INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM … · - Ao Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, ... Guilherme G. Roberto, Daniela F. São Pedro ... - Ao Dr. Fernando B. Zambrosi pela

INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA

TROPICAL E SUBTROPICAL

FISIOLOGIA DE CANA-DE-AÇÚCAR SOB DÉFICIT HÍDRICO:

PLASTICIDADE FENOTÍPICA, TRANSPORTE DE ÁGUA,

METABOLISMO ANTIOXIDANTE E FOTOSSÍNTESE

PAULO EDUARDO RIBEIRO MARCHIORI

Orientador: Rafael Vasconcelos Ribeiro

Tese submetida como requisito parcial

para obtenção do grau de Doutor em

Agricultura Tropical e Subtropical, Área

de Concentração em Tecnologia da

Produção Agrícola.

Campinas, SP

Outubro, 2014

ii

iii

iv

Aos meus pais, Paulo e Maria Elisa,

DEDICO

OFEREÇO

Às minhas irmãs Bruna e Berta

e à vó Binda (in memoriam)

v

AGRADECIMENTOS

- Ao Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, que é mais que orientador, é amigo.

- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado pela excelente convivência, conversas, sugestões,

oportunidades e pela amizade.

- À Bárbhara, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos.

- Ao Severino S. Nogueira pelas conversas e ajuda na instalação dos experimentos.

- Aos amigos do “Laboratório de Fisiologia Vegetal Coaracy Moraes Franco” Erick

Espinoza-Núñez, Cristina R. G. Sales, Fernanda Correa C. Marcos, José R. Magalhães

Filho, Neidiquele Maria Silveira, Karina I. Silva, Guilherme G. Roberto, Daniela F. São

Pedro Machado, Pedro Rampazzo e Ricardo S. Machado pela indispensável ajuda

durante a realização dos experimentos, nas análises laboratoriais e especialmente pela

ótima convivência.

- À Dra. Regina Célia M. Pires pelo auxílio na adaptação e manejo da irrigação do

sistema de rizotrons.

- Ao Dr. Fernando B. Zambrosi pela ajuda na implantação do sistema de hidroponia.

- À Dra. Silvana Creste e à doutoranda Larissa M. Andrade pelo auxílio com as análises

de expressão gênica.

- Ao Dr. Marcos Landell pelo auxílio com a escolha das variedades utilizadas.

- Aos amigos do IAC, em especial ao Guilherme Augusto P. Silva, Alex Paulo

Mendonça, Andre Luiz B. O. Silva, Vinicius Andrade e Anderson (Fogo).

- À PG/IAC especialmente à Célia, Carol e Tati.

- Aos professores da PG-IAC pelos ensinamentos transmitidos.

- Aos amigos Marcelo, Priscila, Ana Julia e Angelina pelo apoio e ótima convivência

durante esses quatro anos.

- Ao Programa de Pós-Graduação e ao Instituto Agronômico pela oportunidade.

- Aos amigos da república Kurva-d-Rio.

- À FAPESP pelo financiamento do projeto através do Programa BIOEN (Proc.

2008/57495-3).

- Ao CNPq pelo suporte financeiro.

- À todos aqueles que de uma forma direta ou indireta contribuíram para a realização

desse trabalho.

vi

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIAÇÕES ......................................................................................... vii

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................... x

ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ xiv

RESUMO ....................................................................................................................... xv

ABSTRACT ................................................................................................................. xvii

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1

2 ESTRUTURA DA TESE .............................................................................................. 7

CAPÍTULO I .................................................................................................................... 8

RESUMO ......................................................................................................................... 9

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 10

2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 13

3 RESULTADOS ........................................................................................................... 19

4 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 32

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 37

CAPÍTULO II ................................................................................................................. 38

RESUMO ....................................................................................................................... 39

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 40

2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 42

3 RESULTADOS ........................................................................................................... 52

4 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 68

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 73

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 74

vii

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AF Área foliar cm2

AFE Área foliar específica cm2 g

-1

AN Assimilação de CO2 µmol m-2

s-1

AQP Aquaporinas

AQP% Contribuição das aquaporinas na condutância

hidráulica das raízes %

APX Ascorbato peroxidase µmol AsA g-1

MF min-1

AR Área radicular cm2

ARE Área radicular específica cm2 g

-1

ART Área radicular total m2

ATP Adenosina trifosfato

Ca Concentração de CO2 da atmosfera Pa

CAT Catalase nmol g-1

MF min-1

CI Concentração intercelular de CO2 Pa

CP Componente principal

CR Comprimento radicular M

CRE Comprimento radicular específico cm g-1

CRT Comprimento radicular total M

DAT Dias após o transplantio Dia

DH Tratamento de déficit hídrico

DR Diâmetro médio das raízes Mm

DHAR Deidroascorbato redutase

E Transpiração mmol m-2

s-1

ERO Espécie reativa de oxigênio

ETR Taxa de transporte de elétrons µmol m-2

s-1

EUA Eficiência do uso da água mol mmol-1

EUAi Eficiência intrínseca do uso da água µmol mol-1

ETR/AN Razão entre taxa de transporte de elétrons e CO2

assimilado molmol

-1

Fm Fluorescência máxima no escuro unid. rel.

Fm’ Fluorescência máxima na luz unid. rel.

Fo Fluorescência mínima no escuro unid. rel.

Fo’ Fluorescência mínima na luz unid. rel.

viii

Fq’/Fm’ Eficiência quântica efetiva do fotossistema II unid. rel.

Fq’/Fv’ Coeficiente de extinção fotoquímica unid. rel.

Fs Fluorescência no estado de equilíbrio dinâmico unid. rel.

FSI Fotossistema I

FSII Fotossitema II

Fv/Fm Eficiência quântica potencial do fotossistema II unid. rel.

Fv’ Fluorescência variável na luz unid. rel.

gM Condutância do mesofilo mol m-2

s-1

GR Glutationa redutase

gS Condutância estomática mol m-2

s-1

H Altura da planta cm

k Eficiência instantânea de carboxilação µmol m-2

s-1

Pa-1

Lpr Condutância hidráulica das raízes mmol m-2

s-1

MPa-1

MDA Aldeído malônico

MDHAR Monodeidroascorbato redutase

MS R/PA Razão entre a matéria seca da raiz e parte aérea

MSPA Matéria seca da parte aérea g

MSR Matéria seca da raiz g

MST Matéria seca total g

MSTR Matéria seca total das raízes g

NADPH Fosfato de dinucleotido de nicotinamida e adenina

NP Número de perfilhos unid.

NPQ Coeficiente de extinção não-fotoquímico

NFV Número de folhas verdes da touceira unid.

O2●-

Ânion superóxido

PEP Fosfoenolpiruvato

PEPCase Fosfoenolpiruvato carboxilase

PF Plasticidade fenotípica

PIP Proteína intrínseca de membrana plasmática

Q Radiação fotossinteticamente ativa μmol m-2

s-1

QEXC Excesso relativo de energia

Rd Respiração no escuro μmol m-2

s-1

RDPI Índice de plasticidade de distâncias relativas

ix

RDPIf Índice de plasticidade de distâncias relativas de

parâmetros fisiológicos

RDPIm Índice de plasticidade de distâncias relativas de

parâmetros morfológicos

REF Tratamento referência

Rubisco Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase

RuBP Ribulose-1,5-bisfosfato

SM Tratamento de seca moderada

SOD Superóxido dismutase U.A. g-1

MF min-1

SS Tratamento de seca severa

TME Coleta realizada no máximo estresse

TR Coleta realizada 48 h após a reidratação

T48h Coleta realizada 48 h após indução do estresse hídrico

VR Volume das raízes mm3

CO2 Eficiência quântica da fixação de CO2 μmol μmol

-1

Potencial da água na folha MPa

me Potencial da água na folha medido no máximo estresse MPa

8h Potencial da água na folha medido 18 h após a

reidratação MPa

x

ÍNDICE DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 1. Posicionamento das mangueiras de irrigação com os gotejadores instalados em

três profundidades (em A). Detalhe do sensor WaterMark® posicionado no raio de 3 cm

do gotejador (em B). Registros para individualizar a saída de água para os gotejadores

(em C). ............................................................................................................................ 15

Figura 2 - Sistema radicular antes de ser fracionado para as análises de imagem. As

raízes foram seccionadas a cada 30 cm, considerando as três faixas de profundidade do

solo (0 a 30 cm; 30 a 60 cm; 60 a 90 cm). Em cada uma das frações, amostras de 8,0 cm

de comprimento foram excisadas, digitalizadas e avaliadas pelo programa Safira®...... 17

Figura 3. Assimilação de CO2 (AN, em A), eficiência instantânea de carboxilação (k, em

B), condutância estomática (gS, em C), eficiência do uso da água (EUA, em D),

transpiração (E, em E) e eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, em F) das

variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 expostas aos

tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS) desde o

transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma representa o valor médio

(n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco dias de avaliações.

Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas comparam as

variedades (t-student, p<0,05). ....................................................................................... 21

Figura 4. Eficiência potencial do fotossistema II (Fv/Fm, em A), excesso relativo de

energia (QEXC, em B), eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em C),

taxa aparente de transporte de elétrons (ETR, em D) e coeficiente de extinção

fotoquímico (Fq’/Fv’, em E) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e

IACSP95-5000 expostas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca

severa (SS) desde o transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma

representa o valor médio (n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco

dias de avaliações. Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas

comparam as variedades (t-student, p<0,05). ................................................................. 23

Figura 5. Matéria seca total (MST, em A), matéria seca da parte aérea (MSPA, em B) e

razão matéria seca das raízes e da parte aérea (MS R/PA, em C) das variedades de cana-

de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de

disponibilidade hídrica referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada

histograma representa a média (n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os

regimes hídricos e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05). 24

Figura 6. Área foliar (AF, em A) e área foliar específica (AFE, em B) das variedades de

cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência

(REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada histograma representa a médias

(n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade

hídrica e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05). ............... 25

Figura 7. Área (AR, em A,B), comprimento (CR, em D,E) e matéria seca das raízes

(MSR, em G,H) no perfil do solo (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm) e área radicular total

(ART, em C), comprimento radicular total (CRT, em F) e matéria seca total das raízes

(MSTR, em I) nas variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (A,D,G) e IACSP95-

5000 (B,E,H) submetidas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM, o) e

seca severa (SS, Δ). Cada símbolo ou barra indica o valor médio (n=3)±desvio padrão

xi

comparadas pelo teste t-student (p<0,05), seguidas por letras iguais não diferem entre si.

Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e letras

minúsculas os tratamentos de variedades. ...................................................................... 26

Figura 8. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das características

fisiológicas (A; n=378), morfológicas (B; n=351) e total (C; n=729) em variedades de

cana-de-açúcar submetidas à deficiência hídrica. * indica diferença significativa entre as

variedades (p<0,05, Mann-Whitney). ............................................................................. 28

Figura 9. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas

(RDPIf, em A; n=27), agrupadas em trocas gasosas [assimilação de CO2 (AN),

condutância estomática (gS), concentração intercelular de CO2 (CI), transpiração (E),

eficiência da fixação de CO2 (CO2), eficiência do uso da água (EUA), eficiência

intrínseca do uso da água (EUAi) e eficiência instantânea de carboxilação (k)] e

fotoquímica [eficiência quântica aparente do fotossistema II (Fq’/Fm’), coeficiente de

extinção fotoquímico (Fq’/Fv’), taxa de transporte de elétrons (ETR), eficiência quântica

potencial do fotossistema II (Fv/Fm), coeficiente de extinção não-fotoquímico (NPQ) e

excesso relativo de energia (QEXC)] e morfológicas (RDPIm, em B; n=27) [área (AR),

volume (VR), comprimento (CR), matéria seca (MSR) e diâmetro (DR) da raiz, matéria

seca da parte aérea (MSPA), área foliar (AF), área foliar específica (AFE), razão

matéria seca raiz/parte aérea (MS R/PA), altura (H), matéria seca total (MST),

comprimento radicular específico (CRE) e área radicular específica(ARE)]. * indica

diferença significativa entre as variedades (p<0,05, Mann-Whitney). ........................... 29

Figura 10. Análise de componentes principais (CP) considerando os parâmetros

fisiológicos (em A), morfológicos (em B) e total (em C) utilizados no cálculo de RDPI

(Figura 8) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (□) e IACSP95-5000 (Δ).

Os símbolos abertos representam o tratamento referência (REF), os símbolos azuis

parcialmente fechados representam o tratamento de seca moderada (SM) e os símbolos

vermelhos fechados representam os tratamento de seca severa (SS). A percentagem de

explicação de cada componente principal é mostrada. ns

indica não significância do

componente principal. .................................................................................................... 31

CAPÍTULO II

Figura 1. Ilustração do método de avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lpr).

(Adaptado de SILVA, 2014). ......................................................................................... 51

Figura 2. Assimilação de CO2 (AN, em A,B), condutância estomática (gS, em C,D) e

eficiência instantânea de carboxilação (k, em E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar

IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit

hídrico (DH). DAT indica dias após o início do déficit hídrico. Cada símbolo representa

as médias (n=5±dp). *indica diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos

comparados pelo teste t-student. As setas indicam os dias de amostragem de tecidos

vegetais: T48h, 48 h após a redução do potencial osmótico da solução nutritiva; TME,

máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.................................................... 53

Figura 3. Eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em A,B), taxa de

transporte de elétrons (ETR, em C,D) e ETR/AN (E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar





xii


máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.................................................... 55

Figura 4. Coeficiente de extinção fotoquímico (Fq’/Fv’, em A,B), coeficiente de

extinção não-fotoquímico (NPQ, em C,D) e excesso relativo de energia (QEXC, em E,F)

nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos

tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). DAT indica dias após o início do

déficit hídrico. Cada símbolo representa as médias (n=5±dp). *indica diferença

significativa (p<0,05) entre os tratamentos comparados pelo teste t-student. As setas

indicam os dias de amostragem de tecidos vegetais: T48h, 48 h após a redução do

potencial osmótico da solução nutritiva; TME, máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a

reidratação. ..................................................................................................................... 56

Figura 5. Concentração de aldeído malônico (MDA) em folhas (em A,B) e raízes (em

C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos

tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a

média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-

student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da

solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta

realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 58

Figura 6. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) em folhas (em A,B) e raízes

(C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos

aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a





Figura 7. Atividade de superóxido dismutase (SOD) em folhas (em A,B) e raízes (em







Figura 8. Identificação de isoformas de superóxido dismutase (SOD) em PAGE-nativo

em folhas e raízes dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065

submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). TME indica a coleta

realizada no máximo déficit e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. Cada gel é

resultante de uma amostra composta de quatro repetições, representativo de três

corridas. .......................................................................................................................... 61

Figura 9. Atividade de catalase (CAT) em folhas (em A,B) e raízes (em C,D) dos

genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos






Figura 10. Atividade de ascorbato peroxidase (APX) em folhas (em A,B) e raízes (em


xiii






Figura 11. Condutância hidráulica das raízes (Lpr, em A) e contribuição das aquaporinas

em Lpr (AQP%, em B) em genótipos de cana-de-açúcar submetidos a condição de boa

disponibilidade hídrica (REF) e 48 h após a exposição ao déficit hídrico (DH).*indica

diferenças significativas entre genótipos pelo teste t-student (p<0,05). Médias (n=3±dp).

........................................................................................................................................ 64

Figura 12. Expressão relativa dos transcritos das aquaporinas ScPIP2;1 (em A),

ScPIP2;3 (em B), ScPIP2;5 (em C) e ScPIP2;6 (em D) nos genótipos de cana-de-açúcar

IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos ao déficit hídrico. A expressão foi

quantificada por qPCR e calculada pelo método 2-ΔΔCt

. Cada histograma representa a

média (n=4±ep) e *indica diferença significativa entre os tratamentos referência e

déficit hídrico (p<0,05). T48h indica a coleta realizada 48 h após a redução do potencial

osmótico da solução nutritiva; TME representa a coleta realizada no máximo déficit

hídrico; e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. ................................................ 66

Figura 13. Acúmulo de matéria seca no colmo, folha, raiz e total em genótipos de cana-

de-açúcar IACSP94-2094 (A) e IACSP97-7065 (B) submetidos aos tratamentos

referência (REF) e déficit hídrico (DH). Quantificação realizada após 48 h da

reidratação. Cada histograma representa a média (n=5±dp) e * indica diferença

significativa (p<0,05) entre os tratamentos pelo teste t-student. .................................... 67

xiv

ÍNDICE DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1. Diâmetro médio das raízes (DR), volume médio das raízes (VR), crescimento

radicular específico(CRE) e área radicular específica (ARE) das variedades de cana-de-

açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência (REF),

seca moderada (SM) e seca severa (SS). ........................................................................ 27

CAPÍTULO II

Tabela 1. Potencial da água na folha () em genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-7065

submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Medidas realizadas

na antemanhã, no máximo déficit hídrico (me) e 18 h após a reidratação (18h). ......... 57

Tabela 2. Sequência (5’-3’), concentração dos primers, eficiência da amplificação (E) e

variação da expressão de cinco genes constitutivos nas raízes de dois genótipos de cana-

de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos à restrição hídrica. ................ 65

Tabela 3. Número de perfilhos (NP), número de folhas verdes da touceira (NFV) e área

foliar (AF) avaliados 48 h após a reidratação dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-

7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). .................. 67

xv

Fisiologia de cana-de-açúcar sob déficit hídrico: plasticidade fenotípica, transporte

de água, metabolismo antioxidante e fotossíntese

RESUMO

A limitação na disponibilidade de água é a principal causa da perda de produção em

cana-de-açúcar. A busca por variedades resistentes à seca é fundamental para a

manutenção da produtividade e economia de recursos. O sistema radicular é órgão

chave para a resistência à seca, no entanto há poucos estudos que relacionam as

respostas do sistema radicular com as da parte aérea em cana-de-açúcar submetidas à

seca. O objetivo deste estudo foi identificar mecanismos envolvidos com a resistência à

seca em mudas de cana-de-açúcar e avaliar se a resistência está associada ao melhor

desempenho do sistema radicular em manter o status hídrico da parte aérea, favorecendo

a fotossíntese. O desempenho das raízes foi avaliado através de respostas fisiológicas e

morfológicas. Foram realizados dois estudos, no primeiro as variedades de cana-de-

açúcar, IACSP94-2094 (tolerante à seca) e IACSP95-5000 (responsiva e altamente

produtiva) foram submetidas a três condições hídricas e foi avaliada a plasticidade

fenotípica de características morfológicas e fisiológicas. Plantas de ambas as variedades

submetidas ao déficit hídrico severo apresentaram redução da fotossíntese se

comparadas às plantas referência, porém, a redução foi menor em IACSP94-2094 se

comparada a IACSP95-5000. O maior acúmulo de matéria seca total de IACSP94-2094

ocorreu no tratamento referência, ao passo que o maior crescimento de IACSP95-5000

foi sob déficit hídrico moderado. Os resultados revelaram que IACSP94-2094

apresentou menor plasticidade fisiológica que IACSP95-5000 em todos os parâmetros,

exceto na eficiência quântica potencial do fotossistema II e no coeficiente de extinção

não-fotoquímico. Sob déficit hídrico as duas variedades apresentaram mecanismos de

resistência à seca, com IACSP95-5000 evitando o déficit hídrico com o maior

crescimento das raízes sob estresse moderado. Em condição de seca severa, IACSP94-

2094 apresenta tolerância, com menor sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo

de biomassa sob déficit hídrico em IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade

fenotípica, com o componente fisiológico (trocas gasosas) sendo determinante se

comparado ao morfológico. No segundo estudo foram utilizadas IACSP94-2094 e

IACSP97-7065 (sensível à seca) e analisadas as relações entre a condutância hidráulica

das raízes (Lpr), a fotossíntese e o metabolismo antioxidante. Os resultados sugerem que

xvi

o genótipo resistente IACSP94-2094 apresenta menor redução no crescimento devido a

menor sensibilidade da fotossíntese no período inicial de seca, dada pela menor

sensibilidade da condutividade hidráulica das raízes à restrição hídrica e manutenção da

contribuição das aquaporinas em Lpr (~80%). O padrão de expressão das aquaporinas

não foi associado à variação de Lpr. Não foi possível estabelecer uma relação entre o

teor de H2O2 no sistema radicular e a atividade das aquaporinas nas raízes. As respostas

do sistema antioxidante na raiz variaram entre os genótipos, mas os teores de H2O2

permaneceram inalterados em condição de déficit hídrico. Em geral, as enzimas

superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase foram mais responsivas ao déficit

hídrico em IACSP94-2094 no máximo estresse e na recuperação. São discutidos os

mecanismos fisiológicos relacionados com a sensibilidade ou resistência diferencial à

seca entre os genótipos.

