gota de inculo.

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