INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS …iz.sp.gov.br/pdfs/1332339361.pdf · Colegas da república, Giani, Joana, Claiton, pela amizade e experiências trocadas. Aos funcionários

INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

PERFIL MICROBIOLÓGICO E DE RESISTÊNCIA DOS STAPHYLOCOCCUS

COAGULASE NEGATIVA ISOLADOS DE NOVILHAS TRATADAS NO PRÉ-

PARTO

Lucas Eduardo Pilon

Nova Odessa

Fevereiro de 2012

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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS


Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus Coagulase negativa isolados de

novilhas tratadas no pré-parto

Lucas Eduardo Pilon Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro

Nova Odessa

Fevereiro de 2012

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.

iv

Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia

Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166

P643p Pilon, Lucas Eduardo

Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados de novilhas tratadas no pré-parto. / Lucas Eduardo Pilon. Nova Odessa - SP, 2012.

57p. : il.

Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA.

Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro.

1. Mastite animal. 2. Novilhas - Doenças. I. Arcaro, Juliana Rodrigues Pozzi. II. Título.

CDD 636.089692

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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS


CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

PERFIL MICROBIOLÓGICO E DE RESISTÊNCIA DOS

STAPHYLOCOCCUS COAGULASE NEGATIVA ISOLADOS DE

NOVILHAS TRATADAS NO PRÉ-PARTO

LUCAS EDUARDO PILON

Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro

Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção

Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora:

_____________________________

Drª.Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro

__________________________ Drª. Cecília José Verissimo

______________________________

Dr. Roberto Bellizia Raia Júnior

Data da realização: 03 de Fevereiro de 2012

Presidente da Comissão Examinadora Prof. Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro

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vii

Dedicatória

Dedico este trabalho aos meus queridos pais:

Adair Pilon (in memorian) e Maria Alice Malpeli Pilon,

que nunca mediram esforços para que seus filhos

aprendessem o que há de mais belo, o estudo; aos

meus irmãos: José Angelo Pilon e Carlos Eduardo Pilon

e a minha sobrinha Natalia Ferreira Pilon.

A minha orientadora Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro,

pelos ensinamentos e pelas experiências que me

foram passadas durante o período em que trabalhamos juntos.

viii

Pensamentos

A nossa maior glória, não reside no fato

de nunca cairmos, mas sim em levantarmos

sempre depois de uma queda.

Confúcio

Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz até onde os outros foram.

Alexandre Graham Bell

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Agradecimentos

Gostaria de agradecer primeiramente a Deus e Nossa Senhora Aparecida, por ter me dados forças nessa caminhada, em busca de mais um sonho. Agradeço a toda a minha família, Maria Alice Malpeli Pilon, minha querida mamãe, que sofreu e sorriu junto comigo durante todo esse período em que passei fora de casa, aos meus queridos irmãos José Angelo Pilon, Carlos Eduardo Pilon e minha querida sobrinha Natália Ferreira Pilon, pelo apoio e incentivo durante esta caminhada em busca de mais um sonho. Não posso deixar de citar o Sr. Adair Pilon, o meu querido papai, seu fã e me espelho em você pai, gostaria de poder sorrir junto com o senhor esse momento tão especial, que está se concretizando em minha vida. Agradeço a minha namorada Sabrina Souza da Costa, pelo incentivo, paciência, pelo carinho, pelos esforços que tem feito para podermos nos ver, só tenho a agradecer, te amo. À Professora Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro, pela oportunidade, pelos ensinamentos, incentivos durante esta caminhada. Aos professores do Conselho de Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia (IZ), pelos ensinamentos que transmitiram a todos os alunos. Ao Drº. Luiz Alberto Ambrósio, pelos ensinamentos estatísticos e pelas análises realizadas. À Mariana, Thiago e a Lívia pelo apoio durante as coletas nas propriedades e nas análises laboratoriais. Ao Drº. José Victor de Oliveira, pelo confiança, pelos conselhos e ensinamentos durante esta caminhada. Ao Professor Drº. Irineu Arcaro Junior e Drª. Luciandra Macedo de Toledo pela oportunidade, amizade e pelos ensinamentos. Aos colegas de pós-graduação, Juliano, Ana Claudia, Marco Aurélio, pelos momentos de descontração. Colegas da república, Giani, Joana, Claiton, pela amizade e experiências trocadas. Aos funcionários da CAPTA Bovino de Leite (setor palmeira), Tereza, Ana Baião, Creusa, Donizete e Edmar, pela amizade, companheirismo e que sem dúvida não mediram esforços para ajudar na realização deste projeto.

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Aos proprietários das propriedades por permitirem a inclusão de dados neste trabalho, aos funcionários pelo apoio, compreensão e paciência durante as coletas. À todos que colaboraram de forma direta ou indireta na realização deste projeto. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela bolsa concedida durante a execução do projeto.

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURA..................................................................................................................... xiii

LISTA DE TABELA..................................................................................................................... xv

RESUMO .................................................................................................................................... xvii

ABSTRACT ................................................................................................................................. xix

1 – INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 1

2 – REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................. 3

2.1 – Mastite ................................................................................................................................ 3

2.2 – Prejuízos econômicos causados pela mastite...................................................................... 5

2.3 – Mastite em novilhas............................................................................................................ 5

2.4 – Mastite por Staphylococcus coagulase negativa................................................................. 8

2.5 – Perfil de resistência aos antimicrobianos ........................................................................... 9

2.5 – Produção de (slime) biofilme pelos Staphylococcus coagulase negativo......................... 10

3 – MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................... 13

3.1 – Rebanhos estudados.......................................................................................................... 13

3.2 – Manejos ............................................................................................................................ 13

3.3 – Manejo de ordenha ........................................................................................................... 15

3.4 – Delineamento experimental e tratamentos ....................................................................... 16

3.5 – Colheita do material biológico das novilhas .................................................................... 17

3.5.1 – Período pré-parto ....................................................................................................... 17

3.5.2 – Parição ....................................................................................................................... 17

3.5.3 - Dez dias após a data de parição.................................................................................. 18

3.6 – Análises Laboratoriais ...................................................................................................... 19

3.6.1 - Isolamento e identificação de microrganismos .......................................................... 19

3.6.2 - Identificação dos Staphylococcus coagulase negativa ............................................... 20

3.6.3 - Teste de sensibilidade a antimicrobianos................................................................... 20

3.6.4 - Ensaio para a verificação da produção da cápsula mucosa (slime)............................ 21

3.7 – Amostragem e análises estatísticas............................................................................... 21

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 23

4.1 – Perfil microbiológico........................................................................................................ 23

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4.2 – Perfil antimicrobiano dos Staphylococcus coagulase negativa. ....................................... 35

4.3 - Produção de biofilme (slime) pelos Staphylococcus coagulase negativa.......................... 38

5 – CONCLUSÃO......................................................................................................................... 41

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................................... 43

xiii

LISTA DE FIGURA

Figura 1: Colheita de leite para análise laboratorial..................................................................... 18

Figura 2: Placa de ágar sangue com crescimento bacteriano. ...................................................... 19

Figura 3: Antibiograma com os discos que continham os princípios ativos – Furazolidona

(acima) e Bacitracina (abaixo)....................................................................................................... 20

Figura 4: Placa de Antibiograma.................................................................................................. 21

Figura 5: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase negativa (SCN),

Staphylococcus coagulase positiva (SCP) e Staphylococcus aureus, isolados das secreções das

glândulas mamàrias, colostro e das amostras de leite, durante o período de coleta na (Fazenda 1),

São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 25

Figura 6: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus

coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos

animais pertencentes ao grupo não tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.......................... 27



animais pertencentes ao grupo tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011................................. 28



animais pertencentes ao grupo não tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011. ......................30



animais pertencentes ao grupo tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.............................. 31

xiv

xv

LISTA DE TABELA

Tabela 1: Frequência absoluta (FA) e relativa (FR) dos microrganismos isolados da secreção da

glândula mamária, colostro e leite das novilhas tratadas durante o período pré–parto na Fazenda

1, São Paulo, Brasil, 2011. ............................................................................................................ 24

Tabela 2: Frequência relativa (FR) dos patógenos isolados das amostras coletadas dos tetos das

novilhas durante todo o período do experimento, animais pertencentes aos grupos tratado e não

tratado e o valor do Qui-quadrado, (Fazendas 2 e 3), São Paulo, Brasil, 2011............................. 32

Tabela 3: Frequência absoluta, valor do Odds-Ratio e Intervalo de confiança (IC) do Odds-Ratio,

dos patógenos isolados das novilhas pertencentes aos grupos não tratadas e tratadas, (Fazendas 2

e 3), São Paulo, Brasil, 2011. ........................................................................................................ 33

Letras iguais, não diferem nas frequências entre si. ...................................................................... 33

Tabela 4: Frequência absoluta (FA) e frequência relativa (FR) das espécies de Staphylococcus

coagulase negativa (SCN) identificados dos quartos mamários das novilhas pertencentes aos

grupos tratados e não tratados, durante todo o período de colheita, nas (Fazendas 1, 2 e 3), São

Paulo, Brasil, 2011. ....................................................................................................................... 34

Tabela 5: Perfis antimicrobianos de Staphylococcus coagulase negativa, isolados de amostras

coletadas dos quartos mamários no pré-parto, pós-parto e durante a lactação das fazendas 1, 2 e 3,

São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 36

Tabela 6: Resultado das estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, submetidas ao teste do

ágar Vermelho Congo, para diagnosticar ou não a produção de biofilme (slime) das amostras


São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 39

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RESUMO

Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados de

novilhas tratadas no pré-parto.