Palavras-chave: Saccharum ssp., aquaporina, condutividade hidráulica, seca, raiz.

xvii

Physiology of sugarcane under water deficit: phenotypic plasticity, water transport

antioxidant metabolism and photosynthesis

ABSTRACT

Low water availability is the main cause of yield losses in sugarcane. The search for

drought-resistant varieties is crucial for maintaining productivity and saving water

resources. The root system plays a key role in drought resistance, however studies

relating root and shoot responses in sugarcane under drought are scarce. The aim of this

study was to identify mechanisms related to drought resistance in sugarcane and assess

if drought resistance is associated with better performance of root system, maintaining

shoot water status and favoring photosynthesis. The performance of roots was assessed

by morphological and physiological responses. In the first experiment, varieties of

sugarcane IACSP94-2094 (drought tolerant) and IACSP95-5000 (responsive and highly

productive) were subjected to three water conditions and the phenotypic plasticity of

morphological and physiological traits were evaluated. Plants of both varieties subjected

to severe water stress showed reductions in photosynthesis compared to reference

plants, however, the reduction was smaller in IACSP94-2094 compared to IACSP95-

5000. Higher accumulation of dry matter in IACSP94-2094 occurred under reference

treatment, whereas the highest growth in IACSP95-5000 was found under moderate

drought. The results revealed that IACSP94-2094 showed less physiological plasticity

than IACSP95-5000 in all parameters, except the potential quantum efficiency of

photosystem II and the non-photochemical quenching. Under drought stress the two

varieties showed resistance mechanisms against drought, with IACSP95-5000 avoiding

drought due to higher root growth under moderate stress. In conditions of severe

drought, IACSP94-2094 showed tolerance given by less sensitivity of photosynthesis.

The higher biomass accumulation under water deficit in IACSP95-5000 was associated

with higher phenotypic plasticity, with the physiological component (gas exchange)

being decisive when compared to morphological one. In the second experiment,

IACSP94-2094 and IACSP97-7065 (sensitive to drought) were studied and the relations

between root hydraulic conductance (Lpr), photosynthesis and antioxidant metabolism

were analyzed. The results suggest that the resistant genotype IACSP94-2094 shows

less reduction in growth due to lower sensitivity of photosynthesis during the initial

xviii

period of drought, given by the lower sensitivity of root hydraulic conductance and

maintenance of aquaporin contribution to Lpr (~80%). The pattern of aquaporins

expression was not associated with changes in Lpr. There was not possible to establish a

relation between root H2O2 concentration and aquaporin activity. The responses of root

antioxidant system varied between cultivars, but H2O2 levels remained unchanged in

water stress conditions. In general, the enzymes superoxide dismutase, catalase and

ascorbate peroxidase were more responsive to water deficit in IACSP94-2094 as

compared to IACSP97-7065, regarding the maximum stress and recovery. The

physiological mechanisms related to differential sensitivity to drought resistance among

genotypes were discussed.

Keywords: Saccharum ssp., aquaporin, hydraulic conductance, drought, root.

1

1 INTRODUÇÃO

O interesse mundial na produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) tem

crescido significativamente na última década devido à sua importância para a produção

de energia renovável (CHEAVEGATTI-GIANOTTO et al., 2011). Os biocombustíveis

são alternativas importantes aos combustíveis fósseis e apresentam grande potencial de

mitigação dos prejuízos causados pelos gases de efeito estufa (MOREIRA et al., 2014).

O aumento de produtividade e da eficiência do uso de recursos é importante para a

sustentabilidade da produção, mas para atingirmos esse objetivo é essencial o

entendimento das respostas das plantas às condições estressantes (PARRY &

HAWKESFORD, 2010).

A situação de estresse ocorre quando há desvio significativo das condições

ótimas para o desenvolvimento e as respostas das plantas ocorrem em todos os níveis

organizacionais (LARCHER, 2000). O déficit hídrico ocorre quando a demanda de água

da planta é maior que o suprimento pelas raízes (VADEZ et al., 2013), sendo

considerado a principal causa de perda de produção da agricultura (CATIVELLLI et al.,

2008). No entanto, além de ser genótipo-dependente, a severidade dos danos está

relacionada ao tempo de exposição, a intensidade da seca e ao estádio fenológico da

planta no momento da falta de água (LOPES et al., 2011). A seca pode prejudicar

aspectos fisiológicos, alterando o metabolismo, crescimento e desenvolvimento da

planta (JANGPROMMA et al., 2012). Para minimizar os prejuízos da falta de água, as

plantas apresentam diferentes mecanismos para superar a limitação hídrica, que

conferem diferentes níveis de resistência à seca. Os mecanismos são separados

didaticamente em (i) escape, (ii) evitamento e (iii) tolerância ao dessecamento. O escape

ocorre em plantas que completam o ciclo de vida antes do período seco. O evitamento

envolve todas as respostas que evitam a desidratação dos tecidos e a tolerância está

associada à capacidade da planta em manter a homeostase celular mesmo com baixos

conteúdos de água nos tecidos (LARCHER, 2000). De um modo geral, as plantas

utilizam mecanismos de evitamento e tolerância de maneira associada para superar o

estresse hídrico.

A alteração no fenótipo das plantas em resposta às variações no ambiente é

definida como plasticidade fenotípica (VALLADARES et al., 2007) e está associada à

capacidade de aclimatação da planta ao meio (NICOTRA et al., 2010). A plasticidade

fenotípica é espécie e genótipo-dependente e considera tanto aspectos morfológicos

2

como fisiológicos (VALLADARES et al., 2002). A plasticidade de determinadas

características funcionais das plantas pode ser traduzida em vantagem para a

sobrevivência e manutenção da produção em condição ambiental adversa (MATESANZ

et al., 2010). Desta forma, identificar quais são essas características é importante para a

compreensão da natureza da resistência à seca em plantas.

O sistema radicular é responsável pela absorção de água do solo, estando

diretamente relacionado à manutenção do status hídrico da planta. As raízes fazem parte

do sistema solo-planta-atmosfera, favorecendo a manutenção do fluxo de água através

da planta. A manutenção da homeostase da planta é dependente deste sistema, portanto

o fluxo de água deve ser mantido em variadas condições ambientais (JAVOT &

MAUREL, 2002), sendo a eficiência de absorção e transporte de água pelas raízes

características importantes para a resistência à seca (SALIENDRA & MEINZER, 1992)

e associadas com a regulação estomática. Com o início da restrição hídrica, o sistema

radicular percebe o secamento do solo e ocorre o desencadeamento de sinais químicos,

hidráulicos e moleculares que permitem a regulação do fluxo de água para manutenção

do status hídrico (TARDIEU, 1996; WILKINSON & DAVIES, 2002).

A condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) é ajustada a fim de regular o

fluxo de água para a parte aérea (CLARKSON et al., 2000; NORDEN et al., 2012).

Sabe-se que Lpr é variável ao longo do dia e responde ao balanço entre a demanda

hídrica e o suprimento de água via solo (HACHEZ et al., 2012; STEUDLE, 2000), com

sua variação estando diretamente ligada à atividade das aquaporinas (JAVOT &

MAUREL, 2002). Aquaporinas (AQP) são proteínas integrais que formam canais

transmembrana e facilitam o fluxo de água e/ou de solutos apolares, como ureia e

glicerol e os gases CO2 e amônia em células e organelas (HEINEN et al., 2009). Essas

proteínas regulam até 95% da condutância hidráulica celular (HENZLER et al., 2004).

Em plantas, já foram identificadas mais de 30 isoformas de AQPs, que são classificadas

em cinco subgrupos baseados na similaridade da sequência de aminoácidos: (i)

proteínas intrínsecas da membrana plasmática (PIP), (ii) proteínas intrínsecas do

tonoplasto (TIP), (iii) proteínas intrínsecas tipo nodulina (NIP), (iv) pequenas proteínas

intrínsecas básicas (SIP) e (v) proteínas intrínsecas X (XIP), estas ultimas não ocorrem

em monocotiledôneas (HEINEN et al., 2009; KATSUHARA et al., 2008). As PIPs são

as principais AQPs envolvidas no transporte de água célula-célula e compõe até 20% da

fração proteica das membranas plasmáticas. São divididas em duas famílias, que atuam

em conjunto, PIP1 e PIP2, sendo as PIP2 as que apresentam maior capacidade de

3

transporte de água (CHAUMONT et al., 2000; JOHANSSON et al., 1996). Dentro de

cada grupo de PIPs há as isoformas específicas que diferem na localização subcelular e

na seletividade de transporte de solutos (KATSUHARA et al. 2008). No entanto, as

AQPs podem ser inativadas pelo peróxido de hidrogênio (BENEBDELAH et al., 2009;

KTITOROVA et al. 2002). Mesmo sabendo-se da relação entre a atividade de

aquaporinas e a condutância hidráulica das raízes, ainda não há consenso no meio

científico sobre a regulação das AQPs e da Lpr quando as plantas são submetidas à seca.

Sob estresse abiótico, já foram identificadas reduções (AROCA et al., 2005; SILVA,

2014; VANDELEUR et al., 2009) ou aumentos (LIAN et al., 2004) no fluxo de água em

diferentes espécies de plantas.

Em situações de estresses pode ocorrer o aumento da geração de espécies

reativas de oxigênio (ERO) nas raízes, como H2O2. Dado o potencial efeito inibitório do

H2O2 sobre a atividade das AQPs é esperado que plantas que apresentem raízes com

sistema antioxidante mais eficiente acumulem menor quantidade de H2O2, favorecendo

a manutenção da atividade de AQPs e, portanto, a hidratação da parte aérea. No entanto,

em relação ao desempenho do metabolismo antioxidante no sistema radicular, órgão que

inicialmente é afetado pela baixa disponibilidade hídrica, não há estudos que revelem a

importância deste sistema enzimático em plantas de cana-de-açúcar submetidas à

restrição hídrica.

Se, apesar dos mecanismos de prevenção da desidratação, houver redução na

turgescência das folhas, ocorrerá menor crescimento foliar (INMAN-BAMBER et al.

2008). A posterior redução da condutância estomática (gS) e restrição na difusão de CO2

da atmosfera promoverá limitações difusivas da fotossíntese (GHANNOUM et al.,

2009; LOPES et al., 2011). A limitação difusiva promove desbalanço entre a produção

(atividade fotoquímica) e o consumo (atividade bioquímica) de produtos como

adenosina trifosfato (ATP) e nicotinamida adenina dinucleotídeo de piridina fosfato

reduzida (NADPH), levando à fotoinibição nos centros de reação do fotossistema II

(LAWLOR, 2002). A limitação metabólica é resultante da redução na atividade das

enzimas do metabolismo fotossintético C4, especialmente a ribulose-1,5-bisfosfato

carboxilase/oxigenase (Rubisco) e a fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase)

(GHANOOUM, 2009; LOPES et al., 2011) associadas a redução na síntese de ATP e

NADPH e consequentemente menor regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) e

fosfoenolpiruvato (PEP) (LAWLOR, 2002). As limitações fotoquímicas são

dependentes da redução na síntese de ATP, causada pela redução na taxa de transporte

4

de elétrons entre os fotossistemas e por danos nas membranas dos tilacóides (LAWLOR

& CORNIC, 2002).

Associado às limitações na fotossíntese, uma vez que a energia luminosa

continua sendo absorvida pelas folhas, ocorre alteração no status redox das células. Com

isso, há o desencadeamento do estresse oxidativo que é consequência da redução no

consumo de elétrons nas reações de assimilação de CO2. As EROs são produzidas

continuamente no metabolismo de seres vivos nas cadeias de transporte de elétrons, por

isso as plantas evoluíram com mecanismos de defesa antioxidante que atuam

constantemente para mitigar os efeitos negativos dessas espécies reativas. No caso de

desbalanço entre produção e eliminação das EROs, há acúmulo de superóxido (O2•-),

peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxila (OH•) (ARBONA et al., 2003;

MITTLER, 2002; VAIDYANATHAN et al., 2003). Baixas concentrações de EROs

podem atuar como agentes sinalizadores, porém o acúmulo dessas moléculas reativas

pode levar à desestabilização de membranas lipídicas, danos ao DNA e proteínas

celulares (MITTLER, 2002), com consequente colapso do metabolismo celular,

causando a morte da célula e redução no crescimento (MITTLER, 2002; NEILL et al.,

2002).

O sistema antioxidante nas células é composto por mecanismos enzimáticos e

não-enzimáticos. O sistema não-enzimático é composto por moléculas de ascorbato,

glutationa, flavonoides, carotenóides e tocoferóis, enquanto que o sistema enzimático

compreende diversas enzimas presentes nos diferentes compartimentos celulares. As

principais são a superóxido dismutase (SOD), ascorbato-peroxidase (APX) e a catalase

(CAT), além da monodeidroascorbato redutase (MDHAR), deidroascorbato redutase

(DHAR) e glutationa redutase (GR). O radical O2•- é produzido principalmente nas

mitocôndrias, cloroplastos, peroxissomos, sendo dismutado à H2O2 pela SOD, que é

rapidamente eliminado pelas CAT e APX, produzindo H2O + O2 ( PARIDA et al., 2004;

FOYER & NOCTOR, 2005).

Em cana-de-açúcar, a seca é o principal fator abiótico de perdas de

produtividade (LISSON et al., 2005) e as plantas apresentam diversos mecanismos para

minimizar os efeitos negativos da seca. A alteração do ângulo de inserção, enrolamento

e redução da área foliar, redução da abertura estomática, redução da transpiração,

alteração na condutividade hidráulica das raízes, redução na atividade de enzimas do

metabolismo de nitrogênio e de carboidratos e acúmulo ativo de açúcares solúveis e

aminoácidos são alterações morfológicas e fisiológicas encontradas em plantas quando

5

expostas ao déficit hídrico (CHAVES et al.,2009; GHANNOUM, 2009; INMAM-

BAMBER & DE JAGER, 1986; LOPES et al., 2011; SINCLAIR & LUDLOW, 1986).

A sensibilidade da condutância estomática à falta de água é uma característica

fisiológica importante relacionada à resistência à seca em cana-de-açúcar (RIBEIRO et

al., 2013). Há variedades consideradas resistentes à seca que reduzem a condutância

estomática (gS) logo no início da desidratação, minimizando reduções no teor relativo

de água das folhas (MACHADO et al., 2009). No entanto, há genótipos de cana-de-

açúcar resistentes à seca que apresentam menor redução na abertura estomática que os

genótipos sensíveis, quando expostos à condição de déficit hídrico (SMIT & SINGELS,

2006). Também foi relatado que em condições de deficiência hídrica, o potencial da

água na folha em cana-de-açúcar apresenta rápido decréscimo, mas posteriormente

permanece praticamente constante à medida que a desidratação do solo aumenta

(SALIENDRA & MEINZER, 1989). Tal variação de respostas é possivelmente

explicada pelo caráter genótipo-dependente da coordenação entre o sistema radicular e

parte aérea, que compreende propriedades hidráulicas e a eficiência de absorção de água

das raízes (SMITH et al., 2005).

A capacidade de manter a maquinaria fotossintética ativa durante o déficit

hídrico é uma das principais características encontradas em plantas resistentes à seca

(ZLATEV & YORDANOV, 2004). Esta característica pode estar associada à

capacidade de manutenção da absorção de água sob diferentes condições ambientais,

que também é uma característica relacionada com a resistência a estresses

(BENABDELAH et al., 2009). Há ampla variação genotípica para resistência à seca em

cana-de-açúcar (MACHADO et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013; SALES et al., 2013;

SMITH et al., 1999), por isso a compreensão das respostas das plantas ao déficit hídrico

é fundamental para a escolha e manejo das variedades a fim de otimizar a exploração

dos recursos disponíveis (SMIT & SINGELS, 2006).

Em plantas com metabolismo fotossintético C4, como a cana-de-açúcar, as

principais limitações da fotossíntese em condição de seca não são estomáticas

(TAYLOR et al., 2011). Os processos bioquímicos são os principais limitantes

(MACHADO et al., 2009; MACHADO et al., 2013), no entanto também foram

identificadas importantes limitações fotoquímicas do metabolismo fotossintético

(SALES et al., 2013). A eficiência de dissipação do excesso de energia através do

sistema antioxidante é uma importante característica para a resistência ou tolerância à

seca (CIA et al., 2012; SALES et al., 2013). A variedade de cana-de-açúcar tolerante à

6

seca exibiu menor sensibilidade à restrição hídrica, conferida pela melhor capacidade do

metabolismo antioxidante, sendo que essas alterações no metabolismo fotossintético

permitiram a manutenção do crescimento e melhor recuperação das trocas gasosas após

a reidratação (SALES et al., 2013).

A busca por genótipos com maior eficiência do uso da água é uma das

alternativas para a manutenção da produtividade em ambientes com baixa

disponibilidade hídrica (SINCLAIR et al., 2008). Sugere-se que a resistência ou

tolerância à seca seja maior em variedades que apresentem tendência de aprofundar o

sistema radicular e que essa característica está associada à maior eficiência do uso da

água (SMITH et al., 2005). O bom desenvolvimento do sistema radicular para a

manutenção de altas produtividades é considerada característica importante nos

programas de melhoramento genético que visam plantas resistentes à ambientes

limitantes (BODNER et al., 2013). Além das respostas morfo-fisiológicas que ocorrem

na parte aérea, as respostas à seca em cana-de-açúcar englobam mudanças no sistema

radicular, pois a dinâmica de crescimento e a distribuição das raízes de variedades de

cana-de-açúcar respondem às características do solo (SMITH et al., 2005). No entanto

são poucos os estudos que exploram as respostas do sistema radicular de cana-de-açúcar

frente a situações de restrição hídrica (JANGPROMMA et al., 2012). Os mecanismos

de resistência à seca são variados nos diferentes genótipos e a sua importância para o

melhor desempenho das plantas ainda é pouco conhecida (INMAN-BAMBER et al.,

2005). A falta de conhecimento é reflexo dos poucos estudos que sugerem os

mecanismos de resistência à seca de cana-de-açúcar, mesmo sabendo-se que o

conhecimento de características-chave para a resistência à seca é de grande importância

para os programas de melhoramento genético (BASNAYAKE et al., 2012).

Embora o estudo dos mecanismos envolvidos com a resistência à seca seja

fundamental para aumentar o conhecimento sobre a fisiologia dos estresses, menos

ainda se conhece quando a interação entre os metabolismos do sistema radicular e das

folhas é considerada.

7

2 ESTRUTURA DA TESE

A tese foi organizada em dois capítulos, com o primeiro intitulado “Plasticidade

fenotípica em cana-de-açúcar sob déficit hídrico: características morfológicas e

fisiológicas associadas à resistência à seca” no qual o objetivo do estudo foi identificar

os mecanismos predominantes de resistência à seca em duas variedades de cana-de-

açúcar. A hipótese deste trabalho é que a plasticidade fenotípica está relacionada com a

resistência à seca de variedades de cana-de-açúcar, sendo necessário estabelecer a

importância relativa da plasticidade fisiológica e morfológica na resposta das plantas à

baixa disponibilidade de água. No segundo capítulo é apresentado o estudo intitulado

“Integrando o transporte de água, fotossíntese e metabolismo antioxidante para

compreender a sensibilidade diferencial de genótipos de cana-de-açúcar ao déficit

hídrico”, no qual testamos a hipótese que a resistência à seca em cana-de-açúcar está

associada à menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em condição de

restrição hídrica. Esta habilidade estaria associada a um efetivo sistema antioxidante nas

raízes, que inibe a produção de H2O2 em condição de déficit hídrico e mantém a

atividade das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições limitantes.

8

CAPÍTULO I

PLASTICIDADE FENOTÍPICA EM CANA-DE-AÇÚCAR SOB DÉFICIT HÍDRICO:

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS ASSOCIADAS À

RESISTÊNCIA À SECA

9

Plasticidade fenotípica em cana-de-açúcar sob déficit hídrico: características

morfológicas e fisiológicas associadas à resistência à seca

RESUMO

O objetivo do estudo foi identificar os mecanismos predominantes de resistência à seca

em duas variedades de cana-de-açúcar. Mudas pré-brotadas das variedades de cana-de-

açúcar (Saccharum spp.) IACSP95-5000 e IACSP94-2094 foram transplantadas para

rizotrons. As plantas foram submetidas a três regimes hídricos, com o potencial

matricial do solo sendo -3±1, -14±1 e -75±4 kPa nos tratamentos referência, déficit

moderado e severo, respectivamente. Trinta e cinco dias após o transplantio, depois das

primeiras raízes alcançarem a base dos rizotrons (95 cm de profundidade), o

experimento foi finalizado. As características biométricas (parte aérea e sistema

radicular), trocas gasosas foliares e a atividade fotoquímica foram avaliadas e a

plasticidade fenotípica, considerando parâmetros fisiológicos (trocas gasosas e atividade

fotoquímica) e morfológicos (raízes e parte aérea) calculada. Plantas de ambas as

variedades submetidas ao déficit hídrico moderado ou severo apresentaram redução da

fotossíntese se comparadas às plantas referência, porém, a redução foi menor em

IACSP94-2094 se comparada a IACSP95-5000 sob déficit hídrico severo. O maior

acúmulo de matéria seca total de IACSP94-2094 ocorreu no tratamento referência, ao

passo que o maior crescimento de IACSP95-5000 foi sob déficit hídrico moderado. Os

resultados revelaram que IACSP94-2094 apresentou menor plasticidade fisiológica que

IACSP95-5000 em todos os parâmetros, exceto na eficiência quântica potencial do

fotossistema II e no coeficiente de extinção não-fotoquímico. Sob déficit hídrico as duas

variedades apresentaram mecanismos de resistência à seca, com IACSP95-5000

evitando o déficit hídrico com o maior crescimento das raízes sob estresse moderado.

