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INSTITUTO DE PESQUISAS EMER6ETICAS E NUCLEARES
AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE DE SAO PAULO
60tf Kl TO DA RADIAÇÃO KAMA DC Co NAS PROTEÍNAS DO CRISTALINO
1XJLC1LA MARIA LESSA BERNARDES
Dissertação apresentadaccmo parte dos requisitospara obtenção do grau deMestre em TecnologiaIMuclear
ORIENTADORA: I)ra • NELIDA LÜC1A DEL MASTRO
BRD PAULO
J991
Ao Joáo Cesar
A meu pai
A minha mãe
Agradeço de modo especial è Dra.. Nèlida Lúcia Del Mastro,
pelo relevante papel exercido e«r> minha -formação profissional,
orientação desta dissertação, ensinamentos, estimulo e amizade.
Ds meus agradecimentos se estendem-.
Ao Instituto de Pesquisas Energéticas r Nucleares <SP), pela
possibilidade o-ferecida de realização deste trabalho;
A Coordenador ia de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino
Superior - CAPES, pela bolsa concedida;
Ao Pr. Byron A. 0. Bernardes, por introduzi!—mr no campo da
pesquisa,
A Drs. bortira Arezzo, peJo constante apoio e incentivo;
A Dra. Adelaide f-eljoni Alârio, pelas discussões p sugestões
durante» a realiíaçfto deste trabalho;
Ao Prof. Dr. L. J. üreene, do Centro Interdepartamental de
ünimic* de Proteínas da Faculdadp dp Medicina dR Ribeirão Preto
(UBP), pc?la colaboração nas análises;
Ao João f>p.sr, meu marido, pe)o carinho, apoio, incentivo e
compreensão durante todo tempo de-.-tícado a este trabalho;
A Nanei Passador, pela dedicação dispensada na diBitacao e
«ontagem desta dissertação»
Aos meus pais o amigos pelo constante apoio e incentivo»
Enfim, a todos que direta ou indiretamente colaborara* para a
realização deste trabalho.
RESUMO
60L'FEITO DA RADIAÇÃO GAMA DE Co NAS PROTEÍNAS DO CRISTALINO
DULCILA HARIA LESSA HERNARDES
Com intuito de estudar os efeitos da radiação gama de60
Co n*s proteínas do cristalino bovino foi rlaborado um sietem*
"in vitro'* . Para isso -forao utilizadas soluções aquosas de
cristalino bovino irradiadas nas doses de O, 5.000, iO.OOO,
15.000, £0.000 p B5.O0O By. Essa exposição ã radiação resultou m»
alterações nas proteínas avaliadas por diferentes métodos. A
trubidimetria revelou a formação de agregados que aumentam com a
dose de radiação; isso também foi observado através da
viscosimetria das amostras e do espectro de absorção na região do
ultravioleta. Pelas análises dos aminoácidos e por
fluori «net ria foi observado que o aminoácido mais afetado foi o
triptofano. Foi também observado um aumento de grupos SH livres
das amostras, corr.u conseqüência da irradiação.
Após a padronização do método foi testada a capacidade
radioffvodificadora da glutataona, do aminoeti1isotioureia, da
merraptoetilalanina e do dimetil sulfoxido neste sistema. Petos
resultados obtidos observou-s>e que na presença dessas
substancias o efeito da radiação foi amenizado.
ABSTRACT
6OtFFECl OF Co 6AMMA RADIATION ON CRYSTALL1N PROTEINS
DULC1LA MARIA LESSA BERNARDES
60In order to study the effects of Co gamma radiation on
crystal)in proteins an in vitro system was set up. For that,
aqueous solutions from bovine crystal 1 in were used irradiated
with 0, 5,000, 10,000, 15,000, £0,000 and 85,000 By. The
treatment led to protein alterations determined by different.
methods. By turbidinetry the formation of aggregates that
increased with the radiation dose was revealed. The same
observation was dont froir. viscosity data and from the UV
spectrum of the samples. From aminoacid analysis and fluorimetry
del prir.i nations, tryptoph*n appeared as the most sensitive
aminoacid. An increase in the free-SH-groups was also observed.
After the standardization o-f the method, the radiomodifier
capabi 11 ty cH glutathicne, aminoethy lthiourea, ir.err ap toethy lalanine
«\r»d dimethyl sul fox ide- was tested. The results showed that in the
presence oi those substances thp radiation effect was diminished.
Í N D I C E
PAG
1 - Introdução Oi
fc? - Hevisào da literatura
i*. i - Formação tia catarat& O4
Lv .£ - E f e i t o dê, rad i«*ç iâo i o n i z a n t e em p r o t e í n a s . . . . Otí
ü 3 - A n á l i s e s a b s o r c i o n t é t r i c a s n o u l t r a v i o l e t a . . . . 1 3
c? 4 - F1 uor i met r i a 15
E S - ViBcosiffietria 17
£?.6 - Açào dos r a d i o p r o t e t o r e s 18
:•: - Kfitèriaç. e Métodos
3 . i - Preparação das amostreis BA
3.S - I r r ad i a r ão PA
i!.3 - Herdada dn turbidér ic ia E5
3.4 - Tee.te> dAS substanciafr radioprotetc»raç> E5
H.5 - Determinação de grupos SH l i v r e s 85
:-i.í> - Determinarão do conteúdo p ro té i co E5
:•).'/ ~ t s p e r t r o tie abnorçao n& região LI. V V.L
3.B - Fluorioetri* 66
3.9 - Viscosiaietria BA
3.10- Aminograwa f*7
4 - Resultados
4 . 1 - fedida d* turbidancia 88
A.í? - Determinação de grupos SH livres 29
1.3 ~ Conteúdo protéir.o 31
4.4 - Espectro de absorção na região U.V 33
4.5 - F'luorj«r,ptrja 35
4.fc - Viscosimetria
4.7- Ami nog r ame 38
5 - Discussão 4J.
í, - Cone lusóes 49
7 - Bibliogra-fi& 50
i- INTRODUCM
Os efeitos biológicos das radiações tem sido objeto de
inúmeros estudos. Isto porque a radiação ao incidir em um
determinado sistema ou órgão, atinge simultaneamente muitos
outros que apresentam «aior ou menor sensibilidade. Podem, então,
surgir diversos tipos de lesões irreversíveis na maioria das
vezes. Na radioterapia de tumores de cabeça e de pescoço, uma
das lesões indesejáveis ê o aparecimento da catarata, já que ê
inevitável a irradiação da cavidade ocular.
Na catarata, o cristalino que normalmente é
transparente, torna-se opaco. 0 cristalino, tem duas funções
-fundamentais: modificar sua forma para alterar o foco da
lente num processo acomodativo e servir como filtro tía luz
ultravioleta.
A perda de transparência do cristalino se deve a
modificações oxidativas de sua* proteínas, que mostram um aumento
gradual dos níveis de agregação, pigmentação e uma diminuição de
grupo? tióís.
A radiação ionizante provoca «Iterações na estrutura
das suas proteínas,que sáo detectaveis pelas modificações em suas
propriedades químicas e físico químicas. Essas alterações eao
também observadas na velhice, embora em menor proporção (Spector,
1984). £m geral, é aceito que a opacidade das lentes seja o
último PASSO de ue. complexo processo, no qual • oxidado * o
•fator iniciador predominante.
fcm humanos, a dose li «ti ar de radiação para a formação da
catarata, parece ser alguns grays, em dose aguda. Doses
baixAç. podem produzir algum dano, Mas clinicamente
insignificante. Para doses de 8,5 - 6,5 By, o período latente
gira em torno d»? 8 anos; em doses de 6,5 - 11,5, e reduzido para
4 anos. Aumentos de doses resultam em menor período latente.
Além de se desenvolver após a radioterapia, pode haver
aparecimento de catarata em trabalhadores expostos a neutrons
durante as operações de cyclotrons e também entre os
sobreviventes de acidentes com reatores e explosões nucleares
CHall, 1978).
iodos esses -fatos demonstram a importância do
aprofundamento dos estudos sobre os mecanismos que conduzem á
•formação da catarata e os -fatores que possam influir no seu
aparecimento. Para isso é mister o desenvolvimento de métodos "in
vivn" utilizando animais dr experimentação bem como métodos "in
vitro" que permitam caracterizar os fenômenos envolvidos no
processo. Nesta última abordagem se baseia a presente
dissertação.