A mastite, processo inflamatório da glândula mamária, é responsável por grandes prejuízos aos produtores. O trabalho teve como objetivos: avaliar o tratamento pré-parto nas novilhas sobre os Staphylococcus coagulase negativa (SCN); o perfil antimicrobiano; verificar a produção de biofilme e identificar as espécies (SCN) em novilhas primíparas. Foram utilizados 87 animais, distribuídos em três propriedades: Fazenda (1), com 40 novilhas, (Descalvado, SP), todas tratadas no pré-parto; Fazenda (2), (Pindamonhangaba, SP), com 18 novilhas; fazenda (3), com 29 animais, (Nova Odessa, SP). Nas Fazendas 2 e 3 os animais foram divididos em grupos tratadas e não tratadas no pré-parto. Os resultados mostraram que na Fazenda 1 ocorreu predominância dos SCN no pré-parto (30,16%) e no parto (1,57%). Na Fazenda 2 ocorreu predominância dos SCN no pré-parto (88,89%) e no parto (60%) no grupo de novilhas não tratadas; no grupo tratado, a ocorrência no pré-parto dos SCN foi de 100% e, no parto, os Staphylococcus coagulase positiva (SCP) (50%). Na fazenda 3 prevaleceram os (SCP), tanto no pré-parto e parto para o grupo não tratado (69,24% e 39,38%, respectivamente), e igualmente no grupo tratado (100% e 39,28%, respectivamente). Ocorreram diferenças significativas quando se comparam os grupos não tratado e tratado na fazenda 2 em relação S. aureus (P=0,004), Corynebacterium spp. (P=0,05), e Fazenda 3 para os SCP (P=0,0001) e S. aureus (P=0,029). O Staphylococcus simulans prevaleceu nas Fazendas 1, 2 e 3 (51,02%, 68,97% e 50%, respectivamente). No antibiograma, as fazendas apresentaram as seguintes resistências: Fazenda 1 – 16,98% ampicilina, 13,21% penicilina e 2,83% oxacilina; fazenda 2 – 31,03% penicilina e 17,24% oxacilina e Fazenda 3 – 52,22% pencilina e 13,33% oxacilina.

Palavra chave: antimicrobiano, glândula mamária, leite, parto, pré-parto.

xviii

xix

ABSTRACT

Microbiological and resistence profile of the coagulase-negative Staphylococci, isolated

heifers treated precalving.

Mastitis inflammation of the mammary gland is responsible for great economic loss to dairy farmers. The objectives of the present study were to evaluate the treatment in pre-partum heifers on coagulase-negative Staphylococcus (SCN); the antimicrobial profile; check the production of biofilm and identify species (SCN) in primiparous heifers. We used 87 animals, divided into three farms: Farm (1), 40 heifers (Descalvado, SP), all treated in the pre-partum; Farm (2), (Pindamonhangaba, SP), with 18 heifers; Farm (3), with 29 animals (Nova Odessa, SP). On farms 2 and 3 the animals were divided into treated and untreated groups in the pre-partum. The results showed that the Farm 1 was a predominance of SCN in the pre-partum (30.16%) and partum (1.57%). On the Farm 2 there was a predominance of two SCN in the pre-partum (88.89%) and partum (60%) of heifers in the group not treated, the treated group, the occurrence in the pre-partum SCN was 100% and in the partum, Staphylococcus coagulase positive (CPS) (50%). Prevailed on the Farm 3 (SCP), both pre-partum and partum to the untreated group (69.24% and 39.38%, respectively), and also in the treated group (100% and 39.28% respectively.) There were significant differences when comparing the untreated and treated groups at the farm 2 for S. aureus (P = 0.004), Corynebacterium spp. (P = 0.05), and Farm 3 for PCS (P = 0.0001) and S. aureus (P = 0.029). Staphylococcus simulans prevalent in Farm 1, 2 and 3 (51.02%, 68.97% and 50% respectively). In the antibiogram, the farms had the following strengths: farm 1 to 16.98% ampicillin, 13.21% penicillin and 2.83% oxacillin; farm 2 to 31.03% penicillin, 17.24% oxacillin and, farm 3- 52.22% penicillin and 13.33% oxacillin.

Key words: antimicrobial, calving, mammary gland, milk, precalving

xx

1

1 – INTRODUÇÃO

O leite é uma mistura complexa, estável e nutritiva de proteínas, gorduras e outros

elementos sólidos, que se encontram suspensos em água e constituem a composição que define a

qualidade do leite. Animais que recebem uma alimentação adequada, equilibrada e são

manejados corretamente produzem leite de boa qualidade (GIANOLA et al., 2004).

Dentre os principais problemas que afetam os animais produtores de leite, destaca-se a

mastite, processo inflamatório da glândula mamária, que leva a alterações na composição do

leite. As perdas econômicas ocasionadas pelo leite descartado de animais portadores de mastite

superam os prejuízos causados por doenças reprodutivas ou infertilidade. Essas perdas foram

equivalentes a seis vezes a produção média diária por vaca, para cada teto portador de mastite

clínica, segundo Holanda Junior et al. (2005).

Apesar da mastite ser considerada a principal doença que afeta os rebanhos leiteiros no

mundo, não há estudos aprofundados com novilhas primíparas, baseado no conceito de que esses

animais estariam livres de infecções. Entretanto, foi demonstrado em vários países e no Brasil

que novilhas primíparas podem parir com a doença (CALVINHO et al., 2007). Nos últimos 20

2

anos, diversas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de determinar a mastite em novilhas,

derrubando o dogma de que as novilhas são livres dessa doença.

Os objetivos deste trabalho foram: identificar Staphylococcus coagulase negativa (SCN),

presentes nas glândulas mamárias de novilhas primíparas tratadas e não tratadas no pré-parto e

traçar o perfil antimicrobiano. Traçar o perfil microbiológico dos agentes causadores de mastite

em novilhas, no pré-parto, parto e lactação; estabelecer a ocorrência de SCN no pré-parto, parto e

durante a lactação de novilhas; verificar a eficiência do tratamento de vaca seca utilizado nas

novilhas, quanto à redução de SCN; identificar as espécies de SCN, por meio de testes

bioquímicos; determinar o perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro dos SCN, isolados

frente aos antibióticos mais frequentemente utilizados na clínica médica veterinária; avaliar a

produção de biofilme das estirpes de SCN pela técnica de Agar Vermelho Congo.

3

2 – REVISÃO DE LITERATURA

2.1 – Mastite

Dentre as várias patologias que acometem os animais produtores de leite, a mastite (do

grego mastos) ou mamite (do latim mammae) bovina é considerada a doença que causa prejuízos

à produção leiteira, reduzindo em quantidade e qualidade o leite e os derivados lácteos

(SANTOS, 2003; RUEGG, 2003; ZAFALON et al., 2007).

A mastite é definida como o processo inflamatório da glândula mamária, essa inflamação

acarreta alterações na composição do leite. Diversas razões podem levar ao aparecimento da

mastite, sendo a mais comum a infecção do úbere por microrganismos (SOUTO, 2006). Segundo

Pinheiro et al. (2009), mesmo com a implantação de programas de prevenção da mastite, será

necessário continuar o monitoramento dessa afecção, e até mesmo implantar novas medidas de

controle.

A ocorrência de mastite pode resultar em perdas não só na lactação atual, mas também na

lactação seguinte, comprometendo a produção total do animal. Os prejuízos ocasionados pela

4

mastite na produção leiteira por lactação podem variar de 10 a 30% (AULDIST e HUBBLE,

1998).

A mastite pode ser classificada em: mastite clínica e subclínica, e essas definições

permitem diferenciar o processo inflamatório. A mastite clínica caracteriza-se por modificações

visíveis no leite, como a presença de grumos, fibrina ou secreção purulenta, e muitas vezes

alterações na glândula mamária como aumento de volume, presença de dor, aumento de

temperatura e rubor. Dentre os vários métodos de diagnóstico da mastite clínica, o teste da caneca

de fundo escuro ou caneca telada é o mais utilizado, sendo interpretado segundo os diferentes

escores observados nos primeiros jatos de leite retirados da glândula mamária, momento antes do

início da ordenha, com a interpretação realizada da seguinte maneira, segundo (DOMINGUES,

1993).

• Escore zero, leite normal (ausência de partículas);

• Escore um, leite ligeiramente descolorido com presença de grumos finos e delicados;

• Escore dois, leite com muitos grumos;

• Escore três, secreções não semelhantes ao leite, apresentado pus e/ou sangue, e/ou fibrina,

ou ainda aspecto viscoso, similar ao colostro.

A mastite subclínica não apresenta sinais clínicos evidentes, pois o leite apresenta aspecto

macroscópico normal, e não há sinais visíveis de inflamação do úbere, podendo ser detectada

somente por provas indiretas com o leite, como o (“California Mastitis Test” - CMT) (COSTA et

al., 1995). A realização do CMT consiste na comparação do escore de viscosidade da mistura

(leite acrescido de reagente próprio) e a intensidade do processo inflamatório na glândula

mamária. O escore é interpretado sob a forma de escala, que varia da seguinte maneira 0

(resultado negativo) a 3 (resultado máximo da inflamação) (SCHALM e NOORLANDER, 1957).

A mastite subclínica alastra-se silenciosamente entre o rebanho, não apresentando

alterações macroscópicas à inspeção do úbere ou no leite secretado, necessitando receber uma

maior atenção (BARBALHO e MOTA, 2001). A principal característica que a mastite subclínica

5

apresenta é o aumento na contagem de células somáticas (CCS), e valores acima de 200.000

células/ml indicam resposta inflamatória na glândula mamária (SMITH, 2001).

2.2 – Prejuízos econômicos causados pela mastite

Diante de todas as doenças microbianas, a mastite pode ser considerada a que causa maior

impacto no ponto de vista econômico, tanto para os produtores como para as indústrias de

produtos lácteos e, geralmente, os produtores adotam medidas preventivas para as vacas em

lactação, considerando os animais jovens refratários à infecção (HALLBERG et al., 1995).

Segundo Miller et al., (1993), os custos para realizar a prevenção da mastite pode ser de US$

14,50 vaca/ano, enquanto que os custos com mastite clínica aos produtores foi de US$ 37,91 vaca

ano.

No Brasil, estima-se que as perdas na produção variam de 12 a 15%, significando uma

perda de 2,8 bilhões de litros/ano, valores estes referentes a uma produção anual de 20 bilhões de

litros (CARVALHO et al., 2004).

Nos rebanhos brasileiros, a mastite subclínica atinge entre 20 e 43% das vacas em

lactação, provocando uma redução de cerca de 7,69% da produção de leite (900 milhões de

litros/ano). Quando se adotam medidas de controle da mastite, essas perdas se reduzem a 3,1%

(CHAPAVAL e PIEKARSKI, 2000).

2.3 – Mastite em novilhas

Até pouco tempo atrás acreditava-se que as taxas de infecções intramamárias em novilhas

vazias e gestantes eram baixas, porque para a maioria dos produtores esses animais eram

considerados sadios e a presença da mastite não era notada até o início da produção de leite ou

até o primeiro episódio clínico na lactação.

O desenvolvimento maior do tecido secretor de leite ocorre na primeira gestação, sendo

assim a mastite prejudica o desenvolvimento do tecido da glândula mamária, fazendo com que a

6

mesma não atinja o pleno desenvolvimento, prejudicando as lactações futuras (CERQUEIRA et

al., 2009).