Em condição de seca severa, IACSP94-2094 apresenta tolerância, com menor

sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo de biomassa sob déficit hídrico em

IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade fenotípica, com o componente

fisiológico (trocas gasosas) sendo determinante se comparado ao morfológico.

Palavras-chave: Saccharum ssp., fotossíntese, raiz, seca.

10

1 INTRODUÇÃO

O interesse mundial na produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) vem

crescendo significativamente desde a última década devido à sua importância como

matéria-prima para a produção de energia renovável (CHEAVEGATTI-GIANOTTO et

al., 2011; WALTER et al., 2014). Com a crescente busca pelo aumento de

produtividade e eficiência do uso de recursos é essencial a compreensão dos aspectos

fisiológicos e morfológicos associados ao crescimento e desenvolvimento das plantas de

cana-de-açúcar em condição de deficiência hídrica (PARRY & HAWKESFORD,

2010). A busca por genótipos com maior resistência a seca é uma das alternativas para a

manutenção da produtividade em ambientes com baixa disponibilidade hídrica. Neste

sentido, estudos que ajudem na compreensão das respostas de plantas de cana-de-açúcar

expostas à seca devem ser prioritárias (INMAN-BAMBER et al., 2005).

A seca é o principal fator ambiental responsável pela redução na produtividade

na cana-de-açúcar (LISSON et al., 2005; BASNAYAKE et al., 2012). A deficiência

hídrica ocorre quando a demanda de água pela planta é maior do que a capacidade de

absorção e transporte da água pelas raízes (AROCA et al., 2011). Quando a desidratação

celular atinge níveis críticos que interfere no status fisiológico e na homeostase celular,

ocorrem alterações no metabolismo e consequentemente no desenvolvimento da planta

(JANGPROMMA et al., 2012). A severidade dos efeitos da restrição hídrica nas plantas

é relacionada ao tempo de exposição, à intensidade e ao estádio fenológico da planta no

momento da falta de água (LOPES et al., 2011). Porém as respostas à seca estão

associadas com a capacidade da planta em perceber e responder à falta de água

(CHAVES et al., 2009).

De um modo geral as variedades de cana-de-açúcar reduzem a condutância

estomática (gS) logo no início do evento de seca, minimizando reduções no teor relativo

de água das folhas (INMAN-BAMBER et al., 2005; MACHADO et al., 2009).

Comparativamente às plantas C3, plantas C4 como a cana-de-açúcar apresentam maior

eficiência do uso da água. No entanto, com o decorrer da seca o processo fotossintético

passa a ser limitado pela menor difusão de CO2 no mesofilo (gM) (LOPES et al., 2011).

Além das limitações da fotossíntese dadas pelo menor suprimento de CO2 dada por

limitações difusivas (menor gS e gM), a desidratação dos tecidos desencadeia limitações

metabólicas. A limitação metabólica é resultante da redução na atividade das enzimas

do metabolismo fotossintético C4, especialmente a Rubisco e a PEPcase (LAWLOR &

11

CORNIC, 2002; LAWLOR, 2002). Ocorre também redução na produção de ATP,

NADPH e consequentemente nas taxas de regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato

(RuBP) e fosfoenolpiruvato (PEP) (LAWLOR, 2002). A redução na síntese de ATP está

relacionada à redução na taxa de transporte de elétrons entre os fotossistemas e também

a danos nas membranas dos tilacóides (LAWLOR & CORNIC, 2002). Somadas a essas

limitações, também foram observadas perdas na eficiência quântica do fotossistema II

em variedades de cana-de-açúcar submetidas ao déficit hídrico (SALES et al., 2013;

RIBEIRO et al., 2013).

Além das respostas fisiológicas das plantas de cana-de-açúcar expostas à seca,

também ocorrem alterações em características morfológicas. Com o início da restrição

hídrica ocorre redução da expansão foliar (INMAN-BAMBER et al., 2005) em

consequência de prejuízos da divisão e alongamento celular. Com o decorrer da seca a

área foliar verde é reduzida, dada pelo aumento da senescência foliar associado ao

aumento do filocrono (SMIT & SINGELS, 2006). Observa-se em determinadas

variedades de cana-de-açúcar o enrolamento das folhas, que se inicia quando o potencial

da água na folha na antemanhã atinge valores ao redor de -1,0 MPa (INMAN-

BAMBER & DE JAGER, 1986). Com a redução da área foliar exposta, ocorre redução

da perda de água por transpiração, da interceptação de radiação e da temperatura foliar

(SILVA et al., 2007).

Associado a alterações morfo-fisiológicas na parte aérea, as respostas à seca em

cana-de-açúcar englobam mudanças no sistema radicular. A dinâmica de crescimento e

a distribuição das raízes de variedades de cana-de-açúcar respondem às características

do solo (SMITH et al., 2005). SALES et al. (2012) observaram que uma variedade de

cana-de-açúcar considerada tolerante à seca não apresentou alteração no acúmulo de

raízes quando submetidas à restrição hídrica. Também foi observado redução da

condutância hidráulica em variedades submetidas à restrição hídrica em cana-de-açúcar

(SALIENDRA & MEINZER, 1989; MEINZER & GRANTZ, 1990). É importante

salientar que essas alterações impactam o status hídrico da parte aérea. No entanto são

poucos os estudos que exploram as respostas do sistema radicular de cana-de-açúcar

frente a situações de restrição hídrica (JANGPROMMA et al., 2012).

As respostas de cana-de-açúcar à seca podem variar entre genótipos

(BASNAYAKE et al., 2012; MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2013). Desta

forma, há variedades de cana-de-açúcar mais eficientes que outras em condições de

seca. No entanto os mecanismos de resistência à seca são variados nos diferentes

12

genótipos (INMAN-BAMBER et al., 2005). Estudos distintos utilizando a mesma

variedade resistente de cana-de-açúcar concluíram que esta apresentou menor redução

da fotossíntese durante a seca, associado à recuperação mais rápida da assimilação de

CO2 após a reidratação (MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2013). A recuperação

da fotossíntese foi relacionada à maior atividade das enzimas superóxido dismutase e

ascorbato peroxidase (SALES et al., 2013). No entanto pouco são os estudos que

sugerem os mecanismos de resistência, mesmo sendo de fundamental importância para

os programas de melhoramento genético o conhecimento de características-chave para a

resistência à seca (BASNAYAKE et al., 2012). INMAN-BAMBER et al. (2012)

afirmaram que o aprofundamento das raízes, manutenção da área foliar verde,

condutância hidráulica e eficiência de transpiração são características importantes para o

aumento da resistência à seca e manutenção da produtividade em cana-de-açúcar.

Para minimizar os prejuízos da seca, as plantas apresentam diferentes

mecanismos para superar a limitação de água, que conferem diferentes níveis de

resistência à seca. Estes mecanismos são separados didaticamente em (i) “evitamento” e

(ii) tolerância ao dessecamento. O “evitamento” envolve todas as repostas que

minimizam a desidratação dos tecidos e a tolerância à dessecação é a capacidade da

planta em manter a homeostase celular mesmo com baixos conteúdos de água nos

tecidos (LARCHER, 2000). De um modo geral, as plantas utilizam mecanismos de

evitamento e tolerância de maneira associada para superar o estresse hídrico.

A planta não pode ser considerada isolada do contexto ambiental

(BRADSHAW, 1965) e assim a resistência ou tolerância à seca dependem da

capacidade da planta em perceber e responder aos estímulos ambientais. Esta habilidade

para expressar fenótipos alternativos em resposta a variações ambientais é chamada de

plasticidade fenotípica (PF). A plasticidade fenotípica está associada à capacidade de

aclimatação da planta ao meio (NICOTRA et al., 2010; VALLADARES et al., 2002).

Didaticamente, a PF pode ser separada em plasticidade morfológica e fisiológica

(VALLADARES et al., 2002), sendo o conhecimento da plasticidade das

características-chave envolvidas com a eficiência do uso da água importante para se

entender a resistência e a tolerância à seca (COUSO & FERNÁNDEZ, 2012). Assim, a

plasticidade de determinadas características funcionais das plantas pode ser traduzida

em vantagem para a sobrevivência e manutenção da produtividade em condição

ambiental adversa (MATESANZ et al., 2010). Em estudo realizado com três espécies de

gramíneas, a espécie que apresentou maior plasticidade fenotípica foi a mais sensível à

13

seca, dada pela redução de 50% na produção de biomassa. A espécie mais resistente foi

a que menos apresentou prejuízos em aspectos funcionais e morfológicos (COUSO &

FERNÁNDEZ, 2012). Esse resultado foi semelhante ao obtido por CLIFTON-BROWN

& LEWANDOWSKI (2000), que identificaram o Miscanthus sinensis como mais

tolerante à seca que o M. x giganteus devido à manutenção da produção sob condições

de seca.

Neste contexto, o objetivo do estudo foi identificar quais os mecanismos

predominantes de resistência à seca em duas variedades de cana-de-açúcar. A hipótese

deste trabalho é que a plasticidade fenotípica está relacionada com a resistência à seca

de variedades de cana-de-açúcar, sendo necessário estabelecer a importância relativa da

plasticidade fisiológica e morfológica na resposta das plantas à baixa disponibilidade de

água.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material Vegetal

Foram utilizadas mudas de duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

provenientes do Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico (IAC).

A variedade IACSP94-2094 é classificada como rústica e seu sistema radicular descrito

como superficial (LANDELL et al., 2005). Em relação a diversas variedades de cana-

de-açúcar, se submetida a condições de restrição hídrica apresenta menor perda na

produção de biomassa, sendo considerada resistente à seca (MACHADO et al., 2009;

SALES et al., 2013). A variedade IACSP95-5000 é considerada responsiva a insumos,

tendo alta produção de biomassa quando cultivada em condições adequadas, com

sistema radicular também concentrado nas camadas superficiais do solo (LANDELL et

al., 2007).

2.2 Condições Experimentais

O experimento foi conduzido em estufa com condições ambientais semi-

controladas, com a temperatura média do ar de 23,8±2,7 °C e radiação

fotossinteticamente ativa (Q) máxima de aproximadamente 1100 mol m-2

s-1

. Para a

14

produção das mudas, colmos maduros de ambas as variedades foram coletados no

Centro Experimental Central – Fazenda Santa Elisa/IAC (CEC/IAC), Campinas/SP.

Mini-toletes contendo uma gema intacta foram obtidos após a secção de colmos em

frações de três a quatro centímetros e plantados em bandejas contendo substrato

comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz RS, Brasil).

Após 20 dias da brotação, as mudas foram transplantadas para rizotrons

preenchidos com 28 L (95 cm de altura x 26 cm de diâmetro x 13 cm de raio) de mistura

de terra e areia na proporção (2:1). A terra utilizada no estudo foi coletada de solo do

tipo Latossolo vermelho-amarelo distrófico típico (DOS SANTOS et al., 2013). Após a

mistura com areia, a terra ficou com a seguinte constituição física: 59% de areia grossa;

13% de areia fina; 22% de silte e 6% de argila. Os rizotrons foram montados com uma

janela fixa de vidro e uma cobertura móvel de acrílico negro, que tem a função de

manter o sistema radicular na ausência de luz. As avaliações visuais do

desenvolvimento radicular foram feitas retirando a cobertura de acrílico. Os rizotrons

foram posicionados em ângulos de 45° com a horizontal para forçar o crescimento das

raízes junto à janela de vidro.

Foram utilizados 18 rizotrons para a realização do estudon nos quais foram

plantadas uma muda. Em cada rizotron foram instaladas três mangueiras de irrigação e

em cada mangueira foi instalado um gotejador autocompensante com vazão de 2,0 L h-1

(Netafim Ltd., Kibutz Hatzerim, Negev, Israel) em três profundidades distintas: 15, 45 e

70 cm a partir da superfície do solo (Figura 1A). Considerando o raio de três

centímetros a partir de cada gotejador (em cada profundidade), na região do bulbo

úmido, foi instalado um sensor WaterMark® 200SS (Irrometer, Riverside CA, EUA)

(Figura 1B). Na linha principal de irrigação foram instalados registros de água que

permitiam a abertura de cada gotejador de forma individual e cada registro permitia

liberar água de dois gotejadores localizados na mesma profundidade de dois rizotrons

adjacentes (Figura 1C). O sistema de irrigação foi acionado por motobomba elétrica

Hydrobloc P500 (KSB, Várzea Paulista SP, Brasil) com potência de 0,5 hp.

/

15

Figura 1. Posicionamento das mangueiras de irrigação com os gotejadores instalados

em três profundidades (em A). Detalhe do sensor WaterMark® posicionado no raio de 3

cm do gotejador (em B). Registros para individualizar a saída de água para os

gotejadores (em C).

Desde o momento do transplantio das mudas até o final do experimento, a

disponibilidade hídrica nos rizotrons foi mantida sempre a mesma. As plantas foram

submetidas a três condições de disponibilidade de água, baseadas no potencial mátrico

do solo, que foi monitorado diariamente através dos sensores WaterMark®

200SS.

Durante todo o período experimental o solo do tratamento referência (REF) foi mantido

a -3±1 kPa, o tratamento de seca moderada (SM) a -14±1 kPa e o tratamento de seca

severa (SS) a -75±4 kPa ao longo do perfil do solo nos rizotrons. A reposição da água

era feita apenas nas profundidades que estavam fora das faixas pré-definidas de tensão

de água.

2.3 Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a

Aos 22 dias após o transplantio (DAT) iniciaram-se as medidas de trocas

gasosas realizadas com analisador de gases por infravermelho Li-6400 (Licor Inc.

Lincoln NE, EUA). As avaliações foram realizadas na folha +1 segundo o sistema de

nomenclatura Kuijper (VAN DILLEWIJN, 1952) aos 22, 24, 26, 29 e 35 DAT entre

10:00 e 12:00 horas, com radiação fotossinteticamente ativa (Q) fixada em de 2000

mol m-2

s-1

e pressão parcial de CO2 do ambiente (Ca) de 39,2±0,1 Pa. Foram avaliadas

a assimilação de CO2 (AN), transpiração (E), condutância estomática (gS), eficiência do

16

uso da água (EUA, AN/E), eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, AN/gS),

concentração intercelular de CO2 (CI) e a eficiência instantânea de carboxilação (k,

AN/CI). A temperatura foliar e o déficit de pressão de vapor folha-ar foram monitorados

durante as medidas.

A fluorescência da clorofila a foi medida com o fluorômetro modulado 6400-40

LCF (Licor Inc. Lincoln NE, EUA) acoplado ao Li-6400, concomitantemente com as

medidas de trocas gasosas. Usando os sinais emitidos antes e após o pulso de saturação

(710 nm, Q ~ 8000 mol m-2

s-1

, 0,8 s) e após a excitação do fotossistema I (FSI) por

luz vermelho-distante (=735 nm, Q ~ 5 mol m-2

s-1

, 3,0 s), os seguintes parâmetros

foram monitorados: fluorescência em estado de equilíbrio (Fs) e máxima (Fm’) captadas

em tecidos adaptados a luz (Q = 2000 mol m-2

s-1

) e a fluorescência mínima (Fo’) após

a excitação do fotossistema I (VAN KOOTEN & SNEL, 1990). A partir destes

parâmetros, foram calculadas a fluorescência variável na luz (Fv’=Fm’–Fs), eficiência

quântica efetiva do fotossistema II (FSII) [Fq’/Fm’=(Fm’-Fs)/Fm’], o transporte aparente

de elétrons (ETR=Fq’/Fm’*f*Q*αfolha), onde f é a fração da energia absorvida usada pelo

fotossistema II, assumido como 0,4 em plantas C4 (EDWARDS & BAKER, 1993) e

αfolha é a absorbância da folha (0,85). A eficiência da fixação de CO2 (CO2) foi

calculada por CO2=(AN+Rd)/(Q*f), sendo Rd a respiração no escuro. O coeficiente de

extinção fotoquímica (Fq’/Fv’) foi calculado por Fq’/Fv’=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’). Ao final do

experimento, foram avaliadas também a fluorescência máxima (Fm) e a fluorescência

mínima (Fo) em tecidos adaptados ao escuro, sendo calculados o coeficiente de extinção

não-fotoquímica [NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’] e o excesso relativo de energia [QEXC=(Fv/Fm–

Fq’/Fm’)/Fv/Fm] (BILGER et al., 1995; EDWARDS & BAKER, 1993; MAXWELL &

JOHNSON, 2000; MURCHIE & LAWSON, 2013).

2.4 Potencial da Água nas Folhas

Medidas de potencial da água nas folhas () foram realizadas na antemanhã aos

35 DAT. Discos foliares de 0,6 cm² foram excisados do terço final das lâminas foliares,

desconsiderando a nervura central, e imediatamente dispostos em câmaras de medida C-

52 (Wescor Inc., Logan UT, EUA). Após alcançar o equilíbrio termodinâmico, foi

estimado pelo método higrométrico, com o auxílio de um microvoltímetro HR-33T

(Wescor Inc., Logan UT, EUA).

17

2.5 Biometria

Ao longo do experimento a altura (H) das plantas (colo até a inserção da folha

+1) foi monitorada com uso de régua comum. No dia seguinte após as primeiras raízes

alcançarem a base dos vasos, foi realizado o desmonte do experimento, sendo retirado

cuidadosamente todo o solo dos rizotrons para manter as plantas íntegras. Após a coleta

das plantas, foi realizada a separação em parte aérea e sistema radicular. A

quantificação do número de folhas verdes e secas foi feita e a área foliar (AF) foi

medida com planímetro Li-3000C (Licor Inc., Lincoln NE, EUA). A parte aérea (folhas,

nó e colmo) foi seca em estufa de circulação forçada de ar modelo MA032 (Marconi,

Piracicaba SP, Brasil) a 60 °C até estabilização do peso para determinação da matéria

seca da parte aérea (MSPA). A área foliar específica (AFE) é dada como a razão entre a

AF e a matéria seca das folhas.

As raízes foram armazenadas em solução aquosa de etanol (30%, v/v) em

refrigerador até o momento das análises de imagem. As raízes intactas foram

gentilmente dispostas ao lado de uma fita métrica para determinação do comprimento

máximo e então separadas em até três frações (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm). Uma sub-

amostra de 8,0 cm de comprimento da porção mediana de cada fração foi retirada para a

análise de imagem (Figura 2).

Figura 2 - Sistema radicular antes de ser fracionado para as análises de imagem. As

raízes foram seccionadas a cada 30 cm, considerando as três faixas de profundidade do

solo (0 a 30 cm; 30 a 60 cm; 60 a 90 cm). Em cada uma das frações, amostras de 8,0 cm

de comprimento foram excisadas, digitalizadas e avaliadas pelo programa Safira®.

As amostras foram cuidadosamente separadas e dispostas em scanner de mesa

Scanjet G2410 (Hewlett-Packard, Palo Alto CA, EUA) evitando a sobreposição de

raízes. Após a digitalização, as imagens foram analisadas com auxílio do programa

SAFIRA® (JORGE & SILVA, 2010) e estimativas de comprimento (CR), área (AR),

8 cm 8 cm8 cm

Prof. 60 – 90 cm Prof. 30 – 60 cm Prof. 0 – 30 cm

18

volume (VR) e diâmetro (DR) das raízes foram obtidas. Após a análise de imagem, as

sub-amostras e o restante das raízes foram secas (MSR) para que os parâmetros fossem

estimados com base na matéria seca. A determinação da matéria seca total (MST) da

planta foi obtida com a somatória da MSPA e MSR. O comprimento radicular

específico (CRE) foi obtido pela razão entre o CR/MSR e a área radicular específica

(ARE) foi obtida pela razão AR/MSR (MEIER & LEUSCHNER, 2008).

2.6 Plasticidade Fenotípica

A partir dos dados obtidos ao término do experimento, calculou-se o índice de

plasticidade de distâncias relativas (relative distance plasticity index, RDPI), para todas

as variáveis analisadas no estudo. O RDPI indica a distância fenotípica entre indivíduos

do mesmo genótipo expostos a diferentes ambientes e varia de 0 (sem plasticidade) a 1

(plasticidade máxima) e foi calculado de acordo com o método proposto por

VALLADARES et al. (2006).

Foram estimados o RDPI para as características fisiológicas (RDPIf) AN, gS, E,

CI, EUA, CO2, k, EUAi, Fq’/Fm’, Fq’/Fv’, NPQ, ETR, Fv/Fm e QEXC e para as

características morfológicas (RDPIm) AR, VR, CR, MSR, DR, MSPA, AF, AFE, MS

R/PA, H, MST, CRE e ARE. Também foi estimado o RDPI total, considerando todas as

variáveis analisadas.

2.7 Análise Estatística

O desenho experimental adotado foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial

2x3, sendo os fatores de variação as variedades (dois níveis) e a disponibilidade hídrica

(três níveis), considerando três repetições. Para os parâmetros de trocas gasosas e de

fluorescência da clorofila a avaliados ao longo do experimento, a análise estatística não

revelou diferenças entre as cinco avaliações e então foi realizada análise em arranjo

fatorial 2x3 considerando 15 repetições. Com apoio do programa Assistat 7.6 beta®

(UFCG, Brasil), a normalidade dos dados foi checada e os mesmos submetidos à análise

de variância. Quando detectadas diferenças significativas, as médias foram comparadas

pelo teste t-student (p<0,05).