Cl presente trabalho tem como objetivo:
- elaborar um sistema in vitro , que possa ser utilizado
parei o estudo da formação da catarata induzida pela radiação
ionizante;
6O- analisar o* e-feitos da radiação • — ám Co* nas
proteínas «Ktraidas do cristalino, utilizando técnicas d»
•spcctrofotoawtria. fluoriMttria. viscosiactri* * analisv úm
aaiinoécidos;
-- testar, neste sistema, o potencial radiomodificador dft
substâncias presentes durante a irradiação.
3
£- HCtflSftO BÉ
ti J- EOCMCiQ dA CfttâXAte.
A formação da catarata está relacionada a agentes físico»
como luz solar, IUE ultravioleta» raios X e gama, a doenças como
diabete ou arterioscleroses agentes químicos como galactose,
e a efeitos bioquímicos por deficiências enzimâticas, algumas
das quais hereditárias (Ohoori ft Nose, 1989). E também
conseqüência quase inevitável do processo de envelhecimento.
Prova disto è a comprovação de que 50 % das pessoas com idade
Acima de 75 anos sao portadoras de catarata.
A catarata consiste na opaci-ficação do cristalino, que
é uma estrutura transparente situada entre o humor aquoso e o
humor vitreo. Tem a forma de lente biconvexa e apresenta grande
elasticidade que diminui progressivamente com a idade.
0 cristalino se constitui de três partes (Junqueira ft Carneiro,
19BB):
. as fibras do cristalino, que se apresentam sob A forma
de elementos prismáticos finos e longos. Sao células altamente
diferentes, derivadas das células originais da lente embrionária.
Essas células, perdem seus núcleos e alongam-se
consideravelmente. 0 citop1asma possui poucas organelas, e isso
rrduv & difusão da luz. As fibras da lente sáo unidas por
desmossomos e se orientam ea. direção paralela á superfície da
lente;a cápsula do cristalino, que se apresenta como um
revestimento homogêneo, hialino * «ais espesso n* face anterior
dessa et.trutura. E uma fermaçáo muito elástica, constituída
princjpalmnete por delgadas 1ameias de fibras colagenas,
-fortemente impregnadas por substância glicoprotèica;
. o epitélio subcapsular, formado por uma camada única de
células epiteliais dispostas na porcao anterior da lente. E a
partir desse epitèlio que se diferenciam as fibras responsáveis
pelo aumento gradual da lente durante o processo de crescimento
do organismo. Não existe epitélio na face posterior da lente.
Derivado do eetoderma, o cristalino nao contém vasos
sangüíneos ou nervos; o humor aquoso abastecido de compostos
nutritivos é que os transmitem para as células epiteliais da
lente.0 equilíbrio eletrolitico no cristalino, o qual corresponde
f\ baixas concentrações de sódio e cálcio e uma concentração muito
alta de potássio (Duncam & Jacobs, 1984), é preservado pelas
áreas tie junção entre as células (Benedettí et ai, 1984).
As lente<5 têm também desenvolvido um eficiente sistema para
prevenir oxidacao de sirupos sulfidri1icos, envolvendo £
plutationa (Yu, 1977; Reddy et «1, 1V75).
Durante a diferencja^én celular, proteínas permanentes
especi 4iccis da lente &'ào sintetizadas e altas concentrações
ri top] rHsmát i c S E ç,áo obtidas, cerca de- 0,Ü a 0,4 g/ml. Essa alta
rontentrscao produz um índice de refração adequado par» A
passagem óã lu?, pnqunnto que variações, na distribuição e
concentração dessas proteínas levam a um gradual aumento desse
indice (Delay* è Terdieti. 1988). D» acordo com Benectek (1984), a
transparência do cristalino se deve provavelmente a concentração
apropriada e distribuição dessas proteínas na lente.
Dos trabalhos feitos para elucidar as modificações
produzidas pela radiação nas proteínas do cristalino»
sabe-se que essas modificações sáo acompanhadas pela diminuição
das proteínas solúveis de baixo peso molecular, pelo aumento das
proteínas insolúveis e pela formação de agregados de proteínas
rorr. alto peso molecular (Spector et «1, 1974, Roy Ir Spector, 1976;
Coshlan ft Augusteyn, 1977).
Em cristalinos humanos, os agregados aumentam com a idade
e estão presentes em altas concentrações na catarata senil
(Jedziniak et ai, .1973). A formação de agregados depende,
tflmbéff., da oxidaçraci dos grupos SM das proteínas (Gibiin et ai,
1980), e do aumento intracelular da concentração de cálcio (High
Tower et ai, 1983).
Br a car. ao advento de- melhores técnicas de separação pars
isolamento e caracterização de proteinar,, alguns pesquisadores
(Spector et ai, 3v/i, Hanson ft Hines, iV66; Ocken et ai, 1977),
dividiram as proteínas do cristalino em três classes: alfa, beta
e gama cristalino. 0 efeito da radiação e de outros indutores da
catarata, dependerá da distrubuiçào espacial e do micro-ambiente
do» aminoáridos sensíveis á oxidação (cisteina, triptofano,
tirosina, hist.ídina e metionina) dentro de toda a estrutura do
cristalino. Embora a «strutura secundária das três classes d»
proteínas do cristalino» seja similar, sendo predominant»»ente
conformação "beta-sheet", diferenças significantes fora»
encontradas em suas estruturas tereiarias e nos micro-ambientes
ria ri st ei na e do triptofano (Liana ft Chakrabarti, 1V32;
Andley et ai, 1985).
Hã fortes indicações de que os mecanismos de formação de
catarata induzida pela radiação incluam a formação de radicais
livres e consequentemente dano oxidativo, tanto quanto
modificações na permeabilidade das células do cristalino (Lipman
et «1, 1968).
A oxidaçáo do cristalino induz "crosslinkins" e mudanças
conformacionais nas suas proteínas (Borkman et ai, 1V81;
Ziegler ft Goosey 1961). Os resultados encontrados por Ziegler ft
Goosey, JV31), indicam que as espécies ativas de oxigênio <0£,
DC, H2U2 e OH ), que sáo geradas nas reações de óxido-reduçao,
causar alguma*, modificações rias lentes, observadas na
e e na formação óa catarata (Dillon, 1984). Além disso,
alguns estudos espectroseópicos (Andley ft Chylack, 1986),
mostram que as proteínas do cristalino sofrem modificações em
sua conformação, pela ação dessas espécies, envolvendo resíduos
sulfidrilicos e de triptofano.
Efaitp úã ruHartp
U padrão geral de desenvolvimento do dano por radiação,
CM» 5ist «na5 biológicos» ocorre em 5 estágios (Bacq ft Alexander,
1961):
. a radiação ao passar pelo sistema, deposita energia;
. parte dessa energia é usada nas alterações químicas de
alguns constituintes, e parte è dissipada na forma de calorj
. a maioria dessas reações podem ser insignificantes, mas
algumas delas, chamadas lesões radioquimicas primárias, ocorrem
rm pontos vitais da célula agindo como foco de desenvolvimento
do dano;
apôs um certo período, lesões bioquímicas podem ser
observadas;
. essas lesões bioquímicas levam a lesões biológicas.
A radiação age sobre as protrinas de forma direta ou
indireta, causando alterações que podem ser avaliadas por
critérios bioquímicos ou fisico-quimicos.
A açào direta è a interação da radiação com a molécula
alvo (proteína), diretamente (Hall, 19768). Essa interação se dá
pela absorção de energia pela molécula, causando excitaçáo ou
ionizaçiáo. Subseqüentemente, essas moléculas excitadas ou
ionizadas sendo instáveis, tendem a sofrer rearranjos intra e
íntprmoleculares. A última etapa de transferencia de rner&ia p<r.
moléculas irradiadas é a formação de moléculas estáveis, que
e
podem levar à perda da atividade biológica da proteína (I
1963).
As alterações podem ocorrer na estrutura prinária, pela
destruição de aminoâcidos. Análises químicas demonstram que os
diferentes aminoâcidos não são igualmente susceptíveis ao dano
por radiação. No caso da soroalbumina, por exemplo, há uma
relação linear entre a dose e a percentagem de aminoâcidos
alterados. Contudo, a susceptibi)idade dos diversos aminoâcidos,
tais como a cisteina, aminoâcidos ácidos, triptofano, histidina
prolina, arginina e aminoâcidos básicos, é insuficiente para
explicar a denaturaçào (Brosh ft Hopwood, 1979).