Durante as décadas de 20 e 30, foram relatados os primeiros casos de mastite em novilhas

(STABELFORTH et al., 1935) e nos últimos 20 anos, diversas pesquisas foram realizadas com o

objetivo de descrever a natureza da mastite em novilhas, derrubando o dogma de que esses

animais seriam livres dessa doença (FOX, 2009). A partir dos anos 70 essa categoria animal

passou a receber mais atenção (MUNCH-PETERSEN, 1970; OLIVER e MITCHELL, 1983;

FOX et al., 1995).

Segundo Cerqueira et al. (2009), as novilhas podem tornar-se susceptíveis aos patógenos

causadores da mastite quando começam a produzir secreções intramamárias, por volta dos 6 a 8

meses de idade. Não se sabe ao certo como as novilhas se infectam, mas existem algumas

hipóteses que podem estar relacionadas ao aparecimento da doença: a presença de bactérias na

microbiota da pele dos tetos, a presença de bactérias que habitam a cavidade oral das bezerras

que mamam em outras, bactérias presentes no ambiente, nas camas, estercos e no solo ou ainda

veiculadas por moscas, e bezerras que são alimentadas com leite mastítico.

Alguns animais livram-se das infecções nas primeiras semanas pós-parto em

consequência dos procedimentos de ordenha, mas um número elevado de vacas primíparas

permanecem infectadas por longos períodos, acarretando diminuição na produção de leite

(MATTHEWS et al., 1992).

Diversos patógenos foram isolados de glândulas mamárias de novilhas, dentre esses

patógenos destacam-se Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, Staphylococcus

coagulase negativa, e coliformes (MCDONALD 1982; OLIVER e MITCHELL 1983; DANIEL

et al., 1986; OLIVER 1987).

Oliver e Mitchell (1983) avaliaram os quartos mamários de 32 novilhas aos 14 e 7 dias

pré-parto e 7 e 14 dias pós-parto, verificaram que 67,1% dos quartos foram bacteriologicamente

negativos e 15,7% estavam infectados com Staphylococcus coagulase negativa, 8%

7

Staphylococcus coagulase positiva, 4,4% Streptococcus spp., 3,8% coliformes e 1%

Corynebacterium bovis.

Em trabalho realizado por Nickerson et al. (1995), no qual avaliaram a ocorrência de

mastite em rebanhos que adotavam medidas de controle contra moscas, observou-se que cerca de

70% das novilhas que apresentavam algum tipo de lesão na pele dos tetos, como por exemplo,

pequenas feridas ou abrasão, provavelmente causados por moscas, possuíam infecções

intramamárias, enquanto somente 30% das novilhas que apresentavam tecidos íntegros possuíam

infecções intramamárias. Os resultados obtidos pelos autores para os rebanhos com controle de

moscas foram: 32,9% Staphylococcus coagulase negativa, 5,6% Staphylococcus aureus, 3,7%

Streptococcus spp. 2,2,% Coliformes, enquanto que os resultados obtidos com os rebanhos sem

controle de moscas foram: 41,4% Staphylococcus coagulase negativa, 55,2% Staphylococcus

aureus, 20,7% Streptococcus spp. e 3,4% Actinomyces pyogenes.

Fox et al. (1995) analisaram amostras colhidas de novilhas em idade de reprodução e

imediatamente após o parto em quatro estados dos Estados Unidos da América, durante quatro

estações do ano. Tanto no pré-parto como no pós-parto ocorreu predominância dos

Staphylococcus coagulase negativa, nas quatro estações, em todos os estados, e a maior

ocorrência foi observada, no pré-parto no inverno na Lousiania (35,6%) e no pós-parto, na

primavera no estado de Vermont (36%).

Parker et al. (2007) analisaram amostras da secreção láctea de quartos mamários de 255

novilhas, obtidas quando os animais estavam com aproximadamente 31 dias pré-parto. As

frequências de isolamentos de Staphylococcus coagulase negativa no pré e pós-parto foram de

11,9% e 4,9%, respectivamente. Sampinom et al. (2009) colheram amostras de leite dos quartos

mamários de 185 novilhas durante o parto e 14 dias pós-parto e encontraram prevalências de

Staphylococcus coagulase negativa de 32% e 15%, respectivamente.

Paradis et al. (2010) avaliaram amostras colhidas de 1691 novilhas com

aproximadamente 30 dias pós-parto e relataram maior frequência de isolamentos dos

Staphylococcus coagulase negativa (9,9%), seguidos pelo Staphylococcus aureus (5,3%).

8

Levantamento realizado por Laffranchi et al. (2001) em quatro rebanhos leiteiros, localizados na

região norte do estado do Paraná, encontraram nas amostras de leite colhidas ao longo dos 120

primeiros dias de lactação de 457 quartos mamários de 88 vacas primíparas, (68,05%) de

Staphylococcus coagulase negativa, (12,25%) Corynebacterium bovis, (8,10%) Streptococcus

spp. Os autores concluíram que houve alta incidência de infecções intramamárias em vacas

primíparas, com predominância dos SCN, e que o leite dos quartos infectados apresentou alta

Contagem de Células Somáticas (CCS), comparado com os não infectados.

No Brasil, Costa et al. (1996), examinando 467 glândulas mamárias de 120 novilhas, de 6

(seis) rebanhos leiteiros, verificaram que 80% das novilhas apresentavam infecções

intramamárias, com 57% dos quartos mamários infectados, sendo que desse total, 49,2% eram

Staphylococcus spp., 95% foram caracterizados como SCN, Corynebacterium spp., correspondeu

a 7% dos isolamentos, 4% de Streptococcus spp. e microrganismos da Família Enterobacteriacea

(Klebsiella spp. e Escherichia coli) em 2% das glândulas mamárias infectadas .

2.4 – Mastite por Staphylococcus coagulase negativa

No passado pouco se sabia sobre a epidemiologia e patogenia das infecções

intramamárias por Staphylococcus coagulase negativa por serem considerados patógenos

secundários ou menores e, portanto, de pouca importância para o controle da mastite (HOGAN et

al. 1987). Atualmente são considerados os principais patógenos isolados nas amostras de leite de

animais com mastite. O termo coagulase negativa se refere ao teste laboratorial que diferencia

este grupo do Staphylococcus coagulase positivo. A maior parte dos pesquisadores não classifica

os SCN como agentes ambientais ou contagiosos, designando-os como “Microbiota oportunista

da pele do teto”, uma vez que esses agentes são normalmente encontrados na pele do teto, e dessa

forma podem ter acesso ao interior da glândula mamária resultando em infecção intramamária

(TRINDAD et al., 1990).

Staphylococcus coagulase negativo (SCN) são agentes de grande ocorrência na mastite

contagiosa. Diversas espécies já foram isoladas de amostras de leite de quartos mamários com

infecção. Dentre os mais importantes estão: S. epidermides, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.

9

warneri, S. hominis, S. simulans, S. lugudinensis, S. capitis, S. auricularis. S. pasteuri, S. caprae,

S. cohnii, S. xylosus, S. sacccharolyticus, S. sciuri, S. chromogenes, S. gallinarum, S. lentus, S.

equorum, S. felis, S. vitulinus, S. muscae, S. kloosii, S. arlettae, S. piscifermentans, S. condimenti,

S. succinus, S. fleurettii, S. carnosus (WINN et al., 2007).

Laffranchi et al. (2001), colheram amostras de leite ao longo dos 120 primeiros dias de

lactação, encontrando Staphylococcus chromogenes (4,08%), Staphylococcus haemolyticus

(4,08%) e Staphylococcus simulans (2,04%). Waage et al. (1999) analisaram amostras de leite

colhidas de quartos mamários de novilhas que apresentaram mastite até 14 dias pós-parto e

encontraram Staphylococcus simulans em 53,7% das amostras.

2.5 – Perfil de resistência aos antimicrobianos

O descobrimento dos antibióticos foi um grande avanço na terapêutica, tanto na medicina

veterinária quanto na medicina humana (ASCHBACHER, 1978). Com a utilização dos

antimicrobianos, na década de 1950, iniciaram as resistências bacterianas e, a partir desse período

essas resistências passaram a representar importância considerável em saúde pública (NAWAZ,

2002; RAPINI et al., 2004).

Muitas fazendas utilizam os antibióticos de maneira indiscriminada para diversos fins

terapêuticos, principalmente visando à cura da mastite. O abuso destes medicamentos pode ser

corrigido por meio de informações suficientes e exatas aos usuários, veiculadas por cooperativas

e centro de apoio técnico governamental, a difusão de boas práticas agrícolas e veterinárias, como

orientação aos produtores sobre o uso de antimicrobianos pode levar a uma melhor

conscientização das pessoas e deixar de ser um problema de saúde pública (MINIUSSI, 1992). A

escolha do antibiótico apropriado para a patologia é de extrema importância para o animal e para

a saúde da glândula mamária (SUMANO e OCAMPO, 1992), o que evita problemas com

resistência.

10

Beloti et al. (1997) avaliaram 150 amostras de leite de vacas positivas ao CMT e

encontraram 12,54% SCN, sendo que 30,30% foram resistentes a lincomicina, 27,27%

tetraciclina, 18,18% penicilina e novobiocina e 15,15% ampicilina e eritromicina.

Machado (2006) isolou 109 cepas de SCN de vacas em lactação e testou os perfis de

resistência a vários antimicrobianos, encontrando pelo menos uma cepa resistente a um

antibiótico, e a maior resistência foi observada contra a penicilina (93,5%), seguida pela

sulfonamida (88,9%), novobiocina (88,6%), ampicilina (85,3%), oxacilina (80,7%) e lincomicina

(76,1%).

Segundo Trabulsi e Alterthum (2005) as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa

que apresentarem resistência à oxacilina, são consideradas resistentes a todos os antimicrobianos

pertencentes ao grupo dos beta-lactâmicos.

Em unidades de terapia intensiva neonatal já foram encontrados 80% de cepas de S.

epidermidis (SCN) e 60% S.aureus (SCP), resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos (KNAUS

et al., 1985; CERCENADO et al., 1990).

Diversos autores encontraram uma elevada resistência em estirpes de SCN isoladas da

epiderme e de cateter venoso central de UTI, principalmente as neonatais (DIENER Jr. et al.,

1996; BALTIMORE 1998; MALIK et al., 1999; CUNHA e LOPES 2002; BERNARDI et al.,

2007).