19

Para a análise estatística de RDPI, como não foi observada normalidade dos

dados, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whittney (p<0,05).

A análise de componentes principais (ACP) foi realizada considerando todos os

parâmetros utilizados nas estimativas de RDPI (AN, gS, E, CI, CO2, EUA, k, EUAi,

Fq’/Fm’, Fq’/Fv’, NPQ, ETR, Fv/Fm, QEXC, AR, VR, CR, MSR, DR, MSPA, AF, AFE,

MS R/PA, H, MST, CRE e ARE). A significância do componente principal foi

determinada pelo método broken-stick e considerado seu autovalor (eigenvalue). A

importância das variáveis em cada componente principal foi dada por seu peso (loading,

l). Foram consideradas apenas as variáveis que apresentaram os cinco maiores valores

de l. Para essa análise foi utilizado o programa PC-ORD v.4.10 (McCUNE &

MEFFORD, 1999).

3 RESULTADOS

3.1 Avaliações Fisiológicas

O potencial da água na folha () avaliado na antemanhã foi menor (p<0,05) nas

plantas do tratamento SM, atingindo valores próximos a -0,53±0,14 MPa nas duas

variedades estudadas. Já as plantas REF e SS mantiveram ao redor de -0,28±0,09 e

-0,26±0,09 MPa, respectivamente em ambas as variedades (dados não apresentados).

Ao longo do período experimental, as plantas submetidas aos tratamentos SM e

SS de ambas as variedades apresentaram redução significativa (p<0,05) em AN, se

comparadas às plantas REF. Considerando a variedade IACSP94-2094, a redução em

AN foi de 42% nas plantas SM e de 70% nas plantas SS (Figura 1A). Já a variedade

IACSP95-5000 apresentou menor prejuízo em AN (-17%) no tratamento de seca

moderada e maior redução sob seca severa (-87%) se comparada à IACSP94-2094

(Figura 3A,B). As plantas da IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos REF e SM

apresentaram maior AN (p<0,05) durante o período experimental em relação às plantas

da variedade IACSP94-2094, porém a fotossíntese foi similar nas duas variedades

(p>0,05) quando submetidas à seca severa.

Em ambas as variedades, os maiores (p<0,05) valores de gS foram registrados no

tratamento referência (Figura 3C). Os valores de gS foram similares (p>0,05) entre as

plantas SM e SS da variedade IACSP94-2094, padrão distinto do observado em

20

IACSP95-5000. Nesta, as plantas SM apresentaram maiores valores de gs (p<0,05) do

que as plantas SS (Figura 3C). A redução média em gS de IACSP94-2094 foi da ordem

de 45% e 62% nas plantas SM e SS, respectivamente. Tal redução em IACSP95-5000

foi de 31% e 81% em SM e SS, respectivamente. A transpiração das plantas mostrou

padrão de resposta similar ao detectado em gS, sendo a redução média em E da

IACSP94-2094 de 39% e 58% nas plantas expostas à seca moderada e seca severa,

respectivamente, e de 28% e 76% nas plantas de IACSP95-5000 em SM e SS

respectivamente (Figura 3E).

Apenas nas plantas dos tratamentos de seca severa foram observados efeitos em

EUA e em EUAi, com reduções de 38% e 31% respectivamente em IACSP94-2094 e de

55% e 50% em IACSP95-5000 (Figura 3D,F). Na IACSP95-5000 foi observada

redução média em k quando submetida à seca severa, com decréscimo de 95% (Figura

3B).

21

0

10

20

30

40

aC

aB

aA

aC

bB

bA

AN

(m

ol m

-2 s

-1)

REF

SM

SS

A

0

2

4

6

8

aB

aAaA

aB

bAaA

D

EU

A

(m

ol m

mol -1)

0

75

150

225

aB

aAaA

aB

bAaA

F

EU

Ai

(m

ol m

ol -1

)

0

5

10

15

aAaA

aA

aA

aB

bA

bA

B

k

(m

ol m

-2 s-1 P

a-1)

0,0

0,1

0,2

aC

aB

aA

aBbB

C

gS

(mol m

-2 s

-1)

0

2

4

6

Variedades

aC

aB

aA

aBbB

bA

IACSP94-

2094

IACSP95-

5000IACSP95-

5000

IACSP94-

2094

E

E

(mm

ol m

-2 s

-1)

Figura 3. Assimilação de CO2 (AN, em A), eficiência instantânea de carboxilação (k, em

B), condutância estomática (gS, em C), eficiência do uso da água (EUA, em D),

transpiração (E, em E) e eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, em F) das

variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 expostas aos

tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS) desde o

transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma representa o valor médio

(n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco dias de avaliações.

Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas comparam as

variedades (t-student, p<0,05).

Apenas o tratamento de seca severa causou aumento (p<0,05) de CI em

IACSP94-2094 (+35%) e IACSP95-5000 (+63%). No tratamento de seca moderada não

foram observadas diferenças neste parâmetro, que variaram em torno de 11,8±4,0 Pa em

IACSP94-2094 e 7,2±4,0 Pa em IACSP95-5000. As plantas referência da IACSP94-

2094 apresentaram CO2 de 0,009±0,002 µmol µmol-1

e os tratamentos de seca

22

causaram redução em CO2 de 33% em SM e 44% em SS. Já na variedade IACSP95-

5000 o padrão de resposta foi distinto, com redução significativa de CO2 (-81%)

apenas nas plantas sob seca severa (dados não apresentados).

O déficit hídrico não causou alteração em NPQ e as variedades IACSP94-2094 e

IACSP95-5000 apresentaram valores similares de 1,35±0,66 e 1,44±0,70,

respectivamente. Apenas IACSP95-5000 apresentou redução (p<0,05) em Fv/Fm quando

submetida a seca severa (Figura 4A). Foi detectado aumento em QEXC nas plantas

IACSP94-2094 submetidas aos tratamentos de restrição hídrica, sendo esse aumento

mais expressivo em IACSP95-5000 (Figura 4B). Foram detectadas reduções em

Fq’/Fm’, ETR e em Fq’/Fv’ causados pelos tratamentos de restrição hídrica.

Considerando as plantas IACSP94-2094, Fq’/Fm’ e ETR foram reduzidos em 32% nas

plantas submetidas à seca moderada e em 48% nas plantas sob seca severa. Também

foram observadas reduções médias de 20% e 35% em Fq’/Fv’ nas plantas SM e SS,

respectivamente. Já nas plantas IACSP95-5000 a reduções médias Fq’/Fm’ foram de

12% nas plantas sob seca moderada e de 67% em seca severa. A redução em Fq’/Fv’ foi

de 11% em SM e de 46% em SS (Figura 4C,D,E).

23

0,00

0,05

0,10

0,15

aC

aB

aA

aC

bB

bA

bAB

bA

C

Fq'/F

m'

REF

SM

SS

0

30

60

90

120

aC

bB

bA

aC

aBaA

D

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

aC

aB

aA

aB

E

Fq'/F

v'

0510

80

85

90

95

100

aA

bB

bC

aAaA

aB

ET

R

(m

ol m

-2 s-1)

B

QE

XC

(%)

0,00,10,2

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

bBaAaAaA

bB

Variedades

Variedades

IACSP95-

5000

IACSP95-

5000IACSP94-

2094

IACSP94-

2094

Fv/F

mA

aAB

Figura 4. Eficiência potencial do fotossistema II (Fv/Fm, em A), excesso relativo de

energia (QEXC, em B), eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em C),

taxa aparente de transporte de elétrons (ETR, em D) e coeficiente de extinção

fotoquímico (Fq’/Fv’, em E) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e

IACSP95-5000 expostas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca

severa (SS) desde o transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma

representa o valor médio (n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco

dias de avaliações. Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas

comparam as variedades (t-student, p<0,05).

3.2 Biometria

Apenas a ocorrência de seca severa promoveu redução significativa em MST

(p<0,05) nas duas variedades, com decréscimos de 77% em IACSP94-2094 e 60% em

IACSP95-5000. Foi detectada a manutenção da MST na variedade IACSP94-2094,

24

enquanto a IACSP95-5000 apresentou maior acúmulo de biomassa sob seca moderada

(Figura 5A). Nas duas variedades o acúmulo de MSPA foi menor (p<0,05) apenas nas

plantas que foram submetidas à seca severa (Figura 5B). Considerando a variedade

IACSP94-2094, a razão MS R/PA foi menor nas plantas submetidas à seca severa. Em

IACSP95-5000, houve manutenção da razão MS R/PA sob seca severa e aumento

(p<0,05) nas plantas submetidas à seca moderada (Figura 5C).

0

1

2

3

4

5 B

aB

aAaA

bB

bAbA

MS

PA

(g)

0

1

2

3

4

5 REF

SM

SS

A

bAbA

bB

aB

aA

aCMS

T

(g)

IACSP94-2094 IACSP95-5000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Variedades

C

aB

aA

aB

bB

bA

MS

R/P

A

aA

Figura 5. Matéria seca total (MST, em A), matéria seca da parte aérea (MSPA, em B) e

razão matéria seca das raízes e da parte aérea (MS R/PA, em C) das variedades de cana-

de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de

disponibilidade hídrica referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada

histograma representa a média (n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os

regimes hídricos e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05).

25

Foram detectadas reduções de 34% em AF (Figura 6A) e 23% em AFE (Figura

6B) de IACSP94-2094 expostas à seca moderada e redução de 92% em AF e 53% em

AFE quando submetidas à seca severa. Já nas plantas IACSP95-5000 não foram

observadas reduções, tanto em AF quanto em AFE, quando as plantas foram expostas à

SM, no entanto as plantas submetidas à SS apresentaram redução de 68% em AF

(Figura 6A) e de 21% em AFE (Figura 6B).

IACSP94-2094 IACSP95-50000

50

100

150

200

250A

AF

(cm

²)

REF

SM

SS

B

bA

bB

bC

aAaA

aB

IACSP94-2094 IACSP95-50000

40

80

120

160

aB

aAaA

bC

bB

aA

AF

E (c

m2 g

-1)

Variedades

Figura 6. Área foliar (AF, em A) e área foliar específica (AFE, em B) das variedades de

cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência

(REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada histograma representa a médias

(n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade

hídrica e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05).

3.2.1 Distribuição do sistema radicular no perfil do solo

A distribuição do sistema radicular no solo foi diferente entre as duas

variedades, enquanto a IACSP94-2094 apresentou sistema radicular menos

desenvolvido e mais superficial nos três regimes hídricos (Figura 7A,D,G), IACSP95-

5000 apresentou sistema radicular maior e mais aprofundado (Figura 7B,E,H). As

plantas da IACSP94-2094 foram afetadas negativamente apenas pelo tratamento de seca

severa, com redução em AR (Figura 7C). Já IACSP95-5000 apresentou aumento

(p<0,05) de AR em superfície e em 45 cm de profundidade quando submetida ao

estresse moderado. Houve redução de AR em IACSP95-5000 apenas sob seca severa,

assim como observado em IACSP94-2094 (Figura 7C). Os dois tratamentos de seca

promoveram redução em CR na IACSP94-2094 e apenas a seca severa afetou

26

negativamente IACSP95-5000 (Figura 7F). IACSP95-5000 quando exposta à seca

moderada apresentou aumento (p<0,05) em CR (Figura 7E). As plantas desta variedade

quando foram submetidas à seca moderada apresentaram aumento (p<0,05) na produção

de raízes na camada superficial do solo (Figura 7H). IACSP94-2094 foi afetada

negativamente pelo déficit hídrico apenas em condição de seca severa, com redução de

84% em MSR (Figura 7I). Já IACSP95-5000 apresentou aumento (p<0,05) de MSR

quando submetida ao estresse moderado e redução de 80% sob seca severa (Figura 7I).

As plantas da variedade IACSP95-5000 apresentaram maior (p<0,05) MSR se

comparadas à IACSP94-2094 em condição de boa disponibilidade hídrica e seca

moderada (Figura 7I).

Figura 7. Área (AR, em A,B), comprimento (CR, em D,E) e matéria seca das raízes

(MSR, em G,H) no perfil do solo (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm) e área radicular total

(ART, em C), comprimento radicular total (CRT, em F) e matéria seca total das raízes

(MSTR, em I) nas variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (A,D,G) e IACSP95-

5000 (B,E,H) submetidas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM, o) e

0,0 0,4 0,8 1,2

80

60

40

20

0

0,0 0,4 0,8 1,2 IACSP94-2094 IACSP95-50000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

aC

aA

aB

bB

bA

aA

C

AR

T (m

²)

REF

SM

SS

AR (m²)

SMA REF.

IACSP95-5000

SS

IACSP94-2094

*

*

B

-80

-60

-40

-20

0

0 2 4 6 80 2 4 6 8 IACSP94-2094 IACSP95-50000

4

8

12

16

Pro

fun

did

ade

do s

olo

(cm

)

aC

aA

aB

bC

bB

aA

F

CR

T (m

)

D

*

E

*

CR (m)

0 200 400 600 8000 200 400 600 800

-80

-60

-40

-20

0H

*

Variedades

MS

TR

(mg

)

MSR (mg)

G

IACSP94-2094 IACSP95-50000

500

1000

1500

2000

aC

aA

aB

aB

bA

I

bA

27

seca severa (SS, Δ). Cada símbolo ou barra indica o valor médio (n=3)±desvio padrão

comparadas pelo teste t-student (p<0,05), seguidas por letras iguais não diferem entre si.

Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e letras

minúsculas os tratamentos de variedades.

A seca, em nenhum dos dois tratamentos, afetou DR e ARE (p>0,05) das

variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 (Tabela 1). Foi

observado redução em CRE na IACSP94-2094 sob condição de seca severa, porém o

CRE aumentou quando esta planta foi exposta à condição de seca moderada. A seca não

afetou CRE em IACSP95-5000 (Tabela 1). Enquanto na variedade IACSP94-2094 o

VR foi reduzido apenas em seca severa, em IACSP95-5000 ele foi reduzido sob seca

moderada e severa (Tabela 1).

Tabela 1. Diâmetro médio das raízes (DR), volume médio das raízes (VR), crescimento

radicular específico(CRE) e área radicular específica (ARE) das variedades de cana-de-

açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência (REF),

seca moderada (SM) e seca severa (SS).

Var. Trat. DR (mm)

VR (mm³)

CRE (m g

-1)

ARE (m

2 g

-1)

IACSP94-2094

REF 0,39±0,03ns

15,2±5,8 bA

140,6±6,0 aB

0,16±0,07ns

SM 0,39±0,03 18,2±3,1 aA

282,5±48,9 aA

0,20±0,05

SS 0,47±0,08 3,4±2,4 aB

92,7±31,8 aC

0,15±0,07

IACSP95-5000

REF 0,39±0,02 45,2±3,4 aA

91,3±20,5 bA

0,15±0,03

SM 0,43±0,05 26,0±8,9 aB

89,5±8,9 bA

0,14±0,01

SS 0,49±0,15 10,4±1,2 aC

117,9±9,5 aA

0,20±0,03

Valor médio (n=3) ± desvio padrão. Médias comparadas pelo Teste t-student seguidas por letras iguais

não diferem entre si (p<0,05). Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e

minúsculas comparam os tratamentos de variedades. ns

indica que não houve diferença significativa.

3.3 Índice de Plasticidade de Distâncias Relativas (RDPI)

O índice de plasticidade e distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas

foi maior (p<0,05) em IACSP95-5000, ao passo que o RDPI das variáveis morfológicas

foi maior em IACSP94-2094. O RDPI total que reúne variáveis fisiológicas e

morfológicas foi maior em IACSP95-5000 (Figura 8).

28

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 *

IACSP95-5000

RD

PI

IACSP94-2094

A *B

*C

TotalMorfológicaFisiológica

Figura 8. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das características

fisiológicas (A; n=378), morfológicas (B; n=351) e total (C; n=729) em variedades de

cana-de-açúcar submetidas à deficiência hídrica. * indica diferença significativa entre as

variedades (p<0,05, Mann-Whitney).

Considerando as variáveis fisiológicas, IACSP95-5000 apresentou maior RDPI

das trocas gasosas (AN, gS, CI, E, φCO2, EUA, EUAi, k) e fotoquímica (Fq’/Fm’, Fq’/Fv’,

ETR, QEXC) que IACSP94-2094 (Figura 9A). Diferenças significativas entre as

variedades quando se considera o RDPI das variáveis morfológicas foram notadas

apenas em AF, AFE e CRE, que foi maior (p<0,05) em IACSP94-2094 (Figura 9B).

29

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0ns

ns *

***

**

*

**

**

*

**

Fotoquímica

Q EXC

F q'/F

v'

RD

PIf

AR V

RCR

MSR

DR

MSPA A

FAFE

MS R

/PA

H MST

CRE

ARE

A N g S C I E

CO 2

EUA E

UA i

k

F q'/F

m'

ETR

F v/F m

NPQ

A

Trocas Gasosas

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

nsns

nsB

ns

*

*ns

*ns

nsnsnsns

RD

PIm


Figura 9. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas

(RDPIf, em A; n=27), agrupadas em trocas gasosas [assimilação de CO2 (AN),

condutância estomática (gS), concentração intercelular de CO2 (CI), transpiração (E),

eficiência da fixação de CO2 (CO2), eficiência do uso da água (EUA), eficiência

intrínseca do uso da água (EUAi) e eficiência instantânea de carboxilação (k)] e

fotoquímica [eficiência quântica aparente do fotossistema II (Fq’/Fm’), coeficiente de

extinção fotoquímico (Fq’/Fv’), taxa de transporte de elétrons (ETR), eficiência quântica

potencial do fotossistema II (Fv/Fm), coeficiente de extinção não-fotoquímico (NPQ) e

excesso relativo de energia (QEXC)] e morfológicas (RDPIm, em B; n=27) [área (AR),

volume (VR), comprimento (CR), matéria seca (MSR) e diâmetro (DR) da raiz, matéria

seca da parte aérea (MSPA), área foliar (AF), área foliar específica (AFE), razão

matéria seca raiz/parte aérea (MS R/PA), altura (H), matéria seca total (MST),

comprimento radicular específico (CRE) e área radicular específica(ARE)]. * indica

diferença significativa entre as variedades (p<0,05, Mann-Whitney).

30

3.4 Análise de Componentes Principais

A análise de componentes principais (ACP) foi realizada considerando-se as 27

variáveis utilizadas na estimativa de RDPI e revelou um padrão interessante da resposta

das variedades de cana-de-açúcar frente ao déficit hídrico. A ACP realizada com os

parâmetros fisiológicos revelou forte proximidade entre as plantas REF e SM da

IACSP95-5000, porém com uma grande distância das plantas SS. Já na IACSP94-2094

foi observado maior aproximação entre as plantas submetidas aos três tratamentos

(Figura 10A). O CP1 explicou 78,9% da variância total e os cinco parâmetros com os

maiores loadings foram AN (l = 0,3085), seguido por CO2 (l = 0,3081), ETR (l =

0,3044), Fq’/Fm’ (l = 0,3043) e k (l = 0,3025). A ACP realizada com os parâmetros

morfológicos sugere um forte agrupamento entre as plantas dos tratamentos referência e

seca moderada (Figura 10B). O CP1 representou 58,3% da variância total dos dados e

os cinco principais parâmetros foram MST (l = 0,3553), VR (l = 0,3545), MSR (l =

0,3537), AR (l = 0,3526) e CR (l = 0,3524). Considerando os parâmetros morfológicos e

fisiológicos foi possível identificar a proximidade entre as plantas dos tratamentos

referência e de seca moderada da IACSP95-5000. Por outro lado, as plantas de ambas as

variedades submetidas ao tratamento de seca severa se agruparam do lado esquerdo do

gráfico. Também foi possível observar grande distância entre as plantas submetidas à

seca severa e à referência na IACSP95-5000, sugerindo grande sensibilidade desta

variedade à restrição hídrica severa (Figura 10C). O CP1 representou 61,1% da

variância total do estudo, sendo AN a principal variável para a separação das plantas

(l=0,2400), seguido por k (l=0,2396), CO2 (l=0,2395), AF (l=0,2337) e ETR

(l=0,2318).

31

A

CP

2 n

s

(11

,1%

)

CP1*(78,9%)

B

CP

2 n

s

(15

,2%

)

CP1*(58,3%)

C

CP1*(61,1%)

CP

2 n

s

(10

,5%

)

IACSP94-2094 - Ref. SM SS

IACSP95-5000 - Ref. SM SS

Figura 10. Análise de componentes principais (CP) considerando os parâmetros

fisiológicos (em A), morfológicos (em B) e total (em C) utilizados no cálculo de RDPI

(Figura 8) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (□) e IACSP95-5000 (Δ).

Os símbolos abertos representam o tratamento referência (REF), os símbolos azuis

parcialmente fechados representam o tratamento de seca moderada (SM) e os símbolos

vermelhos fechados representam os tratamento de seca severa (SS). A percentagem de

explicação de cada componente principal é mostrada. ns

indica não significância do

componente principal.