Podem ocorrer também quebras das ligações - C - N -,
produzindo os grupos carbonila e amida, durante a irradiação na
presença de oxigênio como conseqüência da -formaçàn de
peróxidos; sendo assim o número de grupos carbonila aumenta bem
como a destruição de aminoâcidos (Alexander ft Lett, 1967).
D processo de? absorção de? energia da radiação pode
resultar tambéiT. em «-.Iterações da estrutura secundária da
proteína. Isso pode ser observado pelas modificações na
reatividade dos aminoácido& da cadeia lateral, que levam #
ripnaturaçáo da proteína (Alexander ft Lett, 1967).
D primeiro estágio de denaturaçáo por irradiação de
proteínas, produz uma diminuição na constant? de sedimentação,
sem significar um aumento do peso molecular. Este fato se deve a
um relaxamento dô molécula, qu* se torna menos compacta.
Acredita-se que haja quebra de diversas pontes de hidrogênio.
Neste estádio, man ten sua solubil idade ee. água e se torna «ais
termolâbil. Com uma segunda ionizaçáo, «s moléculas jâ totalmente
abertas começam a formar agregados por "crosslinking"
jntermolecu)í>reE. A molécula nao ê mais solúvel em água e sim em
soluções salinas. Em doses maiores de radiação, se torna
insolúvel (Bacq ft Alexander, iVé»i>.
A ação indireta sobre as proteínas ocorre através da ação
ri«m p&pécies reativas formadas pela interação ú* radiação com o
solvente (Hall, 1978). Vir.to ser a água o principal solvente nos
niEtemas biológicos, ela esta envolvida na maioria das reações.
DE estudos da ação indireta s>ao realizados em soluções diluídas,
onde & probabilidade da ação direta sobre o soluto è pequena
<Buxton, 198B).
A acao dfi radiação sobre as moléculas de água, resulta em
excitaçao, ionizaçac» ou superexcitaçáo das moléculas. Na reação
primária, são formados DS radicais livres hidroxi)a (0H*>,
hjdroe»#nio (H" >, o e>)êtron hidratado (ê aq) e o superòxido <0Í >
(Hagee ft Chatterjee, í VRO) ts&es processo?, ocorrem em pequenos
volumes, com raio aproximado de 15 A. A recombinação desses
radicais, resulta na formação de HS, HÍ20P e H30 (Alexander ft
Lett, 1967i Pryor,iV77). Na presença de oxigênio, ê aq e H'
m rapidamente,resultando 05 e HOL' .
A presença tie substancias orgânicas estranheis,
geralmente protege a solução de proteínas pois removem
.10
rompetitivawente os produtos da radiolis* da água.
O oxigênio também pode se combinar com radicais da
proteína e alterar qualitativamente os produtos radioquimicos
•formados (Brawler »t ai, 1978). Na presença de oxigênio, a
proteção por compostos sulfidri 1 icos pode ser prevenida, pois a
reação com 0L' ocorre mais -facilmente do que o processo de
transferencia de hidrogênio. Como hã -formação de moléculas
oxidadas, na presença de oxigênio, este tem a propriedade de
fixar o dano (Singh ft Singh, 1982).
Na ação indireta da radiação, a inativação está
rxponencialmente relacionada á dose. Como na açào direta, somente
UM único evento parece ser necessário par» ínativar a proteína
(Alexander ft Lett, 1967), havendo freqüentemente modificações
na sua solubi)idade. Na denaturação.os radicais; livres produzidos
HA radio)ise da água causam mudanças na forma da molécula de
proteína, facilitando consequentemente, o processo de agregação,
liando origem a estruturas de diferentes pesos moleculares
(Barrison, 1987>. fcsses agregados sáo produzidos por crosslinking
row*lente , roae sua natureza química é desconhecida.
A agregação causa modificações, na absorção da solução de
proteínas., que são observadas a partir de mudanças no espectro de
absorção na região ultravioleta. A quantidade de luz absorvida
pela r.oüuçião tít proteína será aumentada pela presença de
agregados (Garrison, 1987).
Co* o aumento da dos» de radiação, nao só a fração d»
proteínas denaturadas aumenta, «as também o tamanho dos agregados
formados torna-se maior, até atingir um ponto em que a proteína
torna-se insolúvel e precipita.
A -formação de "crosslinking" afeta o peso molecular d*
proteína, &umentando-o. Isso pode ser observado pelo aumento da
vi se05idade com o aumento da dose de radiação.
Os agregados podem ser quebrados pela exposição, durante
algumas horas, a ácidos ou álcalis, mas nem uréia nem sais,
Promovem a dissociação. Isto sugere que as ligações responsáveis
pela manutenção dos agregados não são pontes de hidrogênio, e sim
ligações covalent.es que não são hidrolisadas.
A rôdiossensibi)idade de> diferentes aminoácidos em
soluções diluídas varia enormemente, mas não mantém relação com a
relativa taxa de destruição dos vários resíduos de aminoácidos
nas proteínas. Essa radiossensibi 1 idade varia dr? proteína para
proteína, possivelmente por causa de fatores estêricos. Os grupos
localizados fora da molécula de proteína, por exemplo, são mais
vulneráveis que aqueles no seu interior (Alexander ft Lett, 1967).
Um outro fator importante na ação indireta da radiação, é
o pH. Da mesma maneira que na ação direta, a influência do pH
podo ser entendida como conseqüência de mudanças na forma e
configuração da molécula de proteína, o que conduz a maior
exposição rios sítios críticos .
A absorção da energia radiante nas regiões do espectro
visível e ultravioleta depende do número e do arranjo dr»s
rlêtrons. nas moléculas ou ions absorventes (Ewing, 1V7S).
Compostos totalmente saturados não mostram absorção seletiva
nas regiões do visivel e do ultravioleta. Compostos que contém
uma dupla ligação, absorvem fortemente no ultravioleta afastado.
As> duplas ligações conjugadas produzem absorção em comprimentos
de onda maiores. Quanto mais extenso for o sistema conjugado,mais
longos serão os comprimentos de onda onde se observa a absorção.
0 comprimento de onda de absorção máxima de um composto,
fornece um meio de identificar o cromóforo que ele contém. Em
geral, os espectros são modificados pela presença de vários
grupos atômicos, quando substituem os átomos de hidrogênio nos
carhonos do sistema cromóforo. Tais substituintes tem, em
geral, o efeito de deslocar as bandas de absorção para
comprimentos de onda mais longos e mudar seus valores de
ansorváncia. Us substituintes que produzem esses> efeitos são
conhecidos como auxócromos (Ewing, 197S).
Em compostos arométicos, o anel benzénico é o cromóforo
«r.Ais sir.píes. Dois ou mais anéis em conjugação, como o naftaleno
F? o difenol, deslocam a absorção p&r& o visível (Donovan, 1969).
0 espectro de absorção no ultravioleta e no visível
constituem um instrumento na identificação de compostos orgânicos
.13
insaturados e na elucidação de suas estruturas. Uma informação
relativa a um composto de estrutura desconhecida pode, algunas
vezes, ser obtida através da comparação direta de seu espectro de
absorção com os de compostos de estrutura conhecida.
A absorção espectrofotométrica de perturbações nos
rromòforos das proteínas tornou-se um método valioso para a
determinação de certos aspectos da conformação da proteína nativa
f? denaturada em solução. Essas perturbações (Donovan, 1969),
podem ser divididas em duas classes.- aquelas produzidas por
outros grupos na proteína, e aquelas produzidas por moléculas ou
ions adicionados ã solução de proteínas. Quando essas
perturbações, srio observadas, modi -f i caçoes conformacionais ne
Proteína, podem ser detectadas pela medida de rotação óptica,
rticroisffio celular, ressonância magnética nuclear ou viscosidade
intrínseca (Donovan, 1V69).
Freqüentemente s.So notadas diferenças entre a absorção
ultravioleta de uma proteína e a absorção calculada para a
proteirti com bast eir, análises químicas cuidadosamente feitas, dos
Aminuácidor. cromo-fòricos.. Essas diferenças são uma medida das
interações inter e intramolecular dos cromóforos com seu
f.mbiente. Quando essas interações sáo alteradas, sáo observadas
modificações na absorção.
A absorção na regi an do ultravioleta, de uma proteína, e
ronr.£?qutncis de seu conteúdo de certos aminoácidos aromáticos,
principalmente triptofano e tirosina (Kabat ft Mayer, 1967).
14
As proteínas «ostra* absorção característica entre £70 e
c*V0 nm, com absorção Máxima em 280 na>.