2.5 – Produção de (slime) biofilme pelos Staphylococcus coagulase negativo

O biofilme é considerado importante fator de virulência, pois aumentam a capacidade das

estirpes aderirem e colonizarem as superfícies (AGUILLAR et al., 2001). São formados por

macromoléculas como polissacarídeos, proteínas, DNA, sais minerais, lipídeos, e no seu estado

hidratado podem conter cerca de 99% de água, protegendo as células da desidratação

(FIGUEIREDO, 2000). Podem ser constituídos de microrganismos de uma única espécie,

11

espécies e gêneros diferentes, e ficam alojados dentro da matriz polimérica auto-produzida, as

quais são aderidas em qualquer superfície, inerte ou viva (CONSTERTON et al., 1999).

Vários estudos mostraram que os Staphylococcus coagulase negativa produzem uma

substância extracelular que facilita a aderência e formação dos biofilmes (CHRISTENSEN et al.,

1982; PFALLER et al., 1988; COSTERTON et al., 1999). A formação do biofilme pode ser

determinada por diferentes métodos, entre eles o teste da microplaca, que avalia

espectrofotometricamente o filme bacteriano corado. Outro método utiliza o ágar vermelho

Congo, para identificar Staphylococcus spp produtores de biofilme, o qual se baseia no cultivo de

Staphylococcus spp sobre um meio de ágar sólido, suplementado com o corante Vermelho

Congo, e os Staphylococcus spp, são classificados como produtores ou não produtores de

biofilme conforme coloração apresentada pelos patógenos (CHRISTENSEN et al., 1982;

BASELGA et al., 1993).

Estudos “in vitro” realizados por Amorena et al. (1999) demonstraram que as bactérias

nos biofilmes tornaram-se de 10-1.000 vezes mais resistentes aos efeitos dos agentes

antimicrobianos quando comparadas com as células livres das mesmas estirpes. Os mecanismos

responsáveis pela resistência dos microrganismos nos biofilmes aos agentes antimicrobianos são:

demora na penetração dos agentes antimicrobianos através das matrizes dos biofilmes, taxa de

multiplicação alterada de organismos nos biofilmes, mudanças fisiológicas com o crescimento

dos biofilmes incluindo as células persistentes (MELO, 2008).

O ágar Vermelho Congo foi proposto como método alternativo para detectar a produção

de biofilme em Staphylococcus coagulase negativa, o que se confirmou em 77,7% das estirpes

(FREEMAN et al., 1989).

O estudo realizado com 27 cepas de Staphylococcus coagulase negativa isoladas de

cateter venoso central de pacientes de um hospital no interior do Estado de São Paulo mostrou

que 77,7% foram positivas para a produção de biofilme, por meio do método ágar Vermelho

Congo (BERNARDI et al., 2007).

12

13

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Rebanhos estudados

Foram utilizadas 87 novilhas, 348 glândulas mamárias, dos quais 40 animais são

pertencentes a uma propriedade localizada no município de Descalvado, estado de São Paulo

(fazenda 1), 18 novilhas pertencentes ao Pólo Regional Vale do Paraíba, localizado no município

de Pindamonhangaba (fazenda 2), 29 animais pertencentes ao Centro Apta Bovinos de Leite do

Instituto de Zootecnia, localizado no município de Nova Odessa (fazenda 3). O experimento foi

conduzido durante o período compreendido entre agosto de 2009 a setembro de 2011.

As análises foram conduzidas no Laboratório da Qualidade do Leite, pertencente ao

Centro Apta Bovinos de Leite do Instituto de Zootecnia, localizado no município de Nova Odessa

– SP.

3.2 – Manejos

4.2.1 - Fazenda 1:

14

Após o diagnóstico de gestação com confirmação de prenhes positiva, os animais foram

levados para uma área formada com gramíneas Tifton, e receberam uma dieta no cocho,

formulada segundo o (NRC, 2001) para atender as exigências nutricionais das novilhas em fase

de crescimento e gestação.

Com aproximadamente 60 dias pré-parto os animais receberam antibiótico intramamário,

selante interno nos tetos a base de subnitrato de bismuto, vacinas contra clostridioses, diarreia e

pneumonia bacterianas neonatais, diarreias virais e bacterianas neonatais, mastite ambiental e

uma dose de produto a base de Ivermectina 1%. Aos 30 dias antes da data prevista do parto

receberam a segunda dose das seguintes vacinas: diarreia e pneumonia bacterianas neonatais,

diarreias virais e bacterianas neonatais, mastite ambiental e vacinas contra doenças respiratórias,

reprodutivas e digestivas. Os animais foram alojados em piquetes próximos à maternidade e

receberam uma dieta no cocho, formulada segundo o (NRC, 2001); próximo à data de parto as

novilhas foram alojadas em baias individuais onde permaneceram até a parição.

3.2.2 - Fazenda 2:

Após serem inseminadas as novilhas foram encaminhadas para uma área formada por

capim-Vitória (Brachiaria brizantha, cv. Vitória), onde foram manejadas sob controle de lotação,

permanecendo até aproximadamente 60 dias pré-parto. A dieta durante este período foi composta

de cana-de-açúcar picada com uréia e concentrado, e formulada segundo o (NRC, 2001), para

atender às exigências nutricionais das novilhas em fase de crescimento e gestação.

Com 60 dias pré-parto, as novilhas foram trazidas para o piquete maternidade, formado

por capim-Vitória (Brachiaria brizantha cv. MG5 Vitória), e receberam dieta total no cocho,

composta por silagem de sorgo, capim picado e 2 Kg de concentrado/animal/dia. A dieta foi

formulada segundo o (NRC, 2001) para atender as exigências nutricionais das novilhas em fase

de crescimento e gestação. Após a parição a dieta foi formulada para atender as exigências

nutricionais de novilhas na 1ª lactação.

3.2.3.- Fazenda 3.

15

As novilhas após serem inseminadas permaneceram em sistema rotacionado formado por

capim-Tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia) ou capim-Vitória (Brachiaria brizantha cv.

Vitória), permanecendo até 60 dias antes da data prevista do parto.

Com aproximadamente 60 dias pré-parto as novilhas foram trazidas para o piquete

maternidade, formada por gramínea do gênero Cynodon, onde recebiam a dieta total nos cochos.

A dieta era composta de silagem de milho e 3 Kg de concentrado a base de milho triturado, farelo

de soja, farelo de algodão e sal mineral, formulada para atender as exigências nutricionais das

novilhas em fase de crescimento e gestação (NRC, 2001).

3.3 – Manejo de ordenha

3.3.1 - Fazenda 1.

As novilhas foram ordenhadas logo após a parição, independente do horário que ocorreu o

parto, sendo ordenhadas novamente às 5:00 e às 14:00 horas, permanecendo neste setor

aproximadamente até 10 dias de paridas, em seguida, foram transportadas até o “free-stall”, onde

foram distribuídas nos lotes já existentes e ordenhadas 3 vezes ao dia, com intervalo de 8 horas

entre as ordenhas. Era realizado o pré-dipping imergindo-se os tetos em solução de cloro a 10% e

em seguida secando-os com papel toalha descartável (uma folha para cada teto), o pós-dipping foi

realizado com a mesma solução utilizada no pré-dipping.

3.3.2 - Fazenda 2.

Os animais foram ordenhados com ordenhadeira mecânica tipo Tandem, duas vezes ao

dia, às 6:00 e 15:00 horas, e receberam 1,5 Kg de concentrado durante o período de ordenha. Os

tetos foram lavados com água e sabão e secos com papel toalha descartável (uma folha para cada

teto). Após o término da lavagem foi realizado o teste de Tamis que tem como finalidade detectar

a presença de mastite clínica, após a ordenha realizava-se o pós-dipping, com solução de iodo

glicerinado a 0,5%.

16

3.3.3.- Fazenda 3

As ordenhas foram realizadas duas vezes ao dia, sendo nos horários das 7:00 e 15:00

horas, com ordenhadeira mecânica tipo Tandem. Os tetos eram lavados com água corrente e

secos com papel toalha descartável (uma folha para cada teto). Após a lavagem e secagem dos

tetos era realizado o teste de Tamis para identificar os animais com mastite clínica. Após a

ordenha, foi realizado o pós-dipping com solução de iodo glicerinado a 0,5%.

3.4 – Delineamento experimental e tratamentos

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado e os animais foram

distribuídos aleatoriamente nos tratamentos.

3.4.1 - Fazenda 1:

Por se tratar de fazenda comercial optou-se por não modificar o manejo adotado na

propriedade, portanto todas as novilhas foram tratadas com Cefalônio 0,25g, antimicrobiano

semi-sintético de infusão intramamária com ação bactericida, recomendado para o tratamento de

vaca seca e pertencente ao grupo dos beta-lactâmicos.

3.4.2 - Fazenda 2:

As novilhas foram divididos nos seguintes grupos:

� 10 animais não tratados – Grupo Controle;

� 8 animais tratados – Grupo tratados; antibiótico de infusão intramamário

recomendado para vaca-seca, (Composição química: Sulfato de Gentamicina

677mg).

3.4.3 - Fazenda 3:

17

As novilhas foram divididas nos seguintes grupos:

� 14 animais não tratados - Grupo controle;

� 15 animais tratados - Grupo tratado; antibiótico de infusão intramamário

recomendado para vaca-seca, (Composição química: Penicilina G Potássica

500.00 UI, Penicilina G Procaína 1.000.000 UI, Neomicina 0,732g).

3.5 – Colheita do material biológico das novilhas

3.5.1 – Período pré-parto

Sessenta dias antes da data estimada do parto, as secreções dos quartos mamários das

novilhas foram coletadas, obedecendo a uma rigorosa antissepsia. Após o término das colheitas,

os animais pertencentes aos grupos tratados receberam o antibiótico por infusão intramamária

recomendado para vaca seca de eliminação e absorção lenta.

As amostras de secreção foram colhidas individualmente em tubos de ensaio esterilizados,

previamente identificados com o nome ou número dos animais e do quarto mamário, após a

lavagem dos tetos com água e sabão, secos com papel toalha descartável e antissepsia do óstio

papilar com álcool etílico 70% GL, conforme recomendação do “National Mastitis Council”

(NMC) (HARMON et al., 1990). O material foi acondicionado em caixas de material isotérmico

com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação das bactérias.