32

4 DISCUSSÃO

Os resultados deste trabalho sugerem que as variedades de cana-de-açúcar

estudadas apresentam resistência diferencial ao déficit hídrico e que o nível de

resistência varia de acordo com a intensidade do estresse. A resistência à seca está

relacionada com a capacidade da planta, quando exposta ao agente estressor, em manter

ou minimizar a restrição do crescimento.

Nas duas variedades, o das plantas expostas à seca severa foi similar ao das

plantas referência. Esta situação pode ter ocorrido devido ao baixo consumo de água

dado pelo maior fechamento estomático e menor área foliar (Figuras 3C e 6A). As

plantas IACSP95-5000 apresentaram maior redução em EUA (Figura 3D) e EUAi

(Figura 4F), indicando menor capacidade de aclimatação à baixa disponibilidade de

água. Associado a essas respostas fisiológicas foi detectado menor perda na AF da

IACSP95-5000 (Figura 6A). A redução na área foliar é considerada uma resposta de

aclimatação à seca, promovendo redução da área transpirante e da interceptação de

radiação, minimizando a pressão energética nos fotossistemas (CHAVES et al., 2009;

GHANOOUM, 2009).

Na condição de déficit hídrico severo, as duas variedades apresentaram reduções

significativas no metabolismo fotossintético. No entanto, a variedade IACSP95-5000

mostrou-se mais sensível devido a maior redução de AN em comparação às plantas da

referência (Figura 3A). Embora os estômatos estivessem parcialmente fechados (Figura

3C) a fotossíntese não foi limitada por aspectos difusivos, pois foi detectado aumento de

CI nas plantas submetidas à seca severa. Em condição de seca severa também é

esperado que ocorra redução na condutância do mesofilo (gM), prejudicando o processo

fotossintético (GHANOOUM, 2009). MACHADO et al. (2013) identificaram que

aproximadamente 90% da limitação fotossintética em plantas de cana-de-açúcar

submetidas à seca foi causada por aspectos metabólicos, dada pela redução nas

velocidades de carboxilação da PEPCase e Rubisco. A redução na atividade destas

enzimas provavelmente foi maior na IACSP95-5000, dada pela maior redução em k

(Figura 3B) e de CO2. As limitações não-estomáticas são as principais causas da

redução de fotossíntese em plantas C4 submetidas à estresse hídrico e ocorrem

principalmente pela redução na síntese e acúmulo de ATP nos cloroplastos (LAWLOR,

2002).

33

Associado à limitação bioquímica, a fotossíntese também foi limitada pela

atividade fotoquímica (Figura 4). A fase fotoquímica da fotossíntese também foi mais

sensível à seca na IACSP95-5000, dado pelas maiores reduções de Fq’/Fm’, ETR e

Fq’/Fv’ (Figura 4). Em ambas as variedades foi detectado aumento em QEXC em

decorrência da seca (Figura 4B), que pode ser explicado pela menor Fq’/Fm’ (Figura 4C)

e está associada à redução da energia direcionada para a etapa fotoquímica, indicada

pela redução em Fq’/Fv’ (Figura 4E). Apesar de ter havido redução de Fv/Fm, estes

foram sempre maiores que 0,750 (Figura 4A), sugerindo que os fotossistemas II não

sofreram danos fotoquímicos permanentes nas duas variedades (BOLHÁR-

NORDENKAMPF & LECHNER, 1990) e confirmando a alta resistência do aparato

fotoquímico à seca (YORDANOV et al., 2000).

Porém quando as plantas foram submetidas à seca moderada, a maior

sensibilidade foi observada na IACSP94-2094. Apesar de ambas as variedades terem

apresentado redução significativa na fotossíntese (Figuras 3 e 4), a variedade IACSP95-

5000 apresentou menor redução em AN quando comparada a IACSP94-2094, 17% vs.

42%, respectivamente (Figura 3A). Nas duas variedades foi observada manutenção de

CI, EUA e EUAi nas plantas SM (Figura 3D,F). Considerando as características

morfológicas das plantas submetidas à seca moderada, a IACSP95-5000 apresentou o

melhor desempenho, acumulando mais biomassa do que na condição referência (Figura

5A), especialmente nas raízes (Figura 7I).

A grande maioria dos estudos sobre efeitos da seca em cana-de-açúcar abordam

apenas as respostas na parte aérea (BOARETTO et al., 2014; SALES et al., 2013;

BASNAYAKE et al., 2012; INMAN-BAMBER et al., 2005; RAMESH, 2000), mesmo

sabendo-se que o sistema radicular tem grande importância na percepção e no

desencadeamento das respostas frente ao secamento do solo (MASLE, 2002). No caso

deste trabalho, o maior acúmulo de biomassa em IACSP95-5000 submetida à seca

moderada ocorreu em função do maior crescimento das raízes (Figura 7I). Com isso,

houve aumento de duas vezes na razão de MS R/PA (Figura 5C), indicando uma

resposta de aclimatação à seca. Após o transplantio das mudas para os rizotrons não foi

observado aumento em H (dados não mostrados) na variedade IACSP95-5000

sugerindo que esta variedade apresenta crescimento inicial lento da parte aérea, pois

investe os produtos da fotossíntese no aprofundamento das raízes (Figura 7B,E,H),

explorando maior volume de solo, confirmado pelo maior VR (Tabela 1). Assim, a

capacidade de utilização dos recursos do solo na fase inicial de crescimento deve ser

34

maior em comparação a IACSP94-2094. A maximização do uso da umidade do solo é

um componente crucial na resistência à seca (BLUM, 2005). INMAN-BAMBER et al.

(2012) preveem aumentos de até 21% na produção de biomassa em plantas de cana-de-

açúcar com sistema radicular mais aprofundado em situações de restrição hídrica.

Assim, as plantas IACSP95-5000 apresentam vantagem sobre a IACSP94-2094 em

ambiente com déficit hídrico brando a moderado, pois o aprofundamento do sistema

radicular é uma estratégia importante para evitar a desidratação das plantas em

ambientes com limitação hídrica (BLUM, 2011; HUND et al., 2009).

O crescimento das raízes é dependente da respiração dos fotoassimilados que são

transportados para as raízes. A respiração pode ser separada em respiração de

crescimento e de manutenção (VAN OIJEN et al., 2010), sendo os esqueletos

carbônicos produzidos incorporados em biomassa. O maior crescimento da IACSP95-

5000 em relação a IACSP94-2094 pode ser explicado pela maior fotossíntese quando

submetidas à condição referência e de seca moderada (Figura 3A). Já o maior

crescimento das raízes da IACSP95-5000 submetida à seca moderada não foi explicado

pela AN, pois houve redução neste parâmetro. Tampouco pode ser explicado por

variações na fotossíntese global do dossel, visto que houve manutenção de AF (Figura

6A). Portanto, podemos considerar a hipótese de que as plantas IACSP95-5000

apresentam maior capacidade de translocação de fotoassimilados para as raízes do que a

IACSP94-2094. De fato, a fração de carboidratos translocados e metabolizados nas

raízes varia entre as espécies, estádio fenológico e condição ambiental (LAMBERS et

al., 2002). Associado à translocação de açúcares, a respiração de crescimento ou a

eficiência da respiração em condições de estresses pode ser maior na IACSP95-5000

que na IACSP94-2094. MACHADO & PEREIRA (1990) determinaram que a eficiência

de conversão de carboidratos nas raízes (YR) é alterada por estresses abióticos. Plantas

de arroz (Oryza sativa L.) e milho (Zea mais L.) apresentaram aumento em YR quando

foram expostas à estresse por alumínio. Logo, é esperado variação entre os genótipos de

cana-de-açúcar quando se considera o balanço de carbono sob condições de seca. Nesse

sentido, há a necessidade de pesquisas futuras para revelar a associação entre respiração

e o crescimento de raízes expostas à seca.

A plasticidade fenotípica (PF) é uma ferramenta usada para a análise da

aclimatação das plantas às alterações no ambiente (NICOTRA et al., 2010). Portanto,

para entender a capacidade da planta de crescer em ambiente adverso, é necessário

compreender a habilidade dela para resistir à limitação dos recursos (COUSO &

35

FERNÁNDEZ, 2012). A variedade IACSP95-5000 apresentou maior RDPIf (Figura

9A), pois as variações em todos os parâmetros, exceto Fv/Fm e NPQ, foram maiores que

na IACSP94-2094. A maior plasticidade fisiológica traduziu-se em vantagem para o

acúmulo de biomassa em IACSP95-5000. Essa estratégia é interessante, pois as

respostas fisiológicas podem ocorrer em curto prazo, são reversíveis e os custos

energéticos envolvidos com as respostas plásticas morfológicas são maiores (MEIER &

LEUSCHNER, 2008). Considerando a RDPIm, não foram detectadas diferenças

significativas (p>0,05) na maioria dos parâmetros analisados, exceto em AF, AFE e

CRE (Figura 9B) que foram maiores em IACSP94-2094. No entanto, nem sempre alta

plasticidade é sinônimo de vantagem adaptativa (COUSO & FERNÁNDEZ, 2012), p.e.,

a grande redução no acúmulo de matéria seca total das raízes observada na IACSP94-

2094 (Figura 7I) em função da seca não pode ser considerada uma vantagem. As plantas

IACSP94-2094 apresentaram maior plasticidade em AF e AFE devido à grande redução

(Figura 6A,B) com o aumento da intensidade do estresse. A redução em AF está

envolvida com economia de água devido à redução da área transpirante, conforme já

abordado. A redução na AFE pode estar relacionada com outra estratégia de economia

de água e preservação do aparato fotossintético, pois ao se reduzir a área foliar e manter

a massa do tecido ocorre concentração de proteínas e redução da área superficial

transpirante. O maior aumento em CRE sugere que a variedade IACSP94-2094, quando

submetida ao estresse hídrico, investe em ramificação do sistema radicular, e não no

aumento da produção em biomassa das raízes (Figura 7I). Aparentemente, tal

característica (maior RDPIm) é menos efetiva do que as fisiológicas.

Ambas as variedades estudadas apresentaram características de resistência à seca

quando foram submetidas à condição de estresse hídrico moderado, pois mantiveram a

produção de biomassa (Figura 5A). Porém, os mecanismos de resistência envolvidos

foram diferentes: enquanto IACSP94-2094 tem o processo fotossintético menos sensível

à seca, sendo esse um mecanismo de tolerância a IACSP95-5000 apresenta o

mecanismo de “evitação” da seca, dado pelo aumento do crescimento radicular. Com

isso, a IACSP95-5000 apresentou maior eficiência do uso da água (Figura 3D,F) e

maior acúmulo de biomassa (Figura 5A) sob condição de seca moderada.

Para determinarmos as principais características da cana-de-açúcar envolvidas

com a resistência à seca foi realizada a análise de componentes principais. Essa análise

ajuda a classificar a variedade IACSP95-5000 como resistente à seca, porque há

agrupamento das plantas submetidas aos tratamentos referência e seca moderada e um

36

grupo distante das plantas expostas à seca severa (Figura 10C). Este grande

distanciamento dos grupos ocorreu quando a condição de seca foi severa, com isso deve

ter havido quebra da homeostase das plantas da variedade IACSP95-5000, que

causaram danos expressivos no crescimento. No entanto, a IACSP94-2094 foi

classificada como tolerante à seca, pois esta variedade aparentemente reduz o

metabolismo, economizando energia para um possível período de reidratação. Porém

esta estratégia penaliza o crescimento das plantas durante o período de seca. Esta

hipótese pode ser confirmada pela analise de ACP, em que todos os indivíduos da

IACSP94-2094 estão separados, porém o distanciamento entre eles é menor do que da

IACSP95-5000 (Figura 10C). Com esta análise foi possível identificar que as cinco

características mais importantes na separação dos grupos de plantas foram as

características relacionadas às fases bioquímica e fotoquímica da fotossíntese, além da

área foliar.

RIBEIRO et al. (2013) identificaram que a variedade IACSP94-2094 apresenta

tolerância à seca devido à menor sensibilidade da fotossíntese durante o período de

restrição hídrica. No entanto ainda não se sabe quais os mecanismos responsáveis pela

proteção do processo fotossintético em condição de restrição hídrica. Uma hipótese que

pode explicar a manutenção da fotossíntese é a presença de proteínas específicas que

atuam protegendo as estruturas celulares da desidratação (WAHID & CLOSE, 2007).

De acordo com o modelo da compensação (trade-off), é esperado que uma planta

produtiva apresente comprometimento da produção quando exposta à seca. No entanto

nem sempre o trade-off entre produção e resistência à seca ocorre. Neste estudo, a

variedade IACSP95-5000, considerada altamente produtiva (LANDELL et al., 2007), se

mostrou resistente à seca moderada. Outros estudos também não confirmaram o trade-

off entre produção e resistência à seca em variedades de gramíneas C4 submetidas à

restrição hídrica (COUSO et al., 2010; FERNÁNDEZ & REYNOLDS, 2000). Esses

resultados demonstram que é possível aliar a resistência à seca a alta produtividade em

um único genótipo, sendo uma importante constatação para a sustentabilidade da

agricultura.

37

5 CONCLUSÃO

Sob baixa disponibilidade hídrica, as duas variedades apresentam mecanismos

de resistência, com IACSP95-5000 evitando o déficit hídrico com o maior crescimento

das raízes sob estresse moderado. Em condição de seca severa, IACSP94-2094

apresenta tolerância, com menor sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo de

biomassa sob déficit hídrico em IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade

fenotípica, com o componente fisiológico prevalecendo em relação ao morfológico. A

regulação das trocas gasosas determinou esta maior plasticidade fisiológica.

38

CAPÍTULO II

INTEGRANDO O TRANSPORTE DE ÁGUA, FOTOSSÍNTESE E METABOLISMO

ANTIOXIDANTE PARA COMPREENDER A SENSIBILIDADE DIFERENCIAL DE

GENÓTIPOS DE CANA-DE-AÇÚCAR AO DÉFICIT HÍDRICO

39

Integrando o transporte de água, fotossíntese e metabolismo antioxidante para

compreender a sensibilidade diferencial de genótipos de cana-de-açúcar ao déficit

hídrico

RESUMO

A hipótese do trabalho é que a resistência à seca em cana-de-açúcar está associada à

menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em condição de restrição

hídrica. Esta habilidade estaria relacionada a um efetivo sistema antioxidante nas raízes,

que inibiria a produção de H2O2 em condição de déficit hídrico e manteria a atividade

das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições limitantes. Genótipos de

cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 foram cultivados em hidroponia e

submetidos ao déficit hídrico pela adição de polietilenoglicol (PEG-8000) à solução

nutritiva. Trocas gasosas e a atividade fotoquímica foram monitoradas a cada dois dias e

as enzimas do metabolismo antioxidante em folhas e raízes e a expressão relativa de

transcritos das isoformas ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 de aquaporinas das

raízes analisadas em três momentos: 48 h após a adição de PEG-8000 (T48h); após nove

dias de restrição hídrica, no máximo estresse (TME) e 48 h após a reidratação (TR). Em

T48h também foram avaliadas a condutância hidráulica das raízes (Lpr) e a contribuição

das aquaporinas no fluxo de água (AQP%). O genótipo resistente IACSP94-2094

apresenta menor redução no crescimento devido a menor sensibilidade da fotossíntese

no período inicial de seca, dada pela menor sensibilidade de Lpr à restrição hídrica e

manutenção de AQP% (~80%). O padrão de expressão das aquaporinas não foi

associado à variação de Lpr. Não foi possível estabelecer uma relação entre o teor de

H2O2 no sistema radicular e a atividade das aquaporinas nas raízes. As respostas do

sistema antioxidante na raiz variaram entre os genótipos, mas os teores de H2O2

permaneceram inalterados em condição de déficit hídrico. Em geral, as enzimas

superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase foram mais responsivas ao déficit

hídrico em IACSP94-2094. São discutidos os mecanismos fisiológicos relacionados

com a sensibilidade ou resistência diferencial à seca entre os genótipos.

Palavras-chave: Saccharum, spp., aquaporina, condutância hidráulica, seca, sistema

radicular

40

1 INTRODUÇÃO

A limitação na disponibilidade hídrica representa o principal fator abiótico que

causa redução da produtividade na cultura da cana-de-açúcar (LISSON et al., 2005),

pois causa importantes prejuízos no metabolismo da planta (RIBEIRO et al., 2013;

SALES et al., 2013). Nas situações em que a demanda de água para a manutenção e

crescimento da planta não é suprida pela absorção de água pelas raízes ocorre o déficit

hídrico (VADEZ et al., 2013). A manutenção do status hídrico da planta é dependente

da capacidade de absorção de água pelo sistema radicular associado à eficiência de

transporte da água para a parte aérea (SALIENDRA & MEINZER, 1992). Devido à

característica séssil, as plantas desenvolveram ajustes complexos para a regulação do

balanço hídrico e a condutância hidráulica das raízes (Lpr) tem importante papel neste

processo (NORDEN et al., 2012).

Sabe-se que a Lpr não é constante ao longo do dia e varia em função do balanço

entre a demanda hídrica da atmosfera e o suprimento de água via solo (HACHEZ et al.,

2012; STEUDLE, 2000), sendo regulada pelas aquaporinas (AQP) de membrana

plasmática (JAVOT & MAUREL, 2002). Sob estresse abiótico, já foram identificadas

reduções (AROCA et al., 2005; SILVA, 2014; VANDELEUR et al., 2009) ou aumentos

(LIAN et al., 2004) no fluxo de água em diferentes espécies de plantas, com o aumento

em Lpr sendo relacionado com o aumento na expressão dos genes de AQP nas raízes

(LIAN et al., 2004). As proteínas intrínsecas da membrana plasmática (PIPs) são as

principais AQPs envolvidas no transporte de água célula-célula e compõe até 20% da

fração proteica das membranas plasmáticas. São divididas em PIP1 e PIP2, mas as PIP2

apresentam maior capacidade de transporte de água (CHAUMONT et al., 2000;

JOHANSSON et al., 1996). Sabe-se que há maior expressão de genes de AQPs nas

raízes do que nas folhas (HEINEN et al., 2009) e em raízes de cana-de-açúcar foram

identificadas por Northen Blot Virtual sete isoformas da ScPIP2 (ScPIP2;1, ScPIP2;2,

ScPIP2;3, ScPIP2;4, ScPIP2;5, ScPIP2;6, ScPIP2;7) (FRIGEL, 2011). Dentre diversos

fatores internos que podem afetar a atividade de AQP, o peróxido de hidrogênio foi

identificado como eficaz inibidor de AQPs (BENEBDELAH et al., 2009;

KTITOROVA et al. 2002).

Com o início da restrição hídrica, o sistema radicular é responsável por perceber

o secamento do solo e desencadear sinais químicos para que a planta se ajuste à situação

de menor disponibilidade de água (TARDIEU, 1996; WILKINSON & DAVIES, 2002).

41

No caso de seca prolongada e/ou severa, o sistema radicular pode sofrer danos

metabólicos que causam prejuízos na eficiência da cadeia de transporte de elétrons,

especialmente nas mitocôndrias. Assim, o desbalanço no status redox das células

promove o acúmulo das espécies reativas de oxigênio (ERO), como superóxido (O2•-),

radicais hidroxila (OH•) e H2O2, sendo iniciado o estresse oxidativo (FOYER &

NOCTOR, 2005). Para prevenir ou amenizar os danos causados pelo acúmulo de EROs

nos tecidos, as plantas evoluíram com um sistema antioxidante composto por processos

não-enzimáticos, mediados por determinadas moléculas (ascorbato, glutationa,

flavonoides, carotenóides e tocoferóis) e enzimáticos, que envolvem principalmente as

enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX)

(FOYER & NOCTOR et al., 2005). Considerando a atividade das enzimas do

metabolismo antioxidante nas folhas de cana-de-açúcar expostas à limitação de água, há

relatos de maior atividade e maior quantidade de isoformas de SOD e maior atividade

de APX em variedade resistente à seca (BOARETTO et al., 2014; SALES et al., 2013).

Em relação ao desempenho do sistema antioxidante no sistema radicular, órgão que

inicialmente é afetado pela baixa disponibilidade hídrica, há poucos estudos que

revelem a importância do sistema enzimático em plantas de cana-de-açúcar submetidas

à restrição hídrica (SILVA, 2014).

Sabe-se que há ampla variação genotípica em relação às respostas das plantas de

cana-de-açúcar ao déficit hídrico e que a manutenção da capacidade de absorção de

água sob diferentes condições ambientais está relacionada com a resistência a estresses

(BENABDELAH et al., 2009). Embora o estudo dos mecanismos envolvidos com a

proteção à seca seja fundamental para aumentar o conhecimento sobre a resistência à

estresses, pouco se conhece quando a interação entre os metabolismos do sistema

radicular e das folhas é considerado.

Neste contexto, a hipótese do trabalho é que a resistência à seca em cana-de-

açúcar está associada à menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em

condição de restrição hídrica. Esta habilidade estaria associada a um efetivo sistema

antioxidante nas raízes, que inibe o acúmulo de H2O2 em condição de déficit hídrico e

mantém a atividade das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições

limitantes.