B.4- El
A fluorescéncia é um dos -fenômenos pelo qual moléculas
excitadas perdem energia. Durante o processo de excitacao. a
maior parte das moléculas afetadas adquire energia vibracional e
também eletrônica. Sua principal tendência è passar para estados
vibracionais interiores através de colisões. Na fluorescéncia,
essa perda de energia cessa em um nível eletrônico excitado,
consequentemente, as moléculas estarão aptas a voltarem
diretamente ao seu estado -fundamental pela radiação de um quantum
de energia (Ewing, 1972).
A -flunrescéncia ocorre principalmente em duas classes de
substancias- uma grande variedade de minerais e -fósforos
inorgânicos e compostos orgânicos ou organometalicos que
apresentam grande absorção no ultravioleta.
Na fluorescència de proteínas, contribuíçõe*
si gr» i -f i cantes no espectro de» emissão são dadas pela tirosina e
pelo triptofano, que exibem espectros de fluorescéncia
distintos.E bem conhecido que o triptofano domina a fluorescencia
da proteínas que possuem alguns triptofanos, mas a fluorescéncia
da tirosina é também observada, particularmente naquelas
proteínas que não contém triptofano. Srgundo alguns altores, a
.15
fluoreseéncia metciM do tripto-fano varia de proteína para
proteína (Chan »t al. 1969).
A iluorescencia pode ser medida através de dois
espectros, um de excitaçao e u» de emissão. O espectro de emissão
descreve a distribuição do -fóton na 4 luorescencia de uma
substancie excitada por luz monocromática. Similarmente, o
espectro de excitaçãr> è obtido pela variação do comprimento de
nnda de excitaçao, roantendn-se constante o comprimento de ond£ de
emissão.
A intensidade da iluorescencia de moléculas orgânica é
marcadamente dependente do tipo de solvente empregado. Isso pode
ser atribuído ao fato de que o período de -fluorescencia seja
longo o bastante para que ocorra interação do estado excitado com
as moléculas do solvente. Esse efeito do solvente na
Í)uore5céncia, pode ocorrer se há pontes de hidrogênio, reação
química, ou alguma outra interação especifica entre o solvente e
o so)uto (Chen «t al, 1V69).
As, proteínas, mostram grandes varia toes. em su«
estabilidade. As condições para a integridade estrutura), deve
ser estabelecida para cada proteína no que diz respeita
variáveis comumente empregadas, tais como pH, temperatura e
reagent es denatur antes. A -fluorrscenc ia nisto é necessariamente
constante naquelas proteínas que parecem ser susceptíveis a
modi-Hcaçoes dessas variáveis (Chvn »t al, 1969)
A redução n* intensidade da fluorescencia é chamada
fujpressão ( "quenching* >. Esta supressão pode ocorrer
simplesmente» conto resultado da absorção parcial da lut
fluorescente por algum componente da solução. Se, a substancia em
si for responsável por essa absorção, o fenômeno é conhecido COMO
auto- supressão. A supressão também pode ser atribuiria ã
possibilidade de transferencia da energia por colisão de
moléculas excitadas da substancia fluorescente com a molécula do
solvente ou de outros solutos, resultando um mecanismo paralelo
mr.s não radiante para voltar ao estado fundamental (Ewing, 1V7P).
e .5- UiKOftietttCift
ViEcosJdade de um* fluido ê a propriedade pelo qual ele
rpsiütE- a uma modificação na forma ou no movimento de- porçõe*
vjzinhris da molécula em relação a outras, sendo sus reciproca a
•flu ide 2 A viscosidade representa « fricção interna entre as
moléculas.
lintre as técnicas físicas usadas para a deter ir. inação do
tamanho e da -forme d* proteína, a viBCoaimetrie ê a mais simples
rfss ir.RdjdAç., niso çpndo um método absoluto (Bradbury, JV70) .
A viscosidade intrínseca está relacionada ao peso
molecular tia polímeros pela equação empírica de Mark-Houwink:
C n 3 - K Ma
17
onde H e « sáo constantes» independentes da concentração e do
peso molecular, mas variam com a temperatura e com o solvente
usado. Essa equação è muito usada na determinação do peso
molecular e o expoente a è dependente da -forma e solvatação da
macromolécula.
A viscosidade è dependente da temperatura. 0 efeito
observado com o aumento da temperatura pode ser uma diminuição da
viseosidade, nenhuma modificação, um aumento da viseosidade
ou a ocorrência de um piato (Bradbury, 1970).
A viecosimetria tem sido utilizada em experimentos que
envolvem quebra de moléculas grandes em unidades menores, ou
naqueles envolvendo reações acompanhadas por agregação. Em al&un&
estudos, a determinação da viseosidade tem servido no controle da
degradação de substancias biologicamente ativas. A depradaçáo
resultante de tratamentos drásticos, resulta numa diminuição
Acentuada da viseosidade. Quando proteínas nativas sao
denaturadas por vários tipos de tratamentos, um aumento na
viseosidade é observado (Kabat, 1967).
das
Substancias radioprotetorar, sâo agentes químicos que
reduzem ou previnem os efeitos das radiações, quando presentes no
sistema durante a irradiação.
As teoria?, de proteção à radiação podem ser consideradas
Í0
tanto a nível molecular CORNS a nivel fieiológico-bioquimico.ou
se.ia, mecanismos de proteção envolvendo processos químicos de
inirio rápido e aqueles em que a proteção ê resultado de mudanças
na bioquímica ou fisiología da célula. Do ponto de vista da
química da radiação, os compostos protetores parecem agir por
participação direta em reações de radicais livres.
0* mecanismos de proteção química contra o dano da
radiação ionizante, levam em consideração 3 hipóteses: seqüestro
rte radicais ( "radical scavenging" >, reações de transferência de
hidrogênio e -formação de dissulfetos mistos (Biambarresi •
Jacobs, 1987).
Radical Scavenging
Lssc< teoria em radioproteçâo, envolve -fundamentalmente o
efeito indireto tis radiação, ou seja, a interação da radiação
Joni7ante> CO.T sistemas biológicos aquosos. Esta teoria se refere
ã capacidade dos radioprotetores, dp removerem os produtos
altamente» reativos da radio)ise da água, antes que eles reajarr.
com moléculas biologicamente importantes (Bacq flr Boutier, 1967;
Fabríkant, 197tí).
Lsse processo ê uma reação de competição entre os
radioprotetores e as espécies ativas de oxigênio, pelas moléculas
biolngicas. U rartioprotetor reduz a concentração de radicais
)ivrt-s na soluçán, protegendo os alvos biológicos (Klayman Ir
Copeland, 19BE).
Nos seres vivos, quando moléculas de água sao irradiadas,
uma grande variedade de radicais sao produzidos, entre eles
incluem-se o radical hidroxila <CH*>, o elétron hidratado (ê aq>,
o radical supero*ido (OÍ ) e o radical hidrogênio (H* ). Dessem, o
DH" e o ê aq sao produzidos em concentrações mais altas, e o DH*
è considerado o mais danoso (Chapman ft Reuvers, 1977; Cxapski,
1984).
. Doação de hidrogênio
Consiste num processo de reparo rápido, pelo qual um
átomo de hidrogênio é perdido da molécula biologicamente
importante (Copeland, 1987). Isso se dá pela absorção direta da
energia da radiação:
R — H Ar._-> R- + H'
ou via reação indireta com radicais livres:
0H- 4 K — H -» R' + H20
ou por doação de um átomo de hidrogênio por um protetor
sul-fidrilico (P — H) .
. Formação de dissulfetos mistos
teor is sò sr> aplica a racli oprotetores contendo
enxo-fre e involve a formação reversível de lipaçoee
riis&ulfidríca& entre os grupos txóis d« proteína e do
SC)
radioprotetor (Eldjarn A Pihl, 1956). Essas ligações preserva* «
integridade da proteína, alterando sua radio&sensibílidade
intrínseca, segundo as equações:
proteína —- SH • RSSR •» proteína — SSR • RSH
proteína — S — S — proteína + HRSH • Sproteina — SSR
A grande maioria dos agentes radioprotetores sãom
aminntiõis. São os mais efetivos radioprotetores conhecidos.
Dentre os aminotiôis, os mais representativos sao a cisteina, a
mercaptostilalanina e o aoinoeti1isotiourèia (Biambarresi A
Jacobs, 1987).