3.5.2 – Parição

No dia do parto, foram colhidas amostras de colostro dos quartos mamários das 87

novilhas, de acordo com as recomendações do National Mastitis Council” (NMC) (HARMON et

al., 1990).

18

3.5.3 - Dez dias após a data de parição

Decorridos 10 dias após a data de parição, amostras de leite de todos os quartos mamários

foram colhidas individualmente em tubos de ensaio, de acordo com as recomendações do

“National Mastitis Council” (NMC) (HARMON et al., 1990), e os tubos foram identificados com

o nome ou número do animal. Após o término das colheitas o material foi acondicionado em

caixas de material isotérmico com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e

identificação das bactérias.

3.5.4 – Colheitas mensais

Após a parição, amostras de leite de todas as novilhas foram colhidas individualmente em

tubos de ensaio esterilizados, identificados com o nome ou número do animal e o quarto

mamário, (Figura 1), as colheitas foram realizadas de acordo com as recomendações do “National

Mastitis Council” (NMC) (HARMON et al., 1990). O material foi acondicionado em caixa de

material isotérmico com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação

das bactérias. As colheitas mensais foram realizadas aproximadamente até 305 dias de lactação.

Figura 1: Colheita de leite para análise laboratorial.

19

3.6 – Análises Laboratoriais

3.6.1 - Isolamento e identificação de microrganismos

Alíquotas de 100 µL de leite foram cultivadas em placas de ágar sangue de ovino 5%,

incubadas por aerobiose em estufa bacteriológica a 37ºC e analisadas após 24 e 48 horas.

Figura 2: Placa de ágar sangue com crescimento bacteriano.

Após a incubação, foram registradas as características de crescimento das colônias em

ágar sangue, como produção de hemólise, tipo de desenvolvimento e pigmentação das colônias

(Figura 2), e produção da catalase. Em seguida, observaram os caracteres morfo-tintoriais,

utilizando a técnica de coloração de Gram. As colônias que se revelaram catalase positiva e cocos

Gram positivos foram submetidas às provas da coagulase lenta com plasma de coelho

(HOLMERG, 1973). As leituras para a verificação da produção de coagulase foram realizadas

uma, duas, três, quatro e 24 horas após a incubação das amostras a 37ºC (GARCIA; MORENO;

BERGDOLL, 1980).

As colônias que revelaram-se como catalase positiva e bastonetes gram positiva foram

classificadas como Corynebcaterium spp, segundo Collins e Cumminis (1986).

20

3.6.2 - Identificação dos Staphylococcus coagulase negativa

As estirpes que se revelaram catalase positiva e coagulase negativa foram submetidas à

prova da Oxidação e Fermentação da Glicose (EVAN et al., 1955), e antibiograma para verificar

se as amostras eram resistentes à bacitracina (0,04 U), indicada pela ausência de halo de inibição

ou formação de halo de até 9 mm, e pela sensibilidade à furazolidona (100 µg) caracterizada por

halos de inibição maior que 15 mm de diâmetro (BAKER, 1984.) (Figura 3).

Figura 3: Antibiograma com os discos que continham os princípios ativos – Furazolidona

(acima) e Bacitracina (abaixo).

Para diferenciar as espécies de Staphylococcus coagulase negativa as colônias foram

submetidas a provas bioquímicas, utilizando os seguintes açúcares: xilose, arabinose, sacarose,

trealose, manitol, maltose, lactose, xylitol, ribose e frutose. Além da caracterização de

hemolisinas, foram realizadas provas de redução de nitrato, segundo metodologia preconizada

por (Kloss e Schleifer, 1975) e kloos e Bannerman (1999).

3.6.3 - Teste de sensibilidade a antimicrobianos

Após a identificação das espécies de Staphylococus Coagulase negativa, estas

mesmas foram submetidas a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, de acordo com os

padrões do “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS, 2005) utilizando-

21

se discos impregnados com os seguintes princípios ativos: Ceftiofur (30 µg), Neomicina (10 µg),

Cefalexina (30 µg), Gentamicina (10 µg), Penicilina (10 µg), Florfenicol (30 µg), Oxacilina (1

µg), Ampicilina (10 µg) e Cefaclor (30 µg) (Figura 4). O crescimento das zonas de inibição foi

avaliado de acordo com os padrões do “National Committee for Clinical Laboratory Standards”

(WOODS e WASHINGTON, 1995).

Figura 4: Placa de Antibiograma.

3.6.4 - Ensaio para a verificação da produção da cápsula mucosa (slime)

A produção da cápsula mucosa por estirpes de Staphylococcus coagulase negativa foi

determinada pelo cultivo em placas de (CRA) Ágar Vermelho Congo de acordo com as

recomendações de Freeman et al. (1989). As placas de CRA com as bactérias foram incubadas a

37ºC por 24 horas, com posterior estocagem à temperatura ambiente por 48 horas. A produção de

colônias negras rugosas por estirpes de Staphylococcus coagulase negativa produtoras de mucosa

foi determinada como positiva.

3.7 – Amostragem e análises estatísticas

22

As novilhas amostradas para colheita de material foram selecionadas por um processo não

probabilístico constituído de todos os animais acessíveis no período de colheita em cada

propriedade.

Para a descrição das frequências dos patógenos usou-se as frequências absolutas e

relativas por grupos de novilhas tratadas e não tratadas apresentadas em tabelas e gráficos.

Para comparar as diferenças entre as prevalências de patógenos nos grupos tratados e não

tratados, usou-se o teste Z para duas proporções ao nível de 95% de confiança. A hipótese nula

do teste Z considera a igualdade entre as proporções e a hipótese alternativa considera que as

proporções diferirem entre si. Para o teste Z bi-caudal para duas proporções tem-se:

H0: p1 - p2 = p0

H1: p1 - p2 ≠ p0

Onde, p1 (grupo das novilhas não tratadas) e p2 (grupo das novilhas tratadas), são as

proporções de amostras de leite positivas para a ocorrência de patógenos na população p1 e p2,

respectivamente, que representam as vacas primíparas e p0 indica que a diferença entre as duas

proporções é igual a zero. O Software Minitab v. 13 foi usado para análise estatística.

O odds ratio (OR), que é uma medida de intensidade de associação foi utilizado para

calcular quantas vezes a prevalência do patógeno no grupo tratado é menor que a prevalência dos

patógenos no grupo não tratado, conforme (RUMEL, 1986). O odds ratio é calculado pela razão:

(a/b)/(c/d) ou (ad)/(bc), no apêndice (a) apresenta-se em forma didática. Calcula-se uma

estimativa do seu intervalo de confiança de 95% associado ao Odds ratio.

Foi realizado o estudo estatístico, utilizando o teste do Qui-quadrado, para avaliar se

houve diferença significativa a nível de 95% de confiança, quando comparou-se os grupos de

novilhas não tratadas e tratadas durante o pré-parto. O teste foi realizado no Software Minitab v.

13.

23

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 – Perfil microbiológico

Na tabela 1 podemos observar predominância de Staphylococcus coagulase negativa

isolados das amostras da secreção da glândula mamária, colostro e amostras de leite das novilhas

tratadas no pré-parto pertencentes ao rebanho leiteiro denominado de Fazenda 1. Das 160

amostras colhidas no pré-parto, foram isolados patógenos em 64 (40,02%) amostras, sendo

71,85% de SCN.

24

Tabela 1: Frequência absoluta (FA) e relativa (FR) dos microrganismos isolados da secreção da

glândula mamária, colostro e leite das novilhas tratadas durante o período pré–parto na Fazenda

1, São Paulo, Brasil, 2011.

PATÓGENOS

SCN SCP Strep. Cory. spp Cocos G - S. aureus Bacilos G- COLHEITAS

FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR)

Pré-parto 46 (28,75) 11 (6,88) 0 0 3 (1,88) 1 (0,63) 3 (1,88)

Parto 2 (1,25) 0 0 0 0 0 0

3ª 3 (1,88) 0 1 (0,63) 0 0 1 (0,63) 0

4ª 3 (1,88) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0

5ª 8 (5,0) 0 0 0 0 0 0

6ª 8 (5,0) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0

7ª 7 (4,38) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0

8ª 6 (3,75) 0 0 0 1 (0,63) 0 0

9ª 5 (3,13) 0 0 0 0 0 0

10ª 4 (2,5) 0 3 (1,88) 2 (1,25) 1 (0,63) 2 (1,25) 0

11ª 4 (2,5) 0 0 0 0 0 0

12ª 2 (1,25) 0 0 0 0 0 0

13ª 0 0 0 0 0 0 0

SCN = Staphylococcus coagulase negativa; SCP = Staphylococcus coagulase positiva; Strep = Streptococcus; Cory = Corynebacterium spp; Cocos G-. = Cocos Gram negativos; S. aureus = Staphylococcus aureus; Bacilo G - = Bacilos Gram negativos.

Nas 160 amostras de secreção dos quartos mamários colhidas das novilhas no pré-parto

verificou-se maior ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa (28,75%), seguido dos

Staphylococcus coagulase positiva (6,88%), (figura 5), valores estes inferiores aos encontrados

por Laffranchi et al., (2001), que ao realizarem levantamento microbiológico em amostras de

leite de 88 vacas primíparas, oriundas de quatro rebanhos leiteiros, durante os 120 dias pós-parto,

encontraram Staphylococcus coagulase negativa em 69,14% das amostras. Segundo os autores as

infecções por Staphylococcus coagulase negativa e Streptococcus spp. decrescem ao longo das

primeiras semanas pós-parto.

Após o parto, verifica-se maior ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa,

durante as 5ª e 6ª colheitas, período compreendido aos meses de fevereiro e março,

correspondentes ao final do verão e início do outono, estações do ano que apresentam baixa

quantidade de chuva.

25

1,25 1,88

5 5

4,38 3,75 3,132,5 2,5 1,25

28,75

1,880

5

10

15

20

25

30

35

Pré-p

arto

Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10

ª11

ª12

ª13

ª

Coletas

%

SCN

SCP

S. aureus

Figura 5: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase negativa (SCN),

Staphylococcus coagulase positiva (SCP) e Staphylococcus aureus, isolados das secreções das

glândulas mamàrias, colostro e das amostras de leite, durante o período de coleta na (Fazenda 1),

São Paulo, Brasil, 2011.