42

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal e condições experimentais

Foram utilizados uma variedade e um clone de cana-de-açúcar provenientes do

Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico (IAC). A variedade

IACSP94-2094 foi escolhida como padrão tolerante à seca (MACHADO et al., 2009;

RIBEIRO et al., 2013) e o clone IACSP97-7065 foi selecionado por ser considerado

sensível à seca (SALES et al., 2013). Os colmos maduros utilizados para retirada dos

minitoletes com as gemas íntegras para formação das mudas da variedade IACSP94-

2094 foram coletados no Centro Experimental Central, Instituto Agronômico,

Campinas/SP. Os colmos do genótipo IACSP97-7065 foram coletados na Usina Jalles

Machado, Goianésia/GO e trazidos inteiros para Campinas, onde foram seccionados em

minitoletes de três a quatro centímetros contendo uma gema.

Mudas pré-brotadas em substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz RS,

Brasil) com 15 dias foram passadas para caixas plásticas com 12 L de solução nutritiva.

Em cada caixa foram colocadas três plantas de cada genótipo, presas com espuma pelo

tolete em uma placa de isopor perfurada, de modo que apenas o sistema radicular

ficasse mergulhado na solução nutritiva. O experimento foi conduzido em casa de

vegetação com condições ambientais semi-controladas. Durante o período experimental

a temperatura média do ar foi de 24,1±4,2 °C e a radiação fotossinteticamente ativa

máxima aproximadamente 1100 µmol m-2

s-1

.

A solução nutritiva (SARRUGE, 1975) era composta por (mmol L-1

para

macronutrientes e mol L-1

para os micronutrientes: 15 de N (7% como NH4+); 4,8 de

K; 5,0 de Ca; 2,0 de Mg; 1,0 de P; 1,2 de S; 28,0 de B; 54,0 de Fe; 5,5 de Mn; 2,1 de

Zn; 1,1 de Cu; e 0,01 de Mo. Na primeira semana após o transplantio, as plantas foram

mantidas em solução com ¼ da força iônica. Na semana seguinte, mantidas em solução

nutritiva com ½ força e após a terceira semana foram cultivadas em solução com 100%

da força iônica. A cada dois dias o volume da solução nutritiva era reposto com água

destilada e a cada cinco dias a solução era totalmente substituída. A aeração do sistema

hidropônico foi realizada com compressor de ar. O pH da solução foi avaliado com

pHmetro Tec-3MPp (Tecnopon, Piracicaba SP, Brasil), mantido em 5,5±0,3. A

condutividade elétrica, avaliada com condutivímetro Tec-4MPp (Tecnopon, Piracicaba

43

SP, Brasil) foi mantido em 1,83±0,11 mS cm-1

. Já o potencial osmótico foi -0,11 MPa,

sendo medido pelo método higrométrico, com microvoltímetro HR-33T (Wescor Inc.,

Logan UT, EUA) e câmara de medida C-52 (Wescor Inc., Logan UT, EUA).

Para simular efeito de estresse hídrico por seca foi utilizado o osmólito

polietilenoglicol 8000 (PEG-8000), que induz a redução da disponibilidade de água para

as raízes via redução do potencial osmótico da solução nutritiva. Trinta e seis dias após

o transplantio das mudas para o sistema hidropônico foi realizada a primeira adição de

PEG-8000 Carbowax Sentry (Dow Chemical Comp, Midland MI, EUA) à solução

nutritiva. A adição de PEG-8000 foi realizada em dois dias para evitar choque osmótico

nas raízes. No primeiro dia o potencial osmótico da solução nutritiva foi reduzido para

-0,29 MPa, e no dia seguinte reduzido para -0,55 MPa. O volume das caixas foi

completado com a mesma solução nutritiva com PEG-8000 a cada dois dias. Após nove

dias de tratamento com PEG-8000, foi realizada a substituição da solução nutritiva com

potencial osmótico de -0,55 MPa por solução com potencial osmótico de -0,11 MPa,

simulando a reidratação das plantas.

2.2 Avaliação da fotossíntese

Foi realizado o acompanhamento das trocas gasosas e atividade fotoquímica a

cada dois dias a partir do 33° dia após o transplantio. As medidas foram realizadas entre

10:00 e 12:00 horas, com radiação fotossinteticamente ativa (Q) de 2000 mol m-2

s-1

e

pressão parcial de CO2 do ambiente (Ca) de 39,6±0,7 Pa. Em relação às trocas gasosas,

foram consideradas a assimilação de CO2 (AN), a transpiração (E), a condutância

estomática (gS), a eficiência do uso da água (EUA, AN/E), a eficiência intrínseca do uso

da água (EUAi, AN/gS), a concentração intercelular de CO2 (CI) e a eficiência

instantânea de carboxilação (k, AN/CI). A temperatura foliar e o déficit de pressão de

vapor folha-ar foram monitorados durante as medidas. A fluorescência da clorofila a foi

medida com um fluorômetro modulado 6400-40 LCF (Licor Inc., Lincoln NE, EUA)

acoplado ao Li-6400, concomitantemente com as medidas de trocas gasosas. Antes e

após um pulso de saturação (710 nm, Q ~ 8.000 mol m-2

s-1

, 0,8 s) e após a

excitação do fotossistema I por luz vermelha-distante (=735 nm, Q ~ 5 mol m-2

s-1

,

3,0 s), os seguintes parâmetros foram monitorados: fluorescência em estado de

equilíbrio (Fs) e máxima (Fm’) captadas em tecidos adaptados a luz (Q = 2000 mol m-2

44

s-1

) e a fluorescência mínima (Fo’) após a excitação do fotossistema I (VAN KOOTEN

& SNEL, 1990). A partir destes parâmetros, foram calculadas a eficiência quântica

efetiva do fotossistema II, [Fq’/Fm’=(Fm’-Fs)/Fm’], o transporte aparente de elétrons

(ETR=Fq’/Fm’*f*Q*αfolha), onde f é a fração da energia absorvida usada pelo

fotossistema II, assumido como 0,4 para plantas C4 (EDWARDS & BAKER, 1993) e

αfolha é a absorbância da folha (0,85). Foi calculado o número de elétrons por CO2

assimilado (ETR/AN) e a eficiência da fixação de CO2 (CO2) foi calculada por

CO2=(AN+Rd)/(Q*f), sendo Rd a respiração no escuro. O coeficiente de extinção

fotoquímica (Fq’/Fv’) foi calculado por Fq’/Fv’=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’). Ao final do

experimento, foram avaliadas também a fluorescência máxima (Fm) e a fluorescência

mínima (Fo) em tecidos adaptados ao escuro, sendo calculados o coeficiente de extinção

não-fotoquímica [NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’] e o excesso relativo de energia [QEXC=(Fv/Fm–

Fq’/Fm’)/Fv/Fm] (BILGER et al., 1995; MAXWELL & JOHNSON, 2000; MURCHIE &

LAWSON, 2013).

Com um clorofilômetro (CFL1030, Falker, Porto Alegre RS, Brasil), foram

medidos os teores relativos de clorofila total. As avaliações foram realizadas no dia de

máximo estresse.

2.3 Medidas do potencial da água nas folhas

Medidas do potencial da água nas folhas () foram realizadas no pré-amanhecer

com uma câmara de pressão modelo 3005 (Soil Moisture Equipment Corp. Santa

Barbara CA, EUA) antes da reidratação das plantas e no dia subsequente, após 18 h,

para avaliar a recuperação do status hídrico foliar.

2.4 Avaliação do metabolismo antioxidante

Coletas de material vegetal foram realizadas 48 horas (T48h) após adição de

PEG-8000 à solução nutritiva; no máximo déficit hídrico (TME); e 48 horas após a

reidratação (TR). Em cada tempo de coleta, as plantas foram particionadas em parte

aérea e sistema radicular, as frações imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e

depois transferidas para ultrafreezer a -80 °C. A folha 0 foi coletada para determinação

da atividade total de enzimas do metabolismo antioxidante (catalase, superóxido

45

dismutase e ascorbato peroxidase, quantificação de H2O2 e peroxidação lipídica). Parte

das raízes foi coletada para avaliação do metabolismo antioxidante e a outra parte para

avaliação da expressão gênica de transcritos de isoformas de aquaporina (ScPIP2;1, 2;3,

2;5, 2;6).

2.4.1 Peroxidação lipídica e teor de peróxido de hidrogênio em folhas e raízes

Para a estimativa da peroxidação lipídica e a determinação do teor de H2O2 nos

tecidos vegetais (folhas ou raízes), foi obtido o extrato bruto a partir de 0,16 g de tecido

congelado, que foram finamente macerados em almofariz com nitrogênio líquido. Então

foram adicionados 1,5 mL de ácido tricoloroacético (TCA) 0,1% (p/v) e realizada a

extração mecânica em almofariz resfriado por 2 minutos. Após, foi realizada a

centrifugação em 10.000 rpm por 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante recolhido.

A peroxidação lipídica foi estimada pela detecção de aldeído malônico (MDA)

segundo método proposto por CAKMAK & HOST (1991). Após a coleta do

sobrenadante, uma alíquota de 0,5 mL do extrato foi adicionada em 1,5 mL de solução

de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,5% (p/v) em tubo de ensaio com rosca, que foi

incubado sob agitação em banho-maria a 90ºC por 20 minutos. O tubo foi então

colocado em banho de gelo para paralisação da reação e resfriamento, sendo

posteriormente centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. Após, os microtubos

permaneceram em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente para determinação

da absorbância a 532 e 600 nm em espectrofotômetro, para descontar a absorbância

inespecífica a 600 nm. Para calcular a quantidade de MDA na amostra considerou-se o

coeficiente de absortividade do MDA de 155 mM-1

cm-1

e o resultado foi expresso em

nmol g-1

MF.

A determinação do teor de H2O2 nos tecidos foi realizada seguindo o método de

ALEXIEVA et al. (2001). Alíquotas de 0,2 mL do extrato bruto foram adicionadas em

0,8 mL de KI 1,0 mol L-1

e 0,2 mL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1

(pH

7,5). Os microtubos foram incubados em gelo e no escuro por 1 hora e então foi

realizada a determinação da absorbância a 390 nm. Para o cálculo da concentração de

H2O2 foi feita curva de calibração, com pontos de 0 a 15 µg mL-1

de H2O2. O resultado

foi expresso em µmol H2O2 g-1

MF.

46

2.4.2 Extrato proteico e atividade de enzimas do sistema antioxidante

Para obtenção do extrato bruto de proteínas que foi utilizado para a

quantificação de proteínas, atividades de superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1),

catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e ascorbato peroixidase (APX, EC 1.11.1.11), 0,3 g de

tecido vegetal (folha ou raiz) foram macerados em nitrogênio líquido com 2%

de polivinilpirrolidona (PVPP). Após moagem fina do material vegetal, foram

adicionados 2,0 mL de meio de extração composto por tampão fosfato de potássio 0,1

mol L-1

(pH 6,8), etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,1 mmol L-1

e de fluoreto de

fenilmetilsulfônico (PMSF) 1,0 mmol L-1

e a extração mecânica com pistilo foi

realizada por 2 minutos. Após centrifugação do homogeneizado a 15.000 g por 15

minutos a 4 ºC, coletou-se o sobrenadante (extrato bruto) que foi mantido em gelo até o

momento das determinações. Todos os reagentes usados nas análises enzimáticas foram

da Sigma-Aldrich (St. Louis MO, EUA).

A quantificação de proteínas solúveis totais foi realizada de acordo com método

proposto por BRADFORD (1976). Foi utilizado como corante o reagente Bradford BG-

250. Alíquotas de 30 L do extrato proteico foram adicionadas em 70 L de água

deionizada e 3,0 mL do reagente de Bradford BG-250. A leitura de absorbância em

espectrofotômetro foi realizada a 595 nm. A curva padrão foi feita com quatro

concentrações de albumina de soro bovino (BSA): 0,002, 0,005, 0,010 e 0,020 mg mL-1

.

O resultado foi expresso em mg g-1

MF.

Para a determinação da atividade total da SOD nos tecidos vegetais, 30 L do

extrato proteico bruto de folhas foram adicionados em tubo de ensaio contendo 1,5 mL

de tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1

(pH 7,8), 0,78 mL de metionina 50 mmol L-1

,

0,06 mL de EDTA 5 mmol L-1

e 0,345 mL de água deionizada. Volumes de 60 L de

riboflavina 100 µmol L-1

e 0,225 mL de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) 1,0

mmol L-1

foram posteriormente adicionados. Todos os reagentes foram mantidos em

frascos protegidos da luz. As reações foram montadas em duplicatas, pois um grupo de

tubos foi exposto à luz de lâmpada fluorescente (30 W) por 5 minutos e o outro grupo

permaneceu no escuro. A absorbância foi medida a 560 nm. Por definição, uma unidade

de SOD corresponde à quantidade da enzima necessária para inibir em 50% a

fotorredução do NBT, sendo a atividade expressa em U.A. min-1

g-1

MF, de acordo com

método proposto por GIANNOPOLITIS & RIES (1977).

47

A atividade da CAT foi determinada de acordo com o método de HAVIR &

McHALE (1987). Alíquota de 0,1 mL do extrato enzimático foi adicionada a 1,5 mL de

tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1

(pH 6,8), 1,1 mL de água deionizada e 0,3 mL

de solução de H2O2 125 mmol L-1

e o decréscimo na absorbância em 240 nm a 25 ºC foi

monitorado por 1 minuto. A atividade da CAT foi calculada utilizando-se o coeficiente

de extinção molar 36 M-1

cm-1

e expressa em µmol min-1

g-1

MF.

A atividade da APX foi determinada de acordo com método de NAKANO &

ASADA (1981). Alíquota de 0,15 mL do extrato proteico de folhas ou 0,2 mL do

extrato proteico de raízes foi adicionada a 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100

mmol L-1

(pH 6,0), 0,86 mL de água deionizada, 0,24 mL de ácido ascórbico 10 mmol

L-1

e 0,3 mL de solução de H2O2 10 mmol L-1

. Acompanhou-se o decréscimo da

absorbância a 290 nm por 1 minuto a 25 ºC e a atividade da APX foi calculada

utilizando-se o coeficiente de extinção molar 2,8 mM-1

cm-1

e expressa em µmol AsA

min-1

g-1

MF.

2.4.3 Isoformas de superóxido dismutase

O extrato proteico utilizado para a avaliação das isoformas de SOD foi obtido

através da maceração de 0,4 g de amostra composta (~0,1 g por repetição) maceradas

em nitrogênio líquido com 4% PVPP. Após o tecido ser finamente moído, foi

adicionado 2,0 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM contendo 1 mmol L-1

de

EDTA e 3 mmol L-1

de ditiotreitol (DTT) por 2 minutos. Após, o extrato foi recolhido

em microtubo e centrifugado por 30 minutos em 10.000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi

coletado e utilizado nas análises (FERREIRA et al., 2002).

A identificação das isoformas de SOD foi realizada através de eletroforese em

gel de poliacrilamida (12,5%) em sistema não desnaturante (PAGE-nativo). O gel

principal era composto por 1,25 mL de tampão Tris HCL 3 mmol L-1

(pH 8,8), 4,16 mL

de solução de acri/bisacrilamida (30%), 4,08 mL de H2O deionizada, 0,1 mL de

persulfato de amônio (10%) e 5 L de tetrametiletilenodiamina (TEMED). O gel de

empacotamento era composto por 1,25 mL de Tris-HCL 0,5 mmol L-1

, 0,625 mL de

acri/bisacrilamida, 2,87 mL de H2O deionizada, 0,05 mL de persulfato de amônio (10%)

e 5 L de TEMED. O resfriamento da cuba de eletroforese foi realizado por sistema de

circulação forçada de água gelada. A eletroforese foi realizada em corrente constante de

48

30 mA e o tampão de corrida composto por Tris-HCl 25 mmol L-1

(pH 8,3) e 192 mmol

L-1

de glicina. O tampão da amostra foi composto por Tris-HCl 0,0625 mmol L-1

(pH

6,8), glicerol 10%, β-mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,02%. A eletroforese foi

realizada com 30 µg de proteína das folhas e 15 µg de proteína das raízes.

Para cada amostra composta a eletroforese foi realizada em triplicata. Após o

término da eletroforese uma replicata foi incubada por 30 minutos no escuro em solução

de 0,1 mmol L-1

de NBT, 1,0 mmol L-1

e EDTA, 3% de TEMED, tampão fosfato de

potássio 100 mmol L-1

(pH 7,8), 0,05 mmol L-1

de riboflavina e água destilada sob

agitação. Após esse período, o gel foi retirado da solução, lavado brevemente com água

deionizada e revelado sob a luz (30 W) até aparecimento das bandas. Neste gel todas as

bandas de SOD são reveladas (gel controle). As outras duas replicatas foram incubadas

sob agitação no escuro por 20 minutos com inibidores de SOD, em solução contendo

1,0 mmol L-1

de EDTA, 2,0 mmol L-1

KCN e tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1

ou em solução de 1,0 mmol L-1

de EDTA, 5,0 mmol L-1

de H2O2 e tampão fosfato de

potássio 100 mmol L-1

. Após a reação com os inibidores, os géis foram revelados

conforme descrito anteriormente. As isoformas foram classificadas como Mn-SOD, Fe-

SOD e Cu/Zn-SOD, sendo a Mn-SOD resistente a ambos os inibidores, Fe-SOD

resistente apenas ao KCN e Cu/Zn-SOD inibida por ambos os inibidores (AZEVEDO et

al., 1998).

2.5 Expressão de transcritos de aquaporina na raiz

Foi realizada a análise do perfil de transcrição de quatro genes da família das

aquaporinas (ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6) presentes nas raízes de cana-de-

açúcar (FRIGEL, 2011). Os primers foram desenhados a partir das sequências de

expressed sequence tag (EST) do banco de dados SUCEST (Projeto de Sequenciamento

de EST de Cana-de-açúcar, http://sucest-fun.org), utilizando o programa Primer3

(http://frodo.wi.mit.edu/) nas condições adequadas para o PCR quantitativo (qPCR), tais

como tamanho do produto da PCR (100 a 150 pb), temperatura de anelamento (58 a 62

oC) e ausência de formação de estruturas secundárias, e analisados no programa

NetPrimer (http://premierbiosoft.com/netprimer/). Para a determinação da eficiência dos

primers foi realizada uma reação de qPCR utilizando como molde cDNA em uma

diluição seriada de 5 pontos (1/10, 1/20, 1/40, 1/80 e 1/160). Com esses resultados foi

49

gerada uma equação de primeiro grau e a inclinação da curva utilizada para a

determinação da eficiência da reação a partir da equação [E=10(-1/inclinação)

-1].

Para a extração do RNA total, 1,0 g de raiz foi macerado em nitrogênio líquido e

então adicionado em 2,0 mL de tampão de extração (2% brometo de centrimetilamônio

(CTAB), 2% PVP, 100 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 2,0 mM de NaCl, 0,5 g L-1

de Spermidine e 2% de β-mercaptoetanol) aquecido a 65 °C. O extrato foi

homogeneizado em vórtex por 2 minutos e incubado por 30 minutos a 65 ºC. Após a

incubação, o extrato foi resfriado a temperatura ambiente e então adicionado 2,0 mL de

CIA (clorofórmio:álcool isoamilico, 24:1), homogeneizado em vórtex por 2 minutos,

centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a 4 ºC até a separação de fases. Posteriormente,

o sobrenadante foi transferido para um microtubo novo com ¼ de cloreto de lítio 10 M e

mantido por 12 h a -20°C. No dia seguinte, o extrato foi centrifugado a 12.000 g por 30

minutos a 4 ºC, o sobrenadante descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol

75%. O material foi novamente centrifugado nas mesmas condições já descritas, o

etanol foi descartado e o precipitado seco a temperatura ambiente. O precipitado foi

então ressuspendido em 0,6 mL de SSTE (1,0 M de NaCl; 0,5% dodecil-sulfato de

sódio (SDS); 10 mM de Tris-HCl; 1,0 mM de EDTA) a 37 ºC. Após, foi adicionado 0,6

mL de CIA, homogeneizado em vórtex e centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a

temperatura ambiente. O sobrenadante foi recuperado e adicionado a 2 volumes de

etanol absoluto e armazenado por 2 horas a -80 ºC. Após, o extrato foi novamente

centrifugado a 12.000 g por 30 minutos a 4 ºC e descartado o sobrenadante e o

precipitado lavado com 1 mL de etanol 75% e centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a

4 ºC. Após, o etanol foi descartado e o precipitado seco em temperatura ambiente. O

RNA foi ressuspendido em 20 μL de água tratada com DEPC (1,0%

diethilpirocarbonato) e autoclavada, quantificado em espectrofotômetro NanoDrop

2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA, EUA) e armazenado a -80 ºC. A

integridade e qualidade dos RNAs extraídos foram determinadas através de géis de

agarose a 1%, corados com brometo de etídio.

Após a extração e quantificação do RNA, o mesmo foi tratado com DNAse

(Promega, Madison WI, EUA) para eliminar eventuais contaminações de DNA

genômico e em seguida convertido em cDNA pela ação da enzima QuantiTect Reverse

Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Germany), conforme recomendação do fabricante.