Embora a proteção conferida por essas drogas seja
significativa, o maior obstáculo para sua utilização em humanos,
ê a sua estreita faina terapêutica. Elas protegem somente rr
doses que são tóxicas para o organismo. Entretanto, essas
descobertas contribuíram significativamente para o
desenvolvimento de» novas substancias, pois promoveram o
entendimento das raracteristicas estruturais que sao necessárias
P*ra a proteção pelos arr.inotióis (Brown, 1967; Brown et ai.,
1988). Foi determinado que para uma considerável proteção, a
substancia deva ter um grupo SH livre separado de um grupo amina
fortemente básico, por náo mais do que 3 átomos de carbono (6rosh
ft Hopwood, 1979). Atualmente, estão sendo desenvolvidas novas
substancias com essas características, dentrp as quais cabe citar
o» derivados, do árido for.forotiòíco (Yuha», 1970; Yuhas et «1.,
El
1980)
Os radicais livres, além de serem fornados na radiólise
rta água, sáo também produtos de diversos processos fisiológicos,
tais c o w respiração e in-flamacão (Henegnini. 1V87) Por isso, o
organismo possui mecanismos antioxidant.es enzimàticos e não
vnzimáticos de de-fesa, para neutralizar esses radicais.
Nos sistemas enzimàticos incluem-se as peroxidases, a
catalase e o superóxido dismutase.
A çiltitationa peroxiriase, por exemplo, converte HcíO2 a
via oxidacào da glutationa (LaMrence ft Burk, 1778) e, da
maneira que outrss peroxidases, pode também metabolizar
hidroperòxidos lipidico<3 a gorduras não reativa?.
A catalãos, outra enzima que remove HSOK, catalisa a
redução de Hc*OE a água. Assim, a g)utstiona peroxidase e &
cat a) ase, eiti conjunto , diminuem a concent raçào de HSUE que-, SE
náo degradada, pode produzir radicais mais potentes (Giambarresi
it Jacobs, 19B7).
agem rc conjunto com a superóxido
dismutase, e e^sR é o meio primário pelo qual o ánion superóxido
é eliminado do<? sistemas biológicos. A supernxido dismutase
catalisa a conversão dR DÍ a HEOff e oxigênio (Ptfcan, 197B; Br«mm
ft Frídovich, J.9B0) .
Hntre os compostos náo enzimát icon., inrluem-se:
Pt1
. a glutationa (L - gama - glutamil - L - cistenil -
glicina), que é o principal radioprotetor endõgeno pela sua
capacidade de desintoxicar o organismo das espécies reativas
geradas pela radiação (Heister ft Tat», 1976; feister, 1981).
. as vitaminas A (beta - raroteno), C (ácido ascôrbico) e
E <tocoferol>,que são scavengers de radicais livres (Davidson »t
«1., 19Bü; Seifter et ai., 1962; Sr in i vasa et el.» 19FJ3)
c nrTíinnn
3.1- Praparacao da solucfto protéica
Us cristalinos -for*» removidos cirurgicamente de olhos
bovinos frescos, obtidos em abatedouro. Apôs serem
descapsulados, -foram homogeneizados era ã9ua bidestilada • Og C (E
gr cristalino / 5 «1 ãgua>, em um homogeneizador Pot te»—
II1 ve?he\j em, err. banho de gelo. A solução foi centrifugada a 13.000
rpm/ 30 minutos, em uma centrifuga refrigerada SOftVALL mod. RCB-B
à 4 Q C. AO sobrenadante foi acrescentado N-eti1maleimide (Sigma)
nume concentração final de 10 mM. A solução foi dializada em
tampão fosfato de* potássio 0,1 M pH 7,4. Este material foi
)io-'ilizado e estocado em dessecador a - 1 8 Q C.
3.E- Irradiação das amostras
Alíquotas da solução fora ir. submetidas a irradiação de60
L.D (CSamniàcell EP.Q, Atomic Energy of Canada, Ltda), nas doses de
0, 5.000, 10.000, 15.000, E0.000 e £5.000 6y, numa taxa de dose
mt-di* He B51 By / hora, em tubos de vidro. A câmara de irradiação
da g&inmate)) P.BO tem dimensões de 15,4Vcm de- diâmetro por é*0,47rm60
He altura. A fonte dr Co propriamente dita, está localizada no
centro da blindagem de chumbo, consistindo de t?6 lápis com 7
pastilhas de robalto Isto faz com que a amostra seja irradiada
3.3- fedida da Turbidancia
A medida da turbidancia foi realizada em um
espectrof otòa»etro Carl Zeiss mod. PMQ II, num comprimento de
onda d» 6OO nn, em todas as amostras, diluídas 1/iOO.
3.4- Test» das substâncias radiooodificadoras
a padronização do método, foram testadas as
seguintes substancias:
. g)utationa(gama-g)utami1-cistenil-glicina) - 6SH(Sigma)
. #?-aroinofi?t ilisotiourêia - AET (Sigma)
. mercaptoetilalanina ~ MEA (Sigma)
dimeti) sulfóxido - DMSO (Merk)
ll&tas nubstancias -foram acrescentadas, aproximadamente 10
nánutos antes da irradiação, numa concentração final de J.O mM.
3.5- Determinado de grupos SH livres
f'«rfl determinar grupamentos SU livres que podem se formar
durante a irradiação pela quebra de pontes S S, empregou-se o
método df» E'. 11 man (1959), ondr se usa a cisteina rocio padrão de
dosagem.
3.6- Espectro de absorção na reaiáo U.V.
l-oj determinado o espectrc) de «bsorçào entre S40 e 350
run, com o intuito de observar as possíveis alterações estruturais
da proteína, apôs a irradiação. As leituras foram realizadas em
um espeetrofotòmetro Carry, mod. 11B, nas amostras diluídas i/10.
3.7- Determinação do conteúdo protéico
O conteúdo protéico das amostras, foi determinado segundo
o método descrito por Lowry e modi-ficado por Killer (1959),
utilizando como padrão de dosagem soroalbumina bovina.
3.8- Fluorimetria
iodas as medidas de fluorescéncia relativa, foram obtidas
um espectro*otõmetro de fluorescéncia Perkin Elmer, mod. MPF-2A,
equipado com lâmpada de xenònio de JSOW.do Instituto de Química
ria ur.P. A excitaçao foi fixada em £?60 n«i, e fez-se o espectro
de emissão de £90 a 450 nm.
3.9- Viscosimetria
medir e vjfic.osidade, utilizou-se um viscosimetro
Brcokfield df? leitura digital, mod. DV-11, spindle SC4-18/13R
ei if rmp, CO.T adaptador para pequenas amostras, com banho
termostatizado de -30o C a 130Q C Neslab RTE-11O (Neslab
Instruments l.tda Newington, USA), calibrado contra fluido padrão
de silicone de 5 centipoise (densidade D,9L'0> e 10 centipoise
(densidade 0,940) a é?5a C da Fírookfield, segundo normas da U.S.
National Bureau of Standards.
3.10- teinoar
A análise de aminoàcidos foi realizada no Centro
Interdepartamental de Ouimica de Proteínas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP, pela equipe do Dr. Greene após
as seguintes hidrólises:
. com LiOH 4N para o tripto-fano, por S4 horas a 110o C.
. com HC1 6N por £E horas, ã mesma temperatura para os
demais aminoãcidos.
£7
4.1- Ftedida da Turbidancia
(Is resultados obtidos na medida da turbidancia da -fração
solúvel das proteínas do cristalino bovino ã 600nm, sao
demonstrados na figura 1.
60As amostras de cristalino bovino irradiadas com Co
apresentam um aumento da turbidancia com o progress;ivo aumento da
dose de radiação, numa relação aparentemente linear em relação ao
controle nao irradiado.
Nas amostras em que se acrescentou as substancias
radiomodi*icadoras, nota-se uma aparente proteção dessas
substâncias, em relação ao controle irradiado. A glutationa
apresentou um índice de proteção de 65K; a mercaptoetilalanina de
(>0% -, o diroeti) su)fóxjdo de t»95í; e o aminoeti 1 isotiouréia de 3VV,
FT. relação aos valores tic dose de £5.000 Gy.
Figura f- Medida de turbldâncla è OOOnm
OomtOyiO MET A H£A x DKtaO
4.8- Brutos 8H livres
Imediatamente apôs a irradiação, -foi realizada *
determinação de grupos SM livres de todas as amostras pelo método
de Ell man (J959), utilizando cisteina como padrão (tabela i).
Os resultados apresentados nas tabelas 8 e 3, indicam que
nas amostras náo irradiadas há ausência desses grupos, sugerindo
que, os grupos SH foram eficientemente bloqueados pelo
N-et ilmalpimjdfc. Com o aumento da dose de radiação, essas pontes
sáo quebradas, e há liberação desses grupos, que aumentam com a
dose de radiação. AR amostras irradiadas na presença de DMSO,
apresentaram um comportamento semelhante.