No pré-parto ocorreu 28,75% de Staphylococcus coagulase negativa, valores inferiores

aos encontrados por Parker et al., (2007) que avaliaram 255 novilhas divididas em dois grupos,

tratadas e não tratadas, com um medicamento, selante interno de teto, a base de subnitrato de

bismuto, com 31 dias pré-parto e encontraram maior prevalência dos Staphylococcus coagulase

negativa (10,4%) nas amostras. Os autores verificaram que houve redução no isolamento de SCN

(4,5% de isolamento no parto), nos animais que receberam selante, esses resultado foram

superiores aos encontrados na fazenda 1 (1,25%), provavelmente em razão do tempo de infusão

do selante que na fazenda 1 foi de 60 dias pré-parto.

Com aproximadamente 15 dias de lactação ocorreu predominância dos Staphylococcus

coagulase negativa (1,88%), enquanto que Parker et al., (2008), analisando amostras de leite de

animais com 14 dias pós-parto, encontraram 6,9% de Staphylococcus coagulase negativa nos

quartos mamários com mastite; os autores investigaram em 1.067 novilhas o efeito da infusão do

26

selante interno de teto, e três aplicações intramusculares do antimicrobiano a base de tilosina 5g

(antibiótico de ação bacteriostática, pertencente à classe dos macrolídeos). O resultado

encontrado no pós-parto no presente estudo está abaixo dos valores encontrados pelos autores,

diferença esta que pode estar relacionada ao princípio ativo e o modo de ação dos medicamentos

e as amostras analisadas, uma vez que os autores trabalharam somente com quartos mamários

portadores de mastite.

Segundo Costa et al. (2004), em propriedades onde a infecção de quartos mamários é baixa

durante o pré-parto, não se justifica o uso de antimicrobianos durante este período, o que evita

gastos desnecessários com medicamentos, além de riscos de resíduos de antibióticos no leite. Os

autores recomendam que para adotar medidas de tratamento com antimicrobianos em novilhas, é

necessário realizar exames microbiológicos, verificar se os animais apresentam mastite subclinica

ou clinica durante o parto, já que existe uma diminuição da ocorrência de patógenos logo após a

parição, e a aplicação de antimicrobianos intramamário em todos os animais pode levar ao

surgimento de estirpes resistentes, trazendo prejuízos futuros.

A figura 6 mostra a frequência relativa dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP),

Staphylococcus coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, isolados durante todo o

período de coleta, nos animais que não receberam antimicrobiano durante o pré-parto, na fazenda

2.

Podemos observar na figura 6 predominância de Staphylococcus coagulase negativa

(88,89%) isolados das amostras da secreção da glândula mamária no pré-parto nos animais não

tratados pertencentes á Fazenda 2.

27

88,89

62,5

2528,57

42,86

60

0

20

40

60

80

100

120

Pré-p

arto


ª11

ª12

ª13

ª14

ª15

ª

Coletas

%

SCP

SCN

S. aureus



animais pertencentes ao grupo não tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.

Nos quartos mamários das novilhas tratadas observou-se 100% de isolamentos de

Staphylococcus coagulase negativa no pré-parto, enquanto que no parto prevaleceram os

Staphylococcus Coagulase positiva 50% (Figura 7).

A figura 7 mostra que a ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados com

aproximadamente uma semana de lactação foi 40%, enquanto que Pardo et al. (1998) avaliando

332 amostras de leite dos quartos mamários de novilhas na primeira semana após o parto,

encontraram 20,4% de mastite clínica em um ou mais quartos e a maior ocorrência foi de

Staphylococcus coagulase negativa (35,2%). A menor frequência de Staphylococcus coagulase

negativa observada por Pardo et al. (1998) pode ser atribuída à realização dos isolamentos

microbiológicos somente dos quartos mamários que apresentavam mastite clínica, diferente do

procedimento realizado no presente estudo, no qual foram feitos isolamentos nas amostras de

leite de todos os quartos mamários.

28

100

33,33

40

14,29

25

10

0

20

40

60

80

100

120

Pré-p

arto


ª11

ª12

ª13

ª14

ª15

ª

Coletas

%

SCP

SCN

S. aureus



animais pertencentes ao grupo tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.

Sampinon et al., (2009) avaliando o efeito da Cloxacilina 600 mg (medicamento

bactericida de pequeno espectro, pertencente ao grupo dos beta-lactâmicos), aplicado entre 8 e 10

semanas pré-parto em 369 novilhas, encontraram maior ocorrência de Staphylococcus coagulase

negativa no parto, no grupo tratado (32%) e no grupo não tratado (42%). No presente estudo, nas

colheitas realizadas durante o parto, o patógeno que apresentou maior ocorrência no grupo

tratado foi o Staphylococcus coagulase positiva (50%), enquanto que no grupo não tratado foi o

Staphylococcus coagulase negativa (60%), resultados estes que não condizem com os

encontrados pelos autores, entretanto com 10 e 14 dias pós-parto a frequência dos Staphylococcus

coagulase negativa encontrada pelos autores foi de (15% e 19%) para os grupos tratados e não

tratados, em nosso estudo o patógeno que apresentou maior ocorrência aos 10 dias pós-parto no

grupo não tratado foi o Staphylococcus coagulase positiva (42,9%) e no grupo tratado foi

Staphylococcus coagulase negativa (30,7%). Os resultados foram semelhantes somente para o

grupo de novilhas tratadas.

29

Com aproximadamente 30 dias de lactação a ocorrência dos Staphylococcus coagulase

negativa nos grupos não tratado e tratado foi 30% e 27,7%, respectivamente, enquanto que no

levantamento microbiológico realizado por Paradis et al. (2010) no Canadá, envolvendo 1.691

novilhas, com uma média de 30 dias pós-parto, foram encontradas 24,5% das novilhas com

infecções intramamárias, tendo como patógeno de maior frequência os Staphylococcus coagulase

negativa (9,9%). Essa menor ocorrência encontrada por estes autores pode estar relacionada às

amostras colhidas dos quartos mamários somente com mastite clínica, pois as análises somente

desses quartos pode deixar de identificar os patógenos que possivelmente poderiam estar

presentes nas glândulas mamárias sem provocar infecções nos períodos de colheita.

Na fazenda 2, as variações dos patógenos mostrados nas figuras 6 e 7, pode estar

relacionado a falta de higiene durante a ordenha, pois não é realizado o pré-dipping,

procedimento que tem como finalidade eliminar os patógenos presentes na epiderme dos tetos,

diminuir a contaminação dos equipamentos de ordenha, que consequentemente diminuíra a

disseminação dos microrganismos entre os animais.

As figuras 8 e 9 apresentam as ocorrências dos agentes microbiológicos isolados das

novilhas no pré-parto, parto e lactação da fazenda 3.

Na fazenda 3, Staphylococcus coagulase positiva prevaleceram no pré-parto e no parto

para o grupo de novilhas não tratadas (69,2% e 39,3%) e tratadas (100% e 39,3%), enquanto que

os Staphylococcus coagulase negativa apresentaram maior ocorrência quando os animais estavam

com 200 dias de lactação.

Staphylococcus coagulase negativa são considerados agentes de baixa patogenicidade, e

as infecções causadas pelo patógeno manifestam-se de forma subclínica, mas as infecções

intramamárias em animais de primeira lactação podem atingir cerca de 10 a 20% dos quartos

mamários. De acordo com Santos (2009) novilhas podem apresentar alta ocorrência de mastite

causada pelo Staphylococcus coagulase negativa após o parto, com um rápido declínio dos casos

após a segunda semana de lactação, fato que não foi observado neste estudo, pois conforme se

30

visualiza nas Figuras 8 e 9, os Staphylococcus coagulase negativa prevaleceram durante a

lactação.

60

44,4440

57,14

30

41,18

30

18,19

35,71

28,58

15,38

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Pré-p

arto


ª11

ª12

ª13

ª14

ª15

ª

Coletas

%

SCN

SCP

S. aureus



animais pertencentes ao grupo não tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.

Conforme se ilustra a Figura 9, Staphylococcus coagulase negativa apresentaram

ocorrência ao parto (28,58%), e permaneceram sendo isolados por toda a lactação com exceção

da 12ª até a 15ª colheita, com um pico de 80% de isolamentos aos 200 dias de lactação. Segundo

Mcdonald (1982), Munch-Petersen (1970) e Oliver e Sordillo (1988), as glândulas mamárias de

novilhas poderiam conter bactérias no pré-parto, observação que pode ser confirmada através dos

resultados encontrados no presente estudo.

Os resultados obtidos no presente estudo na fazenda 3 estão abaixo dos encontrados por

Compton et al. (2007), que analisaram amostras de colostro e leite de quartos mamários de 708

31

novilhas e encontraram três semanas antes do parto predominância dos Staphylococcus coagulase

negativa (13,5%), com diminuição na ocorrência do patógeno 5 dias após o parto (9,7%).

10

50

60

42,85

80

71,44

50

50

27,2725

30,7525

0

20

40

60

80

100

120

Pré-p

arto


ª11

ª12

ª13

ª14

ª15

ª

Coletas

%

SCN

SCP

S. aureus



animais pertencentes ao grupo tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.

A tabela 2 mostra os valores do qui-quadrado, e se houve diferença significativa quando

se comparou os grupos de novilhas não tratadas com as novilhas tratadas, nas fazendas 2 e 3,

respectivamente.

Podemos observar na tabela 2, quanto aos isolamentos de Staphylococcus coagulase

positiva e Staphylococcus coagulase negativa, não houve diferença significativa a nível de 5% de

probabilidade pelo teste do qui-quadrado, na fazenda 2, enquanto na fazenda 3, houve diferença

significativa somente para Staphylococcus coagulase positiva.

32

Tabela 2: Frequência relativa (FR) dos patógenos isolados das amostras coletadas dos tetos das

novilhas durante todo o período do experimento, animais pertencentes aos grupos tratado e não

tratado e o valor do Qui-quadrado, (Fazendas 2 e 3), São Paulo, Brasil, 2011.

Fazenda 2 Fazenda 3

Patógenos Grupo de Novilhas Positivo

(FR%) Qui-

Quadrado P Positivo (FR%)

Qui-Quadrado

P

Não Tratadas 18 56 S. coagulase positiva

Tratadas 13 0,358 ns 0,549

26 12,174* 0,0001

Não Tratadas 24 47 S. coagulase negativa

Tratadas 14 1,629 ns 0,202

43 0,274 ns 0,601

Não Tratadas 22 18 S. aureus

Tratadas 43 8,512 * 0,004

8 4,767* 0,029

Não Tratadas 34 ---------- Corynebacterium spp.

Tratadas 17 3,829 * 0,05

---------- ------------- -------

Não Tratadas 0 40 Streptococcus spp.