As reações de qPCR foram realizadas em triplicatas técnicas para cada uma das três

réplicas biológicas, para cada combinação gene alvo/normalizador. Cada reação foi

50

composta por 5 µL de SYBR green qPCR Master Mix (Applied BioSystems, New York

NY, EUA), 3 µL do cDNA diluído 1:20 (v:v), primer forward e reverse a 0,2 µM, e

água ultrapura (Milli-Q) estéril em volume final de 10 µL. As reações foram realizadas

em termociclador Step One Plus (Applied BioSystems, New York NY, EUA), seguindo

recomendações do fabricante. A quantidade relativa das moléculas-alvos relacionadas

ao calibrador foi calculada a partir do método 2-ΔΔCt

(LIVAK & SCHMITTGEN, 2001).

Para a avaliação da estabilidade dos genes de referência, foram considerados

cinco genes constitutivos (Tabela 2) e a eficiência da reação e a melhor concentração

(0,2 µM ou 0,8 µM) do primer para cada gene normalizador foi determinada por uma

diluição seriada de cinco pontos.

2.6 Condutância hidráulica do sistema radicular e contribuição das aquaporinas

As determinações de condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) e da

contribuição das aquaporinas em Lpr (AQP%) não puderam ser realizadas nas mesmas

plantas usadas para as análises fisiológicas e moleculares. Essas plantas estavam

grandes e perfilhando, o que impossibilitava o fechamento hermético da câmara de

pressão. Portanto mudas dos dois genótipos foram produzidas e conduzidas conforme

descrito no item 2.1, sendo as medidas de Lpr e AQP% realizadas em T48h.

As determinações de Lpr foram realizadas de acordo com método descrito por

AROCA et al. (2001). A muda foi transferida da caixa de cultivo para um recipiente

plástico contendo 300 mL da mesma solução nutritiva, posicionado dentro da câmara de

pressão (3005, Soil Moisture Equipment Corp., Palo Alto CA, EUA). O sistema

radicular ficou totalmente imerso na solução e em seguida a parte aérea foi excisada a

aproximadamente 5,0 cm abaixo da inserção da folha mais velha de modo que o restante

da parte aérea passasse pelo orifício da tampa da câmara de pressão, que foi

hermeticamente fechada. Em contato com o local do corte, foi posicionado um algodão

hidrofílico seco, com a massa previamente determinada, com auxílio de um tubete

plástico. Foram exercidas pressões de 0,2, 0,4 e 0,6 MPa por 10 minutos e ao término da

medida de cada ponto o algodão úmido era pesado e substituído por algodão seco

(Figura 1). A diferença de massa do algodão úmido e seco, normalizada pelo tempo é o

fluxo de seiva através do sistema radicular. Por fim, as raízes foram armazenadas em

solução de etanol 30% para posterior medição da área radicular com o auxílio do

51

programa Safira® (JORGE & SILVA, 2010). Lpr é dado pela inclinação da regressão

entre fluxo vs. pressão e então normalizada pela área radicular. O resultado de Lpr foi

expresso em mmol m-2

s-1

MPa-1

.

Figura 1. Ilustração do método de avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lpr).

(Adaptado de SILVA, 2014).

Para a determinação de AQP% foi utilizado H2O2 como inibidor da atividade de

AQPs (AROCA et al., 2005). Foi calculada Lpr nas plantas referência ou sob déficit

hídrico conforme descrito anteriormente. Todavia, medidas foram realizadas em plantas

com sistema radicular imerso apenas em solução nutritiva (Lpr máximo) e em solução

nutritiva com a adição de H2O2 (Lpr inibido). O tratamento com H2O2 foi realizado

expondo as raízes por 1 hora (BENABDELLAH et al., 2009) à solução com 45 mmol

L-1

de H2O2. A AQP% foi determinada através da seguinte equação: AQP%=100-(100*

Lpr inibido/ Lpr máximo).

O horário das medidas foi padronizado entre 11:00 e 14:00 h para minimizar

variações em Lpr em função do ciclo circadiano da atividade das aquaporinas

(HACHEZ et al., 2012).

Transferência da

planta decapitada para

câmara de pressão

contendo solução

nutritiva

Solução nutritiva

Corte da

parte aérea

Coleta das raízes para quantificação da área radicular

Absorção da

seiva pelo

algodão

Algodão no tubete

Aplicação da pressão

Superfície

de corte

N2

52

2.7 Biometria

Ao longo do experimento a altura das plantas (entre o colo e a inserção da folha

+1) foi monitorada com uso de régua comum. Foi realizada a contagem do número de

perfilhos e de folhas verdes (NFV) na touceira.

Após a coleta do material vegetal para as análises bioquímicas e moleculares, a

área foliar (AF) foi determinada com planímetro Li-3000C (Licor Inc., Lincoln NE,

EUA) e então todo o material vegetal foi seco em estufa de circulação forçada de ar

(MA032, Marconi, Piracicaba SP, Brasil) a 65 °C para a determinação da matéria seca.

2.8 Análise estatística

O desenho experimental adotado foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial

2x2, sendo os fatores variedade (dois níveis) e disponibilidade hídrica (dois níveis), com

n=5 para as análises fisiológicas, n=4 para as moleculares e bioquímicas e n=3 para as

análises de Lpr e AQP%. Cada parcela era composta por uma planta. Foram realizadas

análises de variância e quando detectadas diferenças significativas, as médias foram

comparadas pelo teste t-student (p<0,05).

Para a validação dos dados da expressão gênica relativa, utilizou-se a ferramenta

REST (PFAFFL et al., 2002), a qual é indicada para análises estatísticas de dados

provenientes de qPCR.

3 RESULTADOS

3.1 Trocas gasosas e atividade fotoquímica

As plantas de ambos os genótipos submetidos à restrição hídrica apresentaram

redução nas trocas gasosas e na atividade fotoquímica da fotossíntese (Figuras 2 e 3).

Apenas 48 horas após o potencial osmótico da solução nutritiva ser reduzido à -0,55

MPa (T48h), houve redução significativa (p<0,05) em AN nos dois genótipos. Após nove

dias de restrição hídrica (TME), AN foi reduzido em 81% em IACSP94-2094 e 84% em

IACSP97-7065. Nenhum dos genótipos apresentou completa recuperação (p<0,05) de

AN após 48 h da reidratação. Considerando a integração das medidas de AN ao longo do

53

período experimental, IACSP94-2094 apresentou maior acúmulo de carbono (+24%) do

que a IACSP97-7065 em situação de déficit hídrico. A integração das diferenças entre

plantas referência e sob déficit hídrico durante todo o período experimental revelou que

IACSP94-2094 teve redução de 47% e a IACSP97-7065 de 53% na assimilação de CO2

(Figura 2A,B, área hachurada).

0

10

20

30

40

50

0,0

0,1

0,2

0,3

-1

0

1

2

3

4

*

*

****

*

AN

(m

ol m

-2 s

-1)

REF

DHA

*

DAT

* *****

**

B

***

****

C

gS

(mol m

-2 s

-1)

*

*

**

***

D

*

***

*

TRTMET48h

F

IACSP97-7065

k

(m

ol m

-2 s

-1 P

a-1

)

IACSP94-2094

146146

*

0 2 4 8 10 121210842

**

TRTME

Déficit Hídrico

E

Déficit Hídrico Rec. Rec.

T48h

0

Figura 2. Assimilação de CO2 (AN, em A,B), condutância estomática (gS, em C,D) e

eficiência instantânea de carboxilação (k, em E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar






máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.

54

A abertura estomática em IACSP94-2094 e IACSP97-7065 foi reduzida de

forma similar (48% vs. 54%, respectivamente) quando se considera o momento de

máximo déficit hídrico (Figura 2C,D). Os estômatos de ambos os genótipos

apresentaram fechamento (p<0,05) após 24 h de exposição ao potencial osmótico -0,55

MPa (Figura 2C,D), porém o genótipo IACSP94-2094 apresentou redução de 35%

enquanto que o IACSP97-7065 de 51%. IACSP94-2094 mostrou recuperação de gS 24 h

após a reidratação, enquanto IACSP97-7065 mostrou recuperação após 48 h (Figura

2C,D). Integrando os nove dias de restrição hídrica, IACSP94-2094 apresentou redução

de 39% em k enquanto a redução em IACSP97-7065 foi de 58% (Figura 2E,F). Em

geral, k foi mais afetada pelo déficit hídrico em IACSP97-7065 se comparado com

IACSP94-2094. Durante a restrição hídrica não foram detectadas diferenças em EUAi

devido ao tratamento hídrico e entre os genótipos (dados não apresentados). Porém, foi

observado aumento em EUA em decorrência da restrição hídrica, com os genótipos

apresentando aumentos similares de 50% em IACSP94-2094 e 52% em IACSP97-7065,

no momento de máximo déficit hídrico (dados não apresentados).

As variáveis fotoquímicas Fq’/Fm’ e ETR foram reduzidas (p<0,05) em ambos os

genótipos devido ao déficit hídrico (Figura 3A-D). Os dois genótipos de cana-de-açúcar

apresentaram redução de 37% nesses dois parâmetros fotoquímicos, sendo que

IACSP94-2094 apresentou maior atividade fotoquímica em condições de boa

disponibilidade hídrica (Figura 3A-D). A razão ETR/AN aumentou em ambos os

genótipos ao final do período de restrição hídrica, com IACSP97-7065 apresentando

maior consumo de elétrons por CO2 assimilado se comparado a IACSP94-2094 (+33%

vs. +22%) no dia de máximo déficit hídrico (Figura 3E,F).

55

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

50

100

150

200

0

5

10

15

20

*

* ****

**

REF

DHA

**

**

***

B

*

**

***

*

D

IACSP97-7065

Fq'/F

m'

ET

R

(m

ol m

-2 s

-1)

IACSP94-2094

***

****

*C

1268 10 12 1410844 22 0

*

*

*

TRTMET48h

F

0DAT

Déficit Hídrico

146

***

TRTMET48h

Déficit Hídrico Rec.

E

ET

R/A

N

(m

ol

mo

l-1

)

Rec.

Figura 3. Eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em A,B), taxa de

transporte de elétrons (ETR, em C,D) e ETR/AN (E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar






máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.

Durante todo o período experimental não foram observadas diferenças em Fv/Fm

entre os genótipos IACSP94-2094 (0,788±0,008) e IACSP97-7065 (0,789±0,008)

(dados não apresentados) e o regime hídrico não causou alterações nessa variável.

Fq’/Fv’ foi reduzida (p<0,05) em ambos os genótipos após 48 h do início do déficit

56

hídrico (Figura 4A,B). Em NPQ não ocorreram diferenças entre os genótipos ou

tratamentos hídricos (Figura 4C,D). A restrição hídrica promoveu aumento (p<0,05) no

QEXC em ambos os genótipos, porém não foram detectadas diferenças entre eles (Figura

4E,F).

0

1

2

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

50

60

70

80

90

100

C

IACSP97-7065

QE

XC

(%)

NP

Q

IACSP94-2094

D

6

**

**

**

Fq'/F

v'

A

*

****

TRTMET48h

F

Rec.

**

B REF

DH

124128

Déficit HídricoDéficit Hídrico

DAT

0 2 8 10 141410642

****

TRTMET48h

E

0

Rec.Déficit Hídrico

Figura 4. Coeficiente de extinção fotoquímico (Fq’/Fv’, em A,B), coeficiente de

extinção não-fotoquímico (NPQ, em C,D) e excesso relativo de energia (QEXC, em E,F)

nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos

tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). DAT indica dias após o início do

déficit hídrico. Cada símbolo representa as médias (n=5±dp). *indica diferença

significativa (p<0,05) entre os tratamentos comparados pelo teste t-student. As setas

indicam os dias de amostragem de tecidos vegetais: T48h, 48 h após a redução do

potencial osmótico da solução nutritiva; TME, máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a

reidratação.

57

Não foram detectadas diferenças nos teores relativos de clorofila total avaliados

no dia de máximo estresse devido à restrição hídrica ou entre genótipos, com valores

médios de 51,2±2,2 em IACSP94-2094 e 53,7±3,3 em IACSP97-7065 (dados não

apresentados).

3.2 Potencial da água nas folhas

O déficit hídrico causou redução de medido na antemanhã (p<0,05) nos dois

genótipos. Todavia, ambos os genótipos apresentaram recuperação de após 18 h da

reidratação (Tabela 1).

Tabela 1. Potencial da água na folha () em genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-

7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Medidas

realizadas na antemanhã, no máximo déficit hídrico (me) e 18 h após a reidratação

(18h).

Variedade Tratamento me

(MPa)

18h

(MPa)

IACSP94-2094 REF -0,06 ± 0,01* -0,02 ± 0,01

ns

DH -1,12 ± 0,06 -0,04 ± 0,02

IACSP97-7065 REF -0,07 ± 0,02* -0,03 ± 0,00

DH -1,13 ± 0,02 -0,04 ± 0,02

Valores médios (n=4±dp) * indica diferença pelo teste t-student entre os tratamentos na mesma variedade

e ns

indica que não houve diferença significativa entre tratamentos.

3.3 Peroxidação lipídica e teor de peróxido de hidrogênio em folhas e raízes

O déficit hídrico causou aumento da peroxidação lipídica nas folhas e raízes da

IACSP94-2094 apenas em TME, enquanto que em IACSP97-7065 os aumentos foram

registrados nesses tecidos em T48h e TR (Figura 5). Comparando os tecidos, os níveis de

MDA foram sempre maiores nas folhas.

58

0

10

20

30

40

50

60

*

TRTMET48h

A

MD

A

(nm

ol M

DA

g-1 M

F)

TME

Folha

T48h

REF

DH


TR

Avaliações

0

10

20

30

40

50

*

CRaiz

*Folha

B

*

* *

RaizD

Figura 5. Concentração de aldeído malônico (MDA) em folhas (em A,B) e raízes (em






realizada 48 h após a reidratação.

Com a restrição hídrica também foi detectado aumento nos teores de H2O2 nas

folhas de IACSP97-7065, mas apenas em TME. Nas raízes dessa variedade também

foram verificados aumentos no teor de H2O2 em TR (Figura 6). Em geral, os teores de

H2O2 foram maiores (p<0,05) nas folhas se comparadas às raízes.

59

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

A

Avaliações

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4C

REF

DH*

BFolha

IACSP97-7065IACSP94-2094

*

DRaiz

TRTMET48h

TRTMET48h

H2

O2

(m

ol g

-1M

F)

Folha

Raiz

Figura 6. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) em folhas (em A,B) e raízes

(C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos

aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a





3.4 Enzimas do sistema antioxidante

A atividade de SOD aumentou em TME e TR nas folhas de IACSP94-2094,

porém nas raízes foi detectado aumento apenas em TR (Figura 7A,C). IACSP97-7065

apresentou aumento da atividade da SOD nas raízes apenas em TME (Figura 7B,D).

60

0

10

20

30

40

**

Folha

Raiz

SO

D

(U.A

. g

-1M

F m

in-1

)

A

Avaliações

0

10

20

30

*

C

BFolha

*

DRaiz

REF

DH

TRTMET48h

T48hTME TR


Figura 7. Atividade de superóxido dismutase (SOD) em folhas (em A,B) e raízes (em







O zimograma de SOD revelou que não houve aparecimento de isoforma em

decorrência do estresse hídrico nos tecidos dos dois genótipos (Figura 8). Foi observado

aumento da atividade das isoformas i-Mn-SOD, ii-Fe-SOD e iii-Cu/Zn-SOD das raízes

devido à restrição hídrica em TME e TR nos dois genótipos. Duas isoformas exclusivas

da IACSP94-2094 foram detectadas: v-Fe-SOD e vi-Fe-SOD. Nos dois genótipos, há

presença de mais isoformas de SOD em folhas do que em raízes (Figura 8).

61

Figura 8. Identificação de isoformas de superóxido dismutase (SOD) em PAGE-nativo

em folhas e raízes dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065

submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). TME indica a coleta

realizada no máximo déficit e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. Cada gel é

resultante de uma amostra composta de quatro repetições, representativo de três

corridas.

Não foram detectadas diferenças significativas na atividade de CAT nas folhas

da IACSP94-2094 em função do déficit hídrico (Figura 9A). Nas folhas de IACSP97-

7065 houve aumento da atividade da CAT em T48h devido ao déficit hídrico com

posterior redução em TME (Figura 9B). Nas raízes, a atividade de CAT aumentou devido

à imposição do déficit hídrico em IACSP94-2094 em TME e TR (Figura 9C). Nas raízes

de IACSP97-7065 foi detectada redução da atividade da CAT em T48h com posterior

aumento em TME (Figura 9D). A atividade de CAT foi maior nas folhas do que nas

raízes nos dois genótipos estudados.

iv

iiiiii

Cu/Zn-SOD

Mn-SOD

Cu/Zn-SOD

Ref. DH94- 2094

Ref. DH 97- 7065

Fe-SOD

vi

i

iiiii

vii

v

iv

Cu/Zn-SOD

Cu/Zn-SOD

Fe-SOD

Mn-SOD

TME

Cu/Zn-SOD

iv

iiiiii

Ref. DH94- 2094

Ref. DH97-7065

Cu/Zn-SOD

Mn-SOD

Cu/Zn-SODFe-SOD

iiiiii

vii

v

iv

Cu/Zn-SOD

Cu/Zn-SOD

Fe-SOD

Mn-SOD

TR

vi

FO

LH

AR

AIZ

Cu/Zn-SOD

62

0

50

100

150

Folha

Raiz

IACSP97-7065

CA

T

(nm

ol g

-1 M

F m

in-1

)

IACSP94-2094

A

0

50

100

**

C

*

BFolha

REF

DH

Avaliações

**

*

TR

TME

T48h

DRaiz

T48h

TME

TR

Figura 9. Atividade de catalase (CAT) em folhas (em A,B) e raízes (em C,D) dos

genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos






A atividade de APX aumentou nas folhas devido ao déficit hídrico nos dois

genótipos e nos três tempos de coleta, com exceção de T48h na IACSP94-2094 (Figura

10A, B). Nas raízes também foram detectados aumentos na atividade de APX nos três

tempos de coleta, exceto em TR para IACSP97-7065 (Figura 10C, D).

63

B

* **

Folha

D

**

TRTMET48h

Raiz

Folha

REF

DH


T48h TME TR

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

*

AP

X

(m

ol A

sA

g-1

MF

min

-1)

*

A

Avaliações

0,0

2,5

5,0

7,5

C

** *

Raiz

Figura 10. Atividade de ascorbato peroxidase (APX) em folhas (em A,B) e raízes (em







A restrição hídrica não induziu alterações nos teores de proteínas totais nos

tecidos nos genótipos estudados. O teor de proteínas total nas folhas se manteve

próximo entre os genótipos IACSP94-2094 (12,8±1,7 mg g-1

) e IACSP97-7065

(13,1±2,2 mg g-1

). Nas raízes, o teor de proteínas foi menor que nas folhas (p<0,05).

Também não foram detectadas diferenças entre IACSP94-2094 (4,2±1,3 mg g-1

) e

IACSP97-7065 (3,7±1,5 mg g-1

) (dados não apresentados).

3.5 Condutância hidráulica das raízes

Houve manutenção da condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) na

IACSP94-2094 após 48 h da exposição à restrição hídrica, enquanto que IACSP97-7065

apresentou redução de 71% em Lpr (Figura 11A). Sob déficit hídrico, Lpr em IACSP94-

2094 foi cerca de 2,3 maior se comparado a IACSP97-7065.

64

Aproximadamente 80% de Lpr foi regulada pela atividade de aquaporinas

presentes no sistema radicular das plantas de cana-de-açúcar (Figura 11B). Esse

controle não foi prejudicado pelo déficit hídrico em IACSP94-2094, ao passo que em

IACSP97-7065 houve redução significativa na contribuição das aquaporinas no fluxo de

água através do sistema radicular (Figura 11B).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0 REF

DH

*

IACSP97-7065

Lp

r

(mm

ol m

-2 s

-1 M

Pa

-1)

IACSP94-2094IACSP94-2094 IACSP97-7065

A

0

20

40

60

80

100B

*

AQ

P%

(%)

Variedades

Figura 11. Condutância hidráulica das raízes (Lpr, em A) e contribuição das

aquaporinas em Lpr (AQP%, em B) em genótipos de cana-de-açúcar submetidos a

condição de boa disponibilidade hídrica (REF) e 48 h após a exposição ao déficit

hídrico (DH).*indica diferenças significativas entre genótipos pelo teste t-student

(p<0,05). Médias (n=3±dp).

3.6 Expressão de transcritos de aquaporina nas raízes

O gene escolhido como o gene normalizador e posteriormente utilizado como

gene de referência para a quantificação relativa dos genes de AQP foi o GAPDH. Este

gene apresentou a menor variação de expressão (0,150) nas amostras testadas quando

comparados com os demais genes, associado à 100% de eficiência de amplificação

(Tabela 2). Esta análise foi determinada de acordo com a ferramenta NormFinder

(ANDERSEN et al., 2004).