Nas amostras irradiadas com GSH, AET e MEA, os controles
não irradiados possuem alta concentração de grupos SK que
F.o-frem diminuição com o aumento da do&e de radiação. Assim, OE
valore?» para a dose de S5.000 6y, -ficaram reduzidos 4,8, 3,4 e
S,3 vpzes para o MEA, BEH e AET, respectivamente.
Tab»la 1 - Curva padrão para a determinação de grupos SH l i
concentração de absorvância-3
eisteina CxiO M) a 4iSn*
5,00 4.98 +/- 0.008
c»,5o e.ie • / - o.oos
1,67 i.37 •/- 0,006
i,85 1,03 +/- 0,006
1,00 . 0,70 +/- 0.001
O,83 O,55 •/- O.OO4
tabela 8- Valores de absorvância * AiEna* para an amostras de
rristalino bovino, segundo o «etodo de Ellamn.
Dose Controle DMSO BSH AET «EA<Gy)
0 E,05+/-0,07 1,90+/-O,01 e,05+/-0,07
M 0,3S+/-0,01 0,34+/-0,0i l,BÍ>+/-0,0í J,79+/-0,0S i ,88+/-0,01
10 0,49+/-0,01 0,33+/ 0,01 l,3tí+/--0,01 l,69+/-0,01 l,65+/-0,01
i?> (>,V5+/-0,01 O.7A+/-0.04 l,84+/-0,04 l,48+/-0,01 1.31+/-C01
80 i,17+/~0,03 0,91+/-0,0.l 0,9í3+/-0,07 l,B3+/-0,01 0,70+/-O,Oi
Í?S J,90+/-0,0í l,05+/-0,07 0,60+/-0,0i 0,B9+/-0,0J 0.44+/-0.O1
Tabela 3- Concentração -final de SH livres, nas amostras de
cristalino bovino <Y^ax+b,onde a * 1,04 e b * -0,299»
Dose Controle DMSO BBH AET ME A<Gy)
0 2,26+/-0,3 2,li+/-0,2 2,26+/- 0,3
?> 0,59+/-0,2 0,M+/-0,2 2,08+/~-0,B S,00+/-0,3 2,09+/-0,2
10 0,76+/-0,3 0,79+/-0,2 l,56+/-0,2 1,91+/-0,2 1,88+/-0,8
15 j,^O^/-O,e 0,99+/-0,3 l,4B+/-0,4 l,71+/-0,2 1.54+/-0.2
EÜ l,41+/-0,3 l,.lí>+/-0,e l,20+/-0,3 i,47+/-0,B 0,96+/-0,8
í'5 í!,ii+/-0,e l,29+/-0,3 0,86+/-0,E l,i4+/-0,2 0,7J+/-0,2
4.3- Espectro de absorçio na regi2o ultravioleta
NH tabela 4, são apresentados os valores de- absorção
máxima (S8Ü nir.) e mínima (Sr»O rim), das amostras de cristalino
bovj no.
Ubsprva-se- q<ie nas amostras controle, ocorre um aumento
da absorção com o aumento da dose de» radiação. Na presença das
substancias radiomodi-fícadoras, esta correlação, porém não é
mantida.
Tabela 4- Máximos e mínimos no espectro de absorção na região
ultravioleta, das amostras de cristalino bovino.
tiadiomndi -f icador Dose (By) Máxima (880 nm) Minima (850 nm)
controle O
5.000
10.000
15.000
RO.C00
es.ooo
1,189
1, £39
1,357
1,688
i,B££
S,000
0,57£
0,616
0,898
0,719
0,907
1,100
DMSO 0
5.000
10.000
15.000
c»0.000
£5.000
1,617
1,707
1,417
1, BOB
J., 904
1,763
0,741
0,605
0,691
0,883
0,950
0,944
GSH 0
5.000
10.000
15.000
£0.000
f.'5 00,')
i,7eo
1,075
1,400
1,49K
1, 778
1,712
0,B5R
0,539
0,709
0,787
0,943
0,986
(cont
3P.
AET O 1,665 0,778
0,890
1,040
1,187
í ,884
1,764
MEA 0 1,686 0.794
0,678
0,846
0,886
0,989
1,110
0
5.000
10.000
15.000
cíO.000
85.OOO
0
5.000
10.000
15.000
eo.ooo
£fi. 000
1,665
1,738
1,878
1,995
2,068
8,917
1,686
i , 407
1,746
1,779
1,898
í, 978
4.4- Cont«údo protéico
A curva padrão de soroaibumina bovina para a dosagem de
proteínas, é apresentado na tabela 5.
Nos resultados apresentados na tabela 6, nota-se que com
a irradiação ocorre uma diminuição da concentração dR proteínas.
33
Tabela 5- Curva padrão de soroalbunina bovina para a dosapem de
proteínas.
concentração de leitura ã
padrão <>ig/200ml) 6S0nm
E00 0,806 +/- 0,01
100 0,430 +/- O,O£
50 0.B23 +/- O,OI
í» 0.119 +/- 0.01
1E.5 0,058 +/- 0,0e
Tabela 6 - Conteúdo protéico das amostras de cristalino bovino
irradiadas <Y~ ax + b, onde a» 0,004 e t>=- 0.017B).
Dose < By >
0
fí. 000
10.000
15.000
eo.ooo
t.'S. 000
Leitura a
0,370 +/-
0,EZ7 • /-
0,175 +/-
o,i4e +/-
0,135 +/-
0,11V -f/-
0,03
0,03
o,oe
0,03
0,0*
0,0c»
tprotD
441 +/-
£6£ +/-
19B +/-
ISA •*•/-
14B +/~
1£!B +/-
<>-
3,
3,
0,
3,
0,
0,
g/ntl)
B
£
7
e
7
7
4.5- Fluorimetria
Os resultados encontrados para a medida de intensidade de
fluorescent:ia das proteínas do cristalino bovino irradiadas, sao
apresentados na tabela 7.
Na amostra controle e nas amostras com DM50, nota-se que
houve um acentuado decréscimo da -fluorescénc ia com o aumento da
dose de radiação.
As amostras irradiadas com 6SH, AET e MEA mostram também
um decréscimo da -fl uorescénc ia com aumento da dose de radiação,
«as náo tão acentuado quanto nas amostras controle ou com DMBO.
Tabela 7- Medida fluorimétrica das amostra de cristalino bovino.
Excitaçao: ££>0nm; Leitura: 340nm.
Dose <6y) Controle DM50 DSH AET MEA
0
í>. 000
10.000
Í.5.000
£0.000
H5.000
B2+/-i,4
50+/-1,4
33+/~l,4
ai+/-e,i
.L6+/~0,7
11+/-0.7
94+/-Ü,7
51+/-0.7
38+ /-0, «7
c»8+/-C>,3
17+/- 0,4
ic?+/-0,3
98+/-1,4
73+/~t!,tí
64+/-0,7
sy+/-3,5
47+/-3,&
36+/-0,9
93+/-&,
71+/-0,
6O+/-2?,
56+ /~'d,
4B+/-0,
33-fV-c',
8
9
3
7
9
7
85+/-0,9
76+/-3,5
64+/-3,0
R4+/-g,7
43+/-i,5
34+/-i,i
4.6- ViscosiMtria
Nos resultados apresentados na tabela 8, observa-se que
nas diferentes temperaturas, a viscosidade da solução de proteína
aumentou com o aumento da dose de radiação. Entretanto, com o
aumento da temperatura ( 8 , 5 D C - SOoC), a viscosidade diminuiu
(Tabela 9 ) . Nas amostras com as substancias radiomodificadoras,
são observados resultados semelhantes, mas o aumento è menor.
Tabela 8- Valores da viscosidade em centipoise (CPB), a
diferentes temperaturas, das amostras de cristalino
bovino irradiadas
Radiomori.
controle
DÍ1SÜ
Dose
0
5. 000
10.000
15.000
80.000
8ü. 000
0
5.000
j 0.000
.15.000
Í:'O . 0 0 0
es.ooo
8,5
8,76
8,86
3,00
3,86
3,36
3,71
8,50
8,61
8,76
8,96
8,96
3,06
5
8,45
8,70
8,76
3,11
3,16
3,66
8,61.