Tratadas 2

-------------

--------

43 0,064 ns 0,8

Não Tratadas ---------- 12 Cocos G -

Tratadas ---------- ------------- --------

5 3,044 ns 0,081

Não Tratadas 2 6 Bacilos G -

Tratadas 3

0,317 ns 0,574

11

1,397 ns 0,23

SCP: Staphylococcus coagulase positiva; SCN: Staphylococcus coagulase negativa; S. aureus: Staphylococcus aureus; Cocos G -: Cocos Gran negativos; Bacilos G -: Bacilos Gran negativos. * = Teste de Qui-quadrado para a independência da ocorrência de patógeno nos tetos dos nos grupos tratado e não tratado foi significativo a 5% de probabilidade. ns = Teste de Qui-quadrado para a independência da ocorrência de patógeno nos tetos nos grupos tratado e não tratado foi não significativo a 5% de probabilidade. ----- = valores iguais a zero. P: valor da probabilidade calculada, no teste do Qui-quadrado.

Conforme mostra a tabela 3 quando houve diferença significativa para a proporção de

patógenos ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Z, calculou-se através do Odds ratio, a

probabilidade de ocorrência dos patógenos nos grupos não tratados em relação aos tratados.

Assim, na fazenda 2 o Odds ratio da prevalência do Staphylococcus aureus para os grupos de

novilhas não tratadas e tratadas foi significativo a 5% de probabilidade igual a 0,46.Portanto, a

probabilidade de prevalência do Staphylococcus aureus no grupo não tratado foi de 46% em

33

relação ao grupo tratado. O Odds ratio da prevalência para o patógeno Corynebacterium spp não

foi significativo para o grupo não tratado e tratado na fazenda 2. Na fazenda 3 o Odds ratio da

prevalência do Staphylococcus coagulase positiva para os grupos de novilhas não tratadas foi de

2,29 vezes a prevalência do patogeno no grupo tratado. E, para o patógeno Staphylococcus

aureus, o Odds ratio de sua prevalência foi significativo a 5% de probabilidade e igual a 2,45.

Portanto, a prevalência do patógeno no grupo não tratado foi de 2,45 vezes a prevalência do

grupo tratado. No apêndice (b) apresentam-se os resultados do teste Z para comparar as

proporções, que confirmam as significâncias observadas no cálculo do Odds ratio.

Tabela 3: Frequência absoluta, valor do Odds-Ratio e Intervalo de confiança (IC) do Odds-Ratio,

dos patógenos isolados das novilhas pertencentes aos grupos não tratadas e tratadas, (Fazendas 2

e 3), São Paulo, Brasil, 2011.

Fazenda. 2 Fazenda. 3

Patógeno Não Tratados

Tratados

Odds Ratio (OR)

IC 95% Não

Tratados

Tratados Odds Ratio (OR)

IC 95%

S. coagulase positiva 18 a 13 a 1,25 0,60-2,58 56 a 26 b 2,29 1,42-3,68

S. coagulase negativa 24 a 14 a 1,54 0,79-3,03 47 a 43 a 1,12 0,73-1,72

S. aureus 22 a 43 b 0,46 0,27-0,78 19 a 8 b 2,45 1,07-5,64

Corynebacterium spp 34 a 17 b 1,8 0,99-3,27 0 0 ------- ------------

Streptococcus spp 0 2 ------- -------- 40 a 43 a 0,94 0,61-1,47

Cocos G - . 0 0 ------- -------- 12 a 5 a 2,47 0,86-7,04

Bacilos G - . 2 a 3 a 0,6 0,10-3,61 6 a 11 a 0,55 0,2-1,50

TOTAL 455 410 ----------------------- 765 779 ------------------------

Letras iguais, não diferem nas frequências entre si.

As espécies de SCN identificadas das 225 estirpes isoladas durante todo o período de

colheita das amostras dos quartos mamários de novilhas tratadas e não tratadas são apresentados

na tabela 4.

34

Tabela 4: Frequência absoluta (FA) e frequência relativa (FR) das espécies de Staphylococcus

coagulase negativa (SCN) identificados dos quartos mamários das novilhas pertencentes aos

grupos tratados e não tratados, durante todo o período de colheita, nas (Fazendas 1, 2 e 3), São

Paulo, Brasil, 2011.

Espécies de SCN Fazenda 1 Fazenda 2 Fazenda 3

S. xylosus 3 (3,06%) 0 3 (3,33%) S. cohni 1 (1,02%) 0 1 (1,11%) S. capitis 4 (4,08%) 0 3 (3,33%)

S. epidermidis 10 (10,20%) 0 2 (2,22%)

S. saprophyticus 13 (13,27%) 1 (3,45%) 0

S. haemolyticus 9 (9,18%) 0 0 S. warneri 0 0 9 (10%) S. hominis 8 (8,16%) 8 (27,59%) 27 (30%) S. simulans 50 (51,02%) 20 (68,97%) 45 (50%)

Total 98 (100%) 29 (100%) 90 (100%)

Staphylococcus simulans foi a espécie que apresentou maior ocorrência nas fazendas 1, 2

e 3, (51,02%%, 68,97% e 50%, respectivamente). Staphylococcus coagulase negativa são

considerados um dos principais patógenos isolados de animais com mastite (TRINDAD,

NICKERSON e ALLEY, 1990), podendo ser encontrado nos quartos mamários de novilhas que

não apresentam sinais clínicos de mastite, fato que foi observado neste estudo.

Os S. epidermidis, S. chromogenes e S. simulans, são considerados os principais

Staphylococcus coagulase negativa causadores de mastite em novilhas (NADER FILHO et al.,

1985; LANGONI et al., 1991), Laffranchi et al., (2001), encontraram Staphylococcus

chromogenes (4,08%), Staphylococcus haemolyticus (4,08%) e Staphylococcus simulans (2,04%)

em quartos mamários de vacas, ao longo dos 120 dias de lactação.

Nickerson et al. (1995) analisaram amostras coletadas de secreções das glândulas

mamárias de novilhas 31 dias pré-parto, e encontraram Staphylococcus hominis (6%),

Staphylococcus simulans (6,0%), Staphylococcus xylosus (1,1%), Staphylococcus warneri

(3,0%), Staphylococcus epidermidis (3,0%). A frequência do Staphylococcus simulans

35

encontrada pelos autores foi menor do que a encontrada no trabalho, os autores possivelmente

tenham encontrado uma menor ocorrência de Staphylococcus simulans porque coletaram

amostras somente das secreções das glândulas mamárias no pré-parto, não realizando colheitas

quando os animais estavam em lactação.

Waage et al. (1999) encontraram Staphylococcus simulans de quartos mamários de

novilhas que apresentaram mastite até 14 dias pós-parto (53,7%), no presente estudo a ocorrência

dos Staphylococcus simulans foi de 50,94%, 68,97% e 50%, nas fazendas 1, 2 e 3,

respectivamente, a alta frequência das espécies de Staphylococcus coagulase negativa

identificadas nas três propriedades mostra que os profissionais e os produtores devem dar mais

atenção a esta categoria animal, principalmente durante o pré-parto e parto.

Staphylococcus coagulase negativa representam o maior componente da microbiota

cutânea e por viverem em equilíbrio com esse ecossistema foram descritos como microrganismos

avirulentos. Durante a última década, houve um progresso na identificação de gênero, espécies e

subespécies de patógenos, permitindo aos clínicos identificarem as variedades de SCN presentes

em amostras clínicas e os implicarem como agentes etiológicos de uma série de processos

infecciosos, sendo considerado um dos principais patógenos isolados dos quartos mamários de

animais portadores de mastite (BONNA et al., 2007; PARADIS et al., 2010).

As infecções causadas pelos Staphylococcus coagulase negativa vêm aumentando com o

passar do tempo, fato este que levou os profissionais a estudarem as espécies existentes, pois

estas são responsáveis por diversas patologias em animais. Staphylococcus coagulase negativa

têm sido isolados com grande frequência em pessoas que estão em UTI e portadoras de cateter

venoso central (DIENER JR. et al., 1996; BALTIMORE, 1998; MALIK et al., 1999; CUNHA &

LOPES, 2002; BERNARDI et al., 2007;).

4.2 – Perfil antimicrobiano dos Staphylococcus coagulase negativa.

Na tabela 5 podemos observar os perfis de resistências de Staphylococcus coagulase

negativa isolados das amostras da secreção da glândula mamária, colostro e amostras de leite das

36

novilhas tratadas e não tratadas no pré-parto pertencentes aos rebanhos leiteiros das fazendas 1, 2

e 3.

Tabela 5: Perfis antimicrobianos de Staphylococcus coagulase negativa, isolados de amostras



FAZENDA 1

PERFIL

Resistente Intermediário Sensível Princípios Ativos

F.A F.R (%) F.A F.R (%) F.A F.R (%)

Florfenicol 30 µg 4 3,77 2 2,12 100 94,34

Ampicilina 10 µg 18 16,98 - ----- 88 83,02

Cefalexina 30 µg 4 3,77 - ----- 102 96,23

Ceftiofur30 µg 3 2,83 - ----- 103 97,17

Penicilina 10 µg 14 13,21 - ----- 92 86,79

Neomicina 10 µg - ----- - ----- 106 100,00

Oxacilina 1 µg 3 2,83 - ----- 103 97,17

Gentamicina 10 µg 4 4.24 - ----- 102 96,23

FAZENDA 2

Florfenicol 30 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76

Ampicilina 10 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76

Cefalexina 30 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76

Ceftiofur30 µg 5 17,24 2 6,90 22 75,86

Penicilina 10 µg 9 31,03 - ----- 20 68,97

Neomicina 10 µg 0 0,00 1 3,45 28 96,55

Oxacilina 1 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76

Gentamicina 10 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76

FAZENDA 3

Florfenicol 30 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Ampicilina 10 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Cefalexina 30 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Ceftiofur30 µg 12 13,33 6 6,67 72 80,00

Penicilina 10 µg 47 52,22 - ----- 43 47,78 Neomicina 10 µg 1 1,11 2 2,2 87 96,67

Oxacilina 1 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Gentamicina 10 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67

R: resistente; I: Intermediário e S: sensível.

37

Os animais que apresentarem estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, resistentes à

oxacilina, não responderam a terapias realizadas com antimicrobianos pertencentes ao grupo dos

beta-lactâmicos (TRABULSI e ALTERTHUM., 2005).