65

Tabela 2. Sequência (5’-3’), concentração dos primers, eficiência da amplificação (E) e

variação da expressão de cinco genes constitutivos nas raízes de dois genótipos de cana-

de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos à restrição hídrica. Gene Sequência do primer (5’- 3’) [primer]

(µM)

E*

(%)

Variação da

Expressão***

Actina F: CTCAACCCCAAGGCTAACAG 0,2 96,8 0,290

R: GGCATGAGGAAGGGCATAA

GAPDH**

F: CCGTCAACGACCCCTTCAT 0,2 100 0,150

R: GCAGCCTTGTCCTTGTCAGT

Ubiquitina-1 F: AGCCTCAGACCAGATTCCAA 0,2 95,4 0,410

R: AATCGCTGTCGAACTACTTGC

Ubiquitina-2 F: CTTCTTCTGTCCCTCCGATG 0,2 100 0,470

R: TCCAACCAAACTGCTGCTC

rpl35_

SCVPST1060B03

F: GGGAAAAGAAGCGTGAGAAGTA 0,8 99,2 0,360

R: GGAAAGAAACAGCCGATGATA *E=10

(-1/inclinação)-1,

**Glideraldeído 3-fosfato desidrogenase,

***obtida através da ferramenta NormFinder

Os níveis de transcritos de todas as isoformas de AQP foram alterados em ambos

os genótipos em função da restrição hídrica. Foi detectado aumento na expressão da

ScPIP2;1 após 48 h de déficit hídrico apenas na IACSP97-7065 (Figura 12A). Neste

mesmo momento do estudo, houve aumento na expressão da ScPIP2;5 em ambos os

genótipos (Figure 12C). Quando consideradas as avaliações no momento de máximo

déficit hídrico, apenas IACSP94-2094 apresentou aumento na expressão de ScPIP2;3,

ScPIP2;5 e ScPIP2;6 (Figura 12B-D). Novamente, apenas IACSP94-2094 apresentou

variação na expressão de ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 após a reidratação das plantas,

com redução na quantidade de transcritos das três aquaporinas citadas (Figura 12B-D).

A isoforma ScPIP2;5 foi a mais responsiva ao déficit hídrico em ambos genótipos

(Figura 12).

66

-2

0

2

4

6

T ME

T 48h

*

T R

B

IACSP97-7065IACSP97-7065 IACSP94-2094

ScPIP 2;1

IACSP94-2094

A

T 48h

T ME T R T 48

hT M

ET R

T 48h

T ME T R

*

*

ScPIP 2;3

-2

0

2

4

6*

*

*

*

C ScPIP 2;5

*

*

*

D ScPIP 2;6

Exp

ressã

o R

ela

tiva

Figura 11. Expressão relativa dos transcritos das aquaporinas ScPIP2;1 (em A),

ScPIP2;3 (em B), ScPIP2;5 (em C) e ScPIP2;6 (em D) nos genótipos de cana-de-açúcar

IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos ao déficit hídrico. A expressão foi

quantificada por qPCR e calculada pelo método 2-ΔΔCt

. Cada histograma representa a

média (n=4±ep) e *indica diferença significativa entre os tratamentos referência e

déficit hídrico (p<0,05). T48h indica a coleta realizada 48 h após a redução do potencial

osmótico da solução nutritiva; TME representa a coleta realizada no máximo déficit

hídrico; e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação.

3.7 Biometria

Ao término do experimento, IACSP94-2094 não teve o perfilhamento afetado

pelo déficit hídrico enquanto que IACSP97-7065 apresentou redução nessa importante

característica (Tabela 3). O número de folhas verdes foi mantido em ambos os

genótipos, porém IACSP94-2094 apresentou maior NFV que IACSP97-7065 (Tabela

3). A restrição hídrica causou redução da área foliar nos dois genótipos, com IACSP94-

2094 apresentando maior AF do que IACSP97-7065 nos dois tratamentos (Tabela 3).

67

Tabela 3. Número de perfilhos (NP), número de folhas verdes da touceira (NFV) e área

foliar (AF) avaliados 48 h após a reidratação dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-

7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH).

Variedade Tratamento NP (unid.)

NFV (unid.)

AF

(cm²)

IACSP94-2094 REF 3,6

aA 13,8

aA 1539

aA

DH 3,8aA

14,6aA

580 aB

IACSP97-7065 REF 2,4

bA 9,0

bA 436

bA

DH 1,6bB

7,2bA

95 bB

Valores médios (n=5±dp) seguidos por letras diferentes diferem entre si (p<0,05) pelo teste t-student.

Letras maiúsculas comparam as médias entre os tratamentos de genótipos e letras minúsculas comparam

os tratamentos de disponibilidade hídrica.

Houve redução no acúmulo de biomassa no colmo e nas folhas da IACSP94-

2094 devido ao déficit hídrico (Figura 13A). Já em IACSP97-7065 houve redução da

biomassa em todas as frações analisadas da planta (colmo, folhas e raízes) devido ao

déficit hídrico (Figura 13B). Em geral, o acúmulo de carbono foi maior (p<0,05) na

variedade IACSP94-2094 quando comparada a IACSP97-7065, independente da fração

da planta considerada e do tratamento hídrico. As plantas do genótipo IACSPSP94-

2094 apresentaram redução de 30% e as de IACSP97-7065 de 52% no acúmulo total de

biomassa.

0

10

20

30

40

50

*

*

*

Folha

Ma

téria

Se

ca

(g)

IACSP94-2094

Colmo Raiz Total Colmo Folha Raiz Total

A

*

REF

DH

*

**

B

IACSP97-7065

Figura 12. Acúmulo de matéria seca no colmo, folha, raiz e total em genótipos de cana-

de-açúcar IACSP94-2094 (A) e IACSP97-7065 (B) submetidos aos tratamentos

referência (REF) e déficit hídrico (DH). Quantificação realizada após 48 h da

reidratação. Cada histograma representa a média (n=5±dp) e * indica diferença

significativa (p<0,05) entre os tratamentos pelo teste t-student.

68

4 DISCUSSÃO

A menor redução no crescimento da IACSP94-2094 durante o período de

restrição hídrica ocorreu em função da maior fotossíntese acumulada ao longo do

período experimental. Sob condição de restrição hídrica, AN da IACSP94-2094 foi 24%

maior que da IACSP97-7065 e a área foliar de IACSP94-2094 foi menos afetada se

comparada à da IACSP97-7065 (Área hachurada da Figura 2; Tabela 3). O período

inicial do déficit hídrico foi o que mostrou a principal diferença em AN, com IACSP94-

2094 apresentando redução de 50% em AN apenas após seis dias do início da restrição

hídrica. IACSP97-7065 apresentou menor capacidade de sustentação da assimilação de

CO2, visto que após dois dias do início do estresse hídrico a AN havia reduzido em 50%

(Figura 2A,B). A redução da assimilação de CO2 ocorreu devido, em parte, à redução de

gS, com IACSP94-2094 mantendo a abertura estomática no início do estresse (Figura

2C,D). Enquanto a IACSP94-2094 mostrou redução de 35% na abertura estomática,

IACSP97-7065 teve redução de 50% após 48 h do início do déficit hídrico. À parte da

menor limitação difusiva, IACSP94-2094 apresentou menor sensibilidade das reações

bioquímicas da fotossíntese, dadas pela k (Figura 2E,F). Uma hipótese é que tenha

havido menor inibição da Rubisco por inibidores endógenos, como a 2-

carboxiarabintol-1-fosfato (CA1P), que aumenta com a intensidade do estresse

(CARMO-SILVA et al., 2010).

Decréscimo na regeneração de PEP e RuBP devido à baixa produção de ATP

(LAWLOR & TEZARA, 2009) também poderia limitar a fotossíntese das plantas. Os

dois genótipos apresentaram alterações importantes na atividade fotoquímica três dias

após o início da restrição hídrica, com reduções em ETR e Fq’/Fm’ (Figura 3). Sabe-se

que um dos principais compartimentos afetados pela restrição hídrica são os

cloroplastos e a menor atividade fotossintética associada à contínua interceptação de

energia radiante ocasiona excesso de energia no aparato fotoquímico. Se esse excesso

não for dissipado por mecanismos não fotoquímicos (NPQ), ocorrerá aumento na

geração de EROs e o desbalanço entre a formação e o consumo poderia levar à

fotoinibição e foto-oxidação dos fotossistemas (FOYER & NOCTOR, 2005; PINTÓ-

MARIJUAN & MUNNÉ-BOSCH, 2014; SALES et al., 2013). Como nenhum dos

genótipos apresentou aumento em NPQ (Figura 4C,D) e houve aumento de QEXC

(Figura 4F,E) com manutenção de FV/FM, sugere-se que houve aumento da dissipação

69

de energia por drenos alternativos de elétrons (indicado pelo aumento de ETR/AN,

Figura 3E,F) e que as plantas tinham um sistema antioxidante atuando para limitar o

potencial dano ocasionado por EROs.

Nas folhas de ambos os genótipos foram detectados danos oxidativos nas

membranas celulares causados pela restrição na disponibilidade de água (Figura 5A,B).

Em IACSP94-2094 os danos oxidativos ocorreram apenas em TME enquanto que em

IACSP97-7065 a peroxidação lipídica ocorreu 48 h após o início do estresse e após a

reidratação. Nas folhas do genótipo IACSP94-2094 não foram observadas alterações na

atividade de enzimas do metabolismo antioxidante após 48 h do início do estresse

(Figuras 7A, 9A, 10A), tampouco foram observadas alterações no teor de H2O2 (Figura

6A). Como o processo fotossintético não havia sofrido grandes limitações, não houve

acúmulo acentuado de EROs para causar dano oxidativo ou desencadear as respostas

antioxidantes no início do déficit hídrico (T48h). No entanto, o genótipo IACSP97-7065

que apresentou redução em 50% da AN após 24 h da restrição hídrica, teve maior

peroxidação lipídica (Figura 5B) e aumento das atividades de CAT e APX (Figuras 9B,

10B), as quais aparentemente impediram o aumento do teor de H2O2 nos tecidos (Figura

6B).

Após nove dias de restrição hídrica, o genótipo IACSP94-2094 apresentou

aumento na atividade total de SOD (Figura 7A), dada provavelmente pela maior

atividade das isoformas mitocondriais (ii-Mn-SOD), cloroplastidiais (iv-Fe-SOD, v-Fe-

SOD) e citosólicas (vii-Cu/Zn-SOD) (Figura 8). Junto com a atividade de SOD, houve

aumento da atividade de APX (Figura 10A) e a ação dessas duas enzimas foi eficiente

em manter os níveis de H2O2 (Figura 6A). No entanto, foi detectado breve aumento na

peroxidação lipídica nas folhas desta variedade em TME (Figura 5A), sugerindo dano

oxidativo. Já em IACSP97-7065 foi detectado aumento somente na atividade de APX

(Figura 10B), com manutenção da atividade de SOD (Figura 7B) e redução da atividade

de CAT (Figura 9B). O declínio na atividade de CAT sugere que o aumento de EROs

ocorreu principalmente nos cloroplastos, organela que apresenta baixos níveis desta

enzima (MHAMDI et al., 2010). Além dos baixos níveis desta enzima, esta proteína

apresenta alta sensibilidade à luz, que é compensada pela taxa de síntese. Em situações

de estresse, a fotodegradação pode ser maior que a síntese, reduzindo a quantidade e

consequentemente a atividade (MHAMDI et al., 2010; SHARMA & DUBEY, 2005).

Após 48 h da reidratação, IACSP94-2094 continuou com as atividades da APX e

total de SOD aumentadas, esta última pela maior atividade das isoformas iii-Mn-SOD e

70

vi-Fe-SOD (Figura 8). A alta atividade destas duas enzimas após a reidratação está

relacionada com a recuperação mais eficiente da fotossíntese, sendo essa uma

característica importante de resistência à seca (SALES et al., 2013). De fato, a rápida

recuperação da fotossíntese é mais frequente em plantas com maior capacidade

antioxidante (FLEXAS et al., 2006).

Espera-se que os danos oxidativos causados pela seca nas raízes sejam menores

que em folhas, pois a pressão energética ocasionada pela energia radiante não ocorre nas

raízes. No entanto, sinais de estresse oxidativo também foram detectados nas raízes de

ambos os genótipos devido à restrição hídrica (Figura 5C,D). Os genótipos

apresentaram aumento na atividade de APX após 48 h da exposição ao estresse e se

sabe que esta enzima representa uma das primeiras linhas de defesa enzimática contra o

acúmulo de H2O2 devido à alta afinidade com esta espécie reativa (MITTLER, 2002).

Mesmo com a redução da atividade de CAT, não foi detectado acúmulo de H2O2 nas

raízes em IACSP97-7065.

No dia de máximo déficit hídrico, as raízes de IACSP94-2094 apresentaram

aumento da peroxidação lipídica (Figura 4D,E) e aumento da atividade da APX (Figura

10D,E), sem variação no teor de H2O2 na IACSP97-7065 (Figura 6D,E). Apesar de não

ter sido observado aumento na atividade total de SOD, sabe-se que a atividade das

isoformas pode aumentar, de forma independente, no local em que estiver ocorrendo

maior indução de estresse oxidativo (SHARMA & DUBEY, 2005). Em ambos os

genótipos observou-se maior atividade das isoformas i-Mn-SOD, presentes

principalmente em mitocôndrias, da iii-Cu/Zn-SOD, prioritariamente de citosol e

também da ii-Fe-SOD, que pode ser encontrada em cloroplastos (MITTLER, 2002) e

também em plastídios (KLIEBENSTEIN et al., 1998) presentes nas raízes. O aumento

das atividades isoladas das isoformas de SOD nas raízes do genótipo IACSP97-7065

resultaram em aumento da atividade total. Também foram detectados aumentos em

CAT e APX, sugerindo que este genótipo apresenta sistema antioxidante ativo mesmo

sob déficit hídrico severo. Após 48 horas da reidratação, não foi identificado aumento

na atividade de nenhuma das três enzimas estudadas, resultando em acúmulo de H2O2

(Figura 6D) e aumento da peroxidação das membranas (Figura 5D). Já em IACSP94-

2094 foram detectados aumentos em SOD, CAT e APX, evitando o acúmulo de H2O2 e

os danos às membranas (Figuras 7, 9 e 10). Nas raízes, assim como nas folhas, esta

variedade apresenta alta atividade antoxidante no momento de recuperação do estresse

hídrico. De fato, o genótipo de cana-de-açúcar resistente à seca apresentou metabolismo

71

antioxidante mais eficiente, dado pelas maiores atividades de APX e SOD durante a

reidratação após período de seca (SALES et al., 2013).

Não houve aumento no acúmulo de H2O2 em T48h (Figura 6A,B) nas raízes de

nenhum dos dois genótipos estudados, sugerindo que a redução de Lpr observada na

IACSP97-7065 não ocorreu devido à inibição das aquaporinas pelo H2O2 (Figura

11A,B). No entanto, o fluxo de água para a parte aérea foi mantida na IACSP94-2094

(Figura 11A), possibilitando o fechamento estomático mais lento, em comparação à

IACSP97-7065 (Figura 2C). A manutenção de Lpr não foi associada ao aumento da

expressão de ScPIP2;5 em IACSP94-2094 (Figura 12C). Embora a manutenção da Lpr

possa estar associado ao aumento da expressão de PIP2:5, os resultados indicaram que

esse padrão foi fortuito. IACSP97-7065 apresentou maior expressão dessa isoforma

(Figura 12C), porém houve redução de Lpr (Figura 11A) quando este genótipo foi

exposto à redução da disponibilidade de água. Ainda, IACSP97-7065 apresentou

aumento na expressão de transcritos das isoformas ScPIP2;1 e ScPIP2;6 após 48 horas

de restrição hídrica (Figura 12). Logo, o aumento da expressão das isoformas das

aquaporinas ScPIP2;1, ScPIP2;5, ScPIP2;6 após 48 h de exposição à restrição hídrica

representam um mecanismo de aclimatação ao déficit hídrico, cuja efetividade em

manter o fluxo de água na planta não foi comprovada.

A regulação da condutância hidráulica pelas AQPs pode ocorrer pelo nível de

expressão que determinaria a abundância de AQPs nas membranas, pela distribuição e

localização das AQPs após sua síntese, além da ativação do canal (HEINEN et al.,

2009). A abertura ou fechamento dos canais é regulada ativamente pela protonação do

resíduo H193, pela fosforilação dos resíduos S115 e S274 e ativadas por íon Ca2+

(NORDEN, 2012). Enquanto IACSP94-2094 não apresentou redução de Lpr e AQP%

sob déficit hídrico, IACSP97-7065 apresentou redução significativa de Lpr associado ao

decréscimo no controle do fluxo de água pelas aquaporinas (Figuras 11A,B).

Aparentemente, a maior sensibilidade de Lpr em IACSP97-7065 foi causada pela

redução do potencial osmótico da solução nutritiva e pela perda da regulação do

transporte de água via aquaporinas. Sabe-se que a Lpr sofre interferência de estímulos

ambientais, como a seca (EHLERT et al., 2009). Foi reportada redução de Lpr em raízes

de uva submetidas à seca (VANDELEUR et al., 2009). Essa habilidade de alterar o

fluxo de água em função de alterações ambientais sugere que a Lpr está relacionada com

a aclimatação das plantas ao ambiente (STEUDLE, 2000).

72

Para minimizar os prejuízos causados pelo déficit hídrico, a Lpr deve se ajustar a

demanda fisiológica de água da planta e as AQPs estão diretamente envolvidas com

esses ajustes (JAVOT & MAUREL, 2002). A coordenação entre as condutâncias de

raízes e estômatos resulta na regulação do potencial da água na folha da cana-de-açúcar

(TARDIEU et al., 2010). No entanto neste estudo não foi observada correlação entre Lpr

e gS após 48 h do início da restrição hídrica, pois ambos os genótipos apresentaram

redução em gS, porém apenas em IACSP97-7065 houve redução de Lp r (Figura 11A).

No entanto, o fechamento estomático foi menor em IACSP94-2094 (-35%) do que em

IACSP97-7065 (-50%), possibilitando a menor redução no fluxo de água para as folhas.

Portanto é provável que a redução em gS na IACSP94-2094 seja devido à sinalização

química, e não hidráulica (redução em Lpr). O ácido abscísico (ABA) é produzido nas

raízes e está envolvido com o fechamento estomático (ZHANG & DAVIES, 1987). Foi

detectado redução de 30% na gS, sem alteração no potencial da água na folha de cana-

de-açúcar, quando apenas metade das raízes foram expostas à seca, sugerindo que a

regulação estomática ocorre através de sinais químicos (SMITH et al., 1999). Como o

controle estomático é regulado tanto por sinais químicos quanto hidráulicos, nem

sempre a regulação estomática e Lpr se correlacionam, portanto há necessidade de mais

pesquisas a respeito da sinalização hidráulica raiz-parte aérea (MARTÍNEZ-

BALLESTA et al., 2003).

De acordo com MARTÍNEZ-BALLESTA et al. (2003), variações em Lpr e

consequentemente diferenças na condutância total da planta e também no status hídrico

foliar são características genótipo-dependente. No genótipo IACSP94-2094 não foi

observado redução de Lpr após 48 h do início do estresse, sugerindo que este genótipo

apresenta a capacidade de manter o transporte de água. Esta característica aliada à

menor sensibilidade da fotossíntese à seca (MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al.,

2013; SALES et., 2013) podem ser as bases para a manutenção do crescimento sob

déficit hídrico.

Apesar do maior acúmulo de H2O2 nas raízes da IACSP97-7065 após 48 h da

reidratação, é provável que não tenha havido redução de Lpr uma vez que houve

recuperação de (Tabela 1), pois não se sabe qual a concentração de H2O2 endógeno

necessária para desencadear o fechamento do canal das AQPs. Após 48 h da reidratação

a expressão dos transcritos de ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 em IACSP94-2094, foi

inibida (Figura 12). Essa inibição pode estar envolvida com a redução da

permeabilidade da membrana e a manutenção do status hídrico celular, sendo uma

73

estratégia de conservação da água (JANG et al., 2004). Este padrão de resposta estaria

associado com a menor abertura estomática de IACSP94-2094 na recuperação e não

afetaria de forma significativa (Figura 2C e Tabela 1).

Os resultados desta pesquisa indicam que os genótipos de cana-de-açúcar

apresentam resistência diferencial à seca, indicada pela menor redução no acúmulo de

biomassa da IACSP94-2094 em relação à IACSP97-7065 (Figura 13). A menor redução

no crescimento da IACSP94-2094 esta associada à maior capacidade de realizar

fotossíntese sob déficit hídrico e à manutenção da área foliar fotossinteticamente ativa e

do perfilhamento (Tabela 3). De fato, a manutenção das folhas verdes é um bom

indicador de resistência à seca em cana-de-açúcar (INMAN-BAMBER, 2004; SMIT &

SINGELS, 2006).

5 CONCLUSÃO

IACSP94-2094 é afetado mais tardiamente pela restrição hídrica e essa

capacidade é associada à manutenção na condutância hidráulica do sistema radicular no

início do déficit hídrico, sendo as trocas gasosas menos prejudicadas. A redução na

condutância hidráulica das raízes de IACSP97-7065 não é associada à presença de H2O2

nos tecidos. Embora o padrão de expressão de ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6

não justifique as variações na condutância hidráulica das raízes nas duas variedades

estudadas, a contribuição das aquaporinas para o fluxo de água radicular é mantida

apenas em IACSP94-2094. As respostas do sistema antioxidante na raiz variam entre os

genótipos, mas os teores de H2O2 permanecem inalterados em condição de déficit

hídrico. Em geral, as enzimas superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase são

mais responsivas ao déficit hídrico em IACSP94-2094.

74

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