8,70
8,81
8,96
8,99
3,86
10
8,40
8,56
8,58
8,91
3,06
3,36
8,45
8,61
8,70
8,76
8,76
8,96
15
8,80
8,35
8,37
8,65
8,70
8,86
8,80
8,85
8,35
8,50
8,56
8,65
(cont
80
8,00
8,05
8,15
8,30
8,35
8,50
1,95
8,05
8,85
B,E5
8,30
8,30
inua)
36
BílH
AET
MEA
0
5 . OOO
10.OOO
15.000
L»0.0OO
85.000
0
5 000
10.GOO
i ?•. OOÍ)
80.000
L'b. 000
0
5.000
3 0.000
15.000
BO.000
£5.000
8.5O
8.61
8,61
8,76
8,76
8,86
E,45
ií,65
R.Bi
B,8i
e, 8i
2,86
c?,50
R,56
E.70
e,86
e,8í>
E,86
8,45
8.SO
8,50
B.7O
8.70
8.86
8,56
8,65
8,76
8,76
8,76
8,86
8,61
8,61
8,70
8,7O
8,81
8,81
8.40
a,so
8,50
5,61
S.61
8,61
8,35
8,64
8,64
8,65
8,65
8,70
£,40
8,45
8,56
8,56
B,56
E,6i
8.15
8.80
8,80
8,30
8,30
8,40
8,05
8.85
8,30
8,30
8,35
8,40
8,15
8,E0
8,85
8,85
8,85
5,30
8.00
8.05
8,05
8.10
8.10
8,15
1,95
8,00
8,00
8,05
8,05
8,10
1,95
8,00
8,00
8,05
8,05
8,05
3 7
Tabela 9- Diferença na viscosidade das amostras de cristalino
bovino, nas diferentes temperaturas» entre O e £5.000
Gy
Temperatura Controle DMSD 6SH AET HEA
2,5
5
10
íb
B0
0,95
Í ,ei
0,96
0,66
0,50
0,56
0,65
0,51
0,45
0,35
0,36
0,41
0,81
0,£5
0,15
0,41
0,30
0,35
0,35
0,15
0.36
0,80
0.B.I
0,15
0,10
4.7- Afliinograma
Na tabela 10, são mostrados os resultados da análise de
rtninoiteírior. das amostras de cristalino bovino irradiadas. Os
resultados em rr.icromoles dp aniinoácidos/ mi programa d& amostra
mostrar» que a maioria dos aminoátidos não -foi afetada
significativamente pela irradiação. Entretanto, os aminoácidos
mais afetados foram o triptofano, a metionina, a tirosína, a
histidínc* e a cisteina, quando comparados os dados das amostras
irradiadas com E5.000 C>y COD O S controles (Tabela li>. Os valores
calculados diüsse decréscimo são 90%, 67%, 43%, 33% e S4%, para o
triptofano, a metionina, a tirosina, a histidina e» a cisteina,
respect i vãmente.
Tabela 11- AminoBraaa das
irradiadas.
trás de cristalino bovino
Aminoàcido controle S.OOO ÍO.OOO 15.OOO 20.OOO E5.OOO
lisina
histidina
arginina
tripto-f ano
ér. . aspârt ico
treonina
serina
ác glut .
pro)ina
glicina
alanina
1/Ecistina
va) irta
met ionina
isoleucina
leucina
tirosina
fenilaIanina
ác., c. istéico
o,es
O.El
0,47
0,é?0
0,46
0,17
0,4R
0.6V
0,33
0,4E
o,es
ND
0,30
0,15
0,£3
0,37
0,21
0,36
0,17
O.BS
o.eo
0,45
0,16
0,47
0,17
0,42
0,67
0,33
0,41
0,£4
ND
0,28
0,13
0,83
0,35
0,19
0,35
0,16
0.B3
0.18
0,44
0,10
0,47
0,15
0,40
0,65
0,31
0,4.1.
0,£4
0,01
0,28
O,1R
0,££
0,34
0,17
0,35
0,15
0,51
0,17
0,4í?
0,07
0,45
0,14
0,39
0,64
0,30
0,39
o.ee
0,03
0,27
0,10
0.B1
0,35
0,16
0,33
0,15
0.80
0,15
0,40
0,04
0,43
0,13
0,38
0,62
0.E9
0,39
0,20
0,06
0,PS
0,09
0,20
0,31
0,14
0,3.1
0,13
0,80
0.14
0,40
o.oe
0,41
0,13
0,37
0,60
0,29
0,37
0,20
0,07
0,25
0,05
0,20
0,31
0,11
0,31
0,13
NI) " Náo detentável .
Tabela li- Decréscimo nas concentrações dos aatinoacidos das
soluções de cristalino bovino.
Aminnâcitío Decréscimo (X)
li sina 80
histidina 33
arginina 15
tripto-fano 90
ác.aspãrtico 15
treonine S3
ser i na 1K
ác.glut. 13
pro)ina i£
glirina 1L>
aJanins 20
l/E cistina ND
vali na 1^
tnetionina 67
i 5D)f?ucine 13
leucina 16
•f«pni lalanina 14
ác . cistêico £'4
40
s -
Neste trabalho, procurou-se analisar os efeitos da radiação60
gana de Co nas proteínas do cristalino bovino e estabelecer a
capacidade modificadora da 6SH, do AET, do MEA e do DttSO em
relação a resposta á radiação.
HE resultados obtidos na turbidimetria demonstram que a
medida que a radiação ionizante atravessa a solução de proteína,
há uma deposição de energia dependente da dose absorvida,
mani-festado pelo aumento da absorvãncia. Considera-se que e
radiação induz modificações químicas nas estruturas primária e
secundária, bem como quebra de ligações peptidicas e dissulfeto
e formação de "crosslinking" inter e intra-molecular. Assim, o
efeito da radiâtáo assemelha-se è denaturacáo pelo calor ou por
agentes que quebrem ponte«r. de hidrogênio (Alexaner & Lett, 1967).
No estudo realizado por Ohmori e Nose <1987),foram analisadas
r.* modificações na turbidez e viscosidade das proteínas de
cristalino bovino in vitro apôç. irradiação II.V.. Segundo esses
autores», os dados sobre modificação na turbides em experimentos
jn vitro sao necessários visto que a formação da catarata ê
acompanhada por um aumento da opacidade das proteínas da lente.
As modificacõs na turbidimetria das proteínas pede ser atribuída
ao "crosslinking".
fcm nosso trabalho, ao F.ere.n âcre¢nidâs as
4J.
radiomodificadoras. nota-se também uma diminuição da turbidez
significando que o efeito da radiação foi amenizado.
Essas substâncias testadas em nosso sistema são consideradas
"scavengers" de radical hidroxila (OH*). Esse radical reage com a
maioria dos compostos orgânicos e ê a maior espécie inativante em
nistemas aquosos (Czapski, 1V84). Esses "scavengers" tern a
rapacidade de? rea.over os radicais hidraxila produzidos ne
radiúlise ria água antes que eles reajam com moléculas
biologicamente importantes. Neste processo há redução da
concentração de radicais livres na solução (Giambarrvsi ft Jacob,
1987)
A g)utationa (BSH) ê o mais importante tiol não proteico
endógeno, estando ben> distribuída nas células, presentes nas
concentrações de 0,5 a 10 /«mol/g do peso úmido de vários tecidos
animais. N O B cristalinos, está presente numa concentração de 7
í t> >*mol/g do peso unido da )e>nte. Bua mais importante -função é
manter incolor o cristalino. Na •formação da catarata ororre uma
acentuada diminuição de sua concentração, levando á opacificaçáo
da lente, devidn ao -fato dela ser um potente inibidor das reações
foto-oxidativas.
Li aciinoeti 1 icot iouréia (ALT) e a mercaptoeti l&lanina <MEA)
SÃO fl/)»inot3oiF,, com analogia química com a cisteina, que -foi a
primeira substancia COÍTI capacidade radioprotetora encontrada
(Bíambarr»«i & Jacobs, ÍV87) . 0 ACT, d i-fere da ei steins por
possuir um grupo uréia encobrindo & funçáo SH. Bua r-f icierir.:i&
como radioprotetor vai depender da liberação do grupo SH M pH
fisiológico, -formando o composto mercaptoetilguanidina, que
possui o grupo SH livre (Snapira et ai., 1958).
A MEA é a forma descarboxilada da cisteina e è considerada um
dos mais potentes radioprotetores. Pela sua eficiência e
simplicidade estrutural, foi muito estudada e a muitos anos ê
protótipo para testes de outros agentes radioprotetores
, Giambarresi ft Jacob, 1VB7).