Dentre as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa isoladas na fazenda 1,

percentuais de resistências foram observadas contra a ampicilina (16,98%), penicilina (13,21%) e

gentamicina (4,24%), assim como também uma importante resistência à oxacilina 2,83%.

Machado (2006) trabalhou com vacas em lactação e encontraram alta resistência das

estirpes de Staphylococcus coagulase negativa a vários antimicrobianos: penicilina (93,5%),

ampicilina (85,3%) e oxacilina (80,7%), resultados estes bem superiores aos encontrados no

presente estudo, realizado com novilhas que podem vir a aumentar sua carga microbiana

resistente com o decorrer do tempo.

Na fazenda 2 observou-se elevada resistência à penicilina (31,03%), enquanto que

17,24% das estirpes foram resistentes à oxacilina e conseqüentemente, a todos os antibióticos do

grupo dos beta-lactâmicos. Bonna et al. (2007) encontraram estirpes resistentes à penicilina

(79,2%), amoxicilina (21,8%), ampicilina (54,3%), e sendo que 100% das estirpes foram

sensíveis à oxacilina, resultados estes superiores aos do presente estudo, no qual foi encontrada

considerável resistência à oxacilina.

Na fazenda 3, ocorreu elevada resistência à penicilina 52,22%, enquanto que 13,33% das

estirpes apresentaram resistência a oxacilina, consequentemente esses animais não responderiam

à terapia realizada com antimicrobianos do grupo dos beta-lactâmicos segundo Trabulsi e

Alterthum (2005). O antibiótico utilizado no tratamento pré-parto das novilhas foi a base de

penicilina, principio ativo que os Staphylococcus coagulase negativa apresentaram alta resistência

52,22%, esse resultado pode estar relacionado a baixa resposta aos tratamentos das novilhas do

grupo tratado quando se compara com o grupo não tratado, nas colheitas pré-parto e parto. A

utilização de antibióticos intramamários no pré-parto não deve ser feita, indiscriminadamente,

como rotina, sem saber o perfil microbiológico e de sensibilidade aos antibióticos.

38

Beloti et al. (1997) encontraram 18,18% de estirpes resistentes à penicilina e novobiocina,

seguida da ampicilina e eritromicina (15,15%), em quartos mamários de vacas positivas no teste

do CMT, resultados não muito diferentes dos obtidos no presente estudo, nas fazendas 1, 2 e 3, e

que mostram a importância que devemos dar às novilhas, por serem consideradas o futuro do

rebanho não podem apresentar alta frequência de estirpes resistente no inicio da lactação.

A elevada resistência apresentada pelos patógenos nas três propriedades é um alerta aos

profissionais durante a prescrição de antimicrobianos para animais portadores de mastite. A

terapia realizada nas novilhas durante o pré-parto poderá selecionar estirpes de Staphylococcus

coagulase negativa resistentes a antimicrobianos, acarretando assim prejuízos aos animais e

produtores, e se tornar problema de saúde pública.

4.3 - Produção de biofilme (slime) pelos Staphylococcus coagulase negativa

O ágar Vermelho Congo permite identificar as modificações nas colônias de

Staphylococcus coagulase negativa, sendo caracterizadas como positivas as colônias que

apresentarem coloração negra e negativa as colônias de cor vermelha.

A tabela 6 mostra que não ocorreu produção de (slime), através do ágar Vermelho Congo

(CRA), pois todas as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa apresentaram colônias

vermelhas sendo consideradas como não produtoras de biofilme.

39

Tabela 6: Resultado das estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, submetidas ao teste do

ágar Vermelho Congo, para diagnosticar ou não a produção de biofilme (slime) das amostras



Resultados

Propriedades

Positivo Negativo

Fazenda 1 --------- 100%

Fazenda 2 --------- 100%

Fazenda 3 --------- 100%

As bactérias presentes no interior dos biofilmes podem permanecer aderidas e sobreviver

por longos períodos após procedimento de higienização, tornando-se contaminantes para os

alimentos e comprometendo a qualidade do produto final (ROSSI & PORTO, 2009). Apesar das

estirpes não serem produtoras de biofilme pelo ágar Vermelho Congo, não podemos afirmar que

estas não possuem gene responsável pela produção do slime, uma vez que elas podem não

expressar o gene através da técnica do ágar Vermelho Congo (CRAMTON et al., 1999).

40

41

5 – CONCLUSÃO

Podemos concluir de acordo com os resultados obtidos nesta pesquisa que:

O isolamento de agentes infecciosos, causadores de mastite, na secreção da glândula

mamaria de novilhas no pré-parto e parto comprovam que as novilhas podem tornar-se fonte de

infecção para o rebanho.

A presença de Staphylococcus coagulase negativa resistentes à oxacilina em novilhas,

provavelmente, irá afetar os tratamentos de mastite nas lactações subsequentes.

Staphylococcus coagulase negativa resistentes à oxacilina, em amostras de secreção da

glândula mamaria no pré-parto, parto e lactação, pode se tornar um problema de saúde pública

pelo consumo de leite in natura.

A utilização de antibióticos intramamários no pré-parto deve ser realizada com critério,

devendo ser procedidos por exames microbiológicos e antibiogramas para que se faça o uso do

antimicrobiano correto, obtendo melhor resposta do tratamento. Os antibióticos não devem ser

utilizados indiscriminadamente como rotina nas fazendas.

42

43

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS:

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mammary gland epithelial cells. Veterinary Microbiology, v.82, p.165-175, 2001.

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53

APÊNDICES

54

Apêndice (a)

ODDS RATIO

Definição:

O "odds ratio" é uma medida introduzida por Snow em seu trabalho de identificação do

fator de risco da propagação da cólera em Londres, em 1853 (Rumel, 1986). O "odds ratio" é

utilizado como medida de associação causal, em estudos transversais controlados (que é o

método utilizado nesta pesquisa). O odds ratio indica quantas vezes a prevalência do patógeno no

grupo tratado é menor que a prevalência dos patógenos no grupo não tratado. Por exemplo,

usando os dados como mostrado na tabela a seguir o "odds ratio" é igual a (a/b)/(c/d) ou (ad)/(bc)

e por isto é também chamado de razão de produtos cruzados; onde a é frequência de patógenos

positivos e b é a frequência de patógenos negativos no grupo não tratado; onde c é frequência de

patógenos positivos e d é a frequência de patógenos negativos no grupo tratado.

Tabela de contingência para a prevalência do patógeno SCP na Fazenda 3.

Fator de

Risco

Patógeno,

positivo

Patógeno,

negativo Total

Não Tratado A 56 b 709 765

Tratado C 26 d 753 779

Total N1 82 n2 1462 1544

Odds Ratio = (56/709)/(26/753)= 2,29.

Interpretação. A prevalência do patógeno no período de lactação é 2,29 vezes maior na

amostra não tratada em relação à amostra tratada.

O odds ratio calculado está associado a uma estimava do seu intervalo de confiança de

95% (IC95%): se o extremo inferior do IC 95% exceder o valor de 1, a hipótese H0 do valor do

OR ser igual a 1 é rejeitada e o teste é considerado significativo aceitando o valor calculado da

55

OR como sendo a diferença de frequência de patógenos entre os grupos. Se o IC95% incluir o

valor 1, a H0 é rejeitada e não se aceita o valor calculado como sendo diferente do valor 1. O

valor 1 indica que os dois grupos comparados possuem a mesma frequência de patógenos

positivos.

56

Apêndice (b)

Teste e intervalo de confiança para comparar duas proporções

FAZENDA 2

Comparação entre as isolados de SCP nos grupos não tratados e tratados:

Grupos F. A. N PROPOÇÃO

Não tratados p(1) 18 455 0,039560

Tratados p(2) 13 410 0,031707

Estimate for p(1) - p(2): 0,00785312

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0168136; 0,0325198)

Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 0,62 P-Value = 0,533

Comparação entre as isolados de SCN nos grupos não tratados e tratados:

Grupos F. A. N PROPORÇÃO

Não tratados p(1) 24 455 0,052747

Tratados p(2) 14 410 0,034146

Estimate for p(1) - p(2): 0,0186009

95% CI for p(1) - p(2): (-0,00843331; 0,0456351)


57

Comparação entre as isolados de S. aureus nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 22 455 0,048352

Tratados p(2) 43 410 0,104878

Estimate for p(1) - p(2): -0,0565264

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0921364; -0,0209164)

Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = -3,11 P-Value = 0,002

Comparação entre as isolados de Corynebacterium nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 34 455 0,074725

Tratados p(2) 17 410 0,041463

Estimate for p(1) - p(2): 0,0332619

95% CI for p(1) - p(2): (0,00234060; 0,0641831)


Comparação entre as isolados de Bacilos G- nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 2 455 0,004396

Tratados p(2) 3 410 0,007317

Estimate for p(1) - p(2): -0,00292147

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0131686; 0,00732563)


58

FAZENDA 3

Comparação entre as isolados de SCP nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 56 765 0,073203

Tratados p(2) 26 779 0,033376

Estimate for p(1) - p(2): 0,0398265

95% CI for p(1) - p(2): (0,0174709; 0,0621821)


Comparação entre as isolados de SCN nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 47 765 0,061438

Tratados p(2) 43 779 0,055199

Estimate for p(1) - p(2): 0,00623894

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0171434; 0,0296213)


Comparação entre as isolados de S. aureus nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 19 765 0,024837

Tratados p(2) 8 779 0,010270

Estimate for p(1) - p(2): 0,0145670

95% CI for p(1) - p(2): (0,00146200; 0,0276721)


59

Comparação entre as isolados de Streptococcus spp. nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 40 765 0,052288

Tratados p(2) 43 779 0,055199

Estimate for p(1) - p(2): -0,00291139

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0254061; 0,0195833)


Comparação entre as isolados de Cocos G-. nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 12 765 0,015686

Tratados p(2) 5 779 0,006418

Estimate for p(1) - p(2): 0,00926779

95% CI for p(1) - p(2): (-0,00117163; 0,0197072)


Comparação entre as isolados de Bacilos G-. nos grupos não tratados e tratados:


Não tratados p(1) 6 765 0,007843

Tratados p(2) 11 779 0,014121

Estimate for p(1) - p(2): -0,00627753

95% CI for p(1) - p(2): (-0,0166566; 0,00410154)


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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS …iz.sp.gov.br/pdfs/1332339361.pdf · Colegas da república, Giani, Joana, Claiton, pela amizade e experiências trocadas. Aos funcionários