I) dimetil sul-fox ido (DM50), foi a única substancia testada em
nosso sistema, que náo pertence ao grupa dos aminotióis. Sue
r.apac idade* radioprotetora foi descoberta por acaso, ao ser usado
como solvente de substancias a serem injetadas em camundongos que
&eriani irradiados (Ashwood - Smith, 1961). Sua capacidade de
radioproteçào so deve a sua habilidade de inativar radicais
Jjvrrs, particularmente OH' (Bridges, Í96S>.
Os resultados encontrados em nosso sistema, nos permite supor
que na ação direta e indireta da radiação na presença das
substâncias ensaiadas, houve uma competição cap&z tie reduzir os
radicais livres na solução, principalmente o radical hidroxila,
dando origem a moléculas estáveis, como sugerem Alexander ft L«tt,
(1967).
()?, resultados obtidos cm nosso sistema, na dosagem de grupos
SM, pelo método de Ellman (1959), demonstram que os resíduos ÚP
cisteina poderiao «star comprometidos ea» pontes de dissul-feto. ou
que esses resíduos -fora» bloqueados pelo N--etilmaleimide, no
controle não irradiado. Essa substancia foi acrescentada antes da
irradiação para bloquear os tiòis endôçienos das proteínas do
cristalino. Co» a irradiação essas pontes -foram quebradas e houve
liberação dos grupos SH, que aumentam com a dose de radiação. Nas
Amostras com DM59, ocorreu o mesmo -fate.
amostras cora B8H, AET e MLA, os controles não irradiados
apresentaram uma alta concentração de grupos SH, provenientes da
substância acrescentada, visto que os tiois endògenos -foram
bloqueados pelo N-etilmaleimide. Com o aumento da dose de
radiação .esses grupos -foram oxidados e sua concentração diminuiu.
Durante a -formação da catarata, as proteínas do cristalino
mostram uma diminuição gradual do contreúdo de grupos SH. Isso se
deve principalmente á glutatiorta, que na -formação da catarata é
oxidada.
Mero la ft Kinoshita <19f>7) tambê.T- observaram que os grupos SM
das proteínas do cristalino sáo normalmente estáveis; entretanto
esses, grupos tornam-se muito susceptíveis ã oxidaçào apo? a
denaturação ria proteína. Fenômeno semelhante pode ocorrer após a
irradiação da lente, onde os grupos EH tornam-se expostos e
oxidados.
Psra avaliar as. ntodi-f icaçôe» oxidat i vas ocorridas eir
proteínas de cristalino bovino, Siezen »t «1 (1788) determinerair,
44
uma perda substancial doe grupos SH das proteínas em solução,
quando incubadas em alta concentração de HEOE juntamente com a
sua denaturacão.
As soluções de cristalino bovino irradiadas foram sujeitas» á
dosagem de proteínas. Verificou-se uma perda de EVX do material
proteico, quando se considera a maior dose utilizada. Sabendo que
na fornação da catarata ocorre o aparecimento de agregados
proteicos (Spector et ai, 1974), é sugerido que essa
perda seja resultante* da precipitação de algumas proteínas
em virtude da agregação (Walker & Borkman, 1986).
Nas amostras irradiadas com GSH, AET e MEA, a determinação do
conteúdo proteico foi prejudicada. Isso se deve ao fato de que
esse método sofre interferência do nitrogênio dessas substancias
que apresentam o grupo ami na (Miller, 1959) e também pela
presença de grupos SH livres ou de outros agentes oxidant.es
(Kabat, 1967). A determinação do conteúdo proteico nas amostras
irradiadas com DMSO, também foi prejudicada de maneira semelhante.
A absorção especifica n& região ultravioleta para várias
moléculas, principalmente? proteínas, é conseqüência do conteúdo
rios aminoácidos aroroátícos, principalmente triptofano e tirosina,
proporcionando importantes informações sobre a constituição e
estrutura da proteína (Kabat, 1967).
E.m proteínas irradiadas em solução a agregação causa
modificaçb&s no espectro de absorção na região U.V. por causa do
45
maior número de moléculas d i-fusas ã luz. Essa aparente
modificação no espectro de absorção de proteínas irradiadas è
erroneamente atribuída a modificações químicas nos grupos
rromóforos das proteínas (Alexander & Lett, 1967).
Walker ft Borkman (1988) em experimentos de crosslinking
induzido pel» lu? ultravioleta de soluções aquosas de a&tra
cristalino bovino, mostraram que no espectro de absorção na
região ultravioleta ocorre um aumento da densidade óptica na
região entre £50 a 350nm, pelo aumento da turbidez da solução.
Não ha evidencias claras do aparecimento de novos cromó-foros após
a irradiação U.V..
Nossos resultados mostram um aumento na absorção na região
U.V., com aumento da dose de radiação. Isso também corresponde a
um aumento da turbidez das amostras. Nas soluções irradiada?» com
GSH, AET, MEA e DMBO essa correlação não foi observada,
provavelmente por introduzir perturbações no sistema
(Donovan, 1969).
A fluorescència de proteínas se origina dos aminoácidos
aro,Ttí.t ico& que absorvem no ultravioleta próximo (Chen et ai,
1969). Nas amostras de cristalino bovino, observou-se uma
diminuição na fluorescencia das proteínas com o aumento da dose
rir radiação.
A oxidsçáo direta dos resíduos de triptofano eltera a
estruture da proteína suficientemente, causando insolubi1izaçáo m
46
mod i -f i rações na estrutura terciãria. Esse dano oxidativo é
considerado um importante -Fator nas modi-ficaçoes da lente durante
a formação da catarata (Spector, 19B4).
Segundo dados da literatura (Torriglia ft Zigman, 1938; Walker
ft Borkman, 1988), o principal alvo da radiação nas proteínas do
cristalino são os resíduos de tripto-fano e seus foto--produtos,
que levam a modificações na solubilidade da proteína e inibiçáo
ria atividade biológica. A radiação pode a-fetar o peso molecular
dat. proteína* -rundamental mente de duas maneiras: aumentá-la
«través da -formação de "crosslinking" ou reduzi-lo pele
degradação de cadeia Nos nossos experimentos, este aumento nao
•foi muito acentuado mas índice uma predominância do processo de
agregação na solução df? proteínas do cristalino. Nas amostras com
6SH, AET, MEA e DMSO, ocorreu uma aparente proteção da -formação
de agregados observadas pelos valores da viscosidade em função da
dose de radiação.
Ohmori & Nose (1V81//) , ao examinarem SF O "cross! inking"
proteínas do cristalino bovino irradiadas com lu? ultravioleta
pre prevenido pela plutationa <GSH) realizaram a medida da
viscosidade Especifica das soluções. Pelos resultados, eles
observaram que a glutariona protegeu a solução de proteínas.
Nossos resultados confirmam esses dados.
Babe—se também que a viscosidade? de proteínas vária com o
aumento da temperature,. Em nossas amostras, nas diferentes
47
temperaturas, observamos um decréscimo na vi se os idade em -função
da temperatura.
NAS proteínas do cristalino, os aminoàcidos mais sensíveis á
OKidaçiâo %'àa & risteins, o tripto-fano, a tirosina, a metionina e
A histidina, dependendo de sua localização na molécula de
proteína (Andley ft Clark, 1988).
Km nosso sistema, o decréscimo maior -foi no tripto-fano,
metioninã, tirosina, histidina e cisteina. Esses resultados
sugerem que o resíduo de tripto-fano è o mais afetado pela
radiação, corroborando os dados da absorção no U.V. e aqueles
obtidos por -f luorimetria .
4B
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:
- E possível a montagem de um sistema para o estudo da
-íormaçao da catarata "in vitro" induzida pela radiação
innizante, a partir de soluções aquosas de proteínas
extraídas do cristalino bovino.
- Ds dados de absorção no U.V., análise de aminoãcidor.,
•' luoriroetrie e determinação de grupos SN livres,
demonstram o envolvimento -fundamental do triptofano,
metionina, tirosina, histidina e cisteina na
manifestação do efeito da radiação no sistema.
- Os valores encontrados na viscosimetria confirmam
aqueles obtidos na turbitíiroetria das soluções de
cristalino, indicando ser a formação de agregados o
processo predominante induzido pela radiação.
& possível utilizar este sistema experimental para
estabelecer a capacidade ratíiomodif icadora de
substancias tais como BEH, AET, tfEA e DMSD, quando
presentes durante a irradiação.
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